CN109266682B - 一种神经细胞快速逆行跨突触标记的方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于辅助病毒的构建领域，公开了一种神经细胞快速逆行跨突触标记的方法及应用。本发明利用双链腺相关病毒（SCAAV）作为辅助病毒载体分别装载TVA受体和狂犬病毒外膜糖蛋白（RVG），并包装成病毒，用于ENVA外膜包裹的缺陷型重组狂犬病毒的特异性识别和逆行跨突触标记。经过活体测试结果表明，本发明建立的重组缺陷型狂犬病毒RV‑△G‑X‑ENVA与辅助病毒SCAAV组合系统，可以实现快速逆行跨突触标记，较传统的单链AAV病毒辅助方法节省1‑2周的实验时间，节省物力人力，为缺陷型狂犬病毒在神经网络逆向跨突触标记中的应用上提供了更好的研究工具，为神经网络的结构与功能解析奠定了很好的技术支撑。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种神经细胞快速逆行跨突触标记的方法及应用。
背景技术
解析大脑神经网络连接，是理解大脑工作机制及脑疾病网络变异机制的基础。传统的神经网络示踪方法，少数蛋白质类示踪剂，如WGA、HRP等,能初步实现大脑核团间的投射关系，但这些示踪方法具有信号间接、方向不特异、跨突触后信号衰减严重等问题。上述传统示踪方法促进了人们对大脑神经网络结构的认识，但难以用于研究由多个脑区、多种类型神经元通过突触连接形成的复杂神经网络。利用改造的嗜神经工具病毒(Neurotropicvirus)，跨突触追踪大脑的神经网络，是目前最有效的标记结构神经网络的技术。嗜神经病毒是一类能感染神经细胞，且能沿神经环路传播增殖的病毒。利用嗜神经病毒作为示踪工具，与传统的示踪剂相比有如下特点：(1)可以跨突触传播；(2)跨突触方向可控，可特异顺行或逆行传播；(3)病毒跨突触后可复制，信号不衰减；(4)可携带多种标示物。上述特性使其在示踪大脑神经网络结构的研究中显示出独特优势。
改造的狂犬工具病毒(RV)能实现严谨的跨单突触标记，可精确解析神经回路，在近几年广泛应用于神经科学研究，成为神经结构回路解析的工具之一，Wickersham等在2007报道了基于RV疫苗株Sad B-19感染性克隆构建的重组狂犬病毒，其G蛋白基因被敲除，并携带GFP、mCherry等荧光蛋白基因，可使外源蛋白在神经元中高丰度表达，从而清晰地标记神经元的精细形态。他们建立了RV的ENVA-TVA系统，实现了RV特异逆行跨突触的特性，并已被多个实验室使用。
腺病毒相关病毒(adenovirus associated virus，AAV)是一类单链线状DNA缺陷型病毒。其基因组小于5kb，无包膜，外形为裸露的20面体颗粒。由于其安全性好、宿主细胞范围广(分裂和非分裂细胞)、免疫源性低，在体内表达外源基因时间长等特点，被视为最有前途的基因转移载体之一，在神经科学领域也得到广泛的应用。AAV感染细胞后，需要经历一个由单链转变为双链的过程，而病毒DNA第二链的合成已被证明是病毒基因表达的限速步骤，直接影响到病毒的转导效率。双链AAV病毒(self-complementary AAV,scAAV)是在单链AAV病毒(ssAAV)右边的ITR删除了一个D序列(包装信号)，同时突变末端解链位点(Δtrs)，阻止了Rep蛋白修饰调节解链切口，增强自我互补双链DNA的包装。双链AAV病毒进入细胞后，不需要一个由单链变为双链的过程，基因表达更为快速，表达水平可能更高。但双链AAV的载量只有单链AAV的一半，大约2.5kb(Wang Z et al.,Gene Ther.2003,10(26):2105-11.)。
然而，现有技术使用缺陷型RV结合单链AAV辅助病毒实现逆行跨单突触标记，需要提前在起始脑区注射AAV辅助病毒2-3周后，使外源基因大量表达后再注射缺陷型RV并表达一周，此方法需要的实验周期比较长，大约需要一个月的时间。而双链AAV的载量有限，且辅助基因RVG的大小也比较大，为1575bp，其能否装载到双链AAV上并成功拯救出病毒和实现特异性在cre转基因鼠上表达与辅助缺陷型RV跨突触的功能，一直未见报道。
针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种快速逆行标记大脑神经网络结构的方法，其通过提供快速表达TVA和RVG的SCAAV病毒，其中表达RVG的SCAAV病毒的载量已经超过2.6kb，并用其作为辅助病毒结合缺陷型重组狂犬病毒形成新型逆行跨单突触系统，将该系统用于标记神经网络活体测试，活体测试表明该系统能够在注射辅助病毒一周后注射狂犬病毒实现快速逆行跨突触标记。
发明内容
本发明提供了一种神经细胞快速逆行跨突触标记的方法，方法简单，可实现在注射辅助病毒几天后注射狂犬病毒实现快速逆行跨突触标记。
本发明的另一个目的在于提供了一种神经细胞快速逆行跨突触标记的方法的应用，利用该方法，可用于神经环路示踪，神经网络的结构与功能解析等。
为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
一种神经细胞快速逆行跨突触标记的方法，包括下述步骤：
将SCAAV-hSyn-DIO-RVG(SEQ ID NO.2所示)和SCAAV-hSyn-DIO-EGFP-T2A-TVA(SEQ ID NO.1所示)病毒混合后对目的位点进行注射；注射后的第3～9天再注射ENVA包裹的缺陷型狂犬病毒。
本发明的保护内容还包括上述方法的应用，包括利用上述方法用于神经环路示踪，神经网络的结构与功能解析等。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1、对双链AAV载体进行改造，使其能够容纳和特异性表达辅助ENVA-RV-△G-dsred病毒感染跨突触的基因；
2、改造的双链AAV载体可搭载其他基因，如辅助VSV-△G病毒跨突触的VSVG等，用于其他跨突触系统的改造升级；
3、本发明首次提出将狂犬病毒与scAAV组合后应用于神经环路跨突触标记。
附图说明
图1：重组质粒SCAAV-hSyn-DIO-RVG酶切鉴定图；
其中泳道M表示DNA Marker，第一条带8kb、第二条带5kb、第三条带3kb、第四条带2kb、第五条带1kb；泳道1表示重组质粒酶切图。
图2：重组质粒SCAAV-hSyn-DIO-EGFP-T2A-TVA酶切鉴定图；
其中泳道M表示DNA Marker，第一条带8kb、第二条带5kb、第三条带3kb、第四条带2kb、第五条带1kb；泳道1表示重组质粒酶切图。
图3：重组质粒SCAAV-hSyn-DIO-EGFP-T2A-TVA在倒置荧光显微镜下的细胞荧光鉴定图(100倍)；
左图-cre为不加cre,即SCAAV-hSyn-DIO-EGFP-T2A-TVA质粒单独转染，不表现荧光；
右图+cre为加cre,即SCAAV-hSyn-DIO-EGFP-T2A-TVA质粒与AAV-CAG-CRE质粒(购自武汉枢密脑科学技术有限公司)共转染，表现绿色荧光。
图4：ENVA包裹的缺陷型狂犬病毒RV-△G-dsred的制备示意图；
左图为BHK-ENVA细胞系，带绿色荧光；右图为RV-△G-dsred感染细胞图，带红色荧光。
图5：ENVA包裹的缺陷型狂犬病毒RV-△G-dsred滴度测定；
用梯度稀释法对浓缩病毒滴度进行测定，测定细胞为293T-TVA800细胞(FumitakaOsakada and Edward M.CallawayNat Protoc.2013August；8(8):1583–1601.)，TVA800是ENVA外膜糖蛋白的特异性识别受体。
图6：辅助病毒载体与ENVA-RV-△G-dsred组合后在活体标记上的应用；
A图为注射位点，A图中左图绿色表明TVA大量表达，中间红色是ENVA-RV-△G-dsred感染效果，右图是两个病毒之间的共标效果，黄色为起始共标细胞，表明TVA介导ENVA-RV-△G-dsred病毒高效感染；
B图为逆行跨突触的脑区，表明辅助病毒载体与ENVA-RV-△G-dsred组合系统可实现快速逆行跨突触标记。
具体实施方式
本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规技术；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。
实施例1：
一种神经细胞快速逆行跨突触标记的方法，包括下述步骤：
一、辅助病毒载体的构建与病毒包装
1.辅助病毒载体的构建
SCAAV-CMV-EGFP(Wang Z et al.,Gene Ther.2003,10(26):2105-11.)用MluI(ACGCGT)和HindIII双切回收载体，得到SCAAV(M/H)；AAV-hSyn-DIO-EYFP(购自武汉枢密脑科学技术有限公司)用MluI(ACGCGT)和HindIII双切回收片段，得到hSyn-DIO-EYFP(M/H)；SCAAV(M/H)载体与hSyn-DIO-EYFP(M/H)片段用T4连接酶，16℃连接过夜，转化StbI3感受态进行菌落PCR鉴定，将阳性克隆置于LB培养基，30℃过夜培养，提取质粒进行酶切验证和测序，得到SCAAV-hSyn-DIO-EYFP。
SCAAV-hSyn-DIO-EYFP用NheI/AscI双切回收载体，获得SCAAV-hSyn-DIO(N/A)，AAV-hSyn-DIO-RVG-WPRE-pA(购自武汉枢密脑科学技术有限公司)用NheI/AscI双切回收片段，得到RVG(N/A)，AAV-EF1a-DIO-EGFP-T2A-TVA-WPRE-pA(购自武汉枢密脑科学技术有限公司)用NheI/AscI双切回收片段，得到EGFP-T2A-TVA(N/A)，将RVG(N/A)和EGFP-T2A-TVA(N/A)片段分别与SCAAV-hSyn-DIO(N/A)载体进行连接转化，鉴定阳性后经酶切验证和测序，分别得到SCAAV-hSyn-DIO-RVG(SEQ ID NO.2所示)和SCAAV-hSyn-DIO-EGFP-T2A-TVA(SEQ ID NO.1所示)；SCAAV-hSyn-DIO-RVG酶切鉴定图如图1所示，SCAAV-hSyn-DIO-EGFP-T2A-TVA酶切鉴定图如图2所示；同时对带荧光载体进行细胞转染验证，重组质粒SCAAV-hSyn-DIO-EGFP-T2A-TVA转染细胞后的验证图如图3所示。
2.辅助病毒的包装与质检
SCAAV辅助病毒采用传统的三质粒包装方法，并用碘克沙醇梯度离心法进行纯化，最后用SYBR Green qPCR法检测重组腺相关病毒滴度，最终获得SCAAV-hSyn-DIO-RVG、SCAAV-hSyn-DIO-EGFP-T2A-TVA病毒的滴度分别为2.98×1012vg/ml、3.12×1013vg/ml。二、ENVA包裹的缺陷型狂犬病毒RV-△G-dsred的制备
首先利用B7GG细胞系拯救和扩增RV-△G-dsred(Osakada et al Neuron.2011 Aug 25；71(4):617-31)(来自addgene，编号32638)病毒，然后按感染复数moi＝1-3感染BHK-ENVA细胞系，6小时后用DMEM洗涤两次，更换新鲜培养基(DMEM+5％FBS+1％双抗)置于35℃，3％CO2培养箱中继续培养36-48小时，消化细胞，按1:5传代于T75细胞培养瓶，每瓶加10-15ml新鲜的培养基(DMEM+5％FBS+1％双抗)，置于35℃，3％CO2培养箱中继续培养48-72小时，收集上清，在4℃，6000g下离心10min，弃沉淀，将上清用0.22μm的滤膜过滤。将收集到的滤液在4℃，50000g，2.5h，倒掉上清液，倒扣纸上，然后第一次加入700ul的PBS于离心管中，清洗管壁上沉淀到溶液中，第二次加入700ul的PBS于离心管中，清洗管壁残余沉淀到溶液中，最后合并到一个离心管中，吸取冰预冷的700ul20％的蔗糖加入1.5mL离心管中，在上层加入700ul混匀的病毒液，4℃，50000g，2.5h，吸去上清，将80-150ul细胞外液加入离心管，盖紧盖子，将离心管插入冰盒，在4℃冰箱溶解2小时，再用枪轻柔重悬沉淀。将重悬病毒液重新离心，6000g，3min。离心后，将上清分装至平盖PCR管，每管3ul，保存于-80度冰箱，即得到ENVA包裹的缺陷型狂犬病毒ENVA-RV-△G-dsred(图4)。用梯度稀释法对浓缩病毒滴度进行测定，滴度是3×108IU/ml，测定细胞为293T-TVA800细胞(图5)。
三、逆行跨单突触系统的活体测试
将SCAAV-hSyn-DIO-EGFP-T2A-TVA和SCAAV-hSyn-DIO-RVG按照病毒颗粒数1:1混合，取0.1μl混合后的病毒定位注射到THY1-CRE转基因小鼠(The Jackson Laboratory)背侧海马CA1区，注射后8天后在同一位置注射ENVA-RV-△G-dsred病毒。注射RV病毒6天后麻醉动物，用0.9％(V/V)生理盐水灌流，然后用4％(V/V)多聚甲醛继续灌流以固定鼠脑，取出脑组织浸泡于4％(V/V)多聚甲醛液中，然后将脑组织先置于20％(V/V)蔗糖溶液中1天，然后置于30％(V/V)蔗糖溶液中2天；将脑组织底部切平，置于底座上包埋冰冻1h后切片；取脑片后使用荧光显微镜观察(图6)。
在注射位点可观察到辅助病毒SCAAV-hSyn-DIO-EGFP-T2A-TVA表达的绿色荧光信号，该信号强度高，表示scAAV在上述时间内即可高量表达外源基因。同时，在注射位点观察到红色荧光信号，表示SCAAV-hSyn-DIO-EGFP-T2A-TVA中TVA表达，ENVA-RV-△G-dsred能够感染表达TVA的神经元。在注射位点以外的脑区，可观察到清楚的红色荧光信号，表示SCAAV-hSyn-DIO-RVG中RVG大量表达，使得ENVA-RV-△G-dsred能够快速逆行跨突触传播。
序列表
<110> 中国科学院武汉物理与数学研究所
<120> 一种神经细胞快速逆行跨突触标记的方法及应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 6232
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cagcagctgg cgtaatagcg aagaggcccg caccgatcgc ccttcccaac agttgcgcag 60
cctgaatggc gaatggaatt ccagacgatt gagcgtcaaa atgtaggtat ttccatgagc 120
gtttttcctg ttgcaatggc tggcggtaat attgttctgg atattaccag caaggccgat 180
agtttgagtt cttctactca ggcaagtgat gttattacta atcaaagaag tattgcgaca 240
acggttaatt tgcgtgatgg acagactctt ttactcggtg gcctcactga ttataaaaac 300
acttctcagg attctggcgt accgttcctg tctaaaatcc ctttaatcgg cctcctgttt 360
agctcccgct ctgattctaa cgaggaaagc acgttatacg tgctcgtcaa agcaaccata 420
gtacgcgccc tgtagcggcg cattaagcgc ggcgggtgtg gtggttacgc gcagcgtgac 480
cgctacactt gccagcgccc tagcgcccgc tcctttcgct ttcttccctt cctttctcgc 540
cacgttcgcc ggctttcccc gtcaagctct aaatcggggg ctccctttag ggttccgatt 600
tagtgcttta cggcacctcg accccaaaaa acttgattag ggtgatggtt cacgtagtgg 660
gccatcgccc tgatagacgg tttttcgccc tttgacgttg gagtccacgt tctttaatag 720
tggactcttg ttccaaactg gaacaacact caaccctatc tcggtctatt cttttgattt 780
ataagggatt ttgccgattt cggcctattg gttaaaaaat gagctgattt aacaaaaatt 840
taacgcgaat tttaacaaaa tattaacgtt tacaatttaa atatttgctt atacaatctt 900
cctgtttttg gggcttttct gattatcaac cggggtacat atgattgaca tgctagtttt 960
acgattaccg ttcatcgcct gcactgcgcg ctcgctcgct cactgaggcc gcccgggcaa 1020
agcccgggcg tcgggcgacc tttggtcgcc cggcctcagt gagcgagcga gcgcgcagag 1080
agggagtgga attcacgcgt gtgtctagac tgcagagggc cctgcgtatg agtgcaagtg 1140
ggttttagga ccaggatgag gcggggtggg ggtgcctacc tgacgaccga ccccgaccca 1200
ctggacaagc acccaacccc cattccccaa attgcgcatc ccctatcaga gagggggagg 1260
ggaaacagga tgcggcgagg cgcgtgcgca ctgccagctt cagcaccgcg gacagtgcct 1320
tcgcccccgc ctggcggcgc gcgccaccgc cgcctcagca ctgaaggcgc gctgacgtca 1380
ctcgccggtc ccccgcaaac tccccttccc ggccaccttg gtcgcgtccg cgccgccgcc 1440
ggcccagccg gaccgcacca cgcgaggcgc gagatagggg ggcacgggcg cgaccatctg 1500
cgctgcggcg ccggcgactc agcgctgcct cagtctgcgg tgggcagcgg aggagtcgtg 1560
tcgtgcctga gagcgcagtc gagaaggtac cggatcctct agagtcgact ccggaataac 1620
ttcgtatagg atactttata cgaagttatg cagaatggta gctggattgt agctgctatt 1680
agcaatatga aacctcttaa taacttcgta tagcatacat tatacgaagt tatggcgcgc 1740
cttaggagaa caagtctgcc tggctcttgt caggcaccag cagctccttg gatgcgcttt 1800
caagactgaa gatgtcagac ctgctttttg ctttggactt cccccatgca gcgataccac 1860
ccacagctac caggcagcac aggagcactg cagtgatcag catccacatg cggccgtgat 1920
tcctggctgg cagagcacgt ccaggagcag gggcagtggg agcctctgtg ccgttgtccg 1980
tgggcaccgc ggggatcgcg ctggtcccgc agccccactc gtcccgcccg tcgtcgcagt 2040
cggggtgtcc gtcgcacagc cagtcctgcg ggtaacactc cccgtgggca ccgggcggct 2100
ccgagcagcg gaactgaccg ggggggcaac gggacaaaga accgttaccg gacccgttac 2160
cggtcacgtt accgggcagc agcagcagca gcagcgcggg cagcagccgc gcatcgattg 2220
ggccaggatt ctcctcgacg tcaccgcatg ttagcagact tcctctgccc tccttgtaca 2280
gctcgtccat gccgagagtg atcccggcgg cggtcacgaa ctccagcagg accatgtgat 2340
cgcgcttctc gttggggtct ttgctcaggg cggactgggt gctcaggtag tggttgtcgg 2400
gcagcagcac ggggccgtcg ccgatggggg tgttctgctg gtagtggtcg gcgagctgca 2460
cgctgccgtc ctcgatgttg tggcggatct tgaagttcac cttgatgccg ttcttctgct 2520
tgtcggccat gatatagacg ttgtggctgt tgtagttgta ctccagcttg tgccccagga 2580
tgttgccgtc ctccttgaag tcgatgccct tcagctcgat gcggttcacc agggtgtcgc 2640
cctcgaactt cacctcggcg cgggtcttgt agttgccgtc gtccttgaag aagatggtgc 2700
gctcctggac gtagccttcg ggcatggcgg acttgaagaa gtcgtgctgc ttcatgtggt 2760
cggggtagcg gctgaagcac tgcacgccgt aggtcagggt ggtcacgagg gtgggccagg 2820
gcacgggcag cttgccggtg gtgcagatga acttcagggt cagcttgccg taggtggcat 2880
cgccctcgcc ctcgccggac acgctgaact tgtggccgtt tacgtcgccg tccagctcga 2940
ccaggatggg caccaccccg gtgaacagct cctcgccctt gctcaccatg gtggcgctag 3000
cataacttcg tataaagtat cctatacgaa gttatttgcc ttaacccaga aattatcact 3060
gttattcttt agaatggtgc aaagaataac ttcgtataat gtatgctata cgaagttatg 3120
aattcgatat caagcttatc gataccgtcg actagagctc gctgatcagc ctcgactgtg 3180
ccttctagtt gccagccatc tgttgtttgc ccctcccccg tgccttcctt gaccctggaa 3240
ggtgccactc ccactgtcct ttcctaataa aatgaggaaa ttgcatcgca ttgtctgagt 3300
aggtgtcatt ctattctggg gggtggggtg gggcaggaca gcaaggggga ggattgggaa 3360
gacaatagca ggcatgctgg ggagagatcg atctgaggaa cccctagtga tggagttggc 3420
cactccctct ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccggg cgaccaaagg tcgcccgacg 3480
cccgggcttt gcccgggcgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa 3540
cccccccccc cccccccctg catgcaggcg attctcttgt ttgctccaga ctctcaggca 3600
atgacctgat agcctttgta gagacctctc aaaaatagct accctctccg gcatgaattt 3660
atcagctaga acggttgaat atcatattga tggtgatttg actgtctccg gcctttctca 3720
cccgtttgaa tctttaccta cacattactc aggcattgca tttaaaatat atgagggttc 3780
taaaaatttt tatccttgcg ttgaaataaa ggcttctccc gcaaaagtat tacagggtca 3840
taatgttttt ggtacaaccg atttagcttt atgctctgag gctttattgc ttaattttgc 3900
taattctttg ccttgcctgt atgatttatt ggatgttgga attcctgatg cggtattttc 3960
tccttacgca tctgtgcggt atttcacacc gcatatggtg cactctcagt acaatctgct 4020
ctgatgccgc atagttaagc cagccccgac acccgccaac acccgctgac gcgccctgac 4080
gggcttgtct gctcccggca tccgcttaca gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca 4140
tgtgtcagag gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcgag acgaaagggc ctcgtgatac 4200
gcctattttt ataggttaat gtcatgataa taatggtttc ttagacgtca ggtggcactt 4260
ttcggggaaa tgtgcgcgga acccctattt gtttattttt ctaaatacat tcaaatatgt 4320
atccgctcat gagacaataa ccctgataaa tgcttcaata atattgaaaa aggaagagta 4380
tgagtattca acatttccgt gtcgccctta ttcccttttt tgcggcattt tgccttcctg 4440
tttttgctca cccagaaacg ctggtgaaag taaaagatgc tgaagatcag ttgggtgcac 4500
gagtgggtta catcgaactg gatctcaaca gcggtaagat ccttgagagt tttcgccccg 4560
aagaacgttt tccaatgatg agcactttta aagttctgct atgtggcgcg gtattatccc 4620
gtattgacgc cgggcaagag caactcggtc gccgcataca ctattctcag aatgacttgg 4680
ttgagtactc accagtcaca gaaaagcatc ttacggatgg catgacagta agagaattat 4740
gcagtgctgc cataaccatg agtgataaca ctgcggccaa cttacttctg acaacgatcg 4800
gaggaccgaa ggagctaacc gcttttttgc acaacatggg ggatcatgta actcgccttg 4860
atcgttggga accggagctg aatgaagcca taccaaacga cgagcgtgac accacgatgc 4920
ctgtagcaat ggcaacaacg ttgcgcaaac tattaactgg cgaactactt actctagctt 4980
cccggcaaca attaatagac tggatggagg cggataaagt tgcaggacca cttctgcgct 5040
cggcccttcc ggctggctgg tttattgctg ataaatctgg agccggtgag cgtgggtctc 5100
gcggtatcat tgcagcactg gggccagatg gtaagccctc ccgtatcgta gttatctaca 5160
cgacggggag tcaggcaact atggatgaac gaaatagaca gatcgctgag ataggtgcct 5220
cactgattaa gcattggtaa ctgtcagacc aagtttactc atatatactt tagattgatt 5280
taaaacttca tttttaattt aaaaggatct aggtgaagat cctttttgat aatctcatga 5340
ccaaaatccc ttaacgtgag ttttcgttcc actgagcgtc agaccccgta gaaaagatca 5400
aaggatcttc ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg ctgcttgcaa acaaaaaaac 5460
caccgctacc agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct accaactctt tttccgaagg 5520
taactggctt cagcagagcg cagataccaa atactgtcct tctagtgtag ccgtagttag 5580
gccaccactt caagaactct gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta atcctgttac 5640
cagtggctgc tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg gttggactca agacgatagt 5700
taccggataa ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag cccagcttgg 5760
agcgaacgac ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga gctatgagaa agcgccacgc 5820
ttcccgaagg gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga acaggagagc 5880
gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc gggtttcgcc 5940
acctctgact tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc ctatggaaaa 6000
acgccagcaa cgcggccttt ttacggttcc tggccttttg ctggcctttt gctcacatgt 6060
tctttcctgc gttatcccct gattctgtgg ataaccgtat taccgccttt gagtgagctg 6120
ataccgctcg ccgcagccga acgaccgagc gcagcgagtc agtgagcgag gaagcggaag 6180
agcgcccaat acgcaaaccg cctctccccg cgcgttggcc gattcattaa tg 6232
<210> 2
<211> 6559
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cagcagctgg cgtaatagcg aagaggcccg caccgatcgc ccttcccaac agttgcgcag 60
cctgaatggc gaatggaatt ccagacgatt gagcgtcaaa atgtaggtat ttccatgagc 120
gtttttcctg ttgcaatggc tggcggtaat attgttctgg atattaccag caaggccgat 180
agtttgagtt cttctactca ggcaagtgat gttattacta atcaaagaag tattgcgaca 240
acggttaatt tgcgtgatgg acagactctt ttactcggtg gcctcactga ttataaaaac 300
acttctcagg attctggcgt accgttcctg tctaaaatcc ctttaatcgg cctcctgttt 360
agctcccgct ctgattctaa cgaggaaagc acgttatacg tgctcgtcaa agcaaccata 420
gtacgcgccc tgtagcggcg cattaagcgc ggcgggtgtg gtggttacgc gcagcgtgac 480
cgctacactt gccagcgccc tagcgcccgc tcctttcgct ttcttccctt cctttctcgc 540
cacgttcgcc ggctttcccc gtcaagctct aaatcggggg ctccctttag ggttccgatt 600
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gccatcgccc tgatagacgg tttttcgccc tttgacgttg gagtccacgt tctttaatag 720
tggactcttg ttccaaactg gaacaacact caaccctatc tcggtctatt cttttgattt 780
ataagggatt ttgccgattt cggcctattg gttaaaaaat gagctgattt aacaaaaatt 840
taacgcgaat tttaacaaaa tattaacgtt tacaatttaa atatttgctt atacaatctt 900
cctgtttttg gggcttttct gattatcaac cggggtacat atgattgaca tgctagtttt 960
acgattaccg ttcatcgcct gcactgcgcg ctcgctcgct cactgaggcc gcccgggcaa 1020
agcccgggcg tcgggcgacc tttggtcgcc cggcctcagt gagcgagcga gcgcgcagag 1080
agggagtgga attcacgcgt gtgtctagac tgcagagggc cctgcgtatg agtgcaagtg 1140
ggttttagga ccaggatgag gcggggtggg ggtgcctacc tgacgaccga ccccgaccca 1200
ctggacaagc acccaacccc cattccccaa attgcgcatc ccctatcaga gagggggagg 1260
ggaaacagga tgcggcgagg cgcgtgcgca ctgccagctt cagcaccgcg gacagtgcct 1320
tcgcccccgc ctggcggcgc gcgccaccgc cgcctcagca ctgaaggcgc gctgacgtca 1380
ctcgccggtc ccccgcaaac tccccttccc ggccaccttg gtcgcgtccg cgccgccgcc 1440
ggcccagccg gaccgcacca cgcgaggcgc gagatagggg ggcacgggcg cgaccatctg 1500
cgctgcggcg ccggcgactc agcgctgcct cagtctgcgg tgggcagcgg aggagtcgtg 1560
tcgtgcctga gagcgcagtc gagaaggtac cggatcctct agagtcgact ccggaataac 1620
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ttctgttcac tcttctgcag caggtcatca ggaagatgat cagcatcagg gcggtcaggg 1920
cgccggcgct cagcagcacg tacttgcccc agttgggcag gcccaggtcc acgccgctca 1980
cctggttgtg cacgtcgggc aggtgcacct ccacgaagtc ctcggcctcg tcgccgtcct 2040
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gctccatgtg ctgctgcagc aggctgctct gcatctcggg gatcagcacg ttgccgtcgg 2160
ggcccaggat gatgccgttg aagaacacgc cgttcacgtg ggggtggcat ctgccgccca 2220
ctctcaggca gcccttgctg ggcaggatct cgttccaggt tctcacgctc ttgtagtggg 2280
cgtcggcctc catcagggtc ttgttgaaga tggtgtaggc cttgccgaag ccgggcacca 2340
gctttctcag gtggctcagt cttctgaagc tcacgctctt ggtggtcatg atgctctcca 2400
gggcgtccag gcactcctct ctctttctca ccagctcctc caccaccagg tgctcgatct 2460
cgtcgcttct gaagtcgtgc aggttcacca gcttgtcggg ggggcaccac ttggtctcgt 2520
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gtataatgta tgctatacga agttatgaat tcgatatcaa gcttatcgat accgtcgact 3480
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tcccccgtgc cttccttgac cctggaaggt gccactccca ctgtcctttc ctaataaaat 3600
gaggaaattg catcgcattg tctgagtagg tgtcattcta ttctgggggg tggggtgggg 3660
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ggccgggcga ccaaaggtcg cccgacgccc gggctttgcc cgggcggcct cagtgagcga 3840
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ctctgaggct ttattgctta attttgctaa ttctttgcct tgcctgtatg atttattgga 4260
tgttggaatt cctgatgcgg tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca 4320
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ttcaataata ttgaaaaagg aagagtatga gtattcaaca tttccgtgtc gcccttattc 4740
ccttttttgc ggcattttgc cttcctgttt ttgctcaccc agaaacgctg gtgaaagtaa 4800
aagatgctga agatcagttg ggtgcacgag tgggttacat cgaactggat ctcaacagcg 4860
gtaagatcct tgagagtttt cgccccgaag aacgttttcc aatgatgagc acttttaaag 4920
ttctgctatg tggcgcggta ttatcccgta ttgacgccgg gcaagagcaa ctcggtcgcc 4980
gcatacacta ttctcagaat gacttggttg agtactcacc agtcacagaa aagcatctta 5040
cggatggcat gacagtaaga gaattatgca gtgctgccat aaccatgagt gataacactg 5100
cggccaactt acttctgaca acgatcggag gaccgaagga gctaaccgct tttttgcaca 5160
acatggggga tcatgtaact cgccttgatc gttgggaacc ggagctgaat gaagccatac 5220
caaacgacga gcgtgacacc acgatgcctg tagcaatggc aacaacgttg cgcaaactat 5280
taactggcga actacttact ctagcttccc ggcaacaatt aatagactgg atggaggcgg 5340
ataaagttgc aggaccactt ctgcgctcgg cccttccggc tggctggttt attgctgata 5400
aatctggagc cggtgagcgt gggtctcgcg gtatcattgc agcactgggg ccagatggta 5460
agccctcccg tatcgtagtt atctacacga cggggagtca ggcaactatg gatgaacgaa 5520
atagacagat cgctgagata ggtgcctcac tgattaagca ttggtaactg tcagaccaag 5580
tttactcata tatactttag attgatttaa aacttcattt ttaatttaaa aggatctagg 5640
tgaagatcct ttttgataat ctcatgacca aaatccctta acgtgagttt tcgttccact 5700
gagcgtcaga ccccgtagaa aagatcaaag gatcttcttg agatcctttt tttctgcgcg 5760
taatctgctg cttgcaaaca aaaaaaccac cgctaccagc ggtggtttgt ttgccggatc 5820
aagagctacc aactcttttt ccgaaggtaa ctggcttcag cagagcgcag ataccaaata 5880
ctgtccttct agtgtagccg tagttaggcc accacttcaa gaactctgta gcaccgccta 5940
catacctcgc tctgctaatc ctgttaccag tggctgctgc cagtggcgat aagtcgtgtc 6000
ttaccgggtt ggactcaaga cgatagttac cggataaggc gcagcggtcg ggctgaacgg 6060
ggggttcgtg cacacagccc agcttggagc gaacgaccta caccgaactg agatacctac 6120
agcgtgagct atgagaaagc gccacgcttc ccgaagggag aaaggcggac aggtatccgg 6180
taagcggcag ggtcggaaca ggagagcgca cgagggagct tccaggggga aacgcctggt 6240
atctttatag tcctgtcggg tttcgccacc tctgacttga gcgtcgattt ttgtgatgct 6300
cgtcaggggg gcggagccta tggaaaaacg ccagcaacgc ggccttttta cggttcctgg 6360
ccttttgctg gccttttgct cacatgttct ttcctgcgtt atcccctgat tctgtggata 6420
accgtattac cgcctttgag tgagctgata ccgctcgccg cagccgaacg accgagcgca 6480
gcgagtcagt gagcgaggaa gcggaagagc gcccaatacg caaaccgcct ctccccgcgc 6540
gttggccgat tcattaatg 6559
Claims (3)
1.一种神经细胞快速逆行跨突触标记的方法，包括将SCAAV-hSyn-DIO-RVG和 SCAAV-hSyn-DIO-EGFP-T2A-TVA病毒混合后对目的位点进行注射；注射后的第3~9天再注射ENVA包裹的缺陷型狂犬病毒；
所述的SCAAV-hSyn-DIO-RVG为SEQ ID NO.2所示的多核苷酸；所述的SCAAV-hSyn-DIO-EGFP-T2A-TVA为SEQ ID NO.1所示的多核苷酸。
2.权利要求1所述方法在神经环路示踪中的应用。
3.权利要求1所述的方法在神经网络的结构与功能解析中的应用。
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