CN109880807B - 神经细胞稀疏高亮度标记重组腺相关病毒的包装方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于神经细胞稀疏高亮度标记的重组腺相关病毒的包装方法及其应用，通过将剪切酶的核心表达质粒和对应的剪切酶依赖的荧光蛋白质粒混合成表达质粒混合物，然后与重组腺相关病毒辅助包装质粒共同转染包装细胞后，经过纯化获得稳定性良好的单一重组腺相关病毒集合。相比于不同表达质粒分别单独包装成重组腺相关病毒后混合感染的方法，通过本发明可以明显降低不同重组腺相关病毒混合共感染所造成的排斥问题，获得的新型重组腺相关病毒可用于神经细胞数目稀少且高亮度的标记，结合一定的成像手段，可以获得神经细胞局部的高清形态，还可以获得单个神经细胞在全脑尺度的完整细胞形态，即单个神经细胞在全脑完整的树突纤维投射。

Description

神经细胞稀疏高亮度标记重组腺相关病毒的包装方法及其 应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于神经细胞稀疏高亮度标记的重组腺相关病毒的包装方法及其应用，该重组腺相关病毒主要用于解析神经细胞切片水平局部形态以及全脑水平单个神经细胞的完整轴树突投射形态等。

背景技术

神经环路是大脑行使各项功能的结构基础，是由数量庞大、种类多样的神经元之间通过突触连接形成，其结构的精确解析有助于人们更好地理解大脑的工作原理。目前介观水平常用的研究神经环路结构的方法主要分为群体标记和稀疏标记。其中群体标记是指标记大脑特定脑区群体神经元，以研究群体神经元的神经网络结构。然而由于群体神经元中每个个体形态结构千差万别，不同个体之间轴树突纤维彼此相互缠绕，群体标记很难揭示每个个体神经元的清晰完整的结构特征，制约了对神经环路精细组织构架的理解。因此人们开发各种稀疏标记方法，以期对神经细胞进行少量高亮度标记，结合一定的成像手段，研究单个神经细胞的全脑完整形态，进而理解单个神经细胞的信息输入和输出的走向，更进一步理解不同单个神经细胞之间如何组织形成神经环路。

目前常用的稀疏标记方法主要包括转基因小鼠遗传学标记以及病毒标记等，其中病毒标记以重组腺相关病毒(rAAV)的应用最为广泛。rAAV是一种单链DNA 病毒，具有免疫原性低，可导入外源基因，能在动物体内长期稳定表达等特点，已广泛应用于大脑神经科学等多个领域的研究[1]。现有稀疏标记方法能在一定程度上满足对小鼠大脑神经细胞少量亮度较高的标记。具体的稀疏标记方法主要有：

1、通过Cre-ER转基因小鼠控制他莫昔芬剂量药物诱导[2-4]；

2、将高倍稀释的表达Cre剪切酶的rAAV病毒与Cre剪切酶依赖的表达荧光蛋白的rAAV病毒混合后注射小鼠大脑特定脑区[5]；

3、逆向标记病毒启动上游表达[6,7]；

4、利用四环素诱导表达系统中的泄露机制进行稀疏标记[7,8]。

上述方法依然存在不少问题，比如方法1中转基因小鼠药物诱导表达方法中单个神经细胞的荧光亮度相比于病毒标记神经细胞的荧光亮度仍有一定的差距，且由于不同转基因小鼠特定细胞类型神经细胞中Cre-ER表达水平差异性较大等因素，被标记的神经细胞的数量和密度均不可控。上述方法2和方法4混合两种不同的rAAV病毒注射大脑会导致每个病毒组分相互排斥，这是由病毒本身的感染特性所决定的，不同种病毒或者同种病毒携带不同元件混合共感染细胞会导致相互排斥[9-11]，进而导致被感染神经细胞长程轴突投射末梢的荧光亮度不高，无法完整高效地标记出神经细胞在全脑水平的完整轴突投射形态。同时方法2 无法实现对特定细胞类型神经细胞的标记，限制了该方法在单个特定细胞类型神经细胞完整形态研究中的应用。方法4中病毒泄露表达有一定的随机性，因此被标记神经元的数量和密度均不可控，且不同批次病毒混合标记结果差别较大。方法3中病毒逆向启动标记无法同时兼顾投射特异性和细胞类型特异性标记，且由于逆向启动标记的犬腺病毒CAV和RetroAAV病毒或者其它病毒均存在感染神经元细胞类型偏好性或者毒性等问题[12]，因此被标记的神经细胞类型、荧光亮度以及完整细胞形态都会受到一定影响。

针对上述各种方法带来的问题或者困难，本发明公开了一种用于大脑非特定细胞类型或特定细胞类型神经细胞稀疏高亮度标记的rAAV病毒的包装方法及其应用。其中前者是指对神经细胞进行非特定细胞类型选择性的标记，后者是指对神经细胞进行特定细胞类型选择性的标记。该rAAV病毒包装方法基于多核心表达质粒预混合共包装成单一rAAV病毒集合的方法，在保证被标记神经细胞高亮度的同时兼顾被标记神经细胞的数量和密度，即标记数目十分稀少，不同神经细胞间彼此分离较好且细胞胞体以及长程轴突末梢高亮度的神经细胞。其中特定细胞类型神经细胞稀疏高亮度标记通过结合特定细胞类型神经细胞表达Cre剪切酶的转基因小鼠实现。通过使用fMOST全脑成像系统[13]对鼠脑进行全脑切削成像，可重建出其中被稀疏高亮度标记的单个神经细胞全脑水平的完整形态。所获数据可以帮助人们更好地理解单个神经细胞的全脑完整形态和投射模式，理解单个神经细胞如何形成神经环路，为人们认识大脑工作原理奠定一定的结构基础。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于神经细胞稀疏高亮度标记的rAAV病毒的包装方法及其应用，通过预先将表达剪切酶的核心表达质粒和对应的剪切酶依赖的荧光蛋白表达质粒混合成核心表达质粒混合物，然后与其它辅助包装质粒共转染包装细胞，经过纯化获得的单一rAAV病毒集合，该病毒可以标记数量十分稀少且高亮度的神经细胞，结合一定的成像手段，可以实现对单个神经细胞完整形态的解析。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

用于神经细胞稀疏高亮度标记的rAAV病毒，通过以下方法制备：预先将表达剪切酶的核心表达质粒和对应的剪切酶依赖的荧光蛋白质粒混合成核心表达质粒混合物，然后与重组腺相关病毒辅助包装质粒共同转染包装细胞后，经过纯化获得单一rAAV病毒集合。

进一步地，所述的表达剪切酶的核心表达质粒和对应的剪切酶依赖的荧光蛋白表达质粒按摩尔数比1:10³-1:10⁶混合。

进一步地，所述的剪切酶的核心表达质粒包括Cre剪切酶表达质粒(如 AAV-CMV-Cre、AAV-Syn-Cre、AAV-CAG-Cre、AAV-EF1α-Cre等质粒)，Flp剪切酶表达质粒(如AAV-EF1α-Flp、AAV-Syn-Flp、AAV-CAG-Flp、AAV-CMV-Flp 等质粒)，以及其它可用于神经标记的剪切酶表达质粒，如Dre剪切酶系统或Vika 剪切酶系统[14]，还包括这四种剪切酶中任意两种或三种剪切酶组合的表达质粒，比如Cre剪切酶与Flp剪切酶组合质粒(如AAV-EF1α-DIO-Flp、AAV-EF1 α-FDIO-Cre或者其它将EF1α启动子替换成诸如Syn、CMV、CAG等启动子的质粒等)。

进一步地，所述的剪切酶质粒对应的剪切酶依赖的荧光蛋白表达质粒包括 Cre剪切酶依赖的荧光蛋白表达质粒，比如AAV-EF1α-DIO-EYFP、AAV-Syn -DIO-EYFP等，其中EF1α或者Syn启动子可被替换成其它诸如CAG、CMV等可用于神经细胞标记的启动子，EYFP荧光蛋白元件可被替换成其它种类的可以用于神经标记的荧光蛋白元件，诸如绿色荧光蛋白GFP、黄色荧光蛋白YFP、红色荧光蛋白RFP等其它多种荧光蛋白元件。Flp剪切酶依赖的荧光蛋白表达质粒，比如AAV-EF1α-FDIO-EYFP、AAV-Syn-FDIO-EYFP等，其中EF1α或者 Syn启动子可被替换成其它诸如CAG、CMV等可用于神经细胞标记的启动子， EYFP荧光蛋白元件可增加或被替换成其它可用于神经标记的荧光蛋白元件。Cre 剪切酶与Flp剪切酶组合的质粒依赖的荧光蛋白表达质粒，比如AAV-Syn -Con/Fon-EYFP、AAV-Cmv-Con/Fon-EYFP等质粒。还包括Dre剪切酶或Vika 剪切酶等依赖的荧光蛋白表达质粒。

进一步地，可增加剪切酶依赖的荧光蛋白表达质粒中荧光蛋白元件的拷贝数或者进一步增加其它神经结构标记或者功能标记元件。比如增加荧光蛋白元件拷贝数，提高单位时间内病毒表达荧光蛋白的丰度；增加神经细胞突触荧光标记元件(如Synaptophysin-XFP)，可标记出神经细胞高清突触结构；增加Chr2等光遗传学元件，使用不同波长的激发光激活或者抑制神经元的活动；增加Gcamp 钙成像元件，检测神经细胞活动中的钙离子发放水平；增加各种不同神经递质探针元件，检测神经细胞释放的神经递质水平；以及其它可能用于神经细胞研究的元件。

进一步地，所述重组rAAV病毒的包装方法，该病毒包装的血清型不仅限于 2/9型，还应包括其它可以用于神经细胞标记的血清型，比如2/1、2/2、2/5、/2/6、 2/8、2/DJ等其它常用于神经标记的血清型。

进一步地，所述重组rAAV病毒的包装方法，由于rAAV感染的普适性，可用于斑马鱼、大鼠、豚鼠、雪貂、树鼩、非人灵长类等其它动物的大脑神经细胞和神经胶质细胞、外周神经元和神经胶质细胞的稀疏高亮度标记。

通过上述方法包装的rAAV病毒可用于神经细胞稀疏高亮度标记，以小鼠的大脑神经细胞为例进行说明：

1、将获得的rAAV病毒分别立体定位注射至C57bL/6小鼠或者特定细胞类型神经细胞表达Cre剪切酶的转基因小鼠大脑特定脑区，表达约21天后可获得大脑非细胞类型特异性或者细胞类型特异性神经细胞稀疏高亮度标记；

2、将步骤1中稀疏高亮度标记的大脑样本进行组织切片并对神经细胞局部形态进行成像，可以获得神经细胞胞体以及近胞体端的轴树突纤维的高清形态；

3、对步骤1中标记样本进行包埋并使用fMOST成像系统进行全脑成像，可获得被稀疏高亮度标记的神经细胞在全脑水平高分辨率的数据，通过对其中单个神经细胞在全脑水平的投射形态进行三维重建，可以十分准确且完整地将单个神经细胞全脑水平的精细形态清晰地勾勒出来。

与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：

1、包装方法相对简单且节约成本，相比于过去的方法，该方法只需要包装一次病毒即可，节省了包装过程中的人力成本和经济成本。包装获得的单一rAAV 病毒集合感染神经细胞稳定性很好，不同批次实验获取的实验结果差异性较小。

2、该病毒标记大脑神经细胞效果多方面优于过去的多种稀疏标记方法，无论从标记细胞数目的可控性和稳定性以及被标记细胞的亮度都明显优于过去已有方法，且标记实验操作简便易行，只需要注射一次单一rAAV病毒集合即可，无需其它额外的病毒混合或者病毒稀释等操作，极大地简化了实验流程，减少了繁琐的实验操作过程中人为因素带来的误差。

3、该方法相比于不同表达质粒分别单独包装成重组腺相关病毒后混合感染的方法，可以明显降低后者混合共感染所造成的排斥问题，即不同质粒预先混合后包装得到的单一腺相关病毒集合感染细胞中的多个基因的表达效果比不同质粒分别包装获得的重组腺相关病毒混合后共感染细胞所得到多个基因的表达效果有明显的提升，如图1-图5所示。其中，图1，图2和图3表明，对于某种重组腺相关病毒而言，在同等感染条件下，相比于和等体积的磷酸盐缓冲液(PBS)混合后感染组织的效果，该重组腺相关病毒和另外一种重组腺相关病毒混合感染的效果有明显降低，即图1和图2中所示的图片右侧的荧光亮度相对更低，图3为图1 和图2的荧光亮度数据定量化，图3表明，一种病毒和另外一种病毒混合感染相比于病毒和磷酸盐缓冲液混合感染，在相同条件下，荧光蛋白的表达水平更低。因此表明，不同的病毒混合共感染细胞会造成相互排斥。图4和图5中，两种荧光蛋白表达质粒预混合包装的病毒和两种荧光蛋白质粒分别包装病毒后混合感染小鼠大脑的标记效果，从图5可以看到前者两质粒先混合后包装病毒感染的细胞表达两种荧光蛋白水平的差异明显小于后者两质粒分别包装的感染结果。

附图说明

图1为AAV9-EF1α-mCherry病毒(表达红色荧光蛋白mCherry)与磷酸盐缓冲液(PBS)等体积混合后感染C57BL/6小鼠大脑初级运动皮层的荧光亮度与 AAV9-EF1α-mCherry病毒等体积混合AAV9-EF1α-EYFP病毒(表达黄色荧光蛋白EYFP)的荧光亮度的对比。图1左上图为AAV9-EF1α-mCherry病毒等体积混合PBS后感染小鼠大脑运动皮层的荧光表达图，图1右上图为AAV9- EF1α-mCherry病毒等体积混合AAV9-EF1α-EYFP病毒后感染小鼠大脑运动皮层的荧光表达图，图1左下和右下分别为上述两种混合感染方式标记神经细胞的荧光定量曲线图，表明AAV9-EF1α-mCherry病毒混合PBS的荧光亮度明显高于 AAV9-EF1α-mCherry病毒混合AAV9-EF1α-EYFP病毒的荧光亮度。

图2为AAV9-EF1α-EYFP病毒与磷酸盐缓冲液(PBS)等体积混合后感染 C57BL/6小鼠大脑初级运动皮层的荧光亮度与AAV9-EF1α-EYFP病毒等体积混合AAV9-EF1α-mCherry病毒的荧光蛋白亮度的对比，图2左上图为AAV9- EF1α-EYFP病毒等体积混合PBS后感染小鼠大脑运动皮层的荧光表达图，图2右上图为AAV9-EF1α-EYFP病毒等体积混合AAV9-EF1α-mCherry病毒感染小鼠大脑运动皮层的荧光表达图，图2左下和右下分别为上述两种混合感染方式标记神经细胞的荧光定量曲线图，表明AAV9-EF1α-EYFP病毒混合PBS的荧光亮度明显高于AAV-EF1α-EYFP病毒混合AAV9-EF1α-mCherry病毒的荧光亮度。

图3为图1和图2中所示结果的荧光定量图。进一步定量地说明AAV9- EF1α-EYFP病毒和AAV9-EF1α-mCherry病毒分别单独与PBS混合后感染大脑初级运动皮层的亮度显著高于两者混合后感染大脑初级运动皮层的亮度，表明 AAV9-EF1α-EYFP和AAV9-EF1α-mCherry两种病毒混合共同感染神经细胞会有一定的排斥(两病毒混合后彼此荧光亮度均降低)。

图4为AAV9-EF1α-EYFP质粒和AAV9-EF1α-mCherry质粒预先等摩尔数混合共转染293T细胞获得的单一rAAV病毒集合感染C57BL/6小鼠大脑初级运动皮层的结果与AAV9-EF1α-EYFP病毒和AAV9-EF1α-mCherry病毒等体积近似等滴度混合感染C57BL/6小鼠大脑初级运动皮层的结果对比图。

图5为两种不同混合方式(质粒预先混合或病毒混合)获得的病毒感染小鼠大脑神经细胞的荧光定量图，其中左图为AAV9-EF1α-EYFP质粒和AAV9- EF1α-mCherry质粒预先混合包装的单一rAAV病毒集合感染细胞的荧光散点图，图中每一个红色的点表明一个神经细胞的红色荧光和绿色荧光亮度值，右图为两种AAV9-EF1α-EYFP病毒和AAV9-EF1α-mCherry病毒混合后感染大脑神经细胞的荧光散点图，图中每一个黑色的点表明一个神经细胞的红色荧光和绿色荧光亮度值。图5表明，对于每个细胞的荧光亮度而言，右图中两种病毒混合后感染细胞所获得的mCherry和EYFP荧光亮度差异更加明显。

图6为用于非特定细胞类型神经细胞稀疏高亮度标记rAAV病毒的包装示意图。预先以一定的比例混合Cre剪切酶表达质粒和Cre剪切酶依赖的荧光蛋白表达质粒获得核心表达质粒混合物。然后混合rAAV病毒包装所需其它相关质粒，共同感染293T细胞后纯化获得单一rAAV病毒集合，该病毒即为非特定细胞类型神经细胞稀疏高亮度标记病毒。

图7为AAV-CMV-Cre质粒和AAV-EF1α-DIO-EYFP质粒以不同比例 (1:20000,1:200000，1:1000000，分别命名为cAAV²⁰⁰⁰⁰，cAAV²⁰⁰⁰⁰⁰，cAAV^1000000) 预混合包装的非特定细胞类型神经细胞稀疏高亮度标记病毒感染C57BL/6小鼠大脑初级运动皮层的局部荧光亮度和长程纤维的荧光亮度对比图。结果表明，随着Cre剪切酶质粒混合比例逐渐减少，被标记的神经细胞的数量也逐渐减少。但通过最右侧三张图可看出，三种不同质粒混合比例所获病毒感染小鼠初级运动皮层的神经细胞投射到胼胝体(corpus callosum)的轴突纤维随着混合比例的降低而减少，但亮度没有明显变化。因此，该两种表达质粒混合比例的改变只影响最终病毒感染神经细胞的数目，但并不明显影响最终被标记神经细胞的亮度。

图8为三种非特定细胞类型神经细胞稀疏高亮度标记病毒(cAAV ²⁰⁰⁰⁰，cAAV ²⁰⁰⁰⁰⁰，cAAV^1000000)感染C57BL/6小鼠大脑初级运动皮层标记的神经细胞数目的统计图。从左到右依次分别为Cre质粒和Cre依赖质粒以1:1000000,1:200000， 1:20000的比例混合包装病毒的感染结果。数据表明，随着Cre剪切酶质粒的比例逐渐增加，被标记的神经细胞的数量也逐渐增加，呈正相关关系。

图9最左图为非特定细胞类型神经细胞稀疏高亮度标记病毒cAAV²⁰⁰⁰⁰⁰感染C57BL/6小鼠大脑初级运动皮层的荧光标记结果。右边三张图片为表达Cre剪切酶的rAAV病毒和Cre剪切酶依赖表达荧光蛋白的rAAV病毒分别以一定的比例 (1:20000,1:40000,1:80000，分别命名为mAAV²⁰⁰⁰⁰，mAAV⁴⁰⁰⁰⁰，mAAV⁸⁰⁰⁰⁰)混合后感染C57BL/6小鼠大脑初级运动皮层的荧光标记结果。在相同的拍摄参数条件下，前者质粒混合包装的cAAV²⁰⁰⁰⁰⁰病毒感染神经细胞的亮度以及神经纤维细节的丰富程度显著高于后者三种不同混合比例的rAAV混合病毒感染的结果，说明在相同感染条件下，质粒预混合包装rAAV可以显著提高最终被标记神经细胞的荧光亮度。

图10为cAAV²⁰⁰⁰⁰⁰病毒感染C57BL/6小鼠大脑初级运动皮层的荧光标记结果与三种不同混合比例的rAAV混合病毒mAAV²⁰⁰⁰⁰，mAAV⁴⁰⁰⁰⁰，mAAV⁸⁰⁰⁰⁰感染结果的荧光亮度定量对比图，从图中可以看到前者质粒混合包装的病毒标记神经细胞的亮度显著高于后者病毒混合标记的亮度，进一步说明质粒预混合包装病毒可以显著提高被标记神经细胞的荧光亮度。

图11为cAAV²⁰⁰⁰⁰⁰注射C57BL/6小鼠大脑初级运动皮层的长程投射标记效果。该切片为距离病毒注射位点5mm的长程投射区域的脑片，从图中e和f可以看到初级运动皮层神经元投射的下游脑区RN(红核)被高亮度标记出来，从图中g， h，i，j可以看到RN脑区投射纤维更精细的轴突小结结构也被高亮度标记出来。结果表明该病毒可以标记大脑初级运动皮层神经元的长程轴突投射末梢，说明了该病毒标记神经元长程投射的高效性。

图12为cAAV²⁰⁰⁰⁰⁰注射C57BL/6小鼠大脑初级运动皮层并进行fMOST全脑成像获得的全脑数据及单个神经元全脑形态重建数据。其中q图为fMOST全脑成像数据预处理结果，可看出注射位点大脑初级运动皮层神经元被高效标记，并且全脑神经纤维也被清晰高效标记。s图为重建出的8个神经元的全脑矢状面和水平面的形态特征，不同颜色代表不同神经元，可看到被标记神经元在全脑水平的神经纤维投射特征。r图为s图中重建出的部分单个神经元的胞体在皮层不同亚层的定位。该结果表明，被标记神经元亮度和稀疏度符合要求，样本可被清晰完整地成像，单个神经元完整形态可被高清晰重建出来。

图13为用于特定细胞类型神经细胞稀疏高亮度标记rAAV病毒的包装示意图，即预先以一定的比例混合Flp剪切酶表达质粒以及Cre剪切酶和Flp剪切酶双依赖的荧光蛋白表达质粒获得核心表达质粒混合物，然后再混合rAAV病毒包装所需的其它相关质粒，将上述质粒混合物共感染293T细胞后纯化获得单一rAAV 集合，该病毒即为特定细胞类型神经细胞稀疏高亮度标记病毒。

图14为特定细胞类型神经细胞稀疏高亮度标记病毒scAAV²⁰⁰⁰⁰ (AAV-EF1α-Flp质粒与AAV-Syn-Con/Fon-EYFP质粒以1:20000比例预混合包装)感染胆碱能神经元特异性表达Cre剪切酶的转基因小鼠(Chat-Cre，Jackson 编号：006410)基底前脑的标记效果。其中a图为病毒注射位点的标记结果(50 μm大脑切片)，可看到三个神经细胞被高亮度标记。b图表明被标记三个神经细胞均为胆碱乙酰转移酶阳性神经元(胆碱乙酰转移酶抗体免疫组化鉴定)，c图为病毒注射位点被标记的三个胆碱能神经元局部的高清形态。

图15为特定细胞类型神经细胞稀疏高亮度标记病毒感染胆碱能神经元特异性表达Cre剪切酶的转基因小鼠(Chat-Cre)基底前脑的神经细胞在全脑水平的投射纤维，其中e图表明基底前脑胆碱能神经细胞可以投射到PIR(梨状皮层，f 图)以及Amy(杏仁核，g图)和ENTm(内嗅皮层，h图)，且投射纤维亮度较高。表明该特定细胞类型神经细胞稀疏高亮度标记病毒可以标记出胆碱能神经细胞在全脑的投射纤维。

图16为特定细胞类型神经细胞稀疏高亮度标记病毒scAAV²⁰⁰⁰⁰感染Chat-Cre 转基因小鼠基底前脑的标记效果并进行fMOST全脑成像获得的全脑数据及单个神经元全脑形态重建数据。其中i图为fMOST全脑成像数据预处理结果，可看出注射位点大脑初级运动皮层神经元被高效标记，并且全脑投射神经纤维也被清晰高效标记。j图为重建出的单个胆碱能神经元的全脑矢状面和水平面的形态特征，可看到该被标记胆碱能神经元在初级视觉皮层(V1)密集的轴突纤维投射。k图为j图中矩形框出部分的放大图片。该结果表明，被标记神经元亮度符合要求，样本可被清晰完整地成像，单个神经元完整形态可被高清晰地重建出来。

具体实施方式

为了使本发明的设计理念，技术方案以及多种优点更易理解，我们通过附图和部分实施案例，对本发明进行更加详细的说明。应当提出的是，以下提到的具体实施方式仅用于解释本发明，但不能被理解为对本发明的应用的限制。以下实施案例中应用于不同研究目的设计方式彼此相互印证，核心理念都是将不同表达质粒预混合并共包装成单一rAAV病毒集合。本发明研发的用于神经细胞稀疏高亮度标记的方法将对人们理解单个神经细胞在全脑的完整形态具有重大的意义，此外，该稀疏高亮度标记方法也会对大脑成像技术带来一定程度上的便利。

实施例1

一种用于非特定细胞类型神经细胞稀疏高亮度标记的rAAV病毒的包装方法，其步骤是：

1、质粒组合系统的筛选：筛选出适合的剪切酶表达质粒和剪切酶依赖的荧光蛋白表达质粒组合，根据目前常用的剪切酶表达系统，以代表性的Cre剪切酶表达系统组合为例：Cre剪切酶表达质粒(AAV-CMV-Cre质粒，来自武汉枢密脑科学技术有限公司)与Cre剪切酶依赖的荧光蛋白表达质粒 (AAV-EF1α-DIO-EYFP质粒，来自武汉枢密脑科学技术有限公司)。

2、非特定细胞类型神经细胞稀疏高亮度标记rAAV病毒包装：将步骤1中筛选出的具有代表性的质粒组合分别进行扩增，获得足够量的质粒。将扩增后的质粒以不同混合比例作为具体实施例预混合成核心质粒混合物：

1)Cre剪切酶表达质粒与Cre剪切酶依赖的荧光蛋白表达质粒以一定的摩尔数比例(1:20000,1:200000，1:1000000)预混合成核心质粒混合物，该混合比例为预测试小鼠大脑初级运动皮层获得的效果较好的比例。由于大脑不同脑区神经细胞数目和细胞类型的多样性，因此其它脑区该病毒对应的表达质粒混合的最佳比例范围在1:10³-1:10⁶。

2)293T转染细胞的培养：将正常生长的贴壁293T细胞用胰酶消化后，按照大约1.0×10⁷cells的量接种至15cm的细胞培养皿中。随后在37℃，浓度5％的 CO₂培养箱中培养约12-18h，待细胞密度达到整个培养皿的80％-90％时可进行转染，转染前2h更换新鲜无抗生素的培养基。

3)转染复合物的配制：转染时先确定转染体系，以5×15cm平皿的细胞量为例，转染的体系一般为5ml，包括AAV表达质粒85μg，辅助质粒(pHelper) (购自安捷伦公司)85μg，AAV衣壳质粒(pRC)85μg，765μl的转染试剂PEI 以及稀释液约4ml PBS；配制转染复合物时，先取约4ml的PBS于15ml的离心管中，将AAV系统三质粒按量依次添加到PBS中，混匀，然后添加765μl的转染试剂PEI(PEI/总DNA＝3：1)，混匀，室温静置15分钟。

4)293T细胞转染：将转染复合物按1ml/15cm平皿均匀添加到细胞中，轻轻混匀后，即完成转染，将细胞放置在37℃，浓度5％的CO₂培养箱中培养，约 72h后收集细胞及培养基。

5)rAAV病毒纯化：将上述转染后72h收集的细胞添加一定量的细胞裂解液(NaCl:150mM，Tris-Cl:100Mm,pH＝8.0)在液氮或37℃反复冻融3次，离心，取上清液。此外对于收集的培养基用PEG-NaCl(终浓度分别为0.6M NaCl和8％ PEG(W/V))，置冰上孵育3h或过夜，离心后，弃上清液，用PBS重悬沉淀，将重悬的沉淀与细胞裂解液上清液进行碘克沙醇密度梯度超速离心，离心后取 40％层的悬液进行透析和浓缩，得到最终成品rAAV病毒，放-80℃保存。

其中，AAV-CMV-Cre质粒与AAV-EF1α-DIO-EYFP质粒预混合包装非特定细胞类型神经细胞稀疏高亮度标记病毒的过程如图6所示，本实施例中该单一rAAV病毒集合被包装成2/9型血清型。同理，在非特定细胞类型神经细胞稀疏高亮度标记病毒的包装制备过程中，Cre剪切酶表达质粒与Cre剪切酶依赖的荧光蛋白表达质粒组合可分别被替换成Flp剪切酶质粒和Flp剪切酶依赖的荧光蛋白表达质粒或者其它可能设计改造的剪切酶和剪切酶依赖的荧光蛋白表达质粒组合，具体包装条件和质粒混合比例类似上述Cre剪切酶系统制作非特定细胞类型神经细胞稀疏高亮度标记病毒的条件。

实施例2

一种用于特定细胞类型神经细胞稀疏高亮度标记的rAAV病毒的包装方法，其步骤是：

1、质粒组合系统的筛选：由于目前神经环路研究中以特定细胞类型神经细胞表达Cre剪切酶的转基因小鼠品系居多，因此我们目前主要筛选能在特异性表达Cre剪切酶的神经细胞中表达的质粒组合，进而设计出能在特定细胞类型神经细胞表达的Cre剪切酶依赖的稀疏高亮度标记病毒。首先筛选出适合的剪切酶表达质粒和剪切酶依赖的荧光蛋白表达质粒组合，根据目前常用的剪切酶表达系统，可筛选出具有代表性的剪切酶系统组合为：

1)Cre剪切酶依赖表达Flp剪切酶的质粒(AAV-EF1α-DIO-Flp质粒，来自武汉枢密脑科学技术有限公司)与Flp剪切酶依赖的荧光蛋白表达质粒 (AAV-EF1α-FDIO-EYFP质粒，来自武汉枢密脑科学技术有限公司)组合使用；

2)Flp剪切酶表达质粒(AAV-EF1α-Flp质粒，来自武汉枢密脑科学技术有限公司)与Cre剪切酶和Flp剪切酶双依赖的荧光蛋白表达质粒 (AAV-Syn-Con/Fon-EYFP质粒，Addgene编号：#55650)；

同理，在设计原理不变的情况下，也可筛选设计Flp剪切酶依赖的特定细胞类型神经细胞稀疏高亮度标记病毒，通过结合特定细胞类型神经细胞表达Flp剪切酶的转基因小鼠也可实现特定细胞类型神经细胞稀疏高亮度标记。

2、稀疏高亮度标记病毒包装：将步骤1中筛选出的两组代表性的质粒组合分别进行扩增，获得足够量的质粒。将扩增后的质粒以下述两种组合方式作为具体实施例预混合成核心质粒混合物：

1)Cre剪切酶依赖表达Flp剪切酶的质粒(AAV-EF1α-DIO-Flp质粒)与Flp 剪切酶依赖的荧光蛋白表达质粒(AAV-EF1α-FDIO-EYFP质粒)以一定的比例(1:20000)预混合成核心质粒混合物，该混合比例为预测试小鼠基底前脑区域获得的效果较好的比例。由于大脑不同脑区神经细胞数目和细胞类型的多样性，因此其它脑区该病毒对应的表达质粒混合的最佳比例范围在1:10³-1:10⁶；

2)Flp剪切酶表达质粒(AAV-EF1α-Flp质粒)与Cre剪切酶和Flp剪切酶双依赖的荧光蛋白表达质粒(AAV-Syn-Con/Fon-EYFP质粒)以一定的比例(1:20000) 预混合成核心质粒混合物，混合比例参考步骤1)；

本实施例中该单一rAAV病毒集合被包装成2/9型血清型。该病毒具体包装流程与前述非特定细胞类型特异性稀疏高亮度标记病毒包装步骤和所需病毒包装辅助原材料基本一致，只需将核心表达质粒混合物替换成上述用于特定细胞类型神经细胞稀疏高亮度标记的两种核心质粒混合物即可。其中，Flp剪切酶表达质粒与Cre剪切酶和Flp剪切酶双依赖的荧光蛋白表达质粒获得特异性稀疏高亮度标记病毒的包装过程如图13所示。同理，在该特异性稀疏高亮度标记病毒的制备过程中，Flp剪切酶表达质粒与Cre剪切酶和Flp剪切酶双依赖的荧光蛋白表达质粒组合可被替换成Cre剪切酶依赖表达Flp剪切酶的质粒与Flp剪切酶依赖的荧光蛋白表达质粒或者其它可能设计改造的剪切酶和剪切酶依赖的质粒组合，具体包装条件和质粒混合比例类似。

实施例3

一种用于非特定细胞类型神经细胞稀疏高亮度标记的rAAV病毒的应用，其步骤是：

1、非特定细胞类型神经细胞稀疏高亮度病毒活体标记

将实施例1中制备出的Cre剪切酶表达质粒(AAV-CMV-Cre质粒)与Cre 剪切酶依赖的荧光蛋白表达质粒(AAV-EF1α-DIO-EYFP质粒)分别以三种不同混合比例(1:20000，1:200000,1:1000000)共转染293T细胞而获得非特定细胞类型神经细胞稀疏高亮度标记病毒。将该病毒立体定位注射100nl至8周龄雄性 C57BL/6(购买自湖南斯莱克景达实验动物有限公司)小鼠大脑初级运动皮层 (M1)，待该病毒表达21天后灌流即可获得小鼠初级运动皮层(M1)的非特定细胞类型神经细胞稀疏高亮度活体标记结果。

2、非特定细胞类型神经细胞稀疏高亮度病毒活体标记结果的获取

通过激光扫描共聚焦显微镜(Leica SP8)对上述所获得的初级运动皮层(M1) 稀疏高亮度标记结果进行成像可获得以下数据：

1)小鼠初级运动皮层被标记神经细胞的数目与rAAV包装过程中的Cre剪切酶表达质粒和Cre剪切酶依赖的荧光蛋白表达质粒预先混合比例呈正相关(如图8所示)。

2)Cre剪切酶表达质粒和Cre剪切酶依赖的荧光蛋白表达质粒预先混合比例的变化只影响最终标记神经细胞的数目但不明显改变被标记神经细胞的亮度 (如图7所示)。其中两种质粒混合比例为1:200000的单一rAAV集合可以标记出初级运动皮层约60个左右且彼此分离较好的非特定细胞类型神经细胞。该病毒不仅可以将初级运动皮层(M1)神经细胞的局部轴树突纤维形态清晰高亮度的标记出来，还可以将这些神经细胞的长程轴突投射纤维完整地标记出来(如图 11所示)。

3)将上述Cre剪切酶表达质粒和Cre剪切酶依赖的荧光蛋白表达质粒以 1:200000比例预混合包装获得的非特定细胞类型神经细胞稀疏高亮度标记病毒感染小鼠大脑初级运动皮层的结果与两种分别包装的AAV-CMV-Cre病毒和 AAV-EF1α-DIO-EYFP病毒以特定的比例(1:20000,1:40000,1:80000)混合感染小鼠大脑初级运动皮层的结果对比可以发现，在相同感染条件下，前者标记神经细胞的亮度明显高于后者三种不同梯度病毒混合后感染的结果(如图9，图10所示)。

通过对上述稀疏高亮度标记的鼠脑样本使用fMOST全脑成像技术进行成像，可以获得被稀疏标记的神经细胞在全脑水平的数据，对其中单个神经细胞在全脑水平的形态进行三维重建，可以十分准确且完整地将单个神经细胞全脑水平的轴树突结构清晰地勾勒出来(如图12所示)。

实施例4

一种用于特定细胞类型神经细胞稀疏高亮度标记的rAAV病毒的应用，其步骤是：

1、特定细胞类型神经细胞稀疏高亮度病毒活体标记

将实施例2中制备出的Flp剪切酶表达质粒(AAV-EF1α-Flp质粒)与Cre 剪切酶和Flp剪切酶双依赖的荧光蛋白表达质粒(AAV-Syn-Con/Fon-EYFP质粒) 组合以1:20000比例共转染293T细胞获得特定细胞类型神经细胞稀疏高亮度标记病毒。将该病毒立体定位注射100nl至8周龄雄性Chat-Cre(胆碱能神经元表达Cre剪切酶)转基因小鼠基底前脑区域，该病毒表达21天后灌流即可获得注射部位数量十分稀少且彼此分离的特定细胞类型神经细胞的超高亮度标记。

2、特定细胞类型神经细胞稀疏高亮度病毒活体标记结果的获取

通过激光扫描共聚焦显微镜(Leica SP8)对上述获得的稀疏高亮度标记样本进行成像，可以获得被标记神经细胞的局部轴树突纤维高分辨率的形态特征(图 14，c和d)以及全脑范围内的长程轴突投射纤维(如图15所示)，胆碱乙酰转移酶抗体免疫组化结果表明被标记神经元为胆碱乙酰转移酶阳性(图14，a和b)，表明该rAAV病毒可以稀疏高亮度标记基底前脑胆碱能神经元的全脑形态。

使用fMOST全脑成像技术对上述获得的稀疏高亮度标记的鼠脑样本进行全脑成像，获得稀疏标记的基底前脑胆碱能神经元在全脑水平的数据。通过对其中的单个胆碱能神经元在全脑水平进行三维重建，可以十分准确且完整地将单个胆碱能神经元的三维形态清晰地勾勒出来(如图16所示)。表明该rAAV病毒标记方法以及进一步的全脑切片成像重建方法可以帮助人们更准确地追踪出单个特定细胞类型神经细胞的完整形态。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，是对本发明的进一步说明，并不用以限制本发明，凡在本发明的原理和精神之内所作的任何等同替换、修饰和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

参考文献

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14.Karimova,M.,et al.,A single reporter mouse line for Vika,Flp,Dre,and Cre-recombination. Sci Rep,2018.8(1):p.14453。

Claims (4)

1.一种神经细胞稀疏高亮度标记的方法，其特征在于，预先将表达剪切酶的核心表达质粒和对应的剪切酶依赖的荧光表达蛋白质粒按摩尔数比1:10³-1:10⁶ 混合成核心表达质粒混合物，然后与重组腺相关病毒辅助包装质粒共同转染包装细胞后，经过纯化获得单一重组腺相关病毒集合，并将其用于神经细胞稀疏高亮标记；表达剪切酶的核心表达质粒选自Cre剪切酶表达质粒或Flp剪切酶表达质粒，或两者的组合。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述重组腺相关病毒的血清型选自2/9 、2/1、2/2、2/5、2/6、2/8或2/DJ血清型。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的神经细胞包括大脑神经细胞、外周神经元以及神经胶质细胞。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述重组腺相关病毒集合的应用对象包括小鼠、斑马鱼、大鼠、豚鼠、雪貂、树鼩，以及非人灵长类动物。

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