JP2022525477A - 細胞型特異的調節エレメントを同定するための調節エレメントの多重化 - Google Patents
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Abstract
目的の特定の細胞型において選択的発現を提供する調節エレメントをスクリーニングおよび同定するためのハイスループット方法が、本明細書で提供される。ハイスループットスクリーニング方法において使用される核酸組成物もまた提供される。本開示は、細胞の特定の集団において導入遺伝子の生理学的または治療的に適切なレベルの発現を達成する調節エレメントを同定するために、多数の(例えば、10~104個の)調節エレメントをスクリーニングする方法を提供する。
Description
本出願は、参照により本明細書に組み込まれる、2019年3月22日出願の米国仮特許出願第62/822,528号に基づく優先権の利益を主張する。
開示の背景
近年、疾患の処置のために遺伝子治療を利用する臨床試験の数は、着実に増加している。これらの臨床試験が直面してきた主要な課題の1つは、治療有効性と治療的タンパク質またはRNA干渉に基づく配列の過剰発現に起因する非特異的毒性との間のバランスを提供するために、治療的遺伝子の発現またはサイレンシングのレベルを制御する能力である。具体的には、治療的に適切な用量を達成するために要求される導入遺伝子発現のレベルは、特定の疾患の固有の病態生理学および導入遺伝子産物の性質(例えば、細胞内 対 細胞外、構造的機能 対 酵素的機能)に基づいて変動する。さらに、導入遺伝子の細胞特異的発現は、病理学的に適切な細胞型(例えば、がん細胞)を選択的に標的化する能力を提供し、患者における有害事象の可能性を低減させるので、高度に望ましい。したがって、オフターゲット(off-target)効果を減少させることができ、標的組織および/または細胞型における治療有効性を増加させることができ、有効性を達成するために必要とされる有効用量を下降させることによって、患者の安全性および耐容能を増加させることができる、遺伝子治療または遺伝子発現を目的の組織または細胞型に標的化するための調節エレメントおよびその使用の方法を同定することが必要である。
近年、疾患の処置のために遺伝子治療を利用する臨床試験の数は、着実に増加している。これらの臨床試験が直面してきた主要な課題の1つは、治療有効性と治療的タンパク質またはRNA干渉に基づく配列の過剰発現に起因する非特異的毒性との間のバランスを提供するために、治療的遺伝子の発現またはサイレンシングのレベルを制御する能力である。具体的には、治療的に適切な用量を達成するために要求される導入遺伝子発現のレベルは、特定の疾患の固有の病態生理学および導入遺伝子産物の性質(例えば、細胞内 対 細胞外、構造的機能 対 酵素的機能)に基づいて変動する。さらに、導入遺伝子の細胞特異的発現は、病理学的に適切な細胞型(例えば、がん細胞)を選択的に標的化する能力を提供し、患者における有害事象の可能性を低減させるので、高度に望ましい。したがって、オフターゲット(off-target)効果を減少させることができ、標的組織および/または細胞型における治療有効性を増加させることができ、有効性を達成するために必要とされる有効用量を下降させることによって、患者の安全性および耐容能を増加させることができる、遺伝子治療または遺伝子発現を目的の組織または細胞型に標的化するための調節エレメントおよびその使用の方法を同定することが必要である。
一部の実施形態では、本開示は、所与の細胞型において選択的発現を提供する調節エレメントを同定する方法であって、a)細胞に、導入遺伝子に作動可能に連結した候補調節エレメントを各々が含むベクターの混合物を提供するステップであって、各ベクターは、バーコードをさらに含む、ステップ;b)導入遺伝子を発現する複数の単一細胞からRNAを単離するステップ;c)単一細胞の各々のトランスクリプトームを配列決定することによって、単一細胞の各々を同定するステップ;およびd)トランスクリプトーム中のバーコードを候補調節エレメントと相関させるステップを含み、それにより、細胞型において選択的発現を提供する調節エレメントを同定する、方法を提供する。一部の実施形態では、調節エレメントは、細胞型における導入遺伝子の発現を選択的に増加させる。一部の実施形態では、調節エレメントは、同じ細胞型において別の候補調節および/または対照調節エレメントによって駆動される発現と比較して、少なくとも2倍、少なくとも4倍、少なくとも6倍、少なくとも8倍もしくは少なくとも10倍大きい、または多くても2分の1、多くても4分の1、多くても6分の1、多くても8分の1もしくは多くても10分の1の、導入遺伝子の選択的発現を提供する。一部の実施形態では、調節エレメントは、同じ細胞型において別の候補調節エレメントおよび/または対照調節エレメントによって駆動される発現と比較して、少なくとも2%、少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%または少なくとも95%大きいまたは小さい、導入遺伝子の選択的発現を提供する。一部の実施形態では、調節エレメントは、同じ細胞型において別の候補調節エレメントおよび/または対照調節エレメントによって駆動される発現と比較して、約1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、7.5倍、8倍、9倍もしくは10倍大きい、または約1.5分の1、2分の1、3分の1、4分の1、5分の1、6分の1、7分の1、7.5分の1、8分の1、9分の1もしくは10分の1の、導入遺伝子の選択的発現を提供する。一部の実施形態では、調節エレメントは、異なる細胞型における同じ調節エレメント由来の導入遺伝子の発現と比較して、少なくとも2倍、少なくとも4倍、少なくとも6倍、少なくとも8倍もしくは少なくとも10倍大きい、または多くても2分の1、多くても4分の1、多くても6分の1、多くても8分の1もしくは多くても10分の1の、導入遺伝子の選択的発現を提供する。一部の実施形態では、調節エレメントは、異なる細胞型における同じ調節エレメント由来の導入遺伝子の発現と比較して、少なくとも2%、少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%または少なくとも95%大きいまたは小さい、導入遺伝子の選択的発現を提供する。一部の実施形態では、調節エレメントは、異なる細胞型における同じ調節エレメント由来の導入遺伝子の発現と比較して、約1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、7.5倍、8倍、9倍もしくは10倍大きい、または約1.5分の1、2分の1、3分の1、4分の1、5分の1、6分の1、7分の1、7.5分の1、8分の1、9分の1もしくは10分の1の、導入遺伝子の選択的発現を提供する。一部の実施形態では、調節エレメントは、少なくとも1つの他の細胞型を超える、1つの細胞型における導入遺伝子の選択的発現を提供する。一部の実施形態では、調節エレメントは、興奮性ニューロンと比較して、GABA作動性ニューロンにおいて導入遺伝子の選択的発現を提供する。他の実施形態では、調節エレメントは、GABA作動性ニューロンサブタイプ、例えば、グルタミン酸デカルボキシラーゼ2(GAD2)、GAD1、NKX2.1、DLX1、DLX5、SST、PVまたはVIPを発現するGABA作動性ニューロンにおいて導入遺伝子の選択的発現を提供する。他の実施形態では、調節エレメントは、非PVニューロンと比較して、パルブアルブミン(PV)ニューロンにおいて導入遺伝子の選択的発現を提供する。一部の実施形態では、非PVニューロンは、興奮性ニューロン、ドパミン作動性ニューロン、アストロサイト、ミクログリアまたは運動ニューロンのうち1つまたは複数である。一部の実施形態では、調節エレメントは、異なるGABA作動性ニューロンサブタイプにおける同じ調節エレメントからの導入遺伝子の発現と比較して、少なくとも2%、少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%または少なくとも95%大きいまたは小さい、導入遺伝子の選択的発現を提供する。一部の実施形態では、調節エレメントは、異なるGABA作動性ニューロンサブタイプにおける同じ調節エレメントからの導入遺伝子の発現と比較して、約1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、7.5倍、8倍、9倍もしくは10倍大きい、または約1.5分の1、2分の1、3分の1、4分の1、5分の1、6分の1、7分の1、7.5分の1、8分の1、9分の1もしくは10分の1の、導入遺伝子の選択的発現を提供する。
一部の実施形態では、本開示は、細胞型または細胞サブタイプにおいて導入遺伝子の選択的発現を提供する調節エレメントを同定する方法であって、a)細胞に、導入遺伝子に作動可能に連結した候補調節エレメントを各々が含むベクターの混合物を提供するステップであって、各ベクターは、バーコードをさらに含む、ステップ;b)導入遺伝子を発現する複数の単一細胞からRNAを単離するステップ;c)単一細胞の各々のトランスクリプトームを配列決定することによって、単一細胞の各々を同定するステップ;d)トランスクリプトーム中のバーコードを候補調節エレメントと相関させるステップ;およびe)各候補調節エレメントによって提供される導入遺伝子の発現レベルを、導入遺伝子の参照発現レベルと比較するステップを含み、それにより、細胞型において導入遺伝子の選択的発現を提供する候補調節エレメントを同定する、方法を提供する。一部の実施形態では、調節エレメントは、細胞型における導入遺伝子の発現を選択的に増加または減少させる。一部の実施形態では、導入遺伝子の参照発現レベルは、対照調節エレメントによって提供される。一部の実施形態では、調節エレメントは、同じ細胞型において別の候補調節エレメントおよび/または対照調節エレメントによって駆動される発現と比較して、少なくとも2倍、少なくとも4倍、少なくとも6倍、少なくとも8倍もしくは少なくとも10倍大きい、または多くても2分の1、多くても4分の1、多くても6分の1、多くても8分の1もしくは多くても10分の1の、導入遺伝子の選択的発現を提供する。一部の実施形態では、調節エレメントは、同じ細胞型において別の候補調節エレメントおよび/または対照調節エレメントによって駆動される発現と比較して、少なくとも2%、少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%または少なくとも95%大きいまたは小さい、導入遺伝子の選択的発現を提供する。一部の実施形態では、調節エレメントは、同じ細胞型において別の候補調節エレメントおよび/または対照調節エレメントによって駆動される発現と比較して、約1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、7.5倍、8倍、9倍もしくは10倍大きい、または約1.5分の1、2分の1、3分の1、4分の1、5分の1、6分の1、7分の1、7.5分の1、8分の1、9分の1もしくは10分の1の、導入遺伝子の選択的発現を提供する。一部の実施形態では、導入遺伝子の参照発現レベルは、汎細胞調節エレメントによって提供される。一部の実施形態では、汎細胞調節エレメントは、サイトメガロウイルス主要最初期プロモーター(CMV)、ニワトリβ-アクチンプロモーター(CBA)、CMV初期エンハンサー/CBAプロモーター(CAG)、伸長因子-1αプロモーター(EF1α)、サルウイルス40プロモーター(SV40)、ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター(PGK)およびポリユビキチンC遺伝子プロモーター(UBC)からなる群から選択される。一部の実施形態では、調節エレメントは、同じ細胞型において汎細胞調節エレメントによって駆動される発現と比較して、少なくとも2倍、少なくとも4倍、少なくとも6倍、少なくとも8倍もしくは少なくとも10倍大きい、または多くても2分の1、多くても4分の1、多くても6分の1、多くても8分の1もしくは多くても10分の1の、導入遺伝子の選択的発現を提供する。一部の実施形態では、調節エレメントは、同じ細胞型において汎細胞調節エレメントによって駆動される発現と比較して、少なくとも2%、少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%または少なくとも95%大きいまたは小さい、導入遺伝子の選択的発現を提供する。一部の実施形態では、調節エレメントは、同じ細胞型において汎細胞調節エレメントによって駆動される発現と比較して、約1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、7.5倍、8倍、9倍もしくは10倍大きい、または約1.5分の1、2分の1、3分の1、4分の1、5分の1、6分の1、7分の1、7.5分の1、8分の1、9分の1もしくは10分の1の、導入遺伝子の選択的発現を提供する。一部の実施形態では、調節エレメントは、少なくとも1つの他の細胞型を超える、1つの細胞型における導入遺伝子の選択的発現を提供する。一部の実施形態では、調節エレメントは、非PVニューロンと比較して、PVニューロンにおける導入遺伝子の選択的発現を生じる。一部の実施形態では、非PVニューロンは、興奮性ニューロン、ドパミン作動性ニューロン、アストロサイト、ミクログリアまたは運動ニューロンのうち1つまたは複数である。
一部の実施形態では、本開示は、細胞型または細胞サブタイプにおいて導入遺伝子の選択的発現を提供する調節エレメントを同定する方法であって、a)細胞に、導入遺伝子に作動可能に連結した候補調節エレメントを各々が含むベクターの混合物を提供するステップであって、各ベクターは、バーコードをさらに含む、ステップ;b)導入遺伝子を発現する複数の単一細胞からRNAを単離するステップ;c)単一細胞の各々のトランスクリプトームを配列決定することによって、単一細胞の各々を同定するステップ;d)トランスクリプトーム中のバーコードを候補調節エレメントと相関させるステップ;およびe)各候補調節エレメントによって提供される導入遺伝子の発現レベルを、導入遺伝子の参照発現レベルと比較するステップを含み、それにより、細胞型において導入遺伝子の選択的発現を提供する候補調節エレメントを同定する、方法を提供する。一部の実施形態では、調節エレメントは、細胞型における導入遺伝子の発現を選択的に増加または減少させる。一部の実施形態では、導入遺伝子の参照発現レベルは、対照調節エレメントによって提供される。一部の実施形態では、調節エレメントは、同じ細胞型において別の候補調節エレメントおよび/または対照調節エレメントによって駆動される発現と比較して、少なくとも2倍、少なくとも4倍、少なくとも6倍、少なくとも8倍もしくは少なくとも10倍大きい、または多くても2分の1、多くても4分の1、多くても6分の1、多くても8分の1もしくは多くても10分の1の、導入遺伝子の選択的発現を提供する。一部の実施形態では、調節エレメントは、同じ細胞型において別の候補調節エレメントおよび/または対照調節エレメントによって駆動される発現と比較して、少なくとも2%、少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%または少なくとも95%大きいまたは小さい、導入遺伝子の選択的発現を提供する。一部の実施形態では、調節エレメントは、同じ細胞型において別の候補調節エレメントおよび/または対照調節エレメントによって駆動される発現と比較して、約1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、7.5倍、8倍、9倍もしくは10倍大きい、または約1.5分の1、2分の1、3分の1、4分の1、5分の1、6分の1、7分の1、7.5分の1、8分の1、9分の1もしくは10分の1の、導入遺伝子の選択的発現を提供する。一部の実施形態では、導入遺伝子の参照発現レベルは、汎細胞調節エレメントによって提供される。一部の実施形態では、汎細胞調節エレメントは、サイトメガロウイルス主要最初期プロモーター(CMV)、ニワトリβ-アクチンプロモーター(CBA)、CMV初期エンハンサー/CBAプロモーター(CAG)、伸長因子-1αプロモーター(EF1α)、サルウイルス40プロモーター(SV40)、ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター(PGK)およびポリユビキチンC遺伝子プロモーター(UBC)からなる群から選択される。一部の実施形態では、調節エレメントは、同じ細胞型において汎細胞調節エレメントによって駆動される発現と比較して、少なくとも2倍、少なくとも4倍、少なくとも6倍、少なくとも8倍もしくは少なくとも10倍大きい、または多くても2分の1、多くても4分の1、多くても6分の1、多くても8分の1もしくは多くても10分の1の、導入遺伝子の選択的発現を提供する。一部の実施形態では、調節エレメントは、同じ細胞型において汎細胞調節エレメントによって駆動される発現と比較して、少なくとも2%、少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%または少なくとも95%大きいまたは小さい、導入遺伝子の選択的発現を提供する。一部の実施形態では、調節エレメントは、同じ細胞型において汎細胞調節エレメントによって駆動される発現と比較して、約1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、7.5倍、8倍、9倍もしくは10倍大きい、または約1.5分の1、2分の1、3分の1、4分の1、5分の1、6分の1、7分の1、7.5分の1、8分の1、9分の1もしくは10分の1の、導入遺伝子の選択的発現を提供する。一部の実施形態では、調節エレメントは、少なくとも1つの他の細胞型を超える、1つの細胞型における導入遺伝子の選択的発現を提供する。一部の実施形態では、調節エレメントは、非PVニューロンと比較して、PVニューロンにおける導入遺伝子の選択的発現を生じる。一部の実施形態では、非PVニューロンは、興奮性ニューロン、ドパミン作動性ニューロン、アストロサイト、ミクログリアまたは運動ニューロンのうち1つまたは複数である。
一部の実施形態では、本開示は、調節エレメントに作動可能に連結した導入遺伝子を選択的に発現する細胞型を同定する方法であって、a)細胞に、導入遺伝子に作動可能に連結した候補調節エレメントを各々が含むベクターの混合物を提供するステップであって、各ベクターは、バーコードをさらに含む、ステップ;b)導入遺伝子を発現する複数の単一細胞からRNAを単離するステップ;c)単一細胞の各々のトランスクリプトームを配列決定することによって、単一細胞の各々を同定するステップ;d)トランスクリプトーム中のバーコードを候補調節エレメントと相関させるステップ;およびe)1つの細胞型において候補調節エレメントによって提供される導入遺伝子の発現レベルを、異なる細胞型における同じ候補調節エレメントの発現レベルと比較するステップを含み、それにより、調節エレメントに作動可能に連結した導入遺伝子を選択的に発現する細胞型を同定する、方法を提供する。一部の実施形態では、調節エレメントは、少なくとも1つの他の細胞型と比較して、1つの細胞型における導入遺伝子の発現を選択的に増加または減少させる。一部の実施形態では、調節エレメントは、少なくとも1つの細胞型において候補調節エレメントによって駆動される発現と比較して、少なくとも2倍、少なくとも4倍、少なくとも6倍、少なくとも8倍もしくは少なくとも10倍大きい、または多くても2分の1、多くても4分の1、多くても6分の1、多くても8分の1もしくは多くても10分の1の、1つの細胞型における導入遺伝子の選択的発現を提供する。一部の実施形態では、調節エレメントは、少なくとも1つの細胞型において候補調節エレメントによって駆動される発現と比較して、少なくとも2%、少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%または少なくとも95%大きいまたは小さい、1つの細胞型における導入遺伝子の選択的発現を提供する。一部の実施形態では、調節エレメントは、少なくとも1つの細胞型において候補調節エレメントによって駆動される発現と比較して、約1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、7.5倍、8倍、9倍もしくは10倍大きい、または約1.5分の1、2分の1、3分の1、4分の1、5分の1、6分の1、7分の1、7.5分の1、8分の1、9分の1もしくは10分の1の、1つの細胞型における導入遺伝子の選択的発現を提供する。一部の実施形態では、調節エレメントは、非PVニューロンと比較して、PVニューロンにおける導入遺伝子の選択的発現を生じる。一部の実施形態では、非PVニューロンは、興奮性ニューロン、ドパミン作動性ニューロン、アストロサイト、ミクログリアまたは運動ニューロンのうち1つまたは複数である。
容易に理解できるように、目的の細胞または細胞型において調節エレメントによって駆動される発現の選択性は、いくつかの方法で測定することができる。例えば、非標的細胞型を超える標的細胞型における遺伝子発現の選択性は、1つまたは複数の調節エレメントに作動可能に連結した遺伝子から検出可能なレベルの転写物を発現する標的細胞の数を、その遺伝子を発現する細胞の総数と比較することによって測定することができる。かかる測定、検出および定量は、in vivoまたはin vitroのいずれかで実施され得る。
一部の例では、特定の細胞型に対する選択性は、共局在化アッセイを使用して決定することができる。一部の場合には、共局在化アッセイは、免疫組織化学に基づく。一部の場合には、検出可能なレポーター遺伝子が、目的の細胞型における遺伝子発現の検出および/または測定を可能にするための導入遺伝子として使用される。一部の場合には、検出可能なマーカー、例えば、標的細胞を特異的に標識する蛍光マーカーまたは抗体が、標的細胞を検出および/または測定するために使用される。一部の場合には、共局在化アッセイは、異なる蛍光標識間の重複、例えば、標的細胞を示す蛍光シグナルと遺伝子発現を示す別の蛍光シグナルとの間の重複を決定するために、イメージング、例えば、蛍光イメージングを使用する。一部の場合には、共局在化アッセイに使用される蛍光標識には、赤色蛍光タンパク質(RFP)、例えば、tdTomatoレポーター遺伝子、および緑色蛍光レポータータンパク質、例えば、eGFPが含まれる。
一部の実施形態では、細胞型における調節エレメントの選択性は、免疫組織化学に基づく共局在化アッセイによって決定され得る。一部の実施形態では、このアッセイは、a)導入遺伝子発現を測定するための、調節エレメントに作動可能に連結した導入遺伝子としての検出可能なレポーター遺伝子、およびb)標的細胞型に特異的なマーカーを同定する結合剤であって、検出可能な標識に連結した、結合剤を使用することを含む。一部の実施形態では、細胞型に対する選択性は、a)導入遺伝子発現を測定するための、調節エレメントに作動可能に連結した導入遺伝子、およびb)第2の蛍光標識に連結された、目的の細胞型を同定する抗体を使用する免疫組織化学に基づく共局在化アッセイを使用して、決定または検証され得る。
一部の実施形態では、本開示は、所与の細胞型において選択的発現を提供する調節エレメントを同定する方法であって、a)細胞に、導入遺伝子に作動可能に連結した候補調節エレメントを各々が含むベクターの混合物を提供するステップであって、各ベクターは、バーコードをさらに含む、ステップ;b)導入遺伝子を発現する複数の単一細胞からRNAを単離するステップ;c)単一細胞の各々のトランスクリプトームを配列決定することによって、単一細胞の各々を同定するステップ;およびd)トランスクリプトーム中のバーコードを候補調節エレメントと相関させるステップを含み、それにより、細胞型において選択的発現を提供する調節エレメントを同定する、方法を提供する。単一核RNAseqにおける検出の閾値を下回るAAV構築物の検出を増加させるために、富化PCRステップを増幅前に実施した。一部の実施形態では、PCR富化ステップは、単一細胞の各々のトランスクリプトームを配列決定することによって、単一細胞の各々を同定する前に実施される。一部の実施形態では、PCR富化ステップは、AAV構築物からのシグナルの少なくとも1~50倍、少なくとも2~25倍または少なくとも3~10倍の増幅を生じる。
本明細書に開示される方法のいずれかの一部の実施形態では、RNAは、mRNA、長い非コードRNA、アンチセンス転写物およびpri-miRNAからなる群から選択される。本明細書に開示される方法のいずれかの一部の実施形態では、ベクターは、プラスミド、ウイルスベクターまたはコスミドからなる群から選択される。本明細書に開示される方法のいずれかの一部の実施形態では、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターである。本明細書に開示される方法のいずれかの一部の実施形態では、AAVベクターは、AAV1、AAV8、AAV9、scAAV1、scAAV8またはscAAV9である。本明細書に開示される方法のいずれかの一部の実施形態では、AAVベクターはAAV9である。本明細書に開示される方法のいずれかの一部の実施形態では、ベクターは、5’AAV逆位末端反復(ITR)配列および3’AAV ITR配列を含む。本明細書に開示される方法のいずれかの一部の実施形態では、ベクターの混合物は、少なくとも104個の候補調節エレメントを含む。本明細書に開示される方法のいずれかの一部の実施形態では、各候補調節エレメントは、少なくとも1つの独自のバーコードと相関する。本明細書に開示される方法のいずれかの一部の実施形態では、導入遺伝子は、レポーター遺伝子配列を含む。本明細書に開示される方法のいずれかの一部の実施形態では、レポーター遺伝子配列は、核結合ドメインをコードする配列に作動可能に連結されている。本明細書に開示される方法のいずれかの一部の実施形態では、導入遺伝子は、バーコードを含む。本明細書に開示される方法のいずれかの一部の実施形態では、レポーター遺伝子配列は、バーコードを含む。本明細書に開示される方法のいずれかの一部の実施形態では、バーコードは、代替コドンを含む。本明細書に開示される方法のいずれかの一部の実施形態では、核結合ドメインをコードする配列は、バーコードを含む。本明細書に開示される方法のいずれかの一部の実施形態では、核結合ドメインをコードする配列は、Klarsicht/ANC-1/Syne相同性(KASH)ドメインもしくはSad1p/UNC-84(SUN)ドメインタンパク質、またはそれらの生物学的に活性な断片をコードする。本明細書に開示される方法のいずれかの一部の実施形態では、細胞型は、結合組織、筋肉組織、神経組織および上皮組織からなる群から選択される組織に属する。
一部の実施形態では、本開示は、導入遺伝子に作動可能に連結した調節エレメントを含む核酸分子であって、バーコードを含む、核酸分子を提供する。一部の実施形態では、バーコードは、代替コドンを含む。一部の実施形態では、導入遺伝子は、レポーター遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、レポーター遺伝子配列は、核結合ドメイン配列をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、核結合ドメイン配列は、KASHドメインもしくはSUNドメインタンパク質、またはそれらの生物学的に活性な断片をコードする。一部の実施形態では、調節エレメントは、天然に存在しないものである。一部の実施形態では、レポーター遺伝子配列は、蛍光タンパク質をコードする。一部の実施形態では、蛍光タンパク質は、緑色蛍光タンパク質(GFP)、高感度緑色蛍光タンパク質(EGFP)、黄色蛍光タンパク質(YFP)、例えば、mBanana、赤色蛍光タンパク質(RFP)、例えば、mCherry、DsRed、dTomato、tdTomato、mHoneydewもしくはmStrawberry、TagRFP、遠赤色蛍光パミドロネート(FRFP)、例えば、mGrape1もしくはmGrape2、シアン蛍光タンパク質(CFP)、青色蛍光タンパク質(BFP)、高感度シアン蛍光タンパク質(ECFP)、ウルトラマリン蛍光タンパク質(UMFP)、橙色蛍光タンパク質(OFP)、例えば、mOrangeもしくはmTangerine、赤色(橙色)蛍光タンパク質(mROFP)、TagCFP、またはテトラシステイン蛍光モチーフである。一部の実施形態では、導入遺伝子は、バーコードを含む。一部の実施形態では、核結合ドメインをコードする配列は、バーコードを含む。一部の実施形態では、レポーター遺伝子配列は、バーコードを含む。一部の実施形態では、バーコードは、導入遺伝子のコード領域内に配置されている。一部の実施形態では、核酸分子は、非コード領域を含み、バーコードは、導入遺伝子の非コード領域内に配置されている。一部の実施形態では、核酸分子は、非翻訳領域(UTR)を含み、バーコードは、UTR内に配置されている。一部の実施形態では、バーコード配列は、核酸中のポリAテイルの開始点から約25、30、35、50、100、150、200、250、300、350、400、450または500塩基以内に位置する。他の実施形態では、核酸は、ポリA配列を含み、バーコードは、ポリA配列の少なくとも35塩基上流に配置されている。一部の実施形態では、バーコードは、転写開始部位の上流に配置されている。
一部の実施形態では、本開示は、DNA分子から転写されたRNA分子である核酸分子であって、RNA分子は、導入遺伝子およびバーコード配列を含み、DNA分子は、調節エレメントを含み、RNA分子中のバーコード配列は、DNA分子中の調節エレメントと相関する、核酸分子を提供する。一部の実施形態では、導入遺伝子は、レポーター遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、レポーター遺伝子配列は、核結合ドメインをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、核結合ドメインは、KASHドメインもしくはSUNドメインタンパク質、またはそれらの生物学的に活性な断片である。一部の実施形態では、調節エレメントは、天然に存在しないものである。一部の実施形態では、レポーター遺伝子配列は、蛍光タンパク質をコードする。一部の実施形態では、蛍光タンパク質は、緑色蛍光タンパク質(GFP)、高感度緑色蛍光タンパク質(EGFP)、黄色蛍光タンパク質(YFP)、例えば、mBanana、赤色蛍光タンパク質(RFP)、例えば、mCherry、DsRed、dTomato、tdTomato、mHoneydewもしくはmStrawberry、TagRFP、遠赤色蛍光パミドロネート(FRFP)、例えば、mGrape1もしくはmGrape2、シアン蛍光タンパク質(CFP)、青色蛍光タンパク質(BFP)、高感度シアン蛍光タンパク質(ECFP)、ウルトラマリン蛍光タンパク質(UMFP)、橙色蛍光タンパク質(OFP)、例えば、mOrangeもしくはmTangerine、赤色(橙色)蛍光タンパク質(mROFP)、TagCFP、またはテトラシステイン蛍光モチーフである。一部の実施形態では、導入遺伝子は、バーコードを含む。一部の実施形態では、核結合ドメインをコードする配列は、バーコードを含む。一部の実施形態では、レポーター遺伝子配列は、バーコードを含む。一部の実施形態では、バーコードは、代替コドンを含む。一部の実施形態では、核酸分子は、非翻訳領域(UTR)を含み、バーコードは、UTR内に配置されている。一部の実施形態では、核酸分子は、ポリA配列を含み、バーコードは、ポリA配列の少なくとも30~50塩基上流に配置されている。一部の実施形態では、微粒子に接続されている。一部の実施形態では、微粒子はビーズである。一部の実施形態では、微粒子は、微粒子ポリヌクレオチド分子に接続されている。一部の実施形態では、微粒子ポリヌクレオチド分子を介して微粒子に接続されている。一部の実施形態では、微粒子ポリヌクレオチド分子は、プライマー配列を含む。一部の実施形態では、微粒子ポリヌクレオチド分子は、細胞バーコード配列を含む。一部の実施形態では、微粒子ポリヌクレオチド分子は、Unique Molecular Identifier(UMI)ヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、微粒子ポリヌクレオチド分子は、オリゴ-dT配列を含む。一部の実施形態では、微粒子ポリヌクレオチド分子は、a)プライマー配列、b)細胞バーコード配列、c)Unique Molecular Identifier(UMI)ヌクレオチド配列、およびd)オリゴ-dT配列を含み;核酸は、ポリAヌクレオチド配列を含み、微粒子は、以下の順序:微粒子--a)--b)--c)--d)でa)~d)に接続され;ポリAヌクレオチド配列は、オリゴ-dT配列にハイブリダイズされている。一部の実施形態では、微粒子はビーズである。
一部の実施形態では、本開示は、本明細書に開示される核酸のいずれかを含むベクターを提供する。一部の実施形態では、ベクターはウイルスベクターである。一部の実施形態では、ベクターはアデノ随伴ウイルスベクターである。一部の実施形態では、アデノ随伴ウイルスベクターは、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、rh10、およびそれらのハイブリッド、トリAAV、ウシAAV、イヌAAV、ウマAAV、霊長類AAV、非霊長類AAVまたはヒツジAAVのいずれか1つである。一部の実施形態では、アデノ随伴ウイルスベクターは、AAV9ベクターである。
一部の実施形態では、本開示は、本明細書で開示される核酸のいずれかを含む細胞を提供する。
一部の実施形態では、本開示は、本明細書で開示されるベクターのいずれかを含む細胞を提供する。
一部の実施形態では、本明細書に開示される核酸のいずれかのうち1つまたは複数に接続された微粒子を提供する。一部の実施形態では、微粒子はビーズである。一部の実施形態では、微粒子は、微粒子ポリヌクレオチド分子に接続されている。一部の実施形態では、微粒子ポリヌクレオチド分子は、プライマー配列を含む。一部の実施形態では、微粒子ポリヌクレオチド分子は、Unique Molecular Identifier(UMI)を含む。一部の実施形態では、微粒子ポリヌクレオチド分子は、オリゴ-dT配列を含む。一部の実施形態では、核酸は、ポリAヌクレオチド配列を含み、ポリAヌクレオチド配列は、オリゴ-dT配列にハイブリダイズされている。一部の実施形態では、微粒子ポリヌクレオチド分子は、a)プライマー配列、b)細胞バーコード配列、c)Unique Molecular Identifier(UMI)配列、およびd)オリゴ-dT配列を含み;核酸は、ポリAヌクレオチド配列を含み、微粒子は、以下の順序:微粒子--a)--b)--c)--d)でa)~d)に接続され;ポリAヌクレオチド配列は、オリゴ-dT配列にハイブリダイズされている。一部の実施形態では、微粒子はビーズである。
一部の実施形態では、本開示は、本明細書で開示される核酸分子のいずれかを含む液滴を提供する。
一部の実施形態では、本開示は、本明細書で開示される細胞のいずれかを含む液滴を提供する。
一部の実施形態では、本開示は、本明細書で開示される微粒子のいずれかを含む液滴を提供する。
一部の実施形態では、本開示は、本明細書で開示される細胞のいずれかおよび本明細書で開示される微粒子のいずれかを含む液滴を提供する。
本発明の新規の特徴は、特に添付の特許請求の範囲に記載される。本発明の特徴および利点のより良い理解は、本発明の原理が活用されている例示的な実施形態について記載している以下の詳細な説明、および添付の図面を参照することによって得られる。
開示の詳細な説明
遺伝子治療における1つの課題は、オフターゲット効果なしにまたは最小のオフターゲット効果を伴って遺伝子発現をもたらすまたは標的化するために、目的の導入遺伝子が、目的の適切な細胞型、または標的細胞型において発現されることを確実にすることである。標的化遺伝子治療のための従来の方法は、送達方法および/またはビヒクル(例えば、使用されるウイルスまたはウイルスのカプシド配列を変動させる)に依存する場合が多かった。多くのベクターは、導入遺伝子サイズについて限定的な容量を有するので、導入遺伝子の送達が関与する治療方法は、いくつかの課題、例えば、導入遺伝子のサイズにおける制限もまた有する。例えば、AAVベクターは、およそ4.7kbの最大容量を有し、2つの逆位末端反復(ITR)は、合計で約0.2~0.3kbであり、導入遺伝子と導入遺伝子の発現を制御する調節エレメントとの両方を収容すべきおよそ4.4kbが残る。
遺伝子治療における1つの課題は、オフターゲット効果なしにまたは最小のオフターゲット効果を伴って遺伝子発現をもたらすまたは標的化するために、目的の導入遺伝子が、目的の適切な細胞型、または標的細胞型において発現されることを確実にすることである。標的化遺伝子治療のための従来の方法は、送達方法および/またはビヒクル(例えば、使用されるウイルスまたはウイルスのカプシド配列を変動させる)に依存する場合が多かった。多くのベクターは、導入遺伝子サイズについて限定的な容量を有するので、導入遺伝子の送達が関与する治療方法は、いくつかの課題、例えば、導入遺伝子のサイズにおける制限もまた有する。例えば、AAVベクターは、およそ4.7kbの最大容量を有し、2つの逆位末端反復(ITR)は、合計で約0.2~0.3kbであり、導入遺伝子と導入遺伝子の発現を制御する調節エレメントとの両方を収容すべきおよそ4.4kbが残る。
本開示は、目的の細胞型において目的の遺伝子(導入遺伝子)の選択的発現を提供する調節エレメントを同定するための、調節エレメントをスクリーニングする組成物および方法を提供する。特に、本開示は、細胞の特定の集団において導入遺伝子の生理学的または治療的に適切なレベルの発現を達成する調節エレメントを同定するために、多数の(例えば、10~104個の)調節エレメントをスクリーニングする方法(例えば、in vivoまたはin vitro)を提供する。一部の実施形態では、本開示は、数千の候補調節エレメントの中から、目的の細胞型において目的の導入遺伝子の選択的発現を提供する調節エレメントを同定するためのハイスループットシステムを提供する(それにより、治療設定において導入遺伝子の発現を駆動するために使用される場合のオフターゲット効果を有効に最小化または排除する)。本開示は、どの細胞型が目的の調節エレメントを使用して導入遺伝子を発現させるためにより適しているか(またはより選択的であるか)を同定するためにも使用することができる。すなわち、本発明の方法を使用して、所与の調節エレメントが、目的の任意の導入遺伝子の最適な選択的発現のために、所与の細胞型(例えば、PVニューロン、心筋細胞など)に「マッチ」され得る。本明細書で開示される方法を使用して調節エレメントを同定することによって、遺伝子治療の有効性を改善すること、治療効果を生じるために必要な有効用量を減少させること、有害効果もしくはオフターゲット効果を最小化すること、ならびに/または患者の安全性および/もしくは耐容能を増加させることが可能である。本開示は、本発明の方法を実施するために有用な組成物もまた提供する。
定義
定義
本明細書で使用される場合、単数形「1つの(a)」、「1つの(an)」および「この(the)」は、文脈が明らかに他を示さない限り、複数形も同様に含むことを意図する。さらに、用語「含む(including)」、「含む(includes)」、「有する(having)」、「有する(has)」、「有する(with)」またはそれらの異形が詳細な説明および/または特許請求の範囲のいずれかにおいて使用される限りにおいて、かかる用語は、用語「含む(comprising)」と同様の様式で包括的であることを意図する。
用語「AAV」は、アデノ随伴ウイルスの省略語であり、ウイルスそのものまたはその誘導体を指すために使用され得る。用語は、それ以外であることを必要としている場合を除き、全ての血清型、サブタイプ、ならびに天然に存在する型および組換え型の両方を含む。省略語「rAAV」は、組換えアデノ随伴ウイルスを指す。用語「AAV」は、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、rh10、およびそのハイブリッド、トリAAV、ウシAAV、イヌAAV、ウマAAV、霊長類AAV、非霊長類AAV、およびヒツジAAVを含む。AAVの様々な血清型のゲノム配列、ならびに天然の末端反復配列(TR)、Repタンパク質、およびカプシドサブユニットの配列は、当技術分野で公知である。そのような配列は、文献またはGenBankなどの公共のデータベースにおいて見出され得る。「rAAVベクター」は、本明細書で使用される場合、AAV起源ではないポリヌクレオチド配列(すなわち、AAVに対して異種のポリヌクレオチド)、典型的に細胞の遺伝子形質転換のための目的の配列を含むAAVベクターを指す。一部の実施形態では、異種ポリヌクレオチドには、少なくとも1つ、一般的には2つのAAV逆位末端反復配列(ITR)に挟まれている。rAAVベクターは、一本鎖(ssAAV)または自己相補的(scAAV)のいずれかであり得る。「AAVウイルス」または「AAVウイルス粒子」は、少なくとも1つのAAVカプシドタンパク質およびカプシド化されたポリヌクレオチドrAAVベクターで構成されるウイルス粒子を指す。粒子が、異種ポリヌクレオチド(すなわち、野生型AAVゲノム以外のポリヌクレオチド、例えば哺乳動物細胞に送達される導入遺伝子)を含む場合、これは典型的には、「rAAVウイルス粒子」、または単純に「rAAV粒子」と呼ばれる。
用語「約」または「およそ」は、その値が測定または決定される方法、即ち、測定システムの制限に一部依存する、当業者によって決定される特定の値について許容される誤差範囲内であることを意味する。例えば、「約」は、当該分野の実務に従って、1標準偏差以内または1よりも大きい標準偏差以内であることを意味し得る。あるいは、「約」は、所与の値を上回ってまたは下回って最大で20%、最大で15%、最大で10%、最大で5%または最大で1%の範囲を意味し得る。
用語「~に接続されている」または「~に接続する」は、2個またはそれよりも多くの実体間の関連、例えば、本明細書で開示される核酸のいずれかの2個またはそれよりも多くの間の関連を意味する。2個の実体は、例えば、共有結合(例えば、2個またはそれよりも多くの核酸ヌクレオチド鎖を一緒に接続するホスホジエステル結合)または水素結合(例えば、1個の核酸分子上のヌクレオチド配列と別の核酸分子上の相補的ヌクレオチド配列との間のハイブリダイゼーションに関連する水素結合)によって、互いに接続され得る。
実施形態が言語「含む(comprising)」を用いて本明細書に記載される場合はいつも、「~からなる」および/または「~から本質的になる」の用語で記載される他の点では類似の実施形態もまた提供されることが理解される。
用語「決定する」、「測定する」、「評価する(evaluating)」、「評価する(assessing)」、「アッセイする」、「分析する」およびそれらの文法的等価物は、任意の形態の測定を指すために本明細書で相互交換可能に使用し得、エレメントが存在するかしないかを決定すること(例えば、検出)を含む。これらの用語は、定量的決定および/または定性的決定の両方を含み得る。評価は、相対的または絶対的であり得る。
用語「発現」または「発現する」は、核酸配列もしくは核酸分子および/またはポリヌクレオチドがDNA鋳型から(例えば、mRNAまたは他のRNA転写物へと)転写されるプロセス、および/または転写されたmRNAがペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質へと引き続いて翻訳されるプロセスを指す。.用語「発現」または「発現させる」は、非コードRNA分子、例えば、アンチセンスRNA分子、RNAi分子および/または低分子ヘアピンRNA分子の転写も指し得る。転写物およびコードされたポリペプチドは、集合的に「遺伝子産物」と呼ばれ得る。ポリヌクレオチドがゲノムDNAに由来する場合、発現は、真核生物細胞におけるmRNAのスプライシングを含み得る。
ヌクレオチドまたはペプチド配列の「断片」は、「全長」配列と考えられている長さよりも短い配列を指す意味である。
DNAまたはタンパク質配列の「機能的断片」は、全長または参照のDNAまたはタンパク質配列よりも短いが、全長または参照のDNAまたはタンパク質配列の生物活性と実質的に類似した少なくとも1つの生物活性(機能的または構造的のいずれか)を保持する、その配列の生物学的に活性な断片を指す。
用語「in vitro」は、対象の体外で起こる事象を指す。例えば、in vitroアッセイは、対象の体外での任意のアッセイの実行を包含する。in vitroアッセイは、生存細胞または死細胞を使用する細胞に基づくアッセイを包含する。in vitroアッセイはまた、無傷の細胞を使用しない無細胞アッセイも包含する。
用語「in vivo」は、対象の体に起こる事象を指す。
「単離された」核酸は、その天然の環境の構成成分から分離されている核酸分子を指す。単離された核酸は、核酸分子を通常含有する細胞に含有される核酸分子を含むが、核酸分子は、その天然の染色体位置とは異なる染色体位置で染色体外に存在するか、またはコード配列のみを含有する。
本明細書で使用される場合、「作動可能に連結した」、「作動可能な連結」、「作用的に連結した」またはそれらの文法的等価物は、遺伝エレメント、例えば、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化配列などの並置であって、それらのエレメントが、予測された様式でそれらを作動させる関係にある並置を指す。例えば、プロモーターを含む調節エレメントは、その調節エレメントがコード配列の転写を開始することを助ける場合、コード領域に作用的に連結されている。一部の実施形態では、この機能的関係が維持される限り、調節エレメントとコード領域との間に介在する残基が存在してもよい。
用語「調節エレメント」(「RE」と互換可能に使用される)は、遺伝子などの作動可能に連結された配列の発現に影響を及ぼす(例えば、増加させる、減少させる、またはモジュレートする)ことが可能な核酸配列または遺伝子エレメントを指す。調節エレメントとしては、プロモーター、エンハンサー、リプレッサー、サイレンサー、インスレーター配列、イントロン、UTR、逆位末端反復(ITR)配列、長鎖末端反復配列(LTR)、安定性エレメント、マイクロRNA結合部位、翻訳後応答エレメント、またはポリA配列、またはその組合せが挙げられるがこれらに限定されない。調節エレメントは、例えば遺伝子発現を遺伝子発現の転写相、転写後相、もしくは翻訳相でモジュレートすることによって;翻訳レベル(例えば、翻訳のためにmRNAを安定化させる安定性エレメント)、RNA切断、RNAスプライシング、および/もしくは転写の終止をモジュレートすることによって;転写因子を、遺伝子発現を増加させるコード領域に動員することによって;RNA転写物が産生される速度を増加させる、産生されるRNAの安定性を増加させる、および/もしくはRNA転写物からのタンパク質合成速度を増加させることによって;ならびに/またはRNA分解を防止する、および/もしくはタンパク質合成を容易にするためにその安定性を増加させることによって、DNAおよび/またはRNAレベルで機能し得る。一部の実施形態では、調節エレメントは、エンハンサー、リプレッサー、プロモーター、またはその組合せを指し、特にエンハンサープラスプロモーターの組合せ、またはリプレッサープラスプロモーターの組合せを指す。一部の実施形態では、調節エレメントは、ヒト配列に由来する、例えば、配列は、ヒト配列に由来する配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも93%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%または少なくとも99%の配列同一性である。一部の実施形態では、調節エレメントは、合成配列である。
「候補調節エレメント」は、本開示のアッセイ方法のいずれかにおいて評価される調節エレメントを意味する。「候補調節エレメント」には、1個の調節エレメント、または1個よりも多くの調節エレメントの組合せが含まれ得る。
「対照調節エレメント」は、候補調節エレメントが比較される調節エレメントを意味する。一部の実施形態では、「対照調節エレメント」は、十分特徴付けられた発現プロファイルを有する調節エレメントである。例えば、一部の実施形態では、「対照調節エレメント」は、天然に存在する調節エレメント、例えば、ニワトリβ-アクチンプロモーター(CBA)である。
本明細書で使用される場合、「RNAseq」または「RNA-seq」は、所与の試料からRNAの相補体全体が単離され、ハイスループット次世代シークエンシング(NGS)テクノロジー(例えば、SOLiD、454、IlluminaまたはION Torrent)を使用して配列決定される、トランスクリプトームアプローチを指すために使用される。一部の実施形態では、RNAseq転写物は、cDNAへと逆転写され、アダプターが、cDNAの各末端にライゲーションされる。一部の実施形態では、シークエンシングは、一方向性(シングルエンドシークエンシング)または二方向性(ペアドエンドシークエンシング)のいずれかで実施され得、次いで、参照ゲノムデータベースにアラインされ得る。
一般的に、「配列同一性」または「配列相同性」は、互換的に使用することができ、それぞれ、2つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の正確なヌクレオチド対ヌクレオチドまたはアミノ酸対アミノ酸の対応を指す。2つまたはそれより多くの配列(ポリヌクレオチドまたはアミノ酸)は、「パーセント相同性」とも呼ばれるその「パーセント同一性」を決定することによって比較することができる。参照配列(例えば、核酸またはアミノ酸配列)に対するパーセント同一性は、2つの最適に整列させた配列間の正確なマッチ数を参照配列の長さで除算し、100を乗算したものとして計算され得る。保存的置換は、配列同一性のマッチ数を決定する場合、マッチと見なされない。第1の配列(A)の長さが第2の配列(B)の長さと等しくない場合、A:Bの配列のパーセント同一性は、B:Aの配列のパーセント同一性とは異なることが認識される。パーセント同一性を評定する目的のためなどの配列アライメントは、Needleman-Wunschアルゴリズム(例えば、ワールドワイドウェブebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/で入手可能なEMBOSS Needleアライナーを参照されたい)、BLASTアルゴリズム(例えば、ワールドワイドウェブblast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgiで入手可能なBLASTアライメントツールを参照されたい)、Smith-Watermanアルゴリズム(例えば、ワールドワイドウェブebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_water/で入手可能なEMBOSS Waterアライナーを参照されたい)、およびClustal Omegaアライメントプログラム(例えば、ワールドワイドウェブclustal.org/omega/およびF. Sievers et al., Mol Sys Biol. 7: 539 (2011)を参照されたい)が挙げられるがこれらに限定されない任意の適したアライメントアルゴリズムまたはプログラムによって実施され得る。最適なアライメントは、デフォルトパラメーターを含む選択したアルゴリズムの任意の適したパラメーターを使用して評定され得る。BLASTプログラムは、Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268 (1990)のアライメント方法に基づき、Altschul, et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990); Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877 (1993);およびAltschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997)において考察されている。
用語「対象」および「個体」は、本明細書において互換的に使用され、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトを指す。
ヌクレオチド配列の「バリアント」は、最も一般的な野生型DNA配列(例えば、cDNAまたはそのGenBank受託番号によって参照される配列)または特定の参照配列と比較して遺伝子変化または変異を有する配列を指す。
「ベクター」は、本明細書で使用される場合、連結される別の核酸分子の、それが複製または発現され得る細胞内への送達を媒介するために使用することができる核酸分子を指す。用語は、自己複製核酸構造としてのベクターならびにそれが導入されている宿主細胞のゲノムに取り込まれるベクターを含む。ある特定のベクターは、それが作用的に連結している核酸の発現を方向付けることが可能である。そのようなベクターは、本明細書において「発現ベクター」と呼ばれる。ベクターの他の例は、プラスミド、ウイルスベクターおよびコスミドを含む。
用語「導入遺伝子」は、本明細書で使用される場合、特定の細胞中に天然には存在しないポリヌクレオチド配列、細胞に外因的に添加されたポリヌクレオチド配列、および/またはベクター(例えば、ウイルスベクター、例えば、AAVベクター)中に含まれる異種ポリヌクレオチド配列を指す。導入遺伝子は、天然の配列(例えば、天然のタンパク質をコードする配列)および合成配列を含み得る。導入遺伝子は、コードおよび/または非コード配列を含み得る。一部の実施形態では、導入遺伝子は、調節エレメントに作動可能に連結した配列である。
用語「選択的発現」または「選択的に発現する」は、参照発現レベル(本明細書で定義される)と比較した、導入遺伝子が作動可能に連結されている調節エレメント(例えば、候補調節エレメント)によって駆動される導入遺伝子の発現における選択的増加または減少を指す。様々な実施形態では、調節エレメントによって提供される導入遺伝子の選択的発現には、以下が含まれる:同じ細胞型において異なる調節エレメントによって提供される導入遺伝子発現のレベルよりも高いもしくは低い、1つの細胞型における導入遺伝子発現;1つもしくは複数の他の細胞型において同じ調節エレメントよって提供される導入遺伝子発現のレベルよりも高いもしくは低い、1つの細胞型における導入遺伝子発現;同じ調節エレメントに作動可能に連結した同じ導入遺伝子を発現する異なる細胞型(参照細胞型)では観察されない、特定の細胞型における導入遺伝子発現における増加もしくは減少;同じ調節エレメントに作動可能に連結した導入遺伝子を発現する集団中の細胞の総数と比較した、細胞の(例えば、標的組織の)集団中の、候補調節エレメントに作動可能に連結した導入遺伝子を発現する1つの特定の細胞型の標的細胞の数の比における増加もしくは減少;導入遺伝子が異なる調節エレメントに作動可能に連結した場合に得られる比と比較した、導入遺伝子が候補調節エレメントに作動可能に連結した場合の、導入遺伝子を発現する標的細胞の数 対 導入遺伝子を発現する細胞の総数の比における増加もしくは減少;非標的細胞もしくは非標的組織における(例えば、ヒト対象における)導入遺伝子発現レベルよりも少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、120%、140%、150%、200%、250%、300%、350%、400%、450%、500%高いレベルでの、標的細胞における導入遺伝子発現;標的標的組織における目的の細胞型の少なくとも一部分において、有意義な(例えば、治療的に適切な)レベルで生じる導入遺伝子発現;および/または他の組織の細胞に対して標的組織の細胞において主に生じる導入遺伝子発現。
用語「参照発現レベル」は、以下によって提供される発現のレベルを指す:目的の同じ細胞型における別の候補調節エレメント;異なる細胞型における同じ候補調節;目的の同じ細胞型における公知の対照調節エレメント;および/または異なる細胞型における公知の対照調節エレメント。
用語「汎細胞」は、調節エレメントの文脈において、多くの細胞型にわたって(すなわち遍在的に)それが作動可能に連結されている遺伝子または導入遺伝子の発現を駆動する調節エレメントを指す。かかる調節エレメントの一部の例には、サイトメガロウイルス主要最初期プロモーター(CMV)、ニワトリβ-アクチンプロモーター(CBA)、CMV初期エンハンサー/CBAプロモーター(CAG)、伸長因子-1αプロモーター(EF1α)、サルウイルス40プロモーター(SV40)、ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター(PGK)およびポリユビキチンC遺伝子プロモーター(UBC)が含まれる。
用語「細胞型」は、細胞の別個の形態学的または機能的形態を指す。細胞型は、例えば、遺伝子発現プロファイル、エピジェネティックプロファイル、非コードRNAプロファイル、タンパク質発現プロファイル、細胞表面マーカー、分化能、増殖能、刺激もしくはシグナルに対する応答、解剖学的位置、形態(morphology)、染色プロファイル、および/または発生の間の出現のタイミング、ならびに/あるいは上述の任意の組合せを含む様々な特徴を使用して同定され得る。一部の実施形態では、細胞型は、特定の特徴または特徴の組合せに基づいて規定される。例えば、一部の実施形態では、細胞型は、特定の遺伝子または遺伝子の組合せの発現に基づいて規定される。一部の実施形態では、細胞型は、それが調達または起源する組織、例えば、結合組織、筋肉組織、神経組織または上皮組織によって規定され得る。例として、筋肉組織に由来する細胞には、心臓筋肉(cardiac muscle)細胞(例えば、心筋細胞(cardiomyocyte))、平滑筋細胞、骨格筋細胞および上述のいずれかの様々な下位集団が含まれる。種々の異なる細胞型が、単一の生物体から(または同じ種の生物体から)、単一の臓器または単一の組織から得られ得る。例示的な細胞型には、膀胱(urinary bladder)、膵上皮、膵アルファ、膵ベータ、膵内皮、骨髄リンパ芽球、骨髄Bリンパ芽球、骨髄マクロファージ、骨髄赤芽球、骨髄樹状、骨髄脂肪細胞、骨髄骨細胞、骨髄軟骨細胞、前骨髄球(promyeloblast)、骨髄巨核芽球、膀胱(bladder)、脳Bリンパ球、脳グリア、ニューロン、脳アストロサイト、神経外胚葉、脳マクロファージ、脳ミクログリア、脳上皮、心筋細胞、皮質ニューロン、脳線維芽細胞、乳房上皮、結腸上皮、結腸Bリンパ球、乳腺上皮、乳腺筋上皮、乳腺線維芽細胞、結腸腸細胞、子宮頚上皮、卵巣上皮、卵巣線維芽細胞、乳管上皮、舌上皮、扁桃腺樹状、扁桃腺Bリンパ球、末梢血リンパ芽球、末梢血Tリンパ芽球、末梢血皮膚Tリンパ球、末梢血ナチュラルキラー、末梢血Bリンパ芽球、末梢血単球、末梢血骨髄芽球、末梢血単芽球、末梢血前骨髄球、末梢血マクロファージ、末梢血好塩基球、肝臓内皮、肝臓マスト、肝臓上皮、肝臓Bリンパ球、脾臓内皮、脾臓上皮、脾臓Bリンパ球、肝臓肝細胞、肝臓アレキサンダー、肝臓線維芽細胞、肺上皮、気管支上皮、肺線維芽細胞、肺Bリンパ球、肺シュワン、肺扁平、肺マクロファージ、肺骨芽細胞、神経内分泌、肺肺胞、胃上皮および胃線維芽細胞が含まれるがこれらに限定されない。
用語「レポーター分子」は、細胞または生物体における特定の生物学的プロセス、活性、事象または状態の存在またはレベルの指標として使用され得る分子(例えば、タンパク質)を指す。レポーター分子は、典型的には、それらが容易に測定されるのを可能にする、またはレポーター分子を発現する細胞の選択を可能にする、1つまたは複数の特性または酵素活性を有する。一般に、細胞は、レポーター分子自体(例えば、DNA、RNAおよび/またはタンパク質)またはレポーター分子の酵素活性の存在を決定することおよび/またはそのレベルを測定することによって、レポーター分子の存在についてアッセイされ得る。レポーター分子が有し得る検出可能な特徴または活性には、例えば、蛍光、生物発光、特定の基質に結合する能力、配列、適切な基質の存在下で蛍光もしくは着色物質を産生する反応を触媒する能力、または光子(光)の放射および/もしくは吸収に基づく他の読み出しが含まれる。典型的には、レポーター分子は、レポーター分子が使用される細胞もしくは生物体によっては内因的に発現されない分子、または内因性分子を超える選択的検出を可能にするために改変された分子である。
用語「ドメイン」または「タンパク質ドメイン」は、タンパク質鎖の残りとは独立して存在および機能し得るタンパク質鎖の一部を指す。
用語「非天然の」または「天然に~しない」または「バリアント」は、天然に存在するものから逸脱した品質の表出を意味すると解釈すべきである。
用語「統計的に有意な」または「有意に」は、統計的有意性を指し、一般に、参照レベルから少なくとも2標準偏差(2SD)離れていることを意味する。これは、帰無仮説が実際に真である場合に帰無仮説を棄却する決定が行われる確率として定義される。
用語「減少」、「低減された」、「低減」、「減少させる」または「阻害する」は全て、測定されたパラメーターにおける観察可能な減少を意味するために本明細書で一般に使用される。
用語「増加した」、「増加させる/増加」または「増強する」または「活性化する」は全て、測定されたパラメーターにおける観察可能な増加を意味するために本明細書で一般に使用される。
本明細書で使用される場合、用語「処置する」、「処置」、「治療」等は、疾患または障害を軽減する、その進行を遅延させるまたは遅らせる、その効果または症状を低減する、その発症を防止する、その再発を防止する、阻害する、その発症を改善する、疾患、障害、または医学的状態に関して有益なまたは望ましい結果、例えば治療利益および/または予防利益を得ることが挙げられるがこれらに限定されない、望ましい薬理学的および/または生理学的効果を得ることを指す。本明細書で使用される場合、「処置」は、哺乳動物、特にヒトにおける疾患の任意の処置を含み、(a)疾患の素因を有し得るまたは病気にかかるリスクにあり得るがまだ疾患を有すると診断されていない対象において、疾患が起こるのを防止すること;(b)疾患を阻害する、すなわちその発生を停止させること;および(c)疾患を軽減する、すなわち疾患の退縮または以下のうちのいずれかの段階を引き起こすことを含む。治療利益には、処置されている根底にある障害の根絶または軽快が含まれる。また、治療利益は、対象が根底にある障害になおも苦しんでいる場合があるにもかかわらず、対象において改善が観察されるような、根底にある障害に関連する生理学的症状の1つまたは複数の根絶または軽快で達成される。一部の実施形態では、予防利益のために、組成物が、特定の疾患を発達させるリスクがある対象、または疾患の生理学的症状の1つもしくは複数を報告する対象に、この疾患の診断がなされていない場合であっても、投与される。本開示の方法は、任意の哺乳動物で使用し得る。一部の実施形態では、処置は、症状の減少または休止を生じ得る。予防効果には、疾患もしくは状態の出現を遅延もしくは排除すること、疾患もしくは状態の症状の開始を遅延もしくは排除すること、疾患もしくは状態の進行を遅くする、停止させるもしくは逆転させること、またはそれらの任意の組合せが含まれる。
他に示さない限り、本明細書で使用される全ての用語は、当業者にとってそれらが有するのと同じ意味を有し、本発明の実施は、当業者の知識の範囲内の分子生物学、微生物学および組換えDNAテクノロジーの従来技術を使用する。
核酸組成物
核酸組成物
一部の実施形態では、本開示は、細胞の特定の集団において目的の導入遺伝子の選択的発現を提供する調節エレメントを同定するために、多数の(例えば、10~104個の)候補調節エレメントをスクリーニングする方法(例えば、in vivoまたはin vitro)に関する。一部の実施形態では、本開示は、細胞の特定の集団において目的の導入遺伝子の選択的発現を提供する調節エレメントを同定するために、10~20、10~50、10~100、10~200、10~400、10~600、10~800、10~1000、10~3000、10~6000、10~10,000、10~13,000、10~16,000、10~20,000、10~30,000、10~40,000、10~50,000、10~60,000、10~70,000、10~80,000、10~90,000、10~100,000、10~500,000または10~1,000,000個の候補調節エレメントをスクリーニングする方法(例えば、in vivoまたはin vitro)に関する。これらの方法は、調節エレメント同定のために、細胞(例えば、細胞または組織の集団)に、導入遺伝子(例えば、レポーター遺伝子を含む)をコードする配列に作動可能に連結した1つまたは複数の候補調節エレメントとバーコード配列とを有する核酸分子を各々が含むベクターの混合物を提供することを含む。したがって、一部の態様では、本開示の方法を実施するために有用な核酸成分および組成物が、本明細書で提供される。
一部の実施形態では、核酸は、DNA分子である。一部の実施形態では、核酸は、RNA分子である。一部の実施形態では、核酸は、本明細書で開示されるベクターのいずれか中のDNA分子である。一部の実施形態では、核酸分子は、本明細書で開示される導入遺伝子のいずれかを含む。一部の実施形態では、核酸分子は、本明細書で開示される候補調節エレメントのいずれかを含む。一部の実施形態では、核酸は、本明細書で開示されるバーコード配列のいずれかを含む。一部の実施形態では、核酸は、本明細書で開示される導入遺伝子のいずれか、本明細書で開示される候補調節エレメントのいずれかおよび本明細書で開示されるバーコード配列のいずれかを含むDNA分子である。一部の実施形態では、核酸分子は、本明細書で開示される導入遺伝子のいずれかおよび本明細書で開示されるバーコード配列のいずれかを含むRNA核酸分子である。一部の実施形態では、RNA分子は、本明細書で開示されるDNA分子のいずれか(例えば、本明細書で開示される導入遺伝子、候補調節エレメントおよびバーコード配列のいずれかを含むDNA分子)から転写される。一部の実施形態では、RNA分子は、本明細書で開示されるDNA分子のいずれか(例えば、本明細書で開示される導入遺伝子、候補調節エレメントおよびバーコード配列のいずれかを含むDNA分子)から転写され、RNA分子は、導入遺伝子およびバーコード配列を含み、RNA分子中のバーコード配列は、DNA分子中の候補調節エレメントと相関する。
以下でより詳細に議論するように、一部の実施形態では、本明細書で開示される核酸分子のいずれかは、微粒子に接続されている。特定の実施形態では、微粒子に接続されている核酸分子は、DNA分子(例えば、本明細書で開示されるDNA分子のいずれか)から転写されるRNA分子である。一部の実施形態では、RNA分子は、導入遺伝子およびバーコード配列を含む。一部の実施形態では、DNA分子は、調節エレメントを含み、RNA分子中のバーコード配列は、DNA分子中の調節エレメントと相関する。一部の実施形態では、微粒子は、ビーズである。一部の実施形態では、微粒子は、微粒子ポリヌクレオチド分子に接続されている。一部の実施形態では、核酸分子は、微粒子ポリヌクレオチド分子を介して(例えば、核酸分子および微粒子ポリヌクレオチド分子上の相補的ヌクレオチド配列間でのハイブリダイゼーションを介して)微粒子に接続されている。一部の実施形態では、微粒子ポリヌクレオチド分子は、プライマー配列を含む。一部の実施形態では、微粒子ポリヌクレオチド分子は、バーコード配列を含む。一部の実施形態では、微粒子ポリヌクレオチド分子は、Unique Molecular Identifier(UMI)ヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、微粒子ポリヌクレオチド分子は、オリゴ-dT配列を含む。一部の実施形態では、微粒子ポリヌクレオチド分子は、a)プライマー配列、b)バーコード配列、c)Unique Molecular Identifier(UMI)ヌクレオチド配列、d)オリゴ-dT配列、およびe)核酸配列を含み;核酸は、ポリAヌクレオチド配列を含み、微粒子は、以下の順序:微粒子--a)--b)--c)--d)--e)でa)~e)に接続され;ポリA配列は、オリゴ-dT配列にハイブリダイズされている。一部の実施形態では、微粒子ポリヌクレオチド分子は、a)プライマー配列、b)バーコード配列、c)Unique Molecular Identifier(UMI)ヌクレオチド配列、d)オリゴ-dT配列、およびe)核酸配列を含み;核酸は、ポリAヌクレオチド配列を含み、微粒子は、以下の順序:微粒子--a)--c)--b)--d)--e)でa)~e)に接続され;ポリA配列は、オリゴ-dT配列にハイブリダイズされている。
調節エレメント識別子バーコード
調節エレメント識別子バーコード
一部の実施形態では、本明細書で開示される核酸分子のいずれかは、それが関連する特定の調節エレメントを同定するように機能する核酸バーコード配列を含む。本明細書に記載されるように、本発明の方法は、細胞(例えば、ニューロン、心筋細胞など)または細胞サブタイプ(例えば、GABA作動性サブタイプ、例えば、グルタミン酸デカルボキシラーゼ2(GAD2)、GAD1、NKX2.1、DLX1、DLX5、SST、PVまたはVIPを発現するGABA作動性ニューロン)の特定の型および/または集団において目的の導入遺伝子の選択的発現を提供するREを同定するための、多数の(例えば、10~104個の)REのスクリーニング(例えば、in vivoまたはin vitro)を可能にする。所与の細胞型において選択的発現を提供するREを同定する能力は、特定の候補REへの特定のバーコード配列の割り当て(またはタグ化、マッチング、ペアリング)によって可能にされる。導入遺伝子発現が、(例えば、レポーター遺伝子、例えば、EGFPをコードする遺伝子の発現によって)細胞において検出される場合、その細胞中に存在するバーコード配列は、どの特定の候補REがその細胞中に存在して導入遺伝子(例えば、EGFP)の発現を駆動したかを決定することを可能にする。ある特定の実施形態では、バーコード配列は、特定の調節エレメントに独自である。したがって、本発明の方法において試験される全ての候補調節エレメントについて、独自のバーコード配列が、各候補調節エレメントとペアリングされて、各候補調節エレメントの同定が可能になる。一部の実施形態では、本開示は、本明細書で開示される核酸のいずれかを発現させる方法を提供する。一部の実施形態では、核酸の発現は、核酸中の目的の導入遺伝子を転写するステップを含み、導入遺伝子は、候補REに作動可能に連結されている。一部の実施形態では、核酸中の候補REは、導入遺伝子と共に転写されないので、バーコード配列が特に有用であるが、それは、バーコード配列が、核酸中の目的の導入遺伝子の転写を促進した特定の候補REを同定する情報を保存するからである。特定の実施形態では、バーコード配列は、DNA核酸分子中にある。一部の実施形態では、バーコード配列は、本明細書で開示されるDNA核酸分子のいずれかから転写されたRNA核酸分子中にある。
バーコード配列のサイズは、約4~約100、約4~約50、約4~約20もしくは約6~約20またはそれよりも長いヌクレオチド長の範囲であり得る。ある特定の実施形態では、バーコード配列の長さは、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20ヌクレオチドまたはそれよりも長い。ある特定の実施形態では、バーコード配列の長さは、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、バーコード配列は、連続する、すなわち、隣接するヌクレオチドの単一のストレッチ中にある、または一部の実施形態では、バーコード配列は、1つまたは複数ヌクレオチド分離された2つまたはそれよりも多くの別々のサブ配列へと分離される。ある特定の実施形態では、分離されたバーコードサブ配列は、約4~約16ヌクレオチド長であり得る。一部の実施形態では、バーコードサブ配列は、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16ヌクレオチドまたはそれよりも長い。ある特定の実施形態では、バーコードサブ配列は、少なくとも4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16ヌクレオチドまたはそれよりも長くてもよい。ある特定の実施形態では、バーコードサブ配列は、多くて4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16ヌクレオチドまたはそれよりも短くてもよい。一部の実施形態では、バーコード配列は、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20のバーコードサブ配列を含み、バーコードサブ配列は、少なくとも2~10ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、バーコード配列は、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20のバーコードサブ配列を含み、バーコードサブ配列は、少なくとも4~20ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、2つまたはそれよりも多くのバーコードサブ配列の間には、1つまたは複数のヌクレオチドが存在する。一部の実施形態では、2つまたはそれよりも多くのバーコードサブ配列の間には、1~200、1~150、1~100、1~90、1~80、1~70、1~60、1~50、1~40、1~30、1~20、1~10、5~200、5~150、5~100、5~90、5~80、5~70、5~60、5~50、5~40、5~30、5~20、t~10、10~200、10~150、10~100、10~90、10~80、10~70、10~60、10~50、10~40、10~30、10~20、20~200、20~150、20~100、20~90、20~80、20~70、20~60、20~50、20~40、20~30、30~200、30~150、30~100、30~90、30~80、30~70、30~60、30~50、30~40、50~200、50~150、50~100、50~90、50~80、50~70、50~60、75~200、75~150、75~100、75~90、75~80、80~200、80~150、80~100または80~90ヌクレオチドが存在する。一部の実施形態では、バーコードは、2つのバーコードサブ配列を含み、各バーコードサブ配列は、4~20ヌクレオチド長であり、バーコードサブ配列は、1~200、1~150、1~100、1~90、1~80、1~70、1~60、1~50、1~40、1~30、1~20、1~10、5~200、5~150、5~100、5~90、5~80、5~70、5~60、5~50、5~40、5~30、5~20、t~10、10~200、10~150、10~100、10~90、10~80、10~70、10~60、10~50、10~40、10~30、10~20、20~200、20~150、20~100、20~90、20~80、20~70、20~60、20~50、20~40、20~30、30~200、30~150、30~100、30~90、30~80、30~70、30~60、30~50、30~40、50~200、50~150、50~100、50~90、50~80、50~70、50~60、75~200、75~150、75~100、75~90、75~80、80~200、80~150、80~100または80~90ヌクレオチド分離される。一部の実施形態では、バーコードは、3つのバーコードサブ配列を含み、各バーコードサブ配列は、4~20ヌクレオチド長であり、バーコードサブ配列は、1~200、1~150、1~100、1~90、1~80、1~70、1~60、1~50、1~40、1~30、1~20、1~10、5~200、5~150、5~100、5~90、5~80、5~70、5~60、5~50、5~40、5~30、5~20、t~10、10~200、10~150、10~100、10~90、10~80、10~70、10~60、10~50、10~40、10~30、10~20、20~200、20~150、20~100、20~90、20~80、20~70、20~60、20~50、20~40、20~30、30~200、30~150、30~100、30~90、30~80、30~70、30~60、30~50、30~40、50~200、50~150、50~100、50~90、50~80、50~70、50~60、75~200、75~150、75~100、75~90、75~80、80~200、80~150、80~100または80~90ヌクレオチド分離される。一部の実施形態では、バーコードは、4つのバーコードサブ配列を含み、各バーコードサブ配列は、4~20ヌクレオチド長であり、バーコードサブ配列は、1~200、1~150、1~100、1~90、1~80、1~70、1~60、1~50、1~40、1~30、1~20、1~10、5~200、5~150、5~100、5~90、5~80、5~70、5~60、5~50、5~40、5~30、5~20、t~10、10~200、10~150、10~100、10~90、10~80、10~70、10~60、10~50、10~40、10~30、10~20、20~200、20~150、20~100、20~90、20~80、20~70、20~60、20~50、20~40、20~30、30~200、30~150、30~100、30~90、30~80、30~70、30~60、30~50、30~40、50~200、50~150、50~100、50~90、50~80、50~70、50~60、75~200、75~150、75~100、75~90、75~80、80~200、80~150、80~100または80~90ヌクレオチド分離される。一部の実施形態では、バーコードは、5つまたはそれよりも多くのバーコードサブ配列を含み、各バーコードサブ配列は、4~20ヌクレオチド長であり、バーコードサブ配列は、1~200、1~150、1~100、1~90、1~80、1~70、1~60、1~50、1~40、1~30、1~20、1~10、5~200、5~150、5~100、5~90、5~80、5~70、5~60、5~50、5~40、5~30、5~20、t~10、10~200、10~150、10~100、10~90、10~80、10~70、10~60、10~50、10~40、10~30、10~20、20~200、20~150、20~100、20~90、20~80、20~70、20~60、20~50、20~40、20~30、30~200、30~150、30~100、30~90、30~80、30~70、30~60、30~50、30~40、50~200、50~150、50~100、50~90、50~80、50~70、50~60、75~200、75~150、75~100、75~90、75~80、80~200、80~150、80~100または80~90ヌクレオチド分離される。
一部の実施形態では、1つまたは複数のバーコード配列は、核酸分子の1つよりも多くの領域中に含まれ得る。例えば、1つまたは複数のバーコード配列は、コード領域(例えば、発現される導入遺伝子をコードする配列)もしくは非コード領域(例えば、UTRおよび/またはイントロン配列)、または両方中に含まれ得る。一部の実施形態では、導入遺伝子のコード領域も非コード領域も、バーコード配列を含まない。一部の実施形態では、バーコード配列は、導入遺伝子のコード領域または非コード領域に連結されている。一部の実施形態では、1つよりも多くのバーコード配列が核酸分子内に含まれる場合、各バーコード配列は、同一であり得(例えば、少なくとも1ヌクレオチド分離された3コピーの同じバーコード配列)、各々互いに異なり得る(例えば、少なくとも1ヌクレオチド分離された3つの異なるバーコード配列)、またはバーコード配列の一部は、互いに同一であり得互いに異なり得る。したがって、任意の数のバーコード配列(同一、各々異なる、または一部が同一/一部が異なる)が、本明細書で開示される核酸分子のいずれか中に含まれ得る。ある特定の実施形態では、核酸分子は、少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5または少なくとも6つの同一なバーコード配列を含む。ある特定の実施形態では、核酸分子は、少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5または少なくとも6つの異なるバーコード配列を含む。
一部の実施形態では、バーコード配列は、特定の候補調節エレメントに特異的である。一部の実施形態では、バーコード配列の組合せは、特定の候補調節エレメントに特異的である。一部の実施形態では、核酸分子中のバーコード配列の配置は、特定の候補調節エレメントに特異的である。一部の実施形態では、a)バーコード配列、b)バーコード配列の組合せ、c)核酸分子中のバーコード配列の配置、またはa)~c)の任意の組合せが、特定の候補調節エレメントに特異的である。
一部の実施形態では、核酸分子のいずれかのコード領域(例えば、導入遺伝子)は、1つまたは複数のバーコード配列を含む。一部の実施形態では、導入遺伝子のコード領域中のバーコードは、代替コドンを含む。代替コドンは、コードDNA中の同義のコドンを指す。単一のアミノ酸が1つよりも多くのコドンによってコードされ得るので、遺伝コードは、縮重または冗長と記載される。例えば、コドンTATおよびコドンTACは共に、アミノ酸チロシンをコードする。したがって、例として、EGFPをコードするヌクレオチド配列のコード領域中に配置されたバーコードは、EGFP野生型タンパク質配列の発現を維持しつつ、代替コドン(例えば、DNA配列に対する変化)を使用してEGFPの領域をコードするように設計され得る(すなわち、EGFPコードヌクレオチド配列のコード領域中に存在するバーコード配列内の代替コドンは、そのヌクレオチド配列によってコードされるEGFPアミノ酸配列を変更しない)。一部の実施形態では、本明細書で開示される核酸分子のいずれかの非コード領域(例えば、導入遺伝子のUTRおよび/またはイントロン領域)は、1つまたは複数のバーコード配列を含む。一部の実施形態では、本明細書で開示される核酸分子のいずれかの非コード領域およびコード領域は各々、1つまたは複数のバーコード配列を含む。一部の実施形態では、本明細書で開示される核酸分子のいずれかは、核酸分子のコード領域中に少なくとも部分的にあり、核酸分子の非コード領域中に少なくとも部分的にある、少なくとも1つのバーコード配列を含む。
一般に、1つまたは複数のバーコード配列は、核酸分子中のいずれの場所にも配置され得る。一部の実施形態では、本明細書で開示される核酸配列のいずれかは、ポリAテイルおよび少なくとも1つのバーコード配列を含む。一部の実施形態では、バーコード配列は、核酸中のポリAテイルの開始点から約25、30、35、50、100、150、200、250、300、350、400、450または500塩基以内に位置する。一部の実施形態では、バーコードは、核酸中のポリAテイルの開始点から約50塩基以内に位置する。一部の実施形態では、核酸は、複数のバーコードを含み、各バーコードは、核酸中のポリAテイルの近位の約50塩基にわたる領域内で、80~120bp分離される。一部の実施形態では、少なくとも1つのバーコード配列は、ポリAテイルの近位の約50塩基にわたる領域内で、各々80~120bpの距離で配置されている。
導入遺伝子
導入遺伝子
一部の実施形態では、本発明の方法に従って使用され得る本明細書で提供される核酸分子のいずれかは、多重方法における使用のための、候補調節エレメントに作動可能に連結した導入遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法の導入遺伝子は、存在する場合、候補調節エレメントによって駆動される発現を検出するためのレポーターとして機能する。一部の実施形態では、候補REは、導入遺伝子の上流に位置する。一部の実施形態では、候補REは、導入遺伝子の非コード領域内に位置する。
一部の実施形態では、導入遺伝子は、野生型参照遺伝子配列(例えば、EGFPタンパク質をコードする遺伝子配列)に由来する。一部の実施形態では、導入遺伝子は、野生型遺伝子配列に対して少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%同一である。一部の実施形態では、導入遺伝子は、野生型参照ヌクレオチド配列と比較して、いずれの変異も含まない。一部の実施形態では、導入遺伝子は、本明細書で開示されるバーコード配列のいずれか1つまたは複数に連結されている(すなわち、バーコード配列は、導入遺伝子のコード中にも非コード領域中にもない)。目的の任意の導入遺伝子が、本発明の方法において設計および使用され得る。本明細書に記載され例示されるように、導入遺伝子は、容易に検出可能なおよび/または同定可能な特性、特徴または部分を含むように設計され得る。一部の実施形態では、導入遺伝子は、参照ヌクレオチド配列と比較して改変されたヌクレオチド配列(例えば、代替コドン)を含む。一部の実施形態では、導入遺伝子は、ある特定の有益な特性を有するように設計され得る、例えば、発現された導入遺伝子は、細胞の特定の区画に特異的に局在化する、ならびに/または発現された導入遺伝子は、導入遺伝子タンパク質、細胞もしくは細胞成分(例えば、核)の単離および/もしくは精製を促進する。当該分野で公知の機能的ドメインおよび/またはタグを組み込むタンパク質設計の様々な方法が、本発明の方法のために特定の文脈において有用な導入遺伝子を生成するために使用され得る。一部の実施形態では、導入遺伝子は、DNA核酸分子である。一部の実施形態では、導入遺伝子は、本明細書に記載されるDNA核酸分子のいずれかから転写されたRNA核酸分子である。
一部の実施形態では、導入遺伝子は、レポーター遺伝子をコードする配列を含む。当該分野で公知の様々なレポーター遺伝子が、本発明の方法のための導入遺伝子を生成するために使用され得る。レポーター遺伝子は、存在する場合、導入遺伝子発現の検出を促進する任意の遺伝子またはヌクレオチド配列を含む。レポーター遺伝子は、例えば、細胞の特定の領域もしくはオルガネラにおける、および/または特定の細胞、組織、臓器もしくは多細胞生物体の任意の部分における、発現された産物の局在化を必要に応じて可能にし得る。かかるレポーター遺伝子はまた、レポーターポリペプチド(例えば、GFPタンパク質)と、機能的利益、例えば、細胞単離、細胞同定、または細胞の領域への(例えば、核結合ドメインを介した)レポーター局在化を付与する1つまたは複数のドメインとを含む融合タンパク質をコードするように設計され得る。一部の実施形態では、本明細書で開示されるレポーター遺伝子のいずれかは、1つまたは複数の蛍光タンパク質、例えば、緑色蛍光タンパク質(GFP)、高感度緑色蛍光タンパク質(EGFP)、黄色蛍光タンパク質(YFP)、例えば、mBanana、赤色蛍光タンパク質(RFP)、例えば、mCherry、DsRed、dTomato、tdTomato、mHoneydew、mStrawberry、TagRFP、遠赤色蛍光パミドロネート(FRFP)、例えば、mGrape1もしくはmGrape2、シアン蛍光タンパク質(CFP)、青色蛍光タンパク質(BFP)、高感度シアン蛍光タンパク質(ECFP)、ウルトラマリン蛍光タンパク質(UMFP)、橙色蛍光タンパク質(OFP)、例えば、mOrangeもしくはmTangerine、赤色(橙色)蛍光タンパク質(mROFP)、TagCFP、またはテトラシステイン蛍光モチーフをコードする。ある特定の実施形態では、蛍光タンパク質は、GFPまたはEGFPである。一部の実施形態では、導入遺伝子は、検出可能に標識されたタンパク質、例えば、検出可能に標識された抗体またはその抗原結合性断片をコードする。一部の実施形態では、導入遺伝子は、そのタンパク質に結合する1つまたは複数の薬剤を使用して検出され得るタンパク質をコードする。例えば、一部の実施形態では、導入遺伝子は、1つまたは複数の検出可能に標識された抗体(例えば、蛍光標識された抗体)で検出され得るタンパク質をコードする。
本明細書で例示されるように、導入遺伝子は、発現されたレポーター遺伝子タンパク質(EGFP)を外側核膜に標的化する核結合ドメイン(例えば、KASHドメインもしくはSUNドメインタンパク質、またはそれらの生物学的に活性な断片)をコードする配列に作動可能に連結したレポーター遺伝子配列(例えば、EGFPをコードする配列)を含み得る。EGFPは、導入遺伝子を発現する細胞の容易な同定および選別を可能にするが、核結合ドメインは、細胞からの核単離を促進し、これは、インタクトな組織からの解離の間に細胞膜が破壊される傾向がある特定の細胞(例えば、ニューロンまたは脂肪細胞)にとって有益である。当業者が認識するように、レポーター遺伝子配列によってコードされるポリペプチドは、核結合ドメイン配列に連結されている必要はない。一部の実施形態では、レポーター遺伝子によってコードされるポリペプチド(例えば、EGFP)は、レポーター遺伝子を発現する細胞のサイトゾルを標識するために単独で使用され得、導入遺伝子を発現する細胞の同定を可能にする。この標識化は、インタクトな組織からの解離の間に細胞膜が破壊される傾向がない組織由来の細胞全体(例えば、上皮細胞および線維芽細胞)を単離するために使用され得る。かかる細胞は、本明細書で詳述されるように、それらの供給源(例えば、組織)から分離され得、レポーター遺伝子発現に基づいて選別され得、それらのトランスクリプトームが分析のために配列決定され得る。
一部の実施形態では、導入遺伝子は、細胞局在化ドメインをコードする配列を含む。様々な細胞局在化ドメインが、当該分野で公知であり、それには、例えば、KASHドメイン、SUNドメインが含まれる。当業者は、他の細胞局在化ドメイン、例えば、LOCATE細胞内局在化データベース(http://locate.imb.uq.edu.au)に保存されたものを認識している。
調節エレメント
調節エレメント
一部の実施形態では、本開示の核酸分子のいずれかは、例えば、1つまたは複数のバーコード配列、および導入遺伝子に作動可能に連結した1つまたは複数の候補調節エレメントを含む。本明細書に記載されるように、本開示は、細胞の特定の集団において目的の導入遺伝子の選択的発現を提供するREを同定するために、多数の(例えば、10~104個の)候補REをスクリーニングする方法(例えば、in vivoまたはin vitro)に、一部関する。候補REは、所与の細胞型(目的の細胞型または標的細胞)において導入遺伝子の選択的発現を提供するREを同定するために、本明細書に記載される方法を使用して試験され得る。一般に、任意の公知の、天然のおよび/または合成の候補REが、本明細書に記載される方法を使用して、スクリーニング、単離および同定され得る。公知のおよび/または天然に存在するREは、本発明の方法における候補REとしての使用のために容易に得ることができる。本開示のために有用な合成候補REは、当該分野で公知の様々な方法を使用して、設計および生成され得る。一部の実施形態では、本発明の方法において使用され得る候補REは、1つまたは複数の細胞型において公知の活性を有するが、他の細胞型では未知の活性を有するREであり得る。一部の実施形態では、本発明の方法において使用され得る候補REは、未知の活性を有するREであり得る。様々な公知のまたは新規の(例えば、合成の)REは、本明細書に記載されるように、REが選択的発現を提供する細胞型を同定するために、本発明の方法に従ってスクリーニングされ得る。一部の実施形態では、本発明の方法において使用され得る候補REには、候補REがそれに対して比較され得る陰性または陽性対照RE(例えば、汎細胞RE)として使用され得る公知のREが含まれる。
特定の実施形態では、候補REは、DNA核酸分子の一部である。一部の実施形態では、DNA核酸分子は、本明細書で開示される導入遺伝子のいずれか、1つまたは複数の候補RE、および1つまたは複数のバーコード配列を含み、バーコード配列は、核酸中の候補REと相関する(例えば、バーコードは、核酸分子中に含まれるREを同定するために使用され得る)。一部の実施形態では、本開示は、本明細書で開示されるDNA核酸分子のいずれか(例えば、本明細書で開示される、バーコード配列(複数可)、候補RE(複数可)および導入遺伝子を含むDNA核酸分子)から転写されるRNA核酸分子を提供し、RNA核酸分子は、導入遺伝子およびバーコード配列を含み、RNA分子中のバーコード配列は、DNA分子中の候補REと相関する。
REは、DNAおよび/またはRNAレベルで機能し得る。REは、細胞選択的(細胞特異的)遺伝子発現をモジュレートまたは制御するように機能し得る。REは、遺伝子発現の転写期、転写後期または翻訳期において遺伝子発現をモジュレートするように機能し得る。REには、プロモーター、エンハンサー、イントロンまたは他の非コード配列が含まれるがこれらに限定されない。RNAレベルで、調節は、翻訳(例えば、翻訳のためにmRNAを安定化する安定性エレメント)、RNA切断、RNAスプライシングおよび/または転写終結のレベルで生じ得る。一部の実施形態では、REは、目的の細胞型において遺伝子発現を選択的に増加させる転写因子を動員できる。一部の実施形態では、REは、RNA転写物が産生される速度を増加させ得、産生されたRNAの安定性を増加させ得、および/またはRNA転写物からのタンパク質合成の速度を増加させ得る。
REは、1つまたは複数の細胞型または組織における遺伝子または導入遺伝子(例えば、EGFPもしくはルシフェラーゼなどのタンパク質をコードするレポーター遺伝子;KASHドメインなどの局在化ドメインをコードする導入遺伝子;および/または治療的遺伝子)の発現に影響を与える(例えば、増加または減少させる)ことが可能な核酸配列または遺伝エレメントである。一部の実施形態では、REは、イントロン、プロモーター、エンハンサー、UTR、逆位末端反復(ITR)配列、長い末端反復配列(LTR)、安定性エレメント、翻訳後応答エレメント、マイクロRNA結合部位もしくはポリA配列、またはそれらの組合せであり得る。一部の実施形態では、REは、プロモーターもしくはエンハンサー、またはそれらの組合せである。一部の実施形態では、REは、ヒト配列に由来する。
一部の実施形態では、2つまたはそれよりも多くのRE(公知の、天然のおよび/または合成のRE)は、より大きいREを形成するように組み合わされ得、これが、本明細書に記載される方法において候補REとして使用され得る。一部の実施形態では、より小さい候補REを生成することが望ましい場合がある。導入遺伝子発現活性を保持するより小さいREは、大きい導入遺伝子を使用する遺伝子治療方法において、および/またはベクターもしくはプラスミドのクローニング能が、遺伝子治療を使用して送達される導入遺伝子のサイズを考慮すると限定的である場合に、有利である。したがって、一部の実施形態では、候補REは、例えば、一度に1つまたは複数の塩基を短縮させ、本発明の方法に従って発現を駆動するその能力について、各得られた候補REを試験することによって、公知の活性を有するREから誘導され得る。
一部の実施形態では、2つまたはそれよりも多くの比較的短いREは、より大きいREを形成するように組み合わされ得、本発明の方法において候補REとして使用され得る。かかる組合せは、高い導入遺伝子発現活性および/またはサイズ正規化遺伝子発現を生じることが以前に示されている。このように、この候補REは、例えば、それが選択的発現を提供できる細胞型を同定するためにスクリーニングされ得る。
一部の実施形態では、本明細書で開示される候補REは、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1000bp、1100bp、1200bp、1300bp、1400bp、1500bp、1600bp、1700bp、1800bp、1900bp、2000bp、2100bp、2200bp、2300bp、2400bp、2500bp、2600bp、2700bp、2800bp、2900bp、3000bp、3100bp、3200bp、3300bp、3400bp、3500bp、3600bp、3700bp、3800bp、3900bp、4000bp、4100bp、4200bp、4300bp、4400bp、4500bp、4600bp、4700bp、4800bp、4900または5000bp以下を含む。
一部の実施形態では、本明細書で開示される候補REは、40bp、45bp、49bp、50bp、56bp、60bp、70bp、80bp、90bp、100bp、110bp、117bp、120bp、130bp、140bp、150bp、160bp、170bp、180bp、190bp、200bp、210bp、220bp、230bp、240bp、250bp、259bp、260bp、265bp、270bp、280bp、290bp、300bp、310bp、320bp、330bp、340bp、350bp、360bp、370bp、380bp、390bpまたは400bp以下を含む。
一部の実施形態では、本発明の方法においてスクリーニングされ得る候補REは、49bp、50bp、56bp、60bp、70bp、80bp、90bp、100bp、110bp、117bp、120bp、130bp、140bp、150bp、160bp、170bp、180bp、190bp、200bp、210bp、220bp、230bp、240bp、250bp、259bp、260bp、265bp、270bp、280bp、290bp、300bp、310bp、320bp、330bp、340bp、350bp、360bp、370bp、380bp、390bpまたは400bp以下である。かかる候補REは、大きい導入遺伝子(例えば、遺伝子治療または発現カセットにおける)の発現を駆動するために有用であり得るが、それは、REが、AAVベクターまたは発現カセット内の大きなスペースを占めることなしに導入遺伝子発現を増強し、したがって、大きい導入遺伝子のためのより大きい容量を可能にするからである。
一部の実施形態では、本明細書に記載される候補REは、40~50bp、45~55bp、50~60bpまたは55~65bpである。一部の実施形態では、候補REは、45~60bpである。一部の実施形態では、本明細書に記載される候補REは、49bpまたは56bpである。一部の実施形態では、候補REは、100bpと150bpとの間、110bpと140bpとの間、110bpと130bpとの間または115bpと125bpとの間であり得る。一部の実施形態では、候補REは、100bpである、または約100bpである。
一部の実施形態では、本明細書に記載される方法における使用のための候補調節エレメントは、候補調節エレメントの同定を可能にする任意の方法(例えば、DNAase過感受性、ATAC-SeqおよびChIP-Seq)を使用して選択され得る。例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれるWO2018187363を参照のこと。一部の実施形態では、調節エレメントは、アッセイに基づく実験(例えば、レポーター遺伝子アッセイ)、ハイスループット実験(例えば、クロマチン免疫沈降実験)または計算的アプローチ(例えば、ChIP-seq)を使用して同定され得る。例えば、Narlikar, et al., 2009, Briefings in Functional Genomics and Proteomics, 8(4): 215-230を参照のこと。一部の実施形態では、計算的方法論が、目的の特定のゲノム(例えば、hg19)中の調節エレメントを同定するために使用され得る。一部の実施形態では、エンハンサーとプロモーターとの間の相互作用を遮断する推定インスレーター領域が同定され得、ゲノム領域内の遺伝子およびエンハンサーの、影響の起こり得る範囲を推定するために使用され得る。例えば、Khan, et al., 2013, Genesis, 51:311-324を参照のこと。一部の実施形態では、系統発生学的フットプリンティングが、シス調節エレメントの計算予測のために使用され得る。特に、系統発生学的フットプリンティングは、進化を通じて保持された部位を見出す転写因子を含み得るDNAの保存されたセグメントを同定するために使用され得る。同文献。一部の実施形態では、系統発生学的フットプリンティングは、推定インスレーター領域によって規定される領域においてのみ使用され、候補調節エレメントの選択を有効に可能にする。同文献。
一部の実施形態では、候補REは、公知の対照RE、例えば、公知のプロモーターに由来する。使用され得る公知の対照プロモーターの例には、CMVプロモーター、スーパーコアプロモーター、TTRプロモーター、Proto 1プロモーター、UCL-HLPプロモーター、AATプロモーター、KARプロモーター、EF1αプロモーター、EFSプロモーター、またはCMVeエンハンサー/CMVプロモーター組合せ、ニワトリβ-アクチンプロモーター(CBA)、CMV初期エンハンサー/CBAプロモーター(CAG)、伸長因子-1αプロモーター(EF1α)、サルウイルス40プロモーター(SV40)、ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター(PGK)およびポリユビキチンC遺伝子プロモーター(UBC)が含まれるがこれらに限定されない。かかる公知の対照REに作動可能に連結した導入遺伝子からの発現のレベルは、候補REに作動可能に連結した導入遺伝子(同じ導入遺伝子)からの発現のレベルに対して分析され得る。
一部の実施形態では、候補REは、本開示の核酸分子中に含められた場合に下流配列の転写を駆動することができる、下流配列(例えば、導入遺伝子)と接近して関連し得るまたはそれと直接接触し得るプロモーターであり得る。プロモーターは、連結された導入遺伝子の高い、中間のまたは低い発現を駆動し得る。
一部の実施形態では、本明細書で開示される候補REは、ヒト由来配列を含む。一部の実施形態では、本開示の候補REは、天然に存在しないものである。一部の実施形態では、候補REは、ヒト参照ゲノム(またはヒトゲノムビルド)中の配列に対して少なくとも80%、90%、95%または99%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。相同な配列は、ヒトゲノムの領域と比較して、少なくとも80%の配列同一性(例えば、BLASTによって測定される)を有する領域を有する配列であり得る。例えば、ヒト配列に対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%または少なくとも99%相同な配列は、ヒト由来配列とみなされる。
一部の実施形態では、ヒト由来候補REは、ヒト配列と100%同一な配列である。一部の実施形態では、候補REの配列は、ヒト由来であり、候補REは、対応するヒト配列とは、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90または95ヌクレオチドまたは塩基対異なる。
一部の実施形態では、候補RE配列の少なくとも5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%または99%は、ヒト由来である。例えば、候補REは、その配列の50%がヒト由来であり得、残りの50%が非ヒト由来であり得る(例えば、マウス由来または完全に合成)。さらなる例として、50%ヒト由来とみなされ、300bpを含む候補REは、ヒトゲノム中の配列に対して全体で45%の配列同一性を有し得、一方で、候補REの塩基対1~150は、ヒトゲノムの類似のサイズの領域に対して90%の同一性(例えば、局所配列同一性)を有し得る。
一部の実施形態では、候補REは、RE全体がヒトゲノムに対して低い配列同一性を有するように、ヒト由来配列および非ヒト由来配列を含む。しかし、候補REの一部は、ヒトゲノムに対して100%の配列同一性を有する。他の例では、候補RE配列の少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%もしくは99%がヒト由来であり、または少なくとも10、20、30、40もしくは50連続するヌクレオチドがヒト由来である。例えば、候補REは、その配列の50%がヒト由来であり得、残りの50%が非ヒト由来であり得る(例えば、マウス由来、ウイルス由来または完全に合成)。
候補REは、異なる種に由来し得る。一部の実施形態では、候補REの少なくとも一部は、ヒト由来である。非ヒト由来REは、哺乳動物、ウイルスまたは合成配列に由来し得る。
本明細書に記載されるように、本開示は、REを同定する方法を企図し、REは、例えば、本明細書に記載される導入遺伝子を含む1つまたは複数の機能的配列に作動可能に連結され得る。DNA分子がベクター中に挿入される前またはその後のいずれかにこの作動可能な連結をもたらす方法は、周知である。
一部の実施形態では、本明細書で開示される候補REは、ゲノムプロモーター配列に由来し得る。一部の実施形態では、本明細書で開示される候補REは、ゲノムプロモーター配列および3’非翻訳領域(3’UTR)の両方に由来し得る。一部の実施形態では、本明細書で開示される候補REは、遺伝子間配列に由来し得る。一部の実施形態では、本明細書で開示される候補REは、遺伝子の下流のゲノム配列、もしくは5’UTR配列、または5’UTRと下流配列との混合物に由来し得る。
一部の実施形態では、候補REは、エンハンサーであり得、プロモーターと併せた発現ベクターにおけるその活性は、エンハンサーなしのそのプロモーターによる同じ導入遺伝子の発現と比較して、特定の型の細胞または細胞の特定の集団において導入遺伝子(例えば、EGFP)の選択的発現(例えば、発現の増加または減少)を提供するかどうかについて評価され得る。
一部の実施形態では、本明細書の候補REは、イントロン配列であるかまたはイントロンを含み、プロモーターと併せた発現ベクターにおけるその活性は、イントロン配列なしのそのプロモーターによる同じ導入遺伝子の発現と比較して、細胞の特定の集団において導入遺伝子(例えば、EGFPをコードする導入遺伝子)の選択的発現を提供するかどうかについて評価され得る。
一部の実施形態では、本明細書の候補REは、プロモーター配列であるかまたはプロモーター配列を含み、導入遺伝子を発現させるために、任意の他のプロモーター配列および/またはエンハンサー配列なしに、本開示の核酸分子中の目的の導入遺伝子に作動可能に連結され得る。
一部の実施形態では、候補REは、5’非翻訳領域(5’UTR)の一部または全てを含む。5’UTR候補REは、いくつかの異なる方法で、遺伝子の発現に影響し得る。5’UTR候補REは、RNA結合タンパク質に対する結合部位を含み得る。さらに、5’UTRにおいてREによって形成される二次構造は、翻訳のために要求されるRNA結合タンパク質の結合に影響を与え得る。一部の例では、候補REは、高度な二次構造を有し得る。一部の実施形態では、候補REは、二次構造をほとんどまたは全く有さなくてもよい。候補REはまた、内部リボソーム進入部位(IRES)を含み得、5’キャップ非依存的な翻訳を可能にする。候補REは、上流の翻訳開始コドン(uAUG)を含み得る。一部の実施形態では、候補REは、上流の翻訳開始コドンを含まない。一部の実施形態では、候補REは、AUGコドンの1塩基以内にいずれのコドンも含まない、または偶然予想されるものよりも少ない、AUGコドンと類似したコドンを含む。一部の実施形態では、候補REは、上流のAUG(または十分に類似した配列)が存在する場合に生じる上流オープンリーディングフレームを含み得、その後にインフレームの停止コドンが続く。一部の例では、候補REは、uORFを含まない。一部の実施形態では、候補REは、マイクロRNA結合部位、またはRNA結合タンパク質に対する結合部位を含む。
一部の実施形態では、本開示の候補REはまた、上に記載のいずれかの機能的断片であり得る。機能的断片がエンハンサー、イントロン配列、プロモーター配列、またはそれらの組合せである場合、機能的断片なしの類似のベクターまたはカセットと比較して、より高い、より低い、またはより選択的な発現が、断片が導入遺伝子に作動可能に連結されている場合に観察される。一部の実施形態では、断片は、25bp、30bp、40bp、50bp、60bp、70bp、80bp、90bp、100bpまたは110bp長未満であるかまたはそれと等しい。一部の実施形態では、ヒトプロモーター配列に由来する本開示の候補REは、ベクター中で、第2のプロモーターなしに使用され得る。
一部の実施形態では、イントロン配列である候補REは、任意のプロモーターにカップリングまたは作動可能に連結され得る。一部の実施形態では、プロモーター配列である候補REは、任意の他のプロモーター配列なしに、導入遺伝子にカップリングまたは作動可能に連結され得る。一部の実施形態では、プロモーター配列およびイントロン配列を含む候補REは、任意の他のプロモーター配列なしに、導入遺伝子にカップリングまたは作動可能に連結され得る。一部の実施形態では、プロモーター配列およびエンハンサー配列を含む候補REは、任意の他のプロモーター配列なしに、導入遺伝子にカップリングまたは作動可能に連結され得る。
微粒子
微粒子
一部の実施形態では、本開示は、本明細書で開示される核酸分子のいずれかが接続されている微粒子を提供する。特定の実施形態では、微粒子に接続されている核酸分子は、本明細書で開示されるDNA核酸のいずれかから転写されるRNA分子である。一部の実施形態では、RNA分子は、導入遺伝子およびバーコード配列を含む。一部の実施形態では、DNA分子は、調節エレメントを含み、RNA分子中のバーコード配列は、DNA分子中の調節エレメントと相関する。一部の実施形態では、微粒子は、ビーズである。一部の実施形態では、微粒子は、微粒子ポリヌクレオチド分子に接続されている。一部の実施形態では、微粒子ポリヌクレオチド配列は、プライマー配列を含む。特定の実施形態では、プライマー配列は、微粒子ポリヌクレオチド配列の少なくとも一部分の増幅および/または発現を促進する。一部の実施形態では、プライマー配列は、微粒子ポリヌクレオチド配列の少なくとも一部分、および微粒子ポリヌクレオチド配列に接続/ハイブリダイズされた本明細書で開示される核酸分子のいずれかの少なくとも一部分の、増幅および/または発現を促進する。一部の実施形態では、微粒子ポリヌクレオチドは、微粒子(例えば、ビーズ)に独自のバーコードヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、各微粒子は、2つまたはそれよりも多くの微粒子ポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、2つまたはそれよりも多くの微粒子ポリヌクレオチドの各々が、異なるUnique Molecular Identifier(UMI)ヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、微粒子ポリヌクレオチドは、オリゴ-dTヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、オリゴ-dT配列は、本明細書で開示される核酸分子のいずれかのポリA部分にハイブリダイズすることが可能である。一部の実施形態では、微粒子ポリヌクレオチド分子は、a)プライマー配列、b)バーコード配列、c)Unique Molecular Identifier(UMI)配列、d)オリゴ-dT配列、およびe)本明細書で開示される核酸分子のいずれかを含む。一部の実施形態では、微粒子ポリヌクレオチド分子は、a)プライマー配列、b)バーコード配列、c)Unique Molecular Identifier(UMI)配列、d)オリゴ-dT配列、およびe)本明細書で開示される核酸分子のいずれかを含み;核酸は、ポリAヌクレオチド配列を含み、微粒子は、以下の順序:微粒子--a)--b)--c)--d)--e)でa)~e)に接続され;ポリA配列は、オリゴ-dT配列にハイブリダイズされている。一部の実施形態では、微粒子ポリヌクレオチド分子は、a)プライマー配列、b)バーコード配列、c)Unique Molecular Identifier(UMI)配列、d)オリゴ-dT配列、およびe)本明細書で開示される核酸分子のいずれかを含み;核酸は、ポリAヌクレオチド配列を含み、微粒子は、以下の順序:微粒子--a)--c)--b)--d)--e)でa)~e)に接続され;ポリA配列は、オリゴ-dT配列にハイブリダイズされている。
送達方法および組成物
送達方法および組成物
一部の実施形態では、本開示は、本明細書で開示される核酸分子のいずれかを含むベクター(例えば、本明細書で開示されるベクターのいずれか)を提供する。一部の実施形態では、ベクターは、ウイルスベクター(例えば、アデノ随伴ウイルスベクター)である。一部の実施形態では、ベクターは、ウイルス粒子である。一部の実施形態では、ベクターは、非ウイルスベクターである。
一部の実施形態では、本明細書に記載される核酸分子は、当該分野で利用可能な様々な公知の適切な方法を使用して、in vitroまたはin vivoで細胞または組織に提供(または送達)される。従来のウイルスおよび非ウイルスに基づく遺伝子送達方法が、本明細書で開示される核酸分子を細胞(例えば、哺乳動物細胞)および標的組織中に導入するために使用され得る。非ウイルス発現ベクター系には、核酸ベクター、例えば、直鎖状オリゴヌクレオチドおよび環状プラスミドなど;人工染色体、例えば、ヒト人工染色体(HAC)、酵母人工染色体(YAC)および細菌人工染色体(BACまたはPAC);エピソームベクター;トランスポゾン(例えば、PiggyBac);ならびにコスミドが含まれる。ウイルスベクター送達系には、DNAおよびRNAウイルス、例えば、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクターなどが含まれる。本明細書に記載される核酸分子を非ウイルスおよびウイルス発現系のいずれか中に組み込む方法は、当業者に公知である。
核酸の非ウイルス的送達のための方法および組成物は、当該技術分野で公知であり、物理的方法および化学的方法を含む。物理的方法は、一般に、遺伝子材料の細胞内送達を促進するにあたって、細胞膜障壁に対抗するために物理的力を使用する送達の方法を指す。物理的方法の例には、針の使用、弾道DNA(ballistic DNA)、電気穿孔、ソノポレーション(sonoporation)、フォトポレーション(photoporation)、マグネトフェクションおよびハイドロポレーション(hydroporation)が含まれる。化学的方法は、一般に、化学的キャリアが核酸分子を細胞に送達する方法を指し、これには、無機粒子、脂質に基づくキャリア、ポリマーに基づくキャリアおよびペプチドに基づくキャリアが含まれ得る。
一部の実施形態では、非ウイルス発現ベクターは、無機粒子を使用して標的細胞に投与される。無機粒子は、細網内皮系から逃れるか、または捕捉された分子を分解から保護するために様々なサイズ、形状、および/または多孔性について操作されたナノ粒子などのナノ粒子を指してもよい。無機ナノ粒子を、金属(例えば、鉄、金、および銀)、無機塩、またはセラミックス(例えば、カルシウム、マグネシウム、もしくはケイ素のリン酸塩もしくは炭酸塩)から調製することができる。これらのナノ粒子の表面をコーティングして、DNA結合または標的化遺伝子送達を容易にすることができる。磁気ナノ粒子(例えば、超磁性酸化鉄)、フラーレン(例えば、可溶性炭素分子)、炭素ナノチューブ(例えば、円筒状フラーレン)、量子ドットおよび超分子系を使用することもできる。
一部の実施形態では、非ウイルス発現ベクターは、カチオン性脂質(例えば、カチオン性リポソーム)を使用して、標的細胞に投与される。種々の型の脂質が、遺伝子送達、例えば、脂質ナノエマルジョン(例えば、これは、乳化剤によって安定化した別の不混和性液体中の1つの不混和性液体の分散物である)または固体脂質ナノ粒子などについて調査されている。一部の実施形態では、非ウイルス発現ベクターは、脂質ナノ粒子(LNP)を使用して送達され得る。一部の実施形態では、LNPは、カチオン性脂質を含む。一部の実施形態では、LNPは、3-((4,4-ビス(オクチルオキシ)ブタノイル)オキシ)-2-((((3-(ジエチルアミノ)プロポキシ)カルボニル)オキシ)メチル)プロピル(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエノエートとも呼ばれる(9Z,12Z)-3-((4,4-ビス(オクチルオキシ)ブタノイル)オキシ)-2-((((3-(ジエチルアミノ)プロポキシ)カルボニル)オキシ)メチル)プロピルオクタデカ-9,12-ジエノエート、または別のイオン化可能な脂質を含む。例えば、WO2017/173054、WO2015/095340およびWO2014/136086、ならびにその中で提供される参考文献の脂質を参照のこと。
一部の実施形態では、非ウイルス発現ベクターは、ペプチドに基づく送達ビヒクルを使用して、標的細胞に投与される。ペプチドに基づく送達ビヒクルは、送達される遺伝子材料を保護する、特異的細胞受容体を標的化する、エンドソーム膜を破壊する、および遺伝子材料を核中に送達するという利点を有し得る。一部の実施形態では、非ウイルス発現ベクターは、ポリマーに基づく送達ビヒクルを使用して、標的細胞に投与される。ポリマーに基づく送達ビヒクルは、天然のタンパク質、ペプチドおよび/もしくは多糖または合成ポリマーを含み得る。一実施形態では、ポリマーに基づく送達ビヒクルは、ポリエチレンイミン(PEI)を含む。PEIは、アニオン性細胞表面残基に結合しエンドサイトーシスを介して細胞中に持ち込まれる正に荷電した粒子へと、DNAを凝縮させ得る。他の実施形態では、ポリマーに基づく送達ビヒクルは、ポリ-L-リシン(PLL)、ポリ(DL-乳酸)(PLA)、ポリ(DL-ラクチド-コ-グリコシド)(PLGA)、ポリオルニチン、ポリアルギニン、ヒストン、プロタミン、デンドリマー、キトサン、デキストランの合成アミノ誘導体、および/またはカチオン性アクリルポリマーを含み得る。ある特定の実施形態では、ポリマーに基づく送達ビヒクルは、ポリマー、例えば、PEGおよびPLLなどの混合物を含み得る。
一部の実施形態では、本明細書に開示される任意の核酸分子は、導入遺伝子およびバーコード配列に作動可能に連結した候補調節エレメントを含み、任意の公知の適切なウイルスベクターを使用して送達することができ、例えば、レトロウイルス(例えば、A型、B型、C型およびD型ウイルス)、アデノウイルス、パルボウイルス(例えば、アデノ随伴ウイルス即ちAAV)、コロナウイルス、マイナス鎖RNAウイルス、例えば、オルソミクソウイルス(例えば、インフルエンザウイルス)、ラブドウイルス(例えば、狂犬病および水疱性口内炎ウイルス)、パラミクソウイルス(例えば、麻疹およびセンダイ)、プラス鎖RNAウイルス、例えば、ピコルナウイルスおよびアルファウイルス、ならびにアデノウイルス、ヘルペスウイルス(例えば、単純ヘルペスウイルス1型および2型、エプスタイン・バーウイルス、サイトメガロウイルス)およびポックスウイルス(例えば、ワクシニア、鶏痘およびカナリアポックス)を含む二本鎖DNAウイルスが含まれる。レトロウイルスの例には、トリ白血症肉腫ウイルス、ヒトTリンパ球向性ウイルス1型(HTLV-1)、ウシ白血病ウイルス(BLV)、レンチウイルスおよびスプーマウイルスが含まれる。他のウイルスには、例えば、ノーウォークウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、レオウイルス、パポバウイルス、ヘパドナウイルスおよび肝炎ウイルスが含まれる。ウイルスベクターは、宿主ゲノム中に組み込まれるそれらの能力に従って、2つの群 - 組み込みおよび非組み込みに分類され得る。オンコレトロウイルス(oncoretrovirus)およびレンチウイルスは、宿主細胞クロマチン中に組み込まれ得るが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスおよびヘルペスウイルスは、細胞核中で染色体外エピソームとして優勢に存続する。
一部の実施形態では、適切なウイルスベクターは、レトロウイルスベクターである。レトロウイルスは、レトロウイルス科のウイルスを指す。レトロウイルスの例には、オンコレトロウイルス、例えば、マウス白血病ウイルス(MLV)、およびレンチウイルス、例えば、ヒト免疫不全ウイルス1(HIV-1)が含まれる。レトロウイルスゲノムは、一本鎖(ss)RNAであり、シスまたはトランスで提供され得る種々の遺伝子を含む。例えば、レトロウイルスゲノムは、遺伝子発現、逆転写および宿主染色体中への組み込みのためのエレメントと共に、シス作用性配列、例えば、2つの長い末端反復(LTR)を含み得る。他の成分には、新たに形成されたビリオン中への特異的RNAパッケージングのためのパッケージングシグナル(プサイ即ちψ)、および逆転写の間のプラス鎖DNA合成の開始の部位であるポリプリントラクト(PPT)が含まれる。さらに、一部の実施形態では、レトロウイルスゲノムは、gag、polおよびenv遺伝子を含み得る。gag遺伝子は、構造タンパク質をコードし、pol遺伝子は、ssRNAに付随しウイルスRNAのDNAへの逆転写を実行する酵素をコードし、env遺伝子は、ウイルスエンベロープをコードする。一般に、gag、polおよびenvは、ウイルスの複製およびパッケージングのためにトランスで提供される。
一部の実施形態では、本明細書で提供されるレトロウイルスベクターは、レンチウイルスベクターであり得る。少なくとも5つの血清群または血清型のレンチウイルスが認識されている。異なる血清型のウイルスは、ある特定の細胞型および/または宿主に示差的に感染し得る。レンチウイルスには、例えば、霊長類レトロウイルスおよび非霊長類レトロウイルスが含まれる。霊長類レトロウイルスには、HIVおよびサル免疫不全ウイルス(SIV)が含まれる。非霊長類レトロウイルスには、ネコ免疫不全ウイルス(FIV)、ウシ免疫不全ウイルス(BIV)、ヤギ関節炎脳炎ウイルス(CAEV)、ウマ伝染性貧血ウイルス(EIAV)およびビスナウイルスが含まれる。レンチウイルスまたはレンチベクターは、静止状態の細胞を形質導入することが可能であり得る。オンコレトロウイルスベクターと同様、レンチベクターの設計は、シス作用性配列およびトランス作用性配列の分離に基づき得る。
一部の実施形態では、本開示は、最適化された治療的レトロウイルスベクターによる送達のために設計された発現ベクターを提供する。レトロウイルスベクターは、左(5’)LTR;ウイルスのパッケージングおよび/または核インポートを補助する配列;プロモーター;必要に応じて1つまたは複数のさらなる調節エレメント(例えば、エンハンサーまたはポリA配列など);必要に応じてレンチウイルス逆応答エレメント(RRE);導入遺伝子(例えば、EGFP-KASH)をコードする配列に作動可能に連結した候補調節エレメントを含む構築物;必要に応じてインスレーター;ならびに右(3’)レトロウイルスLTRのうちの任意の1つまたは複数を含むレンチウイルスであり得る。
一部の実施形態では、本明細書で提供されるウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス(AAV)である。AAVは、ヒトおよび一部の他の霊長類種に感染する小さい複製欠損非エンベロープ型動物ウイルスである。AAVは、ヒト疾患を引き起こさないことが公知であり、軽度の免疫応答を誘導する。AAVベクターはまた、宿主細胞ゲノム中に組み込まれることなしに、分裂細胞および静止状態の細胞の両方に感染できる。
AAVゲノムは、天然には、約4.7kb長の直鎖状一本鎖DNAからなる。ゲノムは、約145bp長の逆位末端反復(ITR)配列が隣接する2つのオープンリーディングフレーム(ORF)からなる。ITRは、パリンドローム配列を含む5’末端におけるヌクレオチド配列(5’ITR)および3’末端に位置するヌクレオチド配列(3’ITR)からなる。これらのITRは、相補的塩基対合によって、第2鎖合成のためのDNA複製の開始の間にプライマーとして機能するT字型ヘアピン構造を形成するように折り畳まれることによって、シスで機能する。2つのオープンリーディングフレームは、ビリオンの複製およびパッケージングに関与するrep遺伝子およびcap遺伝子をコードする。一部の実施形態では、本明細書で提供されるAAVベクターは、rep遺伝子もcap遺伝子も含まない。かかる遺伝子は、以下にさらに記載されるように、ビリオンを産生するためにトランスで提供され得る。
一部の実施形態では、AAVベクターは、スタッファー核酸を含み得る。一部の実施形態では、スタッファー核酸は、緑色蛍光タンパク質またはカナマイシンもしくはアンピシリンなどの抗生物質に対する耐性を提供する抗生物質耐性遺伝子をコードし得る。ある特定の実施形態では、スタッファー核酸は、ITR配列の外側に配置してよい(例えば、5’ITR配列と3’ITR配列との間に位置する導入遺伝子配列および調節配列と比較して)。
一部の実施形態では、AAVベクターは、AAV1、AAV2、AAV3、AAV3b、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV-DJ、AAV-DJ8、AAV-DJ9またはキメラ、ハイブリッドもしくはバリアントAAVのいずれか1つである。AAVはまた、自己相補的AAV(scAAV)であり得る。これらの血清型は、それらのトロピズム、またはそれらが感染する細胞の型が異なる。一部の実施形態では、AAVベクターは、複数の血清型由来のゲノムおよびカプシドを含む(例えば、シュードタイプ)。例えば、AAVは、血清型5または血清型9由来のカプシド中にパッケージングされた血清型2のゲノム(例えば、ITR)を含み得る。シュードタイプは、形質導入効率を改善し得るだけでなく、トロピズムを変更させ得る。一部の実施形態では、AAVは、AAV9血清型である。ある特定の実施形態では、AAVによる送達のために設計された発現ベクターは、5’ITRおよび3’ITRを含む。
一部の実施形態では、AAV血清型6またはAAV血清型9のITRが、本明細書で開示されるAAVベクターのいずれかにおいて使用され得る。しかし、他の適切な血清型由来のITRが選択され得る。一部の実施形態では、本明細書で開示される任意の核酸分子は、カプシドタンパク質中にパッケージングされ、選択された宿主細胞に送達される。本開示のAAVベクターを、様々なアデノ随伴ウイルスから生成することができる。ベクターの向性を、ある血清型の組換えゲノムを、別のAAV血清型に由来するカプシド中にパッケージングすることによって変更することができる。一部の実施形態では、rAAVウイルスのITRは、AAV1~12のいずれか1つのITRに基づくものであってよく、AAV1~12、AAV-DJ、AAV-DJ8、AAV-DJ9または他の改変血清型のいずれか1つから選択されるAAVカプシドと組み合わせることができる。特定の実施形態では、AAVのITRおよび/またはカプシドは、AAVベクターで標的化される細胞または組織に基づいて選択される。
一部の実施形態では、本開示は、本明細書で開示される核酸のいずれかを含むベクターを提供し、ベクターは、AAVベクターまたはAAVウイルス粒子、すなわちビリオンである。一部の実施形態では、AAVベクターまたはAAVウイルス粒子、すなわちビリオンは、本明細書で開示される導入遺伝子のいずれかに作動可能に連結した本明細書で開示される候補調節エレメントのいずれかを含む本明細書で開示される核酸分子のいずれかを、in vivo、ex vivoまたはin vitroのいずれかで送達するために使用され得る。一部の実施形態では、かかるAAVベクターは、複製欠損である。一部の実施形態では、AAVウイルスは、ヘルパー因子の存在下でのみ複製しビリオンを生成することができるように、操作または遺伝子改変される。
一部の実施形態では、導入遺伝子に作動可能に連結した1つまたは複数の候補調節エレメントは、その候補調節エレメントが、標的細胞、細胞型または組織において導入遺伝子の選択的(例えば、増加または減少した)発現を提供するかどうかを決定するために、本明細書に記載される方法を使用してスクリーニングされ得る。一部の実施形態では、AAVによる送達のために設計された発現ベクターは、5’ITR、プロモーター、導入遺伝子(例えば、EGFP-KASHをコードする導入遺伝子)に作動可能に連結した候補調節エレメントおよびバーコード配列を含む核酸分子、ならびに3’ITRを含む。一部の実施形態では、AAVによる送達のために設計された発現ベクターは、5’ITR、エンハンサー、プロモーター、導入遺伝子(例えば、EGFP-KASHをコードする導入遺伝子)に作動可能に連結した候補調節エレメントおよびバーコード配列を含む核酸分子、ポリA配列、ならびに3’ITRを含む。
一部の実施形態では、本開示は、本明細書に開示される任意の核酸を含むウイルスベクターを提供する。用語「ウイルス粒子」および「ビリオン」は、本明細書で相互交換可能に使用され、カプシド内、場合によっては、例えば、レトロウイルスについては、カプシドを取り囲む脂質エンベロープ内にパッケージングされたウイルスゲノム(例えば、ウイルス発現ベクター)を含む感染性の、典型的には複製欠損性のウイルス粒子に関する。「カプシド」は、ウイルスゲノムが中にパッケージングされる構造を指す。カプシドは、タンパク質でできた数個のオリゴマー構造サブユニットからなる。例えば、AAVは、3つのカプシドタンパク質:VP1、VP2およびVP3の相互作用によって形成された正二十面体カプシドを有する。一部の実施形態では、本明細書で提供されるビリオンは、本明細書に記載される導入遺伝子およびバーコード配列に作動可能に連結した候補調節エレメントを含むAAVベクターをタンパク質シェル中にパッケージングすることによって得られた、組換えAAVビリオンである。
一部の実施形態では、本明細書で提供される組換えAAVビリオンは、同じ特定の血清型のAAVに対応する天然のCapタンパク質によって形成されるウイルス粒子中に、特定のAAV血清型に由来するAAVゲノムをカプシド封入することによって調製され得る。他の実施形態では、本明細書で提供されるAAVウイルス粒子は、異なる血清型由来のタンパク質中にパッケージングされた所与のAAV血清型のITR(複数可)を含むウイルスベクターを含む。例えば、Bunning H et al. J Gene Med 2008; 10: 717-733を参照のこと。例えば、所与のAAV血清型由来のITRを有するウイルスベクターは、以下へとパッケージングされ得る:a)同じもしくは異なるAAV血清型に由来するカプシドタンパク質から構成されるウイルス粒子(例えば、AAV2のITRおよびAAV9のカプシドタンパク質;AAV2のITRおよびAAV8のカプシドタンパク質;など);b)異なるAAV血清型もしくは変異体由来のカプシドタンパク質の混合物から構成されるモザイクウイルス粒子(例えば、AAV1およびAAV9のカプシドタンパク質と共にAAV2のITR);c)異なるAAV血清型もしくはバリアント間でのドメイン交換によって短縮されたカプシドタンパク質から構成されるキメラウイルス粒子(例えば、AAV9ドメインを有するAAV8のカプシドタンパク質と共にAAV2のITR);またはd)標的細胞特異的受容体とのストリンジェントな相互作用を可能にする選択的結合ドメインを呈するように操作された標的化されたウイルス粒子(例えば、ペプチドリガンドの挿入によって遺伝的に短縮されたAAV9のカプシドタンパク質と共にAAV5のITR;またはカプシド表面へのペプチドリガンドのカップリングによって非遺伝的に改変されたAAV9のカプシドタンパク質)。
当業者は、本明細書で提供されるAAVビリオンが、任意のAAV血清型のカプシドタンパク質を含み得ることを理解する。一実施形態では、ウイルス粒子は、AAV1、AAV2、AAV5、AAV6、AAV8およびAAV9からなる群から選択されるAAV血清型由来のカプシドタンパク質を含む。
トランスフェクション、安定な細胞系産生、ならびにアデノウイルス-AAVハイブリッド、ヘルペスウイルス-AAVハイブリッド(Conway, J E et al., (1997) J. Virology 71(11):8780-8789)およびバキュロウイルス-AAVハイブリッドを含む感染性ハイブリッドウイルス産生系を含む多数の方法が、rAAVビリオンの産生のために当該分野で公知である。一部の実施形態では、rAAVウイルス粒子の産生のためのrAAV産生培養は、以下を含む;1)例えば、ヒト由来細胞系、例えば、HeLa、A549もしくは293細胞、または昆虫由来細胞系、例えば、バキュロウイルス産生系の場合にはSF-9を含む、適切な宿主細胞;2)野生型もしくは変異体アデノウイルス(例えば、温度感受性アデノウイルス)、ヘルペスウイルス、バキュロウイルス、またはヘルパー機能を提供するプラスミド構築物によって提供される、適切なヘルパーウイルス機能;3)AAVのrepおよびcapの遺伝子および遺伝子産物;4)AAV ITR配列が隣接する導入遺伝子に作動可能に連結した候補調節エレメントを含む核酸分子(例えば、本明細書に記載されるレポーター遺伝子配列に作動可能に連結した核結合ドメインをコードするヌクレオチド配列)(核酸分子は1つまたは複数のバーコード配列を含む);ならびに5)rAAV産生を支持するための適切な培地および培地成分。
一部の実施形態では、産生細胞系は、Repタンパク質およびCapタンパク質を提供するバキュロウイルス発現ベクターを感染させた昆虫細胞系(典型的にはSf9細胞)である。この系は、アデノウイルスヘルパー遺伝子を必要としない(Ayuso E, et
al., Curr. Gene Ther. 2010, 10:423-436)。
al., Curr. Gene Ther. 2010, 10:423-436)。
用語「capタンパク質」は、本明細書で使用される場合、ネイティブAAV Capタンパク質(例えば、VP1、VP2、VP3)の少なくとも1つの機能的活性を有するポリペプチドを指す。capタンパク質の機能的活性の例には、カプシドの形成を誘導する能力、一本鎖DNAの蓄積を促進する能力、カプシド中へのAAV DNAのパッケージング(即ち、カプシド封入)を促進する能力、細胞受容体に結合する能力、および宿主細胞中へのビリオンの進入を促進する能力が含まれる。原則として、任意のCapタンパク質が、本発明の文脈において使用し得る。
capタンパク質は、AAVウイルスの宿主トロピズム、細胞、組織または臓器特異性、受容体の使用法、感染効率および免疫原性に対して影響を有することが報告されている。従って、rAAVにおける使用のためのAAV capは、例えば、対象の種(例えば、ヒトまたは非ヒト)、対象の免疫学的状態、長期もしくは短期処置への対象の適性、または特定の治療的適用(例えば、特定の疾患もしくは障害の処置、または特定の細胞、組織もしくは臓器への送達)を考慮して選択され得る。ある特定の実施形態では、capタンパク質は、AAV1、AAV2、AAV5、AAV6、AAV8およびAAV9血清型からなる群のAAVに由来する。
一部の実施形態では、本明細書に提供される方法における使用のためのAAV Capは、上述のAAV capまたはそのコード核酸のうち1つの変異誘発(即ち、挿入、欠失または置換による)によって生成され得る。一部の実施形態では、AAV capは、上述のAAV capのうち1つまたは複数に対して少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%もしくは99%のまたはそれより高い類似性がある。
一部の実施形態では、AAV capは、上述のAAV capのうち2個、3個、4個またはそれよりも多くに由来するドメインを含むキメラである。一部の実施形態では、AAV capは、2個もしくは3個の異なるAAVまたは組換えAAVに由来するVP1、VP2およびVP3モノマーのモザイクである。一部の実施形態では、rAAV組成物は、上述のcapのうち1つよりも多くを含む。
一部の実施形態では、rAAVビリオンにおける使用のためのAAV capは、異種配列または他の改変を含むように操作される。例えば、選択的標的化または免疫回避を付与するペプチドまたはタンパク質配列が、capタンパク質中に操作により導入され得る。あるいは、またはさらに、capは、rAAVの表面がポリエチレングリコール化(即ち、ペグ化)されるように化学的に改変され得、これにより、免疫回避を促進し得る。capタンパク質はまた、(例えば、その天然の受容体結合を除去するために、または免疫原性エピトープをマスクするために)変異誘発され得る。
用語「repタンパク質」は、本明細書で使用される場合、ネイティブAAV repタンパク質(例えば、rep 40、52、68、78)の少なくとも1つの機能的活性を有するポリペプチドを指す。repタンパク質の機能的活性の例には、AAVのDNA複製起点の認識、結合およびニック形成を介してDNAの複製を促進すること、ならびにDNAヘリカーゼ活性を含む、タンパク質の生理学的機能に関連する任意の活性が含まれる。さらなる機能には、AAV(または他の異種)プロモーターからの転写のモジュレーション、および宿主染色体中へのAAV DNAの部位特異的組み込みが含まれる。一部の実施形態では、AAV rep遺伝子は、血清型AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10またはAAVrh10由来であり得る。
一部の実施形態では、本発明の方法における使用のためのAAV repタンパク質は、上述のAAV repまたはそのコード核酸のうち1つの変異誘発(即ち、挿入、欠失または置換による)によって生成され得る。一部の実施形態では、AAV repは、上述のAAV repのうち1つまたは複数と少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%もしくは99%のまたはそれより高い類似性がある。
表現「ヘルパー機能」または「ヘルパー遺伝子」は、本明細書で使用される場合、複製のためにAAVが依存するウイルスタンパク質を指す。ヘルパー機能には、AAV遺伝子転写の活性化、ステージ特異的AAV mRNAスプライシング、AAV DNA複製、cap発現産物の合成、およびAAVカプシドアセンブリに関与するタンパク質が含まれるがこれらに限定されない、AAV複製に必要とされるタンパク質が含まれる。ウイルスに基づくアクセサリー機能は、公知のヘルパーウイルス、例えば、アデノウイルス、ヘルペスウイルス(単純ヘルペスウイルス1型以外)およびワクシニアウイルスのいずれかに由来し得る。ヘルパー機能には、アデノウイルスE1、E2a、VAおよびE4またはヘルペスウイルスUL5、ULB、UL52およびUL29、ならびにヘルペスウイルスポリメラーゼが含まれるがこれらに限定されない。好ましい実施形態では、複製のためにAAVが依存するタンパク質は、アデノウイルスに由来する。
一部の実施形態では、本発明の方法における使用のための、複製のためにAAVが依存するウイルスタンパク質は、上述のウイルスタンパク質またはそのコード核酸のうち1つの変異誘発(即ち、挿入、欠失または置換による)によって生成され得る。一部の実施形態では、ウイルスタンパク質は、上述のウイルスタンパク質のうち1つまたは複数に対して少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%もしくは99%のまたはそれより高い類似性がある。
複製のためにAAVが依存するcapタンパク質、repタンパク質およびウイルスタンパク質の機能をアッセイするための方法は、当該分野で周知である。
一部の実施形態では、ウイルス発現ベクターは、標的細胞に投与するために、脂質送達ビヒクル(例えば、本明細書に記載されるカチオン性リポソームまたはLNP)と関連させることができる。
本明細書に記載される核酸分子を含む様々な送達系が、細胞へのin vivoでの送達のために生物体に投与され得、または細胞もしくは細胞培養物にex vivoで投与され得る。投与は、注射、注入、局所的適用および電気穿孔が含まれるがこれらに限定されない、血液、体液または細胞と最終的に接触するように分子を導入するために通常使用される経路のいずれかによる投与である。かかる核酸を投与する適切な方法は、当業者に利用可能であり、公知である。
核酸分子は、様々な細胞および/または組織を標的化するために、in vitro、in vivoまたはex vivoで送達され得る。一部の実施形態では、送達は、様々な臓器/組織および対応する細胞に、例えば、脳、心臓、骨格筋、肝臓、腎臓、脾臓または胃に標的化され得る。一部の実施形態では、核酸分子は、神経細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、肝細胞、ポドサイトまたは上皮細胞のいずれか1つまたは複数に送達される。一部の実施形態では、送達は、罹患細胞、例えば、腫瘍またはがん細胞などに標的化され得る。一部の実施形態では、送達は、幹細胞、血液細胞または免疫細胞に標的化され得る。
一部の実施形態では、本開示は、本明細書で開示されるベクターのいずれかまたは本明細書で開示される核酸のいずれかの混合物を提供する。一部の実施形態では、混合物は、2個またはそれよりも多くの核酸分子を含み、核酸分子の各々は、異なるバーコードヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、混合物は、約101~約104個の核酸分子を含み、各核酸分子は、異なる調節エレメントを含む。一部の実施形態では、混合物は、約101個の核酸分子を含み、各核酸分子は、異なる調節エレメントを含む。一部の実施形態では、混合物は、約102個の核酸分子を含み、各核酸分子は、異なる調節エレメントを含む。一部の実施形態では、混合物は、約103個の核酸分子を含み、各核酸分子は、異なる調節エレメントを含む。一部の実施形態では、混合物は、約104個の核酸分子を含み、各核酸分子は、異なる調節エレメントを含む。一部の実施形態では、混合物または核酸分子は、約10、約50、約100、約250、約500、約750、約1000、約1250、約1500、約1750、約2000、約2500、約3000、約3500、約4000、約4500、約5000、約5500、約6000、約6500、約7000、約7500、約8000、約8500、約9000、約9500、約10000個またはそれよりも多くの異なる調節エレメントを含む。
多重アッセイの方法
多重アッセイの方法
本明細書に記載されるように、本開示は、細胞の特定の集団において目的の導入遺伝子の選択的発現を提供する調節エレメントを同定するために、調節エレメントをスクリーニングするハイスループット方法(例えば、in vivoまたはin vitro)に一部関する。
一部の実施形態では、これらの方法は、2つまたはそれよりも多くの細胞(例えば、細胞または組織の集団)に、導入遺伝子(例えば、レポーター遺伝子および調節エレメント同定のためのバーコードを含む導入遺伝子)をコードする配列に作動可能に連結した候補調節エレメントを含む核酸配列を各々が含むベクターの混合物を提供すること/かかる細胞をかかる混合物で処理することを含む。一部の実施形態では、本明細書で開示される方法のいずれかは、本明細書で開示される核酸またはベクターのいずれかを細胞の集団に投与するステップを含み得る。投与は、注射、注入、局所的適用および電気穿孔が含まれるがこれらに限定されない、細胞の集団と最終的に接触するように分子を導入するために通常使用される経路のいずれかによる投与である。一部の実施形態では、細胞の集団中の細胞は、哺乳動物細胞である。一部の実施形態では、細胞の集団中の細胞は、ヒト細胞である。一部の実施形態では、細胞の集団は、in vitroである。一部の実施形態では、細胞の集団は、in vivoである。一部の実施形態では、細胞の集団は、動物由来の組織または臓器中にある。一部の実施形態では、細胞の集団は、動物中にある。一部の実施形態では、動物は、マウス、ラット、カエル、イヌ、ウサギ、モルモットまたは非ヒト霊長類である。一部の実施形態では、非ヒト霊長類は、カニクイザルまたはチンパンジーである。一部の実施形態では、細胞の集団が動物中の組織もしくは臓器中にある場合、組織もしくは臓器(または組織もしくは臓器由来の試料)は、細胞の集団から細胞を分離/単離するために、動物から取り出される(例えば、外科的に取り出される)(以下にさらに詳細に記載される)。一部の実施形態では、細胞の集団は、動物中にあり、ベクターおよび/または核酸は、以下の投与の経路のいずれか1つまたは複数によって、動物に投与される:静脈内、皮下、経口、鼻腔内、筋肉内、眼内、目的の組織中への直接注射、または髄腔内。
一部の実施形態では、本発明の方法に従って調節エレメントを同定するために、処置された細胞または組織の個々の細胞は、以下に記載されるように、例えば、導入遺伝子発現を評価するため、導入遺伝子を発現する各細胞の正体を決定するため、および/または発現された導入遺伝子を、(例えば、バーコードを使用して)起源である調節エレメントと相関させるためのさらなる分析のために、分離および単離される。
単一細胞RNA単離
単一細胞RNA単離
一部の実施形態では、本開示は、細胞の混合物から単一細胞(例えば、組織、臓器または体液(例えば、血清)からの細胞)の単離または分離を可能にする任意の方法を組み込む方法を提供する。一部の実施形態では、調節エレメントに作動可能に連結した導入遺伝子を発現する各細胞は、細胞の各々のトランスクリプトームを配列決定するために、分離/単離される。一般に、細胞の混合物から個々の細胞(例えば、組織、臓器または体液(例えば、血清)からの細胞)を分離するための様々な方法が、当該分野で公知である。かかる方法には、細胞分離組成物における浮遊密度に基づいて細胞を分離すること(米国特許第4,927,750号)、抗血清学的因子でコーティングされたラテックスビーズを使用して密度勾配上で血清学的因子を分離すること(米国特許第3,862,303号)、磁場の使用を介して細胞を分離すること(米国特許第4,777,145号)、ならびに密度勾配上でTおよびB細胞を分離すること(米国特許第4,511,662号)が含まれるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、個々の細胞は、例えば、FACS選別を使用することによって、細胞内のまたは細胞に結合した蛍光マーカーによって放射される蛍光強度に基づいて分離される。当業者は、特定の文脈または適用に適切なプロセスを容易に実施できる。例えば、ある特定の細胞型(例えば、ニューロンおよび脂肪細胞)の細胞膜は、インタクトな組織からの解離の間に破壊される傾向がある。したがって、ある特定の標準的な臓器解離技術(例えば、酵素的および機械的力)が、一部の細胞型について他よりも適している。一部の場合には、特定の適用に依存して、細胞は、インタクトなままで(例えば、溶解なしに)分離/単離される。一部の実施形態では、細胞の核が、インタクトなままで(例えば、溶解なしに)分離/単離される。
一部の実施形態では、個々の細胞は、細胞の集団から、例えば、組織供給源から単離され得る。本発明の方法において使用され得る組織供給源の例には、結合組織、筋肉組織、神経組織および上皮組織が含まれる。本発明の方法の適用において分離/単離され分析され得る結合組織の細胞の例には、例えば、線維芽細胞、脂肪細胞、マクロファージ、マスト細胞、形質細胞などが含まれる。本発明の方法の適用において分離/単離され分析され得る筋肉組織の細胞の例には、例えば、心筋細胞、骨格筋細胞、心臓筋肉細胞、平滑筋細胞などが含まれる。本発明の方法の適用において分離/単離され分析され得る神経組織の細胞の例には、例えば、ニューロン、グリアなどが含まれる。本発明の方法の適用において分離/単離され分析され得る神経組織の細胞の例には、神経細胞のサブタイプ、例えば、グルタミン酸デカルボキシラーゼ2(GAD2)、GAD1、NKX2.1、DLX1、DLX5、SST、PVまたはVIPを発現するGABA作動性ニューロンなどを含むGABA作動性細胞が含まれる。本発明の方法の適用において分離/単離され分析され得る上皮組織の細胞の例には、例えば、扁平上皮、立方上皮、円柱上皮などが含まれる。一部の実施形態では、個々の細胞は、血液細胞から分離/単離され得る。一部の実施形態では、個々の細胞は、例えば、骨髄由来の幹細胞の集団から分離/単離され得る。一部の実施形態では、個々の細胞は、腫瘍から分離/単離され得る。一部の実施形態では、個々の細胞は、がんから分離/単離され得る。
一部の実施形態では、本開示は、分離/単離された細胞の選別を可能にする任意の方法を組み込む方法を提供する。一部の実施形態では、分離/単離された細胞(または核)は、単一細胞RNAシークエンシングを受ける前に選別される。ある特定の実施形態では、細胞は、例えば、導入遺伝子(例えば、本明細書で例示される、EGFPまたはEGFP-KASHなどのタンパク質をコードするレポーター遺伝子)の発現、天然の細胞特異的マーカーの存在、または付加された標識の存在に基づいて、単離および選別される。細胞選別を目的とした様々なレポーター遺伝子、天然の細胞特異的マーカーおよび標識が、本明細書に記載されるように、当該分野で公知である。当業者は、レポーター導入遺伝子または標識が、必要に応じて、細胞の任意の部分(例えば、細胞表面または核膜の表面)において発現されるように設計され得ることを認識する。例えば、KASHタンパク質(Klarsicht,ANC-1,Syne相同性)およびSUNタンパク質(Sad1およびUNC-84)は、共に代表的な核結合ドメイン配列であり、核膜の外側膜に発現および局在化する。本明細書で例示されるように、蛍光マーカーおよび核結合ドメイン配列を含む導入遺伝子の発現は、導入遺伝子の発現に基づく核選別を可能にする。様々な細胞選別方法、例えば、蛍光活性化細胞選別(FACS)および磁気活性化細胞選別(MACS)が、本開示の実施において使用され得る。
一部の実施形態では、分離された細胞は、単一細胞RNAシークエンシングを受ける前に選別されない。
一部の実施形態では、当業者に公知の任意の標識化物質が、上に記載の細胞選別方法と組み合わせて利用され得る。ある特定の実施形態では、細胞は、レポーター遺伝子の発現(例えば、EGFPなどの蛍光標識の発現)に基づいて単離および選別され得る。一部の実施形態では、標識は、蛍光標識である。蛍光標識の例には、緑色蛍光タンパク質(GFP)、高感度緑色蛍光タンパク質(EGFP)、黄色蛍光タンパク質(YFP)、例えば、mBanana、赤色蛍光タンパク質(RFP)、例えば、mCherry、DsRed、dTomato、tdTomato、mHoneydewもしくはmStrawberry、TagRFP、遠赤色蛍光パミドロネート(FRFP)、例えば、mGrape1もしくはmGrape2、シアン蛍光タンパク質(CFP)、青色蛍光タンパク質(BFP)、高感度シアン蛍光タンパク質(ECFP)、ウルトラマリン蛍光タンパク質(UMFP)、橙色蛍光タンパク質(OFP)、例えば、mOrangeもしくはmTangerine、赤色(橙色)蛍光タンパク質(mROFP)、TagCFP、またはテトラシステイン蛍光モチーフが含まれるがこれらに限定されない。ある特定の実施形態では、蛍光標識は、GFPまたはEGFPである。一部の実施形態では、分離/単離された細胞または核は、液滴中に封入される。一部の実施形態では、液滴は、エマルジョン液滴である。一部の実施形態では、液滴は、ナノリットルスケールの液滴である。一部の実施形態では、液滴は、微粒子をさらに含む。一部の実施形態では、微粒子は、ビーズである。
一部の実施形態では、本開示は、それらのmRNA転写物のさらなる分析のために、細胞または核を区画化する任意の方法を組み込む方法を提供する。一部の実施形態では、本開示は、本明細書で開示される核酸のいずれかを含む液滴(例えば、エマルジョン液滴)を提供する。一部の実施形態では、本開示は、本明細書で開示される細胞のいずれかを含むエマルジョン液滴を提供する。一部の実施形態では、本開示は、本明細書で開示される微粒子のいずれかを含む液滴(例えば、エマルジョン液滴)を提供する。一部の実施形態では、本開示は、本明細書で開示される微粒子のいずれかおよびまた本明細書で開示される細胞のいずれかを含む液滴(例えば、エマルジョン液滴)を提供する。
一部の実施形態では、本明細書で開示される細胞または核のいずれかが、本明細書で開示される液滴のいずれかによって封入されると、その細胞または核は、細胞または核の内容物(例えば、RNA内容物)を液滴中に放出させるために溶解される。特定の実施形態では、細胞または核は、細胞または核の内容物(例えば、RNA内容物)を液滴中に放出させるために溶解され、液滴は、本明細書で開示される微粒子のいずれかをさらに含む。一部の実施形態では、複数のRNA分子が、複数の微粒子(例えば、ビーズ)に接続され、各ビーズは、独自にバーコード化される。一部の実施形態では、微粒子は、微粒子ポリヌクレオチドに接続され、微粒子ポリヌクレオチドは、オリゴ-dTヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、オリゴ-dTヌクレオチド配列は、溶解された細胞または核から放出されたmRNA分子のいずれかの3’ポリアデニル化(ポリ(A))テイルにハイブリダイズすることが可能である。一部の実施形態では、本発明の方法における分析のために捕捉および単離されたRNAには、mRNA、長い非コードRNA、アンチセンス転写物およびpri-miRNAが含まれる。一部の実施形態では、単離されたRNAは、mRNAである。特定の実施形態では、mRNAは、バーコード化された微粒子(例えば、ビーズ)に結合することによって単離される。
単離された細胞の細胞型を同定する方法
単離された細胞の細胞型を同定する方法
上に記載のように、本発明の方法は、細胞の正体(すなわち、細胞型)を決定するため、ならびに/またはその特定の細胞において発現される遺伝子および導入遺伝子に関する情報を得るために、単一細胞トランスクリプトームを配列決定することを企図する。最終的に、配列情報は、ライブラリーにおいて収集され得、これは、細胞を同定するためだけでなく、どの候補調節エレメントが特定の細胞において導入遺伝子の発現を可能にしたかを決定するため、および細胞において導入遺伝子発現のレベルを定量するために使用され得る。
一部の実施形態では、本開示は、単一の細胞または単一の核からのRNAの単離を可能にする任意の方法を組み込む方法を提供する。一部の実施形態では、本開示は、転写物の起源の細胞に関する情報を保存しながらのmRNA転写物の分析を可能にする任意の方法を組み込む方法を提供する。一部の実施形態では、本開示は、候補調節エレメントに作動可能に連結した導入遺伝子を発現する細胞の同定を可能にする任意の方法を組み込む方法を提供する。一例では、単一の細胞は、液滴-シークエンシング(Droplet-Sequencing)(「Drop-Sequence」または「Drop-Seq」としても公知)方法の使用によって同定され得る。Drop-Sequence方法は、異なる細胞由来のRNAが、独自にバーコード化されたポリヌクレオチドを使用して個々にタグ化され、各配列決定されたmRNAの細胞正体を保持しながら単一のライブラリーが作り出されるのを可能にする、ハイスループット単一細胞RNA-Seqおよび/または標的化核酸プロファイリング(例えば、シークエンシング、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応など)を提供する。一部の実施形態では、分子バーコード化とエマルジョンに基づくマイクロフルイディクスとの組合せが、ハイスループット様式で個々の細胞を単離し、溶解させ、核酸をバーコード化し、かかる細胞から核酸を調製するために使用される。
Drop-Sequence方法では、独自にバーコード化されたポリヌクレオチドに接続された特別に設計された微粒子(例えば、ビーズ)が、細胞同定のために使用される。図1に示されるように、多数の独自にバーコード化されたポリヌクレオチドを含む単一の微粒子(ビーズ)は、単一の細胞(または単一の核)と一緒に、個々のエマルジョン液滴中に導入され得る。一部の実施形態では、バーコード化されたポリヌクレオチドは、バーコード化された捕捉ビーズを形成するように、可撓性多原子リンカーを介して、微粒子(例えば、ビーズ)(5’から3’に、酵素的プライミングのために利用可能な自由な3’末端を生じる)に共有結合される。一部の実施形態では、バーコード化されたポリヌクレオチドは、バーコード化された捕捉ビーズを形成するように、可撓性多原子リンカーを介して、微粒子(例えば、ビーズ)に、5’から3’に(酵素的プライミングのために利用可能な自由な3’末端を生じる)、共有結合される。
一部の実施形態では、本明細書で開示される微粒子(例えば、ビーズ)のいずれかは、ポリヌクレオチド分子(本明細書で「微粒子ポリヌクレオチド」と呼ばれる)に接続されている。一部の実施形態では、微粒子ポリヌクレオチドは、下流のPCRおよびシークエンシングのためのプライミング部位として使用するための一定の配列を含む。一部の実施形態では、微粒子ポリヌクレオチドは、微粒子(例えば、ビーズ)に独自であるが、微粒子に接続された微粒子ポリヌクレオチドの全てに共通するバーコード配列(「細胞バーコード」)を含む。一部の実施形態では、微粒子ポリヌクレオチドは、各微粒子ポリヌクレオチドに独自のUnique Molecular Identifier(UMI)ヌクレオチド配列を含む。例えば、微粒子が2つまたはそれよりも多くの微粒子ポリヌクレオチドを含む場合、その微粒子上の各微粒子ポリヌクレオチドは、異なるUMI配列を含む。一部の実施形態では、UMIは、PCR重複を同定するために使用され得る。一部の実施形態では、微粒子ポリヌクレオチドは、オリゴ-dT配列を含む。一部の実施形態では、オリゴ-dT配列は、ポリアデニル化mRNAを(例えば、mRNAのポリA配列とのハイブリダイゼーションを介して)捕捉するため、および/または逆転写をプライミングするために使用され得る。
一部の実施形態では、本明細書で開示される微粒子ポリヌクレオチド分子のいずれかは、本明細書で開示される核酸分子のいずれかと相互作用する。一部の実施形態では、微粒子と相互作用する(例えば、それに接続されている)核酸分子は、DNA分子から転写されたRNA分子である。一部の実施形態では、RNA分子は、導入遺伝子およびバーコード配列を含む。一部の実施形態では、DNA分子は、調節エレメントを含み、RNA分子中のバーコード配列は、DNA分子中の調節エレメントと相関する。一部の実施形態では、核酸分子は、ポリAテイルを含み、微粒子ポリヌクレオチド分子は、オリゴ-dT配列を含み、核酸分子のポリAテイルは、微粒子ポリヌクレオチドのオリゴ-dT配列にハイブリダイズする。
一部の実施形態では、各微粒子ポリヌクレオチド分子は、以下の4つの別個の領域を含む:(1)下流のPCRおよびシークエンシングのためのプライミング部位として使用するための一定の配列(全ての微粒子にわたって全ての微粒子ポリヌクレオチド分子上で同一);(2)いずれか1つの微粒子上の全ての微粒子ポリヌクレオチド分子にわたって同一であるが、他の微粒子上の細胞バーコードとは異なる「細胞バーコード」(すなわち、細胞バーコードは、特定の微粒子に独自である);(3)各微粒子ポリヌクレオチド分子上で異なり、PCR重複を同定するために使用される、Unique Molecular Identifier(UMI);ならびに(4)ポリアデニル化mRNAを捕捉し、逆転写をプライミングするために使用されるオリゴ-dT配列。
上述のように、マイクロ流体デバイスによって作り出されたエマルジョン液滴(不混和性キャリア流体によって取り囲まれた水性液滴)は、バーコード化された微粒子と共に細胞(または核)を共封入するために使用され得る。一部の実施形態では、細胞(または核)は、液滴内で溶解され、溶解された細胞または核由来のmRNA(トランスクリプトーム)は、微粒子(例えば、ビーズ)の多数の微粒子ポリヌクレオチド分子(例えば、微粒子ポリヌクレオチド分子のオリゴ-dT領域上の)にハイブリダイズする。例えば、図1を参照のこと。本明細書に記載されるように、特定の実施形態では、微粒子は、各液滴およびその内容物が識別可能であるように、独自にバーコード化される。本明細書で開示される方法は、任意の微粒子型を使用する単一細胞アプローチ(例えば、10X Genomics Chromium Single Cell Gene Expression Assays)を企図する。例えば、それらの全体が各々参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第20180030515号ならびにMacosko et al., 2015, ”Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets” Cell 161, 1202-1214;およびKlein et al., 2015, ”Droplet Barcoding for Single-Cell Transcriptomics Applied to Embryonic Stem Cells” Cell 161, 1187-1201を参照のこと。導入遺伝子を発現する細胞を同定するために利用され得る他の技術には、例えば、CEL-seq2/C1、MARS-seq、SCRB-seq、Smar-seq/C1および/またはSmart-seq2が含まれる。例えば、Ziegenhain, et al., 2017, Molecular Cell, 65:631-643を参照のこと。
単一細胞トランスクリプトームシークエンシング
単一細胞トランスクリプトームシークエンシング
一部の実施形態では、溶解された細胞または核由来のRNAは、上で議論したように、本明細書で開示されるシークエンシング方法のいずれかを使用して配列決定され得、配列情報は、配列ライブラリーを生成するために収集される。一部の実施形態では、本開示は、細胞のトランスクリプトームのシークエンシングを可能にする任意の方法を組み込む方法を提供する。配列ライブラリーを生成するための様々な方法が、当該分野で公知であり、これらの方法は、使用されている特定のハイスループットプラットフォームに合わせて調整される。一部の実施形態では、mRNA分析において、3’ポリアデニル化(ポリ(A))テイルが、コードRNAが非コードRNAから分離されることを確実にするために標的化される。本明細書に記載されるDrop-sequence方法では、バーコード化された微粒子ポリヌクレオチド分子は、mRNAにハイブリダイズする。例えば、図1を参照のこと。一部の実施形態では、バーコード化された微粒子上でのmRNAの捕捉後、逆転写(RT)反応が、各細胞のmRNAを、独自にバーコード化されmRNA微粒子に共有結合的に連結されている第1鎖cDNAへと変換するために実施される。引き続いて、一部の実施形態では、鋳型切り換え反応を介して、ユニバーサルプライマーが、合成されたcDNAの下流にPCRハンドルを導入するために使用される。次いで、一部の実施形態では、cDNAの各々は、PCRを使用して増幅され得、定量され得、次世代シークエンシング(NGS)などのハイスループットプラットフォームを使用して平行して配列決定され得、データセットを作り出す。PCR方法は、当該分野で周知である。例えば、Dieffenbach and Dveksler, PCR Primer, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y. [1995]を参照のこと。NGS方法、例えば、Illumina/Solexa(商標)プラットフォームおよびNovaSeq(商標)プラットフォームは、当業者に公知である。
シークエンシングが完了すると、生配列データは、一部の実施形態では、さらなる分析を受け得る。一部の実施形態では、従来のライブラリー調製プロトコールが、RNA-Seqライブラリーを調製するために使用され得る。一部の実施形態では、NGSデータのための汎用データ分析パイプラインが利用され得る。一部の実施形態では、NGSデータのための汎用データ分析パイプラインには、アダプター配列および低品質リードを除去するためのデータの事前処理、参照ゲノムへのデータのマッピングまたは配列リードのde novoアラインメント、およびコンパイルされた配列の分析が含まれ得るがこれらに限定されない。例えば、一部の実施形態では、配列は、特定のヒトトランスクリプトームにアラインされ得、それらの「細胞」バーコード配列情報が、どのmRNAがどの細胞から来ているかを同定するために抽出され得る。一部の実施形態では、配列は、特定のヒトトランスクリプトームにアラインされ得、それらの「UMI」バーコード配列情報が、特定の細胞における特定の転写物の豊富さを同定するために抽出され得る。一部の実施形態では、配列は、特定のヒトトランスクリプトームにアラインされ得、それらの「細胞」および「UMI」バーコード配列情報が、どのmRNAがどの細胞から来ているか、および特定の細胞における特定の転写物の豊富さを同定するために抽出され得る。配列の分析には、小ヌクレオチド多型(SNP)の検出を求めた遺伝的バリアントについての評価、新規遺伝子の検出、導入遺伝子挿入部位の同定、導入遺伝子を発現する細胞型の決定、導入遺伝子の発現に関与する候補調節エレメントの同定、および/または遺伝子(例えば、導入遺伝子)転写物発現レベルの評価が含まれるがこれらに限定されない、広範な生物情報学的評価が含まれ得る。一部の実施形態では、単一のシークエンシング実行を介して、数万の(またはそれよりも多くの)識別可能なトランスクリプトームを同時に得ることができる。
単一細胞発現プロファイルの分析
単一細胞発現プロファイルの分析
一部の実施形態では、本開示は、所与の細胞型において選択的発現を提供する候補調節エレメントを同定するために不均一な細胞集団をアッセイする方法を提供する。一部の実施形態では、本開示は、候補調節エレメントに作動可能に連結した導入遺伝子を選択的に発現する細胞の同定を可能にする任意の方法を組み込む方法を提供する。一部の実施形態では、細胞は、不均一な細胞集団内にあり得る。不均一な細胞集団は、異なる型の細胞(例えば、異なる系譜の細胞、異なる分化状態の細胞、および/または身体中の1つもしくは複数の組織供給源から得られた細胞)だけでなく、様々な細胞周期段階にある細胞もまた含み得る。一部の実施形態では、これらの不均一な細胞集団からのトランスクリプトーム測定値は、種々の生物情報学評価を受け得る。
一部の実施形態では、生配列データは、参照ゲノムにアラインされ得、各遺伝子に関連するリードの数の計数を提供する。一部の実施形態では、生配列データは、公知の細胞型または新規細胞型についての遺伝子発現の1つまたは複数の分子アトラス中の配列データとアラインされ得る。一部の実施形態では、リード計数は、PCR増幅バイアスに起因して含まれている転写物を同定し除去するために、UMIバーコードを使用して、転写物の数を定量することによって決定される。データは、cDNAライブラリーの形成およびシークエンシングの効率における細胞毎のバリエーションを説明するために正規化される。多数の正規化方法が、当該分野で公知である。例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Risso et al., 2018, ”A General and Flexible Method for Signal Extraction from Single-Cell RNA-Seq Data” Nat. Comm. 9:284; 1-17を参照のこと。一部の実施形態では、細胞または遺伝子は、それらのトランスクリプトームプロファイルに基づいてサブグループを形成するようにクラスタリングされ得、それぞれ、細胞サブタイプまたは共変する遺伝子の同定を可能にする。一部の実施形態では、様々な分析、例えば、主成分分析(PCA)またはt-SNEが、高い次元空間からより低い次元空間へと細胞を変換することによって、視覚化およびパターン検出のためにデータを単純化するために使用され得る。一部の実施形態では、代表的な細胞マーカー(すなわち、文献由来のカノニカルなバイオマーカー)が、特定の細胞集団を同定するために、各クラスター上にマッピングされ得る。
一部の実施形態では、細胞が、候補調節エレメントに作動可能に連結したバーコード化された導入遺伝子(例えば、EGFP-KASHをコードする導入遺伝子)を発現する場合、各導入遺伝子バーコードの比較分析は、所与の候補調節エレメントが本明細書に記載される特定の細胞型における導入遺伝子発現に対して有する影響を評価するために実施され得る。例えば、特定の調節エレメントに作動可能に連結した特定の導入遺伝子の発現の大きさが評価され得る。一部の実施形態では、候補調節エレメントに作動可能に連結した特定の導入遺伝子の発現の大きさ(例えば、発現の減少または増加のレベル)は、異なる候補調節エレメントに作動可能に連結した同じ導入遺伝子の発現レベルと比較され得る。一部の実施形態では、候補調節エレメントに作動可能に連結した特定の導入遺伝子の、1つの細胞型における発現の大きさ(例えば、発現の減少または増加のレベル)は、異なる細胞型における同じ候補調節エレメントに連結した同じ導入遺伝子の発現レベルと比較され得る。さらに、一部の実施形態では、様々な細胞型における候補調節エレメントに作動可能に連結した導入遺伝子の発現を比較するための比較がなされ得ることがさらに企図される。このように、調節エレメントの細胞型特異性および調節エレメントに作動可能に連結した導入遺伝子からの発現の大きさが決定され得る。
調節エレメントによって提供される選択的発現を決定する
調節エレメントによって提供される選択的発現を決定する
一部の実施形態では、本開示の方法には、例えば、レポーター導入遺伝子を発現する細胞からRNAを単離するため、目的の転写物を配列決定するため、導入遺伝子の発現を測定および/または検出するため、目的の細胞型において導入遺伝子の発現を提供する調節エレメントを同定するためなどの、様々な方法が含まれる。本発明の方法は、標的細胞型における導入遺伝子の発現の選択性に基づいて、標的細胞型において目的の任意の導入遺伝子を発現させるのに適切な調節エレメントを同定および選択するために使用され得る。一部の実施形態では、導入遺伝子の発現の選択性は、導入遺伝子が、非標的細胞型とは対照的に、標的細胞型において発現されるかどうかの決定である。一部の実施形態では、導入遺伝子の発現の選択性は、導入遺伝子が、非標的細胞型とは対照的に、標的細胞型においてより高いレベルで発現されるかどうかの決定である。一部の実施形態では、導入遺伝子の発現の選択性は、導入遺伝子が、非標的細胞型とは対照的に、標的細胞型においてより低いレベルで発現されるかどうかの決定である。
一部の実施形態では、本発明の方法は、目的の任意の細胞型において選択的発現を提供する調節エレメントを同定するために使用され得る。一部の実施形態では、目的の細胞型は、筋肉細胞、神経細胞、上皮細胞もしくは結合組織細胞、またはそれらの様々な下位集団である。一部の実施形態では、筋肉細胞は、心筋細胞、骨格筋細胞、心臓筋肉細胞または平滑筋細胞である。一部の実施形態では、上皮細胞は、扁平上皮細胞、立方上皮細胞または円柱上皮細胞である。一部の実施形態では、神経細胞は、ニューロンまたはグリア細胞である。一部の実施形態では、結合組織細胞は、線維芽細胞、脂肪細胞、マクロファージ、マスト細胞または形質細胞である。一部の実施形態では、目的の細胞は、血液細胞である。一部の実施形態では、目的の細胞は、幹細胞である。一部の実施形態では、目的の細胞は、腫瘍細胞(例えば、がん細胞)である。一部の実施形態では、目的の細胞型は、真核生物細胞、例えば、哺乳動物細胞であり、これには、ヒト、非ヒト霊長類、例えば、類人猿;チンパンジー;サルおよびオランウータン、イヌおよびネコを含む飼い慣らされた動物、ならびに家畜、例えば、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジおよびヤギ、またはマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ハムスターが含まれるがこれらに限定されない他の哺乳動物種由来の細胞などが含まれるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、目的の細胞型には、継代の数にかかわらず、形質転換された初代細胞およびそれに由来する子孫を含む、「形質転換体」および「形質転換された細胞」が含まれる。
単純なシナリオでは、所与の候補調節エレメント(「調節エレメントA」)は、同じ細胞型における別の調節エレメント(「調節エレメントB」)よりも、特定の細胞型においてより高いレベルまで導入遺伝子の発現を駆動すると決定され得る。かかるシナリオでは、調節エレメントAは、特定の細胞型における導入遺伝子の発現を可能にするにあたり、調節エレメントBと比較してより選択的であるとみなされる。別の単純なシナリオでは、所与の調節エレメントAは、同じ細胞型における別の調節エレメントBよりも、特定の細胞型においてより低いレベルまで導入遺伝子の発現を駆動すると決定され得る。一部の場合には、調節エレメントAは、所与の組織(例えば、ニューロン組織)の多くの異なる細胞型にわたる導入遺伝子の広範な発現を可能にし得る。一部の実施形態では、調節エレメントBは、所与の組織の標的細胞の別個の集団における導入遺伝子の発現を可能にし得る(すなわち、調節エレメントBは、導入遺伝子を発現する標的細胞 対 導入遺伝子を発現する細胞の総数の、より高い比率を提供する)。このシナリオでは、調節エレメントBは、細胞型(複数可)のより限定的なサブセットにおける導入遺伝子の発現を可能にするにあたり、調節エレメントAと比較してより選択的であるとみなされ、これは、例えば、オフターゲット事象を低減させるために有益であり得る。上記単純化された例のシナリオでは、選択性を決定するための比較は、互いに排他的ではない。
一部の実施形態では、複数の比較が、調節エレメントの特定の使用について、および/または特定の治療目的を達成するために、考慮され得る。一部の実施形態では、特定の治療目的に適切な調節エレメントは、所与の細胞型において最も高いまたは最も低いレベルの発現を提供する必要はない。本明細書で詳述されるように、候補調節エレメントによって駆動される発現の選択性は、いくつかの方法で測定および決定され得る。
一態様では、本発明の方法は、導入遺伝子(例えば、レポーター遺伝子)に作動可能に連結した候補調節エレメントのプールから、目的の細胞型において導入遺伝子の任意の検出可能な発現を可能にする調節エレメント(複数可)をスクリーニングおよび同定するために使用され得る。すなわち、目的の細胞型における所与の候補調節エレメントに作動可能に連結した導入遺伝子の任意の検出可能な発現は、調節エレメントが、任意の導入遺伝子の発現を駆動するために目的の細胞型において使用され得ることを示している。例として、PV細胞において導入遺伝子(例えば、レポーター遺伝子)の発現を駆動すると同定された調節エレメントは、同定された調節エレメントが、PV細胞において目的の導入遺伝子の発現を駆動するために使用され得ることを示している。一部の実施形態では、導入遺伝子の発現レベルは、参照発現レベルと比較される必要はない;調節エレメントに作動可能に連結した導入遺伝子の任意の検出可能なレベルの発現は、調節エレメントが、所与の細胞型において選択的発現を提供することを示している。したがって、一部の実施形態では、同定された調節エレメントは、別の細胞型(発現が検出されないまたは低い発現が検出される)と比較して、1つの細胞型において導入遺伝子の発現を選択的に駆動する。一部の実施形態では、同定された調節エレメントは、別の候補調節エレメント(同じ細胞型において導入遺伝子の発現を駆動しなかった)と比較して、1つの細胞型において導入遺伝子の発現を選択的に駆動する。
一部の態様では、本明細書に記載される方法は、導入遺伝子(例えば、レポーター遺伝子)に作動可能に連結した候補調節エレメントのプールから、同じ細胞型における導入遺伝子の参照発現レベルと比較して、目的の細胞型における導入遺伝子の選択的(例えば、増加または減少した)発現を可能にする調節エレメント(複数可)をスクリーニングおよび同定するために使用され得る。一部の実施形態では、導入遺伝子の参照発現レベルは、対照調節エレメントによって提供される導入遺伝子発現のレベルである。当業者は、当該分野における多数の例示的な対照調節エレメント(例えば、CBA)を認識している。一部の実施形態では、対照調節エレメントは、天然に存在する調節エレメント(例えば、CBA)である。一部の実施形態では、導入遺伝子の参照発現レベルは、同じ細胞型において別の候補調節エレメントによって提供される導入遺伝子発現のレベルである。一部の実施形態では、導入遺伝子の参照発現レベルは、同じ細胞型において汎細胞調節エレメントによって提供される導入遺伝子発現のレベルである。汎細胞調節エレメントの例には、例えば、本明細書に記載される、サイトメガロウイルス主要最初期プロモーター(CMV)、ニワトリβ-アクチンプロモーター(CBA)、CMV初期エンハンサー/CBAプロモーター(CAG)、伸長因子-1αプロモーター(EF1α)、サルウイルス40プロモーター(SV40)、ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター(PGK)およびポリユビキチンC遺伝子プロモーター(UBC)が含まれる。例として、目的の細胞型における候補調節エレメントの選択性は、この細胞型において調節エレメントによって提供される発現のレベルを、同じ細胞型において1つまたは複数の異なる候補調節エレメントによって駆動される発現のレベルと比較することによって決定され得る。一部の実施形態では、調節エレメントは、同じ細胞型における参照発現レベル(例えば、別の候補調節エレメントによって提供される導入遺伝子発現のレベル;汎細胞調節エレメントによって提供される導入遺伝子発現のレベル)と比較して、少なくとも1.2倍、少なくとも1.4倍、少なくとも1.6倍、少なくとも1.8倍、少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも4倍、少なくとも5倍、少なくとも6倍、少なくとも7倍、少なくとも8倍、少なくとも9倍、少なくとも10倍、少なくとも12倍、少なくとも14倍、少なくとも16倍、少なくとも18倍、少なくとも20倍大きい、または多くても1.2分の1、多くても1.4分の1、多くても1.6分の1、多くても1.8分の1、多くても2分の1、多くても3分の1多くても4分の1、多くても5分の1、多くても6分の1、多くても7分の1、多くても8分の1、多くても9分の1、多くても10分の1、多くても12分の1、多くても14分の1、多くても16分の1、多くても18分の1、多くても20分の1の、選択的発現を提供する。一部の実施形態では、調節エレメントは、同じ細胞型における参照発現レベル(例えば、別の候補調節エレメントによって提供される導入遺伝子発現のレベル;汎細胞調節エレメントによって提供される導入遺伝子発現のレベル)と比較して、少なくとも2%、少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも100%、少なくとも125%、少なくとも150%、少なくとも175%、少なくとも200%、少なくとも250%、少なくとも300%、少なくとも350%、少なくとも400%、少なくとも450%または少なくとも500%大きい選択的発現を提供する。一部の実施形態では、調節エレメントは、同じ細胞型における参照発現レベル(例えば、別の候補調節エレメントによって提供される導入遺伝子発現のレベル;汎細胞調節エレメントによって提供される導入遺伝子発現のレベル)と比較して、少なくとも2%、少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%または少なくとも95%小さい選択的発現を提供する。一部の実施形態では、調節エレメントは、同じ細胞型における参照発現レベル(例えば、別の候補調節エレメントによって提供される導入遺伝子発現のレベル;汎細胞調節エレメントによって提供される導入遺伝子発現のレベル)と比較して、約1.5倍、約2倍、約2.5倍、約3倍、約3.5倍、約4倍、約4.5倍、約5倍、約5.5倍、約6倍、約6.5倍、約7倍、約7.5倍、約8倍、約8.5倍、約9倍、約9.5倍または約10倍大きい選択的発現を提供する。一部の実施形態では、調節エレメントは、同じ細胞型における参照発現レベル(例えば、別の候補調節エレメントによって提供される導入遺伝子発現のレベル;汎細胞調節エレメントによって提供される導入遺伝子発現のレベル)と比較して、約1.5分の1、約2分の1、約2.5分の1、約3分の1、約3.5分の1、約4分の1、約4.5分の1、約5分の1、約5.5分の1、約6分の1、約6.5分の1、約7分の1、約7.5分の1、約8分の1、約8.5分の1、約9分の1、約9.5分の1または約10分の1の、選択的発現を提供する。
一部の態様では、本明細書に記載される方法のいずれかは、導入遺伝子(例えば、レポーター遺伝子)に作動可能に連結した候補調節エレメントのプールから、1つまたは複数の異なる細胞型における同じ調節エレメントに作動可能に連結した同じ導入遺伝子の発現レベル(参照発現レベル)と比較して、1つの細胞型における調節エレメントに作動可能に連結した導入遺伝子の選択的(例えば、増加または減少した)発現をスクリーニングおよび同定するために使用され得る。例として、目的の細胞型における候補調節エレメントの選択性は、この細胞型において調節エレメントによって提供される発現のレベルを、1つまたは複数の異なる細胞型において同じ調節エレメントによって提供される発現のレベルと比較することによって決定され得る。一部の実施形態では、調節エレメントは、参照発現レベル(例えば、1つまたは複数の異なる細胞型において同じ調節エレメントによって提供される導入遺伝子発現のレベル)と比較して、少なくとも1.2倍、少なくとも1.4倍、少なくとも1.6倍、少なくとも1.8倍、少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも4倍、少なくとも5倍、少なくとも6倍、少なくとも7倍、少なくとも8倍、少なくとも9倍、少なくとも10倍、少なくとも12倍、少なくとも14倍、少なくとも16倍、少なくとも18倍、少なくとも20倍大きい選択的発現を提供する。一部の実施形態では、調節エレメントは、参照発現レベル(例えば、1つまたは複数の異なる細胞型において同じ調節エレメントによって提供される導入遺伝子発現のレベル)と比較して、多くても1.2分の1、多くても1.4分の1、多くても1.6分の1、多くても1.8分の1、多くても2分の1、多くても3分の1多くても4分の1、多くても5分の1、多くても6分の1、多くても7分の1、多くても8分の1、多くても9分の1、多くても10分の1、多くても12分の1、多くても14分の1、多くても16分の1、多くても18分の1、多くても20分の1の、選択的発現を提供する。一部の実施形態では、調節エレメントは、参照発現レベル(例えば、1つまたは複数の異なる細胞型において同じ調節エレメントによって提供される導入遺伝子発現のレベル)と比較して、少なくとも2%、少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも100%、少なくとも125%、少なくとも150%、少なくとも175%、少なくとも200%、少なくとも250%、少なくとも300%、少なくとも350%、少なくとも400%、少なくとも450%または少なくとも500%大きい選択的発現を提供する。一部の実施形態では、調節エレメントは、参照発現レベル(例えば、1つまたは複数の異なる細胞型において同じ調節エレメントによって提供される導入遺伝子発現のレベル)と比較して、少なくとも2%、少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%または少なくとも95%小さい選択的発現を提供する。一部の実施形態では、調節エレメントは、参照発現レベル(例えば、1つまたは複数の異なる細胞型において同じ調節エレメントによって提供される導入遺伝子発現のレベル)と比較して、約1.5倍、約2倍、約2.5倍、約3倍、約3.5倍、約4倍、約4.5倍、約5倍、約5.5倍、約6倍、約6.5倍、約7倍、約7.5倍、約8倍、約8.5倍、約9倍、約9.5倍または約10倍大きい選択的発現を提供する。一部の実施形態では、調節エレメントは、参照発現レベル(例えば、1つまたは複数の異なる細胞型において同じ調節エレメントによって提供される導入遺伝子発現のレベル)と比較して、約1.5分の1、約2分の1、約2.5分の1、約3分の1、約3.5分の1、約4分の1、約4.5分の1、約5分の1、約5.5分の1、約6分の1、約6.5分の1、約7分の1、約7.5分の1、約8分の1、約8.5分の1、約9分の1、約9.5分の1または約10分の1の、選択的発現を提供する。
一部の実施形態では、調節エレメントに作動可能に連結した導入遺伝子発現の選択性は、細胞の集団において(例えば、組織において)導入遺伝子を発現する目的の特定の細胞型(目的の仮想細胞型「Cell X」)の比を測定する方法によって決定され得る。一部の実施形態では、比の決定は、導入遺伝子発現のレベルまたは大きさを測定することを含まない;むしろ、かかる実施形態では、細胞における任意の検出可能な発現が、この比に寄与する。一部の実施形態では、候補調節エレメントに作動可能に連結した導入遺伝子発現の選択性は、細胞の集団において(例えば、組織において)所定の閾値レベル(例えば、検出可能なレベル)の導入遺伝子を発現するCell X細胞の数を、同じ調節エレメントに作動可能に連結した導入遺伝子を発現する細胞の総数と比較することによって測定され得る。一部の実施形態では、この「比」は、導入遺伝子発現Cell X細胞の数 対 細胞集団中の導入遺伝子発現細胞の総数(Cell X+非Cell X細胞)として計算され、導入遺伝子は、細胞集団中の細胞の全てにおいて、同じ調節エレメントに作動可能に連結されている。例として、ニューロン組織中の他の非PV細胞と比較した、PVニューロンなどのGABA作動性ニューロンにおける調節エレメントに作動可能に連結した導入遺伝子(例えば、GFPをコードする導入遺伝子)の選択的発現は、検出可能なレベルの導入遺伝子を発現する(例えば、GFP導入遺伝子を発現する)PV細胞の数を、ニューロン組織中の同じ調節エレメントAの制御下でGFPを発現する細胞の総数と比較すること(すなわち、PV 対 GFPを発現する総細胞(PV+非PV細胞)の比)によって測定され得る。かかる測定、検出および定量は、本明細書に記載されるアッセイ方法に従って、in vivoまたはin vitroのいずれかで実施され得る。例えば、本明細書で詳述される分析方法を使用して、GFPを発現する細胞が分離および単離され得、各単離された細胞の正体が決定され得(例えば、PVニューロン 対 非PV細胞)、候補調節エレメントの制御下にあるGFP発現PVニューロンの数および同じ調節エレメントの制御下にあるGFP発現非PVニューロンが定量され得る。一部の実施形態では、同じ調節エレメントに作動可能に連結した導入遺伝子を発現する総細胞に対して、調節エレメントに作動可能に連結した導入遺伝子を発現するCell X細胞の数が高くなるほど(すなわち、比が高くなるほど)、調節エレメントはCell Xに対してより選択的になる。
一部の実施形態では、細胞型における調節エレメントの選択性は、免疫組織化学に基づく共局在化アッセイを使用して決定または検証され得る。一部の実施形態では、アッセイは、以下を使用することを伴う:a)導入遺伝子発現を測定するための、調節エレメントに作動可能に連結した導入遺伝子(例えば、GFPをコードする導入遺伝子)、およびb)標的細胞型に特異的なマーカーを同定する結合剤(例えば、抗体)であって、検出可能な標識に連結されている結合剤。例えば、一部の実施形態では、細胞型に対する選択性は、以下を使用する免疫組織化学に基づく共局在化アッセイを使用して決定または検証され得る:a)導入遺伝子発現を測定するための、調節エレメントに作動可能に連結した導入遺伝子(例えば、GFPをコードする導入遺伝子)、およびb)第2の蛍光標識(例えば、赤色蛍光タンパク質)に連結された、目的の細胞型を同定する抗体(例えば、PVニューロンと特異的に相互作用する抗PV抗体)。細胞型における遺伝子発現の選択性は、その細胞型(例えば、PV細胞)について陽性でもあるGFP陽性細胞(例えば、総細胞)のパーセンテージとして測定される。かかるアッセイでは、GFP陽性でもある目的の陽性細胞型は、両方の蛍光シグナルの共局在化、すなわち、赤色蛍光と緑色蛍光との重複によって示される。かかる測定、分析および/または検出は、目視またはコンピューターによって実施され得る。
一部の実施形態では、本明細書に記載される「比」は、候補調節エレメントに作動可能に連結した導入遺伝子を発現するCell X細胞の数を、同じ調節エレメントに作動可能に連結した導入遺伝子を発現する細胞(すなわち、Cell Xおよび非Cell X細胞)の総数によって除算し、100を乗算してパーセンテージに変換することによって、計算することができる。一部の実施形態では、調節エレメントAは、調節エレメントAに作動可能に連結した導入遺伝子を発現する細胞の総数の約35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または約99%よりも多くがCell X細胞である場合、Cell Xに対して選択的である。
一部の実施形態では、上に記載の比(またはパーセンテージ)は、調節エレメントを使用してCell X細胞について決定され得、それを、1つまたは複数の異なる調節エレメントを使用してCell X細胞について決定された比(またはパーセンテージ)と比較する。例えば、一部の実施形態では、調節エレメントは、導入遺伝子を発現するCell X細胞のパーセンテージ(例えば、Cell X細胞/総細胞×100)が、異なる調節エレメントに作動可能に連結した場合の同じ導入遺伝子を発現するCell X細胞のパーセンテージよりも高いパーセンテージである場合、Cell Xにおける発現に対して選択的である。一部の実施形態では、異なる調節エレメントは、参照調節エレメントである。一部の実施形態では、異なる調節エレメントは、汎細胞調節エレメント、例えば、本明細書に記載される、サイトメガロウイルス主要最初期プロモーター(CMV)、ニワトリβ-アクチンプロモーター(CBA)、CMV初期エンハンサー/CBAプロモーター(CAG)、伸長因子-1αプロモーター(EF1α)、サルウイルス40プロモーター(SV40)、ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター(PGK)およびポリユビキチンC遺伝子プロモーター(UBC)である。一部の実施形態では、調節エレメントは、導入遺伝子を発現するCell X細胞のパーセンテージ(例えば、Cell X細胞/総細胞×100)が、異なる調節エレメントに作動可能に連結した場合の同じ導入遺伝子を発現するCell X細胞のパーセンテージよりも少なくとも2%、少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも100%、少なくとも125%、少なくとも150%、少なくとも175%、少なくとも200%、少なくとも250%、少なくとも300%、少なくとも350%、少なくとも400%、少なくとも450%もしくは少なくとも500%高い、または少なくとも1~5%、5%~10%、10~15%、15~20%、20~25%、25~30%、30~35%、35~40%、40~45%、45~50%、50~55%、55~60%、65~70%、70~75%、75~80%、80~85%、85~90%、90~95%、100~125%、125~150%、150~200%、200~250%、250~300%、300~350%、350~400%、400~450%もしくは450~500%高い場合、Cell Xにおいて選択的発現を提供する。一部の実施形態では、調節エレメントは、導入遺伝子を発現するCell X細胞のパーセンテージ(例えば、Cell X細胞/総細胞×100)が、異なる調節エレメントに作動可能に連結した場合の同じ導入遺伝子を発現するCell X細胞のパーセンテージよりも少なくとも2%、少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%もしくは少なくとも95%小さい、または少なくとも1~5%、5%~10%、10~15%、15~20%、20~25%、25~30%、30~35%、35~40%、40~45%、45~50%、50~55%、55~60%、65~70%、70~75%、75~80%、80~85%、85~90%もしくは90~95%小さい場合、Cell Xにおいて選択的発現を提供する。一部の実施形態では、調節エレメントは、導入遺伝子を発現するCell X細胞のパーセンテージ(例えば、Cell X細胞/総細胞×100)が、異なる調節エレメントに作動可能に連結した場合の同じ導入遺伝子を発現するCell X細胞のパーセンテージと比較して、少なくとも1.5倍、少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも4倍、少なくとも5倍、少なくとも6倍、少なくとも7倍、少なくとも8倍、少なくとも9倍、少なくとも10倍、少なくとも15倍、少なくとも20倍、少なくとも25倍または少なくとも50倍高い場合、Cell Xにおいて選択的発現を提供する。一部の実施形態では、調節エレメントは、導入遺伝子を発現するCell X細胞のパーセンテージ(例えば、Cell X細胞/総細胞×100)が、異なる調節エレメントに作動可能に連結した場合の同じ導入遺伝子を発現するCell X細胞のパーセンテージと比較して、多くても1.5分の1、多くても2分の1、多くても3分の1、多くても4分の1、多くても5分の1、多くても6分の1、多くても7分の1、多くても8分の1、多くても9分の1、多くても10分の1、多くても15分の1、多くても20分の1、多くても25分の1または多くても50分の1である場合、Cell Xにおいて選択的発現を提供する。一部の実施形態では、調節エレメントは、導入遺伝子を発現するCell X細胞のパーセンテージ(例えば、Cell X細胞/総細胞×100)が、異なる調節エレメントに作動可能に連結した場合の導入遺伝子を発現するCell X細胞のパーセンテージよりも、少なくとも1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95または100倍高いレベルである場合、Cell Xにおいて選択的発現を提供する。
一部の実施形態では、Cell Xにおいて選択的発現を提供する調節エレメントは、高レベルの活性もまた有する。ある特定の実施形態では、Cell Xにおいて選択的発現を提供する調節エレメントは、Cell X細胞における導入遺伝子の発現を、調節エレメントなしのまたは異なる調節エレメント(参照調節エレメント)ありのCell X細胞における同じ構築物の発現のレベルと比較して、少なくとも2、5、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100倍またはそれよりも大きく増加させる。一部の実施形態では、Cell Xにおいて選択的発現を提供する調節エレメントは、遺伝子発現を、調節エレメントなしのまたは異なる調節エレメント(参照調節エレメント)ありのCell X細胞における同じ構築物の発現のレベルと比較して、少なくとも1.5%、2%、5%、10%、15%、20%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%または100%増加させる。一部の実施形態では、Cell Xにおいて選択的発現を提供する調節エレメントは、Cell X細胞における遺伝子発現を、Cell Xとは異なる細胞型における同じ構築物の発現のレベルと比較して、少なくとも1.5%、2%、5%、10%、15%、20%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%または100%増加させる。一部の実施形態では、調節エレメントは、Cell X細胞における導入遺伝子発現を、同じ調節エレメントに作動可能に連結した同じ導入遺伝子を発現する異なる細胞における発現の増加の量と比較して、少なくとも1.5%、2%、5%、10%、15%、20%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%または100%増加させる。一部の実施形態では、調節エレメントは、Cell X細胞における導入遺伝子発現を、異なる調節エレメント(例えば、参照調節エレメントまたは汎細胞調節エレメント)に作動可能に連結した同じ導入遺伝子を発現するCell X細胞における発現の増加の量と比較して、少なくとも1.5%、2%、5%、10%、15%、20%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%または100%増加させる。
一般に、発現における増加または減少は、転写レベルまたは転写後レベルで生じ得、転写産物または転写後産物のいずれかが測定され得る。例えば、転写レベルで、調節エレメントは、転写因子および/もしくはRNAポリメラーゼを動員すること、転写の開始を増加させること、またはDNAを動員すること、ならびに/あるいは転写のレベルを増加させるヒストン改変によって、発現を増加させ得る。発現における増加または減少は、導入遺伝子を表すRNA転写物の量における増加または減少を測定することによって検出され得る。転写後レベルで、調節エレメントは、タンパク質へと翻訳されるRNAの量およびその速度を増加させることによって、発現を増加させ得る。これは、様々な機構を介して、例えば、mRNAの安定性を増加させること、または翻訳に要求されるタンパク質の動員およびアセンブリを増加させることによって、達成され得る。タンパク質発現のかかる増加または減少は、導入遺伝子を表す発現されたタンパク質の量を測定することによって検出され得る。産生されたタンパク質の量は、例えば、酵素連結免疫吸着アッセイ(ELISA)によって直接的に、または例えば、機能的アッセイによって間接的に、測定され得る。
上に記載の方法を使用して同定された様々なREの選択性は、特定の細胞型における選択的遺伝子発現についてさらに試験および検証され得る。例えば、REは、免疫組織化学的方法を使用して、GABA作動性ニューロン、例えば、PV、SSTまたはVIPニューロンにおける選択的遺伝子発現について試験され得る。GABA作動性ニューロンは、グルタミン酸デカルボキシラーゼ2(GAD2)、GAD1、NKX2.1、DLX1、DLX5、SST、PVおよびVIPの発現などのマーカーによって同定され得る。あるいは、REは、他の細胞型、例えば、興奮性ニューロン、ドパミン作動性ニューロン、ミクログリア、運動ニューロン、血管細胞、非GABA作動性ニューロンもしくは他のCNS細胞、上皮細胞、心筋細胞または肝細胞、あるいは身体中の任意の他の細胞型における選択的遺伝子発現について試験され得る。目的の細胞または細胞型において調節エレメントによって駆動される発現の選択性は、いくつかの方法で測定することができる。非標的細胞型を超える標的細胞型における遺伝子発現の選択性は、1つまたは複数の調節エレメントに作動可能に連結した遺伝子から検出可能なレベルの転写物を発現する標的細胞の数を、その遺伝子を発現する細胞の総数と比較することによって測定することができる。かかる測定、検出および定量は、in vivoまたはin vitroのいずれかで実施され得る。
一部の例では、特定の細胞型に対する選択性は、共局在化アッセイを使用して決定することができる。一部の場合には、共局在化アッセイは、免疫組織化学に基づく。一部の場合には、検出可能なレポーター遺伝子が、目的の細胞型における遺伝子発現の検出および/または測定を可能にするための導入遺伝子として使用される。一部の場合には、検出可能なマーカー、例えば、標的細胞を特異的に標識する蛍光マーカーまたは抗体が、標的細胞を検出および/または測定するために使用される。一部の場合には、共局在化アッセイは、異なる蛍光標識間の重複、例えば、標的細胞を示す蛍光シグナルと遺伝子発現を示す別の蛍光シグナルとの間の重複を決定するために、イメージング、例えば、蛍光イメージングを使用する。一部の場合には、共局在化アッセイに使用される蛍光標識には、赤色蛍光タンパク質(RFP)、例えば、tdTomatoレポーター遺伝子、および緑色蛍光レポータータンパク質、例えば、eGFPが含まれる。
一部の例では、1つまたは複数の調節エレメントに作動可能に連結した遺伝子は、蛍光タンパク質、例えば、eGFPまたはRFPであり、導入遺伝子の発現は、検出可能なシグナルを提供する。一部の場合には、組織は、eGFPについて染色され、またはeGFPからの蛍光が、蛍光顕微鏡を使用して直接検出される。異なる蛍光または検出可能なシグナルを有する第2の蛍光マーカーまたはレポーター遺伝子、例えば、標的細胞を同定する抗体が、標的細胞を示すために使用され得る。例えば、PVニューロンと特異的に相互作用する抗PV抗体が、遺伝子発現を測定するために使用される蛍光、例えば、赤色蛍光または赤色染色から識別可能な検出可能なシグナルを得るために使用され得る。したがって、eGFPが、PVニューロンにおいて選択的発現を駆動する1つまたは複数の調節エレメントに作動可能に連結した導入遺伝子であり、PVニューロンが抗PV抗体で標識される例では、PV細胞における遺伝子発現の選択性は、PV+でもあるeGFP+細胞のパーセンテージとして測定される。かかるアッセイでは、eGFP+でもあるPV+細胞は、両方の蛍光シグナルの重複、すなわち、赤色蛍光と緑色蛍光との重複によって示される。かかる測定、分析および/または検出は、目視またはコンピューターによって実施され得る。
一部の場合には、導入遺伝子に作動可能に連結した1つまたは複数の調節エレメントの選択性を評価するために、導入遺伝子を発現する非標的細胞型(または他の細胞)の割合と比較した、導入遺伝子を発現する目的の細胞型(または標的細胞型)の割合を測定することもできる。同様に、発現の選択性は、1つまたは複数の調節エレメントに作動可能に連結した導入遺伝子を発現する標的細胞の数を、導入遺伝子を発現する全ての細胞の数と比較することによっても測定され得る。両方のアプローチでは、導入遺伝子を発現する標的細胞の数が高くなるほど、調節エレメントは標的細胞に対してより選択的になる。一部の場合には、標的細胞は、PVニューロンである。
単一核多重アッセイの代替的適用
単一核多重アッセイの代替的適用
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される単一核多重アッセイは、目的の細胞におけるAAV形質導入を測定するために使用される。かかる実施形態では、多重アッセイは、目的の細胞中への目的の特定のウイルス、例えば、特定のAAV血清型、組換えのもしくは操作されたAAV、または特定のレンチウイルス株の形質導入を測定するために使用され得る。ある特定の実施形態では、多重アッセイは、目的の細胞中へのAAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、rh10、およびそれらのハイブリッド、トリAAV、ウシAAV、イヌAAV、ウマAAV、霊長類AAV、非霊長類AAVならびにヒツジAAVからなる群から選択されるAAVの形質導入を測定するために使用される。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される単一核多重アッセイは、目的の細胞型、例えば、CNS細胞(例えば、ニューロン、またはグリア細胞、例えば、アストロサイト)、非CNS細胞(例えば、興奮性ニューロン、ドパミン作動性ニューロン、ミクログリア、運動ニューロン、血管細胞、非GABA作動性ニューロンまたは他のCNS細胞)、上皮細胞、心筋細胞または肝細胞中へのAAV形質導入を測定するために使用される。特定の実施形態では、本明細書に記載される単一核多重アッセイは、グルタミン酸デカルボキシラーゼ2(GAD2)、GAD1、NKX2.1、DLX1、DLX5、SST、PVおよびVIPの発現などのマーカーによって同定され得るGABA作動性ニューロン中へのAAV形質導入を測定するために使用される。
特定の実施形態では、本発明の単一核多重アッセイは、目的の細胞におけるウイルス形質導入における増加または減少を測定することによって、目的の細胞中へのウイルスの形質導入を増加させる新規ウイルスカプシドまたはウイルスDNA配列を同定するために使用される。例えば、新規ウイルスカプシドバリアントまたはウイルスDNA配列のライブラリーは、目的の細胞中へのウイルス形質導入(例えば、AAVまたはレンチウイルス)を増加させるカプシドまたはDNA配列を同定するためにスクリーニングされ得る。一部の場合には、カプシドまたはDNA配列は、目的の細胞型、例えば、CNS細胞(例えば、ニューロン、またはグリア細胞、例えば、アストロサイト)、非CNS細胞(例えば、興奮性ニューロン、ドパミン作動性ニューロン、ミクログリア、運動ニューロン、血管細胞、非GABA作動性ニューロンまたは他のCNS細胞)、上皮細胞、心筋細胞または肝細胞中へのウイルス形質導入を増加させる。特定の場合には、本明細書に記載される単一核多重アッセイは、GABA作動性ニューロン、例えば、グルタミン酸デカルボキシラーゼ2(GAD2)、GAD1、NKX2.1、DLX1、DLX5、SST、PVまたはVIPを発現するGABA作動性ニューロン中へのAAV形質導入を増加させるカプシドまたはDNA配列を同定するために使用される。
他の実施形態では、新規ウイルスカプシドバリアントまたはウイルスDNA配列のライブラリーは、目的の細胞中へのウイルス形質導入(例えば、AAVまたはレンチウイルス)を低減または阻害するウイルスカプシドまたはウイルスDNA配列を同定するためにスクリーニングされ得る。例えば、カプシドまたはDNA配列は、目的の細胞型、例えば、CNS細胞(例えば、ニューロン、またはグリア細胞、例えば、アストロサイト)、非CNS細胞(例えば、興奮性ニューロン、ドパミン作動性ニューロン、ミクログリア、運動ニューロン、血管細胞、非GABA作動性ニューロンまたは他のCNS細胞)、上皮細胞、心筋細胞または肝細胞中へのウイルス形質導入を低減または阻害する。特定の実施形態では、本明細書に記載される単一核多重アッセイは、GABA作動性ニューロン、例えば、グルタミン酸デカルボキシラーゼ2(GAD2)、GAD1、NKX2.1、DLX1、DLX5、SST、PVまたはVIPを発現するGABA作動性ニューロン中へのAAV形質導入を低減または阻害するカプシドまたはDNA配列を同定するために使用される。
別の実施形態では、本発明の単一核多重アッセイは、ウイルス(例えば、AAV、レンチウイルス、HSVなど)によって目的の細胞中に形質導入される導入遺伝子の翻訳を調節する因子を同定するために使用される。例えば、候補因子のライブラリーは、ウイルス(例えば、AAV、レンチウイルス、HSVなど)によって目的の細胞中に形質導入される導入遺伝子の翻訳を増加または減少させる因子を同定するためにスクリーニングされる。一実施形態では、因子は、目的の細胞、例えば、CNS細胞(例えば、ニューロン、またはグリア細胞、例えば、アストロサイト)、非CNS細胞(例えば、興奮性ニューロン、ドパミン作動性ニューロン、ミクログリア、運動ニューロン、血管細胞、非GABA作動性ニューロンまたは他のCNS細胞)、上皮細胞、心筋細胞または肝細胞中に形質導入される導入遺伝子の翻訳を増加または減少させる。特定の実施形態では、本明細書に記載される単一核多重アッセイは、GABA作動性ニューロン、例えば、グルタミン酸デカルボキシラーゼ2(GAD2)、GAD1、NKX2.1、DLX1、DLX5、SST、PVまたはVIPを発現するGABA作動性ニューロン中に形質導入される導入遺伝子の翻訳を増加または減少させる因子を同定するために使用される。
別の実施形態では、本発明の単一核多重アッセイは、目的の細胞におけるウイルス(例えば、AAV)の第2鎖合成を促進するウイルスDNA配列を同定するために使用される。例えば、新規ウイルスDNA配列のライブラリーは、目的の細胞におけるAAVの第2鎖合成を増加または減少させるDNA配列を同定するためにスクリーニングされ得る。例えば、DNA配列は、目的の細胞型、例えば、CNS細胞(例えば、ニューロン、またはグリア細胞、例えば、アストロサイト)、非CNS細胞(例えば、興奮性ニューロン、ドパミン作動性ニューロン、ミクログリア、運動ニューロン、血管細胞、非GABA作動性ニューロンまたは他のCNS細胞)、上皮細胞、心筋細胞または肝細胞におけるAAVの第2鎖合成を増加または減少させる。特定の実施形態では、本明細書に記載される単一核多重アッセイは、GABA作動性ニューロン、例えば、グルタミン酸デカルボキシラーゼ2(GAD2)、GAD1、NKX2.1、DLX1、DLX5、SST、PVまたはVIPを発現するGABA作動性ニューロンにおけるAAVの第2鎖合成を増加または減少させるウイルスDNA配列を同定するために使用される。
別の実施形態では、本発明の単一核多重アッセイは、目的の機能的タンパク質、例えば、機能的タンパク質エフェクターに応答した目的の細胞における遺伝子発現を測定するために使用される。かかる実施形態では、タンパク質のライブラリーが、1つまたは複数の細胞に添加され得、各独自のタンパク質に応答した遺伝子発現が、目的の細胞において測定される。遺伝子発現は、ライブラリーからの1つまたは複数のタンパク質に応答した、治療応答、細胞経路シグナル伝達応答、オフターゲット遺伝子調節、免疫応答などについて分析され得る。
これらの実施例は、例示目的のためにのみ提供されるのであって、本明細書で提供される請求項の範囲を限定するものではない。
(実施例1)
REの特異性を評価するためにin vivoのAAVに基づく感染において調節エレメント(RE)を多重化する
(実施例1)
REの特異性を評価するためにin vivoのAAVに基づく感染において調節エレメント(RE)を多重化する
複数の調節エレメントを、in vivoのAAVに基づく系においてアッセイして、個々の調節エレメントの細胞特異性を評価した。このアッセイは、細胞特異的調節エレメントおよび細胞特異的調節エレメントの下での各導入遺伝子の発現の大きさの同定を可能にする。
多重化されたRE AAVの設計、産生およびin vivo試験
この系が3個の調節エレメントを多重化する能力を試験するために、目的の導入遺伝子を、以下の3個の候補REのうち1個に作動可能に連結させた:(1)CamKII、(2)CBA、および(3)配列番号1の核酸配列によってコードされる調節エレメント(RE1)。これらのREは、CamKIIプロモーターが興奮性ニューロンにおいて優先的発現を示すこと、CBAプロモーターが遍在性発現を示すこと、および配列番号1の核酸配列によってコードされる調節エレメント(RE1)が阻害性/パルブアルブミン(paravalbumin)(PV)ニューロンにおいて優先的発現を示すことを理解した上で選択した。導入遺伝子は、KASH核テザリングドメインに融合させたEGFPタンパク質(EGFP-KASH)をコードするレポーター遺伝子からなった。EGFP-KASH導入遺伝子中のKASHの3つの特定の領域を配列改変して、混合プール中の個々の同定を可能にした(表1)。これらの配列改変は、EGFP-KASHのDNAおよびRNA配列に影響を与えただけであり、アミノ酸配列は変動させなかった。したがって、配列改変は、それぞれのEGFP-KASH導入遺伝子構築物を駆動する所与のREのための独自のバーコードとして機能する。バーコード化された導入遺伝子を、AAVゲノム骨格中にクローニングし、プラスミドを、一過的にトランスフェクトされたHEK293細胞によって評価し、EGFP蛍光を評価した。バーコード化戦略は、以下の表1に示され、表中、KASH配列のバーコード化された領域は、太字かつ下線付きで示される。
初回多重化実験(図1の単純化された概略図において例示される)をセットアップするために、各REについて2つのバーコードを割り当て、等量の各バーコード化された構築物(例えば、CamKII-EGFP-KASHバーコード1、CamKII-EGFP-KASHバーコード2、CBA-EGFP-KASHバーコード3、CBA-EGFP-KASHバーコード4、RE1-EGFP-KASHバーコード5およびRE1-EGFP-KASHバーコード6)を含むプラスミドミックスを作製した。このミックス(L1と呼ばれる)を使用して、選択されたin vivo送達ビヒクルであるアデノ随伴ウイルス9(AAV9)を産生した。野生型(C57Bl6/J)マウス(n=6)に、AAVベクターを、AAV9 L1(2E14ゲノムコピー(gc)/マウス)を用いて背側および腹側海馬中に両側性に注入し(4つの注射部位)、またはPBS対照を注入した。注射の4週間後、動物を屠殺し、右および左の海馬を外科的に取り出し、RNAlater(商標)中で4℃で一晩貯蔵した。
核を放出させるために、個々のマウス海馬を、溶解緩衝液中で、手動でダウンスホモジナイズした。濃縮粗製核調製物を、PBSに基づく洗浄および遠心分離によって得た。核を、細胞選別機での同定のためにDAPIで染色し、核の完全性を確認した。BD FACSAria(商標)II細胞選別機を使用して核を精製し、PBS注射した対照試料を使用して、ゲーティング戦略を規定した。全ての試料について、およそ100,000の核を選別し、試料を、単一核RNAシークエンシング(RNAseq)のために遠心分離によって濃縮した。10X genomics Chromium Single Cell 3’ v2キットを用いて単一核RNAseqを実施した。得られたcDNAライブラリーに対して、次世代シークエンシングを行った。
配列処理
配列処理
シークエンシング後、生BCL配列ファイル(Illuminaバイナリフォーマット)を、Illumina BaseSpaceからダウンロードし、カスタマイズされた処理スクリプトを使用して生FASTQリードファイルに変換した。各試料について、生FASTQを、マウスゲノムおよび遺伝子アノテーション(GENCODEバージョンM19、https://uswest.ensembl.org/Mus_musculus/Info/Annotation)と共に、10x Cell Rangerソフトウェア(v.2.1.0)を使用して処理した。10x Cell Rangerソフトウェアは、細胞によってリードを逆多重化し、次いで、リードを転写物にマッピングする。リードを転写物にマッピングするために、pre-mRNA参照トランスクリプトームを使用したが、それは、核試料からの転写物の大部分がpre-mRNAであるからである。AAVベクターに由来するリードについて、各バーコード化されたAAV転写物配列を、参照トランスクリプトームに手動で追加した。10x Cell Rangerは、各検出された核中の各遺伝子についてのunique molecular identifier(UMI)計数を含む各試料についてのファイルを生成した。次いで、これらのUMI計数ファイルを、次元削減およびクラスタリングに使用して、組織下位集団を規定した。
シークエンシング分析
シークエンシング分析
上記からのUMI計数ファイルを、custom RおよびPythonスクリプトを使用して処理して、細胞下位集団を同定した。細胞×遺伝子の計数ファイルを最初にフィルタリングして、合計で300未満のUMIを含む細胞を除去した。細胞(行)および遺伝子(列)によるUMI計数のフィルタリングされた2D行列を、同じ数の細胞(行)を有するが、ZinbWave(バージョン1.3.4、D. Risso et al., Nature 9: 284 (2018))を使用して35の削減された次元によって遺伝子列が置き換えられた、より小さいサイズに削減した。35の削減された次元は、遺伝子の線形結合であり、異なる細胞型において活性な生物学的モジュールを示す。約15Kの遺伝子から35の生物学的モジュールへと次元を削減することによって、データ中のノイズは顕著に低減され、単一細胞データの周知の「脱落」問題は有効に軽減され、それにより、クラスタリングは、より扱いやすいものになった。上位5000の可変的な遺伝子(パラメーターmin.cells=300、min.genes=200、y.cutoff=0.005を用いて、Seurat:https://satijalab.org/seurat/によって計算した)を使用して、ZinbWave(デフォルトパラメーター)を使用して35の次元を計算した。さらに、各細胞の総転写出力(総UMI)を、ZinbWave方法において共変量として組み込んだ。
この行列をクラスタリングするために、パッケージLouvain(バージョン0.6.1、https://pypi.org/project/louvain/)中に実装されたLouvainクラスタリングアルゴリズムを使用した。Louvainアルゴリズムは、辺によって接続された頂点とした細胞を有するグラフを、入力として要求する。これらのグラフは、それらの相関(35次元表示を使用する)が0.5よりも大きかった場合に、2つの細胞間の辺を含めることによって構築した。次いで、同定されたクラスター(または細胞下位集団)を、文献由来のカノニカルなバイオマーカーに基づいてアノテーションした(表2および図2を参照のこと)。神経集団におけるEGFP-KASH発現の比較分析を実施して、所与のREが導入遺伝子発現に対して有する影響を評価した。
結果
各試料についての公知のバイオマーカーに基づいて、クラスターを、以下の3つのクラスター群にグループ分けした:興奮性ニューロン(Exc)、GABA作動性ニューロン(GABA)および非神経細胞(NonN)。解釈を容易にするために、これらのクラスター群の各々を、細胞集団と呼ぶ。UMI計数から、各バーコード化されたAAV導入遺伝子の発現を百万当たりの転写物数(TPM)で計算した(図3)。
GABA内の発現を興奮性内の発現に対して比較し、異なるREに駆動されたAAV導入遺伝子をより容易に比較することを可能にするために、全てのAAV遺伝子のTPM発現を、興奮性ニューロンにおけるそれらの発現に対して正規化した。CBAを遍在的に発現される陽性対照として利用したので、細胞集団内の各AAV遺伝子のTPM発現を、その集団内のAAV CBA導入遺伝子の平均TPM発現に対しても正規化した。最後に、解釈を容易にするために、各AAV導入遺伝子の相対的発現(CBAに対して正規化した)を、CBA正規化変化倍率として表した。
予想されたように、2つのCamKII AAV導入遺伝子の相対的発現は、興奮性細胞と比較して、GABAおよび非神経集団において約30%低い(図4)。RE1で駆動された2つのAAV導入遺伝子は、興奮性ニューロンと比較してGABAニューロンにおいて約20%高く、非神経細胞において約25%低い。
さらに、各AAV導入遺伝子についての2つのバーコード化された構築物は、各細胞集団内で類似の発現を示すので、各AAV導入遺伝子についての2つのバーコード化された構築物間で発現値を平均して、単純化された発現プロットを得た(図5)。
図4と同様に、図5は、CamKII AAV導入遺伝子の相対的発現が、興奮性細胞と比較して、GABAおよび非神経集団において約30%低いこと、ならびにRE1で駆動されたAAV導入遺伝子が、興奮性ニューロンと比較してGABAニューロンにおいて約20%高く、非神経細胞において約25%低いことを実証している。
GABA作動性ニューロンの4つの主要な下位集団を、公知のバイオマーカー(PV、VIP、Sst、Ndnf-Reln)を使用して評価した。結果は、106m1導入遺伝子の発現が、GABAのPV、VIPおよびSst下位集団内でかなり高いことを実証している(図6)。さらに、結果は、PV下位集団における平均変化倍率が、RE1について最も高い(興奮性細胞においてよりも約50%高い)ことを実証した。
上に記載の方法を使用して得られたこれらのデータは、候補調節エレメントが、細胞特異的調節エレメントおよび細胞特異的調節エレメントの下での各導入遺伝子の発現の大きさを同定するために、in vivoでスクリーニングされ得ることを実証している。さらに、結果は、これらの方法が、細胞の特定の集団において生理学的に適切な用量を達成する調節エレメントを同定するために、調節エレメントの多重化された分析を実施するために有効に使用され得ることを示している。本明細書に記載されるアッセイは、種々の送達方法を使用するin vivo系における、104よりも多くの候補調節エレメントをスクリーニングする際に有用であり得る。
(実施例2)
REの特異性を評価するためにin vivoのAAVに基づく感染を使用して同定されたREの使用
(実施例2)
REの特異性を評価するためにin vivoのAAVに基づく感染を使用して同定されたREの使用
本明細書に記載されるスクリーニングアッセイを使用して同定された調節エレメントの細胞選択性を検証した後、調節エレメントは、特定の導入遺伝子を細胞の特定の集団に標的化するために利用され得る。具体的には、各調節エレメントは、少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つまたは5つよりも多くの非PV細胞を超えるように、特定の細胞集団に選択的に発現を標的化するために、導入遺伝子に作動可能に連結され得る。
(実施例3)
複雑な混合物におけるREの特異性を評価するために、調節エレメント(RE)をin vivoで大規模で多重化する
(実施例3)
複雑な混合物におけるREの特異性を評価するために、調節エレメント(RE)をin vivoで大規模で多重化する
多重アッセイが、細胞の複雑な混合物における個々のREの細胞型特異性および発現の大きさを評価することが可能であったかどうかを試験するために、15個の調節エレメントを、in vivoのAAVに基づく系においてアッセイした。このアッセイは、複数の異なる構築物の複雑な混合物内の、細胞特異的調節エレメントおよび細胞特異的調節エレメントの下での各導入遺伝子の発現の大きさの同定を可能にする。
多重化されたRE AAVの設計、産生およびin vivo試験
この系が調節エレメントの複雑な混合物を多重化する能力を試験するために、目的の導入遺伝子を、15個の候補REのうち1つに作動可能に連結させた。これらのREのうち2個は、CBAおよびEF1αであり、これらは共に、遍在的に発現される対照プロモーターとして選択された(それぞれ、構築物1および構築物2)。阻害性/パルブアルブミン(PV)ニューロンにおいて優先的発現を示す、配列番号1の核酸配列によってコードされる調節エレメント(RE1)を、構築物3において使用した。表3を参照のこと。残り12個のプロモーターを、阻害性/PVニューロンにおけるそれらの優先的発現について選択した。導入遺伝子は、KASH核テザリングドメインに融合させたEGFPタンパク質(EGFP-KASH)をコードするレポーター遺伝子からなった。EGFP-KASH導入遺伝子中のKASHのコード配列の2つの領域(KASH配列1およびKASH配列2)を配列改変して、混合プール中の個々の同定を可能にした(表4)。これらの配列改変は、EGFP-KASHのDNAおよびRNA配列に影響を与えただけであり、アミノ酸配列は変動させなかった。したがって、配列改変は、それぞれのEGFP-KASH導入遺伝子構築物を駆動する所与のREのための独自のバーコードとして機能する。さらなる独自のバーコード配列を、各構築物について転写開始部位の上流に挿入して、混合プール中の特定の構築物の個々の同定を可能にした(表4、上流配列)。最後に、独自のバーコード配列を、各構築物についてEGFP導入遺伝子の停止コドンの後ろに挿入して、混合プール中の特定の構築物の個々の同定を可能にした(表4、下流配列)。バーコード化された導入遺伝子を、AAVゲノム骨格中にクローニングし、in vivo研究のためのAAV9ウイルスを調製するために使用した。独自のバーコード配列は、以下の表4に示される。
複雑な混合物の多重化を、独自の上流配列、KASHに対して内部の2つの独自の配列、および独自の下流配列を含む単一のMBCバーコードを各REに割り当てたことを除き、実施例1に記載された初回実験と同様にセットアップし、等量の各バーコード化された構築物(例えば、MBC7-CBA-EGFP-KASH、MBC10-EF1α-EGFP-KASH、MBC11-RE1-EGFP1-KASHなど)を含むプラスミドミックスを作製した。このミックス(L3と呼ばれる)を使用して、選択されたin vivo送達ビヒクルであるアデノ随伴ウイルス9(AAV9)を産生した。バーコード(例えば、上流配列、KASHに対して内部の2つの配列、および下流配列)を含む配列セグメントを、構築物内で異なって構成したことを除いて、同じ独自のバーコード配列を使用して実験を2回反復した。等量のこれらのバーコード化された構築物の各々を含むプラスミドミックスを作製した。このミックス(L3.2と呼ばれる)を使用して、さらなるAAV9を産生した。L3.2ライブラリーは、構築物14を含まなかった。
6~8週齢の野生型(C57Bl6/J)雄性マウスに、1.5×1011~2.4×1011ウイルスゲノム/マウス(vg/マウス)のゲノム含量のAAV9 L3またはAAV9 L3.2を用いて、注射後4分間の安静期間で、0.3μL/分の速度で、背側および腹側皮質中に1.5μLのAAVベクタープールを、背側および腹側海馬中に1.5μLを片側性に注入した(1部位につき3μLで2つの注射部位;海馬について1.5μL、皮質について1.5μL)。
注射の4週間後、動物を屠殺し、それらの感覚皮質および海馬を外科的に取り出し、RNAlater(商標)中で4℃で24時間貯蔵し、次いで、組織を処理する準備ができるまで、-80℃で凍結させた。
RNAlater(商標)脳皮質または海馬試料を氷上で解凍させた。核を放出させるために、およそ20ミリグラムの組織を、溶解緩衝液中で手動でホモジナイズした。濃縮粗製核調製物を、PBSに基づく洗浄および遠心分離によって得た。核を、細胞選別機での同定のためにDAPIで染色し、核の完全性を確認した。BD FACS Melody細胞選別機を使用して核を精製した。全ての試料について、およそ100,000の核を選別した。試料を、単一核RNAseqのために遠心分離によって濃縮した。10X Genomics Chromium Single Cell 3’ v3キットを用いて単一核RNAseqを実施した(製造業者の使用説明書に記載されるように - 図1)。得られたcDNAライブラリーに対して、次世代シークエンシングを行った。
単一核RNAseqにおける検出の閾値を下回るUMIを有するAAV構築物の検出を増加させるために、富化PCRステップを、増幅前に、10XワークフローからのcDNA試料に対して実施した。この富化ステップは、10xライブラリーから検出されたAAV構築物からのシグナルの3~10倍の増幅を生じた。富化PCRステップにおいて使用したPCRプライマーは、標準的なIllumina Truseqシークエンシングプライマー(501)からのフォワードプライマーおよびポリA部位に比較的近いAAV導入遺伝子中の領域に結合するように設計されたリバースプライマーを含んだ。このリバースプライマーには、リード2ハンドルが付加されており、その結果、これは、Illuminaアダプターを産物に付加するための手段として引き続くPCR反応において使用され得る(シークエンシング目的のため)。このステップは、本明細書でプルアウト(pullout)PCRと呼ばれる。このプルアウトPCRのためのプライマー配列は、表5に示される。
10X Genomics Chromium Single Cell 3’ v3キットワークフローは、単一細胞レベルでのDNA/タンパク質情報の感度を改善し、その検出を可能にする。cDNA産生のために単一核液滴中に組み込まれるビーズを、v3ワークフローにおいて改変する。これらのビーズを、ポリA配列、ならびに捕捉1または捕捉2配列を組み込むDNA/RNA配列を捕捉するように操作する。これは、目的の特定のタンパク質に対する抗体-オリゴコンジュゲートおよびこれらの捕捉配列を組み込むDNA種の検出を促進する。キットがこれらのDNA/RNA種を捕捉し、それらを所与の構築物中のREに独自に関連付けるために、独自のバーコード特徴が、捕捉配列の次にコードされる。このバーコードは、各REにとって独自である。
10X Genomics Chromium Single Cell 3’ v3キットワークフローでは、各試料は、逆多重化のための4つの試料インデックスを含む。プルアウトPCRでは、各試料は、1つの試料インデックスのみを含む。10X Genomics Chromium Single Cell 3’ v3キットワークフローにおいて使用される10x Cell Rangerソフトウェアを介してプルアウトPCR試料を処理するために、1つのプルアウトPCR試料インデックスを、3つの「偽」インデックス(任意の10xインデックスとは少なくとも2つのヌクレオチドが異なる)と組み合わせて、10x Cell Rangerソフトウェアによる4試料インデックス要件を模倣させた。10x適合性FASTQファイルへと逆多重化した後、処理は、ちょうど10x配列処理と同様に進行する。
配列処理
配列処理
シークエンシング後、生BCL配列ファイル(Illuminaバイナリフォーマット)を、Illumina BaseSpaceからダウンロードし、10x Cell Rangerソフトウェア(v.3.0.2)を使用して生FASTQリードファイルに変換して試料を逆多重化し、各試料は、4つの10xインデックスを有していた。各試料について、生FASTQを、マウスゲノムおよび遺伝子アノテーション(GENCODEバージョンM19、https://uswest.ensembl.org/Mus_musculus/Info/Annotation)と共に、10x Cell Rangerソフトウェア(v.3.0.2)を使用して処理した。10x Cell Rangerソフトウェアは、細胞によってリードを逆多重化し、次いで、リードを転写物にマッピングする。FASTQファイルは、ペアドエンドリードを含み、リード1は、UMIバーコードおよび10x細胞バーコードを含み、リード2は、遺伝子転写物配列を含む。リード2を、マウスゲノムおよび各RE配列にアラインさせて、遺伝子/RE同一性を決定する。10x Cell Rangerソフトウェアは、各検出された核中の各遺伝子についてのunique molecular identifier(UMI)計数を含む各試料についてのファイルを生成した。次いで、これらのUMI計数ファイルを、次元削減およびクラスタリングに使用して、組織下位集団を規定した。
シークエンシング分析
シークエンシング分析
次元削減のために、上位5000の可変的な遺伝子(パラメーターmin.cells=300、min.genes=200、y.cutoff=0.005を用いて、Stuart, Butler et al., bioRxiv, 2018;Butler et al, Nature Biotechnology, 2018;Hafemeister and Satija, bioRxiv 2019に従って計算した)を使用して、ZinbWave(デフォルトパラメーター)を使用して35の次元を計算した。さらに、各細胞の総転写出力(総UMI)を、ZinbWave方法において共変量として組み込んだ。L1ライブラリーの処理と同様に、UMI計数ファイルを、custom RおよびPythonスクリプトを使用して処理して、細胞下位集団を同定した。細胞×遺伝子の計数ファイルを最初にフィルタリングして、合計で300未満のUMIを含む細胞を除去した。細胞(行)および遺伝子(列)によるUMI計数のフィルタリングされた2D行列を、同じ数の細胞(行)を有するが、ZinbWave(バージョン1.3.4、D. Risso et al., Nature 9: 284 (2018))を使用して35の削減された次元によって遺伝子列が置き換えられた、より小さいサイズに削減した。35の削減された次元は、遺伝子の線形結合であり、異なる細胞型において活性な生物学的モジュールを示す。約15Kの遺伝子から35の生物学的モジュールへと次元を削減することによって、データ中のノイズは顕著に低減され、単一細胞データの周知の「脱落」問題は有効に軽減され、それにより、クラスタリングは、より扱いやすいものになった。
この行列をクラスタリングするために、パッケージLouvain(バージョン0.6.1、https://pypi.org/project/louvain/)中に実装されたLouvainクラスタリングアルゴリズムを、上に記載のように使用した。Louvainアルゴリズムは、辺によって接続された頂点とした細胞を有するグラフを、入力として要求する。これらのグラフは、それらの相関(35次元表示を使用する)が0.5よりも大きかった場合に、2つの細胞間の辺を含めることによって構築した。次いで、同定されたクラスター(または細胞下位集団)を、表2および図2に示されるように、GABA作動性ニューロン、興奮性ニューロンおよび非神経細胞集団について、文献由来のカノニカルなバイオマーカーに基づいてアノテーションした。神経集団におけるEGFP-KASH発現の比較分析を実施して、発現の相対的大きさおよび所与のREが導入遺伝子発現に対して有する細胞型特異性を評価した。
結果
結果
実施例1に記載されるように、クラスターを、各試料について公知のバイオマーカーに基づいて、以下の3つのクラスター群にグループ分けした:興奮性ニューロン(Exc)、GABA作動性ニューロン(GABA)および非神経細胞(NonN)。UMI計数から、各バーコード化されたAAV導入遺伝子の発現を、上で議論したGene TPMアルゴリズムを使用して、百万当たりの転写物数(TPM)で計算した。
最初に、各REからのL3およびL3.2の両方のライブラリーにおけるTPMを、興奮性およびGABA作動性ニューロンにおいて分析して、興奮性およびGABA作動性ニューロンにおける各REからの遺伝子発現の大きさおよび細胞型特異性を決定した。発現の大きさは、REの強さに対するフィードバックを提供する。興奮性またはGABA作動性ニューロンに対する細胞型特異性もまた示され、このとき、特定のプロモーターについての興奮性ニューロンとGABA作動性ニューロンとの間での発現における差異は、それぞれの細胞型に対する特異性を示す。例えば、構築物6および構築物3は、GABA作動性ニューロンにおいてより高い発現を示し、したがって、このREがGABA作動性ニューロン特異的であることを示す。しかし、構築物1は、GABA作動性ニューロンおよび興奮性ニューロンの両方において比較的類似の発現を示し、これは、プロモーターの細胞型特異性の欠如を示す。
解釈を容易にするために、各AAV導入遺伝子の相対的発現を、対数スケールで示した。CBAプロモーター(構築物1)およびEF1αプロモーター(構築物2)からの増加した発現が観察された。CBAおよびEF1αプロモーターからのこの増加した発現は、これらのプロモーターが強い遍在性プロモーターであることが公知であることから、予想された。増加した発現は、RE1(構築物3)からも観察された。より低いレベルの発現が、他の候補プロモーターから観察され、これは、これらのプロモーターがCBAおよびEF1αよりも低い遺伝子発現を駆動することを潜在的に示している。興味深いことに、GABA作動性ニューロンにおいて、試験した調節エレメントからの細胞型特異的発現が、いくつかの構築物について観察された。図7および8を参照のこと。これらのデータは、多重アッセイが、単一のアッセイにおいて複数のREを検出することが可能であり、細胞型特異的REおよびそれらの強さを同定することが可能であることを実証している。
各REからの細胞型特異的発現を、GABA作動性ニューロン内での特異性について、L3およびL3.2の両方のライブラリーにおいて次に評価した(図9)。EF1αを遍在的に発現される対照として利用したので、本明細書で、細胞集団内の各AAV遺伝子のTPM発現を、その集団内のAAV EF1α関連導入遺伝子の平均TPM発現に対して正規化した。さらに、GABA作動性ニューロン内での発現についての特異性を、以下のように、興奮性ニューロンにおける発現と比較して計算した:
log10(特異性)=log10(GABAニューロン発現)-log10(興奮性ニューロン発現)
解釈を容易にするために、各AAV導入遺伝子の相対的発現(EF1αに対して正規化された)を、EF1α正規化変化倍率として表し、対数スケールで示した。
集団内の各TPM発現を、EF1α関連導入遺伝子の平均TPM発現に対して正規化したので、EF1αの発現はゼロである。CBAプロモーター(構築物1)からの発現は、平均して、EF1αプロモーターからの発現と類似している。これは、CBAおよびEF1αが高度に発現される遍在性プロモーターであることから予想される。対照的に、構築物3は、興奮性ニューロンと比較したGABA作動性ニューロンにおける実質的により高い発現、ならびにCBAおよびEF1αからの遍在性発現を示す。これもまた、構築物3が、阻害性/パルブアルブミン(PV)ニューロンにおいて優先的発現を示すRE(配列番号1によってコードされるRE1)を利用することから予想される。残りの構築物は、興奮性ニューロンと比較したGABA作動性ニューロンにおけるより高い発現、ならびにCBAおよびEF1αからの遍在性発現を示すが、この発現は、構築物3ほど高くはない。これは、これらの構築物中のREが、GABA作動性ニューロンにおいて細胞型特異的発現を駆動することを示している。これらのデータは、多重アッセイが、GABA作動性ニューロン特異的発現を駆動する複数のREを検出することが可能であることを実証している。
多重アッセイを、GABA作動性ニューロン一般の代わりに、GABA作動性ニューロンのクラス内の特定の細胞型(例えば、PV、SSTおよびVIP細胞)内の細胞型特異的発現(AAV L3.2ライブラリー)を測定する能力について試験した。EF1αを遍在的に発現される対照として利用したので、細胞集団内の各AAV遺伝子のTPM発現を、その集団内のAAV EF1α関連導入遺伝子の平均TPM発現に対して正規化した。特異性も、上に記載のように規定した。予想されたように、EF1αおよびCBA関連導入遺伝子の発現は、全ての特定のGABA作動性細胞型において類似であり、ゼロに近いが、それは、これらが遍在的に発現される細胞だからである。多重アッセイは、全てのGABA作動性細胞型においてより高い導入遺伝子発現を有したRE(例えば、構築物11)もまた同定できたが、これは、これらのREが、GABA作動性ニューロンのクラス内のある特定の細胞型に特異的でないことを示している(図10)。重要なことに、多重アッセイは、GABA作動性ニューロンのクラス内のある特定の細胞型からの発現に特異的なある特定のREからの発現を同定および描写することができた。
上に記載の方法を使用して得られたデータは、候補調節エレメントが、細胞特異的調節エレメントおよび細胞特異的調節エレメントの下での各導入遺伝子の発現の大きさを同定するために、調節エレメントの複雑な混合物においてin vivoでスクリーニングされ得ることをさらに実証している。さらに、これらの結果は、本明細書に記載される方法が、細胞の特定の集団において生理学的に適切な用量を達成する調節エレメントを同定するために、調節エレメントの多重化された分析を実施するために有効に使用され得ることをさらに示している。本明細書に記載されるアッセイは、種々の送達方法を使用するin vivo系における、104よりも多くの候補調節エレメントをスクリーニングする際に有用であり得る。
Claims (108)
- 所与の細胞型において選択的発現を提供する調節エレメントを同定する方法であって、
a.細胞に、導入遺伝子に作動可能に連結した候補調節エレメントを各々が含むベクターの混合物を提供するステップであって、各ベクターが、バーコードをさらに含む、ステップ;
b.前記導入遺伝子を発現する複数の単一細胞からRNAを単離するステップ;
c.前記単一細胞の各々のトランスクリプトームを配列決定することによって、前記単一細胞の各々を同定するステップ;および
d.前記トランスクリプトーム中の前記バーコードを候補調節エレメントと相関させるステップ
を含み、それにより、前記細胞型において選択的発現を提供する調節エレメントを同定する、方法。 - 前記調節エレメントが、前記細胞型における前記導入遺伝子の発現を選択的に増加させる、請求項1に記載の方法。
- 前記調節エレメントが、同じ細胞型において別の候補調節および/または対照調節エレメントによって駆動される発現と比較して、少なくとも2倍、少なくとも4倍、少なくとも6倍、少なくとも8倍もしくは少なくとも10倍大きい、または多くても2分の1、多くても4分の1、多くても6分の1、多くても8分の1もしくは多くても10分の1の、前記導入遺伝子の選択的発現を提供する、請求項1に記載の方法。
- 前記調節エレメントが、同じ細胞型において別の候補調節エレメントおよび/または対照調節エレメントによって駆動される発現と比較して、少なくとも2%、少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%または少なくとも95%大きいまたは小さい、前記導入遺伝子の選択的発現を提供する、請求項1に記載の方法。
- 前記調節エレメントが、同じ細胞型において別の候補調節エレメントおよび/または対照調節エレメントによって駆動される発現と比較して、約1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、7.5倍、8倍、9倍もしくは10倍大きい、または約1.5分の1、2分の1、3分の1、4分の1、5分の1、6分の1、7分の1、7.5分の1、8分の1、9分の1もしくは10分の1の、前記導入遺伝子の選択的発現を提供する、請求項1に記載の方法。
- 前記調節エレメントが、異なる細胞型における同じ調節エレメント由来の導入遺伝子の発現と比較して、少なくとも2倍、少なくとも4倍、少なくとも6倍、少なくとも8倍もしくは少なくとも10倍大きい、または多くても2分の1、多くても4分の1、多くても6分の1、多くても8分の1もしくは多くても10分の1の、前記導入遺伝子の選択的発現を提供する、請求項1に記載の方法。
- 前記調節エレメントが、異なる細胞型における同じ調節エレメント由来の導入遺伝子の発現と比較して、少なくとも2%、少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%または少なくとも95%大きいまたは小さい、前記導入遺伝子の選択的発現を提供する、請求項1に記載の方法。
- 前記調節エレメントが、異なる細胞型における同じ調節エレメント由来の導入遺伝子の発現と比較して、約1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、7.5倍、8倍、9倍もしくは10倍大きい、または約1.5分の1、2分の1、3分の1、4分の1、5分の1、6分の1、7分の1、7.5分の1、8分の1、9分の1もしくは10分の1の、前記導入遺伝子の選択的発現を提供する、請求項1に記載の方法。
- 前記調節エレメントが、少なくとも1つの他の細胞型を超える、1つの細胞型における前記導入遺伝子の選択的発現を提供する、請求項1に記載の方法。
- 前記調節エレメントが、非PVニューロンと比較して、パルブアルブミン(PV)ニューロンにおける前記導入遺伝子の選択的発現を提供する、請求項1に記載の方法。
- 前記非PVニューロンが、興奮性ニューロン、ドパミン作動性ニューロン、アストロサイト、ミクログリアまたは運動ニューロンのうち1つまたは複数である、請求項10に記載の方法。
- 細胞型において導入遺伝子の選択的発現を提供する調節エレメントを同定する方法であって、
a.細胞に、導入遺伝子に作動可能に連結した候補調節エレメントを各々が含むベクターの混合物を提供するステップであって、各ベクターが、バーコードをさらに含む、ステップ;
b.前記導入遺伝子を発現する複数の単一細胞からRNAを単離するステップ;
c.前記単一細胞の各々のトランスクリプトームを配列決定することによって、前記単一細胞の各々を同定するステップ;
d.前記トランスクリプトーム中の前記バーコードを前記候補調節エレメントと相関させるステップ;および
e.各候補調節エレメントによって提供される前記導入遺伝子の発現レベルを、前記導入遺伝子の参照発現レベルと比較するステップ
を含み、それにより、前記細胞型において前記導入遺伝子の選択的発現を提供する前記候補調節エレメントを同定する、方法。 - 前記調節エレメントが、前記細胞型における前記導入遺伝子の発現を選択的に増加または減少させる、請求項12に記載の方法。
- 前記導入遺伝子の前記参照発現レベルが、対照調節エレメントによって提供される、請求項12に記載の方法。
- 前記調節エレメントが、同じ細胞型において別の候補調節エレメントおよび/または対照調節エレメントによって駆動される発現と比較して、少なくとも2倍、少なくとも4倍、少なくとも6倍、少なくとも8倍もしくは少なくとも10倍大きい、または多くても2分の1、多くても4分の1、多くても6分の1、多くても8分の1もしくは多くても10分の1の、前記導入遺伝子の選択的発現を提供する、請求項12に記載の方法。
- 前記調節エレメントが、同じ細胞型において別の候補調節エレメントおよび/または対照調節エレメントによって駆動される発現と比較して、少なくとも2%、少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%または少なくとも95%大きいまたは小さい、前記導入遺伝子の選択的発現を提供する、請求項12に記載の方法。
- 前記調節エレメントが、同じ細胞型において別の候補調節エレメントおよび/または対照調節エレメントによって駆動される発現と比較して、約1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、7.5倍、8倍、9倍もしくは10倍大きい、または約1.5分の1、2分の1、3分の1、4分の1、5分の1、6分の1、7分の1、7.5分の1、8分の1、9分の1もしくは10分の1の、前記導入遺伝子の選択的発現を提供する、請求項12に記載の方法。
- 前記導入遺伝子の前記参照発現レベルが、汎細胞調節エレメントによって提供される、請求項12に記載の方法。
- 前記汎細胞調節エレメントが、サイトメガロウイルス主要最初期プロモーター(CMV)、ニワトリβ-アクチンプロモーター(CBA)、CMV初期エンハンサー/CBAプロモーター(CAG)、伸長因子-1αプロモーター(EF1α)、サルウイルス40プロモーター(SV40)、ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター(PGK)およびポリユビキチンC遺伝子プロモーター(UBC)からなる群から選択される、請求項12に記載の方法。
- 前記調節エレメントが、同じ細胞型において汎細胞調節エレメントによって駆動される発現と比較して、少なくとも2倍、少なくとも4倍、少なくとも6倍、少なくとも8倍もしくは少なくとも10倍大きい、または多くても2分の1、多くても4分の1、多くても6分の1、多くても8分の1もしくは多くても10分の1の、前記導入遺伝子の選択的発現を提供する、請求項12に記載の方法。
- 前記調節エレメントが、同じ細胞型において汎細胞調節エレメントによって駆動される発現と比較して、少なくとも2%、少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%または少なくとも95%大きいまたは小さい、前記導入遺伝子の選択的発現を提供する、請求項12に記載の方法。
- 前記調節エレメントが、同じ細胞型において汎細胞調節エレメントによって駆動される発現と比較して、約1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、7.5倍、8倍、9倍もしくは10倍大きい、または約1.5分の1、2分の1、3分の1、4分の1、5分の1、6分の1、7分の1、7.5分の1、8分の1、9分の1もしくは10分の1の、前記導入遺伝子の選択的発現を提供する、請求項12に記載の方法。
- 前記調節エレメントが、少なくとも1つの他の細胞型を超える、1つの細胞型における前記導入遺伝子の選択的発現を提供する、請求項12に記載の方法。
- 前記調節エレメントが、非PVニューロンと比較して、PVニューロンにおける前記導入遺伝子の選択的発現を生じる、請求項12に記載の方法。
- 前記非PVニューロンが、興奮性ニューロン、ドパミン作動性ニューロン、アストロサイト、ミクログリアまたは運動ニューロンのうち1つまたは複数である、請求項24に記載の方法。
- 調節エレメントに作動可能に連結した導入遺伝子を選択的に発現する細胞型を同定する方法であって、
a.細胞に、導入遺伝子に作動可能に連結した候補調節エレメントを各々が含むベクターの混合物を提供するステップであって、各ベクターが、バーコードをさらに含む、ステップ;
b.前記導入遺伝子を発現する複数の単一細胞からRNAを単離するステップ;
c.前記単一細胞の各々のトランスクリプトームを配列決定することによって、前記単一細胞の各々を同定するステップ;
d.前記トランスクリプトーム中の前記バーコードを前記候補調節エレメントと相関させるステップ;および
e.1つの細胞型において前記候補調節エレメントによって提供される前記導入遺伝子の発現レベルを、異なる細胞型における同じ候補調節エレメントの発現レベルと比較するステップ
を含み、それにより、調節エレメントに作動可能に連結した前記導入遺伝子を選択的に発現する前記細胞型を同定する、方法。 - 前記調節エレメントが、少なくとも1つの他の細胞型と比較して、1つの細胞型における前記導入遺伝子の発現を選択的に増加または減少させる、請求項26に記載の方法。
- 前記調節エレメントが、少なくとも1つの細胞型において前記候補調節エレメントによって駆動される発現と比較して、少なくとも2倍、少なくとも4倍、少なくとも6倍、少なくとも8倍もしくは少なくとも10倍大きい、または多くても2分の1、多くても4分の1、多くても6分の1、多くても8分の1もしくは多くても10分の1の、1つの細胞型における前記導入遺伝子の選択的発現を提供する、請求項26に記載の方法。
- 前記調節エレメントが、少なくとも1つの細胞型において前記候補調節エレメントによって駆動される発現と比較して、少なくとも2%、少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%または少なくとも95%大きいまたは小さい、1つの細胞型における前記導入遺伝子の選択的発現を提供する、請求項26に記載の方法。
- 前記調節エレメントが、少なくとも1つの細胞型において前記候補調節エレメントによって駆動される発現と比較して、約1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、7.5倍、8倍、9倍もしくは10倍大きい、または約1.5分の1、2分の1、3分の1、4分の1、5分の1、6分の1、7分の1、7.5分の1、8分の1、9分の1もしくは10分の1の、1つの細胞型における前記導入遺伝子の選択的発現を提供する、請求項26に記載の方法。
- 前記調節エレメントが、非PVニューロンと比較して、PVニューロンにおける前記導入遺伝子の選択的発現を生じる、請求項26に記載の方法。
- 前記非PVニューロンが、興奮性ニューロン、ドパミン作動性ニューロン、アストロサイト、ミクログリアまたは運動ニューロンのうち1つまたは複数である、請求項31に記載の方法。
- 前記RNAが、mRNA、長い非コードRNA、アンチセンス転写物およびpri-miRNAからなる群から選択される、請求項1から32のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ベクターが、プラスミド、ウイルスベクターまたはコスミドからなる群から選択される、請求項1から33のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターである、請求項34に記載の方法。
- 前記AAVベクターが、AAV1、AAV8、AAV9、scAAV1、scAAV8またはscAAV9である、請求項35に記載の方法。
- 前記AAVベクターがAAV9である、請求項36に記載の方法。
- 前記ベクターが、5’AAV逆位末端反復(ITR)配列および3’AAV ITR配列を含む、請求項35から37のいずれか一項に記載の方法。
- ベクターの前記混合物が、少なくとも104個の候補調節エレメントを含む、請求項1から38のいずれか一項に記載の方法。
- 各候補調節エレメントが、少なくとも1つの独自のバーコードと相関する、請求項1から39のいずれか一項に記載の方法。
- 前記導入遺伝子が、レポーター遺伝子配列を含む、請求項1から40のいずれか一項に記載の方法。
- 前記レポーター遺伝子配列が、核結合ドメインをコードする配列に作動可能に連結されている、請求項41に記載の方法。
- 前記導入遺伝子が、前記バーコードを含む、請求項1から43のいずれか一項に記載の方法。
- 前記レポーター遺伝子配列が、前記バーコードを含む、請求項42から44のいずれか一項に記載の方法。
- 前記バーコードが、代替コドンを含む、請求項43または44に記載の方法。
- 前記核結合ドメインをコードする前記配列が、前記バーコードを含む、請求項43から45のいずれか一項に記載の方法。
- 前記核結合ドメインをコードする前記配列が、Klarsicht/ANC-1/Syne相同性(KASH)ドメインもしくはSad1p/UNC-84(SUN)ドメインタンパク質、またはそれらの生物学的に活性な断片をコードする、請求項43から46のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞型が、結合組織、筋肉組織、神経組織および上皮組織からなる群から選択される組織に属する、請求項1から47のいずれか一項に記載の方法。
- 導入遺伝子に作動可能に連結した調節エレメントを含む核酸分子であって、バーコードを含む、核酸分子。
- 前記バーコードが、代替コドンを含む、請求項49に記載の核酸分子。
- 前記導入遺伝子が、レポーター遺伝子配列を含む、請求項49または50に記載の核酸分子。
- 前記レポーター遺伝子配列が、核結合ドメイン配列をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されている、請求項51に記載の核酸分子。
- 前記核結合ドメイン配列が、KASHドメインもしくはSUNドメインタンパク質、またはそれらの生物学的に活性な断片をコードする、請求項52に記載の核酸分子。
- 前記調節エレメントが、天然に存在しないものである、請求項50から53のいずれか一項に記載の核酸分子。
- 前記レポーター遺伝子配列が、蛍光タンパク質をコードする、請求項49から54のいずれか一項に記載の核酸分子。
- 前記蛍光タンパク質が、緑色蛍光タンパク質(GFP)、高感度緑色蛍光タンパク質(EGFP)、黄色蛍光タンパク質(YFP)、例えば、mBanana、赤色蛍光タンパク質(RFP)、例えば、mCherry、DsRed、dTomato、tdTomato、mHoneydewもしくはmStrawberry、TagRFP、遠赤色蛍光パミドロネート(FRFP)、例えば、mGrape1もしくはmGrape2、シアン蛍光タンパク質(CFP)、青色蛍光タンパク質(BFP)、高感度シアン蛍光タンパク質(ECFP)、ウルトラマリン蛍光タンパク質(UMFP)、橙色蛍光タンパク質(OFP)、例えば、mOrangeもしくはmTangerine、赤色(橙色)蛍光タンパク質(mROFP)、TagCFP、またはテトラシステイン蛍光モチーフである、請求項55に記載の核酸分子。
- 前記導入遺伝子が、前記バーコードを含む、請求項49から56のいずれか一項に記載の核酸分子。
- 前記核結合ドメインをコードする前記配列が、前記バーコードを含む、請求項49から56のいずれか一項に記載の核酸分子。
- 前記レポーター遺伝子配列が、前記バーコードを含む、請求項49から56のいずれか一項に記載の核酸分子。
- 前記バーコードが、前記導入遺伝子のコード領域内に配置されている、請求項49から59のいずれか一項に記載の核酸分子。
- 前記核酸分子が、非コード領域を含み、前記バーコードが、前記導入遺伝子の非コード領域内に配置されている、請求項49から59のいずれか一項に記載の核酸分子。
- 前記核酸分子が、非翻訳領域(UTR)を含み、前記バーコードが、前記UTR内に配置されている、請求項61に記載の核酸分子。
- 前記核酸が、ポリA配列を含み、前記バーコードが、前記ポリA配列の少なくとも50塩基上流に配置されている、請求項61に記載の核酸分子。
- 前記バーコードが、転写開始部位の上流に配置されている、請求項49から59のいずれか一項に記載の核酸分子。
- DNA分子から転写されたRNA分子である核酸分子であって、前記RNA分子が、導入遺伝子およびバーコード配列を含み、前記DNA分子が、調節エレメントを含み、前記RNA分子中の前記バーコード配列が、前記DNA分子中の前記調節エレメントと相関する、核酸分子。
- 前記導入遺伝子が、レポーター遺伝子配列を含む、請求項65に記載の核酸分子。
- 前記レポーター遺伝子配列が、核結合ドメインをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されている、請求項66に記載の核酸分子。
- 前記核結合ドメインが、KASHドメインもしくはSUNドメインタンパク質、またはそれらの生物学的に活性な断片である、請求項67に記載の核酸分子。
- 前記調節エレメントが、天然に存在しないものである、請求項65から68のいずれか一項に記載の核酸分子。
- 前記レポーター遺伝子配列が、蛍光タンパク質をコードする、請求項66から69のいずれか一項に記載の核酸分子。
- 前記蛍光タンパク質が、緑色蛍光タンパク質(GFP)、高感度緑色蛍光タンパク質(EGFP)、黄色蛍光タンパク質(YFP)、例えば、mBanana、赤色蛍光タンパク質(RFP)、例えば、mCherry、DsRed、dTomato、tdTomato、mHoneydewもしくはmStrawberry、TagRFP、遠赤色蛍光パミドロネート(FRFP)、例えば、mGrape1もしくはmGrape2、シアン蛍光タンパク質(CFP)、青色蛍光タンパク質(BFP)、高感度シアン蛍光タンパク質(ECFP)、ウルトラマリン蛍光タンパク質(UMFP)、橙色蛍光タンパク質(OFP)、例えば、mOrangeもしくはmTangerine、赤色(橙色)蛍光タンパク質(mROFP)、TagCFP、またはテトラシステイン蛍光モチーフである、請求項70に記載の核酸分子。
- 前記導入遺伝子が、前記バーコードを含む、請求項65から71のいずれか一項に記載の核酸分子。
- 前記核結合ドメインをコードする前記配列が、前記バーコードを含む、請求項67から71のいずれか一項に記載の核酸分子。
- 前記レポーター遺伝子配列が、前記バーコードを含む、請求項66から71のいずれか一項に記載の核酸分子。
- 前記バーコードが、代替コドンを含む、請求項66から74のいずれか一項に記載の核酸分子。
- 前記核酸分子が、非翻訳領域(UTR)を含み、前記バーコードが、前記UTR内に配置されている、請求項65から71のいずれか一項に記載の核酸分子。
- 前記核酸分子が、ポリA配列を含み、前記バーコードが、前記ポリA配列の少なくとも50塩基上流に配置されている、請求項65から71のいずれか一項に記載の核酸分子。
- 前記バーコードが、転写開始部位の上流に配置されている、請求項65から71のいずれか一項に記載の核酸分子。
- 微粒子に接続されている、請求項65から77のいずれか一項に記載の核酸分子。
- 前記微粒子がビーズである、請求項79に記載の核酸分子。
- 前記微粒子が、微粒子ポリヌクレオチド分子に接続されている、請求項79または80に記載の核酸分子。
- 前記微粒子ポリヌクレオチド分子を介して前記微粒子に接続されている、請求項81に記載の核酸分子。
- 前記微粒子ポリヌクレオチド分子が、プライマー配列を含む、請求項81または82に記載の核酸分子。
- 前記微粒子ポリヌクレオチド分子が、細胞バーコード配列を含む、請求項81から83のいずれか一項に記載の核酸分子。
- 前記微粒子ポリヌクレオチド分子が、Unique Molecular Identifier(UMI)ヌクレオチド配列を含む、請求項81から84のいずれか一項に記載の核酸分子。
- 前記微粒子ポリヌクレオチド分子が、オリゴ-dT配列を含む、請求項81から85のいずれか一項に記載の核酸分子。
- 前記微粒子ポリヌクレオチド分子が、a)プライマー配列、b)細胞バーコード配列、c)Unique Molecular Identifier(UMI)ヌクレオチド配列、およびd)オリゴ-dT配列を含み;前記核酸が、ポリAヌクレオチド配列を含み、前記微粒子が、以下の順序:微粒子--a)--b)--c)--d)でa)~d)に接続され;前記ポリAヌクレオチド配列が、前記オリゴ-dT配列にハイブリダイズされている、請求項81から86のいずれか一項に記載の核酸分子。
- 前記微粒子がビーズである、請求項87に記載の核酸分子。
- 請求項49から65のいずれか一項に記載の核酸を含むベクター。
- ウイルスベクターである、請求項89に記載のベクター。
- アデノ随伴ウイルスベクターである、請求項89に記載のベクター。
- 前記アデノ随伴ウイルスベクターが、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、rh10、およびそれらのハイブリッド、トリAAV、ウシAAV、イヌAAV、ウマAAV、霊長類AAV、非霊長類AAVまたはヒツジAAVのいずれか1つである、請求項89に記載のベクター。
- 前記アデノ随伴ウイルスベクターが、AAV9ベクターである、請求項89に記載のベクター。
- 請求項49から87のいずれか一項に記載の核酸を含む細胞。
- 請求項88から92のいずれか一項に記載のベクターを含む細胞。
- 請求項65から88のいずれか一項に記載の核酸のうち1つまたは複数に接続された微粒子。
- ビーズである、請求項96に記載の微粒子。
- 前記微粒子が、微粒子ポリヌクレオチド分子に接続されている、請求項96または97に記載の微粒子。
- 前記微粒子ポリヌクレオチド分子が、プライマー配列を含む、請求項98に記載の微粒子。
- 前記微粒子ポリヌクレオチド分子が、Unique Molecular Identifier(UMI)を含む、請求項98または99に記載の微粒子。
- 前記微粒子ポリヌクレオチド分子が、オリゴ-dT配列を含む、請求項98から100のいずれか一項に記載の微粒子。
- 前記核酸が、ポリAヌクレオチド配列を含み、前記ポリAヌクレオチド配列が、前記オリゴ-dT配列にハイブリダイズされている、請求項98から101に記載の微粒子。
- 前記微粒子ポリヌクレオチド分子が、a)プライマー配列、b)細胞バーコード配列、c)Unique Molecular Identifier(UMI)配列、およびd)オリゴ-dT配列を含み;前記核酸が、ポリAヌクレオチド配列を含み、前記微粒子が、以下の順序:微粒子--a)--b)--c)--d)でa)~d)に接続され;前記ポリAヌクレオチド配列が、前記オリゴ-dT配列にハイブリダイズされている、請求項98から102のいずれか一項に記載の微粒子。
- 前記微粒子がビーズである、請求項103に記載の微粒子。
- 請求項49から88のいずれか一項に記載の核酸分子を含む液滴。
- 請求項94または95に記載の細胞を含む液滴。
- 請求項96から104のいずれか一項に記載の微粒子を含む液滴。
- 請求項94または95に記載の細胞および請求項96から104のいずれか一項に記載の微粒子を含む液滴。
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