CN112143712B - 一种重组腺相关病毒及其制备方法和在抗体检测的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种重组腺相关病毒及其制备方法和在抗体检测上的应用，本发明利用EF1α启动子以及碱基替换后的荧光素酶Gaussia luciferase和绿色荧光蛋白mNeonGreen的核苷酸序列构建表达载体，制备出同时表达荧光素酶和绿色荧光蛋白的重组腺相关病毒。将所述重组腺相关病毒与待检测血清分别稀释后混合，加入细胞培养，感染后取上清检测荧光素酶的活性即可检测血清中有无腺相关病毒抗体。该重组腺相关病毒还在神经环路标记方面具有广泛的应用价值。

Description

一种重组腺相关病毒及其制备方法和在抗体检测的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种重组腺相关病毒及其制备方法和在抗体检测上的应用。
背景技术
腺相关病毒(Adeno-associated Virus，AAV)属于微小病毒科(parvoviridae)、依赖病毒属(dependovirus)的单链DNA病毒。AAV的基因组是长约4.7Kb的单链DNA分子，病毒颗粒无囊膜，结构上为直径约20-25nm的正二十面体。重组腺相关病毒(Recombinantadeno-associated virus，rAAV)载体是在非致病的野生型AAV基础上改造成的新型基因载体。rAAV载体的DNA一般是用外源基因表达元件替换AAV的编码基因，仅保留了病毒复制和包装所需的ITR序列。rAAV通过反式补偿AAV的非结构蛋白Rep基因、结构蛋白Cap基因和辅助病毒功能因子包装产生。rAAV具有安全性高、免疫原性低、宿主范围广、可感染分裂和非分裂细胞、能介导基因在动物体内长期稳定表达等特点，在基因治疗和神经科学研究中应用非常广泛。
目前，从自然界已经分离出了13种血清型的AAV，从人类细胞中分离的有(AAV2、3、5、6、9)，从非人类动物细胞中分离的有(AAV1、4、7、8和10-13)，自然分离得到的AAV突变型已达100多种。AAV的各种血清型有着不同组织、细胞的感染偏好和特异性。神经科学研究中常用的rAAV主要有2、5、8、9型等，这些rAAV都具有高效转导神经细胞的能力。在神经科学研究中，rAAV主要在三个方面发挥着广泛而重要的作用。首先是实现外源基因在特定类型神经细胞中的表达，通过使用不同类型神经细胞的特异性启动子控制外源基因的表达；其次是运载分子遗传工具实现神经环路的标记范围/连接方向/神经元类型等的可控性，及环路的监控和操纵；最后是rAAV在神经疾病的治疗方面，rAAV作为一种成熟的基因治疗载体工具，已经有多种基于rAAV的基因治疗方案进入临床试验。相关研究表明，体内预先存在的抗体会影响rAAV介导外源效率。
然而目前重组腺相关病毒大多只表达一种外源蛋白，如荧光素酶或荧光蛋白，无法满足一种重组腺相关病毒的多个用途，不能节约制作的成本和时间。个别能够同时表达两种外源蛋白的重组腺相关病毒，其蛋白表达的量低，对蛋白的表达和纯化有更高的要求，或者其荧光蛋白的亮度不够，在使用时无法达到预期的效果。目前对于血清中腺相关病毒抗体检测的手段也并不完善，亟需一种操作简便能准确检测血清中腺相关病毒抗体的方法。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明提出了一种重组腺相关病毒及其制备方法和在抗体检测上的应用，本发明利用EF1α启动子以及碱基替换后的荧光素酶Gaussia luciferase和绿色荧光蛋白mNeonGreen的核苷酸序列构建表达载体，制备出同时表达荧光素酶和绿色荧光蛋白的重组腺相关病毒。将所述重组腺相关病毒与待检测血清分别稀释后混合，加入细胞培养，感染后取上清检测荧光素酶的活性即可检测血清中的腺相关病毒抗体。
本发明提供一种重组腺相关病毒的制备方法，包括如下步骤：
(1)制备具有同时表达荧光素酶和绿色荧光蛋白能力的克隆：利用同源重组的方式将SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3顺次插入到腺相关病毒载体核心骨架，获得克隆命名为pAAV-EF1α-Gluc-2A-mNeonGreen；
SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.3分别是经过个别碱基替换之后的荧光素酶Gaussialuciferase和绿色荧光蛋白mNeonGreen的核苷酸序列。虽然最终翻译的氨基酸序列与替换前相同，但是碱基替换之后的荧光素酶和绿色荧光蛋白表达更强。
本发明中表达的荧光素酶是具有分泌特性的荧光素酶Gaussia luciferase，既方便样品的收集，又能准确检测活病毒；表达的绿色荧光蛋白mNeonGreen效率比GFP更好，亮度更高，能更好的实现对细胞的可视化。
(2)制备同时表达荧光素酶和绿色荧光蛋白的重组腺相关病毒：将所述步骤(1)中的所述克隆和腺相关病毒的辅助质粒共转染细胞，收集细胞裂解后纯化，获得同时表达荧光素酶和绿色荧光蛋白的重组腺相关病毒。
进一步的，所述步骤(1)中的所述腺相关病毒载体取自Addgene质粒库，编号为Addgene#20298，其上具有EF1α启动子序列。选择EF1α启动子使得荧光素酶和绿色荧光蛋白的表达增强，更利于后续的血清抗体检测和神经环路标记。
进一步的，所述步骤(2)中的所述细胞为293T。
本发明还提供一种重组腺相关病毒，由上述的制备方法获得。
本发明还提供一种检测血清中腺相关病毒抗体的方法，包括如下步骤：
(1)分别稀释待检测血清和权利要求4所述的重组腺相关病毒；
(2)将步骤(1)中稀释后的血清和稀释后的重组腺相关病毒混合，孵育；
(3)在步骤(2)获得的混合液中加入293T细胞，培养；
(4)收集上清，检测荧光素酶的活性，活性降低即血清中存在腺相关病毒抗体。
进一步的，所述步骤(1)中的所述稀释步骤采用磷酸缓冲液稀释，所述待检测血清的稀释比例为1:20，所述重组腺相关病毒的稀释比例为1:100，所述稀释比例为体积比。
本发明还提供一种碱基替换的荧光素酶Gaussia luciferase基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供一种碱基替换的绿色荧光蛋白mNeonGreen基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明还提供所述的重组腺相关病毒在腺相关病毒抗体检测中的应用。
本发明还提供所述的重组腺相关病毒在脑神经环路示踪中的应用。
综上，与现有技术相比，本发明达到了以下技术效果：
1.本发明提供了一种同时表达荧光素酶和绿色荧光蛋白的重组腺相关病毒及其制备方法，本发明的重组腺相关病毒表达分泌型荧光素酶，既能方便样品的收集，又能准确的检测活病毒。另外，其表达高亮的绿色荧光蛋白，能更好的实现对细胞的可视化，便于开展相关的研究。
2.本发明对荧光素酶Gaussia luciferase和绿色荧光蛋白mNeonGreen的核苷酸序列进行了改变，这种优化能够增强荧光素酶和绿色荧光蛋白的表达强度。
3.本发明选择EF1α启动子，能够增强荧光素酶和绿色荧光蛋白的表达，降低了蛋白表达和纯化的难度。
4.本发明的方法能够分析动物血清中是否具有重组腺相关病毒抗体，对于开展重组腺相关病毒在血清抗体检测具有广泛的应用价值。
5.本发明制备的重组腺相关病毒具有标记神经细胞的能力，可用于脑神经环路的研究，对于获得可靠的标记效果具有重要意义。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为一种同时表达荧光素酶和绿色荧光蛋白的重组腺相关病毒的构建示意图；其中的启动子是EF1α；荧光素酶是具有分泌特性的荧光素酶Gaussia luciferase；mNeonGreen是效率比GFP更好的绿色荧光蛋白。
图2为一种同时表达荧光素酶和绿色荧光蛋白的重组腺相关病毒的荧光素酶的活性检测示意图；其中：X轴表示分别在6、12、24、48和72h收集培养基上清和细胞裂解液；Y轴表示荧光素酶的活性。
图3为一种同时表达荧光素酶和绿色荧光蛋白的重组腺相关病毒在检测鼠血清中重组腺相关病毒抗体的应用示意图。
图4为一种同时表达荧光素酶和绿色荧光蛋白的重组腺相关病毒在检测猴血清中重组腺相关病毒抗体的应用示意图。
图5为一种同时表达荧光素酶和绿色荧光蛋白的重组腺相关病毒在神经环路标记中的应用示意图。
图6为一种同时表达荧光素酶和绿色荧光蛋白的重组腺相关病毒的荧光强度和荧光素酶活性优于非优化前的基因表达效果；其中2表示本发明的重组腺相关病毒，1为文献报道的重组腺相关病毒。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
本发明提供一种重组腺相关病毒的制备方法，包括如下步骤：
(1)制备具有同时表达荧光素酶和绿色荧光蛋白能力的克隆
利用同源重组的方式将SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3顺次插入到腺相关病毒载体核心骨架，所述载体取自Addgene质粒库，载体编号为Addgene#20298，获得克隆命名为pAAV-EF1α-Gluc-2A-mNeonGreen；其中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.3分别是经过个别碱基替换之后的荧光素酶Gaussia luciferase和绿色荧光蛋白mNeonGreen的核苷酸序列。虽然最终翻译的氨基酸序列与替换前相同，但是替换了碱基之后的荧光素酶和绿色荧光蛋白表达更强。本发明中表达的荧光素酶是具有分泌特性的荧光素酶Gaussialuciferase，既方便样品的收集，又能准确检测活病毒；表达的绿色荧光蛋白mNeonGreen效率比GFP更好，亮度更高，能更好的实现对细胞的可视化。选择EF1α启动子使得荧光素酶和绿色荧光蛋白的表达增强，更利于后续的血清抗体检测和神经环路标记。
(2)制备同时表达荧光素酶和绿色荧光蛋白的重组腺相关病毒
将步骤(1)中所述克隆和腺相关病毒的辅助质粒共转染293T细胞，收集细胞裂解后纯化，获得同时表达荧光素酶和绿色荧光蛋白的重组腺相关病毒。本发明制备得到的重组腺相关病毒血清型为AAV9，不同血清型取决于使用的辅助质粒的类型。本发明中使用的辅助质粒为pAAV-Helper质粒和血清型质粒pAAV-RC。更换其他辅助质粒可以获得不同血清型的重组腺相关病毒，故本发明的方案可用于制备不同血清型的重组腺相关病毒。
本发明制备得到的同时表达荧光素酶和绿色荧光蛋白的重组腺相关病毒能够检测血清中是否存在重组腺相关病毒抗体，具体包括下述步骤：
(1)按照1：20的比例使用PBS稀释血清(待测血清和阴性血清各一份)，同时按照1：100的比例稀释重组腺相关病毒；
(2)取步骤(1)中稀释后的血清和病毒各40μL混合后置于37℃孵育1小时；
(3)将该混合液80μL置于含有293T细胞的96孔板，在37℃、5％CO2培养，使重组病毒感染细胞；
(4)在感染后24小时收集上清，检测荧光素酶的活性，待测血清组的荧光素酶活性与阴性血清组相比降低即待测血清中存在腺相关病毒抗体。
实施例1一种同时表达荧光素酶和绿色荧光蛋白的重组腺相关病毒的制备
1.制备具有同时表达荧光素酶和绿色荧光蛋白能力的克隆
首先采用全基因合成的方式分别合成Gaussia Luciferase基因(SEQ ID NO.1)，插入载体pUC57，即可获得pUC57-Gaussia Luciferase，合成荧光蛋白基因mNeonGreen(SEQID NO.3)，插入载体pUC57，即可获得pUC57-mNeonGreen，采用同源重组的方式将SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.2(2A基因)和SEQ ID NO.3顺次插入到载体AAV核心骨架(Addgene#20298)，获得克隆命名为pAAV-EF1α-Gluc-2A-mNeonGreen；
扩增相应序列的引物分别如下：DNA片段Gaussia Luciferase的引物：SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5，模板为pUC57-mNeonGreen；DNA片段mNeonGreen的引物：SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7，模板为pUC57-mNeonGreen。本发明所有PCR所用引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
使用Kpn I和EcoR I双酶切AAV核心骨架载体(Addgene#20298)，然后采用同源重组的方式将SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3顺次插入到载体，获得克隆命名为pAAV-EF1α-Gluc-2A-mNeonGreen-WPRE-hGHpA。构建的克隆均在生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序验证。
2.制备同时表达荧光素酶和绿色荧光蛋白的重组腺相关病毒
(1)病毒的包装：提前一天将HEK293细胞用胰蛋白酶消化后铺到15cm的培养皿中贴壁培养，转染时细胞汇合度80％左右。将包装AAV所需的三种质以1：1：1的比例，即pAAV-Helper质粒(10μg)，血清型质粒pAAV-RC(10μg)，核心表达质粒pAAV-EF1α-Gluc-2A-mNeonGreen-WPRE-hGHpA(10μg)加入1mL DMEM培养基中，转染试剂PEI(60μL，1mg/mL)加入1mL DMEM培养基中，然后将质粒与PEI混合液混匀，孵育20min，然后将转染混合物加入15cm的培养皿中混匀继续培养。转染72小时后，收集培养上清和细胞。
(2)病毒的纯化：将约10个15cm平皿细胞用10mL裂解液(50mM Tris-Cl(pH8.0)，2mM MgCl2)反复冻融3次，加入1μL的核酸酶在37℃处理1h，离心去除细胞碎片。将细胞裂解液上清与核酸酶处理后的培养上清液合并，然后用PEG4000进行浓缩离心沉淀，用10mL左右的PBS溶液重悬即获得含有AAV的PBS重悬液。在超速离心管中依次加入15％碘克沙醇分离液8mL，25％碘克沙醇分离液6mL，40％碘克沙醇分离液8mL，58％碘克沙醇分离液5mL，然后将10mL左右的含有AAV的PBS重悬液加入离心管的上层密封，再用Type 70Ti转子，63000rpm离心2h。用针头吸取40％碘克沙醇梯度层的液体，PBS透析过夜，然后用Amicon ultra-4(100KD cutoff)截留柱离心浓缩至终体积0.2mL-1mL，无菌分装后-80℃冻存，并测定病毒滴度为3×1012vg/mL。
实施例2同时表达荧光素酶和绿色荧光蛋白的重组腺相关病毒的荧光素酶活性检测
按照1：100的比例使用PBS稀释重组病毒，分别取80μL的病毒感染293T细胞(96孔板)，在37℃、5％CO2培养，分别在感染后6、12、24、48和72小时后分别收集上清和细胞裂解液，并检测荧光素酶的活性，结果如图2所示。结果表明：(1)感染后6小时即可检测到荧光素酶的活性，随着时间的延长，其活性逐渐升高，在感染后24小时即可达到峰值，随后活性呈现下降趋势；(2)上清中的荧光素酶的活性显著高于细胞裂解液中荧光素酶的活性。该结果为后续开展血清抗体的检测提供了有效支撑，后续选用感染后24小时的上清来检测荧光素酶的活性，进而检测血清中的腺相关病毒抗体。
实施例3用同时表达荧光素酶和绿色荧光蛋白的重组腺相关病毒检测鼠血清中是否存在AAV抗体
取鼠血清2份(阴性血清和阳性血清各一份)，按照1：20的比例使用PBS进行稀释，同时按照1：100的比例稀释重组AAV，分别取40μL的血清和病毒混合后置于37℃孵育1小时，将该混合液80μL置于含有293T细胞的96孔板，在37℃、5％CO2培养，在感染后24小时后收集上清检测荧光素酶的活性，结果如图3所示。结果表明，阳性鼠血清组荧光素酶活性相对于阴性血清组明显降低，说明阳性鼠血清能明显抑制重组AAV感染293T细胞，表明该方法可有效检测鼠血清中的AAV抗体。
实施例4用同时表达荧光素酶和绿色荧光蛋白的重组腺相关病毒检测猴血清中是否存在AAV抗体
取猴血清2份(阴性血清和阳性血清各一份)，按照1：20的比例使用PBS进行稀释，同时按照1：100的比例稀释重组AAV，分别取40μL的血清和病毒混合后置于37℃孵育1小时，将该混合液80μL置于含有293T细胞的96孔板，在37℃、5％CO2培养，在感染后24小时收集上清检测荧光素酶的活性，结果如图4所示。结果表明，阳性猴血清组荧光素酶活性相对于阴性血清组明显降低，说明阳性猴血清能明显抑制重组AAV感染293T细胞，表明该方法可有效检测猴血清中的AAV抗体。
实施例5同时表达荧光素酶和绿色荧光蛋白的重组腺相关病毒在神经环路标记中的应用
取0.1μL实施例1中制备的重组腺相关病毒(病毒滴度是3×1012vg/mL)定位注射到鼠中脑腹侧被盖区，感染3周后麻醉动物，分别用0.9％(V/V)生理盐水灌流，然后用4％(V/V)多聚甲醛固定，取出脑组织浸泡于4％(V/V)多聚甲醛液中，然后将脑组织先置于20％(V/V)蔗糖溶液中1天，然后置于30％(V/V)蔗糖溶液中2天。将脑组织底部切平，置于底座上包埋冰冻1小时后切片，挑取脑片使用荧光显微镜观察。
重组病毒注射到鼠脑后，可见绿色荧光信号，图中以灰度表示，表明重组病毒能够在鼠脑内感染神经细胞，且该病毒具有介导绿色荧光基因在神经细胞表达的能力，说明本发明所制备的重组病毒具有标记神经细胞的能力，可用于脑神经环路的研究。
实施例6同时表达荧光素酶和绿色荧光蛋白的重组腺相关病毒的荧光强度和荧光素酶活性优于非优化前的基因表达效果
分别取本发明的重组腺相关病毒和来自文献的重组腺相关病毒(管洁等,生物技术通讯.2011,2:199-202)按照1：100的比例使用PBS稀释重组病毒，分别取80μL的病毒感染293T细胞(96孔板)，在37℃、5％CO2培养，感染后24小时收集上清，并检测荧光表达情况和荧光素酶的活性，结果如图6所示，其中2表示本发明的重组腺相关病毒，1为文献报道的重组腺相关病毒，结果表明，本发明的表达荧光的亮度优于文献报道的重组腺相关病毒；本发明的荧光素酶的活性也优于文献的重组腺相关病毒。以上结果说明利用EF1α启动子以及碱基替换后的荧光素酶Gaussia luciferase和绿色荧光蛋白mNeonGreen的核苷酸序列构建表达载体，制备得到的同时表达荧光素酶和绿色荧光蛋白的重组腺相关病毒，其无论是荧光素酶的活性亦或是荧光蛋白的亮度相比现有技术均有很大的提升，这种更好的效果正是基于对启动子的选择以及荧光素酶Gaussia luciferase和绿色荧光蛋白mNeonGreen核苷酸序列的优化。
结合以上实施例的结果可知，本发明制备得到的同时表达荧光素酶和绿色荧光蛋白的重组腺相关病毒具有多种应用前景，包括利用所述重组腺相关病毒进行血清抗体检测(实施例3和实施例4)和神经环路标记(实施例5)等。
而且，本发明的应用对象不仅限于鼠，还能用于猴和人的血清抗体的检测；本发明所用的绿色荧光蛋白基因只是作为一个范式，因此，还可用其他外源基因替代本发明的绿色荧光蛋白基因。
综上，与现有技术相比，本发明达到了以下技术效果：
1.本发明提供了一种同时表达荧光素酶和绿色荧光蛋白的重组腺相关病毒及其制备方法，本发明的重组腺相关病毒表达分泌型荧光素酶，既能方便样品的收集，又能准确的检测活病毒。另外，其表达高亮的绿色荧光蛋白，能更好的实现对细胞的可视化，便于开展相关的研究。
2.本发明对荧光素酶Gaussia luciferase和绿色荧光蛋白mNeonGreen的核苷酸序列进行了改变，这种优化能够增强荧光素酶和绿色荧光蛋白的表达强度。
3.本发明选择EF1α启动子，能够增强荧光素酶和绿色荧光蛋白的表达，降低了蛋白表达和纯化的难度。
4.本发明的方法能够分析动物血清中是否具有重组腺相关病毒抗体，对于开展重组腺相关病毒在血清抗体检测具有广泛的应用价值。
5.本发明制备的重组腺相关病毒具有标记神经细胞的能力，可用于脑神经环路的研究，对于获得可靠的标记效果具有重要意义。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
SEQ ID NO.1
ATGGGTGTAAAAGTCCTCTTCGCGCTCATCTGCATTGCTGTGGCAGAAGCCAAGCCCACGGAGAACAATGAAGACTTCAACATCGTAGCTGTGGCCAGCAACTTCGCCACCACGGACTTGGATGCTGACCGTGGGAAACTTCCTGGGAAGAAACTTCCTTTAGAAGTATTAAAAGAAATGGAAGCCAACGCCAGGAAAGCAGGCTGCACGCGTGGCTGCCTCATCTGCCTCAGCCACATAAAATGCACGCCGAAGATGAAGAAGTTCATTCCTGGCCGCTGCCACACGTATGAAGGTGACAAAGAAAGTGCCCAGGGTGGCATTGGAGAAGCCATCGTGGACATTCCAGAAATACCAGGCTTCAAGGACCTGGAGCCGATGGAGCAGTTCATTGCCCAGGTGGACCTCTGTGTGGACTGCACCACGGGCTGCTTAAAAGGACTGGCCAATGTCCAGTGCAGCGACCTCCTCAAGAAGTGGCTACCCCAGCGCTGTGCCACCTTCGCCAGCAAAATACAAGGACAAGTGGACAAAATAAAAGGTGCTGGTGGTGAC
SEQ ID NO.2
CAGCTGTTGAATTTTGACCTTCTCAAGCTGGCGGGAGACGTCGAGTCCAACCCTGGGCCA
SEQ ID NO.3
ATGGTCTCCAAAGGAGAAGAAGACAACATGGCGTCGCTGCCGGCGACACATGAACTTCACATATTTGGCTCCATCAATGGTGTAGATTTTGACATGGTTGGACAAGGAACTGGAAACCCCAATGATGGGTATGAAGAATTAAATTTAAAAAGCACCAAAGGAGACTTACAATTCTCCCCGTGGATTTTAGTACCGCACATTGGCTATGGCTTCCACCAGTACCTGCCCTACCCAGATGGCATGTCGCCCTTCCAGGCGGCGATGGTAGATGGCAGCGGCTACCAAGTTCACAGGACCATGCAGTTTGAAGATGGTGCCTCGCTCACTGTCAACTACCGCTACACCTATGAAGGCAGCCACATCAAAGGAGAAGCACAAGTAAAAGGCACGGGCTTCCCGGCGGACGGTCCTGTCATGACCAACAGCCTCACGGCGGCGGACTGGTGCCGCTCCAAGAAGACCTACCCCAACGACAAGACCATCATCTCCACGTTCAAGTGGAGCTACACCACGGGAAATGGGAAGCGCTACCGCTCCACGGCGCGCACCACCTACACCTTTGCCAAGCCCATGGCGGCCAACTACCTGAAGAACCAGCCGATGTATGTCTTCAGGAAGACGGAGCTGAAGCACAGCAAGACGGAGCTCAACTTCAAAGAATGGCAGAAAGCCTTCACAGATGTTATGGGCATGGATGAGCTCTACAAA
SEQ ID NO:4
TTTCAGGTGTCGTGAGGTACCATGGGTGTAAAAGTCCTCTTC
SEQ ID NO:5
AGGTCAAAATTCAACAGCTGCTTAATTAAGTCACCACCAGCACCTTTTAT
SEQ ID NO:6
CAGCTGTTGAATTTTGACCTTCTCAAGCTGGCGGGAGACGTCGAGTCCAACCCTGGGCCACCTAAGGCCATGGTCTCCAAAGGAGAAGAA
SEQ ID NO:7
GATAAGCTTGATATCGAATTCTTATTTGTAGAGCTCATCCAT
SEQUENCE LISTING
<110> 中国科学院深圳先进技术研究院
<120> 一种重组腺相关病毒及其制备方法和在抗体检测的应用
<130> 20200930
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 555
<212> DNA
<213> Daphnia
<400> 1
atgggtgtaa aagtcctctt cgcgctcatc tgcattgctg tggcagaagc caagcccacg 60
gagaacaatg aagacttcaa catcgtagct gtggccagca acttcgccac cacggacttg 120
gatgctgacc gtgggaaact tcctgggaag aaacttcctt tagaagtatt aaaagaaatg 180
gaagccaacg ccaggaaagc aggctgcacg cgtggctgcc tcatctgcct cagccacata 240
aaatgcacgc cgaagatgaa gaagttcatt cctggccgct gccacacgta tgaaggtgac 300
aaagaaagtg cccagggtgg cattggagaa gccatcgtgg acattccaga aataccaggc 360
ttcaaggacc tggagccgat ggagcagttc attgcccagg tggacctctg tgtggactgc 420
accacgggct gcttaaaagg actggccaat gtccagtgca gcgacctcct caagaagtgg 480
ctaccccagc gctgtgccac cttcgccagc aaaatacaag gacaagtgga caaaataaaa 540
ggtgctggtg gtgac 555
<210> 2
<211> 60
<212> DNA
<213> FMDV
<400> 2
cagctgttga attttgacct tctcaagctg gcgggagacg tcgagtccaa ccctgggcca 60
<210> 3
<211> 708
<212> DNA
<213> Branchiostoma
<400> 3
atggtctcca aaggagaaga agacaacatg gcgtcgctgc cggcgacaca tgaacttcac 60
atatttggct ccatcaatgg tgtagatttt gacatggttg gacaaggaac tggaaacccc 120
aatgatgggt atgaagaatt aaatttaaaa agcaccaaag gagacttaca attctccccg 180
tggattttag taccgcacat tggctatggc ttccaccagt acctgcccta cccagatggc 240
atgtcgccct tccaggcggc gatggtagat ggcagcggct accaagttca caggaccatg 300
cagtttgaag atggtgcctc gctcactgtc aactaccgct acacctatga aggcagccac 360
atcaaaggag aagcacaagt aaaaggcacg ggcttcccgg cggacggtcc tgtcatgacc 420
aacagcctca cggcggcgga ctggtgccgc tccaagaaga cctaccccaa cgacaagacc 480
atcatctcca cgttcaagtg gagctacacc acgggaaatg ggaagcgcta ccgctccacg 540
gcgcgcacca cctacacctt tgccaagccc atggcggcca actacctgaa gaaccagccg 600
atgtatgtct tcaggaagac ggagctgaag cacagcaaga cggagctcaa cttcaaagaa 660
tggcagaaag ccttcacaga tgttatgggc atggatgagc tctacaaa 708

Claims (4)

1.一种重组腺相关病毒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)利用同源重组的方式将SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3顺次插入到腺相关病毒载体核心骨架，获得克隆；
(2)将所述步骤(1)中的所述克隆和腺相关病毒的辅助质粒共转染细胞，收集细胞裂解后纯化，获得同时表达荧光素酶和绿色荧光蛋白的重组腺相关病毒；
所述步骤(1)中的所述腺相关病毒载体取自Addgene质粒库，编号为Addgene#20298，其上具有EF1α启动子序列。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中的所述细胞为293T。
3.一种重组腺相关病毒，其特征在于，由权利要求1-2任一项所述的制备方法获得。
4.权利要求3所述的重组腺相关病毒在脑神经环路示踪中的应用。
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