CN107828821A - 一种腺相关病毒感染敏感的细胞系的构建方法及腺相关病毒中和抗体含量测定的检测方法 - Google Patents

一种腺相关病毒感染敏感的细胞系的构建方法及腺相关病毒中和抗体含量测定的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种腺相关病毒感染敏感的细胞系的构建方法及腺相关病毒中和抗体含量测定的检测方法，属于医学检测领域。本发明提供的腺相关病毒感染敏感的细胞系的构建方法，通过全新的思路设计，可以构建出对腺相关病毒感染敏感的细胞，用以检测腺相关病毒感染效率，且与其他细胞系相比，具有更高的检测灵敏度；腺相关病毒中和抗体有无及含量高低的检测方法，使用构建出的腺相关病毒感染敏感的细胞系，快速灵敏地检测待检样本中是否含有腺相关病毒中和抗体及抗体含量，为后续的基因治疗等提供较为可靠的参考，具有重要的应用价值。

Description

一种腺相关病毒感染敏感的细胞系的构建方法及腺相关病毒 中和抗体含量测定的检测方法
技术领域
本发明涉及医学检测领域，具体而言，涉及一种腺相关病毒感染敏感的细胞系的构建方法及腺相关病毒中和抗体含量测定的检测方法。
背景技术
目前，基因治疗药物是新药研发的主要方向。目前重组腺相关病毒是最为常用的治疗工具之一，然而重组腺相关病毒作为治疗工具还是存在一定的风险，需要对风险进行控制。
腺相关病毒(AAV)具有感染范围广、病原性低、携带的治疗基因表达期长等特点，是最有前景的基因治疗载体之一。2012年，欧洲批准了首个基因疗法，用以治疗家族性脂蛋白酶缺乏症。基因治疗将成为某些疾病的主流疗法，并且为更多疾病的治疗提供新的选择。
为了提高治疗的特异性，在进行治疗时会根据不同的治疗部位选择合适的血清型。在现实生活中，大多数人都感染过AAV，因此体内可能也会产生相应的抗体，若不进行中和抗体筛查就进行AAV基因治疗，将会使治疗结果大打折扣甚至引起严重的免疫反应。因此快速准确的进行病人体内不同血清型的AAV中和抗体的筛查和含量检测是AAV临床基因治疗中至关重要且不可或缺的步骤。
目前主要使用ELISA等技术进行样品中AAV中和抗体的筛查和含量测定，需要使用价格较为昂贵的特异性抗体，检测成本高，且操作过程复杂，耗时长。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种腺相关病毒感染敏感的细胞系的构建方法，通过本构建方法的简单操作，可以将多种动物细胞改造成对腺相关病毒敏感的细胞系。
本发明的第二目的在于提供一种不同血清型的腺相关病毒中和抗体含量测定的检测方法，本检测方法可以判断待检样品中是否存在腺相关病毒中和抗体及抗体含量，为后续的基因治疗等提供参考。
为了实现本发明的上述目的，采用以下技术方案：
一种腺相关病毒感染敏感的细胞系的构建方法，包括：
在细胞中导入AAVR基因过表达载体，过表达AAVR相关功能基因，获得腺相关病毒感染敏感的细胞系。
一种腺相关病毒中和抗体含量测定的检测方法，包括：
培养采用上述的构建方法制备的腺相关病毒感染敏感细胞系的细胞，并按照一定数量铺孔板培养；
将待检测样本梯度稀释；
将待检样本与带有特征基因的重组腺相关病毒混合孵育，得到混合样本；
将腺相关病毒敏感的细胞系细胞与混合样本混合培养；
检测特征基因。
本发明的有益效果为：本发明提供的腺相关病毒感染敏感的细胞系的构建方法，通过全新的思路设计，可以构建出对腺相关病毒感染敏感的细胞，用以检测腺相关病毒感染效率，且与其他细胞系相比，具有更高的检测灵敏度；腺相关病毒中和抗体有无及含量高低的检测方法，使用构建出的腺相关病毒感染敏感的细胞系，快速灵敏地检测待检样本中是否含有腺相关病毒中和抗体及抗体含量，为后续的基因治疗等提供较为可靠的参考，具有重要的应用价值。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)，也称腺伴随病毒，属于微小病毒科依赖病毒属，是目前发现的结构最简单的单链DNA 缺陷型病毒，需要辅助病毒(通常为腺病毒)参与复制。腺相关病毒是一种复制缺陷型、无致病性的一种病毒，它编码两个末端的反向重复序列(ITR)中的cap和rep基因。ITRs对于病毒的复制和包装具有决定性作用。cap基因编码病毒衣壳蛋白，rep基因参与病毒的复制和整合。AAV能感染多种细胞。rep基因产物存在时，病毒 DNA很容易整合到人类第19号染色体。腺相关病毒感染的细胞不会产生任何的病理反应，对人类和其他动物的感染也不会产生可感知的症状，其可以感染大部分哺乳动物细胞。因此可以将腺相关病毒应用于基因治疗。
下面对本发明实施例的一种腺相关病毒感染敏感的细胞系的构建方法及腺相关病毒抗体免疫反应的检测方法进行具体说明。
一种腺相关病毒感染敏感的细胞系的构建方法，包括：
在细胞中导入AAVR基因过表达载体，使细胞过表达AAVR功能蛋白，获得腺相关病毒感染敏感的细胞系。
基因治疗中大量应用到腺相关病毒(AAV)，然而腺相关病毒(AAV)作为一种异源病毒，哺乳动物尤其是人类的血清中含有腺相关病毒(AAV)的中和抗体；在进行基因治疗前，需要对患者体内的腺相关病毒(AAV)中和抗体进行检测，腺相关病毒(AAV)的中和抗体含量是一个较为重要的检测指标。若患者体内含有较多的腺相关病毒(AAV)或重组腺相关病毒(recombinant AAV，rAAV)中和抗体，将会引起较强的免疫反应，导致基因治疗失败；因此对患者体内的中和抗体进行检测是不可或缺且至关重要的。中和抗体的检测可以通过中和抗体与腺相关病毒发生抗原抗体反应后的带有报告基因的重组腺相关病毒(rAAV)对细胞的感染活力测定来实现。
AAVR(AAV receptor，AAVR)是一个在AAV感染过程中起关键作用的受体，且对广泛的AAV的血清型的感染均有促进作用，由于AAVR是一类普遍的受体，因此可以应用于多种血清型的AAV中和抗体的检测。通过构建过表达AAVR蛋白的细胞系的方式，可以提高检测的最低限度、灵敏度和可靠性。
由于动物细胞自身表达AAVR蛋白的量不足够高，导致细胞对腺相关病毒(AAV)或重组腺相关病毒(rAAV)的感染不够敏感，在细胞中过量表达AAVR蛋白，可以明显提高细胞对腺相关病毒 (AAV)或重组腺相关病毒(rAAV)感染的敏感性，进而将对腺相关病毒(AAV)或重组腺相关病毒(rAAV)感染敏感的细胞应用到腺相关病毒(AAV)或重组腺相关病毒(rAAV)中和抗体的检测中。
进一步地，细胞为Hela细胞、胰岛细胞、CHO细胞、293细胞、 HepG2细胞中的一种。
Hela细胞，是一种人工培养、具有无限增殖能力的细胞。在医学界，Hela细胞被广泛应用于肿瘤研究、生物实验或者细胞培养，已经成为医学研究中非常重要的工具。这种细胞是现有来自人体的组织培养中最早的分离细胞，在世界各地的研究室继续培养，广泛应用于各种研究。
CHO细胞，从中国地鼠卵巢细胞得到，也是一种广泛应用的实验用细胞系。
293细胞，该类细胞比较容易转染，是一个很常用的表达研究外源基因的细胞株。
HepG2细胞，来源于肝癌组织；该细胞分泌多种血浆蛋白：清蛋白、α2-巨球蛋白、血纤维蛋白溶酶原、铁传递蛋白等。
进一步地，AAVR基因、AAVR基因的同源基因或改造的表达 AAVR蛋白的基因中的一种。
在细胞内能表达出AAVR蛋白的基因可能直接翻译表达的 AAVR基因，也而又可能是与AAVR基因同源的基因；或者是人工改造优化密码子能表达AAVR蛋白的基因序列；还可以是AAVR基因的片段等。
进一步地，AAVR基因过表达载体为慢病毒载体。
慢病毒载体可以将外源基因或外源的shRNA有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达目的序列的效果。所以，在体外实验及体内实验的研究中，慢病毒己经成为表达外源基因或外源shRNA 的常用载体形式之一，并且正在获得越来越广泛的应用。
一种腺相关病毒中和抗体含量测定的检测方法，包括：
培养采用上述的构建方法制备的腺相关病毒感染敏感细胞系的细胞；
将待检测样本梯度稀释；
将待检样本与带有特征基因的重组腺相关病毒混合孵育，得到混合样本；
将腺相关病毒敏感的细胞系细胞与混合样本混合培养；
检测特征基因。
由于制备的腺相关病毒感染敏感的细胞系细胞过表达了AAVR 蛋白，如果待检样本中含有腺相关病毒(AAV)的中和抗体，将腺相关病毒(AAV)或重组腺相关病毒(rAAV)与梯度稀释后的待检样本混合孵育后，腺相关病毒(AAV)或重组腺相关病毒(rAAV)会和抗体发生免疫反应，进行灵敏细胞系的感染时，则无法得到与对照组(无AAV或rAAV中和抗体)相当的感染效率，因此不能检测或只能检测到微弱的特征基因信号。如果待检样本中没有相应的中和抗体，腺相关病毒(AAV)或重组腺相关病毒(rAAV)可以较好的感染腺相关病毒感染敏感的细胞系细胞，则可以检测到与对照组相当的特征基因信号。
制作带特征基因的腺相关病毒可以是野生型腺相关病毒也可以是获得带特征基因的重组腺相关病毒。
进一步地，待检样本为血液样本。
样品检测时稀释梯度视具体样品而定。
进一步地，特征基因为GFP基因、EGFP基因、YFP基因、LacZ 基因、GUS基因、mCherry基因和luciferase基因中的一种。
进一步地，重组腺相关病毒的滴度为1病毒颗粒/毫升-1020病毒颗粒/毫升。
进一步地，待检样本稀释按照1-1×109倍的比例稀释。
进一步地，孵育的温度为25-60℃，孵育的时间为30-120min。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供一种腺相关病毒感染敏感的细胞系的构建方法，具体构建步骤如下：
1.1将过表达AAVR基因的慢病毒载体导入Hela细胞；获得过表达AAVR的Hela细胞，即腺相关病毒感染敏感的Hela细胞；
1.2培养腺相关病毒感染敏感的Hela细胞，得到大量的腺相关病毒感染敏感的Hela细胞。
当然，在其他的实施例中，可以先将Hela细胞的AAVR基因、 AAVR同源基因或者AAVR基因的片段等敲除或干扰掉，再导入过表达AAVR的表达载体；另外还可以选用胰岛细胞、CHO细胞、293 细胞和HepG2细胞等类型的细胞进行实验，然后导入过表达AAVR 基因的慢病毒载体，获得相应的腺相关病毒敏感的细胞系。
实施例2
本实施例提供一种腺相关病毒中和抗体的检测及含量测定方法，具体操作步骤如下：
1.1将实施例1构建得到的腺相关病毒感染敏感的Hela细胞在 24孔板进行培养，细胞数以1×105个细胞/孔的密度进行铺板；
1.2将待检样本按10倍的浓度梯度稀释，最高稀释1×109倍，得到10个不同浓度的待检样本；
1.3并设置最大值对照组(不含AAV抗体，加入新生儿脐带血血清替代抗体样本)和最小值对照组(检测时不加入AAV，采用DMEM 替代AAV)；
1.4将10个不同浓度的待检样本、最大值对照组和最小值对照组共12个组，分别取10μL，分别与带有GFP基因的重组腺相关病毒溶液10μL混合孵育培养，每个样品中加入的带有GFP基因的重组腺相关病毒的量为1020病毒颗粒/毫升；在孵育温度45℃的条件下孵育75min，得到混合样本；
1.5将混合样本感染步骤1.1中的腺相关病毒感染敏感的Hela细胞，37℃培养。
1.6感染48小时后，流式检测上述感染后的细胞的GFP荧光信号，并分别与最大值对照组和最小值对照组的信号值进行比较。
当然，在其他的实施例中，还可以选择EGFP基因、YFP基因、 LacZ基因、GUS基因、mCherry基因和luciferase基因等基因作为特征基因应用检测。
实施例3
本实施例提供一种腺相关病毒中和抗体的检测及含量测定方法，具体操作步骤如下：
1.1将实施例1构建得到的腺相关病毒感染敏感的Hela细胞在 24孔板进行培养，细胞数以1×105个细胞/孔的密度进行铺板；
1.2将待检样本按10倍的浓度梯度稀释，最高稀释1×109倍，得到10个不同浓度的待检样本；
1.3并设置最大值对照组(不含AAV抗体，加入新生儿脐带血血清替代抗体样本)和最小值对照组(检测时不加入AAV，采用DMEM 替代AAV)；
1.4将10个不同浓度的待检样本、最大值对照组和最小值对照组共12个组，分别取30μL，分别与带有GFP基因的重组腺相关病毒溶液10μL混合孵育培养，每个样品中加入的带有GFP基因的重组腺相关病毒的量为1病毒颗粒/毫升；在摇床温度60℃的条件下孵育30min，得到混合样本；
1.5将混合样本感染步骤1.1中的腺相关病毒感染敏感的Hela细胞，37℃培养。
1.6感染48小时后，流式检测上述感染后的细胞的GFP荧光信号，并分别与最大值对照组和最小值对照组的信号值进行比较。
当然，在其他的实施例中，还可以选择EGFP基因、YFP基因、 LacZ基因、GUS基因、mCherry基因和luciferase基因等基因作为特征基因应用检测。
实施例4
本实施例提供一种腺相关病毒中和抗体的检测及含量测定方法，具体操作步骤如下：
1.1将实施例1构建得到的腺相关病毒感染敏感的Hela细胞在 24孔板进行培养，细胞数以1×105个细胞/孔的密度进行铺板；
1.2将待检样本按10倍的浓度梯度稀释，最高稀释1×109倍，得到10个不同浓度的待检样本；
1.3并设置最大值对照组(不含AAV抗体，加入新生儿脐带血血清替代抗体样本)和最小值对照组(检测时不加入AAV，采用DMEM 替代AAV)；
1.4将10个不同浓度的待检样本、最大值对照组和最小值对照组共12组，分别取10μL，分别与带有GFP基因的重组腺相关病毒溶液30μL混合孵育培养，每个样品中加入的带有GFP基因的重组腺相关病毒的量为1010病毒颗粒/毫升；在摇床温度25℃的条件下孵育120min，得到混合样本；
1.5将混合样本感染步骤1.1中的腺相关病毒感染敏感的Hela细胞，37℃培养。
1.6感染48小时后，流式检测上述感染后的细胞的GFP荧光信号，并分别与最大值对照组和最小值对照组的信号值进行比较。
当然，在其他的实施例中，还可以选择EGFP基因、YFP基因、 LacZ基因、GUS基因、mCherry基因和luciferase基因等基因作为特征基因应用检测。
综上所述，本发明实施例的腺相关病毒感染敏感的细胞系的构建方法，能够通过巧妙的实验设计，构建出对腺相关病毒的感染较为敏感的细胞系，该细胞系可以用于临床基因治疗时病人体内的腺相关病毒中和抗体的检查；腺相关病毒中和抗体的检测和含量测定方法：将待检样本梯度稀释后，和带有报告基因的重组腺相关病毒混合孵育后，感染上述对腺相关病毒感染敏感的细胞系，48小时后检测细胞的荧光信号，通过与对照组的比较，判断待检测样本中是否含有AAV 中和抗体并确定中和抗体的含量，，为后续的基因治疗等提供可靠的参考。
以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

Claims (10)

1.一种腺相关病毒感染敏感的细胞系的构建方法，其特征在于，包括：
在细胞中导入AAVR基因过表达载体，过表达AAVR相关功能基因，获得所述腺相关病毒感染敏感的细胞系。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述细胞为Hela细胞、胰岛细胞、CHO细胞、293细胞和HepG2细胞中的一种。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述AAVR相关功能基因为AAVR基因、所述AAVR基因的同源基因或改造的表达AAVR蛋白的基因中的一种。
4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述AAVR基因过表达载体为慢病毒载体。
5.一种腺相关病毒中和抗体含量测定的检测方法，其特征在于，包括：
培养采用如权利要求1-4任一项所述的构建方法制备的腺相关病毒感染敏感的细胞系细胞；
将待检样本按照比例稀释；
将待检样本与带有特征基因的重组腺相关病毒混合孵育，得到混合样本；
将所述腺相关病毒敏感的细胞系细胞与所述混合样本混合培养；
检测所述特征基因。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述待检样本为血液样本。
7.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述特征基因包括为GFP基因、EGFP基因、YFP基因、LacZ基因、GUS基因、mCherry基因和luciferase基因中的一种。
8.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述重组腺相关病毒的滴度为1病毒颗粒/毫升-1020病毒颗粒/毫升。
9.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述待检样本稀释按照1-1×109倍的比例稀释。
10.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述孵育的温度为25-60℃，所述孵育的时间为30-120min。
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