CN104762362B - 一种细胞系法检测热原的方法及其试剂盒 - Google Patents
一种细胞系法检测热原的方法及其试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种细胞系法检测热原的方法和试剂盒。所述的方法包括以下的步骤:(1)制备热原物质的标准溶液和待检样品的溶液;(2)将步骤(1)所述的热原物质的标准溶液或待检样品的溶液分别加入含有HL‑60细胞的细胞培养液中培养,取培养后细胞的上清液;(3)检测步骤(2)所述细胞的上清液中细胞因子IL‑6的含量。所述的方法能够模拟人体对热原的反应,并对革兰氏阴性菌来源、革兰氏阳性菌来源和酵母来源的热原物质进行定性和定量分析,灵敏度高,简单易行。所述的试剂盒包括热原物质的标准溶液、细胞因子IL‑6的检测试剂和HL‑60细胞;所述试剂盒操作简便,能够对热原物质进行定性和定量分析,灵敏度高。
Description
技术领域
本发明属于医药领域,具体涉及一种细胞系法检测热原的方法及其试剂盒。
背景技术
热原(pyrogen)指由微生物产生的能引起恒温动物体温异常升高的致热性物质。各国药典收载的热原检测法包括家兔热原检查法和细菌内毒素检查法(bacterialendotoxins test,BET)。家兔法于1942年被美国药典首次收录,至今被认为是检测热原的“黄金标准”,但其也存在一些缺点:如只能给出阴性或阳性的定性结果、灵敏度低、结果重复性差,结果准确与否依赖于兔子品系的选择和实验条件的控制;费用较高;使用活体动物进行体内实验等。细菌内毒素检查法,也被称作鲎试验法(limulus amoebocyte lysatetest,LAL),LAL法主要的优点是利用细菌内毒素标准品,可以半定量或全定量检测细菌内毒素、灵敏度高。但该方法最大的缺点是它只能特异性地检测革兰氏阴性菌来源的细菌内毒素,不适用于检测其他种类的热原物质。然而随着人们对动物福利问题的日益关注、鲎资源日益匮乏及药品研制技术的发展,尤其是以病毒、细菌为原料的相关生物技术制品的出现,传统热原检测方法用于产品的质量控制正面临严峻的挑战。因此,目前倾向于采用细胞系法或全血法来检测热原刺激后细胞因子的变化来代替传统的检测方法。
近年来,单核细胞系法成为热原检测研究热点。目前已有7种方法(新鲜人全血-IL-1β、新鲜人全血-IL-6、PBMC-IL-6、MM6-IL-6、THP-1-新蝶呤(Neo)、THP-1-TNF-α和冻存人全血-IL-1β)分别于2004、2005年得到欧洲权威机构(例如欧洲替代方法论证中心(European Centre for the Validation of Alternative Methods,ECVAM),英国国家生物制品检定所(National Institute for BIOLOGICAL Standards and Control,NIBSC)等)的正式验证与推荐。尽管细胞系法似乎更符合要求:不使用动物,能真实模拟人体对热原的反应,并且能定量或半定量地检测出较多种类的热原物质,操作简便等,但其需要找到合适的细胞,目前研究比较热门的细胞如MM6亚克隆细胞,较难得到,不适合广泛的推广,而THP-1细胞灵敏度较低,剂量依赖性较差,因此利用细胞系法进行热原检测存在许多亟待解决的问题。
发明内容
本发明针对现有技术中检测热原的方法只能检测革兰氏阴性菌来源的细菌内毒素、细胞难以获得、灵敏度低、剂量依赖性差等缺陷,提供一种细胞系法检测热原的方法及其试剂盒,所述的方法能够对革兰氏阴性菌来源、革兰氏阳性菌来源和酵母来源的热原物质进行定性和定量分析、灵敏度高、剂量依赖性好,而且HL-60细胞市售易得,适合于应用推广。所述的试剂盒操作简便、可以对热原物质进行定性和定量分析,灵敏度高。
发明人经过广泛的研究和反复的试验,发现HL-60细胞在经过本发明方法培养后对热原物质敏感,能够用于细胞系法检测热原,因此发明人发明了一种细胞系法检测热原的方法,并且从HL-60细胞的细胞密度、热原物质的作用时间、热原物质或待检样品的浓度、细胞培养液的种类和HL-60细胞的细胞代次等多个试验参数进行选择和优化,从而建立一个良好的热原检测方法的模型。
本发明提供一种细胞系法检测热原的方法,其包括以下的步骤:
(1)制备热原物质的标准溶液和待检样品的溶液;
(2)将步骤(1)所述的热原物质的标准溶液或待检样品的溶液分别加入含有HL-60细胞的细胞培养液中培养,取培养后细胞的上清液;
(3)检测步骤(2)所述细胞的上清液中细胞因子IL-6的含量。
其中,所述的HL-60细胞又称人白血病细胞。
所述的细胞因子IL-6又称白细胞介素-6,属于内源性致热源,会引发热原反应。
步骤(1)为:制备热原物质的标准溶液和待检样品的溶液。其中,所述的热原物质为本领域常规的热原物质,较佳地为革兰氏阴性菌来源的热原物质、革兰氏阳性菌来源的热原物质和酵母来源的热原物质中的一种或多种,更佳地为细菌内毒素、脂壁酸和酵母多糖中的一种或多种。
所述的待检样品为注射液;较佳地,为静脉注射液或肌肉注射液。
所述的热原物质的标准溶液的制备方法为本领域常规的制备方法,较佳地为用稀释液稀释所述的热原物质。所述的待检样品的溶液或为待检样品本身,或将待检样品用稀释液稀释。所述的稀释液为本领域常规的稀释液,较佳地为含0.5~20%胎牛血清(FBS)的IMDM(Iscove’s Modified Dubecco’s Medium)培养液,更佳地为含1~10%胎牛血清的IMDM培养液,最佳地为含2~5%胎牛血清的IMDM培养液,所述的百分比为胎牛血清占IMDM培养液的体积百分比。
步骤(2)为:将步骤(1)所述的热原物质的标准溶液或待检样品的溶液分别加入含有HL-60细胞的细胞培养液中培养,取培养后细胞的上清液。其中,所述的热原物质的标准溶液或待检样品的溶液的与所述的细胞培养液的体积比为本领域常规的体积比,较佳地为1:1~1:4。
所述的细胞培养液为本领域常规的细胞培养液,较佳地为含0.5~20%胎牛血清的IMDM培养液,更佳地为含1~10%胎牛血清的IMDM培养液;最佳地为含2~5%胎牛血清的IMDM培养液,所述的百分比为胎牛血清占IMDM培养液的体积百分比。
所述的HL-60细胞的细胞密度为本领域常规的细胞密度,较佳地为1×105个/mL~5×107个/mL,更佳地为5×105个/mL~5×107个/mL,最佳地为1×106个/mL~1×107个/mL。
所述的HL-60细胞按本领域常规的步骤培养,较佳地,按包括以下步骤的方法培养:将HL-60细胞在含10~25%胎牛血清的IMDM培养液中培养,即可,所述的百分比为胎牛血清占IMDM培养液的体积百分比。所述的培养的时间为本领域常规的时间,较佳地为2~3天。所述的培养的温度为本领域常规的温度,较佳地为37℃。所述培养的二氧化碳浓度为本领域常规的浓度,较佳地为5%,所述的百分比为体积百分比。较佳地,将HL-60细胞在含15~25%胎牛血清的IMDM培养液中培养;更佳地,将HL-60细胞在含15~20%胎牛血清的IMDM培养液中培养,所述的百分比为胎牛血清占IMDM培养液的体积百分比。
较佳地,所述的HL-60细胞是经过传代培养的HL-60细胞。所述的传代培养的代数为本领域常规的代数,较佳地为所述HL-60细胞复苏后2~30代,更佳地为所述HL-60细胞复苏后5~15代。所述的传代培养的条件和步骤为本领域常规的条件和步骤,较佳地,用含10~25%胎牛血清的IMDM培养液将HL-60细胞于5%,37℃二氧化碳培养箱内培养,每2~3天更换细胞培养液一次,即可,所述的百分比为胎牛血清占IMDM培养液的体积百分比。其中,所述的细胞培养液为本领域常规的细胞培养液,较佳地为10~25%胎牛血清的IMDM培养液;更佳地为含15~25%胎牛血清的IMDM培养液,最佳地为含15~20%胎牛血清的IMDM培养液,所述的百分比为胎牛血清占IMDM培养液的体积百分比。
所述的培养的时间为本领域常规的时间,较佳地为1~4天,更佳地为1~3天,最佳地为1~2天。所述的培养的温度为本领域常规的温度,较佳地为37℃。所述培养的二氧化碳浓度为本领域常规的浓度,较佳地为5%,所述的百分比为体积百分比。
步骤(3)为:检测步骤(2)所述细胞的上清液中细胞因子IL-6的含量。其中,所述的检测的方法为本领域常规的方法,较佳地为酶联免疫吸附试验(enzyme-linkedimmunosorbent assay,ELISA)法。
较佳地,所述的热原检测方法还包括以下的步骤:
(4)根据步骤(3)检测的细胞因子IL-6的含量,得到热原检测的结果。
本发明中的一个较佳实例是:
(1)制备内毒素的标准溶液,所述内毒素的标准溶液的浓度为100Eu/mL、20Eu/mL、4Eu/mL、0.8Eu/mL、0.16Eu/mL、0.032Eu/mL、0.006Eu/mL和0.001Eu/mL;
(2)将100μL所述的内毒素的标准溶液加入400μL含有HL-60细胞的含20%胎牛血清的IMDM培养液中,在37℃、体积百分比为5%的二氧化碳条件下继续培养2天,获得培养的细胞;其中,HL-60细胞为用含20%胎牛血清的IMDM培养液传代培养5代、调整细胞密度为1×107个/mL后的HL-60细胞,所述的百分比为占IMDM培养液的体积百分比;
(3)测定所述培养的细胞中分泌细胞因子IL-6的含量对应的OD值(OD=OD450nm-OD570nm)为0.588、0.521、0.359、0.225、0.116、0.057、0.026和0.029。
本发明所述的热原检测方法的检测范围可跨越5个数量级,灵敏度高,最低检测值可以达到0.01EU/mL(如LPS)或0.01μg/mL(如酵母多糖和脂壁酸);而常规的家兔法检测LPS、酵母多糖和脂壁酸的最低检测值(即引起家兔体温升高0.6℃的最小浓度)分别为0.5EU/mL、0.5μg/mL、16μg/mL(一种基于人体发热机理设计的新热原检测方法研究,贺庆等,药物分析杂志,2012年第12期,2112~2117页),因此本发明所述的热原检测方法更为灵敏准确。并且本发明所述的热原检测方法的检测对象极其广泛,包括革兰氏阴性菌来源、革兰氏阳性菌来源和酵母来源的热原物质。
本发明提供一种细胞系法检测热原的试剂盒,其包括热原物质的标准溶液、细胞因子IL-6的检测试剂和HL-60细胞。
较佳地,所述的热原物质为细菌内毒素、脂壁酸和酵母多糖中的一种或多种。较佳地,所述的细胞因子IL-6的检测试剂为ELISA检测试剂。
较佳地,所述的试剂盒还包括细胞培养液和稀释液中的一种或两种;更佳地,所述的细胞培养液为含15~25%胎牛血清的IMDM培养液,所述的稀释液为含0.5~20%胎牛血清的IMDM培养液,所述的百分比为胎牛血清占IMDM培养液的体积百分比。
本发明提供一种对热原敏感的HL-60细胞的培养方法,其包括以下的步骤:将HL-60细胞在含10~25%胎牛血清的IMDM培养液中培养,即可。
较佳地,所述培养的温度为本领域常规的温度,较佳地为37℃。所述培养的二氧化碳浓度为本领域常规的浓度,较佳地为5%,所述的百分比为体积百分比。
本发明提供一种由上述的培养方法制备的对热原敏感的HL-60细胞。所述的对热原敏感的HL-60细胞,能够对革兰氏阴性菌来源、革兰氏阳性菌来源和酵母来源的热原物质中的一种或多种敏感,因此可以用于细胞系法检测热原的方法中。
在符合本领域常识的基础上,上述各优选条件,可任意组合,即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于:本发明所述的细胞系法检测热原的方法不需要使用动物就能够真实地模拟人体对热原的反应,并且能够对革兰氏阴性菌来源、革兰氏阳性菌来源和酵母来源的热原物质中的一种或多种进行定性和定量分析,灵敏度高,剂量依赖性好,而且HL-60细胞市售易得使该热原检测方法简单易行。所述的试剂盒操作简便、可以对热原物质进行定性和定量分析,灵敏度高。所述的对热原敏感的HL-60细胞,能够对革兰氏阴性菌来源、革兰氏阳性菌来源和酵母来源的热原物质中的一种或多种敏感,可以用于细胞系法检测热原的方法中。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明,但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,按照常规方法和条件,或按照商品说明书选择。
实施例1基于HL-60细胞的细胞系法检测热原的方法
1.1材料和试剂
细胞培养液:IMDM培养液(购自Gibco)400mL,加入胎牛血清(购自Gibco)100mL混匀即可。
细胞:HL-60购自中国科学院生命科学研究院生化与细胞所;代次:F10。
ELISA试剂盒:人白介素-6(IL-6)酶联免疫(ELISA)试剂盒(购自BD OptEIATM)
耗材:细胞计数板、无菌塑料离心管(1.5mL、50mL)、一次性塑料移液管(无菌,单包装,10mL)、25cm2培养瓶,24孔或96孔细胞培养板。
稀释液:IMDM培养液(购自Gibco)490mL,加入胎牛血清(购自Gibco)10mL混匀即可。
1.2仪器
酶标检测仪(型号:Molecular Devices M2);二氧化碳培养箱(型号:ThermoSeries 8000WT);离心机(型号:Hettich,ROTANTA 460R);倒置三目显微镜(型号:MoticBA400)。
1.3实验方法
1.3.1细胞传代培养和铺板
HL-60细胞使用所述细胞培养液传代培养于5%,37℃二氧化碳培养箱内,每3天换液一次,收集入无菌离心管中,1000rpm离心2分钟,弃去上清液,将细胞沉淀用新鲜的细胞培养液重悬,转入细胞培养瓶,继续培养。取生长状态良好的细胞进行铺板,1000rpm离心2min,弃上清,加入含有20%胎牛血清的IMDM培养液的细胞培养液重悬,得细胞悬浮液。调节细胞浓度为5×106个/mL,以400μL/孔加入到24孔培养板中,所述的百分比为胎牛血清占IMDM培养液的体积百分比。
1.3.2标准溶液及待检样品溶液的制备
内毒素(LPS)标准溶液的制备:取LPS标准品(购自中国食品药品检定研究院)一支,用所述稀释液复溶并稀释成约100Eu/mL的溶液,然后用所述稀释液继续稀释,获得100Eu/mL、20Eu/mL、4Eu/mL、0.8Eu/mL、0.16Eu/mL、0.032Eu/mL、0.006Eu/mL和0.001Eu/mL共8个稀释度。同时用所述的稀释液继续稀释,获得0.5Eu/mL和8Eu/mL的LPS标准溶液。
酵母多糖(Zysoman)标准溶液的制备:称取酵母多糖粉末(购自Sigma)适量,用所述稀释液复溶并稀释成约100μg/ml的溶液,然后用所述稀释液继续稀释,获得100μg/ml、20μg/ml、4μg/ml、0.8μg/ml、0.16μg/ml、0.032μg/ml、0.006μg/ml和0.001μg/ml共8个稀释度。同时用所述的稀释液继续稀释,获得20μg/ml和8μg/ml的酵母多糖标准溶液。
脂壁酸(LTA)标准溶液的制备:称取脂壁酸粉末(购自Sigma)适量,用所述稀释液复溶并稀释成约100μg/ml的溶液,然后用所述稀释液继续稀释,获得100μg/ml、20μg/ml、4μg/ml、0.8μg/ml、0.16μg/ml、0.032μg/ml、0.006μg/ml和0.001μg/ml共8个稀释度。同时用所述的稀释液继续稀释,获得0.5μg/mL和8μg/ml的LTA标准溶液。
待检样品溶液的制备:可以根据情况选择稀释待检样品或者直接加入待检样品进行检测,如果需要稀释待检样品,则用细胞培养液进行稀释,但须在最大有效稀释倍数(MVD)以内,MVD=cL/λ。其中,L表示待检样品中热原物质的限值;c表示待检样品的溶液的浓度,当L以Eu/mL表示时,c等于1.0mL/mL;λ为标准曲线上对应的最低的热原物质的标准溶液的浓度(参考中华人民共和国药典2010版,第二增补本,第455页)。
1.3.3加样
取标准溶液或待检样品溶液各100μL,分别加入24孔细胞培养板内,在含20%胎牛血清的IMDM培养液的条件下,放入5%CO2,37℃培养箱培养2天,所述的百分比为胎牛血清占IMDM培养液的体积百分比。
1.3.4ELISA方法测定细胞上清液中的细胞因子IL-6的含量。
取细胞上清液,按IL-6ELISA试剂盒说明书测定IL-6的量,即可。
其中,①OD值的测定方法:
将取得的细胞上清液按照ELISA试剂盒说明书的步骤进行反应,反应显色终止后,放入酶标仪中读数,根据吸收波长为450nm处和参比波长为570nm处的吸光度值,计算得到OD值(OD=OD450nm-OD570nm),将测得热原物质的标准溶液的OD值进行四参数拟合,得到一个四参数方程;将待测样品的OD值带入上述四参数方程进行计算,即得到待测样品的热原浓度值,如果该样品经过稀释,则再将得出的值乘以稀释倍数即可。
②待检样品中IL-6回收率的计算方法(参考中华人民共和国药典2010版,第二增补本,第457页):首先制备待检样品原液(即不进行稀释)和含热原的待检样品溶液,所述含热原的待检样品溶液的制备方法如下:
100μL待检样品原液+100μL稀释液
100μL待检样品原液+100μL 8Eu/ml LPS
100μL待检样品原液+100μL 8μg/ml zysoman
100μL待检样品原液+100μL 8μg/ml LTA
加入所述细胞悬液,放入5%CO2,37℃培养箱培养2天后测得其OD值分别为OD1、OD2、OD3和OD4;
LPS的回收率计算:y=(OD2-OD1)/ODLPS×100%;其中ODLPS指仅4Eu/mLLPS刺激所述细胞悬液后得到的OD值;
zysoman的回收率计算:y=(OD3-OD1)/ODzysoman×100%;其中ODzysoman指仅4μg/mlzysoman刺激所述细胞悬液得到的OD值;
LTA的回收率计算:y=(OD4-OD1)/ODLTA×100%;其中ODLTA指仅4μg/mlLTA刺激所述细胞悬液后得到的OD值。
实施例2不同细胞密度的检测热原的方法
将实施例1所制备的细胞悬浮液分别稀释到如下的浓度(即细胞密度为):1×105个/mL、5×105个/mL、1×106个/mL、5×106个/mL、1×107个/mL和5×107个/mL。分别以400μl/孔加入到24孔培养板中。
将实施例1所述0.5Eu/mL LPS标准溶液按100μL/孔加入24孔细胞培养板内进行热原刺激,在含20%胎牛血清的IMDM培养液的条件下,放入5%CO2,37℃培养箱继续培养2天,所述的百分比为胎牛血清占IMDM培养液的体积百分比。取细胞上清液,按IL-6ELISA试剂盒说明书测定IL-6的量,结果如表1所示。
表1 不同细胞密度的检测结果
细胞密度(个/mL) | OD |
1×105 | 0.030 |
5×105 | 0.057 |
1×106 | 0.077 |
5×106 | 0.269 |
1×107 | 0.535 |
5×107 | 0.499 |
表1的结果说明,热原刺激细胞后,细胞分泌IL-6的量与细胞密度基本呈现线形关系(R2≥0.95):y=5×10-8x+0.0261,其中,x代表细胞密度,y代表测得的OD值,随细胞密度的增大,细胞分泌IL-6的量也逐渐增大。
实施例3不同培养时间的检测热原的方法
将实施例1所制备的细胞悬浮液调节细胞浓度为5×106个/mL,以400μl/孔加入到24孔培养板中。
将实施例1所述0.5Eu/mL LTA标准溶液按100μL/孔加入24孔细胞培养板内,进行热原刺激,在含20%胎牛血清的IMDM培养液的条件下,放入5%CO2,37℃培养箱继续培养2天,所述的百分比为胎牛血清占IMDM培养液的体积百分比。取细胞上清液,按IL-6ELISA试剂盒说明书测定IL-6的量,结果如表2所示。
表2 不同时间的检测结果
表2的结果说明,热原刺激细胞2天后,IL-6的分泌量最高,因此确定热原作用细胞2天为最佳作用时间。
实施例4不同培养液的检测热原的方法
将HL-60细胞分别使用如表3中所列的培养液传代培养于5%,37℃二氧化碳培养箱内,每2天换液一次,传代步骤为将细胞悬液收集入无菌离心管中,1000rpm离心2分钟,弃去上清液,将细胞沉淀用新鲜的如表3中所列的培养液稀释,转入细胞培养瓶,继续培养细胞。
细胞培养一段时间后,取生长状态良好的细胞悬液进行铺板,铺板步骤为收集细胞悬液装入无菌离心管中,1000rpm离心2min,弃上清,加入5mL新鲜的如表3中所列的培养液,重悬,并调节细胞浓度为5×106个/mL按400μl/孔加入到24孔培养板中。
将实施例1所述0.5Eu/mL的LPS标准溶液按100μL/孔加入24孔细胞培养板内,进行热原刺激,再放入在含2%胎牛血清的IMDM培养液的条件下,放入5%CO2,37℃培养箱继续培养3天,所述的百分比为胎牛血清占IMDM培养液的体积百分比。取细胞上清液,按IL-6ELISA试剂盒说明书测定IL-6的量,结果如表3所示(表3中的百分比为占IMDM培养液的体积百分比)。表3中的阴性对照为不添加0.5Eu/mL LPS标准溶液时,在含20%胎牛血清的IMDM的培养液中按上述相同条件培养HL-60细胞,由于无热原物质,HL-60细胞所分泌的IL-6含量甚少,所述的百分比为占IMDM培养液的体积百分比。
表3 不同培养液的检测结果
序号 | 培养液 | OD |
1 | 含20%FBS的RPMI1640 | 0.082 |
2 | 含20%胎牛血清的IMDM | 0.663 |
3 | 含25%胎牛血清的IMDM | 0.660 |
4 | 含15%胎牛血清的IMDM | 0.607 |
5 | 含10%胎牛血清的IMDM | 0.512 |
6 | 阴性对照 | 0.026 |
表3的结果说明,用含20%FBS的RPMI1640培养液培养HL-60细胞后,细胞状态不佳,细胞分泌IL-6的量明显下降。因此含20%胎牛血清的IMDM培养液为培养液的更佳选择,所述的百分比为占IMDM培养基的体积百分比。
实施例5不同代次的检测热原的方法
将实施例1所述的HL-60细胞复苏后使用含20%胎牛血清的IMDM的培养液于5%,37℃二氧化碳培养箱内培养,每3天换液一次,传代步骤为将细胞悬液收集入无菌离心管中,1000rpm离心2分钟,弃去上清液,将细胞沉淀用新鲜的含20%胎牛血清的IMDM的培养液重悬,转入细胞培养瓶,继续培养,传代培养,所述的百分比为占所述IMDM培养液的体积百分比。
取如表4所示的代数生长状态良好的细胞悬液进行铺板,铺板步骤为收集细胞悬液装入无菌离心管中,1000rpm离心2min,弃上清,加入所述细胞培养液重悬并调节细胞浓度为5×106个/mL,以400μL/孔加入到24孔培养板中。
将实施例1所述0.5Eu/mL的LPS标准溶液按100μL/孔加入24孔细胞培养板内,进行热原刺激,在含20%胎牛血清的IMDM培养液的条件下,放入5%CO2,37℃培养箱继续培养2天,所述的百分比为胎牛血清占IMDM培养液的体积百分比。取细胞上清液,按IL-6ELISA试剂盒说明书测定IL-6的量,结果如表4所示(请补充表4中的数据)
表4 不同代次的检测结果
序号 | 代次 | OD |
1 | 5 | 0.656 |
2 | 10 | 0.687 |
3 | 15 | 0.615 |
4 | 20 | 0.139 |
5 | 30 | 0.067 |
表4的结果说明,细胞复苏后随着细胞代次的增长,细胞对IL-6的灵敏度降低,尤其到了30代以后,细胞的灵敏度已经降得很低了,因此该方法较佳的代次为5~20代。
实施例6含不同浓度胎牛血清培养液的热原检测方法
将实施例1所述的HL-60细胞复苏后使用含20%胎牛血清的IMDM的培养液于5%,37℃二氧化碳培养箱内培养,每2天换液一次,传代步骤为将细胞悬液收集入无菌离心管中,1000rpm离心2分钟,弃去上清液,将细胞沉淀用新鲜的含20%胎牛血清的IMDM的培养液重悬,转入细胞培养瓶,继续培养,所述的百分比为占IMDM培养液的体积百分比。
培养一段时间后,取生长状态良好的细胞悬液进行铺板,使用如表5所示的细胞培养液进行铺板,步骤为收集细胞悬液装入无菌离心管中,1000rpm离心2min,弃上清,加入2mL如表5所示的细胞培养液重悬并调节细胞浓度为5×106个/mL,以400μL/孔加入到24孔培养板中。
将实施例1所述0.5Eu/mL的LPS标准溶液加入24孔细胞培养板内,100μL/孔,进行热原刺激,在如表5所述的培养液条件下,放入5%CO2,37℃培养箱继续培养2天。取细胞上清液,按IL-6ELISA试剂盒说明书测定IL-6的量,结果如表5所示(表5中的百分比为占IMDM培养液的体积百分比)。表5中的阴性对照为不添加0.5Eu/mL LPS标准溶液,加入100μL含3%胎牛血清的IMDM的培养液时,在含3%胎牛血清的IMDM的培养液中按上述相同条件培养HL-60细胞,由于无热原物质,HL-60细胞所分泌的IL-6含量甚少,所述的百分比为占IMDM培养液的体积百分比。
表5 加入待检样品的溶液后不同浓度培养液的检测结果
序号 | 培养液 | OD |
1 | IMDM+20%FBS | 0.660 |
2 | IMDM+10%FBS | 1.434 |
3 | IMDM+5%FBS | 1.981 |
4 | IMDM+3%FBS | 2.579 |
5 | IMDM+2%FBS | 2.699 |
6 | IMDM+1%FBS | 2.714 |
7 | IMDM+0.5%FBS | 2.666 |
8 | IMDM+0.1%FBS | 2.779 |
9 | 阴性对照 | 0.028 |
表5的数据说明,加入待检样品的溶液后不同FBS浓度的培养液对该实验的灵敏度影响很大,较佳浓度为1%~10%,更佳浓度为2%~5%,所述的百分比为占IMDM培养液的体积百分比。
效果实施例1尼妥珠单抗注射液的热原检测
LPS标准溶液的制备:取LPS标准品一支,用含20%胎牛血清的IMDM培养液,复溶并稀释成约100Eu/mL的溶液,所述的百分比为胎牛血清占IMDM培养液的体积百分比,然后继续稀释,获得8Eu/mL和4Eu/mL的LPS标准溶液。
Zysoman标准溶液的制备:用含20%胎牛血清的IMDM培养液,溶解并稀释成约100μg/ml的溶液,所述的百分比为胎牛血清占IMDM培养液的体积百分比,然后继续稀释,获得8μg/ml和4μg/ml的Zysoman标准溶液。
LTA标准溶液的制备:用含20%胎牛血清的IMDM培养液,溶解并稀释成约100μg/ml的溶液,所述的百分比为胎牛血清占IMDM培养液的体积百分比,然后继续稀释,获得8μg/ml和4μg/ml的LTA标准溶液。
上述的8Eu/mL LPS标准溶液、8μg/ml Zysoman标准溶液和8μg/ml LTA标准溶液适用于效果实施例1~7。
将尼妥珠单抗注射液(购自百泰生物,规格:5mg/mL)用含20%胎牛血清的IMDM培养液稀释两倍作为尼妥珠单抗注射液待检样品溶液,同时将8Eu/mL LPS标准溶液、8μg/mlZysoman标准溶液和8μg/ml LTA标准溶液分别与尼妥珠单抗注射液原液等量混合,作为LPS、Zysoman和LTA干扰溶液,所述的百分比为占IMDM的体积百分比。调节实施例1所制备的细胞悬浮液细胞浓度为5×106个/mL,以400μl/孔加入到24孔培养板中。
将4Eu/mL LPS标准溶液、4μg/ml Zysoman标准溶液和4μg/ml LTA标准溶液、尼妥珠单抗注射液待检样品溶液与上述LPS、Zysoman和LTA干扰溶液分别按100μL/孔分别加入24孔细胞培养板内进行热原刺激,在含20%胎牛血清的IMDM培养液的条件下,放入5%CO2,37℃培养箱继续培养2天,所述的百分比为占IMDM培养液的体积百分比。取细胞上清液,按IL-6ELISA试剂盒说明书测定IL-6的量,然后根据实施例1所述的方法计算IL-6的回收率,结果如表6所示。
表6 热原检测尼妥珠单抗注射液
表6说明,尼妥珠单抗注射液样品溶液的浓度为2.5mg/mL时,三种热原(LPS、zysoman和LTA)的回收率分别为73.7%、76.4%、63.3%,均在50%-200%之内。因此,该方法可以用于尼妥珠单抗注射液热原的检测。
效果实施例2强克单抗注射液的热原检测
将强克单抗注射液(购自赛金生物,规格:25mg/瓶),用含20%胎牛血清的IMDM培养液作为稀释液稀释两倍后作为强克单抗注射液待检样品溶液,同时将8Eu/mL LPS标准溶液、8μg/ml Zysoman标准溶液和8μg/ml LTA标准溶液分别与强克单抗注射液原液等量混合,作为LPS、Zysoman和LTA干扰溶液,所述的百分比为占IMDM的体积百分比。调节实施例1所制备的细胞悬浮液细胞浓度为5×106个/mL,以400μl/孔加入到24孔培养板中。
将上述4Eu/mL LPS标准溶液、4μg/ml Zysoman标准溶液和4μg/ml LTA标准溶液、强克单抗注射液待检样品溶液和上述LPS、Zysoman和LTA干扰溶液分别按100μL/孔分别加入24孔细胞培养板内进行热原刺激,在含20%胎牛血清的IMDM培养液的条件下,放入5%CO2,37℃培养箱继续培养2天,所述的百分比为占IMDM培养液的体积百分比。取细胞上清液,按IL-6ELISA试剂盒说明书测定IL-6的量,然后根据实施例1所述的方法计算IL-6的回收率,结果如表7所示。
表7 热原检测强克单抗注射液
表7说明,在强克单抗注射液稀释2倍以后,三种热原(LPS,zysoman,LTA)的回收率分别为65.3%,65.2%,72.2%,均在50%-200%之内。因此,该方法可以用于强克注射液单抗注射液热原的检测。
效果实施例3人血白蛋白注射液的热原检测
将人血白蛋白注射液(购自奥克特珐玛,规格:200mg/mL)将人血白蛋白注射液用含20%胎牛血清的IMDM培养液稀释两倍作为人血白蛋白注射液待检样品溶液,同时将8Eu/mL LPS标准溶液、8μg/ml Zysoman标准溶液和8μg/ml LTA标准溶液与人血白蛋白注射液原液等量混合,作为LPS、Zysoman和LTA干扰溶液,所述的百分比为占IMDM的体积百分比。调节实施例1所制备的细胞悬浮液细胞浓度为5×106个/mL,以400μl/孔加入到24孔培养板中。
将4Eu/mL LPS标准溶液、4μg/ml Zysoman标准溶液和4μg/ml LTA标准溶液人血白蛋白注射液待检样品溶液和上述LPS、Zysoman和LTA干扰溶液分别按100μL/孔分别加入24孔细胞培养板内进行热原刺激,在含20%胎牛血清的IMDM培养液的条件下,放入5%CO2,37℃培养箱继续培养2天,所述的百分比为占IMDM培养液的体积百分比。取细胞上清液,按IL-6ELISA试剂盒说明书测定IL-6的量,然后根据实施例1所述的方法计算IL-6的回收率,结果如表8所示。
表8 热原检测人血白蛋白注射液
表8说明,人血白蛋白注射液三种热原(LPS,zysoman,LTA)的回收率分别为95.7%,97.6%,84.4%,均在50%-200%之内。因此,该方法可以用于人血白蛋白注射液热原的检测。
效果实施例4罗可曼注射液的热原检测
将罗可曼注射液(购自罗氏,规格:2000IU/0.3mL)用含20%胎牛血清的IMDM培养液稀释20倍作为罗可曼注射液待检样品溶液,同时将8Eu/mL LPS标准溶液、8μg/mlZysoman标准溶液和8μg/ml LTA标准溶液分别与稀释10倍后的罗可曼注射液等量混合,作为LPS、Zysoman和LTA干扰溶液,所述的百分比为占IMDM的体积百分比。调节实施例1所制备的细胞悬浮液细胞浓度为5×106个/mL,以400μl/孔加入到24孔培养板中。
将4Eu/mL LPS标准溶液、4μg/ml Zysoman标准溶液和4μg/ml LTA标准溶液、罗可曼注射液待检样品溶液和上述LPS、Zysoman和LTA干扰溶液分别按400μL/孔分别加入24孔细胞培养板内进行热原刺激,在含20%胎牛血清的IMDM培养液的条件下,放入5%CO2,37℃培养箱继续培养2天,所述的百分比为占IMDM培养液的体积百分比。取细胞上清液,按IL-6ELISA试剂盒说明书测定IL-6的量,然后根据实施例1所述的方法计算IL-6的回收率,结果如表9所示。
表9 热原检测罗可曼注射液
表9说明,在罗可曼注射液稀释20倍以后,三种热原(LPS,zysoman,LTA)的回收率分别为100%,89.4%,74%,均在50%~150%之内。因此,该方法可以用于罗可曼注射液热原的检测。
效果实施例5健尼哌单抗注射液的热原检测
将健尼哌单抗注射液(购自中信国建,规格:12.5mg/支)用含20%胎牛血清的IMDM培养液稀释2倍作为健尼哌单抗注射液待检样品溶液,同时将8Eu/mL LPS标准溶液、8μg/mlZysoman标准溶液和8μg/ml LTA标准溶液分别与健尼哌单抗注射液原液等量混合,作为LPS、Zysoman和LTA干扰溶液,所述的百分比为占IMDM的体积百分比。调节实施例1所制备的细胞悬浮液细胞浓度为5×106个/mL,以400μl/孔加入到24孔培养板中。
将4Eu/mL LPS标准溶液、4μg/ml Zysoman标准溶液和4μg/ml LTA标准溶液、健尼哌单抗注射液待检样品溶液和上述LPS、Zysoman和LTA干扰溶液分别按100μL/孔分别加入24孔细胞培养板内进行热原刺激,在含20%胎牛血清的IMDM培养液的条件下,放入5%CO2,37℃培养箱继续培养2天,所述的百分比为占IMDM培养液的体积百分比。取细胞上清液,按IL-6ELISA试剂盒说明书测定IL-6的量,然后根据实施例1所述的方法计算IL-6的回收率,结果如表10所示。
表10 热原检测健尼哌单抗注射液
序号 | 健尼哌单抗注射液待检样品溶液浓度 | 热原品种 | IL-6的回收率 |
(单位) | (%) | ||
1 | 6.25mg/ml | LPS | 52.1 |
2 | 6.25mg/ml | Zysoman | 67.1 |
3 | 6.25mg/ml | lta | 63.1 |
表10说明,在健尼哌单抗注射液稀释2倍以后,三种热原(LPS,zysoman,LTA)的回收率分别为100%,98.4%,74%,均在50%~200%之内。因此,该方法可以用于健尼哌单抗注射液热原的检测。
效果实施例6阿达木单抗注射液的热原检测
将阿达木单抗注射液(购自雅培,规格:50mg/mL)用含20%胎牛血清的IMDM培养液稀释10倍作为阿达木单抗注射液待检样品溶液,同时将8Eu/mL LPS标准溶液、8μg/mlZysoman标准溶液和8μg/ml LTA标准溶液分别与稀释5倍后的阿达木注射液单抗注射液等量混合,作为LPS、Zysoman和LTA干扰溶液,所述的百分比为占IMDM的体积百分比。调节实施例1所制备的细胞悬浮液细胞浓度为5×106个/mL,以400μl/孔加入到24孔培养板中。
将4Eu/mL LPS标准溶液、4μg/ml Zysoman标准溶液和4μg/ml LTA标准溶液、阿达木注射液单抗注射液待检样品溶液和上述LPS、Zysoman和LTA干扰溶液分别按100μL/孔分别加入24孔细胞培养板内进行热原刺激,在含20%胎牛血清的IMDM培养液的条件下,放入5%CO2,37℃培养箱继续培养2天,所述的百分比为占IMDM培养液的体积百分比。取细胞上清液,按IL-6ELISA试剂盒说明书测定IL-6的量,然后根据实施例1所述的方法计算IL-6的回收率,结果如表11所示。
表11 热原检测阿达木单抗注射液
表11说明,在阿达木单抗注射液稀释250倍以后,三种热原(LPS,zysoman,LTA)的回收率分别为88%,88.2%,66.2%,均在50%-200%之内。因此,该方法可以用于阿达木单抗注射液热原的检测。
效果实施例7益赛普单抗注射液的热原检测
将益赛普单抗注射液(购自中信国建,规格:12.5mg/支)用1mL含20%胎牛血清的IMDM培养液进行复溶,再用含20%胎牛血清的IMDM培养液稀释10倍,作为益赛普单抗注射液待检样品溶液,同时将8Eu/mL LPS标准溶液、8μg/ml Zysoman标准溶液和8μg/ml LTA标准溶液分别与稀释5倍后的益赛普单抗注射液等量混合,作为LPS、Zysoman和LTA干扰溶液,所述的百分比为占IMDM的体积百分比。调节实施例1所制备的细胞悬浮液细胞浓度为5×106个/mL,以400μl/孔加入到24孔培养板中。
将4Eu/mL LPS标准溶液、4μg/ml Zysoman标准溶液和4μg/ml LTA标准溶液、益赛普单抗注射液待检样品溶液和上述LPS、Zysoman和LTA干扰溶液分别按100μL/孔分别加入24孔细胞培养板内进行热原刺激,在含20%胎牛血清的IMDM培养液的条件下,放入5%CO2,37℃培养箱继续培养2天,所述的百分比为占IMDM培养液的体积百分比。取细胞上清液,按IL-6ELISA试剂盒说明书测定IL-6的量,然后根据实施例1所述的方法计算IL-6的回收率,结果如表12所示。
表12 热原检测益赛普单抗注射液
表12说明,在益赛普单抗注射液稀释1倍以后,三种热原(LPS,zysoman,LTA)的回收率分别为77.4%,75.7%,51.1%,均在50%-200%之内。因此,该方法可以用于益赛普单抗注射液热原的检测。
效果实施例8人凝血因子Ⅷ的热原检测
内毒素(LPS)标准溶液的制备:取LPS标准品一支,用含2%胎牛血清的IMDM培养液,复溶并稀释成约10Eu/mL的溶液,所述的百分比为胎牛血清占IMDM培养液的体积百分比,然后继续稀释,获得10Eu/mL、2Eu/mL、0.4Eu/mL、0.08Eu/mL、0.016Eu/mL、0.0032Eu/mL共6个稀释度。
酵母多糖(Zysoman)标准溶液的制备:称取酵母多糖粉末适量,用含2%胎牛血清的IMDM培养液,溶解并稀释成约50μg/ml的溶液,所述的百分比为胎牛血清占IMDM培养液的体积百分比,然后继续稀释,获得50μg/ml、10μg/ml、5μg/ml、2.5μg/ml、0.5μg/ml、0.05μg/ml共6个稀释度。
脂壁酸(LTA)标准溶液的制备:称取脂壁酸粉末适量,用含2%胎牛血清的IMDM培养液,溶解并稀释成约10μg/ml的溶液,所述的百分比为胎牛血清占IMDM培养液的体积百分比,然后继续稀释,获得10μg/ml、2μg/ml、0.4μg/ml、0.08μg/ml、0.016μg/ml、0.0032μg/ml共6个稀释度。
利用上述六个稀释度的内毒素、酵母多糖和脂壁酸标准溶液,根据实施例1所述的方法测定OD值获得相应的四参数方程。然后继续配制如下的标准溶液:
取LPS标准品一支,用含2%胎牛血清的IMDM培养液,复溶并稀释成约100Eu/mL的溶液,所述的百分比为胎牛血清占IMDM培养液的体积百分比,然后继续稀释,获得2Eu/mL、4Eu/mL的LPS标准溶液。
称取酵母多糖粉末适量,用含2%胎牛血清的IMDM培养液,溶解并稀释成约100μg/ml的溶液,所述的百分比为胎牛血清占IMDM培养液的体积百分比,然后继续稀释,获得2μg/ml、4μg/ml的Zysoman标准溶液。
称取脂壁酸粉末适量,用含2%胎牛血清的IMDM培养液,溶解并稀释成约100μg/ml的溶液,所述的百分比为胎牛血清占IMDM培养液的体积百分比,然后继续稀释,获得2μg/ml、4μg/ml的LTA标准溶液。
上述的2Eu/mL LPS标准溶液、4Eu/mL LPS标准溶液、2μg/ml Zysoman标准溶液、4μg/ml Zysoman标准溶液、2μg/ml LTA标准溶液和4μg/ml LTA标准溶液适用于效果实施例8。
将人凝血因子Ⅷ(购自上海生物制品研究所,规格:200IU)先取10mL含2%胎牛血清的IMDM培养液进行复溶,再用含2%胎牛血清的IMDM培养液稀释2倍,作为人凝血因子Ⅷ待检样品溶液,将所述4Eu/mL的LPS、4μg/mL的Zysoman和4μg/mL的LTA溶液分别与人凝血因子Ⅷ原液等量混合作为LPS、Zysoman和LTA干扰溶液,所述的百分比为占IMDM的体积百分比。将实施例1所制备的细胞悬浮液调节细胞浓度为5×106个/mL,以400μl/孔加入到24孔培养板中。
将所述2Eu/mL LPS标准溶液、2μg/mL Zysoman标准溶液和2μg/mL LTA的标准溶液和人凝血因子Ⅷ待检样品溶液和上述LPS、Zysoman和LTA干扰样品溶液按100μL/孔分别加入24孔细胞培养板内进行热原刺激,在含2%胎牛血清的IMDM培养液的条件下,放入5%CO2,37℃培养箱继续培养2天,所述的百分比为占IMDM培养液的体积百分比。取细胞上清液,按IL-6ELISA试剂盒说明书测定IL-6的量,然后根据实施例1所述的方法计算IL-6的回收率,结果如表13所示。
表13 热原检测人凝血因子Ⅷ
表13说明,在人凝血因子Ⅷ稀释2倍以后,三种热原(LPS,zysoman,LTA)的回收率分别为90%,64%,55.1%,均在50%~200%之内。因此,该方法可以用于益赛普热原的检测。
对比实施例1不同细胞的热原检测
按实施例1所述方法,分别制备稀释到5×106个/mL浓度THP-1(购自中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所)、K562(购自ATCC:美国典型培养物保存中心)和HL-60细胞的细胞悬浮液分别以400μl/孔加入到24孔培养板中。
将实施例1所述0.5Eu/mL的LPS标准溶液按100μL/孔加入24孔细胞培养板内进行热原刺激,在含20%胎牛血清的IMDM培养液的条件下,放入5%CO2,37℃培养箱继续培养2天,所述的百分比为占IMDM培养液的体积百分比。取细胞上清液,按IL-6ELISA试剂盒说明书测定IL-6的量,结果如表14所示。
表14 不同细胞种类的检测结果
表14的结果说明,与THP-1和K562细胞相比,HL-60细胞经热原刺激后,能够产生更多的IL-6,即对热原反应更为敏感。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不构成对权利要求范围的限制,本领域内技术人员可以想到的其他实质上等同的替代,均在本发明保护范围内。
Claims (7)
1.一种细胞系法检测热原的方法,其特征在于,其包括以下的步骤:
(1)制备热原物质的标准溶液和待检样品的溶液;
(2)将步骤(1)所述的热原物质的标准溶液或待检样品的溶液分别加入含有HL-60细胞的细胞培养液中培养,取培养后细胞的上清液;所述的培养时间为1~3天;所述的细胞培养液为含0.5~20%胎牛血清的IMDM培养液;所述的HL-60细胞的细胞密度为5×106个/mL~5×107个/mL;所述的HL-60细胞是经过传代培养的HL-60细胞,所述的传代培养的代数为所述HL-60细胞复苏后5~20代,所述的传代培养包括以下的步骤:将HL-60细胞用含10~25%胎牛血清的IMDM培养液培养,每2~3天更换所述的细胞培养液一次,即可;所述热原物质的标准溶液或所述待检样品的溶液与所述细胞培养液的体积比为1:1~1:4;所述的百分比为胎牛血清占IMDM培养液的体积百分比;
(3)检测步骤(2)所述细胞的上清液中细胞因子IL-6的含量。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(1)中所述的热原物质为革兰氏阴性菌来源的热原物质、革兰氏阳性菌来源的热原物质和酵母来源的热原物质中的一种或多种;
所述的待检样品为注射液;
所述的热原物质的标准溶液的制备方法为用稀释液稀释所述热原物质;所述的待检样品的溶液为所述待检样品本身或将所述待检样品用稀释液稀释;
和/或,所述的稀释液为含0.5~20%胎牛血清的IMDM培养液,所述的百分比为胎牛血清占IMDM培养液的体积百分比。
3.如权利要求2所述的方法,其特征在于,所述的待检样品为静脉注射液或肌肉注射液;
所述的热原物质为细菌内毒素、脂壁酸和酵母多糖中的一种或多种;
和/或,所述的稀释液为含1~10%胎牛血清的IMDM培养液,所述的百分比为胎牛血清占IMDM培养液的体积百分比。
4.如权利要求3所述的方法,其特征在于,所述的稀释液为含2~5%胎牛血清的IMDM培养液,所述的百分比为胎牛血清占IMDM培养液的体积百分比。
5.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的传代培养中,将HL-60细胞在含15~20%胎牛血清的IMDM培养液培养,所述的百分比为胎牛血清占IMDM培养液的体积百分比。
6.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(2)中,所述的培养的时间为1~2天;所述的细胞培养液为含1~10%胎牛血清的IMDM培养液;步骤(3)中,所述的检测的方法为ELISA法;和/或,所述的方法还包括如下的步骤:(4)根据步骤(3)检测的细胞因子IL-6的含量,得到热原检测的结果。
7.如权利要求6所述的方法,其特征在于,所述的细胞培养液为含2~5%胎牛血清的IMDM培养液,所述的百分比为胎牛血清占IMDM培养液的体积百分比。
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C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
EXSB | Decision made by sipo to initiate substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
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