CN107091932A

CN107091932A - 结核病免疫诊断分子标识及其医药用途

Info

Publication number: CN107091932A
Application number: CN201710300177.7A
Authority: CN
Inventors: 金奇; 刘立国; 李海凤; 张笑冰; 张维佳
Original assignee: Institute of Pathogen Biology of CAMS
Current assignee: Institute of Pathogen Biology of CAMS
Priority date: 2015-12-01
Filing date: 2015-12-01
Publication date: 2017-08-25
Anticipated expiration: 2035-12-01
Also published as: CN105388300A; CN107091932B; CN105388300B

Abstract

本发明属于免疫学和细胞生物学领域，涉及结核病免疫诊断分子标识及其疫苗用途。具体地，本发明涉及选自氨基酸序列如SEQ ID NO:1‑4所示的任意一个或多个蛋白在制备结核病诊断剂中的用途；优选地，所述结核病为肺结核。SEQ ID NO:1‑4中任一序列所示的蛋白可以作为结核病(例如肺结核)免疫诊断分子标识，并且具有良好的符合率和反应强度；此外，还具有应用于制备结核病疫苗的潜力。

Description

结核病免疫诊断分子标识及其医药用途

本发明是申请号为201510867478.9的母案的分案申请，该母案的申请日为2015年12月1日，公开号为CN 105388300 A，发明名称为“结核病免疫诊断分子标识及其疫苗用途”。

技术领域

本发明属于免疫学和细胞生物学领域，涉及结核病免疫诊断分子标识及其疫苗用途。

背景技术

结核分枝杆菌是对人类健康威胁最大的病原体之一，结核病是当今世界上成年人中的主要传染病，已对国际公共卫生构成严峻挑战。结核菌在感染人体以后，多处于潜伏状态或持续感染状态，它能在感染宿主细胞内逃避宿主的防御作用而大量繁殖并和宿主达到一种微妙的平衡，感染者一生中的任何时候都有可能发病。一般情况下，10％的感染者将发展为活动性肺结核。一个未经治疗的活动性肺结核病人，一年能传染10－15人。

近五十年来，结核病的控制理论与技术、临床诊断治疗水平与研究均有长足的进步。由于有效化疗药物(异烟肼、利福平、吡嗪酰铵、链霉素、乙胺丁醇等)的普遍应用和卡介苗在世界范围的推广，使得结核病的发病率曾一度降低，以至于人们乐观地认为，结核病将同天花一样被人类彻底消灭。但在八十年代中期，由于过分乐观的估计形势，减少投资、缩减机构，放松对结核病的治疗与管理，结核病又在许多国家死灰复燃，发病率在全世界范围内再次回升。1993年WHO宣布结核病处于“全球紧急状态”，并呼吁“迅速采取行动与结核病危机进行斗争”，这在WHO历史上发表这样的声明尚属首次。耐药及耐多药结核病也已成为当前结核病控制工作中的重大威胁。

在常用的肺结核诊断技术中存在着阳性率低、周期长、操作复杂、假阳性率高等问题。故此需要一种快速、简便、敏感、特异的诊断方法。

目前结核病毒诊断方法有：(一)痰菌检查：痰涂菌检查和痰结核菌检查简便易行，准确性较高，痰中查出结核菌，就能确诊患了结核病。一般初次就诊要查三个痰标本，即夜间痰、清晨痰和即时痰。它虽然是诊断肺结核“金指标”但诊断率低，培养周期长。痰结核菌培养，结果可信度高，并能做结核菌药敏试验，但需时6－8周，应用受到限制。(二)Ⅹ射线检查：胸部Ⅹ线检查可以早期发现结核病，而且可以确定病灶的部位、性质、范围，了解发病情况及用于治疗效果的判断，并且开展方便，病人乐于接受。胸部CT可以发现较小的或隐蔽部位的病变，可以弥补一般Ⅹ线检查的不足。但容易与其他肺部疾病混淆，需要专业医生确证。(三)肺结核病免疫学诊断：1.常用的有结核菌素纯蛋白衍化物(PPD)试验，该试验阳性是感染过结核菌的证据之一，但是假阳性率高，容易误诊。2.血中、痰中结核抗体检测阳性也有助于诊断，也容易出现假阳率。3.BACTEC法测结核分枝杆菌的代谢物，一般两周可分离出分枝杆菌，但菌量多少能影响阳性结果出现的天数。4.聚合酶链反应(PCR)，优点是敏感性可达98％－100％，缺点是特异性较差。(四)其他检查：只能作为辅助诊断，不能作为诊断依据。1.纤维支气管镜检查，可以直接观察或间接判断支气管、肺内病变，并且有活组织检查、灌洗、录像、拍摄气管内照片等功能，对于诊断和鉴别诊断特别有用。2.胸腔镜和纵隔镜检查，均可用于观察胸腔、纵隔内肿大淋巴结，并可取出活组织检查以利诊断和鉴别诊断。3.超声波检查，主要用于胸腔积液的诊断和鉴别诊断。

结核分枝杆菌(MTB)培养物滤液中有一种早期分泌抗原靶蛋白(early secretoryantigenic target，ESAT-6)，GenBank登录号为：NC_00962，gi：57117165，相对分子质量为6000，在MTB感染早期即可被机体的免疫系统所识别，是重要的T细胞抗原抗原。ESAT-6来源的合成多肽被广泛地用于外周血MTB特异性γ-干扰素(IFN-γ)应答情况的检测，临床上用于诊断是否有MTB感染指标之一[Ravn P.Munk ME.Andersen AB Prospective evaluationof a whole-blood test using Mycobacterium tuberculosis-specific antigensESAT-6 and CFP-10 for diagnosis of active tuberculosis 2005；HarbceM.Oetteinger T.Wiker HG Evidence for oceurrence of the ESAT-6 protein inMycobacterium tuberculosis and virulent Mycobacterium bovis and for itsabsence in Mycabacterium bovis BCG 1996；Zhang,M.,H.Wang,M.Liao,et al.(2010)."Diagnosis of latent tuberculosis infection in bacille Calmette-Guerinvaccinated subjects in China by interferon-gamma ELISpot assay."Int J TubercLung Dis 14(12):1556-1563.]。

尽管如此，目前尚需要发现新的诊断结核病或者检测结核分枝杆菌的标识，以及新的检测诊断结核病或者检测结核分枝杆菌的方法和试剂。

发明内容

本发明人经过深入的研究和创造性的劳动，惊奇地发现，氨基酸序列如SEQ IDNO:1-4中的任一序列所示的蛋白，具有很强的抗原性和良好的抗原特异性，与ESAT-6的符合率较高，反应强度较高，能成为筛选诊断结核病例如肺结核的理想靶抗原，可以作为细胞水平的免疫诊断分子标识；另外，还具有应用于制备结核病疫苗的潜力。由此提供了下述发明：

本发明的一个方面涉及选自氨基酸序列如SEQ ID NO:1-4所示的任意一个或多个蛋白在制备结核病诊断剂或者结核分枝杆菌检测剂中的用途；优选地，所述结核病为肺结核。

所述结核病诊断剂是指用于诊断结核病的药物或者试剂。所述结核分枝杆菌检测剂是指用于检测结核分枝杆菌的药物或者试剂。

本发明还涉及一种诊断结核病(特别是肺结核)或者检测结核分枝杆菌的方法，包括检测氨基酸序列如SEQ ID NO:1-4所示的任意一个或多个蛋白(作为免疫诊断分子标识)的步骤。所用样品可以是痰液、血液、淋巴液或者肺部组织等。

本发明的另一方面涉及一种抗体，其能够特异性结合或者识别选自氨基酸序列如SEQ ID NO:1-4所示的任意一个或多个蛋白；优选地，所述抗体还连接有可检测的标记；优选地，所述可检测的标记为放射性同位素、荧光物质、发光物质、有色物质或酶。

本发明的再一方面涉及一种结核病诊断剂或者结核分枝杆菌检测剂，其包含一种或者几种本发明上面所述的抗体，以及可选的一种或多种药学上可接受的辅料。在本发明的一个实施方案中，所述结核病诊断剂包含上述4种蛋白中的任意2种、3种或4种的抗体。

本发明的再一方面涉及选自氨基酸序列如SEQ ID NO:1-4所示的任意一个或多个蛋白在制备预防和/或治疗和/或辅助治疗结核病的药物或者制备抑制结核杆菌的药物中的用途；优选地，所述药物为疫苗；优选地，所述疫苗为结核病疫苗；优选地，所述结核病为肺结核。

本发明的再一方面涉及一种药物组合物，其包含选自氨基酸序列如SEQ ID NO:1-4所示的任意一个或多个蛋白，以及可选的一种或几种药学上可接受的载体或赋形剂；优选地，所述药物组合物为疫苗，并且所述药学上可接受的载体或赋形剂为疫苗用载体或赋形剂；优选地，所述疫苗为结核病疫苗；优选地，所述结核病为肺结核。

本发明的再一方面涉及一种预防和/或治疗和/或辅助治疗结核病的方法，包括给予受试者有效量的本发明的药物组合物的步骤。

本发明的再一方面涉及选自氨基酸序列如SEQ ID NO:1-4所示的任意一个或多个蛋白在制备提高受试者或细胞因子的水平的药物中的用途，所述细胞因子选自如下的至少一种(例如任意的2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种或9种)：

GM-CSF、IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6、IL-12p40、IL-17、IP-10以及TNF-α；优选地，所述细胞为淋巴细胞。

本发明的再一方面涉及一种在体内或体外提高细胞因子的水平的方法，包括使用有效量的选自氨基酸序列如SEQ ID NO:1-4所示的任意一个或多个蛋白的步骤，所述细胞因子选自如下的至少一种(例如任意的2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种或9种)：

GM-CSF、IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6、IL-12p40、IL-17、IP-10以及TNF-α。

本发明的实施例5的结果表明，选自氨基酸序列如SEQ ID NO:1-4所示的任意一个或多个蛋白能够提高上述9种细胞因子的水平，说明蛋白有很强的抗原性，可以作为结核病例如肺结核的免疫诊断标识，预防和治疗。

本发明的再一方面涉及选自氨基酸序列如SEQ ID NO:1-4所示的任意一个或多个蛋白在制备或者作为工具药的用途，所述工具药用于筛选预防和/或治疗和/或辅助治疗结核病的药物或者用于筛选抑制结核杆菌的药物；优选地，所述结核病为肺结核。

例如，可以通过被筛选的药物是否能够检测本发明的蛋白，来判断被筛选的药物是否能够用作诊断和/或治疗和/或预防和/或辅助治疗结核病特别是肺结核的药物或者抗结核杆菌的药物。

本发明的再一方面涉及选自氨基酸序列如SEQ ID NO:1-4所示的任意一个或多个蛋白在制备促进淋巴细胞(例如CD4细胞或CD8细胞)增殖的药物中的用途。

本发明的再一方面涉及一种在体内或体外促进淋巴细胞(例如CD4细胞或CD8细胞)增殖的方法，包括使用有效量的选自氨基酸序列如SEQ ID NO:1-4所示的任意一个或多个蛋白的步骤。

本发明的实施例4的实验结果表明，选自氨基酸序列如SEQ ID NO:1-4所示的任意一个或多个蛋白能够有效地促进淋巴细胞的增殖，增强机体的免疫能力，起到对结核病例如肺结核的预防作用。

在本发明中，所述“选自氨基酸序列如SEQ ID NO:1-4所示的任意一个或多个蛋白”，是指选自SEQ ID NO:1-4中任意1个、任意2个、3个或者4个序列所示的蛋白。优选地，其包括选自SEQ ID NO:1-4中任意1个序列，以及选自其余3个序列中的任意2个或3个序列。本领域技术人员能够理解，这些方案均能实现本发明的技术效果。

在本发明中，术语“特异性结合”具有免疫学的一般含义，例如抗原抗体间的结合。

术语“药学上可接受的辅料”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的(参见例如Remington's PharmaceuticalSciences.Edited by Gennaro AR,19th ed.Pennsylvania:Mack Publishing Company,1995)，并且包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液；表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如Tween-80；离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。

在本发明中，术语“疫苗用载体或赋形剂”是指选自如下物质的一种或多种，包括但不限于：pH调节剂、表面活性剂、佐剂、离子强度增强剂。具体地，例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液，表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂。其中，非离子型表面活性剂包括但不限于:Tween-80。离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。

在本发明中，术语“佐剂”是指非特异性免疫增强剂，当其与抗原一起或预先递送入机体时，其可增强机体对抗原的免疫应答或改变免疫应答类型。佐剂有很多种，包括但不限于铝佐剂(例如氢氧化铝)、弗氏佐剂(例如完全弗氏佐剂和不完全弗氏佐剂)、短小棒状杆菌、脂多糖、细胞因子等。弗氏佐剂是目前动物试验中最常用的佐剂。氢氧化铝佐剂则在临床实验中使用较多。

在本发明中，术语“有效量”是指可在受试者中实现治疗、预防、减轻和/或缓解本发明所述疾病或病症的剂量。

在本发明中，术语“受试者”可以指患者或者其它接受本发明药物组合物以治疗、预防、减轻和/或缓解本发明所述疾病或病症的动物，特别是哺乳动物，例如人、狗、猴、牛、马等。

在本发明中，术语“疾病和/或病症”是指所述受试者的一种身体状态，该身体状态与本发明所述疾病和/或病症有关。

在本发明中，术语“结核杆菌”，包括但不限于，例如，结核分枝杆菌；术语“结核分枝杆菌”包括但不限于，结核分枝杆菌H37Rv。

在本发明中，术语“结核病”，包括但不限于，例如由“结核杆菌”感染引起的疾病和/或病症。

发明的有益效果

本发明的蛋白可以作为作为结核病(例如肺结核)或结核杆菌细胞免疫诊断分子标识，具有良好的符合率和反应强度。具有应用于制备结核病疫苗的潜力。

附图说明

图1：蛋白的ELISPOT鉴定中对照设置以及读值示意图。植物凝集素PHA作为阳性指控条件(终浓度5μg/ml)，ESAT-6是阳性对照(ELISPOT试剂盒自带)。

图2：流式细胞仪测定CD4CD8内分泌因子IFN-γ和IL-2染色结果。图2A，CD4+分泌INF-γ的细胞占全部外周淋巴细胞的比值；图2B，CD8+分泌INF-γ的细胞占全部外周淋巴细胞的比值。图2C，CD4+分泌IL-2的细胞占全部外周淋巴细胞的比值；图2D，CD8+分泌IL-2的细胞占全部外周淋巴细胞的比值。

图3：细胞增殖实验结果。图3A，CD4细胞增殖结果。图3B，CD8+细胞增殖结果。其中，图3A和3B纵坐标中的“细胞增殖情况”的是指增殖的数是减去了正常培养没有加相应刺激物的结果，是去掉本底后的结果，也是一个百分比数。

图4：细胞增殖后上清中细胞因子测定结果。图4A，GM-CSF；图4B，IL-2；图4C，IL-4；图4D，IL-6；图4E，IL-12p40；图4F，IL-17；图4G，IFN-γ；图4H，IP-10；图4I，TNF-α。

序列信息

表1

序列1(SEQ ID NO:1)138aa

WLLVRGHGPQQPEISAYSHGHLTRVGPYLYCNVVDLDDCQTPQAQGELPVSERYPVQLSVPEVISRAPWRLLQVYQDPANTTSTLFRPDTRLAVTIPTVDPQRGRLTGIVVQLLTLVVDHSGELRDVPHAEWSVRLIF

序列2(SEQ ID NO:2)512aa

MPILATNVVCTSQPLAAQAGLRMLADGGNAVDAAVATAITLTVVEPVSNGIGSDAFSIVWDGQKLHGLNASGRSPSAWTPEYFGGNAVPVLGWNSVTVPGAVSAWVELHARFGRLPFETLFEPAISYGRNGFLVSPTVAAQWAAQVPLFASQPGFADAFMPGGRAPKPGELFTFPDHAATLEKIAATNGEEFYRGELAAKLEAHSAANGGVMRADDLAAHRVDWVDTITGTYRGYTIHQIPPNGQGIVALIALGILEHFDMSSWSVDSAESVHVQIEALKLAFADAQACVADIDYMPVHPKRLLDKEYLRQRATLIDPKRAMPAATGIPRGGTVYLAAADAAGMMVSMIQSNYLGFGSGVVVPGTGISLHNRGSDFTVVPRHPNRVGPRKRPYHTIIPGFVTRDGAPVMSFGVMGGMMQPQGHVQVLVRIADYGQNPQAACDGPRFRWVNGMRVSFENGFPDSTLDELRQRGHDLVAVADYSQFGSCQAIWRLDDGYLAASDPRRDGQAAAC

序列3(SEQ ID NO:3)417aa

MPDGGHRHRAQPVSVRPNRHRRTRVSRAQRRHAQQIRRRRRVAGGFALSLLVVVVVVAVVVGAKLWQTMLGFGNDYTGPGKRDIVIQIRAGDSTTAVGETLLKHGVVATVRAFVDAAHGNTAISSIQPGFYRMRTEISAASAVARLTDPHNRVGKLVIPEGRQLDDTTDMKTNVVNPGIFALISRATCVDLDGTQRCVSVADLRAAASRSTPTMLSVPRWAVGPVMELGTDHRRIEGLIAPGTFNIDPSASAETILATLISAGAVEYMKSGLVDTAKSLGLSPYDILVVASLVQQEANTQDFPKVARVIYNRLHEHRTLEFDSTVNYPLDRREVATSDTDRAQRTPWNTYMAQGLPATAICSPGVDALRAAEHPVPGDWLYFVTIDSQGTTLFTRDYQQHLANIELAKHNGVLDSAR

序列4(SEQ ID NO:4)201aa

QVVGTPYIPGGDSPAGTDCSELASWVSNAATARPVFGDRFNTGNEEAALAARGFQQGTAPNALVIGWNGHHTAVTLPDGTPVSSGEGGGVRVGGGGAYQPKFTHHMYLPMDVDAGEDQPPAPDEPVTAVDDVEPEMPAPCPTQRPPVTPRHNLCNKLRTMPGALSAALAAAAPVWPAPISGCRGFSTSLLAKRNHPVIVGK

序列5(SEQ ID NO:5)110aa

HLLGRPLGRLVDRDNAVEDEGLQPYQVRVICRPKAETYVRAHIVQRTSSNDITLRGIRTGPAGDDNITLTAHLLMVGHTPAKLERLVAELSLQPGVYAVHWYAGEHAQAE

序列6(SEQ ID NO:6)95aa

MTEQQWNFAGIEAAASAIQGNVTSIHSLLDEGKQSLTKLAAAWGGSGSEAYQGVQQKWDATATELNNALQNLARTISEAGQAMASTEGNVTGMFA

序列7(SEQ ID NO:7)414bp

TGGCTGCTAGTACGCGGACACGGTCCGCAGCAACCCGAGATCAGCGCTTACTCGCACGGGCACCTGACCCGCGTGGGGCCCTATTTGTACTGCAACGTGGTCGACCTCGACGACTGTCAGACCCCGCAGGCGCAGGGCGAATTGCCGGTAAGCGAACGCTATCCCGTGCAGCTCTCGGTACCCGAAGTCATTTCCCGGGCGCCGTGGCGTTTGCTGCAGGTATACCAGGACCCCGCCAACACCACCAGCACCTTGTTTCGGCCGGACACCCGGTTGGCGGTCACCATCCCCACTGTCGACCCGCAGCGCGGGCGGCTGACCGGGATTGTCGTGCAGTTGCTGACGTTGGTGGTCGACCACTCGGGTGAACTACGCGACGTTCCGCACGCGGAATGGTCGGTGCGCCTTATCTTT

序列8(SEQ ID NO:8)1539bp

ATGCCCATCCTGGCGACAAACGTCGTGTGCACGTCACAACCGCTGGCCGCGCAAGCGGGTCTTCGGATGCTGGCCGACGGCGGCAACGCGGTCGACGCCGCCGTCGCCACAGCCATCACCCTCACCGTGGTGGAACCGGTGTCCAATGGCATCGGCTCGGACGCCTTCAGCATCGTCTGGGACGGGCAAAAACTGCACGGCCTGAACGCGTCCGGCCGCTCACCCTCGGCGTGGACGCCAGAGTACTTCGGCGGCAACGCCGTTCCCGTGCTCGGCTGGAACTCCGTGACGGTGCCCGGTGCGGTGTCGGCCTGGGTGGAACTGCACGCCAGGTTCGGCAGGCTACCATTCGAAACACTCTTCGAGCCCGCCATCTCGTACGGCCGCAACGGCTTTCTGGTCTCACCGACCGTCGCGGCACAATGGGCGGCACAGGTGCCGTTGTTCGCATCCCAGCCCGGATTCGCCGATGCGTTCATGCCCGGCGGACGAGCGCCGAAACCCGGTGAGCTGTTTACCTTTCCTGACCACGCGGCGACGCTAGAGAAGATCGCGGCGACCAACGGTGAGGAGTTCTACCGGGGAGAGCTGGCCGCCAAACTCGAGGCGCACTCGGCGGCAAACGGCGGGGTGATGCGTGCCGACGACCTCGCCGCCCATCGCGTGGACTGGGTCGACACGATCACGGGAACCTACCGCGGGTACACCATCCACCAGATACCGCCCAACGGCCAGGGCATCGTGGCCTTGATCGCCCTCGGAATCCTCGAGCATTTCGATATGTCATCGTGGTCAGTGGATTCCGCTGAAAGTGTGCACGTGCAGATCGAAGCACTGAAGCTTGCCTTCGCCGACGCGCAAGCGTGTGTCGCCGACATCGACTACATGCCGGTGCACCCGAAGCGCCTGCTCGACAAGGAGTATCTGCGGCAGCGCGCCACGCTGATCGATCCAAAGAGGGCAATGCCGGCGGCCACCGGCATCCCGCGAGGCGGCACCGTCTATCTGGCCGCCGCCGATGCTGCGGGAATGATGGTGTCCATGATTCAGTCGAACTACCTTGGGTTCGGCTCCGGTGTGGTGGTGCCCGGCACCGGCATTTCGCTGCACAATCGCGGCTCGGATTTCACTGTGGTGCCGAGACATCCGAACCGGGTTGGGCCACGGAAGCGCCCCTATCACACGATCATCCCAGGTTTTGTGACCCGCGACGGTGCGCCGGTGATGAGCTTCGGGGTGATGGGCGGCATGATGCAACCCCAGGGTCACGTGCAGGTGCTGGTGCGCATCGCCGACTACGGCCAGAACCCCCAGGCGGCCTGTGACGGCCCTCGGTTCCGCTGGGTGAACGGTATGCGGGTCAGTTTCGAAAACGGCTTCCCGGATTCAACTCTCGATGAACTGCGGCAGCGTGGGCATGACTTGGTCGCAGTAGCGGACTACAGCCAGTTCGGGAGTTGTCAGGCAATCTGGCGGCTCGACGATGGGTACCTCGCGGCCAGCGATCCCCGCCGTGATGGCCAAGCCGCAGCCTGCTAG

序列9(SEQ ID NO:9)1254bp

ATGCCTGACGGTGGCCACCGCCACCGCGCCCAGCCGGTGTCGGTAAGACCGAACCGGCACCGCAGGACCCGAGTCAGCCGCGCTCAGCGCCGACACGCCCAACAAATCCGCCGGCGACGGCGCGTCGCCGGCGGATTTGCCCTGAGCCTGCTCGTCGTGGTGGTGGTGGTGGCCGTCGTCGTCGGCGCCAAGTTGTGGCAGACCATGTTGGGCTTCGGTAACGACTACACCGGTCCCGGCAAGCGAGACATCGTGATTCAGATCAGGGCCGGTGACTCGACCACGGCGGTCGGGGAGACGCTGCTCAAACACGGTGTAGTGGCCACCGTCCGAGCATTCGTCGATGCCGCGCACGGCAACACCGCGATTTCCTCGATCCAACCCGGGTTCTATCGGATGCGAACCGAGATTTCGGCGGCTTCCGCTGTCGCGCGGCTTACCGATCCGCACAACCGGGTGGGGAAGTTGGTCATACCGGAAGGGCGTCAGCTCGACGACACCACCGACATGAAGACCAACGTGGTGAATCCTGGCATATTCGCGCTGATCTCCCGTGCCACCTGTGTGGATCTCGACGGTACCCAACGCTGCGTCTCGGTGGCCGACCTCCGCGCGGCGGCGAGCAGGAGCACGCCGACGATGCTGTCAGTGCCGCGCTGGGCGGTTGGGCCGGTGATGGAGCTGGGCACTGACCATCGCCGGATCGAGGGGCTGATCGCACCGGGGACCTTCAACATCGACCCGTCGGCATCGGCTGAAACCATCTTGGCGACCTTGATCAGCGCCGGCGCCGTGGAGTACATGAAATCCGGGTTGGTAGACACCGCAAAGTCGCTGGGCCTGTCGCCCTATGACATTCTCGTGGTGGCCTCGCTGGTGCAGCAGGAAGCCAACACCCAGGATTTCCCGAAGGTGGCCCGGGTCATCTACAACCGGCTGCACGAACACCGCACGTTGGAGTTCGACTCGACCGTGAACTATCCGCTGGATCGCCGTGAGGTGGCCACCAGCGACACCGACCGTGCCCAGCGCACACCGTGGAACACCTACATGGCCCAGGGGCTGCCGGCCACCGCGATCTGTTCGCCCGGCGTCGACGCGCTGCGCGCCGCCGAGCATCCAGTACCTGGCGACTGGCTGTACTTCGTCACCATCGATTCCCAGGGCACGACGCTGTTCACCAGGGACTATCAGCAGCATCTGGCGAACATCGAGCTGGCCAAACACAACGGTGTCCTCGACAGCGCGCGATGA

序列10(SEQ ID NO:10)603bp

CAAGTCGTCGGCACTCCGTATATTCCCGGTGGCGATTCTCCCGCCGGGACCGACTGCTCGGAGCTGGCTTCGTGGGTATCGAATGCGGCGACGGCCAGGCCGGTTTTCGGAGATAGGTTCAACACCGGCAACGAGGAAGCCGCCTTGGCGGCTCGGGGCTTTCAACAGGGAACCGCCCCCAATGCCTTGGTGATCGGTTGGAATGGCCACCACACGGCGGTGACGCTGCCCGATGGCACGCCCGTATCCAGTGGTGAAGGCGGTGGCGTGCGGGTCGGTGGCGGTGGCGCCTACCAGCCCAAATTCACCCACCACATGTATCTGCCGATGGATGTGGACGCGGGAGAAGACCAGCCGCCGGCGCCAGATGAGCCGGTCACCGCGGTCGACGACGTGGAACCGGAAATGCCTGCACCGTGCCCGACCCAGCGCCCGCCGGTGACCCCGAGACATAACCTGTGCAACAAACTCCGGACTATGCCAGGGGCGCTCTCGGCCGCGCTGGCCGCGGCGGCGCCGGTCTGGCCGGCCCCTATAAGCGGCTGCCGCGGGTTCAGCACGTCCCTCTTAGCAAAAAGAAATCACCCAGTAATCGTCGGGAAA

序列11(SEQ ID NO:11)330bp

TCGAACTTGTTTGGGCAGAACGCGCCTGCGATCGCCGCGCTCGAATCCTTGTATGAGTGTATGTGGGCCCAGGATGCAGCGGCCATGGCGGGTTATTACGTTGGGGCTTCGGCGGTGGCCACACAGTTGGCATCGTGGCTGCAACGGCTACAGAGCATCCCCGGCGCCGCCAGTCTTGATGCCCGTCTGCCGAGCTCGGCCGAGGCACCGATGGGAGTCGTCCGCGCGGTCAACAGCGCGATCGCCGCCAATGCGGCTGCGGCACAAACCGTTGGCCTGGTCATGGGAGGCAGCGGCACGCCAATACCGTCGGCCAGATATGTCGAGCTC

序列12(SEQ ID NO:12)285bp

ATGACAGAGCAGCAGTGGAATTTCGCGGGTATCGAGGCCGCGGCAAGCGCAATCCAGGGAAATGTCACGTCCATTCATTCCCTCCTTGACGAGGGGAAGCAGTCCCTGACCAAGCTCGCAGCGGCCTGGGGCGGTAGCGGTTCGGAGGCGTACCAGGGTGTCCAGCAAAAATGGGACGCCACGGCTACCGAGCTGAACAACGCGCTGCAGAACCTGGCGCGGACGATCAGCGAAGCCGGTCAGGCAATGGCTTCGACCGAAGGCAACGTCACTGGGATGTTCGCA

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：ELISPOT分析

Elispot分析使单细胞分泌产物可视化。这些分析异常敏感，因为它是在直接在分泌细胞的周围进行捕捉，而且是在表面被冲淡，或者被临近的细胞上的受体捕获，或降解之前。自身免疫检测、器官移植、疫苗和药品的研发与检测、T细胞功能研究、肿瘤研究、传染病的研究和检测、病毒研究等等。具体原理如下：细胞受到抗原刺激后产生细胞因子，此细胞因子抗原被特异单克隆抗体捕获。细胞分解后，被捕获的细胞因子与生物素标记的二抗结合，其后再与碱性磷酸酶标记的亲和素结合。BCIP/NBT底物孵育后，PVDF孔板出现“紫色”的斑点，表明细胞产生了细胞因子，通过ELISPOT酶联斑点分析系统对斑点的分析后得出结果。结核病的临床检测也常用到这个检测方法，结核病特异性抗原可以刺激外周淋巴细胞产生特异性细胞因子INF-γ，因此本实验以临床病人的检测为依托，对ESAT-6检测阳性的病人为研究主体，提取其PBMC，按ELISPOT检测方法鉴定可用于细胞免疫诊断分子诊断标识的筛选。

1.实验材料

目标蛋白样品：按照上面的表1中所示的4个蛋白(SEQ ID NO:1-4)，可以人工化学合成得到，也可以由相应的编码核苷酸序列通过重组表达载体和重组宿主细胞表达纯化得到。

ELISPOT分析试剂盒：深圳达科生产的Human IFN-γ precoated Elispot Kit，货号：DKW22-1000-500。其中含有阳性对照ESAT-6。

细胞样品：ESAT-6检测阳性的病人的PBMC细胞，用淋巴细胞分离液(货号DKW-LSH-0250，深圳市达科为生物工程有限公司)分离细胞，并用PBS洗涤2次。共分离自73位ESAT-6阳性的肺结核病人，得到73份PBMC细胞样品。肺结核病人的入选标准是：ESAT-6大于40，且菌培或是痰涂是阳性。

2.实验方法

使用前述的ELISPOT分析试剂盒进行实验。

无血清细胞培养基(DKW34-EU0100，深圳市达科为生物工程有限公司)重悬，分配每孔100μl细胞悬液，细胞数2×10⁵。同时，每孔加入一种待测蛋白样品，终浓度分别是5ng/孔；另外每板设通用阳性刺激物植物凝集素(PHA，10ng/ml)一孔，只加细胞的空白对照一孔，加细胞并加蛋白稀释缓冲液对照一孔，阳性对照ESAT-6(来自试剂盒，终浓度是10ng/ml)一孔。盖上板，放细胞于5％CO₂孵箱，37℃培养15-20小时(在此期间不要摇动或平移平板)；

在洗涤槽上轻弹板子倒空液体，并在吸水纸上拍干；

每孔加100μl含0.1％Tween20的PBS，4℃放置2分钟；弃去液体，反复用含0.1％Tween20的PBS洗板5次，并彻底拍干；

加入已稀释好的100μl生物素标记的抗体(试剂盒自带)到10ml含1％BSA的PBS中，每孔加100μl，将封闭板子放于37℃，1小时；倒空板子并用含0.1％Tween20的PBS洗5次，拍干；

稀释10μl链霉亲和素-碱性磷酸酶复合物(试剂盒自带)到10ml含1％BSA的PBS中，每孔加100μl，封闭板子放于37℃，1小时；倒空，用含0.1％Tween20的PBS洗5遍，反复用吸水纸吸以去尽所有残存的液体。

每孔加100μl备用显色溶液，让反应在室温进行5-20分钟。肉眼可见小斑点形成。

用蒸馏水洗三次。

干燥每孔，计数斑点。板子保存于室温，并避免直接光照。

3.判定方法

由于目标蛋白的浓度是阳性对照的二分之一，设置读值大于25个点判定为阳性(阳性对照的斑点数大于40)。图1是蛋白的ELISPOT鉴定中对照设置及读值示意图。

4.实验结果

4个目标蛋白的反应均为阳性且比较强，每个目标蛋白的斑点数(单个蛋白对应某位病人的PBMC形成的斑点数)与对照ESAT-6斑点数的比值均超过50％。

5.复验

参照上述方法，对4个目标蛋白进行了复验，肺结核病人数15位，健康人对照5位(H1～H5)。

结果发现，4个目标蛋白均与现今正在使用的阳性对照ESAT-6符合率较高，详细信息见下面的表2和表3。

表2：15位肺结核病人验证4个蛋白的ELISPOT结果

蛋白/多肽	阳性符合率	平均反应强度
			Rv0875c	66.7％	37.6％
Rv0773c	60.0％	30.5％
			Rv2553c	60.0％	35.1％
Rv1115	40.0％	26.6％

其中，

阳性符合率＝蛋白反应阳性人数/总人数。

平均反应强度＝(蛋白反应斑点数/ESAT-6反应斑点数)加和/总人数。

由表2可见，4个蛋白均可以作为结核病例如肺结核的诊断或疫苗的候选物。

表3：5个健康人重复验证4个目标蛋白的ELISPOT结果

(单位：斑点数)

健康人	Rv0875c	Rv0773c	Rv2553c	Rv1115
					H1	7	4	5	2
H2	21	21	4	2
					H3	11	0	5	0
H4	0	1	3	0
					H5	7	5	4	1

表3的结果说明，这4个蛋白在健康人的实验验证中反应点数很低，表现为阴性，具有较好的抗原特异性。

本实施例的结果表明，以上4个目标蛋白均与ESAT-6的符合率较高，能成为筛选诊断MTB的理想靶抗原，可以作为细胞水平的免疫诊断分子标识。

实施例2：动物免疫和淋巴细胞样品的制备

为了验证体外细胞免疫试验得到的结果，体内鉴定目的蛋白的抗原性也是很重要的一种验证方法，因此本发明人又进行了动物实验，选择的动物是C57BL/6Mark Doherty，是结核病研究的模式动物[T.Mark Doherty.Tropical Medicine and InternationalHealth.New vaccines against tuberculosis.2004(9):818-826.]。

1.实验动物和分组

C57BL/6小鼠(雌性，6-8周龄)，共50只，随机分组，每组6只，小鼠编号用剪耳的方法进行标记。另外，剩余2只作为全阴性对照，不进行免疫，留作观察。

第1组：PBS，作为阴性对照。

第2组：OVA，作为其它蛋白对照。

第3组：Rv1811，作为IFN-γ阴性蛋白对照(在ELISPOT筛选中结果为阴性蛋白)，参照SEQ ID NO:5人工合成或者参照SEQ ID NO:11人工表达。

第4组：Rv3875，作为阳性对照(Chen,X.,Yang,Q.,Zhang,M.,Graner,M.,Zhu,X.,Larmonier,N.,Liao,M.,Yu,W.,Deng,Q.,and Zhou,B.,(2009)Diagnosis of activetuberculosis in China using an in-house gamma interferon enzyme-linkedimmunospot assay.Clin Vaccine Immunol 16(6):p.879-84.)，用于确保动物实验的一致性，参照SEQ ID NO:6人工合成或者参照SEQ ID NO:12人工表达。

第5组：Rv0773c。

第6组：Rv0875c。

第7组：Rv1115。

第8组：Rv2553c。

2.动物免疫流程

实验动物购回后(50只)在相同饲养条件下饲养观察1周，一切正常后进行实验。

每种蛋白每只小鼠每次免疫20μg，每只小鼠的注射体积均为100μl，分为二点在小鼠后肢进行肌肉注射。注射前用酒精棉球进行皮肤的消毒，具体如下：

一周后进行第一次免疫，每只鼠腿部肌注20微克蛋白，50微升，分2点注射；其中，第1组注射50微升PBS，分2点注射。

间隔2周后进行第二次免疫，每只鼠腿部肌注20微克蛋白，50微升分2点注射；其中，第1组注射50微升PBS，分2点注射。

间隔2周后进行第三次免疫，每只鼠腿部肌注20微克蛋白，50微升分2点注射。其中，第1组注射50微升PBS，分2点注射。

3.淋巴细胞的收集和培养

第三次免疫后第七天开始，将小鼠处死，进行细胞免疫学检测。每组分3次进行，每次2只小鼠，免疫后10内做完，后面两次是重复实验验证。具体操作如下：

将小鼠颈部脱臼处死，固定于泡沫板，向胸腹部喷洒酒精消毒，用已经消毒的手术剪及镊子，无菌取出2只小鼠的脾脏组织及淋巴结，将其混合一起，置于1640培养基中。将组织置于滤网(BD)上研磨，用PBS冲洗并滤出细胞，2000rpm离心5min，弃上清，5ml PBS洗一遍，4℃，2000rpm离心15min。用2ml红细胞裂解液轻轻悬浮细胞沉淀，轻轻吹打若干次，放置2min，立即加入等体积1640完全培养基终止反应，2000rpm离心5min，弃上清，用1640完全培养基洗一遍，在用5ml 1640完全培养基悬浮细胞。用细胞计数板进行细胞计数，调整细胞浓度用于后续实验，并计算细胞浓度。

如此得到一个批次的8份淋巴细胞样品(每组2只小鼠的细胞混合)，加上重复的两批次，共得到3个批次的共24份淋巴细胞样品。

实施例3：细胞内因子IFN-γ和IL-2的流式检测实验

1.实验样品和试剂

细胞样品：上面实施例2中8组小鼠样品的淋巴细胞(一个批次8份)。

试剂盒：invitrogen公司的CellTrace^TM CFSE Cell Proliferation Kit(C34554)。

2.实验方法步骤

(1)将实施例2中收取的一个批次8份淋巴细胞按照2×10⁶稀释，使用96孔板，每孔100μl，每份淋巴细胞设置3孔。富余的细胞设一孔对照(不加刺激物，不加染色抗体)。共25孔。

其中，刺激物分别是Rv0773c、Rv0875c、Rv1115、Rv2553c、PBS、OVA、阴性蛋白对照Rv1811、阳性对照Rv3875；并且各孔加入的刺激物，与前面实施例2中免疫所用的刺激物是对应的，例如，原先动物是Rv0773c免疫，则相应的细胞中加入的刺激物还是Rv0773c。加入的刺激物量均为终浓度10ng/μl。不加刺激物的细胞对照孔作为本底是要减去的。

同时，为了防止细胞分泌的因子INF-γ和IL-2释放到培养液里，所有细胞孔加入2μl的BD GolgiStop^TM protein transport inhibitor(BD，货号：554715)，37℃，5％二氧化碳，过夜(不超过12小时)。

(2)收集细胞到流式细胞管，每管加入2ml PBS，洗涤细胞，4℃，1200rpm，离心5分钟。

(3)弃上清，弹起细胞，每管加入2μl的Fc(BD pharmingen,553141)封闭非特异性染色，避光，30分钟。

(4)加入CD4抗体(BD pharmingen,550954)，CD8抗体(ebioscience,85-17-0083-81)，表面染色，按照试剂说明使用。

(5)加入2ml PBS洗涤细胞，4℃，1200rpm，离心5分钟，重复一次。

(6)固定和细胞破膜(目的在于让细胞内分泌的因子IFN-γ和IL-2释放出来)，边震荡边滴入Fixation/permeabilization solution(BD pharmingen,554715)，避光，2小时，之后用BD wash solution(BD pharmingen,554715)洗涤细胞，弃上清，重复一次。

(7)将处理好的细胞一分为三，一份做IFN-γ染色(BD pharmingen，554411)，一份做IL-2染色(BD pharmingen，554428)，按照试剂说明使用，一份作为前述细胞染色抗体(抗体上标记上了荧光染料，荧光有不同颜色，用于区别不同细胞)的同型对照，以去除本底。染色避光，30分钟。

(8)BD wash solution洗涤细胞，重复一次，弃上清后加入150μl的PBS上流式细胞仪(BD pharmingen,BDFACSCantoⅡ)检测。

使用实施例2中制备的后两个批次32份淋巴细胞样品，参照上面的步骤进行两次重复实验。

将3次实验的结果进行数据分析，取其平均值，并计算偏差。

3.实验结果

如图2A、2B所示，CD4+细胞分泌的INF-γ，Rv3875和Rv0773c与阴性对照(PBS组)差异显著，CD8+细胞分泌的INF-γ，Rv3875、Rv0773c和Rv1115与阴性对照PBS组差异显著。IFN-γ可使巨噬细胞活化，增强其吞噬杀伤等活性，可以诱导APC表达识别MHCΠ分子，促进抗原提呈作用。说明Th1细胞发挥作用，可以产生足够的IFN-γ抵御细菌侵袭。

如图2C、2D所示，CD4细胞(CD4抗体染色阳性)分泌的IL-2组Rv3875和阴性对照PBS组相比差异显著，其他组不明显。CD8细胞(CD8抗体染色阳性)分泌的IL-2组中Rv3875、Rv0773c、Rv0875c、Rv1115、Rv1811和阴性对照PBS组相比差异显著。IL-2可以促进TB细胞活化，增殖，分化，产生CK促进活化B细胞增殖及产生抗体。

实施例4：细胞增殖实验

1.实验样品和试剂

细胞样品：上面实施例2中8组小鼠样品的淋巴细胞一个批次8份。

试剂盒：Flow Cytometry Staining Buffer(eBioscience，Cat.No.00-4222)

2.实验方法步骤

细胞增殖实验：荧光染料CSFE标记。将上述收取的淋巴细胞按照2×10⁶稀释，每份淋巴细胞在96孔板种植一孔，另外设置两个重复孔(共3个孔)，加入相应刺激物(共8组，刺激物分别是Rv0773c、Rv0875c、Rv1115、Rv2553c、PBS、OVA、阴性蛋白对照Rv1811、阳性对照Rv3875；加入的刺激物，与前面实施例2中免疫所用的刺激物是对应的。例如，原先动物是Rv0773c免疫，则相应的细胞中加入的刺激物还是Rv0773c。)，终浓度均为10ng/μl。培养箱培养72小时。

收集刺激和培养后的细胞(相同的3个孔的淋巴细胞合并)，离心，4℃，1200rpm，收集上清，待用(准备用于下面的实施例5)。

加入2ml PBS洗细胞，离心，4℃，1200rpm，弃上清，重复一次，

按照CSFE染色试剂盒染色，染色避光，30分钟。

加入2ml PBS洗细胞，离心，4℃，1200rpm，弃上清，重复一次，

弃上清后加入150μl的PBS上机(BD pharmingen,BDFACSCanto Ⅱ)检测。

3.实验结果

如图3A和3B所示。

由图3A可见，CD4细胞经培养72小时后，CD4细胞在各个样品刺激组与阴性对照(PBS组)相比，都有不同程度的增加，尤其是Rv2553c组明显，与Rv3875相比差异不大。说明四个蛋白均可以相对的刺激CD4细胞的增加，可以起到对结核病例如肺结核的预防作用。

由图3B可见，在各个样品刺激组与阴性对照(PBS组)相比，CD8细胞都有不同程度的增加，尤其是Rv2553c组与阴性对照相比差异显著，可以说明Rv2553c能明显地保护机体产生免疫细胞，起到对结核病例如肺结核的预防作用。

实施例5：细胞因子检测实验

1.实验样品

实验样品：实施例4中收集的8组细胞培养物1200rpm离心后的上清，轻轻吸取上面的上清，每组分成三份(两份是用于重复测定以便计算平均值)，每份25μl，待用。

试剂盒：MOUSE CYTOKINE/CHEMOKINE MAGNETIC BEAD PANEL 96-Well PlateAssay(Millipore，Cat.No:HCYTOMA G-60K)

2.实验方法步骤

取实施例4中的培养上清，每份25μl，用于细胞因子的测定公司的MOUSECYTOKINE/CHEMOKINE MAGNETIC BEAD PANEL 96-Well Plate Assay)，共测定9种细胞因子，即GM-CSF、IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6、IL-12p40、IL-17、IP-10以及TNF-α。具体操作按照试剂盒操作说明进行。

3.实验结果

如图4A-4I。

结果表明，8个组经过细胞增殖后，各组的9种因子和阴性对照PBS组的9种因子相比都有不同差异，说明蛋白有很强的抗原性，可以作为结核病例如肺结核的免疫诊断标识，预防和/或治疗。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

序列表

<110> 中国医学科学院病原生物学研究所

<120> 结核病免疫诊断分子标识及其医药用途

<130> NNF1702

<160> 12

<170> PatentIn version 3.2

<210> 1

<211> 138

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Rv0875c的氨基酸序列

<400> 1

Trp Leu Leu Val Arg Gly His Gly Pro Gln Gln Pro Glu Ile Ser Ala

1 5 10 15

Tyr Ser His Gly His Leu Thr Arg Val Gly Pro Tyr Leu Tyr Cys Asn

20 25 30

Val Val Asp Leu Asp Asp Cys Gln Thr Pro Gln Ala Gln Gly Glu Leu

35 40 45

Pro Val Ser Glu Arg Tyr Pro Val Gln Leu Ser Val Pro Glu Val Ile

50 55 60

Ser Arg Ala Pro Trp Arg Leu Leu Gln Val Tyr Gln Asp Pro Ala Asn

65 70 75 80

Thr Thr Ser Thr Leu Phe Arg Pro Asp Thr Arg Leu Ala Val Thr Ile

85 90 95

Pro Thr Val Asp Pro Gln Arg Gly Arg Leu Thr Gly Ile Val Val Gln

100 105 110

Leu Leu Thr Leu Val Val Asp His Ser Gly Glu Leu Arg Asp Val Pro

115 120 125

His Ala Glu Trp Ser Val Arg Leu Ile Phe

130 135

<210> 2

<211> 512

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Rv0773c的氨基酸序列

<400> 2

Met Pro Ile Leu Ala Thr Asn Val Val Cys Thr Ser Gln Pro Leu Ala

1 5 10 15

Ala Gln Ala Gly Leu Arg Met Leu Ala Asp Gly Gly Asn Ala Val Asp

20 25 30

Ala Ala Val Ala Thr Ala Ile Thr Leu Thr Val Val Glu Pro Val Ser

35 40 45

Asn Gly Ile Gly Ser Asp Ala Phe Ser Ile Val Trp Asp Gly Gln Lys

50 55 60

Leu His Gly Leu Asn Ala Ser Gly Arg Ser Pro Ser Ala Trp Thr Pro

65 70 75 80

Glu Tyr Phe Gly Gly Asn Ala Val Pro Val Leu Gly Trp Asn Ser Val

85 90 95

Thr Val Pro Gly Ala Val Ser Ala Trp Val Glu Leu His Ala Arg Phe

100 105 110

Gly Arg Leu Pro Phe Glu Thr Leu Phe Glu Pro Ala Ile Ser Tyr Gly

115 120 125

Arg Asn Gly Phe Leu Val Ser Pro Thr Val Ala Ala Gln Trp Ala Ala

130 135 140

Gln Val Pro Leu Phe Ala Ser Gln Pro Gly Phe Ala Asp Ala Phe Met

145 150 155 160

Pro Gly Gly Arg Ala Pro Lys Pro Gly Glu Leu Phe Thr Phe Pro Asp

165 170 175

His Ala Ala Thr Leu Glu Lys Ile Ala Ala Thr Asn Gly Glu Glu Phe

180 185 190

Tyr Arg Gly Glu Leu Ala Ala Lys Leu Glu Ala His Ser Ala Ala Asn

195 200 205

Gly Gly Val Met Arg Ala Asp Asp Leu Ala Ala His Arg Val Asp Trp

210 215 220

Val Asp Thr Ile Thr Gly Thr Tyr Arg Gly Tyr Thr Ile His Gln Ile

225 230 235 240

Pro Pro Asn Gly Gln Gly Ile Val Ala Leu Ile Ala Leu Gly Ile Leu

245 250 255

Glu His Phe Asp Met Ser Ser Trp Ser Val Asp Ser Ala Glu Ser Val

260 265 270

His Val Gln Ile Glu Ala Leu Lys Leu Ala Phe Ala Asp Ala Gln Ala

275 280 285

Cys Val Ala Asp Ile Asp Tyr Met Pro Val His Pro Lys Arg Leu Leu

290 295 300

Asp Lys Glu Tyr Leu Arg Gln Arg Ala Thr Leu Ile Asp Pro Lys Arg

305 310 315 320

Ala Met Pro Ala Ala Thr Gly Ile Pro Arg Gly Gly Thr Val Tyr Leu

325 330 335

Ala Ala Ala Asp Ala Ala Gly Met Met Val Ser Met Ile Gln Ser Asn

340 345 350

Tyr Leu Gly Phe Gly Ser Gly Val Val Val Pro Gly Thr Gly Ile Ser

355 360 365

Leu His Asn Arg Gly Ser Asp Phe Thr Val Val Pro Arg His Pro Asn

370 375 380

Arg Val Gly Pro Arg Lys Arg Pro Tyr His Thr Ile Ile Pro Gly Phe

385 390 395 400

Val Thr Arg Asp Gly Ala Pro Val Met Ser Phe Gly Val Met Gly Gly

405 410 415

Met Met Gln Pro Gln Gly His Val Gln Val Leu Val Arg Ile Ala Asp

420 425 430

Tyr Gly Gln Asn Pro Gln Ala Ala Cys Asp Gly Pro Arg Phe Arg Trp

435 440 445

Val Asn Gly Met Arg Val Ser Phe Glu Asn Gly Phe Pro Asp Ser Thr

450 455 460

Leu Asp Glu Leu Arg Gln Arg Gly His Asp Leu Val Ala Val Ala Asp

465 470 475 480

Tyr Ser Gln Phe Gly Ser Cys Gln Ala Ile Trp Arg Leu Asp Asp Gly

485 490 495

Tyr Leu Ala Ala Ser Asp Pro Arg Arg Asp Gly Gln Ala Ala Ala Cys

500 505 510

<210> 3

<211> 417

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Rv2553c的氨基酸序列

<400> 3

Met Pro Asp Gly Gly His Arg His Arg Ala Gln Pro Val Ser Val Arg

1 5 10 15

Pro Asn Arg His Arg Arg Thr Arg Val Ser Arg Ala Gln Arg Arg His

20 25 30

Ala Gln Gln Ile Arg Arg Arg Arg Arg Val Ala Gly Gly Phe Ala Leu

35 40 45

Ser Leu Leu Val Val Val Val Val Val Ala Val Val Val Gly Ala Lys

50 55 60

Leu Trp Gln Thr Met Leu Gly Phe Gly Asn Asp Tyr Thr Gly Pro Gly

65 70 75 80

Lys Arg Asp Ile Val Ile Gln Ile Arg Ala Gly Asp Ser Thr Thr Ala

85 90 95

Val Gly Glu Thr Leu Leu Lys His Gly Val Val Ala Thr Val Arg Ala

100 105 110

Phe Val Asp Ala Ala His Gly Asn Thr Ala Ile Ser Ser Ile Gln Pro

115 120 125

Gly Phe Tyr Arg Met Arg Thr Glu Ile Ser Ala Ala Ser Ala Val Ala

130 135 140

Arg Leu Thr Asp Pro His Asn Arg Val Gly Lys Leu Val Ile Pro Glu

145 150 155 160

Gly Arg Gln Leu Asp Asp Thr Thr Asp Met Lys Thr Asn Val Val Asn

165 170 175

Pro Gly Ile Phe Ala Leu Ile Ser Arg Ala Thr Cys Val Asp Leu Asp

180 185 190

Gly Thr Gln Arg Cys Val Ser Val Ala Asp Leu Arg Ala Ala Ala Ser

195 200 205

Arg Ser Thr Pro Thr Met Leu Ser Val Pro Arg Trp Ala Val Gly Pro

210 215 220

Val Met Glu Leu Gly Thr Asp His Arg Arg Ile Glu Gly Leu Ile Ala

225 230 235 240

Pro Gly Thr Phe Asn Ile Asp Pro Ser Ala Ser Ala Glu Thr Ile Leu

245 250 255

Ala Thr Leu Ile Ser Ala Gly Ala Val Glu Tyr Met Lys Ser Gly Leu

260 265 270

Val Asp Thr Ala Lys Ser Leu Gly Leu Ser Pro Tyr Asp Ile Leu Val

275 280 285

Val Ala Ser Leu Val Gln Gln Glu Ala Asn Thr Gln Asp Phe Pro Lys

290 295 300

Val Ala Arg Val Ile Tyr Asn Arg Leu His Glu His Arg Thr Leu Glu

305 310 315 320

Phe Asp Ser Thr Val Asn Tyr Pro Leu Asp Arg Arg Glu Val Ala Thr

325 330 335

Ser Asp Thr Asp Arg Ala Gln Arg Thr Pro Trp Asn Thr Tyr Met Ala

340 345 350

Gln Gly Leu Pro Ala Thr Ala Ile Cys Ser Pro Gly Val Asp Ala Leu

355 360 365

Arg Ala Ala Glu His Pro Val Pro Gly Asp Trp Leu Tyr Phe Val Thr

370 375 380

Ile Asp Ser Gln Gly Thr Thr Leu Phe Thr Arg Asp Tyr Gln Gln His

385 390 395 400

Leu Ala Asn Ile Glu Leu Ala Lys His Asn Gly Val Leu Asp Ser Ala

405 410 415

Arg

<210> 4

<211> 201

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Rv1115的氨基酸序列

<400> 4

Gln Val Val Gly Thr Pro Tyr Ile Pro Gly Gly Asp Ser Pro Ala Gly

1 5 10 15

Thr Asp Cys Ser Glu Leu Ala Ser Trp Val Ser Asn Ala Ala Thr Ala

20 25 30

Arg Pro Val Phe Gly Asp Arg Phe Asn Thr Gly Asn Glu Glu Ala Ala

35 40 45

Leu Ala Ala Arg Gly Phe Gln Gln Gly Thr Ala Pro Asn Ala Leu Val

50 55 60

Ile Gly Trp Asn Gly His His Thr Ala Val Thr Leu Pro Asp Gly Thr

65 70 75 80

Pro Val Ser Ser Gly Glu Gly Gly Gly Val Arg Val Gly Gly Gly Gly

85 90 95

Ala Tyr Gln Pro Lys Phe Thr His His Met Tyr Leu Pro Met Asp Val

100 105 110

Asp Ala Gly Glu Asp Gln Pro Pro Ala Pro Asp Glu Pro Val Thr Ala

115 120 125

Val Asp Asp Val Glu Pro Glu Met Pro Ala Pro Cys Pro Thr Gln Arg

130 135 140

Pro Pro Val Thr Pro Arg His Asn Leu Cys Asn Lys Leu Arg Thr Met

145 150 155 160

Pro Gly Ala Leu Ser Ala Ala Leu Ala Ala Ala Ala Pro Val Trp Pro

165 170 175

Ala Pro Ile Ser Gly Cys Arg Gly Phe Ser Thr Ser Leu Leu Ala Lys

180 185 190

Arg Asn His Pro Val Ile Val Gly Lys

195 200

<210> 5

<211> 110

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Rv1811的氨基酸序列

<400> 5

His Leu Leu Gly Arg Pro Leu Gly Arg Leu Val Asp Arg Asp Asn Ala

1 5 10 15

Val Glu Asp Glu Gly Leu Gln Pro Tyr Gln Val Arg Val Ile Cys Arg

20 25 30

Pro Lys Ala Glu Thr Tyr Val Arg Ala His Ile Val Gln Arg Thr Ser

35 40 45

Ser Asn Asp Ile Thr Leu Arg Gly Ile Arg Thr Gly Pro Ala Gly Asp

50 55 60

Asp Asn Ile Thr Leu Thr Ala His Leu Leu Met Val Gly His Thr Pro

65 70 75 80

Ala Lys Leu Glu Arg Leu Val Ala Glu Leu Ser Leu Gln Pro Gly Val

85 90 95

Tyr Ala Val His Trp Tyr Ala Gly Glu His Ala Gln Ala Glu

100 105 110

<210> 6

<211> 95

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Rv3875的氨基酸序列

<400> 6

Met Thr Glu Gln Gln Trp Asn Phe Ala Gly Ile Glu Ala Ala Ala Ser

1 5 10 15

Ala Ile Gln Gly Asn Val Thr Ser Ile His Ser Leu Leu Asp Glu Gly

20 25 30

Lys Gln Ser Leu Thr Lys Leu Ala Ala Ala Trp Gly Gly Ser Gly Ser

35 40 45

Glu Ala Tyr Gln Gly Val Gln Gln Lys Trp Asp Ala Thr Ala Thr Glu

50 55 60

Leu Asn Asn Ala Leu Gln Asn Leu Ala Arg Thr Ile Ser Glu Ala Gly

65 70 75 80

Gln Ala Met Ala Ser Thr Glu Gly Asn Val Thr Gly Met Phe Ala

85 90 95

<210> 7

<211> 414

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 编码Rv0875c的核苷酸序列

<400> 7

tggctgctag tacgcggaca cggtccgcag caacccgaga tcagcgctta ctcgcacggg 60

cacctgaccc gcgtggggcc ctatttgtac tgcaacgtgg tcgacctcga cgactgtcag 120

accccgcagg cgcagggcga attgccggta agcgaacgct atcccgtgca gctctcggta 180

cccgaagtca tttcccgggc gccgtggcgt ttgctgcagg tataccagga ccccgccaac 240

accaccagca ccttgtttcg gccggacacc cggttggcgg tcaccatccc cactgtcgac 300

ccgcagcgcg ggcggctgac cgggattgtc gtgcagttgc tgacgttggt ggtcgaccac 360

tcgggtgaac tacgcgacgt tccgcacgcg gaatggtcgg tgcgccttat cttt 414

<210> 8

<211> 1539

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 编码Rv0773c的核苷酸序列

<400> 8

atgcccatcc tggcgacaaa cgtcgtgtgc acgtcacaac cgctggccgc gcaagcgggt 60

cttcggatgc tggccgacgg cggcaacgcg gtcgacgccg ccgtcgccac agccatcacc 120

ctcaccgtgg tggaaccggt gtccaatggc atcggctcgg acgccttcag catcgtctgg 180

gacgggcaaa aactgcacgg cctgaacgcg tccggccgct caccctcggc gtggacgcca 240

gagtacttcg gcggcaacgc cgttcccgtg ctcggctgga actccgtgac ggtgcccggt 300

gcggtgtcgg cctgggtgga actgcacgcc aggttcggca ggctaccatt cgaaacactc 360

ttcgagcccg ccatctcgta cggccgcaac ggctttctgg tctcaccgac cgtcgcggca 420

caatgggcgg cacaggtgcc gttgttcgca tcccagcccg gattcgccga tgcgttcatg 480

cccggcggac gagcgccgaa acccggtgag ctgtttacct ttcctgacca cgcggcgacg 540

ctagagaaga tcgcggcgac caacggtgag gagttctacc ggggagagct ggccgccaaa 600

ctcgaggcgc actcggcggc aaacggcggg gtgatgcgtg ccgacgacct cgccgcccat 660

cgcgtggact gggtcgacac gatcacggga acctaccgcg ggtacaccat ccaccagata 720

ccgcccaacg gccagggcat cgtggccttg atcgccctcg gaatcctcga gcatttcgat 780

atgtcatcgt ggtcagtgga ttccgctgaa agtgtgcacg tgcagatcga agcactgaag 840

cttgccttcg ccgacgcgca agcgtgtgtc gccgacatcg actacatgcc ggtgcacccg 900

aagcgcctgc tcgacaagga gtatctgcgg cagcgcgcca cgctgatcga tccaaagagg 960

gcaatgccgg cggccaccgg catcccgcga ggcggcaccg tctatctggc cgccgccgat 1020

gctgcgggaa tgatggtgtc catgattcag tcgaactacc ttgggttcgg ctccggtgtg 1080

gtggtgcccg gcaccggcat ttcgctgcac aatcgcggct cggatttcac tgtggtgccg 1140

agacatccga accgggttgg gccacggaag cgcccctatc acacgatcat cccaggtttt 1200

gtgacccgcg acggtgcgcc ggtgatgagc ttcggggtga tgggcggcat gatgcaaccc 1260

cagggtcacg tgcaggtgct ggtgcgcatc gccgactacg gccagaaccc ccaggcggcc 1320

tgtgacggcc ctcggttccg ctgggtgaac ggtatgcggg tcagtttcga aaacggcttc 1380

ccggattcaa ctctcgatga actgcggcag cgtgggcatg acttggtcgc agtagcggac 1440

tacagccagt tcgggagttg tcaggcaatc tggcggctcg acgatgggta cctcgcggcc 1500

agcgatcccc gccgtgatgg ccaagccgca gcctgctag 1539

<210> 9

<211> 1254

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 编码Rv2553c的核苷酸序列

<400> 9

atgcctgacg gtggccaccg ccaccgcgcc cagccggtgt cggtaagacc gaaccggcac 60

cgcaggaccc gagtcagccg cgctcagcgc cgacacgccc aacaaatccg ccggcgacgg 120

cgcgtcgccg gcggatttgc cctgagcctg ctcgtcgtgg tggtggtggt ggccgtcgtc 180

gtcggcgcca agttgtggca gaccatgttg ggcttcggta acgactacac cggtcccggc 240

aagcgagaca tcgtgattca gatcagggcc ggtgactcga ccacggcggt cggggagacg 300

ctgctcaaac acggtgtagt ggccaccgtc cgagcattcg tcgatgccgc gcacggcaac 360

accgcgattt cctcgatcca acccgggttc tatcggatgc gaaccgagat ttcggcggct 420

tccgctgtcg cgcggcttac cgatccgcac aaccgggtgg ggaagttggt cataccggaa 480

gggcgtcagc tcgacgacac caccgacatg aagaccaacg tggtgaatcc tggcatattc 540

gcgctgatct cccgtgccac ctgtgtggat ctcgacggta cccaacgctg cgtctcggtg 600

gccgacctcc gcgcggcggc gagcaggagc acgccgacga tgctgtcagt gccgcgctgg 660

gcggttgggc cggtgatgga gctgggcact gaccatcgcc ggatcgaggg gctgatcgca 720

ccggggacct tcaacatcga cccgtcggca tcggctgaaa ccatcttggc gaccttgatc 780

agcgccggcg ccgtggagta catgaaatcc gggttggtag acaccgcaaa gtcgctgggc 840

ctgtcgccct atgacattct cgtggtggcc tcgctggtgc agcaggaagc caacacccag 900

gatttcccga aggtggcccg ggtcatctac aaccggctgc acgaacaccg cacgttggag 960

ttcgactcga ccgtgaacta tccgctggat cgccgtgagg tggccaccag cgacaccgac 1020

cgtgcccagc gcacaccgtg gaacacctac atggcccagg ggctgccggc caccgcgatc 1080

tgttcgcccg gcgtcgacgc gctgcgcgcc gccgagcatc cagtacctgg cgactggctg 1140

tacttcgtca ccatcgattc ccagggcacg acgctgttca ccagggacta tcagcagcat 1200

ctggcgaaca tcgagctggc caaacacaac ggtgtcctcg acagcgcgcg atga 1254

<210> 10

<211> 603

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 编码Rv1115的核苷酸序列

<400> 10

caagtcgtcg gcactccgta tattcccggt ggcgattctc ccgccgggac cgactgctcg 60

gagctggctt cgtgggtatc gaatgcggcg acggccaggc cggttttcgg agataggttc 120

aacaccggca acgaggaagc cgccttggcg gctcggggct ttcaacaggg aaccgccccc 180

aatgccttgg tgatcggttg gaatggccac cacacggcgg tgacgctgcc cgatggcacg 240

cccgtatcca gtggtgaagg cggtggcgtg cgggtcggtg gcggtggcgc ctaccagccc 300

aaattcaccc accacatgta tctgccgatg gatgtggacg cgggagaaga ccagccgccg 360

gcgccagatg agccggtcac cgcggtcgac gacgtggaac cggaaatgcc tgcaccgtgc 420

ccgacccagc gcccgccggt gaccccgaga cataacctgt gcaacaaact ccggactatg 480

ccaggggcgc tctcggccgc gctggccgcg gcggcgccgg tctggccggc ccctataagc 540

ggctgccgcg ggttcagcac gtccctctta gcaaaaagaa atcacccagt aatcgtcggg 600

aaa 603

<210> 11

<211> 330

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 编码Rv1811的核苷酸序列

<400> 11

tcgaacttgt ttgggcagaa cgcgcctgcg atcgccgcgc tcgaatcctt gtatgagtgt 60

atgtgggccc aggatgcagc ggccatggcg ggttattacg ttggggcttc ggcggtggcc 120

acacagttgg catcgtggct gcaacggcta cagagcatcc ccggcgccgc cagtcttgat 180

gcccgtctgc cgagctcggc cgaggcaccg atgggagtcg tccgcgcggt caacagcgcg 240

atcgccgcca atgcggctgc ggcacaaacc gttggcctgg tcatgggagg cagcggcacg 300

ccaataccgt cggccagata tgtcgagctc 330

<210> 12

<211> 285

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 编码Rv3875的核苷酸序列

<400> 12

atgacagagc agcagtggaa tttcgcgggt atcgaggccg cggcaagcgc aatccaggga 60

aatgtcacgt ccattcattc cctccttgac gaggggaagc agtccctgac caagctcgca 120

gcggcctggg gcggtagcgg ttcggaggcg taccagggtg tccagcaaaa atgggacgcc 180

acggctaccg agctgaacaa cgcgctgcag aacctggcgc ggacgatcag cgaagccggt 240

caggcaatgg cttcgaccga aggcaacgtc actgggatgt tcgca 285

Claims

1.氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的蛋白在制备结核病诊断剂或者结核分枝杆菌检测剂中的用途；优选地，所述结核病为肺结核；优选地，所述结核病诊断剂或者结核分枝杆菌检测剂还包含SEQ ID NO:2所示的蛋白。

2.一种抗体，其能够特异性结合氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的蛋白；优选地，所述抗体还连接有可检测的标记；优选地，所述可检测的标记为放射性同位素、荧光物质、发光物质、有色物质或酶。

3.一种结核病诊断剂或者结核分枝杆菌检测剂，其包含一种或者多种权利要求2所述的抗体，以及可选的一种或多种药学上可接受的辅料。

4.氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的蛋白在制备预防和/或治疗和/或辅助治疗结核病的药物或者制备抑制结核杆菌的药物中的用途；优选地，所述药物为疫苗；优选地，所述疫苗为结核病疫苗；优选地，所述结核病为肺结核；优选地，所述药物还包含SEQ ID NO:2所示的蛋白。

5.一种药物组合物，其包含氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的蛋白，以及可选的一种或几种药学上可接受的载体或赋形剂；优选地，所述药物组合物为疫苗，并且所述药学上可接受的载体或赋形剂为疫苗用载体或赋形剂；优选地，所述疫苗为结核病疫苗；优选地，所述结核病为肺结核；优选地，所述药物组合物还包含SEQ ID NO:2所示的蛋白。

6.氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的蛋白在制备提高受试者或细胞的细胞因子的水平的药物中的用途，所述细胞因子选自如下的至少一种：

GM-CSF、IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6、IL-12p40、IL-17、IP-10以及TNF-α；优选地，所述细胞为淋巴细胞；优选地，所述药物还包含SEQ ID NO:2所示的蛋白。

7.一种在体内或体外提高细胞因子的水平的方法，包括使用有效量的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的蛋白的步骤，所述细胞因子选自如下的至少一种：

GM-CSF、IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6、IL-12p40、IL-17、IP-10以及TNF-α；优选地，所述方法包括使用有效量的SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:2所示的蛋白的步骤。

8.氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的蛋白在制备或者作为工具药的用途，所述工具药用于筛选预防和/或治疗和/或辅助治疗结核病的药物或者用于筛选抑制结核杆菌的药物；优选地，所述结核病为肺结核；优选地，所述工具药还包含SEQ ID NO:2所示的蛋白。

9.氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的蛋白在制备促进淋巴细胞(例如CD4细胞或CD8细胞)增殖的药物中的用途；优选地，所述药物还包含SEQ ID NO:2所示的蛋白。

10.一种在体内或体外促进淋巴细胞(例如CD4细胞或CD8细胞)增殖的方法，包括使用有效量的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的蛋白的步骤；优选地，所述方法包括使用有效量的SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:2所示的蛋白的步骤。