CN107281465B - 一种结核病疫苗候选组分以及含有该组分的疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明属于免疫学和分子生物学领域，涉及一种结核病疫苗候选组分以及含有该组分的疫苗。本发明还涉及一种诊断结核病的分子标记物。具体地，本发明涉及蛋白MYVA_1927在制备治疗和/或预防结核病的药物或者抑制结核分枝杆菌的药物中的用途，或者在制备诊断结核病的药物中的用途。本发明还涉及一种疫苗，其含有蛋白MYVA_1927。蛋白MYVA_1927具有良好的符合率和反应强度，具有应用于制备结核病疫苗的潜力；此外，蛋白MYVA_1927还可以作为结核病(例如肺结核)免疫诊断分子标识。

Description

一种结核病疫苗候选组分以及含有该组分的疫苗

技术领域

本发明属于免疫学和分子生物学领域，涉及一种结核病疫苗候选组分以及含有该组分的疫苗。本发明还涉及一种诊断结核病的分子标记物。

背景技术

结核病是危害人类健康的主要传染病之一，是当今世界上成年人传染病中的主要杀手，已对国际公共卫生构成严峻挑战[1]。我国是世界上22个结核病高负担国家之一，疫情呈“三高一低”，即患病率高、死亡率高，耐药率高、年递降率低。并且随着艾滋病合并感染、耐药结核以及流动人口增多等情况的出现，造成了结核病疫情日趋严重的局面，防控形势非常严峻[2]。

疫苗是预防传染病最有效、最经济的方法。目前可用于预防结核病的卡介苗(简称为BCG)对成年人肺结核的免疫保护力从0％～80％不等，效果并不理想。自90年代以来，随着对结核分枝杆菌的保护性抗原的研究，其它如营养缺陷型结核减毒活疫苗、BCG重组疫苗、结核亚单位疫苗以及DNA疫苗等成为研究的热点，但是这些疫苗的保护效果也不特别理想，有些甚至没有超过BCG的保护效果[3]。因此，研发新的结核病疫苗显得非常迫切。

母牛分枝杆菌(Mycobacterium vaccae)疫苗是目前仅有的针对结核病并且进入III期临床试验的疫苗，其命名为微卡(Vaccae)[4]。作为一个新兴的免疫治疗性疫苗，它能够在宿主受到病原菌侵袭而不能产生有效的免疫反应的时候，进一步刺激宿主的免疫系统从而加强免疫[5]。早期的临床试验显示，结核病人接触母牛分枝杆菌后能够减轻结核的症状，而采用低剂量的微卡与一线药或二线药同时治疗可以有效清除结核病人痰中的分枝杆菌，并且仅一个月的治疗之后痰中结核菌就转阴。此外，口服剂型的微卡在复治结核、多耐药结核和艾滋病合并感染治疗方面甚有疗效，并且在整个治疗过程中没有不良反应。而且，该疫苗制备容易、价格便宜，治疗疗程短，尤其适合于发展中国家应用[6]。经过长期筛选而得到的微卡是目前为止唯一针对结核有效的治疗性疫苗，尽管其应用前景非常看好，但是关于此疫苗株的基础研究有待加强，例如，其基因组、蛋白质组、有效抗原组分等都不清楚；另外，其表现性状和传统的卡介苗差别很大，卡介苗的遗传背景没有参考性；微卡发挥免疫作用从而达到治疗目的的机制也不清楚。

针对母牛分支杆菌的基因组和蛋白质组学研究已成为研究的热点之一，其中M.vaccae ATCC 25954的基因组的草图(Scaffolds or contigs)已经提交NCBI数据库，但是并没有完整的基因组精细图，也没有准确的基因注释，这给此类疫苗后续的研究带来很大的障碍[7]。

目前，迫切需要开发新的能够有效地用于预防和/或治疗结核病的药物，或者用于诊断结核病的药物。

发明内容

本发明人经过不懈的探索和创造性的劳动，惊奇地发现，氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示的蛋白，具有很强的抗原性和良好的抗原特异性，与ESAT-6的符合率较高，反应强度较高，具有应用于制备结核病疫苗的潜力；另外，SEQ ID NO:1所示的蛋白在结核病人和健康人中的表达存在显著差异，还能成为诊断结核病的理想靶抗原，可以作为结核病免疫诊断的分子标记物。由此提供了下述发明：

本发明的一个方面涉及蛋白在制备治疗和/或预防结核病的药物或者抑制结核分枝杆菌的药物或者促进PBMC分泌IFN-γ的药物中的用途，其中，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；优选地，所述药物为疫苗。在本发明的一个实施方案中，所述的用途，其中，所述结核病为肺结核。

蛋白MYVA_1927的氨基酸序列如下：319aa

MPVDVTLTEAETDALRKWVQGSGIGSTVTDVAPLTGGSQN IVVRLRVDGEPMVLRRPPQHPRPTSDNTMRREIAVLQTLKGTA VPHPELIAGCEDLSVLGVVFYLMEAVDGFNPGTEVDQAYVRDA GMRHRVGTSYAASLAELGKVAWQGSPLAALKRPGSFLARQVP QFMRLLESYRHDNYAPESFPSVHVLADWLDSRRPDDAEPGIMH GDCHLNNVLLRRDVPELAAFIDWEMCTVGDPLLDLGWMLVC WPDGPNPIDAGAELAALGGLATRAELIEAYLDAGGRRTSRLDW YIAMACFKLAIVIEGTWSRHLAGQ(SEQ ID NO:1)

本发明的另一方面涉及多核苷酸在制备治疗和/或预防结核病的药物或者抑制结核分枝杆菌的药物或者促进PBMC分泌IFN-γ的药物中的用途，其中，所述多核苷酸编码氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的蛋白；优选地，所述多核苷酸的核酸序列如SEQ ID NO:2所示；优选地，所述药物为疫苗。在本发明的一个实施方案中，所述的用途，其中，所述结核病为肺结核。

编码蛋白MYVA_1927的碱基序列如下：957bp

ATGCCGGTGGATGTGACGCTGACCGAGGCCGAGACCGA CGCGCTGCGGAAGTGGGTGCAGGGGAGCGGGATCGGGTCCA CGGTCACCGACGTCGCACCGCTGACCGGCGGATCGCAGAAC ATCGTGGTGCGCCTGCGGGTGGACGGTGAGCCGATGGTGCT GCGCCGACCGCCGCAACACCCGCGGCCGACGAGCGACAACA CCATGCGCCGAGAGATCGCGGTGCTGCAGACACTGAAGGGC ACCGCGGTGCCGCACCCGGAACTGATCGCCGGATGCGAGGA CCTCAGCGTGCTCGGGGTGGTGTTCTATCTGATGGAGGCGG TCGACGGGTTCAACCCCGGCACCGAGGTCGACCAGGCCTAC GTCCGTGACGCCGGCATGCGTCACCGCGTCGGGACGTCCTA CGCGGCGAGCCTGGCCGAGCTCGGCAAGGTGGCCTGGCAGG GCAGTCCGCTGGCCGCGCTGAAACGTCCGGGATCCTTTCTG GCACGCCAGGTTCCGCAGTTCATGCGGCTGCTGGAGAGTTA CCGGCACGACAACTACGCGCCCGAGTCGTTCCCGTCGGTGC ATGTGCTCGCCGACTGGCTGGACTCGCGCAGGCCCGACGAC GCCGAACCCGGGATCATGCACGGCGACTGCCATCTGAACAA CGTGCTGCTGCGCCGCGACGTCCCCGAGCTCGCGGCGTTCA TCGACTGGGAGATGTGCACCGTCGGGGACCCGTTGCTCGACCTCGGGTGGATGCTGGTGTGCTGGCCGGACGGACCCAACCC GATCGACGCCGGAGCGGAACTGGCTGCCCTCGGCGGGCTGG CGACCAGGGCCGAACTGATCGAGGCCTACCTGGATGCGGGC GGGCGCCGGACGTCGCGACTGGACTGGTACATCGCGATGGC GTGTTTCAAACTCGCGATCGTCATCGAGGGCACCTGGTCGCG CCACCTGGCCGGGCAG(SEQ ID NO:2)

本发明的再一方面涉及蛋白在制备诊断结核病的药物或者检测结核分枝杆菌的药物中的用途，其中，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。在本发明的一个实施方案中，所述的用途，其中，所述结核病为肺结核。

本发明的再一方面涉及多核苷酸在制备诊断结核病的药物或者检测结核分枝杆菌的药物中的用途，其中，所述多核苷酸编码氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的蛋白；优选地，所述多核苷酸的核酸序列如SEQ ID NO:2所示。在本发明的一个实施方案中，所述的用途，其中，所述结核病为肺结核。

本发明的再一方面涉及一种药物组合物，其包含氨基酸序列如 SEQ ID NO:1所示的蛋白；优选地，其还一种或多种包含药学上可接受的辅料例如疫苗用载体或赋形剂例如佐剂；优选地，所述药物组合物为疫苗；优选地，所述药物组合物为治疗和/或预防结核病的药物组合物；优选地，所述结核病为肺结核。

在本发明的一个实施方案中，所述的药物组合物，其还包含至少一种抗结核药物；优选地，所述抗结核药物选自如下的一种或多种：

异烟肼、利福平、吡嗪酰铵、链霉素和乙胺丁醇。

本发明的再一方面涉及一种结核病诊断剂或结核病诊断试剂盒，其包含检测氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示蛋白的药物；优选地，所述药物为SEQ ID NO:1所示蛋白的抗体；优选地，所述抗体为单克隆抗体。所述抗体能够与SEQ ID NO:1所示蛋白特异性结合。在本发明的一个实施方案中，所述的结核病为肺结核。

在本发明的一个实施方案中，所述的结核病诊断剂或结核病诊断试剂盒，其中，所述抗体还连接有可检测的标记；优选地，所述可检测的标记为放射性同位素、荧光物质、发光物质、有色物质或酶。

在本发明的一个实施方案中，所述的结核病诊断剂或结核病诊断试剂盒，其还包括能够与所述抗体(第一抗体)特异性结合的第二抗体，其中，所述第二抗体还连接有可检测的标记；优选地，所述可检测的标记为放射性同位素、荧光物质、发光物质、有色物质或酶。

本发明的再一方面涉及一种治疗和/或预防结核病(例如肺结核) 的方法，包括给予受试者有效量的SEQ ID NO:1所示蛋白的步骤。

给药剂量取决于许多因素，例如所要预防或治疗疾病的性质和严重程度，患者或动物的性别、年龄、体重及个体反应，所用的具体多肽，给药途径及给药次数等。上述剂量可以单一剂量形式或分成几个，例如二、三或四个剂量形式给药。

可改变药物组合物中活性成分(多肽)的实际剂量水平，以便所得的活性成分的量能有效针对具体患者、组合物和给药方式得到所需的治疗反应。剂量水平须根据具体多肽的活性、给药途径、所治疗病况的严重程度以及待治疗患者的病况和既往病史来选定。但是，本领域的做法是，给药剂量从低于为得到所需治疗效果而要求的水平开始，逐渐增加剂量，直到得到所需的效果。

在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培养、分子遗传学、核酸化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。

术语“药学上可接受的辅料”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的(参见例如 Remington's PharmaceuticalSciences.Edited by Gennaro AR,19th ed. Pennsylvania:Mack Publishing Company,1995)，并且包括但不限于： pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液；表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如Tween-80；离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。

在本发明中，术语“疫苗用载体或赋形剂”是指选自如下物质的一种或多种，包括但不限于：pH调节剂、表面活性剂、佐剂、离子强度增强剂。具体地，例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液，表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂。其中，非离子型表面活性剂包括但不限于:Tween-80。离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。

术语“佐剂”是指非特异性免疫增强剂，当其与抗原一起或预先递送入机体时，其可增强机体对抗原的免疫应答或改变免疫应答类型。佐剂有很多种，包括但不限于铝佐剂(例如氢氧化铝)、弗氏佐剂(例如完全弗氏佐剂和不完全弗氏佐剂)、短小棒状杆菌、脂多糖、细胞因子等。弗氏佐剂是目前动物试验中最常用的佐剂。氢氧化铝佐剂则在临床实验中使用较多。

术语“有效量”是指足以获得或至少部分获得期望的效果的量。例如，预防疾病(例如结核病特别是肺结核)有效量是指，足以预防，阻止，或延迟疾病(例如结核病特别是肺结核)的发生的量；治疗疾病有效量是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。测定这样的有效量完全在本领域技术人员的能力范围之内。例如，对于治疗用途有效的量将取决于待治疗的疾病的严重度、患者自己的免疫系统的总体状态、患者的一般情况例如年龄，体重和性别，药物的施用方式，以及同时施用的其他治疗等等。

在本发明中，术语“特异性结合”具有免疫学的一般含义，例如抗原抗体间的结合。

术语“疾病和/或病症”是指所述受试者的一种身体状态，该身体状态与本发明所述疾病和/或病症有关。

术语“受试者”可以指患者或者其它接受本发明药物组合物以治疗、预防、减轻和/或缓解本发明所述疾病或病症的动物，特别是哺乳动物，例如人、狗、猴、牛、马等。

术语“结核杆菌”，包括但不限于，例如，结核分枝杆菌；术语“结核分枝杆菌”包括但不限于，结核分枝杆菌H37Rv。

术语“抗结核病”包括但不限于预防和/或治疗结核病。

术语“结核病”，包括但不限于，例如由“结核分枝杆菌(MTB)”感染引起的疾病和/或病症，包括但不限于：肺结核、肝结核和/或肾结核。

发明的有益效果

蛋白MYVA_1927与现今正在使用的阳性对照ESAT-6均能刺激 PBMC产生INFγ，较好地反映了MYVA_1927蛋白的INFγ释放功能。MYVA_1927蛋白与ESAT-6的符合率较高。可见，MYVA_1927 蛋白可以作为抗结核病疫苗的有效成分之一。

蛋白MYVA_1927还具有较好的抗原特异性。相对于健康人，病人血清中含有较高的抗MYVA_1927的抗体，能够作为结核病免疫诊断的分子标记物。

附图说明

图1：质谱鉴定MYVA_1927结果。第6个柱状图为蛋白 MYVA_1927的得分，大约在75分附近。

图2A-2C：全菌蛋白的SDS PAGE和western blot结果。图2A，全菌蛋白SDS PAGE(考马斯亮蓝染色)。图2B，全菌蛋白与健康人血浆(结核病阴性)western blot结果。图2C，为vaccae全菌蛋白与结核病人(结核病阳性)血浆western blot的结果。

图3：蛋白的ELISPOT鉴定中对照设置及读值示意图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案进行详细描述。本领域技术人员能够理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件的，按照常规实验条件或生产商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产商的，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：蛋白MYVA_1927的制备和鉴定

关于蛋白MYVA_1927(如SEQ ID NO:1所示)的制备，可以通过获得其编码碱基序列(如SEQ ID NO:2所示)，并克隆至表达载体，经蛋白表达纯化制得。该编码碱基序列可以通过合成化学合成制得，也可以从母牛分枝杆菌(Mycobacterium vaccae strain ATCC95051)克隆得到。

具体地，可以采用下面的方法。

1.细菌培养

将冻存的菌株(ATCC 95051)接种200毫升7H9液体培养基中 (10％的OADC营养添加剂，美国BD公司生产)，30℃，100rpm 培养过夜，按照1:100倍传代培养适量，当OD值到0.8-1.0时，冰上放置1.5小时后，3000g，10分钟，离心收集菌株。

将收集的菌株一部分用于下面步骤2中的基因组提取，另一部分用于下面实施例2中的全菌蛋白提取。

2.基因组提取

将收集的菌株加入终浓度10mg/ml的溶菌酶37℃孵育过夜。之后按照试剂盒

Genomic DNA Purification Kit(PROMEGA, Madison USA)提取母牛分枝杆菌(Mycobacterium vaccae)95051基因组。

3.目的基因的扩增

合成如下引物序列：

F:ATGCCGGTGGATGTGACGCT(SEQ ID NO:3)

R:TCACCCGAACGGGTTGTCGC(SEQ ID NO:4)

按照下面的PCR反应体系进行目的基因的扩增。

PCR反应体系：

PCR反应条件：

4.表达载体的构建

使用表达载体pET28a(Novagen公司)，一步法构建重组表达载体，使用双酶切，内切酶为EcoR I和Hind III。

5.蛋白的表达和分离纯化

将上面构建的重组表达载体转化感受态大肠杆菌，挑取阳性克隆，用Qiagen试剂盒提取质粒，并送测序验证。测序正确后进行下面的实验。

携带目的基因的表达质粒带有卡那霉素抗性，将其转化到表达菌株BL21(DE3)挑取单克隆菌落，接种到含卡那霉素抗性的LB液体中，37℃，200rpm/min，过夜。

IPTG诱导表达：按照1:100转接上述菌液到含有相同抗性的 100ml LB培养基中,37℃，200rpm/min至OD值超过0.6时，加入终浓度1mMIPTG，再37℃，200rpm/min摇过夜。

收集上述菌液，4000rmp离心。本实验的表达蛋白含有6His标签，因此采用His.Tag序列相邻组氨酸和固定化金属镍离子的亲和力来进行纯化。

在收好的菌泥中，加入5毫升0.1mg/mLlysozyme(BugBuster Protein ExtractionReation,Novagen)，1mM(终浓度)苯甲基磺酰氟(Phenylmethanesulfonyl fluoride,PMSF)，4℃搅拌30min。

超声裂解。10sec超声，10sec间歇，共10-15分钟。注意一直在冰上操作。

4℃，12000r/min，离心20min，收集沉淀。称重，重新以binding buffer(8M尿素，5mM咪唑)溶解，10-20mg/mL(沉淀/binding buffer)，室温作用1小时。

填料混合物预先处理，乙醇沉降，用纯水冲洗一次，binding buffer 平衡。裂解上清液经0.45μm滤膜过滤，与适量填料结合1小时(裂解上清液应一直放在冰上)。

收集流出液。以10毫升binding buffer洗涤1－2次，分别收集洗涤液。以1mL蛋白洗脱液洗(8M尿素，100mM咪唑)洗脱目的蛋白，收集洗脱液。SDS-PAGE分析显示，蛋白MYVA_1927大小约为44kDa。

BCA试剂盒蛋白测蛋白浓度，按试剂盒说明书进行。

6.蛋白的鉴定

通过质谱方法鉴定表达的蛋白。

(1)实验材料和仪器

目标蛋白样品：制备的MYVA_1927蛋白。

仪器：MALDI-TOF-MS。

数据处理软件：Xcalibur software v2.2.6(Thermo)，MASCOT version 2.2(Matrix Sciences,UK)。

(2)实验方法

1)目标蛋白进行SDS PAGE后，去离子水冲洗胶片15分钟；切下目的片段，1-2mm大小；放到蛋白低吸附的离心管中，用100μL的 ddH₂O在碟子里冲洗胶粒并重复一次，弃去液体，加入40μL的(乙腈)/ddH₂O(50/50)，弃去液体，孵育15分钟；弃去液体，加入100μL 100mM碳酸氢铵，孵育15分钟，再加入100μL乙氰，孵育15分钟；重复以上步骤；取出所需胶量(根据估测取10μg)；加入200μL乙腈脱水，5分钟，弃去；真空干燥样品30分钟，样品必须非常干燥。

2)还原蛋白和烷基化：在样品中加入40μL10mM二硫苏糖醇1M 贮存液(DTT，1M)/100mM碳酸氢铵，使胶粒完全没入液体中，56℃水浴45分钟，取出样品放凉。

3)立即加入40μL 55mM碘乙酰胺(IAA1M贮存液)/100mM碳酸氢铵室温孵育30分钟，避光。

4)洗涤：弃去胶粒中的溶液，加入100mM碳酸氢铵40μL，孵育 15分钟；加入40μL乙腈，孵育15分钟；弃去液体，加入100μL乙腈干燥5分钟，弃去；真空干燥样品30分钟。

5)胰蛋白酶消化蛋白：加入10μL胰蛋白酶溶液(足量，胰蛋白酶和蛋白的质量比为1：10)，4℃孵育45分钟(冰浴)。37℃孵育过夜 (12-16小时)；

6)抽提蛋白：吸取上清，放入低吸附蛋白离心管中，在胶片上加入20μL的25mM碳酸氢铵，孵育15分钟；加入等量的乙腈(ACN) 使之成1:1溶液碳酸氢铵(Ambic)/乙腈，孵育15分钟；重复以上步骤；吸取上清，保存，在胶片上加入20μL的5％的甲酸，孵育15分钟；加入等量的乙腈，孵育15分钟；吸取含有消化后肽段的上清，保存待用。在保存的上清中加入浓度为0.1M DTT使蛋白的终浓度为1mM。彻底干燥，30℃大约1小时；用5％的甲酸重新溶解，使终浓度为500 fmol/μL；

7)除盐：用ZipTip c18除盐(www.merckmillipore.com, Germany)按说明书进行。

8)上样：

原始数据通过Xcalibur software v2.2.6(Thermo)获取。肽段到蛋白搜索软件MASCOT version 2.2，搜索数据库:MV95051entries of genome and 247knowncontaminant protein sequences，搜索参数和修饰：max missed cleavage:1；固定修饰:Carbamidomethylation(C)；可变修饰:Oxidation(M)；Carbamyl(N-term),Deamidated(NQ)；Precursor ion mass tolerance:±50ppm；fragment mass tolerance:±0.6Da.High peptide confidence(p<0.01)and the false positive rate(FPR)wascontrolled at under 1％,missed cleavages permitted:2。

(3)实验结果

如图1所示。

由图1可见，蛋白MYVA_1927的得分为75分。

由于蛋白得分高于50认为是有统计学意义且可信度高的蛋白，此处鉴定出来的是唯一一个高可信度的蛋白。

另外，鉴定出来10个肽段，均匹配上MYVA_1927的蛋白序列，因此结果非常可靠。质谱鉴定蛋白MYVA_1927的结果还显示，蛋白覆盖率为28％。

结果表明，MYVA_1927完全符合母牛分枝杆菌(Mycobacterium vaccae strainATCC 95051)编码的蛋白序列。

实施例2：蛋白MYVA_1927特异性引起结核病人中抗体产生

1.实验材料

实施例1中步骤1收集的菌株。

结核病人血浆：来自200位结核病人。经对象知情同意后采集。病人的确定满足下列条件中的任意一项：痰涂片或菌培养是阳性；PCR 扩增阳性(PCR扩增的目的基因是结核分枝杆菌的保守序列片段 IS6110，拷贝数2x10⁵为阳性)；胸片或CT支持是结核病人；临床检查ESAT-6阳性。

健康人血浆：来自50位健康人。经对象知情同意后采集。健康人的确定满足下列全部条件：无临床症状且胸片证实是健康人，并且 ESAT-6是阴性。

2.实验方法

全菌蛋白质组提取，二维电泳以及western blot。

(1)全菌蛋白处理

分泌蛋白的提取：取对数生长中期的培养液，分别采用0.45μm 和0.22μm的滤膜过滤2次，收集滤液，使用10kDa的超滤管浓缩后用10％的三氯乙酸(TCA)在4℃沉淀1小时以上，离心之后沉淀用冰冷的丙酮洗涤两次，真空抽干待用。

胞壁蛋白的提取。收集过滤时留在滤膜上的菌体，用PBS洗涤2 次，采用超声法充分破碎菌体，低速离心(600g)去掉未破碎的菌体，之后12000g离心后收集细胞碎片沉淀，为胞壁蛋白组份；上清部分为胞质和胞膜蛋白组分。胞壁沉淀采用氯仿/甲醇来抽提(氯仿：甲醇：水＝10:10:3)两次，抽提出的蛋白采用10％的TCA在4℃沉淀1小时以上，离心之后沉淀用冰冷的丙酮洗涤两次，真空抽干待用。

胞质和胞膜蛋白的提取。取“胞壁蛋白的提取”步骤中的上清，采用超速离心(150,000g)离心2小时，沉淀为胞膜组份，上清为胞质组份。膜组分采用碳酸钠变性处理和TritonX-114孵育两种方法，所得的胞膜和胞质蛋白分别采用丙酮和TCA沉淀，丙酮洗涤后真空抽干待用。

将以上3个组分等体积混合，得到全菌蛋白样品，用于下面的二维电泳。

(2)二维凝胶电泳样品的定量

使用

2-D Quant试剂盒。

分别取试剂盒自带的2000μg/ml BSA标准溶液5μL、10μL、15 μL、20μL和25μL，分别加入到2ml EP管中，另取一支2ml EP管不加BSA作为空白对照。分别加入500μL试剂盒自带的沉淀剂，混匀后室温孵育10分钟。分别加入500μL试剂盒自带的共沉淀剂，混匀后室温10000xg离心5分钟。弃去上清，分别加入100μL试剂盒自带的铜离子溶液和400μL去离子水，混匀。取试剂盒中显色液A 液与B液，按照A：B＝100：1混合均匀。每个EP管中加入1ml显色液，室温孵育20分钟。将显色的溶液滴入96孔酶标板中，每孔200 μL，每个样品重复一次，测定480nm处的吸光度。

以各标准液的浓度为横坐标，OD480为纵坐标，用各浓度标准液 OD480的平均值和浓度绘制标准曲线并拟合。

以标准曲线计算全菌蛋白样品中的蛋白浓度。

根据计算结果，取包含有300μg蛋白的全菌蛋白样品按照下面的步骤(3)进行预处理。

(3)二维凝胶电泳样品的预处理

使用

2-D Clean-Up试剂盒。

将定量后蛋白样品分装入1.5ml EP管中，每管中蛋白总质量不超过100μg。将试剂盒提供的洗涤剂放入-20℃孵育，使用时孵育时间不少于1小时。每管中加入300μL试剂盒提供的沉淀剂，混匀后在冰上孵育15分钟。每管中继续加入300μL试剂盒提供的共沉淀剂，混匀。4℃12000xg离心5分钟，小心吸去上清液。每管中加入40μL 共沉淀剂，在冰上孵育5分钟。4℃12000xg离心5分钟，小心吸去上清液。沉淀中加入25μL去离子水，振荡10-12秒后加入1ml洗涤剂，5μL洗涤添加剂，混匀并打散沉淀。在-20℃孵育30分钟，每10 分钟振荡混匀一次。4℃12000g离心5分钟，尽量吸去上清液。加入足量水化液(7mol/L尿素，2mol/L硫脲，2％CHAPS 0.002％溴酚蓝)溶解沉淀，合并来自于相同蛋白质样品的沉淀。轻甩溶液后弃去沉淀，所得溶液即可用于下面步骤(4)中的二维凝胶电泳。

(4)二维凝胶电泳

蛋白样品中加入新鲜的终浓度为0.5％IPG缓冲液和终浓度为 15mM的二硫苏糖醇。将蛋白样品加入一维电泳槽，覆盖上合适的等电聚焦胶条，以不导电的矿物油完全覆盖住胶条但又不溢出电泳槽。设定程序，进行一维等电聚焦电泳。

电泳程序如下：

限定最高电流50μA，限定最高温度20℃。共计97250Vh，共用时25小时30分钟。电压30V，保持10小时。电压200V，保持1小时。电压500V，保持1小时。电压从500V上升到1000V，用时1小时。电压从1000V上升到10000V，直到8000Vh。电压10000V，维持直至80000Vh。电压1000V，保持3小时。

取出胶条，吸去背面矿物油，有胶的一面朝上，另一面贴着内壁装入封筒中。

配置24cm x 20cm 12％SDS-PAGE电泳凝胶两块，凝固至少2 小时。

12％SDS-PAGE胶配方(250ml)：80ml ddH₂O，100ml 30％ PAGE溶液(丙烯酰胺：甲叉双丙烯酰胺＝29:1)，63ml 1.5M Tris-HCl (pH＝8.5)，2.5ml 10％SDS溶液，2.5ml 10％APS，100μL TEMED。

10x SDS-PAGE电泳缓冲液配方：30.2g Tris碱、140g甘氨酸、 10g SDS，用去离子水定容至1000ml。

在平衡液一(6mol/L尿素，75mmol/L Tris-HCl pH8.8，29.3％甘油，2％SDS，0.002％溴酚蓝，1％二硫苏糖醇)中孵育15分钟。

在平衡液二(6mol/L尿素，75mmol/L Tris-HCl pH8.8，29.3％甘油，2％SDS，0.002％溴酚蓝，2.5％IAA)中孵育15分钟。

安装胶条，加入marker开始二维SDS-PAGE电泳。

取融化的1％低熔点琼脂糖(琼脂糖溶解在1x SDS-PAGE电泳缓冲液中)填满SDS-PAGE胶上部空隙，赶尽气泡。从平衡液二中取出胶条，用去离子水、1x PAGE电泳缓冲液各1ml冲洗一遍。剪去胶条两端，小心塞入SDS-PAGE胶上部低熔点琼脂糖中，与SDS-PAGE 胶上沿紧贴。将滤纸剪成合适大小，滴上适量磷酸化蛋白Marker和预染Marker，塞入SDS-PAGE胶两端，与胶条相平。加入低熔点琼脂糖，填补空隙。安装电泳槽，限定功率2W开始电泳，时长15-16hr 直至预染Marker散开至合适位置，溴酚蓝条带跑到凝胶底部将近跑出SDS-PAGE凝胶。取下凝胶，泡入合适固定液中一块染色，一块转膜。

(5)western blot

取步骤(4)中的一块凝胶，用超纯水清洗，在电流为 21cm*25cm*0.8mA＝420mA，转膜50min(转膜仪Amersham)。

一抗的制备方法如下：

A.200位结核病人，抽取抗凝血，离心取上清，每人200微升混合。按照每100μl血浆:100微克大肠杆菌粉末的比例，加入预先制备好的大肠杆菌粉末(用于去除血浆中非特异性抗体)，混匀，4℃孵育过夜。离心收取上清，再用磁珠吸附方法去除血清中的杂蛋白。按照和原液血浆等体积用抗体稀释液1:100倍稀释，待用。

其中，所用大肠杆菌粉末参考如下方法制备：

接种E.coli BL21(DE3)至100mL LB培养基中，220rpm，37℃培养过夜，次日收集菌体；10mL PBS重悬E.coli BL21(DE3)菌体，再加入40mL预冷的丙酮，4℃条件下充分混匀；12000rpm，4℃离心10min收集菌体，使用丙酮洗涤两次；取出菌体放在干净的纸上待其自然风干备用。

B.磁珠吸附IgG处理方法

磁珠处理方法：

250μL ddH₂O洗涤50μL磁珠，500μL IgG Binding buffer(20mM Na₃PO₄，pH7.5)平衡50μL磁珠。

磁珠处理血清：

已处理磁珠(50μL)加入500μL血清混匀，室温孵育30min，分钟，然后置于磁力架上，弃上清。

50μL磁珠加入250μL 0.1M Gly-Hcl pH为2.7洗脱缓冲液洗脱，收集上清，使IgG与磁珠分离，收集上清。

在收集的上清中加入60μL Tris-Hcl pH为9.0中性缓冲液中和至 PH为7.0，分装-80℃保存，用时按照实际血浆1:500倍稀释。

二抗为Odyssey goat IgG(H&L)Antibody IRDye(货号： 605-430-002)，1:10000倍稀释。

健康人的二维凝胶western blot参照上面结核病人二维凝胶 western blot的步骤进行。

经全菌蛋白PAGE，上样量200μg，同时跑3块凝胶，第1块为原始SDS PAGE，用于对照。第2块用于转膜后与结核病人血浆 western blot，第3块用于转膜后与健康人血浆做western blot。

扫膜(Odyssey扫描仪)。

3.实验结果

扫膜的结果如图2A、图2B和图2C所示。

比较图2B和图2C的反应差异点(灰度比差异在1.5倍以上，或是有或无的差异选取)，在图2A的凝胶上切下对应的免疫反应差异点。经脱色，酶切，回收等步骤处理蛋白样品，最后溶解在0.1％的 TFA溶液中，点靶，将靶放入到UltraflexⅢMALDI-TOF/TOF质谱质谱仪中进行分析。质谱加速电压为20kv，串联质谱加速电压为9kv，以PeptideCalibStandard II为校准内参，质量扫描范围为m/z 700-4000Da。质谱鉴定，其中包含蛋白MYVA_1927(图2C中箭头所指)。

其中，蛋白MYVA_1927，在图2B和图2C中的差异为在健康人中没有反应点，在病人中一明显的反应点，MYVA_1927的等电点为 5.6，分子量大小为44kDa。MYVA_1927如图2C中箭头所指，图2B 中相应位置没有该蛋白(对应位置也用箭头标出)。该差异显示，相对于健康人，病人血清中含有较高的抗MYVA_1927的抗体，说明蛋白MYVA_1927可以作为检测结核病的分子标记物。

实施例3：细胞免疫试验

ELISPOT分析能够使单细胞分泌产物可视化。这些分析异常敏感，因为它是在直接在分泌细胞的周围进行捕捉，而且是在表面被冲淡，或者被临近的细胞上的受体捕获，或降解之前。自身免疫检测、器官移植、疫苗和药品的研发与检测、T细胞功能研究、肿瘤研究、传染病的研究和检测、病毒研究等等。具体原理是：细胞受到抗原刺激后产生细胞因子，此细胞因子抗原被特异单克隆抗体捕获。细胞分解后，被捕获的细胞因子与生物素标记的二抗结合，其后再与碱性磷酸酶标记的亲和素结合。BCIP/NBT底物孵育后，PVDF孔板出现“紫色”的斑点，表明细胞产生了细胞因子，通过ELISPOT酶联斑点分析系统对斑点的分析后得出结果。

结核病特异性抗原可以刺激外周淋巴细胞产生特异性细胞因子 IFN-γ，因此本实验以临床病人的检测为依托，对ESAT-6检测阳性的病人为研究主体，提取其PBMC，按ELISPOT检测方法进行鉴定。

1.实验材料和试剂

取实施例1中表达纯化的蛋白MYVA_1927，并参照实施例2的步骤(2)中的方法测定蛋白浓度，用纯化蛋白用的缓冲液(8M尿素， 100mM咪唑)调整浓度为500ng/μl，用于ELISPOT分析。

ELISPOT分析试剂盒：深圳达科生产的Human IFN-γprecoated Elispot Kit，货号：DKW22-1000-500。其中含有阳性对照ESAT-6。

细胞样品：ESAT-6检测阳性的病人的PBMC细胞，用淋巴细胞分离液(货号DKW-LSH-0250，深圳市达科为生物工程有限公司)分离细胞，并用PBS洗涤2次。其中，本实施例中肺结核病人的入选标准是满足下列条件中的任意一项：ESAT-6大于40，或者菌培或痰涂为阳性，或者PCR扩增阳性(PCR扩增的目的基因是结核分枝杆菌的保守序列片段IS6110，拷贝数2x105为阳性)，或者胸片或CT支持是结核病人。

入选实验对象的情况：如下面的表1。

表1：入选实验对象的情况

备注：表1中的“细菌学特征”一项中的细菌是指结核分枝杆菌。

无血清细胞培养基：DKW34-EU0100，深圳市达科为生物工程有限公司。

2.实验方法

参照ELISPOT分析试剂盒的说明书进行实验。

每位实验对象的PBMC细胞样品用无血清细胞培养基重悬，分配每孔100μl细胞悬液，细胞数2×10⁵。同时，加入待测蛋白样品，终浓度分别是5ng/孔；另外设通用阳性刺激物植物凝集素(PHA，10ng/ml) 一孔，只加细胞的空白对照一孔，加细胞并加蛋白稀释缓冲液对照一孔，阳性对照ESAT-6(来自试剂盒，终浓度是10ng/ml)一孔。盖上板，放细胞于5％CO₂孵箱，37℃培养15-20小时(在此期间不要摇动或平移平板)；

在洗涤槽上轻弹板子倒空液体，并在吸水纸上拍干；

每孔加100μl含0.1％Tween20的PBS，4℃放置2分钟；弃去液体，反复用含0.1％Tween20的PBS洗板5次，并彻底拍干；

加入已稀释好的100μl生物素标记的抗体(试剂盒自带)到10ml 含1％BSA的PBS中，每孔加100μl，将封闭板子放于37℃，1小时；倒空板子并用含0.1％Tween20的PBS洗5次，拍干；

稀释10μl链霉亲和素-碱性磷酸酶复合物(试剂盒自带)到10ml 含1％BSA的PBS中，每孔加100μl，封闭板子放于37℃，1小时；倒空，用含0.1％Tween20的PBS洗5遍，反复用吸水纸吸以去尽所有残存的液体。

每孔加100μl备用显色溶液，让反应在室温进行5-20分钟。肉眼可见小斑点形成。

用蒸馏水洗三次。

干燥每孔，计数斑点。板子放置于室温，并避免直接光照。

3.判定方法

由于目标蛋白的浓度是阳性对照的二分之一，设置读值大于25 个点判定为阳性(阳性对照的斑点数大于40)。

图3是蛋白的ELISPOT鉴定中对照设置及读值示意图。

4.实验结果

(1)初筛结果

初筛病人数为3位(P1-P3)，结果见表2。

表2：ELISPOT初筛实验结果

其中，平均反应强度＝蛋白反应斑点数/ESAT-6反应斑点数。

表2的结果显示，目的蛋白MYVA_1927的反应均为阳性且比较强，每个目标蛋白的斑点数(单个蛋白对应某位病人的PBMC形成的斑点数)与对照ESAT-6斑点数的平均超过60％。

(2)复验结果

参照上述方法，肺结核病人数20位(P4-P23，表1)，健康人对照10位(H1-H10，表1)。

实验结果如下面的表3和表4所示。

表3：20位肺结核病人验证MYVA_1927蛋白的ELISPOT结果

(斑点数)

表4：10个健康人重复验证MYVA_1927蛋白的ELISPOT结果

(单位：斑点数)

表3的结果显示，蛋白MYVA_1927与现今正在使用的阳性对照 ESAT-6均能刺激PBMC产生IFN-γ，较好地反映了MYVA_1927蛋白的IFN-γ释放功能。可见，MYVA_1927蛋白可以为vaccae疫苗株的有效成分之一，也可以作为结核病例如肺结核的疫苗候选物。

表4的结果显示，蛋白MYVA_1927在健康人的实验验证中反应点数很低，表现为阴性(均低于25)，具有较好的抗原特异性。

以上结果表明，以上目标蛋白MYVA_1927与ESAT-6的符合率 (ESAT-6阳性同时蛋白MYVA_1927也呈现阳性视为符合)较高，能成为筛选诊断MTB的理想靶抗原，可以作为细胞水平的免疫诊断分子标识。

主要参考文献

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2.Zhang,J.；Gou,H.；Hu,X.；Shang,M.；Zhou,J.；Zhou,Y.；Ye, Y.；Song,X.；Lu,X.；Chen,X.；Ying,B.；Wang,L.,Status of drug-resistant tuberculosis in China:Asystematic review and meta-analysis.Am J Infect Control 2016Mar 1.doi:10.1016/j.ajic.2015.12.042.[Epub ahead of print].

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尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员能够理解，根据已经公开的所有教导，可以对一些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国医学科学院病原生物学研究所

<120> 一种结核病疫苗候选组分以及含有该组分的疫苗

<130> NNF1703

<160> 4

<170> PatentIn version 3.2

<210> 1

<211> 319

<212> PRT

<213> Mycobacterium vaccae

<400> 1

Met Pro Val Asp Val Thr Leu Thr Glu Ala Glu Thr Asp Ala Leu Arg

1 5 10 15

Lys Trp Val Gln Gly Ser Gly Ile Gly Ser Thr Val Thr Asp Val Ala

20 25 30

Pro Leu Thr Gly Gly Ser Gln Asn Ile Val Val Arg Leu Arg Val Asp

35 40 45

Gly Glu Pro Met Val Leu Arg Arg Pro Pro Gln His Pro Arg Pro Thr

50 55 60

Ser Asp Asn Thr Met Arg Arg Glu Ile Ala Val Leu Gln Thr Leu Lys

65 70 75 80

Gly Thr Ala Val Pro His Pro Glu Leu Ile Ala Gly Cys Glu Asp Leu

85 90 95

Ser Val Leu Gly Val Val Phe Tyr Leu Met Glu Ala Val Asp Gly Phe

100 105 110

Asn Pro Gly Thr Glu Val Asp Gln Ala Tyr Val Arg Asp Ala Gly Met

115 120 125

Arg His Arg Val Gly Thr Ser Tyr Ala Ala Ser Leu Ala Glu Leu Gly

130 135 140

Lys Val Ala Trp Gln Gly Ser Pro Leu Ala Ala Leu Lys Arg Pro Gly

145 150 155 160

Ser Phe Leu Ala Arg Gln Val Pro Gln Phe Met Arg Leu Leu Glu Ser

165 170 175

Tyr Arg His Asp Asn Tyr Ala Pro Glu Ser Phe Pro Ser Val His Val

180 185 190

Leu Ala Asp Trp Leu Asp Ser Arg Arg Pro Asp Asp Ala Glu Pro Gly

195 200 205

Ile Met His Gly Asp Cys His Leu Asn Asn Val Leu Leu Arg Arg Asp

210 215 220

Val Pro Glu Leu Ala Ala Phe Ile Asp Trp Glu Met Cys Thr Val Gly

225 230 235 240

Asp Pro Leu Leu Asp Leu Gly Trp Met Leu Val Cys Trp Pro Asp Gly

245 250 255

Pro Asn Pro Ile Asp Ala Gly Ala Glu Leu Ala Ala Leu Gly Gly Leu

260 265 270

Ala Thr Arg Ala Glu Leu Ile Glu Ala Tyr Leu Asp Ala Gly Gly Arg

275 280 285

Arg Thr Ser Arg Leu Asp Trp Tyr Ile Ala Met Ala Cys Phe Lys Leu

290 295 300

Ala Ile Val Ile Glu Gly Thr Trp Ser Arg His Leu Ala Gly Gln

305 310 315

<210> 2

<211> 957

<212> DNA

<213> Mycobacterium vaccae

<400> 2

atgccggtgg atgtgacgct gaccgaggcc gagaccgacg cgctgcggaa gtgggtgcag 60

gggagcggga tcgggtccac ggtcaccgac gtcgcaccgc tgaccggcgg atcgcagaac 120

atcgtggtgc gcctgcgggt ggacggtgag ccgatggtgc tgcgccgacc gccgcaacac 180

ccgcggccga cgagcgacaa caccatgcgc cgagagatcg cggtgctgca gacactgaag 240

ggcaccgcgg tgccgcaccc ggaactgatc gccggatgcg aggacctcag cgtgctcggg 300

gtggtgttct atctgatgga ggcggtcgac gggttcaacc ccggcaccga ggtcgaccag 360

gcctacgtcc gtgacgccgg catgcgtcac cgcgtcggga cgtcctacgc ggcgagcctg 420

gccgagctcg gcaaggtggc ctggcagggc agtccgctgg ccgcgctgaa acgtccggga 480

tcctttctgg cacgccaggt tccgcagttc atgcggctgc tggagagtta ccggcacgac 540

aactacgcgc ccgagtcgtt cccgtcggtg catgtgctcg ccgactggct ggactcgcgc 600

aggcccgacg acgccgaacc cgggatcatg cacggcgact gccatctgaa caacgtgctg 660

ctgcgccgcg acgtccccga gctcgcggcg ttcatcgact gggagatgtg caccgtcggg 720

gacccgttgc tcgacctcgg gtggatgctg gtgtgctggc cggacggacc caacccgatc 780

gacgccggag cggaactggc tgccctcggc gggctggcga ccagggccga actgatcgag 840

gcctacctgg atgcgggcgg gcgccggacg tcgcgactgg actggtacat cgcgatggcg 900

tgtttcaaac tcgcgatcgt catcgagggc acctggtcgc gccacctggc cgggcag 957

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物序列

<400> 3

atgccggtgg atgtgacgct 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物序列

<400> 4

tcacccgaac gggttgtcgc 20

Claims (2)

1.蛋白在制备诊断结核病的药物中的用途，其中，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示。

2.根据权利要求1所述的用途，其中，所述结核病为肺结核。

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