CN109843321A - 作为结核病疫苗的重组巨细胞病毒载体 - Google Patents

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Abstract

本公开提供了编码包含结核分枝杆菌(Mtb)抗原的融合蛋白的巨细胞病毒载体、编码所述融合蛋白的核酸分子、包含核酸分子的巨细胞病毒载体、包含它们的组合物以及引发针对结核病的免疫应答的方法。

Description

作为结核病疫苗的重组巨细胞病毒载体
技术领域
本公开部分涉及编码包含结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)(Mtb)抗原的融合蛋白的巨细胞病毒载体、编码所述融合蛋白的核酸分子、包含核酸分子的巨细胞病毒载体、包含它们的组合物以及引发针对结核病的免疫应答的方法。
背景技术
结核病(TB)是每年导致8百万新病例和2百万死亡的全球健康问题。多重耐药性和完全耐药性TB菌株的出现只会使这一问题更严重。Mtb的生命周期具有3个阶段。在初始感染后的急性期，细菌在宿主中复制并表达毒力因子，从而导致宿主产生免疫应答。随着免疫应答开始控制感染，Mtb进入潜伏的无症状状态，其中细菌变得不复制并被包裹在肉芽肿中。细菌可在感染的个体中以这种潜伏状态存在多年，从而使得疾病的诊断和治疗变得困难。在一些情况下，细菌被重新活化并再次开始复制，从而导致回至疾病状态。再活化可出于多种原因发生，包括由诸如HIV的疾病引起的免疫抑制、诸如化学疗法的治疗或由于衰老所致的免疫系统的减弱。在世界范围内估计20亿人潜伏感染Mtb，并且潜伏Mtb的再活化产生活动性TB疾病的大多数新病例。再活化与肺部的炎症、坏死和成洞相关联，这一过程导致病变排出至支气管中。当患有支气管病变的个体咳嗽时产生的气溶胶导致将Mtb生物体传播至未感染、易患病的个人，并且传输循环因而得以维持。
抗御TB的目前唯一可用的疫苗(牛分枝杆菌(卡介苗)(BCG))首次在1921年引入。BCG已经广泛地利用并且虽然研究表明对于一些用途，BCG是有效的(例如针对婴儿中的散播性TB)，但是已知它对于预防成人中的潜伏TB的发展、持续和再活化是无效的。持续需要开发针对TB的改进的、更有效的疫苗。
使用巨细胞病毒(CMV)载体(例如，恒河猴CMV(RhCMV)和人CMV(HCMV))具有特别的优点。首先，CMV引发惊人的高频率(稳态)T细胞应答，至少比大多数非持久性病毒的应答高一个数量级(CMV特异性T细胞涵盖>20％的循环记忆库的情况并不少见)，并且CMV特异性T细胞(在它涉及CMV驱动的非CMV抗原时)的表现在诸如肺和肝的组织中甚至更高。此外，上述应答无限期地持续存在。CMV还能够重新感染已经慢性感染的个体，即使面对预先存在的免疫应答，并且这种被重组CMV再感染也能够诱导对不同CMV编码的外源蛋白的新的应答。CMV还仅在免疫缺陷、不成熟或血清阴性孕妇的非常特定的情况下产生致病性(它的疾病潜力在潜在人病原体中最好的记录)。最后，CMV感染在大多数人中普遍存在。
虽然疫苗常常有效地使个体针对病原体感染或人疾病预防性或治疗性免疫，但是仍需要改进的疫苗和载体。还需要产生增强的免疫应答的组合物和方法。同样，虽然一些免疫治疗剂可用于调节患者的免疫应答，但是仍需要改进的免疫治疗组合物和方法。
发明内容
本公开提供了重组RhCMV或HCMV载体，其包含编码可表达的Mtb抗原的核酸序列，所述Mtb抗原选自Ag85A-Ag85B-Rv3407、Rv1733-Rv2626c、RpfA-RpfC-RpfD、Ag85B-ESAT6和Ag85A-ESAT6-Rv3407-Rv2626c-RpfA-RpfD。
本公开还提供了药物组合物，其包含本文所述的重组RhCMV或HCMV疫苗载体和药学上可接受的载体。
本公开还提供了用于治疗或预防结核病的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用至少一种本文所述的重组RhCMV或HCMV疫苗载体。
本公开还提供了用于引发对Mtb抗原的免疫应答的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用至少一种本文所述的重组RhCMV或HCMV疫苗载体。
本公开还提供了用于引发对Mtb抗原的CD8+或CD4+ T细胞应答的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用至少一种本文所述的重组RhCMV或HCMV疫苗载体。
本公开还提供了选自Ag85B-ESAT6和Ag85A-ESAT6-Rv3407-R v2626c-RpfA-RpfD的Mtb抗原。
附图说明
图1示出含有各种TB构建体的BCG和恒河猴CMV载体的免疫原性；在整个疫苗接种期间通过细胞内细胞因子染色对通过疫苗接种诱导的免疫应答进行分析；示出了表达IFNγ或TNF的记忆细胞的百分比；CD4+ T细胞在上图中示出，并且CD8+ T细胞在下图中示出。
图2(图a、b、c和d)示出在整个疫苗接种期间通过细胞内细胞因子染色分析的ESAT-6特异性应答；上面示出表达IFNγ或TNF的记忆细胞的百分比；包括了来自外周血单核细胞(PBMC；在图a和b中示出)和支气管肺泡灌洗细胞(BAL；在图c和d中示出)的应答；CD4+ T细胞在图a和c中示出，并且CD8+ T细胞在图b和d中示出。
图3(图a、b、c和d)示出在整个疫苗接种期间通过细胞内细胞因子染色分析的Rv1733特异性应答；上面示出表达IFNγ或TNF的记忆细胞的百分比；包括了来自外周血单核细胞(PBMC；在图a和b中示出)和支气管肺泡灌洗细胞(BAL；在图c和d中示出)的应答；CD4+ T细胞在图a和c中示出，并且CD8+ T细胞在图b和d中示出。
图4(图a、b、c和d)示出在整个疫苗接种期间通过细胞内细胞因子染色分析的RpfC特异性应答；上面示出表达IFNγ或TNF的记忆细胞的百分比；包括了来自外周血单核细胞(PBMC；在图a和b中示出)和支气管肺泡灌洗细胞(BAL；在图c和d中示出)的应答；CD4+T细胞在图a和c中示出，并且CD8+ T细胞在图b和d中示出。
图5(图a、b、c和d)示出在整个疫苗接种期间通过细胞内细胞因子染色分析的Ag85B特异性应答；上面示出表达IFNγ或TNF的记忆细胞的百分比；包括了来自外周血单核细胞(PBMC；在图a和b中示出)和支气管肺泡灌洗细胞(BAL；在图c和d中示出)的应答；CD4+T细胞在图a和c中示出，并且CD8+ T细胞在图b和d中示出。
图6(图a和b)示出在整个疫苗接种期间通过细胞内细胞因子染色分析的Ag85A特异性应答；上面示出表达IFNγ或TNF的记忆细胞的百分比；包括了来自外周血单核细胞的应答；CD4+ T细胞在图a中示出，并且CD8+ T细胞在图b中示出。
图7(图a和b)示出在整个疫苗接种期间通过细胞内细胞因子染色分析的Rv3407特异性应答；上面示出表达IFNγ或TNF的记忆细胞的百分比；包括了来自外周血单核细胞的应答；CD4+ T细胞在图a中示出，并且CD8+ T细胞在图b中示出。
图8(图a和b)示出在整个疫苗接种期间通过细胞内细胞因子染色分析的Rv2626特异性应答；上面示出表达IFNγ或TNF的记忆细胞的百分比；包括了来自外周血单核细胞的应答；CD4+ T细胞在图a中示出，并且CD8+ T细胞在图b中示出。
图9(图a和b)示出在整个疫苗接种期间通过细胞内细胞因子染色分析的RpfD特异性应答；上面示出表达IFNγ或TNF的记忆细胞的百分比；包括了来自外周血单核细胞的应答；CD4+ T细胞在图a中示出，并且CD8+ T细胞在图b中示出。
图10(图a和b)示出在整个疫苗接种期间通过细胞内细胞因子染色分析的RpfA特异性应答；上面示出表达IFNγ或TNF的记忆细胞的百分比；包括了来自外周血单核细胞的应答；CD4+ T细胞在图a中示出，并且CD8+ T细胞在图b中示出。
图11(图a和b)示出通过流式细胞术进行表型分析并分类为初始、Tcm(中心记忆)、TrEM(移行效应记忆)或Tem(效应记忆)T细胞的Ag85B特异性细胞；CD4+ T细胞在图a中示出，并且CD8+ T细胞在图b中示出；在BCG疫苗接种后的平稳期，在316/318天进行分析。
图12示出在阻断MHC I(红色)或MHC II(蓝色)的抗体存在下用抗原刺激的T细胞；通过BCG诱导的CD8+ T细胞应答主要通过阻断MHC I来抑制；相比之下，通过RhCMV 68-1诱导的应答主要通过阻断MHC II来抑制。
图13示出各种功效标准配对之间的相关性；每个分析中还包括斜率(rs)和p值。
图14示出未疫苗接种的组和RhCMV/TB组中来自NHP的代表性CT扫描。
图15示出在所指示的时间点(或者，在尸检时，对于用空心符号显示的数据点)存在的实质性疾病的体积。
图16(图a、b和c)示出总体(图a)、单独肺部中(图b)和肺引流淋巴结中(图c)的尸检评分。
图17(图a、b、c和d)示出来自肺/气管(浅蓝色)、引流淋巴结(红色)、外周淋巴结(深蓝色)和肺外组织(绿色)的随机样品中存在的细菌负荷(CFU/g组织)；示出了来自每组的代表性NHP，包括未疫苗接种的(图a)、BCG(图b)、CMV(图c)和BCG+CMV(图d)。
图18示出来自NHP的随机活检中存在的Mtb培养阳性样品的数量；总体培养评分分为肺部和非肺部隔室。
图19(图a和b)示出进一步分为肺引流淋巴结样品(图a)和非肺部相关样品(图b)的非肺部样品；非肺部相关样品包括肝脏、肾脏和脾脏。
图20(图a、b、c、d、e和f)示出所有肺引流淋巴结(图a)以及特定肺引流淋巴结(图b、c和d)中的细菌负荷；还包括了脊下(图e)和肺门(图f)淋巴结的肉芽肿评分。
图21示出在整个疫苗接种期的不同时间点显示针对每种抗原的T细胞应答。
图22示出在整个疫苗接种期的不同时间点显示的针对每种抗原的CD4 T细胞应答与肺外扩散程度之间的相关性。
图23示出在整个疫苗接种期的不同时间点显示的针对每种抗原的CD8 T细胞应答与肺外扩散程度之间的相关性。
图24(图a、b、c和d)示出通过检测从头免疫应答的感染。用RhCMV裂解物(图a和b)或CFP肽(图c和d)刺激PBMC；通过细胞内细胞因子染色对应答进行分析；示出表达IFNγ或TNF的记忆细胞的百分比；包括了来自外周血单核细胞的应答；示出CD4+(图a和c)和CD8(图b和d)T细胞应答。
图25(图a、b、c、d、e和f)示出在激发后分析的RhCMV诱导的免疫应答；用ESAT6(图a和b)、Ag85B(图c和d)和Rv1733(图e和f)刺激PBMC；通过细胞内细胞因子染色对应答进行分析；示出表达IFNγ或TNF的记忆细胞的百分比；CD4+(图a、c和e)和CD8+(图b、d和f)T细胞应答。
图26(图a、b、c和d)示出在尸检后分析的各种隔室中的总RhCMV诱导的免疫应答(图a和b)和由感染诱导的从头CFP10应答(图c和d)；上面示出表达IFNγ或TNF的记忆细胞的百分比。
图27示出在尸检后分析的各种隔室中的单独抗原特异性CD4+T细胞应答；上面示出表达IFNγ或TNF的记忆细胞的百分比。
图28示出在尸检后分析的各种淋巴结中的单独抗原特异性CD4+ T细胞应答；上面示出表达IFNγ或TNF的记忆细胞的百分比。
图29示出在尸检后分析的各种隔室中的总RhCMV诱导的免疫应答；图c和d示出由感染诱导的从头CFP10应答；上面示出表达IFNγ或TNF的记忆细胞的百分比。
图30示出在尸检后分析的各种隔室中的单独抗原特异性CD8+T细胞应答；上面示出表达IFNγ或TNF的记忆细胞的百分比。
图31示出在尸检后分析的各种淋巴结中的单独抗原特异性CD8+ T细胞应答；上面示出表达IFNγ或TNF的记忆细胞的百分比。
图32示出将脾CD4+ T细胞应答与培养阳性淋巴结的数量进行比较的相关分析。
图33示出在整个疫苗接种期通过细胞内细胞因子染色分析的疫苗接种诱导的免疫应答；示出表达IFNγ或TNF的记忆细胞的百分比；包括了来自外周血单核细胞的应答；示出CD4+ T细胞和CD8+ T细胞；数据点代表所测定的抗原的总和，所述抗原在图下面指示。
图34示出通过仅对每种载体中存在的那些抗原(在图下面注明的抗原)进行求和而在载体之间归一化的疫苗接种诱导的免疫应答；在整个疫苗接种期通过细胞内细胞因子染色对应答进行分析；示出表达IFNγ或TNF的记忆细胞的百分比；包括了来自外周血单核细胞的应答；示出CD4+ T细胞和CD8+ T细胞。
图35(图a和b)示出在整个疫苗接种期通过细胞内细胞因子染色分析的由疫苗接种诱导的免疫应答；示出表达IFNγ或TNF的记忆细胞的百分比；包括了来自BAL的应答；CD4+ T细胞在图a中示出，并且CD8+ T细胞在图b中示出；数据点代表所测定的抗原的总和，所述抗原在图下面指示。
图36示出在Mtb激发后的外周血CFP10特异性T细胞应答。
图37示出来自纵向CT扫描的临床结果数据，其用于量化激发后存在的肺病的体积。
图38示出尸检评分。
图39示出培养评分。
图40示出菌株68-1 RhCMV/TB载体的总体功效。
图41示出菌株68-1 RhCMV/TB-6Ag单一载体疫苗接种中的晚期疾病消退。
图42(图a、b、c、d、e和f)示出研究3的RhCMV/TB和BCG疫苗的免疫原性。
图43(图a、b、c、d、e和f)示出研究3的Mtb激发的结果。
图44(图a、b、c、d、e、f和g)示出研究4的RhCMV/TB疫苗的免疫原性。
图45(图a、b、c、d、e、f、g和h)示出研究4和总体的Mtb激发的结果。
图46(图a、b和c)示出研究3和4中使用的RhCMV/TB载体。
图47(图a、b和c)示出在Mtb激发后从头Mtb特异性CD8+ T细胞应答的发展。
图48示出在尸检时TB疾病的病理学评分。
图49(图a、b、c、d和e)示出结果统计的总结。
图50(图a、b、c和d)示出TB感染结果的不同测量值的比较。
图51示出在研究3的尸检时TB疾病结果的总结。
图52示出研究4中RhCMV/TB载体引发的CD8+ T细胞应答的MHC-限制性分析。
图53(图a和b)示出在尸体剖检时非疫苗引发的Mtb特异性CD4+和CD8+ T细胞应答的分析。
图54示出在研究4的尸检时结果的总结。
图55(图a、b和c)示出研究3和4的免疫相关性分析。
具体实施方式
本文所使用的术语仅仅出于描述具体实施方案的目的，并且不意图是限制性的。
除非上下文另外清楚地指示，否则如本文所用，单数形式“一个/种(a/an)”和“所述”包括复数个指示物。
对于本文的数值范围的叙述来说，明确地涵盖具有相同精确度的介于其间的每个中间数字。例如，对于6-9的范围来说，除6和9之外，还涵盖数字7和8，并且对于范围6.0-7.0来说，明确地涵盖数字6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9和7.0。
如本文所用，“佐剂”是指添加至本文所述的任何组合以增强Mtb抗原的免疫原性的任何分子。
如本文所用，“编码序列”或“编码核酸”是指包含编码Mtb抗原的核苷酸序列的核酸(RNA或DNA分子)。编码序列还可包含可操作地连接至调控元件的起始信号和终止信号，所述调控元件包括能够在施用核酸的个体或哺乳动物的细胞中指导表达的启动子和聚腺苷酸化信号。
如本文所用，“共有”或“共有序列”是指基于特定Mtb抗原的多种亚型的比对的分析的多肽序列。可制备编码共有多肽序列的核酸序列。包含Mtb抗原可被用来诱导针对特定抗原的多种亚型或血清型的广泛免疫，所述疫苗包含编码此类抗原的共有序列和/或核酸分子。在一些实施方案中，共有序列可以是最常见的序列。
如本文所用，“电穿孔”是指使用跨膜电场脉冲来诱导生物膜中的微观途径(孔隙)；所述微观途径的存在允许生物分子如质粒、寡核苷酸、siRNA、药物、离子以及水从细胞膜的一侧穿至另一侧。
如本文所用，相对于核酸序列的“片段”是指编码与全长野生型Mtb抗原交叉反应的能够在哺乳动物中引发免疫应答的Mtb抗原的一部分的核酸序列或其一部分。所述片段可以是选自编码下文所述的蛋白质片段的各种核苷酸序列中的至少一种的DNA片段。例如，多核苷酸可包含本文公开的一种或多种序列的至少约15、20、30、40、50、75、100、150、200、300、400、500或1000或更多个连续核苷酸以及其间的所有中间长度。将容易理解的是，在这种情况下，“中间长度”是指引用值之间的任何长度，如16、17、18、19等；21、22、23等；30、31、32等；50、51、52、53等；100、101、102、103等；150、151、152、153等；包括200至500的所有整数；500至1,000等。
如本文所用，关于多肽序列的“片段”或“免疫原性片段”是指与全长野生型毒株Mtb抗原交叉反应的能够在哺乳动物中引发免疫应答的MTB抗原的一部分。共有或野生型Mtb抗原的片段可包含共有或野生型Mtb抗原的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％。在一些实施方案中，共有蛋白的片段可包含共有或野生型蛋白的至少20个氨基酸或更多、至少30个氨基酸或更多、至少40个氨基酸或更多、至少50个氨基酸或更多、至少60个氨基酸或更多、至少70个氨基酸或更多、至少80个氨基酸或更多、至少90个氨基酸或更多、至少100个氨基酸或更多、至少110个氨基酸或更多、至少120个氨基酸或更多、至少130个氨基酸或更多、至少140个氨基酸或更多、至少150个氨基酸或更多、至少160个氨基酸或更多、至少170个氨基酸或更多、至少180个氨基酸或更多。
如本文所用，“遗传构建体”是指包含编码Mtb抗原的核苷酸序列的DNA或RNA分子。所述编码序列包含可操作地连接至调控元件的起始信号和终止信号，所述调控元件包括能够在施用核酸分子的个体的细胞中指导表达的启动子和聚腺苷酸化信号。
如本文所用，“可表达形式"是指含有可操作连接至编码Mtb抗原的编码序列的必需调控元件的基因构建体，以使得当存在于个体的细胞中时，编码序列将被表达。
如本文所用，“同源性”是指核酸分子的互补性程度。可存在部分同源性或完全同源性(即，同一性)。至少部分地抑制完全互补序列杂交于靶核酸的部分互补序列是使用功能术语“基本上同源”来提及。当关于如cDNA或基因组克隆的双链核酸序列使用时，术语“基本上同源”是指探针可在低严格性条件下杂交于双链核酸序列的链。当关于单链核酸序列使用时，术语“基本上同源”是指探针可在低严格性条件下杂交于单链核酸模板序列(即，是单链核酸模板序列的互补序列)。
如本文所用，在两种或更多种核酸或多肽序列的背景下“相同的”或“同一性”是指序列具有指定百分比的在指定区上相同的残基。可通过以下来计算所述百分比：最优比对两个序列，在指定区域上比较两个序列，确定在两个序列中出现相同残基的位置的数目以产生匹配位置的数目，用匹配位置的数目除以指定区中的位置的总数目，并且将结果乘以100以产生序列同一性的百分比。在两个序列具有不同的长度或者比对产生一个或多个交错的末端并且比较的指定区域仅包含单个序列的情况下，单个序列的残基被包括在计算的分母中而不是分子中。当比较DNA和RNA时，胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)残基可被认为是等同的。同一性和/或同源性可手动地或者通过使用计算机序列算法如BLAST或者BLAST 2.0来执行。
如本文所用，“免疫应答”是指响应于Mtb抗原的引入，宿主的免疫系统(例如，哺乳动物的免疫系统)的活化。免疫应答可以是细胞应答或体液应答或两者的形式。
如本文所用，“分离的”是指多核苷酸基本上远离其他编码序列，并且核酸区段不含有大部分无关编码DNA，如大染色体片段或其他功能基因或多肽编码区。当然，这是指最初分离的核酸区段，并且不排除随后通过人工添加至所述区段中的基因或编码区。
如本文所用，“Mtb抗原”是指来自结核分枝杆菌的抗原，其可以是分离的抗原，或与一种或多种其他抗原形成融合蛋白的一部分的抗原。
如本文所用，“分枝杆菌”是指需氧细胞内细菌生物的属。在宿主侵入后，这些生物在单核细胞和巨噬细胞的内体区室内存活。人分枝杆菌疾病包括结核病(由结核分枝杆菌(Mtb)引起)、麻风病(由麻风分枝杆菌(M.leprae)引起)、Bairnsdale溃疡(由溃疡分枝杆菌(M.ulcerans)引起)以及可由海洋分枝杆菌(M.marinum)、堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)、瘰疬分支杆菌(M.scrofulaceum)、苏尔加分枝杆菌(M.szulgai)、蟾分枝杆菌(M.xenopi)、偶然分枝杆菌(M.fortuitum)、嗜血分枝杆菌(M.haemophilum)、龟分枝杆菌(M.chelonei)和胞内分枝杆菌(M.intracelluare)引起的其他感染。先前被认为是非致病性的分枝杆菌菌株(如鸟分枝杆菌(M.avium))现在也已知是免疫抑制AIDS患者的主要杀手。对分枝杆菌的主要应答涉及与T细胞和巨噬细胞的细胞介导的超敏反应(DTH)，其在细胞内杀伤和阻断(或含有)生物体(肉芽肿形成)中起主要作用。主要T细胞应答涉及识别分枝杆菌热休克蛋白和免疫显性抗原的CD4+淋巴细胞。
如本文所用，“核酸”或“寡核苷酸”或“多核苷酸”是指共价连接在一起的至少两个核苷酸，其已被分离，不含特定物种的总基因组DNA。这些术语内包括核酸区段和此类区段的较小片段，以及还有重组CMV载体。单链的描绘也定义了互补链的序列。因此，核酸还涵盖所描绘的单链的互补链。核酸的许多变体可用于与给定核酸相同的目的。因此，核酸还涵盖了基本上相同的核酸及其补体。单链提供可在严格杂交条件下与靶序列杂交的探针。因此，核酸还涵盖了在严格杂交条件下杂交的探针。核酸可以是单链的或者双链的，或可含有双链序列和单链序列两者的部分。核酸可以是DNA、基因组和cDNA两者、RNA或杂合体，其中所述核酸可含有脱氧核糖核苷酸与核糖核苷酸的组合，以及包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌啉、肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、异胞嘧啶以及异鸟嘌呤的碱基的组合。核酸可通过化学合成方法或者通过重组方法来获得。如本领域技术人员所理解的，核酸分子可包括表达或可适于表达蛋白质、多肽、肽等的基因组序列、基因组外和质粒编码的序列以及较小的工程化基因区段。此类片段可以是天然分离的，或通过人工合成地修饰。
如本文所用，“可操作地连接”是指基因的表达在与之在空间上连接的启动子的控制下。启动子可位于受其控制的基因的5'(上游)或3'(下游)。启动子与基因之间的距离可与所述启动子与其所控制的基因(即启动子的来源基因)之间的距离大约相同。如本领域所已知，这个距离的变化可在没有失去启动子功能的情况下进行调整。
如本文所用，“启动子”是指能够在细胞中赋予、活化或增强核酸的表达的合成或天然来源的分子。启动子可包含一个或多个特异性转录调控序列以进一步增强表达和/或改变其空间表达和/或时间表达。启动子还可包含远端增强子或阻遏子元件，它们可位于与转录起始位点相距多达数千个碱基对处。启动子可源自包括病毒、细菌、真菌、植物、昆虫以及动物的来源。启动子可调控基因组分相对于其中发生表达的细胞、组织或器官或相对于发生表达所处的发育阶段或响应于外部刺激(如生理应激、病原体、金属离子或诱导剂)而组成型地或差异性地表达。
如本文所用，可互换使用的“信号肽”和“前导序列”是指可被连接在本文所述的Mtb抗原蛋白的氨基末端的氨基酸序列。信号肽/前导序列通常指导蛋白质的定位。本文所用的信号肽/前导序列优选地促进蛋白质从产生其将其锚定在膜中的细胞中分泌。信号肽/前导序列常常从蛋白质的剩余部分裂解，所述蛋白质在从细胞分泌后经常被称为成熟蛋白质。信号肽/前导序列连接在所述蛋白质的N末端。
如本文所用，“严格杂交条件”是指在其下第一核酸序列(例如，探针)将与第二核酸序列(例如，靶标)如在核酸的复杂混合物中杂交的条件。严格的条件是序列依赖性的并且在不同的环境中将是不同的。严格条件可经选择比限定离子强度pH下特定序列的热熔点(Tm)低约5℃至10℃。Tm可以是在所述温度下处于平衡时50％互补于靶标的探针杂交于靶标序列(因为靶标序列过量存在，所以在Tm下，在平衡时50％的探针被占据)的温度(在限定的离子强度、pH以及核酸浓度下)。严格条件可以是那些条件，即其中盐浓度小于约1.0M的钠离子，如在pH 7.0至8.3下约0.01至1.0M的钠离子浓度(或其它盐)，并且温度对于短的探针(例如，约10至50个核苷酸)为至少约30℃且对于长的探针(例如，大于约50个核苷酸)为至少约60℃。严格条件还可通过添加去稳定剂如甲酰胺来实现。对于选择的或特定的杂交，阳性信号可以是本底杂交的至少2至10倍。示例性严格杂交条件包括以下：50％甲酰胺、5xSSC以及1％SDS，在42℃下孵育；或者5x SSC、1％SDS，在65℃下孵育，在65℃下用0.2x SSC和0.1％SDS洗涤。
如本文所用，“基本上互补”是指第一序列在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、180、270、360、450、540或更多个核苷酸或氨基酸的区域内与第二序列的补体至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％相同，或者是指两个序列在严格杂交条件下杂交。
如本文所用，“基本上相同”是指第一序列和第二序列在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、180、270、360、450、540或更多个核苷酸或氨基酸的区域内是至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的，或者就核酸而言，如果第一序列与第二序列的补体基本上互补，则第一序列和第二序列基本上相同。
如本文所用，“结核病”意指通常由结核分枝杆菌引起的疾病，其通常感染肺部。然而，其他“非典型”分枝杆菌如堪萨斯分枝杆菌可能产生类似的疾病临床和病理表现。结核分枝杆菌的传播在通风不良的狭窄区域中通过空气传播途径发生。在超过90％的病例中，在结核分枝杆菌感染后，免疫系统防止来自结核分枝杆菌)的疾病(通常称为活动性结核病)的发展。然而，并非所有结核分枝杆菌都被杀死，并且因此形成微小的硬胶囊。“原发性结核病”被视为初次感染后发展的疾病，通常在儿童中。感染的初始焦点是小的胸膜下肉芽肿伴有肉芽肿性肺门淋巴结感染。这些一起构成了高恩综合症(Ghon complex)。在几乎所有情况下，这些肉芽肿都会消退，并且感染没有进一步扩散。“继发性结核病”在成人中主要被视为先前感染(或再感染)的再活化，特别是当健康状况下降时。肉芽肿性炎症更为旺炽和广泛。通常，上肺叶受到的影响最大，并且可能发生成洞。在肺外的结核病播散可导致出现许多具有特征模式的罕见发现，包括骨骼结核、生殖道结核、泌尿道结核、中枢神经系统(CNS)结核、胃肠结核、肾上腺结核、淋巴结核和贲门结核。“潜伏”结核病是个体中的Mtb感染，其可通过诊断测定如但不限于结核菌素皮肤测试(TST)进行检测，其中所述感染不会在所述个体中产生症状。“活动性”结核病是受试者中有症状的Mtb感染。在显微镜下，在TB感染情况下产生的炎症是肉芽肿性的，伴随上皮样巨噬细胞，并且郎汉斯(Langhans)巨细胞以及淋巴细胞、浆细胞可能是少数多形核细胞、具有胶原的成纤维细胞，以及中心的特征性干酪样坏死。炎症应答由IV型超敏反应介导，并且皮肤测试是基于这种反应。在一些实例中，结核病可通过皮肤测试、抗酸染色、金胺染色或其组合来诊断。所筛查的最常见的标本是痰液，但组织学染色也可对组织或其他体液进行。
如本文所用，关于核酸的“变体”是指i)参考核苷酸序列的一部分或片段；ii)参考核苷酸序列或其部分的补体；iii)与参考核酸或其互体大致上相同的核酸；或者iv)在严格条件下与参考核酸、其补体或与其大致上相同的序列杂交的核酸。
如本文所用，关于肽或多肽的“变体”是指所述肽或多肽因氨基酸的插入、缺失或保守取代而在氨基酸序列上不同但保留至少一种生物活性。变体还可指具有与参考蛋白质大致上相同的氨基酸序列的蛋白质，所述参考蛋白质具有保留至少一种生物活性的氨基酸序列。氨基酸的保守性取代，即用具有类似性质(例如，亲水性、带电区域的程度和分布)的不同氨基酸置换氨基酸，在本领域中被认为通常涉及微小变化。可与生物功能相容的氨基酸取代被理解为取决于所述氨基酸的相对类似性，并且特别是那些氨基酸的侧链的相对类似性，如通过疏水性、亲水性、电荷、大小及其他性质所揭示。术语“变体”还涵盖异种起源的同源基因。
如本文所用，“CMV载体”是指引入宿主细胞中、从而产生转化的宿主细胞的CMV核酸分子。CMV载体可包括允许其在宿主细胞中复制的核酸序列，如复制起点。CMV载体还可包括一种或多种选择性标记基因和本领域已知的其他遗传元件。
本公开提供了重组RhCMV或HCMV载体，其包含编码可表达的Mtb抗原的核酸分子，所述Mtb抗原选自Ag85A-Ag85B-Rv3407、Rv1733-Rv2626c、RpfA-RpfC-RpfD、Ag85B-ESAT6和Ag85A-ESAT6-Rv3407-Rv2626c-RpfA-RpfD。在一些实施方案中，编码任何特定M tb抗原的核酸分子可以是分枝杆菌序列、细菌密码子优化的序列(如大肠杆菌优化的序列)或哺乳动物优化的序列(如人优化的序列)。密码子优化的方法(无论是用于细菌还是哺乳动物)是本领域技术人员所熟知的。
在本文列出的核酸分子的任何实施方案中，单独Mtb核酸序列可以任何顺序存在。例如，对于包含Ag85A、Ag85B和Rv3407抗原的融合蛋白，第一(或N-末端)核酸分子可编码Ag85A、Ag85B或Rv3407；第二核酸分子可编码Ag85A、Ag85B或Rv3407(无论哪一种都不是第一Mtb抗原)；并且第三核酸分子可编码Ag85A、Ag85B或Rv3407(无论哪一种都不是第一或第二Mtb抗原)。同样对于本文公开的每种核酸分子。
另外的编码序列或非编码序列可以但不需要存在于本发明的多核苷酸内，并且多核苷酸可以但不需要连接至其他分子和/或支持体材料。
多核苷酸可包含天然序列(例如，编码CMV或TB蛋白或其部分的内源序列)或可包含变体，或这种序列的生物或抗原功能等效物。
编码Ag85A的核苷酸序列在表1中示出为SEQ ID NO:1，并且Ag85A的氨基酸序列在表1中示出为SEQ ID NO:2。
编码Ag85B的核苷酸序列在表1中示出为SEQ ID NO:3，并且Ag85B的氨基酸序列在表1中示出为SEQ ID NO:4。
编码Rv3407的核苷酸序列在表1中示出为SEQ ID NO:5，并且Rv3407的氨基酸序列在表1中示出为SEQ ID NO:6。
编码Rv1733的核苷酸序列在表1中示出为SEQ ID NO:7，并且Rv1733的氨基酸序列在表1中示出为SEQ ID NO:8。
编码Rv2626c的核苷酸序列在表1中示出为SEQ ID NO:9，并且Rv2626c的氨基酸序列在表1中示出为SEQ ID NO:10。
编码RpfA的核苷酸序列在表1中示出为SEQ ID NO:11，并且RpfA的氨基酸序列在表1中示出为SEQ ID NO:12。
编码RpfC的核苷酸序列在表1中示出为SEQ ID NO:13，并且RpfC的氨基酸序列在表1中示出为SEQ ID NO:14。
编码RpfD的核苷酸序列在表1中示出为SEQ ID NO:15，并且RpfD的氨基酸序列在表1中示出为SEQ ID NO:16。
编码ESAT-6的核苷酸序列在表1中示出为SEQ ID NO:17，并且ESAT-6的氨基酸序列在表1中示出为SEQ ID NO:18。
表1
表1中所示的所有序列均源自HCMV。
在一些实施方案中，所述融合蛋白包含Ag85A、Ag85B和Rv3407抗原。在一些实施方案中，所述融合蛋白包含Rv1733和Rv2626c抗原。在一些实施方案中，所述融合蛋白包含RpfA、RpfC和RpfD抗原。在一些实施方案中，所述融合蛋白包含Ag85B和ESAT6抗原。在一些实施方案中，所述融合蛋白包含Ag85A、ESAT6、Rv3407、Rv2626c、RpfA和RpfD抗原。
在本文列出的融合蛋白的任何实施方案中，单独Mtb抗原可以任何顺序存在。例如，对于包含Ag85A、Ag85B和Rv3407抗原的融合蛋白，第一(或N-末端)抗原可以是Ag85A、Ag85B或Rv3407；第二抗原可以是Ag85A；Ag85B或Rv3407(无论哪一种都不是第一Mtb抗原)；并且第三抗原可以是Ag85A、Ag85B或Rv3407(无论哪一种都不是第一或第二Mtb抗原)。同样对于本文公开的每种融合蛋白。
单独Mtb抗原可以C-末端至N-末端或N-末端至C-末端方式连接在一起而无任何接头。或者，接头可存在于本文公开的任何融合蛋白内的任何两种Mtb抗原之间。在一些实施方案中，所述接头是任选地含有一个或多个限制性位点的DNA的区段，其中所述接头插入编码本文公开的任何融合蛋白的两种Mtb抗原的核酸分子之间。
在一些实施方案中，所述融合蛋白包含Ag85A-Ag85B-Rv3407(构建体A；参见表2)。核苷酸序列是SEQ ID NO:19，并且相应氨基酸序列是SEQ ID NO:20。
在一些实施方案中，所述融合蛋白包含Rv1733-Rv2626c(构建体B；参见表2)。核苷酸序列是SEQ ID NO:21，并且相应氨基酸序列是SEQ ID NO:22。
在一些实施方案中，所述融合蛋白包含RpfA-RpfC-RpfD(构建体C；参见表2)。核苷酸序列是SEQ ID NO:23，并且相应氨基酸序列是SEQ ID NO:24。
在一些实施方案中，所述融合蛋白包含Ag85B-ESAT6(构建体D；参见表2)。核苷酸序列是SEQ ID NO:25，并且相应氨基酸序列是SEQ ID NO:26。
在一些实施方案中，所述融合蛋白包含Ag85A-ESAT6-Rv3407-Rv2626c-RpfA-RpfD(构建体E；参见表2)。核苷酸序列是SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:28，并且相应氨基酸序列是SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:30。
表2
任何Mtb抗原(包括本文所述的任何融合蛋白内的任何Mtb抗原)可具有与表1和2中列出的特定氨基酸序列100％或70％至99.9％相同的氨基酸序列。任何单独Mtb抗原(包括本文所述的任何融合蛋白内的任何Mtb抗原)的氨基酸序列可与表1和2中列出的特定氨基酸序列至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。关于氨基酸或核苷酸序列的同一性或相似性在本文中定义为在比对所述序列并且如果必要引入空位以实现最大序列同一性百分比后，特定Mtb抗原中与表1和2中所示的Mtb抗原的氨基酸或核苷酸序列相同(即，相同残基)的氨基酸残基(或视情况而定的核苷酸残基)的百分比。序列同一性百分比可通过例如使用Smith和Waterman(Adv.Appl.Math.,1981,2,482-489)的算法的Gap程序(Wisconsin SequenceAnalysis Package,Version 8for Unix,Genetics Computer Group,UniversityResearch Park,Madison WI)使用默认设置来测定。以同一性％计算的任何氨基酸数目可根据具体情况向上或向下舍入到最接近的整数。
用于比较的序列的最佳比对也可使用Lasergene生物信息学软件套件(DNASTAR,Inc.,Madison,Wis.)中的Megalign程序，使用默认参数进行。这种程序包含在以下参考文献中描述的几种比对方案：Dayhoff,M.O.(1978)A model of evolutionary change inproteins--Matrices for detecting distant relationships.于Dayhoff,M.O.(编辑)Atlas of Protein Sequence and Structure,National Biomedical ResearchFoundation,Washington D.C.第5卷,增刊3,第345-358页中；Hein J.(1990)UnifiedApproach to Alignment and Phylogenes第626-645页Methods in Enzymology第183卷,Academic Press,Inc.,San Diego,Calif.；Higgins,D.G.和Sharp,P.M.(1989)CABIOS 5:151-153；Myers,E.W.和Muller W.(1988)CABIOS 4:11-17；Robinson,E.D.(1971)Comb.Theor 11:105；Santou,N.Nes,M.(1987)Mol.Biol.Evol.4:406-425；Sneath,P.H.A.和Sokal,R.R.(1973)Numerical Taxonomy--the Principles and Practice ofNumerical Taxonomy,Freeman Press,San Francisco,Calif.；Wilbur,W.J.和Lipman,D.J.(1983)Proc.Natl.Acad.,Sci.USA 80:726-730。
或者，可通过Smith和Waterman(1981)Add.APL.Math 2:482的局部同源性算法、通过Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443的同源性比对算法、通过Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444的相似性检索方法、通过这些算法的计算机化实现形式(Wisconsin Genetics软件包中的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA,Genetics Computer Group(GCG),575Science Dr.,Madison,Wis.)或通过检查来进行用于比较的序列的最佳比对。
用于确定序列同一性百分比和序列相似性的算法的适合实例是BLAST和BLAST2.0算法，其分别描述于Altschul等人(1977)Nucl.Acids Res.25:3389-3402和Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215:403-410中。可例如使用BLAST和BLAST 2.0与本文描述的参数来确定本发明的多核苷酸和多肽的序列同一性百分比。用于执行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心公开获得。在一个说明性实例中，对于核苷酸序列，可使用参数M(一对匹配残基的奖励评分；总是>0)和N(对于错配残基的罚分；总是<0)来计算累积评分。对于氨基酸序列，可使用评分矩阵来计算累积评分。当：累积的比对评分从它的最大达到值降低了数量X；由于累积一个或多个负得分的残基比对使累积评分趋于0或0以下；或者到达任一序列的末端时，停止所述字串命中在每个方向上的延伸。BLAST算法参数W、T和X决定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)使用的默认值是字长(W)为11，并且期望值(E)为10和BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff和Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10915)，比对(B)为50，期望值(E)为10，M＝5，N＝-4，以及两条链的比较。
在一些实施方案中，“序列同一性百分比”通过在至少20个位置的比较窗上比较两个最佳比对的序列来确定，其中所述比较窗中的多核苷酸或多肽序列的部分与参考序列(其不包含添加或缺失)相比可包含20％或更少、通常5％至15％或10％至12％的添加或缺失(即，空位)以用于两个序列的最佳比对。通过如下方法计算所述百分比：确定两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置数以产生匹配位置数，将所述匹配位置数除以参考序列中的总位置数(即，窗口大小)并且将结果乘以100而产生序列同一性百分比。
任何Mtb抗原(包括本文所述的任何融合蛋白内的任何Mtb抗原)可以是表1中列出的特定氨基酸序列的片段。任何单独Mtb抗原(包括本文所述的任何融合蛋白内的任何Mtb抗原)的氨基酸序列可缺失构成表1中列出的特定氨基酸序列的至少20％、至少15％、至少10％、至少5％、至少4％、至少3％、至少2％或至少1％的连续氨基酸。省略的连续氨基酸可来自抗原的C-末端或N-末端部分。或者，省略的连续氨基酸可来自抗原的内部部分，因此至少保留所述抗原的其C-末端和N-末端氨基酸。
与表1中列出的特定氨基酸序列相比，任何Mtb抗原(包括本文所述的任何融合蛋白内的任何Mtb抗原)可具有一个或多个氨基酸添加、缺失或取代。与表1中列出的特定氨基酸序列相比，任何单独Mtb抗原(包括本文所述的任何融合蛋白内的任何Mtb抗原)可具有至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个、至少十个、至少十一个或至少十二个氨基酸添加、缺失或取代。氨基酸添加、缺失或取代可在Mtb抗原内的任何氨基酸位置发生。
当特定Mtb抗原(包括本文所述的任何融合蛋白内的任何Mtb抗原)包含至少一个或多个取代时，所述一个或多个取代的氨基酸可各自独立地是任何天然存在的氨基酸或任何非天然存在的氨基酸。因此，特定Mtb抗原可包含为天然存在的氨基酸的一个或多个氨基酸取代和/或为非天然存在的氨基酸的一个或多个氨基酸取代。单独氨基酸取代选自以下中的任一种：1)具有非极性侧链的氨基酸组，例如Ala、Cys、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Val；2)具有带负电荷的侧链的氨基酸组，例如Asp、Glu；3)具有带正电荷的侧链的氨基酸组，例如Arg、His、Lys；以及4)具有不带电荷的极性侧链的氨基酸组，例如，Asn、Cys、Gln、Gly、His、Met、Phe、Ser、Thr、Trp、Tyr，其中添加了Cys、Gly、Met和Phe。本文考虑了用同一类别的另一成员取代一种类别的成员。天然存在的氨基酸包括例如，丙氨酸(Ala)、精氨酸(Arg)、天冬酰胺(Asn)、天冬氨酸(Asp)、半胱氨酸(Cys)、谷氨酰胺(Gln)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、组氨酸(His)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、赖氨酸(Lys)、甲硫氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、脯氨酸(Pro)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和缬氨酸(Val)。非天然存在的氨基酸包括例如，正亮氨酸、鸟氨酸、正缬氨酸、高丝氨酸和其他氨基酸残基类似物，诸如Ellman等人,Meth.Enzym.,1991,202,301-336中所描述的那些。为产生此类非天然存在氨基酸残基，可使用Noren等人,Science,1989,244,182和Ellman等人,同上的程序。简言之，这些程序涉及用非天然存在氨基酸残基化学活化抑制因子tRNA，接着体外转录和翻译RNA。
如本文所述进行修饰的Mtb抗原(包括本文所述的任何融合蛋白中的任何Mtb抗原)保留其引发针对结核分枝杆菌的免疫应答的能力。也就是说，特定Mtb抗原(包括本文所述的任何融合蛋白内的任何Mtb抗原)的修饰仍将允许所得Mtb抗原或包含所述Mtb抗原的融合蛋白引发针对结核分枝杆菌的免疫应答。
本公开还提供了编码本文所述的任何融合蛋白的核酸分子，所述融合蛋白包含至少三种结核分枝杆菌(Mtb)抗原。本文以及表1和2中描述的核酸分子是代表性的。表1中列举的特定序列仅是可编码融合蛋白内的特定Mtb抗原的核酸分子的一个实例。具有遗传密码知识的本领域技术人员可常规地制备和设计编码同一Mtb抗原的大量核酸分子。任何特定核酸分子的长度和核苷酸含量由编码的Mtb抗原的所需氨基酸序列决定。表1和2中所示的核酸分子序列是DNA，尽管也考虑了RNA核酸分子。
在一些实施方案中，所述CMV疫苗是减毒的CMV疫苗，其在与CMV播散和疾病相关的细胞和组织中复制或组装的能力方面不能或受损。此外，本公开包括涉及RhCMV重新感染血清阳性恒河猴(或HCMV重新感染血清阳性人)的独特能力的实施方案，尽管存在显著抗RhCMV免疫应答(或抗HCMV免疫应答)。CMV载体的这种固有性质可归因于由这种病毒编码的免疫逃避基因的广泛谱系(Hansen,S.G.,Powers,C.J.,Richards,R.,Ventura,A.B.,Ford,J.C.,Siess,D.,Axthelm,M.K.,Nelson,J.A.,Jarvis,M.A.,Picker,L.J.,等人2010.Evasion of CD8+ T cells is critical for superinfection bycytomegalovirus.Science 328:102-106)。
一些实施方案解决了病毒脱落和发病机理的问题，并且涉及使用CMV载体产生安全且有效的疫苗的两种潜在互补的方法。一种方法集中于CMV载体的开发，所述CMV载体完全或有条件地在其复制中缺陷性或受严格限制的扩散，但仍然能够诱导针对异源抗原的保护性免疫应答。第二种方法集中于产生不能感染肺中与CMV肺炎相关的细胞如上皮细胞(其是主要细胞类型)以及成纤维细胞的具有复制能力的CMV载体。一些实施方案可涉及这些载体中的额外安全性特征，包括神经和骨髓细胞中复制的阻断。
在一些实施方案中，所述HCMV和RhCMV重组载体编码异源抗原，所述异源抗原可引发和维持对编码的抗原具有特异性的高水平细胞和/或体液免疫应答。
进一步提供了重组RhCMV或HCMV载体，其包括对对复制重要的一种或多种RhCMV或HCMV基因中的缺失。在一些实施方案中，至少一种必需或增强基因是UL82、UL94、UL32、UL99、UL115或UL44或其同源物。在一些实施方案中，所述重组RhCMV或HCMV载体还包括异源抗原，如病原体特异性抗原或肿瘤抗原。
为了使人CMV(HCMV)/TB疫苗对于一般群体(包括具有未被怀疑的免疫受损的个体)中的所有潜在受试者是安全的，所述CMV疫苗载体需要减毒而不丧失诱导保护性免疫的能力。CMV可在宿主中的多种细胞和组织中复制，包括：中枢神经系统(CNS)、上皮细胞、肝细胞、肺和肾中的神经元。骨髓和内皮细胞被认为是宿主中CMV的持久位点。在免疫受损个体的明显CMV疾病期间，导致肺部、肝脏和视网膜中的上皮细胞和内皮细胞的破坏的直接感染是这些靶器官中的疾病的原因。在先天性感染期间，神经元细胞的直接CMV感染据信是相关的听力缺陷和智力迟钝的原因。本发明的实施方案涉及调节CMV在这些关键细胞类型中复制的能力，以增加载体安全性而不损害疫苗功效、所述减毒病毒及其作为疫苗的用途。
一些实施方案涉及HCMV作为用于诱导针对TB的保护性免疫的载体，其是与HCMV提供了这样的应答的认识相结合的基于高度创新的假设，即高频、效应记忆偏向的T细胞应答具有优于常规疫苗产生的记忆的明显优势。即使与诸如单纯疱疹病毒(HSV)和埃-巴二氏病毒的其他持久性病毒相比时，HCMV所特有的这种特征对于这种病毒也是独特的(Asanuma,H.,Sharp,M.,Maecker,H.T.,Maino,V.C.,和Arvin,A.M.2000.Frequencies of memory Tcells specific for varicella-zoster virus,herpes simplex virus,andcytomegalovirus by intracellular detection of cytokine expression.J InfectDis 181:859-866；Harari,A.,Vallelian,F.,Meylan,P.R.,和Pantaleo,G.2005.Functional heterogeneity of memory CD4+ T cell responses in differentconditions of antigen exposure and persistence.J Immunol 174:1037-1045；Harari,A.,Enders,F.B.,Cellerai,C.,Bart,P.A.,和Pantaleo,G.2009.Distinctprofiles of cytotoxic granules in memory CD8+ T cells correlate withfunction,differentiation stage,and antigen exposure.J Virol83:2862-2871；Sylwester,A.W.,Mitchell,B.L.,Edgar,J.B.,Taormina,C.,Pelte,C.,Ruchti,F.,Sleath,P.R.,Grabstein,K.H.,Hosken,N.A.,Kern,F.,等人2005.Broadly targetedhuman cytomegalovirus-specific CD4+and CD8+ T cells dominate the memorycompartments of exposed subjects.J Exp Med 202:673-685)。
虽然HCMV疫苗可被认为是安全的，但仍然关注致病性以及病毒传播至未接种疫苗的血清阴性个体的能力。随着克隆和遗传操纵CMV的技术突破的出现，现在可获得合理地设计具有较低致病性并且不会脱落到环境中的HCMV疫苗的能力。长期目标是产生编码TB抗原的CMV疫苗载体，所述载体是安全的并且不能传播至其他个体。本发明的实施方案涉及合理设计和使用最新的反向遗传技术来产生基于CMV的载体，所述载体对参与脱落的细胞具有受限的向性以及在与成人和免疫抑制群体相关的组织中复制的能力改变。
在一些实施方案中，所述重组RhCMV或HCMV疫苗载体是向性限制性载体。在一些实施方案中，所述向性限制性载体缺乏在某些细胞类型中最佳生长所需的基因或含有对于病毒复制必需的基因中的组织特异性微小RNA的靶标，或者其中向性限制性载体具有上皮、中枢神经系统(CNS)或巨噬细胞缺陷向性，或其组合。
一些实施方案涉及改变CMV载体的细胞向性，以防止参与潜在组织损伤和/或脱落到尿液或分泌物中的特定细胞类型的感染。CMV能够感染宿主中的多种细胞，包括：肠道、肾脏、肺和视网膜中的上皮细胞、CNS中的神经元细胞、肝细胞以及被认为是病毒持久性位点的内皮细胞和骨髓谱系细胞(Dankner,W.M.,McCutchan,J.A.,Richman,D.D.,Hirata,K.,和Spector,S.A.1990.Localization of human cytomegalovirus in peripheral bloodleukocytes by in situ hybridization.J Infect Dis 161:31-36；Einhorn,L.,和Ost,A.1984.Cytomegalovirus infection of human blood cells.J Infect Dis149:207-214；Gnann,J.W.,Jr.,Ahlmen,J.,Svalander,C.,Olding,L.,Oldstone,M.B.,和Nelson,J.A.1988.Inflammatory cells in transplanted kidneys are infected by humancytomegalovirus.Am J Pathol 132:239-248；Howell,C.L.,Miller,M.J.,和Martin,W.J.1979.Comparison of rates of virus isolation from leukocyte populationsseparated from blood by conventional and Ficoll-Paque/Macrodex methods.J ClinMicrobiol 10:533-537；Myerson,D.,Hackman,R.C.,Nelson,J.A.,Ward,D.C.,和McDougall,J.K.1984.Widespread presence of histologically occultcytomegalovirus.Hum Pathol15:430-439；Schrier,R.D.,Nelson,J.A.,和Oldstone,M.B.1985.Detection of human cytomegalovirus in peripheral blood lymphocytesin a natural infection.Science 230:1048-1051；Sinzger,C.,Grefte,A.,Plachter,B.,Gouw,A.S.,The,T.H.,和Jahn,G.1995.Fibroblasts,epithelial cells,endothelialcells and smooth muscle cells are major targets of human cytomegalovirusinfection in lung and gastrointestinal tissues.J Gen Virol 76:741-750)。
HCMV编码>200种基因，并且对于基本病毒复制可分配的基因中的几种已被鉴别为向性决定簇，所述向性决定簇使病毒能够进入巨噬细胞、内皮细胞和上皮细胞并在其中复制。已显示HCMV基因的一个基因座UL128-131A对于进入内皮细胞和上皮细胞是必需的(Gerna,G.,Percivalle,E.,Lilleri,D.,Lozza,L.,Fornara,C.,Hahn,G.,Baldanti,F.,和Revello,M.G.2005.Dendritic-cell infection by human cytomegalovirus isrestricted to strains carrying functional UL131-128genes and mediatesefficient viral antigen presentation to CD8+ T cells.J Gen Virol 86:275-284；Hahn,G.,Revello,M.G.,Patrone,M.,Percivalle,E.,Campanini,G.,Sarasini,A.,Wagner,M.,Gallina,A.,Milanesi,G.,Koszinowski,U.,等人2004.Humancytomegalovirus UL131-128genes are indispensable for virus growth inendothelial cells and virus transfer to leukocytes.J Virol 78:10023-10033；Wang,D.,和Shenk,T.2005.Human cytomegalovirus UL131open reading frame isrequired for epithelial cell tropism.J Virol 79:10330-10338；Wang,D.,和Shenk,T.2005.Human cytomegalovirus virion protein complex required for epithelialand endothelial cell tropism.Proc Natl Acad Sci USA102:18153-18158；Ryckman,B.J.,Rainish,B.L.,Chase,M.C.,Borton,J.A.,Nelson,J.A.,Jarvis,M.A.,和Johnson,D.C.2008.Characterization of the human cytomegalovirus gH/gL/UL128-131complexthat mediates entry into epithelial and endothelial cells.J Virol82:60-70；Ryckman,B.J.,Jarvis,M.A.,Drummond,D.D.,Nelson,J.A.,和Johnson,D.C.2006.Humancytomegalovirus entry into epithelial and endothelial cells depends on genesUL128to UL150and occurs by endocytosis and low-pH fusion.J Virol 80:710-722.)。
HCMV UL128和130的RhCMV同源物在RhCMV菌株68-1中失活。在多种恒河猴和人细胞类型中有效复制恒河猴巨细胞病毒变体。Proc Natl Acad Sci USA 105:19950-19955。有趣的是，RhCMV 68-1仍然在上皮细胞和内皮细胞中生长(尽管与具有完整UL128/130的低通道RhCMV病毒相比以降低的速率)(Lilja,A.E.,Chang,W.L.,Barry,P.A.,Becerra,S.P.,和Shenk,T.E.2008.Functional genetic analysis of rhesus cytomegalovirus:Rh-1isan epithelial cell tropism factor.J Virol 82:2170-2181；Rue,C.A.,Jarvis,M.A.,Knoche,A.J.,Meyers,H.L.,DeFilippis,V.R.,Hansen,S.G.,Wagner,M.,Fruh,K.,Anders,D.G.,Wong,S.W.,等人2004.A cyclooxygenase-2homologue encoded by rhesuscytomegalovirus is a determinant for endothelial cell tropism.Journal ofVirology 78:12529-12536)。RhCMV 68-1的突变分析已经鉴别了4种其他RhCMV基因(Rh01(HCMV TLR1)、Rh159(HCMV UL148)、Rh160(UL132)和Rh203(HCMVUS22))，所述基因也是上皮细胞向性所必需的(Lilja等人,J Virol,2008,82,2170-2181)。一些实施方案涉及这些上皮细胞向性基因的其余部分的突变，以高度降低(如果不是消除的话)CMV感染上皮细胞的能力，从而阻止其脱落到尿液或腺体分泌物(即，唾液和母乳)中的能力，但可能不会损害CMV载体诱导对TB的保护性免疫应答的能力。
此外，因为肺和视网膜中上皮细胞的CMV感染分别导致肺炎和视网膜炎，因此消除所有CMV上皮细胞向性基因可显著降低所得载体的致病潜力。本发明的方面涉及这种高度靶向和创新的方法，所述方法将显著增强RhCMV/HCMV载体用作TB疫苗的安全性，以及防止脱落和疫苗载体潜在扩散到未接种疫苗的群体中。
其他实施方案涉及利用细胞微小RNA(miRNA)的组织特异性表达来减弱与成人和先天性感染中的疾病相关的组织中的病毒。可广泛地利用内源性微小RNA来根据组织、谱系和分化状态调控转基因表达。(Barnes等人,Cell Host Microbe,2008,4,239-248；Lee等人,Clin.Cancer Res.,2009,15,5126-5135；Perez等人,Nat.Biotechnol.,2009,27,572-576)。
已经利用miRNA的组织特异性表达来通过引入miR-124的多个miRNA靶序列产生减毒脊髓灰质炎疫苗，所述miR-124在CNS中特异性地表达到脊髓灰质炎病毒基因组的3'UTR中(Barnes等人，同上)。观察到向脊髓灰质炎病毒基因组添加miR-124靶序列以显著减弱小鼠中的病毒感染。类似地，将在所有哺乳动物但非禽类组织中普遍表达的miR-93的多个靶序列添加至流感的核蛋白基因中，从而产生物种限制的流感突变体，所述突变体能够在鸡蛋中生长但在小鼠中不生长(Perez等人，同上)。
一些实施方案涉及对较大的病毒如鼠CMV(MCMV)有效的这种衰减方法。与小RNA病毒不同，CMV编码超过200种基因，其中大约50％是必需的并且是复制或编码病毒的结构蛋白所必需的。这些必需MCMV基因中的一种是立即早期(IE)3基因(小鼠与HCMV或RhCMV中的IE2相关)，所述基因编码病毒中的早期和晚期基因所必需的转录调控蛋白。这种基因的缺失完全阻断细胞和小鼠组织中的病毒复制(Angulo等人,J.Virol.,2000,74,11129-11136)。本文描述了将组织特异性miRNA的靶序列引入这种基因的3'UTR中将减弱这些细胞中的病毒复制。
在其他实施方案中，所述CMV载体可包含一种或多种微小RNA识别元件(MRE)。成熟的微小RNA(可互换地称为miRNA或miR)通常是18-25个核苷酸的非编码RNA，其调控与对miRNA具有特异性的MRE可操作地连接的mRNA的表达。MRE可以是与mRNA转录物上某处的miRNA碱基配对并与之相互作用的任何序列。通常，所述MRE存在于mRNA的3'非翻译区(UTR)中，但它也可存在于编码序列或5'-UTR中。MRE不一定是miRNA的完美补体，通常仅具有与miRNA互补的少数碱基，并且通常在互补性的这些碱基内含有一个或多个错配。因此，MRE可以是能够被miRNA充分结合的任何序列，使得MRE所可操作地连接的基因的翻译(如对于体内生长必需或增强体内生长的CMV基因)受到miRNA沉默机制如RISC的阻遏。
在一些实例中，微小RNA识别元件(MRE)与CMV基因可操作地连接，所述CMV基因对于体内生长是必需的或增强体内生长。在其他实例中，所述MRE在表达于髓样谱系细胞中的miRNA存在下使表达沉默。这种miRNA包括但不限于miR-142-3p、miR-223、miR-27a、miR-652、miR-155、miR146a、miR-132、miR-21或miR-125(Brown等人,Nat.Biotechnol.,2007,25,1457-1467)。已显示骨髓谱系细胞代表潜伏病毒的储库，并且被认为在整个宿主中携带和传播病毒(Jarvis和Nelson,Front Biosci.,2002,7,d1575-1582)。
MCMV的进一步研究(Snyder等人,C.M.,Allan,J.E.,Bonnett,E.L.,Doom,C.M.,和Hill,A.B.Cross-presentation of a spread-defective MCMV is sufficient to primethe majority of virus-specific CD8+ T cells.PLoS One 5:e9681)表明交叉致敏是CMV编码的蛋白质引发免疫应答的主要机制，骨髓树突状细胞中的复制可对CMV免疫原性具有出人意料的最小影响。
基于细菌人工染色体(BAC)的技术用于产生重组MCMV病毒，所述病毒含有与必需病毒基因IE3(IE3-142)的3'UTR内的细胞miRNA，miR-142-3p具有精确互补性的四个重复的靶序列(四个21聚体)。为了证实miR-142-3p表达可阻遏IE3-142复制的程度，在巨噬细胞系IC-21中进行病毒生长测定。RT-PCR分析证实IC-21细胞表达高水平的miR-142-3p，从而使得所述细胞系适合于测试所述策略的有效性。初步实验证实了所述方法用于CMV的细胞类型特异性减弱的效用。虽然IE3-142在成纤维细胞中复制至野生型水平，但生长在IC-21巨噬细胞中完全阻断。对照病毒IE3-015(其仅含有IE3插入位点内的载体序列)在IC-21细胞中复制至野生型水平。RT-PCR分析表明，IE3表达在感染IC-21细胞后、但不在感染成纤维细胞(缺乏miR-142-3p表达)后完全消除，从而表明IE3表达的破坏不是由于靶序列的插入。
一些实施方案涉及基于可通过使用miRNA靶序列以及通过使细胞特异性miRNA靶向必需病毒基因而在髓样细胞中减弱MCMV来减弱病毒以获得组织特异性生长的发现来减弱CMV的策略。由于CNS是先天性和成人疾病中CMV发病机理的主要靶标，因此产生了HCMV/TB疫苗，所述疫苗含有由与必需CMV基因融合的神经元特异性表达的高度保守的miRNA的靶序列，以防止CNS中的复制。还使用骨髓miRNA miR-124的靶序列以防止CMV载体在这种细胞类型中的复制和传播。这些减毒病毒一起将提供进一步的安全性水平，其将使得这种疫苗能够在所有人目标群体中使用。
本文还公开了在一种或多种基因中具有缺失的重组CMV载体，如RhCMV和HCMV载体，所述基因对CMV复制、传播或扩散是必需的或增强CMV复制、传播或扩散。因此，这些载体被称为“复制缺陷型”CMV载体。如本文所用，“复制缺陷型”涵盖CMV载体，所述载体不能在宿主细胞中经历任何复制或具有显著降低的经历病毒复制的能力。在一些实例中，所述复制缺陷型CMV载体能够复制，但由于它们不能感染相邻细胞而不能传播。在一些实例中，所述复制缺陷型CMV载体能够复制，但由于它们不是从感染的宿主中释放而不能扩散。
CMV必需基因和增强基因是本领域熟知的(参见例如，Dunn等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2003,100,14223-14228；和Dong等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2003,100,12396-12401)并在本文中描述。在一些实施方案中，所述重组RhCMV或HCMV载体包含一种基因中的缺失，所述基因对于病毒复制、传播或扩散是必需的或增强病毒复制、传播或扩散。在其他实施方案中，所述重组RhCMV或HCMV载体包含多种(如但不限于，两种、三种或四种)基因的缺失，所述基因对于CMV复制、传播或扩散是必需的或增强CMV复制、传播或扩散。缺失不一定是基因的整个开放阅读框的缺失，而是包括消除功能蛋白的表达的任何缺失。
在一些实施方案中，所述重组RhCMV或HCMV疫苗载体包含对于宿主内的复制、宿主内的传播或宿主至宿主的扩散是必需的RhCMV或HCMV基因中的缺失。在一些实施方案中，必需基因是UL82(编码pp71)、UL94(编码UL94蛋白)、UL32(编码pp150)、UL99(编码pp28)、UL115(编码gL)和UL44(编码p52)或其同源物。
本文公开的复制缺陷型RhCMV和HCMV载体可包括编码异源抗原的核酸序列，如病原体特异性抗原。如针对本文所述的其他重组RhCMV和HCMV载体所公开的，复制缺陷型RhCMV和HCMV载体可用于在受试者中引发针对编码的异源抗原的免疫应答。
在基因UL82(编码pp71蛋白)中具有缺失的重组RhCMV载体在其体外生长和体内扩散的能力方面严重受损，但仍然引发针对CMV的稳健T细胞免疫应答(美国专利号9,249,427)。因此，本文考虑使用这种复制缺陷型载体作为针对CMV本身的疫苗。
在一些实施方案中，所述重组RhCMV或HCMV疫苗载体在对于体内生长非必需的基因区域中具有缺失。在一些实施方案中，所述基因区域选自由以下组成的组：RL11家族、pp65家族、US12家族和US28家族。在一些实施方案中，所述RhCMV基因区域选自由以下组成的组：Rh13-Rh29、Rh111-Rh112、Rh191-Rh202和Rh214-Rh220。在一些实施方案中，所述RhCMV基因区域选自由以下组成的组：Rh13.1、Rh19、Rh20、Rh23、Rh24、Rh112、Rh190、Rh192、Rh196、Rh198、Rh199、Rh200、Rh201、Rh202和Rh220。在一些实施方案中，所述HCMV基因区域选自由以下组成的组：RL11、UL6、UL7、UL9、UL11、UL83(pp65)、US12、US13、US14、US17、US18、US19、US20、US21和UL28。
在一些实施方案中，所述重组RhCMV或HCMV载体包含RhCMV或HCMV基因中的缺失，所述基因对于复制是必需的或增强复制。CMV必需基因和增强已在本领域中充分描述(参见例如，Dunn等人，同上；和Dong等人，同上)。必需CMV基因包括但不限于，UL32、UL34、UL37、UL44、UL46、UL48、UL48.5、UL49、UL50、UL51、UL52、UL53、UL54、UL55、UL56、UL57、UL60、UL61、UL70、UL71、UL73、UL75、UL76、UL77、UL79、UL80、UL82、UL84、UL85、UL86、UL87、UL89、UL90、UL91、UL92、UL93、UL94、UL95、UL96、UL98、UL99、UL100、UL102、UL104、UL105、UL115和UL122。在一些实施方案中，所述CMV必需或增强基因是UL82、UL94、UL32、UL99、UL115或UL44或其同源物(即，RhCMV中的同源基因)。其他必需或增强基因是本领域已知的并在本文中描述。在特定实例中，所述必需基因是UL82或其同源物。在一些实施方案中，所述重组RhCMV和HCMV载体不包含异源抗原。在其他实施方案中，在必需基因或增强基因中具有缺失的重组RhCMV或HCMV载体包含编码异源抗原的核酸序列，如病原体特异性抗原或肿瘤抗原。还提供了包含重组RhCMV或HCMV载体和药学上可接受的载体的组合物。此类载体和组合物可用于例如治疗患有感染性疾病的受试者或处于被感染性疾病感染的风险的方法中。具有至少一种重要基因的缺失的CMV载体通常被减毒，并且因此可用作治疗或预防CMV的疫苗(在这种情况下，重组载体不编码异源抗原)。
在一些实施方案中，所述重组RhCMV或HCMV载体包含防止病毒进一步复制的自杀(suicide)或安全手段。例如，所述重组CMV载体可包含位于RhCMV或HCMV基因组的必需基因或区域侧翼的LoxP位点(必需CMV基因在上文列出并且是本领域已知的)，以及Cre重组酶的编码序列。Cre-重组酶通常在诱导型启动子的控制下以调控Cre的表达，从而控制必需基因的去除和病毒复制的抑制。在特定实例中，Cre是Tet调控的Cre并且Cre的表达由Dox的存在控制。
本公开还涉及一种能够重复感染生物体的CMV载体的方法，所述方法可包括(a)构建含有且过表达至少一种巨细胞病毒(CMV)糖蛋白的载体，其中所述糖蛋白是US2、US3、US6或US11；以及(b)将所述载体重复施用于动物或人。在需要超感染性的情况下，任何CMV载体都可表达HCMV糖蛋白US2、US3、US6和US11(或RhCMV同源物Rh182、Rh184、Rh185、Rh189)中的一种或多种。
在一些实施方案中，所述重组RhCMV或HCMV疫苗载体还包含编码US2、US3或US6或其同源物的第二核酸序列，其中所述载体不编码功能性US11。在一些实施方案中，所述第二核酸序列编码US2、US3和US6。在一些实施方案中，缺失编码US11开放阅读框的核酸。在一些实施方案中，所述重组RhCMV或HCMV疫苗载体还包含编码US11的第三核酸序列，并且其中编码US11的核酸序列包含点突变、移码突变和/或编码US11的核酸序列的一个或多个核苷酸的缺失。
在一些实施方案中，从所述载体中缺失RhCMV或HCMV的US2至US11区域内的糖蛋白。在一些实施方案中，所述重组RhCMV或HCMV疫苗载体缺乏反式活化因子pp71。在一些实施方案中，所述重组RhCMV或HCMV疫苗载体缺乏间层蛋白pp65。
在一些实施方案中，所述重组RhCMV或HCMV疫苗载体还包含编码UL128或其直向同源物的核酸序列，和编码UL131或其直向同源物的另一核酸序列，其中所述载体不表达活性UL130蛋白。
在一些实施方案中，所述重组RhCMV或HCMV疫苗载体还包含编码UL130或其直向同源物的核酸序列，和编码UL131或其直向同源物的另一核酸序列，其中所述载体不表达活性UL128蛋白。
在一些实施方案中，所述重组RhCMV或HCMV疫苗载体包含UL128或UL130中的突变，所述突变选自点突变、移码突变以及全部或少于全部UL128或UL130的缺失。
在一些实施方案中，所述重组RhCMV或HCMV疫苗载体还包含抑制UL128或UL130或两者的表达的反义序列或RNAi序列。
在一些实施方案中，所述重组RhCMV或HCMV疫苗载体包含US2、US3、US4、US5、US6、US11或UL97或其同源物的缺失或修饰。
在一些实施方案中，所述重组RhCMV或HCMV疫苗载体包含Rh158-166或其同源物的缺失。
在需要重复感染CMV载体的一些实施方案中，所述CMV载体可表达糖蛋白US2、US3、US6和US11中的一种或多种。在特别有利的实施方案中，所述载体表达糖蛋白US2、US3、US6和US11。更有利地，所述载体含有并表达CMV的US2至US11区域内的所有糖蛋白。在一个有利的实施方案中，所述糖蛋白US2、US3、US6和US11中的一种或多种可包括但不限于美国专利号7,892,564；7,749,745；7,364,893；6,953,661；6,913,751；6,740,324；6,613,892；6,410,033；6,140,114；6,103,531；6,033,671；5,908,780；5,906,935；5,874,279；5,853,733；5,846,806；5,843,458；5,837,532；5,804,372；5,753,476；5,741,696；5,731,188；5,720,957；5,676,952；5,599,544；5,593,873和5,334,498的糖蛋白。
本文公开了人或动物CMV载体，其包含编码异源蛋白抗原的核酸序列和编码活性UL131蛋白的核酸序列。在一个实例中，所述CMV载体包含表达活性UL128蛋白、但不表达活性UL130蛋白的核酸序列。在另一个实例中，所述CMV载体编码活性UL130蛋白，但不表达活性UL128蛋白。
在一些实例中，由于在动物CMV中编码UL128或UL130或其直系同源基因的核酸序列中存在有害突变，所以所述CMV载体不表达活性UL128或UL130蛋白。所述突变可以是导致缺乏活性UL128或UL130蛋白的表达的任何有害突变。此类突变可包括点突变、移码突变、少于全部编码所述蛋白质的序列的缺失(截短突变)，或全部编码所述蛋白质的核酸序列的缺失或任何其他突变。
在其他实例中，所述CMV载体不表达活性UL128或UL130蛋白，因为所述载体中存在包含抑制UL128或UL130蛋白的表达的反义或RNAi序列(siRNA或miRNA)的核酸序列。
本文还公开了在受试者中产生针对异源抗原的CD8+ T细胞应答的方法。所述方法涉及向受试者施用有效量的CMV载体。所述CMV载体的特征在于具有编码异源抗原的核酸序列和编码活性UL131蛋白的核酸序列。所述CMV载体的特征进一步在于不编码活性UL128蛋白或活性UL130蛋白或者不编码活性UL128或活性UL130蛋白。CD8+ T细胞应答的进一步特征在于具有至少10％的CD8+ T细胞针对由MHC II类呈递的表位。在其他实例中，至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％或超过60％的CD8+ T细胞是针对由MHC II类呈递的表位。
在其他实例中，所述方法涉及向受试者施用有效量的第二CMV载体，所述第二CMV载体包含编码异源抗原的核酸序列。这种第二载体可以是任何CMV载体，包括具有活性UL128和活性UL130蛋白的CMV载体。所述第二CMV载体可包含本领域中已知的另外缺失以提供不同的免疫应答，如US11缺失或任何其他缺失。第二异源抗原可以是任何异源抗原，包括与第一CMV载体中的异源抗原相同的异源抗原。所述第二CMV载体可在相对于第一CMV载体的施用的任何时间施用，包括在施用第一CMV载体之前、同时或之后。这包括在第一载体之前或之后的任何数量的月、日、小时、分钟或秒施用第二载体。在本发明的优选实施方案中，使用病毒载体。有利地，所述载体是至少缺少糖蛋白UL128的CMV载体或至少缺少糖蛋白UL130的CMV载体。每种CMV载体还表达糖蛋白UL131。
本领域技术人员可容易地确定免疫原性组合物中CMV载体的合适剂量。例如，所述CMV载体的剂量可根据施用途径和受试者的体型而变化。合适的剂量可由本领域技术人员确定，例如通过使用常规免疫学技术测量受试者(如实验室动物)的免疫应答并适当地调整剂量。用于测量受试者的免疫应答的此类技术包括但不限于铬释放测定、四聚体结合测定、IFN-.γ。ELISPOT测定、IL-2ELISPOT测定、细胞内细胞因子测定和其他免疫学检测测定，例如，如Ed Harlow和David Lane的文本“Antibodies:A Laboratory Manual”所详述。
在一些实施方案中，所述重组RhCMV疫苗载体是Rh68-1或Rh68-1.2。在成纤维细胞的体外培养期间，Rh68-1CMV载体丧失了从Rh13、Rh60、Rh157.5和Rh157.6开放阅读框表达基因产物的能力。这些基因的HCMV直向同源物分别是RL11、UL36、UL128和UL130。Rh68-1.2载体具有通过重组DNA技术恢复的Rh60、Rh157.5和Rh157.6的表达(Lilja和Shenk,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2008,105,19950-19955)。Rh68-1CMV载体而不是Rh68-1.2CMV载体引发出人意料的大量受MHC-E限制的CD8+ T细胞。
在一些实施方案中，所述CMV载体可包含用于核酸的编码序列的基因表达的调控元件。所述调控元件可以是启动子、增强子、起始密码子、终止密码子、聚腺苷酸化信号、另外的限制酶位点、多克隆位点或其他编码区段等。在一些实施方案中，所述CMV载体可包含编码Mtb抗原的异源核酸，并且还可包含在抗原编码序列上游的起始密码子和在抗原编码序列下游的终止密码子。起始密码子和终止密码子与抗原编码序列同框。
在一些实施方案中，所述Mtb抗原的表达由抗原编码序列驱动，所述抗原编码序列与选自由以下组成的组的启动子可操作的缔合：组成型CMV启动子、立即早期CMV启动子、早期CMV启动子和晚期CMV启动子。在一些实施方案中，所述启动子选自由以下组成的组：EF1-α、UL82、MIE、pp65和gH。
所述CMV载体还可包含聚腺苷酸化信号，其可位于抗原编码序列的下游。所述聚腺苷酸化信号可以是SV40聚腺苷酸化信号、LTR聚腺苷酸化信号、CMV聚腺苷酸化信号、牛生长激素(bGH)聚腺苷酸化信号、人生长激素(hGH)聚腺苷酸化信号或人β-球蛋白聚腺苷酸化信号。所述SV40聚腺苷酸化信号可以是来自pCEP4载体(Invitrogen,San Diego,CA)的聚腺苷酸化信号。
所述CMV载体还可包含增强子。在一些实施方案中，增强子可以是DNA表达所必需的。所述增强子可以是人肌动蛋白、人肌凝蛋白、人血红素、人肌肉肌酸或病毒增强子，如来自CMV、RSV或者EBV的一种增强子。多核苷酸功能增强子描述于美国专利号5,593,972、5,962,428以及WO94/016737中，所述专利各自的内容以引用的方式并入本文。
所述CMV载体还可包含哺乳动物复制起点，以将载体维持在染色体外并在细胞中产生所述载体的多个拷贝。所述CMV载体可包含埃-巴二氏病毒复制起点和核抗原EBNA-1编码区域，其可在没有整合的情况下产生高拷贝附加型复制。所述CMV载体可含有pVAX1或pVax1变体的某些元件。所述变体pVax1质粒是主链载体质粒pVAX1(Invitrogen,CarlsbadCA)的2998碱基对变体。所述CMV启动子位于碱基137-724处。T7启动子/引发位点位于碱基664-683处。多克隆位点位于碱基696-811处。牛GH聚腺苷酸化信号位于碱基829-1053处。卡那霉素(Kanamycin)抗性基因位于碱基1226-2020处。pUC起点位于碱基2320-2993处。
所述CMV载体还可包含调控序列，所述调控序列可非常适合在施用所述载体的哺乳动物或人细胞中的基因表达。共有编码序列可包含密码子，所述密码子可允许在宿主细胞中更有效地转录编码序列。
本公开还提供了宿主细胞，所述宿主细胞包含本文公开的核酸分子或CMV载体中的任一种。所述宿主细胞可用于例如表达Mtb抗原或其片段。所述Mtb抗原或其片段也可在体内细胞中表达。进行转化(例如，转染)以产生Mtb抗原或其片段的宿主细胞可以是永生化的哺乳动物细胞系，如淋巴来源的那些细胞系(例如，骨髓瘤、杂交瘤、三源杂交瘤或四源杂交瘤细胞系)。所述宿主细胞还可包括通过用病毒(例如，埃-巴二氏病毒)转化而永生化的正常淋巴样细胞，如B细胞。
在一些实施方案中，所述宿主细胞包括但不限于：细菌细胞，如大肠埃希氏菌、新月柄杆菌(Caulobacter crescentus)、链霉菌属物种(Streptomyces species)和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)；酵母细胞，如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)；昆虫细胞系，如来自草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)的那些(例如，Sf9和Sf21细胞系，以及expresSFTM细胞(Protein SciencesCorp.,Meriden,CT,USA))，果蝇属(Drosophila)S2细胞和High细胞中的粉纹夜蛾属(Trichoplusia)(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)；以及哺乳动物细胞，如COS1和COS7细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NS0骨髓瘤细胞、NIH 3T3细胞、293细胞、Procell92S、perC6、HEPG2细胞、HeLa细胞、L细胞、HeLa、MDCK、HEK293、WI38、鼠ES细胞系(例如，来自菌株129/SV、C57/BL6、DBA-1、129/SVJ)、K562、Jurkat细胞和BW5147。其他有用的哺乳动物细胞系是众所周知的并且可从美国典型培养物保藏中心(“ATCC”)(Manassas,VA,USA)和CoriellCell Repositories(Camden,NJ,USA)的美国国立综合医学科学研究所(NIGMS)人类遗传细胞库中容易地获得。在一些实施方案中，所述细胞是重组BCG。这些细胞类型仅具有代表性，并且不意味着是详尽列表。
在其他考虑因素中，其中一些如上所述，可针对其以所需方式加工所表达的Mtb抗原或其片段的能力选择宿主细胞株。多肽的翻译后修饰包括但不限于糖基化、乙酰化、羧基化、磷酸化、脂化和酰化，并且本公开的一个方面是提供具有这些翻译后修饰中的一种或多种的其Mtb抗原。
在一些实施方案中，所述重组BCG已进行遗传工程改造以表达功能性溶内体蛋白质，所述蛋白质在接近中性的pH值(例如约pH 6-8或约6.5至7.5)下具有生物活性。溶内体蛋白质在含有分枝杆菌的内体中是活性的，其通常具有接近中性的内部pH。由rBCG产生的溶内体蛋白质的活性导致内体的破坏，从而允许rBCG从内体逃逸并进入细胞的细胞质中。
在一些实施方案中，通过遗传工程改造引入rBCG中的溶内体蛋白质是来自产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)的产气荚膜梭菌溶素(Perfringolysin)O(PfoA)或其突变体，如PfoAG137Q，如WO 2007/058663中所描述，所述专利以引用的方式整体并入本文。
在一些实施方案中，分枝杆菌是减毒的，如由BCG所例示。然而，本领域技术人员将认识到存在其他减毒和非减毒的分枝杆菌，其也适用于本文。另外类型的分枝杆菌的实例包括但不限于结核分枝杆菌菌株CDC1551、结核分枝杆菌菌株Beijing、结核分枝杆菌菌株H37Ra(ATCC#：25177)、结核分枝杆菌菌株H37Rv(ATCC#：25618)、牛分枝杆菌(M.bovis)(ATCC#：19211和27291)、偶然分枝杆菌(M.fortuitum)(ATCC#：15073)、耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)(ATCC#：12051和12549)、胞内分枝杆菌(M.intracellulare)(ATCC#：35772和13209)、堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)(ATCC#：21982和35775)、鸟分枝杆菌(M.avium)(ATCC#：19421和25291)、鸡分枝杆菌(M.gallinarum)(ATCC#：19711)、母牛分枝杆菌(M.vaccae)(ATCC#：15483和23024)、麻风分枝杆菌(M.leprae)(ATCC#：)、海洋分枝杆菌(M.marinarum)(ATCC#：11566和11567)以及田鼠分枝杆菌(M.microtti)(ATCC#：11152)。
减毒分枝杆菌菌株的实例包括但不限于，结核分枝杆菌泛酸营养缺陷型菌株、结核分枝杆菌rpoV突变体菌株、结核分枝杆菌亮氨酸营养缺陷型菌株、BCG丹麦菌株(ATCC#35733)、BCG日本菌株(ATCC#35737)、BCG芝加哥菌株(ATCC#27289)、BCG哥本哈根菌株(ATCC#：27290)、BCG巴斯德菌株(ATCC#：35734)、BCG葛兰素菌株(ATCC#：35741)、BCG康诺特菌株(ATCC#35745)、BCG蒙特利尔(ATCC#35746)、BCG1331菌株、BCG东京菌株、BCG莫罗菌株、BCG-巴斯德地区和BCG莫斯科菌株。
本公开还提供了药物组合物，其包含本文所述的任何一种或多种重组RhCMV或HCMV疫苗载体和药学上可接受的载体。
在一些实施方案中，所述Mtb抗原或其片段用可检测标记物标记。可检测标记物包括但不限于放射性同位素(如P32何S35)、酶(如辣根过氧化物酶、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、β-半乳糖苷酶(β-gal)等)、荧光染料、发色团、胶体金、染料和生物素。标记的Mtb抗原或其片段可用于在多种细胞或组织类型中进行诊断程序。对于体外或体内的成像程序，所述Mtb抗原可用另外的剂标记，如NMR造影剂、X射线造影剂或量子点。用于使可检测剂连接至多肽的方法是本领域中已知的。所述Mtb抗原也可连接至不溶性载体(如珠粒、玻璃或塑料载玻片等)上。
在一些实施方案中，所述Mtb抗原或其片段可与治疗剂缀合，所述治疗剂包括但不限于放射性同位素(如111In或90Y)、毒素(如破伤风类毒素或蓖麻毒素)、类毒素和化学治疗剂。
在一些实施方案中，所述Mtb抗原或其片段可与成像剂缀合。成像剂包括例如，标记部分(如生物素、荧光部分、放射性部分、组氨酸标签或其他肽标签)以便于分离或检测。
本公开还提供了组合物，所述组合物包含融合蛋白、Mtb抗原、编码Mtb抗原的核酸分子(包括其融合蛋白)、细胞和/或CMV载体)中的任何一种或多种和施用于例如疫苗中的药学上可接受的载体。
在一些实施方案中，在水或其他水性媒介物中制备的用于口服施用的药物组合物的液体制剂可含有各种悬浮剂，如甲基纤维素、藻酸盐、黄芪胶、果胶、藻胶钠(kelgin)、角叉菜胶、阿拉伯胶、聚乙烯吡咯烷酮和聚乙烯醇。药物组合物的液体制剂还可包括含有润湿剂、甜味剂以及着色剂和调味剂连同一种或多种活性化合物的溶液、乳液、糖浆和酏剂。所述药物组合物的各种液体和粉末制剂可通过常规方法制备以用于吸入待治疗的哺乳动物的肺部中。
在一些实施方案中，用于注射的药物组合物的液体制剂可包含各种载体，如植物油、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺、乳酸乙酯、碳酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯、乙醇、多元醇例如像甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等。在一些实施方案中，所述组合物包含柠檬酸盐/蔗糖/吐温载体。对于静脉内注射，可通过滴注方法施用水溶性形式的组合物，由此输注含有抗真菌剂和生理学上可接受的赋形剂的药物制剂。生理学上可接受的赋形剂可包括例如5％葡萄糖、0.9％盐水、林格氏溶液或其他合适的赋形剂。可于水性基质或药学上可接受的油基质(如长链脂肪酸的酯，例如像油酸乙酯)中的悬浮液形式制备并施用组合物的合适的不溶性形式。
所述组合物可以是例如，可注射溶液、水性悬浮液或溶液、非水性悬浮液或溶液、固体和液体口服制剂、药膏、凝胶、软膏、皮内贴剂、乳膏、气雾剂、洗剂、片剂、胶囊、持续释放制剂等。在一些实施方案中，对于局部应用，可将药物组合物配制成合适的软膏。在一些实施方案中，局部半固体软膏制剂通常在载体(如药物乳膏基质)中包含约1％至20％或5％至10％的活性成分的浓度。用于局部使用的组合物的制剂的一些实例包括但不限于含有活性成分和各种载体和媒介物的滴剂、酊剂、洗剂、乳膏、溶液和软膏。
通常，组合物被制备为呈液体溶液或悬浮液形式的可注射物；也可制备适于在注射之前溶解或悬浮于液体媒介物中的固体形式。制剂也可于脂质体或微粒(如聚丙交酯、聚乙交酯或共聚物)中乳化或囊封以获得增强的佐剂作用(参见Langer,Science,1990,249,1527和Hanes,Advanced Drug Delivery Reviews,1997,28,97)。还可制备无菌可注射制剂，例如像无菌可注射水性或油性悬浮液。这种悬浮液可根据本领域中已知的技术，使用合适的分散剂、润湿剂和悬浮剂来配制。在一些实施方案中，所述药物组合物可在微囊化装置中递送，以减少或预防针对蛋白质的宿主免疫应答。
合适的剂量是当如上所述施用时能够促进抗TB免疫应答的化合物的量，并且优选高于基础(即未治疗)水平至少10％-50％。可例如通过测量患者体内的抗T细胞应答来监测这种应答。与未接种疫苗的患者相比，此类疫苗还应该能够引起免疫应答，所述免疫应答导致接种疫苗的患者的临床结果改善(例如，更频繁的缓解，完全或部分或更长的无疾病存活)。通常，对于包含一种或多种多肽的药物组合物和疫苗，每种多肽的量寻求在约25mcg至5mg/kg宿主的剂量范围内。合适的剂量大小将随患者的体型而变化，但通常将在约0.1mL至约5mL的范围内。
通常，适当的剂量和治疗方案提供足以提供治疗和/或预防益处的量的一种或多种活性化合物。与未治疗的患者相比，可通过在治疗的患者中建立改善的临床结果(例如，更频繁的缓解，完全或部分或更长的无疾病存活)来监测这种应答。对TB蛋白的预先存在的免疫应答的增加可与改善的临床结果相关。此类免疫应答通常可使用标准增殖、细胞毒性或细胞因子测定来评价，所述测定可使用在治疗之前和之后从患者获得的样品进行。
在一些实施方案中，所述组合物包含约1纳克至约10mg的核酸。在一些实施方案中，所述组合物包含：1)至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100纳克，或至少1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95,100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、305、310、315、320、325、330、335、340、345、350、355、360、365、370、375、380、385、390、395、400、405、410、415、420、425、430、435、440、445、450、455、460、465、470、475、480、485、490、495、500、605、610、615、620、625、630、635、640、645、650、655、660、665、670、675、680、685、690、695、700、705、710、715、720、725、730、735、740、745、750、755、760、765、770、775、780、785、790、795、800、805、810、815、820、825、830、835、840、845、850、855、860、865、870、875、880、885、890、895、900、905、910、915、920、925、930、935、940、945、950、955、960、965、970、975、980、985、990、995或1000微克，或至少1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10mg或更多；以及2)至多且包括15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100纳克，或至多且包括1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95,100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、305、310、315、320、325、330、335、340、345、350、355、360、365、370、375、380、385、390、395、400、405、410、415、420、425、430、435、440、445、450、455、460、465、470、475、480、485、490、495、500、605、610、615、620、625、630、635、640、645、650、655、660、665、670、675、680、685、690、695、700、705、710、715、720、725、730、735、740、745、750、755、760、765、770、775、780、785、790、795、800、805、810、815、820、825、830、835、840、845、850、855、860、865、870、875、880、885、890、895、900、905、910、915、920、925、930、935、940、945、950、955、960、965、970、975、980、985、990、995或1000微克，或至多且包括1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10mg。
在一些实施方案中，所述组合物包含约5纳克至约10mg的核酸分子。在一些实施方案中，所述组合物包含约25纳克至约5mg的核酸分子。在一些实施方案中，所述组合物含有约50纳克至约1mg的核酸分子。在一些实施方案中，所述组合物含有约0.1至约500微克的核酸分子。在一些实施方案中，所述组合物含有约1至约350微克的核酸分子。在一些实施方案中，所述组合物含有约5至约250微克的核酸分子。在一些实施方案中，所述组合物含有约10至约200微克的核酸分子。在一些实施方案中，所述组合物含有约15至约150微克的核酸分子。在一些实施方案中，所述组合物含有约20至约100微克的核酸分子。在一些实施方案中，所述组合物含有约25至约75微克的核酸分子。在一些实施方案中，所述组合物含有约30至约50微克的核酸分子。在一些实施方案中，所述组合物含有约35至约40微克的核酸分子。在一些实施方案中，所述组合物含有约100至约200微克的核酸分子。在一些实施方案中，所述组合物包含约10至约100微克的核酸分子。在一些实施方案中，所述组合物包含约20至约80微克的核酸分子。在一些实施方案中，所述组合物包含约25至约60微克的核酸分子。在一些实施方案中，所述组合物包含约30纳克至约50微克的核酸分子。在一些实施方案中，所述组合物包含约35纳克至约45微克的核酸分子。在一些实施方案中，所述组合物含有约0.1至约500微克的核酸分子。在一些实施方案中，所述组合物含有约1至约350微克的核酸分子。在一些实施方案中，所述组合物含有约25至约250微克的核酸分子。在一些实施方案中，所述组合物含有约100至约200微克的核酸分子。
可根据待使用的施用模式来配制组合物。在组合物为可注射药物组合物的情况下，它们是灭菌、无致热原和无颗粒的。可使用等渗制剂。一般来说，用于等渗性的添加剂可包括氯化钠、右旋糖、甘露醇、山梨糖醇和乳糖。在一些情况下，等渗溶液如磷酸缓冲盐水是合适的。稳定剂包括明胶和白蛋白。在一些实施方案中，将血管收缩剂添加到制剂中。
所述组合物还可包含药学上可接受的赋形剂。药学上可接受的赋形剂可以是作为媒介物、佐剂、载体或稀释剂的功能分子。药学上可接受的赋形剂可以是转染促进剂，其可包括表面活性剂如免疫刺激复合物(ISCOMS)、弗氏不完全佐剂、LPS类似物(包括单磷酰基脂质A)、胞壁酰肽、醌类似物、囊泡如角鲨烯和角鲨烷、透明质酸、脂质、脂质体、钙离子、病毒蛋白质、聚阴离子、聚阳离子或纳米粒子或其他已知的转染促进剂。
转染促进剂是聚阴离子、聚阳离子，包括聚-L-谷氨酸(LGS)或脂质。转染促进剂是聚-L-谷氨酸，并且更合适地，聚-L-谷氨酸以小于6mg/ml的浓度存在于组合物中。转染促进剂还可包括表面活性剂如免疫刺激复合物(ISCOMS)、弗氏不完全佐剂、LPS类似物(包括单磷酰酯A)、胞壁肽、醌类似物和囊泡如角鲨烯和角鲨烷，并且透明质酸也可与遗传构建体结合施用。在一些实施方案中，质粒组合物还可包含转染促进剂如脂质、脂质体，包括卵磷脂脂质体或本领域中已知的其他脂质体，如DNA-脂质体混合物(参见例如W09324640)、钙离子、病毒蛋白、聚阴离子、聚阳离子或纳米颗粒，或其他已知的转染促进剂。在一些实施方案中，转染促进剂是聚阴离子、聚阳离子，包括聚-L-谷氨酸(LGS)或脂质。转染剂在所述组合物中的浓度是小于4mg/ml、小于2mg/ml、小于1mg/ml、小于0.750mg/ml、小于0.500mg/ml、小于0.250mg/ml、小于0.100mg/ml、小于0.050mg/ml或小于0.010mg/ml。
药学上可接受的赋形剂可以是佐剂。佐剂可以是在替代质粒中表达或以蛋白质形式与以上质粒组合递送的其他基因。佐剂可选自由以下组成的组：α-干扰素(IFN-α)、β-干扰素(IFN-β)、γ-干扰素、血小板源性生长因子(PDGF)、TNFα、TNFβ、GM-CSF、表皮生长因子(EGF)、皮肤T细胞吸引趋化因子(CTACK)、上皮胸腺表达的趋化因子(TECK)、粘膜相关的上皮趋化因子(MEC)、IL-12、IL-15、MHC、CD80、CD86(包括缺失信号序列并任选地包含来自IgE的信号肽的IL-15)。佐剂可以是IL-12、IL-15、IL-28、CTACK、TECK、血小板源性生长因子(PDGF)、TNFα、TNFβ、GM-CSF、表皮生长因子(EGF)、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18或其组合。
可以是有用的佐剂的其他基因包括编码以下的那些：MCP-1、MIP-la、MIP-1p、IL-8、L-选择素、P-选择素、E-选择素、CD34、GlyCAM-1、MadCAM-1、LFA-1、VLA-1、Mac-1、pl50.95、PECAM、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、CD2、LFA-3、M-CSF、G-CSF、IL-4、IL-18的突变形式、CD40、CD40L、血管生长因子、成纤维细胞生长因子、IL-7、神经生长因子、血管内皮生长因子、Fas、TNF受体、Flt、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、半胱天冬酶ICE、Fos、c-jun、Sp-1、Ap-1、Ap-2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、失活NIK、SAP K、SAP-1、JNK、干扰素反应基因、NFkB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、TRAIL-R4、RANK、RANK配体、Ox40、Ox40配体、NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAP1、TAP2以及其功能片段。
所述质粒组合物还可包含如1994年4月1日提交的美国序列号021,579中描述的基因疫苗促进剂，所述专利以引用的方式全部并入。
本公开还提供了包含本文所述的Mtb抗原、其片段、融合蛋白、核酸分子、CMV载体或细胞的药盒。所述药盒可包括例如一个或多个容器、一个或多个包装或一个或多个分配器以及用于施用或使用的标签和说明书。
疫苗CMV载体和药物组合物可以单位剂量或多剂量容器(如密封的安瓿或小瓶)存在。可气密地密封此类容器以保持制剂的无菌性直至使用。通常，制剂可作为悬浮液、溶液或乳液储存在油性或水性媒介物中。或者，疫苗或药物组合物可在冷冻干燥的条件下储存，仅需药在临使用前添加无菌液体载体。
本公开还提供了用于治疗或预防结核病的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用至少一种如本文所述的重组RhCMV或HCMV疫苗载体。在一些实施方案中，所述方法还包括向所述受试者再施用至少一种本文所述的重组RhCMV或HCMV疫苗载体。在一些实施方案中，再施用的重组RhCMV或HCMV疫苗载体不同于初始施用的重组RhCMV或HCMV疫苗载体。
本公开还提供了用于引发对Mtb抗原的免疫应答的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用至少一种如本文所述的重组RhCMV或HCMV疫苗载体。
本公开还提供了用于引发对Mtb抗原的CD8+或CD4+ T细胞应答的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用至少一种如本文所述的重组RhCMV或HCMV疫苗载体。
在一些实施方案中，所述重组RhCMV或HCMV疫苗载体静脉内、肌肉内、腹膜内、鼻内或口服施用至受试者。在一些实施方案中，受试者是人。
在一些实施方案中，本文所述的Mtb抗原、构建体、载体或细胞或包含所述Mtb抗原、构建体、载体或细胞的组合物可作为气雾剂施用于哺乳动物。在一些实施方案中，气雾剂接种物包含盐水。常规的气雾剂递送装置包括但不限于加压计量剂量吸入器(pMDI)和干粉吸入器(DPI)(两者都递送干粉末制剂)；以及雾化器如PARI eFlow装置，所述装置递送呈细雾形式的水性剂量。在一些实施方案中，气雾剂递送装置是连接至递送面罩的ParieFlow便携式电子气雾剂递送平台。在一些实施方案中，平均粒度是约1μm至约10μm、约1μm至约5μm、约3μm至约5μm、约4μm至约5μm或约3.9μm至约4.9μm。在一些实施方案中，气雾剂的体积是约0.1ml至约5ml、约0.1ml至约2ml、约0.1ml至约1.5ml、约0.5ml至约1.5ml、约0.5ml至约1.2ml、约0.7ml至约1.2ml或约1ml。
用于治疗病状的本公开的组合物的有效剂量根据许多不同因素而变化，所述因素包括施用方式、靶位点、受试者的生理状态、受试者为人还是动物、所施用的其他药物和治疗为预防性还是治疗性。通常，受试者是人，但是也可治疗非人哺乳动物，包括转基因哺乳动物。
在一些实施方案中，所述组合物可通过使用标准方法通过静脉内、皮下、腹膜内、肌内、髓内、脑室内、脑膜内、动脉内、血管内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、肝内、脊柱内、肿瘤内、颅内、肠内、肺部、透粘膜、子宫内、舌下或在炎症或肿瘤生长部位局部注射施用于受试者。或者，所述组合物可通过包括口服、经鼻、眼部、直肠或局部的途径施用于受试者。最典型的施用途径是血管内、皮下或肌内，但其他途径可以是有效的。在一些实施方案中，组合物以持续释放组合物或装置(如MedipadTM装置)的形式施用。所述组合物还可经由呼吸道施用，例如使用干粉吸入装置、雾化器或计量剂量吸入器。所述组合物还可通过传统注射器、无针注射装置、“微粒轰击基因枪”或其他物理方法诸如电穿孔(“EP”)、“流体动力学方法”或超声施用。
在一些实施方案中，药物组合物可以通过鼻内喷雾、吸入和/或其它气雾剂递送媒介物来递送。用于经由鼻气溶胶喷雾剂将基因、核酸和肽组合物直接递送至肺部的方法已例如描述于美国专利号5,756,353和美国专利号5,804,212(各自明确地以引用的方式整体并入本文)中。同样地，使用鼻内微粒树脂(Takenaga等人，1998)和溶血磷脂酰-甘油化合物(美国专利号5,725,871，明确地以引用的方式整体并入本文)递送药物在制药领域中也是众所周知的。同样地，以聚四氟乙烯载体基质形式的透粘膜药物递送在美国专利号5,780,045中描述(明确地以引用的方式整体并入本文)。
在一些实施方案中，所述组合物可通过持续释放施用、通过诸如在手术期间直接施加的可侵蚀植入物的储库注射液或通过将输注泵或生物相容性持续释放植入物植入受试者中的方式施用于受试者。或者，所述组合物可通过可注射储库施用途径，如通过使用1个月、3个月或6个月的储库可注射或生物可降解的材料和方法，或通过向受试者的皮肤施加含有所述组合物的透皮贴剂并使所述贴剂与受试者的皮肤接触通常每片贴剂1至5小时来施用于受试者。
本公开还提供了在哺乳动物中引发针对结核分枝杆菌的免疫应答的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用免疫学上足够量的一种或多种CMV载体，所述CMV载体包含本文所述的一种或多种Mtb融合蛋白。
本文所述的融合蛋白和组合物可用于治疗或预防结核病。在一些实施方案中，所述方法包括向人施用治疗或预防有效量的本文所述的CMV载体或组合物中的任一种，以使得减轻或预防结核感染。在一些实施方案中，所治疗的受试者先前已被诊断为患有结核病。因此，此类受试者将已被诊断为需要这种治疗。或者，所述治疗可意图用于预防尚未患有结核病的受试者的结核感染或用于前往结核病普遍存在的区域的受试者。
可使用标准方法监测患有结核病的受试者的治疗。一些方法需要在施用一定剂量的剂之前确定例如受试者中抗体水平或分布的基线值，并将所述基线值与治疗后的分布或水平的值进行比较。显著增加，例如像大于同一样品的重复测量中的实验误差的典型容限(表示为与所述水平或分布的值的此类测量的平均值的一个标准偏差)表示阳性治疗结果(即，所述剂的施用已经实现了所需应答)。如果免疫应答的值未显著变化或降低，则指示阴性治疗结果。
在其他实施方案中，确定对照群体的水平或分布的对照值，如平均值和标准偏差。通常，对照群体中的个体尚未接受过先前治疗。然后将施用治疗剂后受试者中的水平或分布的测量值与对照值进行比较。相对于对照值的显著增加(如大于平均值的一个标准偏差)表示阳性或足够的治疗结果。缺乏显著增加或减少表明阴性或不足的治疗结果。通常继续施用治疗剂，同时水平相对于对照值增加。如前所述，相对于对照值达到平台期是可停止或减少剂量和/或频率的治疗施用的指标。
在其他实施方案中，水平或分布的对照值(如平均值和标准偏差)是从已经用治疗剂治疗并且其水平或分布已经响应于治疗而平稳的个体的对照群体确定的。将受试者中的水平或分布的测量值与对照值进行比较。如果受试者中的测量水平与对照值没有显著差异(如超过一个标准偏差)，则可停止治疗。如果受试者中的水平显著低于对照值，则保证持续施用剂。如果受试者中的水平持续低于对照值，则可指示治疗的变化。
在其他实施方案中，监测目前未接受治疗但已经历前一疗程的受试者的抗体水平或分布，以确定是否需要恢复治疗。可将受试者中测量的水平或分布与前一疗程之后在所述受试者中先前实现的值进行比较。相对于前一测量值的显著降低(如大于同一样品的重复测量中的典型误差容限)是可恢复治疗的指示。或者，可将受试者中测量的值与在经历疗程后的受试者群体中确定的对照值(平均值加标准偏差)进行比较。或者，可将受试者中的测量的值与保持无疾病症状的预防性治疗的受试者群体或显示疾病特征的改善的治疗性治疗的受试者群体中的对照值进行比较。在所有这些情况下，相对于对照水平的显著降低(如超过标准偏差)是治疗应在受试者中恢复的指标。
在一些方法中，在施用前进行受试者中针对给定抗原的抗体的基线测量，此后不久进行第二测量以确定峰值抗体水平，并且间隔进行一次或多次另外测量以监测抗体水平的衰减。当抗体的水平已经下降到基线或减去基线的峰值的预定百分比(如50％、25％或10％)时，施用另外剂量的抗原。在一些实施方案中，将减去本底的峰值或随后测量的水平与先前经确定来构成其他受试者的有益的预防性或治疗性治疗方案的参考水平进行比较。如果测量的抗体水平显著小于参考水平(如小于平均值减去受益于治疗的受试者群体中的参考值的一个标准偏差)，则指示另外剂量的抗原的施用。
免疫计划表(或方案)对于动物(包括人)是众所周知的，并且可针对特定受试者和免疫原性组合物容易地确定。因此，免疫原可一次或多次施用至受试者。优选地，在免疫原性组合物的单独施用之间存在设定的时间间隔。虽然这种时间间隔对于每个受试者不同，但它通常在10天至数周的范围内，并且通常为2、4、6或8周。对于人，时间间隔通常为2至6周。在本发明的一个特别有利的实施方案中，所述时间间隔更长，有利地为约10周、12周、14周、16周、18周、20周、22周、24周、26周、28周、30周、32周、34周、36周、38周、40周、42周、44周、46周、48周、50周、52周、54周、56周、58周、60周、62周、64周、66周、68周或70周。
在一些实施方案中，可通过上述方法治疗的受试者是动物，如哺乳动物，包括但不限于人、非人灵长类动物、啮齿动物(包括大鼠、小鼠、仓鼠和豚鼠)、牛、马、绵羊、山羊、猪、狗和猫。在大多数情况下，哺乳动物是人。
本公开还提供了如本文所述的CMV/TB载体，其用于制备用于治疗或预防结核分枝杆菌感染的药物。
本公开还提供了如本文所述的CMV/TB载体，其用于治疗或预防结核分枝杆菌感染。
本公开还提供了如本文所述的CMV/TB载体在制备用于治疗或预防结核分枝杆菌感染的药物中的用途。
本公开还提供了如本文所述的CMV/TB载体在治疗或预防结核分枝杆菌感染中的用途。
本公开还提供了如本文所述的任何CMV/TB载体、或本文所述的任何组合物、或本文所述的任何细胞、或本文所述的任何方法、或本文描述的任何用途，基本上如参考所附实施例和/或附图所描述的。
提出以下代表性实施方案：
实施方案1.一种重组RhCMV或HCMV载体，其包含编码可表达的Mtb抗原的核酸序列，所述Mtb抗原选自Ag85A-Ag85B-Rv3407、Rv1733-Rv2626c、RpfA-RpfC-RpfD、Ag85B-ESAT6和Ag85A-E SAT6-Rv3407-Rv2626c-RpfA-RpfD。
实施方案2.如实施方案1所述的重组RhCMV或HCMV疫苗载体，其中所述Mtb抗原的表达由抗原编码序列驱动，所述抗原编码序列与选自由以下组成的组的启动子可操作的缔合：组成型CMV启动子、立即早期CMV启动子、早期CMV启动子和晚期CMV启动子。
实施方案3.如实施方案2所述的重组RhCMV或HCMV疫苗载体，其中所述启动子选自由以下组成的组：EF1-α、UL82、MIE、pp65和gH。
实施方案4.如实施方案1至3中任一项所述的重组RhCMV或HCMV疫苗载体，其包含US2、US3、US4、US5、US6、US11或UL97或其同源物的缺失或修饰。
实施方案5.如实施方案1至4中任一项所述的重组RhCMV或HCMV疫苗载体，其包含Rh158-166或其同源物的缺失。
实施方案6.如实施方案1至5中任一项所述的重组RhCMV或HCMV疫苗载体，其中所述RhCMV或HCMV疫苗载体是向性限制性载体。
实施方案7.如实施方案6所述的重组RhCMV或HCMV疫苗载体，其中所述向性限制性载体缺乏在某些细胞类型中最佳生长所需的基因或含有对于病毒复制必需的基因中的组织特异性微小RNA的靶标，或者其中所述向性限制性载体具有上皮、中枢神经系统(CNS)或巨噬细胞缺陷向性，或其组合。
实施方案8.如实施方案1至7中任一项所述的重组RhCMV或HCMV疫苗载体，其中所述RhCMV或HCMV疫苗载体在对于体内生长非必需的基因区域中具有缺失。
实施方案9.如实施方案8所述的重组RhCMV或HCMV疫苗载体，其中所述基因区域选自由以下组成的组：RL11家族、pp65家族、US12家族和US28家族。
实施方案10.如实施方案9所述的重组RhCMV疫苗载体，其中所述RhCMV基因区域选自由以下组成的组：Rh13-Rh29、Rh111-Rh112、Rh191-Rh202和Rh214-Rh220，或者其中所述RhCMV基因区域选自由以下组成的组：Rh13.1、Rh19、Rh20、Rh23、Rh24、Rh112、Rh190、Rh192、Rh196、Rh198、Rh199、Rh200、Rh201、Rh202和Rh220。
实施方案11.如实施方案9所述的重组HCMV疫苗载体，其中所述HCMV基因区域选自由以下组成的组：RL11、UL6、UL7、UL9、UL11、UL83(pp65)、US12、US13、US14、US17、US18、US19、US20、US21和UL28。
实施方案12.如实施方案1至11中任一项所述的重组RhCMV或HCMV疫苗载体，其中所述载体包含对于宿主内的复制、宿主内的传播或宿主至宿主的扩散是必需的RhCMV或HCMV基因中的缺失。
实施方案13.如实施方案12所述的重组RhCMV或HCMV疫苗载体，其中所述必需基因是UL94、UL32、UL99、UL115或UL44或其同源物。
实施方案14.如实施方案1至13中任一项所述的重组RhCMV或HCMV疫苗载体，其中所述载体包含基因UL82/pp71或其同源物中的缺失。
实施方案15.如实施方案1至14中任一项所述的重组RhCMV或HCMV疫苗载体，其中所述载体还包含编码US2、US3或US6或其同源物的第二核酸序列，其中所述载体不编码功能性US11。
实施方案16.如实施方案15所述的重组RhCMV或HCMV疫苗载体，其中所述第二核酸序列编码US2、US3和US6。
实施方案17.如实施方案15或实施方案16所述的重组RhCMV或HCMV疫苗载体，其中缺失所述编码US11开放阅读框的核酸。
实施方案18.如实施方案15至17中任一项所述的重组RhCMV或HCMV疫苗载体，其还包含编码US11的第三核酸序列，并且其中所述编码US11的核酸序列包含点突变、移码突变和/或所述编码US11的核酸序列的一个或多个核苷酸的缺失。
实施方案19.如实施方案18所述的重组RhCMV或HCMV疫苗载体，其中所述载体缺乏间层蛋白pp65。
实施方案20.如实施方案1至19中任一项所述的重组RhCMV或HCMV疫苗载体，其中所述载体不表达活性UL130蛋白。
实施方案21.如实施方案1至20中任一项所述的重组RhCMV或HCMV疫苗载体，其中所述RhCMV疫苗载体是Rh68-1或Rh68-1.2。
实施方案22.如实施方案1所述的重组RhCMV或HCMV疫苗载体，其还包含与CMV基因可操作地连接的微小RNA识别元件(MRE)，所述CMV基因对于CMV生长是必需的或增强的，并且其中所述MRE在由骨髓谱系的细胞表达的微小RNA存在下使表达沉默。
实施方案23.一种药物组合物，其包含如实施方案1至22中任一项所述的重组RhCMV或HCMV疫苗载体以及药学上可接受的载体。
实施方案24.一种用于治疗或预防结核病的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用如实施方案1至22中任一项所述的至少一种重组RhCMV或HCMV疫苗载体。
实施方案25.如实施方案24所述的方法，其还包括向所述受试者再施用如实施方案1至22中任一项所述的至少一种重组RhCMV或HCMV疫苗载体。
实施方案26.如实施方案25所述的方法，其中所述再施用的所述重组RhCMV或HCMV疫苗载体不同于初始施用的所述重组RhCMV或HCMV疫苗载体。
实施方案27.一种用于引发对Mtb抗原的免疫应答的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用如实施方案1至22中任一项所述的至少一种重组RhCMV或HCMV疫苗载体。
实施方案28.一种用于引发对Mtb抗原的CD8+或CD4+ T细胞应答的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用如实施方案20所述的至少一种重组RhCMV或HCMV疫苗载体。
实施方案29.如实施方案24至28中任一项所述的方法，其中所述重组RhCMV或HCMV疫苗载体静脉内、肌肉内、腹膜内、鼻内或口服施用至所述受试者。
实施方案30.如实施方案24至29中任一项所述的方法，其中所述载体是HCMV载体，并且所述受试者是人。
实施方案31.一种Mtb抗原，其选自Ag85B-ESAT6和Ag85A-ESAT6-Rv3407-Rv2626c-RpfA-RpfD。
实施方案32.如实施方案31所述的Mtb抗原，其是Ag85A-ESAT6-Rv3407-Rv2626c-RpfA-RpfD。
为了使本文公开的主题可得到更有效的理解，以下提供了实施例。应理解，这些实施例仅出于说明性目的且不应解释为以任何方式限制所要求保护的主题。在这些实施例中，分子克隆反应和其他标准重组DNA技术是使用可商购的试剂根据Maniatis等人,Molecular Cloning-A Laboratory Manual,第2版,Cold Spring Harbor Press(1989)中描述的方法进行的，除非另有说明。
实施例
实施例1：CMV/TB载体
特定方面提供了可在体内进行生长调节(例如，通过口服施用抗生素多西环素)的重组HCMV/TB载体。相对于CMV感染周期，异源抗原表达可在不同动力学类别的启动子的控制下(例如，EF1α--组成型；MIE--立即早期；pp65--早期；gH--晚期)。
在特定实施方案中，HCMV/TB载体缺乏免疫调节基因(例如，Rh158-166和Rh182-189)以增强所述载体的载体免疫原性、安全性和异源基因携带能力。例如，HCMV编码干扰MHC I的抗原呈递的至少四种不同的基因产物，gpUS2、gpUS3、gpUS6和gpUS11。所有四种HCMV MHC逃避分子都在HCMV的独特短区域内编码并且属于相关的US6基因家族。另外的HCMV免疫调节剂包括但不限于UL118、UL119、UL36、UL:37、UL111a、UL146、UL147等。同样，RhCMV含有类似的免疫调节基因，所述基因可被缺失或修饰以增强本发明疫苗载体的载体免疫原性、安全性和异源基因携带能力。
在另外的实施方案中，通过插入多种抗原基因(如本文公开的那些)来进一步优化HCMV/TB的抗TB免疫原性。或者，可使用各自具有单一插入抗原的若干载体用于共同施用。
在另外的实施方案中，HCMV/TB载体含有与四环素(Tet)调控的Cre重组酶组合的策略性地置于CMV基因组中以侧接病毒基因组的必需区域的LoxP位点。
RhCMV BAC的构建和表征。
BAC技术用于克隆大的基因组DNA区段的发展与基于λ噬菌体的复杂诱变系统结合彻底改变了疱疹病毒学领域，从而使遗传方法能够分析病毒。申请人已经使用了这种系统，例如来构建含有完整RhCMV菌株68-1基因组的RhCMV BAC(RhCMV BAC-Cre)。RhCMV BAC-Cre源自感染性、致病性RhCMV 68-1/EGFP重组病毒。RhCMV BAC-Cre含有插入RhCMVvLoxP的Rh181(US1)/Rh182(US2)基因间区域内的单个LoxP位点处的BAC盒。在该位点插入BAC盒导致产生侧接盒的LoxP序列。由于BAC盒含有在真核细胞中表达的Cre基因，将这种“自我切除的”RhCMV BAC-Cre转染到成纤维细胞中导致BAC盒的有效切除，从而重构病毒(称为RhCMVvLoxP)。在体外和体内表征BAC重构病毒(RhCMVvLoxP)的生长证明各种遗传操作不改变病毒的WT性质。除了残余LoxP位点外，RhCMVvLoxP的基因组结构与WT RhCMV的基因组结构相同。LoxP序列的存在不改变相邻Rh181(US1)和Rh182(US2)或远端(IE2)基因的表达谱。RhCMVvLoxP在组织培养和RhCMV血清阴性免疫活性RM(n＝2)两者中均以WT动力学复制。来自接种后6个月终止的一只动物的组织的分析证明脾脏中存在RhCMV DNA和IE1-表达细胞，这与先前用WT病毒进行的研究中观察到的持久性基因表达一致。两种RM都发展了与天然感染动物中观察到的那些相当的有效抗RhCMV抗体滴度。总之，这些观察结果证明RhCMVvLoxP在表型上是WT并且适于构建疫苗载体开发的位点特异性改变。
实施例2：非人灵长类动物研究#1
这种激发包括四个处理组：1)初次接受实验的非人灵长类动物(NHP)(例如，恒河猴)(即未疫苗接种的对照)(n＝8)；2)仅用BCG疫苗接种的NHP(n＝7)；3)仅用CMV/TB载体的混合物进行疫苗接种的NHP(n＝7)；以及4)用BCG以及CMV/TB载体的混合物进行疫苗接种的NHP。初次接受实验的NHP是CMV血清阳性的。将用BCG进行疫苗接种的NHP用丹麦国立血清研究所(SSI)BCG疫苗进行皮内疫苗接种0.1ml。将用CMV/TB载体混合物进行疫苗接种的NHP用四种Rh68-1载体(编码由Ag85A-Ag85B-Rv3407、Rv1733-Rv2626、RpfA-RpfC-RpfD和Ag85B-ESAT6组成的融合蛋白)进行疫苗接种。将用BCG以及CMV/TB载体混合物进行疫苗接种的NHP用SSI BCG初免，并用如上的四种Rh68-1载体的相同混合物加强。接受CMV/TB载体的NHP在第6周和第21周皮下接受5x106PFU(噬斑形成单位)的CMV/TB载体混合物。两个BCG组在第0周给予BCG。在第6周和第21周，用RhCMV/TB载体的混合物免疫两个CMV/TB载体组。在第49周，用结核分枝杆菌激发NHP。终点包括纵向CT扫描、总体病理学和细菌负荷。
本研究中使用的四种载体中的三种编码经典的潜伏期和复苏抗原盒(编码分别由Ag85A-Ag85B-Rv3407、Rv1733-Rv2626和RpfA-RpfC-RpfD组成的融合蛋白)。NHP接受皮下递送的5E6pfu/RhCMV载体。还包括编码由Ag85AB和ESAT6组成的融合蛋白的Rh68-1载体。
使用细胞内细胞因子染色评价这些载体的免疫原性。图1示出CD4+和CD8+ T细胞应答。针对9种抗原中的每一种测定了PBMC。
图2A、2B、2C和2D示出疫苗接种后的ESAT-6特异性应答。图3A、3B、3C和3D示出疫苗接种后的Rv1733特异性应答。图4A、4B、4C和4D示出疫苗接种后的RpfC特异性应答。图5A、5B、5C和5D示出疫苗接种后的Ag85B特异性应答。图6A和6B示出疫苗接种后的Ag85A特异性应答。图7A和7B示出疫苗接种后的Rv3407特异性应答。图8A和8B示出疫苗接种后的Rv2626特异性应答。图9A和9B示出疫苗接种后的RpfD特异性应答。图10A和10B示出疫苗接种后的RpfA特异性应答。
图11示出血液中BCG和RhCMV诱导的T细胞的表型分化。
图12示出如所预期的，这些Rh68-1载体诱导主要受MHC II限制的CD8 T细胞。
RhCMV载体具有高度免疫原性，从而在外周血单核细胞(PBMC)以及支气管肺泡灌洗(BAL)两者中均显示出稳健应答。与天然对照相比，用Rh68-1进行的疫苗接种也显著降低了疾病进展。
通过若干方式评价了功效，包括CT扫描分析(肺部受累体积)、尸检评分(总体病变的大小、数量和分布；肺、肺引流淋巴结和总计(其包括远处播散))，以及尸检结核分枝杆菌培养物(通过体视学的40个肺部样品(右侧30个；左侧10个)；9个淋巴结(6个肺引流和3个非纵隔)；以及9个肺外组织(5个肝脏，2个肾脏，脾脏和胰腺))。
对于肺部尸检评分，在5mm切片上对单独肺叶进行评分。对于肉芽肿流行率给出以下评分：无可见的病变＝1；1-3个病变＝2；4-10个病变＝3；11-15个病变＝4；16-20个病变＝5；>20个病变＝6；以及<50％的肺叶粟粒状＝7。对于最大的肉芽肿大小给出以下评分：无可见＝1；<1-2mm＝2；3-4mm＝3；5-10mm＝4；11-20mm＝5；>20mm＝6；涉及<50％的肺叶的汇合或粟粒状病变＝7；并且涉及>50％的肺叶的汇合或粟粒状病变＝8。对于另外的评分标准给出以下评分(1＝不存在；2＝存在)：与肉芽肿性疾病相关的壁层胸膜粘连，与肉芽肿性疾病相关的壁层胸膜增厚；伴有空洞的肉芽肿性疾病，以及涉及壁层胸膜、膈肌或体壁的肉芽肿性疾病。
对于胸部淋巴结尸检评分，对于大小给出以下评分：结节可见但未扩大(≤5mm)＝0；节点明显扩大(≤5-10mm)(单侧)＝1；结节明显扩大(≤5-10mm)(双侧)＝2；并且结节明显扩大(>1cm)(单侧/双侧)＝3。对于肉芽肿流行率给出以下评分：在囊状或切面上无可见的肉芽肿＝0；局灶性或多灶性、局限性、非聚结性肉芽肿<2mm＝1；占据<50％的结节的聚结实性或干酪性肉芽肿＝2；占据>50％的结节的聚结实性或干酪性肉芽肿＝3；以及完全肉芽肿结节消失＝4。对于另外的评分标准(不存在＝1；存在＝2)给出以下评分：其他胸部淋巴结。
对于肝脏和脾脏尸检评分，对于流行率给出以下评分：无可见的肉芽肿＝0；1-3个可见的肉芽肿＝1；4-10个可见的肉芽肿＝2；>10个可见肉芽肿＝3；以及粟粒型＝4。对于肉芽肿大小给出以下评分：无存在＝0；<1-2mm＝1；3-4mm＝2；以及>4mm＝3。
对于其他器官和组织，对于流行率给出以下评分：无可见的肉芽肿＝0；1-3个可见的肉芽肿＝1；4-10个可见的肉芽肿＝2；>10个可见肉芽肿＝3；以及粟粒型＝4。对于肉芽肿大小给出以下评分：无存在＝0；<1-2mm＝1；3-4mm＝2；以及>4mm＝3。
图13示出双周和尸检前CT扫描(仅肺病)的各种功效标准(即，对于病因尸检<16周，并且随机>16周)的相关性。尸检评分考虑了肺、肺引流淋巴结和远端部位的总体病变的大小、数量和分布。特别地，40个肺部样品(右侧30个；左侧10个)、9个淋巴结(6个肺引流和3个非纵隔)以及9个肺外组织(5个肝脏、2个肾脏、脾脏和胰腺)通过体视学进行分析。图14示出感染后14周的CT扫描。图15示出通过CT扫描对肺病的定量。图16示出总体病理学评分。这些评分反映了存在的肉芽肿的数量、肉芽肿的大小以及任何复杂的病理学(胸膜增厚、肺炎等)。包括了总体评分(其包括肺、肺引流淋巴结、肝脏和脾脏)，以及肺和肺引流淋巴结的分开的评分。图17和18示出疾病和播散的程度。单独RhCMV/TB载体疫苗接种针对总体疾病扩散实现了73％的功效，这在统计学上优于未疫苗接种和单独BCG疫苗接种。在RhCMV/TB疫苗接种前6周用BCG初免的猴仍然被显著地保护免于总体疾病扩散，但保护作用小于在单独RhCMV/TB疫苗接种中观察到的保护。图19示出非肺样品中疾病和播散的程度。图20示出淋巴结中疾病和播散的程度。
图21示出比较性T细胞应答分析。图22示出CD4 T细胞应答与肺外扩散的相关性。图23示出CD8 T细胞应答与肺外扩散的相关性。总之，最强的相关性是在第一CMV载体疫苗接种后血液中的峰值ESAT6特异性CD4+ T细胞应答之间(相关性减弱但在排除BCG组后仍然显著)。对于肺外疾病的程度(对比肺病的程度)，血液应答相关性最强。“最佳”血液CD4+应答是：ESAT6、RpfA、RpfD、Rv2626、Rv3407。“最佳”血液CD8+应答：与CD4+Ag 85A和85B相同。很少BAL应答与结果相关。
图24示出通过免疫分析确认感染，其中CFP10(一种不包括在RhCMV构建体中的Mtb抗原)用于通过检测从头免疫应答来确认感染。图25示出PBMC中的激发后免疫应答。
图26和27示出尸检后的CD4 T细胞应答。图28示出尸检后分析的淋巴结中的抗原特异性CD4 T细胞应答。图29和30示出尸检后的CD8 T细胞应答。图31示出尸检后分析的淋巴结中的抗原特异性CD8 T细胞应答。总体而言，TB感染引发的CFP10特异性CD4+和CD8+ T细胞应答在所有RM组之间是相似的。对于除ESAT6之外的所有插入物，CMV载体在PBMC、BM、脾脏和肺中维持更高频率的TB插入物特异性CD4+ T细胞应答。除了RpfA和RpfD之外，这种差异在LN样品中不太明显(尽管在某些LN中，RpfC、85A、Rv2623和Rv3407Ag应答在CMV载体疫苗接种的组中也最高)。TB插入物特异性CD8+ T细胞应答更加可变(并且在未疫苗接种的RM中倾向于更高)，但对RpfA、RpfD、85A、Rv2626和Rv3407的应答在CMV载体疫苗接种的动物内的大多数组织中仍倾向于更高。
图32示出脾CD4 T细胞应答与淋巴结培养之间的尸检后相关性。对于Ag85A、RpfA、RpfD、Rv2626和Rv3407(中等至强)以及对于Ag85B和RpfC(尽管较弱)，观察到对非肺病的CD4+应答的相关性。对于RpfA和RpfD(中度)以及对于ESAT6(尽管较弱)，观察到对肺病的CD8+应答的相关性。对于Ag85A、RpfA和RpfD(强)以及对于Rv2626、Rv3407和Ag85B(中度)，观察到对非肺病的CD8+应答的相关性。疫苗接种期间的峰值ESAT6特异性应答(特别是CD4+)与激发后而非尸检时的肺外疾病减少相关(因为TB感染最终在所有动物中诱导高频ESAT6特异性应答)。
一般来说，CMV载体引发并维持比BCG更高的TB插入物特异性CD4+和CD8+ T细胞应答。这些应答与针对肺和肺外疾病进展的显著保护相关。BCG最多与朝向适度肺保护的趋势相关，但肺外疾病与未疫苗接种的对照无差异。实际上，在CMV载体疫苗接种之前施用BCG部分地消除了CMV载体介导的保护，特别是对于肺外扩散而言。与仅接受CMV载体的动物相比，对一些但并非全部TB插入物的T细胞应答在接受BCG和CMV载体两者的动物内的一些组织中较低，但是仍然需要确定这种或另一种机制(例如，BCG引发的促进细菌扩散的应答)是否解释了与BCG“初免”相关的减少的保护。保护的相关性对于肺外疾病高于肺病，并指向RpfA、RpfD、Ag85A、Rv2626和Rv3407(以及可能ESAT6)是最有效的疫苗插入物。
总之，RhCMV/TB载体-疫苗接种的RM显示出根据所有标准显著减轻的疾病(肺和肺外)。与BCG相比，RhCMV/TB载体引发并维持更高(和定性不同)的TB插入物特异性CD4+和CD8+ T细胞应答。RhCMV/TB载体疫苗接种提供了针对肺病和肺外疾病进展的显著保护(总体上为73％)。与未疫苗接种的对照相比，BCG与朝向适度肺保护的趋势相关，但肺外疾病与未疫苗接种的对照无差异。BCG和RhCMV/TB载体的组合不如单独RhCMV/TB载体疫苗接种有效，其中BCG组分减少肺和肺外保护。RhCMV/TB载体-疫苗接种的RM可表现出明显增强的对脊下LN中的感染的早期应答。结果(肺外扩散)主要与对Ag85A、Rpf-A/C/D、Rv3407、Rv2626和ESAT6的CD4+ T细胞应答相关。
实施例3：非人灵长类动物研究#2
第二项研究旨在证实和扩展在恒河猴中针对结核分枝杆菌的CMV诱导的保护的先前发现。在原始研究中，通过CMV载体(菌株68-1)的混合物诱导了显著保护，所述载体编码总计9种抗原。
第二NHP研究由四个疫苗组组成：1)菌株68-1 RhCMV/TB-9Ag载体组(n＝9)；2)菌株68-1.2RhCMV/TB-9Ag载体组(n＝9)；3)菌株68-1 RhCMV/TB-6Ag单一载体(n＝9)；4)未疫苗接种。组1)由用四种R h68-1载体(编码由Ag85A-Ag85B-Rv3407、Rv1733-Rv2626、RpfA-RpfC-RpfD和Ag85B-ESAT6组成的融合蛋白)的混合物进行疫苗接种的猕猴组成。组2)由用四种Rh68-1.2载体(编码由Ag85A-Ag85B-Rv3407、Rv1733-Rv2626、RpfA-RpfC-RpfD和Ag85B-ESAT6组成的融合蛋白)的混合物进行疫苗接种的猕猴组成。组3)由用单一Rh68-1载体(编码由Ag85A-ESAT6-Rv3407-Rv2626c-RpfA-RpfD组成的融合蛋白)进行疫苗接种的猕猴组成。
在第0周和第14周，用上述RhCMV/TB载体对组1)-3)中的NHP进行疫苗接种。在第55周，用结核分枝杆菌(Erdman E11-10mTB，以10CFU支气管内给予)激发NHP。在激发后不存在BAL。所分析的结果与上文实施例2中描述的那些结果相同。
第一研究中使用的4种Rh68-1载体在此再次使用(有关构建的信息，参见上文)。本研究中使用的四种Rh68-1.2载体中的三种编码经典的潜伏期和复苏抗原盒(编码分别由Ag85A-Ag85B-Rv3407、Rv1733-Rv2626和RpfA-RpfC-RpfD组成的融合蛋白)。还使用了编码六抗原融合蛋白(包含抗原Ag85A、ESAT6、Rv3407、Rv2626、RpfA和RpfD)的Rh68-1载体和编码Ag85B和ESAT6的Rh68-1.2载体。
使用细胞内细胞因子染色评价这些载体的免疫原性。图33示出在用RhCMV载体疫苗接种后的PBMC免疫应答；所有疫苗都显示出稳健的免疫原性。图34示出比较由每种RhCMV载体诱导的免疫原性；所有疫苗都显示出与常见插入物相当的免疫原性。图35示出用RhCMV载体疫苗接种后的BAL免疫应答。此外，对于菌株68-1RhCMV/TB载体(UL128/UL130-缺失的)，所有CD8+ T细胞应答均为MHC-II和MHC-E限制性的，而对于菌株68-1.2RhCMV/TB载体(UL128/UL130-完整的)，所有CD8+ T细胞应答均是MHC-Ia限制性的(数据未示出)。
图36示出Mtb激发后的外周血CFP10特异性T细胞应答。所有猴在激发后显示出对Mtb的从头应答。图37示出来自纵向CT扫描的临床结果数据，其用于量化激发后存在的肺病的体积。在每个疫苗接种组中存在保护的明显证据。图38和39分别示出尸检评分和培养物。图40示出菌株68-1 RhCMV/TB载体的总体功效。图41示出菌株68-1 RhCMV/TB-6Ag单一载体疫苗接种中的晚期疾病消退。图42示出在尸检时，在仅单一Mtb培养物的情况下，猴表现出疾病评分为10的病理程度。数据表明，菌株68-1 RhCMV载体引发的T细胞反应可能不仅能够预防TB病变的发展，而且还可能能够调节其消退。
总之，低剂量(10个细菌)Erdman E11-10菌株mTB激发导致比使用>25个细菌激发剂量的先前研究显著更少的侵袭性疾病，但是所有未疫苗接种的对照仍显示肺部和引流LN疾病。菌株68-1RhCMV/TB载体疫苗接种(9Ag载体组或单一6 Ag插入载体)在低剂量mTB激发后提供针对肺病和肺外疾病的显著保护：1)18例NHP中有10例(56％)没有感染的病理证据(其中7例也完全是培养阴性)对比未疫苗接种的对照的0％；和2)与疾病进展程度最小的未疫苗接种的对照相比，18例NHP中的12例(67％)疾病较少(如通过路径评分和培养所测量)；和3)菌株68-1 RhCMV/TB-6Ag单一载体的功效≥菌株68-1 RhCMV/TB-9Ag载体组的功效。菌株68-1.2RhCMV/TB-9Ag疫苗接种产生显著的总体保护。
此外，菌株68-1 RhCMV/TB载体疫苗接种在高剂量和低剂量支气管内Erdman菌株mTB激发后保护高度TB易感的恒河猴免于进行性肺和肺外TB疾病。在高剂量激发模型中，BCG没有显著保护性，并且BCG和菌株68-1 RhCMV/TB载体疫苗接种的组合比单独的菌株68-1 RhCMV/TB载体疫苗接种的保护性低。目前的数据表明，载体引发的CD4+ T细胞应答是主要的保护相关性。迄今为止，表达RhCMV载体的单一6 Ag(多聚蛋白)提供最佳的总体保护，但是仍然可能的是，不同的或另外的TB Ag插入物将提高功效。
实施例4：用于研究#3和#4的一般方法
恒河猴：
在研究3和4中使用了印度遗传背景的65只目的繁殖的纯种雄性RM(普通猕猴(Macaca mulatta))。在分配时，这些RM是无特定病原体(SPF)的，如通过不含猕猴疱疹病毒1、D型猿猴逆转录病毒、1型猿猴T淋巴细胞病毒、猿猴免疫缺陷病毒和Mtb所定义。本研究中使用的所有RM均圈养于俄勒冈州国家灵长类动物中心(Oregon National PrimateCenter，ONPRC)内的具有自主控制的温度、湿度和照明的动物生物安全水平(ABSL)-2(疫苗期)和ABSL-3室(激发期)内。由于研究的传染性质，RM是单笼圈养的，并且与其他动物具有视觉、听觉和嗅觉接触。由于RM是单笼圈养的，因此由非人灵长类动物行为专家设计并监督了增强的富集计划。将RM每天两次饲喂商业制备的灵长类食物，并且每天接受补充的新鲜水果或蔬菜。经由自动供水系统提供新鲜的饮用水。每天两次观察所有RM以评估食欲、态度、活动水平、水合状态和疾病证据(呼吸急促、呼吸困难、咳嗽)。在所有方案时间点进行身体检查，包括体重和全血计数。RM护理和所有实验方案和程序均由ONPRC批准。ONPRC是I类设施。ONPRC的实验室动物护理和使用计划完全获得美国实验动物护理认证协会(AmericanAssociation for Accreditation of Laboratory Animal Care，AAALAC)的认可，并且拥有经NIH预防研究风险办公室(NIH Office for Protection from Research Risks)认证的动物护理和使用的批准保证(#A3304-01)。IACUC遵守如由美国公共卫生服务政策规定的动物福利法(Animal Welfare Act，7U.S.C.章节2131-2159)和实验室动物护理和使用指南(Care and Use of Laboratory Animals，第8版)中建立的国家指南。
动物程序：
将RM用氯胺酮HCl或镇静，以用于皮内和皮下疫苗施用、静脉穿刺、支气管肺泡灌洗、淋巴结活检、支气管内Mtb接种和计算机断层扫描(CT)程序。将Mtb ErdmanK01稀释于盐水中，轻微超声处理，并使用支气管镜将细菌递送至右尾肺叶中的节段性支气管。研究3和4中的RM分别接受25和10个菌落形成单位(CFU)，体积为2ml。使用螺旋技术、准直3mm和螺距1.5(CereTom,Neurologica Corp.,Danvers,MA)，使用多断层CT扫描仪获得激发前和激发后的轴向CT扫描(2.5mm切片)，并重建为1.25mm切片以提高检测灵敏度。非离子碘化造影剂(Isovue 370,1-2ml/kg,Bracco Diagnostics,Princeton NJ)以1-2ml/s的速率静脉内施用。用120kVp和200mA获得CT扫描。将所有动物在激发前、在研究期间以两周时间间隔和临尸检前立即成像。扫描由兽医解释，兽医对受试者的身份不知情。使用IMPAX6.5.5.3020软件区域工具(AGFA HealthCare N.V.,Mortsel,Belgium)从穿过整个肺视野的横切片确定连续扫描中的病变面积，并通过将所述病变面积乘以1.25确定病变体积。一只RM发展广泛的双侧粟粒性疾病，估计病变体积>200,000mm3，并且在该动物中没有进行进一步尝试来估计病变体积。
尸检：
从研究中除去患有终末期TB的RM的人道标准如下：1)标志性嗜睡，2)基于脉搏血氧仪或血气分析在静息时严重呼吸困难和/或未能维持充分氧合(85％)，3)咯血，4)体重减轻(2周内>15％；在成年动物的任何时程内>25％)，5)在补充加热情况下低体温<96℉，6)持续性贫血(2周内<20％)，7)对口服补液疗法无响应的脱水持续3天，8)对自发性疾病疾患的治疗的无响应性，9)食欲不振，7天内需要超过3次口胃管进食，10)迟钝，11)神经缺陷，以及12)对位置或富集的变化无响应的持续性自我伤害行为。表现出一种或多种这些终末期标准的RM立即进行尸检。将在感染后第16周后保持临床良好的RM随机分组，并以每周两只的速率安排进行安乐死和尸检。由终末期疾病标准或随机化(指定为“其他”)引发的这种一般尸检规则有3个例外。研究3中的一个非终末期RM(D1)在与终末期RM的同一天被安乐死，因为IACUC不允许在一个房间内单独容纳单只RM。研究3中另外两只RM(N1，N3)被安乐死，因为在支气管肺泡灌洗程序后未能维持充分氧合作用，其不能归因于终末期Mtb疾病。为了在研究4中避免这个问题，在本研究中在激发后未进行BAL。
在人道或预定的终点，用戊巴比妥钠过剂量(>50mg/kg)对RM实施安乐死，并经由远端主动脉放血。尸检程序包括在进入胸腔之前对腹部器官和组织以及脑进行完整的大体病理学评估，以避免污染。对肝脏、脾脏、肾脏和脑中的肉眼可见的肉芽肿进行计数、测量并在连续的5mm组织切片中拍照，而在另外的胸部淋巴结、胃肠道和软组织中发生的肉芽肿被收集、测量并用最少的切片拍照并给予使用半定量分级系统的数值点值评分(参见图48)。将在这些组织中发生的肉芽肿(≤10)一分为二，并将一半收集在预先称重的无菌培养基管中用于分枝杆菌培养(参见下文)，并将剩余的一半浸入10％中性缓冲的福尔马林中用于组织学分析。选择代表性肉芽肿用于具有>10个肉芽肿的组织的分枝杆菌培养和组织学。单个小肉芽肿(≤1mm)完全用于细菌学。收集所有腹部器官和组织以及脑的代表性样品，且然后在10％中性缓冲的福尔马林中固定用于组织学分析。收集来自这些组织的额外样品用于单核分离和用于分枝杆菌培养。在进入胸腔时检查胸膜和胸壁，并且如所描述(参见图48)将肉眼可见的肉芽肿和粘连收集、计数、测量、拍照和评分粘连，并取样用于定量细菌学和组织学。整体取出胸部内脏，且然后转移至无菌砧板进行检查和解剖。在解剖期间，应非常谨慎以避免通过肉芽肿内容物的溢出引起胸膜组织的分枝杆菌污染，并且这在除1只RM(其中在打开胸腔后观察到肉芽肿内容物的严重溢出)之外的全部中完成。取出并检查心脏，并且解剖出肺部和纵隔淋巴结和单独肺叶，称重并拍照。将淋巴结分成用于分枝杆菌培养、组织病理学和单核细胞分离的样品(如果组织有限，则优先考虑分枝杆菌培养)。对单独肺叶中的肉眼可见的肉芽肿进行计数、测量、拍照并在连续的5mm组织切片中评分。使用无偏立体采样方法收获来自右肺和左肺切片的用于分枝杆菌培养和组织学的样品。将单个6mm肺组织核心(来自右肺的30个和来自左肺的10个)一分为二，并且在预先称重的无菌培养基管中收集一半用于细菌学，并将剩余的一半浸入10％中性缓冲的福尔马林中用于组织学分析。另外，收集所有肺叶和心脏的代表性样品并浸入10％中性缓冲的福尔马林中。用于组织学分析的组织常规加工并包埋在石蜡中。将切片(6mm)用苏木精和曙红染色。通过Ziehl-Neelsen方法对选择的组织染色以获得抗酸细菌。
疫苗：
通过细菌人工染色体(BAC)重组工程化构建68-1和68-1.2RhC MV/TB载体，并如前所述重构并扩增成载体制剂(Hansen等人,Natu re,2011,473,523-527；Hansen等人,Nature,2013,502,100-104；Hansen等人,Science,2013,340,1237874；以及Hansen等人,Nat.Med.,2009,15,293-299)。以通过11个标准对4000个Mtb开放阅读框进行评分开始，通过生物信息学选择标准选择待包含在这些载体中的Mtb Ag(Zvi等人,BMC Med.Genomics,2008,1,18)。那些标准包括免疫原性、疫苗功效、肉芽肿中的表达、分泌和在低氧存活中的作用。然后通过对预测的T细胞表位的更深入的生物信息学分析进一步筛选排在前面的候选物，并策划包括在TB感染的不同阶段期间有活性的抗原。此外，已显示所有抗原在小鼠激发模型中至少部分地有保护性。疫苗插入物的9种Mtb蛋白的最终选择包括来自Mtb Ag的所谓急性期(85A、85B、ESAT6)、潜伏期(Rv1733c、Rv3407、Rv2626c)和复苏(Rpf A、Rpf C和RpfD)类的3种代表性蛋白。对于68-1和68-1.2主链，这些9 Ag在4种不同的RhCMV/TB载体(待组合使用)中表达，如下：1)Ag85A/Ag85B/Rv3407(GenBank#KY611401)，2)Rv1733/Rv26226(GenBank#KY611402)，3)RpfA/RpfC/RpfD(G enBank#KY611403)，以及4)Ag85B/ESAT-6(GenBank#KY611404)。GenBank登录#对应于它们在最终载体中发现时的序列。将多聚蛋白#1-3插入在鼠CMV IE启动子控制下的非必需Rh211开放阅读框中。将多聚蛋白#4插入RhCMV基因组的相同区域，但在EF1α启动子的控制下(参见图46，图a)。对于单个表达6 Ag的68-1 RhC MV/TB载体，将由来自上述3种类别中的每一种的2个Ag组成的单个多聚蛋白插入物(急性：ESAT-6、Ag85A；潜伏：Rv3407、Rv2626；复苏：RpfA、RpfD；GenBank#KY611405)用于置换非必需Rh107基因，从而将其表达置于内源Rh107启动子的控制下(参见图46，图a和b)。通过限制性消化分析所有BAC以确认基因组完整性，并通过Illumina MiSeq测序仪上的下一代测序(NGS)进一步检查以确保转基因中不存在任何非预期的突变。为了重构疫苗载体，将BAC电穿孔到端粒化或原代恒河猴成纤维细胞中并保持培养直至达到完全细胞病变效应。此时，通过感染的细胞裂解物的免疫印迹证实转基因表达，并且通过OHSU分子病毒学支持核心(MVSC)产生疫苗原种。通过RM中的免疫印迹、NGS和初步免疫原性研究证实了最终疫苗原种的总体基因组完整性和转基因表达。另外，通过RT-PCR证实了与TB Ag插入位点相邻的ORF的表达。在TCID50测定中使用原代恒河猴成纤维细胞滴定RhCMV/TB载体原种。通过皮下施用5x 106pfu的每种指定的RhCMV/TB载体对研究3和4RM进行疫苗接种。对于接受4种载体组的RM，每个载体在单独的肢体(右臂、左臂、右腿、左腿)中施用。给予RM两次测试疫苗，在第一剂量后15周(研究1)或14周(研究2)施用第二剂量(同源加强)。BCG疫苗(丹麦菌株1331；批号111005A)从丹麦国立血清研究所(Copenhagen,Denmark)获得，并按照制造商的说明书(稀释剂批号386587B)进行复原。将R M通过皮内施用100μl含有5.5x 105CFU的疫苗到中背部中来进行BCG疫苗接种。
免疫学测定：
如前所述(Hansen等人,Science,2013,340,1237874；Hansen等人,Science,2016,351,714-720；以及Hansen等人,Nat.Med.,2009,15,293-299)，通过流式细胞术ICS在血液、BAL和组织中测量Mtb特异性CD4+和CD8+ T细胞应答。简言之，将来自血液、BAL或组织的单核细胞制剂在37℃下在潮湿的5％CO2气氛中与含有这些蛋白质的重叠的连续15-聚体肽混合物(11个氨基酸重叠)或来自这些蛋白质的单独15-聚体肽和共刺激分子CD28和CD49d(BDBiosciences)一起孵育1小时，然后添加布雷菲德菌素A(Sigma-Aldrich)持续另外8小时。没有抗原肽的共刺激充当本底对照。如先前所述(Hansen等人,Science,2016,351,714-720)，肽特异性应答的MHC限制(MHC-1a、MHC-E、MHC-II)通过将分离的单核细胞1小时在室温下与以下阻断剂一起预孵育(之后添加肽并按照标准ICS测定孵育)来确定：1)泛抗MHC-ImAb W6/32(10mg/ml)，2)MHC-II阻断CLIP肽(MHC-II相关不变链，氨基酸89-100；20μM)，和3)MHC-E阻断VL9肽(VMAPRTLLL；SEQ ID NO:31；20μM)。阻断试剂未洗涤，但在整个测定过程中保持不变。在孵育后，将刺激的细胞如先前所述固定、透化并使用以下荧光染料缀合的mAb的组合进行染色(Hansen等人,Science,2013,340,1237874；Hansen等人,Science,2016,351,714-720；以及Hansen等人,Nat.Med.,2009,15,293-299)：SP34-2(CD3；太平洋蓝，Alexa700)、L200(CD4；AmCyan，BV510)、SK-1(CD8α；PerCP-Cy5.5)、MAB11(TNF-α；FITC，PE)、B27(IFN-γ；APC)、FN50(CD69；PE，PE-德州红)、B56(Ki-67；FITC)以及在多细胞因子分析中JES6-5H4(IL-2；PE，PE Cy-7)。为了确定Mtb特异性CD8+ T细胞的细胞表面表型，如上所述刺激单核细胞，除了CD28共刺激mAb用作荧光染料缀合物以允许CD28表达水平随后通过流式细胞术评估，并且在这些实验中，将细胞在孵育后固定/透化之前针对谱系标记物CD3、CD4、CD8、CD95和CCR7(关于mAb克隆，参见下文)进行表面染色，且然后针对应答标记物(CD69、IFN-γ、TNF-α)进行细胞内染色。在LSR-II(BD Biosciences)上收集数据。使用FlowJo软件(Tree Star)进行分析。在所有分析中，对淋巴细胞群体进行门控，然后分离CD3+ T细胞亚群和对CD4+和CD8+ T细胞亚群的进行性门控。CD4+和CD8+ T细胞群体中的抗原应答细胞通过其CD69和一种或多种细胞因子(IFN-γ和TNF中的一种或两种；以及多细胞因子分析中的±IL-2)的细胞内表达来确定。在减去本底后，如先前所述(Hansen等人,Nature,2011,473,523-527和Hansen等人,Nat.Med.,2009,15,293-299)使用以下荧光染料缀合的mAb的组合对原始应答频率进行记忆校正以定义记忆亚群对比初始亚群SP34-2(CD3；Alexa700，PerCP-Cy5.5)、L200(CD4；AmCyan)、SK-1(CD8α；APC，PerCP-cy-5.5)、MAB11(TNF-α；FITC)、B27(IFN-γ；APC)、FN50(CD69；PE)、CD28.2(CD28；PE-德州红)、DX2(CD95；PE)、15053(CCR7；太平洋蓝)以及B56(Ki-67；FITC)。对于Mtb Ag特异性T细胞的记忆表型和多细胞因子分析，将表达CD69加一种或多种细胞因子的所有细胞首先进行布尔门控，且然后基于表面表型或细胞因子产生模式将这种总体Ag响应群体细分为目标亚群。
分枝杆菌培养：
在研究3和4中，在尸检时常规收集用于Mtb负荷分析的组织包括：来自右肺叶的30个体视学穿孔、来自左肺叶的10个穿孔、气管、左肺门LN、右肺门LN、左脊下LN、右脊下LN、气管旁LN、纵隔LN、腋窝LN、腹股沟LN、肠系膜LN、脾脏、胰腺、肝左内叶、肝右内叶、肝左外叶、肝右外叶、肝尾核、左肾和右肾。在研究4中，还收集并培养了咽后LN、扁桃体、颌下LN和髂骶LN。在研究4的一只RM中，由于胸部组织被肉芽肿内容物严重污染，所以未报告分枝杆菌培养分析。将组织收集在HBSS中，且然后在IKA研磨机管中用IKA Ultra-Turrax Tube Drive均质器均化。然后将组织匀浆物在70μm丝网上过滤以除去碎片，并将200μl的这种物质纯净地和以连续稀释(1/10，1/100)涂铺在7H11琼脂板(Remel)上。将所有板在37℃下孵育，并在28和42天后对结核分枝杆菌生长进行计数。以每克组织的CFU计算细菌负荷。如果鉴别出具有正确形态特征的任何菌落，则组织被认为是Mtb+。通过Ziehl-Neelsen方法针对抗酸细菌分析所选择的培养物以确认菌落形态特征。
用于统计分析的数据准备：
针对每项研究中治疗组之间差异的证据评价了三项结果量度：CT扫描面积-从激发至激发后第112天的曲线下，尸检时的病理学评分和尸检时的Mtb培养。通过这些结果量度(参见图49)，三个研究4疫苗组的等效性证明了汇总分析的合理性。对将尸检评分和培养结果组合成可在两种功效研究中评价的单一值的结果量度进行了评价。评估了这些结果与通过ICS测量的Mtb特异性T细胞应答之间的关联。
对数CT扫描确定的肺部疾病体积曲线下面积：计算从时间0(设定为0)至第112天的对数转换的CT扫描确定的肺部疾病体积测量值的AUC。推算了在完整系列的预定CT扫描时间点之前进行尸检的猴的遗失值。计算了这种增强数据的AUC。采用的推算程序使用线性回归来估计来自先前时间点的遗失值。作为敏感性分析，使用更保守的规则来推算遗失值(在接受相同处理的猴中，在同一时间点将遗失值替换为最大非遗失值，排除进一步保守性，一只高值异常值未疫苗接种的RM)；所得AUC对这种程序高度不敏感(两项研究的皮尔逊相关性均超过0.99)。
尸检评分数据：非负计数值尸检评分适用于泊松建模。模型评价支持在负二项模型中包含过离散的另外参数。在TB研究4中，估计的额外参数为零，因此这种模型等效于简单的泊松模型。对于这种泊松模型，采用方差-协方差矩阵的基于夹心的估计值作为解决过离散的替代方法，使用R中的夹心包中的vcovHC函数(Zeileis,J.Stat.Software,2004,11,1-17和Zeileis,J.Stat.Software,2006,16,1-16)。
尸检培养数据：尸检培养输入是培养物生长的定量测量值，每个组织具有多个重复。这些数据被视为培养物阳性对比阴性(零)的二元指标，并评价了阳性培养物的总数。尸检培养结果数据的模型评价有利于泊松模型中更具表现力的负二项模型，并且不支持使用ZIP模型。TB研究4(Rh30072)中的一只动物遗失尸检培养数据，但确实具有尸检评分数据；因此，对培养数据的分析排除了此RM，但如下所述，用于计算组合按比例缩放结果测量的遗失值被推算。
组合按比例缩放结果测量：如图50中所示，观察到每个研究中的尸检评分与尸检培养结果测量值之间的强相关性，尽管尺度不同：在两项研究中，尸检培养物大约是尸检评分的三分之一。创建中间的研究特异性的组合按比例缩放结果测量，以通过对这两个非常相似的结果测量值进行平均化来获得测量精度。为了确保每个在组合测量中接受相等的权重并保持离散性以支持统计的泊松分析，通过将尸检培养值乘以3然后将这些值加到尸检评分中来按比例缩放输入。对于研究4，一只RM(I3)具有遗失的尸检培养值。对于这只动物，使用推算的尸检培养值计算组合的按比例缩放的结果测量值，其通过将观察到的尸检评分值乘以来自使所述两个值相关的简单线性回归模型的估计系数而获得。该猴的尸检评分值为29，其推算的尸检培养值为8，并且其组合的按比例缩放的结果测量值为53。采用了这些研究特异性组合测量值对比治疗和研究的负二项回归模型，并使用估计的研究系数(0.3796)来进一步扩展TB研究3的组合的按比例缩放的结果值。因此，TB研究3RM的组合按比例缩放的结果变量是研究特异性值乘以0.3796且然后舍入以维持泊松分析的最终变量的离散性。
疫苗期结束T细胞应答数据：对靶向RhCMV疫苗中的9种单独基因和CFP10的CD4+和CD8+免疫应答的纵向流式细胞术ICS测量值进行了评价。这些数据的主要总结是疫苗期结束时免疫应答的量度。这些激发前基线免疫原性值是图42(图a)和图44(图a)中所示时间段内三次独立测量值的几何平均值。在对数转换和归一化之前计算超过6或9种抗原的总数。归一化将这些值移位并缩放以得到平均值零、标准偏差1，以使得此单位具有测量标准偏差数的z评分的解释，免疫测量(在对数尺度上)是来自该测量的总体(研究特异性)平均值。
统计分析：
所有统计分析均在R40中进行。
功效：非参数测试用于主要比较，并且参数模型用于估计治疗作用的置信区间。为了比较成对组之间的结果测量值，使用了双侧Wilcoxon检验。箱线图仅显示在0.05水平下显著的成对比较的未调整的p值。Holm调整用于指定的主要非参数比较：未疫苗接种与疫苗接种的TB研究3组之间，以及分开地在仅BCG与其他疫苗接种组之间。对于TB研究，4个类似地应用在单独未疫苗接种与疫苗接种的TB研究4组之间以及原始68-1 9Ag载体与两种修饰(68-1 6Ag和68-1.2 9Ag)之间的比较组内的Holm调整。箱线图显示未调整的p值；Holm调整的p值在图51中示出。疫苗功效被报告为100％-W，其中W是泊松或负二项式模型的估计速率(或置信限度)的100倍，其表示疫苗组中计数值结果测量(尸检评分、尸检培养或组合按比例缩放的结果测量)，作为未疫苗接种的RM的速率的一小部分。为了分析结果变量之间的相关性，使用Spearman秩转换相关统计(r)和检验。对于Spearman检验，使用R中的cor.test方法通过渐近t近似计算p值。
免疫原性和相关性分析：为了比较激发前基线处的接受疫苗的处理组的免疫原性，采用了Kruskal-Wallis(KW)检验。如果KW和Wilcoxon检验两者具有未调整的p值≤0.05，则箱线图表明成对Wilcoxon检验的显著性。由于遗失来自RM U6第41周的血液免疫学数据(研究3；仅BCG组)，对于图42(图d)，对于BCG组n＝6；并且对于图42(图c)，该RM的数据点仅使用2个而不是3个时间点进行平均化。为了分析与接受RhCMV和无BCG的RM之间的组合按比例缩放的结果测量(如上定义)的免疫应答相关性，计算了Spearman统计和检验，并且散点图还显示最佳拟合负二项模型的曲线。低相关性(参见图55)通过敏感性分析得到证实，所述敏感性分析还分别在每项研究中和每项结果测量中发现，因此缺乏显著性不是这些分析选择的假象。广泛非参数分析以及采用负二项模型来估计这种组合按比例缩放的测量与对RhCMV免疫原的激发前免疫应答之间的单参数和多参数关联的参数分析揭示了此结果或者其他相关结果的无统计支持的免疫相关性。
实施例5：研究#3和#4
为了初始检验由RhCMV/TB载体引发的TEM应答将表现出比BCG更高功效的假设，将3组RM(每组n＝7；在研究分配时所有天然RhCMV感染)用以下进行疫苗接种：1)单独RhCMV/TB载体(一组基于68-1菌株的4种RhCMV载体，它们共同表达9种不同的Mtb蛋白：ESAT-6、Ag85A、Ag85B、Rv3407、Rv1733、Rv2626、Rpf A、Rpf C、Rpf D；参见图46，图a)，2)单独BCG，和3)BCG、随后RhCMV/TB，根据图42，图a中概述的方案。如所预期，RhCMV/TB载体在血液中引发并维持对所有9种Mtb插入物的高频CD4+和CD8+ T细胞应答，如通过流式细胞术细胞内细胞因子(ICS)分析通过重叠15-聚体肽混合物诱导的细胞内TNF和/或IFN-γ表达所测量，并且在平稳期，这些应答主要是效应子分化的，从而表现为完全分化的TEM表型(CD8+)或混合的过渡和完全分化的TEM表型(CD4+)(参见图42，图b-d)。在ICS测定中有应答的大约一半的RhCMV/TB引发的Mtb Ag特异性CD4+和CD8+ T细胞产生TNF和IFN-γ(有或无IL-2)，其余的主要产生单独TNF(参见图42，图e)。BCG引发对9种插入物Ag中的8种(除了不由BCG22表达的ESAT-6之外的全部)的循环CD4+和CD8+ T细胞应答。这些应答主要表现为CD4+ T细胞的中心记忆表型和CD8+ T细胞的完全分化的TEM表型。然而，在外周血中，BCG引发的对这些Ag的T细胞应答的总体幅度比RhCMV/TB疫苗接种的RM中显著更少(5-10倍)，并且这些T细胞中的大多数产生单独TNF或IL-2(CD4+)或者单独TNF或IFN-γ(CD8+)，但不同时产生TNF和IFN-γ(参见图42，图b-e)。实际上，BCG诱导的对这些Ag的CD4+和CD8+ T细胞应答不足够大至相对于接受单独RhCMV/TB疫苗接种的RM可测量地改变接受BCG和RhCMV/TB两者的RM中TB Ag特异性应答的平稳期大小、表型和功能(参见图42，图b-e)。BCG疫苗接种的RM与RhCMV/TB疫苗接种的RM之间应答幅度的差异在支气管肺泡灌洗(BAL)液中较不明显，其中后者组中的应答仅略高于前者组(参见图42，图f)。
参考图42，示出研究3中RhCMV/TB和BCG疫苗的免疫原性。图a是研究3的疫苗接种和激发方案以及RM组的示意图。图b示出在用指定疫苗进行疫苗接种后对9种Mtb插入蛋白的总体CD4+和CD8+ T细胞应答的纵向分析。将通过流式细胞术ICS测定确定的记忆CD4+或CD8+ T细胞亚群内对包含每种Mtb蛋白的肽混合物有应答(TNF和/或IFN-γ产生)的细胞的扣除本底的频率进行相加，其中数字示出在每个时间点的这些总体(相加的)应答的平均值(±SEM)。图c示出比较在疫苗期结束时疫苗组之间外周血中的单独Mtb蛋白(9种Mtb插入物中的每种加非插入CFP-10)特异性和总体(相加的)Mtb特异性CD4+和CD8+ T细胞应答频率(由TNF和/或IFN-γ定义)的箱线图(每个数据点是来自第44-49周的3个单独样品中的应答频率的平均值；表示未检测到应答)。图d示出比较疫苗期结束时(第47周)外周血中对Ag85A有应答的疫苗引发的CD4+和CD8+记忆T细胞的记忆分化与TNF和/或IFN-γ产生的箱线图。记忆分化状态是基于CD28对比CCR7表达，从而描绘中心记忆(TCM)、移行效应记忆(TTREM)和效应记忆(TEM)，如所指定的。图e示出比较在疫苗期结束时(第49周)外周血中对Ag85A有应答的疫苗引发的CD4+和CD8+记忆T细胞的频率与单独和所有组合的TNF、IFN-γ和IL-2产生的箱线图。图f示出比较疫苗期结束时(第46-47周；表示未检测到应答)疫苗组之间支气管肺泡灌洗(BAL)液中单独Mtb蛋白特异性和总体(相加的)Mtb特异性CD4+和CD8+T细胞应答频率(由TNF和/或IFN-γ产生定义)的箱线图。在图c-f中，Kruskal-Wallis(KW)检验用于确定疫苗组之间差异的显著性，其中如果KW p值≤0.05，则Wilcoxon秩和检验用于进行成对分析；括号表示成对比较，其中Wilcoxon p值≤0.05。
参考图46，示出RhCMV/TB载体的描述。图a是示出RhCMV68-1和68-1.2BAC主链中TBAg盒的插入位点的图。前4种构建体使用外源启动子(MCMV IE或EF1α)来驱动插入物表达，而底部的构建体(68-1 RhCMV/TB-6Ag)用6 Ag插入物置换Rh107开放阅读框，并依赖于内源性Rh107启动子调控插入物表达。图b示出68-1RhCMV/TB-6Ag载体的RT-PCR分析，从而证实Rh107的缺失、6 Ag TB插入物的伴随表达以及IE1和相邻Rh108开放阅读框的未改变的表达。在该实验中，用感染复数(MOI)为3的载体感染端粒化的恒河猴成纤维细胞(TRF)，并且收获RNA并在感染后48小时产生cDNA。使用对指定基因的内部区域具有特异性的引物进行RT-PCR，以证明Rh107的缺失和6Ag插入物的表达以及周围的开放阅读框。图c示出68-1RhCMV/TB-6Ag载体对HA标记的6 Ag插入物表达(箭头)的蛋白质印迹分析。将TRF用RhCMV68-1或68-1 RhCMV/TB-6Ag载体(RhCMV68-1ΔRh107-TB6Ag)以MOI＝3感染，在完全细胞病变效应下收获，并进行针对HA标签的蛋白质印迹。用表达6 Ag插入物的质粒(pOri-TB6Ag)转染的HeLa细胞显示为对照。
在初始疫苗接种后50周，3组疫苗接种的RM和未疫苗接种的RM(n＝8；也是天然CMV+)的对照组通过支气管内滴注25个菌落形成单位(CFU)的Erdman菌株Mtb细菌进入右下叶来进行激发。通过在所有RM中对CFP-10Ag的CD4+和CD8+ T细胞应答的从头开发证实了激发的有效性(参见图43，图a；和图47，图a；Mtb表达的CFP-10Ag不包括于RhCMV/TB载体中，并且与ESAT-6一样，不由BCG22表达)。每两周通过CT扫描评估病变体积来监测激发后肺病的发展，但在尸检(参见方法)时通过病理学检查(病理学评分；参见图48)和通过广泛分枝杆菌培养肺(使用体视学取样)以及肺部引流和其他胸部淋巴结(LN)、外周LN和选定器官(脾脏、肝脏、肾脏、胰腺)来确定主要结果，在临床终点或在感染后(pi)20周后随机进行尸检(参见图42，图a)。肺病在未疫苗接种的对照RM中迅速发展，通过CT扫描在感染后第56天在7/8RM中并且在感染后第98天在所有RM进展至严重(>10,000mm3)肺实质疾病(参见图43，图b)。在接受BCG的两个RM组中，肺病的发展变化较大，但每组中7只RM中的5只在感染后第98天发展严重疾病。相比之下，使用单独RhCMV/TB载体进行疫苗接种的7只RM中的5只仅发展轻度肺病(<3,000mm3，n＝4)或无疾病(n＝1)，并且在感染后前16周期间该组的肺部病变体积的总体曲线下面积(AUC)与未疫苗接种的对照组相比显著减小(参见图43，图c和图49，图a)。
参考图43，示出Mtb激发(研究3)的结果。图a示出在Mtb激发后通过流式细胞术ICS分析在所有研究3RM中对包含非疫苗插入物Mtb蛋白CFP-10的肽混合物的外周血CD4+ T细胞应答的发展(由在记忆亚群中减去本底后的TNF和/或IFN-γ产生定义的应答；CFP-10特异性CD8+ T细胞应答，示于图47，图a中)。图b示出在Mtb激发后肺实质中疾病体积的CT定量(存在或不存在由闭合符号对比空心符号表示的引流LN扩大)。图c示出比较4个RM组的CT确定的肺部病变体积(第0-112天)的AUC的箱线图。图d-e示出比较肺实质(图d)、所有非肺实质组织(图e)和所有组织(图f)中的通过用分枝杆菌培养进行的Mtb恢复和病理性疾病评分测量的尸检时TB的程度的箱线图。在图c-f中，示出未调整的Wilcoxon p值≤0.05(参见图49，图a)。
参考图47，示出在Mtb激发后的从头Mtb特异性CD8+ T细胞应答的发展。图a和b示出在Mtb激发后通过流式细胞术ICS分析在研究3(图a)和研究4(图b)RM中对包含非疫苗插入物Mtb蛋白CFP-10的肽混合物的外周血CD8+ T细胞应答的发展(由在记忆亚群中减去本底后的TNF和/或IFN-γ产生定义的应答)。相应的CFP-10特异性CD4+ T细胞应答在图43，图a和图45，图a中示出。所有Mtb激发的RM(包括未表现出激发后疾病的疫苗接种的RM)显示具有高于阈值的CFP-10特异性CD4+和CD8+ T细胞应答的多个激发后样品，从而表明对激发的从头应答。图c示出在接受缺乏这些插入物Ag的RhCMV/TB-6Ag疫苗的研究4，组3RM中对包含Ag85B、Rv1733和Rpf蛋白的肽混合物的外周血CD8+ T细胞应答的发展(相应的CD4+ T细胞应答在图45，图b中示出)。再次，在所有组3RM中观察到对这些3Mtb蛋白的应答的从头激发后诱导。
参考图48，示出尸检时TB疾病的病理学评分。所述表示出用于量化研究3和4RM中尸检时TB疾病的病理程度的标准和评分系统。注意，每只RM接受7个肺叶、胸壁、每个单独淋巴结组(胸部和非胸部)、肝脏、脾脏和每个其它涉及的器官的单独评分，这些评分的总和是总体病理学评分。7个肺叶的评分的总和是肺病理评分，所有其他评分(包括胸壁和淋巴结)的总和是非肺病理评分。所有评分(肺和非肺)的总和是总体病理评分。
参考图49，示出结果统计的总结。图a和b示出研究3分析。图c和d示出研究4分析。图e示出组合分析。
如通过病理评分和分枝杆菌培养测量，CT测定的感染后到第16周时的病变AUC与尸检时的肺实质疾病密切相关(参见图50，图a)，并且因此通过这两种量度，在尸检时肺病的程度与未疫苗接种的对照相比在RhCMV/TB载体组中显著降低(参见图43，图d和图49，图a)。通过任一尸检测量，在仅BCG疫苗接种的群组中未观察到显著肺病减轻，并且BCG+RhCMV/TB疫苗方案仅导致分枝杆菌负荷的适度减少。在给予这种剂量的Erdman菌株Mtb的RM中TB通常不限于肺实质，并且尸检分析揭示未疫苗接种的RM中的广泛肺外疾病，包括肺相关淋巴结受累和胸外扩散(参见图51)。如通过病理学评分测量的疾病程度与通过分枝杆菌培养测量的疾病的程度密切相关(参见图50，图b)，并且根据这两个标准，肺外疾病在RhCMV/TB疫苗接种的群组中显著减轻，从而产生相对于未疫苗接种的RM该群组中的疾病总体程度显著降低(参见图43，图e和f；图49，图a；和图51)。通过泊松建模，相对于未疫苗接种的对照，疾病总体程度在RhCMV/TB疫苗接种的组中根据分枝杆菌培养降低68.7％(P<0.0001)，并且根据病理学评分降低67.3％(P<0.0001)(参见图49，图b)。相比之下，根据任一标准在仅BCG疫苗接种的RM中肺外和总体疾病的程度与未疫苗接种的RM没有显著差异，并且与这个一致，给予单独RhCMV/TB疫苗的RM中的肺外和总体疾病的程度也与仅BCG疫苗接种的RM相比显著降低。使用相同的泊松建模，对于分枝杆菌培养和病理学评分，RhCMV/TB疫苗接种相对于BCG疫苗接种使总体疾病分别减轻57.7％(P＝0.0007)和51.4％(P＝0.01)(参见图49，图b)。在初始RhCMV/TB疫苗接种前6周用BCG对RM进行前-疫苗接种似乎显著降低单独RhCMV/TB疫苗接种的肺外以及肺部功效，因为BCG+RhCMV/TB疫苗接种的组仅显示相对于未疫苗接种的对照在所有部位的分枝杆菌恢复中的非常适度降低(参见图43，图d-f；图49，图a；和图51)。
参考图50，示出TB感染结果的不同测量值的比较。图a和b示出如通过CT扫描确定的感染后疾病体积(至第112天的AUC)所测量的肺实质疾病对比研究3RM的尸检时肺样品的Mtb培养物(图a)和肺病理学评分(图b)的相关性。图c示出在研究3RM的尸检时总体Mtb培养物对比总体病理学评分的相关性。图c和d示出研究4RM的相同分析。Spearman相关系数(r)和相关的p值在每个图中示出。
参考图51，示出研究3的尸检时TB疾病结果的总结。对于每个单独的研究3RM，示出通过分枝杆菌培养(#阳性培养物；左y轴)和病理学评分(右y轴；参见图48)确定的Mtb疾病的肺、非肺和总体程度。
为了确认并进一步表征RhCMV/TB功效，使用较低剂量的Erdman菌株进行第二更大的Mtb激发研究(每组n＝9RM；在分配时全部RhCMV+)，并且其中将在研究3(第1组)中使用的相同68-1RhCMV/TB-9 Ag疫苗与基于68-1.2载体主链的类似RhCMV/TB-9Ag)疫苗(其中修复的Rh157.5和Rh157.4表达导致不同的CD8+ T细胞表位靶向；组2)和表达6-Ag Mtb多聚蛋白(Ag85A；ESAT-6；Rv3407；Rv2626；Rpf A；Rpf D)的单一68-1 RhCMV/TB-6 Ag载体(组3)进行了比较(参见图44，图a；图46)。68-1 RhCMV载体引发受MHC-II和MHC-E限制的非常规CD8+ T细胞应答，而由68-1.2RhCMV载体引发的CD8+ T细胞应答常规地受MHC-1a限制；因此，组1对比组2的比较允许确定非常规限制的CD8+ T细胞对RhCMV/TB功效的贡献。在组1对比组3比较中，确定了在编码9种Mtb Ag(急性期、潜伏期和复苏Ag类型各3种)的4种RhCMV/TB载体组情况下观察到的功效是否能够通过表达6种Mtb Ag(来自这些Ag类型各2种)的单一RhCMV/TB载体(其更适合于临床翻译)重演。由68-1和68-1.2RhCMV/TB-9 Ag载体引发的总体Mtb特异性和单独Mtb插入物特异性CD4+和CD8+ T细胞应答的幅度在整个疫苗接种期的血液中并且在疫苗接种期结束时的BAL和淋巴结中是相当的，血液中Mtb特异性应答的记忆分化和功能表型也如此(参见图44，图b-g)。然而，由68-1 RhCMV/TB疫苗引发的CD8+ T细胞非常规地(MHC-II和MHC-E)受限制，而由68-1.2RhCMV/TB疫苗引发的那些常规地(MHC-Ia)受限制(参见，图52)。针对对于68-1 RhCMV/TB-6 Ag和RhCMV/TB-9 Ag疫苗两者常见的6种Ag的观察到的免疫应答在组1与组3之间关于幅度、表型和(非常规)MHC限制方面相似，除了LN中CD8+ T细胞应答的水平略有不同(参见图44，图b-g；图52)。
参考图3，示出RhCMV/TB疫苗的免疫原性(研究4)。图a示出研究4的疫苗接种和激发方案以及RM组的示意图。图b示出在用指定疫苗进行疫苗接种后对9种Mtb Ag的总体CD4+和CD8+ T细胞应答的纵向分析，如在图42，图b中所描述。图c示出比较在疫苗期结束时疫苗组之间外周血中的单独Mtb蛋白(9种Mtb插入物中的每种加非插入CFP-10)特异性和总体(相加的)Mtb特异性CD4+和CD8+T细胞应答频率(由TNF和/或IFN-γ定义)的箱线图(每个数据点是来自第49-55周的3个单独样品中的应答频率的平均值；表示未检测到应答)。图d示出比较疫苗期结束时(第51-52周)外周血中对Ag85A有应答的疫苗引发的CD4+和CD8+记忆T细胞的记忆分化(参见图42，图d)与TNF和/或IFN-γ产生的箱线图。图e示出比较在疫苗期结束时(第49-50周)外周血中对Ag85A有应答的疫苗引发的CD4+和CD8+记忆T细胞的频率与单独和所有组合的TNF、IFN-γ和/或IL-2的箱线图。图f和g示出比较疫苗期结束时(第46-47周；表示未检测到应答)疫苗组之间BAL(图f)和外周LN(图g)中单独Mtb蛋白(9Mtb插入物加非插入CFP-10)特异性和总体(相加的)Mtb特异性CD4+和CD8+ T细胞应答频率(由TNF和/或IFN-γ产生定义)的箱线图。在图c-g中，如图42中所描述进行统计，其中括号表示成对比较，其中Wilcoxon p值≤0.05。
参考图52，示出研究4中RhCMV/TB载体引发的CD8+ T细胞应答的MHC-限制性分析。使用流式细胞术ICS，RhCMV/TB疫苗引发的CD8+ T细胞在来自研究4的代表性组1、2和3RM中进行表位作图，以检测构成所示TB蛋白的每个连续的重叠15-聚体gag肽的识别。产生特异性CD8+ T细胞应答的肽通过框表示，其中框的颜色表示如通过用抗泛-MHC-I mAb W6/32、MHC-E阻断肽VL9和MHC-II阻断肽CLIP测定的MHC限制。在此产生了菌株68-1RhCMV/Ag85B/ESAT-6-和RhCMV/Rpf A/Rpf C/Rpf D引发的对Rpf A、Ag85B和ESAT-6的CD8+应答的表位限制谱，以用于与这些载体的68-1.2型式比较以及用于Rpf A和ESAT-6与68-1RhCMV/TB-6Ag载体的比较。
在56周疫苗接种期后，将组1-3中所有27只疫苗接种的RM和9只RhCMV+未疫苗接种的对照RM(组4)用10CFU的Erdman菌株Mtb细菌进行支气管内激发-相对于研究3的剂量减少，意图使研究4RM中的TB进展减缓以更接近于人Mtb感染的过程。此外，在该实验中未进行激发后BAL以防止程序相关的死亡或肺内细菌的扩散增强。所有RM在激发后在血液中发展从头CFP-10特异性T细胞应答，并且RhCMV/TB-6 Ag疫苗接种的RM(组3)也在血液中发展对Ag85B、Rpf C和Rv1733 Ag(其未包括在它们的疫苗中)的从头T细胞应答(参见图45，图a和b；图47，图b和c)。所有9只未疫苗接种的(组4)RM到感染后28天在CT扫描中发展TB病变，但是，如所预期，该研究中的疾病进展比研究3中更慢(参见图45，图c)，并且仅2只未疫苗接种的(组4)对照RM在观察过程中发展终点TB疾病(参见图44，图a)。值得注意的是，27只疫苗接种的RM中的13只(组1和组3中各5只；组2中3只)在直至感染后>16周的随机选择性尸检的任何时间点都未发展肺TB的任何放射学征象(包括无肺门腺病)，并且疫苗接种的RM的总体群组的肺实质中的平均CT确定的病变AUC与未疫苗接种组相比显著降低(参见图45，图c和d；图49，图c)。在尸检时，来自疫苗组1-3的13只CT阴性RM中没有一只表现出任何肉眼可见的肉芽肿性疾病，并且这13只中的10只在所有组织中均为培养阴性(其余3只在肺引流淋巴结中为Mtb+；参见图50，图c和d；图54)。尽管在肺、肺引流和外周淋巴结以及脾脏中发展了对在其疫苗中的Mtb蛋白的CD4+和CD8+ T细胞应答(参见图53)，但在这些13TB无疾病RM中肺和肺引流淋巴结切片的组织病理学检查显示无肉芽肿性炎症。根据分枝杆菌培养和病理学评分的总体疾病程度在该实验中强烈相关(参见图50，图d)，并且与未疫苗接种的组相比，在总体(合并的组1-3)RhCMV/TB疫苗接种组中显著降低，其中在单独组1-3之间无功效的显著差异，并且在肺组织和非肺组织中的保护作用相似(参见图45，图e-g；图49，图c；图54)。对于合并的疫苗接种组，使用泊松建模，相对于未疫苗接种的对照组，疾病程度的总体降低根据分枝杆菌培养为74.5％(P＝0.0024)并且根据病理学评分为61.4％(P＝0.0011)(参见图51)。使用68-1.2RhCMV/TB疫苗接种的功效的发现表明，功效不依赖于非常规MHC-II和MHC-E限制性CD8+ T细胞，从而表明保护可通过常规或非常规CD8+ T细胞介导，或者完全独立于CD8+ T细胞。
参考图45，示出Mtb激发(研究4和总体)的结果。图a和b示出在Mtb激发后通过流式细胞术ICS分析，在所有研究4RM中对包含非疫苗插入物Mtb蛋白CFP-10的肽混合物(图a)和在仅组3RM中对包含Ag85B、Rv1733和Rpf蛋白的肽混合物(图b；用缺乏这3种插入物的单一68-1 RhCMV/TB-6Ag载体疫苗接种的RM)的外周血CD4+ T细胞应答的发展，如图43，图a中所描述(对这些相同Ag的外周血CD8+ T细胞应答和组织CD4+和CD8+ T细胞应答分别在图47，图b和c以及图53中示出)。图c示出在Mtb激发后肺实质中疾病体积的CT定量(存在或不存在由闭合符号对比空心符号表示的引流LN扩大)。图d示出比较未疫苗接种的RM对比所有RhCMV/TB疫苗接种的RM对比每个单独RhCMV/TB疫苗组中的RM的CT确定的肺部病变体积(第0-112天)的AUC的箱线图。图e-g示出比较相同RM组中肺实质(图e)、所有非肺实质组织(图f)和所有组织(图g)中的通过用分枝杆菌培养进行的Mtb恢复和病理性疾病评分测量的尸检时TB的程度的箱线图。图h示出比较在研究3和4中使用组合分枝杆菌培养和病理学评评分据的按比例缩放结果测量值，在所有未疫苗接种的RM对比所有仅RhCMV/TB疫苗接种的RM中Mtb激发的结果的箱线图。在图d-h中，示出未调整的Wilcoxon p值≤0.05(参见图49，图c)。
参考图53，示出尸检时对非疫苗引发的Mtb特异性CD4+和CD8+ T细胞应答的分析(对Mtb激发的应答)。图a示出流式细胞术ICS分析，其证明1只研究3RM和13只研究4RM(分别来自组1、2和3的5、3和5只)中对包含非疫苗插入物Mtb蛋白CFP10的肽混合物的外周血和组织CD4+和CD8+ T细胞应答，而没有在尸检时TB疾病的病理学证据(参见图50和54；由在记忆亚群中减去本底后的TNF和/或IFN-γ产生定义的应答)。图b示出在5只研究4，组3RM(用缺乏这些插入物的RhCMV/TB-6 Ag疫苗进行疫苗接种)中对包含Ag85B、Rv1733和Rpf蛋白的肽混合物的T细胞应答的类似分析，所述RM在激发后未表现出TB疾病。这些数据证实这些受保护的猴在激发后充分暴露于Mtb感染，以对其疫苗中不存在的TB蛋白发展稳健全身应答。
参考图54，示出研究4的尸检时结果的总结。对于每个单独的研究4RM，示出通过分枝杆菌培养(#阳性培养物；左y轴)和病理学评分(右y轴；参见图48)确定的Mtb疾病的肺、非肺和总体程度。
值得注意的是，尽管事实上研究3和4中未疫苗接种的对照猴中的平均TB进展程度差异很大，但在RhCMV/TB疫苗接种的情况下疾病的减轻在两项研究中相似。实际上，使用基于分枝杆菌培养和病理学评分的归一化组合结果参数，估计在两项研究中，相对于未疫苗接种的对照，RhCMV/TB疫苗接种的RM中的疾病程度降低68％(P＝0.0019)(参见图45，图h；图51)。与RhCMV/SIV疫苗针对快速进展性SIV感染的“全部或无”功效相比，由RhCMV/TB提供的针对更缓慢进行性Mtb感染的保护似乎是分级的，包括具有明显灭菌保护的RM、没有肉眼可见的疾病但具有非常局灶性的细菌持久性的RM，和与未疫苗接种的对照相比具有降低的进展的更高比例的RM(参见图50和54)。然而，也存在疫苗接种的RM，其发展与未疫苗接种的对照类似的进行性和最终致命的TB疾病。在激发前血液、BAL或LN中通过RhCMV/TB引发的、TNF/IFN-γ定义的CD4+或CD8+ T细胞应答幅度未预测这种结果异质性(参见图55)。在RhCMV/TB疫苗接种前6周BCG疫苗接种在近1年后降低功效的观察结果支持了分枝杆菌诱导的免疫应答确实包含抗保护组分的概念。
参考图55，示出研究3和4的免疫相关性分析。图a和b示出外周血(图a)和BAL(图b)中疫苗期结束时总体TB特异性CD4+和CD8+ T细胞应答与图45中使用的将尸检时的分枝杆菌培养和病理学评分数据组合的相同按比例缩放的结果测量之间的关系，对于仅接受RhCMV/TB疫苗的所有研究3和4RM示于图h。T细胞应答反映了对ESAT-6、Ag85A、Ag85B、Rv3407、Rv1733、Rv2626、Rpf A、Rpf C、Rpf D Ag的应答的总和，并以z评分(在疫苗期结束时猴的归一化的总免疫应答高于所述研究中猴的平均值的标准偏差的数量)的单位表示。图c示出对RhCMV/TB疫苗接种的研究4RM中的外周淋巴结中的总体Mtb特异性CD4+和CD8+ T细胞应答的相同分析(在研究3中未进行淋巴结活检)。Spearman相关系数(r)和相关的P值在每个图中示出，其中最佳拟合负二项式曲线重叠。对于外周血中的整个疫苗期的总AUCCD4+或CD8+ T细胞应答，以及对于在激发前所有RhCMV/TB疫苗接种的RM常见的仅6 Ag或对任何单独Mtb Ag的外周血、BAL和淋巴结应答，观察到类似的结果(缺乏显著相关性)。
这些研究表明，胃肠外施用的基于RhCMV的疫苗能够在至少一年的过程中引发和维持效应物应答，所述应答可在感染早期控制Mtb，并且如果不灭菌，则由这种疫苗提供的保护作用可以是完全的。据我们所知，这是RM模型中TB的完全预防的第一次报告。鉴于对天然、持续性CMV感染的TEM应答终生维持，由这种载体平台提供的保护可能非常持久，可能是终身的。RhCMV/TB疫苗针对RM中的侵袭性TB是有效的，并且提供一种人CMV/TB疫苗治疗，其将有效预防青少年和成人的肺性TB且由此有助于结束全球TB流行。
在研究3和4两者中，如通过病理学评分和分枝杆菌培养阳性组织的频率所测量，与未疫苗接种的对照相比，RhCMV/TB疫苗接种将尸检时的疾病程度降低68％(P＝0.0019)。用68-1对比68-1.2RhCMV载体主链(其在CD8+ T细胞表位识别方面不同)或用表达9种对比6种Mtb蛋白的68-1 RhCMV载体进行疫苗接种的群组之间的功效没有显著差异。相比之下，BCG在这种激发模型中不是显著有效的，并且在RhCMV/TB疫苗接种前6周施用BCG降低后一种疫苗的功效。在两项研究中，34只RhCMV/TB疫苗接种的RM中的14只(41％)在尸检时未显示肉芽肿性疾病(对比17只未疫苗接种的对照中0只；P＝0.0018)，尽管存在激发后初始感染的免疫学证据，并且这些中的10只在所有组织中是分枝杆菌培养阴性的。因此，RhCMV/TB疫苗在RM模型中优于BCG，并且是被证明可完全预防灵长类动物中的进行性TB的第一种疫苗。
除本文所述的那些修改之外，所描述主题的各种修改也将为本领域的技术人员根据以上描述所显而易知。此类修改也意图属于所附权利要求书的范围内。本申请中引用的每个参考文献(包括但不限于杂志文章、美国专利和非美国专利、专利申请公布、国际专利申请公布、基因库登录号等)以引用的方式整体并入本文。
序列表
<110> Aeras基金会
俄勒冈健康与科学大学
<120> 作为结核病疫苗的重组巨细胞病毒载体
<130> 189107.01502
<140>
<141>
<150> 62/353,432
<151> 2016-06-22
<150> 62/478,099
<151> 2017-03-29
<160> 31
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 1017
<212> DNA
<213> 结核分枝杆菌
<220>
<223> Ag85A
<400> 1
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<211> 338
<212> PRT
<213> 结核分枝杆菌
<220>
<223> Ag85A
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Arg Leu Val Val Gly Ala Val Gly Ala Ala Leu Val Ser Gly Leu Val
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Gly Ala Val Gly Gly Thr Ala Thr Ala Gly Ala Phe Ser Arg Pro Gly
35 40 45
Leu Pro Val Glu Tyr Leu Gln Val Pro Ser Pro Ser Met Gly Arg Asp
50 55 60
Ile Lys Val Gln Phe Gln Ser Gly Gly Ala Asn Ser Pro Ala Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Leu Asp Gly Leu Arg Ala Gln Asp Asp Phe Ser Gly Trp Asp Ile
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Met Pro Val Gly Gly Gln Ser Ser Phe Tyr Ser Asp Trp Tyr Gln Pro
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Thr Ser Glu Leu Pro Gly Trp Leu Gln Ala Asn Arg His Val Lys Pro
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210 215 220
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Gly Lys Pro Ser Asp Leu Gly Gly Asn Asn Leu Pro Ala Lys Phe Leu
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275 280 285
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Glu Tyr Trp Gly Ala Gln Leu Asn Ala Met Lys Gly Asp Leu Gln Ser
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Ser Leu Gly Ala Gly
325
<210> 5
<211> 300
<212> DNA
<213> 结核分枝杆菌
<220>
<223> Rv3407
<400> 5
atgcgtgcta ccgttgggct tgtggaggca atcggaatcc gagaactaag acagcacgca 60
tcgcgatacc tcgcccgggt tgaagccggc gaggaacttg gcgtcaccaa caaaggaaga 120
cttgtggccc gactcatccc ggtgcaggcc gcggagcgtt ctcgcgaagc cctgattgaa 180
tcaggtgtcc tgattccggc tcgtcgtcca caaaaccttc tcgacgtcac cgccgaaccg 240
gcgcgcggcc gcaagcgcac cctgtccgat gttctcaacg aaatgcgcga cgagcagtga 300
<210> 6
<211> 99
<212> PRT
<213> 结核分枝杆菌
<220>
<223> Rv3407
<400> 6
Met Arg Ala Thr Val Gly Leu Val Glu Ala Ile Gly Ile Arg Glu Leu
1 5 10 15
Arg Gln His Ala Ser Arg Tyr Leu Ala Arg Val Glu Ala Gly Glu Glu
20 25 30
Leu Gly Val Thr Asn Lys Gly Arg Leu Val Ala Arg Leu Ile Pro Val
35 40 45
Gln Ala Ala Glu Arg Ser Arg Glu Ala Leu Ile Glu Ser Gly Val Leu
50 55 60
Ile Pro Ala Arg Arg Pro Gln Asn Leu Leu Asp Val Thr Ala Glu Pro
65 70 75 80
Ala Arg Gly Arg Lys Arg Thr Leu Ser Asp Val Leu Asn Glu Met Arg
85 90 95
Asp Glu Gln
<210> 7
<211> 633
<212> DNA
<213> 结核分枝杆菌
<220>
<223> Rv1733
<400> 7
atgatcgcca caacccgcga tcgtgaagga gccaccatga tcacgtttag gctgcgcttg 60
ccgtgccgga cgatactgcg ggtgttcagc cgcaatccgc tggtgcgtgg gacggatcga 120
ctcgaggcgg tcgtcatgct gctggccgtc acggtctcgc tgctgactat cccgttcgcc 180
gccgcggccg gcaccgcagt ccaggattcc cgcagccacg tctatgccca ccaggcccag 240
acccgccatc ccgcaaccgc gaccgtgatc gatcacgagg gggtgatcga cagcaacacg 300
accgccacgt cagcgccgcc gcgcacgaag atcaccgtgc ctgcccgatg ggtcgtgaac 360
ggaatagaac gcagcggtga ggtcaacgcg aagccgggaa ccaaatccgg tgaccgcgtc 420
ggcatttggg tcgacagtgc cggtcagctg gtcgatgaac cagctccgcc ggcccgtgcc 480
attgcggatg cggccctggc cgccttggga ctctggttga gcgtcgccgc ggttgcgggc 540
gccctgctgg cgctcactcg ggcgattctg atccgcgttc gcaacgccag ttggcaacac 600
gacatcgaca gcctgttctg cacgcagcgg tga 633
<210> 8
<211> 210
<212> PRT
<213> 结核分枝杆菌
<220>
<223> Rv1733
<400> 8
Met Ile Ala Thr Thr Arg Asp Arg Glu Gly Ala Thr Met Ile Thr Phe
1 5 10 15
Arg Leu Arg Leu Pro Cys Arg Thr Ile Leu Arg Val Phe Ser Arg Asn
20 25 30
Pro Leu Val Arg Gly Thr Asp Arg Leu Glu Ala Val Val Met Leu Leu
35 40 45
Ala Val Thr Val Ser Leu Leu Thr Ile Pro Phe Ala Ala Ala Ala Gly
50 55 60
Thr Ala Val Gln Asp Ser Arg Ser His Val Tyr Ala His Gln Ala Gln
65 70 75 80
Thr Arg His Pro Ala Thr Ala Thr Val Ile Asp His Glu Gly Val Ile
85 90 95
Asp Ser Asn Thr Thr Ala Thr Ser Ala Pro Pro Arg Thr Lys Ile Thr
100 105 110
Val Pro Ala Arg Trp Val Val Asn Gly Ile Glu Arg Ser Gly Glu Val
115 120 125
Asn Ala Lys Pro Gly Thr Lys Ser Gly Asp Arg Val Gly Ile Trp Val
130 135 140
Asp Ser Ala Gly Gln Leu Val Asp Glu Pro Ala Pro Pro Ala Arg Ala
145 150 155 160
Ile Ala Asp Ala Ala Leu Ala Ala Leu Gly Leu Trp Leu Ser Val Ala
165 170 175
Ala Val Ala Gly Ala Leu Leu Ala Leu Thr Arg Ala Ile Leu Ile Arg
180 185 190
Val Arg Asn Ala Ser Trp Gln His Asp Ile Asp Ser Leu Phe Cys Thr
195 200 205
Gln Arg
210
<210> 9
<211> 432
<212> DNA
<213> 结核分枝杆菌
<220>
<223> Rv2626c
<400> 9
atgaccaccg cacgcgacat catgaacgca ggtgtgacct gtgttggcga acacgagacg 60
ctaaccgctg ccgctcaata catgcgtgag cacgacatcg gcgcgttgcc gatctgcggg 120
gacgacgacc ggctgcacgg catgctcacc gaccgcgaca ttgtgatcaa aggcctggct 180
gcgggcctag acccgaatac cgccacggct ggcgagttgg cccgggacag catctactac 240
gtcgatgcga acgcaagcat ccaggagatg ctcaacgtca tggaagaaca tcaggtccgc 300
cgtgttccgg tcatctcaga gcaccgcttg gtcggaatcg tcaccgaagc cgacatcgcc 360
cgacacctgc ccgagcacgc cattgtgcag ttcgtcaagg caatctgctc gcccatggcc 420
ctcgccagct ag 432
<210> 10
<211> 143
<212> PRT
<213> 结核分枝杆菌
<220>
<223> Rv2626c
<400> 10
Met Thr Thr Ala Arg Asp Ile Met Asn Ala Gly Val Thr Cys Val Gly
1 5 10 15
Glu His Glu Thr Leu Thr Ala Ala Ala Gln Tyr Met Arg Glu His Asp
20 25 30
Ile Gly Ala Leu Pro Ile Cys Gly Asp Asp Asp Arg Leu His Gly Met
35 40 45
Leu Thr Asp Arg Asp Ile Val Ile Lys Gly Leu Ala Ala Gly Leu Asp
50 55 60
Pro Asn Thr Ala Thr Ala Gly Glu Leu Ala Arg Asp Ser Ile Tyr Tyr
65 70 75 80
Val Asp Ala Asn Ala Ser Ile Gln Glu Met Leu Asn Val Met Glu Glu
85 90 95
His Gln Val Arg Arg Val Pro Val Ile Ser Glu His Arg Leu Val Gly
100 105 110
Ile Val Thr Glu Ala Asp Ile Ala Arg His Leu Pro Glu His Ala Ile
115 120 125
Val Gln Phe Val Lys Ala Ile Cys Ser Pro Met Ala Leu Ala Ser
130 135 140
<210> 11
<211> 1224
<212> DNA
<213> 结核分枝杆菌
<220>
<223> RpfA
<400> 11
atgagtggac gccaccgtaa gcccaccaca tccaacgtca gcgtcgccaa gatcgccttt 60
accggcgcag tactcggtgg cggcggcatc gccatggccg ctcaggcgac cgcggccacc 120
gacggggaat gggatcaggt ggcccgctgc gagtcgggcg gcaactggtc gatcaacacc 180
ggcaacggtt acctcggtgg cttgcagttc actcaaagca cctgggccgc acatggtggc 240
ggcgagttcg ccccgtcggc tcagctggcc agccgggagc agcagattgc cgtcggtgag 300
cgggtgctgg ccacccaggg tcgcggcgcc tggccggtgt gcggccgcgg gttatcgaac 360
gcaacacccc gcgaagtgct tcccgcttcg gcagcgatgg acgctccgtt ggacgcggcc 420
gcggtcaacg gcgaaccagc accgctggcc ccgccgcccg ccgacccggc gccacccgtg 480
gaacttgccg ctaacgacct gcccgcaccg ctgggtgaac ccctcccggc agctcccgcc 540
gacccggcac cacccgccga cctggcacca cccgcgcccg ccgacgtcgc gccacccgtg 600
gaacttgccg taaacgacct gcccgcaccg ctgggtgaac ccctcccggc agctcccgcc 660
gacccggcac cacccgccga cctggcacca cccgcgcccg ccgacctggc gccacccgcg 720
cccgccgacc tggcgccacc cgcgcccgcc gacctggcac cacccgtgga acttgccgta 780
aacgacctgc ccgcgccgct gggtgaaccc ctcccggcag ctcccgccga actggcgcca 840
cccgccgatc tggcacccgc gtccgccgac ctggcgccac ccgcgcccgc cgacctggcg 900
ccacccgcgc ccgccgaact ggcgccaccc gcgcccgccg acctggcacc acccgctgcg 960
gtgaacgagc aaaccgcgcc gggcgatcag cccgccacag ctccaggcgg cccggttggc 1020
cttgccaccg atttggaact ccccgagccc gacccccaac cagctgacgc accgccgccc 1080
ggcgacgtca ccgaggcgcc cgccgaaacg ccccaagtct cgaacatcgc ctatacgaag 1140
aagctgtggc aggcgattcg ggcccaggac gtctgcggca acgatgcgct ggactcgctc 1200
gcacagccgt acgtcatcgg ctga 1224
<210> 12
<211> 407
<212> PRT
<213> 结核分枝杆菌
<220>
<223> RpfA
<400> 12
Met Ser Gly Arg His Arg Lys Pro Thr Thr Ser Asn Val Ser Val Ala
1 5 10 15
Lys Ile Ala Phe Thr Gly Ala Val Leu Gly Gly Gly Gly Ile Ala Met
20 25 30
Ala Ala Gln Ala Thr Ala Ala Thr Asp Gly Glu Trp Asp Gln Val Ala
35 40 45
Arg Cys Glu Ser Gly Gly Asn Trp Ser Ile Asn Thr Gly Asn Gly Tyr
50 55 60
Leu Gly Gly Leu Gln Phe Thr Gln Ser Thr Trp Ala Ala His Gly Gly
65 70 75 80
Gly Glu Phe Ala Pro Ser Ala Gln Leu Ala Ser Arg Glu Gln Gln Ile
85 90 95
Ala Val Gly Glu Arg Val Leu Ala Thr Gln Gly Arg Gly Ala Trp Pro
100 105 110
Val Cys Gly Arg Gly Leu Ser Asn Ala Thr Pro Arg Glu Val Leu Pro
115 120 125
Ala Ser Ala Ala Met Asp Ala Pro Leu Asp Ala Ala Ala Val Asn Gly
130 135 140
Glu Pro Ala Pro Leu Ala Pro Pro Pro Ala Asp Pro Ala Pro Pro Val
145 150 155 160
Glu Leu Ala Ala Asn Asp Leu Pro Ala Pro Leu Gly Glu Pro Leu Pro
165 170 175
Ala Ala Pro Ala Asp Pro Ala Pro Pro Ala Asp Leu Ala Pro Pro Ala
180 185 190
Pro Ala Asp Val Ala Pro Pro Val Glu Leu Ala Val Asn Asp Leu Pro
195 200 205
Ala Pro Leu Gly Glu Pro Leu Pro Ala Ala Pro Ala Asp Pro Ala Pro
210 215 220
Pro Ala Asp Leu Ala Pro Pro Ala Pro Ala Asp Leu Ala Pro Pro Ala
225 230 235 240
Pro Ala Asp Leu Ala Pro Pro Ala Pro Ala Asp Leu Ala Pro Pro Val
245 250 255
Glu Leu Ala Val Asn Asp Leu Pro Ala Pro Leu Gly Glu Pro Leu Pro
260 265 270
Ala Ala Pro Ala Glu Leu Ala Pro Pro Ala Asp Leu Ala Pro Ala Ser
275 280 285
Ala Asp Leu Ala Pro Pro Ala Pro Ala Asp Leu Ala Pro Pro Ala Pro
290 295 300
Ala Glu Leu Ala Pro Pro Ala Pro Ala Asp Leu Ala Pro Pro Ala Ala
305 310 315 320
Val Asn Glu Gln Thr Ala Pro Gly Asp Gln Pro Ala Thr Ala Pro Gly
325 330 335
Gly Pro Val Gly Leu Ala Thr Asp Leu Glu Leu Pro Glu Pro Asp Pro
340 345 350
Gln Pro Ala Asp Ala Pro Pro Pro Gly Asp Val Thr Glu Ala Pro Ala
355 360 365
Glu Thr Pro Gln Val Ser Asn Ile Ala Tyr Thr Lys Lys Leu Trp Gln
370 375 380
Ala Ile Arg Ala Gln Asp Val Cys Gly Asn Asp Ala Leu Asp Ser Leu
385 390 395 400
Ala Gln Pro Tyr Val Ile Gly
405
<210> 13
<211> 531
<212> DNA
<213> 结核分枝杆菌
<220>
<223> RpfC
<400> 13
gtgcatcctt tgccggccga ccacggccgg tcgcggtgca atagacaccc gatctcacca 60
ctctctctaa tcggtaacgc ttcggccact tccggcgata tgtcgagcat gacaagaatc 120
gccaagccgc tcatcaagtc cgccatggcc gcaggactcg tcacggcatc catgtcgctc 180
tccaccgccg ttgcccacgc cggtcccagc ccgaactggg acgccgtcgc gcagtgcgaa 240
tccgggggca actgggcggc caacaccgga aacggcaaat acggcggact gcagttcaag 300
ccggccacct gggccgcatt cggcggtgtc ggcaacccag cagctgcctc tcgggaacaa 360
caaatcgcag ttgccaatcg ggttctcgcc gaacagggat tggacgcgtg gccgacgtgc 420
ggcgccgcct ctggccttcc gatcgcactg tggtcgaaac ccgcgcaggg catcaagcaa 480
atcatcaacg agatcatttg ggcaggcatt caggcaagta ttccgcgctg a 531
<210> 14
<211> 176
<212> PRT
<213> 结核分枝杆菌
<220>
<223> RpfC
<400> 14
Val His Pro Leu Pro Ala Asp His Gly Arg Ser Arg Cys Asn Arg His
1 5 10 15
Pro Ile Ser Pro Leu Ser Leu Ile Gly Asn Ala Ser Ala Thr Ser Gly
20 25 30
Asp Met Ser Ser Met Thr Arg Ile Ala Lys Pro Leu Ile Lys Ser Ala
35 40 45
Met Ala Ala Gly Leu Val Thr Ala Ser Met Ser Leu Ser Thr Ala Val
50 55 60
Ala His Ala Gly Pro Ser Pro Asn Trp Asp Ala Val Ala Gln Cys Glu
65 70 75 80
Ser Gly Gly Asn Trp Ala Ala Asn Thr Gly Asn Gly Lys Tyr Gly Gly
85 90 95
Leu Gln Phe Lys Pro Ala Thr Trp Ala Ala Phe Gly Gly Val Gly Asn
100 105 110
Pro Ala Ala Ala Ser Arg Glu Gln Gln Ile Ala Val Ala Asn Arg Val
115 120 125
Leu Ala Glu Gln Gly Leu Asp Ala Trp Pro Thr Cys Gly Ala Ala Ser
130 135 140
Gly Leu Pro Ile Ala Leu Trp Ser Lys Pro Ala Gln Gly Ile Lys Gln
145 150 155 160
Ile Ile Asn Glu Ile Ile Trp Ala Gly Ile Gln Ala Ser Ile Pro Arg
165 170 175
<210> 15
<211> 465
<212> DNA
<213> 结核分枝杆菌
<220>
<223> RpfD
<400> 15
atgacaccgg gtttgcttac tactgcgggt gctggccgac cacgtgacag gtgcgccagg 60
atcgtatgca cggtgttcat cgaaaccgcc gttgtcgcga ccatgtttgt cgcgttgttg 120
ggtctgtcca ccatcagctc gaaagccgac gacatcgatt gggacgccat cgcgcaatgc 180
gaatccggcg gcaattgggc ggccaacacc ggtaacgggt tatacggtgg tctgcagatc 240
agccaggcga cgtgggattc caacggtggt gtcgggtcgc cggcggccgc gagtccccag 300
caacagatcg aggtcgcaga caacattatg aaaacccaag gcccgggtgc gtggccgaaa 360
tgtagttctt gtagtcaggg agacgcaccg ctgggctcgc tcacccacat cctgacgttc 420
ctcgcggccg agactggagg ttgttcgggg agcagggacg attga 465
<210> 16
<211> 154
<212> PRT
<213> 结核分枝杆菌
<220>
<223> RpfD
<400> 16
Met Thr Pro Gly Leu Leu Thr Thr Ala Gly Ala Gly Arg Pro Arg Asp
1 5 10 15
Arg Cys Ala Arg Ile Val Cys Thr Val Phe Ile Glu Thr Ala Val Val
20 25 30
Ala Thr Met Phe Val Ala Leu Leu Gly Leu Ser Thr Ile Ser Ser Lys
35 40 45
Ala Asp Asp Ile Asp Trp Asp Ala Ile Ala Gln Cys Glu Ser Gly Gly
50 55 60
Asn Trp Ala Ala Asn Thr Gly Asn Gly Leu Tyr Gly Gly Leu Gln Ile
65 70 75 80
Ser Gln Ala Thr Trp Asp Ser Asn Gly Gly Val Gly Ser Pro Ala Ala
85 90 95
Ala Ser Pro Gln Gln Gln Ile Glu Val Ala Asp Asn Ile Met Lys Thr
100 105 110
Gln Gly Pro Gly Ala Trp Pro Lys Cys Ser Ser Cys Ser Gln Gly Asp
115 120 125
Ala Pro Leu Gly Ser Leu Thr His Ile Leu Thr Phe Leu Ala Ala Glu
130 135 140
Thr Gly Gly Cys Ser Gly Ser Arg Asp Asp
145 150
<210> 17
<211> 288
<212> DNA
<213> 结核分枝杆菌
<220>
<223> ESAT-6
<400> 17
atgacagagc agcagtggaa tttcgcgggt atcgaggccg cggcaagcgc aatccaggga 60
aatgtcacgt ccattcattc cctccttgac gaggggaagc agtccctgac caagctcgca 120
gcggcctggg gcggtagcgg ttcggaggcg taccagggtg tccagcaaaa atgggacgcc 180
acggctaccg agctgaacaa cgcgctgcag aacctggcgc ggacgatcag cgaagccggt 240
caggcaatgg cttcgaccga aggcaacgtc actgggatgt tcgcatag 288
<210> 18
<211> 95
<212> PRT
<213> 结核分枝杆菌
<220>
<223> ESAT-6
<400> 18
Met Thr Glu Gln Gln Trp Asn Phe Ala Gly Ile Glu Ala Ala Ala Ser
1 5 10 15
Ala Ile Gln Gly Asn Val Thr Ser Ile His Ser Leu Leu Asp Glu Gly
20 25 30
Lys Gln Ser Leu Thr Lys Leu Ala Ala Ala Trp Gly Gly Ser Gly Ser
35 40 45
Glu Ala Tyr Gln Gly Val Gln Gln Lys Trp Asp Ala Thr Ala Thr Glu
50 55 60
Leu Asn Asn Ala Leu Gln Asn Leu Ala Arg Thr Ile Ser Glu Ala Gly
65 70 75 80
Gln Ala Met Ala Ser Thr Glu Gly Asn Val Thr Gly Met Phe Ala
85 90 95
<210> 19
<211> 2049
<212> DNA
<213> 结核分枝杆菌
<220>
<223> Ag85A-Ag85B-Rv3407
<400> 19
atggcatttt cccggccggg cttgccggtg gagtacctgc aggtgccgtc gccgtcgatg 60
ggccgtgaca tcaaggtcca attccaaagt ggtggtgcca actcgcccgc cctgtacctg 120
ctcgacggcc tgcgcgcgca ggacgacttc agcggctggg acatcaacac cccggcgttc 180
gagtggtacg accagtcggg cctgtcggtg gtcatgccgg tgggtggcca gtcaagcttc 240
tactccgact ggtaccagcc cgcctgcggc aaggccggtt gccagactta caagtgggag 300
accttcctga ccagcgagct gccggggtgg ctgcaggcca acaggcacgt caagcccacc 360
ggaagcgccg tcgtcggtct ttcgatggct gcttcttcgg cgctgacgct ggcgatctat 420
cacccccagc agttcgtcta cgcgggagcg atgtcgggcc tgttggaccc ctcccaggcg 480
atgggtccca ccctgatcgg cctggcgatg ggtgacgctg gcggctacaa ggcctccgac 540
atgtggggcc cgaaggagga cccggcgtgg cagcgcaacg acccgctgtt gaacgtcggg 600
aagctgatcg ccaacaacac ccgcgtctgg gtgtactgcg gcaacggcaa gccgtcggat 660
ctgggtggca acaacctgcc ggccaagttc ctcgagggct tcgtgcggac cagcaacatc 720
aagttccaag acgcctacaa cgccggtggc ggccacaacg gcgtgttcga cttcccggac 780
agcggtacgc acagctggga gtactggggc gcgcagctca acgctatgaa gcccgacctg 840
caacgggcac tgggtgccac gcccaacacc gggcccgcgc cccagggcgc catgttctcc 900
cggccggggc tgccggtcga gtacctgcag gtgccgtcgc cgtcgatggg ccgcgacatc 960
aaggttcagt tccagagcgg tgggaacaac tcacctgcgg tttatctgct cgacggcctg 1020
cgcgcccaag acgactacaa cggctgggat atcaacaccc cggcgttcga gtggtactac 1080
cagtcgggac tgtcgatagt catgccggtc ggcgggcagt ccagcttcta cagcgactgg 1140
tacagcccgg cctgcggtaa ggctggctgc cagacttaca agtgggaaac cttcctgacc 1200
agcgagctgc cgcaatggtt gtccgccaac agggccgtga agcccaccgg cagcgctgca 1260
atcggcttgt cgatggccgg ctcgtcggca atgatcttgg ccgcctacca cccccagcag 1320
ttcatctacg ccggctcgct gtcggccctg ctggacccct ctcaggggat ggggcctagc 1380
ctgatcggcc tcgcgatggg tgacgccggc ggttacaagg ccgcagacat gtggggtccc 1440
tcgagtgacc cggcatggga gcgcaacgac cctacgcagc agatccccaa gctggtcgca 1500
aacaacaccc ggctatgggt ttattgcggg aacggcaccc cgaacgagtt gggcggtgcc 1560
aacatacccg ccgagttctt ggagaacttc gttcgtagca gcaacctgaa gttccaggat 1620
gcgtacaacg ccgcgggcgg gcacaacgcc gtgttcaact tcccgcccaa cggcacgcac 1680
agctgggagt actggggcgc tcagctcaac gccatgaagg gtgacctgca gagttcgtta 1740
ggcgccggca tgcgtgctac cgttgggctt gtggaggcaa tcggaatccg agaactaaga 1800
cagcacgcat cgcgatacct cgcccgggtt gaagccggcg aggaacttgg cgtcaccaac 1860
aaaggaagac ttgtggcccg actcatcccg gtgcaggccg cggagcgttc tcgcgaagcc 1920
ctgattgaat caggtgtcct gattccggct cgtcgtccac aaaaccttct cgacgtcacc 1980
gccgaaccgg cgcgcggccg caagcgcacc ctgtccgatg ttctcaacga aatgcgcgac 2040
gagcagtga 2049
<210> 20
<211> 683
<212> PRT
<213> 结核分枝杆菌
<220>
<223> Ag85A-Ag85B-Rv3407
<400> 20
Met Ala Phe Ser Arg Pro Gly Leu Pro Val Glu Tyr Leu Gln Val Pro
1 5 10 15
Ser Pro Ser Met Gly Arg Asp Ile Lys Val Gln Phe Gln Ser Gly Gly
20 25 30
Ala Asn Ser Pro Ala Leu Tyr Leu Leu Asp Gly Leu Arg Ala Gln Asp
35 40 45
Asp Phe Ser Gly Trp Asp Ile Asn Thr Pro Ala Phe Glu Trp Tyr Asp
50 55 60
Gln Ser Gly Leu Ser Val Val Met Pro Val Gly Gly Gln Ser Ser Phe
65 70 75 80
Tyr Ser Asp Trp Tyr Gln Pro Ala Cys Gly Lys Ala Gly Cys Gln Thr
85 90 95
Tyr Lys Trp Glu Thr Phe Leu Thr Ser Glu Leu Pro Gly Trp Leu Gln
100 105 110
Ala Asn Arg His Val Lys Pro Thr Gly Ser Ala Val Val Gly Leu Ser
115 120 125
Met Ala Ala Ser Ser Ala Leu Thr Leu Ala Ile Tyr His Pro Gln Gln
130 135 140
Phe Val Tyr Ala Gly Ala Met Ser Gly Leu Leu Asp Pro Ser Gln Ala
145 150 155 160
Met Gly Pro Thr Leu Ile Gly Leu Ala Met Gly Asp Ala Gly Gly Tyr
165 170 175
Lys Ala Ser Asp Met Trp Gly Pro Lys Glu Asp Pro Ala Trp Gln Arg
180 185 190
Asn Asp Pro Leu Leu Asn Val Gly Lys Leu Ile Ala Asn Asn Thr Arg
195 200 205
Val Trp Val Tyr Cys Gly Asn Gly Lys Pro Ser Asp Leu Gly Gly Asn
210 215 220
Asn Leu Pro Ala Lys Phe Leu Glu Gly Phe Val Arg Thr Ser Asn Ile
225 230 235 240
Lys Phe Gln Asp Ala Tyr Asn Ala Gly Gly Gly His Asn Gly Val Phe
245 250 255
Asp Phe Pro Asp Ser Gly Thr His Ser Trp Glu Tyr Trp Gly Ala Gln
260 265 270
Leu Asn Ala Met Lys Pro Asp Leu Gln Arg Ala Leu Gly Ala Thr Pro
275 280 285
Asn Thr Gly Pro Ala Pro Gln Gly Ala Phe Ser Arg Pro Gly Leu Pro
290 295 300
Val Glu Tyr Leu Gln Val Pro Ser Pro Ser Met Gly Arg Asp Ile Lys
305 310 315 320
Val Gln Phe Gln Ser Gly Gly Asn Asn Ser Pro Ala Val Tyr Leu Leu
325 330 335
Asp Gly Leu Arg Ala Gln Asp Asp Tyr Asn Gly Trp Asp Ile Asn Thr
340 345 350
Pro Ala Phe Glu Trp Tyr Tyr Gln Ser Gly Leu Ser Ile Val Met Pro
355 360 365
Val Gly Gly Gln Ser Ser Phe Tyr Ser Asp Trp Tyr Ser Pro Ala Cys
370 375 380
Gly Lys Ala Gly Cys Gln Thr Tyr Lys Trp Glu Thr Phe Leu Thr Ser
385 390 395 400
Glu Leu Pro Gln Trp Leu Ser Ala Asn Arg Ala Val Lys Pro Thr Gly
405 410 415
Ser Ala Ala Ile Gly Leu Ser Met Ala Gly Ser Ser Ala Met Ile Leu
420 425 430
Ala Ala Tyr His Pro Gln Gln Phe Ile Tyr Ala Gly Ser Leu Ser Ala
435 440 445
Leu Leu Asp Pro Ser Gln Gly Met Gly Pro Ser Leu Ile Gly Leu Ala
450 455 460
Met Gly Asp Ala Gly Gly Tyr Lys Ala Ala Asp Met Trp Gly Pro Ser
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Ser Asp Pro Ala Trp Glu Arg Asn Asp Pro Thr Gln Gln Ile Pro Lys
485 490 495
Leu Val Ala Asn Asn Thr Arg Leu Trp Val Tyr Cys Gly Asn Gly Thr
500 505 510
Pro Asn Glu Leu Gly Gly Ala Asn Ile Pro Ala Glu Phe Leu Glu Asn
515 520 525
Phe Val Arg Ser Ser Asn Leu Lys Phe Gln Asp Ala Tyr Asn Ala Ala
530 535 540
Gly Gly His Asn Ala Val Phe Asn Phe Pro Pro Asn Gly Thr His Ser
545 550 555 560
Trp Glu Tyr Trp Gly Ala Gln Leu Asn Ala Met Lys Gly Asp Leu Gln
565 570 575
Ser Ser Leu Gly Ala Gly Ala Ala Ala Arg Ala Thr Val Gly Leu Val
580 585 590
Glu Ala Ile Gly Ile Arg Glu Leu Arg Gln His Ala Ser Arg Tyr Leu
595 600 605
Ala Arg Val Glu Ala Gly Glu Glu Leu Gly Val Thr Asn Lys Gly Arg
610 615 620
Leu Val Ala Arg Leu Ile Pro Val Gln Ala Ala Glu Arg Ser Arg Glu
625 630 635 640
Ala Leu Ile Glu Ser Gly Val Leu Ile Pro Ala Arg Arg Pro Gln Asn
645 650 655
Leu Leu Asp Val Thr Ala Glu Pro Ala Arg Gly Arg Lys Arg Thr Leu
660 665 670
Ser Asp Val Leu Asn Glu Met Arg Asp Glu Gln
675 680
<210> 21
<211> 1062
<212> DNA
<213> 结核分枝杆菌
<220>
<223> Rv1733-Rv2626c
<400> 21
atgaccaccg cacgcgacat catgaacgca ggtgtgacct gtgttggcga acacgagacg 60
ctaaccgctg ccgctcaata catgcgtgag cacgacatcg gcgcgttgcc gatctgcggg 120
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gtcgatgcga acgcaagcat ccaggagatg ctcaacgtca tggaagaaca tcaggtccgc 300
cgtgttccgg tcatctcaga gcaccgcttg gtcggaatcg tcaccgaagc cgacatcgcc 360
cgacacctgc ccgagcacgc cattgtgcag ttcgtcaagg caatctgctc gcccatggcc 420
ctcgccagca tgatcgccac aacccgcgat cgtgaaggag ccaccatgat cacgtttagg 480
ctgcgcttgc cgtgccggac gatactgcgg gtgttcagcc gcaatccgct ggtgcgtggg 540
acggatcgac tcgaggcggt cgtcatgctg ctggccgtca cggtctcgct gctgactatc 600
ccgttcgccg ccgcggccgg caccgcagtc caggattccc gcagccacgt ctatgcccac 660
caggcccaga cccgccatcc cgcaaccgcg accgtgatcg atcacgaggg ggtgatcgac 720
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<210> 22
<211> 353
<212> PRT
<213> 结核分枝杆菌
<220>
<223> Rv1733-Rv2626c
<400> 22
Met Thr Thr Ala Arg Asp Ile Met Asn Ala Gly Val Thr Cys Val Gly
1 5 10 15
Glu His Glu Thr Leu Thr Ala Ala Ala Gln Tyr Met Arg Glu His Asp
20 25 30
Ile Gly Ala Leu Pro Ile Cys Gly Asp Asp Asp Arg Leu His Gly Met
35 40 45
Leu Thr Asp Arg Asp Ile Val Ile Lys Gly Leu Ala Ala Gly Leu Asp
50 55 60
Pro Asn Thr Ala Thr Ala Gly Glu Leu Ala Arg Asp Ser Ile Tyr Tyr
65 70 75 80
Val Asp Ala Asn Ala Ser Ile Gln Glu Met Leu Asn Val Met Glu Glu
85 90 95
His Gln Val Arg Arg Val Pro Val Ile Ser Glu His Arg Leu Val Gly
100 105 110
Ile Val Thr Glu Ala Asp Ile Ala Arg His Leu Pro Glu His Ala Ile
115 120 125
Val Gln Phe Val Lys Ala Ile Cys Ser Pro Met Ala Leu Ala Ser Met
130 135 140
Ile Ala Thr Thr Arg Asp Arg Glu Gly Ala Thr Met Ile Thr Phe Arg
145 150 155 160
Leu Arg Leu Pro Cys Arg Thr Ile Leu Arg Val Phe Ser Arg Asn Pro
165 170 175
Leu Val Arg Gly Thr Asp Arg Leu Glu Ala Val Val Met Leu Leu Ala
180 185 190
Val Thr Val Ser Leu Leu Thr Ile Pro Phe Ala Ala Ala Ala Gly Thr
195 200 205
Ala Val Gln Asp Ser Arg Ser His Val Tyr Ala His Gln Ala Gln Thr
210 215 220
Arg His Pro Ala Thr Ala Thr Val Ile Asp His Glu Gly Val Ile Asp
225 230 235 240
Ser Asn Thr Thr Ala Thr Ser Ala Pro Pro Arg Thr Lys Ile Thr Val
245 250 255
Pro Ala Arg Trp Val Val Asn Gly Ile Glu Arg Ser Gly Glu Val Asn
260 265 270
Ala Lys Pro Gly Thr Lys Ser Gly Asp Arg Val Gly Ile Trp Val Asp
275 280 285
Ser Ala Gly Gln Leu Val Asp Glu Pro Ala Pro Pro Ala Arg Ala Ile
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Ala Asp Ala Ala Leu Ala Ala Leu Gly Leu Trp Leu Ser Val Ala Ala
305 310 315 320
Val Ala Gly Ala Leu Leu Ala Leu Thr Arg Ala Ile Leu Ile Arg Val
325 330 335
Arg Asn Ala Ser Trp Gln His Asp Ile Asp Ser Leu Phe Cys Thr Gln
340 345 350
Arg
<210> 23
<211> 2217
<212> DNA
<213> 结核分枝杆菌
<220>
<223> RpfA-RpfC-RpfD
<400> 23
atggcgtcag ggaggcatcg gaaaccaact acaagcaatg tatctgttgc caagattgct 60
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aatgctaccc ctagggaggt gctgcccgcc tcagccgcta tggacgctcc actggatgct 420
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gtcaacgatc ttcctgcgcc tcttggagag cccctgcccg ctgctccagc cgaactcgca 840
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gcatccccgc aacagcaaat cgaggtggcc gataacatca tgaaaaccca gggacccgga 2100
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<210> 24
<211> 737
<212> PRT
<213> 结核分枝杆菌
<220>
<223> RpfA-RpfC-RpfD
<400> 24
Met Ser Gly Arg His Arg Lys Pro Thr Thr Ser Asn Val Ser Val Ala
1 5 10 15
Lys Ile Ala Phe Thr Gly Ala Val Leu Gly Gly Gly Gly Ile Ala Met
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Gly Glu Phe Ala Pro Ser Ala Gln Leu Ala Ser Arg Glu Gln Gln Ile
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Ala Val Gly Glu Arg Val Leu Ala Thr Gln Gly Arg Gly Ala Trp Pro
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Val Cys Gly Arg Gly Leu Ser Asn Ala Thr Pro Arg Glu Val Leu Pro
115 120 125
Ala Ser Ala Ala Met Asp Ala Pro Leu Asp Ala Ala Ala Val Asn Gly
130 135 140
Glu Pro Ala Pro Leu Ala Pro Pro Pro Ala Asp Pro Ala Pro Pro Val
145 150 155 160
Glu Leu Ala Ala Asn Asp Leu Pro Ala Pro Leu Gly Glu Pro Leu Pro
165 170 175
Ala Ala Pro Ala Asp Pro Ala Pro Pro Ala Asp Leu Ala Pro Pro Ala
180 185 190
Pro Ala Asp Val Ala Pro Pro Val Glu Leu Ala Val Asn Asp Leu Pro
195 200 205
Ala Pro Leu Gly Glu Pro Leu Pro Ala Ala Pro Ala Asp Pro Ala Pro
210 215 220
Pro Ala Asp Leu Ala Pro Pro Ala Pro Ala Asp Leu Ala Pro Pro Ala
225 230 235 240
Pro Ala Asp Leu Ala Pro Pro Ala Pro Ala Asp Leu Ala Pro Pro Val
245 250 255
Glu Leu Ala Val Asn Asp Leu Pro Ala Pro Leu Gly Glu Pro Leu Pro
260 265 270
Ala Ala Pro Ala Glu Leu Ala Pro Pro Ala Asp Leu Ala Pro Ala Ser
275 280 285
Ala Asp Leu Ala Pro Pro Ala Pro Ala Asp Leu Ala Pro Pro Ala Pro
290 295 300
Ala Glu Leu Ala Pro Pro Ala Pro Ala Asp Leu Ala Pro Pro Ala Ala
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Gly Pro Val Gly Leu Ala Thr Asp Leu Glu Leu Pro Glu Pro Asp Pro
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Glu Thr Pro Gln Val Ser Asn Ile Ala Tyr Thr Lys Lys Leu Trp Gln
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Ala Ile Arg Ala Gln Asp Val Cys Gly Asn Asp Ala Leu Asp Ser Leu
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Asn Ala Ser Ala Thr Ser Gly Asp Met Ser Ser Met Thr Arg Ile Ala
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Lys Pro Leu Ile Lys Ser Ala Met Ala Ala Gly Leu Val Thr Ala Ser
450 455 460
Met Ser Leu Ser Thr Ala Val Ala His Ala Gly Pro Ser Pro Asn Trp
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Asp Ala Val Ala Gln Cys Glu Ser Gly Gly Asn Trp Ala Ala Asn Thr
485 490 495
Gly Asn Gly Lys Tyr Gly Gly Leu Gln Phe Lys Pro Ala Thr Trp Ala
500 505 510
Ala Phe Gly Gly Val Gly Asn Pro Ala Ala Ala Ser Arg Glu Gln Gln
515 520 525
Ile Ala Val Ala Asn Arg Val Leu Ala Glu Gln Gly Leu Asp Ala Trp
530 535 540
Pro Thr Cys Gly Ala Ala Ser Gly Leu Pro Ile Ala Leu Trp Ser Lys
545 550 555 560
Pro Ala Gln Gly Ile Lys Gln Ile Ile Asn Glu Ile Ile Trp Ala Gly
565 570 575
Ile Gln Ala Ser Ile Pro Arg Met Thr Pro Gly Leu Leu Thr Thr Ala
580 585 590
Gly Ala Gly Arg Pro Arg Asp Arg Cys Ala Arg Ile Val Cys Thr Val
595 600 605
Phe Ile Glu Thr Ala Val Val Ala Thr Met Phe Val Ala Leu Leu Gly
610 615 620
Leu Ser Thr Ile Ser Ser Lys Ala Asp Asp Ile Asp Trp Asp Ala Ile
625 630 635 640
Ala Gln Cys Glu Ser Gly Gly Asn Trp Ala Ala Asn Thr Gly Asn Gly
645 650 655
Leu Tyr Gly Gly Leu Gln Ile Ser Gln Ala Thr Trp Asp Ser Asn Gly
660 665 670
Gly Val Gly Ser Pro Ala Ala Ala Ser Pro Gln Gln Gln Ile Glu Val
675 680 685
Ala Asp Asn Ile Met Lys Thr Gln Gly Pro Gly Ala Trp Pro Lys Cys
690 695 700
Ser Ser Cys Ser Gln Gly Asp Ala Pro Leu Gly Ser Leu Thr His Ile
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Leu Thr Phe Leu Ala Ala Glu Thr Gly Gly Cys Ser Gly Ser Arg Asp
725 730 735
Asp
<210> 25
<211> 1146
<212> DNA
<213> 结核分枝杆菌
<220>
<223> Ag85B-ESAT6
<400> 25
atgttctccc ggccggggct gccggtcgag tacctgcagg tgccgtcgcc gtcgatgggc 60
cgcgacatca aggttcagtt ccagagcggt gggaacaact cacctgcggt ttatctgctc 120
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agcgctgcaa tcggcttgtc gatggccggc tcgtcggcaa tgatcttggc cgcctaccac 420
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gcatag 1146
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<211> 381
<212> PRT
<213> 结核分枝杆菌
<220>
<223> Ag85B-ESAT6
<400> 26
Met Phe Ser Arg Pro Gly Leu Pro Val Glu Tyr Leu Gln Val Pro Ser
1 5 10 15
Pro Ser Met Gly Arg Asp Ile Lys Val Gln Phe Gln Ser Gly Gly Asn
20 25 30
Asn Ser Pro Ala Val Tyr Leu Leu Asp Gly Leu Arg Ala Gln Asp Asp
35 40 45
Tyr Asn Gly Trp Asp Ile Asn Thr Pro Ala Phe Glu Trp Tyr Tyr Gln
50 55 60
Ser Gly Leu Ser Ile Val Met Pro Val Gly Gly Gln Ser Ser Phe Tyr
65 70 75 80
Ser Asp Trp Tyr Ser Pro Ala Cys Gly Lys Ala Gly Cys Gln Thr Tyr
85 90 95
Lys Trp Glu Thr Phe Leu Thr Ser Glu Leu Pro Gln Trp Leu Ser Ala
100 105 110
Asn Arg Ala Val Lys Pro Thr Gly Ser Ala Ala Ile Gly Leu Ser Met
115 120 125
Ala Gly Ser Ser Ala Met Ile Leu Ala Ala Tyr His Pro Gln Gln Phe
130 135 140
Ile Tyr Ala Gly Ser Leu Ser Ala Leu Leu Asp Pro Ser Gln Gly Met
145 150 155 160
Gly Pro Ser Leu Ile Gly Leu Ala Met Gly Asp Ala Gly Gly Tyr Lys
165 170 175
Ala Ala Asp Met Trp Gly Pro Ser Ser Asp Pro Ala Trp Glu Arg Asn
180 185 190
Asp Pro Thr Gln Gln Ile Pro Lys Leu Val Ala Asn Asn Thr Arg Leu
195 200 205
Trp Val Tyr Cys Gly Asn Gly Thr Pro Asn Glu Leu Gly Gly Ala Asn
210 215 220
Ile Pro Ala Glu Phe Leu Glu Asn Phe Val Arg Ser Ser Asn Leu Lys
225 230 235 240
Phe Gln Asp Ala Tyr Asn Ala Ala Gly Gly His Asn Ala Val Phe Asn
245 250 255
Phe Pro Pro Asn Gly Thr His Ser Trp Glu Tyr Trp Gly Ala Gln Leu
260 265 270
Asn Ala Met Lys Gly Asp Leu Gln Ser Ser Leu Gly Ala Gly Met Thr
275 280 285
Glu Gln Gln Trp Asn Phe Ala Gly Ile Glu Ala Ala Ala Ser Ala Ile
290 295 300
Gln Gly Asn Val Thr Ser Ile His Ser Leu Leu Asp Glu Gly Lys Gln
305 310 315 320
Ser Leu Thr Lys Leu Ala Ala Ala Trp Gly Gly Ser Gly Ser Glu Ala
325 330 335
Tyr Gln Gly Val Gln Gln Lys Trp Asp Ala Thr Ala Thr Glu Leu Asn
340 345 350
Asn Ala Leu Gln Asn Leu Ala Arg Thr Ile Ser Glu Ala Gly Gln Ala
355 360 365
Met Ala Ser Thr Glu Gly Asn Val Thr Gly Met Phe Ala
370 375 380
<210> 27
<211> 3570
<212> DNA
<213> 结核分枝杆菌
<220>
<223> Ag85A-ESAT6-Rv3407-Rv2626c-RpfA-RpfD
<400> 27
atggcgttca gcagacccgg cctgcccgtg gagtacctgc aggtgcccag ccccagcatg 60
ggccgggaca tcaaagtgca gttccagagc ggcggagcca acagccctgc cctgtacctg 120
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tacagcgact ggtatcagcc cgcctgcggc aaggccggct gccagaccta caagtgggag 300
accttcctga ccagcgagct gcccggctgg ctgcaggcca accggcacgt gaagcccacc 360
ggcagcgccg tggtgggcct gagcatggcc gccagcagcg ccctgaccct ggccatctac 420
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atgggcccca ccctgatcgg cctggccatg ggcgacgccg gaggctacaa ggccagcgac 540
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agcggcaccc acagctggga gtactgggga gcccagctga acgccatgaa gcccgacctg 840
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atccacagcc tgctggacga gggcaagcag agcctgacca agctggctgc tgcttggggc 1020
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cccgctcccg ccgatgtagc ccctccggtc gagttggctg tgaatgacct gccggcacct 2520
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gcgccggctg acctggcccc tccagcagcc gttaatgagc aaaccgcacc aggggaccag 2880
ccggctacgg caccaggtgg accggtgggg ctggccaccg acctggagct gcctgagccg 2940
gatccccaac cagctgatgc tcccccacct ggcgacgtaa ctgaggcccc agctgaaacg 3000
ccccaggtca gtaacatcgc ttacacaaag aaactgtggc aggcaattag ggctcaggac 3060
gtgtgtggga acgacgccct ggacagcttg gcccaaccgt acgtgatcgg tacccccgga 3120
ctcctcacca cagctggagc tggcaggccc agagacagat gcgccaggat cgtgtgcacc 3180
gtgttcatcg agaccgccgt ggtggctacc atgttcgtgg ccctgctggg cctgagcacc 3240
atcagcagca aggccgacga catcgactgg gacgccatcg cccagtgtga atccggcgga 3300
aactgggccg ccaataccgg caatggcctg tacggcggcc tgcagatcag ccaggctacc 3360
tgggactcca acggaggagt gggaagccct gccgctgctt cccctcagca gcagatcgag 3420
gtggccgaca acatcatgaa gacccaaggc cctggcgcct ggcctaagtg ttccagctgt 3480
agccagggcg atgctcctct gggcagcctg acccacatcc tgacctttct cgccgccgag 3540
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<210> 28
<211> 3618
<212> DNA
<213> 结核分枝杆菌
<220>
<223> Ag85A-ESAT6-Rv3407-Rv2626c-RpfA-RpfD
<400> 28
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cccgccttcg agtggtacga ccagagcggc ctgagcgtgg tgatgcccgt gggcggccag 240
agcagcttct acagcgactg gtatcagccc gcctgcggca aggccggctg ccagacctac 300
aagtgggaga ccttcctgac cagcgagctg cccggctggc tgcaggccaa ccggcacgtg 360
aagcccaccg gcagcgccgt ggtgggcctg agcatggccg ccagcagcgc cctgaccctg 420
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agccaggcca tgggccccac cctgatcggc ctggccatgg gcgacgccgg aggctacaag 540
gccagcgaca tgtggggccc caaggaggac cccgcctggc agcggaacga ccccctgctg 600
aacgtgggca agctgatcgc caacaacacc cgcgtgtggg tgtactgcgg caacggcaag 660
cccagcgacc tgggcggcaa caacctgccc gccaagttcc tggagggctt cgtgcggacc 720
agcaacatca agttccagga cgcctacaac gccggaggcg gccacaacgg cgtgttcgac 780
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gtgaccagca tccacagcct gctggacgag ggcaagcaga gcctgaccaa gctggctgct 1020
gcttggggcg gatccggaag cgaagcctac cagggcgtgc agcagaagtg ggacgccaca 1080
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gtggaggcca ttggcatcag ggagctgagg cagcacgcca gcaggtacct ggccagagtg 1260
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ctgagcgacg tgctgaacga gatgagggac gagcagacaa cagccaggga catcatgaac 1500
gccggcgtga cctgcgtggg agagcatgaa accctcaccg ccgccgccca atacatgagg 1560
gagcacgaca tcggcgccct gcccatctgt ggagacgacg acaggctgca cggcatgctg 1620
accgacaggg acatcgtgat caagggcctg gctgccggcc tcgatcctaa caccgctaca 1680
gccggcgagc tggccagaga cagcatctac tacgtggacg ccaacgccag catccaggag 1740
atgctcaacg tgatggagga gcaccaggtg agaagggtgc ctgtgatcag cgagcacagg 1800
ctggtgggca tcgtgaccga ggccgatatc gctaggcacc tgcccgagca cgccatcgtg 1860
cagttcgtga aggccatctg cagccccatg gctctggcca gctcagggag gcatcggaaa 1920
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ggcggaattg ccatggctgc ccaggcaaca gccgctacag atggagagtg ggatcaggtg 2040
gctcgatgtg agtctggtgg caactggtct atcaacactg ggaacgggta tcttggcggc 2100
ttgcaattta ctcagagcac ttgggctgcc cacggagggg gtgaatttgc tcctagcgcg 2160
cagctggcct cccgcgagca gcagatcgct gtgggagaga gggtgttggc cacacaggga 2220
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ccgctggcac ccccacctgc agaccccgct cccccagtcg agctggcggc aaacgacctg 2400
cccgcacctc tcggagaacc acttcctgca gcgcctgccg atccagctcc acctgctgat 2460
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ctggcaccac ccgctcctgc cgacctcgcc ccacccgccc cagcagacct ggctccacca 2640
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ctgagcacca tcagcagcaa ggccgacgac atcgactggg acgccatcgc ccagtgtgaa 3300
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cagatcgagg tggccgacaa catcatgaag acccaaggcc ctggcgcctg gcctaagtgt 3480
tccagctgta gccagggcga tgctcctctg ggcagcctga cccacatcct gacctttctc 3540
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tacgccgatt agtctaga 3618
<210> 29
<211> 1190
<212> PRT
<213> 结核分枝杆菌
<220>
<223> Ag85A-ESAT6-Rv3407-Rv2626c-RpfA-RpfD
<400> 29
Met Ala Phe Ser Arg Pro Gly Leu Pro Val Glu Tyr Leu Gln Val Pro
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Ala Asn Ser Pro Ala Leu Tyr Leu Leu Asp Gly Leu Arg Ala Gln Asp
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Asp Phe Ser Gly Trp Asp Ile Asn Thr Pro Ala Phe Glu Trp Tyr Asp
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Tyr Lys Trp Glu Thr Phe Leu Thr Ser Glu Leu Pro Gly Trp Leu Gln
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Ile His Ser Leu Leu Asp Glu Gly Lys Gln Ser Leu Thr Lys Leu Ala
325 330 335
Ala Ala Trp Gly Gly Ser Gly Ser Glu Ala Tyr Gln Gly Val Gln Gln
340 345 350
Lys Trp Asp Ala Thr Ala Thr Glu Leu Asn Asn Ala Leu Gln Asn Leu
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435 440 445
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450 455 460
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465 470 475 480
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485 490 495
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500 505 510
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515 520 525
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530 535 540
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Leu Ala Arg Asp Ser Ile Tyr Tyr Val Asp Ala Asn Ala Ser Ile Gln
565 570 575
Glu Met Leu Asn Val Met Glu Glu His Gln Val Arg Arg Val Pro Val
580 585 590
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595 600 605
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610 615 620
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625 630 635 640
Ser Asn Val Ser Val Ala Lys Ile Ala Phe Thr Gly Ala Val Leu Gly
645 650 655
Gly Gly Gly Ile Ala Met Ala Ala Gln Ala Thr Ala Ala Thr Asp Gly
660 665 670
Glu Trp Asp Gln Val Ala Arg Cys Glu Ser Gly Gly Asn Trp Ser Ile
675 680 685
Asn Thr Gly Asn Gly Tyr Leu Gly Gly Leu Gln Phe Thr Gln Ser Thr
690 695 700
Trp Ala Ala His Gly Gly Gly Glu Phe Ala Pro Ser Ala Gln Leu Ala
705 710 715 720
Ser Arg Glu Gln Gln Ile Ala Val Gly Glu Arg Val Leu Ala Thr Gln
725 730 735
Gly Arg Gly Ala Trp Pro Val Cys Gly Arg Gly Leu Ser Asn Ala Thr
740 745 750
Pro Arg Glu Val Leu Pro Ala Ser Ala Ala Met Asp Ala Pro Leu Asp
755 760 765
Ala Ala Ala Val Asn Gly Glu Pro Ala Pro Leu Ala Pro Pro Pro Ala
770 775 780
Asp Pro Ala Pro Pro Val Glu Leu Ala Ala Asn Asp Leu Pro Ala Pro
785 790 795 800
Leu Gly Glu Pro Leu Pro Ala Ala Pro Ala Asp Pro Ala Pro Pro Ala
805 810 815
Asp Leu Ala Pro Pro Ala Pro Ala Asp Val Ala Pro Pro Val Glu Leu
820 825 830
Ala Val Asn Asp Leu Pro Ala Pro Leu Gly Glu Pro Leu Pro Ala Ala
835 840 845
Pro Ala Asp Pro Ala Pro Pro Ala Asp Leu Ala Pro Pro Ala Pro Ala
850 855 860
Asp Leu Ala Pro Pro Ala Pro Ala Asp Leu Ala Pro Pro Ala Pro Ala
865 870 875 880
Asp Leu Ala Pro Pro Val Glu Leu Ala Val Asn Asp Leu Pro Ala Pro
885 890 895
Leu Gly Glu Pro Leu Pro Ala Ala Pro Ala Glu Leu Ala Pro Pro Ala
900 905 910
Asp Leu Ala Pro Ala Ser Ala Asp Leu Ala Pro Pro Ala Pro Ala Asp
915 920 925
Leu Ala Pro Pro Ala Pro Ala Glu Leu Ala Pro Pro Ala Pro Ala Asp
930 935 940
Leu Ala Pro Pro Ala Ala Val Asn Glu Gln Thr Ala Pro Gly Asp Gln
945 950 955 960
Pro Ala Thr Ala Pro Gly Gly Pro Val Gly Leu Ala Thr Asp Leu Glu
965 970 975
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980 985 990
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Thr Lys Lys Leu Trp Gln Ala Ile Arg Ala Gln Asp Val Cys Gly
1010 1015 1020
Asn Asp Ala Leu Asp Ser Leu Ala Gln Pro Tyr Val Ile Gly Thr
1025 1030 1035
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1040 1045 1050
Cys Ala Arg Ile Val Cys Thr Val Phe Ile Glu Thr Ala Val Val
1055 1060 1065
Ala Thr Met Phe Val Ala Leu Leu Gly Leu Ser Thr Ile Ser Ser
1070 1075 1080
Lys Ala Asp Asp Ile Asp Trp Asp Ala Ile Ala Gln Cys Glu Ser
1085 1090 1095
Gly Gly Asn Trp Ala Ala Asn Thr Gly Asn Gly Leu Tyr Gly Gly
1100 1105 1110
Leu Gln Ile Ser Gln Ala Thr Trp Asp Ser Asn Gly Gly Val Gly
1115 1120 1125
Ser Pro Ala Ala Ala Ser Pro Gln Gln Gln Ile Glu Val Ala Asp
1130 1135 1140
Asn Ile Met Lys Thr Gln Gly Pro Gly Ala Trp Pro Lys Cys Ser
1145 1150 1155
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1160 1165 1170
Leu Thr Phe Leu Ala Ala Glu Thr Gly Gly Cys Ser Gly Ser Arg
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<211> 1200
<212> PRT
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Ser Pro Ser Met Gly Arg Asp Ile Lys Val Gln Phe Gln Ser Gly Gly
20 25 30
Ala Asn Ser Pro Ala Leu Tyr Leu Leu Asp Gly Leu Arg Ala Gln Asp
35 40 45
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50 55 60
Gln Ser Gly Leu Ser Val Val Met Pro Val Gly Gly Gln Ser Ser Phe
65 70 75 80
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100 105 110
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355 360 365
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370 375 380
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420 425 430
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435 440 445
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485 490 495
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565 570 575
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595 600 605
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740 745 750
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770 775 780
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1085 1090 1095
Gly Gly Asn Trp Ala Ala Asn Thr Gly Asn Gly Leu Tyr Gly Gly
1100 1105 1110
Leu Gln Ile Ser Gln Ala Thr Trp Asp Ser Asn Gly Gly Val Gly
1115 1120 1125
Ser Pro Ala Ala Ala Ser Pro Gln Gln Gln Ile Glu Val Ala Asp
1130 1135 1140
Asn Ile Met Lys Thr Gln Gly Pro Gly Ala Trp Pro Lys Cys Ser
1145 1150 1155
Ser Cys Ser Gln Gly Asp Ala Pro Leu Gly Ser Leu Thr His Ile
1160 1165 1170
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Asp Asp Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Asp
1190 1195 1200
<210> 31
<211> 9
<212> PRT
<213> 结核分枝杆菌
<220>
<223> VL9肽
<400> 31
Val Met Ala Pro Arg Thr Leu Leu Leu
1 5

Claims (29)

1.一种Mtb抗原，其选自Ag85B-ESAT6和Ag85A-ESAT6-Rv3407-Rv2626c-RpfA-RpfD。
2.如权利要求1所述的Mtb抗原，其是Ag85A-ESAT6-Rv3407-Rv2626c-RpfA-RpfD。
3.一种重组RhCMV或HCMV载体，其包含编码可表达的Mtb抗原的核酸序列，所述Mtb抗原选自Ag85A-Ag85B-Rv3407、Rv1733-Rv2626c、RpfA-RpfC-RpfD、Ag85B-ESAT6和Ag85A-ESAT6-Rv3407-Rv2626c-RpfA-RpfD。
4.如权利要求3所述的重组RhCMV或HCMV疫苗载体，其中所述Mtb抗原的表达由抗原编码序列驱动，所述抗原编码序列与选自由以下组成的组的启动子可操作的缔合：组成型CMV启动子、立即早期CMV启动子、早期CMV启动子和晚期CMV启动子。
5.如权利要求4所述的重组RhCMV或HCMV疫苗载体，其中所述启动子选自由以下组成的组：EF1-α、UL82、MIE、pp65和gH。
6.如权利要求3至5中任一项所述的重组RhCMV或HCMV疫苗载体，其包含US2、US3、US4、US5、US6、US11或UL97或其同源物的缺失或修饰。
7.如权利要求3至6中任一项所述的重组RhCMV或HCMV疫苗载体，其包含Rh158-166或其同源物的缺失。
8.如权利要求3至7中任一项所述的重组RhCMV或HCMV疫苗载体，其中所述RhCMV或HCMV疫苗载体是向性限制性载体。
9.如权利要求8所述的重组RhCMV或HCMV疫苗载体，其中所述向性限制性载体缺乏在某些细胞类型中最佳生长所需的基因或含有对于病毒复制必需的基因中的组织特异性微小RNA的靶标，或者其中所述向性限制性载体具有上皮、中枢神经系统(CNS)或巨噬细胞缺陷向性，或其组合。
10.如权利要求3至9中任一项所述的重组RhCMV或HCMV疫苗载体，其中所述RhCMV或HCMV疫苗载体在对于体内生长非必需的基因区域中具有缺失。
11.如权利要求10所述的重组RhCMV或HCMV疫苗载体，其中所述基因区域选自由以下组成的组：RL11家族、pp65家族、US12家族和US28家族。
12.如权利要求11所述的重组RhCMV疫苗载体，其中所述RhCMV基因区域选自由以下组成的组：Rh13-Rh29、Rh111-Rh112、Rh191-Rh202和Rh214-Rh220，或者其中所述RhCMV基因区域选自由以下组成的组：Rh13.1、Rh19、Rh20、Rh23、Rh24、Rh112、Rh190、Rh192、Rh196、Rh198、Rh199、Rh200、Rh201、Rh202和Rh220。
13.如权利要求11所述的重组HCMV疫苗载体，其中所述HCMV基因区域选自由以下组成的组：RL11、UL6、UL7、UL9、UL11、UL83(pp65)、US12、US13、US14、US17、US18、US19、US20、US21和UL28。
14.如权利要求3至13中任一项所述的重组RhCMV或HCMV疫苗载体，其中所述载体包含对于宿主内的复制、宿主内的传播或宿主至宿主的扩散是必需的RhCMV或HCMV基因中的缺失。
15.如权利要求14所述的重组RhCMV或HCMV疫苗载体，其中所述必需基因是UL94、UL32、UL99、UL115或UL44或其同源物。
16.如权利要求3至15中任一项所述的重组RhCMV或HCMV疫苗载体，其中所述载体包含基因UL82/pp71或其同源物中的缺失。
17.如权利要求3至16中任一项所述的重组RhCMV或HCMV疫苗载体，其中所述载体还包含编码US2、US3或US6或其同源物的第二核酸序列，其中所述载体不编码功能性US11。
18.如权利要求17所述的重组RhCMV或HCMV疫苗载体，其中所述第二核酸序列编码US2、US3和US6。
19.如权利要求17或权利要求18所述的重组RhCMV或HCMV疫苗载体，其中缺失编码US11开放阅读框的核酸。
20.如权利要求17至19中任一项所述的重组RhCMV或HCMV疫苗载体，其还包含编码US11的第三核酸序列，并且其中所述编码US11的核酸序列包含点突变、移码突变和/或所述编码US11的核酸序列的一个或多个核苷酸的缺失。
21.如权利要求20所述的重组RhCMV或HCMV疫苗载体，其中所述载体缺乏间层蛋白pp65。
22.如权利要求3至21中任一项所述的重组RhCMV或HCMV疫苗载体，其中所述载体不表达活性UL130蛋白。
23.如权利要求3至22中任一项所述的重组RhCMV或HCMV疫苗载体，其中所述RhCMV疫苗载体是Rh68-1或Rh68-1.2。
24.如权利要求3所述的重组RhCMV或HCMV疫苗载体，其还包含与CMV基因可操作地连接的微小RNA识别元件(MRE)，所述CMV基因对于CMV生长是必需的或增强的，并且其中所述MRE在由骨髓谱系的细胞表达的微小RNA存在下使表达沉默。
25.一种药物组合物，其包含如权利要求3至24中任一项所述的重组RhCMV或HCMV疫苗载体或如权利要求1或权利要求2所述的Mtb抗原以及药学上可接受的载体。
26.如权利要求3至24中任一项所述的重组RhCMV或HCMV疫苗载体，其用于制备用于治疗或预防结核分枝杆菌感染或用于引发对Mtb抗原的免疫应答的药物。
27.如权利要求3至24中任一项所述的重组RhCMV或HCMV疫苗载体，其用于治疗或预防结核分枝杆菌感染或用于引发对Mtb抗原的免疫应答。
28.如权利要求3至24中任一项所述的重组RhCMV或HCMV疫苗载体在制备用于治疗或预防结核分枝杆菌感染或用于引发对Mtb抗原的免疫应答的药物中的用途。
29.如权利要求3至24中任一项所述的重组RhCMV或HCMV疫苗载体用于治疗或预防结核分枝杆菌感染或用于引发对Mtb抗原的免疫应答的用途。
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