JP6816031B2 - 非標準的なｃｄ８＋ｔ細胞応答を生成するのに有用な方法および組成物 - Google Patents

非標準的なｃｄ８＋ｔ細胞応答を生成するのに有用な方法および組成物 Download PDF

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Description

関連出願の相互参照
本願は、２０１５年２月１０日出願の米国特許仮出願第６２／１１４，２０３号；２０１５年７月２４日出願の米国特許仮出願第６２／１９６，５２０号；および２０１５年９月１８日出願の米国特許仮出願第６２／２２０，７０３号の優先権を主張し、その各々は参照によりその全文が本明細書に援用される。
一般に、分野は、免疫化におけるＣＭＶベクターの使用である。より具体的には、分野は、非標準的なＭＨＣ拘束を特徴とするＣＤ８＋免疫応答の生成である。さらにより具体的には、分野は、ＭＨＣ−Ｅによって拘束される受容体を含むＣＤ８＋を含めたＴ細胞の生成である。
政府支援の承認
本発明は、米国国立衛生研究所によって拠出された助成金番号Ｐ０１ ＡＩ０９４４１７の条件に基づいて合衆国政府の支援によって生み出された。合衆国政府は、本発明に一定の権利を有する。
サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）タンパク質を発現するアカゲザルサイトメガロウイルス（ＲｈＣＭＶ）ワクチンベクター（ＲｈＣＭＶ／ＳＩＶ）は、病原性ＳＩＶからの保護をもたらす（Ｈａｎｓｅｎ，Ｓ．Ｇ．ｅｔ ａｌ，Ｎｏｔ Ｍｅｄ １５，２９３（２００９）；Ｈａｎｓｅｎ，Ｓ．Ｇ．ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ ４７３，５２３（２０１１）；両文献ともに参照により本明細書に援用される）。この保護は、基本的に他のＴ細胞ワクチンとはその著しい効力とほとんど即時的な作用発現の点で異なり、ワクチンを受けた人の約５０％が、ウイルス血症の急性期を深く鈍らせ、収縮した後に、ウイルス複製の完全な制御を示す。ＲｈＣＭＶによって保護されたマカクはウイルス血症の周期的な低レベルの「ブリップ（ｂｌｉｐｓ）」を示したが、ＣＤ４＋メモリーＴ細胞の欠乏は観察されず、ＳＩＶ特異的抗体応答は発生しなかった。その後、時間とともにウイルスの核酸は、かろうじて数量化できるようになったが、複製能力のあるウイルスは保護された動物の組織から消失した。これらの事象は、自然に生じるＳＩＶエリートコントローラーと、ＤＮＡプライム／Ａｄ５ブーストを接種したコントローラーでは起こらなかった（Ｈａｎｓｅｎ，Ｓ．Ｇ．ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ ５０２，１００（２０１３）；参照により本明細書に援用される）。ＲｈＣＭＶ／ＳＩＶを接種したマカクにおけるこの保護作用を媒介する際に、ＲｈＣＭＶに誘導されるＣＤ８＋Ｔ細胞に中心的な役割があるとすると、これらのＴ細胞の機能的性質を定義することは、ＲｈＣＭＶ／ＳＩＶベクターに誘導されるＳＩＶ複製の制御へのそれらの機構的貢献を理解するのに重要である。これらの性質を理解することは、次に、異種抗原を発現するサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ワクチンベクターの新しい使用を導くことができる。
本明細書には、対象において少なくとも１つの異種抗原に対する免疫応答を生じる方法が開示される。この方法は、対象に有効量のＣＭＶベクターを投与することを伴う。ＣＭＶベクターは、少なくとも１つの異種抗原をコードする第１の核酸と、少なくとも１つの活性のあるＵＬ４０タンパク質またはそのホモログもしくはオーソログをコードする第２の核酸配列と、少なくとも１つのＵＳ２８タンパク質またはそのホモログもしくはオーソログをコードする第３の核酸配列とを含む。ＣＭＶベクターは、活性のあるＵＬ１２８タンパク質またはそのオーソログを発現せず、活性のあるＵＬ１３０タンパク質またはそのオーソログを発現せず、ベクターによって生成されたＣＤ８＋Ｔ細胞の少なくとも１０％は、ＭＨＣ−Ｅまたはそのホモログに拘束される。一部の実施形態では、第３の核酸配列は、２〜５個の活性のあるＵＳ２８タンパク質またはそれらのホモログもしくはオーソログをコードする。異種抗原は、例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、単純ヘルペスウイルス、Ｂ型またはＣ型肝炎ウイルス、パピローマウイルス、プラスモディウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）寄生虫、および結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）に由来する病原体特異的抗原を含めたいずれの抗原であってもよい。なおさらなる例では、異種抗原は腫瘍抗原であってよく、それには、例えば、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ芽球性白血病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、悪性黒色腫、乳癌、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、膵臓癌、結腸癌、腎細胞癌（ＲＣＣ）、および胚細胞性腫瘍に関連する腫瘍抗原が挙げられる。なおさらなる例では、異種抗原は、組織特異的抗原または宿主自己抗原であってよく、それには、例えば、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の可変領域由来の抗原、Ｂ細胞受容体の可変領域由来の抗原、精子抗原、または卵抗原が挙げられる。なおさらなる例では、ベクターは、（１）活性のあるＵＬ４０タンパク質（またはそのオーソログ）および／または活性のあるＵＳ２８タンパク質（またはそのオーソログ）、（２）活性のあるＵＬ１２８タンパク質（またはそのオーソログ）、および（３）活性のあるＵＬ１３０タンパク質（またはそのオーソログ）をコードしないので、ＭＨＣ−ＩＩ「スーパートープ（ｓｕｐｅｒｔｏｐｅ）」拘束性のＣＤ８＋Ｔ細胞を生じるが、ＨＬＡ−Ｅ拘束性のＣＤ８＋Ｔ細胞を生じない。
また、（１）少なくとも１つの異種タンパク質抗原をコードする第１の核酸配列、（２）少なくとも１つの活性のあるＵＬ４０タンパク質またはそのホモログもしくはオーソログをコードする第２の核酸配列、および（３）少なくとも１つの活性のあるＵＳ２８タンパク質またはそのホモログもしくはオーソログをコードする第３の核酸配列を含むヒトまたは動物サイトメガロウイルスベクターも本明細書に開示される。このベクターは、活性のあるＵＬ１２８およびＵＬ１３０タンパク質またはそのオーソログを発現しない。一部の実施形態では、第３の核酸配列は、２〜５の活性のあるＵＳ２８タンパク質またはそのホモログもしくはオーソログをコードする。
また、（１）活性のあるＵＬ１２８タンパク質（またはそのオーソログ）を発現しない、（２）活性のあるＵＬ１３０タンパク質（またはそのオーソログ）を発現しない、かつ（３）活性のあるＵＬ４０タンパク質（またはそのオーソログ）および／または活性のあるＵＳ２８タンパク質（またはそのオーソログ）を発現しない、ヒトまたは動物サイトメガロウイルスベクターも開示される。
また、ＭＨＣ−Ｅ−ペプチド複合体を認識するＣＤ８＋Ｔ細胞を生成する方法も本明細書に開示される。この方法は、第１の対象に、（１）少なくとも１つの異種抗原、（２）少なくとも１つの活性のあるＵＬ４０タンパク質（またはそのオーソログもしくはホモログ）、および（３）少なくとも１つの活性のあるＵＳ２８遺伝子（またはそのオーソログもしくはホモログ）をコードするＣＭＶベクターを、ＭＨＣ−Ｅ／ペプチド複合体を認識する一組のＣＤ８＋Ｔ細胞を生成するのに有効な量で投与することを伴う。ＣＭＶベクターは、活性のあるＵＬ１２８およびＵＬ１３０タンパク質またはそのオーソログをコードしない。一部の実施形態では、ＣＭＶベクターは、２〜５の活性のあるＵＳ２８タンパク質またはそのオーソログもしくはホモログをコードする。異種抗原は、病原体特異的抗原、腫瘍抗原、自己抗原、または組織特異的抗原を含めたいずれの抗原であってもよい。一部の実施形態では、自己抗原は、ＴまたはＢ細胞受容体の可変領域由来の抗原である。一部の実施形態では、この方法は、第１のＣＤ８＋ＴＣＲがＭＨＣ−Ｅ／異種抗原由来ペプチド複合体を認識する、ＣＤ８＋Ｔ細胞の組から第１のＣＤ８＋Ｔ細胞受容体を同定することをさらに含むことがある。一部の実施形態では、第１のＣＤ８＋Ｔ細胞受容体は、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列決定によって同定される。一部の実施形態では、この方法は、第１の対象または第２の対象から単離した１つまたは複数のＴ細胞に発現ベクターをトランスフェクトすることをさらに含むことがあり、この際、発現ベクターは、第２のＣＤ８＋Ｔ細胞受容体をコードする核酸配列、および第２のＣＤ８＋Ｔ細胞受容体をコードする核酸配列と動作可能に連結されたプロモーターを含み、第２のＣＤ８＋Ｔ細胞受容体は、第１のＣＤ８＋Ｔ細胞受容体のＣＤＲ３αおよびＣＤＲ３βを含み、それによってＭＨＣ−Ｅ／異種抗原由来ペプチド複合体を認識する１つまたは複数のトランスフェクトされたＣＤ８＋Ｔ細胞を生成する。一部の実施形態では、この方法は、疾患、例えば癌、病原性感染、または自己免疫疾患もしくは障害を治療するために、トランスフェクトされたＣＤ８＋Ｔ細胞を第１もしくは第２の対象に投与することをさらに含むことがある。一部の実施形態では、この方法は、自己抗原または組織特異的抗原に対する自己免疫応答を誘導するために、トランスフェクトされたＣＤ８＋Ｔ細胞を第１もしくは第２の対象に投与することをさらに含むことがある。
また、（１）第１の対象にＣＭＶベクターを、ＭＨＣ−Ｅ／ペプチド複合体を認識する一組のＣＤ８＋Ｔ細胞を生成するのに有効な量で投与する工程であって、ＣＭＶベクターは、少なくとも１つの異種抗原をコードする第１の核酸配列と、少なくとも１つの活性のあるＵＬ４０タンパク質またはそのオーソログもしくはホモログをコードする第２の核酸配列と、少なくとも１つの活性のあるＵＳ２８タンパク質またはそのオーソログもしくはホモログをコードする第３の核酸配列とを含み、かつ、ＣＭＶベクターは、活性のあるＵＬ１２８およびＵＬ１３０タンパク質またはそのオーソログを発現しない工程；（２）第１のＣＤ８＋Ｔ細胞受容体をＣＤ８＋Ｔ細胞の組から識別する工程であって、第１のＣＤ８＋Ｔ細胞受容体はＭＨＣ−Ｅ／異種抗原由来ペプチド複合体を認識する工程；（３）１つまたは複数のＣＤ８＋Ｔ細胞を第１の対象または第２の対象から単離する工程；および（４）第１または第２の対象から単離した１つまたは複数のＣＤ８＋Ｔ細胞に発現ベクターをトランスフェクトする工程であって、発現ベクターは、第２のＣＤ８＋Ｔ細胞受容体をコードする核酸配列と、第２のＴ細胞受容体をコードする核酸配列と動作可能に連結されたプロモーターとを含み、第２のＣＤ８＋Ｔ細胞受容体は、第１のＣＤ８＋Ｔ細胞受容体のＣＤＲ３αおよびＣＤＲ３βを含み、それによってＭＨＣ−Ｅ−ペプチド複合体を認識するトランスフェクトされたＴ細胞を作製する工程を含む方法によって調製されたＭＨＣ−Ｅ−ペプチド複合体を認識するトランスフェクトされたＣＤ８＋Ｔ細胞も開示される。異種抗原は、病原体特異的抗原または腫瘍抗原を含めたいずれの抗原であってもよい。一部の実施形態では、ＣＭＶベクターの第３の核酸配列は、２〜５個の活性のあるＵＳ２８タンパク質またはそのオーソログもしくはホモログをコードする。また、疾患、例えば癌、病原性感染、または自己免疫疾患もしくは障害などを治療する方法も本明細書に開示され、該方法は、ＭＨＣ−Ｅ−ペプチド複合体を認識するトランスフェクトされたＣＤ８＋Ｔ細胞を、第１または第２の対象に投与することを含む。
本明細書に含まれるグラフおよびプロットのいくつかは色を使用するとより良く理解されるかもしれないが、色は特許出願公報では使用できない。本出願人らは、全ての本来開示される画像およびグラフを（着色されていようとなかろうと）原開示の一部と考え、後の手続きにおいて本明細書に開示される図面の色グラフおよびプロットを提示する権利を保有する。
株６８−１ ＲｈＣＭＶ／ｇａｇを接種したマカク（Ｒｈ２２０３４かまたはＲｈ２１８２６のいずれか）の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の一組のフローサイトメトリープロットを示す図である。実施例１で考察されるように、ＲｈＣＭＶ株６８−１は、Ｒｈ１３、Ｒｈ６０、Ｒｈ１５７．５および１５７．４からの遺伝子産物（それぞれ、ＨＣＭＶ ＲＬ１１、ＵＬ３６、ＵＬ１２８およびＵＬ１３０）オープンリーディングフレームを発現しない。ＰＢＭＣを、示されるペプチドでパルスした、表示される抗原提示細胞とともにインキュベートした後に、ＩＦＮ−γおよび／またはＴＮＦ−α産生（各々の四分円に示されるＣＤ８＋Ｔ細胞の応答頻度）を検出するためのフローサイトメトリー細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）を使用して、ペプチド特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞認識について評価した。親のＭＨＣ−Ｉ陰性Ｋ５６２細胞は、陰性対照として使用され、また、表示されるＭＨＣ−Ｉ分子を発現させるためにトランスフェクトされた。一方、自家Ｂリンパ芽球様細胞株（ＢＬＣＬ）は陽性対照として使用された。 Ｇａｇ２７３−２８７（ＳＩＶｍａｃ２３９ Ｇａｇ １５−ｍｅｒ ＃６９）でパルスした抗原提示細胞（Ｍａｍｕ−Ｅだけを発現している自家ＢＬＣＬまたはＫ５６２形質移入体）とともにインキュベートした後の、ＩＦＮ−γおよび／またはＴＮＦ−α産生（各々の四分円に示されるＣＤ８＋Ｔ細胞の応答頻度）を示す、株６８−１ ＲｈＣＭＶ／ｇａｇベクターを接種したマカク（Ｒｈ２２０３４およびＲｈ２１８２６）のＰＢＭＣ中のＣＤ８＋Ｔ細胞の一組のフローサイトメトリープロット（左パネル）と棒グラフ（右パネル）を示す図である。抗原提示細胞は、表示されるＧａｇ １５−ｍｅｒとともに、追加のペプチドなし（ブロッキングなし）か、あるいはＭａｍｕ−Ｅ結合ペプチドＲｈ６７８−１６ＶＬ９（Ｒｈ６７ ＶＬ９）またはＭａｍｕ−Ａ＊００２：０１結合ペプチドＧａｇ７１−７９ＧＹ９（ＳＩＶｇａｇ ＧＹ９）の存在下でインキュベートした。右側のパネルは、Ｇａｇ２７３−２８７（ＳＩＶｍａｃ２３９ Ｇａｇ １５−ｍｅｒ ＃６９）でパルスした自家ＢＬＣＬまたはＭａｍｕ−Ｅ形質移入体とともにインキュベートした、株６８−１ ＲｈＣＭＶ／ｇａｇベクターを接種した４匹のマカクのＣＤ８＋Ｔ細胞からのＩＦＮ−γおよび／またはＴＮＦ−α産生におけるペプチドブロッキング条件の比較である。データは、ペプチドブロッキングなしで観察される応答に対して正規化される。 は、Ｇａｇ４７７−４９１（ＳＩＶｍａｃ２３９ Ｇａｇ １５−ｍｅｒ ＃１２０）でパルスした抗原提示細胞（Ｍａｍｕ−Ｅだけを発現している自家ＢＬＣＬまたはＫ５６２形質移入体）とともにインキュベートした後の、ＩＦＮ−γおよび／またはＴＮＦ−α産生（各々の四分円に示されるＣＤ８＋Ｔ細胞の応答頻度）を示す、株６８−１ ＲｈＣＭＶ／ｇａｇベクターを接種したマカク（Ｒｈ２２０３４およびＲｈ２１８２６）のＰＢＭＣ中のＣＤ８＋Ｔ細胞の一組のフローサイトメトリープロット（左パネル）と棒グラフ（右パネル）を示す図である。抗原提示細胞は、表示されるＧａｇ １５−ｍｅｒとともに、追加のペプチドなし（ブロッキングなし）か、あるいはＭａｍｕ−Ｅ結合ペプチドＲｈ６７８−１６ＶＬ９（Ｒｈ６７ ＶＬ９）またはＭａｍｕ−Ａ＊００２：０１結合ペプチドＧａｇ７１−７９ＧＹ９（ＳＩＶｇａｇ ＧＹ９）の存在下でインキュベートした。右側のパネルは、Ｇａｇ４７７−４９１（ＳＩＶｍａｃ２３９ Ｇａｇ １５−ｍｅｒ ＃１２０）でパルスした自家ＢＬＣＬまたはＭａｍｕ−Ｅ形質移入体とともにインキュベートした、株６８−１ ＲｈＣＭＶ／ｇａｇベクターを接種した４匹のマカクのＣＤ８＋Ｔ細胞からのＩＦＮ−γおよび／またはＴＮＦ−α産生におけるペプチドブロッキング条件の比較である。データは、ペプチドブロッキングなしで観察される応答に対して正規化される。 株６８−１ ＲｈＣＭＶ／ｇａｇベクター（ｎ＝６）、株６８−１．２ＲｈＣＭＶ／ｇａｇベクター（ｎ＝９）、ＭＶＡ／ｇａｇベクター（ｎ＝７）を接種したマカクと、ＳＩＶｍａｃ２３９に感染したマカク（ｎ＝８）において、１２５の連続した１５ｍｅｒのＧａｇペプチド（１１アミノ酸オーバーラップを含む）の認識を検出するために、フローサイトメトリーＩＣＳを使用してエピトープマッピングした、ＳＩＶｍａｃ２３９ Ｇａｇに対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答を示す表である。実施例１に考察されるように、Ｒｈ６０、Ｒｈ１５７．５、およびＲｈ１５７．４（それぞれ、ＨＣＭＶ ＵＬ３６、ＵＬ１２８、およびＵＬ１３０）の発現は、ＲｈＣＭＶ株６８−１．２において回復される。上のバックグラウンドＣＤ８＋Ｔ細胞応答で得られるペプチドを、ＭＨＣ−Ｉ（ｍＡｂ Ｗ６／３２）、ＭＨＣ−Ｅ（Ｒｈ６７ ＶＬ９）、およびＭＨＣ−ＩＩ（ｍＡｂ Ｇ４６−６）封鎖に付し、ＭＨＣ−Ｉにブロックされたもの（白色で塗りつぶしたボックス）、完全にＭＨＣ−Ｅにブロックされたもの（灰色で塗りつぶしたボックス）、部分的にＭＨＣ−Ｅにブロックされたもの（水平ハッチング線で塗りつぶしたボックス）、ＭＨＣ−ＩＩにブロックされたもの（黒色で塗りつぶしたボックス）、または不確定のもの（垂直ハッチング線で塗りつぶしたボックス）に分類した。各々のマカクのこれらの反応性ペプチドに潜在的に含まれる、独立したＭＨＣ−Ｅに封鎖されたエピトープの最小数は、右側に示される（「方法」を参照）。マカク２２０６３および２２６２４には、ＢＡＣ由来ＲｈＣＭＶ／ｇａｇを接種したのに対し、マカク２１８２６、２２０３４、２２４３６、および２２６０７にはＢＡＣに由来しないＲｈＣＭＶｇａｇ（Ｌ）を接種したことに留意されたい。 Ｇａｇ６９−８３（Ｇａｇ ＃１８）ペプチドを単独で（ブロッキングなし）、あるいは、ＭＨＣ−Ｅ−結合Ｒｈ６７８−１６ ＶＬ９またはＭａｍｕ−Ａ＊０１結合Ｇａｇ１８１−１８９ＣＭ９ペプチドの存在下でパルスした抗原提示細胞（ＭａｍｕＡ１＊００１：０１またはＭａｍｕ−Ｅだけを発現する自家ＢＬＣＬまたはＫ５６２形質移入体）とともにインキュベートした後の、ＩＦＮ−γおよび／またはＴＮＦ−α産生（各々の四分円に示されるＣＤ８＋Ｔ細胞の応答頻度）を示す、ＭａｍｕＡ１＊００１：０１＋株６８−１ ＲｈＣＭＶ／ｇａｇベクターを接種したマカクのＰＢＭＣ中のＣＤ８＋Ｔ細胞の一組のフローサイトメトリープロットを示す図である。 図２Ｂについて記載される抗原提示細胞とともにインキュベートした、ＭａｍｕＡ１＊００１：０１−株６８−１ ＲｈＣＭＶ／ｇａｇベクターを接種したマカクのＰＢＭＣ中のＣＤ８＋Ｔ細胞の一組のフローサイトメトリープロットを示す図である。 増殖性にＳＩＶ感染した（ＣＤ４− Ｇａｇ ｐ２７＋）または感染しなかった（ＣＤ４＋ Ｇａｇ ｐ２７−）ＣＤ４＋Ｔ細胞標的の表面でバルク表面ＭＨＣ−Ｉ（ｍＡｂ Ｗ６／３２により測定）を示す２つのプロットからなる組を示す図である。代表的なフローサイトメトリープロットは左側のパネルに示され、一方、右側のパネルは、合計１６匹の非血縁アカゲザル由来のＳＩＶ感染ＣＤ４＋Ｔ細胞と非感染ＣＤ４＋Ｔ細胞を比較した、バルクＭＨＣ−Ｉ染色の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を表す。 増殖性にＳＩＶ感染した（ＣＤ４− Ｇａｇ ｐ２７＋）または感染しなかった（ＣＤ４＋ Ｇａｇ ｐ２７−）ＣＤ４＋Ｔ細胞標的の表面でＭＨＣ−Ｅ（ｍＡｂ ４Ｄ１２により測定）を示す２つのプロットからなる組を示す図である。代表的なフローサイトメトリープロットは左側のパネルに示され、一方、右側のパネルは、合計１６匹の非血縁アカゲザル由来のＳＩＶ感染ＣＤ４＋Ｔ細胞と非感染ＣＤ４＋Ｔ細胞を比較した、ＭＨＣ−Ｅ染色のＭＦＩを表す。 Ｇａｇ２７３−２８７（６９）またはＧａｇ４７７−４９１（１２０）ペプチド刺激に応答するＭＨＣ−Ｅ拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞の表現型を示すプロットを示す図である。百分率は、各々のマーカーを発現するＩＦＮ−γおよび／またはＴＮＦ−α産生細胞の数を調べることによって計算した。 自家ＳＩＶｍａｃ２３９感染ＣＤ４＋Ｔ細胞単独とともに（ブロッキングなし）、あるいはＭＨＣ−ＩＩ結合クラスＩＩ関連インバリアント鎖ペプチド（ＣＬＩＰ）＋ｐａｎ−ＭＨＣ−ＩブロッキングｍＡｂ Ｗ６／３２（Ｗ６／３２＋ＣＬＩＰ）、またはＲｈ６７８−１６ ＶＬ９＋ＣＬＩＰ（ＶＬ９＋ＣＬＩＰ）の存在下でインキュベートした後のＣＤ８＋Ｔ細胞からのＩＦＮ−γおよび／またはＴＮＦ−α産生を示す、株６８−１ ＲｈＣＭＶ／ｇａｇ、ＭＶＡ／ｇａｇ、株６８−１．２ＲｈＣＭＶ／ｇａｇのいずれかを接種したか、またはＳＩＶに感染したマカクから単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞の代表的なフローサイトメトリープロットの組を示す図である。 株６８−１ ＲｈＣＭＶ／ｇａｇ（ｎ＝５）、ＭＶＡ／ｇａｇ（ｎ＝６）、株６８−１．２ＲｈＣＭＶ／ｇａｇ（ｎ＝４）を接種したか、またはＳＩＶに感染した（ｎ＝６）マカクのＣＤ８＋Ｔ細胞について図４Ａに表される認識およびブロッキング実験についての正規化した応答頻度の比較の棒グラフを示す図である。 ＭＨＣ−Ｅ拘束性Ｇａｇ４７７−４９１Ｇａｇ＃１２０エピトープ（上列）またはＭａｍｕ−Ａ＊００１：０１拘束性Ｇａｇ１８１−１８９ＣＭ９エピトープ（下列）のいずれかに特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞株（ＣＬ）によるＳＩＶ感染細胞の認識を示す、一組のフローサイトメトリープロットを示す図である。ＣＬを、表示されるブロッキング条件の存在下、非感染またはＳＩＶ感染ＣＤ４＋Ｔ細胞（Ｒｈ２２６０７由来）とともにインキュベートした。 （左側のパネル）表示される時点のＳＩＶｇａｇに対応するオーバーラップペプチドとともにインキュベートした後のＩＦＮ−γおよび／またはＴＮＦ−α産生を示すＳＩＶｇａｇを発現する、Ｒｈ６７（ＵＬ４０）を欠失した６８−１ ＲｈＣＭＶを接種したアカゲザル由来のＰＢＭＣ中のＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率を示す図である。中央のパネルは、Ｍａｍｕ−Ｅ拘束性ペプチドＧａｇ２７３−２８７（Ｇａｇ６９）またはＧａｇ４７７−４９１（Ｇａｇ１２０）に応答しない、同じ動物由来のＰＢＭＣ中のＣＤ８＋Ｔ細胞を示す。右側のパネルは、ＭＨＣ−ＩＩ拘束性ペプチド（Ｇａｇ５３およびＧａｇ７３）に応答する、同じ動物由来のＰＢＭＣ中のＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率を示す。ＭＨＣ−ＩＩペプチドは、いわゆるスーパートープに対応し、すなわち、これらのペプチドは、多くの異なるＭＨＣ−ＩＩ対立遺伝子によって提示され、そのために大部分の動物において応答を誘発する。 Ｒｈ６７を欠失する株６８−１ ＲｈＣＭＶ／ｇａｇベクター（ｎ＝３）を接種したマカクにおいて、１２５の連続した１５ｍｅｒのＧａｇペプチド（１１アミノ酸オーバーラップを含む）の認識を検出するために、フローサイトメトリーＩＣＳを使用してエピトープマッピングした、ＳＩＶｍａｃ２３９ Ｇａｇに対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答を示す表である。上のバックグラウンドＣＤ８＋Ｔ細胞応答で得られるペプチドを、ＭＨＣ−Ｉ（ｍＡｂ Ｗ６／３２）、ＭＨＣ−Ｅ（Ｒｈ６７ ＶＬ９）、およびＭＨＣ−ＩＩ（ｍＡｂ Ｇ４６−６）封鎖に付し、ＭＨＣ−Ｉにブロックされたもの（白色で塗りつぶしたボックス）、ＭＨＣ−Ｅにブロックされたもの（灰色で塗りつぶしたボックス）、およびＭＨＣ−ＩＩにブロックされたもの（黒色で塗りつぶしたボックス）に分類した。全てのペプチドがＭＨＣ−ＩＩによって拘束され、ＨＬＡ−Ｅ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘発するためにＲｈ６７が必要であることを示すことに留意されたい。 単一のＭａｍｕ−Ｄ分子をトランスフェクトされた細胞株によるＭＨＣ−ＩＩ、ＭＨＣ−Ｉａ、ＭＨＣ−Ｅ、またはＭＨＣ−Ｆの表面染色を示す一組のプロットを示す図である。 表示されるアカゲザル（ＲＭ）個体の遺伝子型判定を示す表である。個体に、Ｒｏｃｈｅ／４５４パイロシーケンシングによってＭａｍｕ−Ａ、−Ｂ、および−Ｅの遺伝子型判定を行った。灰色の影は、ＭＨＣ−Ｉ形質移入体生成に選択された対立遺伝子を示す。複対立遺伝子が記載されている箇所では、太字の対立遺伝子が作製された。 １つのＭＨＣ−ＩａまたはＭＨＣ−Ｉｂ対立遺伝子を親の（ＭＨＣ−Ｉ陰性）細胞株（それぞれ、．２２１細胞またはＫ５６２）にトランスフェクトした、２つのプロットからなる組を示す図である。ＭＨＣ−Ｉ発現を評価するために、細胞を、交差反応性ヒトＭＨＣ−Ｉモノクローナル抗体（Ｗ６／３２）を用いて室温で１５分間染色した。細胞を、１０％ウシ胎児血清を添加した１Ｘ ＰＢＳで１回洗浄し、２％パラホルムアルデヒドで固定し、ＬＳＲＩＩフローサイトメーターで回収し、ＦｌｏｗＪｏで分析した。ＭＨＣ−Ｉを発現するＢリンパ芽球様細胞（ＢＬＣＬ）を陽性対照として用い、一方、ＭＨＣ−Ｉ陰性の親細胞株は陰性対照として使用した。 Ｇａｇ １２０についてのＲｈ２２６０７からの拘束アッセイの代表的なフローデータを示す一組のプロットを示す図である。 自家Ｂリンパ芽球様細胞（ＢＬＣＬ）、ＭＨＣ−Ｉヌル．２２１またはＫ５６２細胞、または表示されるＳＩＶｇａｇペプチドでパルスした、表示される単一のＭａｍｕ−Ｉ形質移入体とともにインキュベートし、次にフローサイトメトリーＩＣＳによってＣＤ８＋Ｔ細胞応答について分析した（図１参照）、４つの表示されるＲＭ（＃２１８２６、２２４３６、２２０３４、および２２６０７；図７Ｂに示されるＭａｍｕ−Ｉ対立遺伝子）のＰＢＭＣを示す表である。２列目から始まる、バックグラウンド（ペプチドなし）を上回るＣＤ８＋Ｔ細胞応答をもたらした組合せは、＋記号で表示され（灰色のボックス）；バックグラウンドを上回るＣＤ８＋Ｔ細胞応答をもたらさなかった組合せは、−記号で表示される（白色のボックス）。１列目では、各々のＲＭにおいて発現されるＭａｍｕ−Ｉ対立遺伝子が灰色のボックスで表示され；発現されない対立遺伝子は白色のボックスで示される。 ＭＨＣ−Ｅと比較したＭＨＣ−Ｉの封鎖調査の一組のフローサイトメトリープロットを示す図である。（左）株６８−１ ＲｈＣＭＶ／ｇａｇベクターを接種したマカク、または（Ｂ）株６８−１．２ＲｈＣＭＶ／ｇａｇベクターを接種したマカクのＰＢＭＣ中のＣＤ８＋Ｔ細胞の代表的なフローサイトメトリープロットは、上部に表示されるＧａｇ １５−ｍｅｒペプチドおよび左側に表示されるブロッキング条件でインキュベートした後の、ＩＦＮ−γおよび／またはＴＮＦ−α産生（各々の四分円に示されるＣＤ８＋Ｔ細胞の応答頻度）を示す。 Ｇａｇ２７３−２８７（ＳＩＶｍａｃ２３９ Ｇａｇ １５−ｍｅｒ ＃６９）で刺激し、フローサイトメトリーＩＣＳを実施した、株６８−１ ＲｈＣＭＶ／ｇａｇベクターを接種したマカクのＰＢＭＣを示す一組のフローサイトメトリープロットを示す図である。これらのＭＨＣ−Ｅ結合Ｇａｇペプチドに応答するＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αによって同定した後、表示されるマーカーの発現についてＰＢＭＣ中の残留細胞と比較した。黒色の数字は、表示されるマーカーに対して陽性のＰＢＭＣ中の細胞の全体の百分率を示し、一方、灰色の数字は、陽性のＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−α産生細胞の百分率を示す。 Ｇａｇ４７７−４９１（ＳＩＶｍａｃ２３９ Ｇａｇ １５−ｍｅｒ ＃１２０）で刺激し、フローサイトメトリーＩＣＳを実施した、株６８−１ ＲｈＣＭＶ／ｇａｇベクターを接種したマカクのＰＢＭＣを示す一組のフローサイトメトリープロットを示す図である。これらのＭＨＣ−Ｅ結合Ｇａｇペプチドに応答するＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αによって同定した後、表示されるマーカーの発現についてＰＢＭＣ中の残留細胞と比較した。黒色の数字は、表示されるマーカーに対して陽性のＰＢＭＣ中の細胞の全体の百分率を示し、一方、灰色の数字は、陽性のＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−α産生細胞の百分率を示す。 図１１は、株６８−１ ＲｈＣＭＶ／ＳＩＶｇａｇに誘発されたＣＤ８＋Ｔ細胞のＭＨＣ拘束をまとめて示す図である。図１１Ａは、代表的な株６８−１ ＲｈＣＭＶ／ＳＩＶｇａｇを接種したマカク（Ｒｈ２２０３４；同様に分析される４つのうちの１つ）由来のＰＢＭＣのフローサイトメトリー細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）分析の結果を示す一組のプロットを示す図である。フローサイトメトリーＩＣＳアッセイによるＩＦＮ−γおよび／またはＴＮＦ−α産生の検出によって求められるＣＤ８＋Ｔ細胞認識（各々の四分円に示されるゲートを設けたＣＤ８＋Ｔ細胞の応答頻度）で、表示されるＭＨＣ−Ｉ形質移入体または対照細胞の表面にパルスした、表示される１５ｍｅｒペプチドエピトープで、ワクチン接種したマカクのＰＢＭＣを刺激した。親のＭＨＣ−Ｉ陰性．２２１およびＫ５６２細胞を陰性対照として使用する一方で、自家Ｂリンパ芽球様細胞（ＢＬＣＬ）を陽性対照として使用した。試験したＭＨＣ−Ｉ分子には、Ｒｈ２２０３４によって発現するそれらの両方が含まれた。 図１１Ａと同様にＲｈ２２０３４によって発現されないさらなるマカクおよびヒトＭＨＣ−Ｅ分子のフローサイトメトリーＩＣＳ分析の結果を示す一組のプロットを示す図である。 上に示したもの（同様に分析した４つの代表）と同じ株６８−１ ＲｈＣＭＶ／ＳＩＶｇａｇベクターを接種したマカクで処理したＲＭ由来のＰＢＭＣの表現型分析を示す一組のプロットを示す図である。ＰＢＭＣは、ＳＩＶｇａｇ２７３−２８７（６９）かまたはＳＩＶｇａｇ４７７−４９１（１２０）のいずれかでパルスした自家ＢＬＣＬで刺激され、応答ＣＤ３＋リンパ球（ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−α産生性；ゲートは左のプロットに示される）は、各々のプロット中でそれぞれ灰色および黒色（および、同じ色で表示される各々のプロットに示される長方形の領域内のそれらの相対％）で表示される指定ゲート内の応答細胞および非応答細胞でのフローサイトメトリーＩＣＳアッセイによって、表現型が決定された。 単一のＭＨＣ−Ｅ形質移入体を、表示されるＳＩＶｇａｇ １５ｍｅｒペプチドエピトープでパルスする前に、標準的なＭＨＣ−Ｅ−結合ペプチドＶＭＡＰＲＴＬＬＬ（ＶＬ９）または対照非ＭＨＣ−Ｅ結合ペプチド（ＳＩＶｇａｇ ＧＹ９）とともにプレインキュベートした結果のプロットの組を示す図である。フローサイトメトリーＩＣＳアッセイは、上記のように、株６８−１ ＲｈＣＭＶ／ＳＩＶｇａｇを接種したマカク由来のＰＢＭＣ、および次のＭＨＣ−Ｅ形質移入体：ＳＩＶｇａｇ２７３−２８７（６９）、ＳＩＶｇａｇ３８５−３９９（９７）、およびＳＩＶｇａｇ４３３−４４７（１０９）についてのＭａｍｕ−Ｅ＊０２：０４、ならびにＳＩＶｇａｇ２５７−２７１（６５）およびＳＩＶｇａｇ４７７−４９１（１２０）についてのＭａｍｕ−Ｅ＊０２：１１を使用して実施した。 図１２は、ＭＨＣ−Ｅ拘束がΔＲｈ１５７．５／．４ ＲｈＣＭＶベクターに誘発されたＣＤ８＋Ｔ細胞応答に制限されることをまとめて示す図である。図１２Ａは、表示されるＳＩＶｇａｇ発現ウイルスベクターを接種したか、またはＳＩＶｍａｃ２３９自体に感染したマカク（示される群あたりｎ＝６）において、１２５の連続した１５ｍｅｒのｇａｇペプチド（１１アミノ酸オーバーラップを含む）の認識を検出するために、フローサイトメトリーＩＣＳを使用してエピトープマッピングした、ＳＩＶｇａｇに対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答を示す表である。上のバックグラウンドＣＤ８＋Ｔ細胞応答の結果得られるペプチドは、ボックスで表示され、ボックスの塗りつぶしは、抗ｐａｎ−ＭＨＣ−Ｉ ｍＡｂ Ｗ６−３２、ＭＨＣ−ＥブロッキングペプチドＶＬ９およびＭＨＣ−ＩＩブロッキングペプチドＣＬＩＰによるブロッキングによって求められるＭＨＣ拘束を示す。ＭＨＣ−Ｉａ、ＭＨＣ−Ｅ、およびＭＨＣ−ＩＩによる拘束は、それぞれ、Ｗ６−３２単独（白色で塗りつぶしたボックス）、Ｗ６−３２およびＶＬ９単独（灰色で塗りつぶしたボックス）、およびＣＬＩＰ単独（黒色で塗りつぶしたボックス）による＞９０％の応答ブロッキングに基づき、これらの判定基準を満たしていない応答は、不確定（垂直ハッチング線で塗りつぶしたボックス）に分類した。これらのＭＨＣ拘束カテゴリーの独立したエピトープの最小数は、各々のマカクの右側に示される。 ＳＩＶｐｏｌならびに結核菌タンパク質Ａｇ８５Ｂ、ＥＳＡＴ−６、およびＲｐｆＡのタンパク質を発現する株６８−１ ＲｈＣＭＶベクターを接種したマカクにおいて上記のようにエピトープマッピングした、ＳＩＶｐｏｌならびに結核菌タンパク質Ａｇ８５Ｂ、ＥＳＡＴ−６、およびＲｐｆＡに対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答を示す表である。 株６８−１ ＲｈＣＭＶ／ｇａｇ、ＭＶＡ／ｇａｇ、株６８−１．２ＲｈＣＭＶ／ｇａｇベクターを接種したか、ＳＩＶに感染したマカクから単離したＣＤ８＋細胞によるＳＩＶ感染ＣＤ４＋細胞認識の分析を示す、一組のプロット（右側）、別の組のプロット（中央）、および棒グラフ（右側）を示す図である。左側のフロープロフィールは、自家ＳＩＶｍａｃ２３９感染ＣＤ４＋Ｔ細胞の、単独での（ブロッキングなし）、またはｐａｎ−ＭＨＣ−ＩブロッキングｍＡｂ Ｗ６／３２＋ＭＨＣ−ＩＩ結合ＣＬＩＰペプチド（抗ＭＨＣ−Ｉ＋ＣＬＩＰ）、またはＭＨＣ−Ｅ−結合ペプチドＶＬ９＋ＣＬＩＰ（ＶＬ９＋ＣＬＩＰ）の存在下でのＣＤ８＋Ｔ細胞インキュベーションの後の、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−α産生を示す。全てのプロットは生細胞、ＣＤ３＋、ＣＤ８＋細胞にゲートが設けられている。右側の棒グラフは、調査したマカク全ての結果を示す。 株６８−１ ＲｈＣＭＶ／ｇａｇを接種したマカクと従来のウイルスベクター（後者はＭＶＡ／ｇａｇ（ｎ＝１１）、Ａｄ５／ｇａｇ（ｎ＝３）および電気穿孔ＤＮＡ／ｇａｇ＋ＩＬ−１２（ｎ＝４）を含む）を接種したマカク、または制御されたＳＩＶｍａｃ２３９感染マカク（血漿ウイルス量＜１０，０００コピー／ｍｌ；ｎ＝１２）における、循環するＣＤ８＋Ｔ細胞に認識される個別のＭＨＣ Ｅ−拘束ＳＩＶｇａｇエピトープ（灰色）とＭＨＣ−Ｉａ拘束性ＳＩＶｇａｇエピトープ（黒色）の総数の比較を示すプロットを示す図である。水平のバーは中央値を示す。 表示される抗原の各々を発現する株６８−１ ＲｈＣＭＶベクターを接種した個々のマカクにおける、循環するＣＤ８＋Ｔ細胞に認識されるＭＨＣ Ｅ拘束性エピトープの密度（エピトープ数／タンパク質長の１００アミノ酸）の比較を示すプロットを示す図である（注：ＲｈＣＭＶ ＩＥ１応答は、６８−１ ＲｈＣＭＶ／ｇａｇを投与したＣＭＶナイーブマカクにおいて評価した）。水平のバーは各群の中央値を示す。 ４２匹の株６８−１ ＲｈＣＭＶ／ｇａｇベクターを接種したマカクにおける１２５の重複している（１１アミノ酸オーバーラップ）、連続したＳＩＶｇａｇ １５ｍｅｒペプチドにわたる、ＭＨＣ−Ｅに拘束されるＳＩＶｇａｇエピトープ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答の幅の分析の棒グラフを示す図である。少なくとも１匹のマカクにおいて、１０９／１２５ １５ｍｅｒｓ（８７％）が、ＭＨＣ−Ｅ拘束性のＣＤ８＋Ｔ細胞によって認識されたことに留意されたい。 （左）は、株６８−１ ＲｈＣＭＶベクターを接種したマカクにおいてＣＤ８＋Ｔ細胞により認識される、１１個の最適なＭＨＣ−Ｅ拘束性のＳＩＶｇａｇ ９ｍｅｒペプチドエピトープに基づく、文字の高さによって所定の位置（ＳＩＶｍａｃ２３９ Ｇａｇのそれらのバックグラウンド頻度に対する位置；方法の項参照）での各々のアミノ酸の頻度を示す配列ロゴを示す図である。配列ロゴは、参照により本明細書に援用される、Ｌａｍｐｅｎ ＭＨ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ５３，１２６−１３１（２０１３）によるＴＡＰ欠損設定においてＨＬＡ−Ｅから溶出される５５１のペプチドの中で濃縮度（灰色で塗りつぶした文字またはハッチングされた文字）または提示不足（白色で塗りつぶした文字）に応じて着色されている。２番目およびＣ末端アンカー位置が濃縮されたアミノ酸は、５５１のＬａｍｐｅｎ ｅｔ ａｌ．のペプチドの中で、本発明者らの１１個の最適なＳＩＶｇａｇペプチド（右側）の中では稀であったが、著しく提示不足であったアミノ酸は濃縮された。各々の最適なペプチドに応答した、株６８−１ ＲｈＣＭＶ／ｇａｇを接種したマカクの百分率を、「認識頻度」として記す。 ＳＩＶｇａｇ２７６−２８４およびＳＩＶｇａｇ４８２−４９０エピトープが、全ての株６８−１ ＲｈＣＭＶ／ｇａｇを接種したアカゲザルにおいてＣＤ８＋Ｔ細胞によって認識されることを示すプロットを示す図である。表示されるＳＩＶｇａｇ ９ｍｅｒペプチドに対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答は、フローサイトメトリーＩＣＳを使用し、応答読み出しとしてＣＤ３＋／ＣＤ８＋Ｔ細胞内でのＴＮＦ−αおよび／またはＩＦＮ−γのペプチド特異的誘導を用いて、株６８−１ ＲｈＣＭＶ／ｇａｇを接種した１２０のＲＭにおいて求めた。全てのマカクは、バックグラウンドを引いた後のこれらのスーパートピック（ｓｕｐｅｒｔｏｐｉｃ）エピトープに対する検出可能な応答を示した。示される応答頻度は、ＣＤ８＋、ＣＤ９５ｈｉｇｈメモリーサブセットをもつ、エピトープに応答する細胞の頻度を反映するようにメモリー補正されている。水平のバーは中央値を示す。 図１５は、株６８−１ ＲｈＣＭＶ／ＳＩＶｇａｇを接種した４匹のマカクによって発現される、ＭＨＣ−Ｉ分子に対応する単一のＭＨＣ−Ｉ分子を発現するトランスフェクトされた細胞株の妥当性の検証をまとめて示す図である。図１５Ａは、株６８−１ ＲｈＣＭＶ／ＳＩＶｇａｇを接種した４匹のマカクに、Ｒｏｃｈｅ／４５４パイロシーケンシングによってＭａｍｕ−Ａ、−Ｂ、および−Ｅの遺伝子型判定を行った結果を示す表である。灰色の影は、ＭＨＣ−Ｉ形質移入体生成に選択された対立遺伝子を示す。複対立遺伝子が記載されている箇所では、太字の異形態を発現している形質移入体が作製された。 単一のＭＨＣ−Ｉ分子の発現を示す２つのプロットからなる組を示す図である。ＭＨＣ−ＩａまたはＭＨＣ−Ｉｂ対立遺伝子を、親の（ＭＨＣ−Ｉ陰性）細胞株（．２２１細胞またはＫ５６２細胞）にトランスフェクトし、ｐａｎ−ＭＨＣ−Ｉモノクローナル抗体（Ｗ６／３２）で染色した。ＭＨＣ−Ｉを発現するＢリンパ芽球様細胞（ＢＬＣＬ）を陽性対照として用いる一方で、ＭＨＣ−Ｉ陰性の親細胞株は陰性対照として使用した。 図１６Ａおよび図１６Ｂは、４匹のマカクにおけるＲｈＣＭＶ／ＳＩＶｇａｇ誘導性のＣＤ８＋Ｔ細胞応答のＭＨＣ−ＩａおよびＭＨＣ−Ｉｂ特異性の包括的分析をまとめて示す図である。図１６Ａは、Ｒｈ２２０３４由来のＰＢＭＣを使用する、ＳＩＶｇａｇ４３３−４４７（１０９）応答のＭＨＣ拘束分析の代表的なフローサイトメトリーＩＣＳプロフィールを示す一組の図を示す図である。示されるＴＮＦ−αとＩＦＮ−γのフロープロフィールの比較は、ＣＤ３＋、ＣＤ８＋リンパ球でゲートされ、各々の四分円中の細胞の割合が数字で表示される。 表示されるＳＩＶｇａｇペプチドでパルスした（そして洗浄した）、自家Ｂリンパ芽球様細胞（ＢＬＣＬ）、ＭＨＣ−Ｉ陰性．２２１もしくはＫ５６２細胞、または単一のＭＨＣ−Ｉ形質移入体とともにインキュベートし、その後、フローサイトメトリーＩＣＳによってＣＤ８＋Ｔ細胞応答について分析された、４匹の表示されるマカク（図１５Ａに示されるＭＨＣ分類）由来のＰＢＭＣを示す表である。２列目から始まる、バックグラウンド（ペプチドなし）を上回るＣＤ８＋Ｔ細胞応答をもたらした組合せは、＋記号で表示され（灰色のボックス）；バックグラウンドを上回るＣＤ８＋Ｔ細胞応答をもたらさなかった組合せは、−記号で表示される（白色のボックス）。１列目では、各々のＲＭにおいて発現されるＭＨＣ−Ｉ対立遺伝子が灰色のボックスに表示され；発現されない対立遺伝子は白色のボックスに示される（Ｍａｍｕ−Ｆ＊０１：０１の発現は不明）。 株６８−１ ＲｈＣＭＶ／ＳＩＶｇａｇに誘発されたＣＤ８＋Ｔ細胞に対してＳＩＶｇａｇペプチドを提示することのできる古典的なＭＨＣ−Ｉａ異形態が、これらのＴ細胞応答の拘束ＭＨＣ対立遺伝子でないことを示す表である。株６８−１ ＲｈＣＭＶ／ＳＩＶｇａｇベクターを接種した２０匹のマカクのコホートを、Ｍａｍｕ−Ａ１＊００１：０１および−Ａ１＊００２：０１の存在についてＭＨＣ型判定を行い（ＭＨＣ−ｔｙｐｅｄ）、ＳＩＶｇａｇ６９−８３（１８）、ＳＩＶｇａｇ１２９−１４３（３３）、およびＳＩＶｇａｇ１９７−２１１（５０）に特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞応答について試験した。株６８−１ ＲｈＣＭＶ／ｇａｇベクターを接種したマカクにおけるこれらの３つのエピトープに特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の検出は、ワクチン接種された動物においてＭａｍｕ−Ａ１＊００１：０１または−Ａ１＊００２：０１の存在とは無関係であることに留意されたい。 図１８Ａおよび図１８Ｂは、株６８−１ ＲｈＣＭＶ／ＳＩＶｇａｇに誘発されたＣＤ８＋Ｔ細胞が、アカゲザルとヒトの両方のＭＨＣ−Ｅ分子の状況でペプチドを認識することをまとめて示す図である。図１８Ａは、株６８−１ ＲｈＣＭＶ／ＳＩＶｇａｇベクターを接種したマカク［Ｒｈ２１８２６：ＳＩＶｇａｇ８９−１０３（２３）、ＳＩＶｇａｇ１２９−１４３（３３）、ＳＩＶｇａｇ２５７−２７１（６５）、ＳＩＶｇａｇ４７３−４８７（１１９）；Ｒｈ２２０３４：ＳＩＶｇａｇ６１−７５（１６）、ＳＩＶｇａｇ６９−８３（１８）、ＳＩＶｇａｇ２７１−２８７（６９）、ＳＩＶｇａｇ３８５−３９９（９７）、ＳＩＶｇａｇ４７７−４９１（１２０）；Ｒｈ２２４３６：ＳＩＶｇａｇ１９７−２１１（３０）、ＳＩＶｇａｇ１９７−２１１（５０）］由来のＰＢＭＣを、表示されるＭＨＣ−Ｅ形質移入体および対照抗原提示細胞にてパルスした（そして、洗浄した）表示されるＧａｇ １５−ｍｅｒペプチドとともにインキュベートした（図１１参照）後のＩＦＮ−γおよび／またはＴＮＦ−α産生（各々の四分円に示されるＣＤ８＋Ｔ細胞の応答頻度）を検出するためのフローサイトメトリーＩＣＳを使用して、ペプチド特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞認識について評価したことを示す一組のプロットを示す図である。１２のＭＨＣ−Ｅ拘束性の１５ｍｅｒペプチドエピトープは全て、Ｍａｍｕ−Ｅ異形態とＨＬＡ−Ｅの両方で株６８−１ ＲｈＣＭＶ／ＳＩＶｇａｇベクターに誘発されたＣＤ８＋Ｔ細胞に対して効果的に提示することができることに留意されたい。 図１８Ａに示す形質移入体によって発現した、ヒトおよびアカゲザルＭＨＣ−Ｅ分子のα１およびα２領域のアミノ酸アラインメントを示す図である。重要なＢおよびＦのポケット残基は灰色の影で表示される。結合ペプチドと相互作用するＢおよびＦポケット残基の全てが、ＨＬＡ−Ｅ＊０１：０３、Ｍａｍｕ−Ｅ＊０２：０４、およびＭａｍｕ−Ｅ＊０２：１１の間に保存されるが、置換はＭａｍｕ−Ｅ＊０２：２０のこれらの残基に存在し、最も異種のＭＨＣ−Ｅ分子をここで調査した。他の異形態と比較してＢとＦのポケット残基の両方に置換を擁するにもかかわらず、Ｍａｍｕ−Ｅ＊０２：２０は同一のペプチドと結合し、提示することが可能である。 株６８−１ ＲｈＣＭＶ／ＳＩＶｇａｇに誘発された、スーパートープ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞が、従来のＣＤ８αβ＋Ｔ細胞表現型を示すことを示すプロットを示す図である。この図は、６８−１ ＲｈＣＭＶ／ＳＩＶｇａｇを接種した４匹のマカク（Ｒｈ２１８２６、Ｒｈ２２０３４、Ｒｈ２２４３６、Ｒｈ２２６０７）での、ＳＩＶｇａｇ２７３−２８７（６９）またはＳＩＶｇａｇ４７７−４９１（１２０）ペプチド刺激に応答するＭＨＣ−Ｅ拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞の表現型分析を要約する。この図は、指定された表現型を発現するペプチド応答性ＣＤ３＋Ｔ細胞（ＩＦＮ−γ＋およびＴＮＦ−α＋）の百分率を示す（図１１Ｃのフローサイトメトリープロフィールを参照）。 表示されるＳＩＶｇａｇ １５ｍｅｒペプチドエピトープでパルスする前の、標準的なＭＨＣ−Ｅ−結合ペプチドＶＭＡＰＲＴＬＬＬ（ＶＬ９）または対照ペプチドとともにプレインキュベートした単一のＭＨＣ−Ｅ形質移入体のプロットの組を示す図である。フローサイトメトリーＩＣＳを、株６８−１ ＲｈＣＭＶ／ＳＩＶｇａｇを接種したマカク：ＳＩＶｇａｇ８９−１０３（２３）、ＳＩＶｇａｇ１２９−１４３（３３）、ＳＩＶｇａｇ１９７−２１１（５０）、およびＳＩＶｇａｇ４７３−４８７（１１９）応答についてのＲｈ２１８２６；ＳＩＶｇａｇ６１−７５（１６）およびＳＩＶｇａｇ６９−８３（１８）応答についてのＲｈ２２０３４；ＳＩＶｇａｇ１１７−１３１（３０）応答についてのＲｈ２２４３６由来のＰＢＭＣを使用して、図１１に記載される通り実施した。以下のＭＨＣ−Ｅ形質移入体を利用した：ＳＩＶｇａｇ６９−８３（１８）およびＳＩＶｇａｇ８９−１０３（２３）応答についてのＭａｍｕ−Ｅ＊０２：０４；ＳＩＶｇａｇ６１−７５（１６）、ＳＩＶｇａｇ１１７−１３１（３０）、ＳＩＶｇａｇ１２９−１４３（３３）、ＳＩＶｇａｇ１９７−２１１（５０）、およびＳＩＶｇａｇ４７３−４８７（１１９）応答についてのＭａｍｕ−Ｅ＊０２：１１。以下の対照ペプチドを、２０μＭの終濃度で利用した：ＳＩＶｇａｇ８９−１０３（２３）、ＳＩＶｇａｇ１１７−１３１（３０）、およびＳＩＶｇａｇ１２９−１４３（３３）応答についてのＭａｍｕ−Ａ１＊００２：０１結合ペプチドＳＩＶｇａｇ７１−７９（ＧＹ９）、ならびにＳＩＶｇａｇ６９−８３（１８）、ＳＩＶｇａｇ１９７−２１１（５０）、およびＳＩＶｇａｇ４７３−４８７（１１９）応答についてのＭａｍｕ−Ａ１＊００１：０１結合ペプチドＳＩＶｇａｇ１８１−１８９（ＣＭ９）。これらのデータは、図１１Ｄのデータとともに、ＶＬ９ペプチドが、１２の多様なＭＨＣ−Ｅに提示される１５ｍｅｒペプチドエピトープのＣＤ８＋Ｔ細胞認識を効率的にブロックすることを示す。 ＳＩＶｇａｇ４７７−４９１（１２０）ＳＩＶｇａｇ １５−ｍｅｒまたは最適なＭａｍｕ−Ａ１＊００１：０１拘束性Ｇａｇ−ＣＭ９またはＴａｔ−ＳＬ８ペプチドでパルスする前に、表示される抗原提示細胞を、ＶＬ９の濃度を増加させてプレインキュベートした状態のプロットを示す図である。次に、これらの抗原提示細胞を、図２０Ａに記載されるフローサイトメトリーＩＣＳ分析用の表示されるエフェクターとともにインキュベートした。Ｒｈ２２４３６は６８−１ ＲｈＣＭＶ／ＳＩＶｇａｇを接種したＲＭであり、一方、Ｒｈ２７００２はＳＩＶ感染している。ＶＬ９ペプチドの濃度を増加させると、ＭＨＣ−Ｅを発現する抗原提示細胞が、株６８−１ ＲｈＣＭＶ／ｇａｇベクターを接種したマカク由来のＳＩＶｇａｇ４７７−４９１（１２０）特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化する能力を次第にブロックするが、Ｇａｇ−ＣＭ９またはＴａｔ−ＳＬ８に特異的な、従来通りＭＨＣ−Ｉａ拘束性のＣＤ８＋Ｔ細胞には影響を及ぼさないことに留意されたい。 応答読み出しとしてフローサイトメトリーＩＣＳによるＴＮＦ−αおよび／またはＩＦＮ−γのペプチド特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞発現を使用する、８のさらなるＭＨＣ−Ｅ拘束性１５ペプチドエピトープの公式なトランケーション分析を示す図である。親１５ｍｅｒのアミノ末端およびカルボキシ末端トランケーションに対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答を最初に測定して、コアエピトープの最適なペプチド長およびアミノおよびカルボキシ末端を規定した（上のパネル、灰色の影は最も刺激性のアミノ末端およびカルボキシ末端切断ペプチドの末端アミノ酸を示す）。このトランケーション手法によって暗示される最適な９ｍｅｒを、次に、各々の１５ｍｅｒを構成する７つの連続した９ｍｅｒの分析によって確認した（下のパネル）。下のパネルの各々の灰色で影をつけた９ｍｅｒｓは、各々の親１５ｍｅｒに最適なエピトープを表す。 図２２Ａおよび図２２Ｂは、ヒトおよびアカゲザルＭＨＣ−Ｅ形質移入体にパルスした最適な９ｍｅｒｓに対するＭＨＣ−Ｅ拘束性のＣＤ８＋Ｔ細胞の用量応答をまとめて示す図である。Ｍａｍｕ−Ｅ＊０２：０４、Ｍａｍｕ−Ｅ＊０２：２０およびＨＬＡ−Ｅ＊０１：０３形質移入体に、表示される濃度の最適なＳＩＶｇａｇ ９ｍｅｒペプチドエピトープＳＩＶｇａｇ４７６−４８４、ＳＩＶｇａｇ２５９−２６７、ＳＩＶｇａｇ２７６−２８４、またはＳＩＶｇａｇ４８２−４９０（図２１参照）をパルスし、形質移入体を洗浄し、応答するＣＤ８＋Ｔ細胞（ＩＦＮ−γ＋および／またはＴＮＦ−α＋）の頻度のフローサイトメトリーＩＣＳ測定のために６８−１ ＲｈＣＭＶ／ＳＩＶｇａｇを接種した３〜４匹のマカク由来のＰＢＭＣと混合した。図２２Ａは、Ｒｈ２２６０７におけるＳＩＶｇａｇ４７６−４８４に対する用量応答の代表的な分析を示す一組のプロットを示す図である。 ＳＩＶｇａｇ４７６−４８４、ＳＩＶｇａｇ２５９−２６７、ＳＩＶｇａｇ２７６−２８４、ＳＩＶｇａｇ４８２−４９０に応答するＣＤ８＋Ｔ細胞の用量応答（応答頻度の平均値±標準誤差）を示す一組のプロットを示す図である。応答頻度は、１０μＭのペプチド用量でパルスした形質移入体に観察される応答に対して正規化される。 ＲｈＣＭＶベクター６８−１、６８−１．２およびΔＲｈ１５７．４／．５ ６８−１．２株間のゲノムの違いのチャートを示す図である。ＲｈＣＭＶの低継代単離株では、Ｒｈ１５７．５（ＵＬ１２８）、Ｒｈ１５７．４（ＵＬ１３０）およびＲｈ１５７．６（ＵＬ１３１Ａ）遺伝子は、第２鎖に逆配向でコードされる。組織培養の連続継代の間に、ＲｈＣＭＶ６８−１は、特徴的な線維芽細胞の適合を獲得した。Ｒｈ１５７．５（ＵＬ１２８）ＯＲＦと、Ｒｈ１５７．４（ＵＬ１３０）ＯＲＦのエキソン２の大部分を欠失させ、隣接するゲノム領域を反転させると、非線維芽細胞へのウイルスの侵入を媒介する五量体の受容体複合体が減少する。株６８−１ ＲｈＣＭＶの線維芽細胞適合はまた、さらなるチミジンをＲｈ６１／Ｒｈ６０（ＵＬ３６）遺伝子に挿入させ、その結果フレームシフト変異および未成熟終止コドンをもたらした。ＲｈＣＭＶ ６８−１．２では、機能性五量体の複合体は、ＲｈＣＭＶ株１８０．９２由来のＲｈ１５７．５（ＵＬ１２８）およびＲｈ１５７．４（ＵＬ１３０）のエキソン２を、ＲｈＣＭＶ ６８．１のＲｈ１５７．４（ＵＬ１３０）の第１のエキソンの直後に挿入することによって回復され、Ｒｈ６１／Ｒｈ６０（ＵＬ３６）変異は、野生型配置に復帰した。株６８−１ ＲｈＣＭＶベクターにより誘発されるＣＤ８＋Ｔ細胞の非慣習的なＭＨＣ拘束が、Ｒｈ１５７．５／．４（ＵＬ１２８／ＵＬ１３０）の欠失（および結果的な機能性五量体複合体の欠如）に起因することを確かめるため、Ｒｈ１５７．５（ＵＬ１２８）およびＲｈ１５７．４（ＵＬ１３０）を、Ｒｈ１５７．６（ＵＬ１３１Ａ）終止コドンの５０ｂｐ上流から開始してＲｈ１５７．５（ＵＬ１２８）終止コドンまでの相同組換えによって６８−１．２株から特異的に再び欠失させ、Ｒｈ６１／Ｒｈ６０（ＵＬ３６）修復を無傷のまま残した。そのため、このΔＲｈ１５７．５／．４（ΔＵＬ１２８／ＵＬ１３０）株６８−１．２ＲｈＣＭＶベクターと、修復された株６８−１．２ＲｈＣＭＶベクターとは異なる本来の６８−１株ベクターが共有する表現型の特徴は、Ｒｈ１５７．５／．４（ＵＬ１２８／ＵＬ１３０）欠失に直接的に起因する。 図２４は、６８−１株に誘発されるＣＤ８＋Ｔ細胞と株６８−１．２ＲｈＣＭＶ／ｇａｇベクターに誘発されるＣＤ８＋Ｔ細胞の比較による、ＭＨＣ−Ｉａと比較したＭＨＣ−Ｅの差別的利用をまとめて示す図である。図２４Ａは、ｐａｎ抗ＭＨＣ−ＩブロッキングｍＡｂ Ｗ６−３２またはＭＨＣ−Ｅ−ブロッキングＶＬ９ペプチドによるブロッキングの有り無し両方の、６８−１株（Ｒｈ１５７．４／．５を欠失）ＲｈＣＭＶ／ｇａｇベクターによって誘発される、ＭＨＣ−Ｉ依存性のＳＩＶｇａｇエピトープ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の代表的なフローサイトメトリー応答プロフィール（ゲートを設けたＣＤ３＋、ＣＤ８＋Ｔ細胞でのＴＮＦ−αに対するＩＦＮ−γ）を示す図である。 ｐａｎ抗ＭＨＣ−ＩブロッキングｍＡｂ Ｗ６−３２またはＭＨＣ−Ｅ−ブロッキングＶＬ９ペプチドによるブロッキングの有り無し両方の（図２０参照）、６８−１．２株（Ｒｈ１５７．４／．５無傷）ＲｈＣＭＶ／ｇａｇベクターによって誘発される、ＭＨＣ−Ｉ依存性のＳＩＶｇａｇエピトープ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の代表的なフローサイトメトリー応答プロフィール（ゲートを設けたＣＤ３＋、ＣＤ８＋Ｔ細胞でのＴＮＦ−αに対するＩＦＮ−γ）を示す図である。ＶＬ９ペプチドだけが、株６８−１ ＲｈＣＭＶベクターにより誘発される全てのＭＨＣ−Ｉ依存性応答をブロックすることに留意されたい。 ＲｈＣＭＶ／ｇａｇベクター（６８．１株および６８−１．２株）、ＭＶＡ／ｇａｇベクターによって誘発されるエピトープ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答、および制御されたＳＩＶ感染によって誘発されるエピトープ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答の拘束分析を示す図である。図１２Ａに関して記載したように、表示されるＳＩＶｇａｇ発現ウイルスベクターを接種したか、またはＳＩＶｍａｃ２３９自体に感染したさらなるマカク（ＳＩＶｍａｃ２３９コントローラ・マカク）（図１２Ａに示される各群から６匹を上回る動物）において、１２５の連続した１５ｍｅｒのｇａｇペプチド（１１アミノ酸オーバーラップを含む）の認識を検出するために、ＳＩＶｇａｇに対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答を、フローサイトメトリーＩＣＳを使用してエピトープマッピングした。上のバックグラウンドＣＤ８＋Ｔ細胞応答の結果得られるペプチドは、ボックスで表示され、ボックスの塗りつぶしは、抗ｐａｎ−ＭＨＣ−Ｉ ｍＡｂ Ｗ６−３２、ＭＨＣ−ＥブロッキングペプチドＶＬ９およびＭＨＣ−ＩＩブロッキングペプチドＣＬＩＰによるブロッキングによって求められるＭＨＣ拘束を示す。ＭＨＣ−Ｉａ、ＭＨＣ−Ｅ、およびＭＨＣ−ＩＩによる拘束は、それぞれ、Ｗ６−３２単独（白色で塗りつぶしたボックス）、Ｗ６−３２およびＶＬ９単独（灰色で塗りつぶしたボックス）、およびＣＬＩＰ単独（黒色で塗りつぶしたボックス）による＞９０％の応答ブロッキングに基づき、これらの判定基準を満たしていない応答は、不確定（垂直ハッチング線で塗りつぶしたボックス）と分類した。これらのＭＨＣ拘束カテゴリーの独立したエピトープの最小数は、各々のマカクの右側に示される。株６８−１ ＲｈＣＭＶ／ｇａｇベクターを接種したマカク由来のＣＤ８＋Ｔ細胞によって認識される全ての評価可能なエピトープが、従来にない方法でＭＨＣ−ＩＩまたはＭＨＣ−Ｅのいずれかによって拘束されたことに留意されたい。対照的に、株６８−１．２ＲｈＣＭＶ／ｇａｇおよびＭＶＡ／ｇａｇベクターによって誘発される全ての応答は、従来通りＭＨＣ−Ｉａに拘束された。ＳＩＶコントローラ・マカクにおいて特定されたＳＩＶｇａｇエピトープ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答の大部分も、ＭＨＣ−Ｉａ拘束性であったが、これらの動物の１２匹のうちの４匹は、疑いの余地なくＭＨＣ−ＩＩ拘束性の１つのエピトープ特異的応答を示し（１７９の全応答のうち４応答＝２．２％）、ＭＨＣ−ＩＩ拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞は、感染に対する従来の免疫応答の微量成分として特定することができることが示される。 天然（野生型）ＲｈＣＭＶ感染ならびに株６８−１ ＲｈＣＭＶ／ｇａｇベクターによる一次および二次感染の両方における、ＲｈＣＭＶ最初期（Ｉｍｍｅｄｉａｔｅ Ｅａｒｌｙ）−１（ＩＥ１）タンパク質に対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答のエピトープマッピングを示すチャートを示す図である。ＲｈＣＭＶ ＩＥ１に対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答を、フローサイトメトリーＩＣＳを使用してエピトープマッピングして、１３７の連続した１５ｍｅｒのＩＥ１ペプチド（１１アミノ酸オーバーラップを含む）の認識を、１）野生型（コロニー循環）ＲｈＣＭＶに自然感染したマカク（上のパネル）、２）株６８−１ ＲｈＣＭＶ／ｇａｇベクターを接種したＲｈＣＭＶナイーブマカク（中央のパネル）、および３）株６８−１ ＲｈＣＭＶ／ｇａｇベクターで重感染させた自然野生型ＲｈＣＭＶ感染マカク（下のパネル）において検出した。上のバックグラウンドＣＤ８＋Ｔ細胞応答の結果得られるペプチドは、ボックスで表示され、ボックスの塗りつぶしは、抗ｐａｎ−ＭＨＣ−Ｉ ｍＡｂ Ｗ６−３２、ＭＨＣ ＥブロッキングペプチドＶＬ９およびＭＨＣ−ＩＩブロッキングペプチドＣＬＩＰによるブロッキングによって求められるＭＨＣ拘束を示す。ＭＨＣ−Ｉａ、ＭＨＣ−Ｅ、およびＭＨＣ−ＩＩによる拘束は、それぞれ、Ｗ６−３２単独（白色で塗りつぶしたボックス）、Ｗ６−３２およびＶＬ９単独（灰色で塗りつぶしたボックス）、およびＣＬＩＰ単独（黒色で塗りつぶしたボックス）による＞９０％の応答ブロッキングに基づき、これらの判定基準を満たしていない応答は、不確定（垂直ハッチング線で塗りつぶしたボックス）と分類した。これらのＭＨＣ拘束カテゴリーの独立したエピトープの最小数は、各々のマカクの右側に示される。自然感染マカクにおけるＩＥ１エピトープ特異的応答は完全にＭＨＣ Ｉａ拘束性であるが、株６８−１ ＲｈＣＭＶ／ｇａｇベクターによってのみ感染したマカクでは、これらの応答はより広く、完全に従来にない方法で拘束される（ＭＨＣ−ＩＩ拘束性エピトープとＭＨＣ−Ｅ拘束性エピトープの比が約１：１）ことに留意されたい。株６８−１ ＲｈＣＭＶ／ｇａｇベクターによって重感染させた、ＲｈＣＭＶに自然感染したマカクは、従来通り（ＭＨＣ−Ｉａ）拘束性のＩＥ１−エピトープ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞と、従来にない方法による（ＭＨＣ−ＩＩおよびＭＨＣ−Ｅ）拘束性のＩＥ１−エピトープ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の予想される混合を示す。 アカゲザルにおけるＭＨＣ−Ｅ特異的ｍＡｂ ４Ｄ１２の特異性の妥当性検証を示す図である。ヒストグラムは、ｐａｎ−ＭＨＣ−Ｉ ｍＡｂ Ｗ６／３２（上列）とＭＨＣ−Ｅ特異的ｍＡｂ ４Ｄ１２（下列）の比較による、単一のＭＨＣ−ＩａまたはＭＨＣ−Ｉｂ形質移入体の表面染色を示す。全てのＭａｍｕ−ＩａおよびＭａｍｕ−Ｅの異形態が、ネズミ細胞株ＲＭＡ−Ｓにトランスフェクトされ、それはヒトβ２−ミクログロブリン（ｍｉｃｒｏｇｌｕｂｕｌｉｎ）を発現することに留意されたい。マカクＢＬＣＬを陽性対照として使用し、一方、親ＲＭＡ−Ｓ細胞株を陰性対照として使用した（薄い灰色のヒストグラム）。Ｍａｍｕ−Ｅ形質移入体に対する４Ｄ１２反応性の拘束に留意されたい。 ｍＡｂ Ｗ６／３２による染色によって求められる、全ＭＨＣ−Ｉの表面発現を示す図である。 同じ培養中の増殖性にＳＩＶ感染したＣＤ４＋Ｔ細胞および非感染ＣＤ４＋Ｔ細胞でのｍＡｂ ４Ｄ１２による染色によって求められる、全ＭＨＣ−Ｉの表面発現を示す図であり、ＳＩＶ感染細胞は、Ｇａｇ Ａｇの細胞内発現およびＣＤ４ダウンレギュレーション（Ｇａｇ＋／ＣＤ４ｌｏｗ）によって認識され、非感染細胞は、Ｇａｇ反応性の不足および高レベルの表面ＣＤ４発現（Ｇａｇ−／ＣＤ４ｈｉｇｈ）によって認識される。左のパネルは、代表的なフローサイトメトリーヒストグラムを示す。右のパネルは、合計１６匹の非血縁マカク由来のＳＩＶ感染ＣＤ４＋Ｔ細胞と非感染ＣＤ４＋Ｔ細胞を比較した、全ＭＨＣ−Ｉまたは特異的ＭＨＣ−Ｅ染色のＭＦＩを表す。Ｐ値は、対応のあるスチューデントＴ検定によって求めた。 ＳＩＶｇａｇに対するＭＨＣ−Ｉａ拘束性のＣＤ８＋Ｔ細胞応答の集団レベル分析を示す図である。従来のＳＩＶｇａｇ発現ワクチン（１１ ＭＶＡ／ｇａｇ、３ Ａｄ５／ｇａｇ、４ ＤＮＡ／ｇａｇ＋ＩＬ−１２）を接種したか、またはＳＩＶｍａｃ２３９に感染した（定常期ウイルス量＜１０，０００コピー／ｍｌ；ｎ＝１２）３０匹のマカクにおける、１２５の重複している（１１アミノ酸）、連続したＳＩＶｇａｇ １５ｍｅｒペプチドにわたる、慣習的にＭＨＣ−Ｉａ拘束性のＳＩＶｇａｇエピトープ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答の幅の分析。アスタリスク（＊）は、Ｍａｍｕ−Ａ１＊００１：０１拘束性の免疫優性ＳＩＶｇａｇ１８１−１８９（ＣＭ９）エピトープを含む、Ｇａｇ−４５ １５ｍｅｒペプチドを示す。このコホート用のサルの選択は、Ｍａｍｕ−Ａ１＊００１：０１（３０匹のマカクのうち１９匹が発現）の優先選択を除いて、ＭＨＣ−Ｉａ異形態に関して主に公平であった。これは、Ｇａｇ４５ １５ｍｅｒに応答するサルの頻度が高いことを説明する。応答頻度を人工的に増加させたＧａｇ４５ペプチドを除いて、その他のＧａｇ １５ｍｅｒｓのいずれに対しても反応性のＭＨＣ−Ｉ拘束性のＣＤ８＋Ｔ細胞をもつサルの頻度は、株６８−１ ＲｈＣＭＶ／ｇａｇベクター（２の万能のスーパートープを含む１９のエピトープが≧４０％の認識頻度をもつ；図３Ｃ）によって誘発されるＭＨＣ−Ｅ拘束性のＣＤ８＋Ｔ細胞応答と比較して比較的低い（２つの１５ｍｅｒｓだけが４０％の認識をもち、＞４０％はなし）。しかし、１２５の連続したＳＩＶｇａｇ １５ｍｅｒｓのうちの１つを除く全てが、少なくとも１匹のマカクにおいてＭＨＣ−Ｉａ拘束性のＣＤ８＋Ｔ細胞によって認識され、１３のＳＩＶｇａｇ １５ｍｅｒｓを除く全ては、２匹以上のマカクにおいて標的化される。対照的に、４２匹のマカクにおいて株６８−１ ＲｈＣＭＶ／ｇａｇベクターによって誘発されるＭＨＣ−Ｅ拘束性のＣＤ８＋Ｔ細胞は、１２５のＳＩＶｇａｇ １５ｍｅｒｓのうちの１６を認識できなかった。したがって、株６８−１ ＲｈＣＭＶベクターによって誘発されるＭＨＣ−Ｅ拘束性のＣＤ８＋Ｔ細胞応答は、機能的に単形性の拘束エレメントに対して著しく広いが、それらは多型性のＭＨＣ−Ｉａ分子の全集団によって支持される応答ほど広くない。これはおそらくＭＨＣ−Ｉａ拘束性の抗原提示系の進化上の優位性を説明する。 ３つのプロットからなる組を示す図である。左側のパネルは、表示される時点のＳＩＶｇａｇに対応するオーバーラップペプチドとともにインキュベートした後のＩＦＮ−γおよび／またはＴＮＦ−α産生を示すＳＩＶｇａｇを発現する、Ｒｈ２１４〜Ｒｈ２２０を欠失させた６８−１ ＲｈＣＭＶを接種したアカゲザル由来のＰＢＭＣ中のＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率を示す図である。遺伝子領域のＲｈ２１４〜Ｒｈ２２０は、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）ＵＳ２８と相同性を有する５つの遺伝子：Ｒｈ２１４、Ｒｈ２１５、Ｒｈ２１６、Ｒｈ２１８、Ｒｈ２２０をコードする（Ｄ．Ｍａｌｏｕｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８６，８９５９（２０１２）；参照により本明細書に援用される）。中央パネルは、Ｍａｍｕ−Ｅ拘束性ペプチドＧａｇ２７３−２８７（Ｇａｇ６９）またはＧａｇ４７７−４９１（Ｇａｇ１２０）に応答しない、同じ動物由来のＰＢＭＣ中のＣＤ８＋Ｔ細胞を示す。右側のパネルは、ＭＨＣ−ＩＩ拘束性ペプチド（Ｇａｇ５３およびＧａｇ７３）に応答する、同じ動物由来のＰＢＭＣ中のＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率を示す。ＭＨＣ−ＩＩペプチドは、いわゆるスーパートープに応答する、すなわち、これらのペプチドは、多くの異なるＭＨＣ−ＩＩ対立遺伝子によって提示され、そのために大部分の動物において応答を誘発する。 Ｒｈ２１４〜２２０を欠失する株６８−１ ＲｈＣＭＶ／ｇａｇベクター（ｎ＝３）を接種したマカクにおいて、１２５の連続した１５ｍｅｒのＧａｇペプチド（１１アミノ酸オーバーラップを含む）の認識を検出するために、フローサイトメトリーＩＣＳを使用してエピトープマッピングした、ＳＩＶｍａｃ２３９ Ｇａｇに対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答を示す表である。上のバックグラウンドＣＤ８＋Ｔ細胞応答で得られるペプチドを、ＭＨＣ−Ｉ（ｍＡｂ Ｗ６／３２）、ＭＨＣ−Ｅ（Ｒｈ６７ ＶＬ９）、およびＭＨＣ−ＩＩ（ｍＡｂ Ｇ４６−６）封鎖に付し、ＭＨＣ−Ｉブロックされたもの（白色で塗りつぶしたボックス）、ＭＨＣ−Ｅブロックされたもの（灰色で塗りつぶしたボックス）、ＭＨＣ−ＩＩブロックされたもの（黒色で塗りつぶしたボックス）、または不確定（ハッチングで塗りつぶしたボックス）に分類した。全てのペプチドがＭＨＣ−ＩＩによって拘束され、ＨＬＡ−Ｅ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘発するためにＲｈ２１４〜２２０が必要であることを示すことに留意されたい。
本発明は、限定されるものではないが、少なくとも１つの異種タンパク質抗原、少なくとも１つの活性のあるＵＬ４０タンパク質、および少なくとも１つの活性のあるＵＳ２８タンパク質をコードするが、活性のあるＵＬ１２８およびＵＬ１３０タンパク質を発現しない核酸を含む組換えＣＭＶベクターを含む、新規な組換えＣＭＶベクターを提供する。本発明はまた、限定されるものではないが、少なくとも１つの異種抗原をコードするが、（１）活性のあるＵＬ４０タンパク質および／または活性のあるＵＳ２８タンパク質、（２）活性のあるＵＬ１２８タンパク質、および（３）活性のあるＵＬ１３０タンパク質を発現しない核酸を含む組換えＣＭＶベクターを含む、組換えＣＭＶベクターを提供する。新規な組換えＣＭＶベクターを使用する方法、例えば対象において少なくとも１つの異種抗原に対する免疫応答を生成する方法、ＭＨＣ−Ｅ−ペプチド複合体を認識するＣＤ８＋Ｔ細胞を生成する方法、および疾患を治療する方法などがさらに提供される。
Ｉ．定義
特に断りのない限り、技術用語は従来の用法に従って使用される。分子生物学の共通語の定義は、Ｂｅｎｊａｍｉｎ Ｌｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ Ｖ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９４（ＩＳＢＮ ０−１９−８５４２８７−９）；Ｋｅｎｄｒｅｗ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｔｈｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．，１９９４（ＩＳＢＮ ０−６３２−０２１８２−９）；およびＲｏｂｅｒｔ Ａ．Ｍｅｙｅｒｓ（ｅｄ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ ＶＣＲ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，１９９５（ＩＳＢＮ １−５６０８１−５６９−８）で見出すことができる。
本明細書に引用される全ての刊行物、特許、特許出願、インターネットサイト、および受託番号／データベース配列（ポリヌクレオチド配列とポリペプチド配列の両方を含む）は、個々の刊行物、特許、特許出願、インターネットサイト、および受託番号／データベース配列の各々が具体的にかつ個別に参照により援用されると表示されているのと同程度に、全ての目的においてその全文が参照により本明細書に援用される。
別に説明されない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示の属する分野の当業者が一般に理解するものと同じ意味を有する。単数を示す語「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」には、文脈上明らかに指示されている場合を除いて複数形への言及が含まれる。同様に、「または」という語には、文脈上明らかに示されている場合を除いて「および」が含まれることが意図される。さらに、核酸またはポリペプチドに与えられる全ての塩基サイズまたはアミノ酸サイズ、および全ての分子量または分子量値は近似値であり、説明のために提供されることが理解される。本明細書に記載されるものに類似または同等の方法および材料は本開示の実践または試験において使用することができるが、適した方法および材料は下記に説明する。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」を意味する。加えて、材料、方法、および実施例は、例示にすぎず、制限を意図するものではない。本開示の様々な実施形態のレビューを容易にするために、特定の用語を以下で説明する：
抗原：本明細書において用いられる、用語「抗原」または「免疫原」は、対象において免疫応答を誘導する能力のある物質、一般にタンパク質を指すために同義的に使用される。この用語は、ひとたび対象に投与されると（直接、またはそのタンパク質をコードするヌクレオチド配列またはベクターを対象に投与することにより）そのタンパク質に対する液性および／または細胞型の免疫応答を惹起することができるという意味で免疫学的に活性のあるタンパク質も指す。
投与：対象に作用剤、例えば外因性抗原を含むＨＣＭＶベクターの有効量を含む組成物などを任意の効果的な経路によって施すかまたは与えること。例となる投与経路としては、限定されるものではないが、注射（例えば皮下、筋肉内、皮内、腹腔内、および静脈内など）、経口、舌下、直腸内、経皮、鼻腔内、膣内および吸入経路が挙げられる。
癌：異常細胞が制御されることなく分割し、その他の組織に侵入することのできる疾患または状態。癌細胞は、血液およびリンパ系を通してその他の身体部位に広まることがある。癌は、多くの疾患を表す用語である。ヒトには１００を超える異なる種類の癌が存在する。大部分の癌は、それらの起源となる器官の名をとって命名される。例えば、結腸で始まる癌は、結腸癌と呼ばれる。しかし、癌の特徴は、特に治療化合物に対する癌の感受性に関して、癌が起こる器官に限定されない。癌細胞は、試験管内であろうと生体内であろうと、あらゆる癌に由来するあらゆる細胞である。
癌には、異常なまたは制御されない細胞増殖を特徴とする悪性腫瘍も含まれる。多くの場合癌に関連しているその他の特徴としては、転移、隣接細胞の正常機能妨害、サイトカインまたはその他の分泌産物の異常レベルでの放出および炎症または免疫応答の抑制または悪化、周囲または遠位の組織または器官、例えばリンパ節などの浸潤が挙げられる。
「転移性疾患」または「転移」とは、本来の腫瘍部位を離れて、例えば血流またはリンパ系を介して身体のその他の部位へと移動する癌細胞を指す。癌の「病理」には、対象の健康な状態を損なう全ての現象が含まれる。これには、限定されないが、異常または制御不能な細胞増殖、転移、隣接細胞の正常機能妨害、サイトカインまたはその他の分泌産物の異常レベルでの放出、炎症または免疫応答の抑制または悪化、新生物、前悪性腫瘍、悪性腫瘍、周囲または遠位の組織または器官、例えばリンパ節などの浸潤が含まれる。
有効量：本明細書において用いられる、用語「有効量」とは、薬剤、例えば異種抗原、またはＭＨＣ−Ｅ／異種抗原由来ペプチド複合体を認識するトランスフェクトされたＣＤ８＋Ｔ細胞を含むＣＭＶベクターの、例えば状態または疾患の徴候または症状を減少させるかまたは除去する、あるいは抗原に対する免疫応答を誘導するなどの望ましい応答を生成するために十分な量を指す。一部の例では、「有効量」は、障害または疾患の１つまたは複数の症候および／または根本原因を治療する（予防を含む）量である。有効量は、特定の疾患または状態の１つまたは複数の徴候または症状、例えば感染症、癌、または自己免疫疾患に関連する１またはそれ以上の徴候または症状などが発生することを防ぐ量を含む、治療上有効な量であり得る。
変異：変異は、正常なコンセンサスまたは「野生型」配列との核酸またはポリペプチド配列の相違である。変異株は、変異を含むタンパク質または核酸配列である。さらに、変異をもつ細胞または生物も変異株と呼ばれることがある。
一部の種類のコード配列変異には、点変異（個々のヌクレオチドまたはアミノ酸の相違）；サイレント変異（アミノ酸の変化をもたらさないヌクレオチドの相違）；欠失（遺伝子の全コード配列の欠失を含むそれ以下の、１個以上のヌクレオチドまたはアミノ酸が欠損している相違）；フレームシフト変異（３で割り切れない数のヌクレオチドの欠失の結果、アミノ酸配列が変わる相違）が含まれる。アミノ酸の相違をもたらす変異は、アミノ酸置換変異と呼ばれることもある。アミノ酸置換変異は、アミノ酸配列中の特定の位置で野生型と比較したアミノ酸の変化によって説明することができる。
本明細書において、「不活性化変異」は、最終的にウイルスタンパク質の機能の低下または機能の完全喪失をもたらすウイルス遺伝子の変異である。
ヌクレオチド配列または核酸配列：用語「ヌクレオチド配列」および「核酸配列」とは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）配列をさし、それには、限定されないが、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、または合成核酸が含まれる。核酸は、一本鎖であってもよいし、または部分的にまたは完全に二重鎖（二本鎖）であってもよい。二本鎖核酸は、ホモ二本鎖であってもよいしヘテロ二本鎖であってもよい。
組換え：組換え核酸またはポリペプチドは、天然起源でない配列を有するか、または２以上の分離した配列の部分を人工的に組み合わせることによって作製される配列を有するもの、例えば、異種抗原を含み、かつ／または１以上の遺伝子の変異によって作られた複製欠損を含むＣＭＶベクターである。この人工的な組合せは、多くの場合、化学合成によって、またはより一般に、例えば、遺伝子工学技術による核酸の単離された部分の人工的な操作によって達成される。組換えポリペプチドは、組換え核酸を使用して作製されたポリペプチドを指すこともでき、それには、ポリペプチドの天然源でない宿主生物に移された組換え核酸（例えば、異種抗原を含むＣＭＶベクターを形成するポリペプチドをコードする核酸）が含まれる。
複製欠損：本明細書において、複製欠損ＣＭＶは、ひとたび宿主細胞に入ればウイルス複製を起こすことができない、またはそのゲノムを複製する能力が著しく制限されており、それ故にビリオンを産生するウイルスである。他の例では、複製欠損ウイルスは、播種欠損である、すなわち、それらはそのゲノムを複製することができるが、別の細胞を感染させることができない。その理由は、ウイルス粒子が感染細胞から放出されないためか、または非感染性ウイルス粒子が放出されるためである。他の例では、複製欠損ウイルスは、伝播欠損である、すなわち、感染性ウイルスは感染宿主から分泌されず、そのためウイルスは宿主から宿主へと伝播することができない。一部の実施形態では、複製欠損ＣＭＶは、ウイルス複製に不可欠な１つまたは複数の遺伝子（「必須遺伝子」）あるいは最適な複製に必要な１つまたは複数の遺伝子（「促進遺伝子（ａｕｇｍｅｎｔｉｎｇ ｇｅｎｅｓ）」）の発現の不足をもたらす変異を含むＣＭＶである。ＣＭＶの必須遺伝子および促進遺伝子は、当技術分野で説明されており（特に、参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２０１３／０１３６７６８号）、本明細書に開示される。
製薬上許容される担体：製薬上許容される使用担体は従来のものである。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ｂｙ Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９５には、本明細書に開示される組成物の薬剤送達に適した組成物および製剤が記載されている。一般に、担体の性質は、用いる特定の投与様式によって決まる。例えば、非経口製剤は、通常、ビヒクルとして水、生理食塩水、平衡塩類溶液、水性デキストロース、グリセロールまたはそのようなものなどの薬剤的にかつ生理的に許容される流体を含む注射可能な流体を含む。固体組成物（例えば粉末、丸剤、錠剤、またはカプセル剤の形態など）に関して、従来の無毒の固体担体としては、例えば、医薬品等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、またはステアリン酸マグネシウムを挙げることができる。生物学的に中性の担体に加えて、投与される医薬組成物は、少量の無毒の補助物質、例えば湿潤剤または乳化剤、保存料、およびｐＨ緩衝剤および同類のもの、例えば酢酸ナトリウムまたはソルビタンモノラウレートなどを含むことができる。
ポリヌクレオチド：本明細書において、用語「ポリヌクレオチド」とは、リボ核酸（ＲＮＡ）またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）のポリマーを指す。ポリヌクレオチドは、４つの塩基；アデニン、シトシン、グアニン、およびチミン／ウラシル（ウラシルはＲＮＡで使用される）で構成されている。核酸のコード配列は、核酸によってコードされるタンパク質の配列を示す。
ポリペプチド：用語「タンパク質」、「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「アミノ酸配列」は、任意の長さのアミノ酸残基のポリマーを指すために本明細書において同義的に使用される。このポリマーは、直線状であっても分枝状であってもよく、修飾されたアミノ酸またはアミノ酸類似体を含んでよく、アミノ酸以外の化学部分によって割り込まれてもよい。これらの用語は、自然に修飾されたか、または介入；例えばジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または任意のその他の操作または修飾（例えば標識化もしくは生理活性成分との結合など）によって修飾されたアミノ酸ポリマーも包含する。
配列同一性／類似性：２以上の核酸配列間、または２以上のアミノ酸配列間の同一性／類似性は、配列間の同一性または類似性の観点から表される。配列同一性は、同一性百分率の観点から測定でき、つまり、百分率が高いほど、配列はより同一である。配列類似性は、同一性または類似性百分率の観点から測定でき（これは保存的アミノ酸置換を考慮する）、つまり、百分率が高いほど、配列はより類似している。多くの配列同一性を有し、互いに同じまたは類似の機能も有するポリペプチドまたはそのタンパク質ドメイン（例えば、異なる種において同じ機能を果たすタンパク質あるいはタンパク質の機能またはその大きさを変えないタンパク質の変異形）は「ホモログ」と呼ぶことができる。
比較のための配列のアラインメントの方法は、当技術分野で周知である。様々なプログラムおよびアラインメントアルゴリズムが、Ｓｍｉｔｈ＆Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ Ａｐｐｌ Ｍａｔｈ ２，４８２（１９８１）；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ４８，４４３（１９７０）；Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８５，２４４４（１９８８）；Ｈｉｇｇｉｎｓ＆Ｓｈａｒｐ，Ｇｅｎｅ ７３，２３７−２４４（１９８８）；Ｈｉｇｇｉｎｓ＆Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ ５，１５１−１５３（１９８９）；Ｃｏｒｐｅｔ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １６，１０８８１−１０８９０（１９８８）；Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｐｐ Ｂｉｏｓｃｉ ８，１５５−１６５（１９９２）；およびＰｅａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｍｅｔｈ Ｍｏｌ Ｂｉｏ ２４，３０７−３３１（１９９４）に記載されている。さらに、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２１５，４０３−４１０（１９９０）は、配列アラインメント法および相同性計算の詳細な考察を提示する。
ＮＣＢＩ Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）（上記Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０））は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｂｕｉｌｄｉｎｇ ３８Ａ，Ｒｏｏｍ ８Ｎ８０５，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ ２０８９４）を含むいくつかの供給元から入手可能であり、また配列分析プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎおよびｔｂｌａｓｔｘと共に使用するためにインターネットで利用可能である。さらなる情報は、ＮＣＢＩのウェブサイトで見出すことができる。
ＢＬＡＳＴＮは、核酸配列を比較するために使用され、ＢＬＡＳＴＰは、アミノ酸配列を比較するために使用される。２つの比較した配列が相同性を持つ場合、指定された出力ファイルは、整列させた配列として相同領域を提示する。２つの比較した配列が相同性を持たない場合、指定された出力ファイルは、整列させた配列を提示しない。
整列した時点で、マッチ数は、同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基が両方の配列に存在する位置の数を計数することによって求められる。配列同一性パーセントは、マッチ数を、同定された配列に示される配列の長さで除算するか、または連結された長さ（例えば、同定された配列に示される配列由来の１００個の連続ヌクレオチドまたはアミノ酸残基）で除算した後に、得られた値に１００を掛けることによって求められる。例えば、１１６６マッチを有する核酸配列は、１１５４ヌクレオチドを有する試験配列と整列させた場合、試験配列と７５．０パーセント同一である（１１６６÷１５５４＊１００＝７５．０）。配列同一性パーセント値は、最も近い小数第１位に四捨五入する。例えば、７５．１１、７５．１２、７５．１３、および７５．１４は７５．１に切り下げられ、一方、７５．１５、７５．１６、７５．１７、７５．１８、および７５．１９は７５．２に切り上げられる。長さの値は常に整数となる。別の例では、以下の通り同定された配列由来の２０個の連続ヌクレオチドと整列する２０ヌクレオチド領域を含む標的配列は、その同定された配列と７５パーセントの配列同一性を持つ領域を含む（つまり、１５÷２０＊１００＝７５）。
約３０個のアミノ酸を超えるアミノ酸配列の比較には、デフォルトパラメータ（ギャップ存在コストは１１、１残渣あたりのギャップコストは１）に設定したデフォルトＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスを使用してＢｌａｓｔ２配列関数が用いられる。ホモログは、典型的には、ＮＣＢＩ Ｂａｓｉｃ Ｂｌａｓｔ ２．０、ｇａｐｐｅｄ ｂｌａｓｔｐをｎｒデータベース、ｓｗｉｓｓｐｒｏｔデータベース、および特許権のある配列データベースなどのデータベースとともに使用するアミノ酸配列との全長アラインメントにわたってカウントされる少なくとも７０％の配列同一性を有することを特徴とする。ｂｌａｓｔｎプログラムで検索されるクエリーは、ＤＵＳＴ（Ｈａｎｃｏｃｋ＆Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ，Ｃｏｍｐｕｔ Ａｐｐｌ Ｂｉｏｓｃｉ １０，６７−７０（１９９４））によってフィルタリングされる。その他のプログラムはＳＥＧを使用する。さらに、手動のアラインメントを実施することができる。さらに大きい類似性をもつタンパク質は、この方法によって評価される場合に、増加する同一性百分率（例えばタンパク質と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性）を示すであろう。
短いペプチド（約３０アミノ酸よりも小さい）を整列させる場合、アラインメントは、デフォルトパラメータ（オープンギャップペナルティ９、伸長ギャップペナルティ１）に設定したＰＡＭ３０マトリックスを用いて、Ｂｌａｓｔ２配列関数を使用して実施される。基準配列に対してさらに大きい類似性をもつタンパク質は、この方法によって評価される場合に、増加する同一性百分率を示すであろう（例えばタンパク質と少なくとも約６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性）。全配列より短い配列が、配列同一性について比較される場合、ホモログは典型的には１０〜２０アミノ酸の短いウィンドウにわたって少なくとも７５％の配列同一性を有することになり、また、基準配列に対するその同一性に応じて少なくとも８５％、９０％、９５％または９８％の配列同一性を有することができる。そのような短いウィンドウにわたる配列同一性を測定するための方法は、ＮＣＢＩのウェブサイトに記載されている。
２つの核酸分子が密接に関連していることの１つの指標は、その２つの分子が、上記のようにストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズすることである。それにもかかわらず、高度の同一性を示さない核酸配列が、遺伝子コードの縮重のために同一または類似の（保存された）アミノ酸配列をコードすることがある。核酸配列の変化は、全てが実質的に同じタンパク質をコードする複数の核酸分子を生成するためにこの縮重を使用してもたらすことができる。そのような相同核酸配列は、例えば、タンパク質をコードする核酸と少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有することができる。
対象：本明細書において、用語「対象」とは、生きている多細胞脊椎動物生物、ヒトおよび非ヒト哺乳動物の両方を含むカテゴリーを指す。
治療：本明細書において、用語「治療」とは、疾患または病状の徴候または症状を寛解させる介入を指す。本明細書において、疾患、病状または症状に関して用語「治療」、「治療する」および「治療すること」は、いずれの観察可能な有益な治療効果もさす。有益な効果は、例えば、感受性の高い対象における疾患の臨床症状の発症の遅延、疾患の一部または全ての臨床症状の重症度の低下、疾患の進行の遅延化、疾患の再発数の低下、対象の全体的な健康または福利の改善によるか、あるいは特定の疾患に特異的な当技術分野で周知のその他のパラメータによって明らかになり得る。予防的治療は、病理を発症する危険性を低下させる目的で、疾患の徴候を示さないかまたは早期の徴候しか示さない、対象に行われる治療である。治療的治療は、疾患の徴候および症状が発症した後に対象に投与される治療である。
ＩＩ．組換えＣＭＶベクターおよびそれを使用する方法
生物を繰り返し感染させる能力のあるヒトまたは動物サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ベクターが、本明細書に開示される。ＣＭＶベクターは、異種タンパク質抗原をコードし、活性のあるＵＬ１２８およびＵＬ１３０タンパク質、またはそのオーソログ（他の種を感染させるＣＭＶの相同遺伝子）を発現しない核酸配列を含む。異種抗原は、例えば、ＨＩＶ、ＳＩＶ、単純ヘルペスウイルス、Ｂ型またはＣ型肝炎ウイルス、パピローマウイルス、プラスモディウム属寄生虫、および結核菌に由来する病原体特異的抗原を含めたいずれの抗原であってもよい。なおさらなる例では、異種抗原は腫瘍抗原であってよく、それには、例えば、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ芽球性白血病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、悪性黒色腫、乳癌、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、膵臓癌、結腸癌、腎細胞癌（ＲＣＣ）、および胚細胞性腫瘍に関連する腫瘍抗原が挙げられる。一部の例では、ＣＭＶベクターは、活性のあるＵＬ４０タンパク質（またはそのオーソログ）および／または活性のあるＵＳ２８タンパク質（またはそのオーソログ）も欠く。なおさらなる例では、異種抗原は、組織特異的抗原または宿主自己抗原であってよく、それには、例えば、Ｔ細胞受容体の可変領域由来の抗原、Ｂ細胞受容体の可変領域由来の抗原、精子抗原、または卵抗原が挙げられる。
一部の例では、ベクターは、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、またはＵＬ４０（またはそのオーソログ）をコードする核酸配列の変異のために、活性のあるＵＬ１２８、ＵＬ１３０、ＵＳ２８またはＵＬ４０タンパク質を発現しない。この変異は、活性のあるＵＬ１２８、ＵＬ１３０、ＵＳ２８またはＵＬ４０タンパク質の発現の欠如をもたらすどんな変異であってもよい。そのような変異としては、点変異、フレームシフト変異、タンパク質をコードする配列の全てよりも少ない欠失（トランケーション変異）、またはタンパク質をコードする全ての核酸配列の欠失、あるいは任意のその他の変異を挙げることができる。
さらなる例では、ベクターは、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、またはＵＬ４０タンパク質（またはそのオーソログ）の発現を抑制するアンチセンスまたはＲＮＡｉ配列（ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ）を含むベクター中の核酸配列の存在に起因して、活性のあるＵＬ１２８、ＵＬ１３０、ＵＳ２８またはＵＬ４０タンパク質（またはそのオーソログ）を発現しない。変異および／またはアンチセンスおよび／またはＲＮＡｉは、活性のあるＵＬ１２８、ＵＬ１３０、ＵＳ２８またはＵＬ４０（またはそのオーソログ）を欠くＣＭＶベクターを生成するためにいずれの組合せでも使用することができる。
ＣＭＶベクターは、異なる免疫応答、例えば不活性化ＵＳ１１変異または不活性化ＵＬ８２（ｐｐ７１）変異、または任意のその他の不活性化変異をもたらすために、当技術分野で公知のさらなる不活性化変異を含むことができる。ＣＭＶベクターは、生体内でウイルスの播種（すなわち、細胞から細胞への伝播）に必須であるかまたはそれを促進する、当技術分野で公知のウイルスタンパク質をコードする１個または複数のウイルス遺伝子中の少なくとも１つの不活性化変異も含んでよい。そのような不活性化変異は、点変異、フレームシフト変異、トランケーション変異、またはウイルスタンパク質をコードする核酸配列全ての欠失から生じ得る。不活性化変異は、最終的にウイルスタンパク質の機能の低下または機能の完全喪失をもたらすいずれのウイルス遺伝子の変異も含む。
対象において異種抗原に対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答を生成する方法も本明細書に開示される。この方法は、有効量のＣＭＶベクターを対象に投与することを伴う。一実施形態では、ＣＭＶベクターは、少なくとも１つの異種抗原をコードする核酸配列と、活性のあるＵＬ１２８タンパク質（またはそのオーソログ）を発現せず、活性のあるＵＬ１３０タンパク質（またはそのオーソログ）を発現せず、少なくとも１つの活性のあるＵＬ４０タンパク質および少なくとも１つの活性のあるＵＳ２８タンパク質を発現する核酸配列とを有することを特徴とする。少なくとも１つの活性のあるＵＬ４０タンパク質および少なくとも１つの活性のあるＵＳ２８タンパク質は、ＵＬ４０およびＵＳ２８のオーソログまたはホモログであり得る。このベクターによって誘発されるＣＤ８＋Ｔ細胞応答は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の少なくとも１０％がＭＨＣ−Ｅによって提示されるエピトープに対して向けられることを特徴とする。さらなる例では、ＣＤ８＋Ｔ細胞の少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９５％がＭＨＣ−Ｅによって拘束される。一部の実施形態では、ＣＭＶベクターは、２〜５個の活性のあるＵＳ２８タンパク質またはそのオーソログもしくはホモログを発現する。一部の実施形態では、この方法は、ＣＭＶベクターによって誘発されたＣＤ８＋Ｔ細胞からＣＤ８＋Ｔ細胞受容体を同定することをさらに含み、ここで、ＣＤ８＋Ｔ細胞受容体はＭＨＣ−Ｅ／異種抗原由来ペプチド複合体を認識する。一部の実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞受容体は、ＲＮＡまたはＤＮＡ配列決定によって同定される。別の実施形態では、ＣＭＶベクターは、活性のあるＵＬ１２８、ＵＬ１３０、およびＵＬ４０タンパク質を発現しない核酸配列を有することを特徴とし、このベクターは、ＭＣ−ＩＩスーパートープを認識するＣＤ８＋Ｔ細胞を誘発するために、ＨＬＡ−Ｅ拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞とともに（無傷のＵＳ２８およびＵＬ４０を含有する１つまたは複数のさらなるベクターによって誘発される）、またはＨＬＡ−Ｅ拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞を用いずに（機能性ＵＬ４０またはＵＳ２８タンパク質を欠く１つまたは複数のさらなるベクターによって誘発される）、使用することができる。別の実施形態では、ＣＭＶベクターは、活性のあるＵＬ１２８、ＵＬ１３０、およびＵＳ２８タンパク質を発現しない核酸配列を有することを特徴とし、このベクターは、ＭＣ−ＩＩスーパートープを認識するＣＤ８＋Ｔ細胞を誘発するために、ＨＬＡ−Ｅ拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞とともに（無傷のＵＳ２８およびＵＬ４０を含有する１つまたは複数のさらなるベクターによって誘発される）、またはＨＬＡ−Ｅ拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞を用いずに（機能性ＵＬ４０またはＵＳ２８タンパク質を欠く１つまたは複数のさらなるベクターによって誘発される）、使用することができる。別の実施形態では、ＣＭＶベクターは、活性のあるＵＬ１２８、ＵＬ１３０、ＵＳ２８、およびＵＬ４０タンパク質を発現しない核酸配列を有することを特徴とし、このベクターは、ＭＣ−ＩＩスーパートープを認識するＣＤ８＋Ｔ細胞を誘発するために、ＨＬＡ−Ｅ拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞とともに（無傷のＵＳ２８およびＵＬ４０を含有する１つまたは複数のさらなるベクターによって誘発される）、またはＨＬＡ−Ｅ拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞を用いずに（機能性ＵＬ４０またはＵＳ２８タンパク質を欠く１つまたは複数のさらなるベクターによって誘発される）、使用することができる。
また、ＭＨＣ−Ｅ−ペプチド複合体を認識するＣＤ８＋Ｔ細胞を生成する方法も本明細書に開示される。この方法は、第１の対象（または動物）に、少なくとも１つの異種抗原と、活性のあるＵＬ４０タンパク質、またはそのホモログもしくはオーソログとをコードするＣＭＶベクターを投与して、ＭＨＣ−Ｅ／ペプチド複合体を認識する一組のＣＤ８＋Ｔ細胞を生成することを伴う。ＣＭＶベクターは、活性のあるＵＬ１２８およびＵＬ１３０タンパク質、またはそのオーソログをコードせず、異種抗原は、病原体特異的抗原、腫瘍抗原、組織特異的抗原、または宿主自己抗原を含めたいずれの抗原であってよい。一部の実施形態では、宿主自己抗原は、Ｔ細胞受容体またはＢ細胞受容体の可変領域由来の抗原である。この方法は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の組から第１のＣＤ８＋Ｔ細胞受容体を同定する工程であって、第１のＣＤ８＋Ｔ細胞受容体はＭＨＣ−Ｅ／異種抗原由来ペプチド複合体を認識する工程と；１つまたは複数のＣＤ８＋Ｔ細胞に発現ベクターをトランスフェクトする工程であって、発現ベクターは、第２のＣＤ８＋Ｔ細胞受容体をコードする核酸配列と、Ｔ細胞受容体をコードする核酸配列と動作可能に連結されたプロモーターとを含み、第２のＣＤ８＋Ｔ細胞受容体は、第１のＣＤ８＋ＴＣＲのＣＤＲ３αおよびＣＤＲ３βを含み、それによってＭＨＣ−Ｅ−ペプチド複合体を認識する１つまたは複数のトランスフェクトされたＣＤ８＋Ｔ細胞を生成する工程と、をさらに含む。発現ベクターによるトランスフェクションのための１つまたは複数のＣＤ８＋Ｔ細胞は、第１の対象または第２の対象から単離されてよい。一部の実施形態では、この方法は、癌、病原性感染、または自己免疫疾患もしくは障害などの疾患を治療するために、１つまたは複数のトランスフェクトされたＴ細胞を第１または第２の対象に投与することをさらに含んでもよい。一部の実施形態では、この方法は、組織特異的抗原または宿主自己抗原に対する自己免疫応答を誘導するために、１つまたは複数のトランスフェクトされたＴ細胞を第１または第２の対象に投与することをさらに含んでもよい。
また、（１）第１の対象にＣＭＶベクターを、ＭＨＣ−Ｅ／ペプチド複合体を認識する一組のＣＤ８＋Ｔ細胞を生成するのに有効な量で投与する工程であって、ＣＭＶベクターは、少なくとも１つの異種抗原をコードする第１の核酸配列を含み、さらに、活性のあるＵＬ４０タンパク質をコードする第２の核酸配列を含み、ＣＭＶベクターは、活性のあるＵＬ１２８およびＵＬ１３０タンパク質、またはそのオーソログを発現しない工程と；（２）第１のＣＤ８＋Ｔ細胞受容体をＣＤ８＋Ｔ細胞の組から同定する工程であって、第１のＣＤ８＋Ｔ細胞受容体はＭＨＣ−Ｅ／異種抗原由来ペプチド複合体を認識する工程と；（３）１つまたは複数のＣＤ８＋Ｔ細胞を第１の対象または第２の対象から単離する工程と；（４）第１または第２の対象から単離した１つまたは複数のＣＤ８＋Ｔ細胞に発現ベクターをトランスフェクトする工程であって、発現ベクターは、第２のＣＤ８＋Ｔ細胞受容体をコードする核酸配列と、第２のＴ細胞受容体をコードする核酸配列と動作可能に連結されたプロモーターとを含み、第２のＣＤ８＋Ｔ細胞受容体は、第１のＣＤ８＋Ｔ細胞受容体のＣＤＲ３αおよびＣＤＲ３βを含み、それによってＭＨＣ−Ｅ−ペプチド複合体を認識するトランスフェクトされたＴ細胞を作製する工程を含む方法によって調製されたＭＨＣ−Ｅ−ペプチド複合体を認識するトランスフェクトされたＣＤ８＋Ｔ細胞も開示される。異種抗原は、病原体特異的抗原、組織特異的抗原、宿主自己抗原、または腫瘍抗原を含めたいずれの抗原であってもよい。一部の実施形態では、第１のＣＤ８＋Ｔ細胞受容体は、ＲＮＡまたはＤＮＡ配列決定によって同定される。また、疾患、例えば癌、病原性感染、または自己免疫疾患もしくは障害などを治療する方法も本明細書に開示され、該方法は、ＭＨＣ−Ｅ−ペプチド複合体を認識するトランスフェクトされたＴ細胞を、第１または第２の対象に投与することを含む。また、宿主自己抗原または組織特異的抗原に対する自己免疫応答を誘導する方法も本明細書に開示され、該方法は、ＭＨＣ−Ｅ−ペプチド複合体を認識するトランスフェクトされたＴ細胞を、第１または第２の対象に投与することを含む。
さらなる例では、本方法は、対象に、有効量の第２のＣＭＶベクターを投与することを伴い、該第２のＣＭＶベクターは、第２の異種抗原をコードする核酸配列を含む。この第２のベクターは、活性のあるＵＬ１２８タンパク質（またはそのホモログもしくはオーソログ）および／または活性のあるＵＬ１３０タンパク質（またはそのホモログもしくはオーソログ）を含むＣＭＶベクターを含めた、いずれのＣＭＶベクターであってもよい。第２のＣＭＶベクターは、第２の異種抗原を含むことができる。第２の異種抗原は、第１のＣＭＶベクター中の異種抗原と同一の異種抗原を含めたいずれの異種抗原であってもよい。第２のＣＭＶベクターは、第１のＣＭＶベクターの投与の前、同時、または後を含む、第１のＣＭＶベクターの投与に対していずれの時間でも投与することができる。これには、第１のベクターの何カ月、何日、何時間、何分または何秒前または後の第２のベクターの投与も含まれる。
発現ベクターとして使用する場合、ヒトまたは動物のＣＭＶベクターは、ヒトなどの選択された対象において生来非病原性である。一部の実施形態では、ＣＭＶベクターは、選択された対象において非病原性となる（宿主間で伝播できない）ように改変されている。
異種抗原は、癌抗原、病原体特異的抗原、モデル抗原（例えばリゾチーム、キーホール−リンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、またはオボアルブミン）、組織特異的抗原、宿主自己抗原、または任意のその他の抗原を含めた、ＣＭＶに由来しないいずれのタンパク質またはそのフラグメントであってもよい。
病原体特異的抗原は、いずれのヒトまたは動物の病原体に由来するものであってよい。病原体は、ウイルス病原体、細菌性病原体、または寄生虫であってよく、抗原は、ウイルス病原体、細菌性病原体、または寄生虫に由来するタンパク質であってよい。寄生虫は、生物に起因する生物または疾患であり得る。例えば、寄生虫は、原生動物生物、疾患を引き起こす原生動物生物、蠕虫生物または虫、蠕虫生物に起因する疾患、外部寄生虫、または外部寄生虫に起因する疾患であり得る。
抗原は、癌に由来するタンパク質であり得る。癌としては、限定されるものではないが、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ芽球性白血病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、悪性黒色腫、乳癌、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、膵臓癌、結腸癌、腎細胞癌（ＲＣＣ）、および胚細胞性腫瘍が挙げられる。
抗原は、宿主自己抗原であり得る。宿主自己抗原としては、限定されるものではないが、Ｔ細胞受容体の可変領域またはＢ細胞受容体の可変領域に由来する抗原が挙げられる。抗原は、組織特異的抗原であり得る。組織特異的抗原としては、限定されるものではないが、精子抗原または卵抗原が挙げられる。
本明細書に開示されるＣＭＶベクターは、組換えＣＭＶウイルスまたはベクター、および製薬上許容される担体または希釈剤を含有する、免疫原性、免疫またはワクチンの組成物として使用することができる。組換えＣＭＶウイルスまたはベクター（またはその発現産物）を含有する免疫組成物は、免疫応答（局所または全身）を誘発する。この応答は保護的であり得るが、保護的である必要はない。組換えＣＭＶウイルスまたはベクター（またはその発現産物）を含有する免疫原性組成物も同様に、保護的であり得るが保護的である必要のない、局所または全身の免疫応答を誘発する。ワクチン組成物は、局所または全身の保護応答を誘発する。したがって、用語「免疫組成物」および「免疫原性組成物」には、「ワクチン組成物」が（前者の２つの用語が保護的組成物であり得るために）含まれる。
本明細書に開示されるＣＭＶベクターは、対象に、組換えＣＭＶウイルスまたはベクターと、製薬上許容される担体または希釈剤とを含む免疫原性、免疫またはワクチンの組成物を投与することを含む、対象において免疫応答を誘導する方法で使用することができる。本明細書では、用語「対象」には、非ヒト霊長類およびヒトを含む全ての動物が含まれるが、「動物」には、ヒトを除く全ての脊椎動物の種が含まれる。「脊椎動物」には、動物（本明細において使用される「動物」）およびヒトを含む、全ての脊椎動物が含まれる。そして、当然、「動物」のサブセットは、「哺乳動物」であり、本明細書では、それにはヒトを除く全ての哺乳動物が含まれる。
本明細書に開示されるＣＭＶベクターは、組換えＣＭＶウイルスまたはベクター、および製薬上許容される担体または希釈剤を含有する、治療組成物で使用することができる。本明細書に開示されるＣＭＶベクターは、異種抗原をコードする配列を含むＤＮＡを、ＣＭＶゲノムの必須または非必須領域に挿入することによって作製することができる。この方法は、ＣＭＶゲノムから１つ以上の領域を欠失させることをさらに含むことができる。この方法は生体内組換えを含むことができる。したがって、この方法は、ＣＭＶゲノムの部分と相同なＤＮＡ配列と隣接している異種ＤＮＡを含むドナーＤＮＡの存在下、細胞適合性培地中で、細胞にＣＭＶ ＤＮＡをトランスフェクトし、それにより異種ＤＮＡをＣＭＶのゲノムに導入することを含むことができ、任意選択的に、その後、生体内組換えによって改変されたＣＭＶを回収することができる。また、この方法は、ＣＭＶ ＤＮＡを切断して切断されたＣＭＶ ＤＮＡを得、異種ＤＮＡと切断されたＣＭＶ ＤＮＡを連結してハイブリッドＣＭＶ−異種ＤＮＡを得、細胞にハイブリッドＣＭＶ−異種ＤＮＡをトランスフェクトし、任意選択的に、その後、異種ＤＮＡの存在によって改変されたＣＭＶを回収することも含むことができる。生体内組換えが包含されることから、この方法は、ＣＭＶとは異質なポリペプチドをコードするＣＭＶにおいて自然に発生しないドナーＤＮＡを含むプラスミドも提供し、該ドナーＤＮＡは、そうでなければＣＭＶゲノムの必須または非必須領域と同一線上にあるＣＭＶ ＤＮＡのセグメント内にあり、その結果ＣＭＶの必須または非必須領域由来のＤＮＡがドナーＤＮＡと隣接する。異種ＤＮＡは、そのＤＮＡの安定した組み込みおよび必要に応じてその発現をもたらす組換えＣＭＶを任意の方向に生成するために、ＣＭＶに挿入することができる。
組換えＣＭＶベクターにおいて異種抗原をコードするＤＮＡは、プロモーターも含むことができる。プロモーターは、内在性ＣＭＶプロモーター、例えばＨＣＭＶ、ＲｈＣＭＶ、ネズミＣＭＶ（ＭＣＭＶ）、またはその他のＣＭＶプロモーターなどを含めたヘルペスウイルスなどのいずれの供給源に由来するものであってよい。プロモーターはまた、ＥＦ１αプロモーターなどの非ウイルスプロモーターであってもよい。プロモーターは、ウイルスにより与えられるトランス活性化タンパク質によってトランス活性化した領域と、末端切断型の転写活性プロモーターが誘導される全長プロモーターの最小プロモーター領域を含む、末端切断型の転写活性プロモーターであり得る。プロモーターは、最小プロモーターに対応するＤＮＡ配列と上流の調節配列の連合で構成され得る。最小プロモーターは、ＣＡＰ部位にＴＡＴＡボックス（転写の基本レベル；転写の非調節レベルのための最小配列）を加えたもので構成される。「上流調節配列」は、１つまたは複数の上流エレメントおよび１つまたは複数のエンハンサーで構成される。さらに、用語「末端切断型」は、全長プロモーターが完全に存在しない、すなわち全長プロモーターの一部が除去されていることを示す。そして、末端切断型プロモーターは、ＭＣＭＶまたはＨＣＭＶ、例えば、ＨＣＭＶ−ＩＥまたはＭＣＭＶ−ＩＥなどに由来し得る。サイズの減少は、塩基対に基づいて、全長プロモーターのサイズの４０％に及び、さらには９０％に及び得る。プロモーターはまた、改変された非ウイルスプロモーターでもあり得る。ＨＣＭＶプロモーターに関して、米国特許第５，１６８，０６２号および第５，３８５，８３９号を参照されたい。それから発現させるためのプラスミドＤＮＡによる細胞のトランスフェクションに関して、Ｆｅｉｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９４），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，２５５０−２５６１を参照されたい。そして、多様な感染症に対するワクチン接種の簡単かつ効果的な方法としての、プラスミドＤＮＡの直接注入に関して、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５９：１７４５−４９，１９９３を参照されたい。そのため、ベクターがベクターＤＮＡの直接注入によって使用され得ることは、本発明の範囲内である。
また、末端切断型の転写活性プロモーターを含む組換えウイルスまたはプラスミドに挿入することができる発現カセットが開示される。発現カセットは、機能性末端切断型ポリアデニル化シグナル；例えば末端切断型であるが、なお機能があるＳＶ４０ポリアデニル化シグナルをさらに含むことができる。自然がより大きなシグナルを与えたことを考えれば、末端切断型ポリアデニル化シグナルが機能性であることは実に驚くべきことである。末端切断型ポリアデニル化シグナルは、ＣＭＶなどの組換えウイルスの挿入サイズ制限の問題に対処する。発現カセットには、それが挿入されるウイルスまたは系に対して異種のＤＮＡも含めることができ、そのＤＮＡは、本明細書に記載される異種ＤＮＡであり得る。
ワクチンまたは免疫組成物で使用するための抗原に関して、Ｓｔｅｄｍａｎ’ｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ（第２４版、１９８２年、例えば、ワクチンの定義（ワクチン製剤で使用される抗原のリストに関して））も参照されたい。そのような抗原またはそれらの抗原の対象のエピトープを使用することができる。異種抗原に関して、当業者は、過度の実験を行うことなく、アミノ酸、およびペプチドまたはポリペプチドの対応するＤＮＡ配列の知識に加えて、特定のアミノ酸の性質（例えば、サイズ、電荷など）およびコドン辞書から、異種抗原およびそれをコードするＤＮＡを選択することができる。
抗原のＴエピトープを求める一方法は、エピトープマッピングを伴う。異種抗原のオーバーラップペプチドは、オリゴペプチド合成によって生成される。個々のペプチドは、その後、天然タンパク質が誘発した抗体と結合する能力、あるいはＴ細胞またはＢ細胞活性化を誘導する能力について試験される。Ｔ細胞はＭＨＣ分子と複合体を形成した短い線状のペプチドを認識するので、この手法は、Ｔ細胞エピトープをマッピングする際に特に有用である。
異種抗原に対する免疫応答は、一般に、以下のように生成される。タンパク質がより短いペプチドに切断されて、別の細胞の表面に位置する「主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）」と呼ばれる複合体に提示される時にだけ、Ｔ細胞はタンパク質を認識する。ＭＨＣ複合体には２つのクラス−クラスＩとクラスＩＩがあり、各クラスは多くの異なる対立遺伝子で構成されている。異なる種、および個々の対象は、異なる種類のＭＨＣ複合体対立遺伝子を有し、つまり、それらは異なるＭＨＣ型を有すると言われる。ＭＨＣクラスＩ分子の１つの種類は、ＭＨＣ−Ｅ（ヒトではＨＬＡ−Ｅ、ＲＭではＭａｍｕ−Ｅ、マウスではＱａ−１ｂ）と呼ばれている。
異種抗原をコードする配列を含むＤＮＡはそれ自体、ＣＭＶベクターにおいて発現を推進するためのプロモーターを含むことができるか、または、該ＤＮＡは異種抗原のコード化ＤＮＡに限定され得ることに留意されたい。この構築物は、内在性ＣＭＶプロモーターに対して、プロモーターと動作可能に連結され、それによって発現されるような方向に置くことができる。さらに、異種抗原をコードするＤＮＡの複数のコピー、あるいは強力なもしくは初期プロモーターまたは初期および後期プロモーターの使用、またはそれらの任意の組合せを、発現を増幅または増加させるために行うことができる。したがって、異種抗原をコードするＤＮＡは、ＣＭＶ内在性プロモーターに対して適切に配置することができ、またはそれらのプロモーターは、異種抗原をコードするＤＮＡとともに位置を変えて別の位置に挿入することができる。複数の異種抗原をコードする核酸は、ＣＭＶベクターにパッケージングすることができる。
さらに、開示されるＣＭＶベクターを含有する医薬およびその他の組成物が開示される。そのような医薬およびその他の組成物は、当技術分野で公知のいずれの投与手順で使用することもできるように製剤することができる。そのような医薬組成物は、非経口経路（皮内、筋肉内、皮下、静脈内など）を介するものであり得る。また、投与は粘膜経路、例えば、経口、経鼻、生殖器などを介するものであり得る。
開示される医薬組成物は、製薬分野の当業者に周知の標準技法に従って調製することができる。そのような組成物は、特定の患者の血統または種、年齢、性別、体重、および状態、ならびに投与経路などの要素を考慮して、医学分野の当業者に周知の投与量および技法で投与することができる。組成物は、単独で投与されてもよいし、その他のＣＭＶベクターと、あるいはその他の免疫組成物、抗原組成物、ワクチン組成物または治療組成物と同時投与または逐次投与されてもよい。そのようなその他の組成物は、精製された天然抗原またはエピトープあるいは組換えＣＭＶまたは別のベクター系による発現からの抗原またはエピトープを含むことができ、上述の要素を考慮して投与される。
組成物の例としては、懸濁液、シロップまたはエリキシル剤などのオリフィス（例えば、口、鼻、肛門、生殖器、例えば、膣など）投与用の液体調製物；および、滅菌懸濁液またはエマルジョンなどの非経口投与、皮下投与、皮内投与、筋肉投与または静脈内投与（例えば、注射投与）用の調製物が挙げられる。そのような組成物中で、組換え体は、滅菌水、生理食塩水、グルコースまたは同類のものなどの適した担体、希釈剤、または賦形剤と混合することができる。
抗原性、免疫またはワクチンの組成物は、典型的には、アジュバントと、所望の応答を誘発する量のＣＭＶベクターまたは発現産物を含むことができる。ヒト用途では、ミョウバン（リン酸アルミニウムまたは水酸化アルミニウム）が典型的なアジュバントである。サポニンおよびその精製された成分であるＱｕｉｌ Ａ、フロイント完全アジュバントおよび研究および獣医学用途で使用されるその他のアジュバントは、ヒトワクチンでの使用の可能性を制限する毒性を有する。ムラミルジペプチドなどの化学的に定義された調製物、モノホスホリルリピドＡ、Ｇｏｏｄｍａｎ−Ｓｎｉｔｋｏｆｆ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：４１０−４１５（１９９１）に記載されるものなどのリン脂質コンジュゲート、Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６：１７３９−１７４４（１９９２）に記載されるプロテオリポソーム内のタンパク質のカプセル封入、およびＮｏｖａｓｏｍｅ脂質小胞（Ｍｉｃｒｏ Ｖｅｓｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｎａｓｈｕａ，Ｎ．Ｈ．）などの脂質小胞へのタンパク質のカプセル封入も使用することができる。
組成物は、非経口（すなわち筋肉内、皮内または皮下）投与またはオリフィス投与、例えば、経舌（例えば、経口）、胃内、粘膜（口腔内、肛門内、膣内などを含む）投与による免疫化のための単一の剤形にパッケージングされてよい。そしてこの場合もやはり、効果的な投与量および投与経路は、組成物の性質、発現産物の性質、組換えＣＭＶが直接使用される場合の発現レベル、既知要素、例えば宿主の血統または種、年齢、性別、体重、状態および性質、ならびにＬＤ５０および公知であり過度の実験を必要としないその他のスクリーニング手順によって決定される。発現産物の投与量は、数〜数百マイクログラム、例えば、５〜５００μｇの範囲である。ＣＭＶベクターは、これらの投与レベルで発現を達成するための任意の適した量で投与することができる。限定されない例では、ＣＭＶベクターは、少なくとも１０２ｐｆｕの量で投与することができる。したがって、ＣＭＶベクターは、少なくともこの量で、または約１０２ｐｆｕ〜約１０７ｐｆｕの範囲で投与することができる。その他の適した担体または希釈剤は、防腐剤を含むまたは含まない、水または緩衝生理食塩水であり得る。ＣＭＶベクターは、投与の時点で再懸濁するために凍結乾燥してもよいし、溶液中にあってもよい。「約」は、所定の値の１％、５％、１０％または２０％以内を意味し得る。
本発明のタンパク質およびそれらをコードする核酸が、本明細書に例示および記載される正確な配列とは異なりうることは当然理解される。したがって、配列が本発明の方法に従って機能する限り、本発明は、示される配列に対する欠失、付加、末端切断、および置換を考慮する。この点で、置換は一般に本来保存的である、すなわちアミノ酸のファミリー内で起こる置換である。例えば、アミノ酸は一般に４つのファミリーに分けられる：（１）酸性−アスパラギン酸およびグルタミン酸；（２）塩基性−リジン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性−アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；および（４）非荷電極性−グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、およびチロシン。フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは、芳香族アミノ酸に分類されることがある。イソロイシンまたはバリンによるロイシンの単独置換、またはその逆；グルタミン酸によるアスパラギン酸の単独置換、またはその逆；セリンによるトレオニンの単独置換、またはその逆；あるいは構造的に関連するアミノ酸によるアミノ酸の同様の保存的置換が生物活性に大きな影響を及ぼさないことは、合理的に予測可能である。記載されるタンパク質と実質的に同じアミノ酸配列を有するが、タンパク質の免疫原性に実質的に影響を及ぼさない小さいアミノ酸置換を有するタンパク質は、そのため、本開示の範囲内である。
本発明のヌクレオチド配列は、コドン最適化され得、例えばコドンはヒト細胞で使用するために最適化することができる。例えば、任意のウイルスまたは細菌の配列は、そのように変更され得る。ＨＩＶおよびその他のレンチウイルスを含めた多くのウイルスが、多数の珍しいコドンを使用する。そして、これらのコドンを所望の対象において一般に使用されるコドンと一致するように変えることによって、異種抗原の発現の強化をＡｎｄｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌ．７２：１４９７−１５０３，１９９８に記載されるように達成することができる。
ＣＭＶベクターの機能的かつ／または抗原性に同等な変異体および誘導体をコードするヌクレオチド配列ならびにその中に含まれる糖タンパク質が考慮される。これらの機能的に同等な変異体、誘導体、およびフラグメントは、抗原活性を保持する能力を示す。例えば、コードされるアミノ酸配列を変えないＤＮＡ配列の変化、ならびにアミノ酸残基の保存的置換をもたらす変化、１または少数のアミノ酸の欠失または付加、およびアミノ酸類似体によるアミノ酸残基の置換は、コードされるポリペプチドの性質にあまり影響を及ぼさない変化である。保存的アミノ酸置換は、グリシン／アラニン；バリン／イソロイシン／ロイシン；アスパラギン／グルタミン；アスパラギン酸／グルタミン酸；セリン／トレオニン／メチオニン；リジン／アルギニン；およびフェニルアラニン／チロシン／トリプトファンである。一実施形態では、変異体は、対象の抗原、エピトープ、免疫原、ペプチドまたはポリペプチドと少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の相同性または同一性を有する。
配列同一性または相同性は、重複および同一性を最大限にする一方で、配列のギャップを最小限にするように整列させて、配列を比較することによって求められる。特に、配列同一性は、多数の数学的アルゴリズムのうちのいずれかを使用して決定してもよい。２つの配列の比較に使用される数学的アルゴリズムの限定されない例は、Ｋａｒｌｉｎ＆Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９９３；９０：５８７３−５８７７のように変更された、Ｋａｒｌｉｎ＆Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９９０；８７：２２６４−２２６８のアルゴリズムである。
配列の比較に使用される数学的アルゴリズムの別の例は、Ｍｙｅｒｓ＆Ｍｉｌｌｅｒ，ＣＡＢＩＯＳ １９８８；４：１１−１７のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。ＡＬＩＧＮプログラムをアミノ酸配列の比較に利用する場合、ＰＡＭ１２０重量残基表、１２のギャップ長ペナルティ、および４のギャップペナルティが使用され得る。局所的な配列類似性およびアライメントの範囲を特定するためのさらに別の有用なアルゴリズムは、Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９８８；８５：２４４４−２４４８に記載されるＦＡＳＴＡアルゴリズムである。
本発明による使用に好都合なものは、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ＢＬＡＳＴ）バージョン２．０ソフトウェアである。いくつかのＵＮＩＸ（登録商標）プラットフォーム用のＷＵ−ＢＬＡＳＴ バージョン２．０実行可能プログラムは、ｆｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ／ｂｌａｓｔ／ｅｘｅｃｕｔａｂｌｅｓからダウンロードすることができる。このプログラムは、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ バージョン１．４に基づき、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ バージョン１．４はパブリックドメインのＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ バージョン１．４に基づく（Ａｌｔｓｃｈｕｌ＆Ｇｉｓｈ，１９９６，Ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ，Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ ｅｄ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２６６：４６０−４８０；Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０），上記；Ｇｉｓｈ＆Ｓｔａｔｅｓ，１９９３；Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ３：２６６−２７２；Ｋａｒｌｉｎ＆Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−５８７７（１９９３）；これらは全て参照により本明細書に援用される）。
本発明の様々な組換えヌクレオチド配列および抗体および／または抗原は、標準的な組換えＤＮＡおよびクローニング技術を使用して作製される。そのような技術は当業者に周知である。例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．１９８９）を参照されたい。
本発明のヌクレオチド配列は、「ベクター」に挿入されてよい。用語「ベクター」は、当業者に広く使用され、理解されており、本明細書において用いられる用語「ベクター」は、当業者に対する意味と同じ意味で使用される。例えば、用語「ベクター」は、１つの環境から別の環境への核酸分子の移動を許容または促進するか、または核酸分子の操作を許容または促進するビヒクルを指すものとして当業者に慣用される。
本発明のウイルスの発現を許容するどんなベクターも、本発明に従って使用することができる。ある種の実施形態では、開示されるウイルスは、コードされた異種抗原（例えば、病原体特異的抗原、ＨＩＶ抗原、腫瘍抗原、および抗体）を産生するために、インビトロで（例えば無細胞発現系を使用するなど）かつ／またはインビトロで生育した培養細胞で使用することができ、それはその後タンパク質性ワクチンの製造においてなどの様々な用途に使用されてよい。そのような用途では、インビトロおよび／または培養細胞中でウイルスの発現を可能にするいずれのベクターも使用してもよい。
開示される異種抗原を発現させるために、異種抗原のタンパク質コード配列は、タンパク質の転写および翻訳を指示する調節または核酸制御配列に「作動可能に連結」されるべきである。本明細書において用いられる、コード配列および核酸制御配列またはプロモーターは、コード配列の発現または転写および／または翻訳を核酸制御配列の影響または制御下に置くようにそれらが共有結合されている場合に、「作動可能に連結」されると言われる。「核酸制御配列」は、任意の核酸エレメント、例えば、限定されるものではないがプロモーター、エンハンサー、ＩＲＥＳ、イントロン、およびそれらに作動可能に連結されている核酸配列またはコード配列の発現を指示する本明細書に記載されるその他の要素であり得る。用語「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの開始部位の周りに集まり、本発明のタンパク質コード配列に作動可能に連結された場合にコードされたタンパク質の発現をもたらす、転写制御モジュールの群を指すものとして本明細書において使用される。本発明の導入遺伝子の発現は、構成的プロモーター、または誘導性プロモーターの制御下で行うことができ、その誘導性プロモーターは、いくつかの特定の外部刺激、例えば、限定されないが、テトラサイクリンなどの抗生物質、エクジソンなどのホルモン、または重金属に触れた場合にのみ転写を開始させる。プロモーターはまた、特定の細胞型、組織または器官に特異的でもあり得る。多くの適したプロモーターおよびエンハンサーは、当技術分野で既知であり、任意のそのような適したプロモーターまたはエンハンサーが本発明の導入遺伝子の発現に使用されてよい。例えば、適したプロモーターおよび／またはエンハンサーは、真核生物プロモーターデータベース（ＥＰＤＢ）から選択することができる。
本開示は、異種タンパク質抗原を発現する組換え型ウイルスベクターに関する。一部の例では、抗原はＨＩＶ抗原である。有利には、ＨＩＶ抗原としては、限定されるものではないが、米国特許出願公開第２００８／０１９９４９３Ａ１号および第２０１３／０１３６７６８Ａ１号に記載のＨＩＶ抗原が挙げられ、その両方が参照により本明細書に援用される。ＨＩＶ、核酸またはその免疫原性断片は、ＨＩＶタンパク質抗原として利用され得る。例えば、米国特許出願公開第２００８／０１９９４９３Ａ１号および第２０１３／０１３６７６８Ａ１号に記載のＨＩＶヌクレオチドを使用することができる。ＨＩＶ抗体が認識するいずれの抗原も、ＨＩＶタンパク質抗原として使用することができる。また、タンパク質抗原はＳＩＶ抗原でもあり得る。例えば、米国特許出願公開第２００８／０１９９４９３Ａ１号および第２０１３／０１３６７６８Ａ１号に記載のＳＩＶ抗原を使用することができる。
本発明に従って使用されるベクターは、本発明の抗原を発現させることができるように、適した遺伝子調節領域、例えばプロモーターまたはエンハンサーなどを含むことができる。
例えばＨＩＶ−１抗原に対する免疫応答および／またはＨＩＶ−１に対する感染防御免疫を生成するために、本発明の抗原を生体内で対象において発現する、その対象での発現に適した、生体内で使用するのに安全な発現ベクターが選択されるべきである。一部の例では、実験動物において、例えば本発明のＨＩＶ−１免疫原性組成物およびワクチンの前臨床試験のためなどに、抗体および／または抗原を発現させることが望まれることがある。他の例では、ヒト対象において、例えば本発明の免疫原性組成物およびワクチンの臨床試験および実際の臨床使用のためなどに、抗原を発現させることができる。
本明細書に記載されるＣＭＶベクターは、宿主間の伝播を防ぐことができ、それによりウイルスがＣＭＶ感染の結果として合併症に直面することがあり得る免疫低下対象またはその他の対象を感染できなくする変異を含むことができる。本明細書に記載されるＣＭＶベクターはまた、結果として免疫優性および非免疫優勢エピトープならびに非標準的なＭＨＣ拘束を提示する変異も含むことができる。しかし、本明細書に記載されるＣＭＶベクターの変異は、以前にＣＭＶに感染したことのある対象を再感染させるベクターの能力に影響を及ぼさない。そのようなＣＭＶ変異は、例えば、米国特許出願公開公報第２０１３−０１３６７６８号；第２０１０−０１４２８２３号；第２０１４−０１４１０３８号；および国際公開第２０１４／１３８２０９号に記載され、その全てが参照により本明細書に援用される。
開示されるＣＭＶベクターは、例えば、目的が、高い割合のＣＤ８＋Ｔ細胞応答がＭＨＣクラスＩＩおよび／またはＭＨＣ−Ｅ（またはそのホモログもしくはオーソログ）に拘束されることを特徴とする免疫応答を含む、ＣＤ８＋免疫応答を含む、免疫原性応答を生成する場合に、生体内に投与することができる。例えば、一部の例では、ＲｈＣＭＶを使用する免疫原性組成物およびワクチンの前臨床試験に実験動物、例えばアカゲザルなどにおいて開示されるＣＭＶベクターを使用することが望ましいことがある。他の例では、開示されるＣＭＶベクターをヒト対象において、例えばＨＣＭＶを使用する免疫原性組成物の臨床試験および実際の臨床使用のためなどに、使用することが望ましいであろう。
そのような生体内用途には、開示されるＣＭＶベクターは、製薬上許容される担体をさらに含む免疫原性組成物の成分として投与される。本発明の免疫原性組成物は、病原体特異的抗原を含む異種抗原に対する免疫応答をシミュレートするために有用であり、ＡＩＤＳの予防、寛解または治療のためのＨＩＶ−１に対する予防用または治療用ワクチンの１つまたは複数の成分として使用されてよい。本発明の核酸およびベクターは、抗原がその後に対象において発現されて免疫応答を誘発するように、遺伝子ワクチン、すなわち、本発明の抗原をコードする核酸を対象、例えばヒトなどに送達するためのワクチンを提供するために特に有用である。
免疫化スケジュール（または計画）は、または動物（ヒトを含む）に対して周知であり、特定の対象および免疫原性組成物のために容易に決定することができる。そのため、免疫原は１回以上対象に投与することができる。好ましくは、免疫原性組成物の別々の投与の間には設定された時間間隔がある。この間隔は対象毎に変動するが、典型的にはそれは１０日から数週に及び、多くの場合２、４、６または８週である。ヒトに関して、間隔は、典型的には２〜６週である。本発明の特に有利な実施形態では、間隔はもっと長く、好都合には約１０週、１２週、１４週、１６週、１８週、２０週、２２週、２４週、２６週、２８週、３０週、３２週、３４週、３６週、３８週、４０週、４２週、４４週、４６週、４８週、５０週、５２週、５４週、５６週、５８週、６０週、６２週、６４週、６６週、６８週または７０週である。免疫化計画は典型的には１〜６回の免疫原性組成物の投与を有するが、わずか１回または２回または４回であってもよい。免疫応答を誘導する方法は、アジュバントと免疫原の投与も含むことができる。一部の例では、年に１回、年に２回または他の長い間隔（５〜１０年）の追加免疫が、初期免疫化プロトコールを補充することができる。本発明の方法には、多様なプライムブースト計画も含まれる。これらの方法では、１回または複数回の初回免疫の後に１回または複数回の追加免疫が続く。実際の免疫原性組成物は、各免疫化に対して同じであっても異なっていてもよく、免疫原性組成物の種類（例えば、タンパク質または発現ベクターを含む）、経路、および免疫原の製剤も変えることができる。例えば、発現ベクターが初回免疫および追加免疫ステップで使用される場合、それは同じかまたは異なる種類かのいずれかであり得る（例えば、ＤＮＡまたは細菌またはウイルスの発現ベクター）。１つの有用なプライムブースト計画は、４週離れた２回の初回免疫を施した後に、最後の初回免疫から４週および８週後に２回の追加免疫が続く。また、初回免疫および追加免疫計画を提供するために本発明のＤＮＡ、細菌およびウイルス発現ベクターを使用して包含されるいくつかの置換および組合せがあることも当業者に明白である。ＣＭＶベクターは、異なる病原体に由来する異なる抗原を発現する間、繰り返し使用することができる。
以下の実施例は、開示される方法を例証する。この開示を考慮すれば、当業者は、過度の実験を行うことなく、開示される方法のこれらの例およびその他の例の変形形態が可能であると認識するであろう。
実施例１ ＵＬ１２８およびＵＬ１３０を欠くが、ＵＬ４０およびＵＳ２８遺伝子を含有するアカゲザルサイトメガロウイルスワクチンベクターによるＭＨＣ−Ｅ拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞の誘導
ＲｈＣＭＶ／ＳＩＶベクターが、従来のワクチン様式によって生じる標準的な応答とは完全に異なり、さらにＳＩＶ感染自体とも完全に異なる、代わりのＳＩＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を推進することは、これまでに実証されている（Ｈａｎｓｅｎ，Ｓ．Ｇ．ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４０，１２３７８７４（２０１３）、参照により本明細書に援用される）。
ＲｈＣＭＶ／ＳＩＶに誘導されるＣＤ８＋Ｔ細胞応答がＭＨＣ−ＩＩ拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞の集団の存在によって支配されたことは確立されたが、残りのＣＤ８＋Ｔ細胞を拘束する分子（ｐａｎ−ＭＨＣ−Ｉブロッキング抗体Ｗ６／３２によって抑制された分子）は、不明のままである。
特に、６８−１ ＲｈＣＭＶ／Ｇａｇベクターの投与は、ＭＨＣ−Ｉａ発現にかかわらず、あらゆるＲｈＣＭＶ／Ｇａｇベクターを接種したマカクにおいて、ＳＩＶｍａｃ２３９ Ｇａｇ２７３−２８７（Ｇａｇ １５−ｍｅｒ ＃６９）およびＧａｇ４７７−４９１（Ｇａｇ １５−ｍｅｒ ＃１２０）「スーパートープ」を標的とするＭＨＣ−Ｉ拘束性のＣＤ８＋Ｔ細胞を誘発した。このことは、機能的に保存された「非古典的な」（すなわち、非多型性の）ＭＨＣ−Ｉｂ分子の関与を暗示した。本明細書では、これらのＣＤ８＋Ｔ細胞の拘束性ＭＨＣ−Ｉ対立遺伝子の識別が記載される。単一の「古典的な」（すなわち、多型性の）ＭＨＣ−Ｉａか、または非古典的なＭＨＣ−Ｉｂ対立遺伝子のいずれかを発現するＭＨＣ−Ｉ形質移入体のパネルを、強い、ＲｈＣＭＶ／ｇａｇに誘導されるＣＤ８＋Ｔ細胞応答を開始する株６８−１ ＲｈＣＭＶ／ｇａｇを接種した４匹のマカクのコホートから展開した（図７）。これまでに記載されたＭＨＣ拘束アッセイ（Ｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１３），上記）を使用して、Ｇａｇ２７３−２８７およびＧａｇ４７７−４９１スーパートープを標的とするＣＤ８＋Ｔ細胞が、ＭＨＣ−Ｅの観点でこれらのエピトープを認識することが確立された（図１Ａ）。
ＭＨＣ−Ｅ（ヒトではＨＬＡ−Ｅ、アカゲザルではＭａｍｕ−Ｅ、およびマウスではＱａ−１ｂ）は、身体中のほとんど全ての有核細胞で発現され、特に免疫系細胞で多く発現される、高度に単形性の非古典的ＭＨＣ−Ｉｂ分子である（Ｎ．Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９５，５１９９（１９９８）およびＳ．Ｃｏｕｐｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １０９，２８０６（２００７）、その両方が参照により本明細書に援用される）。現在同定されている８，５００を超えるＨＬＡクラスＩ対立遺伝子と対照的に（Ｊ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４１，Ｄ１２２２（２０１３）；参照により本明細書に援用される）、ＨＬＡ−Ｅ分子は２つしか存在しない。これはペプチド結合溝の外部に位置する１つのアミノ酸が異なっているので、機能的に同一である可能性が高い（Ｒ．Ｋ．Ｓｔｒｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７８，５０８２（２００３）；参照により本明細書に援用される）。ＭＨＣ−Ｅのこの高度に単形性の性質が、おそらく、あらゆるＲｈＣＭＶ／ｇａｇを接種したマカクが、どのように各々の動物に存在するＭＨＣ−Ｉａ対立遺伝子とは独立した同じＧａｇ ＭＨＣ−Ｉスーパートープを標的化することができるかを説明する。
ＭＨＣ−Ｅはまた、ＲｈＣＭＶ／ｇａｇを接種したマカクにおいて残りのＭＨＣ−Ｉに封鎖されたＣＤ８＋Ｔ細胞の拘束対立遺伝子としても識別された（図１Ａ）。ＭＨＣ−Ｅの構造は古典的なＭＨＣ−Ｉａ分子の構造に類似しているが、正常な生理的条件下でＭＨＣ−ＥはＮＫ細胞に提示するためにＭＨＣ−Ｉａ分子のリーダー配列に由来するたった１つの９−ｍｅｒペプチドを繰り返し結合し、提示する。しかし、ウイルス感染中などの細胞ストレス条件下で、ＭＨＣ−Ｅは、その結合モチーフが支配的なＭＨＣ−Ｉａリーダーペプチドの結合モチーフと一致しない、高度に多様なＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープの完全に別の組と結合する（Ｌａｍｐｅｎ ｅｔ ａｌ．，上記およびＣ．Ｃ．Ｏｌｉｖｉｅｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ ２０７、２０７（２０１０）；その両方が参照により本明細書に援用される）。ＭＨＣ−Ｅがリーダーペプチドを解放してその後に代わりのペプチドレパートリーをＣＤ８＋Ｔ細胞に提示する能力は、代わりのＭＨＣ−Ｉ拘束性のＣＤ８＋Ｔ細胞応答が主に、完全でないとしても、ＭＨＣ−Ｅによる提示に起因することを示唆する。
ＨＬＡ−Ｅ拘束性のＣＤ８＋Ｔ細胞は、最近、ＣＭＶ（Ｇ．Ｐｉｅｔｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １００，１０８９６（２００３）；参照により本明細書に援用される）；ＥＢＶ（Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ ＰＢ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ７，ｅ４６１２０（２０１２）；参照により本明細書に援用される）；サルモネラ・チフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ）（Ｒ．Ｓａｌｅｒｎｏ−Ｇｏｎｃａｌｖｅｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７３，５８５２（２００４）；参照により本明細書に援用される）；および結核菌（Ａ．Ｓ．Ｈｅｉｎｚｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９６，１４７３（２００２）およびＳＡ Ｊｏｏｓｔｅｎ ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｌ ６，ｅ１０００７８２（２０１０）；その両方が参照により本明細書に援用される）を含めたいくつかのヒト病原体に対して見出された。しかし、ＨＩＶ／ＳＩＶに特異的なＭＨＣ−Ｅ拘束性のＣＤ８＋Ｔ細胞応答は報告されておらず、いずれの異種抗原に対してもこれらの非古典的に拘束されるＣＤ８＋Ｔ細胞を誘導するワクチンプラットフォームは現在存在しない。
動物から得たＭＨＣ拘束データは、特異的なＭＨＣ異形態と高い親和性で結合し、それによりそのＭＨＣ分子の結合溝に関して他のペプチドを打ち負かす、ＭＨＣ「ブロッキング」ペプチドを使用して確認した。その感染宿主細胞をＮＫ細胞に媒介される溶解から守るために、ＨＣＭＶは、古典的なＭＨＣ−Ｉａリーダー配列に由来する正確な９−ｍｅｒペプチド（ＶＭＡＰＲＴＬＬＬ、Ｒｈ６７８−１６ ＶＬ９）を含む、糖タンパク質ＵＬ４０をコードする（ＲＣＭＶホモログはＲｈ６７である）。ＶＬ９ペプチドは、ＭＨＣ−Ｅペプチド結合溝と非常に高い親和性で特異的に結合する（Ｐ．Ｔｏｍａｓｅｃ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８７，１０３１（２０００）；参照により本明細書に援用される）。抗原提示細胞を、Ｇａｇ２７３−２８７およびＧａｇ４７７−４９１ペプチドとＭＨＣ−Ｅとの結合を阻止するためにＲｈ６７由来のＶＬ９ペプチドか、または無関係なＭａｍｕ−Ａ＊００２：０１（Ａ＊０２）結合Ｇａｇ７１−７９ ＧＹ９ペプチドのいずれかとともにプレインキュベートした。単一のＭＨＣ−Ｅ対立遺伝子を発現する自家ＢＬＣＬと形質移入体の両方でのＧａｇ２７３−２８７およびＧａｇ４７７−４９１スーパートープのＣＤ８＋Ｔ細胞の認識は、ＭＨＣ−Ｅ高親和性結合ペプチドＲｈ６７８−１６ ＶＬ９の存在によって完全に抑制され、ＭＨＣ−ＥをＭＨＣ−Ｉスーパートープ応答の提示対立遺伝子として確認する（図１Ｂおよび１Ｃ）。
ＲｈＣＭＶ／ｇａｇベクターにより誘発された全体的なＧａｇ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答へのＭＨＣ−Ｅの寄与を、従来の改変ワクシニアアンカラ（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｖａｃｃｉｎｉａ Ａｎｋａｒａ）（ＭＶＡ／ｇａｇ）ベクターおよび自然ＳＩＶ感染のものと比較した。ＭＨＣ−ＩまたはＭＨＣ−ＩＩに特異的なブロッキングモノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）をＭＨＣ−ＥブロッキングＲｈ６７８−１６ ＶＬ９ペプチドとともに使用するフローサイトメトリーＩＣＳを用いて、２５匹のマカクからなるコホート：６匹の株６８−１ ＲｈＣＭＶ／ｇａｇ接種マカク、９匹の株６８−１．２ＲｈＣＭＶ／ｇａｇ接種マカク、７匹のＭＶＡ／ｇａｇ接種マカク、および８匹のＳＩＶ感染マカク、にて見られた各々のエピトープ特異的応答の拘束を評価した。ＭＨＣ−ＥにブロックされたＣＤ８＋Ｔ細胞応答は、株６８−１ ＲｈＣＭＶ／ｇａｇを接種したマカクにおいてのみ見られた。さらに、株６８−１ ＲｈＣＭＶ／ｇａｇを接種したマカクに観察されたＭＨＣ−Ｉにブロックされた応答も全て、ＭＨＣ−Ｅによって提示された（図２Ａ、８、および９）。ＭＨＣ−Ｅ拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞は、株６８−１．２ＲｈＣＭＶ／ｇａｇベクターを接種したマカクにおいて観察されなかった。
株６８−１．２ＲｈＣＭＶ／ｇａｇベクターを接種したマカクにＭＨＣ−Ｅ拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞がないことは、２つのＣＭＶ株間の相違が最小であることを考えれば驚くことであった。細菌人工染色体（ＢＡＣ）としてクローン化される前の線維芽細胞でのインビトロ培養の間、ＲｈＣＭＶ ６８−１は、Ｒｈ１３、Ｒｈ６０、Ｒｈ１５７．５、およびＲｈ１５７．４（それぞれ、ＨＣＭＶ ＲＬ１１、ＵＬ３６、ＵＬ１２８、およびＵＬ１３０）オープンリーディングフレームから遺伝子産物を発現させる能力を失った（Ｄ．Ｍａｌｏｕｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８６，８９５９（２０１２）および国際公開第２０１４／１３８２０９号；参照により本明細書に援用される）。これらのうち、発現はＲｈＣＭＶ ６８−１．２株でＲｈ６０、Ｒｈ１５７．５、およびＲｈ１５７．４について回復され（Ａ．Ｅ．Ｌｉｌｊａ，Ｔ．Ｓｈｅｎｋ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０５，１９９５０（２００８）；参照により本明細書に援用される）、これらの遺伝子産物のうちの１つまたは組合せの存在がＭＨＣ−ＥでのＣＤ８＋Ｔ細胞のプライミングを抑制するのに十分であることが示唆される。Ｒｈ６０は、非ＢＡＣ由来のＲｈＣＭＶ／ｇａｇ（Ｌ）ベクターに存在するので、この抑制効果を媒介する遺伝子として除外することができ（Ｈａｎｓｅｎ，Ｓ，Ｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２８，１０２（２０１０）；参照により本明細書に援用される）、それはＭＨＣ−Ｅ拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞を誘導する（図２Ａ）。したがって、ＣＭＶ由来の遺伝子Ｒｈ１５７．５およびＲｈ１５７．４（ＨＣＭＶではＵＬ１２８−１３０）が存在しないことが、ＭＨＣ−Ｅ拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞の誘導に必要である。
特定の応答に対する不完全なＶＬ９ブロッキングが観察された（図２ＡのＲｈ２２６０７のＧａｇ １５−ｍｅｒ ＃１８参照）。実際に、ＲｈＣＭＶ／ｇａｇに誘導され、Ｗ６／３２にブロックされたＣＤ８＋Ｔ細胞応答は全て、ＭＨＣ−Ｅの観点でペプチドを認識したが、これらの不完全にＶＬ９にブロックされたペプチドは、古典的なＭＨＣ−Ｉａ対立遺伝子、例えばＲｈ２２６０７においてＭａｍｕ−Ａ＊００１：０１（Ａ＊０１）に提示されるＧａｇ６９−８３（Ｇａｇ １５−ｍｅｒ ＃１８）の観点で認識された（図８Ｂ）。この二重提示をより詳しく理解するために、ペプチド封鎖調査を実施した。これらは、Ｍａｍｕ−Ａ＊０１結合Ｇａｇ１８１−１８９ ＣＭ９ペプチドの存在は、Ｍａｍｕ−Ａ＊０１形質移入体でのＧａｇ６９−８３の提示を抑制するのに十分であったこと、Ｒｈ６７由来ＶＬ９ペプチドの存在は、ＭＨＣ−Ｅ形質移入体でのＧａｇ６９−８３の提示を抑制したが、両方のペプチドは、Ｍａｍｕ−Ａ＊０１＋マカク由来の自家ＢＬＣＬでのＧａｇ６９−８３の提示を完全にブロックすることが求められたことを示した（図２Ｂ）。対照的に、同じＧａｇ６９−８３エピトープの提示は、Ｍａｍｕ−Ａ＊０１−マカク由来のＢＬＣＬでＲｈ６７８−１６ ＶＬ９ペプチド単独の存在によって完全にブロックされ、ＭＨＣ−Ｅをこれらのペプチドの主要な拘束対立遺伝子として強調する（図２Ｃ）。しかし、ＭＨＣ−Ｅ拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞がＭＨＣ−Ｅかまたは古典的なＭＨＣ−Ｉａ分子のいずれかの観点で同種ペプチドに応答する能力を考えると、これらの細胞のＴＣＲは、ＭＨＣ−結合ペプチド自体を直接または保存されたＭＨＣ構造モチーフと併せて認識する可能性が高い。驚くことに、特異的ペプチドエピトープを結合する能力のあるＭＨＣ対立遺伝子の存在は、そのエピトープを標的とするＣＤ８＋Ｔ細胞応答の生成に十分でなかった（図８）。そのことは、各々のＲｈＣＭＶ接種マカクにおいて標的化される特定の組のエピトープの決定における免疫調節のさらなる層を示した。
次に、ＭＨＣ−Ｅ拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞がＳＩＶに対する免疫応答に関与することを確立した。ＨＩＶおよびＳＩＶは、細胞表面由来の古典的なＭＨＣクラスＩ分子のＮｅｆ媒介性ダウンレギュレーションによってＣＤ８＋Ｔ細胞認識を逃れる（Ｏ．Ｓｃｈｗａｒｔｚ，ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ Ｍｅｄ ２，３３８（１９９６）；Ｋ．Ｌ．Ｃｏｌｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ ３９１，３９７（１９９８）；その両方が参照により本明細書に援用される）。対照的に、Ｎｅｆは、ＨＬＡ−Ｅをダウンレギュレートすることができず、その表面発現は実際にＨＩＶ感染とともに増加する（Ｊ．Ｎａｔｔｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ，Ａｎｔｉｖｉｒ Ｔｈｅｒ １０，９５，（２００５）；参照により本明細書に援用される）。最初に、増殖性にＳＩＶ感染したＣＤ４＋Ｔ細胞の表面でのＭａｍｕ−Ｅの運命を決定した。ｐａｎ−ＭＨＣ−Ｉ ｍＡｂ Ｗ６／３２およびＭａｍｕ−Ｅ特異的ｍＡｂ ４Ｄ１２を使用して、ＨＩＶ感染の間のＨＬＡ−Ｅのように、Ｍａｍｕ−Ｅ表面発現がＳＩＶ感染の間に大幅に増加することが実証された（図３Ａおよび３Ｂ）。そのため、ＭＨＣ−Ｅ拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞はそれらの拘束するＭＨＣ−Ｉ分子のＮｅｆ媒介性ダウンレギュレーションの影響を受けないことから、ＭＨＣ−Ｅ拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞は特に有効であり得る。ＭＨＣ−Ｅは、ＴＣＲαβおよびＣＤ９４／ＮＫＧ２複合体の両方と相互作用し、ＴＣＲαβおよびＣＤ９４／ＮＫＧ２複合体はＣＤ８＋Ｔ細胞の表面に発現される（Ｖ．Ｍ．Ｂｒａｕｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３９１，７９５（１９９８）；参照により本明細書に援用される）。
特に、高いＮＫＧ２Ｃ発現はＣＭＶ感染によって推進され、ＮＫＧ２Ｃ受容体の関与は、ＭＨＣ−Ｅと相互作用するＮＫおよびＴ細胞の活性化を誘発させる（Ｓ．Ｌｏｐｅｚ−Ｖｅｒｇｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０８，１４７２５（２０１１）およびＭ．Ｇｕｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３５，２０７１（２００５）；その両方が参照により本明細書に援用される）。株６８−１ ＲｈＣＭＶ／ｇａｇを接種したマカクにおいてＭＨＣ−Ｅ拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞がＮＫＧ２Ｃ受容体を利用してＭＨＣ−Ｅに誘導される活性化を媒介する可能性を調査するため、これらの細胞の表面表現型を調べ、たとえあってもわずかしかＮＫＧ２Ａ／ＮＫＧ２Ｃ発現（図３Ｃおよび１０）は見出されなかった。さらに、ＭＨＣ−Ｅ拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞は、従来のＣＤ３＋、ＣＤ８αβ＋、ＴＣＲγδ−、ＮＫＧ２Ａ／Ｃ−表現型を示し、これらのＴ細胞がＣＤ８安定化ＴＣＲαβ相互作用を介してＭＨＣ−Ｅ結合ペプチドを認識したことを示唆した。
次に、６８−１ ＲｈＣＭＶ／ＳＩＶ接種マカクに存在するＭＨＣ−Ｅ拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞が自家ＳＩＶ感染ＣＤ４＋Ｔ細胞を特異的に認識する能力を、ＭＶＡ／ｇａｇまたは株６８−１．２ＲｈＣＭＶ／ｇａｇを接種したかあるいはＳＩＶに感染したマカクに見られる古典的なＭＨＣ−Ｉ拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞のそれと比較した。全ての処理マカクから単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞は、自家ＳＩＶ感染ＣＤ４＋Ｔ細胞を強く認識し、この認識は、ｐａｎ−ＭＨＣ−ＩブロッキングｍＡｂ Ｗ６／３２およびＭＨＣ−ＩＩ結合ＣＬＩＰペプチドの添加によって完全にブロックされた（図４Ａおよび４Ｂ）。対照的に、株６８−１ ＲｈＣＭＶ／ＳＩＶを接種したマカクから単離したＣＤ８＋Ｔ細胞を除いて全ての例でＭＨＣ−ＩブロッキングｍＡｂ Ｗ６／３２をＭＨＣ−ＥブロッキングＲｈ６７８−１６ ＶＬ９ペプチドに置き換えた場合、ＣＤ８＋Ｔ細胞の感染細胞の認識は完全に回復された。このことは、ＭＨＣ−Ｅ拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞がＳＩＶ感染細胞を認識したことを示唆する。
ＭＨＣ−Ｅに結合したＳＩＶ由来のエピトープが感染細胞の表面に存在したかどうかをより正確に調べるために、Ｇａｇ４７７−４９１（Ｇａｇ ＃１２０）スーパートープ特異的なＭＨＣ−Ｅ拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞株を生成した。この細胞株を自家ＳＩＶ感染ＣＤ４＋Ｔ細胞に応答する能力について試験した。比較のために、古典的なＭＨＣ拘束性（Ｍａｍｕ−Ａ＊００１：０１拘束性）Ｇａｇ１８１−１８９ ＣＭ９ ＣＤ８＋Ｔ細胞株も評価した。両方のＧａｇ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞株は、ＳＩＶ感染細胞を特異的に認識し、標的をｐａｎ−ＭＨＣ−ＩブロッキングｍＡｂ Ｗ６／３２とともにプレインキュベートした場合に、認識はブロックされた。対照的に、ＭＨＣ−Ｅ拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞株だけは、標的をＭＨＣ−Ｅ結合ペプチドＲｈ６７８−１６ ＶＬ９とともにプレインキュベートした場合にＳＩＶ感染細胞を認識することができなかった（図４Ｃ）。累積的に、これらのデータは、ＭＨＣ−Ｅ拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞が、感染細胞の表面でＳＩＶ由来のペプチドエピトープを特異的に認識することを示す。
６８−１株ベクターは、非古典的ＭＨＣ−Ｅ分子の観点でペプチド抗原を認識するＣＤ８＋Ｔ細胞を誘導する。そのようなＣＤ８＋Ｔ細胞は、ワクチン開発のための新しい細胞免疫応答を提示し、ＭＨＣ−Ｅの特有の免疫生物学を考えると特に効果的であり得る。ＨＩＶ感染細胞の表面からダウンレギュレートされる古典的なＨＬＡ分子と対照的に、ＨＬＡ−Ｅ発現はアップレギュレートされ、ＭＨＣ−Ｅ発現の増加は、ウイルス侵入の始まりでの感染の最初の２４時間以内に起こる（Ｊ．Ｎａｔｔｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｖｉｒ Ｔｈｅｒ １０，９５（２００５）およびＬ．Ｓｈａｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９３，２７７（２０１４）；その両方が参照により本明細書に援用される）。２つの機能的に同一なＨＬＡ−Ｅ対立遺伝子だけがヒト集団に存在する（Ｒ．Ｋ．Ｓｔｒｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７８，５０８２（２００３）；参照により本明細書に援用される）。そのため、ＭＨＣ−Ｅ拘束性Ｔ細胞を特異的に誘導するワクチンプラットフォームは、ワクチンを接種したあらゆる個体が、ＨＩＶ Ｎｅｆに媒介される免疫回避に影響されない同一のＴ細胞応答を開始する、真に万能なＣＤ８＋Ｔ細胞ワクチンをもたらすことがあり得る。実際に、本明細書に開示されるように、ＭＨＣ−Ｅ拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞は、株６８−１ ＲｈＣＭＶベクターによって強く誘発され、それはマカクにおいてＳＩＶに対して類のない保護を示した（Ｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００９），上記；Ｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０１１），上記；Ｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ（２０１３），上記）。したがって、古典的エピトープと非古典的エピトープの両方に対する応答を誘導するＨＩＶワクチンは、ウイルス複製およびその後の鈍いウイルス伝播を効果的にブロックするために求められるＴ細胞応答の必要な幅を提供するかもしれない。
上に述べたように、ＨＣＭＶは、糖タンパク質ＵＬ４０（ＲＣＭＶホモログはＲｈ６７である）をコードし、それはＭＨＣ−Ｅペプチド結合溝と非常に高い親和性で結合する９−ｍｅｒペプチド（ＶＭＡＰＲＴＬＬＬ、Ｒｈ６７８−１６ ＶＬ９）を含む（Ｐ．Ｔｏｍａｓｅｃ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８７，１０３１（２０００）；参照により本明細書に援用される）。インビトロデータは、ＶＬ９が抗原由来ペプチドと結合について競合することを示したので、ＲｈＣＭＶ ６８−１のゲノムからのＲｈ６７（ＵＬ４０）の欠失が、生体内でＨＬＡ−Ｅ拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞の出現頻度をさらに増加させる可能性を考慮した。この可能性を調べるために、Ｒｈ６７（ＵＬ４０）を６８−１ ＲｈＣＭＶ／ｇａｇベクターから欠失させた。結果として生じる組換えウイルスを、ＲｈＣＭＶに自然感染した動物に接種した。接種後０日、７日、１４日、２１日、２８日および４２日に、ＰＢＭＣを入手し、全ＳＩＶｇａｇならびにＭＨＣ−Ｅに応答するＣＤ８＋Ｔ細胞の出現頻度を、特異的ペプチドを使用する細胞内サイトカイン染色によって測定した。図５に示されるように、接種後１４日に始まる、全ＳＩＶｇａｇに対するＳＩＶｇａｇ応答が検出できた。さらに、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＭＨＣ−ＩＩ拘束性「スーパートープ」ペプチドＧａｇ５３およびＧａｇ７３に応答した。しかし、本発明者らの予測に反して、ＨＬＡ−Ｅ特異的スーパートープに対するＴ細胞応答は増加しなかった。実際に、この実験で調査したどのＨＬＡ−Ｅペプチドでも応答は検出されなかった（Ｇａｇ６９およびＧａｇ１２０）。そのため、この驚くべき結果は、ＵＬ４０およびＵＬ１２８およびＵＬ１３０を欠失するベクターが、ＭＨＣ−ＩＩ拘束性スーパートープを含むＭＨＣ−ＩＩ拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞を誘導するが、ＭＨＣ−Ｅ拘束性のＣＤ８＋Ｔ細胞を誘導しないことを示唆する。したがって、ＭＨＣ−Ｅ拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞の誘導は、ＵＬ４０の存在と、ＵＬ１２８およびＵＬ１３０の不在を必要とする。
Ｒｈ６７（ＵＬ４０）に加えて、ＲｈＣＭＶが、ＵＬ１２８−１３０を欠くＲｈＣＭＶによるＨＬＡ−Ｅおよび／またはＭＨＣ−ＩＩ拘束性Ｔ細胞応答の誘導に必要とされるさらなる遺伝子をコードするかどうかを判定するため、インビトロでの成長に必須でない遺伝子領域をＲｈＣＭＶ ６８−１から欠失させ、アカゲザルの接種によるＴ細胞応答をモニターした。大部分の欠失変異体はＴ細胞特異性に影響を及ぼさなかったが、遺伝子領域Ｒｈ２１４−Ｒｈ２２０の欠失は、ＲｈＣＭＶ ６８−１がＭＨＣ−Ｅ拘束性応答を誘発する能力を消去したことが観察され、一方、ＭＨＣ−ＩＩ拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞応答はなお観察された（図２９および３０）。Ｒｈ２１４−Ｒｈ２２０領域が、ＨＣＭＶ ＵＳ２８：Ｒｈ２１４、Ｒｈ２１５、Ｒｈ２１６、Ｒｈ２１８およびＲｈ２２０（それぞれ、ＲｈＵＳ２８．４、ＲｈＵＳ２８．３、ＲｈＵＳ２８．２、ＲｈＵＳ２８．１、およびＲｈＵＳ２８．５としても公知、Ｍ．Ｅ．Ｐｅｎｆｏｌｄ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７７：１０４０４（２００３）参照により本明細書に援用される）と相同な（すなわちそのホモログである）５コピーの遺伝子をコードすることから、この結果は予想外であった。これまでに予測されたオープンリーディングフレームＲｈ２１７およびＲｈ２１９は、一連のこれまでに記載された判定基準に基づいて機能的遺伝子を提示すると考えられていない（Ｄ．Ｍａｌｏｕｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８６，８９５９（２０１２）参照により本明細書に援用される）。ＨＣＭＶ ＵＳ２８は、ＣＣ−ケモカインと結合するＧタンパク質共役受容体をコードし（Ｊ．Ｌ Ｇａｏ ａｎｄ Ｐ．Ｍ．Ｍｕｒｐｈｙ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６９：２８５３９（１９９３））、５つのＲｈＣＭＶホモログの少なくとも１つについてケモカイン結合が確認された（Ｍ．Ｅ．Ｐｅｎｆｏｌｄ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７７：１０４０４（２００３））。しかし、ＭＨＣ−Ｅ拘束性Ｔ細胞応答の誘導にＵＳ２８が必要であることは予想外であった。この驚くべき結果は、そのため、ＵＳ２８、ＵＬ１２８、およびＵＬ１３０を欠失するベクターが、ＭＨＣ−ＩＩ拘束性スーパートープを含むＭＨＣ−ＩＩ拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞を誘導するが、ＭＨＣ−Ｅ拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞を誘導しないことを示唆する。したがって、ＭＨＣ−Ｅ拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞の誘導は、ＵＳ２８およびＵＬ４０の存在と、ＵＬ１２８およびＵＬ１３０の不在を必要とする。
材料および方法：
アカゲザル：合計４６匹のインドの遺伝的背景をもつパーパスブレッド（ｐｕｒｐｏｓｅ−ｂｒｅｄ）の雄または雌アカゲザル（ＲＭ）（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔｏ）をこの実施例で報告される実験に使用した。それらには、株６８−１ ＲｈＣＭＶ／ｇａｇを接種した９匹のＲＭ、株６８−１．２ＲｈＣＭＶ／ｇａｇを接種したＲＭ、Ｒｈ６７を欠失した６８−１ ＲｈＣＭＶ／ｇａｇを接種した１匹のＲＭ、ＭＶＡ／ｇａｇを接種した７匹のＲＭ、ＳＩＶ感染によるワクチン接種をしていない１９匹のＲＭ、およびＲｈＣＭＶのコロニー循環株に自然感染したワクチン接種をしていない６匹のＲＭが含まれた。全てのＲＭは、米国国立衛生研究所の実験動物の管理と使用に関する指針の基準の下、オレゴン国立霊長類研究センター施設内実験動物委員会の承認を得て使用した。これらの実験で使用されたＲＭは、オナガザルヘルペスウイルス１、Ｄ型サルレトロウイルス、およびサルＴリンパ増殖性ウイルス１型を含まなかった。選択されたＲＭは、ディープシーケンシングによってＭＨＣ−Ｉ遺伝子型を同定した。手短に言えば、ＭａｍｕクラスＩ配列のアンプリコンを、高忠実度Ｐｈｕｓｉｏｎ（商標）ポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）および一対の万能なＭＨＣ−Ｉ特異的プライマーを、以下の熱サイクル条件：９８℃で３分間（９８℃で５秒間、５７℃で１秒間、７２℃で２０秒間）を２３サイクル、そして７２℃で５分間使用するＰＣＲによるｃＤＮＡの増幅によって生成した。各々のＰＣＲプライマーは、特有の１０ｂｐ多重識別子（Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ）（ＭＩＤ）タグを、４５４シーケンシング（商標）のアダプター配列（５’−ＧＣＣＴＣＣＣＴＣＧＣＧＣＣＡＴＣＡＧ−ＭＩＤ−ＧＣＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＡＣＡＣＧ−３’；５’−ＧＣＣＴＴＧＣＣＡＧＣＣＣＧＣＴＣＡＧ−ＭＩＤ−ＴＣＧＣＴＣＴＧＧＴＴＧＴＡＧＴＡＧＣ−３’）とともに含んだ。結果として生じるアンプリコンは、エキソン２内の高度多型性領域の１９０ｂｐに及ぶ。一次ｃＤＮＡ−ＰＣＲ産物は、ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ磁性ビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）を用いて精製した。エマルジョンＰＣＲおよびパイロシーケンシング手順は、製造業者の説明書に従ってゲノムシーケンサーＦＬＸ機器（Ｒｏｃｈｅ／４５４ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で実行した。データ分析は、Ｌａｂｋｅｙデータベースを、配列アセンブリのためのＧｅｎｅｉｏｕｓ−Ｐｒｏ（登録商標）生物情報科学ソフトウェア（Ｂｉｏｍａｔｔｅｒｓ Ｌｔｄ．）と共に用いて実施した。
ＲｈＣＭＶ／ＳＩＶベクター：６８−１株由来ＲｈＣＭＶ／ＳＩＶの構成、特徴づけ、および投与は、以前に詳細に記載されている（Ｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００９），上記；Ｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０１１），上記；Ｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ（２０１３），上記；Ｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１３），上記；Ｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０１０），上記）。この研究で使用される全ての組換えウイルスは、ＲｈＣＭＶ ６８−１株ＢＡＣに由来した。組織培養適応のために、ＲｈＣＭＶ ６８−１構築物は、ＨＣＭＶ ＵＬ１２８およびＵＬ１３０のホモログをそれぞれコードするＯＲＦ１５７．５および大部分のＯＲＦ Ｒｈ１５７．４の欠失を含む（Ｈａｎｓｅｎ，Ｓ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７７，６６２０（２００３）；参照により本明細書に援用される）。
ＵＬ４０発現を欠くベクターを生成するために、ＢＡＣリコンビニアリングによってＯＲＦ Ｒｈ６７をＲｈＣＭＶ ６８−１から欠失させた。手短に言えば、相同組換えによって、Ｒｈ６７をＦＲＴ隣接カナマイシン耐性遺伝子含有ＰＣＲ断片で置き換え、その後にＦＬＰリコンビナーゼを使用してＫａｎＲ遺伝子を削除した。ウイルスをアカゲザル線維芽細胞において回収し、抗原発現とＲｈ６７（ＵＬ４０）の喪失について特徴づけた。
完全なＵＬ１２８−１３０発現を有するベクターを生成するために、ＳＩＶｇａｇ発現カセットをＲｈ６１／Ｒｈ６０（ＵＬ３６）、Ｒｈ１５７．４（ＵＬ１３０）、およびＲｈ１５７．５（ＵＬ１２８）が修復された組換えウイルスであるＲｈＣＭＶ ６８−１．２のＲｈ２１１に挿入した（Ａ．Ｅ．Ｌｉｌｊａ ａｎｄ Ｔ．Ｓｈｅｎｋ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．１０５，１９９５０（２００８）；参照により本明細書に援用される）。全ての組換えウイルスを特徴づけ、制限消化によって確認した、そして抗原挿入物（その隣接領域を含む）を配列検証した。ＳＩＶ抗原の発現を免疫ブロットにより検証した。さらに、隣接遺伝子発現をＲＴ−ＰＣＲにより検証した。
その他のワクチン
ＭＶＡ／ｇａｇは、コドン最適化した全長ＳＩＶｍａｃ２３９ ｇａｇ遺伝子を、ＭＨ５初期／後期ワクシニアプロモーターの制御下で、ＭＶＡシャトルベクターｐＬＷ４４に挿入することによって構成して、組換えプラスミドｐＪＶ７を生成した。ｐＬＷ４４内の隣接配列は、相同組換えによるチミジンキナーゼ遺伝子座への組換え構築物の挿入を導いた。ニワトリ胚線維芽細胞にｐＪＶ７をトランスフェクトし、その後ＭＶＡ株１９７４により感染させて、ＳＩＶｍａｃ２３９ｇａｇを発現する組換えウイルスを生成した（ＳＩＶｇａｇ発現は免疫ブロットにより確認した）。組換えウイルスをプラーク精製し、大規模培養で増幅した。ウイルスストックを、２４〜４０％スクロース勾配で精製し、その後にペレットを含む３６％スクロースクッションによってペレット化した後、１ｍＭトリス−Ｃｌ、ｐＨ９．０に懸濁した。ＭＶＡ／ｇａｇワクチン接種のために、このベクターの１０８プラーク形成単位を筋肉注射によってＲＭに投与した。
抗原および抗原提示細胞：ＳＩＶｇａｇタンパク質を含む連続した１５−ｍｅｒペプチド（１１アミノ酸がオーバーラップ）を、ＮＩＨ ＡＩＤＳ試薬プログラムから得た。これらのタンパク質内の特異的９−１４−ｍｅｒペプチドの合成を、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）によって実施した。全てのペプチドは、ｎ末端からそれらの含むアミノ酸の位置によって同定される（例えば、Ｇａｇｘｘ−ｙｙ）。連続した１５−ｍｅｒｓは、ｎ末端の１５−ｍｅｒから出発するそれらの位置によっても名付けられる（例えば、Ｇａｇ１−１５は、１５ｍｅｒ＃１であり；Ｇａｇ５−１９は、１５ｍｅｒ＃２であるなど）。特に断りのない限り、これらのペプチドは、２μｇ／ｍｌで使用されるＴ細胞アッセイで使用された。自家Ｂリンパ芽球様細胞株（ＢＬＣＬ）は、既に記載されるように（Ｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１３），上記）、アカゲザルＰＢＭＣにヘルペスウイルスパピオを感染させることによって生成した。ＭａｍｕクラスＩ分子のための哺乳動物発現ベクターは、各々の対立遺伝子をｐＣＥＰ４ ＫｐｎＩ／ＮｏｔＩまたはＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｏｔＩ制限部位に連結することによって生成した。プラスミドをＤＨ５α大腸菌（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）でクローン化し、配列を確認し、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ＩＩ／Ｋｉｔ Ｃ（Ｌｏｎｚａ、Ａｌｌｅｎｄａｌｅ ＮＪ）を使用してＭＨＣ−Ｉ陰性Ｋ５６２、７２１．２２１、またはＲＭＡ−Ｓ（Ｋ．Ｓ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５１，３４０７（１９９３）；参照により本明細書に援用される）細胞に電気穿孔した。形質移入体は、薬剤選択（ハイグロマイシンＢ）で維持し、ｐａｎ−ＭＨＣ−Ｉ抗体クローンＷ６／３２で染色することによってＭＨＣ−Ｉの表面発現を日常的に確認した。Ｔ細胞アッセイでの使用を通じて、ＭＨＣ−Ｉ形質移入体由来のｍＲＮＡを、ＡｌｌＰｒｅｐ ＤＮＡ／ＲＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して抽出し、エキソン２内の高度多型性領域に隣接するプライマー対を使用するＲＴ−ＰＣＲによって増幅し、配列確認した。ＭＨＣ−Ｉ形質移入体およびＢＬＣＬを、終濃度１０μＭの対象のＧａｇペプチドで９０分間パルスした後、温ＰＢＳで３回、温Ｒ１０で１回洗浄して非結合ペプチドを除去した後、新しく単離されたＰＢＭＣと１０：１のエフェクター：標的比で混合した。Ｍａｍｕ−Ｅ表面発現を安定化するために、アッセイで使用する前にＭａｍｕ−Ｅ形質移入体を２７℃で３時間インキュベートし、エフェクターと混合するまでペプチドインキュベーションを通して２７℃で維持した。自家ＳＩＶ感染標的細胞は、ＰＢＭＣ由来のＣＤ４＋Ｔ細胞のＣＤ４マイクロビーズおよびＬＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）による単離、ＩＬ−２（ベンダー）、ブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ベンダー）、および抗ＣＤ３（ＮＨＰ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ）、抗ＣＤ２８、および抗ＣＤ４９ｄ ｍＡｂｓ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の組合せによる活性化、並びにスクロース精製ＳＩＶｍａｃ２３９でのスピノキュレーションとそれに続く３〜４日の培養によって生成した。Ｔ細胞アッセイで使用する前に、ＣＤ４マイクロビーズおよびＬＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して以前に記載されたようにＳＩＶ感染標的細胞を精製した（Ｊ．Ｂ．Ｓａｃｈａ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７８，２７４６（２００７）；参照により本明細書に援用される）。感染細胞調製物は、濃縮の後で９５％超のＣＤ４＋Ｔ細胞と５０％超のＳＩＶ感染であり、４０：１のエフェクター：標的比（ＰＢＭＣおよび単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞）または８：１（Ｔ細胞株エフェクター）で使用した。これらの実験では、感染していない活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞は、陰性対照ＡＰＣとして役立つ（ＳＩＶ＋ＲＭ由来の感染していない標的をテノホビル（ＮＩＨ ＡＩＤＳ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｐｒｏｇｒａｍ、濃縮）とともに培養した）。バルクＭＨＣ−ＩおよびＭＨＣ−Ｅを評価するため、ＳＩＶ感染ＣＤ４＋Ｔ細胞を感染後精製を行わずに上記のように生成し、表面ＭＨＣ−Ｉ（クローンＷ６／３２）、ＭＨＣ−Ｅ（クローン４Ｄ１２；抗マウスＩｇＧ１ Ｍ１−１４Ｄ１２）、ＣＤ３、ＣＤ４および細胞内ＳＩＶＧａｇ ｐ２７キャプシッドについて染色した。
Ｔ細胞アッセイ：免疫アッセイ用の単核細胞調製物は、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（ＧＥヘルスケア）を用いて血液から得た。精製ＣＤ８＋Ｔ細胞（＞９０％純粋）は、ＣＤ８マイクロビーズおよびＬＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用してＰＢＭＣから得た。エピトープ特異的Ｔ細胞株は、照射されペプチドでパルスされたＢＬＣＬでＰＢＭＣを刺激すること、およびその後にＩＬ−２（ベンダー）を含有する培地で毎週再刺激を実施して培養することによって調製した。ＳＩＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答は、フローサイトメトリーＩＣＳによって測定した。手短に言えば、エフェクターＴ細胞（単核細胞、単離ＣＤ８＋Ｔ細胞、またはＴ細胞株）を抗原（ペプチド、ペプチドでパルスしたＡＰＣ、またはＳＩＶ感染ＣＤ４＋Ｔ細胞）およびＣＤ２８およびＣＤ４９ｄに対する共刺激モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）とともに１時間インキュベートし、その後にブレフェルジンＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）をさらに８時間添加した。抗原の不在下（ペプチドなし、パルスしないＡＰＣ、または非感染標的）での共刺激は、バックグラウンド対照として使用した。ＭＨＣ−Ｉ形質移入体をＡＰＣとして使用する拘束アッセイでは、ペプチドでパルスしたＭＨＣ−Ｉ陰性の親細胞株Ｋ５６２または７２１．２２１細胞の存在下での共刺激は、さらなる陰性対照として使用した。示した場合、単核細胞または抗原提示細胞は、以下のブロッキング試薬とともに１時間プレインキュベートした：抗ＭＨＣ−Ｉ ｍＡｂ（クローンＷ６／３２；１０μｇ／ｍｌ）、ＣＬＩＰペプチド（ＭＨＣ−ＩＩ関連インバリアント鎖、アミノ酸８９−１００；２μｇ／ｍｌ）、ＭＨＣ−Ｅ結合ペプチドＶＬ９（ＶＭＡＰＲＴＬＬＬ；２０μＭ）、Ｍａｍｕ−Ａ１＊００１：０１結合ペプチドＣＭ９（ＣＴＰＹＤＩＮＱＭ；２０μＭ）、またはＭａｍｕ−Ａ１＊００２：０１結合ペプチドＧＹ９（ＧＳＥＮＬＫＳＬＹ；２０μＭ）。刺激した細胞を固定し、透過処理し、既に記載した通り染色し（Ｓａｃｈａ ｅｔ ａｌ，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１７８，２７４６−２７５４（２００７）；参照により本明細書に援用される）、フローサイトメトリー分析をＬＳＲ−ＩＩ計測器（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で実施した。分析は、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ）を使用し、最初に小リンパ球にゲートを設け、その後、ＣＤ３＋、次にＣＤ４−／ＣＤ８ａ＋Ｔ細胞サブセットに次第にゲートを設けた。結果として得られるＣＤ４−／ＣＤ８ａ＋集団の抗原特異的応答の頻度は、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γの細胞内発現から求めた。エピトープデコンボリューション実験には、厳密な応答判定基準を使用して偽陽性を防いだ。これらの研究では、所与の１５−ｍｅｒペプチドに対する応答は、少なくとも２つの独立したアッセイにおいてＣＤ６９＋、ＴＮＦ−α＋およびＩＦＮ−γ＋としてクラスター形成したイベントの頻度が＞０．０５％であり、バックグラウンドが＜０．０１％であった場合に陽性とみなした。図２Ａおよび６に示される、個々のペプチド応答をブロックされたとする分類は、アイソタイプ対照と比較して、封鎖による＞９０％の抑制に基づいた。部分的封鎖を定義する。これらの判定基準を満たさなかった応答は、不確定とみなした。ブロッキングによりＭＨＣ−Ｅ拘束性であるとみなされるには、個々のペプチド応答は、（１）抗ＭＨＣ−ＩクローンＷ６／３２とＭＨＣ−Ｅ結合ペプチドＶＬ９の両方によってブロックされ、かつ（２）ＣＬＩＰによってブロックされていないはずである。
抗体
以下の結合Ａｂｓをこれらの研究で使用した：ａ）ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製、Ｌ２００（ＣＤ４；ＡｍＣｙａｎ）、ＳＰ３４−２（ＣＤ３；ＰａｃＢｌｕ）、ＳＫ１（ＣＤ８ａ；ＴｒｕＲｅｄ、ＡｍＣｙａｎ）、２５７２３．１１（ＩＦＮｇ；ＡＰＣ、ＦＩＴＣ）、６．７（ＴＮＦ；ＡＰＣ）、ｂ）Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ製、Ｌ７８（ＣＤ６９；ＰＥ）。
実施例２ ＭＨＣ−Ｅの観点で対象のペプチドに特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の生成
古典的な多型性ＭＨＣ−Ｉａ分子の観点で対象の抗原由来ペプチドを認識するＴ細胞受容体は、疾患、例えば癌または感染症などの免疫治療のための自家Ｔ細胞をトランスフェクトするために使用することができる。この手法の主な障害は、ＭＨＣ−Ｉａの一致した患者に所与ＴＣＲの使用を制限するヒト集団におけるＭＨＣ−Ｉａの多様性である。非古典的な非多型性ＭＨＣ−Ｅ分子の観点で対象の抗原由来ペプチド（例えば、腫瘍抗原由来ペプチドおよび病原体由来ペプチド）を認識するＴＣＲを生成することにより、ＭＨＣ−マッチングは時代遅れとなり、結果として得られるＴＣＲは、全ての患者において使用することができる。
ＭＨＣ−Ｅ／ペプチド複合体を認識するＣＤ８＋Ｔ細胞は、実際は稀であり、対象の抗原、例えば腫瘍抗原、病原体由来抗原、組織特異的抗原、または宿主自己抗原などに対して向けられるそのようなＴ細胞を生成するための信用できる方法が現在ない。本明細書に記載される方法は、遺伝子Ｒｈ１５７．５およびＲｈ１５７．４（ＨＣＭＶ ＵＬ１２８およびＵＬ１３０のホモログ）を欠失するアカゲザルサイトメガロウイルス（ＲｈＣＭＶ）が、３０〜４０アミノ酸のタンパク質配列につき約１ペプチドエピトープの頻度でアカゲザルにおいてＭＨＣ−Ｅ拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞を誘発するという知見に基づく。対象の抗原をＵＬ１２８および１３０を欠失したＲｈＣＭＶに挿入することにより、ＭＨＣ−Ｅによって提示される個々のペプチドに対して向けられるＣＤ８＋Ｔ細胞を生成することができる。ＭＨＣ−Ｅ／ペプチドを認識するＴＣＲは、いくつかの方法のいずれによっても特定することができるが、通常、単細胞、クローン性に伸張した単細胞、またはペプチド特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のディープシーケンシングプールのｃＤＮＡからのＰＣＲによって直接的にαおよびβ鎖を配列決定することに依存する。代わりに、配列は最初に、単細胞、クローン性に伸張した単細胞、またはペプチド特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のプールの全トランスクリプトームライブラリーを作製することでＲＮＡ鋳型を伸張させることによって間接的に誘導されてよい。ペプチド特異的可変配列は、ｃＤＮＡ末端の迅速増幅（ＲＡＣＥ）またはｍＲＮＡで実施されるＲＮＡ鋳型の５’末端の切り替え機構（ＳＭＡＲＴ）のプロトコールによって生成することができる。隣接する定常領域に固定されたか、または同様に単一ペプチド反応性ＣＤ８＋細胞の全トランスクリプトームライブラリーからのＰＣＲは、直接配列決定されてもよいし、それらのそれぞれのＴＣＲ可変領域についてディープシーケンシングされてもよい。ペプチド反応性ＣＤ８＋細胞の個々のまたはプールのＴＣＲ配列に由来するα鎖とβ鎖の有効な組合せは、さらに合成することができるか、またはクローン化することができる。結果として生じるＴＣＲ構築物は、次に、Ｔ細胞にトランスフェクトすることができ、該Ｔ細胞は次に、治療（例えば、癌治療または感染症治療）として患者に投与することができる。ＴＣＲ可変領域をクローン化およびトランスフェクトする方法は、Ｂａｒｓｏｖ ＥＶ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ６，ｅ２３７０３（２０１１）でも考察され、これは参照により本明細書に援用される。
実施例３ 主要組織適合性複合体−Ｅによって拘束される広く標的化されたＣＤ８＋Ｔ細胞応答
主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）−Ｅは、主に、ＮＫＧ２／ＣＤ９４受容体との相互作用を介してＮＫ細胞反応性の調節に関与する、限られた多型をもつ、高度に保存された、広範に発現する非古典的なＭＨＣ−Ｉｂ分子である。ここで、Ｒｈ１５７．５／．４遺伝子欠失ＲｈＣＭＶベクターによるアカゲザルのプライミングは、独自に、ＭＨＣ−Ｅ機能を、全ての試験したタンパク質抗原において、高度に多様なペプチドエピトープ（１００アミノ酸につき約４つの別個のエピトープ）のＣＤ８α／β＋Ｔ細胞への提示に向ける。ＭＨＣ−Ｅは、ＮＫ細胞活性を回避するためにＨＩＶ／ＳＩＶおよびその他の持続性ウイルスに感染した細胞でアップレギュレートされるので、ＭＨＣ−Ｅ拘束性のＣＤ８＋Ｔ細胞応答は、病原体免疫回避適合（これらの非慣習的な応答に優れた有効性を与えることができる能力）を活用する可能性を有する。
細胞内病原体に対する適応細胞性免疫は、感染細胞の表面で高度に多型性のＭＨＣ−Ｉａ分子によって提示される短い（８〜１０ｍｅｒ）病原体由来ペプチドエピトープを認識するＣＤ８＋Ｔ細胞の主要な役割である（Ｎｅｅｆｊｅｓ Ｊ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １１，８２３（２０１１）およびＮｉｋｏｌｉｃｈ−Ｚｕｇｉｃｈ Ｊ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｅｓ Ｉｎｆｅｃｔ ６，５０１（２００４）；その両方が参照により本明細書に援用される）。ＭＨＣ−Ｉａ異形態は、そのペプチド結合特性が大幅に変動し、そのため、病原体特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞によって標的化される特定の病原体由来ペプチドは、感染した固体によって発現される制限された数のＭＨＣ−Ｉａ異形態のペプチド結合特異性によって主に決定される（Ｙｅｗｄｅｌｌ ＪＷ，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２５，５３３（２００６）；参照により本明細書に援用される）。したがって、同じ病原体に応答するＣＤ８＋Ｔ細胞によって認識されるエピトープは、個体全体で非常に多様である。ＣＤ８＋Ｔ細胞応答によって標的化されるエピトープの性質は、個体が様々な細胞内病原体、特に変異による免疫回避の高い固有の能力をもつＨＩＶのような病原体を排除または制御する能力に莫大な影響を有し得るので、この認識多様性は重要である（Ｎｉｋｏｌｉｃｈ Ｚｕｇｉｃｈ（２００４），上記およびＧｏｕｌｄｅｒ，Ｐ．Ｊ．ａｎｄ Ｗａｔｋｉｎｓ，Ｄ．Ｉ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ８，６１９（２００８）；参照により本明細書に援用される）。進化上の観点から、このＭＨＣ−Ｉａ多型に媒介される応答多様性は、大きな集団の少なくとも一部のメンバーが効果的なＣＤ８＋Ｔ細胞応答を支持するＭＨＣ−Ｉａ異形態を有する可能性が高いために、大きな集団が新興病原体を乗り越えて生存することを可能にする（Ｎｉｋｏｌｉｃｈ−Ｚｕｇｉｃｈ（２００４），上記およびＰｒｕｇｎｏｌｌｅ Ｆ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ １５，１０２２（２００５）；参照により本明細書に援用される）。一方、この生物学は必然的に、たとえワクチン接種した場合でさえも、所与病原体に非常に感受性が高い特定の個体を集団内にもたらし、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答に基づく、広く効果のあるワクチンを開発する努力を妨害する（Ｇｏｕｌｄｅｒ ａｎｄ Ｗａｔｋｉｎｓ（２００８），上記およびＰｉｃｋｅｒ，Ｌ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｍｅｄ ６３，９５（２０１２）；参照により本明細書に援用される）。
最近、６８−１株（線維芽細胞に適合した）ＲｈＣＭＶに基づくＳＩＶ標的化ワクチンベクターは、上記のＭＨＣ−Ｉａ拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞認識の規則に著しく反し（Ｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１３），上記）、ＣＤ８＋Ｔ細胞を標的化したワクチン接種においてＭＨＣ−Ｉａ依存性の応答多様性に有望な解決策を提供することが報告された。アカゲザルにおいて、ＲｈＣＭＶ／ＳＩＶベクターは、高病原性のＳＩＶの負荷からの深い保護を提供し、感染のストリンジェントな制御および究極のクリアランスをもたらす（Ｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０１１），上記およびＨａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ（２０１３），上記）。これらのベクターは、同じＳＩＶタンパク質を発現する従来のワクチンの３倍多くエピトープに応答するにもかかわらず、従来のＭＨＣ−Ｉａ拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞と全く重複していないＳＩＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘発する。このエピトープの重複がないことは、これらのエピトープの多くが、ＭＨＣ−ＩａよりもむしろＭＨＣ−ＩＩ分子によって拘束されたという知見によって一部説明された。これは、稀であるが、ＣＤ８＋Ｔ細胞によるエピトープ認識の前例のないモードであった（Ｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１３），上記）。また、株６８−１ ＲｈＣＭＶ／ＳＩＶｇａｇベクターは、ほとんどのまたは全てのＭＨＣの異なるマカクにさえ共通する、複数のＭＨＣ−Ｉ依存性エピトープ（例えば、抗ＭＨＣ−Ｉ抗体によって完全にブロックされた応答）を認識したＣＤ８＋Ｔ細胞も誘発した。これは、ＭＨＣ−Ｉａ拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞応答には前例のないほどの交差認識であった。実際に、これまでの報告でＳＩＶｇａｇタンパク質の２つのエピトープ（ＳＩＶｇａｇ２７６−２８４およびＳＩＶｇａｇ４８２−４９０）が、４２匹の株６８−１ ＲｈＣＭＶ／ＳＩＶｇａｇベクターで免疫したサルのうちの４２匹によって標的化され（Ｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１３），上記）、このベクターを接種した１２０匹のサルのうちの１２０匹での、これらの２つの９ｍｅｒエピトープに対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答が文書化されている（図１４）。
この異常に万能なＭＨＣ−Ｉ依存性認識の基礎を理解するために、４匹の株６８−１ ＲｈＣＭＶ／ＳＩＶｇａｇベクターを接種したサルを、詳細なＭＨＣ−Ｉ拘束分析に選択した。これらのマカクは、ＳＩＶｇａｇに対する強い、非慣習的なＭＨＣ−Ｉ依存性ＣＤ８＋Ｔ細胞応答（ＳＩＶｇａｇ２７６−２８４およびＳＩＶｇａｇ４８２−４９０スーパートープへの応答、ならびに１０のその他の一般に認識される応答を含む）を示した。発現したＭＨＣ−Ｉ遺伝子、古典的ＭＨＣ−Ｉａと非古典的ＭＨＣ−Ｉｂの両方（Ｗｉｓｅｍａｎ，Ｒ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ １５，１３２２（２００９）；参照により本明細書に援用される）は、各々のサルで配列決定され、これらのＭＨＣ−Ｉ分子を単独で発現するＭＨＣ−Ｉ形質移入体のパネルを個別に構築した（図１５）。これらの単一ＭＨＣ−Ｉ分子形質移入体を、次に、フローサイトメトリー細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）アッセイで使用して、エピトープの１５ｍｅｒペプチドを、株６８−１ ＲｈＣＭＶ／ＳＩＶｇａｇベクターに誘導されるこれらのサル由来のＣＤ８＋Ｔ細胞に提示した（親ＭＨＣ−Ｉ陰性細胞株と自家Ｂリンパ芽球様細胞株を、それぞれ陰性および陽性対照として使用）（図１１Ａ、１１Ｂ；および１６）。注目すべきことには、古典的ＭＨＣ−Ｉａ異形態は、これらのＴ細胞に１２のエピトープペプチドのうちの３つしか提示できず（Ｍａｍｕ−Ａ１＊００１：０１：ＳＩＶｇａｇ６９−８３（１８）およびＳＩＶｇａｇ１９７−２１１（５０）；Ｍａｍｕ−Ａ１＊００２：０１：ＳＩＶｇａｇ１２９−１４３（３３））、サルにおけるこれらの異形態の発現は、これらのエピトープ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答と一致しなかった（例えば、これらの異形態を欠く多くのサルは、依然としてこれらの３つのペプチドを認識することができた；図１７）。しかし、全ての１２のエピトープエペプチドは、非古典的ＭＨＣ−Ｅ分子によって提示されない場合に、全てのサル由来のＣＤ８＋Ｔ細胞を刺激し、実際に、この分子のヒトバージョンを発現する形質移入体（ＨＬＡ−Ｅ＊０１：０３）によって応答が始まったのと同様に、これらの対立遺伝子を発現したサルから応答が始まったのかどうかとは無関係に、３つの異なるアカゲザルＭＨＣ−Ｅ異形態を発現する形質移入体（Ｍａｍｕ−Ｅ０２：０４、−Ｅ０２：１１、および−Ｅ０２：２０）で全てのペプチドが提示された（図１１Ａ、１１Ｂ、１６および１８）。
ＭＨＣ−Ｅは、ＮＫ細胞のＮＫＧ２Ａ（および、程度は少ないが、ＮＫＧ２Ｃ）分子に提示するためのＭＨＣ−Ｉａリーダー配列の３〜１１位に由来する標準的なＶＭＡＰＲＴＬ（ＬＶＩ）Ｌペプチドおよびその他の密接に関連した９ｍｅｒペプチドと貪欲に結合することが公知である（Ｌｅｅ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６０，４９５１（１９９８）；Ｂｒａｕｄ，Ｖ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３９１，７９５（１９９８）；Ｓｕｌｌｉｖａｎ，Ｌ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ ７２，４１５（２００８）；およびｖａｎ Ｈａｌｌ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｅｓ Ｉｎｆｅｃｔ １２，９１０（２０１０）；その全てが参照により本明細書に援用される）。この高度に保存された相互作用は、細胞が正常なレベルのＭＨＣ−Ｉａを発現する場合に、主に抑制シグナルをＮＫ細胞に送達する。しかし、ウイルス感染または悪性形質転換によってＭＨＣ−Ｉａ生合成を干渉する際に、この抑制シグナルは減少し、ウイルス感染細胞または新生細胞に応答してＮＫ細胞活性化を促進する（Ｌｏｄｏｅｎ，Ｍ．Ｂ．ａｎｄ Ｌａｎｉｅｒ，Ｌ．Ｌ Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ３，５９（２００５）およびＷｉｅｔｅｎ Ｌ ｅｔ ａｌ．，Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ ８４，５２３（２０１４）；その両方が参照により本明細書に援用される）。ＣＤ８＋Ｔ細胞のサブセットもＮＫＧ２Ａおよび／またはＮＫＧ２Ｃを発現するが（Ａｒｌｅｔｔａｚ Ｌ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３４，３４５６（２００４）；参照により本明細書に援用される）、ＭＨＣ−Ｅ依存性の株６８−１ ＲｈＣＭＶ／ＳＩＶｇａｇベクターに誘発されるＣＤ８＋Ｔ細胞の表現型分析により、応答細胞の大部分が、ＮＫＧ２ＡとＮＫＧ２Ｃの両方の発現を欠くＣＤ８α／β＋、ＴＣＲγ／δ−Ｔ細胞（図１１Ｃおよび１９）であったことが明らかになった。さらに、特異的ペプチドの添加の前にＭＨＣ−Ｅ形質移入体またはＰＢＭＣを標準的なＭＨＣ−Ｅ結合ＶＭＡＰＲＴＬＬＬ（ＶＬ９）ペプチドとともにプレインキュベーションすることにより、全ての１２ペプチドのＣＤ８＋Ｔ細胞認識が特異的にブロックされ（図１１Ｄおよび２０）、これらのペプチドのＴ細胞認識が、ペプチドを添加したＭＨＣ−Ｅと結合するＮＫＧ２Ａ／Ｃに媒介されるのではなく、むしろ抗原特異的Ｔ細胞へのＭＨＣ−Ｅ拘束性エピトープ提示を反映することが示唆される。実際に、調査した親１５ｍｅｒｓの各々は、親１５ｍｅｒに応答をする、異なる株６８−１ ＲｈＣＭＶ／ＳＩＶｇａｇベクターを接種したサルの間で一般的な、最適な９ｍｅｒペプチドに末端を切断されることがあり得る（図２１）（Ｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１３），上記）。これらの最適な９ｍｅｒｓは、古典的なＭＨＣ−Ｉａ拘束性エピトープのＴ細胞認識に匹敵する機能的結合活性である（Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ ＤＨ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ ８，４９３（２００２）；参照により本明細書に援用される）、１ｎＭ未満の用量でＭａｍｕ−Ｅ形質移入体をパルスした場合に（図２２）、これらのサル由来のＣＤ８＋Ｔ細胞を誘発することができた。まとめると、これらのデータは、株６８−１ ＲｈＣＭＶ／ＳＩＶｇａｇベクターにより誘発される非慣習的なＭＨＣ−Ｉ依存性ＣＤ８＋Ｔ細胞が、主にＭＨＣ−Ｅによって拘束されるが、一部の例では、従来のＭＨＣ−Ｉａ異形態でその特異的ペプチドも認識することもできる、ＳＩＶｇａｇ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞であることを強く示唆する。
ＭＨＣ−Ｅ拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞応答は、これまでにＨＣＭＶ、Ｃ型肝炎ウイルス、結核菌、およびサルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ）感染において同定されており、典型的には、標準的なＭＨＣ−Ｉａリーダー配列ペプチドに構造的に関連があるが、宿主にとって異質であるエピトープを含む（Ｓｕｌｌｉｖａｎ（２００８），上記；ｖａｎ Ｈａｌｌ（２０１０），上記；Ｐｉｅｔｒａ Ｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２０１０，９０７０９２（２０１０）；およびＣａｃｃａｍｏ Ｎ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４５，１０６９（２０１５）；その全てが参照により本明細書に援用される）。ＭＨＣ−Ｅが異なる設定でＳＩＶｇａｇに対する応答を拘束する程度を求めるため、高親和性ＭＨＣ−Ｅ結合ペプチドＶＬ９によるブロッキング（抗ＭＨＣ−ＩＩ ＣＬＩＰペプチドおよび抗ＭＨＣ Ｉ ｍＡｂ Ｗ６／３２によるブロッキングと併せて）を使用して、株６８−１ ＲｈＣＭＶ／ＳＩＶｇａｇベクター（Ｒｈ１５７．５／．４遺伝子欠失）、株６８−１．２ＲｈＣＭＶ／ＳＩＶｇａｇベクター（Ｒｈ１５７．５／．４−無傷）、ΔＲｈ１５７．５／．４株６８−１．２ＲｈＣＭＶ／ＳＩＶｇａｇベクター（Ｒｈ１５７．５／．４遺伝子を特異的に再欠失；図２３）、および改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）／ＳＩＶｇａｇベクターを接種したサル、ならびにＳＩＶ自体に感染させたサル（図１２、２４および２５）における全てのＳＩＶｇａｇエピトープ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を拘束分類した。この分析により、株６８−１ ＲｈＣＭＶ／ＳＩＶｇａｇベクターおよびΔＲｈ１５７．５／．４ 株６８−１．２ＲｈＣＭＶ／ＳＩＶｇａｇベクターを接種したサルにおける本質的に全てのＳＩＶｇａｇエピトープ特異的応答が、ＣＬＩＰペプチドによるかまたは抗ＭＨＣ−Ｉ ｍＡｂ Ｗ６／３２とＶＬ９ペプチドの両方によって＞９０％ブロックされたことが明らかになり、Ｒｈ１５７．５／．４を欠損したＲｈＣＭＶによって誘発される非慣習的なＴ細胞応答が、効果的に完全にＭＨＣ−ＩＩ拘束性かまたはＭＨＣ−Ｅ拘束性のいずれかのＣＤ８＋Ｔ細胞のものであることが実証される。
対照的に、全てのＳＩＶｇａｇ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答は、ＭＶＡ／ＳＩＶｇａｇベクターを接種したマカクおよび６８−１．２株（Ｒｈ１５７．５／．４を発現する）ＲｈＣＭＶ／ＳＩＶｇａｇベクターを接種したマカクにおいて、ｍＡｂ Ｗ６／３２によってブロックされたが、ＶＬ９ペプチドにはブロックされず、古典的なＭＨＣ−Ｉａの拘束が示される。これはまた、４つのＭＨＣ−ＩＩ拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を除いて、ＳＩＶ感染マカクにおけるＣＤ８＋Ｔ細胞応答の９８％の例であった。Ｒｈ１５７．５／．４を欠損したＲｈＣＭＶベクターが、ＭＨＣ−Ｅ拘束性およびＭＨＣ−ＩＩ拘束性のＣＤ８＋Ｔ細胞を誘発する能力は、ＳＩＶｇａｇ特異的応答に限定されない。ＭＨＣ−Ｅ−およびＭＨＣ−ＩＩ拘束性の抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答の同様の混合は、ＳＩＶｐｏｌ９７−４４１、結核菌タンパク質（Ａｇ８５Ｂ、ＥＳＡＴ６およびＲｐｆＡ）をコードする６８−１株（Ｒｈ１５７．５／．４欠損）ＲｈＣＭＶベクター、ならびに最初期（Ｉｍｍｅｄｉａｔｅ Ｅａｒｌｙ）−１（ＩＥ１）タンパク質などの固有のＲｈＣＭＶタンパク質に観察された（図１２Ｂおよび２６）。
株６８−１ ＲｈＣＭＶ／ＳＩＶベクターに誘発されるＣＤ８＋Ｔ細胞が、自家ＳＩＶ感染ＣＤ４＋Ｔ細胞を認識すること、およびこの認識が抗ＭＨＣ−Ｉ ｍＡｂ Ｗ６／３２およびＭＨＣ−ＩＩ−ブロッキングＣＬＩＰペプチドにより部分的にブロックされることは既に報告されている（Ｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１３），上記）。この認識のＭＨＣ−Ｉ成分に対するＭＨＣ−Ｅ拘束の寄与を求めるために、これらの応答をブロックする際にｍＡｂ Ｗ６／３２の代わりに高親和性ＭＨＣ−Ｅ結合ＶＬ９ペプチドを置換することができるかどうかを尋ねた。この実験は、ＭＨＣ−ＩＩ−ブロッキングＣＬＩＰペプチドと、ｍＡｂ Ｗ６／３２かまたはＶＬ９ペプチドのいずれかとの組合せが、これらの応答を完全にブロックすることを実証したが、ＭＶＡ／ＳＩＶｇａｇベクターまたは株６８−１．２ＲｈＣＭＶ／ｇａｇベクターによるワクチン接種またはＳＩＶ感染によって誘発されるＳＩＶｇａｇ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞によるＳＩＶ感染自家細胞認識は、ＣＬＩＰ＋ＶＬ９ペプチドの組合せに非感受性であった（図１２Ｃ）。まとめると、これらのデータにより、株６８−１ ＲｈＣＭＶベクターは、ＭＨＣ−ＩＩかまたはＭＨＣ−Ｅのいずれかに拘束されるＣＤ８＋Ｔ細胞応答を独特に誘発すること、およびこの珍しい免疫生物学は、ＨＣＭＶ ＵＬ１２８／ＵＬ１３０遺伝子のオーソログであり、非線維芽細胞のＣＭＶ感染に関与する五量体の受容体複合体の２つの成分をコードする、ＲｈＣＭＶ Ｒｈ１５７．５／．４遺伝子（Ｌｉｌｊａ ＡＥ ａｎｄ Ｓｈｅｎｋ Ｔ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．１０５，１９９５０（２００８）；参照により本明細書に援用される）の欠失の特異的な結果であることが確認される。さらに、これらのデータにより、これらのＭＨＣ−Ｅ拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞によって認識される少なくとも一部のエピトープが、自然にプロセシングされ、ＳＩＶ、つまり異種（非ＣＭＶ）病原体に感染した細胞によって提示されることが確認される。
４２匹の株６８−１ ＲｈＣＭＶ／ＳＩＶｇａｇベクターを接種したサルの中で、動物あたりの別個のＣＤ８＋Ｔ細胞に認識されるＭＨＣ−Ｅ拘束性のＳＩＶｇａｇ １５ｍｅｒエピトープの中央値２０が特定され、この幅は、従来のワクチンまたはＳＩＶ感染によってそれぞれ誘発されたＳＩＶｇａｇ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答の範囲内で特定された別個のＭＨＣ−Ｉａ拘束性のＳｌＶｇａｇ特異的エピトープの中央値１１および１４．５を上回る（図１３Ａ）。ＭＨＣ−Ｅ拘束性エピトープの密度（タンパク質長１００アミノ酸あたり約４の独立したＭＨＣ−Ｅ拘束性エピトープ）は、分析された抗原の性質にかかわらず、全ての株６８−１ ＲｈＣＭＶベクターに誘発されたＣＤ８＋Ｔ細胞応答の間で類似している（図１３Ｂ）。特に、同じ４２匹の株６８−１ ＲｈＣＭＶ／ＳＩＶｇａｇベクターを接種したマカクの中で、１２５の重複するＳＩＶｇａｇ １５ｍｅｒペプチドのうちの１０９（８７％）が、少なくとも１匹のマカクにおいてＭＨＣ−Ｅ拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞によって認識された（図１３Ｃ）。ＭＨＣ−Ｅは、標準的なリーダー配列ペプチドよりも広範囲のペプチドと結合することが既に示されているが（ｖａｎ Ｈａｌｌ（２０１０），上記およびＬａｍｐｅｎ ｅｔ ａｌ．，上記）、観察されたエピトープの多様性および幅の程度は、特にＭＨＣ−Ｅの限られた多型と、これまでに試験した全てのＭＨＣ−Ｅ拘束性エピトープの提示がこの限られた配列多型ならびにＭａｍｕ−ＥとＨＬＡ−Ｅの配列の相違と無関係であるという知見を考えると、非常に驚くべきものである（図１１Ｂ、１８および２２）。これらのデータは、ＭＨＣ−Ｅに媒介されるエピトープ提示（例えば、ＭＨＣ−Ｅペプチド結合）が、これまでに考えられていたよりもさらに多様であることを示唆する。これに合わせて、１１個の最適なＭＨＣ−Ｅ拘束性ＳＩＶｇａｇ ９ｍｅｒエピトープの配列分析は、１つのエピトープ（Ｇａｇ２７３−２８７スーパートープ）だけが規準的な（Ｍが位置２にあり：Ｌが位置９にある）ＭＨＣ−Ｅ−結合モチーフをもつことを示したが、その他の１０個の最適なエピトープは、このモチーフを欠くだけでなく、これまでに特徴づけたＭＨＣ−Ｅ結合ペプチドの組との統計学的に有意なオーバーラップを示さなかった（Ｌａｍｐｅｎ ｅｔ ａｌ．，上記）（図１３Ｄ）。実際に、その他のＳＩＶｇａｇ４８２−４９０スーパートープは、位置２と９の両方にリジンをもつ抗ＭＨＣ−Ｅペプチド結合モチーフとみなされ得るものを示した（図１３Ｄ）。エピトープペプチドをＭＨＣ−Ｅに添加および結合するための分子機構は、参照により本明細書に援用される、２０１６年１月２１日に電子出版された、Ｈａｎｓｅｎ，Ｓ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．，「Ｂｒｏａｄｌｙ ｔａｒｇｅｔｅｄ ＣＤ８＋ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ ｂｙ ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ Ｅ」，Ｓｃｉｅｎｃｅにおいて考察されている。
ＨＣＭＶとＲｈＣＭＶの両方が、それぞれ、ＵＬ４０およびＲｈ６７遺伝子の中に標準的なＶＬ９ペプチドを戦略的に埋め込んだタンパク質をコードする（Ｐｒｏｄ’ｈｏｍｍｅ，Ｖ． ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １８８，２７９４（２０１２）およびＲｉｃｈａｒｄｓ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８５，８７６６（２０１１）；その両方が参照により本明細書に援用される）。ＵＬ４０のＶＬ９ペプチドは、ＴＡＰ非依存性機構によって新生ＭＨＣ−Ｅ鎖に搭載されることが示され、そのため、ウイルスに媒介されるＴＡＰ抑制およびＨＣＭＶ ＵＳ２−１１遺伝子産物によって媒介される深いＭＨＣ−Ｉａのダウンレギュレーションにもかかわらず、ＨＣＭＶ−感染細胞においてＭＨＣ−Ｅ発現を安定化しアップレギュレートするように機能する（Ｌｏｄｏｅｎ＆Ｌａｎｉｅｒ（２００５），上記およびＰｒｏｄ’ｈｏｍｍｅ（２０１２），上記）。同様の機能は、ＲｈＣＭＶ Ｒｈ６７にも起こりうる（Ｒｉｃｈａｒｄｓ（２０１１），上記）。ＭＨＣ−Ｅのアップレギュレーションは、そのため、ＭＨＣ−Ｉａ発現を欠く感染細胞へのＮＫ細胞応答を回避するための主要なウイルス戦略であると考えられる。しかし、この回避戦略は、ウイルス感染細胞におけるＭＨＣ−Ｅ発現を増強する結果となり、新規なペプチドをＭＨＣ−Ｅに拘束されるＴ細胞に搭載および提示するための機会を増加させる。この点で、標準的なＭＨＣ−Ｅ結合ＶＬ９ペプチドは、インバリアント鎖に関連するＣＬＩＰペプチドおよびＭＨＣ−ＩＩに類似して、ＭＨＣ−Ｅの安定した高い発現およびペプチド交換を促進するエンドソーム区画への送達を促進するシャペロンとして機能し得る。そのようなペプチド交換機構に一致して、ＭＨＣ−Ｅペプチドの搭載は、結核菌ファゴリソソームで直接実証された（Ｇｒｏｔｚｋｅ ＪＥ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇ ５，ｅ１０００３７４（２００９）；参照により本明細書に援用される）。
ＣＭＶは、ＭＨＣ−Ｅ発現をアップレギュレートする唯一の細胞内病原体ではない。Ｃ型肝炎は、ＭＨＣ−Ｅ発現をアップレギュレートするＭＨＣ−Ｅ−結合ペプチドもコードし（Ｎａｔｔｅｒｍａｎ Ｊ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １６６，４４３（２００５）；参照により本明細書に援用される）、ＨＩＶとＳＩＶの両方が、ＭＨＣ−Ｉａダウンレギュレーションと協調して、特徴づけられていない機構によってＭＨＣ−Ｅをアップレギュレートする（Ｎａｔｔｅｒｍａｎ Ｊ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｖｉｒ Ｔｈｅｒ １０，９５（２００５）；参照により本明細書に援用される）（図２７）。おそらくＭＨＣ−Ｅ拘束性のＣＤ８＋Ｔ細胞がこれらの病原体による感染中にあまり十分に刺激されないために、この共同の適合は、これらおよびありそうなその他の細胞内病原体に対して、ＮＫ細胞応答に対抗するためにＭＨＣ−Ｅをアップレギュレートするという進化上の圧力が、ＭＨＣ−Ｅ拘束性のＣＤ８＋Ｔ細胞に対する感受性の増加という潜在的なリスクよりも重大であることを示唆する。ＭＨＣ−Ｅ拘束性のＣＤ８＋Ｔ細胞応答が、現代の哺乳動物免疫系のそのような小さい成分である理由は、特に、そのような応答は極めて多様かつ広範であり得る（しかし、議論の余地はあるかもしれないが、多型性ＭＨＣ−１ａほど集団レベルで多様でなく広範でない；図２８）というこの報告書での知見を考えると、不明である。しかし、Ｒｈ１５７．５／．４遺伝子欠失ＲｈＣＭＶベクターは、ＭＨＣ−Ｅ拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞のプライミングの固有の制約を回避することができる。この回避が達成される機構はまだ解明されていないが、広範で多様でＭＨＣ−Ｉａハプロタイプ非依存性のＣＤ８＋Ｔ細胞応答を強く誘発するこれらのベクターの能力は、多くの高度に適合された持続性病原体の免疫回避戦略の内在的な脆弱性である、ＭＨＣ−Ｅアップレギュレーションを活用する、ＭＨＣ−Ｅ拘束性のＣＤ８＋Ｔ細胞標的化ワクチンを開発する機会をもたらす。さらに、制限されたＭＨＣ−Ｅ多型のために、ＭＨＣ−Ｅ拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞応答標的化ワクチンは、全てまたは大部分のワクチンにおいて主に類似した応答を誘発することになり、ＭＨＣ遺伝子型に関係なく全ての個体において有効性をもたらす可能性がある。進化は、ＭＨＣ−Ｅを多型性のＭＨＣ−Ｉａ系の代わりの現代の哺乳動物のＣＤ８＋Ｔ細胞の一次拘束分子として嫌うかもしれないが、ＨＣＭＶベクターが、マカクにおけるＲｈ１５７．５／．４遺伝子欠失ＲｈＣＭＶベクターの生物学をヒトにおいて再現することができるならば（あるいは、広範に標的化されたＭＨＣ−Ｅ拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘発する非ＣＭＶに基づく戦略を開発することができるならば）、ワクチン学者は、この休止状態のＭＨＣ−Ｅに基づく適応免疫系を復活させて、病原体が効果的に回避するよう適合されていない新規な免疫応答で病原体を攻撃することができる可能性がある。
材料および方法：
ワクチン：１）ＳＩＶＧａｇおよび５’−Ｐｏｌを発現する株６８−１ ＲｈＣＭＶベクター、２）ＳＩＶＧａｇを発現する株６８−１．２ＲｈＣＭＶベクター、３）ＳＩＶ Ｇａｇを発現するＭＶＡおよびアデノウイルス５（Ａｄ５）ベクター、および４）ＳＩＶ ＧａｇをコードするＤＮＡ＋ＩＬ−１２ワクチンの構成、特徴づけ、および投与は既に報告されている（Ｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１３），上記；Ｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０１１），上記；Ｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ（２０１３），上記；およびＨａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００９），上記）。ＭＣＭＶ ＩＥプロモーターに推進され、Ｒｈ２１１の５’領域に挿入された、結核菌遺伝子産物ＲｐｆＡ、ＲｐｆＣおよびＲｐｆＤの融合タンパク質を発現するＲｈＣＭＶ ６８−１株は、Ａｅｒａｓ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）により提供された。株６８−１．２ＲｈＣＭＶ／ｇａｇに基づくＲｈ１５７．５（ＵＬ１２８）−Ｒｈ１５７．４（ＵＬ１３０）二重欠失変異株も、相同組換えによって構築した。これを達成するために、標的領域に隣接する組換えプライマー（変異原性フォワードプライマー５’−ＡＡＡＡＣＴＡＴＡＡＴＣＡＡＣＡＡＣＴＣＴＡＴＡＣＣＴＴＴＧＴＴＴＴＧＣＴＧＡＴＧＣＴＡ ＴＴＧＣＧＴ−３’および変異原性リバースプライマー５’−ＡＴＴＴＴＴＣＧＡＴＡＡＡＡＡＡＡＴＣＡＣＡＧＣＡＡＡＣＡＴＡＣＴＧＧＴＴＴＴＡＣＡＣＡＣＴＴＴＡＴ−３’）を設計した。Ｒｈ１５７．６（ＵＬ１３１Ａ）およびＲｈ１５７．４（ＵＬ１３０）オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）はＲｈＣＭＶで重複するので、コードされたタンパク質の発現を確実にするために、追加の５０ｂｐを加えてＲｈ１５７．６（ＵＬ１３１Ａ）ＯＲＦの末端を保持するように欠失を構築した。ミニプラスミドＲ６Ｋ−ｋａｎ−Ｆ５を使用して、変異原性プライマーの３’末端に加えられたフォワードプライマー結合部位（５’−ＧＡＡＡＡＧＴＧＣＣＡＣＣＴＧＣＡＧＡＴ−３’）およびリバースプライマー結合部位（５’−ＣＡＧＧＡＡＣＡＣＴＴＡＡＣＧＧＣＴＧＡ−３’）を使用して、代わりの（Ｆ５）ＦＲＴ部位に隣接しているカナマイシン耐性カセットを増幅させた。大腸菌株ＳＷ１０５でのＥ／Ｔ相同組換え（Ｗａｒｍｉｎｇ Ｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３３，ｅ３６（２００５）；参照により本明細書に援用される）を、他所で公開される通り実施した（Ｍｕｙｒｅｒｓ ＪＰ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２７，１５５５（１９９９）；参照により本明細書に援用される）。標的化したＯＲＦの欠失の成功は、欠失遺伝子および隣接遺伝子に特異的なプライマーを用いて感染細胞のウイルスＤＮＡおよびｃＤＮＡでポリメラーゼ連鎖反応を実施することによって確認した。ＳＩＶｍａｃ２３９ｇａｇ導入遺伝子の発現は、ΔＲｈ１５７．５（ＵＬ１２８）−Ｒｈ１５７．４（ＵＬ１３０）６８−１．２ＲｈＣＭＶ／ｇａｇベクターで感染させたアカゲザル初代線維芽細胞の免疫ブロット分析によって確認した。６８−１株、６８−１．２、およびΔＲｈ１５７．５／Ｒｈ１５７．４（ΔＵＬ１２８／ＵＬ１３０）ＲｈＣＭＶベクター間のゲノムの違いの描写については図２３を参照されたい。
アカゲザル：合計２０７匹のインドの遺伝的背景のパーパスブレッドの雄または雌アカゲザル（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ）をこの実施例で報告される実験に使用した。そのうちの８８匹はこれまでの報告でも研究された（Ｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１３），上記）。これらのマカクには、ＳＩＶｇａｇ、ＳＩＶ５’−ｐｏｌ、ＴＢ−ＥＳＡＴ−６／Ａｇ８５ＢまたはＴＢ−ＲｐｆＡ／ＲｐｆＣ／ＲｐｆＤ挿入物を発現する株６８−１ ＲｈＣＭＶベクターを接種した１５９匹のマカク（６２匹は以前に報告済み）；株６８−１．２ＲｈＣＭＶ／ｇａｇベクターを接種した９匹のマカク（６匹は以前に報告済み）；ΔＲｈ１５７．５／．４欠失株６８−１．２ＲｈＣＭＶ／ｇａｇベクターを接種した４匹のマカク（以前に報告済みのものはなし）；ＳＩＶｇａｇを発現するＭＶＡ／ｇａｇ、Ａｄ５／ｇａｇ、およびＤＮＡ／ｇａｇ＋ＩＬ−１２ワクチンをそれぞれ接種した１１匹、３匹、および４匹のマカク（それぞれ３匹、全て、および全てが以前に報告済み）；１３匹の、制御されたＳＩＶｍａｃ２３９に感染した、ワクチン非接種マカク（定常期血漿ウイルス負荷量＜１０，０００コピー／ｍｌ；６匹は以前に報告済み）；および４匹の、ＲｈＣＭＶのＯＮＰＲＣコロニー循環株に自然感染した非接種マカク（全て以前に報告済み）が含まれた。全てのマカクは、米国国立衛生研究所の実験動物の管理と使用に関する指針の基準の下、オレゴン国立霊長類研究センター施設内実験動物委員会の承認を得て使用した。これらの実験で使用されたマカクは、オナガザルヘルペスウイルス１、Ｄ型サルレトロウイルス、およびサルＴリンパ増殖性ウイルス１型を含まなかった。選択されたマカクは、記載されるようにディープシーケンシングによってＭＨＣ−Ｉ遺伝子型を同定した（Ｗｉｓｅｍａｎ（２００９），上記）。手短に言えば、ＭａｍｕクラスＩ配列のアンプリコンを、高忠実度Ｐｈｕｓｉｏｎ（商標）ポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）および一対の万能ＭＨＣ−Ｉ特異的プライマーを以下の熱サイクル条件で使用して、ＰＣＲによるｃＤＮＡの増幅によって生成した：９８℃で３分間、（９８℃で５秒間、５７℃で１秒間、７２℃で２０秒間）を２３サイクル、および７２℃で５分間。各々のＰＣＲプライマーは、特有の１０ｂｐ多重識別子（ＭＩＤ）タグを、４５４シーケンシング（商標）のアダプター配列（５’−ＧＣＣＴＣＣＣＴＣＧＣＧＣＣＡＴＣＡＧ−ＭＩＤ−ＧＣＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＡＣＡＣＧ−３’；５’−ＧＣＣＴＴＧＣＣＡＧＣＣＣＧＣＴＣＡＧ−ＭＩＤ−ＴＣＧＣＴＣＴＧＧＴＴＧＴＡＧＴＡＧＣ−３’）とともに含んだ。結果として生じるアンプリコンは、エキソン２内の高度多型性領域の１９０ｂｐに及ぶ。一次ｃＤＮＡ−ＰＣＲ産物は、ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ磁性ビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）を用いて精製した。エマルジョンＰＣＲおよびパイロシーケンシング手順は、製造業者の説明書に従ってゲノムシーケンサーＦＬＸ機器（Ｒｏｃｈｅ／４５４ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で実行した。データ分析は、Ｌａｂｋｅｙデータベースを、配列アセンブリのためのＧｅｎｅｉｏｕｓ−Ｐｒｏ（登録商標）生物情報科学ソフトウェア（Ｂｉｏｍａｔｔｅｒｓ Ｌｔｄ．）と組み合わせて用いて実施した。
抗原および抗原提示細胞：ＳＩＶｇａｇおよびｐｏｌ、ＲｈＣＭＶ ＩＥ１、およびＴＢ Ａｇ８５Ｂ、ＥＳＡＴ−６、およびＲｐｆＡタンパク質、ならびに特異的９−１４ｍｅｒペプチドをこれらのタンパク質に含む、連続した１５−ｍｅｒペプチド（１１アミノ酸がオーバーラップ）の合成は、Ｉｎｔａｖｉｓ ＡＧによって、ＳＩＶｍａｃ２３９ ＧａｇおよびＰｏｌ配列（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｍ３３２６２）、株６８−１ ＲｈＣＭＶＩＥ−１配列（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＹ１８６１９４）、またはＥｒｄｍａｎ株結核菌Ａｇ８５Ｂ、ＥＳＡＴ−６、およびＲｐｆＡ配列（それぞれ、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＢＡＬ６５８７１．１；ＢＡＬ６８０１３．１；およびＢＡＬ６４７６６．１）に基づいて実施した。全てのペプチドは、Ｎ末端からそれらの含むアミノ酸の位置によって同定される（例えば、Ｇａｇｘｘ−ｙｙ）。連続した１５ｍｅｒｓは、Ｎ末端の１５ｍｅｒから出発するその位置によっても名付けられる（例えば、Ｇａｇ１−１５（１）は、１５ｍｅｒ＃１であり；Ｇａｇ５−１９（２）は、１５ｍｅｒ＃２であるなど）。特に断りのない限り、これらのペプチドは、Ｔ細胞アッセイで２μｇ／ｍｌで使用された。自家Ｂリンパ芽球様細胞株（ＢＬＣＬ）は、前述のように（Ｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１３），上記）、アカゲザルＰＢＭＣにヘルペスウイルスパピオを感染させることによって生成した。ＭａｍｕクラスＩ分子のための哺乳動物発現ベクターは、各々の対立遺伝子をｐＣＥＰ４ ＫｐｎＩ／ＮｏｔＩまたはＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｏｔＩ制限（Ｕｌｂｒｅｃｈｔ Ｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６４，５０１９（２０００）；参照により本明細書に援用される）部位に連結することによって生成した。プラスミドをＤＨ５α大腸菌（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でクローン化し、配列を確認し、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ＩＩ／Ｋｉｔ Ｃ（Ｌｏｎｚａ）を使用してＭＨＣ−Ｉ陰性Ｋ５６２、７２１．２２１、またはＲＭＡＳ細胞（Ａｎｄｅｒｓｏｎ ＫＳ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５１，３４０７（１９９３）；参照により本明細書に援用される）に電気穿孔した。形質移入体は、薬剤選択（ハイグロマイシンＢ）で維持し、ｐａｎ−ＭＨＣ−Ｉ抗体クローンＷ６／３２で染色することによってＭＨＣ−Ｉの表面発現を日常的に確認した。Ｔ細胞アッセイでの使用を通じて、ＭＨＣ−Ｉ形質移入体由来のｍＲＮＡは、ＡｌｌＰｒｅｐ ＤＮＡ／ＲＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して抽出され、エキソン２内の高度多型性領域に隣接するプライマー対を使用するＲＴ−ＰＣＲによって増幅され、配列確認された。ＭＨＣ−Ｉ形質移入体およびＢＬＣＬを、終濃度１０μＭの対象のペプチドで９０分間パルスした後、温ＰＢＳで３回、１０％ウシ胎児血清を含む温ＲＰＭＩ１６４０培地で１回洗浄して非結合ペプチドを除去した後、新しく単離されたＰＢＭＣと１０：１のエフェクター：標的比で混合した。Ｍａｍｕ−Ｅ表面発現を安定化するために、アッセイで使用する前にＭａｍｕ−Ｅ形質移入体を２７℃で３時間を超えてインキュベートし、エフェクターと混合するまでペプチドインキュベーションを通して２７℃で維持した。自家ＳＩＶ感染標的細胞は、ＰＢＭＣ由来のＣＤ４＋Ｔ細胞のＣＤ４マイクロビーズおよびＬＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）による単離、ＩＬ−２（ＮＩＨ ＡＩＤＳ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｐｒｏｇｒａｍ）、ブドウ球菌エンテロトキシンＢ（Ｔｏｘｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）、および抗ＣＤ３（ＮＨＰ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ）、抗ＣＤ２８、および抗ＣＤ４９ｄ ｍＡｂｓ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の組合せによる活性化、およびスクロース精製ＳＩＶｍａｃ２３９でのスピノキュレーションとそれに続く３〜４日の培養によって生成した。Ｔ細胞アッセイで使用する前に、ＣＤ４マイクロビーズおよびＬＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して以前に記載されたように（Ｓａｃｈａ ＪＢ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７８，２７４６（２００７）；参照により本明細書に援用される）ＳＩＶ感染標的細胞を精製した。感染細胞調製物は、濃縮の後で９５％超のＣＤ４＋Ｔ細胞と５０％超のＳＩＶ感染であり、４０：１のエフェクター：標的比（ＰＢＭＣおよび単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞）または８：１（Ｔ細胞株エフェクター）で使用した。これらの実験では、感染していない活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞は、陰性対照ＡＰＣとして役立つ（ＳＩＶ＋マカク由来の感染していない標的を４００μＭテノホビル（ＮＩＨ ＡＩＤＳ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｐｒｏｇｒａｍ）とともに培養した）。全ＭＨＣ−ＩおよびＭＨＣ−Ｅ発現を評価するため、ＳＩＶ感染ＣＤ４＋Ｔ細胞を感染後精製を行わずに上記のように生成し、表面ＭＨＣ−Ｉ（クローンＷ６／３２）、ＭＨＣ−Ｅ（クローン４Ｄ１２；抗マウスＩｇＧ１クローンＭ１−１４Ｄ１２）、ＣＤ３、およびＣＤ４とそれに続いて細胞内ＳＩＶＧａｇについて染色した。
Ｔ細胞アッセイ：ＳＩＶ−、ＲｈＣＭＶ−、およびＴＢ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を、既に記載の通りフローサイトメトリーＩＣＳによって血液由来の単核細胞調製物において測定した（Ｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１３），上記）。手短に言えば、単核細胞または単離したＣＤ８＋Ｔ細胞を、抗原（ペプチド、ペプチドでパルスしたＢＬＣＬまたはＭＨＣ−ＩａまたはＭＨＣ−Ｅ形質移入体、あるいはＳＩＶ感染自家ＣＤ４＋Ｔ細胞）および共刺激分子ＣＤ２８およびＣＤ４９ｄ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）とともに１時間インキュベートし、その後ブレフェルジンＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）をさらに８時間添加した。抗原を用いない共刺激は、主なバックグラウンド対照として使用された。応答のＭＨＣの連合（ＭＨＣ−Ｉａ、ＭＨＣ−Ｅ、ＭＨＣ−ＩＩ）を、単離された単核細胞、抗原提示細胞またはＳＩＶ感染ＣＤ４＋細胞を室温で１時間（ペプチドを添加するか、またはエフェクターと標的細胞を混合し、標準的なＩＣＳアッセイ毎にインキュベートする前に）、以下のブロッカー：１）ｐａｎ抗ＭＨＣ−Ｉ ｍＡｂ Ｗ６／３２（１０ｍｇ／ｍｌ）、２）ＭＨＣ−ＩＩブロッキングＣＬＩＰペプチド（ＭＨＣ−ＩＩ関連インバリアント鎖、アミノ酸８９〜１００；２０μＭ）、および３）ＭＨＣ−ＥブロッキングＶＬ９ペプチド（ＶＭＡＰＲＴＬＬＬ；２０μＭ）の単独または組合せの存在下でプレインキュベートすることによって求めた。一部の実験では、Ｍａｍｕ−Ａ１＊００１：０１結合ペプチドＣＭ９（ＣＴＰＹＤＩＮＱＭ；２０μＭ）、またはＭａｍｕ−Ａ１＊００２：０１結合ペプチドＧＹ９（ＧＳＥＮＬＫＳＬＹ；２０μＭ）をブロッキング対照として使用した。刺激した細胞を固定し、透過処理し、既に記載した通り染色し（Ｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１３），上記）、フローサイトメトリー分析をＬＳＲ−ＩＩ計測器（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で実施した。分析は、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ）を使用して行った。全ての分析において、小リンパ球の光散乱シグネチャーにゲートを設け、その後ＣＤ３＋集団、次にＣＤ４−／ＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットにゲートを次第に設けた。ＣＤ８＋Ｔ細胞集団の抗原特異的応答の頻度は、ＣＤ６９およびＴＮＦ−αかＩＦＮ−γのいずれかまたは両方の細胞内発現から常套的に求めた。エピトープデコンボリューション実験には、厳密な応答判定基準を使用して偽陽性を防いだ。これらの研究では、所与１５ｍｅｒペプチドに対する応答は、少なくとも２つの独立したアッセイにおいてＣＤ６９＋、ＴＮＦ−α＋およびＩＦＮ−γ＋としてクラスター形成したイベントの頻度が＞０．０５％であり、バックグラウンドが＜０．０１％であった場合に陽性とみなした。個々のペプチド応答をブロックされたとする分類は、アイソタイプ対照と比較して、封鎖による＞９０％の抑制に基づいた。これらの判定基準を満たさなかった応答は、不確定とみなした。ブロッキングによりＭＨＣ−Ｅ拘束性であるとみなされるには、個々のペプチド応答は、抗ＭＨＣ−ＩクローンＷ６／３２とＭＨＣ−Ｅ結合ペプチドＶＬ９の両方によってブロックされ、かつＣＬＩＰペプチドによってブロックされていないはずである。最小の独立したエピトープ数は、以下の判定基準：同じ拘束型の陽性ペプチドが１つ＝独立したエピトープは１；同じ拘束型の隣接する陽性ペプチドが２つ＝独立したエピトープは１；同じ拘束型の隣接する陽性ペプチドが３つ＝独立したエピトープは２；同じ拘束型の隣接する陽性ペプチドが４つ＝独立したエピトープは２；および、同じ拘束型の隣接する陽性ペプチドが５つ＝独立したエピトープは３、で連続した１５ｍｅｒペプチドを試験することによって特定された陽性応答から推定した。
抗体：以下の結合抗体をこれらの研究で使用した：ａ）ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製、Ｌ２００（ＣＤ４；ＡｍＣｙａｎ）、ＳＰ３４−２（ＣＤ３；ＰａｃＢｌｕ）、ＳＫ１（ＣＤ８ａ；ＴｒｕＲｅｄ、ＡｍＣｙａｎ）、２５７２３．１１（ＩＦＮ−γ；ＡＰＣ、ＦＩＴＣ）、６．７（ＴＮＦ；ＡＰＣ）、ＭＡｂ１１（ＴＮＦ；Ａｌｅｘａ７００）、ｂ）Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ製、Ｌ７８（ＣＤ６９；ＰＥ）、２ＳＴ８．５Ｈ７（ＣＤ８β；ＰＥ）、Ｚ１９９（ＮＫＧ２Ａ／ＣまたはＣＤ１５９ａ／ｃ；ＰＥ）、ｃ）Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ製、Ｗ６／３２（ｐａｎ−ＭＨＣ−Ｉ；ＰＥ）、ＯＫＴ−４（ＣＤ４；ＰＥ−Ｃｙ７）、Ｂ１（ＴＣＲγ／δ；Ａｌｅｘａ６４７）、ｄ）Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ製、Ｍ−Ｔ４６６（ＣＤ４；ＡＰＣ）、ｅ）ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製、Ｍ１−１４Ｄ１２（マウスＩｇＧ１；ＰＥ−Ｃｙ７）。以下の非結合抗体をこれらの研究で使用した：ａ）Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製、４３２４（ＳＩＶＧａｇ ｐ２７）、ｂ）ＬＳＢｉｏ製、４Ｄ１２（ＨＬＡ−Ｅ）、ｃ）Ｗ６／３２（ｐａｎ−ＭＨＣ−Ｉ）。ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ Ｆｉｘａｂｌｅ Ｙｅｌｌｏｗ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ（ＬＩＦＥ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して細胞生存度を評価した。
エピトープ配列分析：ＷｅｂＬｏｇｏ３｛Ｃｒｏｏｋｓ，２００４ ＃１５０｝に基づいたＬｏｓ Ａｌａｍｏｓ ＨＩＶデータベースツールＡｎａｌｙｚｅ Ａｌｉｇｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈｉｖ．ｌａｎｌ．ｇｏｖ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｓｅｑｕｅｎｃｅ／ＡＮＡＬＹＺＥＡＬＩＧＮ／ａｎａｌｙｚｅ＿ａｌｉｇｎ．ｈｔｍｌ）を使用して、配列ロゴを作成した。Ｌａｍｐｅｎ ｅｔ ａｌ．，（上記）に公開されたＴＡＰ欠損細胞由来の５５１ ＨＬＡ−Ｅ溶出ペプチドについて、マカクにおいて認識される、１１個の最適なＭＨＣ−Ｅ ９−ｍｅｒエピトープの各々の位置でのアミノ酸の統計上の濃縮または提示不足は、Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ Ｐｒｏｆｉｌｅｒ Ｔｏｏｌ（ｈｔｔｐ：／／ｃｐｒｏｆｉｌｅｒ．ｏｒｇ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｐｒｏｆｉｌｅｒ．ｃｇｉ）を使用して計算した（Ｖａｃｉｃ Ｖ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍ ８，２１１（２００７）；参照により本明細書に援用される）。１１個の最適なペプチドの各位置のアミノ酸組成を、ワクチンに使用された挿入株である、ＳＩＶｍａｃ２３９ Ｇａｇ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｍ３３２６２）にて見られるアミノ酸頻度と比較した。１１個の最適なペプチドの位置毎の組成を、以前に公開された、ＴＡＰを欠損した設定でＨＬＡ−Ｅから溶出したペプチドと比較するために、Ｌａｍｐｅｎ ｅｔ ａｌ．において以前に公開された５５１の溶出ペプチドの全セットを使用した。Ｌａｍｐｅｎ ｅｔ ａｌ．のペプチドは、長さが８〜１３アミノ酸の間で変化し；９が最も一般的な長さであった。彼らはモチーフ検索アルゴリズムを使用して、彼らの溶出した組（Ｌａｍｐｅｎ ｅｔ ａｌ．の図２）の中の３１５個の９ｍｅｒｓの中でアミノ酸濃縮および提示不足を探った。長さにかかわらず位置２およびＣ末端位置が最も注目されるので、彼らの公開されたデータを調査するためにわずかに異なる手法をとって、彼らの５５１の溶出ペプチドの全ての整列させたバージョンを特徴づけた。ギャップを加えて、位置８の後に必要に応じてアラインメントを維持して、全てのペプチドを含む２番目の位置と整列したＣ末端の評価を可能にした。それらのデータは、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ ５１に基づいて天然のタンパク質に見出されるアミノ酸頻度に対する各々のアラインメント位置について比較した（Ｂａｉｒｏｃｈ Ａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３３，Ｄ１５４（２００５）；参照により本明細書に援用される）。
図１３Ｄに示される配列ロゴは、株６８−１ ＲｈＣＭＶベクターを接種したマカクにおいてＣＤ８＋Ｔ細胞に認識される１１個の最適なＭＨＣ−Ｅ拘束性のＳＩＶｇａｇ ９ｍｅｒペプチドエピトープに基づく文字の高さによって、（ＳＩＶｍａｃ２３９ Ｇａｇにおけるそのバックグラウンド頻度と比較した）所定の位置での各々のアミノ酸の頻度を示す。図１３Ｄの配列ロゴは、Ｌａｍｐｅｎ ｅｔ ａｌ．によるＴＡＰを欠損した設定でＨＬＡ−Ｅから溶出した５５１個のペプチドの中で濃縮度（灰色で塗りつぶしたボックスまたはハッチングされたボックス）または提示不足（白色で塗りつぶしたボックス）に従って着色されている。図１３Ｄの右のパネルに示されるように、５５１個のＬａｍｐｅｎ ｅｔ ａｌ．のペプチドの中で２番目とＣ末端のアンカー位置で濃縮されたアミノ酸は、本発明者らの１１個の最適なＳＩＶｇａｇペプチドの中でも稀であった一方で、著しく提示不足であったアミノ酸は濃縮された。
本明細書に記載される例および実施形態は、説明目的のためだけのものであり、様々な修正または変更がそれに照らして当業者に示唆され、本願の精神および範囲内に含まれることは当然理解される。
本明細書において引用される全ての刊行物、特許、特許出願、インターネットサイト、および受託番号／データベース配列（ポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列の両方を含む）は、この結果、各々の個々の刊行物、特許、特許出願、インターネットサイトまたは受託番号／データベース配列が参照により本明細書に援用されると具体的かつ個々に示されているのと同じ程度に、全ての目的においてその全文が参照により本明細書に援用される。

Claims (11)

  1. ＭＨＣ−Ｅ−ペプチド複合体を認識するＣＤ８ ＋ Ｔ細胞を生成する方法であって、
    第１の対象から単離された１つまたは複数のＣＤ８ ＋ Ｔ細胞に発現ベクターをトランスフェクトする工程を含み、
    前記発現ベクターが、第１のＣＤ８ ＋ ＴＣＲをコードする核酸配列、および前記第１のＣＤ８ ＋ ＴＣＲをコードする前記核酸配列と動作可能に連結されたプロモーターを含み、
    前記第１のＣＤ８ ＋ ＴＣＲは、ＭＨＣ−Ｅ／ペプチド複合体を認識する第１の組のＣＤ８ ＋ Ｔ細胞を生成するのに有効な量のサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ベクターが投与された第２の対象から得られた第２のＣＤ８ ＋ ＴＣＲのＣＤＲ３αおよびＣＤＲ３βを含み、
    前記サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ベクターは、
    （ａ）少なくとも１つの異種抗原をコードする第１の核酸配列と；
    （ｂ）少なくとも１つの活性のあるＵＬ４０タンパク質、またはそのオーソログもしくはホモログをコードする第２の核酸配列と；
    （ｃ）少なくとも１つの活性のあるＵＳ２８タンパク質、またはそのオーソログもしくはホモログをコードする第３の核酸配列と、を含み；
    （ｄ）前記ＣＭＶベクターが、活性のあるＵＬ１２８タンパク質、またはそのオーソログを発現せず、かつ活性のあるＵＬ１３０タンパク質、またはそのオーソログを発現せず、それによって、ＭＨＣ−Ｅ／ペプチド複合体を認識する１つまたは複数のトランスフェクトされたＣＤ８ ＋ Ｔ細胞を生成することを特徴とする方法。
  2. 前記少なくとも１つの異種抗原が、病原体特異的抗原、腫瘍抗原、組織特異的抗原、または宿主自己抗原を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
  3. 前記病原体特異的抗原が、ヒト免疫不全ウイルス、サル免疫不全ウイルス、単純ヘルペスウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、パピローマウイルス、プラスモディウム属寄生虫、および結核菌からなる群から選択される病原体に由来することを特徴とする請求項２に記載の方法。
  4. 前記腫瘍抗原が、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ芽球性白血病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、悪性黒色腫、乳癌、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、膵臓癌、結腸癌、腎細胞癌（ＲＣＣ）、および胚細胞性腫瘍からなる群から選択される癌に関連していることを特徴とする請求項２に記載の方法。
  5. ＵＬ１２８もしくはＵＬ１３０、またはそのオーソログをコードする核酸配列に１つまたは複数の変異が存在するために、前記ＣＭＶベクターが、活性のあるＵＬ１２８もしくはＵＬ１３０タンパク質、またはそのオーソログを発現しないことを特徴とする請求項１に記載の方法。
  6. ＵＬ１２８もしくはＵＬ１３０、またはそのオーソログをコードする核酸配列の前記１つまたは複数の変異が、点変異、フレームシフト変異、トランケーション変異、およびタンパク質をコードする核酸配列の全ての欠失からなる群から選択されることを特徴とする請求項５に記載の方法。
  7. 前記ＣＭＶベクターが、生体内での成長に必須であるか、必須でないか、またはそれを増強するウイルスタンパク質をコードする１つまたは複数のウイルス遺伝子において少なくとも１つの不活性化変異をさらに含むことを特徴とする請求項６に記載の方法。
  8. 前記少なくとも１つの不活性化変異が、点変異、フレームシフト変異、トランケーション変異、および前記ウイルスタンパク質をコードする前記核酸配列の全ての欠失からなる群から選択されることを特徴とする請求項７に記載の方法。
  9. 前記少なくとも１つの不活性化変異が、ＵＬ８２（ｐｐ７１）にあることを特徴とする請求項７に記載の方法。
  10. 前記少なくとも１つの不活性化変異が、ＵＳ１１にあることを特徴とする請求項７に記載の方法。
  11. 前記第１の対象が、ヒトまたは非ヒト霊長類であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
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