KR20150058152A - 마이코박테리아 항원 백신 - Google Patents

Abstract

본 발명은 일반적으로 마이코박테리움 종의 적어도 5개의 항원을 포함하는 면역원성 조합물 뿐만 아니라 이의 융합체 및 이러한 조합된 항원 및 융합체를 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다. 본 발명은 또한 마이코박테리아 항원 및 융합 폴리펩티드의 상기 조합물을 포함하거나 코딩하는 핵산 분자, 벡터, 숙주 세포 및 조성물 뿐만 아니라 이를 재조합에 의해 생성하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 마이코박테리움 감염, 또는 마이코박테리움 감염에 의해 유발되거나 이와 연관되는 임의의 질환에 대해 면역 반응을 유도 또는 자극하는 마이코박테리아 항원의 조합물, 융합 폴리펩티드, 벡터, 숙주 세포 및 조성물을 사용하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 마이코박테리움 감염의 진단 및 검출 방법에 사용될 수 있는 이러한 마이코박테리아 항원 및 융합 폴리펩티드에 대한 항체 뿐만 아니라, 마이코박테리아 항원의 상기 조합물, 융합 폴리펩티드, 벡터, 숙주 세포, 조성물 또는 항체를 포함하는 시약 키트에 관한 것이다.

Description

마이코박테리아 항원 백신 {MYCOBACTERIAL ANTIGEN VACCINE}

본 발명은 일반적으로 마이코박테리움 종의 적어도 5개의 항원을 포함하는 신규한 면역원성 조합물 뿐만 아니라 이의 융합체 및 이러한 조합된 항원 및 융합체를 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이고, 여기서 상기 항원은 마이코박테리움 종, 특히 마이코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis)(Mtb)와 같은 결핵 복합체의 마이코박테리움의 것이다. 본 발명은 또한 마이코박테리아 항원 및 융합 폴리펩티드의 상기 조합물을 포함하거나 코딩하는 벡터, 숙주 세포 및 조성물 뿐만 아니라 이를 발현 및 생성하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 특히 마이코박테리움 감염, 또는 마이코박테리움 감염에 의해 유발되거나 이와 연관되는 임의의 질환에 대해 보호 반응을 제공할 목적으로 면역 반응을 유도 또는 자극하는 마이코박테리아 항원의 상기 조합물, 융합 폴리펩티드, 벡터, 숙주 세포 및 조성물을 사용하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 마이코박테리움 감염의 진단에 사용될 수 있는 마이코박테리아 항원 및 융합 폴리펩티드에 대한 항체 뿐만 아니라, 마이코박테리아 항원의 상기 조합물, 융합 폴리펩티드, 벡터, 숙주 세포 및 조성물을 포함하는 진단 키트에 관한 것이다.

세계 인구의 추정된 3분의 1(즉, 20억명 이상의 개체)이 마이코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis)(Mtb)에 감염되고, 9백만 내지 1천만명의 신규 증례 및 매년 2 백만명의 사망으로 보아, 결핵(TB)은 글로벌 및 세계의 건강 문제이다. TB의 원인 물질인 마이코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis)(Mtb) 바실루스는 1998년 완전히 서열분석된 4,411,529개 염기쌍(bp)의 환상 게놈을 갖는다[참조: Cole et al., 1998, Nature 393: 537-44]. Mtb는 대략 4000개 유전자를 코딩하지만; 이들 유전자 대부분의 Mtb 라이프 사이클 및 병인에 있어서의 기능 및 역할은 아직까지 해명되지 않았다. 별개의 연속 감염기, 즉 활성기 및 그후 잠복 상태 및, 조건이 수집되는 경우, 신규 활성기를 유도하는 소생기 동안 분리된 유전자 세트가 발현되는 것이 오랫 동안 가정되어 왔다. 최근의 증거는 이러한 고전적 신조를 흔들었으며, 당해 분야는 이제 특정한 "누출"의 발생, 즉 유전자의 발현이 다양한 역치로 상-독립적 방식으로 일어날 수 있다는 것을 인지하고 있다. 더욱이, Mtb의 잠재 성질도 또한 논의되고 있다: 박테리아는 거의 휴면, 비-복제성이거나, 계속 복제하고 심지어 종종 감염된 세포로부터 인접한 기도로 탈출하여, 반복되는 면역 반응을 유발할 수 있을까?[참조: Ehlers et al., 2009, Infection 37: 87-95].

일반적으로, 개인-대-개인 전달은 폐 TB(활성 질환)을 앓고 있는 개인에 의해 생성된 에어로졸화 액적에 의해 발생한다. 이들 감염자(노출된 개체의 30%로 추산) 중에서, 단지 5 내지 10%가 노출후 2년 이내에 활성 TB 질환(원발성 TB로서 공지됨)으로 발달할 것이다. 그러나, 감염된 개체의 대다수는 질환의 임상적 징후 또는 증상 없이 수십년 지속할 수 있는 잠복 감염(LTBI)으로 발달한다. LTBI는 감염된 대상체가 감염을 조절할 수는 없지만 박테리아를 완전히 근절할 수 없는 평형 상태를 나타낸다. 재활성화(원격 감염 후의 활성 TB)는 HIV 감염 및 TNF 억제제에 의한 치료에서와 같이 특히 고령자 또는 면역무방비상태의 개체에서 후기 상태에서 발생할 수 있다. TB 재활성화의 위험은 수명당 10%로 추산되고, 손상된 면역성은 년간 10%까지 위험을 증가시킨다.

세포 면역 시스템의 자극이 TB 질환의 조절에 중요한 역할을 담당하는 것을 시사하는 몇몇 증거가 있다[참조: Rook et al. 2007, J Infect Dis 196:191-8]. 병원체를 조절하고 질환(Mtb 감염된 대상체의 대략 90%)으로의 진행을 방지하기 위한 CD4 T 림프구의 중심적 역할은 잘 확립되어 있다. 예를 들면, 낮은 CD4⁺ T 세포 계수를 갖는 HIV/AIDS 환자는 TB 질환으로의 진행에 더욱 감수성이고, CD4⁺ T 세포를 상승시키는 항바이러스 치료는 TB 질환으로의 진행을 감소시킨다. 그러나, CD4 T 세포는 단독으로 작동하지 않고, CD8 T 세포 및 기타 T 세포 서브셋에 의해 지지되어 있다. 이러한 점에서, 종양 괴사 인자-알파(TNFα) 차단제 및 유전자 다형태, 예를 들면, 인터페론-감마(IFNγ) 및 기타 수용체 결핍을 갖는 경험은 당해 질환의 조절에서 특정 사이토킨 및 사이토킨 네트워크의 중요성을 입증하고, 이는 인간에서 TB 조절의 세포 면역 성질을 보여준다[참조: Cooper et al., 2009, Annu Rev Immunol 27: 393-422].

매년 수백만명의 Mtb-유발 사망은, 백신(Bacille-Calmette-Guerin(BCG)) 및 항생물질 둘 다가 존재하고 광범위하게 사용된다는 것을 고려하면, 특히 극적이다. 그러나, BCG가 신생아 또는 유아에서 질환의 예방에 효과적인 것으로 생각되는 경우, 이는 성인을 보호하지 않고, 잠재적으로 감염된 개인에서 Mtb 재활성화를 방지하지 못한다. 한편, 다양한 항생물질 조합물을 사용한 활성 TB의 치료는 효율적이지만, 수개월에 걸쳐 상이한 약물의 매일 투여에 대한 강력한 환자 순응을 필요로 한다. 더욱이, 항생물질은, 적절하게 섭취한 경우, 야생형 Mtb 균주에 대해 매우 효율적이지만, 주로 이러한 장기간 및 고가의 약물 섭생 치료의 부적절한 준수 때문에, 약물 내성 Mtb 균주(예를 들면, "다중약물 내성"(MDR), "광범위 약물-내성"(XDR) 및 "전체 약물 내성"(TDR) 균주)가 놀라운 속도로 출현한다. 따라서, 효과적 TB 백신의 개발은 이러한 우려하는 맥락에서 우선순위이고, 2개의 주요 접근법이 과거 십년 동안 연구되고 있다: BCG 및 BCG 부스터의 대체. 10여개 이상의 백신 후보가 현재 임상 시험 중에 있다[참조: Ottenhoff and Kaufmann, 2012, PLoS 8(5): e1002607]. 또한, 당해 기술분야에서는, 신규한 독립형 치료로서 또는 대안적으로 표준 치료, 특히 약물 내성 균주의 치료에 부속하여 사용되는 소위 "치료학적 백신"으로 지칭되는 Mtb 감염의 치료에서 역할을 하는 신규한 백신 제형의 사용이 보다 최근에 검토되었다.

BCG 대체 후보는 BCG 효능 및 안전성의 개선을 목적으로 하고, BCG가 부재하는 신규한 항원 세트를 발현하고 BCG가 발현하는 Mtb 항원을 과발현하지만 불충분한 수준으로 또는 여전히 독성 유전자 및 이들의 조절제를 결실하도록 조작된 유전자 변형된 BCG 또는 Mtb 균주 등과 같은 생 약독화 박테리아에 주로 기반한다. 다양한 재조합 BCG 작제물이 BCG를 치환하는 이들의 능력을 시험하기 위해 임상 시험에 도입되었다. 현재 상 II 시험에서 가장 진행된 VPM1002는 면역무방비상태의 동물에서 BCG보다 안전하고 Mtb에 의한 챌린지에 대해 마우스에서 보다 우수한 보호를 제공하는 것으로 밝혀진 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes)로부터 티올-활성화된, 콜레스테롤-결합 리스테리올리신(hly)을 발현하는 우레아제-결핍 rBCG이다[참조: Grode et al., 2005, J Clin Invest 115: 2472-9]. 2개의 추가의 rBCG, 즉 Ag85B를 발현하는 rBCG30, 및 퍼프린고리신과 함께 Ag85A, Ag85B 및 Rv3407을 발현하는 AERAS422가 각각 최근에 임상 평가에 도입되었다.

BCG 부스터는 세포 및/또는 체액 면역 반응의 유도를 목적으로 하고, 강력한 Th1-활성화 애주번트와 일반적으로 혼합된 단백질 조성물로서 또는 바이러스 발현 벡터를 통해 TB 항원을 제공하기 위해 설계된 재조합 백신에 일반적으로 의존한다[참조: Thaissa et al., 2010, Yale J. of Biol. and Medicine 83: 209-15; Andersen, 2007, Nature 5: 484 and Kaufman, 2012, Trend in Immunology 241: 1-7]. 4000개의 잠재적 TB 항원 중에서, 이들의 수는 임상전 모델에서 면역원성을 증명했다.

가장 진행된 단백질-기반 후보 중의 하나는 ESAT-6에 융합된 Ag85B로 이루어진 하이브리드 1(H1) 단백질이다[참조: Langermans et al., 2005, Vaccine 23: 2740-50; Dietrich et al., 2007, J. Immunol. 178: 3721-30]. 인간에서 IC31 애주번트와 함께 투여되는 경우, 강력한 CD4+ Th1 IFNg-매개된 반응이 관찰되었다[참조: Van Dissel et al., 2010, Vaccine 28: 3571-81]. 더욱 최근에, 이 백신은 BCG 또는 잠복 Mtb 감염에 의해 사전 유도된 면역 반응을 높이는 것으로 밝혀졌다[참조: Van Dissel, 2011, Vaccine 29: 2100-9]. TB10.4[참조: Aagaard et al., PLoS One 4: 1-8]에 융합된 Ag85B로 이루어진 또 다른 융합 단백질 Hyvac 4(H4)는 병렬 개발 프로그램이다. 세린 프로테아제 Rv0125의 중간에 삽입된 Rv1196으로 제조된 GSK의 M72 융합 단백질은, 상이한 합성 애주번트와 함께 투여되는 경우, 안전성 및 면역원성 측면에서 양호한 임상 프로파일을 나타냈다[참조: Von Eschen et al., 2009, Hum Vaccine 5: 475-82]. 또한, 소위 ID 융합 단백질(WO2008/124647), 예를 들면, Rv1813, Rv3620 및 Rv2608으로 제조된 ID83[참조: Baldwin et al., 2009, Vaccine 27: 3063-71] 및 3개의 ID83 항원에 융합된 Rv3619를 포함하는 ID93[참조: Bertholet et al., 2010, Sci Transl Med 2(53): 53ra74]을 열거할 수 있다.

임상 시험에서 시험되고 있는 바이러스-벡터화 TB 백신은 Ag85A 항원을 발현하는 변형된 백시니아 바이러스 안카라(MVA)(MVA85A/Aeras-485; WO2006/72787), 및 Ag85A, Ag85B 및 TB10.4 항원을 발현하는 복제-결함 아데노바이러스(Ad) 35(Crucell Ad35/Aeras-402; WO2006/053871)를 포함한다. MVA85A는 고도의 CD4+ T 세포 반응을 유도하는 BCG 프라이밍 개체 뿐만 아니라 천연 개체 둘 다에서 면역원성을 제공하는 반면[참조: Mc Shane et al., 2004, Nat Med 10: 1240-4; Scriba et al., 2010, Eur J Immunol 40: 279-90], Aeras-402는 CD8 T 세포 및 IFNg 반응을 조장하는 것처럼 보인다[참조: Radosevic et al., 2007, Infect Immunol 75: 4105-15; Magalhaes et al., 2008, PLoS One 3, e3790; Abel et al., 2010 Am J Respir Crit Care Med 181: 1407-17].

보다 최근의 연구는 이제 다상 (multiphase) 조성물에 초점을 맞춘다[참조: WO2008/124647 및 WO2011/144951]. 이들 백신 후보 중의 일부는 Mtb에 대한 강력한 세포 매개된 면역 반응을 유도하는 능력을 입증하는 임상전 및 임상 연구의 결과를 생성했다[참조: Thaissa et al., 2010, Yale J. of Biol. and Medicine 83: 209-15; Delogu et al., 2009, J Infect Developing Countries 3: 5-15]. 예를 들면, 활성 Ag85B 및 ESAT-6 항원과 함께 잠복 Mtb Rv2660을 조합한 H56 융합 단백질은, 임상 시험에 아직 도달하지 않았지만, 잠재적으로 유망한 BCG 부스터 활성을 나타냈다[참조: Aagaard et al, 2011, Nature Med 17: 189-94; Lin et al., 2012, J Clin Invest 122: 303-14]. 그러나, 이들 연구는 항원 용량[참조: Aagaard et al., PLoS One 4: 1-8] 및 투여 경로[참조 Goonetilleke et al., 2003, J. Immunol. 171: 1602-9] 등의 T 세포 반응 및 보호 효능에 대한 다양한 인자의 영향을 강조하고 있다.

결핵은 다른 이유로 조절되지 않는다: 제한된 자원을 갖는 부분에서 소정 기준 관리에 대한 불량한 환자 순응, HIV 공감염에 기인한 TB 유행의 악화, 성인 보호에 비효과적인 BCG 백신화의 불량한 성능. TB의 세계적으로 증가하는 위협 및 Mtb 감염 및 항-마이코박테리아 면역 반응의 고유한 복잡성에 비추어, 특히 유행 지역에서 결핵을 진단, 예방 및 치료하기 위한 개선된 백신 전략의 필요성이 여전히 존재한다.

본 발명은 모든 자연경과 감염 단계에 대해 적합하게 조정된 Mtb 항원의 면역원성 조합물을 제공함으로써 이러한 필요성 및 기타 필요성을 만족시킨다.

본 발명의 기술적 과제는 특허청구범위에 정의된 실시형태의 제공에 의해 해소된다.

본 발명의 기타 및 추가의 측면, 특징 및 이점은 본 발명의 현재 바람직한 실시형태의 하기 설명으로부터 명백해질 것이다. 이들 실시형태는 개시 목적을 위해 제공된다.

본 발명은 일반적으로 적어도 5개의 상이한 항원, 또는 적어도 5개의 항원을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 면역원성 조합물로서, 상기 항원은 마이코박테리움 종, 특히 마이코박테리움 투베르쿨로시스(M. tuberculosis)(Mtb) 등의 결핵 복합체의 마이코박테리움 종으로부터 독립적으로 수득되는, 면역원성 조합물에 관한 것이다. 데이터 마이닝 시스템을 개발했고, 이들의 면역원성 및 보호 특성에 기반하여 Mtb 항원의 패널을 분류하기 위해 사용했다. 서열 정렬, 생화학 및 생물정보학 예측 연구에, 14개 Mtb 항원을 선택하고, 항원/벡터 조합물 및 융합 폴리펩티드와 조합했다.

본 발명의 한 가지 측면에서, 본 발명의 항원 조합물은 다상이고, 여기서 절어도 5개의 마이코박테리아 항원은 마이코박테리움 감염의 자연 경과의 2상 또는 3상, 즉 활성기, 잠복기 및 소생기의 것이다. 마이코박테리아 항원은 혼합물 형태로 또는 본원에 기재된 하나 이상의 융합 폴리펩티드(들)로 사용/발현될 수 있다.

본 발명은 또한 특정 마이코박테리아 항원의 융합 폴리펩티드, 이러한 융합 폴리펩티드를 코딩/발현하는 핵산 분자 및 벡터, 및 이러한 융합 폴리펩티드를 포함하거나 코딩하는 조성물 뿐만 아니라 상기 융합체, 벡터 및 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 마이코박테리아 항원 및 융합 폴리펩티드에 대한 항체에 관한 것이다. 추가로, 본 발명은 마이코박테리움 감염의 진단, 예방 또는 치료 목적을 위한 또는 마이코박테리움 감염과 연관된 증상을 완화시키기 위한 이러한 면역원성 조합물, 융합 폴리펩티드, 핵산 분자, 벡터, 조성물 또는 항체의 용도에 관한 것이다.

본 발명의 추가의 측면는, 이러한 면역원성 조합물, 융합 폴리펩티드, 핵산 분자, 벡터 또는 조성물을 제공하거나 포함하는 것을 포함하여, 이를 필요로 하는 대상체에서 마이코박테리움 감염을 치료, 예방 또는 억제하거나 마이코박테리움 감염과 연관된 증상을 완화시키는 방법을 포함한다.

또한, 본 발명의 추가의 측면는, 이러한 대상체에서 면역 반응을 유도하거나 자극할 목적으로 또는 마이코박테리움 감염을 예방 또는 치료하기 위해 이러한 면역원성 조합물, 융합 폴리펩티드, 핵산 분자, 벡터 또는 조성물을 제공하거나 투여하는 것을 포함하여, 이를 필요로 하는 대상체에서 면역 반응을 유발하는 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명의 측면는, 대상체에게 이러한 면역원성 조합물, 융합 폴리펩티드, 핵산 분자, 벡터 또는 조성물을 제공하거나 투여하기 위한 복수의 용기 및 지침을 포함하는 키트 부분을 제공한다.

또한, 본 발명의 그 이상의 측면는, 이러한 면역원성 조합물, 융합 폴리펩티드, 핵산 분자, 벡터 및 조성물을 포함하는 마이코박테리움 감염(예: 결핵)을 진단하기 위한 항체 분석용 시약 키트를 제공한다.

본 발명에 의해 제공된 항원 조합물은 개개 항원과 비교하여 개선된 예상밖의 면역원성 특성(예: 면역원성 반응의 수준, 품질 및/또는 범위)을 제공한다.

본 발명은 마이코박테리움 감염 분야에서 예방적 또는 치료적 목적, 예를 들면, 잠재적으로 감염된 대상체에서 Mtb 감염의 예방 및/또는 원발성 TB의 예방 및/또는 재활성화의 예방을 위해 단독으로 또는 BCG 부스터로서 면역 치료의 맥락에서 특히 유용하다. 또한, 표준(예: 항생물질-치료) 또는 현재 개발되고 있는 임의의 기타 신규한 치료(예: 직접 또는 간접 억제제 소분자; 항체 또는 면역치료 등)와 관련하여 사용될 수 있다. 본 발명은 또한, 예를 들면, 동물, 특히 소 및 염소 육종에서 마이코박테리움 감염 및/또는 활성 질환의 위험을 감소 또는 제거하기 위해 수의학 분야에 유용하다.

본 발명은 일반적으로 마이코박테리움 종의 적어도 5개의 항원 또는 상기 적어도 5개의 항원을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 면역원성 조합물에 관한 것이다.

정의

본 출원 전체를 통하여 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "하나(a, an)"는, 문맥상 달리 진술되지 않는 한, 참조된 화합물들 또는 단계들의 "적어도 하나(at least one)", "적어도 첫 번째(at least a first)", "하나 이상(one or more)" 또는 "다수(a plurality)"를 말하는 의미로 사용된다.

용어 "및/또는(and/or)"는, 본원에서 사용될 때는 언제라도, "및", "또는" 및 "상기 용어에 의해 연결된 요소들의 전부 또는 기타 다른 조합"의 의미를 포함한다.

용어 "약" 또는 "대략"은 본원에서 사용되는 바와 같이 주어진 수치 또는 범위의 10% 이내, 바람직하게는 8% 이내, 및 더욱 바람직하게는 5% 이내를 의미한다.

용어 "아미노산", "잔기" 및 "아미노산 잔기"는 동의어이고 천연 아미노산 뿐만 아니라 아미노산 유사체(예를 들면, D 또는 L 광학적 이성질체를 포함하는 비-천연, 합성 및 변형된 아미노산)도 포함한다.

용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 펩티드 결합을 통해 결합된 적어도 9개 이상의 아미노산을 포함하는 아미노산 잔기의 중합체를 지칭한다. 중합체는 선형, 분지형 또는 사이클릭일 수 있고, 자연적으로 발생하는 것 및/또는 아미노산의 유사체를 포함할 수 있다. 이는 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 절단, 디설파이드 브릿지에 의한 가교-결합 및/또는 포스포릴화됨으로써 또는 추가의 아미노산 잔기, 예를 들면, 태그(his, myc, Flag 등) 또는 표적화 펩티드(신호 펩티드, 막관통 도메인 등)을 함유함으로써 화학적으로 변형될 수 있다. 용어 "폴리펩티드"는 단백질(통상 50개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드에 사용됨), 올리고펩티드 및 펩티드(통상 50개 미만의 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드에 사용됨)를 포함하는 것으로 이해된다. 따라서, 각각의 폴리펩티드는 특정 아미노산에 의해 특성화될 수 있고, 특정 핵산 서열에 의해 코딩될 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 생성물, 조성물 및 방법을 정의하는 데 사용될 때, 용어 "포함하는" (및 "포함하다(comprise)" 및 "포함하다(comprises)"와 같은 포함하는(comprising)의 임의의 형태), "갖는(having)"(및 "가지다(have)" 및 "가지다(has)"와 같은 갖는(having)의 임의의 형태), "포함하는(including)" (및 "포함하다(includes)" 및 "포함하다(include)"와 같은 포함하는(including)의 임의의 형태) 또는 "함유하는(containing)"(및 "함유하다(contains)" 및 "함유하다(contain)"와 같은 함유하는(containing)의 임의의 형태)은 넓은 해석을 인정하고, 추가의 재인용되지 않은 요소 또는 방법 단계를 배제하지 않는다. 따라서, 폴리펩티드는 아미노산 서열이 폴리펩티드의 최종 아미노산 서열의 일부일 수 있을 때 아미노산 서열을 "포함한다". 이러한 폴리펩티드는 최대 수백개의 추가 아미노산 잔기(예: 본원에 언급된 바와 같은 태그 및 표적 펩티드)를 가질 수 있다. "필수적으로 이루어진"은 임의의 필수적으로 중요한 다른 구성성분 또는 단계를 배제하는 것을 의미한다. 따라서, 재인용된 구성성분으로 필수적으로 이루어진 조성물은 미량 오염물 및 약학적으로 허용가능한 담체를 배제하려는 것은 아니다. 폴리펩티드는 이러한 아미노산 서열이 궁극적으로 단지 수개의 추가 아미노산 잔기와 함께 존재할 때 이러한 아미노산 서열로 "필수적으로 이루어진다". "이루어지는"은 다른 구성성분 또는 단계의 미량 이상의 원소를 배제하는 것을 의미한다. 예를 들면, 폴리펩티드가 재인용된 아미노산 서열을 제외하고 임의의 아미노산을 함유하지 않을 때 폴리펩티드는 아미노산 서열로 "이루어진다".

용어 "동일성"은 2개의 폴리펩티드 또는 뉴클레오티드 서열 간의 아미노산 대 아미노산 또는 뉴클레오티드 대 뉴클레오티드 대응을 지칭한다. 2개 서열 간의 동일성 백분율은, 최적의 정렬을 위해 도입될 필요가 있는 갭들의 수 및 각각의 갭의 길이를 고려하여, 서열에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수이다. 예를 들면, NCBI에서 입수가능한 Blast 프로그램 또는 단백질 서열 및 구조의 아틀라스에서 ALIGN[참조: Dayhoffed., 1981, Suppl., 3 482-489]과 같은 다양한 컴퓨터 프로그램 및 수학적 알고리즘은 아미노산 서열 간의 동일성의 백분율을 결정하기 위해 당해 기술분야에서 입수가능하다. 뉴클레오티드 서열 간의 동일성을 결정하기 위한 프로그램은 특수화된 데이터베이스[참조: Genbank, the Wisconsin Sequence Analysis Package, BESTFIT, FASTA 및 GAP 프로그램)에서 역시 입수가능하다. 설명의 목적을 위해, "적어도 80%의 동일성"은 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%를 의미한다.

본원에서 사용된 바와 같이, "작동적으로 연결된"은 연결되는 요소가 정렬되어 이들이 이들의 의도된 목적을 위해 혐력하여 기능하는 것을 의미한다. 예를 들면, 프로모터는, 당해 프로모터가 전사 개시로부터 종결자까지의 전사를 수행하여 허용 숙주 세포에서 핵산 분자에 존재하는 코딩 서열의 발현을 생성하는 경우에, 핵산 분자에 작동적으로 연결된다.

본원에서 사용된 바와 같이, "마이코박테리움", "마이코박테리움 종" 및 "마이코박테리아"는 상호 교대로 사용되어, 마이코박테리아세아에(Mycobacteriaceae) 과에 속하는 액티노박테리아(Actinobacteria) 종의 임의의 구성원을 지칭한다.

"마이코박테리움 감염"은 마이코박테리움 종에 대한 대상체의 노출, 이어서 상기 박테리아에 의한 대상체 또는 대상체 조직(들)의 콜로니화를 지칭한다. 콜로니화는 심각한 질환(예를 들면, 마이코박테리움에 의한 결핵, 나병, 부렐리 궤양 등)을 유발하거나, 부정적 징후(무증후성 또는 잠복성 감염)를 발생시킬 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "조합"은 다양한 성분(예: 마이코박테리아 항원 및/또는 코딩하는 핵산 분자)의 가능한 임의의 정렬을 지칭한다. 이러한 정렬은 마이코박테리아 항원의 혼합물(예: 개개 항원 및/또는 항원 융합체의 혼합물) 또는 핵산 분자의 혼합물(예: 하나 이상의 벡터에 의해 운반된) 뿐만 아니라 폴리펩티드(들) 및 핵산 분자(들)의 혼합물을 포함한다. 본 발명은 동일한 몰 농도의 각각의 성분을 포함하는 조합물 뿐만 아니라 매우 상이한 농도를 갖는 조합물을 포함한다. 각 마이코박테리움 성분의 최적 농도는 당해 기술분야의 숙련가에 의해 결정될 수 있을 것이다.

용어 "면역원성"은 면역원성으로서 정성화된 성분이 도입된 대상체에서 측정가능한 T 및/또는 B 세포-매개된 면역 반응을 유도하거나 자극하는 능력을 지칭한다. 예를 들면, 본 발명의 항원성 조합물은 선천적 및/또는 특이적(즉, 상기 면역원성 조합물에 포함되거나 이들에 의해 발현된 적어도 하나의 마이코박테리아 항원/에피토프에 대해), 체액성 및/또는 세포성(예: 항체 및/또는 사이토킨의 생성 및/또는 세포독성 T 세포, B, T 림프구, 항원 제시 세포, 헬퍼 T 세포, 수지상 세포, NK 세포 등의 활성화)일 수 있는 대상체에서 면역 반응을 유도 또는 자극할 수 있고 통상 투여된 대상체에서 보호 반응을 생성한다는 측면에서 면역원성이다. 다양한 직접 또는 간접 생물학적 분석법은 본원에 기재된 바와 같은 생체내(동물 또는 인간) 또는 시험관내(예: 생물학적 샘플)에서 성분의 면역원성 성질을 평가하기 위해 당해 기술분야에서 이용가능하다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "마이코박테리아 항원"은 마이코박테리아 종에 존재하거나 이로부터 수득된 폴리펩티드, 또는 항체 또는 T 세포 수용체에 의해 결합될 수 있는 이의 단편(예: 에피토프)를 지칭한다. 전형적으로, 이러한 항원은 주조직적합성 복합체(MHC)의 맥락에서 특정 항체 또는 T-세포 수용체에 의한 인식에 관여하는 하나 이상의 B 및/또는 T 에피토프(들), 특히 CTL 또는 T_H 에피토프(들) 또는 이들 둘 다를 함유한다. 본 발명의 맥락에서, 이 용어는 천연 마이코박테리아 폴리펩티드 뿐만 아니라 이하에 기재된 바와 같은 이의 단편 및 변형된 버젼(즉, 변이체)을 포함한다.

"에피토프"는 항체, T-세포 수용체 또는 HLA 분자에 의해 인식된 부위를 형성하는 최소 펩티드 모티프(통상 8 내지 25개 아미노산 잔기의 세트)에 상응한다. 이들 잔기는 연속적(선형 에피토프)일 수 있거나 아닐 수 있다(서로 즉시 인접하지 않는 잔기를 포함하는 입체구조 에피토프).

본원에서 사용된 바와 같은 용어 "치료"(및 "치료", "치료하다" 등의 임의의 치료 형태)는 예방(예: 마이코박테리움으로 감염될 위험에서 대상체의 예방 및/또는 치료(예: 마이코박테리움으로 감염된 것으로 진단된 대상체)를 포함한다. 치료는 궁극적으로 통상의 치료법과 관련하여 활성제(예: 본원에 기재된 면역원성 조합물, 융합 폴리펩티드, 핵산 분자, 벡터 및/또는 조성물), 특히 활성 마이코박테리움 질환(예: TB)의 치료에 현재 사용된 것을 대상체에게 외부 또는 내부 투여하는 것을 필요로 한다.

용어 "대상체"는 일반적으로 마이코박테리움 종에 대해 면역 반응의 유도 또는 자극으로부터 유익할 수 있는 가축, 및 특히 가축 동물, 농장 동물, 경기용 동물 및 영장류로 이루어진 그룹으로부터 선택된 포유동물을 지칭한다. 바람직하게는, 대상체는 마이코박테리움 및 특히 Mtb로 감염되거나 감염 위험이 있는 것으로 진단되고 따라서 마이코박테리움 감염(예: 활성 또는 잠복성 결핵)에 의해 유발되거나 이와 연관된 질환 또는 증상을 갖기 쉽거나 가질 위험이 있는 인간이다.

"보호 반응"은 당해 처리가 무처리 대상체의 반응과 비교하여 처리된 대상체에게 잇점; 예를 들면, 면역 반응의 유도 또는 자극, 마이코박테리움 감염에 걸리는 것으로부터의 보호, 또는 활성 질환에 대한 증가된 내성, 또는 잠복성 마이코박테리움 감염의 재활성화에 대한 예방, 또는 심지어 활성 질환 발달 후의 치유를 제공하는 이의 통상적 의미를 갖는다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "단리된"은 이의 자연 환경으로부터 제거되는(즉, 자연적으로 연관되는 적어도 하나의 다른 성분(들)로부터 분리된) 성분(예: 폴리펩티드, 핵산 분자, 벡터 등)을 지칭한다.

용어 "~로부터 수득된", "기원하는" 또는 "기원한다"는 성분(예: 폴리펩티드, 핵산 분자)의 본래의 공급원을 식별하기 위해 사용되지만, 예를 들면, 화학적 합성 또는 재조합 수단일 수 있는 당해 성분이 제조되는 방법을 제한하는 것은 아니다.

마이코박테리움 종

상기 정의한 바와 같이, 본 발명의 면역원성 조합물을 포함하는/코딩된 마이코박테리아 항원은 독립적으로 현 시점에서 동정된 마이코박테리움(M.) 종의 임의의 구성원으로부터 수득될 수 있다. 본 발명의 문맥에서 사용하기 위한 다수의 마이코박테리움은 당해 기술분야에 기재되어 있다. 예시적 마이코박테리움 종은, 제한 없이, 마이코박테리움 플레이(M. phlei), 마이코박테리움 스메그마티스(M. smegmatis), 마이코박테리움 아프리카눔(M. africanum), 마이코박테리움 카네티(M. canetti), 마이코박테리움 포르투이툼(M. fortuitum), 마이코박테리움 마리눔(M. marinum), 마이코박테리움 울세란스(M. ulcerans), 마이코박테리움 투베르쿨로시스(M. tuberculosis (Mtb)), 마이코박테리움 파라투베르쿨로시스(M. paratuberculosis), 마이코박테리움 보비스(M. bovis), 마이코박테리움 미크로티(M. microti), 마이코박테리움 셀라툼(M. celatum), 마이코박테리움 아비움(M. avium), 마이코박테리움 레프라에(M. leprae), 마이코박테리움 레프라에무리움(M. lepraemurium), 마이코박테리움 인트라셀룰라레(M. intracellulare), 마이코박테리움 스크로풀라세움(M. scrofulaceum), 마이코박테리움 제노피(M. xenopi), 마이코박테리움 게나벤세(M. genavense), 마이코박테리움 칸사시이(M. kansasii), 마이코박테리움 시미아에(M. simiae), 마이코박테리움 스줄가이(M. szulgai), 마이코박테리움 하에모필룸(M. haemophilum), 마이코박테리움 아시아티쿰(M. asiaticum), 마이코박테리움 말로엔세(M. malmoense), 마이코박테리움 바카에(M. vaccae), 마이코박테리움 카프라에(M. caprae), 마이코박테리움 핀니페디이(M. pinnipedii) 및 마이코박테리움 시모이데이(M. shimoidei)를 포함한다.

바람직한 실시형태에서, 본 발명에서 사용되는 마이코박테리아 항원은 종래 질환 결핵을 유발하는 것으로 간주된 마이코박테리움 종 뿐만 아니라 면역 저하된 대상체(예: HIV-감염된 환자)에서 결핵 및 폐 질환을 유발하는 마이코박테리움 환경 및 기회감염성 종을 포함하는 결핵 복합체의 마이코박테리움 종으로부터 수득된다. 본원에서 사용하기 위한 결합 복합체의 예시적 종은, 제한 없이, 마이코박테리움 투베르쿨로시스(M. tuberculosis(Mtb)), 마이코박테리움 보비스(M. bovis), 마이코박테리움 보비스(M. bovis) BCG, 마이코박테리움 아프카눔(M. africanum), 마이코박테리움 카네티(M. canetti), 마이코박테리움 카프라에(M. caprae) 및 마이코박테리움 미크로티(M. microti)를 포함한다. 바람직한 실시형태는 H37Rv 및 H37Ra 등의 Mtb 실험 균주 및 KZN4207, T85, CDC1551(US에서 단리), F11(남아프리카에서 단리), C, K85(네델란드에서 단리), CPHL-A 등의 임상 단리물 뿐만 아니라, TN5904, 할렘(Haarlem), KZN1435, 베이징(Bejing) 및 KZN605 등의 MDR 또는 XDR 단리물을 포함하는 Mtb에 대해 지시된다. 마이코박테리아 항원 공급원에 대한 다른 바람직한 종은 특히 가축 사용을 위한 마이코박테리움 보비스(M. bovis), 마이코박테리움 보비스(M. bovis) BCG 및 마이코박테리움 카프라에(M. caprae)이다. 그러나, 아미노산 및 뉴클레오티드 수준에서 마이코박테리움 종 사이에 존재하는 고도의 상동성을 제공한 교차-반응성을 실제로 예상할 것이다. 예를 들면, Mtb 및 마이코박테리움 보비스(M. bovis)의 Rv1733 항원은 100% 동일한 반면, 마이코박테리움 아프리카눔(M. africanum) Rv1733은 Mtb의 것과 210개 아미노산중 공통의 209개 아미노산을 공유한다. 따라서, Mtb 항원의 조합물은 Mtb-감염된(인간 사용), 마이코박테리움 보비스- 및 마이코박테리움 카프라에-(가축 사용) 감염된 대상체 둘 다의 치료에 유용할 가능성이 있다.

적합한 마이코박테리아 항원의 아미노산 서열 및 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 특화된 데이터 뱅크(및 문헌)에서 용이하게 입수가능하다. 예를 들면, Mtb 서열은 문헌[참조: Cole et al., 1998, Nature 393: 537] 또는 웹사이트, 예를 들면, 웰컴 트러스트 생거 인스티튜트(Wellcome Trust Sanger Institute), 인스티튜트 파스테르(lnstitut Pasteur) 등(예: TB 데이터베이스(@tbdb.org) 및 투베르쿨리스트(@tuberculist.epfl.ch))에 의해 유지된 것들에서 발견할 수 있다. 그러나, 본 발명은 이들 예시적 마이코박테리움 종으로 제한되지 않는다. 실제로, 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 상이한 단리물 및 균주 간에 상이할 수 있고, 하기 기재된 것들과 같은 비-천연 변형(들) 뿐만 아니라 이러한 천연 유전자 변이는 본 발명의 범위 내에 포함된다.

면역원성 조합물

본원에서 사용된 바와 같이, "적어도 5"는 5 내지 50의 범위 내에 포함되는 수(즉, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 등), 바람직하게는 5 내지 33, 바람직하게는 7 내지 20, 및 더욱 바람직하게는 8 내지 18이고, 10 내지 15(예: 12, 13 또는 14)가 특히 바람직하다. 바람직하게는, 본 발명의 조합물은 대략 10 내지 15개 Mtb 항원 또는 상응하는 핵산 분자를 포함한다.

본 발명의 맥락에서, "적어도 5개의 마이코박테리아 항원"은 서로 상이하다(예: 동일한 마이코박테리아 항원의 다중 카피가 사용될 수 있고, 단 조합물은 적어도 5개의 상이한 마이코박테리아 항원을 포함/코딩함).

대안적으로 또는 추가로, 각각의 적어도 5개의 마이코박테리아 항원은 천연 마이코박테리아 항원(예: 전장 항원) 또는 이의 변형된 버젼(단편 또는 변이체)일 수 있다.

"천연" 마이코박테리아 항원은 마이코박테리움의 공급원으로부터 자연적으로 발견, 단리, 수득될 수 있다. 이러한 공급원은 감염된 대상체로부터 수집되거나 마이코박테리움, 배양된 세포 뿐만 아니라 기탁 기관에서 입수가능한 재조합 물질, 라이브러리 또는 문헌에 기재된 것들(예: 마이코박테리움 단리물, 마이코박테리움 게놈, 게놈 단편, 게놈 RNA 또는 cDNA 뿐만 아니라 이러한 요소를 포함하는 것으로 당해 기술분야에 공지된 임의의 플라스미드 및 벡터)에 노출된 생물학적 샘플(예: 혈액, 혈장, 혈청, 타액, 객담, 조직 절편, 생검 표본)을 포함한다.

변형된 마이코박테리아 항원(예: 변이체)는 통상 본원에 구체적으로 개시된 폴리펩티드 또는 하나 이상의 부분(들)에서의 천연 폴리펩티드와 상이하다. 하나 이상의 아미노산 잔기(들)의 치환, 삽입, 부가 및/또는 결실, 비-천연 정렬 및 이들 가능성의 임의의 조합을 포함하는 임의의 변형이 예상될 수 있다. 아미노산 치환은 보존적이거나 비보존적일 수 있다. 몇몇 변형이 고려되지만, 이들은 보존적 잔기 및/또는 비-보존적 잔기에 관련될 수 있다. 변형(들)은 당해 기술분야의 숙련가에게 공지된 다수의 방식, 예를 들면, 부위-지시된 돌연변이유발(예: 아머샴(Amersham, Les Ullis, France)사의 Sculptor^TM 시험관내 돌연변이유발 시스템을 사용), PCR 돌연변이유발, DNA 셔플링에 의해 또는 합성 기술(예: 목적하는 폴리펩티드 변이체를 코딩하는 합성 핵산 분자의 생성)에 의해 생성할 수 있다.

이들의 기원(천연 또는 변형된)에 무관하게, 본 발명의 면역원성 조합물에 포함되거나 이에 의해 코딩된 각각의 마이코박테리아 항원은 B 및/또는 T 세포 에피토프(들)을 포함하는 상응하는 천연 항원의 하나 이상의 면역원성 부분을 보유하는 것이 바람직하다. 이러한 관련 면역원성 부분을 동정하는 방법은 당해 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들면, T 세포 에피토프는 생물학적 분석(예: 합성 중첩 올리고펩티드의 라이브러리를 사용하는 IFNg 분석) 또는 이용가능한 예측 프로그램을 실시함으로써 동정할 수 있다.

한 가지 실시형태에서, 본 발명의 면역원성 조합물은 활성기, 소생기 및 잠복기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 2개의 상이한 감염 상 (infection phase) (예: 활성기 및 소생기, 활성기 및 잠복기 또는 소생기 및 잠복기)으로부터 마이코박테리아 항원을 포함하거나 이를 코딩한다. 바람직한 조합물은 적어도 감염 활성기로부터의 적어도 하나의 항원, 감염 소생기로부터의 적어도 하나의 항원 및 감염 잠복기로부터의 적어도 하나의 항원과 함께 3개 감염 상으로부터 마이코박테리아 항원 및 특히 Mtb 항원을 포함하거나 코딩하는 "다중상"이다.

"활성 상의 항원"은 전형적으로, 마이코박테리움이 생체내에서 활성적으로 성장하고 복제하는 경우에 주로 발현되는 단백질 세트이다. 본 발명에서 사용하기 위한 다수의 활성 마이코박테리아 항원은 문헌[참조: Bertholet et al., 2008, J. Immunol. 181: 7948-57; Bertholet and al., 2010, Sci Transl Med 2: 53ra74]에 기재되어 있다. 활성기의 특히 적절한 항원(들)은 ESAT-6(Rv3875), CFP-10(Rv3874), TB10.4(Rv0288), Ag85A(Rv3804), Ag85B(Rv1886), Rv3619, Rv3620 및 PPE 계열 단백질 Rv3478 및 Rv2608 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 바람직한 면역원성 조합물은 적어도 ESAT-6(Rv3875), Ag85B(Rv1886) 및 TB10.4(Rv0288)를 포함하거나 코딩한다.

"잠복기의 항원"은 마이코박테리움 감염의 휴면(또는 잠복) 상, 마이코박테리움이 연장된 기간 동안 지속할 수 있는 낮은 대사 활성의 가역적 상태 동안에 주로 발현된다. 본 발명에서 사용하기 위한 다수의 잠복 마이코박테리아 항원은 문헌에 기재되어 있다. 예시적 Mtb 잠복 항원은 영양소의 고갈시에 상향 조절되는 저산소증 및 기아 항원에 대한 박테리아 반응을 매개하는 DosR 레귤론에 의해 코딩된 것들이다[참조: Voskuil et al., 2003, J. Exp Med 198: 705-13; Leyten et al., 2006, Microbes Inf. 8: 2052-60; Roupie et al., 2007, Infection and Immunity 75: 941-9; Black et al., 2009, Clin Vaccine Immunol 16: 1203-12; Schuck et al., 2009, PLoS One 4: e5590; Vipond et al., 2006, Vaccine 24: 6340-50; Vipond et al., 2007, Tuberculosis 86: 218-24; Bertholet et al., 2008, J. Immunol. 181: 7948-57; Bertholet et al., 2010, Sci Transl Med 2: 53ra74, Mollenkopf et al., 2004, Infect Immun 72: 6471-9); WO03/000721; WO03/004520; WO03/035681; WO2004/006952 및 WO2006/104389]. 잠복기의 특히 적절한 항원(들)은 Rv0081, Rv0111, Rv0198, Rv0569, Rv1733c, Rv1735, Rv1737, Rv1806, Rv1807, Rv1813, Rv2005c, Rv2029c, Rv2032, Rv2626, Rv2627, Rv2628, Rv2660c, Rv3407 및 Rv3812 및 Rv3478 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 그룹; 및 보다 바람직하게는 Rv0111, Rv1733, Rv2029 및 Rv2626, 또는 Rv0569, Rv1807, Rv1813, Rv3407 및 Rv3478, 또는 Rv0111, Rv1733, Rv2029, Rv2626, Rv0569, Rv1807, Rv1813, Rv3407 및 Rv3478 둘 다로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

"소생기의 항원"은 주로 발현되거나 휴면 상태와 활성 성장 및 복제(마이코박테리움 감염의 활성 상태) 사이의 전이에 관여하는 임의의 항원을 지칭한다. 본 발명에서 사용하기 위한 소생 항원은 문헌[참조: Mukamolova et al., 2002, Mol Microbiol 46: 623-35; Yeremeev et al., 2003, Infection and Immunity 71: 4789-94; Mukamolova et al., 2006, Mol Microbiol 59: 84-98; Tufariello et al., 2006, Infect Immun 74: 2985-95; Biketov et al., 2007, MMC Infect Dis 7: 146; Kana et al., 2008, Mol Microbiol 67: 672-84; Kana et al., 2009, FEMS Immunol Med Microbiol 58: 39-50; Russel-Goldman et al., 2008, Infect Immun 76: 4269-81; Gupta et al., 2010, Microbiol 156: 2714-22 and Commandeur et al., 2011, Clin Vaccine Immunol. 18: 676-83]에 기재되어 있다. 소생기의 특히 적절한 항원(들)은 RpfA, RpfB, RpfC, RpfD 및 RpfE 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 바람직한 면역원성 조성물은 적어도 RpfB 및 RpfD(예: 이의 면역원성 단편)을 포함하거나 코딩한다.

바람직한 실시형태에서, 본 발명의 면역원성 조합물은 ESAT-6(Rv3875), CFP-10(Rv3874), TB10.4(Rv0288), Ag85A(Rv3804), Ag85B(Rv1886), Rv3619, Rv3620, RpfA, RpfB, RpfC, RpfD, RpfE, Rv0081, Rv0111, Rv0198, Rv0569, Rv1733c, Rv1735, Rv1737, Rv1806, Rv1807, Rv1813, Rv2005c, Rv2029c, Rv2032, Rv2626, Rv2627, Rv2628, Rv2660c, Rv3407 Rv3478 및 Rv3812로 이루어진 그룹; 바람직하게는 ESAT-6(Rv3875), TB10.4(Rv0288), Ag85B(Rv1886), RpfB, RpfD, Rv0111, Rv0569, Rv1733c, Rv1807, Rv1813, Rv2029c, Rv2626, Rv3407 및 Rv3478로 이루어진 그룹; 및 보다 바람직하게는 서열번호 1 내지 14에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체 또는 단편을 포함하는 폴리펩티드의 그룹으로부터 선택되는 적어도 5 종의 마이코박테리아 항원을 포함하거나 또는 코딩한다.

설명의 목적을 위해, 서열번호 1은 Rv0111의 아미노산 서열을 나타내고; 서열번호 2는 TB10.4의 아미노산 서열을 나타내고; 서열번호 3은 Rv0569의 아미노산을 나타내고; 서열번호 4는 RpfB의 아미노산 서열을 나타내고; 서열번호 5는 Rv1733의 아미노산 서열을 나타내고; 서열번호 6은 Rv1807의 아미노산 서열을 나타내고; 서열번호 7은 Rv1813의 아미노산 서열을 나타내고; 서열번호 8은 Ag85B의 아미노산 서열을 나타내고; 서열번호 9는 Rv2029의 아미노산 서열을 나타내고; 서열번호 10은 Rv2626의 아미노산 서열을 나타내고; 서열번호 11은 RV2839c의 아미노산 서열을 나타내고; 서열번호 12는 Rv3407의 아미노산 서열을 나타내고; 서열번호 13은 Rv3478의 아미노산 서열을 나타내고; 서열번호 14는 ESAT-6의 아미노산 서열을 나타낸다.

본 발명의 맥락에서 고려될 수 있는 각각의 변형된 마이코박테리아 항원은 천연 대응물과 관련하여 하나 이상의 변형, 및 특히 생성되는 폴리펩티드의 합성, 가공, 안정성 및/또는 용해도 및/또는 이의 면역성에 유리한 하나 이상의 변형을 포함한다. 적합한 변형의 대표적 예는, 제한 없이, (a) 내부 고도 소수성 영역(들)의 결실, (b) N-말단 신호 펩티드의 결실(필요한 경우, 이종성인 것으로 치환) 및/또는 (c) 안정성, 면역성 및 재조합 발현을 부정적으로 간섭할 수 있는 접히지 않은 영역의 결실 및/또는 (d) 생물학적 활성을 무효화하기 위한 촉매 도메인의 결실 또는 돌연변이를 포함한다.

특히 적절한 면역원성 조성물은 서열번호 15 내지 24에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 그룹으로부터 선택된 마이코박테리아 항원을 포함하거나 코딩한다. 보다 구체적으로, 서열번호 15는 소수성 N-말단 부분(최초 서열 내지 약 위치 393)의 결실에 의해 천연 대응물과 관련하여 변형된 Rv0111 항원(Rv0111*)을 나타낸다. 서열번호 16은 신호 펩티(최초 서열 내지 대략 위치 29의 잔기 및 촉매 도메인의 결실에 의해, 따라서 대략 위치 30 내지 위치 283의 RfpB를 보유)의 결실에 의해 천연 대응물과 관련하여 변형된 RpfB 항원을 나타낸다. 서열번호 17은 N-말단 추정된 TM 도메인(최초 잔기 내지 약 위치 61)의 결실에 의해 천연 대응물과 관련하여 변형된 Rv1733 항원(Rv1733*)을 나타낸다. 서열번호 18은 접히지 않은 C-말단 부분(대략 최후 60개 잔기)의 결실에 의해 천연 대응물과 관련하여 변형된 Rv1807 항원(Rv1807*)을 나타낸다. 서열번호 19는 N-말단 신호 펩티드(최초 잔기 내지 약 위치 34)의 결실에 의해 천연 대응물과 관련하여 변형된 Rv1813 항원(Rv1813*)을 나타낸다. 서열번호 20은 N-말단 신호 펩티드(최초 잔기 내지 약 위치 39)의 결실에 의해 천연 대응물과 관련하여 변형된 Ag85B(Ag85B*)를 나타낸다. 서열번호 21은 C-말단 부분(대략 최후 25개 잔기)의 결실에 의해 천연 대응물과 관련하여 변형되고 Rv2029 효소 활성(예: D265N; Cabrera et al., 2010, Arch Biochem Biophys 502: 23-30)을 폐지하기 위해 위치 265에서 돌연변이된 Rv2029 항원(Rv2029*)을 나타낸다. 서열번호 22는 관련된 효소 활성(예: E292K, T315A 및 Q347A)을 폐지하는 것을 목적으로 하는 3개 돌연변이 및 최후 7개 잔기의 결실을 갖는 촉매 도메인(또한 리소자임 도메인용의 LD로 불리워짐)을 보유하도록 천연 대응물과 관련하여 변형된 RpfD 항원을 나타낸다. 서열번호 23은 폴딩되지 않은 C-말단 부분(대략 최후 33개 잔기)의 결실에 의해 천연 대응물과 관련하여 변형된 Rv3407 항원(Rv3407*)을 나타낸다. 서열번호 24는 폴딩되지 않은 C-말단 부분(대략 최후 40개 잔기)의 결실에 의해 천연 대응물과 관련하여 변형된 Rv3478 항원(Rv3478*)을 나타낸다.

바람직한 실시형태에서, 본 발명의 면역원성 조합물은, 전장 폴리펩티드 또는 이의 단편(예: 50개의 연속 아미노산 잔기 이상, 예를 들면, 60, 75, 80 또는 90개 아미노산 잔기의 단편), 및 특히 서열번호 1 내지 24 중의 어느 하나와 적어도 80% 상동성이거나 동일한 아미노산 서열(개시제 Met의 존재 또는 부재)을 포함하는 폴리펩티드 그룹으로부터 선택된 적어도 5개 Mtb에 걸쳐 본원에 기재된 아미노산 서열과 적어도 80% 동일성(예: 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성)을 나타내는 적어도 5개의 마이코박테리아 항원을 포함하거나 코딩한다.

보다 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 서열번호 15에 기재된 Rv0111*에 대해 특이적 선택성을 갖는 적어도 Rv0111을 포함하거나 발현한다.

보다 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 면역원성 조합물은 서열번호 15에 기재된 바와 같이 Rv0111*에 대해 특이적 선택성을 갖는 Rv0111, Rv2626, RpfB, RpfD, TB10.4 및 Ag85B, 서열번호 10에 기재된 바와 같은 Rv2626, 서열번호 16에 기재된 바와 같은 RpfB, 서열번호 22에 기재된 바와 같은 RpfD, 서열번호 2에 기재된 바와 같은 TB10.4 및 서열번호 20에 기재된 바와 같은 Ag85B를 적어도 포함하거나 발현한다.

상기 설명된 바와 같이, 본 발명의 면역원성 조성물은 이의 구성적 마이코박테리아 항원 및/또는 코딩하는 핵산 분자의 임의의 정렬을 포함한다. 따라서, 본 발명의 면역원성 조합물은 분리된 폴리펩티드 형태(예: 재조합에 의해 생성된 Mtb 항원의 혼합물) 또는 하나 이상의 융합 폴리펩티드 형태(적어도 2개의 마이코박테리아 항원의 공유 결합) 또는 분리된 항원(들) 및 융합체(들) 둘 다로 마이코박테리아 항원을 포함하거나 코딩할 수 있다.

동일 선상에서, 핵산 분자의 조합물은 분리된 핵산 분자 또는 공유 결합된 핵산 분자(예: 융합체-코딩 핵산), 또는 하나 이상의 벡터(들)에 의해 운반될 수 있다.분리된 및 융합된 핵산 분자 둘 다를 포함한다. 마이코박테리아 항원의 수(5 내지 50)가 제공되면, 바람직한 조합물은 하기 기재된 항원 융합체를 코딩하는 하나 이상의 벡터(들)를 포함한다. 벡터 조합물은 동일한 유형의 벡터(예: 2개 MVA) 또는 상이한 유형의 벡터(예: 플라스미드 DNA 및 MVA)를 사용하여 본원에 기재된 다양한 마이코박테리아 항원 또는 융합체를 발현할 수 있다.

융합 폴리펩티드

또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 또한 본 발명의 면역원성 조합물을 포함하거나 코딩된 2개 이상의 마이코박테리아 항원을 포함하는 단리된 융합 폴리펩티드 뿐만 아니라 이러한 융합 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 제공한다.

본원에서 사용된 바와 같은 용어 "융합" 또는 "융합 폴리펩티드"는 단일 폴리펩티드 쇄에서 2개 이상의 폴리펩티드의 공유 결합을 지칭하고, 유전적 수단에 의해, 즉 각각의 상기 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 프레임 내에서 융합함으로써 수행된다. "프레임 내에서 융합된"이란, 융합된 코딩 서열의 발현이 각각의 융합된 폴리펩티드 사이의 임의의 전사 터미네이터 부재하에 단일 폴리펩티드를 생성하는 것을 의미한다. 융합은 직접(이들 사이의 임의의 추가의 아미노산 잔기 부재) 또는 간접(예: 융합된 폴리펩티드 사이의 링커를 통해)적일 수 있고, 폴리펩티드의 N 또는 C 말단에서 또는 내부적으로 발생할 수 있다. 링커의 존재는 융합 폴리펩티드의 정확한 폴딩 및/또는 기능을 촉진할 수 있다. 본 발명은 사용된 링커 서열의 형태, 크기 또는 수에 의해 제한되지 않는다. 설명의 목적으로, 전형적 링커는 3 내지 30개 아미노산 길이이고, 글리신, 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 알라닌 및/또는 프롤린 등의 아미노산 잔기의 반복체를 포함한다.

전술한 바와 같이, 본 발명의 융합 폴리펩티드를 포함할 수 있는 마이코박테리아 항원은 천연의 것 및/또는 변형된 것(변이체) 및/또는 상기한 바와 같은 이의 단편(들)일 수 있다. 융합 폴리펩티드 형태로 사용하기 위한 마이코박테리아 항원의 이러한 조합물은 분리된 항원의 혼합물(또는 발현 벡터)에 사용된 동일한 항원 조합물과 비교하여 개선된 면역원성을 제공할 수 있다.

바람직하게는, 본 발명의 융합 폴리펩티드는 본원에 기재된 바와 같은 적어도 2개(예: 2, 3, 4, 5, 6 등)의 마이코박테리아 항원, 및 바람직하게는 서열번호 1 내지 24 중의 어느 하나와 적어도 80%(예: 98 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 그룹으로부터 선택된 적어도 2개의 폴리펩티드를 포함한다.

한 가지 실시형태에서, 본 발명의 융합 폴리펩티드는 동일한 감염기의 마이코박테리아 항원을 포함한다. 잠복 Mtb 항원의 예시적 융합체는 Rv2029, Rv2626, Rv1733 및 Rv0111을 포함하고; 활성 Mtb 항원의 예시적 융합체는 Ag85B, TB10.4 및 ESAT6을 포함하고; 소생 Mtb 항원의 예시적 융합체는 RpfB 및 RpfD 항원을 포함한다.

또 다른 실시형태에서, 본 발명의 융합 폴리펩티드는 2개의 상이한 감염 상 또는 심지어 활성기, 소생기 및 잠복기로부터 균등 (even)의 마이코박테리아 항원을 포함한다. 이러한 유형의 예시적 융합체는, 제한 없이, Rv2029, TB10.4, ESAT-6 및 Rv011을 포함하는 잠복 및 활성 Mtb 항원의 융합체; RpfB, RpfD, Ag85B, o10.4 및 ESAT-6을 포함하는 소생 및 활성 Mtb 항원의 융합체 뿐만 아니라 Ag85B, Rv2626, RpfB, -RpfD 및 Rv1733을 포함하는 잠복, 소생 및 활성 Mtb 항원의 융합체를 포함한다.

바람직한 실시형태에서, 본 발명의 융합 폴리펩티드는

- Mtb 항원 Rv0111을 포함하는 융합 폴리펩티드(서열번호 15에 기재된 바와 같은 Rv0111에 대해 특이적 선택성을 가짐);

- Mtb 항원 Rv2029, Rv2626, Rv1733 및 Rv0111을 포함하는 융합 폴리펩티드;

- Mtb 항원 Rv0569, Rv1813, Rv3407, Rv3478 및 Rv1807을 포함하는 융합 폴리펩티드;

- Mtb 항원 Ag85B, TB10.4 및 ESAT6을 포함하는 융합 폴리펩티드;

- Mtb 항원 RpfB 및 RpfD을 포함하는 융합 폴리펩티드(예: LD-결실된 RpfB 항원과, 효소적 활성을 폐지하는 돌연변이를 갖는 RpfD의 LD 도메인 사이의 융합인 소위 RPFB-Dhyb에 의해 설명된 바와 같음);

- Mtb 항원 RpfB, RpfD(예: RPFB-Dhyb), Ag85B, TB10.4 및 ESAT6을 포함하는 융합 폴리펩티드;

- Mtb 항원 Ag85B, Rv2626, RpfB, RpfD(예: RPFB-Dhyb) 및 Rv1733을 포함하는 융합 폴리펩티드;

- Mtb 항원 Rv2029, TB10.4, ESAT6 및 Rv0111을 포함하는 융합 폴리펩티드; 및

- Mtb 항원 Ag85B, Rv2626 및 Rv1733을 포함하는 융합 폴리펩티드로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

본 발명의 맥락에서, 예시적 융합 폴리펩티드에서 동정된 마이코박테리아 항원은 N 말단으로부터 C 말단까지 임의의 순서로 존재할 수 있고, 반드시 인용된 순서로 존재할 필요는 없다. 따라서, Mtb 항원 Ag85B, Rv2626 및 Rv1733을 포함하는 융합체는 인용된 Ag85B-Rv2626-Rv1733 융합체에 추가하여 Ag85B-Rv1733-Rv2626; Rv1733-Rv2626-Ag85B; Rv1733-Ag85B-Rv2626; Rv2626-Ag85B-Rv1733; Rv2626-Rv1733-Ag85B 및 Ag85B-TB10.4-Rv2626-Ag85B 등의 융합체를 포함한다.

마이코박테리아 항원에 추가하여, 본 발명의 면역원성 조합물 및/또는 융합 폴리펩티드는 마이코박테리움 종(예: 추가의 마이코박테리아 항원(들))로부터 유래할 수 있거나 이종성(즉, 마이코박테리움과 상이한 공급원으로부터)일 수 있는 다른 성분을 임의로 포함할 수 있다. 이러한 추가의 성분(들)은 면역원성이거나 면역원성이 아닐 수 있다. 대표적인 추가의 성분은, 임의의 제한 없이, 태그 펩티드(들), 표적화 펩티드(들), 올리고머화 도메인(들), 면역활성제 펩티드(들)/폴리펩티드(들), 및 이러한 요소(들)을 코딩하는 핵산 분자(들) 등을 포함한다.

한 가지 실시형태에서, 본 발명의 면역원성 조합물 또는 융합 폴리펩티드에 존재하거나 이에 의해 코딩된 임의의 마이코박테리아 항원(들)은 신호 및/또는 막관통 펩티드 등의 표적화 펩티드에 작동적으로 연결될 수 있다. 이러한 표적화 펩티드는 당해 기술분야에 공지되어 있다참조: WO99/03885]. 요약하면, 신호 펩티드(SS)는 막-제시된 또는 분비된 폴리펩티드의 N-말단에 일반적으로 존재하고, 소포체(ER) 내로의 이들의 통과를 개시한다. 이들은 15개 이상의 본질적으로 소수성 아미노산을 포함하고, 이어서 특정의 ER-위치된 엔도펩티다제에 의해 제거되어 성숙 폴리펩티드를 제공할 수 있다. 막관통 펩티드(TM)은 통상 성질상 고도로 소수성이고, 폴리펩티드를 세포막에 고정시키는 작용을 한다. 본 발명의 맥락에서 사용될 수 있는 막관통 및/또는 신호 펩티드의 선택은 광범위하다. 이들은 임의의 막-고정된 및/또는 분비된 폴리펩티드(예: 세포 또는 바이러스 폴리펩티드), 예를 들면, 면역글로불린, 조직 플라스미노겐 활성화제(tPA), 인슐린, 광견병 당단백질, HIV 바이러스 엔벨로프 당단백질 또는 홍역 바이러스 F 단백질로부터 수득할 수 있거나, 합성할 수 있다. 신호 펩티드의 바람직한 삽입 부위는 해독 개시를 위한 코돈의 하류의 N-말단이고, 막관통 펩티드의 삽입 부위는, 예를 들면, 정지 코돈의 즉시 상류의 C-말단이다.

대안적으로 또는 추가로, 본 발명의 면역원성 조합물 또는 융합 단백질에 존재하거나 이에 의해 코딩된 임의의 마이코박테리아 항원(들)은 이의 단리 및 검출을 촉진하거나 이러한 항원 또는 융합체를 발현하는 숙주 세포의 동정을 촉진하기 위해 태그 펩티드에 작동적으로 연결될 수 있다. 다양한 태그 펩티드는 본 발명의 맥락에서 사용될 수 있고, 제한 없이, PK 태그, FLAG 태그(서열번호 25), MYC 태그(서열번호 26), 폴리히스티딘 태그(5 내지 10개의 히스티딘 잔기의 스트렛치; 예를 들면, 서열번호 27)를 포함할 수 있다. 태그 펩티드는 첨부된 실시예에 기재된 바와 같은 항-태그 항체를 사용하는 면역검출 분석에 의해 검출할 수 있다. 태그 펩티드(들)은 마이코박테리아 항원 또는 융합체(태그-폴리펩티드)의 N-말단 또는 대안적으로 이의 C-말단(폴리펩티드-태그), 또는 대안적으로 내부에, 또는 몇몇 태그가 사용되는 경우, 임의의 이들 위치에 독립적으로 위치할 수 있다.

대안적으로 또는 추가로, 본 발명의 면역원성 조합물 또는 융합 폴리펩티드에 존재하거나 이에 의해 코딩된 임의의 마이코박테리아 항원(들)은 면역원성 특성을 증강시킬 수 있는 하나 이상의 면역활성제 펩티드/폴리펩티드에 작동적으로 연결될 수 있다. 예를 들면, 칼레티쿨린[참조: Cheng et al., 2001, J. Clin. Invest. 108: 669], Mtb 열 충격 단백질 70(HSP70)[참조: Chen et al., 2000, Cancer Res. 60: 1035], 유비퀴틴[참조: Rodriguez et al., 1997, J. Virol. 71: 8497], 및 T 헬퍼 에피토프(들), 예를 들면, Pan-Dr 펩티드[참조: Sidney et al., 1994, Immunity 1: 751], pstS1 GCG 에피토프[참조: Vordermeier et al., 1992, Eur. J. Immunol. 22: 2631], 테타누스 톡소이드 펩티드 P2TT[참조: Panina-Bordignon et al., 1989, Eur. J. Immunol. 19: 2237], P30TT[참조: Demotz et al., 1993, Eur. J. Immunol. 23: 425], 헤마글루티닌 에피토프[참조: Rothbard et al., 1989, Int. Immunol. 1: 479] 및 C4bp 올리고머화 도메인[참조: Spencer et al., 2012, PLos One 7:e33555]을 언급할 수 있다.

마이코박테리아 항원에 따라, 이러한 펩티드(들)의 존재는, 이러한 펩티드의 부재하에 발현된 조합물 또는 융합체와 비교하여, 생성되는 조합물 또는 융합 폴리펩티드의 발현 및/또는 면역성의 증강에 유리할 수 있다. 증강된 발현은 웨스턴 블롯팅 등의 통상의 기술에 의해 측정할 수 있다. 증강된 면역성은 ELISpot 분석 등의 통상의 분석법을 사용하여 측정할 수 있다.

바람직한 실시형태에서, 본 발명의 융합 폴리펩티드는 표적화 및/또는 태그 펩티드에 작동적으로 연결된다. 예를 들면, 첨부된 실시예 부분에 설명된 융합체 번호 2, 3, 4 및 5는 개시제 Met 및 myc 태그 직후의 N-말단에 위치된 신호 펩티드 및 Flag 태그, 정지 코돈 직전의 C-말단에 위치된 막관통 펩티드 및 His 태그에 작동적으로 연결되는 반면, 융합체 번호 9, 10, 11 및 12는 개시제 Met 및 myc 태그 직후의 N-말단에 위치된 Flag 태그, 이어서 정지 코돈 직전의 C-말단에 위치된 His 태그에 작동적으로 연결된다. 한편, 융합체 번호 6, 8, 13 및 14는 개시제 Met 및 myc 태그 직후의 N-말단에 위치된 신호 펩티드 및 Flag 태그, 및 정지 코돈 직전의 C-말단에 위치된 His 태그에 작동적으로 연결된다.

융합 폴리펩티드의 바람직한 예는서열번호 28 내지 39에 제시된 임의의 아미노산 서열과 적어도 80%의 동일성, 유리하게는 적어도 85%의 동일한, 바람직하게는 적어도 90%의 동일한, 바람직하게는 적어도 95%의 동일성 및 보다 바람직하게는 98% 동일성 및 심지어 보다 바람직하게는 100% 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어지는 폴리펩티드 그룹으로부터 선택된다. 보다 구체적으로, 서열번호 28 및 29는 각각 표적 펩티드(첨부된 실시예에서 융합체 번호 2 및 10로 제시)의 존재 및 부재하에 Ag85B, TB10.4 및 ESAT6을 포함하는 융합 폴리펩티드를 포함한다. 서열번호 30 및 31은 각각 표적화 펩티드(첨부된 실시예에서 융합체 번호 3 및 12로 제시)의 존재 및 부재하에 RpfB 및 RpfD를 포함하는 소위 RPFB-Dhyb 융합 폴리펩티드를 포함한다. 서열번호 32 및 33은 각각 표적화 펩티드(첨부된 실시예에서 융합체 번호 4 및 11로 제시)의 존재 및 부재하에 RPFB-Dhyb, Ag85B, TB10.4 및 ESAT6을 포함하는 융합 폴리펩티드를 포함한다. 서열번호 34 및 35는 각각 표적화 펩티드(첨부된 실시예에서 융합체 번호 5 및 9로 제시)의 존재 및 부재하에 Rv0569 Rv1813, Rv3407, Rv3478 및 Rv1807을 포함하는 융합 폴리펩티드를 포함한다. 서열번호 36은 신호 펩티드(첨부된 실시예에서 융합체 번호 6으로 제시)와 함께 Ag85B, Rv2626, RPFB-Dhyb 및 Rv1733을 포함하는 융합 폴리펩티드를 포함한다. 서열번호 37은 신호 펩티드(첨부된 실시예에서 융합체 번호 8로 제시)와 함께 Ag85B, Rv2626 및 Rv1733을 포함하는 융합 폴리펩티드를 포함한다. 서열번호 38은 신호 펩티드(첨부된 실시예에서 융합체 번호 13으로 제시)와 함께 Rv2029, Rv2626, Rv1733 및 Rv0111을 포함하는 융합 폴리펩티드를 포함한다. 서열번호 39는 신호 펩티드(첨부된 실시예에서 융합체 번호 14로 제시)와 함께 Rv2029, TB10.4, ESAT-6 및 Rv0111을 포함하는 융합 폴리펩티드를 포함한다.

융합 폴리펩티드의 보다 바람직한 예는 임의의 하기 아미노산 서열과 적어도 80%의 동일성, 유리하게는 적어도 85%의 동일성, 바람직하게는 적어도 90%의 동일성, 바람직하게는 적어도 95%의 동일성 및 가장 바람직하게는 98% 동일성 및 심지어 보다 바람직하게는 100% 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 대안적으로 본질적으로 이루어지거나 또는 대안적으로 이루어지는 폴리펩티드 그룹으로부터 선택된다:

- 서열번호 28에 제시된 대략 위치 32 내지 대략 위치 506의 아미노산 서열(첨부된 실시예에서 융합체 번호 2 또는 10으로 제시된 융합체 Ag85B*-TB10.4-ESAT-6);

- 서열번호 29에 제시된 대략 위치 10 내지 대략 위치 484의 아미노산 서열(첨부된 실시예에서 융합체 번호 2 또는 10으로 제시된 융합체 Ag85B*-TB10.4-ESAT-6);

- 서열번호 30에 제시된 대략 위치 32 내지 대략 위치 380의 아미노산 서열(첨부된 실시예에서 융합체 번호 3 및 12로 제시된 융합체 RPFB-Dhyb);

- 서열번호 31에 제시된 대략 위치 10 내지 대략 위치 358의 아미노산 서열(첨부된 실시예에서 융합체 번호 3 및 12로 제시된 융합체 RPFB-Dhyb);

- 서열번호 32에 제시된 대략 위치 32 내지 대략 위치 855의 아미노산 서열(첨부된 실시예에서 융합체 번호 4 및 11로 제시된 융합체 RPFB-Dhyb-Ag85B*-TB10.4-ESAT-6);

- 서열번호 33에 제시된 대략 위치 10 내지 대략 위치 833의 아미노산 서열(첨부된 실시예에서 융합체 번호 4 및 11로 제시된 융합체 RPFB-Dhyb-Ag85B*-TB10.4-ESAT-6);

- 서열번호 34에 제시된 대략 위치 32 내지 대략 위치 1115의 아미노산 서열(첨부된 실시예에서 융합체 번호 5 및 9로 제시된 융합체 Rv0569-Rv1813*-Rv3407-Rv3478-Rv1807);

- 서열번호 35에 제시된 대략 위치 10 내지 대략 위치 1093의 아미노산 서열(첨부된 실시예에서 융합체 번호 5 및 9로 제시된 융합체 Rv0569-Rv1813*-Rv3407-Rv3478-Rv1807);

- 서열번호 36에 제시된 대략 위치 32 내지 대략 위치 956의 아미노산 서열(첨부된 실시예에서 융합체 번호 6로 제시된 융합체 Ag85B*-Rv2626-RPFB-Dhyb-Rv1733*);

- 서열번호 37에 제시된 대략 위치 32 내지 대략 위치 607의 아미노산 서열(첨부된 실시예에서 융합체 번호 8로 제시된 융합체 Ag85B*-Rv2626-Rv1733*);

- 서열번호 38에 제시된 대략 위치 37 내지 대략 위치 932의 아미노산 서열(첨부된 실시예에서 융합체 번호 13으로 제시된 융합체 Rv2029-Rv2626-Rv1733*-Rv0111*); 및

- 서열번호 39에 제시된 대략 위치 37 내지 대략 위치 831의 아미노산 서열(융합체 Rv2029*-TB10.4-ESAT-6-Rv0111*).

물론, 이러한 아미노산 서열은 개시제 Met을 구비할 수 있다.

바람직한 실시형태에서, 본 발명의 융합 폴리펩티드는 적절한 표적화 펩티드(들), 예를 들면, 세포막에서 이의 제시를 가능하게 하도록 하는 신호 및/또는 막관통 펩티드를 포함한다. 보다 바람직한 융합 폴리펩티드는 임의의 하기 아미노산 서열과 적어도 80%의 동일성, 유리하게는 적어도 85%의 동일성, 바람직하게는 적어도 90%의 동일성, 바람직하게는 적어도 95%의 동일성, 및 보다 바람직하게는 98%의 동일성 및 심지어 보다 바람직하게는 100% 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 대안적으로 본질적으로 이루어지거나 또는 대안적으로 이루어지는 폴리펩티드 그룹으로부터 선택된다:

- 서열번호 28에 제시된 위치 1(개시제 Met) 내지 대략 위치 23 및 대략 위치 32 내지 대략 위치 506 및 대략 위치 517 내지 대략 위치 583의 아미노산 서열(첨부된 실시예에서 융합체 번호 2로 제시된 융합체 SS-Ag85B*-TB10.4-ESAT-6-TM);

- 서열번호 30에 제시된 위치 1(개시제 Met) 내지 대략 위치 23 및 대략 위치 32 내지 대략 위치 380 및 대략 위치 391 내지 대략 위치 457의 아미노산 서열(첨부된 실시예에서 융합체 번호 3으로 제시된 융합체 SS-RPFB-Dhyb-TM);

- 서열번호 32에 제시된 위치 1(개시제 Met) 내지 대략 위치 23 및 대략 위치 32 내지 대략 위치 855 및 대략 위치 866 내지 대략 위치 932의 아미노산 서열(첨부된 실시예에서 융합체 번호 4로 제시된 융합체 SS-RPFB-Dhyb-Ag85B*-TB10.4-ESAT-6-TM);

- 서열번호 34에 제시된 위치 1(개시제 Met) 내지 대략 위치 23 및 대략 위치 32 내지 대략 위치 1115 및 대략 위치 1126 내지 대략 위치 1192의 아미노산 서열(첨부된 실시예에서 융합체 번호 5로 제시된 융합체 SS-Rv0569-Rv1813*-Rv3407-Rv3478-Rv1807-TM);

- 서열번호 36에 제시된 위치 1(개시제 Met) 내지 대략 위치 23 및 대략 위치 32 내지 대략 위치 956의 아미노산 서열(첨부된 실시예에서 융합체 번호 6으로 제시된 융합체 SS-Ag85B*-Rv2626-RPFB-Dhyb-Rv1733*);

- 서열번호 37에 제시된 위치 1(개시제 Met) 내지 대략 위치 23 및 대략 위치 32 내지 대략 위치 607의 아미노산 서열(첨부된 실시예에서 융합체 번호 8로 제시된 융합체 SS-Ag85B*-Rv2626-Rv1733*);

- 서열번호 38에 제시된 위치 1(개시제 Met) 내지 대략 위치 28 및 대략 위치 37 내지 대략 위치 932의 아미노산 서열(첨부된 실시예에서 융합체 번호 13으로 제시된 융합체 SS-Rv2029-Rv2626-Rv1733*-Rv0111*); 및

서열번호 39에 제시된 위치 1(개시제 Met) 내지 대략 위치 28 및 대략 위치 37 내지 대략 위치 831의 아미노산 서열(첨부된 실시예에서 융합체 번호 14로 제시된 융합체 SS-Rv2029*-TB10.4-ESAT-6-Rv0111*).

전형적으로, 본 발명의 면역원성 조합물 및 융합 폴리펩티드에 포함되는 마이코박테리아 항원 및 이러한 항원을 코딩하는 핵산 분자는 표준 기술을 사용하여 단리하거나 제조할 수 있다. 이들은, 예를 들면, 박테리아 배양물로부터 정제될 수 있거나, 당해 기술분야에서 이용가능한 임의의 발현 시스템을 사용하여 숙주 세포에서 재조합에 의해 생성될 수 있거나, 본원에 기재된 것들과 같은 적합한 발현 벡터(들)의 투여로 대상체에게 제공될 수 있다.

핵산 분자 및 핵산 조합물

본 발명은 또한 본 발명의 면역원성 조합물 및 융합 폴리펩티드에 포함된 적어도 5개의 마이코박테리아 항원을 코딩하는 단리된 핵산 분자 및 이러한 핵산 분자를 포함하는 조성물을 제공한다.

본 발명의 맥락에서, 용어 "핵산", "핵산 분자", "폴리뉴클레오티드" 및 "뉴클레오티드 서열"은 상호 교환적으로 사용되고 임의 길이의 폴리데옥시리보뉴클레오티드(DNA)(예: cDNA, 게놈 DNA, 플라스미드, 벡터, 바이러스성 게놈, 단리된 DNA, 프로브, 프라이머, 이들의 임의의 혼합물) 또는 폴리리보뉴클레오티드(RNA)(예: mRNA, 안티센스 RNA) 또는 혼합된 폴리리보-폴리데옥시리보뉴클레오티드의 어느 하나의 중합체를 정의한다. 이들은 단일 또는 이중가닥, 선형 또는 환형, 천연 또는 합성 핵산을 포함한다.

상기 정의한 바와 같이, 본 발명의 핵산 분자는 천연 핵산(예: 마이코박테리움의 게놈 또는 게놈 단편으로 단리)일 수 있거나, 인간에 의해 변형되어 하나 이상의 뉴클레오티드(들)의 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입을 포함할 수 있다. 본 발명은 클로닝, 발현, 안정성을 개선하는 것을 목적으로 하는 임의의 변형을 포함한다(예를 들면, 주어진 숙주 세포에서 해독을 최적화하기 위해 적절한 제한 부위의 도입, 변성 및/또는 뉴클레오티드 서열의 최적화, 및/또는 핵산 분자 또는 이의 전사를 탈안정화시킬 수 있는 잠재적 음성 요소의 억제). 몇몇 변형이 의도되는 경우, 이들은 연속적 및/또는 비-연속적 뉴클레오티드 잔기와 관련될 수 있다. 본 발명에 의해 의도된 변형(들)은 코딩된 마이코박테리아 항원 및 융합 폴리펩티드의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 침묵 변형 뿐만 아니라 코딩된 마이코박테리아 폴리펩티드로 해독되는 변형을 포함한다. 바람직하게는, 상기 변형은 비-변형된 것과 관련하여 코딩된 마이코박테리아 항원 및 융합 폴리펩티드의 면역원성을 감소시키지 않는다.

한 가지 실시형태에서, 본 발명의 핵산 분자는 전장 뉴클레오티드 서열 또는 이의 일부(들)에 걸쳐 퇴화하여, 본 발명의 맥락에서 또는 숙주 세포에서 사용된 핵산 분자(들) 사이의 서열 상동성을 감소시킬 수 있다. 실제로, 고도의 뉴클레오티드 서열 동일성을 나타내는 핵산 서열의 일부를 퇴화시키는 것이 권장되고, 당해 기술분야의 숙련가는 생성 공정 동안 안정성 문제가 회피되도록 상동성 부분에서 핵산 분자를 퇴화시키기 위해 서열 정렬에 의해 이러한 부분을 동정할 수 있다.

대안적으로 또는 추가로, 본 발명의 핵산 분자는 특정 숙주 세포 또는 대상체, 예를 들면, 조류(예: 닭 배아 섬유아세포, WO2010/130756 및 WO2012/001075에 기재된 카이리나 모샤타(Cairina moschata) 세포주), 포유동물, 효모(예: 사카로마이세스 세레비지아에 폼베(Saccharomyces pombe) 또는 피키아 파스토리스(Pichia pastoris) 또는 박테리아(예: 이. 콜라이(E. coli), BCG 또는 리스테리아(Listeria))에서 고도 발현을 제공하도록 최적화될 수 있다. 실제로, 하나 이상의 코돈이 주어진 아미노산의 코딩에 이용가능한 경우, 생물체의 상기 코돈 사용 패턴은 고도로 비무작위화되고, 코돈의 이용이 상이한 숙주 사이에서 현저히 상이할 수 있는 것으로 관찰되었다. 본 발명에서 사용된 뉴클레오티드 서열은 대부분 박테리아 기원이기 때문에, 이들은 고등 진핵 세포 등의 숙주 세포에서 효율적 발현을 위해 적절한 코돈 이용 패턴을 가질 수 있다. 전형적으로, 코돈 최적화는 목적하는 숙주 세포에 빈번하지 않게 사용된 코돈에 상응하는 하나 이상의 "천연"(마이코박테리아) 코돈을, 보다 빈번하게 사용되는 동일한 아미노산을 코딩하는 하나 이상의 코돈으로 대체함으로써 수행된다. 증가된 발현은 부분 대체에 의해서도 달성될 수 있기 때문에, 빈번하지 않게 사용된 코돈에 상응하는 모든 천연 코돈을 대체할 필요는 없다. 더욱이, 최적화된 코돈 사용에 대한 엄격한 부착으로부터의 몇몇 편차는 생성되는 핵산 분자 내로 제한 부위(들)의 도입에 수용하도록 이루어질 수 있다.

코돈 사용의 최적화에 추가하여, 숙주 세포 또는 대상체에서의 발현은 뉴클레오티드 서열의 추가의 변형을 통해 추가로 개선될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 핵산 분자는 농축된 부분에 존재하는 희귀 비-최적 코돈의 클러스터화를 방지하고/하거나 발현 수준에 부정적으로 영향을 미칠 것으로 예상되는 "음성" 서열 요소를 억제 또는 변형하도록 변형될 수 있다. 이러한 음성 서열 요소는, 제한 없이, 매우 높은(>80%) 또는 매우 낮은(<30%) GC 함량을 갖는 영역; AT-농후 또는 CG-농후 서열 스트렛치; 불안정한 직접 또는 역방향 반복 서열; RNA 2차 구조; 및/또는 내부 암호 조절 요소, 예를 들면, 내부 TATA-박스, 카이-부위, 리보솜 도입 부위 및/또는 스플라이싱 공여체/수용체 부위를 포함한다.

본 발명은 서열번호 1 내지 24 중의 어느 한 항에 기재된 폴리펩티드 그룹으로부터 선택된 임의의 마이코박테리아 항원을 코딩하는 핵산 분자를 포함한다.

특히 흥미로운 것은 서열번호 28 내지 39에 제시된 임의의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체 및 단편(예: 상기 인용된 이러한 서열번호 28 내지 39의 예시적 부분(들)을 코딩하는 단편)과 적어도 80%의 동일성(예: 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 100%)을 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 융합 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자이다.

본 발명의 특히 바람직한 측면는 서열번호 40 내지 51 중의 어느 하나에 제시된 뉴클레오티드 서열 또는 이의 임의의 변이체 및 단편(상기 인용된 서열번호 28 내지 39의 예시적 부분을 코딩함)과 적어도 80%의 동일성(즉, 엄격한 조건하에 인용된 핵산 분자와 하이브리드화하는 핵산 분자), 유리하게는 적어도 85%의 동일성, 바람직하게는 적어도 90%의 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 95%의 동일성 및 보다 더 바람직하게는 100% 동일성을 나타내는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 또는 대안적으로 본질적으로 이루어지거나 또는 대안적으로 이루어지는 핵산 분자에 관한 것이다.

본 발명의 핵산 분자는 당해 기술분야에서 접근가능한 서열 데이터 및 본원에 제공된 서열 정보를 사용하여 생성될 수 있다. 예를 들면, 이들은 당해 기술분야에 공지된 통상의 기술을 사용하여, 예를 들면, PCR 단리 및/또는, 특정 종의 마이코박테리움 게놈 또는 이의 게놈 단편, cDNA 및 게놈 라이브러리, 또는 이를 포함하는 것으로 공지된 임의의 종래 기술의 벡터로부터 통상의 분자 생성물의 클로닝에 의해 단리할 수 있다. 또는, 본 발명의 핵산 분자는 자동화 공정으로 화학적 합성에 의해 또한 생성될 수 있다(예: 중첩 합성 올리고뉴클레오티드로부터 조립됨).

본 발명의 또 다른 측면는 본 발명의 핵산 분자의 단편, 예를 들면, 제한 엔도뉴클레아제 및 PCR-생성된 단편에 관한 것이다. 이러한 단편은 관련 면역원성 부분(들)을 코딩하는 프로브, 프라이머 또는 단편으로 사용될 수 있다.

벡터

본 발명은 또한 본 발명의 하나 이상의 핵산 분자(들)를 포함하는 벡터 뿐만 아니라 이러한 벡터(들)를 포함하는 조성물에 관한 것이다.

본원에서 사용된 바와 같은 용어 "벡터"는 비히클, 바람직하게는 숙주 세포 또는 대상체에서 본원에 기재된 임의의 핵산 분자(들)의 전달, 증식 및/또는 발현을 가능하게 하는데 필요한 요소를 함유하는 핵산 분자 또는 바이러스 입자를 지칭한다. 이 용어는 다양한 숙주 세포 또는 대상체에서 유지용 벡터(클로닝 벡터) 또는 발현용 벡터(발현 벡터), 염색체외 벡터(예: 다카피 플라스미드) 또는 통합 벡터(예: 숙주 세포 게놈 내로 통합하고, 숙주 세포가 복제하는 경우, 핵산 분자의 추가 카피를 생성하도록 설계됨) 뿐만 아니라 셔틀 벡터(예: 원핵생물 및/또는 진핵생물 숙주 둘 다에서 기능함) 및 전이 벡터(예: 바이러스 게놈에서 핵산 분자(들)를 전달하기 위해)를 포함한다. 본 발명의 목적을 위해, 벡터는 천연 발생 유전자 공급원, 합성 또는 인공, 또는 천연 및 합성 유전자 요소의 몇몇 조합물의 것일 수 있다.

본 발명의 맥락에서, 용어 "벡터"는 플라스미드 및 바이러스 벡터를 포함하는 것으로 광범위하게 이해되어야 한다. 본원에서 사용된 바와 같은 "플라스미드 벡터"는 복제가능한 DNA 작제물을 지칭한다. 통상적으로, 플라스미드 벡터는 플라스미드 벡터를 포함하는 숙주 세포가 상응하는 선택적 약물의 존재하에 선택되도록 하는 선택가능한 마커 유전자를 함유한다. 다양한 양성 및 음성 선택가능한 마커 유전자는 당해 기술분야에 공지되어 있다. 설명을 위해, 항생물질 내성 유전자는 숙주 세포가 상응하는 항생물질의 존재하에 선택되도록 하는 양성 선택가능한 마커 유전자로서 사용될 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같은 용어 "바이러스 벡터"는 바이러스 게놈의 적어도 하나의 요소를 포함하고 바이러스 입자 내로 또는 바이러스 입자로 팩키징될 수 있는 핵산 벡터를 지칭한다. 용어 "바이러스", "비리온", "바이러스 입자" 및 "바이러스 벡터 입자"는, 핵산 벡터가 바이러스 입자의 생성을 가능하게 하는 적합한 조건에 따라 적절한 세포 또는 세포주 내로 형질도입되는 경우에 형성되는 바이러스 입자를 지칭하기 위해 상호 교환적으로 사용된다. 본 발명의 맥락에서, 용어 "바이러스 벡터"는 핵산 벡터(예: DNA 바이러스 벡터) 뿐만 아니라 이의 생성된 바이러스 입자를 포함하는 것으로 광범위하게 이해되어야 한다. 용어 "감염성"은 숙주 세포 또는 대상체 내로 감염 및 도입되는 바이러스 벡터의 능력을 지칭한다. 바이러스 벡터는 복제-경쟁적 또는 -선택적(예: 특정의 숙주 세포에서 양호하게 또는 선택적으로 복제하도록 조작됨)일 수 있거나, 복제-결함 또는 복제-손상되도록 유전적으로 무효하게 할 수 있다.

본 발명의 맥락에서 적절한 벡터는, 제한 없이, 원핵생물 숙주, 예를 들면, 박테리아(예: 이. 콜라이(E. Coli), BCG 또는 리스테리아(Listeria))에서 발현시키기 위한 박테리오파지, 플라스미드 또는 코스미드 벡터; 효모(예: 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae), 시조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 피키아 파스토리스(Pichia pastoris))에서 발현시키기 위한 벡터; 곤충 세포 시스템(예: Sf9 세포)에서 발현시키기 위한 바쿨로바이러스 벡터; 식물 세포 시스템에서 발현시키기 위한 바이러스 및 플라스미드 벡터(예: Ti 플라스미드, 꽃양배추 모자이크 바이러스 CaMV; 담배 모자이크 바이러스 TMV) 뿐만 아니라 고등 진핵생물 세포 또는 대상체에서 발현시키기 위한 플라스미드 및 바이러스 벡터를 포함한다. 전형적으로, 이러한 벡터는 상업적으로 입수가능하거나(예: Invitrogen, Stratagene, Amersham Biosciences, Promega 등), 기탁 기관, 예를 들면, 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection)(ATCC, Rockville, Md.)으로부터 입수가능하거나, 이들의 서열, 조직 및 생성 방법을 기재하고 당업자가 이들을 적용할 수 있게 하는 다수의 간행물의 주제였다.

적합한 플라스미드 벡터의 대표적 예는, 제한 없이, pREP4, pCEP4(Invitrogen), pCI(Promega), pVAX(Invitrogen) 및 pGWiz(Gene Therapy System Inc)을 포함한다.

적합한 바이러스 벡터의 대표적 예는 각종 상이한 바이러스(예: 레트라바이러스, 아데노바이러스, 아데노바이러스-연관 바이러스(AAV), 폭스바이러스, 헤르페스 바이러스, 홍역 바이러스, 포말상 바이러스, 알파바이러스, 수포성 구내염 바이러스 등)으로부터 생성된다. 상기 기재된 바와 같이, 용어 "바이러스 벡터"는 벡터 DNA, 게놈 DNA 뿐만 아니라 이의 생성된 바이러스 입자 및 특히 감염성 바이러스 입자를 포함한다.

한 가지 실시형태에서, 본 발명에서 사용된 바이러스 벡터는, 정상 세포(예: 정상 인간 세포)에서 또는 투여되는 대상체에서 임의의 상당한 정도로 복제할 수 없는 것을 의미하는 복제-결함 또는 복제-손상된 것이다(복제 기능의 손상 또는 결함은 통상의 수단, 예를 들면, 비-허용 세포에서 DNA 합성 및/또는 바이러스 역가의 측정에 의해 평가할 수 있음). 이러한 복제-결함 또는 손상된 벡터는 전형적으로 결실/손상된 기능을 가져오거나 보충하는 증식, 허용 세포주를 필요로 한다.

본 발명의 문맥에서 유용한 바이러스 벡터의 예는 백신화, 면역치료, 유전자 전이 또는 재조합 생성을 위해 다수의 확립된 잇점을 갖는 아데노바이러스 벡터를 포함한다[참조: "Adenoviral vectors for gene therapy", 2002, Ed D. Curiel and J. Douglas, Academic Press]. 본 발명의 아데노바이러스 벡터는 다양한 인간 또는 동물 공급원(예: 개, 양, 유인원 아데노바이러스 등)으로부터 유래할 수 있다. 임의의 혈청형은 인간 아데노바이러스에 대한 특별한 선택성 및 아속 C, 예를 들면, Ad2, Ad5, Ad6, 및 아속 B, 예를 들면, Ad11, Ad34 및 Ad35에 대한 특별한 선택성으로 사용될 수 있다. 또한, 침팬지 Ad, 예를 들면, 침팬지 Ad3 및 Ad63에 대한 특별한 선택성을 갖는 동물 Ad를 사용하는 것이 유리할 수 있다. 인용된 아데노바이러스는 ATCC로부터 입수가능하거나, 이들의 서열, 조직 및 생성 방법을 기재하고 당업자가 이들을 적용하는 것을 가능하게 하는 다수의 간행물의 주제였다[참조: US 6,136,594; US 6,133,028; WO00/50573; WO00/70071; WO2004/083418; WO2004/097016 및 WO2005/071093].

바람직한 복제-결함 아데노바이러스 벡터는 대략 위치 459 내지 3328 또는 대략 위치 459 내지 3510(수탁번호 M 73260호하에 진뱅크(GeneBank)에 개시된 Ad5의 서열을 참조로 하여)으로 연장하는 E1 결실을 갖는 E1-결함이다. 클로닝 능력은 아데노바이러스 게놈의 추가 부분을 결실시킴으로써 추가로 개선시킬 수 있다(비-필수 E3 영역(예: 대략 위치 27867 내지 30743의 결실) 또는 문헌[참조: WO94/28152 및 Lusky et al., 1998, J. Virol 72: 2022]에 기재된 기타 필수 E2 및/또는 E4 영역의 전부 또는 일부).

본 발명의 핵산 분자는 E1 및/또는 E3 영역의 대체로 삽입을 위해 특이적 선택성으로 아데노바이러스 게놈의 임의의 위치에 독립적으로 삽입될 수 있다. 이들은 문제의 영역의 자연적 전사 방향에 대해 센스 또는 안티센스 배향으로 위치될 수 있다.

본 발명의 맥락에서 특히 적절한 바이러스 벡터의 다른 예는 폭스바이러스 벡터, 예를 들면, 계두 벡터(예: FP9), 카나리팍스 벡터(예: ALVAC) 및 백시니아 바이러스 벡터를 포함하고, 후자가 바람직하다. 적합한 백시니아 바이러스는, 제한 없이, 코펜하겐 균주, 와이어스 (Wyeth) 균주, NYVAC(US 5,494,807) 및 변형된 안카라(MVA) 균주[참조: Antoine et al., 1998, Virol. 244: 365; WO02/42480]를 포함한다. 재조합 폭스바이러스를 작제하고 생성하는 일반 조건은 당해 기술분야에 공지되어 있다[참조: WO2010/130753; WO03/008533; US 6,998,252; US 5,972,597 및 US 6,440,422]. 본 발명의 핵산 분자는 바람직하게는 비-필수 유전자좌에서 폭스바이러스 게놈 내에 삽입된다. 티미딘 키나제 유전자는 코펜하겐 백시니아 벡터에서의 삽입에 특히 적절하고, 결실 II 또는 III은 MVA 벡터에서의 삽입에 특히 적절하다(WO97/02355).

본 발명의 맥락에서 적합한 기타 바이러스 벡터는 홍역 바이러스에 대한 특이적 선택성과 함께 파라믹소비리다에 과로부터 수득할 수 있는 모르빌리바이러스이다. 다양한 약독화된 균주는 당해 기술분야[참조: Brandler et al, 2008, CIMID, 31: 271; Singh et al., 1999, J. virol. 73(6): 4823], 예를 들면, 제한 없이, 에드몬스톤 A 및 B 균주[참조: Griffin et al., 2001, Field's in Virology, 1401-1441], 슈바르츠 균주[참조: Schwarz A, 1962, Am J Dis Child, 103: 216], S-191 또는 C-47 균주[참조: Zhang et al., 2009, J Med Virol. 81 (8): 1477]에서 이용가능하다. P 및 M 유전자 사이 또는 H 및 L 유전자 사이의 삽입이 특히 적절하다.

본 발명에서 사용하기에 적합한 벡터는 또한 야생형 또는 돌연변이체(예:비병원성)일 수 있는 박테리아 세포를 포함한다. 이러한 박테리아 세포의 공지된 예는, 제한 없이, 비병원성 마이코박테리움(예: 마이코박테리움 보비스 BCG), 락토바실루스(예: 락토콕쿠스 락티스(Lactococcus lactis)), 리스테리아(예: 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes)) 및 기타 미생물, 예를 들면, 살모넬라 및 슈도모나스를 포함한다. 바람직한 실시형태는, BCG 벡터가 이러한 요소(들)를 발현하게 하는 방식으로 상기 정의한 하나 이상의 마이코박테리아 항원(들) 또는 융합 폴리펩티드(들)를 코딩하는 핵산 분자(들)가 게놈 내로 도입된 BCG 벡터에 관한 것이다.

본 발명은 또한 리포솜, 리포플렉스 또는 나노입자 등의 입자 구조체를 형성하기 위해 지질 또는 중합체와 복합체화된 벡터(예: 플라스미드 DNA)를 포함한다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 벡터에 포함된 핵산 분자는 숙주 세포 또는 대상체에서의 발현에 적합한 형태로 존재하고, 이는 본원에 기재된 각각의 핵산 분자가 적절한 조절 서열에 작동적으로 연결되어 있는 것을 의미한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "조절 요소" 또는 "조절 서열"은, 핵산(들) 또는 이의 유도체(즉, MRNA)의 복제, 중복, 전사, 스플라이싱, 해독, 안정성 및/또는 수송을 포함하여, 주어진 숙주 세포 또는 대상체에서 핵산 분자(들)의 발현을 가능하게 하거나 기여하거나 조절하는 임의의 요소를 지칭한다.

조절 서열의 선택은 벡터 자체, 숙주 세포 또는 대상체, 목적하는 발현 수준 등의 인자에 의존할 수 있음은 당해 기술분야의 숙련가에게 명백할 것이다. 프로모터는 특히 중요하다. 본 발명의 맥락에서, 이는 다수 유형의 숙주 세포에서 핵산 분자의 발현을 구성적으로 유도할 수 있거나 특정 숙주 세포(예: 폐-특이적 조절 서열)에 특이적일 수 있거나, 특이적 사상 또는 외인성 인자(예: 온도, 영양 첨가제, 호르몬 등)에 반응하여 또는 바이러스 사이클의 상(예: 후기 또는 초기)에 따라 조절될 수 있다. 또한, 바이러스 생성을 최적화하고 발현된 폴리펩티드(들)의 잠재적 독성을 회피하기 위해, 특이적 사상 또는 외인성 인자에 반응하여 생성 단계 동안 억제되는 프로모터를 사용할 수 있다.

포유동물 세포에서 구성적 발현에 적합한 프로모터는, 이로써 한정되지 않지만, 사이토메갈로바이러스(CMV) 즉시 초기 프로모터(US 5,168,062), RSV 프로모터, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터, 포스포글리세로 키나제(PGK) 프로모터, 헤르페스 심플렉스 바이러스(HSV)-1의 티미딘 키나제(TK) 프로모터 및 T7 폴리머라제 프로모터를 포함한다. trp, lac, 파지 프로모터, tRNA 프로모터 및 해당 효소 프로모터 등의 프로모터는 원핵생물 숙주에 사용될 수 있다. 유용한 효모 프로모터는 메탈로티오네인, 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 기타 해당 효소, 예를 들면, 에놀라제 또는 글리세르알데히드-3-포스페이트 데하이드로게나제, 말토즈 및 갈라토즈 사용에 관여하는 효소를 위한 프로모터 영역을 포함한다. 백시니아 바이러스 프로모터는 폭스바이러스 벡터에서의 발현에 특히 적합하다. 대표적 예는, 제한 없이, 백시니아 7.5K, H5R, 11K7.5[참조: Erbs et al., 2008, Cancer Gene Ther. 15: 18], TK, p28, p11 및 K1L 프로모터 뿐만 아니라, 합성 프로모터, 예를 들면, 문헌[참조: Chakrabarti et al., 1997, Biotechniques 23: 1094-7; Hammond et al., 1997, J. Virol Methods 66: 135-8; and Kumar and Boyle, 1990, Virology 179: 151-8]에 기재된 것들, 및 초기/후기 키메라 프로모터를 포함한다. 홍역-매개된 발현에 적합한 프로모터는, 제한 없이, 홍역 전사 단위의 발현을 유도하는 임의의 프로모터를 포함한다[참조: Brandler and Tangy, 2008, CIMID 31: 271].

당해 기술분야의 숙련가는 본 발명의 핵산 분자(들)의 발현을 조절하는 조절 요소가 적절한 전사의 개시, 조절 및/또는 종결(예: 폴리A 전사 종결 서열), mRNA 수송(예: 핵 국지화 신호 서열), 처리(예: 스플라이싱 신호) 및 안정성(예: 인트론 및 비-코딩 5' 및 3' 서열), 숙주 세포 또는 대상체에서의 해독(예: 개시제 Met, 3문자 리더 서열, IRES 리보솜 결합 부위, 샤인-달가노 서열 등) 또는 정제 단계(예: 본원에 기재된 바와 같은 태그)를 위한 추가 요소를 추가로 포함할 수 있음을 인지할 것이다.

한 가지 실시형태에서, 본 발명의 면역원성 조합물 및/또는 융합 폴리펩티드에 존재하거나 이에 의해 코딩된 마이코박테리아 항원을 코딩하는 핵산 분자는 단일 벡터에 의해 수행된다.

대체 실시형태에서, 본 발명의 면역원성 조합물 및/또는 융합 폴리펩티드에 존재하거나 이에 의해 코딩된 마이코박테리아 항원을 코딩하는 핵산 분자는 2개 이상의 벡터에 의해 수행된다. 각각의 벡터는 상기 인용된 것들 중에서 하나 이상의 마이코박테리아 항원 또는 하나 이상의 융합 폴리펩티드를 코딩한다. 2개 이상의 벡터는 대상체에게 실질적으로 동시에 또는 순차로 투여될 수 있다.

본 발명의 특히 바람직한 실시형태는 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 단일 벡터(또는 바이러스 비히클)에 관한 것이다:

i. Rv2029, Rv2626, Rv1733 및 Rv011을 포함하는 융합 폴리펩티드 및 RpfB, RpfD, Ag85B, TB10.4 및 ESAT-6을 포함하는 융합 폴리펩티드를 코딩하는 벡터(각각 융합체 13과 4 및 융합체 13과 11을 코딩하는 예시적 벡터);

ii. Rv2029, Rv2626, Rv1733 및 Rv0111을 포함하는 융합 폴리펩티드, RpfB, RpfD, Ag85B, TB10.4 및 ESAT-6을 포함하는 융합 폴리펩티드, 및 Rv0569, Rv1813, Rv3407, Rv3478 및 Rv1807을 포함하는 융합 폴리펩티드를 코딩하는 벡터(각각 융합체 13, 4 및 5, 및 융합체 13, 11 및 9를 코딩하는 예시적 벡터);

iii. Rv2029, Rv2626, Rv1733 및 Rv0111을 포함하는 융합 폴리펩티드, RpfB, RpfD, Ag85B, TB10.4 및 ESAT-6을 포함하는 융합 폴리펩티드, 및 Rv0569, Rv1813, Rv3407, Rv3478 및 Rv1807을 포함하는 융합 폴리펩티드를 코딩하는 벡터(각각 융합체 13, 4 및 9, 및 융합체 13, 11 및 5를 코딩하는 예시적 벡터);

iv. Ag85B, Rv2626 RpfB, RpfD 및 Rv1733을 포함하는 융합 폴리펩티드 및 Rv2029 TB10.4, ESAT-6 및 Rv0111을 포함하는 융합 폴리펩티드를 코딩하는 벡터(융합체 6 및 14를 코딩하는 예시적 벡터);

v. Ag85B, Rv2626 RpfB, RpfD 및 Rv1733을 포함하는 융합 폴리펩티드, Rv2029 TB10.4, ESAT-6 및 Rv0111을 포함하는 융합 폴리펩티드, 및 Rv0569, Rv1813, Rv3407, Rv3478 및 Rv1807을 포함하는 융합 폴리펩티드를 코딩하는 벡터(각각 융합체 6, 14 및 5, 및 융합체 6, 14 및 9를 코딩하는 예시적 벡터);

vi. RpfB, RpfD, Ag85B, TB10.4 및 ESAT-6을 포함하는 융합 폴리펩티드 및 Rv0569, Rv1813, Rv3407, Rv3478 및 Rv1807을 포함하는 융합 폴리펩티드를 코딩하는 벡터(각각 융합체 9와 11 및 융합체 5와 4를 코딩하는 예시적 벡터).

보다 바람직하게는, 상기 기재된 벡터는 MVA 벡터이다.

필요에 따라, 본 발명의 면역원성 조합물, 융합 폴리펩티드 또는 벡터는, 마이코박테리움 감염, 또는 마이코박테리움 감염에 의해 유발되거나 이와 연관된 임의의 질환 또는 증상에 대한 치료 또는 보호 활성을 개선시킬 목적으로, 선택된 마이코박테리아 항원의 추가 카피, 또는 상이한 마이코박테리움 종, 예를 들면, 마이코박테리움 보비스 또는 마이코박테리움 카프라에로부터의 추가의 항원 및/또는 기타 공급원으로부터의 추가의 폴리펩티드를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 추가 폴리펩티드는, 제한 없이, 면역조절제, 예를 들면, 사이토킨 및 잠재적으로 공-감염 생물체로부터 기원하는 임의의 기타 항원(예: HIV, HBV 등)을 포함한다.

바람직한 측면에 따르면, 본 발명의 벡터는 감염성 바이러스 입자의 형태로 존재한다. 전형적으로, 이러한 바이러스 입자는 (i) 본 발명의 바이러스 벡터를 적합한 숙주 세포주에 도입하는 단계, (ii) 상기 세포주를, 상기 감염성 바이러스 입자의 생성을 가능하게 하도록 적합한 조건하에 배양하는 단계, (iii) 생성된 바이러스 입자를 상기 세포주의 배양물로부터 회수하는 단계 및 (iv) 상기 회수된 바이러스 입자를 임의로 정제하는 단계를 포함하는 공정에 의해 생성된다.

바이러스 벡터가 복제-결함 또는 복제-손상된 경우, 상기 입자는 허용가능한 세포주에서 또는 헬퍼 바이러스의 사용에 의해 통상 생성되고, 이는 결실/손상된 기능을 트랜스로 공급한다. 예를 들면, E1-결실된 아데노바이러스 벡터의 보완에 적합한 세포는 293 세포[참조: Graham et al., 1997, J. Gen. Virol. 36: 59-72] 뿐만 아니라 HER-96 및 PER-C6 세포[참조: Fallaux et al., 1998, Human Gene Ther. 9: 1909-17; WO97/00326] 또는 이들 세포주의 임의의 유도체를 포함한다. 조류 세포는, 제한 없이, 수정난으로부터 수득한 닭 배아로부터 제조한 초기 닭 배아 섬유아세포(CEF) 및 오리 세포주를 포함하여 폭스바이러스 벡터의 증식에 특히 적합하다[참조: WO03/076601, WO2009/004016, WO2010/130756 및 US2011-008872에 기재된 바와 같음].

감염성 바이러스 입자는 배양 상청액 및/또는 용해후 세포로부터 회수할 수 있다. 이들은 표준 기술(크로마토그래피, 초원심분리 기술 등)에 따라 추가로 정제할 수 있다.

본 발명은 또한 특정 숙주 세포로의 우선적 표적화를 가능하게 하도록 변형된 벡터 또는 바이러스 입자를 포함한다. 표적화된 벡터의 특징은 세포 및 표면-노출된 성분, 예를 들면, 세포-특이적 마터(예: 마이코박테리움-감염된 세포), 조직-특이적 마커(예: 폐-특이적 마커) 등을 인식하거나 이에 결합할 수 있는 이들의 리간드 표면에 존재한다는 것이다. 적합한 리간드의 예는 마이코박테리아 항원성 도메인에 대한 항체 또는 이의 단편을 포함한다. 표적화는 상기 리간드를 바이러스(예: 아데노바이러스 섬유, 펜톤, pIX 또는 백시니아 p14 유전자 생성물)의 표면에 존재하는 폴리펩티드에 유전자 삽입함으로써 수행할 수 있다.

숙주 세포 및 생성 방법

또 다른 측면에서, 본 발명은 또한 본 발명의 면역원성 조합물, 융합 폴리펩티드, 핵산 분자 또는 벡터(예: 바이러스 입자)를 포함하는 숙주 세포 뿐만 아니라 이러한 숙주 세포를 포함하는 조성물에 관한 것이다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "숙주 세포"는 조직, 기관 또는 단리된 세포 중의 특정한 조직에 관하여 어떠한 제한 없이 광범위하게 이해되어야 한다. 이러한 세포는 독특한 유형의 세포, 또는 배양된 세포주, 일차 세포 및 증식 세포와 같은 서로 다른 유형의 세포의 그룹일 수 있다. 본 발명의 맥락에서, 용어 "숙주 세포"는 원핵생물 세포, 효모와 같은 하등 원핵생물 세포 및 곤충 세포, 식물 및 포유동물(예: 인간 또는 비-인간) 세포와 같은 기타 진핵생물 세포 뿐만 아니라 본 발명의 벡터를 생산할 수 있는 세포(예: 293, HER96, PERC.6 세포, CEF, 오리 세포주 등)을 포함한다. 본 용어는 본원에 기재된 벡터의 수용자일 수 있거나 수용자이었던 세포 뿐만 아니라 이러한 세포의 자손을 포함한다.

본 발명의 특정한 실시형태에 따라, 상기 숙주 세포는 추가로 캡슐화될 수 있다. 세포 캡슐화 기술은 당해 기술분야에 공지되어 있다.

또한, 본 발명의 추가의 측면는 본 발명의 벡터(또는 감염성 바이러스 입자) 및/또는 숙주 세포를 사용하여 본 발명의 면역원성 조합물 또는 융합 폴리펩티드에 포함되거나 이에 의해 코딩된 마이코박테리아 항원의 재조합 생성 방법이다. 전형적으로 상기 방법은 (i) 벡터를 적합한 숙주 세포 내로 도입하여 형질감염 또는 감염된 숙주 세포를 생성하는 단계, (ii) 상기 형질감염된 또는 감염된 숙주 세포를 숙주 세포의 성장에 적합한 조건하에 시험관내에서 배양하는 단계, (iii) 세포 배양물을 회수하는 단계, 및 (iv) 임의로, 회수된 세포 및/또는 배양 상청액으로부터 마이코박테리아 항원(들) 또는 융합 폴리펩티드를 정제하는 단계를 포함한다.

당해 기술분야의 숙련가는 폴리펩티드를 발현시키기 위해 당해 기술분야에서 이용가능한 다수의 발현 시스템, 및 숙주 세포 내로 벡터를 도입하는 방법에 정통할 것으로 예상된다. 이러한 방법은, 이로써 한정되지 않지만, 미세주입, CaPO₄-매개된 형질감염, DEAE-덱스트란-매개된 형질감염, 전기천공, 지질감염/리포솜 융합, 유전자 총, 형질도입, 바이러스 감염 뿐만 아니라 다양한 수단을 통한 숙주 생물체 내로 직접 투여를 포함한다. 상기 방법은 또한 숙주 세포에서 핵산의 도입을 촉진하는 통상의 형질감염 시약, 예를 들면, 폴리양이온 중합체(예: 키토산, 폴리메타크릴레이트, PEI 등) 및 양이온 지질(예: DC-Chol/DOPE, 트랜스펙탐, 리포펙틴 등)과 관련하여 사용될 수 있다.

숙주 세포는 통상의 발효 생물반응기, 플라스크 및 페트리 접시에서 배양할 수 있다. 배양은 주어진 숙주 세포에 적절한 온도, pH 및 산소 함량에서 수행할 수 있다. 이러한 목적을 위해 당해 기술분야에서 이용가능한 다양한 원핵생물 및 진핵생물 발현 시스템을 기재하기 위한 어떠한 시도도 본원에서 이루어지지 않을 것이다.

바람직한 실시형태에서, 상기 방법은 이. 콜라이 숙주 세포, 및 특히 락토즈 또는 락토즈 유사체(예: IPTG: 이소프로필 b-D-1-티오 갈락토피라노사이드)에 의한 T7 폴리머라제의 유도가능한 발현을 가능하게 하기 위해 이의 게놈 내에 D13 프로파지를 포함하는 이. 콜라이를 사용한다. 이러한 균주는 다양한 제조업자(예: Lucigen, Merck 등)에서 이용가능하다. 플라스미드 도입 후, 형질전환된 이. 콜라이 세포는 대략 18℃ 내지 대략 39℃(특히 바람직하게는 대략 30℃ 또는 대략 37℃)로 이루어진 온도에서 6 내지 48시간(특히 바람직하게는 대략 8 내지 대략 24시간)으로 상이한 시간 동안 벡터 선택된 마커(예: 항생물질의 존재) 및 숙주 균주(예: IPTG 등의 유도인자의 존재하)에 적합한 통상의 배지에서 배향할 수 있다. 세포 배양물을 회수하고, 용해시킬 수 있다(예: 세정제, 초음파처리 등을 사용한 화학적 용해). 세포 용해물의 원심분리 후, 상청액 및 펠렛 둘 다를 추가의 분석(예: SDS PAGE)을 위해 수집하여, 발현 수준 뿐만 아니라 발현된 물질의 용해도를 평가할 수 있다(가용성 물질은 세포 용해물에서 발견될 수 있고, 불용성 물질은 봉입체에 포획될 수 있음).

회수된 마이코박테리아 항원(들) 또는 융합 폴리펩티드는 황산암모늄 침전, 산 추출, 겔 전기영동을 포함하는 공지된 정제 방법; 여과 및 크로마토그래피 방법(예: 역상, 크기 배제, 이온 교환, 친화성, 소수성-상호작용, 하이드록시아파타이트, 고성능 액체 크로마토그래피 등)에 의해 임의로 정제할 수 있다. 사용되는 조건 및 기술은 전체 전하, 분자량, 소수성, 친수성 등의 요인에 의존하고, 당해 기술분야의 숙련가에게 명백할 것이다. 더욱이, 정제 수준은 의도된 용도에 의존할 것이다. 예를 들면, 단백질 농도는 브랜스포드(Bransdford) 분석(Biorad)에 의해 평가할 수 있고, 내독소 수준은 포터블 시험 시스템(Portable Test System; Charles River Laboratories) 등의 기술에 의해 평가할 수 있고, 정제된 폴리펩티드의 질량은 MALDI(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionisation) 또는 전기분무 방법을 사용하여 측정할 수 있다.

조성물

또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 면역원성 조성물, 융합 폴리펩티드, 핵산 분자, 벡터(예: 감염성 바이러스 입자) 또는 숙주 세포 중의 적어도 하나(또한 본원에서 "활성제"라 지칭함) 또는 이의 임의의 조합(예: 상이한 폴리펩티드 또는 벡터/바이러스 입자의 조합)을 포함하는 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 상기 조성물은 치료학적 유효량의 활성제(들), 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 비히클(들)을 추가로 포함하는 약학적 조성물이다.

본원에서 사용된 바와 같이, "약학적으로 허용가능한 비히클"은 대상체 및 특히 인간에서 투여하기에 적합한, 임의의 및 모든 담체, 용매, 희석제, 부형제, 보조제, 분사 매질, 코팅, 항균제 및 항진균제, 및 흡수 지연제 등을 포함하는 것으로 의도된다.

본원에서 사용된 바와 같이, "치료학적 유효량"은 의도된 용도에 충분한 용량이다. 예방적 용도가 고려되는 경우, 이 용어는 마이코박테리움 감염(예: Mtb 감염)의 개시 및/또는 확립을 예방 또는 지연시키기에 충분한 용량을 의미한다. "치료적" 용도의 경우, 상기 조성물은 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 통상의 치료학적 방식과 조합하여 활성 질환을 치료하거나 잠재적으로 감염된 개체에서 재활성화를 예방하기 위한 목적으로 마이코박테리움 종으로 이미 감염된 대상체에게 투여된다. 특히, 본 발명의 치료학적 유효량의 조성물은 투여된 대상체에서 면역 시스템의 유도 또는 자극을 유발하는데 필요한 양일 수 있다(예: 선천성 및/또는 특이적 반응의 발달을 제공함).

치료되는 대상체는 신생아, 유아, 청소년 또는 성인일 수 있다. 대상체는 바실루스 칼메트-구에린(BCG)로 이미 면역화되었거나 본원에 기재된 활성제(들)로 치료하기 전에 마이코박테리아 감염에 대해 이미 치료되었을 수 있다. 이는 또 다른 병원성 생물체(예: 인간 면역결핍 바이러스 HIV)로 동시 감염되거나 감염되지 않을 수 있다.

특히, 치료되는 대상체는 약물 내성(예: MDR, XDR 또는 TDR) 균주일 수 있는 병원성 마이코박테리움 종(예: Mtb)로 감염된다. 감염하는 마이코박테리움은 동일한 균주일 수 있거나, 본 발명에서 사용된 활성제에 포함되거나 이에 의해 코딩된 항원에서 기원하거나 상이한 균주 또는 단리물로부터 유래할 수 있는 임의의 마이코박테리움으로 단리될 수 있다.

본 발명의 조성물은 생리학적 또는 약염기성 pH(예: 대략 pH 7 내지 대략 pH 9)에서 인간 또는 동물 사용에 적절하도록 적합하게 완충된다. 적합한 완충제는, 제한 없이, 인산염 완충제(예: PBS), 중탄산염 완충제 및/또는 트리스 완충제를 포함한다.

본 발명의 조성물은 인간 또는 동물 사용에 적절한 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 이는 바람직하게는 등장성, 저장성 또는 약고장성이고, 비교적 낮은 이온 강도를 갖는다. 대표적 예는 멸균수, 생리학적 염수(예: 염화나트륨), 링거 용액, 글루코즈, 트레할로즈 또는 사카로즈 용액, 행크 용액, 및 기타 생리학적 평형된 염 수용액을 포함한다[참조: 레임토의 최신판: The Science and Practice of Pharmacy, A. Gennaro, Lippincott, Williams & Wilkins].

추가의 약학적으로 허용가능한 부형제는, 예를 들면, pH의 변형 또는 유지, 삼투압, 점도, 투명도, 색, 무균성, 안정성, 제형의 용해 속도, 인간 또는 동물 생물 내로 방출 또는 흡수의 변형 또는 유지, 특정 기관(예: 폐)에서 혈액 차단 또는 투과를 통한 수송의 촉진을 포함하여 목적하는 약학적 또는 약동학적 특성을 제공하기 위해 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 인간에서 전신 또는 점막 적용에 적합한 하나 이상의 보조제(들)을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 보조제는, 예를 들면, TLR-7, TLR-8 및 TLR-9 등의 톨-유사 수용체(TLR)을 통해 본 발명의 조성물에 대한 면역성, 특히 T 세포-매개된 면역성을 자극할 수 있다. 유용한 보조제의 대표적 예는, 제한 없이, 알룸, 광유 에멀젼, 예를 들면, 프로인트 완전 및 불완전(IFA), 리포폴리사카라이드 또는 이의 유도체[참조: Ribi et al., 1986, Immunology and Immunopharmacology of Bacterial Endotoxins, Plenum Publ. Corp., NY, p407-419], 사포닌, 예를 들면, QS21(WO 98/56415), 이미다조-퀴놀린 화합물, 예를 들면, 이미퀴모드(WO2007/147529), 시토신 포스페이트 구아노신 올리고데옥시뉴클레오티드, 예를 들면, CpG 및 양이온성 펩티드, 예를 들면, IC-31[참조: Kritsch et al., 2005, J. Chromatogr Anal. Technol Biomed Life Sci 822: 263] 또는 이의 임의의 유도체를 포함한다.

본 발명의 조성물에 포함된 약학적으로 허용가능한 비히클은 또한 동결(예: -70℃, -20℃), 동결(예: 4℃), 주위 온도에서 제조업자의 조건 및 장기간 저장(즉, 적어도 1개월, 바람직하게는 적어도 1년 동안)하에 이의 안정성을 유지하기 위해 허용해야 한다. 이러한 "장기간" 제형은 당해 기술분야에 공지되어 있다(예: WO98/02522; WO03/053463). (a) 1M 사카로즈, 150mM NaCl, 1mM MgCl₂, 54mg/l 트윈 80, 10mM 트리스 pH 8.5, (b) 10mg/ml 만니톨, 1mg/ml HSA, 20mM 트리스, pH 7.2, 및 150mM NaCl 및 (c) 본 발명의 조성물에 특히 적합한 생리학적 염수를 언급할 수 있다.

본 발명의 조성물은 다양한 형태, 예를 들면, 고체, 액체 또는 동결된 형태로 존재할 수 있다. 고체(예: 건조 분말 또는 동결건조) 조성물은 진공 건조 및 동결-건조를 수반하는 공정에 의해 수득할 수 있다. 특정한 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 분무-건조된(참조: WO2010/135495) 또는 액적 형태(특히 바람직하게는 100 내지 5000㎛를 갖는 액적)로 기도(예: 흡입, 비내 또는 폐내 경로)에 전달하기 위해 제형화된다.

본 발명의 면역원성 조합물, 융합 폴리펩티드, 핵산 분자, 벡터, 숙주 세포 또는 조성물은 다양한 투여 방식에 적합하다. 임의의 통상의 투여 경로는 전신, 국소 또는 점막 경로를 포함하여 본 발명의 맥락에서 적용가능하다.

전신 투여는, 예를 들면, 피하, 피내, 근육내, 정맥내, 복강내, 혈관내, 동맥내 주사 뿐만 아니라 난절을 포함한다. 주사는 통상의 시린지 및 바늘, 또는 당해 기술분야에서 이용가능한 임의의 기타 적절한 장치(예: 전기천공)로 수행할 수 있다. 점막 투여는, 제한 없이, 경구/소화관, 비강내, 기관내, 폐내, 질내 또는 직장내 경로를 포함한다. 기도에의 투여는 적절한 분배기를 사용하여 액적, 스프레이 또는 건조 분말화 조성물의 분무 또는 에어로졸화를 통해 수행할 수 있다. 국소 투여는 또한 경피 수단(예: 패치 등)을 통해 수행할 수 있다. 근육내, 경피 및 피하 경로는 본 발명의 맥락 뿐만 아니라 경비 기관 및 폐내 투여에 특히 바람직하다.

적절한 투여량은 다양한 파라미터, 특히 조성물에 포함된 활성제(들), 투여 방식; 대상체의 연령, 건강 및 체중; 증상의 성질 및 정도; 동시 치료의 종류; 치료 빈도; 및/또는 예방 또는 치료의 필요성의 함수로서 조정할 수 있다. 치료를 위한 적절한 투여량을 결정하는데 필요한 계산의 추가의 개량은 관련 상황에 비추어 의사에 의해 통상적으로 이루어진다.

일반적 지침을 위해, 바이러스 벡터-포함 조성물의 적합한 투여량은 사용된 벡터 및 정량적 기술에 의존하여 약 10⁴ 내지 약 10¹³ vp(바이러스 입자), iu(감염 단위) 또는 pfu(플라크-형성 단위)로 상이하다. 샘플에 존재하는 vp, iu 및 pfu의 양을 평가하기 위해 이용가능한 기술은 당해 기술분야에 통상적이다. 예를 들면, 아데노바이러스 입자(vp)의 수는 정량적 DBP 면역형광에 의해 A260 흡수 또는 HPLC, iu 역가를 측정하고, 허용가능한 세포 감염 후의 플라크 수를 계수함으로써 pfu를 측정함으로써 통상적으로 결정된다. 바람직하게는, vp/iu 비율은 FDA 지침에 따라 100 미만이다. 바람직한 용량은 약 10⁵ 내지 약 10¹² vp의 아데노바이러스 벡터(예: 약 5×10⁸, 약 10⁹, 약 5×10⁹, 약 10¹⁰, 약 5×10¹⁰ vp 또는 약 10¹¹ vp)를 함유한다. 약 5×10⁵ 내지 약 10⁹ pfu의 용량은 백시니아(예: MVA)-기반 조성물에 바람직하고, 약 5×10⁶, 약 10⁷, 약 5×10⁷, 약 10⁸ 또는 약 5×10⁸ pfu가 특히 바람직하다. 약 5×10⁴ 내지 약 10⁷ pfu의 투여량이 홍역-기반 조서물에 바람직하고, 약 10⁵, 5×10⁵, 10⁶ 또는 5×10⁶ pfu가 특히 바람직하다. 플라스미드 벡터에 기반한 조성물은 10㎍ 내지 20mg의 투여량, 유리하게는 100㎍ 내지 2mg의 투여량으로 투여될 수 있다. 단백질 조성물은 10㎍ 내지 20mg의 투여량, 특히 바람직하게는 조성물에 포함된 마이코박테리아 항원 각각에 있어서 체중 kg당 약 0.1mg 내지 약 2mg의 투여량으로 투여될 수 있다. 투여는 단일 투여량으로 수행되거나 특정한 시간 간격 후에 반복 투여량으로 수행될 수 있다.

반복된 투여(2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10회 등)은 적절한 시간에 의해 서로 분리될 수 있고, 동일한 투여 경로 또는 상이한 투여 경로에 의해 동일한 부위 또는 상이한 부위에서 수행될 수 있다. 더욱이, 각각의 투여는 동일한 활성제(들) 또는 상이한 활성제를 사용할 수 있다. 설명의 목적으로, 대략 1주(예: 3 내지 10일)에 의해 서로 분리된 2 또는 3회의 피하 투여가 MVA-기반 조성물에 특히 적합한 반면, 1 또는 2회의 근육내 투여(들)는 Ad-, 홍역- 및 플라스미드-기반 조성물에 특히 적합하다. 1회 이상의 "회상(recall)" 투여(들)는, 프라이밍된 항-마이코박테리움 면역 반응을 회상하도록 최초 일련의 프라이밍 투여 후에 수행할 수 있다(예: 6개월 내지 수년 후). 또한, 휴식 기간 후에 반복되는 순차 사이클의 투여(예: 매주 투여의 사이클)을 통해 진행할 수 있다.

특정한 실시형태에서, 투여는 하나 이상의 프라이밍 조성물(들) 및 하나 이상의 부스팅 조성물(들)의 연속 투여를 포함하는 프라임 부스트 방식에 따라 수행할 수 있다. 전형적으로, 프라이밍 및 부스팅 조성물은 적어도 마이코박테리아 항원, 면역원성 도메인 또는 에피토프를 공통으로 포함하거나 코딩하는 상이한 활성제를 사용한다. 프라이밍 및 부스팅 조성물은 동일한 투여 경로 또는 상이한 투여 경로에 의해 동일한 부위 또는 대안적 부위에 투여될 수 있다. 예를 들면, 폴리펩티드에 기반한 조성물은 점막 경로에 의해 투여될 수 있지만, 벡터에 기반한 조성물은 바람직하게는, 예를 들면, 피하 또는 근육내 경로에 의해 주사된다. 설명의 목적으로, 약독화된 생세균(예: BCG)를 사용한 숙주 반응의 프라이밍 및 본원에 기재된 "활성제"(예: 본 발명의 면역원성 조합물, 융합 폴리펩티드, 핵산 분자, 벡터(예: 감염성 바이러스 입자) 또는 숙주 세포 또는 이의 임의의 조합) 중의 적어도 하나를 사용한 부스팅을 고려할 수 있다.

예방적 및 치료적 용도

본 발명의 면역원성 조합물, 융합 폴리펩티드, 핵산 분자, 벡터, 숙주 세포 또는 조성물은 바람직하게는 마이코박테리움 감염 또는 이에 의해 유발되거나 이와 연관된 임의의 질환 및 병원성 증상을 예방 또는 치료하기 위해 사용하기 위한 것이다. 이러한 용도는 마이코박테리아 항원/에피토프에 대한 보호 면역 반응을 유도 또는 자극하기 위한 것이다.

한 가지 실시형태에서, 본 발명의 면역원성 조합물, 융합 폴리펩티드, 핵산 분자, 벡터, 숙주 세포 또는 조성물은 이를 필요로 하는 대상체, 특히 활성 질환을 발달하거나 마이코박테리움 감염의 발달 위험에 있는 감염된 개체와 밀접하게 접촉하는 대상체에서 마이코박테리움에 의한 감염을 예방하거나 감염 위험을 지연시키는 방법에 사용하기 위한 것이다(예: TB를 갖는 개체가 흡입한 수분 액적 중의 바실루스의 흡입에 의한 수송).

또 다른 실시형태에서, 본 발명의 면역원성 조합물, 융합 폴리펩티드, 핵산 분자, 벡터, 숙주 세포 또는 조성물은 마이코박테리움 종 및 특히 Mtb로 감염된 대상체에서 활성 질환을 치료하는 방법에 사용하기 위한 것이고, 상기 방법은, 감염성 마이코박테리움 종에 대한 면역 반응을 유도하고 이에 의해 활성 질환의 발달 위험을을 지연시키거나 감소시키도록 본원에 기재된 면역원성 조합물, 융합 폴리펩티드, 핵산 분자, 벡터, 숙주 세포 또는 조성물 중의 적어도 하나의 치료학적 유효량을 활성 질환이 발달한 감염된 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.

"활성 질환"은 명백한 중증 질환 징후를 갖는 마이코박테리움 감염을 지칭한다. 예를 들면, 인간 대상체에서, TB는 일반 임상 징후(예를 들면, 체중 감소, 무력증, 발열, 도한 등), 임상 징후 및/또는 증상(예: 기침, 객혈, 폐 TB의 경우에 흉부 통증), 및/또는 일부 경우에 감염 부위(예: 림프절, 골 형태, 수막염, 요로생식기 형태)에 따른 폐외 징후를 특징으로 한다.

또 다른 실시형태에서, 본 발명의 면역원성 조합물, 융합 폴리펩티드, 핵산 분자, 벡터, 숙주 세포 또는 조성물은 마이코박테리움 종 및 특히 마이코박테리움 투베르쿨로시스(M. tuberculosis)로 잠복적으로 감염된 대상체에서 재활성화를 예방 또는 치료하는 방법에 사용하기 위한 것이며, 상기 방법은, 감염성 마이코박테리움 종에 대해 면역 반응을 유도하고 이에 의해 재활성화를 예방 또는 지연하도록, 본원에 기재된 면역원성 조합물, 융합 폴리펩티드, 핵산 분자, 벡터, 숙주 세포 또는 조성물 중의 적어도 하나의 치료학적 유효량을 상기 잠재적으로 감염된 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.

"잠복적으로 감염된 대상체"란, 병원성 마이코박테리움 종(예: Mtb)로 이미 감염되어 있지만 명맥한 질환 증상 또는 임상 징후를 나타내지 않는 개체로 이해된다. 전형적으로, 잠복적으로 감염된 대상체는 이의 체내에 마이코박테리움을 보유하고, 임상적으로 질병이 없지만, 특히 면역억제의 맥락에서 임상 질환(재활성화)으로의 후속 진행의 위험을 보유한다(예: HIV 등의 또 다른 병원체에 의한 동시 감염 또는 TNFa 억제제 등의 면역억제 치료하에). Mtb 잠재적으로-감염된 대상체는 Mtb 감염의 진단을 가능하게 하는 임의의 시험으로 시험하는 경우에 양성일 것으로 예상된다.

용어 "재활성화"는, 마이코박테리움 감염에 양성이지만 명백한 질환 증상을 나타내지 않는 시험 대상체에서 마이코박테리움-연관된 질환의 명백한 질환 증상의 이후 증상을 지칭한다. 예를 들면, 재활성화는 명백한 활성 질환 증상을 이전에 갖거나 가질 수 없는 감염된 대상체 또는 잠복 상태로 감염을 가져오기에 충분하게 치료된 감염된 대상체에서 발생할 수 있다. 예를 들면, Mtb-감염된 대상체는 BCG로 이미 면역화되었거나, Mtb 감염에 대해 이미 치료되었다(예: 하나 이상의 "최전선(front line)" 화학치료 약물(들)).

특정한 실시형태에서, 본 발명의 면역원성 조합물, 융합 폴리펩티드, 핵산 분자, 벡터, 숙주 세포 또는 조성물은 백신화된 대상체에서 BCG 백신화의 효능을 증가시키기 위해 BCG 부스터로서 사용하기 위한 것이다.

화학치료와의 연관

본 발명의 면역원성 조합물, 융합 폴리펩티드, 핵산 분자, 벡터, 숙주 세포 또는 조성물은 하나 이상의 통상의 치료, 예를 들면, 마이코박테리움 감염(예: Mtb 감염)에 효과적인 하나 이상의 화학치료 약물(들)과 조합하여 사용될 수 있다.

화학치료는 통상적으로 현재의 관행을 사용하여 치료 의사에 의해 결정된다. 이러한 화학치료 약물의 예는, 제한 없이, 항생물질(들) 뿐만 아니라 당해 기술분야에 기재된 바와 같은 직접 및 간접 억제제 소분자, 항체 및 면역치료제를 포함한다. 전형적으로, 약물 내성이 없는 Mtb 감염을 치료하기 위해 현재 사용되는 "최전선" 항생물질 화학치료는 이소니아지드, 리파마이신(즉, 리팜핀, 리파펜틴 및 리파부틴), 에탐부톨, 스트렙토마이신, 피라진아미드 및 플루오로퀴놀론을 포함한다. 하나 이상의 "최전선" 치료에 대한 약물 내성이 입증된 Mtb 감염을 치료하기 위해 사용된 "제2선" 화학치료는 오플록사신, 시프로플록사신, 에티온아미드, 아미노살리실산, 사이클로세린, 아미카신, 카나마이신 및 카프레오마이신을 포함한다. 하나 이상의 화학치료제(들)는 일반적으로 적절한 기간, 예를 들면, 1 내지 수개월 동안(예: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 9 또는 12개월) 이상 동안 투여된다. 6 내지 12개월 범위의 기간에 걸쳐 투여량 200 내지 600mg(예: 300 또는 400mg)의 1일 투여가 적절하다.

한 가지 실시형태에서, 본 발명의 면역원성 조합물, 융합 폴리펩티드, 핵산 분자, 벡터, 숙주 세포 또는 조성물은 마이코박테리움(예: Mtb) 감염에 대한 화학치료의 시간 과정을 감소시키기 위해 사용하기 위한 것이다. 통상적으로, 본원에 기재된 활성제(들)의 투여는 화학치료의 효능을 증강시키고(예: 임상 징후의 기간 및/또는 중증도를 감소시키고, 객담 전환율 등을 개선시키는 것), 특히 감염 마이코박테리아가 약물 내성인 경우, 사용되는 화학 치료의 길이 및/또는 화학치료 약물의 수를 감소시키는 것을 가능하게 할 수 있다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 면역원성 조합물, 융합 폴리펩티드, 핵산 분자, 벡터, 숙주 세포 또는 조성물은 하나 이상의 화학치료 약물(들)의 투여 전, 투여와 동시 또는 투여후에 투여될 수 있다. 한 가지 실시형태에서, 본원에 기재된 활성제는 화학치료의 투여 개시후 적어도 2주간 투여된다.

바람직한 실시형태에서, 본 발명의 면역원성 조합물, 융합 폴리펩티드, 핵산 분자, 벡터, 숙주 세포 및/또는 조성물은 투여된 대상체에서 면역 반응을 유도 또는 증강시키기 위해 사용하기 위한 것이다. 따라서, 본 발명은 또한 본 발명의 면역원성 조합물, 융합 폴리펩티드, 핵산 분자, 벡터, 숙주 세포 및/또는 조성물을 대상체에게 투여하면 마이코박테리아 항원에 대한 면역 반응을 유도 또는 자극하는 방법을 포함한다.

유도되거나 자극된 면역 반응은 특이적(즉, 마이코박테리아 에피토프/항원에 대해) 및/또는 비특이적(선천성), 체액성 및/또는 세포성일 수 있다. 본 발명의 문맥에서, 면역 반응은 바람직하게는 마이코박테리아 항원/에피토프에 대한 T 세포 반응 CD4+ 또는 CD8+-매개된 또는 이들 둘 다이다.

면역 반응을 유도 또는 자극하는 본원에 기재된 활성제(들)의 능력은 당해 기술분야의 표준인 다양한 간접 또는 직접 분석법을 사용하여 시험관내 또는 생체내에서 평가될 수 있다. 시험 및 실증은 또한 첨부된 실시예 부분에 설명되어 있다.

예를 들면, 비-특이적 면역성의 유도는 NK/NKT-세포의 측정(예: 대표성 및 활성화 수준) 뿐만 아니라 INF-관련 사이토킨 및/또는 케모킨 생성 캐스케이드, TLR 및 선천적 면역성의 기타 마커의 활성화에 의해 수행할 수 있다[참조: Riano et al., 2012, Tuberculosis 92: 148-59].

체액 반응을 자극하는 능력은 본원에 기재된 면역원성 조합물 및 융합 폴리펩티드에 포함되거나 이에 의해 코딩된 적어도 하나의 항원에 특이적인 항체 역가의 증가에 의해 결정할 수 있다. 예시적 기술은, 제한 없이, 항체 결합, 결합 경쟁 뿐만 아니라 ELISA 및 웨스턴 블롯을 포함한다.

세포 면역성의 평가는, 예를 들면, 본원에 기재된 면역원성 조합물 및 융합 폴리펩티드에 포함되거나 이에 의해 코딩된 적어도 하나의 마이코박테리아 항원에 특이적인 T 림프구 등의 면역 세포의 증가된 빈도에 의해 평가할 수 있다. 또한, 방사성 표지화할 때에 세포 증식을 모니터링할 수 있다(예: [³H]티미딘 도입 분석에 의한 T 세포 증식 분석). 면역 반응을 검출하는 또 다른 및 감수성 방법은 IFNg-생성 세포의 빈도가 측정되는 ELISpot이다. 또한, 항원-특이적 T 림프구에 대한 세포독성 성능은 감작화된 대상체에서 또는 적절한 동물 모델의 면역화에 의해 평가할 수 있다. 또한, 통상의 생물분석(예: 다중파라미터 유동 세포분석(ICS)에 의해, 다중 기술 또는 ELISA 등을 사용한 사이토킨 프로파일 분석에 의해)을 사용하여 활성화된 T 세포에 의해 생성된 관련 Th1 및/또는 Th2 사이토킨(들)의 방출의 정량화에 의해 진행시킬 수 있다. PCR 기술은 또한 관련 사이토킨을 코딩하는 mRNA의 존재를 검출하기 위해 사용할 수 있다. 이러한 관련 사이토킨 양의 현저한 증가 또는 감소는 본원에 기재된 하나 이상의 활성제(들)의 면역원성 활성을 평가하기 위해 사용될 수 있음은 당해 기술분야의 숙련가에 의해 이해될 것이다.

최종적으로, 보호 면역 반응은 적절한 실험 동물, 예를 들면, 마우스, 랫트 또는 기니아 피그[참조: Ashwin et al., 2008, Am J Resp, 39: 503-8; Acosta et al., 2011, Malays J Med, 18: 5-12]에서 생체내 평가할 수 있고, 예를 들면, 마이코박테리움의 동일한 병원성 균주로 감염시켰지만 사전 면역화시키지 않은 실험 동물의 대조군 그룹에서 마이코박테리아 cfu와 비교하여, 본원에 기재된 하나 이상의 활성제(들)로 사전 면역화시킨 후에 마이코박테리움 종(예: Mtb)의 병원성 균주로 챌린지 감염을 제공받은 동물로부터 단리한 비장, 폐 또는 기타 조직 균질물로부터 마이코박테리아 콜로니-형성 단위(cfu)의 감소를 측정함으로써 평가할 수 있다. 처리된 및 무처리된 그룹 사이의 비교는 또한 동물 생존에 대해 평가할 수 있다(처리된 그룹의 증가된 생존은 보호 면역 반응과 상관될 수 있음).

이러한 면역학적 판독치는 본원에 기재된 활성제(들)에 의해 제공된 마이코박테리움 감염에 대한 보호 면역 반응의 양호한 상관이다.

본 발명의 면역원성 조합물, 융합 폴리펩티드, 핵산 분자, 벡터, 숙주 세포 또는 조성물에 의해 제공된 보호 반응은 또한, 기준선 상태 또는 무처리된 경우의 예상된 상태와 비교하여, 본원에 기재된 양식에 따라 인간 대상체에서의 투여로 평가할 수 있다. 보호 반응은, 예를 들면, 하기를 포함하여, 주치의 또는 기타 숙련된 의료 스태프에 의해 통상 사용된 임의의 관련 임상적 측정에 의해 증명할 수 있다:

- 중국 모집단 또는 소정 국가의 이민 모집단 등의 주어진 모집단에서 질환의 발생 및/또는 유병율 및/또는 빈도의 경감(예를 들면, 마이코박테리움 감염으로 진단되거나, 마이코박테리움 감염의 발달 위험에 있거나, 본원에 기재된 활성제(들)를 제공받은 그룹에서 마이코박테리움 감염과 연관된 질환으로 진단된 보다 낮은 비율의 신규 개체);

- 처리된 대상체의 그룹에서 보다 높은 비율의 객담 전환율;

- 처리된 대상체의 그룹에서 보다 높은 비율의 치요 활성 질환;

- 감염된 대상체와 밀접하게 접촉한 후에 마이코박테리움 전달 정도의 감소(예를 들면, 활성 질환의 감염 위험 또는 발달 위험의 감소 또는 지연 및/또는 잠복 감염된 대상체에서 재활성화 위험의 감소 또는 지연);

- 질환 상태의 개선(예를 들면, 표적 조직 또는 생물학적 샘플에서 박테리아 cfu의 감소; 질환 증상 또는 이의 중증도(예: 표적 기관에서 병변의 수 및/또는 중증도)의 감소 또는 안정화(악화 없음) 질환 상태); 및

- 동시 치료에 대한 치료된 대상체의 개선된 반응(통상의 화학치료 약물의 필요성, 수, 기간 및/또는 투여량의 감소).

본 발명의 맥락에서, 보호 반응은 일시적(투여 중단후 수주 동안) 또는 지속적(수개월 또는 수년 동안)일 수 있다. 별개의 대상체마다 상당히 달라질 수 있는 임상 상태의 자연 경과로서, 보호 반응은 치료된 각각의 대상체에서 관찰될 필요는 없지만, 상당한 수의 대상체에서 관찰될 수 있다(예를 들면, 2개 그룹 사이의 통계학적 유의차는 당해 기술분야에 공지된 임의의 통계학적 시험, 예를 들면, 크루스칼-발리스(Kruskal-Wallis) 시험, 만 및 휘트니(Mann and Whitney)에 따른 U 시험, 스튜던트 t-시험, 윌콕손(Wilcoxon) 시험 등).

이러한 측정은 본원에 기재된 활성제(들)의 투여전(기준선) 및 처리 동안의 상이한 시점 및 치료 중지후 적어도 몇주(예: 12주) 동안 수행할 수 있다.

일반 지침을 위해, 마이코박테리움-감염 및 연관된 질환은 다양한 수단에 의해 검출할 수 있다. 예를 들면, Mtb 감염은 또한 현재 임상 사용에서의 다수의 방법, 예를 들면, 만토(Mantoux) 투베르쿨린 피부반응 시험(TST), 퀀터페론(Quantiferon) 시험 뿐만 아니라 HBHA에 대한 반응의 시험관내 검출[참조: 헤파린 헤마글루티닌; Hougardy et al., 2007; PLos One 2(10): e926] 또는 ESAT6, CFP10 및 TB7.7을 사용한 시험관내 자극후 IP10의 검출[참조: Ruhwald et al., 2008; Microbes Infect 9: 806-12]에 의해 배향될 수 있다. 활성 질환을 발달하는 대상체는 현재의 관행에 따라 진단될 수 있다. 설명의 목적으로, TB 진단은 현미경, 배양 기술, 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 및 이의 다양한 유도체에 의해 임상 검체에서 원인 박테리아의 검출에 기초한다. 또한, DNA 핑거프린트 방법 및 스포리고타이핑도 또한 수행할 수 있다. 마이코박테리아 배양물은 마이코박테리아 결핵 복합체 단리물의 동정 및 약물 감수성 시험을 위한 금표준 방법이다. X선 기술 및 임상적 관찰은 또한 활성 폐 및/또는 폐외 질환의 발견을 뒷받침하기 위해 수행할 수 있다. 한편, 다수의 혈청학적 분석법은 보체 고정화 시험, 헤마글루틴화 시험, 방사선 면역분석 및 효소-결합된 면역흡착 분석법(ELISA)을 포함하여 순화 항체를 검출하기 위해 다양한 항원을 사용하는 Mtb 감염의 진단을 위해 개발되었다.

항체

추가의 측면에서, 본 발명은 본 발명의 면역원성 조합물 또는 융합 폴리펩티드에 포함되거나 이에 의해 코딩된 적어도 하나의 마이코박테리아 항원에 선택적으로 결합하는 항체에 관한 것이다.

본원에 사용된 바와 같이, "항체"는, 항원 결합 단편 또는 항원 결합 도메인을 포함하고, 표적 단백질에 결합하는 경우에 표적 단백질에 선택적으로 결합하며 비관련 단백질에 유의적으로 결합하지 않는 임의의 폴리펩티드를 포함한다. 특정한 경우에, 표적 단백질에 결합하는 항체는 어느 정도의 교차-반응에도 불구하고 여전히 선택성인 것으로 이해될 것이다. 전형적으로, 항체와 항원의 결합은 결합 상수 K_A가 10^-6M보다 높은 경우에 특이적인 것으로 간주된다. 적절한 결합 조건, 예를 들면, 항체 농도, 용액의 이온 강도, 온도, 결합에 허용된 시간, 차단제의 농도(예: 혈청 알부민, 우유 카세인) 등은 통상의 기술을 사용하여 숙련가에 의해 최적화될 수 있다.

본 발명의 항체는 폴리클로날, 모노클로날, 모노특이적, 폴리특이적, 인간, 인간화된, 일본쇄, 키메라, 합성, 재조합 항체 뿐만 아니라, 항원 결합을 보유하는 이러한 항체의 임의의 단편일 수 있고, 이로써 한정되지 않지만, Fab, F(ab')₂, Fv 및 scFv 단편을 포함한다.

본 발명의 항체는, 예를 들면, 본원에 기재된 유효량의 임의의 마이코박테리아 항원, 융합 단백질 및/또는 이의 펩티드 단편을 동물(예: 래빗, 말 등)에게 투여한 후에 당해 기술분야에서 통상의 기술을 사용하여 디스플레이(예: 파지, 효모 또는 리보솜 디스플레이) 또는 하이브리도마 기술에 의해 생성할 수 있다. 모노클로날 항체를 제조하는 일반 방법은 당해 기술분야에 공지되어 있다.

본 발명의 항체는 단리된 형태, 용액(예: 동물 항혈청) 또는 숙주 세포(예: 하이브리도마)로 제공될 수 있다. 더욱이, 이는 방사성(₁₃₁I, 또는 ₉₉Tc 등), 효소적(서양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리 포스파타제 등) 및 화학적(예: 비오틴 등) 표지를 포함하는 적절한 표지(검출가능한 또는 기능적 표지)에 접합될 수 있다.

본 발명의 항체는 본 발명의 범위에 포함되는 다양한 잠재적 용도를 갖는다. 예를 들면, 이러한 항체는 (a) 본 발명의 사용시에 마이코박테리아 항원을 검출하기 위한 분석 시약으로서, (b) 생물학적 샘플에서 마이코박테리움의 존재를 검출하기 위한 분석 시약으로서 및/또는 (c) 단백질 혼합물 기타 오염물로부터 본 발명의 방법에 따라 재조합-생성된 마이코박테리아 항원 및 융합 폴리펩티드를 검출 및/또는 회수하기 위한 도구로서 사용될 수 있다(예를 들면, 배양된 숙주 세포로부터 친화성 크로마토그래피 또는 면역침전에 의한 정제를 가능하게 함으로써). 이들은 또한 치료학적 목적, 예를 들면, 마이코박테리움에 대한 노출후에 대상체를 치료하기 위해 사용될 수 있다(예: 수동 면역치료).

한 가지 측면에서, 본 발명은, 상기 생물학적 샘플을 마이코박테리아 항원과 항체 사이에서 복합체의 형성을 가능하게 하는 조건하에 시약으로서 본 발명의 항체와 접촉시키는 단계 및 상기 복합체의 형성을 임의의 적절한 수단에 의해 검출 및/또는 정량화하는 단계를 포함하는, 본 발명의 항체를 사용하여 마이코박테리움에 의해 감염되거나 감염되기 쉬운 대상체로부터 채취한 생물학적 샘플(예: 혈장, 혈청, 객담 등)에서 마이코박테리아 항원을 검출 및/또는 정량화하는 방법에 관한 것이다. 표적 마이코박테리아 항원의 존재를 검출하는 것은 마이코박테리움 감염(예: Mtb)을 나타낸다.

또 다른 실시형태에서, 본 발명은, 상기 생물학적 샘플을 상기 항체와 상술된 시약 중의 어느 하나에 포함되거나 이에 의해 코딩된 마이코박테리아 항원/에피토프 사이에서 복합체의 형성을 가능하게 하는 조건하에 본 발명의 면역원성 조합물, 융합 폴리펩티드, 핵산 분자, 감염성 바이러스 입자, 숙주 세포 중의 어느 하나를 포함하는 시약과 접촉시키는 단계 및 상기 복합체의 형성을 임의의 적절한 수단에 의해 검출 및/또는 정량화하는 단계를 포함하는, 생물학적 샘플(예: 마이코박테리움에 의해 감염되거나 감염되기 쉬운 대상체로부터 채취한 혈장, 혈청 등)에서 마이코박테리움에 대한 항체를 검출 및/또는 정량화하는 방법에 관한 것이다. 특이적 항체를 검출하는 것은 마이코박테리움 감염(예: Mtb)을 나타낸다.

당해 기술분야의 숙련가는 본 발명의 방법에 사용된 시약의 양을 용이하게 결정할 수 있다. 항원/항체 복합체의 검출 및/또는 정량화 방법은 통상적이고, 당해 기술분야의 숙련가에게 공지되어 있다. 예시하면, 블롯팅, ELISA, 수위 샌드위치 기술, 경쟁 기술 및 PCR 기술, 특히 소위 "실시간" 기술을 언급할 수 있다. 상기 인용된 시약의 사용은 검출가능한 물질에 커플링(즉, 물리적 연결)시킴으로써 촉진될 수 있다. 검출가능한 물질의 예는 다양한 효소(예: 서양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리 포스파타제, 베타-갈락토시다제 또는 아세틸콜린스테라제), 보결분자 그룹(예: 스트렙트아비딘/비오틴 또는 아비딘/비오틴), 형광 물질(예: 움벨리페론, 플루오레세인 또는 플루오레세인 유도체), 발광 물질, 생물발광 물질(예: 루시퍼라제, 루시페린 또는 아에쿠오린) 및 방사성 물질(예: ¹²⁵I, ¹³¹I, ³⁵S 또는 ³H)을 포함한다.

본 발명은 또한 본 발명의 항체를 포함하는 항원 분석을 위해, 및 본 발명의 면역원성 조합물, 융합 폴리펩티드, 핵산 분자, 벡터, 숙주 세포, 조성물을 포함하는 항체 분석을 위해 마이코박테리움(예: Mtb) 감염을 진단하기 위한 시약 키트에 관한 것이다.

상기 인용된 특허, 간행물 및 데이터베이스 기록의 모든 개시는, 각각의 이러한 개개 특허, 간행물 또는 기록이 구체적 및 개별적으로 참조로서 도입되는 것을 나타내는 것과 동일한 정도로 이의 전체가 본원에서 참조로서 구체적으로 도입된다.

[도면의 간단한 설명]

도 1은 첨부된 실시예 부분에서 기재된 바와 같이 생성 및 사용된 Mtb 항원의 다양한 융합 폴리펩티드의 개략도를 나타낸다. "SS"는 단일 펩티드를 의미하고, "TM"은 막관통 도메인을 의미하고, "F"는 플래그 태그를 의미하고, "M"은 Myc 태그를 의미하고, "H"는 his 태그를 의미한다. *는 천연 대응물과 관련하여 Mtb 항원의 변형을 나타낸다. 도면은 또한 융합 폴리펩티드의 번호 및 이후에 사용된 발현 플라스미드 벡터(pTGXXXXX)의 기준을 언급한다.

도 2는 특이적 항체를 사용한 면역검출 후에 웨스턴 블롯팅에 의한 개개 Mtb 유전자의 발현을 나타낸다. 2×10⁶ HEK293 세포는 리포펙타민 2000을 사용하여 5㎍의 DNA로 형질감염시켰다. 프로테아좀 억제제 MG132를 형질감염후 18시간에서 배양 배지에 첨가했다. 48시간 배양후에 회수한 세포의 용해물을 10% 겔 기준에 대해 전기영동에 의해 분석하고, 면역검출은 Rv2029*(도 2A), RPFB-Dhyb(도 2B)를 인식하는 1/1000 희석된 래빗 항-혈청 및 ESAT-6(도 2C) 및 Rv2626(도 2D)을 인식하는 시판 항체로 수행했다.

도 3은 항 Flag 면역검출 후에 잠복 항원(융합체 번호 9를 코딩하는 pTG18295), 활성 항원(융합체 번호 10을 코딩하는 pTG18296), 소생 항원(융합체 번호 12를 코딩하는 pTG18307) 및 소생 밀 활성 항원(융합체 번호 11을 코딩하는 pTG18297)을 포함하는 Mtb 융합체의 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다. +/-는 MG132의 존재 및 부재를 나타낸다.

도 4는, 시판용 항-TB10.4 항체(ABIN361292), 항-Rv0569 래빗 항혈청 및 항-Rv2626 마우스 모노클로날 항체 26A11으로 면역검출 후, 각각 TB10.4(도 4A), Rv0569(도 4B) 및 Rv2626(도 4C)을 포함하는 Mtb 융합체의 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다.

도 5는 융합체-코딩 플라스미드 pTG18266(SS-Ag85B-TB10.4-ESAT6-TM; 도 5A), pTG18296(세포질 Ag85B-TB10.4-ESAT6; 도 5B), 각각의 Ag85B, TB10.4 및 ESAT6 항원을 코딩하는 pTG18310, pTG18315 및 pTG18308 플라스미드의 혼합물(도 5C) 및 pGWiz(도 5D)을 사용한 동물의 면역화 후에 유도한 IFNg-생성 세포를 나타낸다. 세포 면역 반응은, 특정한 펩티드 풀을 사용한 생체외 재-자극 후에 ELISpot IFNγ 분석에 의해 최후 DNA 주입후 2주에서 평가했다.

도 6은 융합체-코딩 플라스미드 pTG18268(SS-RPFB-Dhyb-Ag85B-TB10.4-ESAT6-TM; 도 6A), pTG18297(세포질 RPFB-Dhyb-Ag85B-TB10.4-ESAT6; 도 6B), 가각의 RPFB-Dhyb, Ag85B, TB10.4 및 ESAT6 항원을 코딩하는 pTG18307, pTG18310, pTG18315 및 pTG18308 플라스미드의 혼합물(도 6C) 및 pGWiz(도 6D)를 사용한 동물의 면역화 후에 유도한 IFNg-생성 세포를 나타낸다. 세포 면역 반응, 특정한 펩티드 풀을 사용한 생체외 재-자극 후에 ELISpot IFNγ 분석에 의해 최후 DNA 주입후 2주에서 평가했다.

도 7은 융합체-코딩 플라스미드s pTG18267(SS-RPFB-TM; 도 7A), pTG18307(세포질 RPFB-Dhyb; 도 7B) 및 pGWiz(도 7C)를 사용한 동물의 면역화 후에 유도한 IFNg-생성 세포를 나타낸다. 세포 면역 반응은 RpfB 및 RpfD 항원을 커버하는 특정한 펩티드 풀을 사용한 생체외 재-자극 후에 ELISpot IFNγ 분석에 의해 최후 DNA 주입후 2주에서 평가했다.

도 8은 융합체-코딩 플라스미드 pTG18269(SS-Rv0569-Rv1813-Rv3407-Rv3478-Rv1807-TM; 도 8A), pTG18295(세포질 Rv0569-Rv1813-Rv3407-Rv3478-Rv1807; 도 8B), 각각의 Rv0569, Rv1813, Rv3407, Rv3478 및 Rv1807 항원을 코딩하는 pTG18301, pTG18303, pTG18300, pTG18304 및 pTG18302 플라스미드의 혼합물(도 8C) 및 pGWiz(도 8D)를 사용한 동물의 면역화 후에 유도한 IFNg-생성 세포를 나타낸다. 세포 면역 반응, 특정한 펩티드 풀을 사용한 생체외 재-자극 후에 ELISpot IFNγ 분석에 의해 최후 DNA 주입후 2주에서 평가했다.

도 9는 정제된 Rv2626(도 9A), RPFB-Dhyb 융합체(도 9B) 및 TB10.4(도 9C)의 SDS-PAGE 분석을 나타낸다.

도 10은 융합체-코딩 플라스미드 pTG18323(Rv2029 - Rv2626 - Rv1733 - Rv0111; 도 10a) 또는 pGWiz(도 10b)를 사용한 동물의 면역화 후에 생성한 세포 면역 반응을 나타낸다. IFNγ-생성 세포는 특정한 펩티드 풀을 사용한 생체외 재-자극 후에 IFNγ ELISpot 분석에 의해 최후 DNA 주입후 2주에서 평가했다. 각각의 막대는 1마리 마우스의 반응을 나타낸다(7마리 마우스/그룹).

도 11은 (a) MVATG18365(Rv2029-Rv2626-Rv1733-Rv0111 + RpfB-Dhyb-Ag85B-TB10.4-ESAT6 W/O SS/TM) 또는 (b) MVATG18364(Rv2029-Rv2626-Rv1733-Rv0111 + RpfB-Dhyb-Ag85B-TB10.4-ESAT6)를 사용한 마우스의 면역화 후에 유도한 세포 면역 반응을 나타낸다. IFNγ-생성 세포는 특정한 펩티드 풀을 사용한 생체외 재-자극 후에 IFNγ ELISpot 분석에 의해 최후 DNA 주입후 2주에서 평가했다. 각각의 막대는 각 마우스의 반응을 나타낸다(5마리 마우스/그룹).

도 12는 TB 질환 상 또는 생화학 추론에 따라 생성한 모든 MVA 후보로 백신화한 BALB/c 마우스에서 IFNγ 반응의 수준을 요약한 것이다. IFNγ-생성 세포는 14개 Mtb 항원의 특정한 펩티드 풀을 사용한 생체외 재-자극 후에 IFNγ ELISpot 분석에 의해 MVA 주입후 1주에서 평가했다. 검출된 반응의 강도는 색 코드(-, +, ++, +++ 범위의 설명 참조)를 사용하여 컷-오프(cut-off) 값에 있어서 각각의 재-자극에 대한 중앙치(스폿/10⁶ 비장세포)의 배수 증가에 따라 등급화했다. 사선 박스는 항원이 주어진 MVA 백신을 결여하고 있음을 의미한다.

도 13은 (a) MVATG18376(Rv2029-Rv2626-Rv1733-Rv0111 + RpfB-Dhyb-Ag85B-TB10.4-ESAT6 + Rv0569-Rv1813-Rv3407-Rv3478-Rv1807) 또는 (b) 공 MVATGN33.1을 사용한 유전자도입 HLA-A2 마우스의 면역화 후에 유도한 세포 면역 반응을 나타낸다. IFNγ-생성 세포는 특정한 펩티드 풀을 사용한 생체외 재-자극 후에 IFNγ ELISpot 분석에 의해 MVA 주입후 1주에서 평가했다. 각각의 막대는 각 마우스의 반응을 나타낸다(6마리 마우스/그룹).

도 14는 (a) MVATG18377(Rv2029-Rv2626-Rv1733-Rv0111 + RpfB-Dhyb-Ag85B-TB10.4-ESAT6 W/O SS/TM + Rv0569-Rv1813-Rv3407-Rv3478-Rv1807) 또는 (b) 공 MVATGN33.1을 사용한 C3H/HeN 마우스의 면역화 후에 유도한 세포 면역 반응을 나타낸다. IFNγ-생성 세포는 특정한 펩티드 풀을 사용한 생체외 재-자극 후에 IFNγ ELISpot 분석에 의해 MVA 주입후 1주에서 평가했다. 각각의 막대는 각 마우스의 반응을 나타낸다(6마리 마우스/그룹).

도 15는 지시된 MVA 후보로 백신화된 유전자도입 HLA-2A, C57BL/6 및 C3H/HeN 마우스에서 IFNγ 반응의 수준을 요약한 것이다. IFNγ-생성 세포는 14개 Mtb 항원의 특정한 펩티드 풀을 사용한 생체외 재-자극 후에 IFNγ ELISpot 분석에 의해 MVA 주입후 1주에서 평가했다. 검출된 반응의 강도는 색 코드(-, +, ++, +++ 범위의 설명 참조)를 사용하여 컷-오프(cut-off) 값에 있어서 각각의 재-자극에 대한 중앙치(스폿/10⁶ 비장세포)의 배수 증가에 따라 등급화했다. 사선 박스는 항원이 주어진 MVA 백신을 결여하고 있음을 의미한다.

재료 및 방법

분석 방법

Mtb 항원 상의 종래 데이터는, 감염의 자연 경과의 모든 상 동안 항-TB 면역성을 상승시킬 수 있는 면역치료 백신에 유용할 수 있는 Mtb 유전자/항원의 최초 선택을 동정하는 것을 목적으로 이용가능한 문헌 및 데이터베이스로부터 조사했다.

이어서, 선택된 항원은 상이한 공급원으로부터의 데이터를 기록하고 비교하기 위해 개발된 데이터-마이닝 분류 시스템에 제공했다. 전체 최종 "스코어"는 각 항원의 값을 반영하여 생성했다. 이 스코어는 항원의 면역원성 잠재 뿐만 아니라 동물 모델 및 인간에서 감염성 챌린지를 보호하는 이들의 능력을 고려한다(예를 들면, 인간에서의 보호 데이터는 동물 모델에서 면역원성을 유도하는 것보다 우수하게 득점할 것임). 특정 항원에 대한 모든 데이터가 수집되면, 0 내지 5의 등급이 각각의 범주로 할당하고, 0은 최저 가능한 등급이고, 5는 최고 가능한 등급이다. 등급의 선택은 또한 데이터의 품질(예: 실험에 사용된 올바른 대조군, 엄격한 해석) 뿐만 아니라 데이터의 견고성에 기초한다(예: 작동된 실험 회수, 발견을 확인/지지하는 다수의 간행물).

항원 생화학적 인실리코 분석

생화학적 및 생물학적 데이터는 또한 잠재적 발현 문제의 예상을 가능하게 하는 발현 및 융합 설계를 최적화하는 주요 데이터이다. 예를 들면, 단백질의 생물학적 기능은 벡터-매개된 발현시에 유전자 불안정성 및/또는 안전성 프로파일을 생성하는 잠재적 독성을 유도할 수 있다. 더욱이, 단백질 비중첩은 보다 높은 세포 분해 속도에 기인하여 안정성 및 발현 수준에 영향을 미칠 수 있다.

광범위한 문헌 조사는 이들 단백질의 구조 및 기능을 보다 잘 이해하고 특성화하기 위해 모든 Mtb 항원에 대해 수행되었다.

추가로, 생화학적 및 생물정보학적 예측은 또한 Mtb 항원의 특성화를 위해 수행되었다. 생물정보학 예측 도구[참조: Nielsen et al., 2007 PLos One 2: e796; Nielsen et al., 2008, PLoS Comput Biol 4: e1000107]는 부류 I 및 II HLA 분자에 대한 예측된 에피토프를 조사하기 위해 사용되었다. 이들 에피토프 영역의 동정은 선택된 Mtb 항원의 최적화 또는 면역 기반 분석의 개발을 촉진시키는데 유용할 수 있다.

더욱이, 광범위한 인실리코 구조 예측 분석은 생화학적 특성 및/또는 생물학적 기능을 예측하고 따라서 Mtb 항원 선택 및 설계를 가능하게 하기 위해 수행되었다(예를 들면, 전장 천연 형태가 발현될 가능성이 있는지의 여부 또는 변형이 필요할 것인지의 여부).

보다 구체적으로,

- 단백질 데이터 뱅크(PDB)에서 구조적 상동성을 검색한다. 사용된 프로그램은 디펄트 파라미터를 갖는 BLASTP이었고, 선택된 데이터베이스는 NPS@ 3D SEQUENCES이었다(PDB로부터). 이러한 검색은 25% 초과의 서열 상동성을 갖는 항원 또는 단백질의 NMR 또는 결정질 구조의 발견을 가능하게 한다. 3D 구조는 CD3D4.1 또는 PDB 뷰어를 사용하여 가시화했다.

- UNIPROT-SWISSPROT 및 TB 데이터베이스에서 검색한다. 목적하는 Mtb 항원에 대한 단백질 상동성은 NPS@에 대한 문의 및 BLAST 검색으로서 1차 구조를 사용하여 UNIPROT-SWISSPROT 데이터베이스 상에서 검색했다. 사용된 프로그램은 디펄트 파라미터를 갖는 BLASTP이었고, 선택된 데이터베이스는 UNIPROT-SWISSPROT이었고; UNIPROT-SWISSPROT 가입은 단백질 기능, 도메인, 잠재적 신호 펩티드, 해독후 변형의 일반 정보 뿐만 아니라 문헌 참조에 대한 접근을 제공한다. 선택된 Mtb 항원에 관한 일반 정보(예: 유전자 기능, 유전자 사이의 유전자 연결, 유전자와 연관된 표현형 및 돌연변이, 면역원성, 및 문헌 참조)는 TB 데이터베이스에서 문의로서 Rv 단백질 명칭을 사용하여 검색했다.

- 신호 펩티드의 예측: 이들 짧은 N-말단 서열은 종종 막관통 도메인으로서 예측되지만, 천연 및 성숙 단백질에 존재하지 않는다. 신호 펩티드의 존재는 특정한 항원에 대한 UNIPROT-SWISSPROT 데이터베이스에서 또는 신호 v3.0 알고리즘의 비밀 마르코브(Markov) 모델을 사용하여 통지된다.

상동성 검색에 대해 적중이 없는 경우, 추가의 검색을 수행했다:

- 3개의 상이한 프로그램(예를 들면, 치밀한 정렬 표면(DAS) 방법, 알고리즘 TMHMM 및 TopPred0.03)을 사용하여 잠재적 막관통 도메인(TM)의 예측. 이러한 소수성 TM 도메인의 존재는, MVA 등의 바이러스 벡터에서 발현되는 경우, 상응하는 항원의 유전자 안정성을 손상시킬 수 있는 것으로 관찰된다.

- PROSITE SCAN을 사용하여 단백질 도메인, 패밀리 및 기능 부위와 연관된 공지된 단백질 모티프를 검색한다.

- 몇몇 예측 방법(즉, SOPM, MLRC, HNN, DSC, PHD, PREDATOR)을 사용한 2차 구조의 예측. 2차 구조는 6가지 방법이 이를 예측한 경우에 가능성이 높은 것으로 간주했다. 2차 구조는 6개 방법 중의 3개가 이를 예측한 경우에 가능성이 있는 것으로 간주했다.

- 소수성 클러스터 분석(HCA). HCA 방법은 단백질 폴딩의 본질적 특징에 기초한다: 단백질 구상 도메인의 친수성/소수성 이분법 및 소수성 조밀도. HCA 플롯은 단백질 서열을 따라 소수성 클러스터를 동정하기 위해 사용했다. 이들 클러스터는 소수성 매립 코어를 갖는 폴딩된 단백질의 특징이다. 항원은, 소수성 클러스터가 단백질의 적어도 몇몇 부분에 존재하는 경우에 폴딩된 상태를 가질 가능성이 있는 것으로 간주했다.

- 폴딩되지 않은 영역의 동정을 가능하게 하는 음성 무질성 영역의 예측(MetaPrDOS 예측). 이 분석법은 폴딩되지 않은 단백질의 부분을 예측함으로써 HCA 플롯을 보완한다. 역치 0.5(무질서 경향) 초과의 모든 부분은 단백질의 폴딩되지 않은 부분으로 간주했다. 대부분의 시간 동안, 단백질의 N- 및 C-말단 부분은 이들의 천연 상태에서 폴딩되어 있지 않은 것에 유의한다. 말단에서 이러한 스트렛치가 존재하고 10개 잔기보다 작은 경우, 이들은 융합을 위한 잠재적 링커로서 유지되었다.

- 코일형 코일의 예측(COILS 프로그램 사용). 항원의 올리고머화 상태는 항원 융합 설계에 영향을 미칠 수 있다. 코일형 코일 도메인은, 생산 확률이 적어도 14개 잔기 윈도우 분석과 함께 단백질 일부에 대해 1의 값을 나타낸 경우에 예측되었다.

추가로, 서열 정렬은 선택된 Mtb 항원이 상이한 Mtb 균주 및 단리물 중에 보존되는 것을 확인하기 위해 수행되었다. 보다 정확하게는, 다중 서열 정렬은 각각의 선택된 항원의 아미노산 서열(예시된 Mtb 항원은 H37Rv 균주에서 기원함) 및 11개 기타 Mtb 균주의 이들의 등가물(임상 단리물) 및 단백질 데이터베이스(BLASTP 검색)에서 동정된 마이코박테리움 보비스 사이의 클러스탈 W2(@.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)를 사용하여 수행했다. 그 결과, TB 항원은 항원 및 마이코박테리움 균주에 따라 100% 내지 96% 범위의 동일성 비율로 분석된 12개 마이코박테리아 균주 중에서 높은 보존을 나타냈다. 주요 예외는 단지 88% 동일성이 H37Rv 및 CDC1551 서열 사이에서 발견된 Rv3478에서 관찰되었다.

최종적으로, 최종 TB 항원 선택에 도달하기 위한 또 다른 중요한 기준은 다양한 상의 감염으로부터 항원의 균형 대표성을 확보하는 것이다. 예를 들면, 일부 잠복 항원은 대부분의 활성기 항원보다 더욱 낮은 최종 데이터 마이닝 스코어에도 불구하고 선택되었다.

Mtb 항원의 융합체의 작제

Mtb 항원의 12개 융합체는 도 1에 제시된 바와 같은 조작했다. 5개의 융합체는 생화학적 원리에 기초하여 설계한 반면(융합체 3, 5, 6, 8 및 14), 융합체 2, 4 및 13은 질환의 TB 상에 대하여 설계했고, 융합체 2는 활성 항원을 함유하고, 융합체 4는 소생 항원을 함유하고, 융합체 13은 잠복 항원을 포함한다. 다양한 유전자 융합체의 검출을 촉진하고 각각의 Mtb 항원에 대한 특이적 항체의 필요성을 피하기 위해, TAG 서열을 각각의 융합체에 부가, 각각 N-말단에 Flag TAG(DYKDDDDK; 서열번호 25) 및 C-말단에 -cmyc(EQKLISEEDL; 서열번호 26) 및 His(HHHHHH; 서열번호 27) 태그를 부가했다.

한편, 신호 펩티드(또한 신호 서열 또는 SS로 불리움) 및 막-고정 펩티드(또한 막관통 또는 TM 펩티드/도메인으로 불리움)를 Mtb 융합 단백질의 N-말단 및 C-말단에 각각 부가하여, 특정한 경우에 면역원성 활성을 최적화할 것으로 예상되는 세포 표면에서 고착을 보장했다. 그러나, TM 도메인의 부가는, 이들 단백질이 이미 막-고정 펩티드를 함유하기 때문에, Rv0111 또는 Rv1733으로 종결하는 융합체의 경우에 필요하지 않았다. 비교 목적을 위해, 4개 융합체를 또한 임의의 신호 펩티드(SS) 및 TM 도메인의 부재하에 조작하여, 발현 수준 및 면역원성 활성에 대한 세포 위치의 영역을 연구했다(SS 및 TM 펩티드의 존재하에 막 제시 대 이러한 펩티드의 부재하에 세포질 위치). 예를 들면, pTG18269는 pTG18295와 동일한 Mtb 항원(Rv0569 - Rv1813* - Rv3407 - Rv3478 - Rv1807)을 코딩하고, 다만, pTG18269-코딩된 융합체는 이의 N-말단에 SS를 구비하고 Myc 및 His 태그 사이의 이의 C 말단에 TM을 구비하는 반면, pTG18295-코딩된 융합체는 이러한 SS 및 TM 펩티드를 결여한다.

상이한 Mtb 항원 및 융합체를 코딩하는 합성 유전자는 진아트(Geneart; Regensburg, Germany)에 의해 합성되었다. 서열은 인간 코돈 사용을 위해 최적화되었고, 코작 서열(ACC)은 ATG 개시 코돈 앞에 부가되었다. 더욱이, 일부 모티프는 제외되었다: 폭스바이러스 벡터에서의 발현에 유해한 TTTTTNT, GGGGG, CCCCC 및 몇몇 기타 벡터에서의 발현에 유해할 수 있는 AAAGGG, AAAAGG, GGGAAA, GGGGAA, (및 상보성 서열 TTCCCC, TTTCCC, CCTTTT, CCCCTT).

융합체는 NotI 및 BamH에 의해 소화된 pGWiz 플라스미드(Gelantis)에서 클로닝시켰다. 이 플라스미드는 변형된 CMV 프로모터, 이어서 CMV 즉시 초기 유전자로부터의 인트론 A, 및 고효율 인공 전사 터미네이터를 함유한다.

pTG18266 (융합체 번호 2)의 작제

융합체 번호 2의 아미노산 서열은 서열번호 28에 제시되어 있다. 아미노산 1 내지 23은 광견병 바이러스 ERA 균주(Genbank 번호 M38452에 기재됨)의 당단백질 전구체의 N-말단에 존재하는 단일 펩티드에 상응하고, 아미노산 24 내지 31은 Flag TAG에 상응하고, 아미노산 32 내지 317은 Ag85B*에 상응하고, 아미노산 318 내지 412는 TB10.4에 상응하고, 아미노산 413 내지 506은 ESAT6에 상응하고, 아미노산 507 내지 516은 c-myc TAG, Ser 링커에 상응하고, 아미노산 518 내지 583은 ERA 균주의 광견병 당단백질로부터 유래하는 막-고정 펩티드에 상응하고, 아미노산 584 내지 589는 His TAG에 상응한다. 서열번호 40에 제시된 융합체 번호 2-코딩 뉴클레오티드 서열은 합성 방법에 의해 생성했고, 합성 유전자는 NotI 및 BamH1에 의해 제한된 pGWiz에서 클로닝시켜 pTG18266을 수득했다.

pTG18267(융합체 번호 3)의 작제

융합체 번호 3의 아미노산 서열은 서열번호 30에 제시되어 있다. 아미노산 1 내지 23은 광견병 바이러스 PG 균주(Genbank 번호 ay009097 및 WO2008/138649의 서열번호 2에 기재됨)의 당단백질 전구체의 N-말단에 존재하는 신호 펩티드에 상응하고, 아미노산 24 내지 31은 Flag TAG에 상응하고, 아미노산 32 내지 380은 RPFB-Dhyb*에 상응하고, 아미노산 381 내지 390은 c-myc TAG, Ser 링커에 상응하고, 아미노산 392 내지 457은 PG 균주(WO2008/138649의 서열번호 3)의 광견병 당단백질로부터 유래하는 막-고정 펩티드에 상응하고, 아미노산 458 내지 463은 His TAG에 상응한다. 서열번호 42에 제시된 융합체 번호 3-코딩 뉴클레오티드 서열은 합성 방법에 의해 생성했고, 합성 유전자는 NotI 및 BamH1에 의해 제한된 pGWiz에서 클로닝시켜 pTG18267을 수득했다.

pTG18268(융합체 번호 4)의 작제

융합체 번호 4의 아미노산 서열은 서열번호 32에 제시되어 있다. 아미노산 1 내지 23은 광견병 바이러스 PG 균주(Genbank 번호 ay009097에 기재됨)의 당단백질 전구체의 N-말단에 존재하는 신호 펩티드에 상응하고, 아미노산 24 내지 31은 Flag TAG에 상응하고, 아미노산 32 내지 380은 RPFB-Dhyb*에 상응하고, 아미노산 381 내지 666은 Ag85B*에 상응하고, 아미노산 667 내지 761은 TB10.4에 상응하고, 아미노산 762 내지 855은 ESAT6에 상응하고, 아미노산 856 내지 865는 c-myc TAG, Ser 링커에 상응하고, 아미노산 867 내지 932는 PG 균주의 광견병 당단백질로부터 유래하는 막-고정 펩티드에 상응하고, 아미노산 933 내지 938은 His TAG에 상응한다. 서열번호 44에 제시된 융합체 번호 4-코딩 뉴클레오티드 서열은 합성 방법에 의해 생성했고, 합성 유전자는 NotI 및 BamH1에 의해 제한된 pGWiz에서 클로닝시켜 pTG18268을 수득했다.

pTG18269(융합체 번호 5)의 작제

융합체 번호 5의 아미노산 서열은 서열번호 34에 제시되어 있다. 아미노산 1 내지 23은 광견병 바이러스 균주 ERA 균주(Genbank 번호 M38452에 기재됨)의 당단백질 전구체의 N-말단에 존재하는 신호 펩티드에 상응하고, 아미노산 24 내지 31은 Flag TAG에 상응하고, 아미노산 32 내지 118은 Rv0569에 상응하고, 아미노산 119 내지 227은 Rv1813*에 상응하고, 아미노산 228 내지 325는 Rv3407에 상응하고, 아미노산 326 내지 717은 Rv3478에 상응하고, 아미노산 718 내지 1115는 Rv1807에 상응하고, 아미노산 1116 내지 1125는 c-myc TAG, Ser 링커에 상응하고, 아미노산 1127 내지 1192는 PG 균주(WO2008/138649의 서열번호 3)의 광견병 당단백질로부터 유래하는 막-고정 펩티드에 상응하고, 아미노산 843 내지 848은 His TAG에 상응한다. 서열번호 46에 제시된 융합체 번호 5-코딩 뉴클레오티드 서열은 합성 방법에 의해 생성했고, 합성 유전자는 NotI 및 BamH1에 의해 제한된 pGWiz에서 클로닝시켜 pTG18269를 수득했다.

pTG18270(융합체 번호 6)의 작제

융합체 번호 6의 아미노산 서열은 서열번호 36에 제시되어 있다. 아미노산 1 내지 23은 광견병 바이러스 ERA 균주(Genback 번호 M38452에 기재됨)의 당단백질 전구체의 N-말단에 존재하는 신호 펩티드에 상응하고, 아미노산 24 내지 31은 Flag TAG에 상응하고, 아미노산 32 내지 317은 Ag85B*에 상응하고, 아미노산 318 내지 459는 Rv2626에 상응하고, 아미노산 460 내지 808은 RPFB-Dhyb*에 상응하고, 아미노산 809 내지 956은 Rv1733*에 상응하고, 아미노산 957 내지 966은 c-myc TAG, Ser 링커에 상응하고, 아미노산 968 내지 973은 His TAG에 상응한다. 서열번호 48에 제시된 융합체 번호 6-코딩 뉴클레오티드 서열은 합성 방법에 의해 생성했고, 합성 유전자는 NotI 및 BamH1에 의해 제한된 pGWiz에서 클로닝시켜 pTG18270를 수득했다.

pTG18272(융합체 번호 8)의 작제

융합체 번호 8의 아미노산 서열은 서열번호 37에 제시되어 있다. 아미노산 1 to 23은 광견병 바이러스 ERA 균주(Genbank 번호 M38452에 기재됨)의 당단백질 전구체의 N-말단에 존재하는 신호 펩티드에 상응하고, 아미노산 24 내지 31은 Flag TAG에 상응하고, 아미노산 32 내지 317은 Ag85B*에 상응하고, 아미노산 318 내지 459는 Rv2626에 상응하고, 아미노산 460 내지 607은 Rv1733*에 상응하고, 아미노산 608 내지 617은 c-myc TAG, Ser 링커에 상응하고, 아미노산 619 내지 624은 His TAG에 상응한다. 서열번호 49에 제시된 융합체 번호 8-코딩 뉴클레오티드 서열은 합성 방법에 의해 생성했고, 합성 유전자는 NotI 및 BamH1에 의해 제한된 pGWiz에서 클로닝시켜 pTG18272를 수득했다.

pTG18323(융합체 번호 13)의 작제

융합체 번호 13의 아미노산 서열은 서열번호 38에 제시되어 있다. 아미노산 1 내지 28은 홍역 바이러스(Halle 균주, Genbank 번호 X05597-1에 기재됨)의 F 단백질의 N-말단에 존재하는 신호 펩티드에 상응하고, 아미노산 29 내지 36은 Flag TAG에 상응하고, 아미노산 37 내지 349는 Rv2029*에 상응하고, 아미노산 350 내지 491은 Rv2626에 상응하고, 아미노산 492 내지 639는 Rv1733*에 상응하고, 아미노산 640 내지 932는 Rv0111*에 상응하고, 아미노산 933 내지 942는 c-myc TAG, Ser 링커에 상응하고, 아미노산 944 내지 949는 His TAG에 상응한다. 서열번호 50에 제시된 융합체 번호 13-코딩 뉴클레오티드 서열은 합성 방법에 의해 생성했고, 합성 유전자는 NotI 및 BamH1에 의해 제한된 pGWiz에서 클로닝시켜 pTG18323을 수득했다.

pTG18324(융합체 번호 14)의 작제

융합체 번호 14의 아미노산 서열은 서열번호 39에 제시되어 있다. 아미노산 1 내지 28은 홍역 바이러스(Halle 균주, Genbank 번호 X05597-1에 기재됨)의 F 단백질의 N-말단에 존재하는 신호 펩티드에 상응하고, 아미노산 29 내지 36은 Flag TAG에 상응하고, 아미노산 37 내지 349는 Rv2029*에 상응하고, 아미노산 350 내지 444는 TB10.4에 상응하고, 아미노산 445 내지 538은 ESAT6에 상응하고, 아미노산 539 내지 831은 Rv0111*에 상응하고, 아미노산 832 내지 841은 c-myc TAG, Ser 링커에 상응하고, 아미노산 843 내지 848은 His TAG에 상응한다. 서열번호 51에 제시된 융합체 번호 14-코딩 뉴클레오티드 서열은 합성 방법에 의해 생성했고, 합성 유전자는 NotI 및 BamH1에 의해 제한된 pGWiz에서 클로닝시켜 pTG18324를 수득했다.

융합체 9-12의 작제

표적화 서열은, 적절한 쌍의 프라이머, 신호 펩티드 서열을 결실시키기 위한 OTG20188(CGCGGCCGCACCATGGATTACAAGGATGACGACG; 서열번호 52) 및 OTG20189 (CGTCGTCATCCTTGTAATCCATGGTGCGGCCGCG; 서열번호 53), 및 TM 서열을 결실시키기 위한 OTG20189(CGTCGTCATCCTTGTAATCCATGGTGCGGCCGCG; 서열번호 54)를 사용하여 부위특이적 돌연변이유발(Quick Change Site-Directed mutagenesis kit, Stratagene)에 의해 플라스미드 pTG18267, pTG18269, pTG18266 및 pTG18268로부터 결실되었다. 생성되는 플라스미드는, 뉴클레오티드 서열 서열번호 43, 47, 41 및 45에 의해 코딩된 아미노산 서열 서열번호 31, 35, 29 및 33에 상응하는 각각 pTG18307 (융합체 번호 12 = 세포질 융합체 번호 3), pTG18295(융합체 번호 9 = 세포질 융합체 번호 5), pTG18296(융합체 번호 10 = 세포질 융합체 번호 2) 및 pTG18297(융합체 번호 11 = 세포질 융합체 번호 4)였다.

개개 Mtb 유전자 발현 플라스미드의 작제

NheI 제한 부위에 의해 분리된 Flag 서열 및 c-myc-His 서열은 pGWiz 플라스미드 중의 CMV 프로모터 하류에 도입했다. CMV 프로모터의 말단, Flag 및 C-myc-His 서열을 함유하는 합성 DNA 단편을 제네아트(Geneart)에 의해 합성하고, 플라스미드 FLAG_TAG_1에 삽입했다. 이 플라스미드를 PvuII 및 BglII로 소화시키고, 생성되는 단편을 동일한 효소에 의해 제한된 pGWiz에 삽입하여 pTG18282를 생성했다. 이어서, 각각의 Rv3407, Rv0569, Rv1807, Rv1813*, Rv3478 및 Rv2626 유전자를 pTG18269로부터 PCR에 의해 증폭시키고, 다만 Rv2626의 경우에는 pTG18323을 주형으로 사용했다.

각각의 TB 유전자의 단리에 사용된 증폭 프라이머 쌍은 표 1에 제시되어 있다.

TB 유전자	프라아미 명칭	프라이머 서열
Rv3407	OTG20232 서열번호 56	GATGACGACGATAAGGCTAGCAGAGCCACCGTGGGACTGG
	OTG20233 서열번호 57	GATGAGTTTTTGTTCGCTAGCCTGTTCATCCCGCATCTCGT
Rv0569	OTG20234 서열번호 58	GATGACGACGATAAGGCTAGCAAGGCCAAAGTCGGCG
	OTG20235 서열번호 59	GATGAGTTTTTGTTCGCTAGCTGTTCCTCTGGCGTGC
Rv1807	OTG20236 서열번호 60	GATGACGACGATAAGGCTAGCGATTTTGCCACCCTCCCACC
	OTG20237 서열번호 61	GAGATGAGTTTTTGTTCGCTAGCGCCAGCTGCAGGAGGTCTGG
Rv1813*	OTG20238 서열번호 62	GATGACGACGATAAGGCTAGCGCCAACGGCAGCATGAGCG
	OTG20239 서열번호 63	GAGATGAGTTTTTGTTCGCTAGCGTTGCAGGCCCAGTTCACGA
Rv3478	OTG20240 서열번호 64	GATGACGACGATAAGGCTAGCGTGGACTTCGGCGCCCTGC
	OTG20241 서열번호 65	GAGATGAGTTTTTGTTCGCTAGCGCCAGCGGCTGGAGTTCTGG
Rv2626	OTG20242 서열번호 66	GATGACGACGATAAGGCTAGCACAACCGCCAGAGACATCATG
	OTG20243 서열번호 67	GATGAGTTTTTGTTCGCTAGCAGAGGCCAGGGCCATGGGG

생성되는 앰플리콘은 NheI에 의해 선형화된 pTG18282에서 "융합 이점" PCR 클로닝 방법(Clontech)에 의해 클로닝시켰다. 이는 Tag 서열과 Mtb 유전자의 융합을 가능하게 한다. 생성된 플라스미드는 각각 pTG18300(Rv3407), pTG18301(Rv0569), pTG18302(Rv1807), pTG18303(Rv1813*), pTG18304(Rv3478) 및 pTG18305(Rv2626)로 명명했다.

5' 방향에서 Flag 및 3' 방향에서 c-myc-His 서열과 융합된 ESAT6, Rv1733*, Ag85B*, TB10-4, Rv0111* 및 Rv2029*에 대한 6개 플라스미드 함유 발현 카세트는 제네아트(Geneart)에 의해 합성했고, pGWiz에 삽입했다. 이들은 각각 pTG18308(ESAT6), pTG18309(Rv1733*), pTG18310(Ag85B*), pTG18315(TB10.4), pTG18329(Rv0111*), pTG18317(Rv2029*)로 명명했다. Rv1733* 및 Rv0111* 단백질은 TM 도메인을 함유하기 때문에, 광견병 바이러스 ERA 균주의 당단백질 전구체의 N-말단에 존재하는 신호 펩티드는 발현 문제를 피하기 위해 Flag 서열의 상류에 융합시켰다.

각각 또는 융합된 Mtb 유전자의 코딩과 상관 없이, 면역화에 사용된 플라스미드는 내독소-비함유 조건하에 제조했다.

재조합 MVA의 작제

TAG 서열의 결실

TAG 서열은 MVA 벡터 중의 이들의 존재를 피하기 위해 Mbt 항원 융합체로부터 제거했다. Mtb 융합 카세트 내부에 위치한 TAG 서열(즉, Flag는 신호 펩티드와 Mtb 융합체의 제1 아미노산 사이에 존재하고, cmyc TAG는 Mtb 융합체의 최후 아미노산과 막-고정 펩티드 사이에 존재함)은 하기 표 2에 제시된 바와 같이 QuikChange 부위-지시된 돌연변이유발 키트(Stratagen) 및 적절한 프라이머 쌍을 사용하여 부위지시된 돌연변이유발에 의해 결실시켰다. Mtb 융합 카세트 외부에 위치한 TAG 서열(세포질 융합 및 His TAG의 경우)은 융합체의 양 말단 상에 개시제 Met 및 터미네이터 코돈의 부가를 가능하게 하는 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 결실시켰다.

융합체	Flag 결실을 위한 프라이머 쌍	cmyc 결실을 위한 프라이머 쌍	생성 플라스미드
4	OTG20313 (서열번호 68 ) OTG20314 (서열번호 69)	OTG20315 (서열번호 70 ) OTG20316 (서열번호 71 )	pTG18339
5	OTG20317 (서열번호 72) OTG20318 (서열번호 73 )	OTG20319 (서열번호 74) OTG20320 (서열번호 75)	pTG18340
6	OTG20321 (서열번호 76 ) OTG20322 (서열번호 77)	NA	pTG18341
13	OTG20333 (서열번호 78) OTG20334 (서열번호 79)	NA	pTG18342
14	OTG20333 (서열번호 78) OTG20334 (서열번호 79)	NA	pTG18343

MVATG18355(융합체 번호 13)의 작제

융합체 번호 13을 코딩하는 뉴클레오티드 서열(서열번호 38의 일부에 1 내지 28 및 37 내지 932로 제시된 바와 같은 SF-Rv2029*-Rv2626-Rv1733*-Rv0111*)은 p7.5K 프로모터 (서열번호 80; CCACCCACTTTTTATAGTAAGTTTTTCACCCATAAATAATAAATACAATAATTAATTTCTCGTAAAAGTAGAAAATATATTCTAATTTATTGCACGGTAAGGAAGTAGAATCATAAAGAACAGT)의 조절하에 위치시켰다. 이 문자는 적절한 쌍의 프라이머 OTG20405(서열번호 81) 및 OTG20406(서열번호 82)을 사용하여 VV(백시니아 바이러스) 코펜하겐 균주 DNA로부터 PCR에 의해 증폭시키고, 융합체 번호 13 서열은 OTG20407(서열번호:83) 및 OTG20408(서열번호 84)을 사용하여 PCR에 의해 플라스미드 pTG18342로부터 증폭시켰다. 이어서, p7.5K 및 융합체 번호 13-코딩 서열은 프라이머 OTG20405(서열번호 81) 및 OTG20408(서열번호 84)를 사용하여 이중 PCR에 의해 재구성했다. 생성되는 단편은 백시니아 전이 플라스미드 pTG17960의 BglII 및 NotI 제한 부위에 삽입하여 pTG18355를 생성했다.

MVA 전이 플라스미드, pTG17960은 MVA 게놈의 결실 III에서 상동성 재조합에 의해 전이되는 뉴클레오티드 서열의 삽입을 가능하게 하도록 설계된다. 이는 MVA 결실 III[참조: Sutter and Moss, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10847]을 둘러싸는 플랭킹 서열(BRG3 및 BRD3)에 클로닝된 플라스미드 pTG1E[참조: Braun et al., 2000, Gene Ther. 7:1447]로부터 기원한다. 전이 플라스미드는 또한 즉시 후기 백시니아 바이러스 합성 프로모터 p11K7.5[참조: kindly provided by R. Wittek, University of Lausanne]의 조절하에 아쿠오레아 빅토리아(Aequorea victoria) 증강된 녹색 형광 단백질(eGFP 유전자, pEGP-C1으로부터 단리됨, Clontech) 및 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 크산틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제 유전자(gpt 유전자) 사이에 융합체를 함유한다. 크산틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제의 합성은 GPT+ 재조합 MVA가 마이코페놀산, 크산틴 및 하이포크산틴을 함유하는 선택 배지에서 성장할 수 있게 하고[참조: Falkner et al, 1988, J. Virol. 62, 1849-54], eGFP는 재조합 MVA 플라크의 가시화를 가능하게 한다. 선택 마커 eGFP-GPT는 동일한 배향으로 2개 상동성 서열 사이에 위치한다. 클론 선택 후, 선택 마커는 eGFP-GPT-재조합 MVA의 성장을 가능하게 하는 선택 없이 수회 계대에 의해 용이하게 제거할 수 있다.

MVATG18355의 생성은 MVA로 감염되고 pTG18355을 사용한 뉴클레오펙션에 의해 형질감염된 1차 닭 배아 섬유아세포(CEF)에서 상동성 재조합에 의해 수행했다(Amaxa Nucleofector 기술에 따라). 바이러스 선택은 마이코페놀산, 크산틴 및 하이포크산틴을 함유하는 선택 배지의 존재하에 성장시킨 후에 플라크 정제에 의해 수행했다. 상술한 바와 같이, 선택 마커는 비-선택 배지에서 계대에 의해 제거했다. 모 MVA에 의한 오염의 부재는 PCR에 의해 확인했다.

MVATG18364(융합체 번호 13 + 융합체 번호 4)의 작제

융합체 번호 4(서열번호 32의 일부에 서열번호 1 내지 23, 이어서 32 내지 855 및 866 내지 932로 제시된 SR-RPFB-Dhyb*-Ag85B*-TB10.4-ESAT6-TMR)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 프라이머 쌍 OTG20445(서열번호 86) 및 OTG20446(서열번호 87)을 사용하여 PCR에 의해 야생형 MVA의 게놈 DNA로부터 클로닝시킨 pH5R 프로모터 (서열번호 85, TTTATTCTATACTTAAAAAATGAAAATAAATACAAAGGTTCTTGAGGGTTGTGTTAAATTGAAAGCGAGAAATAATCATAAATTATTTCATTATCGCGATATCCGTTAAGTTTG)의 조절하에 위치시켰다. 증폭된 생성물은 NotI 및 PacI에 의해 소화시켰다. 융합체 번호 4-코딩 서열은 OTG20447(서열번호 88) 및 OTG20380(서열번호 89) 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 pTG18339로부터 증폭시켰다. 증폭된 생성물은 PacI 및 XhoI로 소화시켰다. 두 단편은 NotI 및 XhoI에 의해 제한된 pTG18355 내로 함께 클로닝시켜 pTG18364를 수득했다.

MVATG18364 바이러스의 생성은 상기한 바와 같은 상동성 재조합에 의해 CEF에서 수행했다.

MVATG18365(융합체 번호 13 + 융합체 번호 11)의 작제

융합체 번호 11(서열번호 33의 일부에 위치 1의 Met 개시제에 선행하는 위치 10 내지 위치 833로 제시된 RPFB-Dhyb*-Ag85B*-TB10.4-ESAT6)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 pH5R 프로모터의 조절하에 위치시켰다. 프로모터는 OTG20445(서열번호 86) 및 OTG20446(서열번호 87) 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 pTG18364로부터 수득하고, 증폭된 단편은 NotI 및 PacI로 소화시켰다. 융합체 번호 11-코딩 서열은 프라이머 쌍 OTG20448(서열번호 90) 및 OTG20382(서열번호 91)을 사용하여 PCR에 의해 pTG18297로부터 클로닝시키고, 증폭된 단편은 PacI 및 XhoI에 의해 소화시켰다. 두 단편은 NotI 및 XhoI에 의해 소화된 pTG18355 내로 함께 클로닝시켜 pTG18365을 수득했다.

MVATG18365 바이러스의 생성은 상기한 바와 같은 상동성 재조합에 의해 CEF에서 수행했다.

MVATG18376(융합체 번호 13 + 융합체 번호 4 + 융합체 번호 5)의 작제

융합체 번호 5(서열번호 34의 일부에 위치 1 내지 23, 이어서 32 내지 1115 및 1126 내지 1192로 제시된 SR-Rv0569-Rv1813*-Rv3407-Rv3478-Rv1807-TMR)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 B2R 프로모터(서열번호 92, TATATTATTAAGTGTGGTGTTTGGTCGATGTAAAATTT-TTGTCGATAAAAATTAAAAAATAACTTAATTTATTATTGATCTCGTGTGTACAACCGAAATC)의 조절하에 위치시켰다. 프로모터는 프라이머 쌍 OTG20469(서열번호 93) 및 OTG20470(서열번호 94)을 사용하여 PCR에 의해 VV 웨스턴 리저브 균주 DNA로부터 증폭시키고, 증폭된 단편은 XhoI 및 NheI로 소화시켰다. 융합체 번호 5-코딩 서열은 프라이머 쌍 OTG20472(서열번호 95) 및 OTG20473(서열번호 96)을 사용하여 pTG18340로부터 증폭시킨 다음, NheI 및 BamHI로 제한했다. 소화된 두 단편은 XhoI 및 BamHI로 선형화된 pTG18364 내로 함께 클로닝시켜 pTG18376을 수득했다.

MVATG18376 바이러스의 생성은 상기한 바와 같은 상동성 재조합에 의해 CEF에서 수행했다.

MVATG18377(융합체 번호 13+ 융합체 번호 11 + 융합체 번호 5)의 작제

B2R 프로모터는 상기한 바와 같은 프라이머 쌍 OTG20469 및 OTG20470을 사용하여 pTG18376으로부터 증폭시키고, XhoI 및 NheI로 소화시켰다. 융합체 번호 5(SR-Rv0569-Rv1813*-Rv3407-Rv3478-Rv1807-TMR)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 상기한 바와 같이 증폭시키고, XhoI 및 BamHI로 선형화시킨 pTG18364 내로 B2R 프로모터의 조절하에 클로닝시켜 pTG18377을 생성했다.

MVATG18377 바이러스의 생성은 상기한 바와 같은 상동성 재조합에 의해 CEF에서 수행했다.

MVATG18378(융합체 번호 13 + 융합체 번호 4 + 융합체 번호 9)의 작제

융합체 번호 9(서열번호 35의 일부에 위치 1의 Met 개시제에 선행하는 위치 10 내지 1093으로 제시된 Rv0569-Rv1813*-Rv3407-Rv3478-Rv1807)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 프라이머 쌍 OTG20483(서열번호 97) 및 OTG20474(서열번호 98)를 사용하여 PCR에 의해 pTG18295로부터 증폭시켰다. 증폭된 생성물을 NheI 및 BamHI로 소화시키고, XhoI 및 NheI-제한된 B2R 프로모터(상기한 바와 같이 pTG18376로부터 증폭됨)를 사용하여 XhoI 및 BamHI에 의해 소화된 pTG18364 내로 클로닝시켜 pTG18378을 수득했다.

MVATG18378 바이러스의 생성은 상기한 바와 같은 상동성 재조합에 의해 CEF에서 수행했다.

MVATG18379(융합체 번호 13 + 융합체 번호 11 + 융합체 번호 9)의 작제

융합체 번호 9(Rv0569-Rv1813*-Rv3407-Rv3478-Rv1807)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 B2R 프로모터는 둘 다 상기한 바와 같이 증폭시키고, XhoI 및 BamHI로 선형화된 pTG18365 내로 함께 클로닝시켜 pTG18378을 수득했다.

MVATG18379 바이러스의 생성은 상기한 바와 같은 상동성 재조합에 의해 CEF에서 수행했다.

MVATG18404(융합체 번호 14 + 융합체 번호 6)의 작제

융합체 번호 14(서열번호 39의 일부에 위치 1 내지 28 및 37 내지 831에 제시된 SF-Rv2029*-TB10.4-ESAT6-Rv0111*)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 프라이머 쌍 OTG20407(서열번호 83) 및 OTG20525(서열번호 99)를 사용하여 PCR에 의해 pTG18343으로부터 증폭시켰다. p7.5K 프로모터는 OTG20524(서열번호 100) 및 OTG20406(서열번호 82) 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 pTG18355로부터 수득했다. 이어서, 융합체 번호 14-코딩 서열은 OTG20524(서열번호 100) 및 OTG20525(서열번호 99)를 사용하여 이중 PCR에 의해 p7.5K의 조절하에 클로닝시켰다. 생성되는 단편은 BamHI 및 NotI로 제한하고, 백신 전이 플라스미드, pTG17960의 BglII 및 NotI 제한 부위 내로 삽입하여 pTG18395를 수득했다.

융합체 번호 6(서열번호 36의 일부에 위치 1 내지 23 및 32 내지 956으로 제시된 SS-Ag85B*-Rv2626-RPFB-Dhyb*-Rv1733*)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 프라이머 쌍 OTG20527(서열번호 101) 및 OTG20376(서열번호 102)을 사용하여 PCR에 의해 pTG18341로부터 증폭시키고, 증폭 생성물은 PacI 및 XhoI로 소화시켰다. pH5R 프로모터는 상기한 바와 같이 pTG18355로부터 증폭시키고, NotI 및 PacI로 소화시켰다. 소화된 두 단편을 NotI 및 XhoI로 선형화시킨 pTG18395 내로 함께 클로닝시켜 플라스미드 pTG18404를 수득했다.

MVATG18404 바이러스의 생성은 상기한 바와 같이 상동성 재조합에 의해 CEF에서 수행했다.

MVATG18417(융합체 번호 14 + 융합체 번호 6 + 융합체 번호 5)의 작제

융합체 번호 5(SR-Rv0569-Rv1813*-Rv3407-Rv3478-Rv1807-TMR)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 pTG18376을 XhoI 및 BamHI로 소화시켜 수득했다. 생성되는 단편은 동일한 효소로 제한된 pTG18404에 삽입하여 pTG18417을 생성했다.

MVATG18417 바이러스의 생성은 상기한 바와 같이 상동성 재조합에 의해 CEF에서 수행했다.

MVATG18418(융합체 번호 14 + 융합체 번호 6 + 융합체 번호 9)의 작제

B2R 프로모터의 조절하에 위치된 융합체 번호 9(Rv0569-Rv1813*-Rv3407-Rv3478-Rv1807)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 pTG18379를 XhoI 및 BamHI로 소화시켜 수득했다. 생성되는 단편은 동일한 효소에 의해 제한된 pTG18404에 삽입하여 pTG18418을 수득했다.

MVATG18418 바이러스의 생성은 상기한 바와 같이 상동성 재조합에 의해 CEF에서 수행했다.

생성 및 단백질 정제

4개의 이. 콜라이 균주는 개개 Mtb 항원의 발현에 대해 시험했다. 모든 균주는 락토즈 또는 락토즈의 유사체(즉, IPTG)에 의한 T7 폴리머라제의 발현의 유도를 가능하게 하는 이들의 게놈 내에 DE3 프로파지를 함유한다. 4개 균주는 단백질 발현을 위한 고전적 균주로서 Bl21(DE3)(Lucigen), 독성 단백질의 발현을 위한 C41(DE3)(Lucigen), 이. 콜라이 코돈과 상이한 코돈을 갖는 단백질의 발현을 위한 Bl21(DE3) 로제타(Rosetta)(Merck Chemical), 및 막관통 펩티드(예: Rv1733)를 갖는 단백질의 발현을 위한 C43(DE3)(Lucigen)이었다. 더욱이, 3개의 상이한 온도 및 생성 시간이 항원 생성의 최적화를 위해 시험되었다.

최적 조건을 결정하기 위한 발현 분석

각각의 이. 콜라이 균주는 생성되는 Mtb 항원을 코딩하는 플라스미드로 형질전환시켰다. 5개 콜로니를 신선하게 형질전환된 플레이트로부터 단리하고, 암피실린의 존재하에 50ml의 LB(Luria Broth)에 접종하고, 진탕하에 37℃에서 밤새 성장시켰다. 자동유도성 배지(글루코즈/락토즈 및 항생물질을 함유하는 AI 배지; Studier, 2005, 단백질 Expr Purif. 41: 207-34)의 플라스크를 사전배양 시료에 접종하고, 이어서 각각 18℃, 30℃ 및 37℃에서 24시간, 8시간 및 8시간 동안 배양했다. 배양 말기에 600nm에서의 흡광도를 측정하고, 세포를 원심분리에 의해 회수했다. 세포 펠렛을 PBS에 재현탁시키고, OD 600nm를 각각의 시험된 조건 동안 50으로 조정한 다음, 초음파처리에 의해 세포를 용해시켰다. 이어서, 세포 용해물을 10분 동안 4℃에서 10,000g으로 원심분리하고, 상청액 및 펠렛의 시료(전형적으로 10㎕)를 SDS-PAGE 상에 적재하여 최적 조건을 평가했다.

Mtb 항원의 생성 및 정제

His tag-함유 Mtb 항원의 정제는 이미 측정된 최적 조건을 적용하는 2L 플라스크에서 성장한 500mL 배양물로부터 채취했다. 세포는 원심분리에 의해 회수하고, 250mL의 배양물에 상응하는 펠렛은 사용할 때까지 -20℃에서 유지했다. 회수된 박테리아는 항원의 용해도에 따라 PBS 또는 구아니딘에 재현탁시키고, 세포 용해를 위해 초음파처리에 제공하고, 공급업자의 권고에 따라 천연 또는 변성 조건하에 Ni 세파로즈 6 신속 유동 수지(GE Healthcare; 기준 17-5318) 상에서 IMAC 친화성 크로마토그래피에 의해 정제했다. 단백질은 점증 농도의 이미다졸(50mM, 100mM 및 250mM)을 적용하여 용출시켰다. 순수한 단백질을 함유하는 분획을 풀링하고, 항원의 용해도에 따라 PBS 또는 우레아에 대해 투석했다.

단백질 특성화

다양한 시험을 수행하여, 용출된 분획에 존재하는 정제된 Mtb 항원의 양 및 품질을 평가했다.

내독소 수준은 Charles River 실험실의 Portable Test System (PTS)을 사용하여 측정하였다. 0.005 내지 0.5 EU/mL의 검출 범위의 카트리지를 제조업자의 권고에 따라 사용했다.

단백질 농도는 제조업자의 권고에 따라 브래드포드 분석(Bioroad)에 의해 측정했다. 샘플 완충제에서 희석한 소 혈청 알부민(BSA)를 표준으로 사용했다.

용출된 분획 및 투석된 용액의 순도는 SDS-PAGE(4-12% 인비트로겐) 상에서 전기영동에 의해 평가할 수 있다.

정제된 단백질의 질량은 MALDI(매트릭스 지원 레이저 탈리/이온화) 또는 전기분무 방법을 사용하여 측정했다. 측정된 및 계산된 질량은 당해 단백질이 순수한지 아닌지의 여부를 결정하기 위해 비교했다. 용액 또는 겔 밴드에서 단백질의 동일성은 트립신 소화 후에 생성된 펩티드의 질량 측정에 의해 확인했다. 펩티드의 질량은 MALDI 및/또는 탠덤 질량 분광분석과 커플링된 액체 크로마토그래피(LC/MS/MS)에 의해 측정했다. 펩티드의 측정된 및 계산된 질량은 단백질의 동일성을 확인하기 위해 비교했다.

Mtb 항원에 대한 항체의 생성

다양한 Mtb 항원에 대한 항체는 2개의 상이한 항원-특이적 펩티드의 혼합을 사용한 래빗의 면역화 후에 생성했다(Eurogentec; Seraing, Belgium). 15 또는 16개 아미노산 잔기의 이러한 펩티드는 에피토프 B 예측 프로그램을 작동한 후에 선택했다. Rv1733*, Rv2029*, Rv0569, Rv1807, Rv0111, RPFB-Dhyb*, Rv1813* 및 Rv3407 항원에 대한 항혈청은 0일차에 2개의 특이적 펩티드를 사용한 래빗 면역화 및 7일, 10일 및 18일차에 3회 부스팅 후에 생성했다. 혈액 샘플은 최초 펩티드 주사전 및 21일차에 채취했다. 래빗의 최종 채혈은 29일차에 수행했다. Rv3478의 경우, 래빗은 2개의 특이적 16량체 펩티드를 사용하여 0일, 22일, 49일 및 77일차에 주사했다. 혈액 샘플은 최초 펩티드 주사 및 31일 및 59일차에 채취했다. 래빗의 최종 채혈은 87일차에 수행했다.

최종 혈청은 특정한 펩티드를 사용하는 ELISA 및 개개 Mtb 유전자 발현 플라스미드를 사용한 웨스턴-블롯 분석에 의해 평가했다.

Mtb 융합 단백질의 시험관내 시험

DNA-매개된 발현 생성물에 대한 웨스턴 블롯

2×10⁶ HEK293 세포는 형질감염후 18시간에서 성장 배지에 첨가된 프로테아좀 억제제 MG132(10μM)의 존재하에 리포펙타민 2000(Invitrogen; #11668-019)을 사용하여 Mtb 항원 융합체 또는 개개 유전자를 코딩하는 5㎍의 다양한 플라스미드로 형질감염시켰다. pGWIZ 플라스미드는 음성 대조군으로 사용했다. 48시간 후, 배지를 폐기하고, 세포는 β-머캅토에탄올(5% v:v)가 보충된 450μL/접시의 트리스-글리신-SDS 2×완충제(ref: LC2676; Novex)로 용해시켰다. 이어서, 용해물을 초음파처리하고, 5분 동안 95℃에서 비등시켰다. 세포 용해물 30㎕는 표준 프리캐스트 겔 시스템(Biorad)을 사용하여 사전캐스팅된 10% 표준 겔 상에서 전기영동에 제공했다. 전기영동 후, 단백질을 PVDF 막(Macherey Nagel, 741260)으로 옮겼다. 면역검출은 1/500 희석된 모노클로날 항-Flag M2 퍼옥시다제(HRP) 항체(Sigma; #A8592) 또는 1/5000 희석된 모노클로날 항-His 퍼옥시다제 항체(Invitrogen; #R931-25)로 수행했다. 면역-복합체는 ImmunStar WesternC 키트(Biorad, ref 170.5070)를 사용하여 밝혀냈다.

상기한 바와 같이 래빗의 면역화 후에 수득한 혈청(1/1000 희석)은 Rv1733*, Rv2029*, Rv0569, Rv1807, Rv0111*, Rpf-B-D, Rv1813*, Rv3407 및 Rv3478의 웨스턴 블롯 검출에 또한 사용했다. 시판되는 항체를 각각 ESAT6, Ag85B *, TB10.4 및 Rv2626의 검출에 사용하고 마우스 모노클로날 항체 HYB076-08(Santa-Cruz; #sc-57730, 1/500 희석)을 ESAT6의 검출에 사용하고, 래빗 폴리클로날 항-혈청 NR-13800(BEI, 1/5000 희석)을 Ag85B*의 검출에 사용하고, 마우스 모노클로날 항체 26A11(Lifespan-Biosciences;#LS-C91052, 1/1000 희석)을 Rv2626의 검출에 사용하고, 폴리클로날 래빗 항체 ABIN361292(Antibodies-online, 1/1000 희석)를 TB10.4의 검출에 사용했다.

MVA-매개된 발현 생성물에 대한 웨스턴 블롯

10⁶ A549 세포는 감염후 30분에서 성장 배지에 첨가된 프로테아좀 억제제 MG132(10μM)의 존재하에 다양한 MVA 생성 Mtb 항원 융합체로 MOI 1에서 감염시켰다. MVATGN33.1 공 벡터는 음성 대조군으로 사용했다. 24시간 후, 배지를 폐지하고, 세포는 β-머캅토에탄올(5% v:v)이 보충된 300μL/디쉬의 트리스-글리신-SDS 2×완충제(ref: LC2676; Novex)로 용해시켰다. 이어서, 용해물을 초음파처리하고, 5분 동안 95℃에서 가열시켰다. 20㎕의 세포 용해물은 표준 프리캐스트 겔 시스템(Biorad)을 사용하여 사전캐스팅된 4 내지 15% 표준 겔 상에서 전기영동에 제공했다. 전기영동 후, 단백질은 PVDF 막(Trans-blot^R TurboTM Transfer System (#170-4155, Biorad))으로 옮겼다. 면역검출은 DNA 플라스미드의 발현 생성물과 조합하여 상기한 바와 같이 Mtb 특이적 항체로 수행했다. 면역-복합체는 ImmunStar WesternC 키트(Biorad, ref 170.5070)를 사용하여 밝혀냈다.

마우스 모델에서 면역성 평가

DNA 면역화 프로토콜

마우스는 융합체 코딩 플라스미드, 또는 융합체에 포함된 개개 Mtb 항원을 코딩하는 플라스미드의 혼합을 사용하여 2주 또는 3주 간격으로 3회 면역화시켰다. 100μL의 멸균 PBS 중의 100㎍의 DNA를 전경골근에 근육내 경로에 의해 주사했다. 세포 면역 반응은 ELISpot IFNγ 분석에 의해 최후 DNA 주사후 2주에 평가했다.

MVA 면역화 프로토콜

MVA TB 후보의 면역원성은 BALB/c, 유전자도입 HLA-A2, C57BL/6 및 C3H/HeN 마우스에서 평가했다. 각각의 MVA 벡터는 100μL의 트리스-HCl-완충된 및 슈크로즈-함유 완충제 중의 1×10⁷ pfu의 용량으로 꼬리의 기부에 1회 피하 투여했다. 세포 면역 반응은 ELISpot IFNγ 분석에 의해 MVA 주사후 7일에 평가했다.

펩티드 라이브러리

펩티드 라이브러리는 면역화된 마우스로부터 비장세포를 생체외에서 재작하기 위해 사용했다. 보다 정확하게는, 상기한 융합체에 함유된 모든 14개 Mtb 항원을 커버하는 679개 펩티드(11개 아미노산이 중첩하는 15량체)를 합성했다(ProImmune). 펩티드의 풀은 1μmol/L의 최종 농도로 DMSO에서 제조했다. 각각의 Mtb 항원의 전장을 커버하기 위해서는 1 내지 4개 풀이 필요했다.

Rv1733은 18 및 17개 펩티드의 2개 풀로 피복되어 있다. 풀 1: Rv1733 잔기 62 내지 144를 피복하는 18개 펩티드; 풀 2: Rv1733 잔기 134 내지 210을 피복하는 17개 잔기.

Rv2029는 19개 펩티드의 4개 풀로 피복했다. 풀 1: Rv2029 잔기 1 내지 87를 피복하는 19개 펩티드; 풀 2: Rv2029 잔기 77 내지 163을 피복하는 19개 펩티드; 풀 3: Rv2029 잔기 153 내지 239를 피복하는 19개 펩티드; 풀 4: Rv2029 잔기 229 내지 314를 피복하는 19개 펩티드.

Rv0569는 Rv0569의 잔기 1 내지 88을 피복하는 20개 펩티드의 1개 풀로 피복했다.

Rv1807는 최초 3개 풀의 경우에 25개 펩티드 및 제4 풀의 경우에 22개 펩티드의 4개 풀로 피복했다. 풀 1: Rv1807 잔기 1 내지 111을 피복하는 25개 펩티드; 풀 2: Rv1807 잔기 101 내지 211을 피복하는 25개 펩티드; 풀 3: Rv1807 잔기 201 내지 311을 피복하는 25개 펩티드; 풀 4: Rv1807 잔기 301 내지 399를 피복하는 22개 펩티드.

Rv0111은 최초 3개 풀의 경우에 20개 펩티드 및 제4 풀의 경우에 19개 펩티드의 4개 풀로 피복했다. 풀 1: Rv0111 잔기 361 내지 451을 피복하는 20개 펩티드; 풀 2: Rv0111 잔기 441 내지 531을 피복하는 20개 펩티드; 풀 3: Rv0111 잔기 521 내지 611을 피복하는 20개 펩티드; 풀 4: Rv0111 잔기 601 내지 685를 피복하는 19개 펩티드.

RpfB - Dhyb는 최초 3개 풀의 경우에 22개 펩티드 및 제4 풀의 경우에 19개 펩티드의 4개 풀로 피복했다. 풀 1: RpfB 잔기 30 내지 127을 피복하는 22개 펩티드; 풀 2: RpfB 잔기 117 내지 215를 피복하는 22개 펩티드; 풀 3: RpfB 잔기 205 내지 284 및 RpfB 잔기 53 내지 71을 피복하는 22개 펩티드; 풀 4: RpfB 잔기 61 내지 146을 피복하는 19개 펩티드.

Rv1813은 Rv1813 잔기 34 내지 143을 피복하는 25개 펩티드의 1개 풀로 피복했다.

Rv3407은 Rv3407 잔기 1 내지 99을 피복하는 22개 펩티드의 1개 풀로 피복했다.

Rv3478은 24개 펩티드의 4개 풀로 피복했다. 풀 1: Rv3478 잔기 1 내지 107을 피복하는 24개 펩티드; 풀 2: Rv3478 잔기 97 내지 203을 피복하는 24개 펩티드; 풀 3: Rv3478 잔기 193 내지 299를 피복하는 24개 펩티드; 풀 4: Rv3478 잔기 289 내지 393을 피복하는 24개 펩티드.

Rv2626은 17 및 16개 펩티드의 2개 풀로 피복했다. 풀 1: Rv2626 잔기 1 내지 79를 피복하는 17개 펩티드; 풀 2: Rv2626 잔기 69 내지 143을 피복하는 16개 펩티드.

Ag85B는 23개 펩티드의 3개 풀로 피복했다. 풀 1: Ag85B 잔기 39 내지 141를 피복하는 23개 펩티드; 풀 2: Ag85B 잔기 131 내지 233을 피복하는 23개 펩티드; 풀 3: Ag85B 잔기 223 내지 325를 피복하는 23개 펩티드.

ESAT -6은 ESAT-6의 잔기 1 내지 95를 피복하는 21개 펩티드의 1개 풀로 피복했다.

TB10.4은 TB10.4의 잔기 1 내지 95를 피복하는 21개 펩티드의 1개 풀로 피복했다.

IFNγ ELISpot 분석

면역화된 마우스로부터의 비장세포를 수집하고, 적혈구 세포를 용해시켰다(Sigma, R7757). 웰당 2×10⁵개 세포는, 10% FCS(JRH, 12003-100M), 80U/mL 페니실린/80㎍/mL 스트렙토마이신(PAN, P06-07-100), 2mM L-글루타민(Gibco, 25030), 1× 비필수 아미노산(Gibco, 11140), 10mM 헤페스(Gibco, 15630), 1mM 나트륨 피루베이트(Gibco, 31350) 및 50μM β-머캅토에탄올(Gibco, 31350)이 보충된 αMEM 배양 배지(Gibco, 22571에서 및 10단위/mL의 재조합 쥐 IL2(Peprotch, 212-12)의 존재하에 항-마우스 IFNγ 모노클로날 항체(BD Biosciences; 10㎍/mL, 551216)로 피복된 멀티스크린 플레이트(Millipore, MSHA S4510)에서, 음성 대조군으로서 단독으로, 또는 하기와 함께 40시간 동안 삼중으로 배양했다:

- 1μmol/L의 최종 농도에서 펩티드의 상기한 풀

- 양성 대조군을 위해 5㎍/ml의 콘카나발린 A(Sigma, C5275).

- 무관한 펩티드.

IFNγ-생성 T 세포는 문헌[참조: Himoudi et al., 2002, J. Virol. 76: 12735-46]에 이미 기재된 바와 같이 ELISpot(사이토킨 특이적 효소 결합된 면역스폿) 분석에 의해 정량화했다. 결과는 삼중 웰에 대해 수득한 평균 값으로 제시된다. 관찰된 역치(또는 컷-오프)에 대한 양성의 실험 역치는 10⁶개 세포에 대해 보고된 배지 단독 + 2 표준 편차로 관찰된 스폿의 평균 값에 상응하는 역치 값을 계산함으로써 측정했다. 또한, CTL ELISpot 판독치에 결합된 기술적 컷-오프는 50 스폿/10⁶개 세포인 것으로 정의했다(이는 판독치의 CV(변동 계수)가 20%보다도 계통적으로 적은 값임). ELISpot 반응의 통계학적 분석은 크루스칼-왈리스(Kruskal-Wallis) 시험을 사용하여 수행한 다음, 유의차가 수득되는 경우, 만-휘트니(Mann-Whitney) 시험을 사용하여 수행했다. 0.05 이하인 P 값은 유의한 것으로 간주된다.

마우스에서 마이코박테리움 결핵 감염에 대한 Mtb 항원-함유 백신의 치료 효과의 평가

암컷 C57BL/6 마우스(6 내지 8주령)은 아에로 조절 단위[참조: Hartings et al., 2004, J Pharmacol Toxicol Methods 49: 39-55]와 함께 함유된 헨더슨(Henderson) 장를 사용하여 0주에서 에어로졸 챌린지했다. 마이코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis) 챌린지 균주 H37Rv(NCTC 7416)는 케모스탯에서 배양하고[참조: James et al., 2000, J Appl Microbiol 88: 669-77], 2㎛의 평균 직경의 미립자는 콜리슨 분무기에서 생성하고, 동물 코에 직접 전달했다. 콜리슨 분무기 중의 현탁액은 마우스 각 그룹에 대해 대략 100CFU/폐의 추정 흡입 용량을 전달하도록 조정했다.

마우스는 꼬리 기부의 한 부위에 피하 제공된 MVATG18364, MVATG18376 또는 MVATG18377을 사용한 감염 후에 10주 및 14주에 면역화시켰다(10⁷pfu/100μL/마우스). 마우스 그룹은 음성 대조군으로서 MVATGN33.1을 주사했다(10⁷pfu/100μL/마우스).

마우스는 6주에서 15주까지 10주 동안 경구 경구 투여에 의해 주 1회 이소니아지드(INH, 체중 kg당 25mg) 및 리파펜틴(RIF, 체중 kg당 10mg)으로 치료했다(문헌[Aagaard et al., 2011, Nat Med, 17: 189-194]으로부터 적합한 프로토콜). 5마리 마우스를 약물 치료전 6주에 희생시켰다.

각 그룹으로부터의 마우스는, 치료 단계의 말기에 클리어런스를 측정하기 위해 항생물질 치료(감염후 15주)의 말기에 5마리를 희생시키고, 21주에 나머지를 희생시켰다. 기관(예: 비장)은 무균적으로 제거하고, 검시일에 동결시키고, 박테리아 부하 분석을 위해 처리했다. 기관 균질물의 샘플의 연속 희석물을 7H11 미들브룩(Middlebrook) OADC 선택적 아가 상에 플레이팅하고, 실행가능한 마이코박테리아(CFU)의 열거를 위해 최대 3주 동안 배양했다. 박테리아 부하 데이터는 Log10 전체 콜로니 형성 단위(CFU)로서 표시했다.

MVA 후보의 치료 효능을 비교하고, 만-휘트니 시험을 사용하여 등급화했다. 0.05 미만의 p 값은 유의한 것으로 간주했다.

결과

실시예 1: 면역원성 조합물을 위한 적합한 Mtb 항원의 선택

Mtb 게놈은 대략 4000개 유전자를 발현하지만, 대부분의 유전자 생성물의 Mtb 라이프 사이클에서 기능 및 역할은 아직 특성화되지 않았다. 재료 및 방법에서 기재된 바와 같이, Mtb 항원에 대한 종래의 데이터는, 자연 감염 경과의 모든 상 동안 항-TB 면역성을 상승시킬 수 있는 면역치료 백신을 제공하는 Mtb 게놈으로부터 가장 적절한 세트의 유전자/항원을 동정할 목적으로 이용하능한 문헌 및 데이터 베이스로부터 조사했다.

이들 서지의 분석은 모든 3개 감염 상에 속하는 33개 Mtb 항원의 세트, 즉 활성기의 7개 항원, 5개의 소생(Rpf) 항원 및 19개 잠복 항원 뿐만 아니라 2개 PE/PPE 항원을 "사전-선택"하는 것을 가능하게 한다.

- 활성기의 항원: ESAT-6 (Rv3875), CFP-10 (Rv3874), TB10.4 (Rv0288), Ag85A (Rv3804), Ag85B, (Rv1886) 및 2개의 "ESAT-6 유사 항원"(Rv3620 및 Rv3619);

- 병원성과 연관되는 것으로 생각되는 2개의 PE / PPE 항원(Rv2608 및 Rv3478).

- 소생기의 항원: 5개의 기존의 Rpf 유전자(RpfA(Rv0867c), RpfB(Rv1009), RpfC(Rv1884c), RpfD(Rv2389), RpfE(Rv2450c))를 사전선택했다. Rpf는, 휴면 세포의 소생을 위해 발현을 필요로 하는 분비된 또는 막 결합된 무라밀분해 효소이다.

- 19개 잠복 항원은 기재된 150개 이상의 기존 잠복 유전자로부터 사전선택했다. 보다 정확하게는, 12개는 DosR 레귤론, 발현이 잠복기 동안 증가되는 45개 유전자 세트에 속하고, 5개는 생체내에서 Mtb가 조우하는 잠복 상태를 모방하는 것으로 생각되는 배양 조건 동안 발현이 조절되는 유전자 중에서 선택된다. 3개 잠복 항원은 또한 최근 기재된 임상전 및 초기 임상 상에 기반하여 선택했다[참조: Bertholet et al., 2008, J. Immunol. 181: 7948-57; Bertholet et al., 2010, Sci Transl Med 2: 53ra74, Mollenkopf et al., 2004, Infect Immun 72: 6471-9]. 요약하면, 사전선택된 19개 잠복 항원은 Rv1733c, Rv2029c, Rv1735, Rv1737, Rv2628, Rv0569, Rv2032, Rv2627c, Rv0111, Rv3812, Rv1806, Rv1807, Rv0198, Rv2626, Rv0081, Rv2005c, Rv2660, Rv3407 및 Rv1813이었다.

이어서, 제2 선택은 33개의 사전선택된 Mtb 항원을 등급화하기 위해 실시했다. Mtb 항원의 제2 선택은, 생화학적 예측 뿐만 아니라 이들의 면역학적 및 보호 잠재력(보유된 최고 스코어)을 반영하는 데이터 마이닝-기반 선택 공정(재료 및 방법 참조)에 기반한다.

하기 항원이 선택되었다:

- 잠복기 항원: Rv1733, Rv2029, Rv0569, Rv0111, Rv1807 및 Rv3407. Rv2626 및 Rv1813은 또한 이들의 매우 우수한 데이터 마이닝 스코어 및 생화학적 예측 스코어에 기인하여 선택되었다.

- 활성기 항원: ESAT-6(Rv3875), TB10.4(Rv0288), Ag85B(Rv1886) 및 Rv3478. 사전 선택된 활성기 Rv3619 항원은 우수한 데이터 마이닝 스코어를 갖지만, ESAT-6 유사 단백질이고 ESAT-6 자치보다 우수한 스코어를 나타내지 않고, 이는 선택된 목록에 보유되지 않았음에 유의한다. 또 다른 예로서, 활성 Rv2608 및 Rv3478 항원은 동일한 데이터 마이닝 스코어를 갖지만, Rv3478은 인간 코호트 연구에서 보다 강력한 반응자 비율을 유도하는 이의 능력에 기초하여 선택되었다.

- 소생기 항원: RpfB 및 RpfD. 5개의 소생 유전자 생성물 중에서, 3개의 Rpf는 작동 데이터 마이닝 스코어 처리 후에 매우 유사한 스코어와 함께 현저했지만(RpfB, D 및 E), 단지 RpfB 및 D는 2개의 주요 이유를 위해 선택했다. 첫째로, RpfB를 제외하고, 5개의 Rpf 중의 4개 사이의 세포 및 체액 반응의 측면에서 보고된 교차-반응성[참조: Yeremeev et al., 2003, Infect Immun 71: 4789-94]은 본 발명자들의 견해에서 후자의 선택을 정당화했다. 둘째로, RpfD는 RpfB 및 E 사이보다 RpfB 및 D 사이의 리소자임 도메인(LD)에서 보다 낮은 서열 상동성에 기초하여 서열 분석 후에 RpfE 대신에 선택되었다. 따라서, Rpf B 및 D를 유지하는 것은 5개 Rpf에 대한 면역 반응을 생성하기에 충분할 것으로 가정된다.

실시예 2: 융합체 설계

광범위한 인실리코 구조 예측 및 서지 분석은 재료 및 방법에 기재된 바와 같이 선택된 Mtb 항원의 생화학적 특성 및/또는 생물학적 기능을 예측하기 위해 수행되었다.

선택된 14개 항원 후보는 상이한 유형의 분석을 필요로 하는 3개 그룹으로 분류했다.

- 다양한 바이러스 벡터, 즉 MVA 중의 Ag85B ESAT-6 및 TB10-4[참조: Kolilab et al. 2010, Clin Vaccine Immunol 17: 793-801); 백시니아 바이러스[참조: Malin et al. 2000, Microbes Infect 2: 1677-85] 및 아데노바이러스[참조: Mu et al., 2009, Mol Ther 17: 1093-100; Dietrich et al. 2005, J Immunol 174: 6332-9; and Havenga et al. 2006; J Gen Virol 87: 2135-43]에서 이들의 발현에 관한 이용가능한 데이터를 갖는 항원. 이들 경우에, 서지의 분석은 벡터 작제물에 삽입하기 위한 서열을 설계하기 위한 주요 정보원이다.

- 바이러스 벡터화에 대해 보고된 데이터는 없지만 공지된 구조를 갖는 단백질과 동일하거나 상동성인 항원. 이들 경우에, 구조 데이터는 벡터 작제물에 삽입하기 위한 Mtb 서열을 설계하기 위한 주요 정보원이다(Rv2626, Rv2029, RpfB, RpfD 및 Rv0569).

- 바이러스 벡터화에 대해 보고된 데이터는 없고 공지된 구조를 갖는 임의의 단백질과 상동성이 아닌 항원. 이들 경우에, 인실리코 생화학적 분석 및 예측은 항원을 특성화하고 벡터 작제물에 삽입하기 위한 Mtb 서열을 설계하기 위해 사용된다(Rv0111, Rv3407, Rv3478, Rv1807 및 Rv1813).

Ag85B 항원의 설계

Ag85B는 콜리랩(Kolilab)의 MVA 벡터에 보존되지만 말린(Malin)의 백시니아 바이러스 및 아데노바이러스 작제물에 보존되지 않은 40개 잔기의 긴 펩티드 신호를 나타낸다. Ag85B 신호 펩티드는 TM 도메인으로 예측되기 때문에, 본 발명자들은 본 발명의 벡터 작제물에 Ag85B 펩티드 신호를 유지하지 않는 것을 권장했다. 본원에 기재된 벡터 작제물에 사용되는 Ag85B*의 권장된 1차 구조는 서열번호 20에 제시된 아미노산 서열에 상응한다.

ESAT-6 항원의 설계

ESAT-6은 CFP-10과 헤테로이량체 복합체를 형성하고, 이 헤테로이량체 상호작용은 두 단백질의 폴딩을 유도할 것으로 예상된다. ESAT-6 단독은, CFP10과 복합체화하는 경우, 용융된 구상-유사 상태 및 헬릭스-턴-헬릭스를 채용한다. 따라서, 이의 파트너에 결합된 ESAT-6은 단독으로 발현된 ESAT-6보다 더욱 안정할 수 있다. 그러나, 본원에 기재된 벡터 작제물에 사용되는 ESAT-6의 권장된 1차 구조는 최종적으로 이의 개시제 Met가 부재(예를 들면, 융합체에서 내부에 위치하는 경우)하는 전장 단백질(서열번호 14에 제시된 아미노산 서열)에 상응한다.

TB10-4(Rv0288)의 설계

TB10-4는 ESAT-6과 동일한 계열의 단백질에 속한다. TB10-4의 NMR 구조는 구조를 안정화시킬 것으로 예상되는 Rv0287과의 헤테로이량체성 복합체를 형성하는 것을 나타냈다. 폭스바이러스에 의한 TB10-4 발현을 보고하는 간행물은 없지만, 전장 TB10-4의 발현은 Ag85A 또는 Ag85B의 C-말단 부분에 융합된 형태로 아데노바이러스 벡터에서 보고되었다. 이에 기초하여, 본원에 기재된 벡터 작제물에 사용되는 TB10.4의 권장된 구조는 최종적으로 이의 개시제 Met가 부재하는 전장 단백질(서열번호 2에 제시된 아미노산 서열)에 상응한다.

Rv2626의 설계

Rv2626의 결정화[참조: Sharpe et al., 2008, J Mol Biol 383: 822-36]는 인트라 및 인터 아단위 디설파이드 결합를 갖는 호모이량체로서 발현되는 것을 나타냈다. 어떠한 신호 펩티드도 Rv2626에 대해 예측되지 않았다. Rv2626은 매우 잘 규정된 폴드를 갖기 때문에, 본원에 기재된 벡터 작제물에 사용되는 Rv2626의 권장된 1차 구조는 최종적으로 이의 개시제 Met가 부재하는 전장 단백질(서열번호 10에 제시된 아미노산 서열)에 상응한다.

Rv0569의 설계

Rv0569 구조는 공지되어 있지 않지만, 이러한 단백질은 76개 아미노산 중첩 영역(88개 잔기 중)에서 Rv2302와 62% 동일성(81% 유사성)을 나타낸다. 이러한 후자의 구조는 NMR에 의해 해결되었고[참조: Buchko et al., 2006, Bacteriol 188: 5993-6001], 역평행 β-시트 코어 및 C-말단 α-헬릭스를 갖는 용액중 매우 잘 폴딩된 구조를 나타냈다. 어떠한 코일형 코일 예측도 이 단백질과 연관되지 않는다. 공지된 기능은 Rv0569 단백질과 연관되지 않는다. 잠재적으로 매우 잘 규정된 폴딩에 기인하여, 본원에 기재된 벡터 작제물에 사용되는 Mtb Rv0569의 권장된 1차 구조는 최종적으로 이의 개시제 Met가 부재하는 전장 단백질(서열번호 3에 제시된 아미노산 서열)에 상응한다.

Rv2029의 설계

Rv2029 구조는 공지되어 있지 않지만, 이 단백질은 310개 아미노산 중첩 영역(339개 중)에서 에스케리키아 콜라이의 포스포프럭토키나제-2(pfk2)와 35% 동일성을 나타낸다. 더욱이, PROSCAN 검색은 완전히 보존된 탄소화물 키나제 표시의 동정을 제공했다. 따라서, Rv2029는 아마도 Mtb에서 포스포프럭토키나제 활성을 갖는다. 포스포프럭토키나제는 해당 동안에 프럭토즈-6-포스페이트의 포스포릴화를 촉매한다. 이. 콜라이 pfk2 구조는, ATP가 결합되는 경우에 삼량체이고, ATP가 배지에 존재하지 않는 경우에 이량체이다(효소 활성의 알로스테릭 조절). 이. 콜라이 효소에서, 최후 C-말단 4개 잔기의 결실은 ATP 유도된 사량체화를 완전히 억제한다. 따라서, Rv2029(이량체 및 사량체 형태의 혼합물)의 올리고머화 헤테로원성을 피하기 위해, C-말단 부분의 결실이 권장된다(즉, 최후 25개 잔기의 결실). 더욱이, Rv2029의 효소적 활성을 폐지하기 위해, 돌연변이 D265N(Met 개시제로부터 출발하여 위치 265 및 Met 부재하의 264)은 이것이 이. 콜라이 pfk-2에서 효소 활성을 거의 완전히 폐지하기 때문에 권장된다[참조: Cabrera et al., 2010, Arch Biochem Biophys 502: 23-30]. 이에 기초하여, 본원에 기재된 벡터 작제물에 사용되는 Rv2029 항원(Rv2029*)의 권장된 1차 구조는 서열번호 21에 제시된 아미노산 서열에 상응한다.

RpfB 및 RpfD의 설계

소생 촉진 인자(Rpf)는 박테리아의 재활성화 상(휴면에서 성장으로의 이해) 동안 생성되는 분비된 단백질이다. 마이코박테리움 투베르쿨로시스는 보존된 촉매 도메인(리소자임 유사 도메인)을 모두 함유하는 5개의 상이한 Rpf(A 내지 E)를 갖는다. 이 도메인과 별개로, 이들 5개 단백질에서 현저한 유사성은 없다. RpfB 구조는 분자의 대략 절반(잔기 194 내지 362)에 대해 수득되었고, 신호 펩티드는 예측되었다[참조: 잔기 1-29; Ruggiero et al. 2009, J Mol Biol 385: 153-62]. 전장 단백질(이의 신호 펩티드 부재)은 이. 콜라이에서 발현되는 경우 단량체로서 거동한다.

인실리코 예측 및 분석은 어떠한 구조도 이용가능하지 않은 단백질 부분(30-193)을 분석하기 위해 RpfB 상에서 수행했다. 신호 펩티드를 제외하고, 어떠한 막관통 도메인도 예측되지 않았다. HCA 플롯, 2차 구조 예측 및 선천적 무질서 영역 예측은 30-193 영역의 잘 규정된 폴딩과 일치한다. 코일형 코일 예측 및 PROSCAN을 사용한 공지된 모티프에 대한 검색은 임의의 유의한 결과를 제공하지 않았다.

촉매 도메인의 활성은 마이코박테리움 스메그마티스(Mycobacterium smegmatis) 소생 분석에서 마이크로콕쿠스 루테우스(Micrococcus luteus) Rpf의 소생 활성에 필수적인 보존된 잔기에 의존하는 것으로 밝혀졌다[참조: 돌연변이 E292K; Mukamolova et al. 2006, Mol Microbiol 59: 84-98]. 추가로, 2개의 잔기 T315 및 Q347은 리소자임에서 기질 결합에 관여하고, RpfB에 보존된다[참조: Cohen-Gonsaud, et al. 2005, Nat Struct Mol Biol 12, 270-3].

또한, Rpf 중에서 가장 분지된 촉매 도메인(즉, RpfD 촉매 도메인)에 의해 대체된 이의 촉매 도메인을 갖는 RpfB 분자에 상응하는 RPFB-B 하이브리드를 설계하는 것이 선택되었다. 따라서, 바이러스 벡터에서 발현되는 RPFB-D 하이브리드는 3개의 돌연변이(E292K, T315A 및 Q347A)에 의한 중화된 촉매 활성을 갖고 신호 펩티드를 갖지 않는 하이브리드 단백질이다. 융합체에 사용되는 이러한 RPFB-D 하이브리드 단백질에 대한 권장된 1차 구조는 최종적으로 개시제 Met가 존재하는 서열번호 31에 제시된 아미노산 서열(RpfD의 잔기 51 내지 잔기 147에 융합된 RpFB의 잔기 10 내지 잔기 283)에 상응한다.

Rv1807의 설계

Rv1807 구조는 공개적으로 이용할 수 없지만, PDB 데이터베이스에 대한 BLAST 검색은 Mtb PPE 단백질(Rv2430)의 최초 150개 잔기와의 정합을 제공했다. PE/PPE는 이들의 N-말단 부분에 PE(프롤린, 글루탐산) 또는 PPE(프롤린, 프롤린, 글루탐산) 모티프를 공통으로 갖는 거대 계열의 Mtb 단백질(대략 100개 PE 및 60개 PPE 구성원)이다. PE 단백질은 PPE와 함께 헤테로이량체로서 발현되고, 이들의 기능은 아직 알려져 있지 않다. UNIPROT-SWISSPROT에 대한 BLAST 검색은 몇몇 정합을 제공했지만, 이들 모두는 추가의 정보를 수득할 수 없는 추가의 Mtb PPE였다.

이. 콜라이에서, 가용성 PPE(Rv2430) 또는 PE(Rv2431)의 발현은 헤테로이량체로서 발현되는 경우에만 명백하게 가능하다[참조: Strong et al. 2006, Proc Natl Acad Sci 103: 8060-5]. 이들 저자들은 이. 콜라이에서 단독으로 발현된 Rv1807가 봉입체를 형성하는 것을 보고했다. PROSCAN 검색은 공지된 모티프와의 어떠한 현저한 정합을 제공하지 않았다. 신호 펩티드 또는 막관통 도메인은 이러한 단백질에 대해 보고되거나 예측되지 않았다. HCA 플롯 뿐만 아니라 2차 구조 예측은 최후 60-70개 잔기 영역을 제외한 전체 단백질의 잘 규정된 폴딩과 일치하지 않았다. 더욱이, 최후 60개 잔기는 자연적 무질서 영역 예측을 사용하여 폴딩되지 않는 것으로 예측되는 반면, Rv1807에 대한 코일형 코일 예측은 임의의 유의한 결과를 제공하지 않았다.

ESAT6 및 TB10-4의 경우에, Rv1807과 이의 파트너(즉, Rv1806)와의 공발현은 단백질 안정성 및 따라서 잠재적으로는 이의 면역원성에 양호하게 영향을 미칠 것이다. 미스폴딩된 단백질(단량체성 단백질)의 발현은 재조합 벡터 안정성(단백질 독성)을 손상시킬 수 있다. 더욱이, Rv1807의 폴딩되지 않은 C-말단 부분은 또한 면역원성 및/또는 재조합 바이러스 안정성에 바람직하지 않은 영향을 가질 수 있다. 융합체에 사용된 Rv1807에 대한 권장된 1차 구조는 전장 단백질(서열번호 6)에 상응한다. 전장 항원이 직면하는 문제의 경우에, (서열번호 18에 제시된 바와 같이) 최후 60개 잔기가 결실된 C-말단 절단된 항원을 사용할 수 있다.

Rv3478의 설계

Rv3478은 또 다른 PPE 단백질이다. 이의 PPE 도메인은 Rv1807의 PPE 도메인과 57% 동일하다(2개의 전체 단백질 사이의 41% 동일성). UNIPROT-SWISSPROT에 대한 BLAST 검색은 모든 다른 Mtb PPE이었던 몇몇 정합을 제공했다. HCA 플롯은 단백질 서열을 따라 모두 소수성 패치의 존재를 입증했다. 달리 말하면, HCA 플롯은 Rv3478에서 폴딩되지 않은 친수성 영역을 나타내지 않았다. 그러나, Rv1807의 경우, Rv3478의 최후 40 내지 50개 잔기는 폴딩되지 않은 것으로 예측된다(2차 구조 및 자연적 무질서 예측 둘 다에 기초하여). 신호 펩티드 또는 막관통 도메인은 이 단백질에 대해 보고되거나 예측되지 않았다. Rv3478에 대한 코일형 코일은 어떠한 유의한 결과를 제공하지 않았다. Rv1807의 경우, 권장된 1차 구조는 전장 단백질(서열번호 13) 또는, 문제에 직면하는 경우, 최후 40개 잔기가 결실된 C-말단 절단된 항원(서열번호 24에 제시된 바와 같이)이다.

Rv0111의 설계

Rv0111은 가능한 아실트랜스퍼라제 활성을 갖는 막 단백질인 것으로 예측된다. 10개 막관통 도메인은 잔기 58에서 427로 신장하는 DAS, TMHMM 및 TopPred에 의해 예측된다. 신호 펩티드는 예측되지 않았다. 2차 구조는 1차 구조를 따라 모두 예측되고, 449-469에서의 갭은 예측된 자연적 무질서 영역에 상응한다. Rv0111에 대한 코일형 코일 예측은 어떠한 유의적 결과를 제공하지 않았다.

프로스캔 분석은 ≥80% 유사성을 갖는 4개 적중을 제공했다: 알도/케토 리덕타제 효소 부위, 아실트랜스퍼라제 리포일 결합 부위, 당 수송 단백질 표시 및 진핵생물 리포칼린 단백질. 3개의 최초 표시는 단백질의 최초 300개 잔기에 존재하기 때문에, 따라서 임의의 잠재적 생물학적 활성을 피하기 위해 단백질의 적어도 이러한 부분을 제거하는 것이 권장된다. 이는 또한 단백질의 대부분의 막관통 도메인을 제거하게 할 것이다. 따라서, 바이러스 벡터에 사용되는 Rv0111의 권장된 1차 구조는 분비된 구조의 경우에 원형질 막 고착을 위해 하나의 TM만을 갖는 단백질의 C 말단 부분(예: 서열번호 15에 제시된 천연 항원의 잔기 393-685)이다. 발현 문제에 직면하는 경우, 임의의 TM 도메인이 부재하는 보다 절단된 항원(서열번호 15의 잔기 37에서 출발하는 천연 Rv0111의 잔기 429-685)을 사용할 수 있다.

Rv1813의 설계

Rv1813 구조는 공개적으로 이용할 수 없고, PDB에 대한 BLAST 검색은 정합을 제공하지 않았다. Rv1813은 작은 단백질(143개 잔기)이고, 이는 신호 펩티드(1-32)을 함유하고 막관통 도메인을 함유하지 않는 것으로 예측된다. 이는 유니프롯-스위스프롯(Uniprot-Swissprot) 데이터베이스에서 다른 단백질과의 유의한 상동성을 나타내지 않는다. HCA 플롯, 2차 구조 예측 및 자연적 무질서 영역 예측은 전체 단백질의 잘 규정된 폴딩과 모두 일치한다. 코일형 코일 예측은 어떠한 유의한 결과를 제공하지 않았다. 기능은 TB 기부에서 보고되지 않고, PROSCAN 검색은 공지된 모티프와의 유의한 정합을 제공하지 않았다. 따라서, 바이러스 벡터에 사용되는 Rv1813의 권장된 1차 구조는 아미노산 서열이 서열번호 19에 제시되어 있는 이의 신호 펩티드(잔기 1 내지 34)가 부재하는 전장 단백질이다.

Rv3407의 설계

Rv3407 구조는 공개적으로 이용가능하지 않고 PDB에 대한 BLAST 검색은 어떠한 정합도 제공하지 않았다. Rv3407은 유니프롯-스위스프롯 데이터베이스에서 다른 단백질과의 유의한 상동성을 갖지 않는 작은 단백질(99개 잔기)이다. 어떠한 신호 펩티드 또는 막관통 도메인은 이 단백질에 대해 보고 또는 예측되지 않았다. HCA 플롯 및 2차 구조 예측은 전체 단백질의 잘 규정된 폴딩과 일치한다. 그러나, 자연적 무질서 영역 예측은 최후 33개 자기가 규정된 구조에서 폴딩되지 않을 수 있음을 나타냈다. HCA 및 2차 구조 예측과 일치하지 않는 이러한 최종 결과는 파트너 단백질에 대한 결합시에 폴딩하는 MORE("분자 인식 요소")의 표시일 수 있다. Rv3407의 경우, C-말단 알파 헬릭스는 Rv3407이 이의 파트너에 결합하는 경우에만 존재할 수 있다. 코일형 코일 예측은 어떠한 유의적 결과를 제공하지 않았다. 기능은 이 단백질에 대한 TB 기재에서 보고되지 않았고, PROSCAN 검색은 공지된 모티프와의 어떠한 유의적 정합을 제공하지 않았다. Rv3407의 권장된 1차 구조는 전장 단백질(서열번호 12)이다. 안정성 문제에 직면하는 경우, 최후 33개 잔기가 결실된 C-말단 절단된 항원(서열번호 23에 제시된 바와 같음)을 사용할 수 있다.

Rv1733의 설계

Rv1733은 2개의 막 도메인을 갖는 UNIPROT-SWISSPROT 및 TB 기부에 따라 막 단백질인 것으로 예측된다(이는 또한 DAS, TMHMM 및 TopPred을 사용하여 예측됨). 최초 TM 도메인은 단일 펩티드로서 예측된다. 이들 막관통 도메인과 별개로, 소수의 2차 구조는 이러한 단백질에 대해 예측된다. HCA 플롯은 2개의 막관통 헬릭스 사이에 소수의 소수성 패치의 존재를 입증한다. 최종적으로, 자연적 무질서 영역(약 20개 잔기 길이)은 2개의 막관통 헬릭스 사이에서 예측된다. 모두 함께, 이들 결과는 막관통 도메인 이외에 가능하게는 완만한 폴딩을 나타낸다. 이의 신호 펩티드의 부재하에 Rv1733에 대한 PROSCAN 검색은 공지된 모티프와의 임의의 유의적 정합을 제공하지 않았다. Rv1733에 대한 코일형 코일은 어떠한 유의적 결과를 제공하지 않았다. 따라서, 바이러스 벡터에 사용되는 Rv1733의 권장된 1차 구조는 서열번호 17에 제시된 바와 같이 전체 단백질 - 이의 신호 펩티드(62개 최초 잔기)이다. 또는, 전장 Rv1733(서열번호 5)을 사용할 수도 있다.

실시예 3: Mtb 유전자 융합체의 작제

12개의 상이한 융합 단백질은 도 1 및 표 3에 제시된 바와 같이 조작했다. 보다 구체적으로, 융합체는 각각 하기 기재된 바와 같은 생화학적 원리에 기초하여 설계했다:

융합체 번호 3(RPFB-Dhyb*);

융합체 번호 5(Rv0569-Rv1813*-Rv3407-Rv3478-Rv1807);

융합체 번호 6(Ag85B*-Rv2626-RPFB-Dhyb*-Rv1733*);

융합체 번호 8(Ag85B*-Rv2626- Rv1733*); and

융합체 번호 14(Rv2029*-TB10.4-ESAT6-Rv0111*).

하기 생화학적 원리는 융합체를 설계하기 위해 수행했다.

- 2개의 이량체 단백질(즉, Rv2626 및 Rv2929*)은 임의의 입체 충돌을 피하기 위해 동일한 융합체에서 융합되지 않아야 한다.

- 2개의 막 단백질은 잠재적 독성 문제를 피하기 위해 동일한 융합체(즉, Rv1733* 및 Rv0111*)에서 사용되지 않아야 한다.

- TM(Rv1733* 및 Rv0111*)을 갖는 단백질은 분비된 작제물에 대한 혈장 막 고착을 가능하게 하기 위해 융합체의 말단에 삽입되어야 한다.

- 가능한 경우, 융합 단백질은 나머지 융합체에 대한 <<샤프롱>> 효과를 갖도록 잘 폴딩된 단백질(즉, Ag85B*, Rv2029*, Rv2626, Rv0569, RPFB-D hybrid*)로 개시해야 한다.

- 3개의 융합체를 제조한다, 이들중 2개는 최소 세트의 항원(즉, Ag85B*, Rv2029*, Rv2626, Rv0111*, Rv1733*, TB10-4, ESAT-6, RPFB-D hybrid*)을 갖고, 최종 융합체는 나머지(임의의)의 항원(즉, Rv0569, Rv1813*, Rv3407, Rv1807, Rv3478)을 갖는다.

한편, 융합체는 또한 TB 질환의 상에 대하여 진단되었다. 융합체 번호 2는 활성 항원(Ag85B*-TB10.4-ESAT6)을 함유하고, 융합체 번호 4는 활성 및 소생 항원(RPFB-Dhyb*-Ag85B*-TB10.4-ESAT6)을 함유한다. 융합체 번호 13은 잠복 항원(Rv2029*-Rv2626-Rv1733*-Rv0111*)을 포함한다.

재료 및 방법에 기재된 바와 같이, 일련의 펩티드가 Mtb 항원 융합체에 부가되었고, 각각 코딩된 유전자 생성물의 검출을 촉진시킬 목적으로 N-말단 Flag Tag 및 C-말단 c-myc 및 His Tag 펩티드가 부가되고, 또한 면역원성 활성을 증강시킬 목적으로 N-말단 신호 및 C-말단 막-고정 펩티드가 부가된다(TM 도메인의 부가는, 이들 단백질이 이미 이러한 도메인을 함유하기 때문에, Rv0111* 또는 Rv1733*으로 종결하는 융합체에서는 요구되지 않음).

비교 목적을 위해, 융합체는 또한 코딩된 Mtb 항원의 세포질 발현을 평가하기 위해 임의의 SS 및 TM 펩티드의 부재하에 작제되었다. 융합체 번호 3(pTG18267), 번호 5(pTG18269), 번호 2(pTG18266) 및 번호 4(pTG18268)는 SS 및 TM 펩티드가 결실되어, 융합체 번호 12(pTG18307), 번호 9(pTG18295), 번호 10(pTG18296) 및 번호 11(pTG18297)을 제공한다. N-말단 Flag TAG 및 C-말단 c-myc 및 His TAG는 이들 작제물에 유지되었다.

표 3은 본 연구에서 작제된 다양한 융합체의 요약을 제공한다.

	융합체 번호 #	TB 항원	플라스미드
상에 의한 융합	13	Rv2029*-Rv2626-Rv1733*-Rv0111*	pTG18323
	2	Ag85B*-TB10.4-ESAT6	pTG18266
	4	RPFB-Dhyb-Ag85B*-TB10.4-ESAT6	pTG18268
최대 목록	5	Rv0569-Rv1813*-Rv3407-Rv3478-Rv1807	pTG18269
생화학 법칙에 의한 융합	6	Ag85B*-Rv2626-RPFB-Dhyb-Rv1733*	pTG18270
	14	Rv2029-TB10.4-ESAT6-Rv0111*	pTG18324
	8	Ag85B*-Rv2626-Rv1733*	pTG18272
	3	RPFB-Dhyb	pTG18267
SS 및 TM 부재하의 융합	9	Rv0569-Rv1813*-Rv3407-Rv3478-Rv1807	pTG18295
	10	Ag85B*-TB10.4-ESAT6	pTG18296
	11	RPFB-Dhyb-Ag85B*-TB10.4-ESAT6	pTG18297
	12	RPFB-Dhyb	pTG18307

비교 목적을 위해, 상기한 융합체에 사용된 개개 Mtb 유전자를 코딩하는 플라스미드는 PCR 또는 제네아트에 의해 합성된 유전자 서열로 증폭시켰다. 보다 정확하게는, pTG18269는 Rv3407, Rv0569, Rv1807, Rv1813* 및 Rv3478을 증폭시키기 위한 주형으로 사용했고, pTG18323은 Rv2626을 증폭시키기 위해 사용했다. ESAT6, Rv1733*, Ag85B*, TB10-4, Rv0111* 및 Rv2029*은 합성 유전자로서 생성했다.

개개 유전자는 융합체와 동일한 맥락에서 위치시켰다. 즉, CMV 프로모터 하류의 pGWiz에 삽입하고, 5' 방향의 Flag 및 3' 방향의 c-myc-His 서열과 융합시켰다. Rv1733* 및 Rv0111* 단백질은 TM 도메인을 함유하기 때문에, 광견병 바이러스 ERA의 당단백질 전구체의 N-말단에 존재하는 신호 펩티드는 발현 문제를 피하기 위해 Flag 서열과 상류에서 융합되었다. 생성된 플라스미드는 각각 pTG18300(Rv3407), pTG18301(Rv0569), pTG18302(Rv1807), pTG18303(Rv1813*), pTG18304(Rv3478), pTG18305(Rv2626), pTG18308(ESAT6), pTG18309(Rv1733*), pTG18310(Ag85B*), pTG18315(TB10.4), pTG18329(Rv0111*), pTG18317(Rv2029*)로 명명되었다.

다양한 융합 단백질은 상응하는 발현 플라스미드의 도입 후에 진핵생물 발현 시스템에서 평가했다. 발현은 웨스턴 블롯으로 평가한 반면, 면역원성 활성은 마우스의 DNA 면역화 후에 ELISPot IFNγ 분석으로 평가했다. 가능한 경우, 세포질(SS 및 TM 부재) 및 막-고정된 버젼의 발현 및 면역원성은 융합체에 의해 제공된 면역원성을, 개개 Mtb 항원을 발현하는 플라스미드의 혼합물로 수득한 것과 또한 비교했다.

실시예 4: Mtb 항원 및 융합체의 발현 분석

개체 또는 융합체에서 발현되든지, Mtb 유전자의 발현은 형질감염된 HEK293 세포로부터 수득한 세포 용해물로부터 웨스턴 블롯으로 분석했다.

4.1 각각의 Mtb 항원을 코딩하는 플라스미드로 형질감염된 세포 용해물의 웨스턴 블롯 분석

개개 Mtb 항원의 면역검출은 발현 카세트에 포함된 태그 펩티드에 대한 항체(예: 항-Flag M2 퍼옥시다제(HRP) 항체, 모노클로날 항-c-myc 퍼옥시다제 항체 및 모노클로날 항-His 퍼옥시다제 항체) 또는 Mtb 항원에 특이적인 항체로 수행했다. 구체적으로, 래빗의 면역화 후에 수득한 혈청(재료 및 방법 참조)은 Rv1733*, Rv2029*, Rv0569, Rv1807, Rv0111*, Rpf-B-D, Rv1813*, Rv3407 및 Rv3478의 검출에 사용한 반면, 시판되는 항체는 ESAT6, Ag85B *, TB10.4 및 Rv2626의 검출에 사용했다.

결과는 표 4에 요약되어 있다. 보다 구체적으로, 예상된 크기에 상응하는 밴드가 사용된 면역검출 시스템에 상관 없이 모든 개개 단백질에 대해 검출되었다(항-Flag, 항-His 항체, 특이적 래빗 혈청 및 시판되는 항체). 추가의 생성물은 또한 사용된 면역검출 시스템에 의존하여 몇몇 단백질에 대해 검출되었다. 더욱이, Rv3407는 제외되고 TB10.4 및 ESAT6에서는 보다 낮은 정도였지만, 고도의 발현이 검출되었다. 발현 검출의 예는 대표적 Mtb 항원, 즉 Rv2029*(도 2A), RPFB-Dhyb(도 2B), ESAT6(도 2C) 및 Rv2626(도 2D)의 패널에 대해 도 2에 제시되어 있다.

TB 항원 (플라스미드)	예상된 크기(발현 수준)	항 Flag 및 항-His 항체를 사용한 추가의 생성물	항 Mtb 항체를 사용한 추가의 생성물
Rv3407 (pTG18300)	14.4 kDa (+)
Rv0569 (pTG18301)	12.9 kDa (+++)		1주 밴드 약 10kDa
Rv1807 (pTG18302)	43.3kDa (++)
Rv1813* (pTG18303)	15.1 kDa (+++)
Rv3478 (pTG18304)	42.8 kDa (+++)	약 16 및 26kDA의 2개 N-말단 절단된 생성물(항-Flag 항체의 의해 인식됨)	1 밴드 약 30 kDa
Rv2626 (pTG18305)	18.9 kDa (+++)	Rv2626 이량체에 상응하는 추가 밴드	이량체 43 kDa
ESAT6 (pTG18308)	13.0 kDa (++)
Rv1733* (pTG18309)	21.2 kDa (+++)	약 2kDa의 1개 N-말단 절단된 생성물 및 8 내지 10kDa의 3개 C-말단 생성물	2개 밴드 약 10 및 20kDa
Ag85B* (pTG18310)	33.9 kDa (+++)	약 26, 24, 20, 17 및 12kDa의 5개 마이너 N-말단 절단된 생성물 및 약 34kDa의 C-말단 절단된 생성물(항-His 항체로 검출됨)	3주 밴드 약 26, 28 및 34kDa
TB10.4 (pTG18315)	13.5 kDa (++)
Rv0111* (pTG18329)	37.6 kDa (+++)	약 8kDa의 1개 N-말단 절단된 생성물 및 약 34kDa의 1개 C-말단 절단된 생성물	1개 밴드 약 34kDa 및 매우 약한 밴드 약 18 및 20kDa
Rv2029* (pTG18317)	35.8 kDa (+++)
RfpB-Dhyb* (pTG18307)	39.4kDa (+++)		2주 밴드 약 40kDa

4.2 Mtb 항원 융합체를 코딩하는 플라스미드로 형질감염된 세포 용해물의 웨스턴 블롯 분석

HEK293 세포는 상이한 Mtb 유전자 융합체를 발현하는 플라스미드로 형질감염시키고, 발현 생성물은 상기와 동일한 조건하에 웨스턴 블롯으로 분석했다. 형질감염은 프로테아좀 억제제 MG132의 존재, 그러나 또는 이의 부재하에 수행했다. 또한, 면역검출은 항-Flag M2 퍼옥시다제(HRP) 항체, 모노클로날 항-c-myc 퍼옥시다제 항체 및 모노클로날 항-His 퍼옥시다제 항체 뿐만 아니라 항-Mtb 특이적 항체를 사용하여 수행했다.

태그 부착 융합체의 예상된 크기는 하기에 제시되어 있다:

- 융합체 번호 2(pTG18266): 63.6 kDa

- 융합체 번호 3(pTG18267): 49.0 kDa

- 융합체 번호 4(pTG18268): 99.7 kDa

- 융합체 번호 5(pTG18269): 122.0 kDa

- 융합체 번호 6(pTG18270): 103.5 kDa

- 융합체 번호 8(pTG18272): 67.3 kDa

- 융합체 번호 9(pTG18295): 112.9 kDa

- 융합체 번호 10(pTG18296): 53.8 kDa

- 융합체 번호 11(pTG18297): 90.0 kDa

- 융합체 번호 12(pTG18307): 39.3 kDa

- 융합체 번호 13(pTG18323): 101.5 kDa

- 융합체 번호 14(pTG18324): 90.6 kDA

모든 Mtb 항원 융합체는 항-Flag 및 항-His 모노클로날 항체를 사용하여 검출했다. Mtb 융합 생성물은 또한 pTG18266, pTG18267, pTG18268 및 pTG18269를 제외하고는 항-c myc 모노클로날 항체를 사용하여 검출했다. c-myc 에피토프는, 세포질 대응물(pTG18296, pTG18307, pTG18297 및 pTG18295)이 항-myc 항체로 양호하게 검출되기 때문에, 인접한 TM 도메인에 기인하여 이들 융합체에 접근할 수 없을 수 있다. 도 3은 항 Flag 면역검출 후에 잠복성 항원(융합체 번호 9를 코딩하는 pTG18295), 활성 항원(융합체 번호 10을 코딩하는 pTG18296), 소생 항원(융합체 번호 12를 코딩하는 pTG18307) 및 소생 및 활성 항원(융합체 번호 11을 코딩하는 pTG18297)을 포함하는 Mtb 융합체의 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다. 항-His 항체를 사용한 면역검출은 동일한 발현 패턴을 제공했다.

도 4는 상응하는 특이적 혈청, TB10.4-함유 융합체 번호 2(pTG18266), 번호 10(pTG18296), 번호 4(pTG18268), 번호 11(pTG18297), 번호 14(pTG18324); Rv0569-함유 융합체 번호 5(pTG18269) 및 번호 9(pTG18295) 및 Rv2626-함유 융합체 번호 13(pTG18323), 번호 6(pTG18270) 및 번호 8(pTG18272)를 사용한 면역검출 후에 TB10.4(도 4A), Rv0569(도 4B) 및 Rv2626(도 4C)을 포함하는 Mtb 융합체의 웨스턴 블록 분석을 나타낸다. pGWiz는 음성 대조군으로 제시되고, TB10.4-코딩 pTG18315는 양성 대조군으로 제시된다.

면역검출 시스템과 상관 없이, 예상된 크기에 상응하는 밴드는 모든 융합체에 대해 강도되었고, 몇몇 경우에, 추가의 융합 생성물이 또한 관찰되었다. 특히, 이량체는 pTG18270, pTG18272 및 pTG18323에 대해 검출되었다. 이들 3개 융합체는 환원 조건에 대해 내성이 있는 이량체를 형성하는 능력을 갖는 Rv2626을 함유한다. 항-Flag 및 항-His 항체를 사용한 면역검출은 pTG18323 및 pTG18269에 대해 몇몇 추가의 마이너 단백분해 생성물을 강조했다. 더욱이, 예상된 크기보다 높은 추가의 생성물은 항-Falg 및 항-His 항체를 사용하여 pTG18266, pTG18268, pTG18269, pTG18270, pTG18272, pTG18323 및 pTG18324에 대해 검출되었다. 이들 밴드는 N-글리코시다제 F를 사용한 시험관내 처리에 의해 입증된 바와 같이 N-글리코실화 생성물에 상응한다(즉, 예상된 크기에서의 발현 생성물은 세포 추출물의 N-글리코시다제 처리 후에 수득됨). 신호 펩티드를 함유하는 모든 융합체는 융합체 번호 4(pTG18267, RpfB-D*)를 제외하고는 N-글리코실화 생성물을 유도했다. 또한, N-글리코실화된 생성물은 Rv2626-함유 융합체 pTG18270, pTG18272 및 pTG18323에 있어서 이량체 뿐만 아니라 항원-특이적 항체로 검출되었다. 단백분해 생성물은 또한 융합체 및 혈청에 의존하여 특이적 혈청(데이터는 제시되지 않음)으로 몇몇 융합체에 대해 확인되었다. 예를 들면, pTG18269의 경우에 약 40kDa 및 pTG18295의 경우에 약 36 및 38kDa의 추가 밴드는 Rv3407 특이적 혈청으로 검출되었지만, Rv0569 특이적 혈청으로 검출되지 않았다.

유사한 고도의 발현은 모든 융합체에 대해 수득되었고, 보다 높은 양의 생성물은 MG132의 존재하에 검출되었다. 막-고정된 융합체(pTG18269, pTG18268)의 발현 수준은 이들의 세포질 대응물(pTG18295, pTG18297)로 검출된 것들에 필적하였지만, pTG18266의 경우에는 세포질 융합체(pTG18296)보다 양호하게 발현되었다. 융합체 번호 5(pTG18269)는 Rv1807 특이적 항체로 매우 약하게 검출되었지만, 세포질 융합체(pTG18295)의 경우는 아니다. Rv1807 특이적 에피토프는 인접한 TM 서열에 기인하여 이러한 융합체에서 접근할 수 없다.

실시예 5: DNA 면역화 평가

다양한 Mtb 항원 융합체의 면역원성 활성은 DNA 면역화 후에 다양한 마우스 모델에서 평가했다.

5.1 활성기의 Mtb 항원에 기초하여 융합체에 의해 유도된 면역원성의 평가

BALB/c 마우스는 세포 막(SS/TM: pTG18266)에서 고정된 형태로 또는 세포질 형태(pTG18296)로 융합체 "Ag85B-TB10.4-ESAT6"을 발현하는 플라스미드를 사용하여 근육내 경로에 의해 3주 간격으로 3회 면역화시켰다. 비교 목적을 위해, 마우스는 또한 융합체에 포함된 개개 Mtb 항원을 코딩하는 플라스미드의 혼합물(pTG18310 (Ag85B) + pTG18315 (TB10.4) + pTG18308 (ESAT6)) 또는 음성 대조군으로서 공 pGWiz으로 면역화시켰다. 세포 면역 반응은 재료 및 방법에 기재된 다양한 펩티드 풀로 생체외 재-자극시킨 후에 ELISpot IFNγ 분석에 의해 최후 DNA 주사후 2주에 평가했다.

도 5에 제시된 바와 같이, Ag85B 및 TB10.4 항원에 대한 강력한 세포 반응은 pTG18266(고정된 버젼의 Ag85B-TB10.4-ESAT 융합체 발현)으로 면역화시킨 모든 마우스에서 유도된 반면, ESAT-6에 대한 IFNγ 생성 세포는 8마리 동물중 6마리에서 생성되었다(도 5a). pTG18296(세포질 버젼의 Ag85B-TB10.4-ESAT 융합체 발현)으로 면역화시킨 마우스에서, Ag85B 및 TB10.4 항원에 대한 IFNγ 생성 세포의 활성화는 검출되었지만 고정된 융합체에 의해 유도된 것과 비교하여 보다 낮은 수준인 반면, 매우 약한 반응은 ESAT-6에 대해 검출되었다(도 5b). 매우 흥미롭게도, 도 5a/5b 및 도 5c를 비교하는 경우, 모든 3개 항원에 대한 최강의 반응은, 개개 플라스미드(pTG18310, pTG18315 및 pTG18308의 혼합물)로부터 독립적으로 발현되는 경우가 아니라, Ag85B, TB10.4 및 ESAT-6가 융합 단백질(pTG18266 및 pTG18296)로서 발현되는 경우에 검출되었다. 예상된 바와 같이, 공 플라스미드를 사용한 면역화는 특이적 면역 반응을 유도하지 않았다(도 5d).

따라서, 적어도 활성기의 Mtb 항원의 경우에, 이들 결과는 생성되는 Mtb 항원 융합체의 면역원성 활성을 최적화하기 위해 세포 표면(SS 및 TM 펩티드에 의한)에서 발현된 항원 융합체의 설계 잇점을 강조한다.

5.2. 활성기 및 소생기의 Mtb 항원에 기초하여 융합체에 의해 유도된 면역원성의 평가

BALB/c 마우스는 세포 막(SS/TM: pTG18268)에서 고정된 형태로 또는 세포질 형태(pTG18297)로 융합체 "RpfB-Dhyb - Ag85B - TB10.4 - ESAT6"를 발현하는 플라스미드를 사용하여 근육내 경로에 의해 3주 간격으로 3회 면역화시켰다. 비교 목적을 위해, 마우스는 또한 융합체에 포함된 개개 TB 항원을 코딩하는 플라스미드의 혼합물(pTG18307(RpfB-Dhyb) + pTG18310(Ag85B) + pTG18315(TB10.4) + pTG18308(ESAT6)) 및 음성 대조군으로서 공 pGWiz로 면역화시켰다. 세포 면역 반응은 재료 및 방법에 기재된 바와 같이 다양한 펩티드 풀을 사용하여 생체외 재-자극시킨 후에 ELISpot IFNγ 분석에 의해 최후 DNA 주사후 2주에서 평가했다.

도 6에 제시된 바와 같이, pTG18268 플라스미드(고정된 버젼의 RpfB-DHyb-Ag85B-TB10.4-ESAT-6 융합체 발현)을 사용한 면역화는 상응하는 펩티드 풀을 사용한 생체외 재-자극시킨 후에 고도의 IFNγ 생성 세포의 검출을 특징으로 하는 RpfB-DHyb, Ag85B 및 TB10.4 항원에 특이적인 강력한 면역 반응을 생성한 반면, ESAT-6에 대한 IFNγ 생성 세포는 보다 적은 수의 동물에서 보다 낮은 수준으로 유도되었다(도 6a). pTG18297(세포질 버젼의 RpfB-DHyb-Ag85B-TB10.4-ESAT-6 융합체 발현)로 면역화시킨 마우스에서, RpfB-DHyb, Ag85B 및 TB10.4 항원에 대한 IFNγ 생성 세포의 활성화는 또한 고정된 융합체에 의해 유도된 것과 비교하여 보다 낮은 수준으로 검출된 반면, 매우 약한 반응은 ESAT-6에 대해 생성되었다(도 6b). ESAT-6을 제외하고, 도 6에 제시된 바와 같이, 가장 강력한 항 Mtb 반응은, 개개 플라스미드로부터 독립적으로 발현되는 경우(pTG18307 + pTG18310 + pTG18315 + pTG18308의 혼합물)가 아니라, 융합 단백질(pTG18268 및 pTG18297, 도 6a 및 6b)로서 발현되는 경우에 RpfB-DHyb, Ag85B 및 TB10.4에 대해 수득되었다. 예상된 바와 같이, 공 플라스미드를 사용한 면역화는 특이적 면역 반응을 발생하지 않았다(도 6d).

5.3. 소생기의 Mtb 항원에 기초하여 융합체에 의해 유도된 면역성의 평가

BALB/c 마우스는 세포 막(SS/TM: pTG18267)에서 고정된 형태로 또는 세포질 형태(pTG18307)로 융합체 "RpfB-Dhyb"를 발현하는 플라스미드를 사용하여 근육내 경로에 의해 3주 간격으로 3회 면역화시켰다. 공 pGWiz는 음성 대조군으로 사용했다. 세포 면역 반응은 재료 및 방법에 기재된 4개 펩티드 풀을 사용하여 생체외 재-자극시킨 후에 ELISpot IFNγ 분석에 의해 최후 DNA 주사후 2주에서 평가했다.

도 7에 제시된 바와 같이, 고도의 IFNγ 생성 세포는 pTG18267로 백신접종한 마우스에서 관찰되었고(SS/TM 펩티드를 갖는 고정된 버젼의 RpfB-DHyb 융합체 발현), 이는 이들 마우스가 강력한 특이적 세포 반응을 상승시켰음을 나타낸다(도 7a). pTG18307(세포질 버젼의 RpfB-DHyb 융합체 발현)을 사용한 면역화는 또한 IFNγ 생성 세포의 활성화를 생성했지만 약간 보다 낮은 정도였다(도 7b). 더욱이, 상기 반응은 pTG18307으로 처리한 그룹보다 pTG18267로 처리한 동물 그룹에서 더욱 균질하게 보였다. 예상된 바와 같이, 공 플라스미드를 사용한 면역화는 특이적 면역 반응을 상승시키지 않았다(도 7c).

5.4. 잠복기의 Mtb 항원에 기초하여 융합체에 의해 유도된 면역원성의 평가

BALB/c 마우스는 세포 막(pTG18269)에서 고정된 형태로 또는 세포질 형태(pTG18295)로 융합체 "Rv0569 - Rv1813 - Rv3407 - Rv3478 - Rv1807"를 발현하는 플라스미드를 사용하여 근육내 경로에 의해 3주 간격으로 3회 면역화시켰다. 비교 목적을 위해, 마우스는 또한 융합체에 포함된 개개 Mtb 항원을 코딩하는 플라스미드의 혼합물(pTG18300 (Rv3407) + pTG18301 (Rv0569) + pTG18302 (Rv1807) + pTG18303 (Rv1813) + pTG18304 (Rv3478)) 및 음성 대조군으로서 공 pGWiz로 면역화시켰다. 세포 면역 반응은 재료 및 방법에 기재된 다양한 펩티드 풀로 생체외 재-자극시킨 후에 ELISpot IFNγ 분석에 의해 최후 DNA 주사후 2주에서 평가했다.

도 8에 제시된 바와 같이, pTG18269 플라스미드(고정 버젼의 Rv0569 - Rv1813 - Rv3407 - Rv3478 -Rv1807 융합체 발현)를 사용한 면역화는 Rv3407 및 Rv3478 항원에 특이적인 강력한 반응을 제공했고, Rv1807의 경우에는 보다 낮은 정도였다(도 8a). 이들 3개 항원에 대해 유사한 수준의 IFNγ 생성 세포는 pTG18295(세포질 버젼의 Rv0569 - Rv1813 - Rv3407 - Rv3478 - Rv1807 융합체 발현)로 면역화시킨 마우스에서 수득되었다(도 8b). 상기 반응은 플라스미드 혼합물로 주사한 마우스에서 동일한 정도 내였다(도 8c). 한편, 유의한 반응은 모든 세포에서 Rv1813 및 Rv0569에 대해 검출할 수 없었다(도 8a, b 및 c). 예상된 바와 같이, 공 플라스미드를 사용한 면역화는 특이적 면역 반응을 상승시키지 않았다(도 8d).

마우스의 다른 균주는 상이한 MHC 단상형을 피복하기 위해 항 Mtb 항원 반응의 조사에 또한 사용했다: BALB/c 마우스는 H-2d이고, C57BL/6 마우스는 H-2b이고, CBA/J 및 C3H/HeN 마우스는 H-2k이다.

마우스는 잠복기 "Rv2029 - Rv2626 - Rv1733 - Rv0111"로부터의 항원을 발현하는 pTM18323 또는 음성 대조군으로서 공 pGWiz를 사용하여 근육내 경로에 의해 2주 간격으로 3회 면역화시켰다. 세포 면역 반응은 재료 및 방법 부분에 기재된 다양한 펩티드 풀로 생체외 재-자극시킨 후에 ELISpot IFNγ 분석에 의해 최후 DNA 주사후 2주에서 평가했다. 도 10에 제시된 바와 같이, pTG18323 플라스미드를 사용한 C3H/HeN 마우스의 면역화는 Rv2029(펩티드 번호 1의 양성 풀), Rv2626(양성 풀 번호 2) 및 Rv1733 항원(양성 풀 번호 2)에 특이적인 강력한 면역 반응을 제공했다(도 10a). 비특이적 배경 반응은 pGWiz를 사용한 면역화 및 Rv0111 펩티드 풀을 사용한 재-자극 후에 검출되었고(도 10b), 따라서 pTG18323을 사용한 백신화 후에 항-Rv0111 특이적 반응의 검출을 복잡하게 한다.

Rv2029, Rv2626 및 Rv1733 항원에 특이적인 면역 반응은 또한 pTG18323으로 면역화시킨 H-2^K CBA/J 마우스에서 관찰된 수준과 유사한 수준으로 검출되었다. 대조적으로, BALB/c 마우스에서, IFNγ 생성 세포는 Rv2626 펩티드를 사용한 재-자극 후에만 특이적으로 검출된 반면, C57BL/6 마우스에서는 어떠한 신호도 검출되지 않았다.

전체로서, 이들 결과는 시험된 Mtb 항원 융합체 서열이 상이한 단상형의 마우스에서 강력한 세포-기반 면역 반응을 유도할 수 있다는 사실을 강조한다.

5.5. 생화학 규칙에 기초하여 융합에 의해 유도된 면역원성의 평가

BALB/c 마우스 또는 C57BL/6 마우스는 Mtb 항원, 즉 pTG18270(Ag85B - Rv2626 - RpfB-Dhyb - Rv1733), pTG18272(Ag85B - Rv2626 - Rv1733) 및 pTG18324(Rv2029 - TB10.4 - ESAT-6 - Rv0111)의 생화학 특성에 따라 설계된, 융합체 번호 6, 8 또는 14를 코딩하는 플라스미드를 사용하여 근육내 경로를 통해 2주 간격으로 3회 면역화했다. 비교 목적으로, 마우스는 또한 음성 대조군으로 공 pGWiz로 면역화했다. 세포 면역 반응은 재료 및 방법 부분에 기재된 각종 펩타이드 풀로 생체외 재자극 후에 ELISpot IFNγ 분석에 의해 최후 DNA 주사후 2주에서 평가했다.

Ag85B 및 RpfB-Dhyb 항원에 특이적인 강력한 세포 반응은 pTG18270으로 면역화된 두 BALB/c 및 C57BL/6 마우스에서 유도된 반면, Rv2626에 특이적인 고수준의 IFNγ 생성 세포는 BALB/c 마우스에서만 검출되었다. pTG18272에 의한 면역화는 BALB/c 마우스에서 Ag85B에 특이적 및 C57BL/6 마우스에서 Ag85B 및 Rv2626 항원에 특이적인 IFNγ 생성 세포의 활성화를 생성했지만, pTG18270에 의해 유도된 반응과 비교하여 낮은 수준이었다. pTG18324로 면역화시킨 마우스에서, TB10.4 및 ESAT-6 항원에 특이적인 고수준의 IFNγ 생성 세포가 검출된 반면, Rv2029 및 Rv0111에 특이적인 IFNγ 생성 세포는 또한 낮은 수준으로 유도되었다. 예상된 바와 같이, 공 플라스미드를 사용한 면역화는 어떠한 특이적 면역 반응을 유도하지 않았다.

전체로서, 융합체의 안정성 및 생산성을 증가시키기 위해 생화학-기반 원리에 따라 설계된 시험된 융합체는 상이한 감염 상으로부터 Mtb 항원에 특이적인 우수한 면역원성 반응을 나타낸다.

5.6. Mtb 항원 융합체에 의해 유도된 항-Rv1733 체액성 반응의 평가.

BALB/c 마우스를 융합체 "Ag85B* - Rv2626 - Rv1733*"(pTG18270) 및 융합체 "Ag85B* - Rv2626 - RPFB-Dhyb*- Rv1733*(pTG18272)를 발현시키는 플라스미드로 근육내 경로를 통해 3주 간격으로 3회 면역화하였다. 비교 목적으로, 마우스를 융합체(pTG18310 (Ag85B*) + pTG18305 (Rv2626) + pTG18309 (Rv1733*))에 포함된 개별적 Mtb 항원을 코딩하는 플라스미드의 혼합물 및 음성 대조군으로서 공 pGWIZ로 면역화하였다. 체액성 면역 반응은 최후 DNA 주사 후 2주에 평가했다. 면역화된 마우스의 혈청을 풀링하고, 웨스턴-블롯으로 분석하였다. 보다 구체적으로, 100ng/레인의 재조합 단백질 Rv1733(이. 콜리에서 생성됨, 참조: 실시예 번호 8)을 아크릴아미드 겔 상에 부하하고, 면역검출은 1/200 희석된 혈청으로 수행하였다. 결과로서, Rv1733 단백질 상의 특이적 검출은 pTG18270, pTG18272 및 개별적 Mtb 항원을 코딩하는 플라스미드의 혼합물로 면역화된 마우스의 혈청으로 관찰되었다.

5.7. Mtb 항원 융합체에 의해 유도된 항-Rv1813 체액성 반응의 평가

BALB/c 마우스를 세포막에서 고정된 형태(SS/TM: pTG18269)로 또는 세포질 형태(pTG18295)로 융합체 "Rv0569 - Rv1813 - Rv3407 - Rv3478 -Rv1807"을 발현시키는 플라스미드로 근육내 경로를 통해 3주 간격으로 3회 면역화하였다. 비교 목적으로, 마우스를 또한 융합체(pTG18300 (Rv3407) + pTG18301 (Rv0569) + pTG18302 (Rv1807) + pTG18303 (Rv1813) + pTG18304 (Rv3478))에 포함된 개별적 Mtb 항원을 코딩하는 플라스미드의 혼합물 및 음성 대조군으로서 공 pGWiz로 면역화하였다. 체액성 면역 반응은 최후 DNA 주사 후 2주에 평가했다. 면역화된 마우스의 혈청을 풀링하고, 아크릴아미드 겔 상에 부하된 재조합 단백질 Rv1813(이. 콜리에서 생성됨, 참조: 실시예 번호 8)의 100ng/레인을 사용하여 웨스턴-블롯으로 분석하였다. 면역검출은 1/200 희석된 혈청으로 수행하였다. 결과로서, Rv1813 단백질은 구체적으로 pTG18269(세포막에서 고정된 형태로 융합체를 코딩하는)로 면역화된 마우스의 혈청으로 검출되었다.

실시예 6: 재조합 MVA 발현 Mtb 항원의 생성

총 10개의 MVA 백신 후보를 1 또는 3개 이하의 Mtb 융합체의 발현을 위해 유전자 조작하였고, 각종 Mtb 항원의 발현을 감염된 A549 세포로부터 수득된 세포 용해물로부터 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다.

6.1 TB 질병의 상에 의한 재조합 MVA의 생성

7개의 재조합 MVA 후보를 TB 질병의 각종 상의 Mtb 융합체 대표의 발현을 위해 1, 2 또는 3개의 카셋트를 함유하도록 유전자 조작하였다. 융합체 번호 4 및 융합체 번호 11 둘 다 세포막(N-말단 신호 및 C-말단 막 고정 펩타이드가 장착된 융합체 번호 4) 또는 세포질(융합체 번호 11은 융합체 번호 4의 세포질 변형에 상응함)에 고정 발현되는 활성인 소성 항원(RPFB-Dhyb*-Ag85B*-TB10.4-ESAT6)을 함유한다. 융합체 번호 13은 잠재성 항원(Rv2029*-Rv2626-Rv1733*-Rv0111*)을 함유한다. 융합체 번호 5 및 융합체 번호 9는 둘 다 세포막(융합체 번호 5는 N-말단 신호 및 C-말단 막 고정 펩타이드를 함유함) 또는 세포질(융합체 번호 9)에 고저오딘 상이한 세포 위치에서 발현된 추가의 잠재성 항원(Rv056-Rv1813*-Rv3407-Rv3478-Rv1807)을 함유한다.

모두 함께, 7개의 MVA 후보는 다음과 같다:

· MVATG18355는 p7.5K 프로모터의 조절하에 융합체 번호 13을 함유한다.

· MVATG18364는 p7.5K 프로모터의 조절하에 융합체 번호 13 및 pH5R 프로모터의 조절하에 융합체 번호 4를 함유한다.

· MVATG18365는 p7.5K 프로모터의 조절하에 융합체 번호 13 및 pH5R 프로모터의 조절하에 융합체 번호 11을 함유한다.

· MVATG18376은 p7.5K 프로모터의 조절하에 융합체 번호 13, pH5R 프로모터의 조절하에 융합체 번호 4 및 B2R 프로모터의 조절하에 융합체 번호 5를 함유한다.

· MVATG18377은 p7.5K 프로모터의 조절하에 융합체 번호 13, pH5R 프로모터의 조절하에 융합체 번호 11 및 B2R 프로모터의 조절하의 융합체 번호 5를 함유한다.

· MVATG18378은 p7.5K 프로모터의 조절하에 융합체 번호 13, pH5R 프로모터의 조절하에 융합체 번호 4 및 B2R 프로모터의 조절하에 융합체 번호 9를 함유한다.

· MVATG18379는 p7.5K 프로모터의 조절하에 융합체 번호 13, pH5R 프로모터의 조절하에 융합체 번호 11 및 B2R 프로모터의 조절하에 융합체 번호 9를 함유한다.

6.2 생화학적 원리 상의 재조합 MVA의 생성

3개의 재조합 MVA 후보를 생화학적 원리에 대해 설계된 Mtb 융합체의 발현을 위한 2 또는 3개의 카셋트를 함유하도록 유전자 조작하였다. 융합체 번호 6은 다음 항원 Ag85B*-Rv2626-RPFB-Dhyb*-Rv1733*을 함유하는 반면, 융합체 번호 14는 Rv2029*-TB10.4-ESAT6-Rv0111*를 함유한다. N-말단 신호 펩티드를 두 융합체를 위해 첨가한 반면, 이러한 융합체가 이미 막 고정 펩타이드를 함유하는 Rv0111 또는 Rv1733으로 종결되기 때문에 어떤 TM 도메인도 첨가하지 않았다.

· MVATG18404는 p7.5K 프로모터의 조절하에 융합체 번호 14를 함유하고, pH5R 프로모터의 조절하에 융합체 번호 6을 함유한다.

· MVATG18417은 p7.5K 프로모터의 조절하에 융합체 번호 14, pH5R 프로모터의 조절하에 융합체 번호 6 및 B2R 프로모터의 조절하에 융합체 번호 5를 함유한다.

· MVATG18418은 p7.5K 프로모터의 조절하에 융합체 번호 14, pH5R 프로모터의 조절하에 융합체 번호 6 및 B2R 프로모터의 조절하에 융합체 번호 9를 함유한다.

6.3 MVA-발현 Mtb 항원 및 융합체의 웨스턴 블롯 분석

A549 세포를 상기한 각종 MVA 후보로 감염시키고(MOI 1), 발현 생성물을 재료 및 방법에 기술된 조건하에 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다. 면역검출은 본원에서 기술된 각종 Mtb 항원의 특이적 항체를 사용하여 수행하였다. 구체적으로, 래빗의 면역화 후 수득된 혈청(참조: 재료 및 방법)을 Rv1733*, Rv2029*, Rv0569, Rv1807, Rv0111*, RPFB-Dhyb*, Rv1813*, Rv3407 및 Rv3478의 검출용으로 사용한 반면, 통상적인 항체를 ESAT6, Ag85B*, TB10.4 및 Rv2626의 검출용으로 사용하였다.

그 결과, 예상된 크기에 상응하는 밴드는 어떠한 재조합 MVA가 시험되더라도 모든 융합체를 위해 강조되었다. 보다 구체적으로, 약 98.4 kDa(융합체 번호 13의 예상 크기)의 밴드는 MVATG18355, MVATG18364, MVATG18365, MVATG18376, MVATG18377, MVATG18378 및 MVATG18379로 감염된 세포로부터 기원하는 세포 용해물 중의 항-Rv2626 및 항-Rv0111 면역검출 후 검출시켰다. 약 96.7 kDa(융합체 번호 4의 예상 크기)의 밴드 및 약 87 kDa(융합체 번호 11의 예상 크기)의 밴드는 각각 융합체 번호 4-함유 MVATG18364, MVATG18376 및 MVATG18378 및 융합체 번호 11-함유 MVATG18365, MVATG18377 및 MVATG18379로 감염된 세포로부터 기원하는 세포 용해 중의 항-ESAT 면역검출 후 검출시켰다. 또한, 약 119.7 kDa(융합체 번호 5의 예상 크기)의 밴드 및 약 109.9 kDa(융합체 번호 9의 예상 크기)의 밴드는 융합체 번호 5-함유 MVATG18376 및 MVATG18377 및 융합체 번호 9-함유 MVATG18378 및 MVATG18379로 각각 감염된 세포로부터 기원하는 세포 용해물 중의 항-Rv3407 면역검출 후 검출시켰다. 최종적으로, 약 100.4 kDa(융합체 번호 6의 예상 크기)의 밴드 및 약 87.5 kDa(융합체 번호 4의 예상 크기)의 밴드는 각각 항-Rv2626 및 항-Rv0111 면역검출 후 MVATG18404로 감염된 세포로부터 기원하는 세포 용해물 중에서 검출시켰다.

또한, 몇몇 경우에, 추가의 융합 생성물이 또한 관찰되었다. 특히, 이량체는 융합체 번호 13 및 융합체 번호 6에 대해 아마도 환원 조건에 내성인 이량체를 형성하는 Rv2626의 능력의 생성을 검출시켰다. 융합체 번호 13에 관하여, 전체 융합체 번호 13(예상 크기 98.4 kDa)의 발현은 실제로 검출되었지만, 낮은 수준이었다. 주요한 단백질분해 생성물을 항-Rv2626(약 70kDa) 및 항-Rv0111(약 30kDa)로 관찰하여 융합체 번호 13의 단백질분해 절단을 시사한다.

유사한 발현 수준은 막-고정되거나(융합체 번호 4) 또는 세포질(융합체 번호 11)인 동일한 항원(RPFB-Dhyb*-Ag85B*-TB10.4-ESAT6)을 함유하는 융합체 번호 4 및 11에 대해 검출시켰다. 예상 크기보다 큰 밴드(96.7 kDa 대신 115 kDa)는 아마도 N-글리코실화 생성물에 상응하는 융합체 번호 4에 대해 관찰하였다. 최소 단백질분해 생성물을 또한 두 융합체에 대해 검출시켰다.

유사한 발현 수준은 또한 융합체 번호 5 및 9(둘 다 막 고정된 형태(융합체 번호 5) 또는 세포질(융합체 번호 9)에서 발현된 Rv0569-Rv1813*-Rv3407-Rv3478-Rv1807 항원의 융합체에 상응)를 발현시키는 MVA의 세포 용해물 중의 항-Rv3407로 나타냈다. 예상 크기보다 큰 밴드(98.4kDa 대신 120kDa)는 아마도 N-글리코실화 생성물에 상응하는 융합체 번호 5-발현 세포 용해물에 존재하였다. 한편, 융합체 번호 5는 항-Rv1807 항체로 매우 약하게 검출된 반면, 이는 세포질 변형의 경우에서는 아니다. Rv1807 특이적 에피토프는 인접한 TMR 서열에 기인하여 막-고정된 융합에 접근할 수 없을 수도 있다고 가정했다.

실시예 7: Mtb 항원을 발현시키는 MVA 후보 백신의 면역원성의 평가

7.1 BALB/c 마우스에서 Mtb 항원을 발현시키는 MVA 후보 백신의 면역원성의 평가

BALB/c 마우스를 둘 다 ≪Rv2029-Rv2626-Rv1733-Rv0111≫(융합체 번호 13에 상응) 뿐만 아니라 ≪RpfB-Dhyb-Ag85B-TB10.4-ESAT6≫(융합체 번호 4 또는 11에 상응)를 발현시키는 MVATG18365 및 MVATG18364로 면역화하였다. 융합체 번호 13에서, SS 도메인은 N-말단에서 존재하고, Rv1733 및 Rv0111은 세포 표면에 대한 융합의 발현을 지시해야 하는 TM 도메인으로 발현된다. MVATG18364로 발현된 융합체 번호 4는 SS 및 TM 도메인을 모두 함유하는 반면, 융합체 번호 11(MVATG18365)은 세포질 발현을 유지하지 않지만, 이론적으로 세포질 발현을 유지해야 한다. 특이적-세포상 면역 반응은 본원에서 기술된 펩타이드 풀로 재자극 후 IFNγ ELISpot 분석에 의해 주사 후 1주일에 평가했다. 마우스를 또한 음성 대조군으로서 공 MVA 벡터(MVATGN33.1)로 면역화하였다.

각각 도 11a 및 b에 나타낸 바와 같이, 두 벡터 MVATG18365 및 MVATG18364는 MVATGN33.1 벡터와 비교할 경우 BALB/c 마우스에서 Rv2626, Rv0111, RpfB-Dhyb, Ag85B 및 TB10.4의 특이적 IFNγ 양성 반응을 유도했다. 이러한 반응은 유사한 반응을 나타내는 Rv2626을 제외하고 MVATG18365(세포질 융합)와 비교하여 MVATG18364(고정 융합)에 의해 계통적으로 더 강했다. Rv2029, Rv1733 및 ESAT6의 특이적인 보다 약하고 산발적인 반응이 검출되었다.

또한, "실시예 6" 섹션에 기술된 모든 재조합 MVA 후보 백신을 BALB/c 마우스에 주사하고, 모든 Mtb 항원의 특이적 세포상 면역 반응을 재료 및 방법 섹션에서 기술된 바와 같은 IFNγ ELISpot 분석으로 평가했다. BALB/c 마우스에서 각 MVA 후보에 의해 유도된 반응의 범위 및 강도의 요약은 도 12에 기재되어 있다. TB 질병 또는 생화학적 원리의 상에 따라서 설계된 Mtb 항원 융합과 함께 모든 MVA 백신은 BALB/c 마우스에서 14개의 항원 중 12개의 특이적인 IFNγ 반응을 야기할 수 있었다. 두 개의 잠재성 항원, Rv1733 및 Rv0569의 특이적인 양성 세포 반응은 전혀 검출되지 않았다.

7.2 유전자도입 HLA-A2 마우스에서 Mtb 항원을 발현시키는 MVA 후보 백신의 면역원성의 평가

본 발명자들이 DNA-계 연구에서 관찰한 바와 같이, 마우스 단상형(haplotype)은 선택된 Mtb 항원의 면역원성에 대한 영향을 갖는다(참조: 섹션 5). MVA 후보에 의해 유도된 Rv1733 및 Rv0569 항원의 면역원성을 추가로 분석하기 위해, 인간 MHC 부류 I 분자, HLA-A2를 발현시키는 유전자도입 마우스에 두 항원을 발현시키는 재조합 MVA를 주사하였다. 세포상 면역 반응은 본원에서 기술된 펩타이드 풀로 재자극 후 IFNγ ELISpot 분석으로 주사 1주일 후에 평가했다. 마우스를 또한 음성 대조군으로서 공 MVA 벡터(MVATGN33.1)로 면역화하였다. 구체적으로, HLA-A2 마우스는 ≪Rv2029-Rv2626-Rv1733-Rv0111≫(융합체 번호 13에 상응), ≪RpfB-Dhyb-Ag85B-TB10.4-ESAT6≫(융합체 번호 4에 상응) 뿐만 아니라 ≪Rv0569-Rv1813-Rv3407-Rv3478-Rv1807≫(융합체 번호 5 또는 9에 상응)를 발현시키는 MVATG18376 또는 MVATG18378 백신으로 면역화하였다. MVATG18376에 의해 발현된 융합체 번호 5에서, SS 및 TM 도메인은 각각 N-말단 및 C-말단 부분에서 발현시켰다. 도 13은 MVATG18376 백신으로 면역화된 HLA-A2 마우스에서 유도된 IFNγ 반응을 나타낸다. 14개의 항원 중 7개의 특이적 면역 반응이 검출되었다(도 13a). 비장세포를 RpfB-Dhyb 및 Ag85B 항원의 특이적인 펩타이드(각각, 1397스폿/10⁶ 세포 및 1160 스폿/10⁶ 세포)로 재자극되었을 때 고수준의 IFNγ-생산 세포를 검출하였다. 대조적으로, Rv1807, Rv1813, Rv3407 및 ESAT6의 특이적 세포 반응의 저수준은 MVATG18376 백신에 의해 유도되었다. 또한, 세포가 MVATGN33.1 공 백신(36 스폿/10⁶ 세포, 도 13b)으로 검출된 신호와 비교하여 Rv0569-특이적 펩티드로 재자극될 때, 낮지만(1x 컷-오프 < 중앙값 < 2x 컷-오프, 186 스폿/10⁶ 세포, 도 13a) 유의한 수준의 IFNγ-생산 세포가 검출되었다. 유사한 결과가 또한 Rv0111 및 TB10.4 항원의 특이적인 추가의 약한 반응을 유도하는 MVATG18378 후보로 백신접종된 HLA-A2 마우스에서 유도되었다. 두 MVATG18376 및 MVATG18378 백신에 의해 유도된 IFNγ 반응은 도 15에 요약한다. 주사된 MVA 후보가 무엇이든지, Rv1733, Rv2029, Rv2626 및 Rv3478의 특이적인 검출가능한 반응은 HLA-A2 유전자도입 마우스에서 관찰될 수 없었다.

7.3 C57Bl/6 마우스에서 Mtb 항원을 발현시키는 MVA 후보 백신이 면역원성의 평가

H-2^b 단상형 C57BL/6 마우스는 Rv0569 및 Rv1733 항원의 면역원성을 입증하기 위해 ≪Rv2029-Rv2626-Rv1733-Rv0111≫(융합체 번호 13에 상응), ≪RpfB-Dhyb-Ag85B-TB10.4-ESAT6≫(융합체 번호 11에 상응) 뿐만 아니라 ≪Rv0569-Rv1813-Rv3407-Rv3478-Rv1807≫(융합체 번호 5 또는 9에 상응)을 발현시키는 MVATG18377 또는 MVATG18379 백신으로 면역화하였다. 세포상 면역 반응을 본원에서 기술된 펩타이드 풀로 재자극 후 IFNγ ELISpot 분석으로 주사 1주일 후 평가했다. 마우스를 또한 음성 대조군으로서 공 MVA 벡터(MVATGN33.1)로 면역화하였다. 세포상 IFNγ 반응을 도 15에 요약한다. 두 MVA 백신은 Rv1807, RpfB-Dhyb, Rv3478, Ag85B 및 ESAT6 항원(92 내지 861 스폿/10⁶ 세포 범위)의 특이적인 강한 면역 반응을 유발할 수 있는 반면, TB10.4 및 Rv0569 항원의 특이적인 양성 IFNγ 반응은 단지 MVATG18379 후보(각각 78 및 58 스폿/10⁶ 세포)로 면역화한 마우스에서 검출되었다. Rv1733, Rv2029, Rv2626, Rv0111, Rv1813 및 Rv3407의 특이적인 양성 반응은 면역화된 C57BL/6 마우스에서 전혀 검출되지 않았다.

7.4 C3H/HeN 마우스에서 Mtb 항원을 발현시키는 MVA 후보 백신의 면역원성의 평가

Rv1733의 특이적인 면역원성이 플라스미드로 백신접종된 H-2^k 단상형 C3H/HeN 마우스에서 입증될 때(참조: 섹션 5.4), Rv1733 단백질을 함유하는 융합체를 발현시키는 MVATG18376, MVATG18378, MVATG18377 및 MVATG18379를 이 마우스 균주에 주사하였다. 세포상 면역 반응을 본원에서 기술된 펩타이드 풀로 재자극 후 IFNγ ELISpot 분석에 의해 주사 1주일 후 평가했다. 마우스를 또한 음성 대조군으로서 공 MVATGN33.1 벡터로 면역화하였다. 도 14에 나타낸 바와 같이, MVATG18377 백신은 MVATGN33.1과 비교하여 C3H/HeN 마우스에서 IFNγ 반응을 유도하였다. 고수준의 IFNγ-생산 세포가 Rv2029 및 Rv2626 펩티드(각각 660 및 353 스폿/106세포)로 비장세포 재자극시 검출되었다. 78 내지 250스폿/10⁶ 세포에 이르는 RpfB-Dhyb, Rv1813, Rv3407 및 Rv3478 항원의 특이적인 적은 세포상 면역 반응이 또한 면역화된 C3H/HeN 마우스에서 유도되었다. DNA-백신접종된 C3H/HeN 마우스에서 입증된 바와 같이, Rv1733-특이적 IFNγ 반응(183 스폿/10⁶ 세포)이 공 MVATGN33.1 백신(9 스폿/10⁶ 세포, 도 14b)이 주사된 마우스로부터 생성된 신호와 비교하여 이 마우스 균주에서 유발되었다. 비특이적 배경 반응은 MVATGN33.1에 의한 면역화 및 Rv0111, Ag85B 및 Rv1807 펩티드 풀(도 14b)에 의한 생체외 재자극 후 검출되어 MVATG18377에 의한 백신접종 후 이러한 항원의 특이적인 반응의 검출을 어렵게 하였다.

MVATG18377 이외에, C3H/HeN 마우스에서 MVATG18376, MVATG18378 및 MVATG18379에 의해 유도된 면역 반응은 도 15에 나타낸다. 시험된 4개의 MVA 후보 중에, MVATG18377이 가장 면역원성이었다(14개의 항원 중 7). MVATG18376 및 MVATG18378은 14개 항원 중 단지 2개(Rv2029 및 Rv2626)의 특이적인 세포상 면역 반응을 유도하는 반면, MVATG18379는 두 항원 뿐만 아니라 Rv1733에 대한 반응을 유발할 수 있다. MVATG18377 및 MVATG18379는 융합체 ≪Rv0569-Rv1813-Rv3407-Rv3478-Rv1807≫를 제외하고 동일한 융합 단백질을 발현시킨다. MVATG18377에서, SS 및 TM 도메인은 융합체 번호 5의 N-말단 및 C-말단 부분 각각에서 발현되는 반면, MVATG18379에서 두 도메인은 존재하지 않는다. 이 융합체에 존재하는 5개의 항원 중 3개는 MVATG18377에서 면역원성이었지만, MVATG18379에서는 없었다. 이러한 결과는, 세포 막에 융합 단백질을 어드레싱하면 이들의 면역원성을 향상시킨다는 것을 보여준다.

전체로서, MVA 벡터 뿐만 아니라 DNA 플라스미드로의 면역화는 본원에서 기술된 융합체에 포함된 모든 Mtb 항원을 표적화하는 강하고 특이적인 세포 반응의 유도를 야기한다. 두 시험 항원의 특이적인 체액성 면역 반응이 또한 DNA-면역화된 마우스에서 검출되었다. DNA 플라스미드로 사용하는 경우와 같이, MVA-발현된 Mtb 융합체의 막-고정은 특이적 면역 반응의 유도 수준을 어느 정도까지 향상시킨다.

실시예 8: Mtb 항원의 생산 및 정제

8.1 선택된 Mtb 항원의 바이오매스 생산을 위한 최적 조건

4개의 이. 콜리 균주를 개별적인 Mtb 항원 뿐만 아니라 상이한 배양 조건(예: 온도)의 발현에 대해 시험하였다.

이러한 분석은, 모두 14개의 선택된 항원이 하나의 정의된 온도에서 적어도 하나의 세균 균주에서 발현될 수 있지만, 유의차가 다른 것에 대한 하나의 Mtb 항원으로부터 관찰되었다. 실제로, 일부 Mtb 항원은 각종 이. 콜리 균주에서 어떤 배양 조건이든지(예: Rv0111, Rv0569, Rv1807, Rv2029, Rv2626, RpfB-D 융합) 용이하게 생성될 수 있는 반면, 기타 항원은 매우 특이적인 숙주 세포 및 조건(예: Rv1733, Rv1813, TB10-4)을 필요로 한다. 한편, 고발현 수준은 낮지만 검출가능한 수준에서 발현된 Rv3407, Ag85B 및 Rv1813을 제외한 상이한 이. 콜리에서 대부분의 Mtb 항원에 대해 수득될 수 있었다. 또한, 특정 Mtb 항원은 가용성 물질(예: 세포 용해물 상청액으로부터 직접 수집될 수 있는 Rv2626, Rv3407 및 Ag85B)로서 생성되는 반면, 나머지는 불용성 물질(예: 세포 용해 후 펠렛으로부터 수집된 RPFB-D, Rv0111, Rv1733, Rv2029, Rv3478, Rv1807, ESAT6 및 TB10.4)로 존재한다. 흥미롭게도, Rv0569는 18℃에서 배양된 형질전환된 Bl21 세포로부터 생성될 때 가용성이고, Bl21 세포가 37℃에서 배양될 때 모두 가용성 및 불용성 물질(상청액 및 용해 후 펠렛 중)로 존재한다.

8.2 Mtb 항원의 정제

재료 및 방법에 기술된 바와 같이, Mtb 항원은 니켈 컬럼 상의 IMAC 크로마토그래피에 이어, 최종적으로 겔 여과 컬럼에 의해 정제하였다.

대표적인 정제 분석은 Rv2626(37℃에서 C41 (DE3) 세포에서 생성된 가용성 물질로부터 정제됨), RPFB-D 융합체(37℃에서 Bl21 (DE3)에서 생성된 가용화된 봉입체로부터 정제된 변성 RpfB-D) 및 TB10.4(37℃에서 C41 (DE3)에서 생성된 가용성 및 불용성 물질로부터 정제됨)에 대해 제시한다. 용출된 분획은 각각 도 9a, b 및 c에 도시된 바와 같이 SDS-PAGE 상에서 분석하였다.

도 9a에 나타낸 바와 같이, Rv2626 정제된 풀은 임의의 가시적 오염물질을 나타내지 않았다. 주요 밴드는 예상된 Rv2626 분자량 뿐만 아니라 MS에 의해 Rv2626으로서 동정된 최소 밴드(소위 밴드 B)에서 나타났다. Rv2626은 변성 및 환원에 부분적으로 내성인 이량체를 형성하는 것으로 공지되어 있다. 따라서, 최소 밴드 B는 Rv2626의 이량체 형태에 상응한다고 가정된다.

SDS-PAGE 상에서 가시화될 때(레인 1 내지 8은 중간 정제 분획을 나타내고, 레인 9 내지 11은 5, 10 및 15μL의 정제된 풀을 나타냄), RPFB-Dhyb 정제된 풀은 임의의 가시성 오염물질을 나타내지 않았다(참조: 도 9b).

TB10-4는 변성 조건에 이어, 최종 단계로 순수한 조건으로 정제시켰다. 도 9c에 나타낸 바와 같이, 정제된 풀의 겔 분석은 임의의 가시성 오염물질을 나타내지 않았다(레인 2 내지 6은 중간 정제 분획을 나타내고, 레인 7 내지 9는 1, 3 및 6μL의 정제된 풀을 나타냄).

3개의 경우에, 내독소 수준은 정제된 풀에서 측저오디었고, 10EU/mg 단백질의 최고 수준으로 존재함을 나타냈다.

따라서, 3개의 단백질을 허용가능한 양, 순도 및 내독소 수준으로 정제시켰다.

요약하면, 본 발명은 Mtb 항원의 최적화된 조합을 제공한다. 14개의 Mtb 항원을 광범위한 서지 데이터 마이닝 스코링 및 생화학적 인 실리코 분석 후 선택하고, 플라스미드 백터에서 개별적으로 또는 융합체 형태로 클로닝하였다. 웨스턴 블롯팅에 의해 증명된 바와 같이, 모든 융합체는 고수준에서 발현되었고, N 및 C 말단에 존재하는 태그에 대해 또는 융합체에 존재하는 각 Mtb 항원에 대해 검출된 일련의 항체로 면역검출 후 정확한 예상 크기에서 검출되었다. BALB/c 마우스에서 면역화 분석은 T 세포 반응을 유도하기 위한 선택된 Mtb 항원 조합 및 융합체이 면역원성 잠재성을 지지한다.

또한, 선택된 Mtb 항원(융합체 중의 RpfB 및 RpfD)은 재조합 방법에 의해 세균에서 개별적으로 생성되었다. 이. 콜리에서 발현을 위한 조건은 세균 균주 및 배양 조건(예: 성장 온도)과 같은 기준을 연구함으로써 최적화하였다. 모든 단백질은 성공적으로 발현되었고, 한배 규모로 생성되었다.

실시예 9: 마우스에서 마이코박테리움 결핵 감염에 대한 Mtb 항원 함유 백신의 치료 효능의 평가

3개의 Mtb-발현 MVA 후보인 MVATG18364, MVATG18376 및 MVATG18377의 치료 효능을 이미 Mtb 균주 H37Rv로 감염된 마우스에서 항생물질과 공투여된 치료 세팅으로 조사하였다. 음성 대조군으로서, MVATGN33.1을 또한 한 그룹에 주사하였다. 세균 부하는 항생물질 처리 말기(감염후 15주) 및 이후 6주(감염후 21주)에 처리된 마우스로부터 수집된 비장에서 평가했다. 마우스 그룹, 약물 섭생 및 면역화 스케쥴은 표 5에 기재되어 있다.

그룹	N 마우스	처리	0주 에어로졸 챌린지	전처리 CFU (1일, 6주)	INH/RIF 처리 (6주 내지 15주)			CFU (재발) 21주
					MVA 10주	MVA 14주	CFU 15주
1	5	없음	5	5
2	20	INH/RIF	20	-			5	15
3	20	INH/RIF + MVATG18376	20	-	20	20	5	15
4	20	INH/RIF + MVATG18377	20	-	20	20	5	15
5	20	INH/RIF + MVATG18364	20	-	20	20	5	15
6	20	INH/RIF + MVATGN33.1	20		20	20	5	15

Mtb 감염 후 6주 및 화학치료 및 MVA 면역화 개시전에, 마이코박테리아를 모든 마우스 그룹의 비장(2.64 log₁₀ 총 cfu)에서 발생시켰다. 예상한 바와 같이, 마이코박테리아 부하는 화학치료 처리 동안 감소되었다. 단지 화학치료로만 처리된 그룹 2에서, Mtb 수준은 15주에 1.18 log₁₀ 총 cfu 및 21주에 0.70 log₁₀ 총 cfu에 도달하도록 점진적으로 감소되었다. 흥미롭게도, 15주에, 마이코박테리아 부하량은 항생물질 단독(그룹 2) 및 항생제와 함께 대조군 공 MVA(그룹 6)로 처리된 마우스보다 항생제 및 Mtb 항원 발현 MVA로 공-처리된 마우스(그룹 3-5에서 15주에 0.70 log₁₀ 총 CFU)에서 더 적어서 Mtb-발현 MVA가 강한 항균 작용에 기여한다는 것을 시사하였다. 처리 종료 후 6주(21주)에 마이코박테리아가 증식하지 않았고, 부하량은 항생제 치료 단독 처리된 마우스에서 관찰된 것과 유사한 수준으로 MVA-백신접종된 마우스에서 조절되었다(0.70 내지 0.85 log₁₀ 총 cfu 범위)는 것이 주목할 만하다. 대조군으로서, 약물 용법과 병용된 공 MVATGN33.1 벡터는 단지 15주 및 21주에 항생제 섭생보다 우수한 임의의 항-마이코박테리아 효과를 유도하지 않았다.

<110> TRANSGENE SA <120> Mycobacterial antigen vaccine <130> IPA150116-FR <150> EP 12305825.7 <151> 2012-07-10 <150> EP 12306539.3 <151> 2012-12-07 <150> EP 13305737.2 <151> 2013-06-03 <160> 102 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 685 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 1 Met Pro Ala Arg Ser Val Pro Arg Pro Arg Trp Val Ala Pro Val Arg 1 5 10 15 Arg Val Gly Arg Leu Ala Val Trp Asp Arg Pro Glu Arg Arg Ser Gly 20 25 30 Ile Pro Ala Leu Asp Gly Leu Arg Ala Ile Ala Val Ala Leu Val Leu 35 40 45 Ala Ser His Gly Gly Ile Pro Gly Met Gly Gly Gly Phe Ile Gly Val 50 55 60 Asp Ala Phe Phe Val Leu Ser Gly Phe Leu Ile Thr Ser Leu Leu Leu 65 70 75 80 Asp Glu Leu Gly Arg Thr Gly Arg Ile Asp Leu Ser Gly Phe Trp Ile 85 90 95 Arg Arg Ala Arg Arg Leu Leu Pro Ala Leu Val Leu Met Val Leu Thr 100 105 110 Val Ser Ala Ala Arg Ala Leu Phe Pro Asp Gln Ala Leu Thr Gly Leu 115 120 125 Arg Ser Asp Ala Ile Ala Ala Phe Leu Trp Thr Ala Asn Trp Arg Phe 130 135 140 Val Ala Gln Asn Thr Asp Tyr Phe Thr Gln Gly Ala Pro Pro Ser Pro 145 150 155 160 Leu Gln His Thr Trp Ser Leu Gly Val Glu Glu Gln Tyr Tyr Val Val 165 170 175 Trp Pro Leu Leu Leu Ile Gly Ala Thr Leu Leu Leu Ala Ala Arg Ala 180 185 190 Arg Arg Arg Cys Arg Arg Ala Thr Val Gly Gly Val Arg Phe Ala Ala 195 200 205 Phe Leu Ile Ala Ser Leu Gly Thr Met Ala Ser Ala Thr Ala Ala Val 210 215 220 Ala Phe Thr Ser Ala Ala Thr Arg Asp Arg Ile Tyr Phe Gly Thr Asp 225 230 235 240 Thr Arg Ala Gln Ala Leu Leu Ile Gly Ser Ala Ala Ala Ala Leu Leu 245 250 255 Val Arg Asp Trp Pro Ser Leu Asn Arg Gly Trp Cys Leu Ile Arg Thr 260 265 270 Arg Trp Gly Arg Arg Ile Ala Arg Leu Leu Pro Phe Val Gly Leu Ala 275 280 285 Gly Leu Ala Val Thr Thr His Val Ala Thr Gly Ser Val Gly Glu Phe 290 295 300 Arg His Gly Leu Leu Ile Val Val Ala Gly Ala Ala Val Ile Val Val 305 310 315 320 Ala Ser Val Ala Met Glu Gln Arg Gly Ala Val Ala Arg Ile Leu Ala 325 330 335 Trp Arg Pro Leu Val Trp Leu Gly Thr Ile Ser Tyr Gly Val Tyr Leu 340 345 350 Trp His Trp Pro Ile Phe Leu Ala Leu Asn Gly Gln Arg Thr Gly Trp 355 360 365 Ser Gly Pro Ala Leu Phe Ala Ala Arg Cys Ala Ala Thr Val Val Leu 370 375 380 Ala Gly Ala Ser Trp Trp Leu Ile Glu Gln Pro Ile Arg Arg Trp Arg 385 390 395 400 Pro Ala Arg Val Pro Leu Leu Pro Leu Ala Ala Ala Thr Val Ala Ser 405 410 415 Ala Ala Ala Val Thr Met Leu Val Val Pro Val Gly Ala Gly Pro Gly 420 425 430 Leu Arg Glu Ile Gly Leu Pro Pro Gly Val Ser Ala Val Ala Ala Val 435 440 445 Ser Pro Ser Pro Pro Glu Ala Ser Gln Pro Ala Pro Gly Pro Arg Asp 450 455 460 Pro Asn Arg Pro Phe Thr Val Ser Val Phe Gly Asp Ser Ile Gly Trp 465 470 475 480 Thr Leu Met His Tyr Leu Pro Pro Thr Pro Gly Phe Arg Phe Ile Asp 485 490 495 His Thr Val Ile Gly Cys Ser Leu Val Arg Gly Thr Pro Tyr Arg Tyr 500 505 510 Ile Gly Gln Thr Leu Glu Gln Arg Ala Glu Cys Asp Gly Trp Pro Ala 515 520 525 Arg Trp Ser Ala Gln Val Asn Arg Asp Gln Pro Asp Val Ala Leu Leu 530 535 540 Ile Val Gly Arg Trp Glu Thr Val Asp Arg Val Asn Glu Gly Arg Trp 545 550 555 560 Thr His Ile Gly Asp Pro Thr Phe Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Glu Leu 565 570 575 Gln Arg Ala Leu Ser Ile Val Gly Ser Thr Gly Val Arg Val Met Val 580 585 590 Thr Thr Val Pro Tyr Ser Arg Gly Gly Glu Lys Pro Asp Gly Arg Leu 595 600 605 Tyr Pro Glu Asp Gln Pro Glu Arg Val Asn Lys Trp Asn Ala Met Leu 610 615 620 His Asn Ala Ile Ser Gln His Ser Asn Val Gly Met Ile Asp Leu Asn 625 630 635 640 Lys Lys Leu Cys Pro Asp Gly Val Tyr Thr Ala Lys Val Asp Gly Ile 645 650 655 Lys Val Arg Ser Asp Gly Val His Leu Thr Gln Glu Gly Val Lys Trp 660 665 670 Leu Ile Pro Trp Leu Glu Asp Ser Val Arg Val Ala Ser 675 680 685 <210> 2 <211> 96 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 2 Met Ser Gln Ile Met Tyr Asn Tyr Pro Ala Met Leu Gly His Ala Gly 1 5 10 15 Asp Met Ala Gly Tyr Ala Gly Thr Leu Gln Ser Leu Gly Ala Glu Ile 20 25 30 Ala Val Glu Gln Ala Ala Leu Gln Ser Ala Trp Gln Gly Asp Thr Gly 35 40 45 Ile Thr Tyr Gln Ala Trp Gln Ala Gln Trp Asn Gln Ala Met Glu Asp 50 55 60 Leu Val Arg Ala Tyr His Ala Met Ser Ser Thr His Glu Ala Asn Thr 65 70 75 80 Met Ala Met Met Ala Arg Asp Thr Ala Glu Ala Ala Lys Trp Gly Gly 85 90 95 <210> 3 <211> 88 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 3 Met Lys Ala Lys Val Gly Asp Trp Leu Val Ile Lys Gly Ala Thr Ile 1 5 10 15 Asp Gln Pro Asp His Arg Gly Leu Ile Ile Glu Val Arg Ser Ser Asp 20 25 30 Gly Ser Pro Pro Tyr Val Val Arg Trp Leu Glu Thr Asp His Val Ala 35 40 45 Thr Val Ile Pro Gly Pro Asp Ala Val Val Val Thr Ala Glu Glu Gln 50 55 60 Asn Ala Ala Asp Glu Arg Ala Gln His Arg Phe Gly Ala Val Gln Ser 65 70 75 80 Ala Ile Leu His Ala Arg Gly Thr 85 <210> 4 <211> 362 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 4 Met Leu Arg Leu Val Val Gly Ala Leu Leu Leu Val Leu Ala Phe Ala 1 5 10 15 Gly Gly Tyr Ala Val Ala Ala Cys Lys Thr Val Thr Leu Thr Val Asp 20 25 30 Gly Thr Ala Met Arg Val Thr Thr Met Lys Ser Arg Val Ile Asp Ile 35 40 45 Val Glu Glu Asn Gly Phe Ser Val Asp Asp Arg Asp Asp Leu Tyr Pro 50 55 60 Ala Ala Gly Val Gln Val His Asp Ala Asp Thr Ile Val Leu Arg Arg 65 70 75 80 Ser Arg Pro Leu Gln Ile Ser Leu Asp Gly His Asp Ala Lys Gln Val 85 90 95 Trp Thr Thr Ala Ser Thr Val Asp Glu Ala Leu Ala Gln Leu Ala Met 100 105 110 Thr Asp Thr Ala Pro Ala Ala Ala Ser Arg Ala Ser Arg Val Pro Leu 115 120 125 Ser Gly Met Ala Leu Pro Val Val Ser Ala Lys Thr Val Gln Leu Asn 130 135 140 Asp Gly Gly Leu Val Arg Thr Val His Leu Pro Ala Pro Asn Val Ala 145 150 155 160 Gly Leu Leu Ser Ala Ala Gly Val Pro Leu Leu Gln Ser Asp His Val 165 170 175 Val Pro Ala Ala Thr Ala Pro Ile Val Glu Gly Met Gln Ile Gln Val 180 185 190 Thr Arg Asn Arg Ile Lys Lys Val Thr Glu Arg Leu Pro Leu Pro Pro 195 200 205 Asn Ala Arg Arg Val Glu Asp Pro Glu Met Asn Met Ser Arg Glu Val 210 215 220 Val Glu Asp Pro Gly Val Pro Gly Thr Gln Asp Val Thr Phe Ala Val 225 230 235 240 Ala Glu Val Asn Gly Val Glu Thr Gly Arg Leu Pro Val Ala Asn Val 245 250 255 Val Val Thr Pro Ala His Glu Ala Val Val Arg Val Gly Thr Lys Pro 260 265 270 Gly Thr Glu Val Pro Pro Val Ile Asp Gly Ser Ile Trp Asp Ala Ile 275 280 285 Ala Gly Cys Glu Ala Gly Gly Asn 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cctgacagtg 480 gccgaacagg aacagtgcct ggacgagctg agaggcgccg ctgcctctgc tgcttttgtg 540 gtggcctctg gctctctgcc tcctggcgtg gccgccgact actatcagag agtggccgac 600 atctgccggc ggagcagcac acctctgatc ctggatacaa gcggcggagg cctgcagcat 660 atcagcagcg gagtgttcct gctgaaggcc agcgtccgcg agctgaggga atgtgtggga 720 agcgagctgc tgaccgagcc cgaacagctg gccgctgccc acgagctgat cgatagaggc 780 agagccgagg tggtggtggt gtctctggga tctcagggcg ctctgctggc cacaagacac 840 gccagccacc ggttcagcag catccctatg acagccgtgt ctggcgtggg agccggcaat 900 gctatggtgg ccgccatcac agtgggcctg tctagaggct ggtccctgat caagtctgtg 960 cggctgggca atgccgctgg cgctgctatg ctgctgacac ctggaaccgc cgcctgcaac 1020 agggacgacg tggaacggtt cttcgagaca accgccagag acatcatgaa cgccggcgtg 1080 acctgtgtgg gcgagcacga gacactgaca gccgccgctc agtacatgag agagcacgac 1140 atcggcgccc tgcccatctg cggcgacgat gatagactgc acggcatgct gaccgaccgg 1200 gacatcgtga tcaagggcct ggctgctggc ctggacccca atactgctac agctggcgag 1260 ctggcaagag acagcatcta ctacgtggac gccaacgcca gcatccagga aatgctgaac 1320 gtgatggaag aacaccaggt ccgacgggtg cccgtgatca gcgaacacag actcgtgggc 1380 atcgtgaccg aggccgatat cgccagacat ctgcccgagc acgccatcgt gcagttcgtg 1440 aaggccatct gcagccccat ggccctggcc tctgctggaa cagccgtgca ggatagccgg 1500 tcccacgtgt acgctcacca ggcccagaca agacaccctg ccacagccac cgtgatcgac 1560 cacgagggcg tgatcgacag caacaccacc gccacatctg ccccaccccg gaccaagatc 1620 acagtgcctg ctagatgggt ggtcaacggc atcgagcgga gcggcgaagt gaatgccaag 1680 cccggcacca agagcggcga cagagtggga atctgggtgg actctgccgg ccagctggtg 1740 gatgaacctg cccctcctgc cagagccatt gccgatgctg ctctggctgc actgggcctg 1800 tggctgtctg tggcagctgt ggctggcgca ctgctggctc tgacaagagc catcctgatc 1860 agagtgcgga acgccagttg gcagcacgat atcgacagcc tgttctgcac ccagcgggag 1920 cagcccatca gaagatggcg gcctgccaga gtgccactgc tgccactggc tgctgctaca 1980 gtggcttctg ccgccgctgt gaccatgctg gtggtgcctg tgggagctgg acctggcctg 2040 agagagatcg gactgccacc aggcgtgtca gccgtggctg ctgtgtctcc tagccctcct 2100 gaagcctctc agcctgcccc tggcccaaga gatcccaaca gacccttcac cgtgtccgtg 2160 ttcggcgaca gcatcggctg gaccctgatg cactacctgc ctcccacccc tggcttccgg 2220 ttcatcgacc acacagtgat cggctgcagt ctcgtgcggg gcacccctta cagatatatc 2280 ggccagaccc tggaacagcg ggccgagtgt gatggatggc ctgctaggtg gtccgcccag 2340 gtcaacagag atcagcccga cgtggcactg ctgatcgtgg gcagatggga gacagtggac 2400 agagtgaacg agggccggtg gacccacatc ggcgacccta cctttgacgc ctacctgaac 2460 gccgagctgc agcgggccct gtctatcgtg ggaagcacag gcgtcagagt gatggtcacc 2520 accgtgccct acagcagagg cggcgagaag cctgacggca gactgtaccc tgaggaccag 2580 cccgagcgcg tgaacaagtg gaacgccatg ctgcacaacg ccatcagcca gcacagcaac 2640 gtgggcatga tcgacctgaa caagaagctg tgccccgacg gcgtgtacac cgccaaggtg 2700 gacggaatca aagtgcggag cgacggcgtg cacctgaccc aggaaggcgt gaagtggctg 2760 atcccctggc tggaagatag cgtgcgggtg gcctctgaac aaaaactcat ctcagaagag 2820 gatctgagcc atcatcatca tcatc 2845 <210> 51 <211> 2547 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> nt sequence encoding fusion n?4 "SS-Flag-Rv2029*-TB10.4-ESAT6-Rv0111*-Myc-His tag" (pTG18324) <400> 51 atgggtctca aggtgaacgt ctctgccata ttcatggcag tactgttaac tctccaaaca 60 cccaccggtc aaatccattg gggcgattac aaggatgacg acgataagac cgagcctgcc 120 gcctgggatg agggcaagcc cagaatcatc accctgacca tgaaccccgc cctggacatc 180 accaccagcg tggacgtcgt gcggcccacc gagaagatga gatgtggcgc ccctagatac 240 gaccctggcg gcggaggaat caacgtggcc agaatcgtgc acgtgctggg cggctgtagc 300 accgccctgt ttccagctgg cggctctaca ggctctctgc tgatggccct gctgggagat 360 gccggcgtgc ccttcagagt gatccctatc gccgccagca cccgcgagag cttcaccgtg 420 aatgagagcc ggaccgccaa gcagtacaga ttcgtgctgc ctggccccag cctgacagtg 480 gccgaacagg aacagtgcct ggacgagctg agaggcgccg ctgcctctgc tgcttttgtg 540 gtggcctctg gctctctgcc tcctggcgtg gccgccgact actatcagag agtggccgac 600 atctgccggc ggagcagcac acctctgatc ctggatacaa gcggcggagg cctgcagcat 660 atcagcagcg gagtgttcct gctgaaggcc agcgtccgcg agctgaggga atgtgtggga 720 agcgagctgc tgaccgagcc cgaacagctg gccgctgccc acgagctgat cgatagaggc 780 agagccgagg tggtggtggt gtctctggga tctcagggcg ctctgctggc cacaagacac 840 gccagccacc ggttcagcag catccctatg acagccgtgt ctggcgtggg agccggcaat 900 gctatggtgg ccgccatcac agtgggcctg tctagaggct ggtccctgat caagtctgtg 960 cggctgggca atgccgctgg cgctgctatg ctgctgacac ctggaaccgc cgcctgcaac 1020 agggacgacg tggaacggtt cttcgagagc cagatcatgt acaactaccc cgccatgctg 1080 ggccacgccg gcgatatggc tggatatgcc ggcacactgc agagcctggg tgccgagatt 1140 gccgtggaac aggctgccct ccagtctgcc tggcagggcg ataccggcat cacataccag 1200 gcttggcagg cccagtggaa ccaggccatg gaagatctcg tgcgggccta ccacgccatg 1260 agcagcacac acgaggccaa caccatggcc atgatggccc gggatacagc cgaggccgct 1320 aagtggggag gaaccgagca gcagtggaac ttcgccggaa ttgaggccgc tgccagcgcc 1380 atccagggca acgtgacatc catccacagc ctgctggacg agggcaagca gagcctgaca 1440 aaactggctg ctgcctgggg cggctctggc tctgaagctt atcagggcgt gcagcagaag 1500 tgggacgcca ccgccaccga gctgaacaac gccctgcaga acctggcccg gacaatctct 1560 gaagccggac aggccatggc cagcaccgag ggcaatgtga ccggcatgtt tgccgagcag 1620 cccatcagaa gatggcggcc tgccagagtg ccactgctgc cactggctgc tgctacagtg 1680 gcttctgccg ccgctgtgac catgctggtg gtgcctgtgg gagctggacc tggcctgaga 1740 gagatcggac tgccaccagg cgtgtcagcc gtggctgctg tgtctcctag ccctcctgaa 1800 gcctctcagc ctgcccctgg cccaagagat cccaacagac ccttcaccgt gtccgtgttc 1860 ggcgacagca tcggctggac cctgatgcac tacctgcctc ccacccctgg cttccggttc 1920 atcgaccaca cagtgatcgg ctgcagtctc gtgcggggca ccccttacag atatatcggc 1980 cagaccctgg aacagcgggc cgagtgtgat ggatggcctg ctaggtggtc cgcccaggtc 2040 aacagagatc agcccgacgt ggcactgctg atcgtgggca gatgggagac agtggacaga 2100 gtgaacgagg gccggtggac ccacatcggc gaccctacct ttgacgccta cctgaacgcc 2160 gagctgcagc gggccctgtc tatcgtggga agcacaggcg tcagagtgat ggtcaccacc 2220 gtgccctaca gcagaggcgg cgagaagcct gacggcagac tgtaccctga ggaccagccc 2280 gagcgcgtga acaagtggaa cgccatgctg cacaacgcca tcagccagca cagcaacgtg 2340 ggcatgatcg acctgaacaa gaagctgtgc cccgacggcg tgtacaccgc caaggtggac 2400 ggaatcaaag tgcggagcga cggcgtgcac ctgacccagg aaggcgtgaa gtggctgatc 2460 ccctggctgg aagatagcgt gcgggtggcc tctgaacaaa aactcatctc agaagaggat 2520 ctgagccatc atcatcatca tcattga 2547 <210> 52 <211> 34 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 52 cgcggccgca ccatggatta caaggatgac gacg 34 <210> 53 <211> 34 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 53 cgtcgtcatc cttgtaatcc atggtgcggc cgcg 34 <210> 54 <211> 39 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 54 catctcagaa gaggatctgc atcatcatca tcatcattg 39 <210> 55 <211> 39 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 55 caatgatgat gatgatgatg cagatcctct tctgagatg 39 <210> 56 <211> 40 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 56 gatgacgacg ataaggctag cagagccacc gtgggactgg 40 <210> 57 <211> 41 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 57 gatgagtttt tgttcgctag cctgttcatc ccgcatctcg t 41 <210> 58 <211> 37 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 58 gatgacgacg ataaggctag caaggccaaa gtcggcg 37 <210> 59 <211> 37 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 59 gatgagtttt tgttcgctag ctgttcctct ggcgtgc 37 <210> 60 <211> 41 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 60 gatgacgacg ataaggctag cgattttgcc accctcccac c 41 <210> 61 <211> 43 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 61 gagatgagtt tttgttcgct agcgccagct gcaggaggtc tgg 43 <210> 62 <211> 40 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 62 gatgacgacg ataaggctag cgccaacggc agcatgagcg 40 <210> 63 <211> 43 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 63 gagatgagtt tttgttcgct agcgttgcag gcccagttca cga 43 <210> 64 <211> 40 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 64 gatgacgacg ataaggctag cgtggacttc ggcgccctgc 40 <210> 65 <211> 43 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 65 gagatgagtt tttgttcgct agcgccagcg gctggagttc tgg 43 <210> 66 <211> 42 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 66 gatgacgacg ataaggctag cacaaccgcc agagacatca tg 42 <210> 67 <211> 40 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 67 gatgagtttt tgttcgctag cagaggccag ggccatgggg 40 <210> 68 <211> 35 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 68 gttttggaaa attcccaata accgtggacg gcacc 35 <210> 69 <211> 35 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 69 ggtgccgtcc acggttattg ggaattttcc aaaac 35 <210> 70 <211> 35 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 70 gaccggcatg tttgccagct atgttcttct ctctg 35 <210> 71 <211> 35 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 71 cagagagaag aacatagctg gcaaacatgc cggtc 35 <210> 72 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 72 gtttcggtaa gtttcctata aaggccaaag tcggcgac 38 <210> 73 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 73 gtcgccgact ttggccttta taggaaactt accgaaac 38 <210> 74 <211> 32 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 74 cctcctgcag ctggcagcta cgtactgcta tc 32 <210> 75 <211> 32 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 75 gatagcagta cgtagctgcc agctgcagga gg 32 <210> 76 <211> 36 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 76 gttttgggaa attccctatt gccttctcta gacctg 36 <210> 77 <211> 36 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 77 caggtctaga gaaggcaata gggaatttcc caaaac 36 <210> 78 <211> 44 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 78 gatcagatat cgcggccgcc gtacgaccat ggtaccacaa gcgc 44 <210> 79 <211> 32 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 79 ggcggcaggc tcggtgcccc aatggatttg ac 32 <210> 80 <211> 124 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> promoter p7.5K <400> 80 ccacccactt tttatagtaa gtttttcacc cataaataat aaatacaata attaatttct 60 cgtaaaagta gaaaatatat tctaatttat tgcacggtaa ggaagtagaa tcataaagaa 120 cagt 124 <210> 81 <211> 30 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 81 gctggtagat ctcccaccca ctttttatag 30 <210> 82 <211> 42 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 82 ccttgagacc catggtggac tgttctttat gattctactt cc 42 <210> 83 <211> 43 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 83 gtagaatcat aaagaacagt ccaccatggg tctcaaggtg aac 43 <210> 84 <211> 55 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 84 gagtcattct cgacttgcgg ccgcacaaaa atcaagaggc cacccgcacg ctatc 55 <210> 85 <211> 114 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> promoter pH5R <400> 85 tttattctat acttaaaaaa tgaaaataaa tacaaaggtt cttgagggtt gtgttaaatt 60 gaaagcgaga aataatcata aattatttca ttatcgcgat atccgttaag tttg 114 <210> 86 <211> 56 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 86 cctcttgatt tttgtgcggc cgctttattc tatacttaaa aaatgaaaat aaatac 56 <210> 87 <211> 39 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 87 ggacattaat taacaaactt aacggatatc gcgataatg 39 <210> 88 <211> 36 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 88 ggcacttaat taaccaccat ggtaccacaa gcgctg 36 <210> 89 <211> 48 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 89 gttaacgcta gcctcgagac aaaaatcaaa gacgtgtttc gcctccac 48 <210> 90 <211> 42 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 90 ggcacttaat taaccaccat gaccgtggac ggcaccgcca tg 42 <210> 91 <211> 51 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 91 gttaacgcta gcctcgagac aaaaatcagg caaacatgcc ggtcacattg c 51 <210> 92 <211> 100 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> promoter B2R <400> 92 tatattatta agtgtggtgt ttggtcgatg taaaattttt gtcgataaaa attaaaaaat 60 aacttaattt attattgatc tcgtgtgtac aaccgaaatc 100 <210> 93 <211> 35 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 93 ggatcctcga gtatattatt aagtgtggtg tttgg 35 <210> 94 <211> 48 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 94 cttgcggtac catggtgggc tagcgatttc ggttgtacac acgagatc 48 <210> 95 <211> 45 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 95 gtgtgtacaa ccgaaatcgc tagcccacca tggtaccgca agccc 45 <210> 96 <211> 34 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 96 ctttccggat ccacaaaaat cacaggcggg tctc 34 <210> 97 <211> 52 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 97 gtgtgtacaa ccgaaatcgc tagcccacca tgaaggccaa agtcggcgac tg 52 <210> 98 <211> 33 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 98 gagtcggatc cacaaaaatc agccagctgc agg 33 <210> 99 <211> 49 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 99 gagtcattct cgacttgcgg ccgcacaaaa atcaagaggc cacccgcac 49 <210> 100 <211> 40 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 100 gctggtggat cccacccact ttttatagta agtttttcac 40 <210> 101 <211> 37 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 101 ggcacttaat taaccaccat ggttcctcag gctctcc 37 <210> 102 <211> 44 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 102 gttaacgcta gcctcgagac aaaaatcacc gctgggtgca gaac 44

Claims (47)

1. 적어도 5개의 상이한 항원, 또는 적어도 5개의 항원을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 면역원성 조합물로서,
   상기 항원은 마이코박테리움 종으로부터 독립적으로 수득되는, 면역원성 조합물.
2. 제1항에 있어서, 상기 마이코박테리움 항원이 마이코박테리움 투베르쿨로시스(M. tuberculosis)(Mtb), 마이코박테리움 보비스(M. bovis), 마이코박테리움 보비스(M. bovis) BCG, 마이코박테리움 아프리카눔(M. africanum), 마이코박테리움 카네티(M. canetti), 마이코박테리움 카프라에(M. caprae) 및 마이코박테리움 마이크로티(M. microti)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 결핵 복합체의 마이코박테리움 종으로부터 수득되는, 면역원성 조합물.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 면역원성 조성물이 활성기, 소생기 및 잠복기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 2개의 상이한 감염 상 (infection phase)의 마이코박테리아 항원을 포함하거나 이를 코딩하는, 면역원성 조합물.
4. 제3항에 있어서, 상기 면역원성 조성물이 활성 감염기로부터의 적어도 하나의 항원, 소생 감염기로부터의 적어도 하나의 항원 및 잠복 감염기로부터의 적어도 하나의 항원을 포함하거나 이를 코딩하는 다상 (multiphase)인, 면역원성 조합물.
5. 제3항 또는 제4항에 있어서, 활성기의 상기 항원(들)이 ESAT-6(Rv3875), CFP-10(Rv3874), TB10.4(Rv0288), Ag85A(Rv3804), Ag85B(Rv1886), Rv3619, Rv3620 및 PPE 계열 단백질 Rv3478 및 Rv2608로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 면역원성 조합물.
6. 제5항에 있어서, 상기 면역원성 조성물이 적어도 ESAT-6(Rv3875), Ag85B(Rv1886) 및 TB10.4(Rv0288)를 포함하거나 이를 발현하는, 면역원성 조합물.
7. 제3항 또는 제4항에 있어서, 잠복기의 상기 항원(들)이 Rv0081, Rv0111, Rv0198, Rv0569, Rv1733c, Rv1735, Rv1737, Rv1806, Rv1807, Rv1813, Rv2005c, Rv2029c, Rv2032, Rv2626, Rv2627, Rv2628, Rv2660c, Rv3407 및 Rv3812로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 면역원성 조합물.
8. 제7항에 있어서, 잠복기의 상기 항원(들)이 Rv0111, Rv0569, Rv1733, Rv1807, Rv1813, Rv2029, Rv2626, Rv3407 및 Rv3478로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 면역원성 조합물.
9. 제3항 또는 제4항에 있어서, 소생기의 상기 항원(들)이 RpfA, RpfB, RpfC, RpfD 및 RpfE로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 면역원성 조합물.
10. 제9항에 있어서, 상기 면역원성 조성물이 적어도 RpfB 및 RpfD를 포함하거나 발현하는, 면역원성 조합물.
11. 제1항 내지 제10항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 면역원성 조합물이 ESAT-6(Rv3875), CFP-10(Rv3874), TB10.4(Rv0288), Ag85A(Rv3804), Ag85B(Rv1886), Rv3619, Rv3620, RpfA, RpfB, RpfC, RpfD, RpfE, Rv0081, Rv0111, Rv0198, Rv0569, Rv1733c, Rv1735, Rv1737, Rv1806, Rv1807, Rv1813, Rv2005c, Rv2029c, Rv2032, Rv2626, Rv2627, Rv2628, Rv2660c, Rv3407, Rv3478 및 Rv3812로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 5개의 마이코박테리아 항원을 포함하거나 이를 코딩하는, 면역원성 조합물.
12. 제11항에 있어서, 상기 적어도 5개의 마이코박테리아 항원이 ESAT-6 (Rv3875), TB10.4 (Rv0288), Ag85B (Rv1886), RpfB, RpfD, Rv0111, Rv0569, Rv1733c, Rv1807, Rv1813, Rv2029c, Rv2626, Rv3407 및 Rv3478로 이루어진 그룹; 및 바람직하게는 서열번호 1 내지 24 중의 어느 하나와 적어도 80% 상동성이거나 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드의 그룹으로부터 선택되는, 면역원성 조합물.
13. 제1항 내지 제12항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 면역원성 조합물이 마이코박테리아 항원을 분리된 폴리펩티드 형태 또는 하나 이상의 융합 폴리펩티드 형태 또는 분리된 항원(들) 및 융합체(들) 형태 둘 다로 포함하거나 이를 코딩하는, 면역원성 조합물.
14. 제5항 내지 제12항 중의 어느 한 항에 따르는 면역원성 조합물을 포함하거나 이에 의해 코딩된 2개 이상의 마이코박테리아 항원을 포함하는 융합 폴리펩티드.
15. 제14항에 있어서, 서열번호 1 내지 24 중의 어느 하나와 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 그룹으로부터 선택된 적어도 2개의 폴리펩티드를 포함하는, 융합 폴리펩티드.
16. 제14항 또는 제15항에 있어서, 상기 융합 폴리펩티드가 동일한 감염 상의 마이코박테리아 항원을 포함하는, 융합 폴리펩티드.
17. 제14항 또는 제15항에 있어서, 상기 융합 폴리펩티드가 2개의 상이한 감염 상 또는 활성기, 소생기 및 잠복기로부터 균등 (even)의 마이코박테리아 항원을 포함하는, 융합 폴리펩티드.
18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 상기 융합 폴리펩티드가
    (i) 마이코박테리움 투베르쿨로시스(M. tuberculosis) 항원 Rv2029, Rv2626, Rv1733 및 Rv0111를 포함하는 융합 폴리펩티드;
    (ii) 마이코박테리움 투베르쿨로시스(M. tuberculosis) 항원 Rv0569, Rv1813, Rv3407, Rv3478 및 Rv1807를 포함하는 융합 폴리펩티드;
    (iii) 마이코박테리움 투베르쿨로시스(M. tuberculosis) 항원 Ag85B, TB10.4 및 ESAT6을 포함하는 융합 폴리펩티드;
    (iv) 마이코박테리움 투베르쿨로시스(M. tuberculosis) 항원 RpfB 및 RpfD를 포함하는 융합 폴리펩티드;
    (v) 마이코박테리움 투베르쿨로시스(M. tuberculosis) 항원 RpfB, RpfD, Ag85B, TB10.4 및 ESAT6을 포함하는 융합 폴리펩티드;
    (vi) 마이코박테리움 투베르쿨로시스(M. tuberculosis) 항원 Ag85B, Rv2626, RpfB, RpfD 및 Rv1733을 포함하는 융합 폴리펩티드;
    (vii) 마이코박테리움 투베르쿨로시스(M. tuberculosis) 항원 Rv2029, TB10.4, ESAT6 및 Rv0111을 포함하는 융합 폴리펩티드; 및
    (viii) 마이코박테리움 투베르쿨로시스(M. tuberculosis) 항원 Ag85B, Rv2626 및 Rv1733을 포함하는 융합 폴리펩티드로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 융합 폴리펩티드.
19. 제18항에 있어서, 상기 융합 폴리펩티드가 하기 아미노산 서열 중의 어느 하나와 적어도 80% 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 그룹으로부터 선택되는 융합 폴리펩티드:
    - 서열번호 28의 대략 위치 32 내지 대략 위치 506에 제시된 아미노산 서열;
    - 서열번호 29의 대략 위치 10 내지 대략 위치 484에 제시된 아미노산 서열;
    - 서열번호 30의 대략 위치 32 내지 대략 위치 380에 제시된 아미노산 서열;
    - 서열번호 31의 대략 위치 10 내지 대략 위치 358에 제시된 아미노산 서열;
    - 서열번호 32의 대략 위치 32 내지 대략 위치 855에 제시된 아미노산 서열;
    - 서열번호 33의 대략 위치 10 내지 대략 위치 833에 제시된 아미노산 서열;
    - 서열번호 34의 대략 위치 32 내지 대략 위치 1115에 제시된 아미노산 서열;
    - 서열번호 35의 대략 위치 10 내지 대략 위치 1093에 제시된 아미노산 서열;
    - 서열번호 36의 대략 위치 32 내지 대략 위치 956에 제시된 아미노산 서열;
    - 서열번호 37의 대략 위치 32 내지 대략 위치 607에 제시된 아미노산 서열;
    - 서열번호 38의 대략 위치 37 내지 대략 위치 932에 제시된 아미노산 서열; 또는
    - 서열번호 39의 대략 위치 37 내지 대략 위치 831에 제시된 아미노산 서열; 및 여기서 상기 아미노산 서열은 개시자 Met를 추가로 포함함.
20. 제18항 또는 제19항에 있어서, 상기 융합 폴리펩티드가 신호 및/또는 막관통 펩티드와 같은 적절한 표적화 펩티드(들)를 추가로 포함하는, 융합 폴리펩티드.
21. 제5항 내지 제13항 중의 어느 한 항에 따르는 면역원성 조합물 또는 제14항 또는 제20항 중의 어느 한 항에 따르는 융합 폴리펩티드가 포함되는 상기 적어도 5개의 마이코박테리아 항원을 코딩하는 핵산 분자.
22. 제21항에 있어서, 서열번호 40 내지 51 중의 어느 하나에 제시된 뉴클레오티드 서열 또는 이의 단편과 적어도 80% 동일성을 나타내는, 핵산 분자.
23. 제21항 또는 제22항에 따르는 하나 이상의 핵산 분자(들)를 포함하는 벡터.
24. 제23항에 있어서, 상기 벡터가 플라스미드 벡터 또는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노바이러스-연관 바이러스(AAV), 폭스바이러스, 헤르페스 바이러스, 홍역 바이러스, 포말상 바이러스, 알파바이러스 및 수포성 구내염 바이러스로 이루어진 그룹으로부터 선택된 바이러스 벡터인, 벡터.
25. 제24항에 있어서, 상기 벡터가 E1-결손 아데노바이러스 벡터인, 벡터.
26. 제25항에 있어서, 상기 벡터가 계두, 카나리아두 및 백시니아 바이러스 벡터로 이루어진 그룹으로부터 선택된 폭스바이러스 벡터인, 벡터.
27. 제26항에 있어서, 상기 백시니아 바이러스 벡터가 코펜하겐, 와이어스 (Wyeth), NYVAC 및 변형된 안카라(MVA) 균주인, 벡터.
28. 제23항에 있어서, 상기 벡터가 마이코박테리움 보비스(M. bovis) BCG, 락토바실루스, 리스테리아, 살모넬라 및 슈도모나스로 이루어진 그룹으로부터 선택된 세균 세포인, 벡터.
29. 제23항 내지 제28항 중의 어느 한 항에 있어서,
    i. Rv2029, Rv2626, Rv1733 및 Rv0111를 포함하는 융합 폴리펩티드 및 RpfB, RpfD, Ag85B, TB10.4 및 ESAT-6을 포함하는 융합 폴리펩티드를 코딩하는 벡터;
    ii. Rv2029, Rv2626, Rv1733 및 Rv0111을 포함하는 융합 폴리펩티드, RpfB, RpfD, Ag85B, TB10.4 및 ESAT-6을 포함하는 융합 폴리펩티드, 및 Rv0569, Rv1813, Rv3407, Rv3478 및 Rv1807을 포함하는 융합 폴리펩티드를 코딩하는 벡터;
    iii. Rv2029, Rv2626, Rv1733 및 Rv0111을 포함하는 융합 폴리펩티드, RpfB, RpfD, Ag85B, TB10.4 및 ESAT-6을 포함하는 융합 폴리펩티드, 및 Rv0569, Rv1813, Rv3407, Rv3478 및 Rv1807을 포함하는 융합 폴리펩티드를 코딩하는 벡터;
    iv. Ag85B, Rv2626 RpfB, RpfD 및 Rv1733을 포함하는 융합 폴리펩티드 및 Rv2029 TB10.4, ESAT-6 및 Rv0111을 포함하는 융합 폴리펩티드를 코딩하는 벡터;
    v. Ag85B, Rv2626 RpfB, RpfD 및 Rv1733을 포함하는 융합 폴리펩티드, Rv2029 TB10.4, ESAT-6 및 Rv0111을 포함하는 융합 폴리펩티드, 및 Rv0569, Rv1813, Rv3407, Rv3478 및 Rv1807을 포함하는 융합 폴리펩티드를 코딩하는 벡터; 및
    vi. RpfB, RpfD, Ag85B, TB10.4 및 ESAT-6을 포함하는 융합 폴리펩티드 및 Rv0569, Rv1813, Rv3407, Rv3478 및 Rv1807을 포함하는 융합 폴리펩티드를 코딩하는 벡터로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 벡터.
30. 제23항 내지 제29항 중의 어느 한 항에 있어서, 감염성 바이러스 입자의 형태로 존재하는, 벡터.
31. (i) 제24항 내지 제27항, 제29항 및 제30항 중의 어느 한 항의 바이러스 벡터를 적합한 세포주에 도입하는 단계, (ii) 상기 세포주를, 상기 감염성 바이러스 입자의 생성을 가능하게 하는 적합한 조건하에 배양하는 단계, (iii) 생성된 바이러스 입자를 상기 세포주의 배양물로부터 회수하는 단계 및 (iv) 상기 회수된 바이러스 입자를 임의로 정제하는 단계를 포함하는, 감염성 바이러스 입자를 생성하는 방법.
32. 제1항 내지 제13항 중의 어느 한 항의 면역원성 조합물, 제14항 내지 제20항 중의 어느 한 항의 융합 폴리펩티드, 제21항 및 제22항 중의 어느 한 항의 핵산 분자 또는 제23항 내지 제30항 중의 어느 한 항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
33. (i) 벡터를 적합한 숙주 세포에 도입하여 형질감염 또는 감염된 숙주 세포를 생성하는 단계, (ii) 상기 형질감염 또는 감염된 숙주 세포를 상기 숙주 세포의 성장에 적합한 조건하에 시험관내에서 배양하는 단계, (iii) 세포 배양물을 회수하는 단계 및 (iv) 마이코박테리아 항원(들) 또는 융합 폴리펩티드를 상기 회수된 세포 및/또는 배양 상청액으로부터 임의로 정제하는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제13항 중의 어느 한 항의 면역원성 조성물 또는 제14항 내지 제20항 중의 어느 한 항의 융합 폴리펩티드가 포함되거나 이에 의해 코딩된 마이코박테리아 항원의 재조합 생성 방법.
34. 제33항에 있어서, 상기 적합한 숙주 세포가 이. 콜라이(E. coli) 숙주 세포 및 특히 이의 게놈 내에 D13 프로파지를 포함하는 이. 콜라이 균주인, 방법.
35. 제1항 내지 제13항 중의 어느 한 항의 면역원성 조성물, 제14항 내지 제20항 중의 어느 한 항의 융합 폴리펩티드, 제21항 및 제22항 중의 어느 한 항의 핵산 분자, 제23항 내지 제30항 중의 어느 한 항의 벡터 또는 제32항의 숙주 세포 또는 이들의 임의의 조합 중의 적어도 하나를 포함하는 조성물.
36. 제35항에 있어서, 약학적으로 허용가능한 비히클을 추가로 포함하는, 조성물.
37. 마이코박테리움 감염, 또는 이러한 마이코박테리움 감염과 연관되거나 유발된 임의의 질환 및 병리 상태의 예방 또는 치료에 사용하기 위한, 제1항 내지 제13항 중의 어느 한 항의 면역원성 조합물, 제14항 내지 제20항 중의 어느 한 항의 융합 폴리펩티드, 제21항 및 제22항 중의 어느 한 항의 핵산 분자, 제23항 내지 제30항 중의 어느 한 항의 벡터, 제32항의 숙주 세포 또는 제35항 및 제36항 중의 어느 한 항의 조성물.
38. 제37항에 있어서, 이를 필요로 하는 대상체, 특히 활성 질환이 발달한 감염된 개체와 밀접하게 접촉되어 있는 대상체에서 마이코박테리움에 의한 감염을 예방하거나 감염 위험을 지연시키기 위한, 면역원성 조합물, 융합 폴리펩티드, 핵산 분자, 벡터, 숙주 세포 또는 조성물.
39. 제37항에 있어서, 마이코박테리움 종 및 특히 마이코박테리움 투베르쿨로시스(M. tuberculosis)로 감염된 대상체에서 활성 질환의 치료에 사용하기 위한, 면역원성 조합물, 융합 폴리펩티드, 핵산 분자, 벡터, 숙주 세포 또는 조성물.
40. 제37항에 있어서, 마이코박테리움 종 및 특히 마이코박테리움 투베르쿨로시스(M. tuberculosis)로 잠복기로 감염된 대상체에서 재활성화의 예방 또는 치료에 사용하기 위한, 면역원성 조합물, 융합 폴리펩티드, 핵산 분자, 벡터, 숙주 세포 또는 조성물.
41. 제37항에 있어서, BCG 부스터로서 사용하기 위한, 면역원성 조합물, 융합 폴리펩티드, 핵산 분자, 벡터, 숙주 세포 또는 조성물.
42. 제37항 내지 제41항 중의 어느 한 항에 있어서, 마이코박테리움 감염에 대해 효과적인 하나 이상의 화학치료 약물(들) 및 특히 하나 이상의 항생물질 화학치료와 관련하여 사용하기 위한, 면역원성 조합물, 융합 폴리펩티드, 핵산 분자, 벡터, 숙주 세포 또는 조성물.
43. 제37항 내지 제42항 중의 어느 한 항에 있어서, 투여된 대상체에서 면역 반응을 유도하거나 증강시키기 위한, 면역원성 조합물, 융합 폴리펩티드, 핵산 분자, 벡터, 숙주 세포 또는 조성물.
44. 제43항에 있어서, 상기 유도 또는 자극된 면역 반응이 마이코박테리아 항원/에피토프에 대한 CD4+ 및/또는 CD8+-매개된 T 세포 반응인, 면역원성 조합물, 융합 폴리펩티드, 핵산 분자, 벡터, 숙주 세포 또는 조성물.
45. 제1항 내지 제13항 중의 어느 한 항의 면역원성 조합물 또는 제14항 내지 제20항 중의 어느 한 항의 융합 폴리펩티드, 제21항 및 제22항 중의 어느 한 항의 핵산 분자, 제23항 내지 제30항 중의 어느 한 항의 벡터, 제32항의 숙주 세포 또는 제35항 및 제36항 중의 어느 한 항의 조성물이 포함되거나 이에 의해 코딩된 적어도 하나의 마이코박테리아 항원에 선택적으로 결합하는 항체.
46. 마이코박테리움에 의해 감염되거나 감염되기 쉬운 대상체로부터 채취한 생물학적 샘플에서 마이코박테리아 항원을 검출 및/또는 정량화하는 방법으로서,
    상기 생물학적 샘플을 마이코박테리아 항원과 항체 시약 사이에서 복합체의 형성을 가능하게 하는 조건하에 시약으로서 제45항의 항체와 접촉시키는 단계 및
    상기 복합체의 형성을 임의의 적절한 수단에 의해 검출 및/또는 정량화하는 단계를 포함하는, 방법.
47. 제45항의 항체를 포함하는 항원 분석, 및 제1항 내지 제13항 중의 어느 한 항의 면역원성 조합물 또는 제14항 내지 제20항 중의 어느 한 항의 융합 폴리펩티드, 제21항 및 제22항 중의 어느 한 항의 핵산 분자, 제23항 내지 제30항 중의 어느 한 항의 벡터, 제32항의 숙주 세포 또는 제35항 및 제36항 중의 어느 한 항의 조성물을 포함하는 항체 분석을 위해 마이코박테리움 감염을 진단하기 위한 시약 키트.
    

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