KR20210011937A - 미코박테리아 항원 조성물 및 사용 방법 - Google Patents

미코박테리아 항원 조성물 및 사용 방법 Download PDF

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KR20210011937A
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패트릭 핸리
마이클 캘러
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칠드런스 내셔널 메디컬 센터
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Abstract

본 개시내용은 적어도 부분적으로, 마이코박테리아 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드, 그의 단편 또는 변이체, 마이코박테리아 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드를 포함하는 세포, 생체 외에서 T 세포를 확장하도록 조작된 마이코박테리아 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드를 포함하는 세포, 및 그의 사용 방법에 관한 것이다.

Description

미코박테리아 항원 조성물 및 사용 방법
관련 출원의 교차 참조
본 출원은 2018년 4월 26일에 출원된 임시 미국 출원 제62/663,239호의 이익을 주장하며, 그 전체가 모든 목적을 위해 본원에 참고로 포함된다.
기술분야
본 발명은 일반적으로 마이코박테리아 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드를 포함하는 신규한 면역성 조합, 그의 단편 또는 변이체, 및 이러한 조합된 항원을 포함하는 세포에 관한 것이며, 여기서 항원은 마이코박테리움(Mycobacterium) 종으로부터 유래된다.
마이코박테리아는 면역 약화된 환자에서 잠재적으로 심각한 기회 감염의 원인인 편재성 병원균이다. 마이코박테리아 감염의 치료는 광범위한 항균 저항성에 의해 복잡하며, 이는 종종 다수의 약제에 의한 항생제 과정이 필요하다.
T 세포 결핍은 침습성 마이코박테리아 감염의 높은 위험을 부여하기 때문에, 마이코박테리아에 대한 T 세포 면역이 마이코박테리아 감염을 제어하고 예방하는데 중요하다는 증거가 있다.
마이코박테리아 감염의 증가하는 위협 및 세계적인 유행을 고려하여, 마이코박테리아 감염의 보다 효과적인 예방, 치료 및 진단을 위한 새로운 전략이 필요하다.
본 개시내용은 적어도 부분적으로 마이코박테리아 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드, 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함하는 조성물, 및 이러한 조성물을 T 세포와 같은 세포에 노출시키는 것에 관한 것이다. 본 개시내용은 또한 적어도 부분적으로 마이코박테리아 폴리펩티드를 발현하는 폴리뉴클레오티드 및/또는 폴리펩티드 마이코박테리아, 또는 그의 단편 또는 변이체를 포함하는 조성물, 및 이러한 조성물을 T 세포와 같은 세포에 노출시키는 것에 관한 것이다. 본 개시내용은 또한 마이코박테리아 폴리펩티드를 발현하는 폴리뉴클레오티드 및/또는 마이코박테리아 폴리펩티드, 또는 그의 단편 또는 변이체를 포함하는 세포, 및 (i) 폴리뉴클레오티드가 폴리펩티드를 발현하고 세포 또는 세포들 내에서 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 폴리펩티드에 대한 항원-특이적 면역 반응을 자극하고/하거나; (ii) 폴리펩티드에 대한 항원-특이적 면역 반응을 자극하기에 충분한 시간 동안 세포에 폴리뉴클레오티드 및/또는 폴리펩티드를 노출시키는 것을 포함하는 세포 프라이밍 방법에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용은 생체 외 T 세포 확장, 및 그의 사용 방법에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, T 세포는 나이브 T 세포이다. 일부 실시형태에서, T 세포는 마이코박테리아에 노출되지 않은 대상체로부터의 나이브 T 세포이다. 일부 실시형태에서, T 세포는 마이코박테리아 감염에 걸리지 않은 대상체로부터의 나이브 T 세포이다. 일부 실시형태에서, T 세포는 본원에 개시된 하나 또는 복수의 마이코박테리움 종으로부터 마이코박테리아 감염에 걸리지 않은 대상체로부터의 나이브 T 세포이다. 일부 실시형태에서, T 세포는 마이코박테리아 감염에 걸리지 않은 대상체로부터의 나이브 T 세포이다. 일부 실시형태에서, T 세포는 대상체로부터 분리된 나이브 T 세포이다. 본 개시내용은 또한 부분적으로 건강한 공여자로부터의 인간 T 세포가 다양한 마이코박테리아 항원, 특정 실시형태에서 항원 Ag85B, PPe68, P9WNK7, ESXA, ESXB 및 ADK를 포함하는 중첩 합성 펩티드 풀(pool)을 사용하는 신속한 생체 외 확장 프로토콜을 사용하여 확장될 수 있다는 놀라운 발견에 기초한다.
일 양태에서, 본 개시내용은 마이코박테리움 종으로부터의 Ag85B 항원 또는 이의 기능적 단편을 코딩하는 핵산 서열, 마이코박테리움 종으로부터의 PPE68 항원 또는 이의 기능적 단편을 코딩하는 핵산, 마이코박테리움 종으로부터의 ESXA 항원 또는 이의 기능적 단편을 코딩하는 핵산, 마이코박테리움 종으로부터 ESXB 항원 또는 이의 기능적 단편을 코딩하는 핵산, 마이코박테리움 종으로부터의 ADK 항원 또는 이의 기능적 단편을 코딩하는 핵산, 또는 이들의 조합을 포함하는 조성물을 특징으로 한다. 일부 실시형태에서, Ag85B 항원 또는 이의 기능적 단편을 코딩하는 핵산 서열은 서열번호 1과 적어도 50% 동일하다. 일부 실시형태에서, Ag85B 항원 또는 이의 기능적 단편을 코딩하는 핵산 서열은 서열번호 1과 적어도 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일하다. 일부 실시형태에서, PPE68 항원 또는 이의 기능적 단편을 코딩하는 핵산 서열은 서열번호 2와 적어도 50% 동일하다. 일부 실시형태에서, PPE68 항원 또는 이의 기능적 단편을 코딩하는 핵산 서열은 서열번호 2와 적어도 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일하다. 일부 실시형태에서, ESXA 항원 또는 이의 기능적 단편을 코딩하는 핵산 서열은 서열번호 3과 적어도 50% 동일하다. 일부 실시형태에서, ESXA 항원 또는 이의 기능적 단편을 코딩하는 핵산 서열은 서열번호 3과 적어도 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일하다. 일부 실시형태에서, ESXB 항원 또는 이의 기능적 단편을 코딩하는 핵산 서열은 서열번호 4와 적어도 50% 동일하다. 일부 실시형태에서, ESXB 항원 또는 이의 기능적 단편을 코딩하는 핵산 서열은 서열번호 4와 적어도 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일하다. 일부 실시형태에서, ADK 항원 또는 이의 기능적 단편을 코딩하는 핵산 서열은 서열번호 5와 적어도 50% 동일하다. 일부 실시형태에서, ADK 항원 또는 이의 기능적 단편을 코딩하는 핵산 서열은 서열번호 5와 적어도 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일하다.
다른 양태에서, 본 개시내용은 마이코박테리움 종으로부터 Ag85B 항원을 코딩하는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드, 마이코박테리움 종으로부터 PPE68 항원을 코딩하는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드, 마이코박테리움 종으로부터 ESXA 항원을 코딩하는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드, 마이코박테리움 종으로부터 ESXB 항원을 코딩하는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드, 마이코박테리움 종으로부터 ADK 항원을 코딩하는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드, 또는 이들의 조합을 포함하는 조성물을 특징으로 한다. 일부 실시형태에서, Ag85B 항원을 코딩하는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드는 서열번호 6과 약 50% 동일하다. 일부 실시형태에서, Ag85B 항원을 코딩하는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드는 서열번호 6과 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일하다. 일부 실시형태에서, PPE68 항원을 코딩하는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드는 서열번호 7과 50% 동일하다. 일부 실시형태에서, PPE68 항원을 코딩하는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드는 서열번호 7과 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일하다. 일부 실시형태에서, ESXA 항원을 코딩하는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드는 서열번호 8과 50% 동일하다. 일부 실시형태에서, ESXA 항원을 코딩하는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드는 서열번호 8과 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일하다. 일부 실시형태에서, ESXB 항원을 코딩하는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드는 서열번호 9와 50% 동일하다. 일부 실시형태에서, ESXB 항원을 코딩하는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드는 서열번호 9와 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일하다. 일부 실시형태에서, ADK 항원을 코딩하는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드는 서열번호 10과 약 50% 동일하다. 일부 실시형태에서, ADK 항원을 코딩하는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드는 서열번호 10과 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일하다. 다른 실시형태에서, 하나 이상의 아미노산 서열은 Ag85B, PPE68, ESXA, ESXB 및 ADK 항원의 일부 또는 전부에 걸쳐서 서열이 중첩된다. 임의의 상기 양태 또는 실시형태의 일부 실시형태에서, 마이코박테리움 종은 M. 투베르쿨로시스(tuberculosis), M. 보비스(bovis), M. 보비스(bovis) BCG, M. 아비움(avium), M. 압세수스(abscessus), M. 케로나에(chelonae), M. 칸사시이(kansasii), M. 아프리카눔(africanum), M. 카네티(canetti), M. 카프래(caprae), M. 미크로트(microt), M. 문지(mungi), M. 오리기스(orygis), M. 아비움(avium), M. 아비움 파라투베르쿨로시스(avium paratuberculosis), M. 아비움 실바티쿰(avium silvaticum), M. 콜룸비엔세(columbiense), M 인트라셀룰라레(intracellulare), M. 고르도내(gordonae), M. 울세란스(ulcerans), M. 게나벤세(genavense), M. 스크로풀라세움(scrofulaceum), M. 인터메디움(intermedium), M. 포르투이툼(fortuitum), 및 M. 무코게니쿰(mucogenicum)으로 구성된 군으로부터 선택된다. 임의의 상기 양태 또는 실시형태의 다른 실시형태에서, 조성물은 면역 세포를 자극하기 위해 사용된다. 일부 실시형태에서, 면역 세포를 자극하는 것은 면역 세포를 활성화하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 면역 세포를 자극하는 것은 면역 세포를 확장시키는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 면역 세포는 CD8+ T 세포이다. 일부 실시형태에서, 면역 세포는 NK 세포이다. 일부 실시형태에서, 면역 세포는 CD4+ T 세포이다.
다른 양태에서, 본 개시내용은 (i) 서열번호 1과 적어도 약 50% 동일한 Ag85B 항원을 코딩하는 핵산 서열, 서열번호 2와 적어도 약 50% 동일한 PPE68 항원을 코딩하는 핵산 서열, 서열번호 3과 적어도 약 50% 동일한 ESXA 항원을 코딩하는 핵산 서열, 서열번호 4와 적어도 약 50% 동일한 ESXB 항원을 코딩하는 핵산 서열, 서열번호 5와 적어도 약 50% 동일한 ADK 항원을 코딩하는 핵산 서열, 또는 이들의 조합; (ii) 서열번호 6과 적어도 약 50% 동일한 Ag85B 항원을 코딩하는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 7과 적어도 약 50% 동일한 PPE68 항원을 코딩하는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 8과 적어도 약 50% 동일한 ESXA 항원을 코딩하는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 9와 적어도 약 50% 동일한 ESXB 항원을 코딩하는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 10과 적어도 약 50% 동일한 ADK 항원을 코딩하는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는 이들의 조합; (iii) 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4 또는 서열번호 5의 핵산 서열의 기능적 단편을 코딩하는 (i)의 핵산, 및 (iv) 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9 또는 서열번호 10의 아미노산 서열의 기능적 단편을 코딩하는 (ii)의 아미노산 서열 중 하나 또는 조합을 포함하는 세포 또는 복수의 세포들을 특징으로 한다. 일부 실시형태에서, 세포는 헬퍼(helper) (CD4+) T 세포이다. 일부 실시형태에서, 세포는 세포 독성 (CD8+) T 세포이다. 일부 실시형태에서, 세포는 감마/델타 T 세포이다. 일부 실시형태에서, 세포는 중앙 메모리 T 세포이다. 일부 실시형태에서, 세포는 이펙터(effector) 메모리 T 세포이다. 일부 실시형태에서, CD4+ T 세포는 전체 T 세포 집단의 약 60% 내지 약 90%를 차지한다. 일부 실시형태에서, CD8+ T 세포는 전체 T 세포 집단의 약 0% 내지 약 40%를 차지한다. 일부 실시형태에서, 감마/델타 T 세포는 전체 T 세포 집단의 약 0.5% 내지 약 10%를 차지한다. 일부 실시형태에서, 중앙 메모리 T 세포는 전체 T 세포 집단의 약 0.5% 내지 약 15%를 차지한다. 일부 실시형태에서, 중앙 메모리 T 세포는 전체 T 세포 집단의 약 20% 내지 약 60%를 차지한다. 일부 실시형태에서, 복수의 세포는 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포를 포함하며, 여기서 CD8+ T 세포의 수는 CD4+ T 세포의 수보다 많다. 다른 실시형태에서, 세포는 인간 대상체로부터 유래된다. 추가 실시형태에서, 인간 대상체는 면역 약화된다. 다른 추가 실시형태에서, 인간 대상체는 마이코박테리아 감염을 갖는 것으로 진단되었거나 의심된다. 일부 실시형태에서, 세포 또는 복수의 세포들은 세포 배양에서 확장된다. 일부 실시형태에서, 세포 또는 복수의 세포들은 적어도 하나의 1차 T 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포는 항원 제시 세포(APC)이다. 다른 실시형태에서, APC 세포는 인공 항원 제시 세포이다. 일부 실시형태에서, 세포는 대식 세포이다. 일부 실시형태에서, 세포는 가지 세포이다. 임의의 상기 양태 또는 실시형태의 일부 실시형태에서, 조성물은 마이코박테리아 종으로부터의 하나 이상의 항원을 추가로 포함하며, 여기서 하나 이상의 항원은 표 1에 제공된다.
Figure pct00001
임의의 상기 양태 또는 실시형태의 다른 실시형태에서, 세포는, 마이코박테리움 종으로부터 Ag85B 항원을 코딩하는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드, 마이코박테리움 종으로부터 PPE68 항원을 코딩하는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드, 마이코박테리움 종으로부터 ESXA 항원을 코딩하는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드, 마이코박테리움 종으로부터 ESXB 항원을 코딩하는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드, 마이코박테리움 종으로부터 ADK 항원을 코딩하는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드, 또는 이들의 조합을 발현할 수 있다.
다른 양태에서, 본 개시내용은 생체 외 T 세포를 확장하도록 조작된(engineered) 세포를 특징으로 하며, 여기서 세포는 Ag85B, PPE68, ESXA, ESXB 및 ADK로부터 선택된 적어도 5개의 항원을 포함하고, 여기서 세포는 각각이 적어도 5개의 항원 중 하나 이상을 코딩하는 하나 이상의 핵산을 세포 내로 도입하는 단계; 및 하나 이상의 항원의 생산에 적합한 조건 하에서 세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법에 의해 생산된다. 일부 실시형태에서, 세포는 T 세포, B 세포, 단핵구, 가지 세포, 피토해마글루티닌 블라스트(Phytohemagglutinin blasts)를 포함하는 항원 제시 세포, 또는 K562와 같은 불멸화된 세포 또는 다른 세포주에 기초한 인공 항원 제시 세포이다. 일부 실시형태에서, 핵산은 DNA 또는 RNA를 포함한다. 일부 실시형태에서, 도입 단계는 바이러스 형질 도입을 포함한다. 일부 실시형태에서, 도입 단계는 전기 천공을 포함한다. 다른 실시형태에서, 본 개시내용은 본원의 임의의 양태 또는 실시형태의 하나 또는 복수의 세포를 포함하는 조성물을 특징으로 한다.
다른 양태에서, 본 개시내용은 (i) 본원의 임의의 양태 및 실시형태의 조성물의 제약 유효량; 및 (ii) 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물을 특징으로 한다. 다른 양태에서, 본 개시내용은 마이코박테리아 감염의 치료를 필요로 하는 대상체에서 이의 치료를 위한, (i) 본원의 임의의 양태 및 실시형태의 조성물의 제약 유효량, 및 (ii) 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물을 특징으로 한다. 다른 양태에서, 본 개시내용은 대상체에서 마이코박테리아 감염의 치료 또는 예방을 위한, (i) 본원의 임의의 양태 및 실시형태의 조성물의 제약 유효량, 및 (ii) 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물을 특징으로 한다. 일부 실시형태에서, 대상체는 면역 약화된다. 일부 실시형태에서, 대상체는 장기 이식을 갖거나, 갖는 것으로 확인된다. 일부 실시형태에서, 대상체는 면역 약화된다. 일부 실시형태에서, 대상체는 암을 갖거나, 갖는 것으로 확인된다. 일부 실시형태에서, 대상체는 면역 약화된다. 일부 실시형태에서, 대상체는 혈액 암을 갖거나, 갖는 것으로 확인된다.
다른 양태에서, 본 개시내용은 (i) 본원의 임의의 양태 및 실시형태의 하나 또는 복수의 세포의 제약 유효량; 및 (ii) 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물을 특징으로 한다.
다른 양태에서, 본 개시내용은 생체 외 T 세포를 확장하는 방법을 특징으로 하는 바, 본 방법은 (a) 하나 또는 복수의 T 세포를 배양하는 단계; (b) 복수의 T 세포를, 마이코박테리움 종으로부터 Ag85B 항원을 코딩하는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드, 마이코박테리움 종으로부터 PPE68 항원을 코딩하는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드, 마이코박테리움 종으로부터 ESXA 항원을 코딩하는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드, 마이코박테리움 종으로부터 ESXB 항원을 코딩하는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드, 마이코박테리움 종으로부터 ADK 항원을 코딩하는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드, 또는 이들의 조합과 접촉시키거나; 또는 복수의 T- 세포를, 본원의 임의의 양태 또는 실시형태의 조성물 또는 본원의 임의의 양태 또는 실시형태의 제약 조성물과 접촉시키는 단계를 포함한다.
다른 양태에서, 본 개시내용은 생체 외 T 세포를 확장하는 방법을 특징으로 하는 바, 본 방법은 (a) 하나 또는 복수의 분리된 T 세포를 배양하는 단계; (b) 복수의 T 세포를 항원 제시 세포와 접촉시키는 단계를 포함하며, 여기서 항원 제시 세포는 마이코박테리움 종으로부터 Ag85B 항원을 코딩하는 아미노산 서열 또는 그의 단편, 마이코박테리움 종으로부터 PPE68 항원을 코딩하는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드, 마이코박테리움 종으로부터 ESXA 항원을 코딩하는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드, 마이코박테리움 종으로부터 ESXB 항원을 코딩하는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드, 마이코박테리움 종으로부터 ADK 항원을 코딩하는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드, 또는 이들의 조합을 발현하는 것을 제시한다. 일부 실시형태에서, 방법은 하나 이상의 시토카인으로 하나 또는 복수의 T 세포를 자극하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 시토카인은 IL-4, IL-7, IL-15, IL-21, TNFβ 및 IFNα로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 방법은 단계 (a) 전에 대상체로부터 샘플을 분리하는 것과 샘플로부터 T 세포를 분리하는 것을 추가로 포함한다.
다른 양태에서, 본 개시내용은 마이코박테리움 감염의 치료를 필요로 하는 대상체에서 마이코박테리움 감염을 치료하는 방법을 특징으로 하는 바, 본 방법은 본원의 임의의 양태 또는 실시형태의 조성물, 또는 본원의 임의의 양태 또는 실시형태의 제약 조성물의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 대상체는 면역 약화된 숙주이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 마이코박테리움 종에 의한 감염을 갖는 것으로 진단되거나 의심된다. 일부 실시형태에서, 감염은 활성 감염이다.
다른 양태에서, 본 개시내용은 마이코박테리움에 의한 감염의 예방 또는 지연을 필요로 하는 대상체에서 마이코박테리움에 의한 감염을 예방 또는 지연시키는 방법을 특징으로 하는 바, 본 방법은 본원의 임의의 양태 또는 실시형태의 조성물, 또는 본원의 임의의 양태 또는 실시형태의 제약 조성물의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 임의의 상기 양태 또는 실시형태의 일부 실시형태에서, 마이코박테리움 종은 M. 투베르쿨로시스, M. 보비스, M. 보비스 BCG, M. 아비움, M. 압세수스, M. 케로나에, M. 칸사시이, M. 아프리카눔, M. 카네티, M. 카프래, M. 미크로트, M. 문지, M. 오리기스, M. 아비움, M. 아비움 파라투베르쿨로시스, M. 아비움 실바티쿰, M. 콜룸비엔세, M 인트라셀룰라레, M. 고르도내, M. 울세란스, M. 게나벤세, M. 스크로풀라세움, M. 인터메디움, M. 포르투이툼, 및 M. 무코게니쿰으로 구성된 군으로부터 선택된다. 임의의 상기 양태 또는 실시형태의 일부 실시형태에서, 대상체는 면역 약화된다. 임의의 상기 양태 또는 실시형태의 일부 실시형태에서, 대상체는 21세 미만의 아동이다. 임의의 상기 양태 또는 실시형태의 일부 실시형태에서, 대상체는 12세 미만의 아동이다.
도 1은 마이코박테리아-특이적 T 세포의 생체 외 확장의 제조 개요(schema)를 도시한다. 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)는 열거된 마이코박테리아 항원을 포함하는 중첩되는 펩티드 풀로 자극되고 10 내지 12일 동안 시토카인과 함께 G-Rex-10 생물 반응기에서 배양된다.
도 2a는 BCG 면역화된 공여자 및 비-BCG 백신 접종된 공여자 모두에서 10 일째에 다수의 마이코박테리아 항원에 대한 특이성을 나타낸 생체 외 확장된 MST의 IFN- γ ELISpot을 도시한다.
도 2b는 PPE68 (*p = 0.028) 및 ADK (**p = 0.015)에 대한 응답에서 그룹들 간의 유의한 차이가 나타났음을 도시한다. SFC, 스팟 형성 콜로니.
도 3a는 4.4 BCG- = BCG 비면역화; BCG+ = BCG 면역화의 평균 배 확장을 갖는 배양 동안 확장된 마이코박테리아 특이적 T 세포를 도시한다.
도 3b는 확장 후 MST의 표면 표현형이 큰 이펙터 메모리 집단 및 더 작은 중앙 메모리 집단을 갖는 CD4+ T 세포의 우세를 나타냄을 도시한다. 선, 중앙값.
도 3c는 공여자 9에서 확장된 MTS의 예시 플롯이 최소의 나이브 T 세포(Tn)를 갖는 큰 CD4+ 이펙터 메모리 (TEM) 집단 및 더 작은 이펙터 (Teff) 및 중앙 메모리 (Tcm) 집단을 보여주는 것을 도시한다.
도 4는 건강한 공여자로부터 확장된 MST가 다기능성이라는 것을 도시한다. 세포 내 유세포 분석은 건강한 공여자로부터 확장된 MST의 CD4+ T 세포에서만 마이코박테리아 펩믹스(pepmix) 재 자극에 반응하여 IFN-γ 및 TNF의 생산을 입증했으며, CD8+ T 세포에서는 반응이 보이지 않았다.
도 5a는 일차 면역 결핍 장애 (PID)를 가진 환자로부터 확장된 T 세포의 IFN-γ ELISpot이 NFKB1 반수체 부족(hapioinsufficiency)을 가진 환자를 제외하고는 마이코박테리아 항원에 대한 반응이 없는 것으로 감소된 것을 도시한다. IFN-γ 자가 항체를 가진 2명의 환자는 검출 가능한 반응을 보였다. SEB, 포도상 구균 장독소 B; CID, 조합된 면역 결핍.
도 5b는 PID 환자로부터의 T 세포의 생체 외 배양이 2명의 환자를 제외한 모든 환자에서 확장을 나타내지 않음을 도시한다.
도 6은 MST 반응이 펩티드 자극 대 용해물 또는 센시틴(sensitin)을 사용하여 비교 가능한 것을 도시한다. TB 용해물 또는 M 아비움 센시틴을 사용하여 확장된 MST의 IFN-γ ELISpot은 다수의 마이코박테리아(mycobactieral) 펩믹스에 특이성을 나타냈으며, 이는 용해물 또는 센시틴에 의한 재자극에 대한 반응과 크기가 유사했다. 반응의 차이는 PPE68 (*p = 0.032)에서만 유의했다. SFC, 스팟 형성 콜로니; SEB, 포도상 구균 장독소 B.
도 7a는 AG85B 및 ESXB의 에피토프 매핑을 도시한다.
도 7b는 IFN-γ ELISpot을 통한 AG85B 및 ESXB의 에피토프 매핑이 AG85B로부터 8개의 펩티드 및 다수의 건강한 공여자로부터 MST에 의해 인식된 ESXB로부터 3개의 펩티드를 보여줌을 도시한다. SFC, 스팟 형성 콜로니; SEB, 포도상 구균 장독소 B.
도 8은 표면 착색 유세포 분석을 위한 게이팅 전략을 도시한다. CD14/CD19는 제외 게이팅을 위해 결합된다. LD = 살아 있음/죽음.
도 9는 세포 내 유세포 분석을 위한 게이팅 전략을 도시한다. LD = 살아 있음/죽음.
도 10은 펩믹스, 센시틴 및 용해물을 사용하여 생산된 MST의 표면 면역 표현형이 다른 성장 조건에 대해 T 세포 서브 세트에서 최소 차이를 보여 주었다는 것을 도시한다. 확장된 세포는 주로 CD4+ 이펙터 메모리 T 세포(CD4+/CD45RO+/CCR7-)였으며, 더 작은 중앙 메모리 집단(CD4/CD45RO+/CCR7+/CD62L+)을 가진다.
도 11은 마이코박테리아 종에 걸쳐 중간 내지 높은 보존을 보여 준 AG85B로부터 확인된 T 세포 에피토프의 분석을 제공한다. 펩티드 7 표는 위에서 아래로 서열번호 17, 18, 19, 20, 21 및 22를 시작한다. 펩티드 14 표는 위에서 아래로 서열번호 23, 24, 25, 26, 27, 28이다. 펩티드 15 표는 위에서 아래로 서열번호 29, 30, 31, 32, 33, 34로 시작한다. 펩티드 19 표는 위에서 아래로 서열번호 35, 36, 37, 38, 39, 40을 시작한다.
도 12는 마이코박테리아 종에 걸쳐 낮음 내지 중간 보존을 보여 준 ESXB로부터 확인된 T 세포 에피토프의 분석을 제공한다. 펩티드 8 표는 위에서 아래로 서열번호 41, 42, 43, 44, 45 및 46을 시작한다. 펩티드 9 표는 위에서 아래로 서열번호 47, 48, 49, 50, 51, 52이다. 펩티드 10 표는 위에서 아래로 서열번호 53, 54, 55, 56, 57, 58로 시작한다.
본 조성물 및 방법을 설명하기 전에, 본 개시내용은 설명된 특정 분자, 조성물, 방법 또는 프로토콜이 다양할 수 있기 때문에 이들에 제한되지 않는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 설명에서 사용된 용어는 단지 특정 버전 또는 실시형태를 설명하기 위한 것이며 첨부된 청구범위에 의해서만 제한되는 본 개시내용의 범위를 제한하려는 것이 아님이 이해되어야 한다. 이들 실시형태는 설명된 특정 방법, 프로토콜, 세포주, 벡터 및 시약이 다양할 수 있기 때문에 이들에 제한되지 않는 것으로 이해된다. 또한 본원에서 사용된 용어는 단지 특정 실시형태를 설명하기 위한 것이며, 본 실시형태 또는 청구범위의 범위를 제한하려는 것이 아님이 이해되어야 한다. 또한, 설명 및 청구범위에서 용어 제1, 제2, 제3 등은 유사한 요소들을 서로 구별하기 위해 사용되며 반드시 순차적 또는 연대적 순서를 설명하기 위해 사용되는 것은 아니다. 그렇게 사용된 용어는 적절한 환경 하에서 상호 교환될 수 있으며 본원에 설명된 개시내용의 실시형태는 본원에 설명되거나 예시된 것과 다른 순서로 작동될 수 있다는 것이 이해되어야 한다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 당업자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 설명된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 재료가 본 개시내용의 실시형태의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법, 장치 및 재료가 이제 설명된다. 본원에 언급된 모든 간행물은 참조로 포함된다. 본원의 어떠한 내용도 본 개시내용이 이전 개시내용으로 인해 그러한 개시내용을 선행할 자격이 없다는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 안된다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용된 바와 같이, 단수 형태의 표현(영문의 "a", "an" 및 "the"에 대응)은 문맥이 달리 명확하게 지시하지 않는 한 복수의 지시 대상을 포함한다.
본원에서 양, 시간적 지속기간 등과 같은 측정 가능한 값을 언급할 때 사용되는 용어 "약"은 특정된 값에서 ±20%, ±10%, ±5%, ±1%, ±0.9%, ±0.8%, ±0.7%, ±0.6%, ±0.5%, ±0.4%, ±0.3%, ±0.2% 또는 ±0.1%의 변동을 포함하는 것을 의미하며, 이는 그러한 변동이 개시된 방법을 수행하기 위해 적절하기 때문이다.
본원의 명세서 및 청구범위에서 본원에 사용된 "및/또는"의 문구는 이렇게 결합된 요소들, 즉 일부 경우에 결합적으로 존재하고 다른 경우에는 분리적으로 존재하는 요소들의 "어느 하나 또는 둘 모두"를 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 반대로 명확하게 지시되지 않는 한, 구체적으로 식별된 요소와 관련되거나 무관하거나 관계없이 "및/또는"의 구절에 의해 구체적으로 식별된 요소 외에 다른 요소가 선택적으로 존재할 수 있다. 따라서, 비제한적인 예로서, "포함함"과 같은 개방형 언어와 함께 사용될 때 "A 및/또는 B"에 대한 언급은, 일부 실시형태에서 B가 없는 A (선택적으로 B 이외의 다른 요소를 포함함); 다른 실시형태에서는 A가 없는 B(선택적으로 A 이외의 다른 요소를 포함함); 또 다른 실시형태에서는 A와 B 모두(선택적으로 다른 요소를 포함함)를 지칭할 수 있다.
본원의 명세서 및 청구범위에서 사용된 "또는"은 상기 정의된 "및/또는"과 동일한 의미를 갖는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 목록에서 항목을 구분할 때, "또는" 또는 "및/또는"은 포괄적인 것, 즉, 적어도 하나를 포함할 뿐만 아니라 요소의 수 또는 목록 및 선택적으로 추가적인 비열거된 항목 중 하나 초과를 포함하는 것으로 해석될 것이다. "~ 중 하나만" 또는 "~ 중 정확히 하나" 또는 청구범위에서 사용되는 경우의 "~만으로 구성됨"과 같이 명확하게 반대로 지시되는 용어만이 요소들의 수 또는 목록 중 정확히 하나의 요소를 포함하는 것을 의미한다. 일반적으로, 본원에서 사용되는 용어 "또는"은 단지 배타성의 용어인 "둘 중 하나", "~중 하나", "~중 하나만" 또는 "~중 정확히 하나"의 용어가 선행될 때 배타적 대안(즉, "하나 또는 다른 것이지만, 둘 다는 아님")을 나타내는 것으로 해석될 것이며; 청구범위에서 사용되는 경우 "~으로 본질적으로 구성됨"은 특허법 분야에서 사용되는 일반적인 의미를 가질 것이다.
본원에서 사용되는 "X 내지 Y의 정수"라는 구절은 종점을 포함하는 임의의 정수를 의미한다. 즉, 범위가 개시된 경우, 종점을 포함하는 범위의 각 정수가 개시된다. 예를 들어, "X 내지 Y의 정수"라는 구절은 1, 2, 3, 4 또는 5뿐만 아니라 1 내지 5의 범위를 개시한다.
본원에서 제품, 조성물 및 방법을 정의하는 데 사용되는 용어 영어 "포함하는"(및 "포함한다" 및 "포함함"과 같은 '포함하는'의 임의의 형태), "갖는"(및 "갖는다" 및 "가짐"과 같은 '갖는'의 임의의 형태), "구비하는"(및 "구비한다" 및 "구비함"과 같은 '구비하는'의 임의의 형태) 또는 "함유하는"(및 "함유한다" 및 "함유함"과 같은 '함유하는'의 임의의 형태)은 개방형이며 추가의 기재되지 않은 요소 또는 방법 단계를 배제하지 않는다. 따라서, 폴리펩티드는 아미노산 서열이 폴리펩티드의 최종 아미노산 서열의 일부일 수 있는 경우 아미노산 서열을 "포함한다". 이러한 폴리펩티드는 최대 수백 개의 추가적인 아미노산 잔기를 가질 수 있다(예를 들어, 본원에 언급된 바와 같은 태그 및 타겟팅 펩티드). "본질적으로 구성되는"은 본질적으로 중요한 다른 성분 또는 단계를 제외하는 것을 의미한다. 따라서, 기재된 성분으로 본질적으로 구성된 조성물은 미량의 오염물 및 제약상 허용되는 담체를 배제하지 않을 것이다. 폴리펩티드는 아미노산 서열이 궁극적으로 단지 몇개의 추가 아미노산 잔기와 함께 존재할 때 그러한 아미노산 서열로 "본질적으로 구성된다". "~만으로 구성되는"은 다른 성분 또는 단계의 미량 요소의 초과를 배제하는 것을 의미한다. 예를 들어, 폴리펩티드는 임의의 아미노산을 함유하지 않지만 기재된 아미노산 서열을 포함할 때 아미노산 서열만으로 구성된다.
본원에 사용된 "실질적으로 동일"은 주어진 측정 기준에서 비정상 또는 정상 범위와 상관되는 것으로 알려진 범위 내를 의미한다. 예를 들어, 대조군 샘플이 질병에 걸린 환자로부터 유래된다면 실질적으로 동일함은 비정상 범위 내에 있다. 대조군 샘플이 시험되는 상태를 갖지 않는 것으로 알려진 환자로부터 유래된다면, 실질적으로 동일함은 주어진 측정 기준에 대한 정상 범위 내에 있다.
본원에서 사용되는 용어 "대상체", "개체" 또는 "환자"는 상호 교환적으로 사용되며, 마우스, 래트, 기타 설치류, 토끼, 개, 고양이, 돼지, 소, 양, 말과 같은 포유류, 또는 인간과 같은 영장류를 포함하는 임의의 동물을 의미한다. 일부 실시형태에서, 대상체 또는 환자는 약 20세 이하의 인간 아동이다. 일부 실시형태에서, 대상체 또는 환자는 약 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1세 이하의 인간 아동이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 암 진단을 받았거나 암을 갖고 있다. 일부 실시형태에서, 대상체는 골수 이식과 같은 장기 이식을 받았다. 일부 실시형태에서, 실시형태가 T 세포의 자극 또는 프라이밍을 위해 공여자로부터 하나 또는 복수의 세포를 분리하는 방법에 관한 것인 경우 대상체는 T 세포 공여자이다.
용어 "대상체"는 명세서 전체에 걸쳐 세포 샘플이 채취된 동물을 설명하기 위해 사용된다. 일부 실시형태에서, 대상체는 인간이다. 인간과 같은 특정 대상체에 특이적인 상태의 진단을 위해, 용어 "환자"는 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 본 발명의 설명에서 일부 경우에, 용어 "환자"는 특정 질환 또는 장애를 앓고 있는 인간 환자를 지칭할 것이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 마이코박테리움에 감염된 것으로 의심되거나 감염으로 발전할 위험이 있는 것으로 확인되는 인간일 수 있다. 일부 실시형태에서, 대상체는 마이코박테리움에 감염된 것으로 진단될 수 있고 마이코박테리움에 감염된 것으로 의심되거나 감영으로 발전할 위험이 있는 것으로 확인될 수 있다.
본원에 사용된 "면역 약화된 대상체"는 일차 면역 결핍 장애, 화학 요법 또는 면역 억제 요법을 받는 환자, 또는 조혈 줄기 세포 이식을 받는 환자를 포함하지만 이에 제한되지 않는 적응성 또는 선천성 면역에 선천적 또는 후천적 결함이 있는 대상체를 의미한다. 일부 실시형태에서, 대상체는 면역 약화된 성인 또는 아동이다.
본원에 사용된 용어 "동물"은 인간 및 비인간 척추 동물, 예컨대 야생 동물, 설치류, 예컨대 래트, 흰족제비 및 가축, 및 농장 동물, 예컨대 개, 고양이, 말, 돼지, 소, 양 및 염소를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시형태에서, 동물은 포유동물이다. 일부 실시형태에서, 동물은 인간이다. 일부 실시형태에서, 동물은 비인간 포유동물이다.
본원에서 사용된 용어 "포유동물"은 포유류 클래스의 임의의 동물, 예컨대 설치류(즉, 마우스, 래트 또는 기니 피그), 원숭이, 고양이, 개, 소, 말, 돼지 또는 인간을 의미한다. 일부 실시형태에서, 포유동물은 인간이다. 일부 실시형태에서, 포유동물은 임의의 비인간 포유동물을 지칭한다. 본 개시내용은 본원에 개시된 임의의 방법 또는 물질의 조성물에 관한 것이며, 여기서 샘플은 포유동물 또는 비인간 포유동물부터 채취된다. 본 개시내용은 본원에 개시된 임의의 방법 또는 물질의 조성물에 관한 것이며, 여기서 샘플은 인간 또는 비인간 영장류부터 채취된다.
본원에 사용된 "필요로 하는"이라는 구절은 동물 또는 포유동물이 특정 방법 또는 치료가 필요한 것으로 확인되거나 의심되는 것을 의미한다. 일부 실시형태에서, 확인은 진단 또는 관찰의 임의의 수단에 의해 이루어질 수 있다. 본원에 기재된 임의의 방법 및 치료에서, 동물 또는 포유동물은 이를 필요로 할 수 있다. 일부 실시형태에서, 동물 또는 포유동물은 특정 장애 또는 상태가 만연하거나 발생할 가능성이 더 높은 환경에 있거나 환경으로 이동할 것이다.
본원에 사용된 "마이코박테리움 감염"은 대상체가 마이코박테리움 종에 노출된 다음 박테리아에 의한 대상체 또는 대상체 조직(들)의 군체형성(colonization)을 지칭한다. 군체형성은 심각한 질병(예를 들어, 마이코박테리움에 따라 결핵, 나병, 부렐리 궤양 등)을 유발할 수 있거나, 불리한 징후(무증상 또는 잠복 감염)을 초래하지 않을 수 있다.
본원에서 사용되는 "세포 배양"은 세포, 조직 또는 이들의 생성물의 성장, 유지, 형질 감염, 형질 도입 및/또는 증식을 의미한다. 본원에 사용되는 "배양 배지"는 시험관 내 또는 생체 내에서 표적 세포의 성장을 유지할 수 있는 임의의 용액, 또는 시험관 내 세포에 또는 생체 내 세포에 적용하기 전에 표적 세포 또는 외인성 핵산이 혼합된 임의의 용액을 의미한다.
본원에 사용되는 바와 같이 DNA 및 RNA와 같은 핵산과 관련하여 용어 "이종" 및 "외래"는 상호 교환적으로 사용되며, 그것이 존재하거나 그것이 자연에서 발생하는 위치(들) 및/또는 양과 상이한 게놈 또는 세포의 위치(들) 및/또는 양에서 발견되는 게놈 또는 세포의 일부로서 자연적으로 발생하지 않는 핵산, 즉 세포에 내생적이지 않고 세포에 외생적으로 도입된 핵산을 지칭한다. 이종 DNA의 예는 예를 들어 코딩된 단백질의 생산을 위해 세포에 도입된 관심 유전자 산물 또는 유전자 산물(들)을 코딩하는 DNA를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용되는 "전달"은 외인성 핵산 분자가 세포 내부에 위치하도록 세포 내로 전달되도록 하는 과정을 지칭한다. 핵산의 전달은 핵산의 발현과는 별개의 과정이다. 핵산 물질은 형질 감염 또는 형질 도입과 같은 유전자 전달 방법에 의해 생체 외 또는 생체 내 세포에 도입되어 유전자 변형된 세포를 제공할 수 있다. 다양한 발현 벡터(즉, 외인성 핵산의 표적 세포로의 전달을 촉진하기위한 비히클)가 당업자에게 공지되어 있다.
본원에 사용되는 "발현"은 핵산이 펩티드로 번역되거나 mRNA로 전사되고 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질로 번역되도록 하는 과정을 지칭한다. 핵산이 게놈 DNA에서 유래된 경우, 적절한 진핵 숙주 세포 또는 유기체가 선택되면 발현은 mRNA의 스플라이싱을 포함할 수 있다. 이종성 핵산이 숙주 세포에서 발현되기 위해서는, 처음에 세포 내로 전달되어야 하며, 그 다음 세포 내에서 한 번 궁극적으로 핵에 있어야 한다.
본원에 사용되는 "세포의 형질 감염"은 추가된 DNA의 도입에 의한 새로운 핵산 물질의 세포에 의한 획득을 의미한다. 따라서, 형질 감염은 물리적 또는 화학적 방법을 사용하여 핵산을 세포에 삽입하는 것을 의미한다. 여러 형질 감염 기술이 당업자에게 공지되어 있으며 인산 칼슘 DNA 공침(Methods in Molecular Biology (1991)); DEAE-덱스 트란(상기); 전기 천공(상기); 양이온성 리포솜 매개 형질 감염(상기); 및 텅스텐 입자 촉진 마이크로 입자 충격(Johnston (1990))을 포함한다. 인산 스트론튬 DNA 공침 (Brash et al. (1987))이 또한 형질 감염 방법이다.
대조적으로, "세포의 형질 도입"은 DNA 또는 RNA 바이러스를 사용하여 핵산을 세포 내로 전달하는 과정을 지칭한다. 핵산을 세포 내로 전달하기 위한 RNA 바이러스(즉, 레트로 바이러스)는 또한 본원에서 형질 도입 레트로 바이러스로 지칭되기도 한다. 레트로 바이러스 내에 함유된 외인성 핵산 물질은 형질 도입된 세포의 게놈에 통합된다. DNA 바이러스(예를 들어, 치료제를 코딩하는 cDNA를 운반하는 아데노 바이러스)로 형질 도입된 세포는 게놈에 통합된 외인성 핵산 물질을 갖지 않을 것이지만 세포 내에서 염색체 외로 유지되는 외인성 핵산 물질을 발현할 수 있을 것이다.
외인성 핵산 물질은 전사를 제어하는 프로모터와 함께 마이코박테리움 종으로부터의 항원을 코딩하는 핵산을 포함할 수 있다. 프로모터는 특징적으로 전사를 시작하는 데 필요한 특정 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 외인성 핵산 물질은 원하는 유전자 전사 활성을 얻기 위해 필요한 추가 서열 (즉, 인핸서(enhancer))을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 논의를 위해, "인핸서"는 단순히 프로모터에 의해 지시된 기본 전사 수준을 변경하기 위해 코딩 서열(시스(cis)에서)과 함께 작동하는 임의의 비번역 DNA 서열이다. 외인성 핵산 물질은 프로모터의 바로 하류에서 세포 게놈으로 도입되어 프로모터 및 코딩 서열이 작동 가능하게 연결되어 코딩 서열의 전사를 허용할 수 있다. 발현 벡터는 삽입된 외인성 유전자의 전사를 제어하기 위해 외인성 프로모터 요소를 포함할 수 있다. 이러한 외인성 프로모터는 구성적 및 조절 가능한 프로모터를 모두 포함한다.
본원에 사용되는 용어 "도메인"은 뉴클레오티드 서열 내의 펩티드 또는 핵산 내의 아미노산의 일부 또는 하위 서열에 적용된다. 일부 실시형태에서, 도메인은 기능, 활동 또는 이점을 제공한다. 일부 실시형태에서, 예를 들어 도메인은 수용체 또는 수용체의 신호 전달 부분일 수 있다. 다른 실시형태에서 도메인은 2개의 다른 도메인들 사이에서 링커(linker) 기능을 가질 수 있다. 다른 실시형태에서 도메인은 항원 또는 케모카인과 같은 특정 표적 분석물 (표적 도메인)을 결합시키는 역할을 할 수 있다.
본원에 사용되는 용어 "조합"은 다양한 성분(예를 들어, 마이코박테리아 항원 및/또는 코딩 핵산 분자)의 가능한 임의의 배열을 지칭한다. 이러한 배열은 마이코박테리아 항원의 혼합물(예를 들어, 개별 항원의 혼합물 및/또는 항원의 융합) 또는 핵산 분자의 혼합물(예를 들어, 하나 이상의 벡터에 의해 운반됨), 뿐만 아니라 폴리펩티드(들) 및 핵산 분자(들)의 혼합물을 포함한다. 본 발명은 동일한 몰 농도의 각 성분을 포함하는 조합뿐만 아니라 매우 상이한 농도를 갖는 조합을 포함한다. 각각의 마이코박테리움 성분의 최적 농도는 당업자에 의해 결정될 수 있음이 이해된다.
본원에 사용되는 용어 "면역성"은 면역성으로서 적격화된 성분이 도입된 대상체에서 측정 가능한 T 및/또는 B 세포 매개 면역 반응을 유도하거나 자극하는 능력을 지칭한다. 예를 들어, 본 발명의 항원 조합은, 선천적 및/또는 특이적(즉, 상기 면역성 조합에 포함되거나 이에 의해 발현되는 적어도 하나의 마이코박테리아 항원/에피토프에 대해), 체액 및/또는 세포(예를 들어, 항체 및/또는 시토카인의 생산, 및/또는 세포 독성 T 세포, B, T 림프구, 항원 제시 세포, 헬퍼 T 세포, 가지 세포, NK 세포 등의 활성화)일 수 있는 대상체에서 면역 반응을 유도하거나 자극할 수 있고 일반적으로 투여된 대상체에서 보호 반응을 초래한다는 의미에서 면역성이다. 본원에 설명된 바와 같이 생체 내(동물 또는 인간) 또는 시험관 내(예를 들어, 생물학적 샘플에서) 성분의 면역성 특성을 평가하기 위해 매우 다양한 직접 또는 간접 생물학적 분석이 당업계에서 이용 가능하다.
본원에 사용되는 용어 "마이코박테리아 항원"은 항체 또는 T 세포 수용체에 의해 결합될 수 있는 마이코박테리움 종 또는 그의 단편(예를 들어, 에피토프)에 존재하거나 그로부터 수득된 폴리펩티드를 지칭한다. 전형적으로, 이러한 항원은 주요 조직 적합성 복합체(MHC)의 맥락에서 특정 항체 또는 T 세포 수용체에 의한 인식에 관여하는 하나 이상의 B 및/또는 T 에피토프(들), 특히 CTL 또는 TH 에피토프(들) 또는 둘 다를 함유한다. 본 발명의 맥락에서, 이 용어는 후술하는 바와 같이 천연 마이코박테리아 폴리펩티드뿐만 아니라 그의 단편 및 변형된 버전(즉, 변이체)을 포함한다.
"에피토프"는 항체, T 세포 수용체 또는 HLA 분자에 의해 인식되는 부위를 형성하는 최소 펩티드 모티프(보통 8 내지 25개의 아미노산 잔기의 세트)에 대응한다. 이러한 잔기는 연속적(선형 에피토프)이거나 그렇지 않을 수 있다(서로 바로 인접하지 않은 잔기들을 포함하는 형태적 에피토프).
본원에서 사용되는 용어 "변이체"는 실질적으로 유사한 서열을 의미하는 것으로 의도된다. 핵산 분자의 경우, 변이체는 5' 및/또는 3'말단에 결실(즉, 절단)이 있는 핵산 분자; 천연 폴리뉴클레오티드의 하나 이상의 내부 부위에서 하나 이상의 뉴클레오티드의 결실 및/또는 추가; 및/또는 천연 폴리뉴클레오티드의 하나 이상의 부위에서 하나 이상의 뉴클레오티드의 치환을 포함한다. 본원에 사용되는 "천연" 핵산 분자 또는 폴리펩티드는 각각 자연 발생 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열을 포함한다. 핵산 분자의 경우, 보존적 변이체는 유전 코드의 퇴화로 인해 본 개시내용의 폴리펩티드 중 하나의 아미노산 서열을 코딩하는 서열을 포함한다. 변이체 핵산 분자는 또한 합성 유도 핵산 분자, 예컨대 예를 들어 부위 지정 돌연변이 유발을 사용하여 생성되었지만 본 개시내용의 단백질을 여전히 코딩하는 것을 포함한다. 일반적으로, 본 개시내용의 특정 핵산 분자의 변이체는 본원의 다른 곳에 설명된 바와 같은 서열 정렬 프로그램 및 파라미터에 의해 결정된 특정 폴리뉴클레오티드에 대해 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 가질 것이다.
본원에 사용되는 "보존적" 아미노산 치환은 아래 표 A, B 또는 C에 제시된 바와 같이 정의될 수 있다. 본 개시내용의 폴리펩티드는 (핵산 또는 아미노산 서열로부터의) 보존적 치환이 마이코박테리움 종으로부터의 항원(들)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 변형에 의해 도입된 것들을 포함한다. 일부 실시형태에서, 이러한 폴리펩티드는 CDR 또는 그의 기능적 단편을 포함한다. 아미노산은 물리적 특성 및 2차 및 3차 단백질 구조에 대한 기여도에 따라 분류될 수 있다. 보존적 치환은 유사한 특성을 갖는 다른 아미노산에 대한 하나의 아미노산의 치환으로서 당업계에서 인식된다. 일부 실시형태에서, 보존적 치환은 유사한 특성을 갖는 다른 핵산에 대한 하나의 핵산의 치환으로서 당 업계에서 인식되거나, 또는 코딩될 때, 보존적 치환이 기반하는 서열의 결합 친화성과 유사한 표적 또는 결합 파트너에 대한 결합 친화성을 갖는다. 예시적인 보존적 치환은 표 A에 제시되어 있다.
Figure pct00002
대안적으로, 보존적 아미노산은 표 B에 제시된 바와 같이 문헌[Lehninger(Biochemistry, Second Edition; Worth Publishers, Inc. NY, N.Y. (1975), pp. 71-77)]에 설명된 바와 같이 그룹화될 수 있다.
Figure pct00003
대안적으로, 예시적인 보존적 치환은 표 C에 제시되어 있다.
Figure pct00004
본원에 설명된 마이코박테리움 종으로부터의 항원(들) 또는 이의 임의의 단편은 아미노산 잔기의 하나 이상의 삽입, 결실 또는 치환, 또는 이들의 임의의 조합, 뿐만 아니라 아미노산 잔기의 삽입, 결실 또는 치환 이외의 변형, 예컨대 제한되지 않지만 보존적 아미노산 치환을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 아미노산 서열을 포함하도록 의도된다는 것이 이해되어야 한다.
본원에 사용되는 용어 "단편" 또는 "기능적 단편"은 단편이 기반하는 야생형 폴리펩티드와 유사하거나 실질적으로 유사한 적어도 부분적인 생물학적 기능을 보유하기에 충분한 길이의 폴리펩티드의 임의의 부분을 의미한다. 일부 실시형태에서, 마이코박테리움 종의 항원과 관련된 폴리펩티드의 단편은 본원에 개시된 임의의 폴리펩티드의 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99% 서열 동일성을 포함하는 폴리펩티드, 특히 서열번호 6 내지 10에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 임의의 폴리펩티드이다. 일부 실시형태에서, 단편은 본원에 개시된 임의의 폴리펩티드, 특히 서열번호 6 내지 10에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 임의의 폴리펩티드의 단편이고, 적어도 약 10, 약 20, 약 30, 약 40, 약 50, 약 60, 약 70, 약 80, 약 90, 또는 약 100개의 인접 아미노산의 길이를 갖는다. 일부 실시형태에서, 단편은 본원에 개시된 임의의 폴리펩티드, 특히 서열번호 6 내지 10에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 임의의 폴리펩티드의 단편이고, 적어도 약 50개의 아미노산의 길이를 갖는다. 일부 실시형태에서, 단편은 본원에 개시된 임의의 폴리펩티드, 특히 서열번호 6 내지 10에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 임의의 폴리펩티드의 단편이고, 적어도 약 100개의 아미노산의 길이를 갖는다. 일부 실시형태에서, 단편은 본원에 개시된 임의의 폴리펩티드, 특히 서열번호 6 내지 10에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 임의의 폴리펩티드의 단편이고, 적어도 약 150개의 아미노산의 길이를 갖는다. 일부 실시형태에서, 단편은 본원에 개시된 임의의 폴리펩티드, 특히 서열번호 6 내지 10에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 임의의 폴리펩티드의 단편이고, 적어도 약 200개의 아미노산의 길이를 갖는다. 일부 실시형태에서, 단편은 표 1에 개시된 임의의 폴리펩티드의 단편이고, 적어도 약 250개의 아미노산의 길이를 갖는다. 일부 실시형태에서, 단편은 본원에 개시된 임의의 폴리펩티드, 특히 서열번호 6 내지 10에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 임의의 폴리펩티드의 단편이고, 적어도 약 300개의 아미노산의 길이를 갖는다. 일부 실시형태에서, 단편은 본원에 개시된 임의의 폴리펩티드, 특히 서열번호 6 내지 10에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 임의의 폴리펩티드의 단편이고, 적어도 약 350개의 아미노산의 길이를 갖는다. 일부 실시형태에서, 단편은 본원에 개시된 임의의 폴리펩티드, 특히 서열번호 6 내지 10에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 임의의 폴리펩티드의 단편이고, 적어도 약 400개의 아미노산의 길이를 갖는다.
본원에 사용되는 "하나 초과" 또는 "둘 이상"은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 이상을 의미한다. 일부 실시형태에서, "하나 초과"는 본원에 설명된 아미노산 또는 핵산 또는 돌연변이 중 2, 3, 4 또는 5개를 의미한다. 일부 실시형태에서, "하나 초과"는 본원에 설명된 아미노산 또는 핵산 또는 돌연변이 중 2, 3 또는 4개를 의미한다. 일부 실시형태에서, "하나 초과"는 본원에 설명된 아미노산 또는 핵산 또는 돌연변이 중 2 또는 3개를 의미한다. 일부 실시형태에서, "하나 초과"는 본원에 설명된 아미노산 또는 핵산 또는 돌연변이 중 2개를 의미한다.
"서열 상동성"또는 "서열 동일성"또는 "상동성"은 본원에서 FASTA, BLAST 및 Gapped BLAST(Altschul et al., Nuc. Acids Res., 1997, 25, 3389, 이는 그 전체가 본원에 참고로 포함된다) 및 PAUP* 4.0bIO 소프트웨어(D. L. Swofford, Sinauer Associates, Massachusetts)를 사용하여 결정된 뉴클레오티드 및 아미노산 서열에 대해 상호 교환적으로 사용된다. 간단히 말해서, Basic Local Alignment Search Tool을 나타내는 블라스트(BLAST) 알고리즘은 서열 유사성을 결정하는 데 적합하다(Altschul et al., J. MoI. Biol, 1990, 215, 403-410, 이는 그 전체가 본원에 참고로 포함됨). BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 National Center for Biotechnology Information(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)을 통해 공개적으로 이용 가능하다. BLAST 알고리즘에 의해 제공되는 유사성의 하나의 척도는 최소 합계 확률(P(N))이며, 이는 두 뉴클레오티드 서열들 간의 일치가 우연히 발생할 확률의 표시를 제공한다. 예를 들어, 테스트 핵산과 다른 핵산의 비교에서 최소 합계 확률이 약 1 미만, 바람직하게는 약 0.1 미만, 더욱 바람직하게는 약 0.01 미만, 가장 바람직하게는 약 0.001 미만인 경우 핵산은 서로 유사한 것으로 간주된다. "유사성 백분율" 또는 "서열 동일성 백분율"은 PAUP* 4.ObIO 소프트웨어(D. L. Swofford, Sinauer Associates, Massachusetts)를 사용하여 계산될 수 있다. 공통(consensus) 서열의 평균 유사성은 계통수의 모든 서열과 비교하여 계산된다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 조성물은 임의의 서열번호 1 내지 5와 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 상동성인 핵산 서열, 또는 서열번호 6 내지 10과와 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 상동성인 아미노산 서열을 포함한다.
2개의 폴리뉴클레오티드 또는 2개의 폴리펩티드 서열의 "% 동일성" 또는 "% 상동성"은 GAP 컴퓨터 프로그램(GCG Wisconsin Package, 버전 10.3의 일부(Accelrys, San Diego, Calif.)) 및 그의 디폴트 파라미터를 사용하여 서열을 비교함으로써 결정될 수 있다. 2개 이상의 핵산 또는 아미노산 서열과 관련하여 본원에 사용되는 "동일한" 또는 "동일성"은 서열이 특정 영역에 걸쳐 동일한 특정 백분율의 잔기를 갖는다는 것을 의미할 수 있다. 백분율은 2개의 서열을 최적으로 정렬하고, 특정된 영역에 걸쳐 2개의 서열을 비교하고, 두 서열에서 동일한 잔기가 발생하는 위치의 수를 결정하여 일치된 위치의 수를 산출하고, 일치된 위치의 수를 특정된 영역에서의 위치의 총 수로 나누고, 그 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 산출함으로써 계산될 수 있다. 2개의 서열이 다른 길이이거나 정렬이 하나 이상의 엇갈린 말단을 생성하고 비교의 특정된 비교 영역이 단일 서열만을 포함하는 경우, 단일 서열의 잔기는 계산의 분모에는 포함되지만 분자에는 포함되지 않는다. DNA와 RNA를 비교할 때, 티민(T)과 우라실(U)은 동등하다고 간주될 수 있다. 식별은 수동으로 수행되거나 BLAST 또는 BLAST 2.0과 같은 컴퓨터 서열 알고리즘을 사용하여 수행될 수 있다.
용어 "폴리뉴클레오티드", "올리고뉴클레오티드" 및 "핵산"은 전체에 걸쳐 상호 교환적으로 사용되며 DNA 분자(예를 들어, cDNA 또는 게놈 DNA), RNA 분자(예를 들어, mRNA), DNA 유사체 또는 뉴클레오티드 유사체를 사용하여 생성된 RNA(예를 들어, 펩티드 핵산 및 비-천연 뉴클레오티드 유사체) 및 이들의 하이브리드를 포함한다. 핵산 분자는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 핵산 분자는 본원에 설명된 바와 같이 항원 또는 그의 단편을 코딩하는 연속적인 개방 판독 프레임을 포함한다. 본원에 사용되는 "핵산" 또는 "올리고뉴클레오티드" 또는 "폴리뉴클레오티드"는 함께 공유 결합된 적어도 2개의 뉴클레오티드를 의미할 수 있다. 단일 가닥의 묘사는 또한 상보적 가닥의 서열을 정의한다. 따라서, 핵산은 또한 묘사된 단일 가닥의 상보적 가닥을 포함한다. 핵산의 많은 변이체가 주어진 핵산과 동일한 목적을 위해 사용될 수 있다. 따라서, 핵산은 또한 실질적으로 동일한 핵산 및 이의 보체를 포함한다. 단일 가닥은 엄격한 혼성화 조건 하에서 표적 서열에 혼성화될 수 있는 프로브를 제공한다. 따라서 핵산은 또한 엄격한 혼성화 조건 하에서 혼성화되는 프로브를 포함한다. 핵산은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있거나, 이중 가닥과 단일 가닥 서열 모두의 일부를 함유할 수 있다. 핵산은 DNA, 게놈과 cDNA 모두, RNA 또는 하이브리드일 수 있으며, 여기서 핵산은 데옥시리보- 및 리보-뉴클레오티드의 조합, 및 우라실, 아데닌, 티민, 시토신, 구아닌, 이노신, 크산틴, 하이포크산틴, 이소시토 신 및 이소구아닌을 포함하는 염기의 조합을 함유할 수 있다. 핵산은 화학적 합성 방법 또는 재조합 방법으로 얻을 수 있다. 핵산은 일반적으로 포스포디에스테르 결합을 함유할 것이지만, 적어도 하나의 상이한 결합, 예를 들어 포스포라미데이트, 포스포로티오에이트, 포스포로 디티오에이트 또는 O-메틸포스포로아미다이트 결합 및 펩티드 핵산 골격 및 결합을 가질 수 있는 핵산 유사체가 포함될 수 있다. 다른 유사체 핵산은 양성 골격; 비이온성 골격 및 비-리보스 골격이 있는 것을 포함하고, 미국 특허 제5,235,033 및 제5,034,506호에 기재된 것들 것 포함하며, 이들은 그 전체가 참조로 포함된다. 하나 이상의 비-천연 발생 또는 변형된 뉴클레오티드를 함유하는 핵산이 또한 핵산의 일 정의 내에 포함된다. 변형된 뉴클레오티드 유사체는 예를 들어 핵산 분자의 5'-말단 및/또는 3'-말단에 위치할 수 있다. 뉴클레오티드 유사체의 대표적인 예는 당- 또는 골격-변형 리보뉴클레오티드로부터 선택될 수 있다. 그러나, 또한 핵 염기-변형된 리보 뉴클레오타이드, 즉, 5 위치에서 변형된 우리딘 또는 시티딘과 같은 천연적 핵 염기 대신에 비-천연적 핵 염기를 함유하는 리보 뉴클레오타이드, 예를 들어 5-(2-아미노)프로필 우리딘, 5-브로모 우리딘; 8 위치에서 변형된 아데노신 및 구아노신, 예를 들어 8-브로모 구아노신; 데아자 뉴클레오티드, 예를 들어 7-데아자-아데노신; O- 및 N- 알킬화 뉴클레오티드, 예를 들어 N6-메틸 아데노신이 적합하다는 것에 유의해야 한다. 2'-OH-기는 H, OR, R, 할로, SH, SR, NH2, NHR, N2 또는 CN에서 선택되는 기로 치환될 수 있으며, 여기서 R은 C1-C6 알킬, 알케닐 또는 알키닐이고 할로는 F, Cl, Br 또는 I이다. 변형된 뉴클레오티드는 또한 예를 들어 문헌[Krutzfeldt et al., Nature (Oct. 30, 2005)], 문헌[Soutschek et al., Nature 432:173-178 (2004)], 및 미국 특허 공개 제20050107325호에 기재된 바와 같이 히드록시프롤리놀 연결을 통해 콜레스테롤과 접합된 뉴클레오티드를 포함하며, 상기 문헌 및 특허는 그 전체가 본원에 참조로 포함된다. 변형된 뉴클레오티드 및 핵산은 또한 미국 특허 제20020115080호에 기재된 바와 같이 잠금 핵산(LNA)을 포함할 수 있으며, 상기 특허는 본원에 참조로 포함된다. 추가의 변형된 뉴클레오티드 및 핵산은 미국 특허 공개 제20050182005에 기재되어 있으며, 이는 그 전체가 본원에 참조로 포함된다. 리보스-포스페이트 골격의 변형은 다양한 이유로, 예를 들어 생리학적 환경에서 그러한 분자의 안정성 및 반감기를 증가시키거나, 세포막을 통한 확산을 향상시키기 위하여, 또는 바이오칩 상의 프로브로서 수행될 수 있다. 자연적으로 발생하는 핵산과 유사체의 혼합물이 만들어질 수 있고; 대안적으로, 다른 핵산 유사체의 혼합물, 및 자연적으로 발생하는 핵산 및 유사체의 혼합물이 만들어질 수 있다.
용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 임의의 길이의 아미노산 중합체를 지칭하기 위해 본원에서 상호 교환적으로 사용된다. 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있고, 변형된 아미노산을 포함할 수 있으며, 비-천연 아미노산 또는 아미노산이 아닌 화학 기에 의해 차단될 수 있다. 이 용어는 또한 변형된 아미노산 중합체; 예를 들어, 이황화 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 표지 성분과의 접합(conjugation)과 같은 임의의 다른 조작을 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "아미노산"은 글리신 및 D 또는 L 광학 이성질체 둘 다를 포함하는 천연 및/또는 비천연 또는 합성 아미노산, 및 아미노산 유사체 및 펩티도미메틱을 포함한다.
본원에 사용되는 용어 "폴리펩티드"는 일반적으로 적어도 3개 아미노산의 중합체에 대한 당업계에서 인정된 의미를 갖는다. 당업자는 용어 "폴리펩티드"가 본원에 기재된 완전한 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함할 뿐만 아니라 이러한 완전한 폴리펩티드의 기능적 단편(즉, 적어도 하나의 활성을 보유하는 단편)을 나타내는 폴리펩티드를 포함하도록 충분히 일반적인 것으로 의도됨을 이해할 것이다. 더욱이, 당업자는 단백질 서열이 일반적으로 활성을 파괴하지 않고 일부 치환을 허용한다는 것을 이해한다. 따라서, 활성을 유지하고 적어도 약 30 내지 40% 전체 서열 동일성을 공유하며, 종종 약 50%, 60%, 70% 또는 80% 초과하고, 추가로 일반적으로 하나 이상의 고도로 보존된 영역에서 종종 90% 또는 심지어 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%를 초과하는 훨씬 더 높은 동일성을 갖는 적어도 하나의 영역을 포함하며, 일반적으로 동일한 부류의 다른 폴리펩티드와 함께 적어도 3 내지 4개, 종종 최대 20개 이상의 아미노산을 포함하는 임의의 폴리펩티드는 본원에서 사용되는 관련 용어 "폴리펩티드"에 포함된다.
2개의 단일 가닥 폴리뉴클레오티드는, 하나의 폴리뉴클레오티드의 모든 뉴클레오티드가 갭의 도입 없이, 그리고 두 서열의 5' 또는 3'말단에 짝 없는 뉴클레오타이드 없이 다른 폴리 뉴클레오타이드의 상보적 뉴클레오타이드와 반대이도록 그들의 서열이 역-평행 배향으로 정렬될 수 있다면, 서로의 "보체"이다. 폴리뉴클레오티드는 2개의 폴리뉴클레오티드가 적당히 엄격한 조건 하에서 서로 혼성화될 수 있다면 다른 폴리뉴클레오티드에 "상보적"이다. 따라서, 폴리뉴클레오티드는 그것의 보체없이 다른 폴리뉴클레오티드에 대해 상보적일 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "치료하다", "치료된" 또는 "치료함"은 치료적 처리 및/또는 사전 방지 또는 예방적 조치를 의미할 수 있으며, 여기서 그 목적은 원치 않는 생리적 상태, 장애 또는 질병을 예방하거나 늦추거나(경감), 또는 유익하거나 원하는 임상 결과를 얻는 것이다. 본원에 설명된 실시형태의 목적을 위해, 유익하거나 원하는 임상 결과는 증상의 완화; 상태, 장애 또는 질병 정도의 감소; 상태, 장애 또는 질병의 안정된(즉, 악화되지 않은) 양상; 상태, 장애 또는 질병 진행의 발병 지연 또는 완화; 검출 가능하든 검출 불가능하든, 상태, 장애 또는 질병 양상 또는 회복의 개선(부분적이든 전체적이든); 환자가 반드시 식별할 수 있는 것은 아니지만 적어도 하나의 측정 가능한 물리적 파라미터의 개선; 또는 상태, 장애 또는 질병의 향상 또는 개선을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 치료는 과도한 수준의 부작용 없이 임상적으로 유의한 반응을 유도하는 것을 또한 포함할 수 있다. 치료는 또한 치료를 받지 않는다면 예상 생존과 비교하여 생존을 연장하는 것을 포함한다.
본원에 사용되는 용어 "진단", "진단함" 또는 이의 변형은 생리적 상태, 장애 또는 질병의 특성을 확인하는 것을 의미한다. 일부 실시형태에서, 대상체의 진단은 환자가 마이코박테리아 감염 여부를 확인하는 것을 의미한다.
면역성 조성물의 "비경구" 투여라는 용어는 예를 들어 피하(s.c), 정맥 내(i.v.), 근육 내(i.m.), 또는 갑골 내 주사, 종양 내 또는 주입 기술을 포함한다.
본 개시내용은 또한 예방 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 바와 같은 세포 또는 폴리펩티드를 당시에 마이코박테리아 감염으로 감염되지 않은 대상체에게 투여함으로써 마이코박테리아 감염을 예방하는 방법. 예를 들어, 특정 양태에서, 본 개시내용은 환자의 마이코박테리아 감염 위험을 감소시키는 방법을 제공하며, 이는 이를 필요로 하는 대상체에게 본원에 기재된 바와 같은 조성물 또는 제약 조성물을 마이코박테리아 감염의 위험을 감소시키는 데 효과적인 양으로 투여하는 것을 포함한다. 예를 들어, 위험은 예를 들어 적어도 25%, 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 이상 감소될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본원에 기술된 조성물 또는 제약 조성물은 마이코박테리아 감염이 없는 환자에게 제공되며, 그 결과 마이코박테리아 감염이 발생하면 질병의 경과가 조성물 또는 제약 조성물을 제공받지 않은 유사한 환자의 질병의 경과보다 경미할 가능성이 있다. 이러한 위험은 조성물 또는 제약 조성물을 제공받지 않은 환자에 비해 예를 들어 적어도 25%, 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 감소될 수 있다.
용어 "치료적 유효량"은 원하는 치료 또는 예방 효과를 달성하기에 충분한 양, 예를 들어 치료중인 질병, 예를 들어 마이코박테리아 감염과 관련된 증상의 예방 또는 개선 또는 감소를 초래하는 양을 의미한다. 대상체에게 투여되는 화합물의 양은 질병의 유형 및 중증도 및 일반 건강, 연령, 성별, 체중 및 약물 내성과 같은 개인의 특성에 의존할 것이다. 또한 질병의 정도, 중증도 및 유형에 의존할 것이다. 숙련된 기술자는 이들 및 기타 요인에 따라 적절한 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 투여 요법은 유효량을 구성하는 것에 영향을 미칠 수 있다. 본 발명의 화합물은 마이코박테리아 감염의 발병 전 또는 후에 대상체에게 투여될 수 있다. 추가로, 여러개의 분할된 투여량 및 엇갈린 투여량은 매일 또는 순차적으로 투여될 수 있거나, 투여는 연속적으로 주입될 수 있거나, 일시 주입일 수 있다. 또한, 본 발명의 화합물(들)의 투여량은 치료 또는 예방적 상황의 긴급성에 의해 표시되는 바와 같이 비례적으로 증가 또는 감소될 수 있다. 전형적으로, 치료 또는 예방 효과를 달성하기에 충분한 본 발명의 화합물의 유효량은 1일 체중 1kg 당 약 0.000001mg 내지 1일 체중 1kg 당 약 10,000mg 범위이다. 바람직하게는, 투여량 범위는 1일 체중 1kg 당 약 0.0001mg 내지 1일 체중 1kg 당 약 100mg이다. 본 발명의 화합물은 또한 서로 조합하여 또는 하나 이상의 추가 치료 화합물과 함께 투여될 수 있다. 일반적으로, 치료적 유효량은, 단독으로 또는 다른 치료제또는 치료와 함께 투여될 때, 본원에 개시된 억제제를 치료 유효량으로 제공받지 않은 개체의 증상, 질병 진행 속도 또는 수명과 비교하여, 증상을 개선하거나, 질병의 진행률을 역전, 예방 또는 감소시키거나, 개인의 수명을 연장하는 조성물 또는 제약 조성물의 양을 의미한다.
"제약상 허용 가능한"이라는 어구는 인간에게 투여될 때 생리학적으로 견딜 수 있고 전형적으로 알레르기성 또는 유사한 비정상적인 반응, 예컨대 위장 장애, 현기증 등을 생성하지 않는 분자 실체 및 조성물을 지칭한다. 바람직하게는, 본원에 사용되는 용어 "제약상 허용 가능한"은 미국 연방 또는 주 정부의 규제 기관에 의해 승인되거나 미국 약전에 열거되거나 또는 동물, 보다 구체적으로 인간에 사용하기 위해 일반적으로 인정된 다른 약전에 열거된 것을 의미한다.
"제약상 허용 가능한 담체"라는 어구는 당업계에서 인정되고 있으며 본 발명의 화합물을 포유동물에게 투여하기에 적합한 제약상 허용 가능한 물질, 조성물 또는 비히클을 포함한다. 담체는 액체 또는 고체 충전제, 희석제, 부형제, 용매 또는 캡슐화 물질을 포함하며, 본 약제를 한 기관 또는 신체 일부에서 다른 기관 또는 신체 일부로 운반 또는 운송하는 데 관여한다. 각 담체는 제제의 다른 성분과 양립할 수 있고 환자에게 해롭지 않다는 의미에서 "허용 가능"해야 한다. 제약상 허용 가능한 담체로서 역할할 수 있는 물질의 일부 예는 당, 예컨대 락토스, 글루코스 및 수크로스; 전분, 예컨대 옥수수 전분 및 감자 전분; 셀룰로오스 및 그 유도체, 예컨대 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스, 에틸 셀룰로오스 및 셀룰로오스 아세테이트; 분말형 트라가칸스; 맥아; 젤라틴; 활석; 부형제, 예컨대 코코아 버터 및 좌약 왁스; 오일, 예컨대 땅콩유, 면실유, 홍화유, 참기름, 올리브유, 옥수수유 및 대두유; 글리콜, 예컨대 프로필렌 글리콜; 폴리올, 예컨대 글리세린, 소르비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜; 에스테르, 예컨대 에틸 올레이트 및 에틸 라우레이트; 한천; 완충제, 예컨대 수산화 마그네슘 및 수산화 알루미늄; 알긴산; 발열원 없는 물; 등장 식염수; 링거액; 에틸 알코올; 인산염 완충액; 및 제약 제제에 사용되는 기타 무독성 사용 물질을 포함한다. 적합한 제약 담체는 E. W. Martin의 문헌["Remington's Pharmaceutical Sciences"]에 설명되어 있으며, 이는 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
용어 "염"은 무기 및/또는 유기산으로 형성된 산성 염뿐만 아니라 무기 및/또는 유기 염기로 형성된 염기성 염을 의미한다. 이러한 산 및 염기의 예는 당업자에게 잘 알려져 있다. 이러한 산 부가 염은 일반적으로 제약상 허용될 수 있지만, 비-제약상 허용되는 산의 염이 해당 화합물의 제조 및 정제에 유용할 수 있다. 본 발명의 화합물의 산 부가 염은 제약상 허용 가능한 산으로부터 가장 적합하게 형성되고, 예를 들어 무기산, 예컨대 염산, 브롬화 수소산, 황산 또는 인산 및 유기산, 예컨대, 숙신산, 말레산, 아세트산 또는 푸마르산으로 형성된 것들을 포함한다. 다른 비-제약상 허용되는 염, 예를 들어 옥살레이트는 예를 들어 본 발명의 화합물의 분리, 실험실 용도, 또는 후속적인 제약상 허용 가능한 산 부가 염으로의 전환에 사용될 수 있다. 또한 본 발명의 용매화물 및 수화물이 본 발명의 범위 내에 포함된다.
주어진 화합물 염의 원하는 화합물 염으로의 전환은 주어진 염의 수용액이 염기 용액, 예를 들어 탄산나트륨 또는 수산화 칼륨으로 처리되는 표준 기술을 적용하여 유리 염기를 유리한 다음 에테르와 같은 적절한 용매로 추출함으로써 달성된다. 이어서 유리 염기를 수성 부분으로부터 분리하고, 건조시키고, 필요한 산으로 처리하여 원하는 염을 제공한다. 본 발명의 특정 화합물의 생체 내 가수분해성 에스테르 또는 아미드는 메틸렌 클로라이드 또는 클로로포름과 같은 불활성 용매에서 염기의 존재 하에 유리 히드록시 또는 아미노 작용기를 갖는 화합물을 원하는 에스테르의 산 클로라이드로 처리함으로써 형성될 수 있다. 적합한 염기는 트리에틸아민 또는 피리딘을 포함한다. 역으로, 유리 카르복시기를 갖는 본 발명의 화합물은 활성화한 다음 적합한 염기의 존재 하에 원하는 알코올에 의한 처리를 포함할 수 있는 표준 조건을 사용하여 에스테르화될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 마이코박테리아 항원인 아미노산 서열의 하나 또는 조합을 코딩하는 하나 또는 복수의 폴리뉴클레오티드를 발현하는 폴리뉴클레오티드를 포함하거나 이것으로 본질적으로 구성되거나 이것만으로 구성되는 조성물에 관한 것이다. 분리된 T 세포를 노출시키는 방법이 본원에 개시되며, 여기서 방법은 조성물을 하나 이상의 분리된 T 세포에 노출시키는 것을 포함한다.
제약상 허용 가능한 부가 염의 예는 비독성 무기 및 유기산 부가 염, 예컨대 염산에서 유도된 염산염, 브롬화 수소산에서 유도된 브롬화 수소산염, 질산에서 유도된 질산염, 과염소산에서 유도된 과염소산염, 인산에서 유도된 인산염, 황산에서 유도된 황산염, 포름산에서 유도된 포름산염, 아세트산에서 유도된 아세테이트, 아코니트산에서 유도된 아코네이트, 아스코르브산에서 유도된 아스코르베이트, 벤젠 술폰산에서 유도된 벤젠술포네이트, 벤조산에서 유도된 벤조에이트, 신남산에서 유도된 신나메이트, 시트르산에서 유도된 시트레이트, 엠 본산에서 유도된 엠보네이트, 에난트산에서 유도된 에난테이트, 푸마르산에서 유도된 푸마레이트, 글루타민산에서 유도된 글루타메이트, 글리콜산에서 유도된 글리콜레이트, 락트산에서 유도된 락테이트, 말레산에서 유도된 말리에이트, 말론산에서 유도된 말로네이트, 만델산에서 유도된 만델레이트, 메탄설폰산에서 유도된 메탄설포네이트, 나프탈렌-2-설폰산에서 유도된 나프탈렌-2-설포네이트, 프탈산에서 유도된 프탈레이트, 살리실산에서 유도된 살리실레이트, 소르브산에서 유도된 소르베이트, 스테아린산에서 유도된 스테아레이트, 숙신산에서 유도된 숙시네이트, 타르타르산에서 유도된 타르트레이트, p-톨루엔 설 폰산에서 유도된 톨루엔-p-설포네이트 등을 비제한적으로 포함한다. 특히 바람직한 염은 본 발명의 화합물의 나트륨, 리신 및 아르기닌 염이다. 이러한 염은 당업계에 잘 알려져 있고 기술된 절차에 의해 형성될 수 있다.
제약상 허용 가능한 것으로 간주될 수 없는 옥살산과 같은 다른 산은 본 발명의 화합물 및 그의 제약상 허용되는 산 부가 염을 얻는데 중간체로서 유용한 염의 제조에 유용할 수 있다. 본 발명의 화합물의 금속염은 카르복시기를 함유하는 본 발명의 화합물의 나트륨 염과 같은 알칼리 금속염을 포함한다. 본 발명에 따라 얻을 수 있는 이성질체의 혼합물은 그 자체로 공지된 방식으로 개별 이성질체로 분리될 수 있고; 부분 입체 이성질체는 예를 들어 다상 용매 혼합물들 사이의 분할, 재결정화 및/또는 크로마토그래피 분리, 예를 들어 실리카겔 상에서, 또는 예를 들어 역상 컬럼상에서 중압 액체 크로마토그래피에 의해 분리 될 수 있으며, 라세미체는 예를 들어 광학적으로 순수한 염 형성 시약으로 염을 형성하고 이렇게 얻을 수 있는 부분 입체 이성질체 혼합물의 분리에 의해, 예를 들어 분별 결정화에 의해 또는 광학 활성 컬럼 물질상에서 크로마토그래피에 의해 분리될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "샘플"은 본원에 기재된 바와 같이 관심 소스로부터 수득되거나 유도된 생물학적 샘플을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 관심 소스는 동물 또는 인간과 같은 유기체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 생물학적 샘플은 생물학적 조직 또는 유체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 생물학적 샘플은 골수; 혈액; 혈액 세포; 복수; 조직 또는 미세 바늘 생검 샘플; 세포 함유 체액; 자유 부유 핵산; 담; 타액; 오줌; 뇌척수액, 복막액; 흉막액; 대변; 림프; 부인과 유체; 피부 스와브; 질 스와브; 구강 스와브; 비강 스와브; 관 세척 또는 기관지 폐포 세척과 같은 세탁 또는 세척; 흡인; 스크래핑; 골수 표본; 조직 생검 표본; 수술 표본; 대변, 기타 체액, 분비물 및/또는 배설물; 및/또는 그로부터의 세포 등일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 생물학적 샘플은 개체로부터 수득된 세포이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 샘플은 임의의 적절한 수단에 의해 관심 소스로부터 직접 얻은 "1차 샘플"이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 1차 생물학적 샘플은 생검(예를 들어, 미세 바늘 흡인 또는 조직 생검), 수술, 체액 수집(예를 들어, 혈액, 림프, 대변 등) 등으로 구성된 군으로부터 선택된 방법에 의해 수득된다. 일부 실시형태에서, 문맥상 명백한 바와 같이, 용어 "샘플"은 1차 샘플을 처리(예를 들어, 이의 하나 이상의 성분을 제거하고/하거나 이것에 하나 이상의 약제를 첨가함으로써)하여 수득되는 제제를 지칭한다. 예를 들어 반투과성 막을 사용하여 필터링한다. 이러한 "처리된 샘플"은 예를 들어 샘플에서 추출되거나 1차 샘플에 mRNA의 증폭 또는 역전사, 특정 성분의 분리 및/또는 정제 등과 같은 기술을 적용하여 얻은 핵산 또는 단백질을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 "대조 샘플" 또는 "참조 샘플"은 실험 샘플과의 비교에 사용되는 측정되는 물질의 존재, 부재 또는 양이 알려진 샘플을 의미한다.
용어 "키메라 항원 수용체" 또는 대안적으로 "CAR"는 본원에개시된 면역 이펙터 세포 또는 복수의 세포에서 표적 세포에 대한 특이성 및 세포 내 신호 생성을 갖는 세포 또는 세포들을 제공하는 폴리펩티드의 세트, 가장 간단한 실시형태에서 전형적으로 2개를 지칭한다. 일부 실시형태에서, CAR은 적어도 아래에 정의되는 바와 같은 자극 분자 및/또는 공동 자극 분자로부터 유도된 기능적 신호 전달 도메인을 포함하는 세포 외 항원 결합 도메인, 막 관통 도메인 및 세포질 신호 전달 도메인(본원에서 "세포 내 신호 전달 도메인"이라고도 함)을 포함한다. 일부 양태에서, 폴리펩티드 세트는 서로 인접해 있다. 일부 실시형태에서, 폴리펩티드 세트는 이량체화 분자의 존재 시 폴리펩티드를 서로 결합시킬 수 있고, 예를 들어 항원 결합 도메인을 세포 내 신호 전달 도메인에 결합시킬 수 있는 이량 체화 스위치를 포함한다. 일 양태에서, 자극 분자는 T 세포 수용체 복합체와 관련된 제타 사슬이다. 일 양태에서, 세포질 신호 전달 도메인은 하기에 정의된 바와 같은 적어도 하나의 공동 자극 분자로부터 유도된 하나 이상의 기능적 신호 전달 도메인을 추가로 포함한다. 일 양태에서, 공동 자극 분자는 본원에 기재된 공동 자극 분자, 예를 들어 4-1BB(즉, CD137), CD27 및/또는 CD28로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, CAR은 세포 외 항원 결합 도메인, 막 관통 도메인 및 자극 분자로부터 유도된 기능적 신호 전달 도메인을 포함하는 세포 내 신호 전달 도메인을 포함하는 키메라 융합 단백질을 포함한다. 일 양태에서, CAR은 세포 외 항원 결합 도메인, 막 관통 도메인, 및 공동 자극 분자로부터 유도된 기능적 신호 전달 도메인 및 자극 분자로부터 유도된 기능적 신호 전달 도메인을 포함하는 세포 내 신호 전달 도메인을 포함하는 키메라 융합 단백질을 포함한다. 일 양태에서, CAR은 세포 외 항원 결합 도메인, 막 관통 도메인, 및 하나 이상의 공동 자극 분자(들)로부터 유도된 2개의 기능적 신호 전달 도메인 및 자극 분자로부터 유도된 기능적 신호 전달 도메인을 포함하는 세포 내 신호 전달 도메인을 포함하는 키메라 융합 단백질을 포함한다. 일 양태에서, CAR은 세포 외 항원 결합 도메인, 막 관통 도메인, 및 하나 이상의 공동 자극 분자(들)로부터 유도된 적어도 2개의 기능적 신호 전달 도메인 및 자극 분자로부터 유도된 기능적 신호 전달 도메인을 포함하는 세포 내 신호 전달 도메인을 포함하는 키메라 융합 단백질을 포함한다. 일 양태에서, CAR은 CAR 융합 단백질의 아미노 말단(N-ter)에 선택적 리더 서열을 포함한다. 일 양태에서, CAR은 세포 외 항원 결합 도메인의 N-말단에 리더 서열을 추가로 포함하고, 여기서 리더 서열은 세포 처리 및 CAR의 세포막으로의 국소화 동안 항원 결합 도메인(예를 들어, scFv)으로부터 선택적으로 절단된다.
본원에 기재된 것과 같은 특정 마이코박테리아 항원 X를 표적으로 하는 항원 결합 도메인(예를 들어, scFv 또는 TCR)을 포함하는 CAR은 또한 XCAR로도 지칭된다. 예를 들어, ESXA를 표적으로 하는 항원 결합 도메인을 포함하는 CAR은 ESXA-CAR로 지칭된다.
용어 "신호 전달 도메인"은 제2 메신저를 생성하거나 그러한 메신저에 응답함으로써 이펙터로서 기능함으로써 정의된 신호 전달 경로를 통해 세포 활성을 조절하기 위해 세포 내에서 정보를 전송함으로써 작용하는 단백질의 기능적 부분을 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "결합 도메인" 또는 "항체 분자"는 적어도 하나의 면역 글로불린 가변 서열을 포함하는 단백질, 예를 들어 면역 글로불린 사슬 또는 그의 단편을 지칭한다. 용어 "결합 도메인" 또는 "항체 분자"는 항체 및 항체 단편을 포함한다. 실시형태에서, 항체 분자는 다중 특이적 항체 분자이고, 예를 들어 복수의 면역 글로불린 가변 도메인 서열을 포함하고, 여기서 상기 복수의 제1 면역 글로불린 가변 도메인 서열은 제1 에피토프에 대해 결합 특이성을 갖고 상기 복수의 제2 면역 글로불린 가변 도메인 서열은 제2 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는다. 실시형태에서, 다중 특이적 항체 분자는 이중 특이적 항체 분자이다. 이중 특이적 항체는 2개 이하의 항원에 대한 특이성을 갖는다. 이중 특이적 항체 분자는 제1 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 제1 면역 글로불린 가변 도메인 서열 및 제2 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 제2 면역 글로불린 가변 도메인 서열을 특징으로 한다. 항체 또는 이의 항체 단편을 포함하는 본 발명의 CAR의 부분은 항원 결합 도메인이 예를 들어 단일 도메인 항체 단편(sdAb), 단일 사슬 항체(scFv), 인간화 항체 또는 이중 특이적 항체를 포함하는 인접한 폴리펩티드 사슬의 일부로서 발현되는 다양한 형태로 존재할 수 있다(문헌[Harlow et al., 1999, In: Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow et al., 1989, In: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York; Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Bird et al., 1988, Science 242:423-426]). 일 양태에서, 본 발명의 CAR 조성물의 항원 결합 도메인은 항체 단편을 포함한다. 추가의 양태에서, CAR은 scFv를 포함하는 항체 단편을 포함한다.
용어 "공동 자극 분자"는 공동 자극 리간드와 특이적으로 결합하여 T 세포에 의한 공동 자극 반응, 예컨대 이에 제한되지 않지만 증식을 매개하는 T 세포상의 동족 결합 파트너를 지칭한다. 공동 자극 분자는 효율적인 면역 반응에 기여하는 항원 수용체 또는 그의 리간드 이외의 세포 표면 분자이다. 공동 자극 분자는 MHC 클래스 I 분자, BTLA 및 Toll 리간드 수용체, 뿐만 아니라 OX40, CD27, CD28, CDS, ICAM-1, LFA-1(CDl la/CD18), ICOS(CD278) 및 4-1BB(CD137)을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 이러한 공동 자극 분자의 추가 예는 CDS, ICAM-1, GITR, BAFFR, HVEM(LIGHTR), SLAMF7, NKp80(KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD 160, CD 19, CD4, CD8alpha, CD8beta, IL2R beta, IL2R gamma, IL7R alpha, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CDl ld, ITGAE, CD103, ITGAL, CDl la, LFA-1, ITGAM, CDl lb, ITGAX, CDl lc, ITGB 1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1(CD226), SLAMF4(CD244, 2B4), CD84, CD96(tactile), CEACAM1, CRT AM, Ly9(CD229), CD160(BY55), PSGL1, CD100(SEMA4D), CD69, SLAMF6(NTB-A, Lyl08), SLAM(SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG(CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD 19a, 및 CD83과 특이적으로 결합하는 리간드를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "면역 이펙터 세포"는 면역 반응, 예를 들어 면역 이펙터 반응의 촉진에 관여하는 세포를 지칭한다. 면역 이펙터 세포의 예는 T 세포, 예를 들어 알파/베타 T 세포 및 감마/델타 T 세포, B 세포, 자연적 킬러(NK) 세포, 자연적 킬러 T(NKT) 세포, 비만 세포 및 골수-유도된 식세포를 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "면역 이펙터 기능 또는 면역 이펙터 반응"은 예를 들어 표적 세포의 면역 공격을 향상시키거나 촉진시키는 면역 이펙터 세포의 기능 또는 반응을 지칭한다. 예를 들어, 면역 이펙터 기능 또는 반응은 표적 세포의 사멸 또는 성장 또는 증식의 억제를 촉진하는 T 또는 NK 세포의 특성을 지칭한다.
T 세포의 경우, 1차 자극과 공동 자극이 면역 이펙터 기능 또는 반응의 예이다.
마이코박테리움 종
본원에 기재된 바와 같이, 본 발명의 핵산 서열, 아미노산 서열 또는 그의 단편에 포함된 마이코박테리아 항원은 마이코박테리움(M.) 종의 임의의 구성원으로부터 독립적으로 수득될 수 있다. 본 발명의 맥락에서 사용하기 위한 방대한 수의 마이코박테리아가 당업계에 기재되어 있으며, 본 개시내용에 포함되도록 의도된다. 예시적인 마이코박테리움 종은 제한없이 M. 투베르쿨로시스, M. 보비스, M. 보비스 BCG, M. 아비움, M. 압세수스, M. 케로나에, M. 칸사시이, M. 아프리카눔, M. 카네티, M. 카프래, M. 미크로트, M. 문지, M. 오리기스, M. 아비움, M. 아비움 파라투베르쿨로시스, M. 아비움 실바티쿰, M. 콜룸비엔세, M 인트라셀룰라레, M. 고르도내, M. 울세란스, M. 게나벤세, M. 스크로풀라세움, M. 인터메디움, M. 포르투이툼, 및 M. 무코게니쿰을 포함한다
일부 실시형태에서, 마이코박테리아 항원은 전통적으로 질병 결핵을 유발하는 것으로 고려되는 종을 포함하는 결핵 복합체의 마이코박테리움 종, 뿐만 아니라 면역력 손상된 대상체(예를 들어, HIV 감염 환자)에서 결핵 및 폐 질환을 유발하는 마이코박테리움 환경 및 기회 종으로부터 유래된다. 예시적인 마이코박테리움 결핵 항원은 하기 표 1에 제시되어 있다.
Figure pct00005
적합한 마이코박테리아 항원의 아미노산 서열 및 코딩 뉴클레오티드 서열은 공개적으로 이용 가능한 데이터 뱅크 및 문헌에서 쉽게 입수할 수 있다. 예를 들어, 예시적인 마이코박테리움 투베르쿨로시스 항원에 대한 단백질 RefSeq 식별자 및 NCBI 유전자 참조 번호는 위의 표 1에 제시되어 있다. 그러나, 본 발명은 이러한 예시적인 마이코박테리움 종 및 항원에 제한되지 않음이 이해되어야 한다. 실제로 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 상이한 분리물과 균주 사이에서 변할 수 있으며, 이러한 자연적 유전적 변이는 아래에 설명된 것과 같은 비-자연적 변형(들)뿐만 아니라 본 발명의 범위 내에 포함된다.
조성물
본 개시내용은 마이코박테리움 종으로부터 하나 이상의 항원 또는 이의 기능적 단편을 코딩하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 특정 실시형태에서, 항원 또는 이의 기능적 단편은 표 1에 제시되어 있다. 본 개시내용은 또한 마이코박테리움 종으로부터 하나 이상의 항원을 코딩하는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하는 하나 이상의 폴리펩티드를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 마이코박테리움 종으로부터 적어도 2개의 항원 또는 이의 기능적 단편을 코딩하는 적어도 2개의 핵산 서열을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 적어도 2개는 2 내지 10의 범위 내에 포함된 수(즉, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 등)이다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용은 마이코박테리움 종으로부터 적어도 3개의 항원 또는 이의 기능적 단편을 코딩하는 적어도 3개의 핵산 서열을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 적어도 3개는 3 내지 10의 범위 내에 포함된 수(즉, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 등)이다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용은 마이코박테리움 종으로부터 적어도 4개의 항원 또는 이의 기능적 단편을 코딩하는 적어도 4개의 핵산 서열을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 적어도 4개는 4 내지 10의 범위 내에 포함된 수(즉, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 등)이다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용은 마이코박테리움 종으로부터 적어도 3개의 항원 또는 이의 기능적 단편을 코딩하는 적어도 5개의 핵산 서열을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 적어도 5개는 약 5 내지 약 10의 범위 내에 포함된 수(즉, 5, 6, 7, 8, 9, 10 등)이다. 특정 실시형태에서, 항원 또는 이의 기능적 단편은 표 1에 제시되어 있다.
다른 실시형태에서, 본 개시내용은 마이코박테리움 종으로부터 적어도 2개의 항원을 코딩하는 적어도 2개의 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하는 적어도 2개의 폴리펩티드를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 적어도 2개는 2 내지 10의 범위 내에 포함된 수(즉, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 등)이다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용은 마이코박테리움 종으로부터 적어도 3개의 항원을 코딩하는 적어도 3개의 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하는 적어도 3개의 폴리펩티드를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 적어도 3개는 3 내지 10의 범위 내에 포함된 수(즉, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 등)이다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용은 마이코박테리움 종으로부터 적어도 4개의 항원을 코딩하는 적어도 2개의 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하는 적어도 4개의 폴리펩티드를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 적어도 4개는 4 내지 10의 범위 내에 포함된 수(즉, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 등)이다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용은 마이코박테리움 종으로부터 적어도 2개의 항원을 코딩하는 적어도 5개의 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하는 적어도 5개의 폴리펩티드를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 적어도 5개는 5 내지 10의 범위 내에 포함된 수(즉, 5, 6, 7, 8, 9, 10 등)이다. 특정 실시형태에서, 항원 또는 이의 기능적 단편은 표 1에 제시되어 있다.
본 발명의 맥락에서, 마이코박테리움 종으로부터의 적어도 2개의 항원, 마이코박테리움 종으로부터의 적어도 3개의 항원, 마이코박테리움 종으로부터의 적어도 4개의 항원, 마이코박테리움 종으로부터의 적어도 5개의 항원은 서로 다르다(예를 들어, 조합이 적어도 5개의 상이한 마이코박테리아 항원을 포함/코딩한다면 동일한 마이코박테리아 항원의 다중 복사가 사용될 수 있다). 특정 실시형태에서, 항원 또는 이의 기능적 단편은 표 1에 제시되어 있다.
일부 실시형태에서, 마이코박테리움 종으로부터의 항원 또는 이의 기능적 단편은 Ag85B 항원이다. 일부 실시형태에서, 마이코박테리움 종으로부터의 항원 또는 이의 기능적 단편은 PPE68 항원이다. 일부 실시형태에서, 마이코박테리움 종으로부터의 항원 또는 이의 기능적 단편은 ESXA 항원이다. 일부 실시형태에서, 마이코박테리움 종으로부터의 항원 또는 이의 기능적 단편은 ESXB 항원이다. 일부 실시형태에서, 마이코박테리움 종으로부터의 항원 또는 이의 기능적 단편은 ADK 항원이다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 Ag85B, PPE68, ESXA, ESXB 및 ADK로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 2개의 마이코박테리아 항원을 포함하거나 코딩한다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 Ag85B, PPE68, ESXA, ESXB 및 ADK로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 3개의 마이코박테리아 항원을 포함하거나 코딩한다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 Ag85B, PPE68, ESXA, ESXB 및 ADK로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 4개의 마이코박테리아 항원을 포함하거나 코딩한다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 Ag85B, PPE68, ESXA, ESXB 및 ADK로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 5개의 마이코박테리아 항원을 포함하거나 코딩한다.
일 양태에서, 본 개시내용은 마이코박테리움 종으로부터의 Ag85B 항원 또는 이의 기능적 단편을 코딩하는 핵산 서열, 마이코박테리움 종으로부터의 PPE68 항원 또는 이의 기능적 단편을 코딩하는 핵산, 마이코박테리움 종으로부터의 ESXA 항원 또는 이의 기능적 단편을 코딩하는 핵산, 마이코박테리움 종으로부터 ESXB 항원 또는 이의 기능적 단편을 코딩하는 핵산, 마이코박테리움 종으로부터의 ADK 항원 또는 이의 기능적 단편을 코딩하는 핵산, 또는 이들의 조합을 포함하는 조성물을 특징으로 한다.
일부 실시형태에서, Ag85B 항원은 NCBI 유전자 참조 # 885785(디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제/미콜릴트랜스퍼라제 Ag85B)에 대응한다. 일부 실시형태에서, Ag85B 항원 또는 이의 기능적 단편을 코딩하는 핵산 서열은 NCBI 유전자 참조 #885785와 적어도 50% 동일하다. 일부 실시형태에서, Ag85B 항원 또는 이의 기능적 단편을 코딩하는 핵산 서열은 NCBI 유전자 참조 #885785와 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 동일하다. 일부 실시형태에서, Ag85B 항원 또는 이의 기능적 단편을 코딩하는 핵산 서열은 NCBI 유전자 참조 #885785와 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%동일하다. NCBI 유전자 참조 #885785 핵산 서열은 아래에 서열번호 1로서 제시되어 있다.
서열번호 1
ATGACAGACGTGAGCCGAAAGATTCGAGCTTGGGGACGCCGATTGATGATCGGCACG GCAGCGGCTGTAGTCCTTCCGGGCCTGGTGGGGCTTGCCGGCGGAGCGGCAACCGCG GGCGCGTTCTCCCGGCCGGGGCTGCCGGTCGAGTACCTGCAGGTGCCGTCGCCGTCG ATGGGCCGCGACATCAAGGTTCAGTTCCAGAGCGGTGGGAACAACTCACCTGCGGTT TATCTGCTCGACGGCCTGCGCGCCCAAGACGACTACAACGGCTGGGATATCAACACC CCGGCGTTCGAGTGGTACTACCAGTCGGGACTGTCGATAGTCATGCCGGTCGGCGGG CAGTCCAGCTTCTACAGCGACTGGTACAGCCCGGCCTGCGGTAAGGCTGGCTGCCAG ACTTACAAGTGGGAAACCTTCCTGACCAGCGAGCTGCCGCAATGGTTGTCCGCCAAC AGGGCCGTGAAGCCCACCGGCAGCGCTGCAATCGGCTTGTCGATGGCCGGCTCGTCG GCAATGATCTTGGCCGCCTACCACCCCCAGCAGTTCATCTACGCCGGCTCGCTGTCGG CCCTGCTGGACCCCTCTCAGGGGATGGGGCCTAGCCTGATCGGCCTCGCGATGGGTG ACGCCGGCGGTTACAAGGCCGCAGACATGTGGGGTCCCTCGAGTGACCCGGCATGGG AGCGCAACGACCCTACGCAGCAGATCCCCAAGCTGGTCGCAAACAACACCCGGCTAT GGGTTTATTGCGGGAACGGCACCCCGAACGAGTTGGGCGGTGCCAACATACCCGCCG AGTTCTTGGAGAACTTCGTTCGTAGCAGCAACCTGAAGTTCCAGGATGCGTACAACG CCGCGGGCGGGCACAACGCCGTGTTCAACTTCCCGCCCAACGGCACGCACAGCTGGG AGTACTGGGGCGCTCAGCTCAACGCCATGAAGGGTGACCTGCAGAGTTCGTTAGGCG
CCGGCTGA
일부 실시형태에서, PPE68 항원은 NCBI 유전자 참조 #886201(PPE 패밀리 단백질 PPE68)에 대응한다. 일부 실시형태에서, PPE68 항원 또는 이의 기능적 단편을 코딩하는 핵산 서열은 NCBI 유전자 참조 #886201과 적어도 50% 동일하다. 일부 실시형태에서, PPE68 항원 또는 이의 기능적 단편을 코딩하는 핵산 서열은 NCBI 유전자 참조 #886201과 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 동일하다. 일부 실시형태에서, PPE68 항원 또는 이의 기능적 단편을 코딩하는 핵산 서열은 NCBI 유전자 참조 #886201과 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 동일하다. NCBI 유전자 참조 #886201 핵산 서열은 아래에 서열번호 2로서 제시되어 있다.
서열번호 2
ATGCTGTGGCACGCAATGCCACCGGAGCTAAATACCGCACGGCTGATGGCCGGCGCG GGTCCGGCTCCAATGCTTGCGGCGGCCGCGGGATGGCAGACGCTTTCGGCGGCTCTG GACGCTCAGGCCGTCGAGTTGACCGCGCGCCTGAACTCTCTGGGAGAAGCCTGGACT GGAGGTGGCAGCGACAAGGCGCTTGCGGCTGCAACGCCGATGGTGGTCTGGCTACAA ACCGCGTCAACACAGGCCAAGACCCGTGCGATGCAGGCGACGGCGCAAGCCGCGGC ATACACCCAGGCCATGGCCACGACGCCGTCGCTGCCGGAGATCGCCGCCAACCACAT CACCCAGGCCGTCCTTACGGCCACCAACTTCTTCGGTATCAACACGATCCCGATCGCG TTGACCGAGATGGATTATTTCATCCGTATGTGGAACCAGGCAGCCCTGGCAATGGAG GTCTACCAGGCCGAGACCGCGGTTAACACGCTTTTCGAGAAGCTCGAGCCGATGGCG TCGATCCTTGATCCCGGCGCGAGCCAGAGCACGACGAACCCGATCTTCGGAATGCCC TCCCCTGGCAGCTCAACACCGGTTGGCCAGTTGCCGCCGGCGGCTACCCAGACCCTC GGCCAACTGGGTGAGATGAGCGGCCCGATGCAGCAGCTGACCCAGCCGCTGCAGCA GGTGACGTCGTTGTTCAGCCAGGTGGGCGGCACCGGCGGCGGCAACCCAGCCGACGA GGAAGCCGCGCAGATGGGCCTGCTCGGCACCAGTCCGCTGTCGAACCATCCGCTGGC TGGTGGATCAGGCCCCAGCGCGGGCGCGGGCCTGCTGCGCGCGGAGTCGCTACCTGG CGCAGGTGGGTCGTTGACCCGCACGCCGCTGATGTCTCAGCTGATCGAAAAGCCGGT TGCCCCCTCGGTGATGCCGGCGGCTGCTGCCGGATCGTCGGCGACGGGTGGCGCCGC TCCGGTGGGTGCGGGAGCGATGGGCCAGGGTGCGCAATCCGGCGGCTCCACCAGGCC GGGTCTGGTCGCGCCGGCACCGCTCGCGCAGGAGCGTGAAGAAGACGACGAGGACG ACTGGGACGAAGAGGACGACTGGTGA
일부 실시형태에서, ESXA 항원은 NCBI 유전자 참조 #886209(ESAT-6 단백질 EsxA)에 상응한다. 일부 실시형태에서, ESXA 항원 또는 이의 기능적 단편을 인코딩하는 핵산 서열은 NCBI 유전자 참조 # 886209와 적어도 50% 동일하다. 일부 실시형태에서, ESXA 항원 또는 이의 기능적 단편을 코딩하는 핵산 서열은 NCBI 유전자 참조 #886209와 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 동일하다. 일부 실시형태에서, ESXA 항원 또는 이의 기능적 단편을 코딩하는 핵산 서열은 NCBI 유전자 참조 #886209와 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%동일하다. NCBI 유전자 참조 #886209 핵산 서열은 아래에 서열번호 3으로서 제시되어 있다.
서열번호 3
ATGACAGAGCAGCAGTGGAATTTCGCGGGTATCGAGGCCGCGGCAAGCGCAATCCA GGGAAATGTCACGTCCATTCATTCCCTCCTTGACGAGGGGAAGCAGTCCCTGACCAA GCTCGCAGCGGCCTGGGGCGGTAGCGGTTCGGAGGCGTACCAGGGTGTCCAGCAAA AATGGGACGCCACGGCTACCGAGCTGAACAACGCGCTGCAGAACCTGGCGCGGACG ATCAGCGAAGCCGGTCAGGCAATGGCTTCGACCGAAGGCAACGTCACTGGGATGTTC
GCATAG
일부 실시형태에서, ESXB 항원은 NCBI 유전자 참조 #886194(ESAT-6 유사 단백질 EsxB)에 대응한다. 일부 실시형태에서, ESXB 항원 또는 이의 기능적 단편을 인코딩하는 핵산 서열은 NCBI 유전자 참조 # 886194와 적어도 50% 동일하다. 일부 실시형태에서, ESXB 항원 또는 이의 기능적 단편을 코딩하는 핵산 서열은 NCBI 유전자 참조 #886194와 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 동일하다. 일부 실시형태에서, ESXB 항원 또는 이의 기능적 단편을 코딩하는 핵산 서열은 NCBI 유전자 참조 #886194와 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%동일하다. NCBI 유전자 참조 #886194 핵산 서열은 아래에 서열번호 4로서 제시되어 있다.
서열번호 4
ATGGCAGAGATGAAGACCGATGCCGCTACCCTCGCGCAGGAGGCAGGTAATTTCGAG CGGATCTCCGGCGACCTGAAAACCCAGATCGACCAGGTGGAGTCGACGGCAGGTTCG TTGCAGGGCCAGTGGCGCGGCGCGGCGGGGACGGCCGCCCAGGCCGCGGTGGTGCG CTTCCAAGAAGCAGCCAATAAGCAGAAGCAGGAACTCGACGAGATCTCGACGAATA TTCGTCAGGCCGGCGTCCAATACTCGAGGGCCGACGAGGAGCAGCAGCAGGCGCTGT
CCTCGCAAATGGGCTTCTGA
일부 실시형태에서, ADK 항원은 NCBI 유전자 참조 #888567(dkepslffpdlxm zlskwp)에 대응한다. 일부 실시형태에서, ADK 항원 또는 이의 기능적 단편을 코딩하는 핵산 서열은 NCBI 유전자 참조 # 888567과 적어도 50% 동일하다. 일부 실시형태에서, ADK 항원 또는 이의 기능적 단편을 코딩하는 핵산 서열은 NCBI 유전자 참조 #888567과 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 동일하다. 일부 실시형태에서, ADK 항원 또는 이의 기능적 단편을 코딩하는 핵산 서열은 NCBI 유전자 참조 #888567과 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%동일하다. NCBI 유전자 참조 #888567 핵산 서열은 아래에 서열번호 5로서 제시되어 있다.
서열번호 5
GTGAGAGTTTTGTTGCTGGGACCGCCCGGGGCGGGCAAGGGGACGCAGGCGGTGAA GCTGGCCGAGAAGCTCGGGATCCCGCAGATCTCCACCGGCGAACTCTTCCGGCGCAA CATCGAAGAGGGCACCAAGCTCGGCGTGGAAGCCAAACGCTACTTGGATGCCGGTG ACTTGGTGCCGTCCGACTTGACCAATGAACTCGTCGACGACCGGCTGAACAATCCGG ACGCGGCCAACGGATTCATCTTGGATGGCTATCCACGCTCGGTCGAGCAGGCCAAGG CGCTTCACGAGATGCTCGAACGCCGGGGGACCGACATCGACGCGGTGCTGGAGTTTC GTGTGTCCGAGGAGGTGTTGTTGGAGCGACTCAAGGGGCGTGGCCGCGCCGACGACA CCGACGACGTCATCCTCAACCGGATGAAGGTCTACCGCGACGAGACCGCGCCGCTGC TGGAGTACTACCGCGACCAATTGAAGACCGTCGACGCCGTCGGCACCATGGACGAGG TGTTCGCCCGTGCGTTGCGGGCTCTGGGAAAGTAG
본 발명의 핵산 분자는 천연 핵산(예를 들어, 마이코박테리움의 게놈 또는 게놈 단편으로부터 분리됨)일 수 있거나 하나 이상의 뉴클레오티드(들)의 치환, 결실, 추가 및/또는 삽입을 포함하도록 변형될 수 있다. 본 발명은 클로닝, 발현, 안정성을 개선하기 위한 임의의 변형(예를 들어, 적절한 제한 부위의 도입, 주어진 숙주 세포에서 번역을 최적화하기 위한 뉴클레오티드 서열의 변성 및/또는 최적화, 및/또는 핵산 분자 또는 그의 전사체를 불안정하게 할 수 있는 잠재적 인 음성 요소의 억제)을 포함한다. 여러 변형이 고려될 때, 이들은 연속 및/또는 비연속 뉴클레오티드 잔기와 관련될 수 있다. 본 발명에 의해 고려되는 변형(들)은 코딩된 마이코박테리아 항원 및 융합 폴리펩티드의 아미노산 서열을 변경하지 않는 침묵 변형뿐만 아니라 코딩된 마이코박테리아 폴리펩티드로 번역되는 변형을 포함한다. 바람직하게는, 변형은 비변형된 것에 대해 코딩된 마이코박테리아 항원 및 융합 폴리펩티드의 면역성 잠재력을 감소시키지 않는다.
대안적으로 또는 추가로, 본 발명의 핵산 분자는 특정 숙주 세포 또는 대상체, 예를 들어 조류(예를 들어, 닭 배아 섬유 아세포, WO 2010/130756 및 WO2012/001075에 기재된 Cairina moschata 세포주), 포유류, 효모(예를 들어, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces pombe 또는 Pichia pastoris) 또는 박테리아(예를 들어, E. coli, BCG 또는 Listeria)에서 높은 수준의 발현을 제공하기 위해 최적화될 수 있다. 실제로, 주어진 아미노산을 코딩하기 위해 하나 초과의 코돈이 이용 가능할 때 유기체의 코돈 사용 패턴은 매우 비-무작위적이며 코돈의 사용은 상이한 숙주들 사이에 현저하게 다를 수 있다는 것이 관찰되었다. 본 발명에서 사용되는 뉴클레오티드 서열은 대부분 박테리아 기원이므로 고등 진핵 세포와 같은 숙주 세포에서 효율적인 발현을 위해 부적절한 코돈 사용 패턴을 가질 수 있다. 전형적으로, 코돈 최적화는 관심 숙주 세포에서 드물게 사용되는 코돈에 대응하는 하나 이상의 "천연"(마이코박테리아) 코돈을 더 자주 사용되는 동일한 아미노산을 코딩하는 하나 이상의 코돈으로 대체함으로써 수행된다. 심지어 부분적 치환으로도 발현 증가가 달성될 수 있기 때문에 드물게 사용되는 코돈에 대응하는 모든 천연 코돈을 대체할 필요는 없다. 더욱이, 최적화된 코돈 사용에 대한 엄격한 준수로부터의 일부 이탈은 생성된 핵산 분자로의 제한 부위(들)의 도입을 수용하기 위해 만들어질 수 있다.
코돈 사용의 최적화에 추가로, 숙주 세포 또는 대상체에서의 발현은 뉴클레오티드 서열의 추가 변형을 통해 추가로 개선될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 핵산 분자는 농축된 영역에 존재하는 희귀하고 최적이 아닌 코돈의 클러스터링을 방지하고/하거나 발현 수준에 부정적인 영향을 미칠 것으로 예상되는 "음성" 서열 요소를 억제 또는 변형시키도록 변형될 수 있다. 이러한 음성 서열 요소는 제한없이 매우 높은(>80%) 또는 매우 낮은(<30%) GC 함량을 갖는 영역; AT-풍부 또는 GC-풍부 서열 스트레치; 불안정한 직접 또는 역 반복 서열; R A 이차 구조; 및/또는 내부 TATA-박스, 카이-부위, 리보솜 진입 부위 및/또는 스플라이싱 공여자/수용자 부위와 같은 내부 비밀 조절 요소를 포함한다.
본 발명은 서열번호 6 내지 10 중 임의의 것에 기재된 폴리펩티드 군으로부터 선택된 임의의 마이코박테리아 항원을 코딩하는 핵산 분자 또는 그의 임의의 변이체 및 단편을 포함한다.
본 발명의 핵산 분자는 당업계에서 접근 가능한 서열 데이터 및 본원에 제공된 서열 정보를 사용하여 생성될 수 있다. 예를 들어, 이들은 당업계에 잘 알려진 일상적인 기술을 사용하여, 예를 들어, 특정 종의 마이코박테리움 게놈 또는 이의 게놈 단편, cDNA 및 게놈 라이브러리 또는 이를 포함하는 것으로 알려진 임의의 선행 기술 벡터로부터 통상적인 분자 생물학에 의한 PCR 분리 및/또는 클로닝에 의해 분리될 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 핵산 분자는 또한 자동화된 공정으로 화학적 합성에 의해 생성될 수 있다(예를 들어, 중첩 합성 올리고뉴클레오티드로부터 조립됨).
본 발명의 다른 실시형태는 본 발명의 핵산 분자의 단편, 예를 들어 제한 엔도뉴클레아제 및 PCR 생성 단편에 관한 것이다. 이러한 단편은 관련 면역성 부분(들)을 코딩하는 프로브, 프라이머 또는 단편으로서 사용될 수 있다.
다른 양태에서, 본 개시내용은 마이코박테리움 종으로부터 Ag85B 항원을 코딩하는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드, 마이코박테리움 종으로부터 PPE68 항원을 코딩하는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드, 마이코박테리움 종으로부터 ESXA 항원을 코딩하는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드, 마이코박테리움 종으로부터 ESXB 항원을 코딩하는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드, 마이코박테리움 종으로부터 ADK 항원을 코딩하는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드, 또는 이들의 조합을 포함하는 조성물을 특징으로 한다.
일부 실시형태에서, Ag85B 항원은 NCBI 참조 서열 NP_216402.1(디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제/미콜릴트랜스퍼라제 Ag85B)로 나타낸 아미노산 서열에 대응한다. 일부 실시형태에서, Ag85B 항원을 코딩하는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드는 NP_216402.1과 50% 동일하다. 일부 실시형태에서, Ag85B 항원을 코딩하는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드는 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% NCBI 참조 서열 NP_216402.1과 동일하다. 일부 실시형태에서, Ag85B 항원을 코딩하는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드는 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% NCBI 참조 서열 NP_216402.1과 동일하다. NCBI 참조 서열 NP 216402.1 아미노산 서열은 아래에 서열번호 6으로서 제시되어 있다.
서열번호 6
1 mtdvsrkira wgrrlmigta aavvlpglvg laggaataga fsrpglpvey lqvpspsmgr
61 dikvqfqsgg nnspavylld glraqddyng wdintpafew yyqsglsivm pvggqssfys
121 dwyspacgka gcqtykwetf ltselpqwls anravkptgs aaiglsmags samilaayhp
181 qqfiyagsls alldpsqgmg psliglamgd aggykaadmw gpssdpawer ndptqqipkl
241 vanntrlwvy cgngtpnelg ganipaefle nfvrssnlkf qdaynaaggh navfnfppng
301 thsweywgaq lnamkgdlqs slgag
일부 실시형태에서, PPE68 항원은 NCBI 참조 서열 YP_178022.1(PPE 패밀리 단백질 PPE68)로 나타낸 아미노산 서열에 대응한다. 일부 실시형태에서, PPE68 항원을 코딩하는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드는 YP_178022.1과 50% 동일하다. 일부 실시형태에서, PPE68 항원을 코딩하는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드는 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% NCBI 참조 서열 YP_178022.1과 동일하다. 일부 실시형태에서, PPE68 항원을 코딩하는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드는 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% NCBI 참조 서열 YP_178022.1과 동일하다. NCBI 참조 서열 YP_178022.1 아미노산 서열은 아래에 서열번호 7로서 제시되어 있다.
서열번호 7
1 mlwhamppel ntarlmagag papmlaaaag wqtlsaalda qaveltarln slgeawtggg
61 sdkalaaatp mvvwlqtast qaktramqat aqaaaytqam attpslpeia anhitqavlt
121 atnffginti pialtemdyf irmwnqaala mevyqaetav ntlfeklepm asildpgasq
181 sttnpifgmp spgsstpvgq lppaatqtlg qlgemsgpmq qltqplqqvt slfsqvggtg
241 ggnpadeeaa qmgllgtspl snhplaggsg psagagllra eslpgaggsl trtplmsqli
301 ekpvapsvmp aaaagssatg gaapvgagam gqgaqsggst rpglvapapl aqereedded
361 dwdeeddw
일부 실시형태에서, ESXA 항원은 NCBI 참조 서열 YP_178023.1(ESAT-6 단백질 EsxA)로 나타낸 아미노산 서열에 대응한다. 일부 실시형태에서, ESXA 항원을 코딩하는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드는 YP_178023.1과 50% 동일하다. 일부 실시형태에서, ESXA 항원을 코딩하는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드는 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% NCBI 참조 서열 YP_178023.1과 동일하다. 일부 실시형태에서, ESXA 항원을 코딩하는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드는 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% NCBI 참조 서열 YP_178023.1과 동일하다. NCBI 참조 서열 YP_178023.1 아미노산 서열은 아래에 서열번호 8로서 제시되어 있다.
서열번호 8
1 mteqqwnfag ieaaasaiqg nvtsihslld egkqsltkla aawggsgsea yqgvqqkwda
61 tatelnnalq nlartiseag qamastegnv tgmfa
일부 실시형태에서, ESXB 항원은 NCBI 참조 서열 NP_218391.1(ESAT-6 단백질 EsxB)로 나타낸 아미노산 서열에 대응한다. 일부 실시형태에서, ESXB 항원을 코딩하는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드는 NP_218391.1과 50% 동일하다. 일부 실시형태에서, ESXB 항원을 코딩하는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드는 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% NCBI 참조 서열 NP_218391.1과 동일하다. 일부 실시형태에서, ESXB 항원을 코딩하는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드는 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% NCBI 참조 서열 NP_218391.1과 동일하다. NCBI 참조 서열 NP_218391.1 아미노산 서열은 아래에 서열번호 9로서 제시되어 있다.
서열번호 9
1 maemktdaat laqeagnfer isgdlktqid qvestagslq gqwrgaagta aqaavvrfqe
61 aankqkqeld eistnirqag vqysradeeq qqalssqmgf
일부 실시형태에서, ADK 항원은 NCBI 참조 서열 NP_215247.1(아데닐레이트 키나제)로 나타낸 아미노산 서열에 대응한다. 일부 실시형태에서, ADK 항원을 코딩하는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드는 NP_215247.1과 50% 동일하다. 일부 실시형태에서, ADK 항원을 코딩하는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드는 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% NCBI 참조 서열 NP_215247.1과 동일하다. 일부 실시형태에서, ADK 항원을 코딩하는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드는 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% NCBI 참조 서열 NP_215247.1과 동일하다. NCBI 참조 서열 NP_215247.1 아미노산 서열은 아래에 서열번호 10으로서 제시되어 있다.
서열번호 10
1 mrvlllgppg agkgtqavkl aeklgipqis tgelfrrnie egtklgveak ryldagdlvp
61 sdltnelvdd rlnnpdaang fildgyprsv eqakalheml errgtdidav lefrvseevl
121 lerlkgrgra ddtddvilnr mkvyrdetap lleyyrdqlk tvdavgtmde vfaralralg
181 k
다른 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 전장 폴리펩티드 또는 그의 단편(예를 들어, 30, 40, 50, 60, 70, 75, 80 또는 90개 아미노산 잔기와 같은 30개 이상의 연속적인 아미노산 잔기의 단편)에 걸쳐 본원에 기재된 아미노산 서열과 적어도 50%의 동일성(예를 들어, 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성)을 나타내는 적어도 5개의 마이코박테리아 항원을 포함하거나 코딩한다.
대안적으로 또는 추가로, 마이코박테리움 종으로부터의 적어도 5개의 항원 각각은 천연 마이코박테리아 항원(예를 들어, 전장 항원) 또는 그의 변형된 버전(단편 또는 변이체)일 수 있다. "천연" 마이코박테리아 항원은 자연의 마이코박테리움 공급원으로부터 발견, 분리, 수득될 수 있다. 이러한 공급원은 감염되었거나 마이코박테리움에 노출된 대상체로부터 수집한 생물학적 샘플(예를 들어, 혈액, 혈장, 혈청, 타액, 가래, 조직 절편, 생검 표본 등), 배양된 세포, 및 기탁 기관(예를 들어, ATCC 또는 TB 기관), 라이브러리에서 입수할 수 있거나 문헌에 기재된 재조합 물질(예를 들어, 마이코박테리움 분리 물, 마이코박테리움 게놈, 게놈 단편, 게놈 RNA 또는 cDNA, 뿐만 아니라 이러한 요소를 포함하는 것으로 당업계에 공지된 임의의 플라스미드 및 벡터)을 포함한다.
변형된 마이코박테리아 항원(예를 들어, 변이체)은 전형적으로 본원에 구체적으로 개시된 폴리펩티드 또는 천연 폴리펩티드와 하나 이상의 위치(들)에서 상이하다. 하나 이상의 아미노산 잔기(들)의 치환, 삽입, 추가 및/또는 결실, 비-천연 배열 및 이들 가능성의 임의의 조합을 포함하는 임의의 변형(들)이 예상될 수 있다. 아미노산 치환은 보존적일 수도 있고 아닐 수도 있다. 여러 변형이 고려될 때, 연속적인 잔기 및/또는 비연속적인 잔기와 관련될 수 있다. 변형(들)은 부위 지정 돌연변이 유발, PCR 돌연변이 유발, DNA 셔플링 및 합성 기술(예를 들어, 원하는 폴리펩티드 변이체를 코딩하는 합성 핵산 분자 생성)과 같은 당업자에게 알려진 많은 방법에 의해 생성될 수 있다. 그 기원(천연 또는 변형)이 무엇이든, 본 발명의 실시형태에 따르면, 본 발명의 조성물에 의해 포함되거나 코딩된 각각의 마이코박테리아 항원은 B 및/또는 T 세포 에피토프(들)을 포함하는 대응하는 천연 항원의 하나 이상의 면역성 부분을 보유한다. 이러한 관련 면역성 부분을 확인하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, T 세포 에피토프는 생물학적 분석(예를 들어, 합성 중첩 올리고펩티드의 라이브러리를 사용한 IFNg 분석) 또는 사용 가능한 예측 프로그램을 실행하여 확인될 수 있다.
본 발명의 맥락에서 구상될 수 있는 각각의 변형된 마이코박테리아 항원은 천연 대응물에 대한 하나 이상의 변형, 특히 생성된 폴리펩티드의 합성, 처리, 안정성 및/또는 용해도 및/또는 그것의 면역성에 유익한 하나 이상의 변형을 포함한다. 적합한 변형의 대표적인 예는 제한없이 (a) 내부의 높은 소수성 영역(들)의 결실, (b) N-말단 신호 펩티드의 결실(필요한 경우 이종성의 것으로 대체) 및/또는 (c) 안정성, 면역성 및 재조합 발현을 부정적으로 방해할 수 있는 펼쳐진 영역의 결실, 및/또는 (d) 생물학적 활성을 없애기 위한 촉매 도메인의 결실 또는 돌연변이를 포함한다.
벡터
본 발명은 또한 본 발명의 하나 이상의 핵산 분자(들)를 포함하는 벡터 및 이러한 벡터(들)를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
본원에서 사용되는 용어 "벡터"는 비히클, 바람직하게는 핵산분자 또는 숙주 세포 또는 대상체 내에서 본원에 기재된 임의의 핵산 분자(들)의 전달, 증식 및/또는 발현을 허용하는 데 필요한 요소를 포함하는 바이러스 입자를 의미한다. 벡터의 일 유형은 추가 핵산 절편이 결찰될 수 있는 선형 또는 원형 이중 가닥 DNA 분자를 지칭하는 "플라스미드"이다. 벡터의 다른 유형은 바이러스 벡터(예를 들어, 복제 결함 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노 관련 바이러스)이며, 여기서 추가 DNA 단편은 바이러스 게놈에 도입될 수 있다. 일반적으로 플라스미드 벡터는 플라스미드 벡터를 운반하는 숙주 세포가 대응하는 선택적 약물의 존재 하에서 선택될 수 있도록 하는 선별 마커 유전자를 포함한다. 다양한 양성 및 음성 선별 마커 유전자는 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 항생제 내성 유전자는 대응하는 항생제의 존재 하에 숙주 세포가 선택되도록 하는 양성 선별 마커 유전자로서 사용될 수 있다.
특정 벡터는 이들이 도입되는 숙주 세포에서 자율 복제를 할 수 있다(예를 들어, 박테리아 복제 기원을 포함하는 박테리아 벡터 및 에피솜 포유동물 벡터). 다른 벡터(예를 들어, 비-에피솜 포유동물 벡터)는 숙주 세포에 도입될 때 숙주 세포의 게놈에 통합되고, 이에 의해 숙주 게놈과 함께 복제된다. "발현 벡터"는 선택된 폴리뉴클레오티드의 발현을 지시할 수 있는 벡터 유형이다. 본 개시내용은 본원에 개시된 임의의 하나 또는 복수의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 임의의 하나 또는 복수의 벡터에 관한 것이다. 본 개시내용의 목적을 위해, 벡터는 자연 발생 유전원, 합성 또는 인공, 또는 천연 및 인공 유전 요소의 일부 조합일 수 있다.
본 개시내용의 맥락에서 적절한 벡터는 박테리아와 같은 원핵 숙주 세포에서의 발현을 위한 박테리오파지, 플라스미드 또는 코스미드 벡터(예를 들어, E. coli, BCG 또는 Listeria); 효모에서의 발현을 위한 벡터(예를 들어, 문헌[Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris]); 곤충 세포 시스템에서의 발현을 위한 바큘로 바이러스 벡터(예를 들어, Sf 9 세포); 식물 세포 시스템에서의 발현을 위한 바이러스 및 플라스미드 벡터(예를 들어, Ti 플라스미드, 콜리플라워 모자이크 바이러스 CaMV; 담배 모자이크 바이러스 TMV); 뿐만 아니라 고등 진핵 세포 또는 대상체에서의 발현을 위한 플라스미드 및 바이러스 벡터를 비제한적으로 포함한다. 전형적으로, 이러한 벡터는 상업적으로 입수 가능하거나(예를 들어, 문헌[Invitrogen, Stratagene, Amersham Biosciences, Promega etc.]), ATCC(American Type Culture Collection, Rockville, Md.)와 같은 기탁 기관으로부터 입수 가능하거나, 그 서열, 조직 및 생산 방법을 설명하고 숙련자로 하여금 이들을 적용하게 하는 수많은 간행물의 주제였다. 적합한 플라스미드 벡터의 대표적인 예는 pREP4, pCEP4(Invitrogen), pCI(Promega), pVAX(Invitrogen) 및 pGWiz(Gene Therapy System Inc)를 비제한적으로 포함한다. 적합한 바이러스 벡터의 대표적인 예는 다양한 다른 바이러스(예를 들어, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노바이러스 관련 바이러스(AAV), 폭스바이러스, 헤르페스바이러스, 홍역 바이러스, 거품 바이러스, 알파 바이러스, 수포성 기내염 바이러스 등)로부터 생성된다. 전술한 바와 같이, 용어 "바이러스 벡터"는 벡터 DNA, 게놈 DNA 및 그의 생성된 바이러스 입자, 특히 감염성 바이러스 입자를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용에 사용되는 바이러스 벡터는 복제-결함 또는 복제-장애이며, 이는 그것이 정상 세포(예를 들어, 정상 인간 세포) 또는 그것이 투여되는 대상체에서 임의의 상당한 정도로 복제될 수 없음을 의미한다(복제 기능의 손상 또는 결함은 통상적인 수단, 예를 들어 비-허용 세포에서 DNA 합성 및/또는 바이러스 역가 측정을 통해 평가될 수 있다). 이러한 복제 결함 또는 손상된 벡터는 전형적으로 누락/손상된 기능을 가져 오거나 보완하는 증식, 허용 세포주를 필요로 한다.
본 개시내용의 맥락에서 유용한 바이러스 벡터의 예는 백신 접종, 면역 요법, 유전자 전달 또는 재조합 생산에 대해 잘 문서화된 다수의 이점을 갖는 아데노바이러스 벡터를 포함한다(검토를 위해, 문서["Adenoviral vectors for gene therapy", 2002, Ed D. Curiel and J. Douglas, Academic Press] 참조). 본 발명의 아데노바이러스 벡터는 다양한 인간 또는 동물원(예를 들어, 개, 양, 유인원 아데노바이러스 등)으로부터 유도될 수 있다. 임의의 혈청 유형이 인간 아데노바이러스에 대한 특별한 선호도 및 Ad2, Ad5, Ad6과 같은 아속 C 및 Adl 1, Ad34 및 Ad35와 같은 아속 B에 대한 특별한 선호도로 사용될 수 있다. 또한 침팬지 Ad3 및 Ad63과 같은 침팬지 Ad에 대한 특별한 선호도로 동물 Ad를 사용하는 것이 유리할 수 있다. 인용된 아데노바이러스는 ATCC로부터 입수할 수 있거나 이들의 서열, 조직 및 생산 방법을 설명하고 숙련자로 하여금 이들을 적용하게 하는 수많은 간행물의 주제였다(예를 들어 US 6,136,594; US 6,133,028; WO 00/50573; WO 00/70071; WO 2004/083418; WO 2004/097016 및 WO 2005/071093 참조).
복제-결함성 아데노바이러스 벡터는 대략 위치 459 내지 3328 또는 대략 위치 459 내지 3510(수탁 번호 M 73260으로 GeneBank에 개시된 Ad5의 서열을 참조하여)에서 연장되는 El 결실을 갖는 El-결함성이다. 클로닝 능력은 아데노바이러스 게놈의 추가 부분(들)(WO 94/28152 및 문헌[Lusky et al, 1998, J. Virol 72: 2022]에 기재된 바와 같은 비-본질적 E3 영역(예를 들어, 대략 위치 27867 내지 30743으로부터 삭제) 또는 기타 본질적 E2 및/또는 E4 영역의 전부 또는 일부)을 삭제함으로써 추가로 개선될 수 있다.
본 개시내용의 핵산 분자는 아데노바이러스 게놈의 임의의 위치에 독립적으로 삽입될 수 있으며, E1 및/또는 E3 영역의 대체에 삽입하는 것이 특히 바람직하다. 이들은 해당 영역의 자연 전사 방향에 대해 센스(sense) 또는 안티센스 배향으로 위치될 수 있다.
바이러스 벡터의 다른 예는 계두 벡터(예를 들어, FP9), 카나리아 두 벡터(예를 들어, ALVAC) 및 백시니아 바이러스 벡터와 같은 폭스 바이러스를 포함하며, 후자가 바람직하다. 적합한 백시니아 바이러스는 코펜하겐 균주, Wyeth 균주, NYVAC(US 5,494,807) 및 변형된 앙카라(MVA) 균주(문헌[Antoine et al, 1998, Virol. 244: 365]; WO02/42480)를 비제한적으로 포함한다. 재조합 폭스 바이러스를 구성하고 생산하기 위한 일반적인 조건은 당업계에 잘 알려져 있다(예를 들어 WO 2010/130753; WO 03/008533; US 6,998,252; US 5,972,597 및 US 6,440,422). 본 발명의 핵산 분자는 바람직하게는 비-본질적 유전자 자리에서의 폭스 바이러스 게놈 내에 삽입된다. 티미딘 키나아제 유전자는 특히 코펜하겐 백시니아 벡터에의 삽입 및 MVA 벡터에의 삽입을 위한 결실 II 또는 III에 적합하다(WO 97/02355).
다른 바이러스 벡터는 파라믹소바이러스(paramyxoviridae)과로부터 얻을 수 있는 모빌리바이러스이며, 홍역 바이러스가 특히 바람직하다. 다양한 약독화 균주가 당업계에서 입수 가능하며(문헌[Brandler et al, 2008, CIMID, 31 : 271; Singh et al, 1999, J. virol. 73(6): 4823]), 예를 들어, 비제한적으로 에드몬스톤(Edmonston) A 및 B 균주(문헌[Griffin et al, 2001, Field 's in Virology, 1401-1441]), 쉬와르즈(Schwarz) 균주(Schwarz A, 1962, Am J Dis Child, 103 : 216), S191 또는 C-47 균주(Zhang et al, 2009, J Med Virol. 81(8): 1477)와 같은 것이다. P와 M 유전자 사이 또는 H와 L 유전자 사이에 삽입하는 것이 특히 적절하다.
본 개시내용에 사용하기에 적합한 벡터는 또한 야생형 또는 돌연변이(예를 들어, 무독성)일 수 있는 박테리아 세포를 포함한다. 이러한 박테리아 세포의 잘 알려진 예는 무독성 마이코박테리움(예를 들어, Mycobacterium bovis BCG), 유산균(예를 들어, Lactococcus lactis), 리스테리아(예를 들어, Listeria monocytogenes) 및 기타 미생물, 예컨대 살모넬라 및 슈도모나를 비제한적으로 포함한다. 바람직한 실시형태는 BCG 벡터로서, 그것의 게놈 내로 상기에서 정의된 바와 같은 하나 이상의 마이코박테리아 항원(들) 또는 융합 폴리펩티드(들)를 코딩하는 핵산 분자(들)가 BCG 벡터로 하여금 그러한 요소(들)를 발현되게 하는 방식으로 혼입된 BCG 벡터에 관한 것이다.
본 개시내용은 또한 리포좀, 리포플렉스 또는 나노 입자와 같은 미립자 구조를 형성하기 위해 지질 또는 중합체에 복합체화된 벡터(예를 들어, 플라스미드 DNA)를 포함한다.
본 개시내용에 따르면, 본 발명의 벡터에 포함된 핵산 분자는 숙주 세포 또는 대상체에서의 발현에 적합한 형태이며, 이는 본원에 기재된 각각의 핵산 분자가 적절한 조절 서열에 작동 가능하게 연결됨을 의미한다. 본원에서 사용되는 용어 "조절 요소" 또는 "조절 서열"은 핵산(들) 또는 그 유도체(즉, m NA)의 복제, 복사, 전사, 스플라이싱, 번역, 안정성 및/또는 수송을 포함하는 주어진 숙주 세포 또는 대상체에서 핵산 분자(들)의 발현을 허용, 기여 또는 조절하는 임의의 요소를 지칭한다.
조절 서열의 선택은 벡터 자체, 숙주 세포 또는 대상체, 원하는 발현 수준 등과 같은 인자에 의존할 수 있다는 것을 당업자는 이해할 것이다. 프로모터는 특히 중요한다. 본 발명의 맥락에서, 그것은 많은 유형의 숙주 세포에서 핵산 분자의 구성적 발현을 지시하거나, 특정 숙주 세포(예를 들어, 폐-특이적 조절 서열)에 특이적이거나, 특정 이벤트 또는 외인성 인자(예를 들어, 온도, 영양 첨가물, 호르몬 등)에 반응하여 또는 바이러스 주기의 단계(예를 들어, 후기 또는 초기)에 따라 조절될 수 있다. 벡터 생산을 최적화하고 발현된 폴리펩티드(들)의 잠재적인 독성을 회피하기 위하여 특정 이벤트 또는 외인성 인자에 반응하여 생산 단계 동안 억제되는 프로모터를 사용할 수도 있다.
포유동물 세포에서 구성적 발현에 적합한 프로모터는 거대 세포 바이러스(CMV) 즉시 초기 프로모터(US 5,168,062), RSV 프로모터, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터, 포스포글리세로 키나제(PGK) 프로모터, 단순 헤르페스 바이러스(HSV)-1의 티미딘 키나제(TK) 프로모터, 및 T7 중합 효소 프로모터를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. trp, lac, 파지 프로모터, tR A 프로모터 및 해당 효소 프로모터와 같은 프로모터는 원핵 숙주에서 사용될 수 있다. 유용한 효모 프로모터는 메탈로티오네인, 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 기타 해당 효소, 예컨대 에놀라제 또는 글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소효소, 말토오스 및 갈락토스 이용을 담당하는 효소에 대한 프로모터 영역을 포함한다. 백시니아 바이러스 프로모터는 특히 폭스 바이러스 벡터에서의 발현에 적합화되어 있다. 대표적인 예는 백시니아 7.5K, H5R, 11K7.5(문헌[Erbs et al., 2008, Cancer Gene Ther. 15: 18]), TK, p28, pl 1 및 K1L 프로모터, 뿐만 아니라 문헌[Chakrabarti et al. (1997, Biotechniques 23: 1094-7; Hammond et al, 1997, J. Virol Methods 66: 135-8; and Kumar and Boyle, 1990, Virology 179: 151-8)]에 기재된 것과 같은 합성 프로모터, 뿐만 아니라 초기/후기 키메라 프로모터를 비제한적으로 포함한다. 홍역 매개 발현에 적합한 프로모터는 홍역 전사 단위의 발현을 지시하는 임의의 프로모터를 제한없이 포함한다(Brandler and Tangy, 2008, CIMID 31 : 271).
당업자는 본 개시내용의 핵산 분자(들)의 발현을 제어하는 조절 요소가 숙주 세포 또는 대상체 내로 전사의 적절한 개시, 조절 및/또는 종결을 위한 추가 요소(예를 들어, 폴리A 전사 종결 서열), mRNA 수송(예를 들어, 핵 국소화 신호 서열), 처리(예를 들어, 스플라이싱 신호) 및 안정성(예를 들어, 인트론 및 비-코딩 5' 및 3' 서열), 번역(예를 들어, 개시제 Met, 삼자 리더 서열, IRES 리보솜 결합 부위, Shine-Dalgarno 서열 등), 및 정제 단계(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 태그)를 추가로 포함할 수 있다는 것을 인식할 것이다.
일부 실시형태에서, 마이코박테리아 항원을 코딩하는 핵산 분자는 하나 이상의 마이코박테리아 항원에 작동 가능하게 연결된 조절 서열을 선택적으로 포함하는 단일 벡터에 의해 운반된다.
대안적 실시형태에서, 마이코박테리아 항원을 코딩하는 핵산 분자는 2개 이상의 벡터에 의해 수행된다. 각각의 벡터는 본원에 기재된 것들 중에서 하나 이상의 마이코박테리아 항원을 코딩한다. 2개 이상의 벡터는 실질적으로 동시에 또는 순차적으로 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 생체 외에서 분리된 T 세포는 2, 3, 4, 5, 6개 이상의 플라스미드 서열에 노출되며, 여기서 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 이상의 플라스미드 각각은 마이코박테리아 항원을 코딩하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함한다. 조성물은 분리된 T 세포(실시예에서 약술한 단계들을 사용한 건강한 대상체로부터의 세포)에 노출되고 하나 또는 복수의 항원에 대한 면역 반응을 자극하기 위해 일정 기간 동안 방치된다. 일부 실시형태에서, T 세포는 CD3+/CD4+이지만 CD8-이다. 일부 실시형태에서, T 세포는 CD3+/CD4+이지만 CD4-이다.
필요한 경우, 본 개시내용의 벡터는 추가 폴리펩티드를 추가로 포함할 수 있다. 예시적인 추가 폴리펩티드는 면역 조절제, 예컨대 시토카인, 및 잠재적으로 동시 감염 유기체로부터 기원하는 임의의 다른 항원을 제한없이 포함한다.
일 실시형태에 따르면, 본 개시내용의 벡터는 바이러스 입자 또는 리포솜 또는 다른 입자(예를 들어, 유사 입자) 내로 캡슐화될 수 있다. 일부 실시형태에서, 바이러스 입자는 감염성, 약독화 및/또는 비-병원성 바이러스 입자의 형태이다. 전형적으로, 이러한 바이러스 입자는 (i) 본 발명의 바이러스 벡터를 적합한 세포주에 도입하는 단계, (ii) 상기 감염성 바이러스 입자의 생산을 허용하도록 적합한 조건 하에서 상기 세포주를 배양하는 단계, (iii) 상기 세포주의 배양으로부터 생성된 바이러스 입자를 회수하는 단계, (iv) 선택적으로 상기 회수된 바이러스 입자를 정제하는 단계를 포함하는 프로세스에 의해 생산된다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 하나 또는 복수의 폴리뉴클레오티드 및/또는 폴리펩티드를 하나 이상의 T 세포에 노출시키는 단계는 바이러스 입자의 사용이 없는 단계이다.
바이러스 벡터가 복제 결함이거나 복제가 손상된 경우, 입자는 일반적으로 허용 세포주에서 또는 헬퍼 바이러스의 사용을 통해 생성되며, 이는 트랜스에서 누락/손상된 기능을 제공한다. 예를 들어, El-결실된 아데노바이러스 벡터를 보완하기 위한 적합한 세포주는 293 세포(Graham et al, 1997, J. Gen. Virol. 36 : 59-72), 뿐만 아니라 HER-96 및 PER-C6 세포(예를 들어, Fallaux et al, 1998, Human Gene Ther. 9: 1909-17; WO 97/00326) 또는 이들 세포주의 유도체를 포함한다. 조류 세포는 수정란에서 얻은 닭 배아로부터 제조된 일차 닭 배아 섬유 아세포(CEF), 및 오리 세포주(예를 들어, WO 03/076601, WO 2009/004016, WO 2010/130756 및 US2011-008872에 설명된 바와 같음)를 비제한적으로 포함하는 폭스 바이러스 벡터의 증식에 특히 적합하다.
감염성 바이러스 입자는 배양 상청액 및/또는 용해 후 세포로부터 회수될 수 있다. 이는 표준 기술(크로마토그래피, 초원심분리 기술 등)에 따라 추가로 정제될 수 있다.
숙주 세포 및 생산 방법
다른 양태에서, 본 개시내용은 또한 본원에 기재된 핵산 분자 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포 및 이러한 숙주 세포를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 숙주 세포는 본원에 개시된 T 세포이다. 일부 실시형태에서, T 세포는 대상체의 신체로부터 분리된다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용은 숙주 세포가 그 위에서 성장하는 하나 또는 일련의 벽 및 표면을 갖는 용기를 포함하는 조직 배양 시스템에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 조직 배양 시스템은 하나 또는 복수의 숙주 세포를 포함하고; 및 본원에 개시된 임의의 하나 또는 복수의 폴리뉴클레오티드 및/또는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 조직 배양 시스템은 용기를 둘러싸는 가열 요소, 및 세포에 노출되는 공기, 질소, 이산화탄소 및/또는 기타 가스의 양을 조절하는 공기 조절 장치를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 조직 배양 시스템은 폐쇄된 멸균 시스템이다.
본원에서 사용되는 용어 "숙주 세포"는 어떠한 제한없이 광범위하게 조직, 기관 또는 분리된 세포에서의 특정 조직에 관련된 것으로 이해되어야 한다. "숙주 세포"는 핵산, 예를 들어, 본 개시내용의 핵산을 발현하는데 사용될 수 있는 세포이며, 진핵 세포, 박테리아 세포, 곤충 세포 또는 인간 세포일 수 있다. 적합한 진핵 세포는 PBMC, T 세포, B 세포, Vero 세포, HeLa 세포, COS 세포, CHO 세포, HEK293 세포, BHK 세포 및 MDCKII 세포의 1차 샘플로부터의 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 적합한 곤충 세포는 Sf9 세포를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. "재조합 숙주 세포"라는 문구는 발현될 핵산으로 형질 전환되거나 형질 감염된 숙주 세포를 나타내기 위해 사용될 수 있다. 숙주 세포는 또한, 핵산을 포함하지만, 핵산과 작동 가능하게 연결되도록 조절 서열이 숙주 세포에 도입되지 않는 한, 그것을 치료적 유효량과 같은 원하는 수준으로 발현하지 않는 세포일 수 있다. 용어 숙주 세포는 특정 대상체 세포뿐만 아니라 이러한 세포의 자손 또는 잠재적 자손을 지칭하는 것으로 이해된다. 예를 들어 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인해 다음 세대에서 특정 변형이 발생할 수 있기 때문에, 이러한 자손은 실제로 모세포와 동일하지 않을 수 있지만 여전히 본원에서 사용되는 용어의 범위 내에 포함된다. 숙주 세포는 또한 본원에 기술된 벡터의 수용자일 수 있거나 그것이었던 세포 및 이러한 세포의 자손을 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태는 본 발명의 벡터(또는 바이러스 입자) 및/또는 숙주 세포를 사용하여 본 발명의 핵산에 의해 코딩된 마이코박테리아 항원의 재조합 생산 방법이다. 전형적으로, 본 방법은(i) 벡터를 적합한 숙주 세포에 도입하여 형질 감염되거나 감염된 숙주 세포를 생성하는 단계, (ii) 숙주 세포의 성장에 적합한 조건 하에서 상기 형질 감염되거나 감염된 숙주 세포를 시험관 내 배양하는 단계, (iii) 세포 배양물을 회수하는 단계, 및 (iv) 선택적으로, 회수된 세포 및/또는 배양 상청액으로부터 마이코박테리아 항원(들) 또는 융합 폴리펩티드를 정제하는 단계를 포함한다.
당업자는 폴리펩티드를 발현하기 위해 당업계에서 이용 가능한 수많은 발현 시스템 및 숙주 세포에 벡터를 도입하는 방법에 대해 잘 알고 있을 것으로 예상된다. 이러한 방법은 미세 주입, CaP04-매개 형질 감염, DEAE-덱스트란-매개 형질 감염, 전기 천공, 리포펙션/리포좀 융합, 유전자 총, 형질 도입, 바이러스 감염, 및 다양한 수단을 통한 숙주 유기체로의 직접 투여를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 본 방법은 또한 숙주 세포에서 핵산의 도입을 용이하게 하는 통상적 인 형질 감염 시약, 예를 들어 폴리 양이온 폴리머(예를 들어, 키토산, 폴리메타크릴레이트, PEI 등) 및 양이온성 지질(예를 들어, DC-Chol/DOPE, 트랜스펙탐(transfectam), 리포펙틴(lipofectin) 등)과 함께 사용될 수 있다.
숙주 세포는 통상적인 발효 생물 반응기, 플라스크 및 페트리 플레이트에서 배양될 수 있다. 배양은 주어진 숙주 세포에 적합한 온도, pH 및 산소 함량에서 수행될 수 있다. 회수된 마이코박테리아 항원은 황산 암모늄 침전, 산 추출, 겔 전기 영동; 여과 및 크로마토그래피 방법(예를 들어, 역상, 크기 배제, 이온 교환, 친화성, 소수성 상호 작용, 하이드록시아파타이트, 고성능 액체 크로마토그래피 등)을 포함하는 잘 알려진 정제 방법에 의해 선택적으로 정제될 수 있다. 사용되는 조건 및 기술은 순 전하, 분자량, 소수성, 친수성과 같은 인자에 의존하며 당업자에게 명백할 것이다. 또한 정제 수준은 의도하는 용도에 의존할 것이다. 예를 들어 단백질 농도는 브랜스드포드(Bransdford) 분석(Biorad)으로 평가될 수 있고, 내독소 수준은 휴대용 테스트 시스템(Portable Test System)(Charles River Laboratories)과 같은 기술로 평가될 수 있으며, 정제된 폴리펩티드의 질량은 MALDI(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionisation) 또는 전기 분무 방법 사용하여 측정될 수 있다.
타일링
특정 실시형태에 따르면, 본원에 개시된 하나 이상의 아미노산 서열은 Ag85B, PPE68, ESXA, ESXB 및 ADK 항원의 일부 또는 전부에 걸쳐서 서열이 중첩된다.
일 실시형태에 따르면, 마이코박테리움 종으로부터의 제1 항원을 코딩하는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드, 및 마이코박테리움 종으로부터의 제1 항원을 코딩하는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드는 중첩되는 아미노산 서열을 갖는다. 특정 실시형태에서, 마이코박테리움 종으로부터의 제1 항원을 코딩하는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드, 및 마이코박테리움 종으로부터의 제1 항원을 코딩하는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드는 적어도 2개의 아미노산에 의해 중첩되는 아미노산 서열을 갖는다. 특정 실시형태에 따르면, 중첩은 2개의 아미노산과 23개의 아미노산 사이에 있으며, 예를 들어 중첩은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 또는 23개의 아미노산이다. 이러한 방식으로 폴리펩티드의 타일링은 본 개시내용에서 개시된 폴리펩티드 중 하나 이상의 길이에 걸쳐있는 고도의 면역성 펩티드의 세트를 갖는 항원 또는 제시의 더 광범위한 인식을 제공한다.
폴리펩티드를 타일링하는 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 하딩 등(Harding et al.)에 설명되어 있으며, 이는 인간 CD4+ T 세포 기반 증식 분석으로 테스트된 12개의 아미노산이 중첩되는 15 머 폴리펩티드의 개발 및 테스트를 설명한다(문헌[Molecular Cancer Therapeutics, November 2005, Volume 4, Issue 11], 그 전체가 본원에 참조로 포함됨). 스티커 등(Sticker, et al.)은 임의의 단백질에서 기능적 CD4(+) T 세포 에피토프를 식별하는 인간 세포 기반 방법을 설명한다(J Immunol Methods. 2003 Oct 1;281(1-2):95-108, 그 전체가 본원에 참고로 포함됨).
본 발명에서 사용되는 펩믹스는 특정 양태에서 약 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개 아미노산 길이이고 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11개 이상의 아미노산이 서로 중첩되는 펩티드로 구성된 상업적으로 이용 가능한 펩티드 라이브러리로부터 유래될 수 있다. 예를 들면 JPT 테크놀로지 또는 Miltenyi로부터의 것이 있다. 특정 실시형태에서, 펩티드는 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 또는 35개 이상의 아미노산 길이이고, 예를 들어 길이에서 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 또는 34개의 아미노산의 중첩이 있다. 일부 실시형태에서, 펩믹스는 서열번호 11 내지 51의 임의의 하나 또는 조합을 포함한다. 임의의 하나 또는 복수의 이러한 서열 식별자가 아미노산 서열 서열번호 17 내지 59가 기반하는 하나 또는 복수의 항원 단편에 대해 세포 또는 복수의 세포에서 항원-특이적 면역 반응을 유도하거나 자극하는 데 사용될 수 있도록 임의의 그러한 서열의 임의의 순열이 고려된다.
CAR-T 조성물
일부 실시형태에서, 본 발명은 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어, T 세포, NK 세포)를 제공하며, 여기서 조작된 면역 이펙터 세포는 항-박테리아 항원 특성을 나타낸다. 바람직한 항원은 본원에 기재된 마이코박테리아 항원 또는 본원에 개시된 임의의 복수의 마이코박테리아 항원의 조합이다. 일 양태에서, CAR의 항원 결합 도메인은 부분적으로 인간화된 항체 단편을 포함한다. 일 양태에서, CAR의 항원 결합 도메인은 부분적으로 인간화된 scFv를 포함한다. 따라서, 본 발명은 인간화된 항원 결합 도메인을 포함하고 세포, 예를 들어 T 세포 또는 NK 세포로 조작되는 CAR, 및 입양 요법을 위한 이들의 사용 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 CAR은 CD137(4-1BB) 신호 전달 도메인, CD28 신호 전달 도메인, CD27 신호 도메인, CD3zeta 신호 도메인, 및 이들의 임의 조합의 군으로부터 선택된 적어도 하나의 세포 내 도메인을 포함한다. 일 양태에서, 본 발명의 CAR은 CD137(4-1BB) 또는 CD28 이외의 하나 이상의 공동 자극 분자(들)로부터의 적어도 하나의 세포 내 신호 전달 도메인을 포함한다.
키메라 항원 수용체(CAR)
본 개시내용은 CAR을 코딩하는 서열을 포함하는 재조합 DNA 구성을 포함하며, 여기서 CAR은 본원에 기재된 암 관련 항원에 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인(예를 들어, 항체 또는 항체 단편, TCR 또는 TCR 단편)을 포함하며, 여기서 항원 결합 도메인의 서열은 세포 내 신호 전달 도메인을 코딩하는 핵산 서열과 인접하고 이와 동일한 판독 프레임에 있다.세포 내 신호 전달 도메인은 공동 자극 신호 전달 도메인 및/또는 1차 신호 전달 도메인, 예를 들어 제타 사슬을 포함할 수 있다. 공동 자극 신호 전달 도메인은 공동 자극 분자의 세포 내 도메인의 적어도 일부를 포함하는 CAR의 일부를 지칭한다. 본 개시내용은 마이코박테리아 항원에 대해 특이적인 CAR을 발현하는 하나 또는 복수의 이펙터 세포를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
일 양태에서, 예시적인 CAR 구축물은 선택적 리더 서열(예를 들어, 본원에 기재된 리더 서열), 세포 외 항원 결합 도메인(예를 들어, 본원에 기재된 항원 결합 도메인), 힌지(예를 들어, 본원에 기재된 힌지 영역), 막 관통 도메인(예를 들어, 본원에 기재된 막 관통 도메인) 및 세포 내 자극 도메인(예를 들어, 본원에 기재된 세포 내 자극 도메인)을 포함한다. 일 양태에서, 예시적인 CAR 구축물은 선택적 리더 서열(예를 들어, 본원에 기재된 리더 서열), 세포 외 항원 결합 도메인(예를 들어, 본원에 기재된 항원 결합 도메인), 힌지(예를 들어, 본원에 기재된 힌지 영역), 막 관통 도메인(예를 들어, 본원에 기재된 막 관통 도메인), 세포 내 공동 자극 신호 전달 도메인(예를 들어, 본원에 기재된 공동 자극 신호 전달 도메인) 및/또는 세포 내 1차 신호 전달 도메인(예를 들어, 본원에 기재된 1차 신호 전달 도메인)을 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 CAR을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 핵산 구축물을 포함하며, 여기서 핵산 분자는 세포 내 신호 전달 도메인을 코딩하는 핵산 서열과 인접하고 이와 동일한 판독 프레임 내에 있는 항원 결합 도메인, 예를 들어 본원에 기재된 것을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 CAR을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 핵산 구축물을 포함하며, 여기서 핵산 분자는 항원 결합 도메인을 코딩하는 핵산 서열을 포함하고, 여기서 서열은 세포 내 신호 전달 도메인을 코딩하는 핵산 서열과 인접하고 이와 동일한 판독 프레임 내에 있다. CAR에서 사용될 수 있는 예시적인 세포 내 신호 전달 도메인은 예를 들어, CD3-제타, CD28, CD27, 4-IBB 등의 하나 이상의 세포 내 신호 전달 도메인을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 예에서, CAR은 CD3-제타, CD28, 4-IBB 등의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 원하는 분자를 코딩하는 핵산 서열은 당업계에 공지된 재조합 방법을 사용하여, 예를 들어 핵산 분자를 발현하는 세포로부터 라이브러리를 스크리닝함으로써, 동일한 것을 포함하는 것으로 알려진 벡터로부터 핵산 분자를 유도함으로써, 또는 표준 기술을 사용하여 동일한 것을 포함하는 세포 및 조직으로부터 직접 분리함으로써 수득될 수 있다. 대안적으로, 관심 핵산은 클로닝되지 않고 합성적으로 생산될 수 있다.
본 개시내용은 세포 내로 직접 형질 도입될 수 있는 CAR을 발현하는 레트로바이러스 및 렌티바이러스 벡터 구축물을 포함한다.
본 개시내용은 또한 세포 내로 직접 형질 감염될 수 있는 RNA 구축물을 포함한다. 형질 감염에 사용하기 위한 mRNA를 생성하는 방법은 특별히 설계된 프라이머에 의한 템플레이트의 시험관 내 전사(IVT), 이어서 polyA 첨가를 포함하여, 3' 및 5' 비-번역 서열("UTR")(예를 들어, 본원에 기재된 3' 및/또는 5' UTR), 5' 캡(예를 들어, 본원에 기재된 5' 캡) 및/또는 내부 리보솜 진입 부위(IRES)(예를 들어, 본원에 기재된 IRES)를 포함하는 구축물, 발현될 핵산, 및 전형적으로 50 내지 2000 염기 길이인 polyA 테일을 생성한다. 이렇게 생산된 RNA는 다양한 종류의 세포를 효율적으로 형질 감염시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 템플레이트는 CAR에 대한 서열을 포함한다. 실시형태에서, RNA CAR 벡터는 전기 천공에 의해 세포, 예를 들어 T 세포 또는 NK 세포 내로 형질 도입된다. 항원 결합 도메인
일부 실시형태에서, 본 발명의 CAR은 항원 결합 도메인으로도 지칭되는 표적-특이적 결합 요소를 포함한다. 잔기의 선택은 표적 세포의 표면을 정의하는 리간드의 유형과 수에 의존한다. 예를 들어, 항원 결합 도메인은 특정 질병 양상과 관련된 표적 세포에서 세포 표면 마커로 작용하는 리간드를 인식하도록 선택될 수 있다. 따라서, 본 발명의 CAR에서 항원 결합 도메인에 대한 리간드로 작용할 수 있는 세포 표면 마커의 예는 마이코박테리움 감염과 관련된 것들을 포함한다. 일 양태에서, CAR-매개 T 세포 반응은 원하는 항원을 CAR로 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인을 조작함으로써 관심 항원으로 지시될 수 있다. 일 양태에서, 항원 결합 도메인을 포함하는 CAR의 부분은 마이코박테리아 항원, 예를 들어 본원에 기재된 마이코박테리아 항원을 표적화하는 항원 결합 도메인을 포함한다. 항원 결합 도메인은 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 재조합 항체, 인간 항체, 인간화 항체 및 이의 기능적 단편, 단일 도메인 항체, 예컨대 낙타류 유래 나노 바디의 중쇄 가변 도메인(VH), 경쇄 가변 도메인(VL) 및 가변 도메인(VHH)을 포함하나 이에 제한되지 않는 항원, 및 재조합 피브로넥틴 도메인, T 세포 수용체(TCR) 또는 그 단편, 예를 들어 단일 사슬 TCR 등과 같은 항원 결합 도메인으로서 기능하는 것으로 당업계에 공지된 대안적 스캐폴드에 결합하는 임의의 도메인일 수 있다. 일부 경우에, 항원 결합 도메인이 CAR이 궁극적으로 사용될 동일한 종으로부터 유도되는 것이 유리하다. 예를 들어, 인간에서 사용하기 위해, CAR의 항원 결합 도메인이 항체 또는 항체 단편의 항원 결합 도메인에 대한 인간 또는 인간화 잔기를 포함하는 것이 유리할 수 있다.
다른 양태에서, 항원 결합 도메인은 인간화 항체 또는 항체 단편을 포함한다. 일부 양태에서, 비-인간 항체는 인간화되고, 여기서 항체의 특정 서열 또는 영역은 인간 또는 그의 단편에서 자연적으로 생성된 항체와의 유사성을 증가시키기 위해 변형된다. 일 양태에서, 항원 결합 도메인은 인간화된다.
인간화 항체는 CDR-이식(예를 들어, 유럽 특허 번호 EP 239,400; 국제 공개 번호 WO 91/09967; 및 미국 특허 번호 5,225,539, 5,530,101 및 5,585,089 참조, 이들 각각은 전체가 본원에 참조로 포함됨), 비니어링(veneering) 또는 리서피싱(resurfacing)(예를 들어, 유럽 특허 번호 EP 592,106 및 EP 519,596; 문헌[Padlan, 1991, Molecular Immunology, 28(4/5) : 489-498]; 문헌[Studnicka et al., 1994, Protein Engineering, 7(6) : 805-814]; 및 문헌[Roguska et al., 1994, PNAS, 91:969-973] 참조, 이들 각각은 그 전체가 본원에 참조로 포함됨), 체인 셔플링(예를 들어, 미국 특허 번호 5,565,332 참조, 이는 그 전체가 본원에 참고로 포함됨), 및 예를 들어 미국 특허출원 공개 번호 US2005/0042664, 미국 특허출원 공개 번호 US2005/0048617, 미국 특허 번호 6,407,213, 미국 특허 번호 5,766,886, 국제 공개 번호 WO 9317105, 문헌[Tan et al., J. Immunol., 169 : 1119-25(2002), Caldas et al., Protein Eng., 13(5) : 353-60(2000) , Morea et al., Methods, 20(3) : 267-79(2000), Baca et al., J. Biol. Chem., 272(16) : 10678-84(1997), Roguska et al., Protein Eng., 9(10) : 895-904(1996), Couto et al., Cancer Res., 55(23 Supp) : 5973s-5977s(1995), Couto et al., Cancer Res., 55(8) : 1717-22(1995), Sandhu JS, Gene, 150(2) : 409-10(1994) 및 Pedersen et al. ., J. Mol. Biol., 235(3) : 959-73(1994)](이들 각각은 전체가 본원에 참조로 포함됨)에 개시된 기술을 포함하지만 이에 제한되지 않는 당업계에 공지된 다양한 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 종종, 프레임워크 영역의 프레임워크 잔기는 예를 들어 항원 결합을 개선하기 위해 CDR 공여자 항체로부터의 대응하는 잔기로 치환될 것이다. 이러한 프레임워크 치환은 당업계에 잘 알려진 방법에 의해, 예를 들어 항원 결합에 중요한 프레임워크 잔기를 확인하기 위한 CDR 및 프레임워크 잔기의 상호 작용의 모델링, 및 특정 위치에서 비정상적인 프레임워크 잔기를 확인하기 위한 서열 비교에 의해 확인된다. (예를 들어, Queen et al., 미국 특허 번호 5,585,089; 및 Riechmann et al., 1988, Nature, 332:323 참조, 이는 그 전체가 본원에 참조로 포함됨).
일 양태에서, 본 발명은 본원에 설명된 마이코박테리아 관련 항원의 발현과 관련된 질병을 치료하는 방법을 제공한다. 일 양태에서, 본 발명은 필요로 하는 대상체에게 XCAR를 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어, T 세포, NK 세포)를 제공함으로써 잠복성 또는 활성 마이코박테리아 감염(즉, 본원에 개시된 임의의 마이코박테리아 종의 감염)을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 X는 본원에 기재된 바와 같은 마이코박테리아 항원 또는 이의 기능적 단편을 나타내고, 대상체의 감염된 세포는 상기 X 종양 항원 또는 기능적 단편을 발현한다.
일 양태에서, 본 발명은 본원에 설명된 XCAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어, T 세포, NK 세포)를 필요로 하는 대상체에게 제공함으로써 잠복성 또는 활성 마이코박테리아 감염을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 감염된 세포는 X를 발현한다. 일부 실시형태에서, X는 정상 세포와 세균 감염 세포 모두에서 발현되지만 정상 세포에서는 더 낮은 수준으로 발현된다. 일부 실시형태에서, 방법은, XCAR로 하여금 X를 발현하는 감염된 세포에 결합하고 사멸시키게 하는 친화도로 X에 결합하는 CAR을 선택하는 단계를 추가로 포함하되, X를 발현하는 정상 세포의 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5% 미만은 사멸된다. 일부 실시형태에서, 선택된 CAR은 표적 항원에 대해 10 -"4 M 내지 10 -"8 M, 예를 들어 10"5 M 내지 10"7 M, 예를 들어 10"6 M 또는 10"7 M의 결합 친화도 KD를 갖는 항원 결합 도메인을 갖는다. 일부 실시형태에서, 선택된 항원 결합 도메인은 참조 항체, 예를 들어 본원에 기재된 항체보다 적어도 5배, 10배, 20배, 30배, 50배, 100배 또는 1,000배 더 적은 결합 친화도를 갖는다.
본 개시내용은 면역 이펙터 세포(예를 들어, T 세포, NK 세포)가 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하도록 유전적으로 변형되고 CAR-발현 T 세포 또는 NK 세포가 이를 필요로 하는 수용자에게 주입되는 세포 요법의 유형을 포함한다. 주입된 세포는 수용자에서 하나 이상의 마이코박테리움에 감염된 세포를 죽일 수 있다. 항체 요법과 달리, CAR-변형된 면역 이펙터 세포(예를 들어, T 세포, NK 세포)는 생체 내에서 복제될 수 있어 지속적인 세균 감염 제어로 이어질 수 있는 장기 지속성을 초래한다. 다양한 양태에서, 환자 또는 그의 자손에게 투여된 면역 이펙터 세포(예를 들어, T 세포, NK 세포)는 환자에게 T 세포 또는 NK 세포를 투여한 후 환자에서 적어도 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 12개월, 13개월, 14개월, 15개월, 16개월, 17개월, 18개월, 19개월, 20개월, 21개월, 22개월, 23개월, 2년, 3년, 4년 또는 5년 동안 지속된다. 본 발명은 또한 면역 이펙터 세포(예를 들어, T 세포, NK 세포)가 예를 들어 시험관 내 전사된 RNA에 의해 변형되어 키메라 항원 수용체(CAR)를 일시적으로 발현하고 CAR T 세포 또는 NK 세포가 이를 필요로 하는 수용자에게 주입되는 유형의 세포 요법을 포함한다. 주입된 세포는 수용자의 마이코박테리움에 감염된 세포를 죽일 수 있다. 따라서, 다양한 양태에서, 환자에게 투여된 면역 이펙터 세포(예를 들어, T 세포, NK 세포)는 T 세포 또는 NK 세포를 환자에게 투여한 후 1개월 미만, 예를 들어 3주, 2주, 1주 동안 존재한다.
CAR 이펙터 세포를 생성하고 만드는 방법은 PCT 출원 번호 PCT/US2016/052260에 개시되어 있으며, 이는 그 전체가 참고로 포함된다. 본 개시내용은 XCAR을 포함하는 하나 또는 복수의 이펙터 세포를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이며, 여기서 X는 본원에 기재된 바와 같은 마이코박테리아 항원 또는 이의 기능적 단편을 나타내고, 대상체의 감염된 세포는 상기 X 종양 항원 또는 기능적 단편을 발현한다.
CD8+ T 세포 활성화 및 확장
본원에 기재된 바와 같이, 본 개시내용의 조성물(예를 들어, 마이코박테리움 종으로부터의 항원 또는 이의 기능적 단편을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 조성물, 마이코박테리움 종으로부터 항원을 코딩하는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 조성물) 및 본 개시내용의 조성물을 포함하는 세포는 사용되거나 예를 들어 세포 용해성 T 세포(CD8+ 세포), 메모리 CD8+ T 세포, T 헬퍼 세포(CD4+ 세포) 및 NK 세포를 포함하는 면역 세포를 자극할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 본 개시내용의 조성물은 CD8+ T 세포를 자극할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 조성물은 동시에 하나 초과의 유형의 면역 세포, 예를 들어 하나 초과의 세포 용해성 T 세포(CD8+ 세포), 메모리 CD8+ T 세포 및/또는 NK 세포를 자극할 수 있다.
면역 세포의 자극은 정상적인 세포 기능을 향상시키거나 비정상 세포에서 정상적인 세포 기능을 시작할 수 있다. 따라서, 본 개시내용은 또한 본원에 기재된 조성물에 의한 자극으로부터 생성되는 세포 집단을 제공한다.
일부 실시형태에서, 면역 세포를 자극하는 것은 면역 세포의 확장을 의미한다. 일부 실시형태에서, 면역 세포를 자극하는 것은 면역 세포의 활성화를 의미한다. 일부 실시형태에서, 면역 세포를 자극하는 것은 면역 세포의 세포 독성의 증가를 의미한다.
특정 실시형태에서, 본 개시내용의 조성물(예를 들어, 마이코박테리움 종으로부터의 항원 또는 이의 기능적 단편을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 조성물, 마이코박테리움 종으로부터 항원을 코딩하는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 조성물) 및 본 개시내용의 조성물을 포함하는 세포는 생체 외 면역 킬러 세포를 자극하기에 충분하다. 다른 실시형태에서, 본원에 기재된 바와 같은 조성물 및 세포는 생체 내에서 면역 킬러 세포를 자극하기에 충분하다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 조성물 및 세포는 CD8+ T 세포를 활성화할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 조성물 및 세포는 CD8+ T 세포를 확장할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 조성물 및 세포는 CD8+ T 세포를 활성화 및 확장할 수 있다.
T 세포 활성화 및 확장은 본원에 설명된 다양한 분석에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어 측정될 수 있는 T 세포 활성은 T 세포 증식 유도, T 세포에서 신호 전달 유도, T 세포에서 활성화 마커 발현 유도, T 세포에 의한 시토카인 분비 유도, 및 T 세포의 세포 독성 활성을 포함한다. 예를 들어, 특정 실시형태에서, CD8+ T 세포 활성화는 증식 분석에 의해 측정된다.
시토카인 분비
본 개시내용의 조성물 또는 세포에 의한 CD8+ T 세포의 활성화는 감마 인터페론(IFN- γ), 종양 괴사 인자 알파(TNFa), 인터루킨-12(IL-12) 또는 인터루킨 2(IL-2)와 같은 시토카인의 분비를 결정함으로써 평가되거나 측정될 수 있다. 일부 실시형태에서, ELISA는 시토카인 분비, 예를 들어 감마 인터페론(IFN- γ), 종양 괴사 인자 알파(TNFa), 인터루킨-12(IL-12) 또는 인터루킨 2(IL-2)의 분비를 결정하는 데 사용된다. ELISPOT(효소 결합 면역 스팟) 기술은 본원에 기재된 조성물에 의한 자극에 반응하여 주어진 시토카인(예를 들어, 감마 인터페론(IFN-g))을 분비하는 T 세포를 검출하는 데 사용될 수 있다. T 세포는 항-IFN- γ 항체로 코팅된 웰에서 본원에 기재된 조성물 및 조성물을 포함하는 세포와 함께 배양된다. 분비된 IFN- γ는 코팅된 항체에 의해 포획된 다음 발색 기질에 결합된 두 번째 항체로 드러난다. 따라서, 국소적으로 분비된 시토카인 분자는 스팟들을 형성하며, 각 스팟은 하나의 IFN-γ-분비 세포에 대응한다. 스팟의 수를 통해 분석된 샘플에서 IFN-γ-분비 세포의 빈도를 결정할 수 있다. ELISPOT 분석은 또한 종양 괴사 인자 알파, 인터루킨-4(IL-4), IL-5, IL-6, IL-10, IL-12, 과립구-대식 세포 콜로니 자극 인자, 및 그랜짐 B-분비 림프구의 검출에 대해 설명되었다(Klinman D, Nutman T. Current protocols in immunology. New York, N.Y: John Wiley & Sons, Inc.; 1994. pp. 6.19.1-6.19.8, 그 전체가 본원에 참조로 포함됨).
세포 내 시토카인의 유세포 분석은 배양 상층액의 시토카인 함량을 측정하는 데 사용될 수 있지만, 실제로 시토카인을 분비하는 T 세포의 수에 대한 정보는 제공하지 않는다. T 세포가 모넨신 또는 브레펠딘 A와 같은 분비 억제제로 처리될 때, 활성화시(예를 들어, 본 발명의 조성물에 의해) 세포질 내에 시토카인을 축적한다. 림프구의 고정 및 투과화 후, 세포 내 시토카인은 세포 측정법으로 정량화될 수 있다. 이 기술은 생산된 시토카인, 이러한 시토카인을 생산하는 세포 유형, 및 세포 당 생산되는 시토카인의 양을 결정할 수 있게 한다.
세포 독성
본원에 기재된 바와 같은 조성물 또는 조성물을 포함하는 세포에 의한 CD8+ T 세포의 활성화는 CD8+ T 세포의 세포 독성 활성을 분석함으로써 평가될 수 있다.
T 세포의 세포 독성 활성은 당업자에게 알려진 임의의 적합한 기술에 의해 평가될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 조성물 또는 조성물을 포함하는 세포에 노출된 T 세포를 포함하는 샘플은 표준 세포 독성 분석에서 적절한 기간 후에 세포 독성 활성에 대해 분석될 수 있다. 이러한 분석은 당업계에 공지된 크롬 방출 CTL 분석 및 Alamar Blue™ 형광 분석을 포함할 수 있지만 이에 제한되지는 않는다.
증식/확장
T 세포를 확장하는 본원에 기재된 조성물 또는 세포의 능력은 CFSE 염색을 사용하여 평가될 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은 조성물 또는 세포는 CD8+ T 세포(예를 들어, 질병 또는 장애, 예컨대 마이코박테리아 감염을 겪는 대상체로부터)와 혼합된다. 세포 확장의 초기 속도를 비교하기 위해, 세포에 CFSE 염색을 행하여 본원에 기술된 조성물 또는 조성물을 포함하는 세포가 T 세포의 증식을 얼마나 잘 유도했는지를 결정한다. CFSE 염색은 훨씬 더 정량적인 종말점을 제공하고 확장된 세포의 동시 표현형을 허용한다. 자극 후 매일, 세포의 분취량이 각 배양 물로부터 제거되고 유세포 분석에 의해 분석된다. CFSE 염색은 세포를 높은 형광성으로 만든다. 세포 분열시, 형광은 반감되고, 따라서 세포가 분열할수록 형광은 줄어든다. T 세포 증식을 유도하는 본원에 기재된 조성물 또는 조성물을 포함하는 세포의 능력은 1회, 2회, 3회 등으로 분할된 세포의 수를 측정함으로써 정량화된다. 특정 시점에서 가장 많은 수의 세포 분열을 유도하는 본원에 기재된 조성물 또는 조성물을 포함하는 세포는 가장 강력한 확장제로 간주된다.
본원에 기재된 바와 같은 이러한 조성물 또는 세포가 T 세포의 장기 성장을 얼마나 잘 촉진하는지 결정하기 위해, 세포 성장 곡선이 생성될 수 있다. 이러한 실험은 전술한 CFSE 실험으로 설정되지만, CFSE는 사용되지 않는다. 배양의 2 내지 3 일마다 T 세포는 각각의 배양물에서 제거되고 코울터 카운터(Coulter counter)를 사용하여 계수하여 얼마나 많은 세포가 존재하는지와 세포의 평균 부피를 측정한다. 평균 세포 부피는 언제 세포를 재자극할 것인지에 대한 최상의 예측자이다. 일반적으로, T 세포가 적절하게 자극되면 세포 부피가 3배가된다. 이 부피가 초기 폭발(blast)의 약 절반 초과로 감소되면, 로그 선형 확장을 유지하기 위해 T 세포를 재자극할 필요가 있을 수 있다(Levine et al, 1996, Science 272:1939-1943; Levine et al, 1997, J. Immunol. 159:5921-5930). 본원에 기재된 바와 같은 조성물 또는 조성물을 포함하는 세포가 20 집단 배가를 유도하는 데 걸리는 시간이 계산된다. 이러한 수준의 T 세포 확장을 유도하기 위해 본원에 기재된 바와 같은 다양한 조성물 또는 조성물을 포함하는 세포의 상대적 차이는 조성물 또는 조성물을 포함하는 세포가 평가되는 중요한 기준이다.
또한, 본원에 기재된 조성물 또는 조성물을 포함하는 세포에 의해 확장된 세포의 표현형은 특정 서브 세트가 우선적으로 확장되는지 여부를 결정하도록 특성화될 수 있다. 각각의 재자극 전에, Appay 등에 의해 제안된 CD27 및 CD28 정의(2002, Nature Med. 8, 379385, 그 전체가 본원에 참고로 포함됨) 및 Sallusto 등에 의해 제안된 CCR7 정의(1999, Nature 401:708-712, 그 전체가 본원에 참조로 포함됨)를 사용하여 확장된 T 세포의 분화 상태를 정의하기 위해 확장 T 세포 집단의 표현형 분석을 수행한다. Perforin 및 Granzyme B 세포 내 염색은 세포 용해 가능성을 추정하기 위한 총 측정을 수행하는 데 사용될 수 있다.
아포토시스 마커
본 발명의 특정 실시형태에서, 본원에 기재된 바와 같은 조성물 또는 세포를 사용하는 T 세포의 자극, 활성화 및 확장은 다시 아포토시스를 보호하거나 그렇지 않으면 생체 내 또는 시험관 내 생존을 연장하는 T 세포에서 특정 핵심 분자의 발현을 향상시킨다. 아포토시스는 일반적으로 T 세포에서 특정 신호의 유도로부터 초래된다. 따라서, 본원에 기재된 바와 같은 조성물 또는 조성물을 포함하는 세포는 T 세포의 자극으로부터 초래되는 세포 사멸로부터 T 세포를 보호하기 위해 제공될 수 있다. 따라서, 본 발명에는 또한 T 세포 생존에 일반적으로 필요한 Bcl-xL, 성장 인자, 시토카인 또는 림포카인과 같은 인식된 T 세포 성장 마커의 부재 또는 고갈로부터 또는 조기 사망으로부터, 뿐만 아니라 Fas 또는 종양 괴사 인자 수용체(TNFR) 가교로부터 보호함으로써 또는 특정 호르몬 또는 스트레스에의 노출에 의해 향상된 T 세포 성장이 포함된다.
마이코박테리움 종으로부터 항원을 발현하는 세포
일 양태에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 조성물(예를 들어, 마이코박테리움 종으로부터 항원 또는 이의 기능적 단편을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 조성물, 마이코박테리움 종으로부터 항원을 코딩하는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 조성물)을 포함하는 세포 또는 복수의 세포를 제공한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 조성물은 하나 이상의 세포를 포함하고, 여기서 상기 세포는 본원에 기재된 마이코박테리아 항원 중 적어도 하나를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 하나 이상의 세포는 마이코박테리움 종으로부터의 적어도 2개의 항원을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 하나 이상의 세포는 마이코박테리움 종으로부터의 적어도 3개의 항원을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 하나 이상의 세포는 마이코박테리움 종으로부터의 적어도 4개의 항원을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 하나 이상의 세포는 마이코박테리움 종으로부터의 적어도 5개의 항원을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포는 서로 상이한 마이코박테리움 종으로부터의 적어도 2, 3, 4 또는 5개의 항원을 포함한다(예를 들어, 조합이 적어도 5개의 상이한 마이코박테리아 항원을 포함/코딩한다면 동일한 마이코박테리아 항원의 다중 카피가 사용될 수 있다).
일 양태에서, 본 개시내용은 (i) 서열번호 1과 적어도 50% 동일한 Ag85B 항원을 코딩하는 핵산 서열, 서열번호 2와 적어도 50% 동일한 PPE68 항원을 코딩하는 핵산 서열, 서열번호 3과 적어도 50% 동일한 ESXA 항원을 코딩하는 핵산 서열, 서열번호 4와 적어도 50% 동일한 ESXB 항원을 코딩하는 핵산 서열, 서열번호 5와 적어도 50% 동일한 ADK 항원을 코딩하는 핵산 서열, 또는 이들의 조합; (ii) 서열번호 6과 적어도 50% 동일한 Ag85B 항원을 코딩하는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 7과 적어도 70% 동일한 PPE68 항원을 코딩하는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 8과 적어도 50% 동일한 ESXA 항원을 코딩하는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 9와 적어도 50% 동일한 ESXB 항원을 코딩하는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 10과 적어도 50% 동일한 ADK 항원을 코딩하는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는 이들의 조합; (iii) 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4 또는 서열번호 5의 핵산 서열의 기능적 단편을 코딩하는 (i)의 핵산; 및 (iv) 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9 또는 서열번호 10의 아미노산 서열의 기능적 단편을 코딩하는 (ii)의 아미노산 서열 중 하나 또는 조합을 포함하는 세포 또는 복수의 세포들을 특징으로 한다.
일부 실시형태에서, 세포는 헬퍼(helper) (CD4+) T 세포이다.
일부 실시형태에서, 세포는 세포 독성 (CD8+) T 세포이다.
일부 실시형태에서, 세포는 감마/델타 T 세포이다.
일부 실시형태에서, 세포는 중앙 메모리 T 세포이다.
일부 실시형태에서, 세포는 이펙터(effector) 메모리 T 세포이다.
일부 실시형태에서, 헬퍼 T 세포는 전체 T 세포 집단의 약 60% 내지 약 90%, 전체 T세포 집단의 약 60% 내지 약 80%, 약 60% 내지 약 70%, 약 70% 내지 약 80%, 약 70% 내지 약 90%, 약 80% 내지 약 90%를 차지한다. 추가 실시형태에서, 헬퍼 T 세포는 전체 T 세포 집단의 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85% 또는 약 90%를 차지할 수 있다. 헬퍼 T 세포는 CD45+CD3+CD4+ 세포로서 식별될 수 있다. 식별은 예를 들어 유세포 분석법에 의해 수행될 수 있다.
일부 실시형태에서, 세포 독성 T 세포는 전체 T 세포 집단의 약 0% 내지 약 40%, 전체 T 세포 집단의 약 0% 내지 약 30%, 약 0% 내지 약 20%, 약 0% 내지 약 10%, 약 10% 내지 약 20%, 약 10% 내지 약 30%, 약 10% 내지 약 40%, 약 20% 내지 약 40%, 약 30% 내지 약 40%를 차지한다. 추가 실시형태에서, 세포 독성 T 세포는 전체 T 세포 집단의 약 0%, 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35% 또는 약 40%를 차지할 수 있다. 세포 독성 T 세포는 CD45+CD3+CD8+ 세포로서 식별될 수 있다. 식별은 예를 들어 유세포 분석법에 의해 수행될 수 있다.
일부 실시형태에서, 감마/델타 T 세포는 전체 T 세포 집단의 약 0.5% 내지 약 10%, 전체 T 세포 집단의 약 0.5% 내지 약 5%, 약 0.5% 내지 약 1%, 약 1% 내지 약 5%, 약 1.5% 내지 약 5%, 약 2% 내지 약 5%, 약 3% 내지 약 5%, 약 4% 내지 약 5%를 차지한다. 추가 실시형태에서, 감마/델타 T 세포는 전체 T 세포 집단의 약 0.5%, 약 1%, 약 1.5%, 약 2%, 약 2.5%, 약 3%, 약 3.5%, 약 4%, 약 4.5%, 약 5%, 약 6%, 약 7%, 약 8%, 약 9% 또는 약 10%를 차지할 수 있다. 감마/델타 T 세포는 CD45+CD3+CD4-CD8-TCRgd+ 세포로서 식별될 수 있다. 식별은 예를 들어 유세포 분석법에 의해 수행될 수 있다.
일부 실시형태에서, 중앙 메모리 T 세포는 전체 T 세포 집단의 약 0.5% 내지 약 15%, 전체 T 세포 집단의 약 0.5% 내지 약 10%, 약 0.5% 내지 약 5%, 약 0.5% 내지 약 1%, 약 1% 내지 약 15%, 약 1% 내지 약 10%, 약 1% 내지 약 5%, 약 5% 내지 약 15%, 약 5% 내지 약 10%, 약 10% 내지 약 15%를 차지한다. 추가 실시형태에서, 중앙 메모리 T 세포는 전체 T 세포 집단의 약 0.5%, 약 1%, 약 1.5%, 약 2%, 약 2.5%, 약 3%, 약 3.5%, 약 4%, 약 4.5%, 약 5%, 약 6%, 약 7%, 약 8%, 약 9%, 약 10%, 약 11%, 약 12%, 약 13%, 약 14% 또는 약 15%를 차지할 수 있다. 중앙 메모리 T 세포는 CD45+CD3+CD45RA-CCR7+ 세포로서 식별될 수 있다. 식별은 예를 들어 유세포 분석법에 의해 수행될 수 있다.
일부 실시형태에서, 이펙터 메모리 T 세포는 전체 T 세포 집단의 약 20% 내지 약 60%, 전체 T 세포 집단의 약 20% 내지 약 50%, 약 20% 내지 약 40%, 약 20% 내지 약 30%, 약 30% 내지 약 60%, 약 30% 내지 약 50 %, 약 30% 내지 약 40%, 약 40% 내지 약 60%, 약 40% 내지 약 50%, 약 50% 내지 약 60%를 차지한다. 추가 실시형태에서, 이펙터 메모리 T 세포는 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55% 또는 약 60%를 차지할 수 있다. 이펙터 메모리 T 세포는 CD45+CD3+CD45RA-CCR7-세포로서 식별될 수 있다. 식별은 예를 들어 유세포 분석법에 의해 수행될 수 있다.
일부 실시형태에서, 복수의 세포는 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포를 포함하며, 여기서 CD8+ T 세포의 수는 CD4+ T 세포의 수보다 많다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, CD8+ T 세포의 수는 CD4+ T 세포의 수보다 1배 더 많으며; 일부 실시형태에서, CD8+ T 세포의 수는 CD4+ T 세포의 수보다 2배 더 많으며; 일부 실시형태에서, CD8+ T 세포의 수는 CD4+ T 세포의 수보다 3배 더 많으며; 일부 실시형태에서, CD8+ T 세포의 수는 CD4+ T 세포의 수보다 4배 더 많으며; 일부 실시형태에서, CD8+ T 세포의 수는 CD4+ T 세포의 수보다 5배 더 많으며; 일부 실시형태에서, CD8+ T 세포의 수는 CD4+ T 세포의 수보다 6배 더 많으며; 일부 실시형태에서, CD8+ T 세포의 수는 CD4+ T 세포의 수보다 7배 더 많으며; 일부 실시형태에서, CD8+ T 세포의 수는 CD4+ T 세포의 수보다 8배 더 많으며; 일부 실시형태에서, CD8+ T 세포의 수는 CD4+ T 세포의 수보다 9배 더 많으며; 일부 실시형태에서, CD8+ T 세포의 수는 CD4+ T 세포의 수보다 10배 더 많다.
일부 실시형태에서, 세포는 인간 대상체로부터 유래된다. 추가 실시형태에서, 인간 대상체는 면역 약화된다. 다른 실시형태에서, 인간 대상체는 마이코박테리아 감염을 갖는 것으로 진단되었거나 의심된다.
일부 실시형태에서, 세포 또는 복수의 세포들은 세포 배양에서 확장된다. 일부 실시형태에서, 세포 배양은 적어도 하나의 1차 T 세포를 포함한다.
일부 실시형태에서, 세포 또는 복수의 세포들은 항원 제시 세포, 말초 혈액 단핵 세포, 제대혈 세포, 정제된 T 세포 집단, 및 T 세포주, B 세포, 단핵구, 가지 세포, 피토해마글루티닌 블라스트(Phytohemagglutinin blast), 또는 K562 또는 다른 세포주와 같은 불멸화된 세포를 기반으로 하는 인공 항원 제시 세포이다.
일부 실시형태에서, 세포는 항원 제시 세포(APC)이다. 추가 실시형태에서, APC는 인공 항원 제시 세포이다.
일부 실시형태에서, 세포는 대식 세포이다.
일부 실시형태에서, 세포는 가지 세포이다.
특정 실시형태에서, 세포는, 마이코박테리움 종으로부터 Ag85B 항원을 코딩하는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드, 마이코박테리움 종으로부터 PPE68 항원을 코딩하는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드, 마이코박테리움 종으로부터 ESXA 항원을 코딩하는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드, 마이코박테리움 종으로부터 ESXB 항원을 코딩하는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드, 마이코박테리움 종으로부터 ADK 항원을 코딩하는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드, 또는 이들의 조합을 발현할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용은 (i) 서열번호 1과 적어도 50% 동일한 Ag85B 항원을 코딩하는 핵산 서열, 서열번호 2와 적어도 50% 동일한 PPE68 항원을 코딩하는 핵산 서열, 서열번호 3과 적어도 50% 동일한 ESXA 항원을 코딩하는 핵산 서열, 서열번호 4와 적어도 50% 동일한 ESXB 항원을 코딩하는 핵산 서열, 서열번호 5와 적어도 50% 동일한 ADK 항원을 코딩하는 핵산 서열, 및/또는 이들의 조합;
(ii) 서열번호 6과 적어도 50% 동일한 Ag85B 항원을 코딩하는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 7과 적어도 50% 동일한 PPE68 항원을 코딩하는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 8과 적어도 50% 동일한 ESXA 항원을 코딩하는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 9와 적어도 50% 동일한 ESXB 항원을 코딩하는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 10과 적어도 50% 동일한 ADK 항원을 코딩하는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및/또는 이들의 조합;
(iii) 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4 또는 서열번호 5의 핵산 서열의 기능적 단편을 코딩하는 (i)의 핵산; 및/또는
(iv) 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9 또는 서열번호 10의 아미노산 서열의 기능적 단편을 코딩하는 (ii)의 아미노산 서열 중 하나 또는 조합을 포함하는 세포 또는 복수의 세포에 관한 것이다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 (i) 서열번호 17 내지 59와 적어도 50% 동일한 Ag85B 항원을 코딩하는 핵산 서열, 서열번호 17 내지 59와 적어도 50% 동일한 PPE68 항원을 코딩하는 핵산 서열, 서열번호 17 내지 59와 적어도 50% 동일한 ESXA 항원을 코딩하는 핵산 서열, 서열번호 17 내지 59와 적어도 50% 동일한 ESXB 항원을 코딩하는 핵산 서열, 서열번호 17 내지 59와 적어도 50% 동일한 ADK 항원을 코딩하는 핵산 서열, 및/또는 이들의 조합 중 하나 또는 조합을 포함하는 세포 또는 복수의 세포에 관한 것이다;
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 (i) 서열번호 17 내지 59와 적어도 50% 동일한 Ag85B 항원을 코딩하는 핵산 서열, 서열번호 17 내지 59와 적어도 50% 동일한 PPE68 항원을 코딩하는 핵산 서열, , 서열번호 17 내지 59와 적어도 50% 동일한 ESXA 항원을 코딩하는 핵산 서열, 서열번호 17 내지 59와 적어도 50% 동일한 ESXB 항원을 코딩하는 핵산 서열, 서열번호 17 내지 59와 적어도 50% 동일한 ADK 항원을 코딩하는 핵산 서열, 및/또는 이들의 조합; 및/또는 (ii) 서열번호 1과 적어도 50% 동일한 Ag85B 항원을 코딩하는 핵산 서열, 서열번호 2와 적어도 50% 동일한 PPE68 항원을 코딩하는 핵산 서열, 서열번호 3과 적어도 50% 동일한 ESXA 항원을 코딩하는 핵산 서열, 서열번호 4와 적어도 50% 동일한 ESXB 항원을 코딩하는 핵산 서열, 서열번호 5와 적어도 50% 동일한 ADK 항원을 코딩하는 핵산 서열, 및/또는 이들의 조합; 및/또는
(iii) 서열번호 6과 적어도 50% 동일한 Ag85B 항원을 코딩하는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 7과 적어도 50% 동일한 PPE68 항원을 코딩하는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 8과 적어도 50% 동일한 ESXA 항원을 코딩하는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 9와 적어도 50% 동일한 ESXB 항원을 코딩하는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 10과 적어도 50% 동일한 ADK 항원을 코딩하는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및/또는 이들의 조합; 및/또는
(iv) 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4 또는 서열번호 5의 핵산 서열의 기능적 단편을 코딩하는 (ii)의 핵산; 및/또는
(v) 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9 또는 서열번호 10의 아미노산 서열의 기능적 단편을 코딩하는 (iii)의 아미노산 서열 중 하나 또는 조합에 노출되거나 이에 자극된 분리된 세포 또는 복수의 세포에 관한 것이다.
T 세포를 확장하도록 조작된 세포
일 양태에서, 본 개시내용은 생체 외 T 세포를 확장하도록 조작된 세포를 제공하며, 여기서 세포는 Ag85B, PPE68, ESXA, ESXB 및 ADK로부터 선택된 적어도 2개의 항원을 포함하고, 여기서 세포는 각각이 적어도 2개의 항원 중 하나 이상을 코딩하는 하나 이상의 핵산을 세포 내로 도입하는 단계; 및 하나 이상의 항원의 생산에 적합한 조건 하에서 세포를 배양하는 단계를 포함하는 프로세스에 의해 생산된다. 일부 실시형태에서, 하나 또는 다수의 숙주 세포에는 세포의 면역 반응 또는 클론 확장을 유도하거나 자극하기 위해 도입된 폴리펩티드 또는 핵산 서열을 제외하고는 임의의 외인성 DNA 및/또는 RNA 및/또는 폴리펩티드가 없다.
일 양태에서, 본 개시내용은 생체 외 T 세포를 확장하도록 조작된 세포를 제공하며, 여기서 세포는 Ag85B, PPE68, ESXA, ESXB 및 ADK로부터 선택된 적어도 3개의 항원을 포함하고, 여기서 세포는 각각이 적어도 3개의 항원 중 하나 이상을 코딩하는 하나 이상의 핵산을 세포 내로 도입하는 단계; 및 하나 이상의 항원의 생산에 적합한 조건 하에서 세포를 배양하는 단계를 포함하는 프로세스에 의해 생산된다.
일 양태에서, 본 개시내용은 생체 외 T 세포를 확장하도록 조작된 세포를 제공하며, 여기서 세포는 Ag85B, PPE68, ESXA, ESXB 및 ADK로부터 선택된 적어도 4개의 항원을 포함하고, 여기서 세포는 각각이 적어도 4개의 항원 중 하나 이상을 코딩하는 하나 이상의 핵산을 세포 내로 도입하는 단계; 및 하나 이상의 항원의 생산에 적합한 조건 하에서 세포를 배양하는 단계를 포함하는 프로세스에 의해 생산된다.
일 양태에서, 본 개시내용은 생체 외 T 세포를 확장하도록 조작된 세포를 제공하며, 여기서 세포는 Ag85B, PPE68, ESXA, ESXB 및 ADK로부터 선택된 적어도 5개의 항원을 포함하고, 여기서 세포는 각각이 적어도 5개의 항원 중 하나 이상을 코딩하는 하나 이상의 핵산을 세포 내로 도입하는 단계; 및 하나 이상의 항원의 생산에 적합한 조건 하에서 세포를 배양하는 단계를 포함하는 프로세스에 의해 생산된다.
일부 실시형태에서, 세포는 항원 제시 세포, 말초 혈액 단핵 세포, 제대혈 세포, 정제된 T 세포 집단, 및 T 세포주, B 세포, 단핵구, 가지 세포, 피토해마글루티닌 블라스트(Phytohemagglutinin blast), 또는 K562 또는 다른 세포주와 같은 불멸화된 세포를 기반으로 하는 인공 항원 제시 세포이다.
일부 실시형태에서, 핵산은 DNA 또는 RNA를 포함한다. 일부 실시형태에서, 도입 단계는 바이러스 형질 도입을 포함한다. 다른 실시형태에서, 도입 단계는 전기 천공을 포함한다.
T 세포의 공급원
특정 실시형태에서, 확장 전에, T 세포의 공급원은 대상체로부터 수득된다. 대상체의 비제한적인 예는 인간, 개, 고양이, 마우스, 래트 및 그의 트랜스제닉 종을 포함한다. 일부 실시형태에서, 대상체는 인간이다. T 세포는 말초 혈액 단핵 세포, 골수, 림프절 조직, 비장 조직, 탯줄 및 종양을 포함하는 여러 출처에서 얻을 수 있다. 특정 실시형태에서, 당업계에서 이용 가능한 임의의 수의 T 세포주가 사용될 수 있다. 특정 실시형태에서, T 세포는 피콜 분리와 같은 숙련된 기술자에게 공지된 임의의 수의 기술을 사용하여 대상체로부터 수집된 혈액 단위로부터 수득될 수 있다. 일부 실시형태에서, 개인의 순환 혈액으로부터의 세포는 성분채집술(apheresis) 백혈구성분채집술(leukapheresis)에 의해 수득된다. 성분채집 생성물은 전형적으로 T 세포, 단핵구, 과립구, B 세포, 기타 유핵 백혈구, 적혈구 및 혈소판을 포함하는 림프구를 함유한다. 후속 처리 단계를 위해, 성분채집술에 의해 수집된 세포는 세척되어 혈장 분획을 제거하고 세포를 적절한 완충액이나 배지, 예컨대 인산염 완충 식염수(PBS)에 위치시킬 수 있거나 세척 용액은 칼슘이 부족하고 마그네슘이 부족할 수 있거나 모든 2가 양이온은 아니더라도 많은 양이 부족할 수 있다. 세척 후, 세포는 예를 들어 Ca-없고, Mg-없는 PBS와 같은 다양한 생체 적합성 완충액에 재현탁될 수 있다. 대안적으로, 성분채집 샘플의 바람직하지 않은 성분은 제거될 수 있고 세포는 배양 배지에 직접 재현탁될 수 있다.
다른 실시형태에서, T 세포는 예를 들어 PERCOLL™ 구배를 통한 원심 분리에 의해 적혈구를 용해하고 단핵구를 고갈시킴으로써 말초 혈액으로부터 분리된다. 대안적으로, T 세포는 탯줄에서 분리될 수 있다. 어떤 경우에도 T 세포의 특정 하위 집단은 양성 또는 음성 선택 기술에 의해 추가로 분리될 수 있다.
이렇게 분리된 제대혈 단핵 세포는 CD34, CD8, CD14, CD19 및 CD56을 포함하지만 이에 제한되지 않는 특정 항원을 발현하는 세포가 고갈될 수 있다. 이들 세포의 고갈은 분리된 항체, 복수와 같은 항체를 포함하는 생물학적 샘플, 물리적 지지체에 결합된 항체, 및 세포 결합된 항체를 사용하여 수행될 수 있다.
음성 선택에 의한 T 세포 집단의 풍부화는 음성으로 선택된 세포에 고유한 표면 마커에 대한 항체 조합을 사용하여 수행된다. 바람직한 방법은 음성으로 선택된 세포에 존재하는 세포 표면 마커에 대한 단일 클론 항체의 칵테일을 사용하는 음성 자기 면역 부착 또는 유세포 분석을 통한 세포 분류 및/또는 선택이다. 예를 들어, 음성 선택에 의해 CD4+ 세포를 풍부하게 하기 위해, 모노클로날 항체 칵테일은 전형적으로 CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR 및 CD8에 대한 항체를 포함한다.
양성 또는 음성 선택에 의해 원하는 세포 집단을 분리하기 위해, 세포 및 표면(예를 들어, 비드와 같은 입자)의 농도가 변화될 수 있다. 특정 실시형태에서, 세포와 비드의 최대 접촉을 보장하기 위해 비드와 세포가 함께 혼합되는 부피를 상당히 감소시키는 것(즉, 세포의 농도 증가)이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 20억 세포/ml의 농도가 사용된다. 일부 실시형태에서, 10억 세포/ml의 농도가 사용된다. 추가 실시형태에서, 1억 초과의 세포/ml가 사용된다. 추가 실시형태에서, 1000만, 1500만, 2000만, 2500만, 3000만, 3500만, 4000만, 4500만 또는 5000만 세포/ml의 세포 농도가 사용된다. 또 다른 실시형태에서, 7500만, 8000만, 8500만, 9000만, 9500만 또는 1억 세포/ml의 세포 농도가 사용된다. 추가 실시형태에서, 1억 2500만 또는 1억 5000만 세포/ml의 농도가 사용될 수 있다. 높은 농도의 사용은 증가된 세포 수율, 세포 활성화 및 세포 확장을 초래할 수 있다.
T 세포는 또한 세척 단계 후에 동결될 수 있으며, 이는 단핵구 제거 단계가 필요없다. 이론에 얽매이고 싶지는 않지만, 동결 및 후속 해동 단계는 과립구를 제거하고 세포 집단에서 어느 정도 단핵구를 제거함으로써 보다 균일한 제품을 제공한다. 혈장과 혈소판을 제거하는 세척 단계 후, 세포는 동결 용액에 현탁될 수 있다. 많은 동결 용액 및 파라미터가 당업계에 공지되어 있고 이러한 맥락에서 유용할 것이지만, 비제한적인 예에서, 하나의 방법은 20% DMSO 및 8% 인간 혈청 알부민을 함유하는 PBS 또는 다른 적합한 세포 동결 배지를 사용하는 것을 포함한다. 그 다음, 세포는 분당 1°의 속도로 -80℃로 동결되고 액체 질소 저장 탱크의 증기 상에 저장된다. 제어된 동결의 다른 방법이 사용될 수 있으며, 또한 -20℃에서 또는 액체 질소에서 즉시 제어되지 않은 동결이 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 세포 집단은 말초 혈액 단핵 세포, 제대혈 세포, 정제된 T 세포 집단 및 T 세포주를 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 전기 천공될 세포 집단은 말초 혈액 단핵 세포를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 전기 천공될 세포 집단은 정제된 T 세포를 포함한다.
T 세포의 확장
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 각각 적어도 2, 3, 4 또는 5개의 항원 중 하나 이상을 코딩하는 하나 이상의 핵산을 포함하는 T 세포를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 각각 적어도 2, 3, 4 또는 5개의 항원 중 하나 이상을 코딩하는 하나 이상의 핵산을 포함하는 확장된 T 세포 집단을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 핵산은 적어도 하나의 세포 집단에 도입되어 세포 표면에서 발현된다. 본 발명은 또한 각각 서열번호 17 내지 서열번호 59의 조합 중 임의의 하나로부터 선택된 적어도 1, 2, 3, 4 또는 5개의 항원 중 하나 이상을 코딩하는 하나 이상의 핵산을 포함하는 확장된 T 세포 집단을 포함한다. 임의의 세트의 실시형태에서, 본원에 개시된 방법 또는 조성물은 분리된 T 세포를 2 이상의 서열번호 17 내지 서열번호 59의 조합의 어느 하나에 개별적으로 노출 또는 자극하는 것을 포함한다.
일부 실시형태에서, 확장될 T 세포의 공급원은 말초 혈액 단핵 세포(PMBC)이다.
일부 실시형태에서, T 세포는, 마이코박테리움 종으로부터 Ag85B 항원을 코딩하는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드, 마이코박테리움 종으로부터 PPE68 항원을 코딩하는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드, 마이코박테리움 종으로부터 ESXA 항원을 코딩하는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드, 마이코박테리움 종으로부터 ESXB 항원을 코딩하는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드, 마이코박테리움 종으로부터 ADK 항원을 코딩하는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드, 또는 이들의 조합과 접촉하여 확장된다.
일부 실시형태에서, T 세포는 항원 제시 세포와의 접촉에 의해 확장되며, 여기서 항원 제시 세포는 마이코박테리움 종으로부터 Ag85B 항원을 코딩하는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드, 마이코박테리움 종으로부터 PPE68 항원을 코딩하는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드, 마이코박테리움 종으로부터 ESXA 항원을 코딩하는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드, 마이코박테리움 종으로부터 ESXB 항원을 코딩하는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드, 마이코박테리움 종으로부터 ADK 항원을 코딩하는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드, 또는 이들의 조합을 발현하는 것을 제시한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 집단을 배양하는 것을 포함하는 T 세포 집단(예를 들어, 하나 또는 복수의 분리된 T 세포)을 확장하는 방법을 포함하며, 여기서 집단 내에 함유된 T 세포는 적어도 약 10배 확장된다. 일부 실시형태에서, 집단 내에 함유된 T 세포는 적어도 약 5배, 10배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 100배, 200배, 300배, 400배, 500배, 600배, 700배, 800배, 900배, 1000배, 2000배, 3000배, 4000배, 5000배, 6000배, 7000배, 8000배, 9000배, 10,000배, 100,000배, 1,000,000배, 10,000,000배 또는 그 이상 확장된다. 일부 실시형태에서, T 세포는 약 5배 내지 약 100배 범위에서 확장된다.
배양 후, T 세포는, 세포를 다른 배양 장치로 전달하기 전에 최적의 계대를 위해 세포가 합류 또는 높은 세포 밀도에 도달하기에 충분한 기간 동안 또는 도달할 때까지 배양 장치의 세포 배지에서 배양될 수 있다. 배양 장치는 시험관 내에서 세포를 배양하기 위해 일반적으로 사용되는 임의의 배양 장치일 수 있다. 기간은 시험관 내 세포 배양에 적합한 임의의 시간일 수 있다. T 세포 배지는 T 세포의 배양 동안 언제든지 교체될 수 있다. 바람직하게는, T 세포 배지는 약 2 내지 3 일마다 교체된다. 그 다음, T 세포가 배양 장치에서 수확되어 T 세포가 즉시 사용되거나 저온 보존하여 나중에 사용하기 위해 저장될 수 있다. 일부 실시형태에서, 방법은 배양된 T 세포를 저온 보존하는 것을 추가로 포함한다.
세포는 미국 특허 제5,199,942호(본원에 참조로 포함됨)에 설명된 방법을 사용하여 추가로 확장될 수 있다. 미국 특허 제5,199,942호에 설명된 것과 같은 확장은 본원에 설명된 다른 확장 방법에 추가될 수 있다. 간단히 말해서, 생체 외 배양 및 T 세포의 확장은 신속한 확장 프로토콜(REP)을 위해 세포 성장 인자, 예컨대 미국 특허 제5,199,942호에 설명된 것, 또는 기타 인자, 예컨대 flt3-L, IL-1, IL-2, IL-3 및 c-kit 리간드, 예를 들어 문헌[Dudley et al., J. Immunol., 26(4):332-342, 2003]에 설명된 것에 대한 추가를 포함한다.
일부 실시형태에서, 생체 외 T 세포를 확장하는 방법은 본원에 개시된 마이코박테리아 항원 또는 기능적 단편을 코딩하는 핵산 및/또는 코딩하는 아미노산과의 접촉 전, 후 또는 동시에 하나 이상의 시토카인으로 하나 또는 복수의 T 세포를 자극하는 것을 포함한다. 예시적인 시토카인은 IL-4, IL-7, IL-21, IFNα, IL-15 및 TGFβ를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 각각의 시토카인은 코딩된 전술한 폴리펩티드의 인간 변이체 또는 인간 서열이다.
일부 실시형태에서, IL-4는 아래에 서열번호 11로 제시된 GenBank 수탁 번호 AAH70123.1에 대응한다.
서열번호 11
1 mgltsqllpp lffllacagn fvhghkcdit lqeiiktlns lteqktlcte ltvtdifaas
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일부 실시형태에서, IL-7는 아래에 서열번호 12로 제시된 GenBank 수탁 번호 AAH47698.1에 대응한다.
서열번호 12
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일부 실시형태에서, IL-21은 아래에 서열번호 13로 제시된 GenBank 수탁 번호 BBA22643.1에 대응한다.
서열번호 13
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일부 실시형태에서, IL-15는 아래에 서열번호 14로 제시된 GenBank 수탁 번호 AAI00964.1에 대응한다.
서열번호 14
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61 edliqsmhid atlytesdvh psckvtamkc fllelqvisl esgdasihdt venliilann
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일부 실시형태에서, IFNα는 아래에 서열번호 15로 제시된 GenBank 수탁 번호 AAA52724.1에 대응한다.
서열번호 15
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일부 실시형태에서, TGFβ는 아래에 서열번호 16으로 제시된GenBank 수탁 번호 AAA36738.1에 대응한다.
서열번호 16
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일 양태에서, T 세포를 확장하는 방법은 배양 단계를 추가로 포함할 수 있다. 배양 단계는 매우 짧을 수 있으며, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 또는 23 시간과 같은 24시간 미만일 수 있다. 배양 단계는 더 길 수 있으며, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14일 또는 그 이상일 수 있다.
배양에서 세포를 설명하기 위해 다양한 용어가 사용된다. 세포 배양은 일반적으로 살아있는 유기체에서 채취하여 관심있는 세포의 배양을 확립하기에 충분한 제어된 조건 또는 조건들에서 성장한 세포를 의미한다 - 하나 또는 다수의 세포의 생존력을 유지하고 대상체 외부의 세포의 수를 증식 또는 성장시키기 위해. 1차 세포 배양은 제1 계대 배양 전에 유기체에서 직접 채취한 세포, 조직 또는 기관의 배양이다. 세포는 세포 성장 및/또는 분열을 촉진하는 조건 하에서 성장 배지에 위치될 때 배양에서 확장되어 더 많은 세포 집단을 생성한다. 세포가 배양에서 확장될 때, 세포 증식 속도는 전형적으로 세포 수가 2배로 되는 데 필요한 시간의 양(배가 시간이라고도 함)에 의해 측정된다.
계대 배양의 각 라운드는 계대(passage)로 지칭된다. 세포가 계대 배양될 때, 그들은 계대된 것으로 지칭된다. 특정 세포 집단 또는 세포주는 때때로 그것이 계대된 횟수에 의해 지칭되거나 그것을 특징으로 한다. 예를 들어, 10회 계대 배양된 세포 집단은 P10 배양으로 지칭될 수 있다. 1차 배양, 즉 조직에서 세포를 분리한 후의 첫번째 배양은 P0으로 지정된다. 첫번째 계대 배양 후, 세포는 이차 배양(P1 또는 계대 1)으로 설명된다. 두번째 계대 배양 후, 세포는 3 차 배양(P2 또는 계대 2)이 되는 식으로 계속된다. 계대 기간 동안 많은 집단 배가가 있을 수 있다는 것이 당업자에 의해 이해될 것이며; 따라서 배양의 집단 배가 수는 계대 수보다 크다. 계대 사이의 기간 동안 세포의 확장(즉, 집단 배가 수)은 파종 밀도, 기질, 배지 및 계대 사이의 시간을 포함하지만 이에 제한되지 않는 많은 요인에 의존한다.
일부 실시형태에서, 세포는 수 시간(약 3 시간) 내지 약 14 일 동안 또는 그 사이의 임의의 시간당 정수 값 동안 배양될 수 있다. T 세포 배양에 적합한 조건은 혈청(예를 들어, 소 태아 또는 인간 혈청), 인터루킨-2 (IL-2), 인슐린, IFN-γ, IL-4, IL-7, GM-CSF, IL-10, IL-12, IL-15, TGFβ 및 TNF-α 또는 당업자에게 알려진 세포의 성장을 위한 임의의 다른 첨가제를 포함하는, 증식 및 생존력에 필요한 인자를 포함할 수 있는 적절한 배지(예를 들어, Minimal Essential Media 또는 RPMI Media 1640 또는 X-vivo 15,(Lonza))를 포함한다. 세포 성장을 위한 다른 첨가제는 계면 활성제, 플라스마네이트 및 환원제, 예컨대 N-아세틸-1-시스테인 및 2-머캅토에탄올을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 배지는 RPMI 1640, AIM-V, DMEM, MEM, a-MEM, F-12, X-Vivo 15 및 X-Vivo 20, Optimizer를 포함할 수 있으며, 아미노산, 피루브산 나트륨 및 비타민이 추가되며, 이는 혈청이 없거나 적절한 양의 혈청(또는 플라즈마) 또는 정의된 호르몬 세트, 및/또는 T 세포의 성장 및 확장에 충분한 양의 시토카인(들)이 보충된다. 항생제, 예를 들어 페니실린 및 스트렙토마이신은 대상체 내에 주입될 세포 배양이 아닌 실험 배양에만 포함된다. 일부 실시형태에서, 표적 세포는 성장을 지원하는 데 필요한 조건, 예를 들어 적절한 온도(예를 들어, 37℃) 및 대기(예를 들어, 공기 + 5% CO2) 하에서 유지된다.
T 세포를 배양하는데 사용되는 배지는 T 세포를 공동 자극할 수 있는 약제를 포함할 수 있다. 예를 들어, CD3를 자극할 수 있는 약제는 CD3에 대한 항체이고 CD28을 자극할 수 있는 약제는 CD28에 대한 항체이다.
특정 실시형태에서, T 세포의 특정 집단이 분리된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, T 세포 집단은 헬퍼 T 세포, 세포 독성 T 세포, 감마/델타 T 세포, 중앙 메모리 T 세포 및/또는 이펙터 메모리 T 세포로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 헬퍼 T 세포는 CD45+CD3+CD4+ 세포로서 식별될 수 있다. 식별은 예를 들어 유세포 분석법에 의해 수행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포 독성 T 세포는 CD45+CD3+CD8+ 세포로서 식별될 수 있다. 식별은 예를 들어 유세포 분석법에 의해 수행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 감마/델타 T 세포는 CD45+CD3+CD4-CD8-TCRgd+ 세포로서 식별될 수 있다. 식별은 예를 들어 유세포 분석법에 의해 수행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 중앙 메모리 T 세포는 CD45+CD3+CD45RA-CCR7+ 세포로서 식별될 수 있다. 식별은 예를 들어 유세포 분석법에 의해 수행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 이펙터 메모리 T 세포는 CD45+CD3+CD45RA-CCR7-세포로서 식별될 수 있다. 식별은 예를 들어 유세포 분석법에 의해 수행될 수 있다. 본 개시내용은 대상체에서 마이코박테리움 감염을 치료 또는 예방하는데 필요한 제약상 유효량으로 본원에 개시된 임의의 하나 또는 복수의 세포를 포함하는 제약 조성물을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 제약상 유효량
치료
본 개시내용의 조성물(예를 들어, 마이코박테리움 종으로부터의 항원 또는 이의 기능적 단편을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 조성물, 마이코박테리움 종으로부터 항원을 코딩하는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 조성물) 및 본원에 개시된 제약 조성물은 다양한 치료에 사용될 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 개시내용의 조성물(예를 들어, 마이코박테리움 종으로부터의 항원 또는 이의 기능적 단편을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 조성물, 마이코박테리움 종으로부터 항원을 코딩하는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 조성물) 및 본원에 개시된 제약 조성물은 이를 필요로 하는 대상체에서 마이코박테리움 감염 또는 이에 의해 야기되거나 이와 관련된 임의의 질병 및 병리학적 상태를 치료하는데 사용된다. 특정 실시형태에서, 본 개시내용의 조성물(예를 들어, 마이코박테리움 종으로부터의 항원 또는 이의 기능적 단편을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 조성물, 마이코박테리움 종으로부터 항원을 코딩하는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 조성물) 및 본원에 개시된 제약 조성물은 이를 필요로 하는 대상체에서 마이코박테리움 감염 또는 이에 의해 야기되거나 이와 관련된 임의의 질병 및 병리학적 상태를 예방하는데 사용된다. 이러한 용도는 마이코박테리아 항원/에피토프에 대한 보호 면역 반응을 유도하거나 자극하는 것을 목표로 한다. 본 개시내용은 본원에 개시된 하나 또는 복수의 조성물에 의해 자극된 하나 또는 복수의 숙주 세포를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 마이코박테리움 감염을 치료 및/또는 예방하는 방법에 관한 것이다. 본 개시내용은 본원에 개시된 하나 또는 복수의 조성물에 의해 자극된 치료적 유효량의 세포를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 마이코박테리움 감염을 치료 및/또는 예방하는 방법에 관한 것이다.
일부 실시형태에서, 마이코박테리움 감염은 활성 감염이다. 활성 감염은 심각한 질병 증상이 나타난 마이코박테리움 감염을 지칭한다. 예를 들어, 인간 대상체에서, TB는 일반적인 임상 징후(예를 들어, 체중 감소, 무력증, 발열, 식은 땀), 임상 징후 및/또는 증상(예를 들어, 기침, 객혈, 폐결핵의 경우 흉통), 및/또는 일부 경우 감염 부위에 따른 폐외 징후(예를 들어, 림프절, 뼈 형태, 수막염, 비뇨 생식기 형태)를 특징으로 한다.
일부 실시형태에서, 대상체는 면역 약화된 숙주이다. 본 개시내용의 실시형태에서, 면역 약화된 숙주는 적응성 또는 선천성 면역에 선천적 또는 후천적 결함이 있는 대상체(일차 면역 결핍 장애, 화학 요법 또는 면역 억제 요법을 받는 환자, 또는 조혈 줄기 세포 이식을 받는 환자를 포함하지만 이에 제한되지 않음)를 지칭한다. 추가 실시형태에서, 면역 약화된 숙주는 마이코박테리움 종에 감염된 것으로 진단되거나 의심된다.
다른 실시형태에서, 치료될 대상체는 신생아, 유아, 청년 또는 성인일 수 있다. 대상체는 본원에 기재된 조성물 또는 세포로 치료하기 전에 마이코박테리움 감염에 대해 이전에 치료를 받았을 수 있다. 대상체는 다른 병원성 유기체(예를 들어, 인간 면역 결핍 바이러스 HIV)에 공동 감염될 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다. 일부 실시형태에서, 치료 방법은 대상체 내 마이코박테리아 DNA의 검출 가능한 수준의 약 10%만큼 대상체 내 전체 감염을 감소시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 치료는 대상체 내의 전체 감염을 무증상 수준으로 감소시킨다.
일부 실시형태에서, 방법 또는 방법들은 활성 질환이 발병하여 마이코박테리움 감염이 발병할 위험이 있는 감염된 개체와 밀접하게 접촉한 대상체(TB를 갖는 개인이 기침한 습한 비말에서의 간균 흡입에 의한 전파)에서 감염을 예방하거나 지연시키는 데 사용된다.
일부 실시형태에서, 감염을 예방하거나 지연시키는 방법은 잠복 감염된 대상체에서 수행된다. 잠복 감염된 대상체는 이미 악성 마이코박테리움 종(예를 들어, Mtb)에 감염되었지만 뚜렷한 질병 증상이나 임상 징후를 보이지 않는 개인을 의미한다. 전형적으로, 잠복 감염된 대상체는 체내에 마이코박테리움을 보유하고 있으며, 임상적으로 아프지는 않지만, 특히 면역 억제(예를 들어, HIV와 같은 다른 병원체에 의한 공동 감염 또는 TNFa 억제제와 같은 면역 억제 치료 하에)의 맥락에서 임상 질환(재활성화)으로의 후속 진행의 위험을 보유한다. Mtb 잠복 감염된 대상체는 Mtb 감염의 진단을 허용하는 임의의 테스트(예를 들어, 투베르쿨린 테스트, PPD 반응성에 대한 Mantoux 테스트 및/또는 IFNg 방출 분석)에 의해 테스트되는 경우 양성일 것으로 예상될 것이다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 이를 필요로 하는 대상체에서 T 세포-매개 면역 반응을 자극하는 방법을 특징으로 하며, 본 방법은 본 개시내용의 조성물(예를 들어, 마이코박테리움 종으로부터의 항원 또는 이의 기능적 단편을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 조성물, 마이코박테리움 종으로부터 항원을 코딩하는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 조성물) 또는 본원에 개시된 제약 조성물의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 입양(adoptive) 세포 전달 요법을 위한 방법을 포함한다. 방법은 마이코박테리아 감염을 예방 또는 치료하기 위해 이를 필요로 하는 대상체에게 T 세포를 포함하는 확장된 세포 집단을 투여하는 것을 포함한다. 이 실시형태에서, 확장된 세포 집단은 본원에 기재된 바와 같이 확장된다. 본원에 기재된 바와 같이 생성된 확장된 T 세포는 균일하고 T 세포 기능을 보유한다.
일부 실시형태에서, 유도되거나 자극된 면역 반응은 특이적이다(즉, 마이코박테리아 에피토프/항원에 대해). 본 개시내용의 맥락에서, 면역 반응은 바람직하게는 마이코박테리아 항원/에피토프에 대한 CD4+ 또는 CD8+-매개 T 세포 반응, 또는 둘 모두이다.
특정 실시형태에서, T 세포 반응은 특정 T 세포 집단의 조합(하나 이상)의 활성화를 특징으로 한다. 예를 들어, T 세포 반응은 헬퍼 T 세포, 세포 독성 T 세포, 감마/델타 T 세포, 중앙 메모리 T 세포 및/또는 이펙터 메모리 T 세포의 활성화를 특징으로 할 수 있으며, 여기서 각각의 특정 T 세포 집단은 전체 T 세포 집단의 백분율을 차지한다.
일부 실시형태에서, 헬퍼 T 세포는 전체 T 세포 집단의 약 60% 내지 약 90%, 전체 T세포 집단의 약 60% 내지 약 80%, 약 60% 내지 약 70%, 약 70% 내지 약 80%, 약 70% 내지 약 90%, 약 80% 내지 약 90%를 차지한다. 추가 실시형태에서, 헬퍼 T 세포는 전체 T 세포 집단의 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85% 또는 약 90%를 차지할 수 있다. 헬퍼 T 세포는 CD45+CD3+CD4+ 세포로서 식별될 수 있다. 식별은 예를 들어 유세포 분석법에 의해 수행될 수 있다.
일부 실시형태에서, 세포 독성 T 세포는 전체 T 세포 집단의 약 0% 내지 약 40%, 전체 T 세포 집단의 약 0% 내지 약 30%, 약 0% 내지 약 20%, 약 0% 내지 약 10%, 약 10% 내지 약 20%, 약 10% 내지 약 30%, 약 10% 내지 약 40%, 약 20% 내지 약 40%, 약 30% 내지 약 40%를 차지한다. 추가 실시형태에서, 세포 독성 T 세포는 전체 T 세포 집단의 약 0%, 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35% 또는 약 40%를 차지할 수 있다. 세포 독성 T 세포는 CD45+CD3+CD8+ 세포로서 식별될 수 있다. 식별은 예를 들어 유세포 분석법에 의해 수행될 수 있다.
일부 실시형태에서, 감마/델타 T 세포는 전체 T 세포 집단의 약 0.5% 내지 약 10%, 전체 T 세포 집단의 약 0.5% 내지 약 5%, 약 0.5% 내지 약 1%, 약 1% 내지 약 5%, 약 1.5% 내지 약 5%, 약 2% 내지 약 5%, 약 3% 내지 약 5%, 약 4% 내지 약 5%를 차지한다. 추가 실시형태에서, 감마/델타 T 세포는 전체 T 세포 집단의 약 0.5%, 약 1%, 약 1.5%, 약 2%, 약 2.5%, 약 3%, 약 3.5%, 약 4%, 약 4.5%, 약 5%, 약 6%, 약 7%, 약 8%, 약 9% 또는 약 10%를 차지할 수 있다. 감마/델타 T 세포는 CD45+CD3+CD4-CD8-TCRgd+ 세포로서 식별될 수 있다. 식별은 예를 들어 유세포 분석법에 의해 수행될 수 있다.
일부 실시형태에서, 중앙 메모리 T 세포는 전체 T 세포 집단의 약 0.5% 내지 약 15%, 전체 T 세포 집단의 약 0.5% 내지 약 10%, 약 0.5% 내지 약 5%, 약 0.5% 내지 약 1%, 약 1% 내지 약 15%, 약 1% 내지 약 10%, 약 1% 내지 약 5%, 약 5% 내지 약 15%, 약 5% 내지 약 10%, 약 10% 내지 약 15%를 차지한다. 추가 실시형태에서, 중앙 메모리 T 세포는 전체 T 세포 집단의 약 0.5%, 약 1%, 약 1.5%, 약 2%, 약 2.5%, 약 3%, 약 3.5%, 약 4%, 약 4.5%, 약 5%, 약 6%, 약 7%, 약 8%, 약 9%, 약 10%, 약 11%, 약 12%, 약 13%, 약 14% 또는 약 15%를 차지할 수 있다. 중앙 메모리 T 세포는 CD45+CD3+CD45RA-CCR7+ 세포로서 식별될 수 있다. 식별은 예를 들어 유세포 분석법에 의해 수행될 수 있다.
일부 실시형태에서, 이펙터 메모리 T 세포는 전체 T 세포 집단의 약 20% 내지 약 60%, 전체 T 세포 집단의 약 20% 내지 약 50%, 약 20% 내지 약 40%, 약 20% 내지 약 30%, 약 30% 내지 약 60%, 약 30% 내지 약 50 %, 약 30% 내지 약 40%, 약 40% 내지 약 60%, 약 40% 내지 약 50%, 약 50% 내지 약 60%를 차지한다. 추가 실시형태에서, 이펙터 메모리 T 세포는 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55% 또는 약 60%를 차지할 수 있다. 이펙터 메모리 T 세포는 CD45+CD3+CD45RA-CCR7-세포로서 식별될 수 있다. 식별은 예를 들어 유세포 분석법에 의해 수행될 수 있다.
면역 반응을 유도하거나 자극하는 본원에 기재된 조성물 및 세포의 능력은 당업계에서 표준인 다양한 직접 또는 간접 분석을 사용하여 시험관 내 또는 생체 내에서 평가될 수 있다.
세포 면역의 평가는 예를 들어 본원에 기재된 면역성 조합 및 융합 폴리펩티드에 포함되거나 이에 의해 코딩되는 마이코박테리아 항원 중 적어도 하나에 특이적인 T 림프구와 같은 면역 세포에서의 증가된 빈도에 의해 추정될 수 있다. 또한 방사성 표지 시 세포 증식을 모니터링할 수도 있다(예를 들어, [3H] 티미딘 혼입 분석에 의한 T 세포 증식 분석). 면역 반응을 감지하는 다른 민감한 방법은 IFNg 생산 세포의 빈도가 결정되는 ELISpot이다. 항원-특이적 T 림프구에 대한 세포 독성 능력은 또한 감작된 대상체에서 또는 적절한 동물 모델의 면역화에 의해 평가될 수 있다. 일상적인 생물학적 분석(예를 들어, 다중 파라미터 유세포 분석(ICS), 멀티플렉스 기술 또는 ELISA를 사용한 시토카인 프로파일 분석 등에 의해)을 사용하는 활성화된 T 세포에 의해 생성된 관련 Thl 및/또는 Th2 시토카인(들)의 방출의 정량화에 의해 진행할 수도 있다. 또한 PCR 기술을 사용하여 관련 시토카인을 코딩하는 mRNA의 존재를 결정할 수도 있다. 당업자는 이러한 관련 시토카인의 양의 현저한 증가 또는 감소를 사용하여 본원에 기재된 활성제(들) 중 하나 이상의 면역성 활성을 평가할 수 있음을 인식할 것이다.
보호 면역 반응은 적절한 실험 동물, 예를 들어 마우스, 래트또는 기니피그(문헌[Ashwin et al, 2008, Am J Resp, 39: 503-8; Acosta et al, 2011, Malays J Med, 18: 5-12] 참조)에서 생체 내에서, 예를 들어, 마이코박테리움의 동일한 악성 균주에 감염되었지만 이전에 면역화되지 않은 실험 동물의 대조군에서 마이코박테리아 cfu와 비교하여, 본원에 기재된 조성물 중 하나 이상으로 이미 면역화된 후,마이코박테리움 종(예를 들어, Mtb)의 악성 균주에 감염된 동물로부터 분리된 비장, 폐 또는 다른 조직 균질물에서 마이코박테리아 콜로니 형성 단위(cfu)의 감소를 측정함으로써 평가될 수 있다. 치료된 그룹과 치료되지 않은 그룹 간의 비교는 동물 생존율에 대해서도 평가될 수 있다(치료된 그룹에서 증가된 생존율은 보호 면역 반응과 관련이 있을 것이다).
이러한 면역학적 판독은 본원에 기재된 활성제(들)에 의해 제공되는 마이코박테리움 감염에 대한 보호 면역 반응의 좋은 상관 관계이다.
다른 양태에서, 본원에 기재된 T 세포는 치료용 조성물에 포함될 수 있다. 조성물은 제약 조성물을 포함할 수 있고 추가로 제약상 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. T 세포를 포함하는 제약 조성물의 치료적 유효량이 투여될 수 있다.
다른 실시형태에서, 본원에 기재된 T 세포는 이를 필요로 하는 대상체에서 면역 반응의 치료를 위한 약제의 제조에 사용될 수 있다.
본 개시내용의 세포는 마이코박테리아 감염을 치료하기 위해 동물, 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 인간에게 투여될 수 있다.
본 개시내용의 세포는 적절한 전임상 및 임상 실험 및 시험에서 결정되는 투여량 및 경로로 그리고 시간에 투여될 수 있다. 세포 조성물은 이러한 범위 내의 투여량으로 여러 번 투여될 수 있다. 본 개시내용의 세포의 투여는 당업자에 의해 결정되는 바와 같은 원하는 질환 또는 상태를 치료하는 데 유용한 다른 방법과 조합될 수 있다.
투여될 본 개시내용의 세포는 치료를 받는 대상체에 대해 자가, 동종 또는 이종일 수 있다.
본 개시내용의 세포의 투여는 당업자에게 공지된 임의의 편리한 방식으로 수행될 수 있다. 본 개시내용의 세포는 에어로졸 흡입, 주사, 섭취, 수혈, 임플란트 또는 이식에 의해 대상체에게 투여될 수 있다. 본원에 기재된 조성물은 환자에게 경동맥, 피하, 피내, 종양 내, 비강 내, 골수 내, 근육 내, 정맥 내(i.v.) 주사 또는 복강 내 투여될 수 있다. 다른 예에서, 본 개시내용의 세포는 대상체의 염증 부위, 대상체의 국소 질환 부위, 림프절, 기관, 종양 등에 직접 주사된다.
본원에 기재된 세포는 또한 임의의 수의 매트릭스를 사용하여 투여될 수 있다. 본 개시내용은 전형적으로 T 세포의 조절을 통해 면역 시스템을 지지, 유지 또는 조절하기 위해 인공 림프 기관으로서 작용하는 새로운 맥락 내에서 이러한 매트릭스를 사용한다. 따라서, 본 개시내용은 조직 공학에서 유용성이 입증된 매트릭스 조성물 및 제제를 이용할 수 있다. 따라서, 본 개시내용의 조성물, 장치 및 방법에 사용될 수 있는 매트릭스 유형은 사실상 제한이 없으며 생물학적 및 합성 매트릭스를 모두 포함할 수 있다. 하나의 특정 예에서, 미국 특허 제5,980,889호; 제5,913,998호; 제5,902,745호; 제5,843,069호; 제5,787,900호; 또는 제5,626,561호에 의해 제시된 조성물 및 장치가 활용되며, 이러한 특허는 그 전체가 본원에 참조로 포함된다. 매트릭스는 포유동물 숙주에 투여될 때 일반적으로 생체 적합성과 관련된 특징을 포함한다. 매트릭스는 천연 및/또는 합성 재료로 형성될 수 있다. 매트릭스는 임플란트와 같이 동물의 신체에 영구적 구조 또는 제거 가능한 구조를 남겨두는 것이 바람직한 경우 생분해성이 아닐 수 있거나, 또는 생분해성일 수 있다. 매트릭스는 스폰지, 임플란트, 튜브, 텔파 패드, 섬유, 중공 섬유, 동결 건조 성분, 겔, 분말, 다공성 조성물 또는 나노 입자의 형태를 취할 수 있다. 또한, 매트릭스는 접종된 세포 또는 생산된 시토카인 또는 기타 활성제의 지속적인 방출을 허용하도록 설계될 수 있다. 특정 실시형태에서, 본 개시내용의 매트릭스는 유연하고 탄성적이며, 무기 염, 수성 유체 및 산소를 포함하는 용해된 기체 약제와 같은 물질에 투과성인 반고체 스캐폴드로서 설명될 수 있다.
본원에서는 생체 적합성 물질의 예로서 매트릭스가 사용된다. 그러나, 본 개시내용은 매트릭스에 제한되지 않으므로, 매트릭스 또는 매트릭스들이라는 용어가 나타날 때마다, 이러한 용어는 세포 유지 또는 세포 횡단을 허용하고, 생체 적합성이며, 물질을 통해 직접 거대 분자의 횡단을 허용할 수 있어 물질 자체가 반투과성 막이거나 특정 반투과성 물질과 함께 사용되는 장치 및 기타 물질을 포함하도록 읽혀져야 한다.
제약 조성물
본 개시내용은 (i) 본원에 기재된 제약상 유효량의 조성물(예를 들어, 마이코박테리움 종으로부터 항원 또는 이의 기능적 단편을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 조성물, 마이코박테리움 종으로부터 항원을 코딩하는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 조성물 - 또는 둘 다의 조합) 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다. 본 개시내용은 또한 (i) 본원에 기재된 바와 같은 제약 유효량의 하나 또는 복수의 세포, 및 (ii) 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다. 본 개시내용의 제약 조성물은 하나 이상의 제약상 또는 생리학상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 조합하여 본원에 기재된 바와 같은 확장된 T 세포 집단을 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 완충액, 예컨대 중성 완충 식염수, 인산염 완충 식염수 등; 탄수화물, 예컨대 포도당, 만노스, 수크로스 또는 덱스트란, 만니톨; 단백질; 폴리펩티드 또는 아미노산, 예컨대 글리신; 항산화제; 킬레이트제, 예컨대 EDTA 또는 글루타티온; 보조제(예를 들어, 수산화 알루미늄); 및 방부제를 포함할 수 있다. 본 개시내용의 조성물은 바람직하게는 정맥 내 투여용으로 제제된다.
본 개시내용의 제약 조성물은 치료(또는 예방)될 질병에 적절한 방식으로 투여될 수 있다. 투여의 양 및 빈도는 환자의 상태, 환자 질병의 유형 및 중증도와 같은 요인에 따라 결정되지만 적절한 투여량은 임상 시험에 의해 결정될 수 있다.
본 개시내용의 조성물은 생리학적 또는 약간 염기성 pH(예를 들어, 약 pH 7 내지 약 pH 9)에서 인간 또는 동물 사용에 적합하도록 적절하게 완충된다. 적합한 완충액은 비제한적으로 인산염 완충액(예를 들어, PBS), 중탄산염 완충액 및/또는 Tris 완충액을 포함한다.
본 개시내용의 조성물은 인간 또는 동물 사용에 적합한 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 그것은 바람직하게는 등장성, 저장성 또는 약한 고장성이고 상대적으로 낮은 이온 강도를 갖는다. 대표적인 예에는 멸균 수, 생리 식염수(예를 들어, 염화나트륨), 링거 용액, 글루코스, 트레할로스 또는 사카로스 용액, 행크 용액 및 기타 생리학적으로 균형 잡힌 염수 용액이 포함된다(예를 들어 문헌[the most current edition of Remington: The Science and Practice of Pharmacy, A. Gennaro, Lippincott, Williams&Wilkins] 참조).
예를 들어, pH, 삼투압, 점도, 투명도, 색상, 무균성, 안정성, 제제의 용해 속도, 인간 또는 동물 유기체로의 방출 또는 흡수, 혈액 장벽을 통한 수송 또는 특정 기관(예를 들어, 폐)에서의 침투를 변형 또는 유지하는 것을 포함하여 바람직한 제약 또는 약력학적 특성을 제공하기 위해 추가적인 제약상 허용되는 부형제가 사용될 수 있다.
또한, 본 개시내용의 조성물은 인간의 전신 또는 점막 적용에 적합한 하나 이상의 보조제(들)를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 보조제는 본 개시내용의 조성물에 대한 면역, 특히 T 세포-매개 면역을 예를 들어 톨 유사(toll-like) 수용체, 예컨대 TLR-7, TLR-8 및 TLR-9를 통해 자극할 수 있다. 유용한 보조제의 대표적인 예는 비제한적으로 명반, 광유 에멀젼, 예컨대 프로인트 완전 및 불완전(IF A), 지질 다당류 또는 이의 유도체(문헌[Ribi et al, 1986, Immunology and Immunopharmacology of Bacterial Endotoxins, Plenum Publ. Corp., NY, p407-419]), 사포닌, 예컨대 QS21(WO 98/56415), 이미다조-퀴놀린 화합물, 예컨대 이미퀴모드(WO 2007/147529), 시토신 포스페이트 구아노신 올리고데옥시뉴클레오티드, 예컨대 CpG, 및 양이온성 펩티드, 예컨대 IC-31(문헌[Kritsch et al, 2005, J. Chromatogr Anal. Technol Biomed Life Sci 822:263]) 또는 그의 임의의 유도체를 포함한다.
본 개시내용의 조성물에 포함된 제약상 허용 가능한 비히클은 또한 동결(예를 들어, -70℃, -20℃), 냉장(예를 들어, 4 ℃), 주변 온도에서 제조 및 장기간 보관(즉, 적어도 1개월, 바람직하게는 적어도 1년) 조건 하에서 안정성을 보존하도록 허용해야 한다. 이러한 "장기" 제제는 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, WO 98/02522; WO 03/053463). (a) 1M 사카로스, 150mM NaCl, ImM MgCl2, 54mg/1 Tween 80, 10mM Tris pH8.5, (b) 10 mg/ml 만니톨, 1 mg/ml HSA, 20 mM Tris, pH7.2, 및 150 mM NaCl 및 (c) 본 개시내용의 조성물에 특히 적합화된 생리 식염수를 인용할 수 있다.
본 개시내용의 조성물은 다양한 형태, 예를 들어 고체, 액체 또는 냉동일 수 있다. 고체(예를 들어, 건조 분말 또는 동결 건조) 조성물은 진공 건조 및 동결 건조를 포함하는 공정에 의해 얻을 수 있다. 특정 실시형태에서, 본 개시내용의 조성물은 분무-건조된(예를 들어, WO 2010/135495 참조) 또는 액적 형태(100 내지 5000 μιη의 평균 직경을 갖는 액적이 특히 바람직하다)로 기도에서의 전달(예를 들어, 흡입, 비강 내 또는 폐내 경로에 의해)을 위해 제제된다.
전신, 국소 또는 점막 경로를 포함하는 임의의 통상적인 투여 경로가 본 개시내용의 맥락에서 적용 가능하다. 일부 실시형태에서, 제약 조성물은 대상체와 유체 연통하는 백(bag)으로 정맥 내 투여된다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 활성화된 T 세포의 정제된 집단은
전신 투여는 예를 들어 피하, 피내, 근육 내, 정맥 내, 복강 내, 혈관 내, 동맥 내 주사 및 난절(scarification)을 포함한다. 주사는 통상적인 주사기 및 바늘, 또는 당업계에서 이용 가능한 임의의 다른 적절한 장치(예를 들어, 전기 천공)로 이루어질 수 있다. 점막 투여는 비제한적으로 경구/소비, 비강 내, 기관 내, 폐내, 질내 또는 직장 내 경로를 포함한다. 기도 투여는 적절한 디스펜서를 사용하여 액적, 스프레이 또는 건조 분말 조성물의 분무 또는 에어로졸화를 통해 수행될 수 있다. 국소 투여는 경피 수단(예를 들어, 패치 등)을 사용하여 수행될 수도 있다. 근육 내, 피내 및 피하 경로는 본 개시내용의 맥락에서뿐만 아니라 비강 내 및 폐내 투여와 관련하여 특히 바람직하다.
적절한 투여량은 다양한 파라미터, 특히 조성물에 포함된 활성제(들), 투여 방식; 대상체의 연령, 건강 및 체중; 증상의 성질 및 정도; 동시 치료의 종류; 치료 빈도; 및/또는 예방 또는 치료의 필요성의 함수로서 적합화될 수 있다. 치료에 적합한 투여량을 결정하는 데 필요한 계산의 추가 개선은 관련 상황을 고려하여 의사에 의해 일상적으로 수행된다.
특정 실시형태에서, 본원에 기재된 확장된 T 세포를 포함하는 제약 조성물은 104 내지 109 세포/kg체중, 바람직하게는 105 내지 106 세포/kg체중의 투여량으로 투여될 수 있으며, 이들 범위 내의 모든 정수 값이 포함된다. T 세포 조성물은 또한 이러한 투여량으로 여러 번 투여될 수 있다. 세포는 면역 요법에서 일반적으로 알려진 주입 기술을 사용하여 투여될 수 있다(예를 들어, 문헌[Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319:1676, 1988] 참조). 특정 환자에 대한 최적의 투여 량 및 치료 요법은 질병의 징후에 대해 환자를 모니터링하고 그에 따라 치료를 조정함으로써 의학 분야의 숙련가에 의해 쉽게 결정될 수 있다.
특정 실시형태에서, 활성화된 T 세포를 대상체에게 투여한 다음 후속적으로 혈액을 다시 채취하고(또는 성분채집을 수행하고), 본 개시내용에 따라 그로부터 T 세포를 활성화하고, 이러한 활성화 및 확장된 T 세포로 환자를 재주입하는 것이 바람직할 수 있다. 이 프로세스는 몇 주마다 여러 번 수행될 수 있다. 특정 실시형태에서, T 세포는 10 ml 내지 400 ml의 혈액 채취로부터 활성화될 수 있다. 특정 실시형태에서, T 세포는 20ml, 30ml, 40ml, 50ml, 60ml, 70ml, 80ml, 90ml 또는 100ml의 혈액 채취로부터 활성화된다. 이론에 얽매이지 않고, 이러한 다중 채혈/다중 재주입 프로토콜을 사용하여 특정 T 세포 집단을 선택할 수 있다.
본 개시내용의 특정 실시형태에서, 본원에 기재된 방법, 또는 T 세포가 치료 수준으로 확장되는 당업계에 공지된 다른 방법을 사용하여 활성화 및 확장된 세포는 임의의 수의 관련 치료 양식과 함께(예를 들어, 전, 동시 또는 후) 환자에게 투여된다. 추가 실시형태에서, 본 개시내용의 T 세포는 화학 요법, 방사선, 면역 억제제, 예컨대 사이클로스포린, 아자티오프린, 메토트렉세이트, 마이코페놀레이트 및 FK506, 항체, 또는 기타 면역 억제제, 예컨대 CAM PATH, 항-CD3 항체 또는 기타 항체 요법, 사이토신, 플루다리빈, 사이클로스포린, FK506, 라파마이신, 마이코페놀산, 스테로이드, FR901228, 시토카인 및 방사선 조사와 함께 사용될 수 있다. 환자에게 투여되는 상기 치료의 투여량은 치료되는 상태의 정확한 특성과 치료의 수용자에 따라 달라질 수 있다. 인간 투여를 위한 투여량의 스케일링은 당업계에서 인정하는 관행에 따라 수행될 수 있다.
본 개시내용의 실시는 달리 지시되지 않는 한, 숙련된 기술자의 범위 내에 있는 분자 생물학(재조합 기술 포함), 미생물학, 세포 생물학, 생화학 및 면역학의 통상적인 기술을 사용한다. 이러한 기술은 문헌["Molecular Cloning: A Laboratory Manual", fourth edition (Sambrook, 2012)]; 문헌["Oligonucleotide Synthesis" (Gait, 1984); "Culture of Animal Cells" (Freshney, 2010)]; 문헌["Methods in Enzymology" "Handbook of Experimental Immunology" (Weir, 1997)]; 문헌["Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells" (Miller and Calos, 1987)]; 문헌["Short Protocols in Molecular Biology" (Ausubel, 2002)]; 문헌["Polymerase Chain Reaction: Principles, Applications and Troubleshooting", (Babar, 2011)]; 문헌["Current Protocols in Immunology" (Coligan, 2002)]과 같은 문헌에 충분히 설명되어 있다. 이러한 기술은 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드의 생산에 적용 가능하며, 따라서 본 발명을 제조하고 실시하는 데 고려될 수 있다. 특정 실시형태에 특히 유용한 기술은 다음의 섹션에서 논의될 것이다.
본 출원 및 실시예 섹션에 열거된 모든 참고 문헌, 특허 출원 또는 기타 문서는 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
실시예
실시예 1
CTL 자극을 위한 가지 세포의 생성 및 형질 전환(예언적)
마이코박테리아 항원을 발현하는 성숙한 가지 세포(DC)에 의한 말초 혈(PB) T 세포의 자극은 항원 특이적 세포 독성 T 림프구(CTL)의 재활성화로 이어질 수 있다. DC는 GM-CSF 및 IL-4에서 배양함으로써 부착성 PB 단핵 세포(PBMC)와 차별화될 수 있다. 항원(들)은 개시된 항원을 코딩하는 DNA 플라스미드에 의한 형질 감염에 의해 DC내로 도입될 것이며, 그 다음 DC는 IL-1, IL-6, TNFα 및 PGE-2를 함유하는 시토카인 칵테일에서의 배양에 의해 성숙될 수 있다. 이 예에서, 치료 T 세포의 생성에 필요한 성분으로서 가지 세포를 준비하고 형질 감염하기 위한 예시적인 절차가 제공된다. 특정 실시형태에서 표본은 대상체 또는 공여자(또는 이전에 동결된 PBMC)로부터의 헤파린화된 말초 혈액을 포함할 수 있다. 전염병 시험은 채혈 후 7일 이내에 수행되었을 수 있다.
신선한 혈액에서 PBMC의 준비가 수행된다(냉동 보존 혈액을 사용하는 경우 아래에 설명된 바와 같이 진행). 주변(실내) 온도에서 동일한 부피의 D-PBS 또는 RPMI 1640에 헤파린화된 말초 혈액(이상적으로는 60ml)을 희석한다. 50ml 원심 분리기 튜브에서, 약 10ml 림포프레프(Lymphoprep)을 희석된 혈액 약 20ml로 조심스럽게 덮어준다. 사용 가능한 모든 셀을 활용하도록 필요에 따라 조정한다. 400 x G에서 40분 동안 주위 온도에서 원심 분리한다. 3 x 1ml 혈장 분취량을 확보하고 -80℃에서 보관한다. PBMC 인터페이스를 동일한 부피의 D-PBS 또는 RPMI 1640으로 수확한다. 450 x G에서 10분 동안 주위 온도에서 원심 분리한다. 상층액을 흡인한다. "핑거-플릭킹(finger-flicking)에 의해 펠릿을 풀고 20mL의 D-PBS 또는 RPMI 1640에 재현탁한다. 20 μl의 세포를 제거한다. 50% 적혈구 용해 버퍼 20 μl를 가하고 혈구계를 사용하여 계산한다.
이전에 동결된 PBMC의 준비를 위해, 세포를 37℃에서 해동하고 동결된 세포 1mL 당 따뜻한 CellGenix DC 배지 10mL로 희석하고 계수한다. DC 시작을 위해, 다음과 같이 진행한다. 사용 가능한 모든 PBMC를 사용하기 위해 플레이트 당 -10 x 106 PBMC(범위 7 내지 14 x 106)에서 시딩된 6 웰 플레이트(들)의 35mm 웰의 수를 계산한다. 400 x G에서 5분 동안 주위 온도에서 원심 분리한다. 시딩할 플레이트 당 2 mL로 세포를 재현탁한다. 세포는 DC 전구체를 부착하기 위해 2시간 동안 37℃/5% CO2 인큐베이터로 옮겨진다. 웰을 10 mL의 D-PBS 또는 RPMI로 3회 헹구고 PBMC 비-부착 분획을 함유하는 상층 액을 결합한다. 나머지 부착 세포에, IL-4 ml 당 1000 단위 웰 당 GM-CSF ml 당 800 단위를 함유하는 DC 배양 배지 2 mL를 가한다. 플라스크/플레이트를 37℃, 5% CO2 인큐베이터로 되돌린다. 이전에 저온 보존되지 않은 경우, 비-부착성 세포는 향후 사용 반응자(responder) T 세포를 위해 저온 보존될 수 있다.
미성숙 DC는 다음과 같이 공급된다. 3일 또는 4일에 IL-4를 mL당 1000개로 보충하고 GM-CSF를 ml당 800개로 보충한다. 20X GM-CSF 및 IL-4를 함유하는 CellGenix 배지를 구성하고 웰당 100 μ
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를 가한다. DC가 성숙될 때 5일 또는 6일에 온화한 재현탁에 의해 미성숙 DC를 수확한다(지금까지는 플라스크에 몇개의 세포만이 부착되어 있어야 한다). 나머지 부착성 세포를 제거하기 위해, 5 mL의 차가운 D-PBS를 약 1분 동안 가하고 온화하게 재현탁하고 미성숙 DC와 결합한다. 세포 계수는 큰 가지 세포만을 사용하는 혈구계를 사용하여 수행된다. CellGenix 배지에서 mL 당 2 x 106로 DC를 재현탁하고 24 웰 플레이트의 웰당 1mL를 분취한다. 사용하지 않는 웰에 멸균 수를 가한다. 시토카인 성숙 칵테일을 함유하는 1 mL의 DC 배양 배지를 웰에 가하여 GM-CSF 800U/ml; IL-4 1000 U/ml; TNF-cc 10 ng/ml; PGE-1 1 μg/mL; IL-Ιβ 10 ng/ml; IL-6 100 ng/ml의 시토카인 최종 농도를 산출한다.
DC 세포는 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 20 내지 28시간 동안 배양된다. 3 mL 전송 피펫으로 온화하게 재현탁하여 20 내지 28시간 후 24h-성숙 DC를 수확한다. 세포는 혈구계를 사용하여 계수된다. 가지 세포의 형질 감염을 위해, Cell Genix 배지 4ml를 37℃/5% CO2 인큐베이터의 6웰 플레이트에서 미리 데운다. 수확된 가지 세포는 3개의(튜브 1-3) 15 mL 원심 분리 튜브로 분할된다. DC 셀 수/튜브는 0.5 x 106보다 낮지 않고 2 x 106보다 크지 않다. DC는 200g에서 10분 동안 원심 분리된다. 상청액을 흡인하고 튜브 당 플라스미드 당 5 μg의 최종 농도로 DC 펠릿에 DNA 플라스미드를 첨가하며, 각 플라스미드는 본원에 개시된 1, 2, 3, 4개 또는 그 이상의 마이코박테리아 항원에 대응하고 이를 코딩한다. 100 μl의 형질 감염 시약으로 재현탁된 DC 및 DNA를 잘 혼합하고 뉴클레오펙션(nucleofection) 큐벳으로 옮긴다. 큐벳은 Nucleofector 내에 위치되고 프로그램 U2를 선택하고 시작 버튼을 눌러 뉴클레오펙션을 시작한다. 뉴클레오펙션 후 즉시 500 μl의 예열된 배지를 큐벳에 가하고 세포를 37℃/5% CO2 인큐베이터로 옮긴다. 인큐베이터에서 10분 후 세포를 12웰 조직 배양 처리된 플레이트로 옮기고 800 U/ml의 GM-CSF; 1000 U/ml의 IL-4; 10 ng/ml의 TNF-α; 1 μg/ml의 PGE-1; 10 ng/ml의 IL-1β; 및 100 ng/ml의 IL-6의 시토카인 최종 농도를 갖는 시토카인 성숙 칵테일을 함유하는 1.5ml의 DC 배양 배지를 가한다.
그 다음, DC는 5% CO2 인큐베이터에서 37℃에서 12 내지 18 시간 동안 배양된다. DC는 T 세포 집단을 갖는 APC로서 사용하기 위해 수확되고 조사된다. 수확 및 계수 후 DC는 30 Gy의 APC로서 사용하기 위해 조사된다. 그 다음, 그들은 10 mL의 배지로 1회 세척되고, CTL 배양 배지로 mL 당 2 또는 1 x 105로 재현탁된다.
실시예 2
플라스미드 뉴클레펙티드(nuclefected) 가지 세포를 사용하여 항원 특이적 세포 독성 T-림프구(CTLS)의 생성
본 실시예는 항원 특이적 세포 독성 림프구의 예시적인 제조에 관한 것이다. 이 절차는 플라스미드 핵 형성된 DC를 항원 제시 세포로서 사용하는 프로토콜을 위한 세포를 준비하는 데 사용될 수 있다. 특정 경우에, DC는 본원에 제공된 마이코박테리아 항원 또는 기능적 단편을 코딩하는 플라스미드로 핵 형성된다.
항원 특이적 세포 독성 T 세포주(CTL)는 마이코박테리아 항원을 코딩하는 DNA 플라스미드로부터 항원을 발현하는 자가 항원 제시 세포(APC)로 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 자극하여 생성된다. APC는 본 발명의 특정 실시형태에서 가지 세포(DC)이다. 가지 세포는 효율적으로 핵 형성될 수 있는 강력한 APC이며 환자로부터 바이러스 특이적 T 세포를 생성하는 데 사용된다. 특정 실시형태에서, 플라스미드-핵 형성된 가지 세포는 2차 또는 후속 자극에 사용될 수 있다. 사용되는 배양 조건 하에서, 성장하는 T 세포주는 관심 항원(CMV-IE1 및 pp65, 아데노바이러스 항원 및 EBV 항원)에 특이적인 T 세포를 포함해야 한다. 시토카인(IL-4 및 IL-7)은 첫 번째 자극에서 추가된다. 헤파린 처리된 말초 혈액은 환자 또는 이전에 동결된 환자 PBMC로부터 사용될 것이다. 전염병 시험은 채혈 후 7일 이내에(특정 프로토콜에 의존함) 수행될 수 있다. 플라스미드 핵 형성된 가지 세포(DC)는 환자 또는 공여자로부터 준비된다.
필요에 따라 최종 확장된 T 세포 수를 계산할 수 있다. 환자의 신체 표면적, 예측된 투여량 수준 및 추가 투여 허용 여부에 따라 환자 투여 및 QC 시험을 위해 충분한 세포가 요구된다. 특정 실시형태에서, 환자가 예상보다 더 높은 투여량 수준으로 등록될 수 있는 기회를 허용한다. DC는 특정한 경우에서 송아지 태아 혈청 항원이 없는 것을 보장하기 위해 CellGenix 배지에서 준비되어야 한다. CTL 시작은 FCS의 존재에서 수행된다.
신선한 혈액으로부터 단핵 "응답자" 세포의 제조는 주위(실내) 온도에서 동일한 부피의 D-PBS 또는 RPMI 1640에서 헤파린화된 말초 혈액(예를 들어, 60ml)을 희석함으로써 수행될 것이다. 50ml 원심 분리기 튜브에서, 약 10ml 림포프레프(Lymphoprep)을 희석된 혈액 약 20ml로 조심스럽게 덮어준다. 사용 가능한 모든 셀을 활용하도록 필요에 따라 조정한다. 400 x G에서 40분 동안 주위 온도에서 원심 분리한다. 3 x 1ml 혈장 분취량을 확보하고 -80℃에서 보관한다. PBMC 인터페이스를 동일한 부피의 D-PBS 또는 RPMI 1640으로 수확한다. 샘플은 실온에서 10분 동안 450 x G에서 원심 분리된다. 그 다음 상층액이 흡인된다. 세포 펠렛은 "핑거-플릭킹(finger-flicking)에 의해 풀려지고 20mL의 D-PBS 또는 RPMI 1640에 재현탁된다. 20 μl의 세포를 제거한다. 50% 적혈구 용해 버퍼 20 μl를 가하고 혈구계를 사용하여 계수한다. 그 다음, 적절하다면, 플레이트 또는 생물 반응기에서 가지 세포에 의한 PBMC 자극을 진행할 수 있다.
필요하다면, 이전에 동결된 PBMC 또는 비부착성 단핵 세포로부터 CTL의 준비가 수행될 수 있다. 세포를 37℃에서 해동하고 동결된 세포 1mL 당 10mL의 따뜻한 배지로 희석한 다음 계수한다.
적절한 상황에서, 예를 들어 실시예 1에서 언급된 바와 같은 플레이트 또는 생물 반응기에서 가지 세포에 의해 PBMC 자극을 진행할 수 있다. PBMC는 실온에서 5분 동안 400 x G에서 원심 분리된 다음, 상층 액이 제거된다. 세포는 CTL 배지 + IL4(1000 U/ml - 최종 농도) 및 IL-7(10ng/ml - 최종 농도)에서 mL 당 2 x 106 세포로 재현탁된다. 웰당 1 mL의 세포 분취량을 24웰로 옮기고 플레이트를 인큐베이터로 되돌리거나 GP40 생물 반응기에서 약 5 내지 약 7.5 mL(10 내지 15 x 106) PBMC를 분취하여 인큐베이터로 되돌린다. 제조된 플라스미드 핵 형성 DC를 얻고, 30Gy로 조사하고 4회 세척한다. 항원 제시 세포는 PBMC 대 DC의 10:1 또는 20:1 비율에 대해 2x105 내지 1x105(DC) 세포/ml로 재현탁될 것이다. DC의 1 ml 분취량을 PBMC 웰에 넣거나 7.5 mL의 DC를 생물 반응기에 넣고 총 30 mL의 배지에 대해 배지를 가하고 공기 중 5% CO2에서 37℃로 7일 동안 세포를 배양한다. 7일에: <3 x 106 세포/웰이 있는 경우, 절반 배지 변경을 수행한다. 웰당 ~ 1 mL의 배지를 제거하고 ~ 1 mL의 신선한 CTL 배지 + 시토카인으로 대체한다. 7일에: >3x106 세포/웰이 있는 경우, CTL을 분할하고 공급하고; ~ 1 mL의 CTL을 새 웰로 옮기고; ~ 1 mL의 신선한 CTL 배지 + 시토카인으로 공급한다. 7일에: 생물 반응기에 <50x106 세포가 있는 경우, 10ml 배지를 제거하고 신선한 배지 + 시토카인으로 보충한다. 7일에: 생물 반응기에 >50x106 세포가 있는 경우, 15ml CTL을 새로운 생물 반응기로 옮기고 둘 다를 새로운 배지 + 시토카인으로 보충한다. 추가의 4 내지 6일 동안 배양한다. 임상 저온 보존을 위해, 충분한 세포가 얻어지면, 세포를 저온 보존하고 특성화한다. CTL을 동결한 지 1 주일 이내에 세포 독성 분석은 5x106 내지 1x107 세포로 설정되어야 하며 특정 프로토콜 요건에 따라 추가의 2x106 세포로 표현형이 수행되어야 한다.
특정 실시형태에서, 적절한 투여량 수준에서(당시 결정됨) 및 모든 QC 요건에 대해 환자에게 세포를 주입하기 위한 치료적 유효량의 CTL이 있을 것이며; 20:1에서 수용자 PHA 폭발의 <10% 사멸(동종인 경우); 및 <2% CD 83+/CD3 세포(DC 제외).
실시예 3
SOP: 마이코박테리아-특이적 CTL의 제조
1. 목적
1.1 T 세포 면역 결핍 환자는 종종 침습성 마이코박테리아 감염에 대한 감수성(suspectibility)이 있다.
1.2 마이코박테리아-특이적 T 세포는 건강한 공여자로부터 확장될 수 있다.
1.3 이 절차의 목적은 AG85B, PPE68, ESXB, P9WNK7 및 ADK와 같은 다양한 항원을 표적으로 하는 마이코박테리아-특이적 T 세포를 제조하는 수단을 제공하는 것이다.
1.4 마이코박테리아 항원의 겹치는 펩티드(펩믹스)는 T 세포를 자극하는 데 사용된다.
1.5.1 펩믹스는 관심있는 단백질의 전체 길이를 덮는 11개의 아미노산과 겹치는 15개의 아미노산을 갖는 펩티드로 구성된다.
2. 정책
1 이 절차는 훈련된 GMP 및 QA/QC 직원이 따라야 한다.
2.2 이 절차는 항원 제시 세포(APC)로서 펩믹스-펄스화된 PBMC를 사용하는 프로토콜을 위한 세포를 제조하는 데 사용될 수 있다.
2.3 날짜는 대략적이며 명시되지 않는 한 주말과 공휴일을 고려하여 +/-3일이다.
2.4 세포 수 및 생존력은 트리판 블루(Trypan Blue)와 같은 검증되고 확립된 분석을 사용하여 수행되어야 한다. 그러나 일단 자격 부여되면 동등한 분석 또는 장비가 사용될 수 있다.
3. 약어 및 정의
3.1 MST 마이코박테리아-특이적 T 림프구
3.2 펩믹스 중첩되는 15머 펩티드 라이브러리
3.3 QC 품질 제어
3.4 GMP 양호한 제조 관행
3.5 CETI 면역 요법을 위한 세포 향상 및 기술을 위한 프로그램
3.6 FDA 식품 의약국
3.7 PBMC 말초 혈액 단핵 세포
3.8 IND 연구용 신약
3.9 DC 가지 세포
3.10 SOP 표준 운영 절차
3.11 PI 연구 책임자
3.12 QA 품질 보증
3.13 PBS 인산염 완충 식염수
3.14 CTL 배지 45% EHAA Click's, 45% 고급 RPMI, 10% HI FBS 또는 HS, 2mM GlutaMAX
3.15 CoA 분석 증명서
3.16 HS 인간 혈청
3.17 HI 열 비활성화
3.18 IL 인터루킨
3.19 CNMC 어린이 국립 의료 센터
3.20 APC 항원 제시 세포
3.21 g 중력
3.22 C 섭씨
3.23 CO2 이산화탄소
3.24 BSC 생물학적 안전 캐비닛
3.25 HSA 인간 혈청 알부민(플렉스부민)
4. 표본
4.1 환자/공여자로부터의 헤파란화된 말초 혈액, 이전에 동결된 환자 PBMC.
4.1.1 전염병 시험은 연방 규정에 따라 수행되어야 한다.
5. 재료 및 장비
5.1 재료
5.1.1 RPMI 1640 인비트로젠(Invitrogen)
5.1.2 고급 RPMI 1640 인비트로젠
5.1.3 EHAA 클릭의 Irvine Scientific
5.1.4 HI 송아지 태아 혈청 HyClone
5.1.5 인간 혈청 Gemini Bio Products
5.1.6 GlutaMAX (200mM) 인비트로젠
5.1.7 조직 배양 플레이트 Corning
4.2.8 가스 투과성 배양기 Wilson Wolf
4.2.9 인터루킨-4 R & D 시스템
4.2.10 인터루킨-7 R & D 시스템
4.2.11 원심 분리 튜브 Corning
4.2.12 혈청 피펫 Falcon
4.2.13 림포프레프 Nycomed
4.2.14 PBS 인비트로젠
4.2.15 적혈구 용해 완충액 Becton Dickinson
4.2.16 가지 세포 배지 CellGenix
4.2.17 피펫 팁 ART
4.2.18 혈장 전달 세트 Charter Medical
4.2.19 주사기 Becton Dickinson
4.2.20 펩믹스 JPT
5.2 장비
주석: 세포와 접촉하는 모든 재료는 멸균되고, 발열원이 없으며, 달리 언급되지 않는 한 제조업체의 지침에 따라 보관 및 사용되어야 한다. 동등한 재료 및 장비는 QA 승인을 받아 사용될 수 있지만 모든 변경은 적절한 워크 시트에 기록되어야 한다.
5.2.1 생물학적 안전 캐비닛(인증됨)
5.2.2 현미경
5.2.3 원심 분리기
5.2.4 인큐베이터
5.2.5 조사기
5.2.6 혈구계
5.2.7 수조
5.2.8 피펫 보조
5.2.9 LS 선택 자석
6. 절차
6.1 건강한 공여자로부터 마이코박테리아-특이적 T 세포의 생산:
6.1.1 신선한 혈액으로부터 PBMC 제조(동결 PBMC의 경우, 아래의 동결 PBMC 단계로 진행)
6.1.1.1 주변 온도에서 동일한 부피의 D-PBS 또는 RPMI 1640에 헤파린화된 말초 혈액을 희석한다.
6.1.1.2 50 ml 원심 분리기 튜브에서, 약 10 내지 15 ml 림포프레프(Lymphoprep)을 희석된 혈액 약 30 ml로 조심스럽게 덮어준다.
6.1.1.3 800 x g에서 20분 동안 또는 400 x g에서 40분 동안 주위 온도에서 가속 및 제동 레벨 1로 원심 분리한다.
6.1.1.4 1 ml 혈장 분취량(들)을 확보하고(적용 가능하다면) -80℃에서 보관한다.
6.1.1.5 PBMC 인터페이스를 동일한 부피의 PBS 또는 RPMI 1640으로 수확한다.
6.1.1.6 450 x g에서 10분 동안 주위 온도에서 원심 분리한다. 상층액을 흡인한다.
6.1.1.7 예상 1x106 세포/mL를 산출할 PBS 또는 RPMI 1640의 부피에서 펠릿을 풀고 세포를 재현탁한다.
6.1.1.8 계수를 위해 세포 샘플을 제거한다. 트립판 블루 또는 적혈구 용해 완충액으로 샘플을 희석하고 SOP에 따라 혈구계를 사용하여 계수한다. 적격 세포 계수기가 또한 사용될 수 있다.
6.1.1.9 아래 활성화 단계로 진행한다.
6.1.2 이전에 동결된 PBMC로부터 반응자 세포의 제조
6.1.2.1 37℃에서 세포를 해동하고 SOP M02에 따라 동결된 세포 1mL 당 따뜻한 배지 ~ 10mL로 희석한다.
6.1.2.2 SOP에 따라 계수한다.
6.1.2.3 생물 반응기에서의 CTL 시작을 위해 아래의 활성화 단계로 진행한다.
6.1.3 바이러스 펩믹스를 사용하여 생물 반응기에서 새로운/이전에 동결된 PBMC 활성화.
6.1.3.1 주위 온도에서 5분 동안 400 x g에서 ~1.5x107 PBMC/튜브를 원심 분리한다.
6.1.3.2 펩믹스 마스터믹스 1 바이알(40 ng/uL의 5ul, 부피 및 농도에 의해 균일하게 혼합된 모든 표적 마이코박테리아 펩믹스를 함유)을 취하고 200 uL CTL 배지로 희석하여 1 ng/uL을 만든다.
6.1.3.3 PBMC로부터 상층액을 제거하고 희석된 펩믹스 Mastermix(100 ng/펩티드) 100 uL로 37℃, 5% CO2에서 약 30 내지 60 분 동안 펄스한다.
6.1.3.4 6uL IL-4(400 U/ml 최종 농도) 및 30uL IL-7(10 ng/mL 최종 농도)을 함유하는 CTL 배지 30 mL에서 펩믹스-펄스화된 PBMC를 재현탁한다.
6.1.3.5 1.5x107 세포 당 하나의 G-Rex 생물 반응기로 옮기고 인큐베이터로 되돌린다.
6.1.4 3 내지 4일: 선택적 공급
6.1.4.1 6 uL IL-4(스톡 = 2000 U/ml, 최종 400 U/ml) 및 30 uL IL-7(스톡 = 10 ng/ul, 최종 농도 10 ng/ml)을 각 Grex-10에 가한다.
6.1.4.2 Grex 생물 반응기를 인큐베이터로 되돌린다.
6.1.5 6 내지 8일: T 세포 공급
6.1.5.1 세포를 방해하지 않고 각 Grex-10으로부터 15 mL의 배지를 제거한다.
6.2.5.2 세포를 재현탁하고 SOP 당 세포 계수를 수행한다.
6.1.5.3 GRex에 >5.0x107 세포가 있는 경우, 7.5 mL CTL을 새 GRex로 옮기고 둘 다를 신선한 배지 + 시토카인으로 보충하여 30 mL의 최종 부피로 만든다.
6.1.5.4 추가의 4 내지 6일 동안 배양한다.
6.1.6 10 내지 12일: SOP M03(임상 사용을 위한 세포 동결)으로 진행한다.
7. 주석 및 제한
7.1 가능한 경우 세포(PBMC 및 CTL)은 백업으로서 동결되어야 한다.
7.2 제조된 모든 세포는 환자에게 주입하기 위한 것이므로, 환자 샘플의 오인이나 오염을 방지하기 위해 적절한 절차를 준수하는 것이 필수적이다.
7.3 모든 배양 용기 및 튜브에는 환자 이름 및/또는 공여자 이름, 성분 번호, 제조일 및 환자/공여자 ID(P 번호 및/또는 MRN)를 포함하는 제품 식별자가 라벨링되어야 한다. 라벨이 없는 재료는 폐기된다.
7.4 한 번에 1 초과의 환자 제품으로 작업하지 않는다.
7.5 항상 각 환자의 세포에 대해 특별히 제조되고 라벨링된 배지를 사용한다. 1명 초과의 환자의 세포에 공급하기 위해 배지를 사용하지 않는다.
7.6 무균 기술을 사용하고 일반적인 예방 조치를 따라 인증된 생물학적 안전 캐비닛에서 모든 단계를 수행한다.
7.7 연구 책임자 또는 피지명자는 필요한 최종 확장 T 세포 수를 계산해야 한다. 환자의 신체 표면적 또는 체중, 예측된 투여량 수준 및 추가 투여량 허용 여부에 따른 QC 시험뿐만 아니라 환자 투여량에 충분한 세포가 필요하다. 가능하면 환자가 예상보다 더 높은 투여량 수준으로 등록될 수 있는 기회를 허용한다.
8. 예상 결과 및 해석
8.1 세포는 다음과 같지만 이에 제한되지 않는 주어진 IND에 대한 방출 기준을 충족해야 한다:
8.1.1 적절한 투여량 수준(당시에 결정됨)에서 환자 주입 및 모든 QC 요건에 대한 충분한 CTL 수.
8.1.2 20:1에서 수용자 PHA 폭발의 <10% 사멸(동종)
8.1.3 <2% CD14 + 세포(단핵구)
실시예 4.
대상체에서 마이코박테리아 감염을 치료하는 방법
이펙터 세포의 치료적 유효량은 시간이 지남에 따라 대상체에게 투여될 것이며, 효능은 투여 후 시간이 지남에 따라 대상체에서 박테리아 감염의 증상을 모니터링함으로써 결정될 것이다.
실시예 5.
건강한 공여자로부터 T 세포를 확장하는 방법
대상체 및 환자
건강한 공여자 및 환자는 국립 아동 의료원, 국립 보건원, 모든 아동 병원에서 헌혈을 위한 연구 프로토콜에 동의했다. 공여자는 BCG 예방 접종의 이전 이력에 대해 평가되었으며, 예방 접종을 받은 사람들은 투베르쿨린 또는 퀀티페론 시험에서 최근 양성 이력에 대해 평가되었다. 환자 샘플은 원발성 면역 결핍 장애가 있고 M. 아비움 복합체 또는 M. 압세수스에 의한 활동성 또는 최근 침습성 감염의 존재가 있는 개인으로부터 얻었다(표 2).
Figure pct00007
모든 연구 프로토콜은 호스트 기관에서 기관 검토위원회에 의해 승인되었다.
말초 혈액 단핵 세포의 분리
말초 혈액 단핵 세포(PBMC)는 Ficoll 밀도 원심 분리를 통해 분리되었다. 혈액을 인산염 완충 식염수에 1:1로 희석하고, 1015 mL의 림프구 분리 배지(MP Biomedicals, CA) 위에 층을 쌓고, 실온에서 400 G에서 40분 동안 회전시켰다. PBMC를 림프구 층으로부터 수확하고 MST 라인의 계수 및 생성 전에 1X PBS로 2회 세척하였다.
건강한 공여자 및 환자로부터 마이코박테리아-특이적 T 세포의 신속한 생성
1일에, PBMC(10-15 x 106)를 50ml 원뿔형 튜브에서 펠렛화하였다. M. 투베르쿨로시스(펩믹스)으로부터의 항원을 포함하는 중복되는 15-머 펩티드 풀을 모으고, 200 μl CTL 배지(45% RPMI, 45% Click's 배지, 2 mmol L-글루타민을 갖는 10% 소 태아 혈청)에 각 TB 펩믹스(5개의 15-머 펩믹스 라이브러리, 각각 0.5 nmol/μL의 농도로 재구성됨)를 가하고, 25 nmol/ml의 최종 펩티드 농도를 가졌다. TB 펩믹스는 AG85B, PPE68(Rv3873), ESXA(ESAT-6), ESXB(CFP-10) 및 ADK로부터의 펩티드를 포함하였다. 단백질 컨센서스 서열은 펩믹스 생성(JPT, Berlin, Germany)을 위해 NCBI RefSeq (표 3)에서 얻었다.
Figure pct00008
PBMC 펠릿을 200μl의 CTL 배지/펩믹스에 재현탁시키고 37℃에서 30 내지 60분 동안 배양하였다(도 1). 배양 후, PBMC를 IL-7(10 ng/ml) 및 IL-4(400 U/ml)와 함께 CTL 배지/10% FBS에 1 x 106 세포/ml의 최종 농도로 재현탁시켰다(R&D Systems, MN). 펩믹스-펄스화된 PBMC를 24웰 플레이트에 2 ml/웰로 플레이팅했다. 3 내지 5일에, 배양 배지를 색상 및 세포 합류에 대해 모니터링하였다. 합류 배양의 경우 절반-배지 변화(IL-7 및 IL-4)가 수행되었다. 7일에, 배양 배지를 다시 모니터링하고, 절반-배지 변화와 합류하는 경우 세포를 1:1로 분할하였다. 10 내지 12일에, 세포를 수확하고 항원 특이성 및 기능에 대해 평가했다.
M. 아비움 센시틴 또는 TB 용해물에 의한 건강한 공여자로부터의 MST 생성
M. 투베르쿨로시스 용해물(균주 CDC1551, BEI Resources, Manassas, VA)을 10 mg/ml으로 10mM 중탄산 암모늄에서 재구성했다. M. 아비움 센시틴(Statens Serum Institut, Dartmouth University의 Dr. Ford von Reyn 제공) 단백질은 1.5ml의 식염수에 1 ug/ml로 재구성되었다. 1일에, PBMC(10 sowl 15 x 106)를 M. 아비움 센시틴(50 ng) 또는 M. 투베르쿨로시스 용해물(100 μg)의 조건에서 용해물과 함께 공동 배양되었다. PBMCs+용해물을 1 x 106 세포/ml의 최종 농도로 IL-7(10 ng/ml) 및 IL-4(400 U/ml)를 갖는 CTL 배지/10% FBS에 재현탁하고 24-웰 플레이트에서 2 ml/well로 플레이팅하였다. 3 내지 7일에, 배양 배지를 이전과 같이 모니터링하고 적절하게 변경했다. 10 내지 12일에, 세포를 수확하고 TB-특이성 및 기능에 대해 평가했다.
IFN-γ ELISPOT 분석 및 에피토프 매핑
T 세포의 항원 특이성은 IFN-γ ELISPOT(Millipore, Burlington, MA)로 측정되었다. T 세포를 펩티드 또는 액틴(음성 대조군), 스타필로코커스 장독소 B(SEB)(양성 대조군), 또는 자극제로서 TB 펩믹스 및 용해물 없이 1 x 105/웰로 플레이팅 하였다. 특이성은 양측 학생의 T-테스트에 의한 음성 대조군에 대한 결과의 통계적 유의성을 갖는 최소 20개의 스팟 형성 세포(SFC)/1x105 세포/웰로 정의되었다(p<0.05). 에피토프 매핑을 위해, 전체 AG85B 및 ESXB 단백질에 걸쳐있는 15 머 펩티드(GenScript, Piscataway Township, NJ, USA)가 합성되었으며, 각 펩티드 사이에 5개 아미노산이 겹친다. ELISPOT 플레이트는 IFN-γ SFC 계수 및 합류 결정을 위해 전송되었다(Zellnet Consulting, Fort Lee, NJ, USA).
MST의 면역 표현형
MST 세포 배양의 표현형은 CD3, CD8, CD4, CD25, CD14, CD16, CD19, CD27, CD28, CD45RA, CD45RO, CD56, CD57, CD62L, CD127, CCR7, IFN-γ, TNF, CD223(LAG3), CD95, Perforin, PD-1, TCRγδ, CTLA4 및 TIM3(Milenyi Biotec, Bergisch Gadbach, Germany; Biolegend, San Diego, CA, USA; BD Bioscience, San Jose, CA, USA; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA; 및 Ebioscience, San Diego, CA, USA)에 대한 항체를 사용하여 유세포 분석에 의해 수행되었다(표 4).
Figure pct00009
1일에, 건강하고 BCG-백신 접종된 공여자의 MST를 저투여량 IL-2(50 U/mL)로 밤새 휴식을 취했다. 2일에, T 세포를 세척하고 대응하는 펩믹스, αCD28/CD49 공동 자극제 및 브레펠딘 A와 함께 1 x 106 세포/웰로 플레이팅하고 6시간 동안 배양하였다. 조건은 다음과 같았다: 2.5 ug/well에서 펩믹스, actin 펩믹스, SEB 또는 마이코박테리아 펩티드의 혼합(PPE68, ESXA, ESXB, AG85B 및 ADK 펩믹스의 동일한 농도) 없음. 상기 조건에서 6시간 배양한 후, 세포를 세척하고, 표면 마커를 위해 염색하고, 세척하고, 4% 파라포름알데히드로 고정시켰다. 그 다음, 세포를 사포닌(Perm Wash Buffer, BD Biosciences, San Diego, CA)으로 투과시키고, 세포 내 항체로 염색하고, 세척하였다. GD2에 특이적인 키메라 항원 수용체로 형질 도입된 T 세포는 공동 억제 수용체의 존재에 대한 대조군으로 사용되었다(Stanford University의 Crystal Mackall 박사 제공)(33). 샘플은 CytoFlex S 유세포 분석기(Beckman Coulter, Indianapolis, IN, USA)에서 수득하고, FlowJo VX(FlowJo LLC, Ashland, OR, USA)에서 분석했다. 표준화된 게이팅 전략이 표면 염색(도 8) 및 세포 내 염색(도 9)을 위해 사용되었다.
멀티플렉스 시토카인 분석
MST 제품 기능은 Bioplex Pro Human 17-plex 시토카인 분석 키트(Biorad, Hercules, CA, USA)로 측정되었다. 1일에, 건강한 공여자의 MST를 저투여량 IL-2(50 U/mL)로 밤새 휴식을 취했다. 2일에, T 세포를 세척하고 1 ml의 대응하는 펩믹스와 함께 1 x 106 세포/웰로 플레이팅 하였다. 조건은 다음과 같았다: 1 ug/웰에서 펩믹스(대조군), 액틴 단독(대조군), SEB(양성 대조군), AG85B, PPE68, ESXA, ESXB 또는 ADK 없음. 3일에, 상층액을 웰로부터 수확하고 아래로 회전시켜 파편을 제거하고, 멀티플렉스 플레이트에 플레이팅했다. 면역 결핍 환자의 경우, 제한된 세포 수로 인해 ELISPOT 플레이트에서 상층액이 수집되어 17-플렉스에서 실행되었다. Biorad 17-plex 멀티플렉스 제조업체의 프로토콜을 따라 MAGPIX 시스템(Luminex, Austin, TX)에서 읽었다.
HLA 타이핑
선택된 공여자 샘플은 고해상도 SSO HLA 타이핑을 위해 보내졌다(Kashi Clinical Laboratories, Portland, OR).
데이터 분석
데이터 분석은 Graphpad Prism(GraphPad Software, La Jolla, CA) 및 SAS 9.3(SAS Institute, Cary, NC)에서 수행되었다. 양측 유의 수준이 0.05인 Kruskal-Wallis 시험이 여러 데이터 그룹 간의 차이를 시험하는 데 사용되었으며, 양측 데이터 분석을 위해 양측 T-시험이 사용되었다.
결과
마이코박테리아-특이적 T 세포는 건강한 공여자로부터 확장될 수 있다.
10명의 건강한 공여자가 마이코박테리아 항원에 대한 T 세포 반응에 대해 평가되었다. 6명의 공여자는 BCG 예방 접종의 사전 이력을 가지고 있었고, 그 중 3명은 지연형 과민성 시험에서 양성 이력을 알고 있었지만 음성 흉부 방사선 사진을 가졌다. 하나는 사전 음성 퀀티페론(Quantiferon) 시험을 받았다.
MST의 10일 생체 외 확장 후, IFN-γ ELISpot은 대상체 당 5개 항원 중 3개의 중앙값에 대한 반응성을 입증했다(범위 1 내지 5, 표 5).
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
BCG 면역화(도 2a) 및 비-면역 공여자(도 2b)의 비교는 BCG 비-면역 공여자에서 PPE68(p = 0.028) 및 ADK(p = 0.015)에 대한 반응의 더 큰 가능성을 보여주었다(표 6).
Figure pct00014
Figure pct00015
배양은 7 내지 11 x 107 세포의 회복과 함께 평균 4.4배 확장을 겪었다(도 3a).
생체 외 확장된 MST는 주로 CD4+ T 세포이다
배양 후 벌크 MST의 유세포 분석은 대부분의 세포가 CD4+ T 세포(중앙값 63.7% CD3+/CD4+, 범위 47.5-77.7%, 도 3b)였고 CD8+ T 세포(중앙값 6% CD3+/CD8+, 범위 1.1 내지 23%)는 소수였음을 보여 주었다. 대부분의 CD4+ T 세포는 이펙터(중앙값 66.1%, 범위 60.8 내지 68.9%)였고 중앙 메모리 집단은 더 작았다(중앙값 1.6%, 범위 1.4 내지 4.4%)(도 3c). B 세포 또는 NK 세포의 파생물이 없었다.
마이코박테리아 반응은 일차 면역 결핍 환자에서 대체로 부재한다
원발성 면역 결핍 장애 및 M. 아비움 복합체 또는 M. 압세수스에 의한 침습성 감염이 있는 7명의 대상체를 마이코박테리아 항원에 대한 반응에 대해 시험했다. 기저 진단은 IL12RB1 결핍, NFKB1 반수체 부족, IFNGR1 결핍, GATA2 반수체 부족, 가부키 증후군, NEMO 결핍 및 정의되지 않은 조합 면역 결핍(CID)이었다. 항-IFN-γ 자가 항체 및 M. 아비움 및 M. 압세수스에 의한 침습성 감염을 가진 2명의 환자도 평가되었다. 10일 확장 후 IFN-γ ELISPOT를 통한 특이성 평가는 PID 환자 7명 중 2명에서 마이코박테리아 항원에 대한 특이성을 나타냈다(도 5a, 표 7).
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
항-IFN-γ자가 항체를 갖는 대상체의 둘 다는 마이코박테리아 항원에 대해 검출 가능한 T 세포 반응을 가졌다(하나의 대상체에서 AG85B 및 ADK, 다른 대상체에서 ESXA 및 ESXB). 배양 기간 동안 세포 확장은 NFKB1 반수체 부족(3.2배 확장)이 있는 대상체를 제외하고 모든 환자에서 최소이거나 부재했다(도 5b).
M. 투베르쿨로시스 용해물 또는 M. 아비움 센시틴에 대해 확장된 MST는 면역 우성 항원을 인식한다.
M. 투베르쿨로시스 또는 M. 아비움 센시틴으로부터의 용해물로 자극한 후 10일의 배양 후에, 5명의 시험 공여자 모두로부터 MST는 마이코박테리아 항원 펩믹스 또는 용해물 또는 센시틴에 대한 특이성을 나타냈다(도 6). 펩믹스, 용해물 또는 센시틴에 대한 확장 후 IFN-γ ELISPOT를 통한 MST 반응의 분석은 PPE68(p = 0.032)에 대한 반응에서 유의한 차이를 보였지만, 다른 항원에 대해서는 그렇지 않았다(표 8).
Figure pct00019
Figure pct00020
쌍 분석은 펩믹스 대 센시틴(p = 0.016)을 사용하여 생성된 MST의 PPE68에 대한 반응에서 통계적으로 유의한 차이를 보였지만, 펩믹스 대 용해물(p = 0.173) 또는 용해물 대 센시틴(p = 0.116)을 사용하여 MST들 사이에서는 차이를 나타내지 않았다. 펩믹스, 센시틴 또는 용해물을 사용하여 생성된 MST의 비교 표면 유세포 분석은 모두 CD4+ 이펙터 메모리 세포의 우세를 보였으며, 하위 집단들 간에 눈에 띄는 차이가 없었으며, γ/δ T 세포의 최소 비율을 나타냈다(도 10).
마이코박테리아 AG85B 및 ESXB의 에피토프는 종에 걸쳐 다양하게 보존된다
IFN-γ ELISPOT를 사용하여 AG85B 및 ESXB 내에서 에피토프 인식의 매핑은 다수의 공여자가 인식한 각 항원 내에서 여러 에피토프를 나타냈다. AG85B 내에서 5명의 공여자는 아미노산 위치 61-75 및 131-145를 포함하는 펩티드 #7 및 14를 인식했다(도 7). 펩티드 15(AA 141-155)는 2명의 공여자에서 반응을 유도하고 펩티드 19(AA 181-195)는 3명의 공여자에서 반응을 유도했다. ESXB 내에서 C-말단의 펩티드 8-10(AA 71-100)은 3명의 공여자에 의해 인식되었다. 예측 알고리즘을 사용한 공유 공여자 HLA 대립 유전자 분석[NetMHC(http://www.cbs. dtu.dk/services/NetMHCII/), IEDB MHC 예측 자(www.iedb.org)](34, 35)는 HLA DRB4 01:01, DPB1 04:01/02, DRB1 07:01 및 DRB3 02:02를 통한 AG85B 펩티드의 클래스 II MHC 제한, 및 HLA DQB1 03:01/02 및 DRB4 01:01을 통한 ESXB 펩티드의 클래스 II 제한을 제안했다(표 1). 이들 에피토프의 종간 보존 분석은 AG85B 에피토프의 높은 수준의 보존(67 내지 100%, 도 11), 및 ESXB 에피토프의 낮거나 중간 보존(40 내지 93%, 도 12)을 보여주었다.
논의
마이코박테리아 감염은 면역이 저하된 숙주에서 흔하며 치료가 매우 어려울 수 있다. 심지어 면역 능력이 있는 개인들 중에서도 멀티-약물 내성 결핵이 떠오르는 문제이며, 1차 항진균제에 대한 내성이 전세계적으로 새로운 사례의 4% 및 이전에 치료된 사례의 21%에서 보고되었다(1). SCID 또는 이와 유사한 심오한 형태의 PID를 갖는 영아의 경우, T 세포 면역의 회복 없이는 마이코박테리아 감염의 제거가 종종 불가능하다(2). BCG에 면역화된 형제 자매로부터 반복적인 전혈 수혈의 사용은 BCGosis가 개선된 SCID를 갖는 영아에 대한 보조 요법으로 보고되었다(36). 따라서, 마이코박테리아를 표적으로 하는 입양 면역 요법은 항생제와 함께 유용한 보조 요법이 될 수 있다.
건강한 공여자로부터 유도된 MST의 기능에 대한 우리의 분석은 선택된 마이코박테리아 항원에 대한 반응이 CD4+ 제한 및 다기능성임을 입증했다. 모든 공여자(BCG 예방 접종 또는 기타)는 적어도 하나의 항원을 인식했다. BCG 예방 접종과 미접종 사이의 반응 분석은 PPE68에 대한 ELISPOT에 대한 반응 크기의 차이를 보여 주었지만, 다른 4개의 항원에 대해서는 그렇지 않았다. ESXA와 ESXB는 BCG에서 이러한 유전자가 삭제되었음에도 불구하고 양 공여자 그룹 모두에서 인식되었다. 공여자 중 누구도 결핵 감염의 이전 이력이 없었다. 이것은 EXSA 및 ESXB에 대한 반응성(백신 접종을 받지 않은 공여자의 다른 항원뿐만 아니라)이 다른 직면하는 마이코박테리아 종에 대한 사전 반응을 나타냄을 시사한다. 사실이라면, 이것은 이 종들 간에 공유되는 교차 반응 에피토프의 존재를 뒷받침할 것이다. 멀티플렉스 시토카인 분석은 항원 재자극에 대한 반응으로 일관된 IFN-γ, TNF 및 GM-CSF 생산을 보여줄 뿐만 아니라 공여자의 하위 세트에서 IL-13 및 MIP1a를 나타냈다. GM-CSF 생산은 실험적인 마이코박테리아 감염의 세팅에서 설명되었지만, 인간 감염에서의 역할은 명확하지 않다(37). IL-13은 섬유증 및 점액 생성과 관련된 Th2 시토카인이며 BCG 백신을 접종하지 않은 공여자에서만 발견되었다. BCG 예방 접종은 예방 접종된 공여자에서 IL-13의 부재의 원인일 수 있으며, 예방 접종된 개인에서 이러한 항원에 대한 Th1 왜곡된 시토카인 반응을 강화할 수 있다. 많은 연구에서 마이코박테리아 질병을 제어하기 위해 대식 세포를 활성화하는 데 Th1 CD4+ T 세포 반응의 중요성이 강조되었다(38). 실험 모델에서, Th2 시토카인은 마이코박테리아 감염의 진행과 관련이 있지만, 인간 결핵에서는 Th2 시토카인 프로파일 상승이 마이코박테리아 감염의 원인인지 결과인지는 확실하지 않다.
부분적으로 HLA와 일치하는 바이러스-특이적 T 세포를 사용한 입양 면역 요법에서, VST 공여자와 수용자 사이의 HLA 매칭 알고리즘은 하나 이상의 면역 우성 바이러스 에피토프의 HLA 제한의 확인이 생체 내 항 바이러스 활성과 상관 관계가 있기 때문에 이 요법의 효능을 개선하는 데 핵심 단계 중 하나인 것으로 보인다(39). 마이코박테리아 에피토프 및 HLA 제한의 매핑은 부분적으로 일치하는 MST의 "기성품(off the shelf)"사용에도 필수적일 것이다. 여기서, 우리는 AG85B 및 ESXB 내에서 몇 가지 새로운 에피토프를 설명한다. AG85B 내에서, 인식된 단백질 영역(AA 61-75, 131-145, 141-155, 180-195)은 종에 걸쳐 매우 안정적이었다. 이전 연구에 따르면 이러한 영역은 상대적인 안정성을 설명할 수 있는 2차 구조 형성에 관여한다. 아미노산 181-195는 이전에 T 세포 에피토프 및 유도된 생체 외 CD4+ T 세포 증식을 포함하는 것으로 예측되었던 AG85B에서의 도메인과 중첩되었다(31). ESXB의 C-말단 내에서 인식된 에피토프는 종에 걸쳐 더 다양했다. 단백질의 이 영역은 ESXB 복합체의 단핵구 결합에 필수적인 것으로 설명되어 있으며, 따라서 마이코박테리아 발병에 중요한 역할을 할 수 있다(40). ESXA/ESXB 삭제가 BCG의 감쇠에 기여한다고 가정되었다. 임상적으로 분리된 마이코박테리아 종에서 에피토프의 안정성뿐만 아니라 이러한 항원의 HLA 제한 범위를 더 잘 이해하려면 광범위한 HLA 유형을 갖는 추가 공여자에 대한 추가 시험이 필요하다. 상이한 마이코박테리아 종에 걸친 공개된 단백질 서열의 비교는 상이한 정도의 상동성을 보여준다(표 9).
Figure pct00021
Figure pct00022
마이코박테리아 종의 게놈은 많은 종에서 2,000개 초과의 기술된 유전자를 갖는 평균 2MB이다. 따라서, 이 연구에서 시험된 5가지 항원을 넘어서 많은 수의 면역성 단백질이 있을 가능성이 있다. 그러나 M 투베르쿨로시스 용해물 및 M. 아비움 센시틴을 편향되지 않은 항원 공급원으로 사용하면 선택된 단백질에 대한 반응성이 여전히 나타난다. 항원 반응의 폭은 선택된 단백질보다 훨씬 더 넓을 가능성이 있지만, 확장 동안에 항원 경쟁으로 인해 가려지지 않았다. 이전 연구는 M 투베르쿨로시스와 비-투베르쿨로시스 마이코박테리아 사이의 교차 반응을 유사하게 설명했지만, 이러한 공유 항원에 대한 면역 반응의 생물학적 중요성은 아직 명확하지 않다(41).
또한 γ/8 T 세포가 마이코박테리아로부터의 인산염 항원에 의해 활성화된다는 증거도 있지만, 마이코박테리아 감염 제어에 있어서의 그 역할은 아직 명확하지 않다(42). 그러나 단백질에 추가하여 지질과 탄수화물을 함유하는 M. 투베르쿨로시스로부터의 전 세포 용해물을 이용할 때에도 γ/8 T 세포의 확장은 관찰되지 않았다.
T 세포 면역은 항-마이코박테리아 방어에 분명히 중요하지만, 골수 세포가 또한 GATA2 반수체 부족, IFNGR1/2 결핍, 만성 육아종 질환 및 IRF8 결핍과 같은 여러 형태의 일차 면역 결핍에 의해 입증된 바와 같이 필수적이다. PID를 갖는 시험 환자 중, 마이코박테리아 항원에 대한 반응은 NFKB1 반수체 부족(5개 항원 중 2개) 및 NEMO(5개 항원 중 1개)를 갖는 환자 2명에서만 발견되었다. 항-IFN-γ 자가 항체를 갖는 시험된 환자 둘 다에서 반응이 검출되었으며, 이는 환자 혈청이 없는 상태에서 이러한 환자 세포의 생체 외 확장으로 예상되었다. NFKB1 및 관련 장애는 T 세포 증식 결함을 유발하는 것으로 잘 설명되어 있으며, 미묘한 T 세포 이상도 IFNGR1 결핍에 설명되어 있다(43, 44). T 세포 림프 감소증은 GATA2 반수체 부족에도 설명되어 있다(45).
이 연구에서 우리는 좋은 제조 관행과 호환되는 신속한 확장 프로토콜을 사용하여 건강한 공여자로부터 마이코박테리아-특이적 T 세포가 안정적으로 확장될 수 있음을 보여주었다. T 세포 치료 단독으로는 골수성 결손이 우세한 PID 형태에는 도움이 되지 않을 수 있지만, 감염의 T 세포 제어 회복을 촉진하기 위해 이식 후 골수성 생착 직후 MST의 사용을 상상할 수 있으며, 이는 그렇지 않으면 몇 달 후까지는 발생할 것으로 예상되지 않을 것이다. 이상적인 공여자, 항원 및 T 세포 특성을 더 잘 특성화하려면 추가 작업이 필요할 것이지만, 마이코박테리아를 표적으로 하는 T 세포 면역 요법은 침습성 마이코박테리아 감염 환자에게 유용한 미래 치료법이 될 수 있다.
실시예 6 - 생체 내 마이코박테리아-특이적 T 세포 기능의 평가
생체 내에서 마이코박테리아-특이적 T 세포의 생물학적 활성을 평가하기 위해, 면역 결핍 인간화 NSG 마우스(hu-NSG)가 활용된다. 이 모델은 면역 결핍이며 T 세포 및 기타 인간 세포 계통의 빠른 생착을 가능하게 한다.
마이코박테리아 종 및 감염 방법: NSG 마우스는 에어로졸 화된 마이코박테리아(이는 M 아비움 균주 Chester 또는 결핵균 균주 H37RV를 포함할 수 있음)에 노출될 것이다. 마이코박테리아 샘플은 마우스 감염 전에 4주 동안 해동되고 배양된다. 50-400 CFU의 투여량은 에어로졸화를 위해 1ml 식염수에 사용된다.
MST 주입: 모든 MST 세포 주입은 냉동 보존된 배치로부터 신선한 세포 또는 해동된 세포를 사용하여 수행된다. 마우스는 이소플루란을 사용하여 마취된다. 마취는 동물의 발가락 꼬집음과 심호흡에 대한 반응 부족으로 확인된다(2초마다 1회). 게이지 27 바늘을 사용하여 세포를 천천히 정맥 내 주입한다(2x104 내지 10x106 세포/PBS 50uL). 마이코박테리아 감염없이 MST 단독을 받거나 MST 주입없이 마이코박테리아 감염을 받는 대조군이 유지된다.
임상 관찰. 종양 또는 면역 세포 또는 둘 다를 주사한 후, 동물은 특히 호흡기 증상에 초점을 맞춘 마이코박테리아 감염의 임상 징후 및 증상에 대해 매일 모니터링된다. 감염 후 최대 12주 동안 마우스가 추적된다. 마이코박테리아 투여량 및 MST 투여량을 기반으로한 생존 시간은 매트릭스 그리드를 사용하여 결정된다.
아래 기준(http://www.bu.edu/orccommittees/iacuc/policies-and-guidelines/tumor-policy-for-mice-and-rats/) 중 하나 이상의 존재는 안락사의 표시이다: 이동성 장애(음식과 물에 도달할 수 없음), 직립 상태 유지 불가능, 중요한 생리적 기능에 대한 종양 간섭(호흡, 저작, 삼키기, 배뇨, 배변 또는 이동 포함), 종양이 마모되게 하거나 이동을 방해하는 동물의 배 또는 그의 안쪽 다리에 있는 종양의 위치, >48 시간 동안 구부러진 비정상적인 자세, 고된 호흡 및 청색증[푸른 귓바퀴(귀) 또는 발 또는 점막], 임상적 탈수 및/또는 장기간의 음식 섭취 감소, 근육 위축 및 무기력증 및 신체 활동 부족, 체중의 20% 초과의 체중 감소, 48시간 초과의 만성 설사, 심한 빈혈(창백한 귓바퀴(귀) 또는 발 또는 점막), 임의의 구멍에서 피 묻은 또는 점액의 분비물 배출, 자가-절단, 48시간 초과 동안 그루밍 동작 부족/거친/흐트러진 헤어 코트, 돌출된 눈, 상당한 복부 팽만감, 행동 변화, 안절부절, 발작 또는 외부 자극에 대한 반응이 없는 무의식.
면역학적 분석: 동물 혈액 및 조직은 마이코박테리아 감염의 존재(조직의 산성 빠른 염색을 통해) 및 주입된 MST의 존재 및 확장에 대해 분석된다. 혈액 채취를 위해 안와 후 출혈이 수행된다(http://web.jhu.edu/animalcare/procedures/retro-orbital.html). 표준 헤파린화 또는 비-헤파린화 마이크로-헤마토크리트 모세관은 혈액 수집을 위해 사용된다. 동물은 절차 전에 이소플루란으로 마취된다. MST 분석은 마이코박테리아 펩믹스를 사용하여 인터페론 감마 ELISpot에 의해, 그리고 주입된 MST 라인과 관련된 HLA 단백질을 확인하기 위해 유세포 분석을 통해 수행된다. 세포 내 시토카인 염색은 생체 내 다수의 시점에서 MST 시토카인 기능을 결정하기 위해 수행된다.
SEQUENCE LISTING <110> Children's National Medical Center Hanley, Patrick Keller, Michael <120> MYCOBACTERIAL ANTIGEN COMPOSITIONS AND METHODS OF USE <130> 37921.0008P1 <140> PCT/US19/029505 <141> 2019-04-26 <150> US 62/663,239 <151> 2018-04-26 <160> 63 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 978 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atgacagacg tgagccgaaa gattcgagct tggggacgcc gattgatgat cggcacggca 60 gcggctgtag tccttccggg cctggtgggg cttgccggcg gagcggcaac cgcgggcgcg 120 ttctcccggc cggggctgcc ggtcgagtac ctgcaggtgc cgtcgccgtc gatgggccgc 180 gacatcaagg ttcagttcca gagcggtggg aacaactcac ctgcggttta tctgctcgac 240 ggcctgcgcg cccaagacga ctacaacggc tgggatatca acaccccggc gttcgagtgg 300 tactaccagt cgggactgtc gatagtcatg ccggtcggcg ggcagtccag cttctacagc 360 gactggtaca gcccggcctg cggtaaggct ggctgccaga cttacaagtg ggaaaccttc 420 ctgaccagcg agctgccgca atggttgtcc gccaacaggg ccgtgaagcc caccggcagc 480 gctgcaatcg gcttgtcgat ggccggctcg tcggcaatga tcttggccgc ctaccacccc 540 cagcagttca tctacgccgg ctcgctgtcg 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Ala Cys Gly Cys His 420 425 430 <210> 17 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antigen 1 <400> 17 Asp Ile Lys Val Gln Phe Gln Ser Gly Gly Asn Asn Ser Pro Ala 1 5 10 15 <210> 18 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> antigen 2 <400> 18 Asp Ile Lys Val Gln Phe Gln Ser Gly Gly Asn Asn Ser Pro Ala 1 5 10 15 <210> 19 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> antigen 3 <400> 19 Asp Ile Lys Val Gln Phe Gln Ser Gly Gly Asn Gly Ser Pro Ala 1 5 10 15 <210> 20 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> antigen 4 <400> 20 Asp Ile Lys Val Gln Phe Gln Ser Gly Gly Asn Gly Ser Pro Ala 1 5 10 15 <210> 21 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> antigen 5 <400> 21 Asp Ile Lys Val Gln Phe Gln Ser Gly Gly Ala Asn Ser Pro Ala 1 5 10 15 <210> 22 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> antigen 6 <400> 22 Glu Ile Lys Val Gln Phe Gln Asn Gly Gly Ala Lys Ser 1 5 10 <210> 23 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> antigen 6 <400> 23 Gly Cys Gln Thr Tyr Lys Trp Glu Thr Phe Leu Thr Ser Glu Leu 1 5 10 15 <210> 24 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> antigen 8 <400> 24 Gly Cys Gln Thr Tyr Lys Trp Glu Thr Phe Leu Thr Ser Glu Leu 1 5 10 15 <210> 25 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> antigen 9 <400> 25 Gly Cys Thr Thr Tyr Lys Trp Glu Thr Phe Leu Thr Ser Glu Leu 1 5 10 15 <210> 26 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> antigen 10 <400> 26 Gly Cys Thr Thr Tyr Lys Trp Glu Thr Phe Leu Thr Ser Glu Leu 1 5 10 15 <210> 27 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> antigen 11 <400> 27 Gly Cys Thr Thr Tyr Lys Trp Glu Thr Phe Leu Thr Ser Glu Leu 1 5 10 15 <210> 28 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> antigen 12 <400> 28 Thr Tyr Lys Trp Glu Thr Phe Leu Thr Thr Glu Leu 1 5 10 <210> 29 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> antigen 13 <400> 29 Leu Thr Ser Glu Leu Pro Gln Trp Leu Ser Ala Asn Arg Ala Val 1 5 10 15 <210> 30 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> antigen 14 <400> 30 Leu Thr Ser Glu Leu Pro Gln Trp Leu Ser Ala Asn Arg Ala Val 1 5 10 15 <210> 31 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> antigen 15 <400> 31 Leu Ser Ser Glu Leu Pro Asp Trp Leu Ala Ala Asn 1 5 10 <210> 32 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> antigen 16 <400> 32 Leu Thr Ser Glu Leu Pro Gln Tyr Leu Ala Ser Asn Lys Ser Val 1 5 10 15 <210> 33 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> antigen 17 <400> 33 Leu Thr Ser Glu Leu Pro Gln Trp Leu Ser Ala Asn Arg Ser Val 1 5 10 15 <210> 34 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> antigen 18 <400> 34 Leu Thr Thr Glu Leu Pro Gln Trp Leu Gly Ala Asn 1 5 10 <210> 35 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> antigen 19 <400> 35 Gln Gln Phe Ile Tyr Ala Gly Ser Leu Ser Ala Leu Leu Asp Pro 1 5 10 15 <210> 36 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> antigen 20 <400> 36 Gln Gln Phe Ile Tyr Ala Gly Ser Leu Ser Ala Leu Leu Asp Pro 1 5 10 15 <210> 37 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> antigen 21 <400> 37 Gln Phe Ile Tyr Ala Gly Ser Leu Ser Ala Leu Leu Asp Pro 1 5 10 <210> 38 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> antigen 22 <400> 38 Gln Phe Val Tyr Ala Gly Ser Leu Ser Ala Leu Leu Asp Pro 1 5 10 <210> 39 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> antigen 23 <400> 39 Gln Gln Phe Ile Tyr Ala Gly Ser Leu Ser Ala Leu Met Asp Pro 1 5 10 15 <210> 40 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> antigen 25 <400> 40 Gln Gln Phe Ile Tyr Ala Gly Ala Leu Ser Gly Phe Leu His Pro 1 5 10 15 <210> 41 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> antigen 25 <400> 41 Glu Ile Ser Thr Asn Ile Arg Gln Ala Gly Val Gln Tyr Ser Arg 1 5 10 15 <210> 42 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> antigen 26 <400> 42 Glu Ile Ser Thr Ile Asn Arg Gln Ala Gly Val Gln Tyr 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Ala Gln Gln Gln Gln Ala 1 5 10 15 Leu <210> 50 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> antigen 40 <400> 50 Tyr Ala Arg Glu Leu Thr Asp Glu Glu Arg Ala Gln Gln Gln Gln Ala 1 5 10 15 Leu <210> 51 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> antigen 41 <400> 51 Val Gln Tyr Ser Lys Ala Asp Glu Glu Gln Gln Gln Ala Leu Ser 1 5 10 15 <210> 52 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> antigen 42 <400> 52 Tyr Ala Arg Glu Leu Thr Asp Glu Glu Arg Gln Lys Gln Gln Gln Ala 1 5 10 15 Leu <210> 53 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> antigen 31 <400> 53 Ala Asp Glu Glu Gln Gln Gln Ala Leu Ser Ser Gln Met Gly Phe 1 5 10 15 <210> 54 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> antigen 32 <400> 54 Gln Ala Leu Ser Ala Gln Met 1 5 <210> 55 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> antigen 33 <400> 55 Ala Asn Glu Glu Gln Gln Gln Ser Trp Ala Thr Gln 1 5 10 <210> 56 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> 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<213> Artificial Sequence <220> <223> antigen 47 <400> 63 Val Gln Tyr Ser Arg Ala Asp Glu Glu Gln Gln Gln Ala Leu Ser 1 5 10 15

Claims (65)

  1. 마이코박테리움 종으로부터의 Ag85B 항원 또는 이의 기능적 단편을 코딩하는 핵산 서열, 마이코박테리움 종으로부터의 PPE68 항원 또는 이의 기능적 단편을 코딩하는 핵산, 마이코박테리움 종으로부터의 ESXA 항원 또는 이의 기능적 단편을 코딩하는 핵산, 마이코박테리움 종으로부터 ESXB 항원 또는 이의 기능적 단편을 코딩하는 핵산, 마이코박테리움 종으로부터의 ADK 항원 또는 이의 기능적 단편을 코딩하는 핵산, 또는 이들의 조합을 포함하는, 조성물.
  2. 제1항에 있어서, Ag85B 항원 또는 이의 기능적 단편을 코딩하는 핵산 서열은 서열번호 1과 적어도 50% 동일한, 조성물.
  3. 제1항에 있어서, PPE68 항원 또는 이의 기능적 단편을 코딩하는 핵산 서열은 서열번호 2와 적어도 50% 동일한, 조성물.
  4. 제1항에 있어서, ESXA 항원 또는 이의 기능적 단편을 코딩하는 핵산 서열은 서열번호 3과 적어도 50% 동일한, 조성물.
  5. 제1항에 있어서, ESXB 항원 또는 이의 기능적 단편을 코딩하는 핵산 서열은 서열번호 4와 적어도 50% 동일한, 조성물.
  6. 제1항에 있어서, ADK 항원 또는 이의 기능적 단편을 코딩하는 핵산 서열은 서열번호 5와 적어도 50% 동일한, 조성물.
  7. 마이코박테리움 종으로부터 Ag85B 항원을 코딩하는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드, 마이코박테리움 종으로부터 PPE68 항원을 코딩하는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드, 마이코박테리움 종으로부터 ESXA 항원을 코딩하는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드, 마이코박테리움 종으로부터 ESXB 항원을 코딩하는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드, 마이코박테리움 종으로부터 ADK 항원을 코딩하는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드, 또는 이들의 조합을 포함하는, 조성물.
  8. 제7항에 있어서, Ag85B 항원을 코딩하는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드는 서열번호 6과 약 50% 동일한, 조성물.
  9. 제7항에 있어서, PPE68 항원을 코딩하는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드는 서열번호 7과 약 50% 동일한, 조성물.
  10. 제7항에 있어서, ESXA 항원을 코딩하는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드는 서열번호 8과 약 50% 동일한, 조성물.
  11. 제7항에 있어서, ESXB 항원을 코딩하는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드는 서열번호 9과 약 50% 동일한, 조성물.
  12. 제7항에 있어서, ADK 항원을 코딩하는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드는 서열번호 10과 약 50% 동일한, 조성물.
  13. 제7항에 있어서, 하나 이상의 아미노산 서열은 Ag85B, PPE68, ESXA, ESXB 및 ADK 항원의 일부 또는 전부에 걸쳐서 서열이 중첩되는, 조성물.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 마이코박테리움 종은 M. 투베르쿨로시스(tuberculosis), M. 보비스(bovis), M. 보비스(bovis) BCG, M. 아비움(avium), M. 압세수스(abscessus), M. 케로나에(chelonae), M. 칸사시이(kansasii), M. 아프리카눔(africanum), M. 카네티(canetti), M. 카프래(caprae), M. 미크로트(microt), M. 문지(mungi), M. 오리기스(orygis), M. 아비움(avium), M. 아비움 파라투베르쿨로시스(avium paratuberculosis), M. 아비움 실바티쿰(avium silvaticum), M. 콜룸비엔세(columbiense), M 인트라셀룰라레(intracellulare), M. 고르도내(gordonae), M. 울세란스(ulcerans), M. 게나벤세(genavense), M. 스크로풀라세움(scrofulaceum), M. 인터메디움(intermedium), M. 포르투이툼(fortuitum), 및 M. 무코게니쿰(mucogenicum)으로 구성된 군으로부터 선택되는, 조성물.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 면역 세포를 자극하기 위해 사용되는, 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 면역 세포를 자극하는 것은 면역 세포를 활성화하는 것을 포함하는, 조성물.
  17. 제15항에 있어서, 면역 세포를 자극하는 것은 면역 세포를 확장하는 것을 포함하는, 조성물.
  18. 제15항에 있어서, 면역 세포는 CD8+ T 세포인, 조성물.
  19. 제15항에 있어서, 면역 세포는 NK 세포인, 조성물.
  20. 제15항에 있어서, 면역 세포는 CD4+ T 세포인, 조성물.
  21. 세포 또는 복수의 세포들로서,
    (i) 서열번호 1과 적어도 50% 동일한 Ag85B 항원을 코딩하는 핵산 서열, 서열번호 2와 적어도 50% 동일한 PPE68 항원을 코딩하는 핵산 서열, 서열번호 3과 적어도 50% 동일한 ESXA 항원을 코딩하는 핵산 서열, 서열번호 4와 적어도 50% 동일한 ESXB 항원을 코딩하는 핵산 서열, 서열번호 5와 적어도 50% 동일한 ADK 항원을 코딩하는 핵산 서열, 또는 이들의 조합;
    (ii) 서열번호 6과 적어도 50% 동일한 Ag85B 항원을 코딩하는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 7과 적어도 50% 동일한 PPE68 항원을 코딩하는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 8과 적어도 50% 동일한 ESXA 항원을 코딩하는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 9와 적어도 50% 동일한 ESXB 항원을 코딩하는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 10과 적어도 50% 동일한 ADK 항원을 코딩하는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는 이들의 조합;
    (iii) 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4 또는 서열번호 5의 핵산 서열의 기능적 단편을 코딩하는 (i)의 핵산; 및
    (iv) 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9 또는 서열번호 10의 아미노산 서열의 기능적 단편을 코딩하는 (ii)의 아미노산 서열 중 하나 또는 조합을 포함하는, 세포 또는 복수의 세포들.
  22. 제21항에 있어서, 세포는 헬퍼 (CD4+) T 세포인, 세포 또는 복수의 세포들.
  23. 제21항에 있어서, 세포는 세포 독성(CD8+) T 세포인, 세포 또는 복수의 세포들.
  24. 제21항에 있어서, 세포는 감마/델타 T 세포인, 세포 또는 복수의 세포들.
  25. 제21항에 있어서, 세포는 중앙 메모리 T 세포인, 세포 또는 복수의 세포들.
  26. 제21항에 있어서, 세포는 이펙터 메모리 T 세포인, 세포 또는 복수의 세포들.
  27. 제22항에 있어서, CD4+ T 세포는 전체 T 세포 집단의 약 60% 내지 약 90%를 차지하는, 세포 또는 복수의 세포들.
  28. 제23항에 있어서, CD8+ T 세포는 전체 T 세포 집단의 약 0% 내지 약 40%를 차지하는, 세포 또는 복수의 세포들.
  29. 제24항에 있어서, 감마/델타 T 세포는 전체 T 세포 집단의 약 0.5% 내지 약 10%를 차지하는, 세포 또는 복수의 세포들.
  30. 제25항에 있어서, 중앙 메모리 T 세포는 전체 T 세포 집단의 약 0.5% 내지 약 15%를 차지하는, 세포 또는 복수의 세포들.
  31. 제26항에 있어서, 중앙 메모리 T 세포는 전체 T 세포 집단의 약 20% 내지 약 60%를 차지하는, 세포 또는 복수의 세포들.
  32. 제21항에 있어서, 복수의 세포들은 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포를 포함하며, 여기서 CD8+ T 세포의 수는 CD4+ T 세포의 수보다 많은, 복수의 세포들.
  33. 제21항에 있어서, 세포는 인간 대상체로부터 유래되는, 세포 또는 복수의 세포들.
  34. 제33항에 있어서, 인간 대상체는 면역 약화된, 세포 또는 복수의 세포들.
  35. 제33항에 있어서, 인간 대상체는 마이코박테리아 감염을 갖는 것으로 진단되었거나 의심되는, 세포 또는 복수의 세포들.
  36. 제21항에 있어서, 세포 또는 복수의 세포들은 세포 배양에서 확장되는, 세포 또는 복수의 세포들.
  37. 제36항에 있어서, 적어도 하나의 1차 T 세포를 포함하는 세포 또는 복수의 세포들.
  38. 제21항에 있어서, 세포는 항원 제시 세포(APC)인, 세포 또는 복수의 세포들.
  39. 제38항에 있어서, APC 세포는 인공 항원 제시 세포인, 세포 또는 복수의 세포들.
  40. 제21항에 있어서, 세포는 대식 세포인, 세포 또는 복수의 세포들.
  41. 제21항에 있어서, 세포는 가지 세포인, 세포 또는 복수의 세포들.
  42. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 마이코박테리아 종으로부터의 하나 이상의 항원을 추가로 포함하고, 여기서 하나 이상의 항원은 표 1에 제공되는, 조성물.
  43. 제21항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는, 마이코박테리움 종으로부터 Ag85B 항원을 코딩하는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드, 마이코박테리움 종으로부터 PPE68 항원을 코딩하는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드, 마이코박테리움 종으로부터 ESXA 항원을 코딩하는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드, 마이코박테리움 종으로부터 ESXB 항원을 코딩하는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드, 마이코박테리움 종으로부터 ADK 항원을 코딩하는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드, 또는 이들의 조합을 발현할 수 있는, 세포.
  44. 생체 외 T 세포를 확장하도록 조작된 세포로서, 상기 세포는 Ag85B, PPE68, ESXA, ESXB 및 ADK로부터 선택된 적어도 5개의 항원을 포함하며, 상기 세포는,
    각각이 적어도 5개의 항원 중 하나 이상을 코딩하는 하나 이상의 핵산을 세포 내로 도입하는 단계; 및 항원들 중 하나 이상의 생산에 적합한 조건 하에서 세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법에 의해 생산되는, 세포.
  45. 제45항에 있어서, 세포는 T 세포, B 세포, 단핵구, 가지 세포, 피토해마글루티닌 블라스트(Phytohemagglutinin blasts)를 포함하는 항원 제시 세포, 또는 K562와 같은 불멸화된 세포 또는 다른 세포주에 기초한 인공 항원 제시 세포인, 세포.
  46. 제45항에 있어서, 핵산은 DNA 또는 RNA를 포함하는, 세포.
  47. 제45항에 있어서, 도입 단계는 바이러스 형질 도입을 포함하는, 세포.
  48. 제44항에 있어서, 도입 단계는 전기 천공을 포함하는, 세포.
  49. 제21항 내지 제41항 중 어느 한 항의 하나 또는 복수의 세포를 포함하는 조성물.
  50. 제약 조성물로서,
    (i) 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 조성물의 제약 유효량; 및
    (ii) 제약상 허용 가능한 담체를 포함하는, 제약 조성물.
  51. 제약 조성물로서,
    (i) 제21항 내지 제41항 중 어느 한 항의 하나 또는 복수의 세포의 제약 유효량; 및
    (ii) 제약상 허용 가능한 담체를 포함하는, 제약 조성물.
  52. 생체 외 T 세포를 확장하는 방법으로서,
    (a) 하나 또는 복수의 T 세포를 배양하는 단계;
    (b) 복수의 T 세포를 마이코박테리움 종으로부터 Ag85B 항원을 코딩하는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드, 마이코박테리움 종으로부터 PPE68 항원을 코딩하는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드, 마이코박테리움 종으로부터 ESXA 항원을 코딩하는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드, 마이코박테리움 종으로부터 ESXB 항원을 코딩하는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드, 마이코박테리움 종으로부터 ADK 항원을 코딩하는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드, 또는 이들의 조합과 접촉시키는 단계; 또는
    복수의 T 세포를 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 조성물 또는 제50항의 제약 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
  53. 생체 외 T 세포를 확장하는 방법으로서,
    (a) 하나 또는 복수의 분리된 T 세포를 배양하는 단계;
    (b) 복수의 T 세포를 항원 제시 세포와 접촉시키는 단계로서, 상기 항원 제시 세포는 마이코박테리움 종으로부터 Ag85B 항원을 코딩하는 아미노산 서열 또는 그의 단편, 마이코박테리움 종으로부터 PPE68 항원을 코딩하는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드, 마이코박테리움 종으로부터 ESXA 항원을 코딩하는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드, 마이코박테리움 종으로부터 ESXB 항원을 코딩하는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드, 마이코박테리움 종으로부터 ADK 항원을 코딩하는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드, 또는 이들의 조합을 발현하는 것을 제시하는 단계를 포함하는, 방법.
  54. 제52항 또는 제53항에 있어서, 하나 이상의 시토카인으로 하나 또는 복수의 T 세포를 자극하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  55. 제54항에 있어서, 시토카인은 IL-4, IL-7, IL-15, IL-21, TNFβ 및 IFNα로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  56. 제52항 또는 제53항에 있어서, 방법은 단계 (a) 전에 대상체로부터 샘플을 분리하는 것과 샘플로부터 T 세포를 분리하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  57. 치료를 필요로 하는 대상체에서 마이코박테리움 감염을 치료하는 방법으로서, 제1항 내지 제14항 및 제49항 중 어느 한 항의 조성물, 또는 제50항 또는 제51항의 제약 조성물의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  58. 제57항에 있어서, 대상체는 면역 약화된 숙주인, 방법.
  59. 제57항에 있어서, 대상체는 마이코박테리움 종에 의한 감염을 갖는 것으로 진단되었거나 의심되는, 방법.
  60. 제57항에 있어서, 감염은 활성 감염인, 방법.
  61. 치료를 필요로 하는 대상체에서 마이코박테리움 감염을 예방 또는 지연시키는 방법으로서, 제1항 내지 제14항 및 제49항 중 어느 한 항의 조성물, 또는 제50항 또는 제51항의 제약 조성물의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
  62. 제57항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 마이코박테리움 종은 M. 투베르쿨로시스, M. 보비스, M. 보비스 BCG, M. 아비움, M. 압세수스, M. 케로나에, M. 칸사시이, M. 아프리카눔, M. 카네티, M. 카프래, M. 미크로트, M. 문지, M. 오리기스, M. 아비움, M. 아비움 파라투베르쿨로시스, M. 아비움 실바티쿰, M. 콜룸비엔세, M 인트라셀룰라레, M. 고르도내, M. 울세란스, M. 게나벤세, M. 스크로풀라세움, M. 인터메디움, M. 포르투이툼, 및 M. 무코게니쿰으로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  63. 제58항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 면역 약화된, 방법.
  64. 제58항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 21세 미만의 아동인, 방법.
  65. 제58항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 12세 미만의 아동인, 방법.
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