ES2900233T3 - Moléculas que se unen a CD70 y métodos de uso de las mismas - Google Patents

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Abstract

Un polinucleótido aislado que codifica un receptor de antígeno quimérico (CAR) que comprende una molécula de unión al antígeno que se une específicamente a CD70, en el que la molécula de unión al antígeno comprende uno de: (a) una región CDR1 de VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 71; una región CDR2 de VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 72; una región CDR3 de VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 64; una región CDR1 de VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 53; una región CDR2 de VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 54; y una región CDR3 de VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 55; (b) una región CDR1 de VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 73; una región CDR2 de VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 74; una región CDR3 de VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 67; una región CDR1 de VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 56; una región CDR2 de VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 57; y una región CDR3 de VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 58; o (c) una región CDR1 de VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 75; una región CDR2 de VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 76; una región CDR3 de VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 70; una región CDR1 de VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 59; una región CDR2 de VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 60; y una región CDR3 de VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 61.

Description

DESCRIPCIÓN
Moléculas que se unen a CD70 y métodos de uso de las mismas
Campo técnico
La presente divulgación se refiere a receptores de antígenos quiméricos (CAR) que comprenden una molécula de unión al antígeno que se une a CD70, polinucleótidos que los codifican y métodos para tratar un cáncer en un paciente que los utiliza. Las referencias a métodos de tratamiento en el presente documento y en los párrafos posteriores de esta descripción deben interpretarse como referencias a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en un método para el tratamiento del cuerpo humano mediante terapia.
Antecedentes
Los cánceres humanos están compuestos por su naturaleza por células normales que han sufrido una conversión genética o epigenética para convertirse en células cancerosas anormales. Al hacerlo, las células cancerosas comienzan a expresar proteínas y otros antígenos que son distintos de los expresados por las células normales. El sistema inmunológico innato del cuerpo puede utilizar estos antígenos tumorales aberrantes para atacar y destruir específicamente las células cancerosas. Sin embargo, las células cancerosas emplean varios mecanismos para evitar que las células inmunitarias, tal como los linfocitos T y B, se dirijan con éxito a las células cancerosas.
Las terapias con células T humanas se basan en células T humanas enriquecidas o modificadas para atacar y destruir las células cancerosas en un paciente. Para aumentar la capacidad de las células T para atacar y destruir una célula cancerosa particular, se han desarrollado métodos para modificar células T para expresar constructos que dirigen las células T a una célula cancerosa diana particular. Los receptores de antígenos quiméricos (CAR) y los receptores de células T modificados (TCR), que comprenden dominios de unión capaces de interactuar con un antígeno tumoral particular, permiten que las células T se dirijan y eliminen las células cancerosas que expresan el antígeno tumoral particular. Se conocían de la técnica anterior varios anticuerpos con dominios de unión para CD70 (p. ej., los documentos WO2016/016859 o US2013/078237). Sin embargo, los CAR actuales con especificidad por CD70 se basan más bien en fracciones de unión derivadas de CD27 (Wang et al.2017 (Clin Cancer Res; 23: 2267-2276) o Shaffer et al.2011 (Blood 117: 4304-4314)). Wang et al. 2017, p. ej., menciona 7 CAR anti-CD70 humana con fracciones de unión de CD27 humana combinados con CD3 zeta y diferentes dominios coestimuladores de CD28 y/o 4-1BB.
Las terapias actuales para las neoplasias malignas hematológicas han mostrado niveles variables de eficacia. Por lo tanto, existe la necesidad de identificar terapias nuevas y mejoradas para tratar enfermedades y trastornos relacionados con CD70.
Invención
La presente invención está definida por los términos de las reivindicaciones adjuntas. Las siguientes explicaciones están destinadas a explicar el concepto general de la enseñanza y sus diversos aspectos y realizaciones.
Resumen
En un aspecto, se proporciona un polinucleótido aislado que codifica un receptor de antígeno quimérico (CAR) o un receptor de células T (TCR) que comprende una molécula de unión al antígeno que se une específicamente a CD70. En una realización, la molécula de unión al antígeno comprende: (a) una región determinante de la complementariedad (CDR) 1 de la región variable de la cadena pesada (VH) que comprende, consiste o consiste esencialmente en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en GFTFSSY (SEQ ID NO: 71), GDSIISGGY (SEQ ID NO: 73) y GYTFTSY (SEQ ID NO: 75); (b) una región determinante de complementariedad (CDR) 2 de la región variable de la cadena pesada (VH) que comprende, consiste o consiste esencialmente en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en WYDGSN (SEQ ID NO: 72), FYSGS (SEQ ID NO: 74) y DPSGGS (SEQ ID NO: 76); (c) una región determinante de complementariedad (CDR) de la región variable de cadena pesada (VH) 3 que comprende, consiste o consiste esencialmente en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en DLLRGVKGYAMDV (SEQ ID NO: 64), SGYSYALFDH (SEQ ID NO: 67) y DYGDYVFDY (SEQ ID NO: 76); (d) una región determinante de complementariedad (CDR) 1 de la región variable de cadena ligera (VL) que comprende, consiste en, o consiste esencialmente en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en RASQSLRRIYLA (SEQ ID NO: 53), RASQFIGRYFN (SEQ ID NO: 56) y SGSSSNIGTNTVN (SEQ ID NO: 59); (e) una región determinante de complementariedad (CDR) 2 de la región variable de cadena ligera (VL) que comprende, consiste o consiste esencialmente en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en DVFDRAT (SEQ ID NO: 54), AESSLQS (SEQ ID NO: 57) e INNQRPS (SEQ ID NOL 60); (f) una región determinante de complementariedad (CDR) 3 de la región variable de cadena ligera (VL) que comprende, consiste en, o consiste esencialmente en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en QQYSDSPFT (SEQ ID NO: 55), QQSYSTPFT (SEQ ID NO: 58) y ATWDDSLNGPVV (SEQ ID NO: 61). En una realización, la CDR3 de VH comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 64, 67 y 70.
En otro aspecto, se divulga un polinucleótido aislado que codifica un receptor de antígeno quimérico (CAR) o un receptor de células T (TCR) que comprende una molécula de unión al antígeno que se une específicamente a CD70. En una realización, la molécula de unión al antígeno comprende una CDR3 de VH que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 64, 67 y 70. En una realización, CDR1 de VH comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 71, 73 y 75.
En otra realización, la CDR2 de VH comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 72, 74 y 76.
En otra realización, la CDR1 de VL comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 53, 56 y 59. En otra realización, la CDR2 de VL comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 54, 57 y 60. En otra realización, la CDR3 de VL comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 55, 58 y 61.
En otra realización, la CDR1 de VH, CDR2 de VH y CDR3 de VH comprenden cada una la secuencia de aminoácidos de CDR1 de VH, CDR2 de VH y CDR3 de VH de una cadena ligera variable mostrada en las Figuras 7A, 7C o 7E.
En otra realización, la CDR1 de VL, CDR2 de VL y CDR3 de VL comprenden cada una la secuencia de aminoácidos de CDR1 de VL, CDR2 de VL y CDR3 de VL de un anticuerpo de las Figuras 7B, 7D o 7F. En otra realización, la molécula de unión al antígeno comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 3, 7 y 11.
En otra realización, la molécula de unión al antígeno comprende una secuencia de región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 5, 9 y 13.
En otra realización, la molécula de unión al antígeno comprende uno de: (a) una región CDR1 de VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 71; una región CDR2 de VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 72; una región CDR3 de VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 64; una región CDR1 de VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 53; una región CDR2 de VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 54; y una región CDR3 de VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 55; (b) una región c DR1 de VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 73; una región CDR2 de VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 74; una región CDR3 de VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 67; una región CDR1 de VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 56; una región CDR2 de VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 57; y una región CDR3 de VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 58; o (c) una región CDR1 de VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 75; una región CDR2 de VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 76; una región CDR3 de VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 70; una región CDR1 de VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 59; una región CDR2 de VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 60; y una región CDR3 de VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 61. En otra realización, la molécula de unión al antígeno comprende uno de: (a) una VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3; y una VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5; (b) una VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7; y una VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9; o (c) una VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 11; y una VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 13.
En otra realización, la secuencia de nucleótidos es al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, al menos aproximadamente 99% o aproximadamente el 100% idéntica a una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 2 y 4.
En otra realización, la secuencia de nucleótidos es al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, al menos aproximadamente 99% o aproximadamente el 100% idéntica a una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 6 y 8.
En otra realización, la secuencia de nucleótidos es al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, al menos aproximadamente 99% o aproximadamente el 100% idéntica a una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 10 y 12.
En otra realización, la molécula de unión al antígeno es de cadena sencilla.
En varias realizaciones, la molécula de unión al antígeno se selecciona del grupo que consiste en scFv, Fab, Fab', Fv, F(ab')2, dAb y cualquier combinación de los mismos, y en una realización específica la molécula de unión al antígeno comprende un scFv.
En otra realización, la VH y la VL están unidas por un enlazador. En una realización específica, la VH está ubicada en el terminal N del enlazador y la VL está ubicada en el terminal C del enlazador, y en otra realización, la VL está ubicada en el terminal N del enlazador y la VH está ubicada en el N terminal del enlazador.
En otra realización, el enlazador comprende al menos aproximadamente 5, al menos aproximadamente 8, al menos aproximadamente 10, al menos aproximadamente 13, al menos aproximadamente 15, al menos aproximadamente 18, al menos aproximadamente 20, al menos aproximadamente 25, al menos aproximadamente 30, al menos aproximadamente 35, al menos aproximadamente 40, al menos aproximadamente 45, al menos aproximadamente 50, al menos aproximadamente 60, al menos aproximadamente 70, al menos aproximadamente 80, al menos aproximadamente 90, o al menos aproximadamente 100 amino ácidos, y en otra realización el enlazador comprende una secuencia de aminoácidos al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos de una de las SEQ ID NOs: 80 y 81.
En otra realización, la molécula de unión al antígeno se une a CD70 con una Kd de menos de aproximadamente 1 * 10-6 M, menos de aproximadamente 1 * 10-7 M, menos de aproximadamente 1 * 10-8M, o menos de aproximadamente 1 * 10-9 M.
En otra realización, el CAR o TCR comprende además una región constante, y en otra realización, el CAR o TCR comprende además un dominio transmembrana y en otras realizaciones más el dominio transmembrana es un dominio transmembrana de CD28, 4-1BB/CD137, CD8 alfa, CD4, CD19, CD3 épsilon, CD45, CD5, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, una cadena alfa de un receptor de células T, una cadena beta de un receptor de células T, una cadena zeta de un receptor de células T o cualquier combinación de los mismos. En una realización específica, el dominio transmembrana es un dominio transmembrana de CD28T. En otra realización, el dominio transmembrana de CD28T comprende una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, al menos aproximadamente 99% o aproximadamente el 100% idéntica a la SEQ ID NO: 15 o 19.
En otra realización, el dominio transmembrana de CD28T está codificado por una secuencia de nucleótidos al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, al menos aproximadamente 99% o aproximadamente el 100% idéntica a la SEQ ID NO: 16 o 18.
En otra realización, el dominio transmembrana es un dominio transmembrana de CD8 alfa. En otra realización, el dominio transmembrana de CD8 alfa comprende una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, al menos aproximadamente 99% o aproximadamente 100% idéntica a la SEQ ID NO: 17, 21 o 94.
En otra realización, el dominio transmembrana de CD8 alfa está codificado por una secuencia de nucleótidos al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, al menos aproximadamente 99% o aproximadamente 100% idéntica a la SEQ ID NO: 16 o 20.
En otra realización, el CAR o TCR comprende además una región bisagra entre el dominio transmembrana y la molécula de unión al antígeno. En otra realización, la región bisagra comprende todo o un fragmento de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgD, IgE, IgM, CD28 o CD8 alfa. En otra realización, la región bisagra es de CD28T. En otra realización en la que la región bisagra comprende una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, al menos aproximadamente 99%, o aproximadamente el 100% idéntica a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 15 y 83. En otra realización, la región bisagra está codificada por una secuencia de nucleótidos al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, al menos aproximadamente 99%, o aproximadamente el 100% idéntica a un secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 14 y 82.
En otra realización, la región bisagra es de CD8 alfa. En otra realización, la región bisagra comprende una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, al menos aproximadamente 99%, o aproximadamente 100% idéntica a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 17 y 85, y en otra realización la región bisagra está codificada por una secuencia de nucleótidos al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, al menos aproximadamente 99% o aproximadamente el 100% idéntica a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 16 y 84.
En otra realización, el CAR o TCR comprende además una región coestimuladora. En otra realización, la región coestimuladora es una región de señalización de CD2, CD3 delta, CD3 épsilon, CD3 gamma, CD4, CD7, CD8a, CD8p, CD11a (ITGAL), CD11b (ITGAM), CD11c (ITGAX), CD11d (ITGAD), CD18 (ITGB2), CD19 (B4), CD27 (TNFRSF7), CD28, CD28T, CD29 (ITGB1), CD30 (TNFRSF8), CD40 (TNFRSF5), CD48 (SLAMF2), CD49a (ITGA1), CD49d (ITGA4), CD49f (ITGA6), CD66a (CEACAM1), CD66b (CEACAM8), CD66c (CEACAM6), CD66d (CEACAM3), CD66e (CEACAM5), c D69 (c Le C2), c D79A (cadena alfa asociada al complejo del receptor del antígeno de células B), CD79B (cadena beta asociada al complejo del receptor del antígeno de células B), CD84 (SLAMF5), CD96 (Tactile), CD100 (SEMA4D), CD103 (ITGAE), CD134 (OX40), CD137 (4-1BB), CD150 (SLAMF1), CD158A (KIR2DL1), CD158B1 (KIR2DL2), CD158B2 (KIR2DL3), CD158C (KIR3DP1), CD158D (KIRDL4), CD158F1 (KIR2DL5A), CD158F2 (KIR2DL5B), CD158K2 (KIR2DL5B), CDPL60L2 (KIR2DL5B), CDPL6D16 (DNAM1), CD229 (SLAMF3), CD244 (SLAMF4), CD247 (CD3-zeta), CD258 (LIGHT), CD268 (BAFFR), CD270 (TNFSF14), CD272 (BTLA), CD276 (B7-H3), CD279 (PD-1), CD314 (NKG2D), CD319 (SLAMF7), CD335 (NK-p46), CD336 (NK-p44), CD337 (NK-p30), CD352 (SLAMF6), CD353 ( SLAMF8), CD355 (CRTAM), CD357 (TNFRSF18), coestimulador de células T inducible (ICOS), LFA-1 (CD11a/CD18), NKG2C, DAP-10, ICAM-1, NKp80 (KLRF1), IL-2R beta, IL-2R gamma, IL-7R alfa, LFA-1, SLAMF9, LAT, GADS (GrpL), SLP-76 (LCP2), PAG1/CBP, un ligando CD83, receptor Fc gamma, molécula del MHC de clase 1, molécula del MHC de clase 2, una proteína receptora de TNF, una proteína de inmunoglobulina, un receptor de citocina, una integrina, receptores de células NK activadoras, un receptor del ligando Toll y/o fragmentos o combinaciones de los mismos.
En otra realización, la región coestimuladora es una región coestimuladora de CD28. En otra realización, la región coestimuladora comprende una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, al menos aproximadamente 99%, o aproximadamente 100% idéntica a la SEQ ID NO: 23, y en otra realización la región coestimuladora está codificada por una secuencia de nucleótidos al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, al menos aproximadamente 99% o aproximadamente el 100% idéntica a la SEQ ID NO: 22.
En otra realización, la región coestimuladora es una región coestimuladora de CD137 (4-1BB). En otra realización, la región coestimuladora comprende una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, al menos aproximadamente 99%, o aproximadamente 100% idéntica a la SEQ ID NO: 25 y en otra realización la región coestimuladora está codificada por una secuencia de nucleótidos al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, al menos aproximadamente 99% o aproximadamente el 100% idéntica a la SEQ ID NO: 24.
En otra realización, el CAR o TCR comprende además un dominio de activación. Y en otra realización, el dominio de activación es un dominio de CD3 zeta. En otra realización, el dominio de activación comprende una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, al menos aproximadamente 99%, o aproximadamente 100% idéntica a la SEQ ID NO: 27 o 92, y en otra realización el dominio de activación está codificado por una secuencia de nucleótidos al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, al menos aproximadamente 99% o aproximadamente el 100% idéntica a la SEQ ID NO: 26.
En otra realización, el CAR o TCR comprende además un péptido guía. En otra realización, el péptido guía comprende una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, al menos aproximadamente 99%, o aproximadamente 100% idéntica a la SEQ ID NO: 28, y en otra realización el péptido guía está codificado por una secuencia de nucleótidos al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, al menos aproximadamente 99% o aproximadamente el 100% idéntica a la SEQ ID NO: 95.
En otro aspecto, se proporciona un polinucleótido que codifica un CAR o TCR. En una realización específica, el polinucleótido se selecciona del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49 y 51. En otro aspecto, un vector que comprende cualquiera de los polinucleótidos descritos en este documento. En otra realización, el vector es un vector retroviral, un vector de ADN, un plásmido, un vector de ARN, un vector adenoviral, un vector asociado a adenovirus, un vector lentiviral o cualquier combinación de los mismos.
En otro aspecto, un CAR o TCR codificado por un polinucleótido divulgado en este documento o un vector divulgado en el presente documento. En otro aspecto, se proporciona una célula que comprende un polinucleótido divulgado en el presente documento, un vector divulgado en el presente documento, un CAR o TCR divulgado en el presente documento, o cualquier combinación de los mismos. En otra realización, la célula comprende una célula inmunitaria y, en otra realización, la célula es una célula T. En otra realización, la célula T es un linfocito infiltrante de tumor (TIL), célula T autóloga, célula T autóloga modificada (eACT), una célula T alogénica o cualquier combinación de las mismas, y en otra realización la célula es una célula in vitro.
En otro aspecto, una composición que comprende un polinucleótido divulgado en el presente documento, un vector divulgado en el presente documento, un CAR o TCR divulgado en el presente documento, o una célula divulgada en el presente documento. En otra realización, se formula una composición para administrarla a un sujeto.
En otro aspecto, un método para hacer que una célula exprese un CAR o TCR que comprende transducir una célula con un polinucleótido descrito en el presente documento en condiciones adecuadas. En otra realización, el método comprende además aislar la célula.
En otro aspecto, se proporciona un método para inducir una inmunidad contra un tumor, y en una realización comprende administrar a un sujeto una cantidad eficaz de una célula que comprende un polinucleótido descrito en este documento, un vector divulgado en este documento o un CAR o TCR divulgado en el presente documento.
En otro aspecto se proporciona un método para tratar un cáncer en un sujeto que lo necesita, y en una realización comprende administrar al sujeto un polinucleótido divulgado en este documento, un vector divulgado en este documento, un CAR o TCR divulgado en este documento, una célula divulgada en este documento, o una composición de las divulgadas en este documento. En una realización, el cáncer es un cáncer hematológico. En otra realización, el cáncer es de glóbulos blancos. En una realización adicional, el cáncer es de células plasmáticas. En otra realización, el cáncer es leucemia, linfoma o mieloma. En una realización específica, el cáncer es mieloma múltiple, enfermedad de Hodgkin, linfoma no Hodgkin (NHL), linfoma mediastínico primario de células B grandes (PMBC), linfoma difuso de células B grandes (DLBCL), linfoma folicular (FL), linfoma folicular transformado, linfoma esplénico de la zona marginal (SMZL), leucemia crónica o aguda, leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crónica, leucemia linfoblástica aguda (ALL) (incluida la ALL no de células T), leucemia linfocítica crónica (CLL), linfoma de células T, uno o más de leucemia linfoide aguda de células B ("BALL"), leucemia linfoide aguda de células T ("TALL"), leucemia linfoide aguda (ALL), leucemia mielógena crónica (CML), leucemia prolinfocítica de células B, neoplasia de células dendríticas plasmocitoides blásticas, linfoma de Burkitt, linfoma difuso de células B grandes, linfoma folicular, leucemia de células pilosas, linfoma folicular de células pequeñas o células grandes, afecciones linfoproliferativas malignas, linfoma MALT, linfoma de células del manto, linfoma de la zona marginal, mielodisplasia y mielodisplasia y síndrome mielodisplásico, linfoma plasmoblástico, neoplasia de células dendríticas plasmocitoides, macroglobulinemia de Waldenstrom, un trastorno proliferativo de células plasmáticas (p. ej., mieloma asintomático (mieloma múltiple latente o mieloma indolente), gammapatía monoclonal de significado indeterminado (MGUS), plasmacitomas (p. ej., discrasias de células plasmáticas, mieloma solitario, plasmacitoma solitario, plasmacitoma extramedular y plasmacitoma múltiple), amiloidosis de cadena ligera amiloide sistémica, síndrome POEMS (también conocido como síndrome de Crow-Fukase, enfermedad de Takatsuki y síndrome de PEP), o una combinación de los mismos. En una realización específica, el cáncer es mieloma múltiple. También se describe un CAR o TCR, en el que el CAR o TCR comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50 y 52. En varias realizaciones, el CAR o TCR comprende una secuencia guía de las SEQ ID NO: 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50 y 52 está ausente.
Breve descripción de las figuras
Las Figuras 1A-1H son dibujos que representan ejemplos de los constructos CAR proporcionadas en el presente documento; se muestran los componentes representativos y una disposición preferida de los mismos.
La Figura 2 es una serie de gráficos que demuestran la expresión de CD70 en varias líneas de células diana, que corresponden a una variedad de cánceres de sangre; fila superior desde el panel izquierdo al panel derecho, la línea celular de linfoblastos humanos CEM (también conocida como CCRF-CEM), la línea celular de eosinófilos humanos EoL-1, la línea celular mieloide humana HL-60, la línea celular mieloide humana KG-la, y la línea celular mieloide humana MV4-11; fila inferior, desde el panel izquierdo al panel derecho, la línea de células B humanas Namalwa, la línea celular de linfocitos B Raji, la línea celular de linfocitos B humanos Toledo y la línea celular mieloide humana U-937.
Las Figuras 3A y 3B son una serie de gráficos que demuestran la expresión de varios CAR dirigidos contra CD70 en células T transducidas por lentivirus aisladas de un primer donante de células T humanas sanas (Figura 3A) y un segundo donante de células T humanas sanas (Figura 3B); los histogramas claros denotan transducción simulada y los histogramas rellenos de gris denotan células que expresan el CAR transducido, y los números en los paneles indican el porcentaje de células que resultaron ser positivas para CAR.
Las Figuras 4A-4F son una serie de gráficos de barras que representan la producción de IFNy, TNFa e IL-2 por células T transducidas por lentivirus de dos donantes sanos que expresan cuatro CAR diferentes (28T-28z, 28T-4Bz, 8K-28z, 8K-4Bz), cada uno de los cuales comprende un scFv diferente (8G1, 1C8 y 6E9), después de 16 horas de cocultivo con líneas celulares diana KG-la, Raji o Namalwa; las Figura 4A y 4B muestran la producción de IFNy (pg/ml; eje y) en células T CAR transducidas por lentivirus del donante 1 (Figura 4A) y el donante 2 (Figura 4B); las Figuras 4C y 4D muestran el TNFa (pg/ml; eje y) en células T CAR transducidas por lentivirus del donante 1 (Figuras 4C) y del donante 2 (Figuras 4D), y las Figuras 4E y 4F muestran la producción de IL-2 (pg/ml; eje y) en células T CAR transducidas por lentivirus obtenidas de un primer donante (Figura 4E) y un segundo donante (Figura 4F).
Las Figuras 5A-5D muestran la actividad citolítica (como porcentaje de células diana viables restantes; eje y) a lo largo del tiempo de células T transducidas por lentivirus obtenidas del donante 1 sano (Figuras 5A y 5C) o del donante 2 sano (Figuras 5B y 5D) que expresan los CAR indicados cocultivadas durante 112 horas con células diana KG-la (CD70-) (Figuras 5A y 5B), Raji (CD70+) (Figura 5C) o Namalwa (CD70+) (Figura 5D).
La Figura 6 es una tabla que muestra las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de la molécula de unión al antígeno divulgada en el presente documento, numeradas utilizando los sistemas de Kabat, Chothia e IGMT. Las Figuras 7A-7F son una serie de tablas que muestran las secuencias variable pesada (VH) y variable ligera (VL) para cada uno de los CAR o TCR proporcionados en el presente documento; las CDR también se presentan y se muestran numeradas utilizando los sistemas de Kabat, Chothia e IGMT.
Las Figuras 8A-8L representan secuencias de ácido nucleico que codifican los diversos CAR descritos en el presente documento; también se proporcionan las correspondientes secuencias de aminoácidos.
La Figura 9 es un gráfico de barras que demuestra la expresión de CD70 CAR C3L dirigida contra CD70 en células T transducidas por lentivirus.
Las Figuras 10A-10D muestran la actividad citolítica (como porcentaje de células diana viables restantes; eje y) a lo largo del tiempo de células T transducidas por lentivirus obtenidas de un donante sano 3 (Figuras 10A y 10B) o un donante sano 4 (Figuras 10C y 10D ) que expresan los CAR indicados cocultivados durante 112 horas con KG-la o Raji en una relación E:T de 4:1 (Figura 10A y 10C) o 1:1 (Figura 10B y 10D).
Las Figuras 11A-11D son una serie de gráficos de barras que representan IFNy, producción por células T transducidas por lentivirus de dos donantes sanos que expresan CD70 CAR C3L (28T-28z, que comprende un scFv 8G1), luego de 16 horas de cocultivo con líneas celulares diana KG-la o Raji; las Figuras 11A y 11B muestran la producción de IFNy (pg/ml; eje y) en células T CAR transducidas por lentivirus del donante 3 en una relación E:T de 4:1 y 1:1, respectivamente; las Figuras 11C y 11D muestran la producción de IFNy (pg/ml; eje y) en células T CAR transducidas por lentivirus del donante 4 en una relación E:T de 4:1 y 1:1, respectivamente.
Las Figuras 12A-12D son una serie de gráficos de barras que representan IL2, la producción por células T transducidas por lentivirus de dos donantes sanos que expresan un CD70 CAR C3L (28T-28z, que comprende un scFv de 8G1) después de 16 horas de cocultivo con líneas celulares diana KG-la o Raji; las Figuras 12A y 12B muestran la producción de IL2 (pg/ml; eje y) en células T CAR transducidas por lentivirus del donante 3 en una relación E:T de 4:1 y 1:1, respectivamente; las Figuras 12C y 12D muestran la producción de IL2 (pg/ml; eje y) en células T CAR transducidas por lentivirus del donante 4 en una relación E:T de 4:1 y 1:1, respectivamente.
Las Figuras 13A-13D son una serie de gráficos de barras que representan TNFa, producción por células T transducidas por lentivirus de dos donantes sanos que expresan un CAR C3L CD70 (28T-28z, que comprende un scFv 8G1) después de 16 horas de cocultivo con líneas celulares diana KG-la o Raji; las Figuras 13A y 13B muestran la producción de IL2 (pg/ml; eje y) en células T CAR transducidas por lentivirus del donante 3 en una relación E:T de 4:1 y 1:1, respectivamente; las Figuras 13C y 13D muestran la producción de TNFa (pg/ml; eje y) en células T CAR transducidas por lentivirus del donante 4 en una relación E:T de 4:1 y 1:1, respectivamente.
Descripción detallada
La presente divulgación se refiere a anticuerpos, moléculas de unión a antígenos de los mismos, receptores de antígenos quiméricos (CAR) que se unen a CD70, polinucleótidos que lo codifican y células in vitro que lo comprenden. Los polinucleótidos, polipéptidos y células in vitro descritos en el presente documento se pueden usar en una terapia de células T CAR modificadas genéticamente, p. ej., una terapia de células autólogas (eACTMR), para el tratamiento de un paciente que padece un cáncer. En particular, los polinucleótidos, polipéptidos y células in vitro descritos en este documento pueden usarse para el tratamiento del mieloma múltiple.
Definiciones
Para que la presente divulgación pueda entenderse más fácilmente, primero se definen algunos términos. Tal como se utiliza en esta solicitud, salvo que se indique expresamente lo contrario en este documento, cada uno de los siguientes términos tendrá el significado que se expone a continuación. Se exponen definiciones adicionales a lo largo de la solicitud. Los títulos proporcionados en este documento no son limitaciones de los diversos aspectos de la divulgación, aspectos que pueden entenderse por referencia a la memoria descriptiva en su conjunto.
Se entiende que siempre que se describen aquí aspectos con la expresión "que comprende", también se proporcionan aspectos análogos descritos en términos de "que consiste en" y/o "que consiste esencialmente en".
El uso de la alternativa (p. ej., "o") debe entenderse que significa una, ambas o cualquier combinación de las alternativas. Como se usa en el presente documento, los artículos indefinidos "un" o "uno, una" deben entenderse que se refieren a "uno o más" de cualquier componente mencionado o enumerado.
El término "y/o" cuando se usa en este documento debe tomarse como descripción específica de cada una de las dos características o componentes especificados con o sin el otro. Por lo tanto, el término "y/o" como se usa en una frase como "A y/o B" en el presente documento pretende incluir "A y B", "A o B", "A" (solo) y "B" (solo). Asimismo, el término "y/o" como se usa en una frase tal como "A, B y/o C" pretende abarcar cada uno de los siguientes aspectos: A, B y C; A, B o C; A o C; A o B; B o C; A y C; A y B; B y C; A (solo); B (solo); y C (solo).
Las unidades, prefijos y símbolos utilizados en este documento se proporcionan utilizando su forma aceptada por Systéme International de Unites (SI). Los intervalos numéricos incluyen los números que definen el intervalo.
A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que el comúnmente entendido por un experto en la técnica a la que se refiere esta descripción. Por ejemplo, Juo, The Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, 2a ed., (2001), CRC Press; The Dictionary of Cell & Molecular Biology, 5a ed., (2013), Academic Press; y el The Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology, Cammack et al. eds., 2a ed. (2006), Oxford University Press, proporcionan a los expertos en la técnica un diccionario general para muchos de los términos utilizados en esta descripción.
Como se usa en este documento, los veinte aminoácidos convencionales (p. ej., naturales) y sus abreviaturas siguen el uso convencional. Véase, p. ej., Immunology - A Synthesis (2a edición), Golub y Green, eds., Sinauer Assoc., Sunderland, Mass. (1991), que se incorpora aquí como referencia para cualquier propósito. Los estereoisómeros (p. ej., D-aminoácidos) de los veinte aminoácidos convencionales, aminoácidos no naturales tales como aminoácidos alfa, alfa disustituidos, N-alquil aminoácidos, ácido láctico y otros aminoácidos no convencionales también pueden ser componentes adecuados para polipéptidos de la presente divulgación. Ejemplos de aminoácidos no convencionales incluyen: 4-hidroxiprolina, gamma-carboxiglutamato, épsilon-N,N,N-trimetil-lisina, eN-acetil-lisina, O-fosfoserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3-metilhistidina, 5-hidroxilisina, sigma-N-metilarginina y otros aminoácidos e iminoácidos similares (p. ej., 4-hidroxiprolina). En la notación de polipéptidos utilizada aquí, la dirección de la izquierda es la dirección del terminal amino y la dirección de la derecha es la dirección del terminal carboxilo, de acuerdo con el uso y la convención estándar.
Como se usa en este documento, el término "aproximadamente" se refiere a un valor o composición que está dentro de un intervalo de error aceptable para el valor o composición particular según lo determine un experto en la técnica, que dependerá en parte de cómo se mide o determina el valor o la composición, es decir, las limitaciones del sistema de medición. Por ejemplo, "aproximadamente" o "que comprende esencialmente de" puede significar dentro de una o más de una desviación estándar según la práctica en la técnica. Alternativamente, "aproximadamente" o "que comprende esencialmente de" puede significar un intervalo de hasta el 10% (es decir, ± 10%). Por ejemplo, aproximadamente 5 mg pueden incluir cualquier número entre 4,5 mg y 5,5 mg. Además, particularmente con respecto a los sistemas o procesos biológicos, los términos pueden significar hasta un orden de magnitud o hasta 5 veces un valor. Cuando se proporcionan valores o composiciones particulares en la presente divulgación, a menos que se indique lo contrario, se debe suponer que el significado de "aproximadamente" o "que comprende esencialmente de" está dentro de un intervalo de error aceptable para ese valor o composición particular.
Como se describe en este documento, cualquier intervalo de concentración, intervalo de porcentaje, intervalo de relación o intervalo de números enteros debe entenderse que incluye el valor de cualquier número entero dentro del intervalo mencionado y, cuando sea apropiado, fracciones del mismo (tales como un décimo y un centésimo de un número entero), a menos que se indique lo contrario.
"Administración" se refiere a la introducción física de un agente a un sujeto, utilizando cualquiera de los diversos métodos y sistemas de administración conocidos por los expertos en la técnica. Ejemplos de vías de administración para las formulaciones divulgadas en el presente documento incluyen vías de administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, intraperitoneal, espinal u otras vías de administración parenteral, p. ej. mediante inyección o infusión. La frase "administración parenteral" como se usa en este documento significa modos de administración distintos de la administración enteral y tópica, normalmente por inyección, e incluye, sin limitación, inyección e infusión intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intralinfática, intralesional, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal, epidural e intraesternal, así como electroporación in vivo. En algunas realizaciones, la formulación se administra mediante una ruta no parenteral, p. ej., por vía oral. Otras rutas no parenterales incluyen una ruta de administración tópica, epidérmica o mucosa, p. ej., intranasal, vaginal, rectal, sublingual o tópica. La administración también se puede realizar, p. ej., una vez, una pluralidad de veces y/o durante uno o más períodos prolongados.
El término "anticuerpo" (Ab) incluye, sin limitación, una inmunoglobulina glicoproteína que se une específicamente a un antígeno. En general, un anticuerpo puede comprender al menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro, o una molécula de unión al antígeno del mismo. Cada cadena H comprende una región variable de cadena pesada (abreviada aquí como VH) y una región constante de cadena pesada. La región constante de la cadena pesada comprende tres dominios constantes, CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera comprende una región variable de cadena ligera (abreviada aquí como VL) y una región constante de cadena ligera. La región constante de la cadena ligera comprende un dominio constante, CL. Las regiones VH y VL pueden subdividirse además en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones marco (FR). Cada VH y VL comprende tres CDR y cuatro FR, dispuestos desde el extremo amino al extremo carboxilo en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera contienen un dominio de unión que interactúa con un antígeno. Las regiones constantes de los Ab pueden mediar en la unión de la inmunoglobulina a los tejidos o factores del huésped, incluidas varias células del sistema inmunitario (p. ej., células efectoras) y el primer componente (C1q) del sistema del complemento clásico.
Los anticuerpos pueden incluir, p. ej., anticuerpos tanto naturales como no naturales (producidos de forma recombinante), anticuerpos humanos y no humanos, anticuerpos monoespecíficos, anticuerpos multiespecíficos (incluidos anticuerpos biespecíficos), inmunoglobulinas, anticuerpos sintéticos, anticuerpos tetraméricos que comprenden dos moléculas de cadena pesada y dos de cadena ligera, un monómero de cadena ligera de anticuerpo, un monómero de cadena pesada de anticuerpo, un dímero de cadena ligera de anticuerpo, un dímero de cadena pesada de anticuerpo, un par de cadena ligera de anticuerpo-cadena pesada de anticuerpo, intracuerpos (véase, p. ej., Stocks, (2004) Drug Discovery Today 9 (22): 960-66), fusiones de anticuerpos (cuyo término abarca conjugados anticuerpo-fármaco) y que a veces se denominan en el presente documento "conjugados de anticuerpos"), anticuerpos heteroconjugados, anticuerpos de dominio único, anticuerpos monovalentes, anticuerpos de cadena sencilla o Fv de cadena sencilla (scFv), anticuerpos camelizados, aficuerpos, fragmentos Fab, fragmentos F (ab')2, Fv unidos por disulfuro (sdFv), anticuerpos anti-idiotípicos (anti-Id) (incluidos, p. ej., anticuerpos anti-anti-Id), minicuerpos, anticuerpos de dominio, anticuerpos sintéticos (a veces denominados en el presente documento "miméticos de anticuerpos") y fragmentos de unión a antígeno de los mismos. En algunas realizaciones, los anticuerpos descritos en el presente documento se refieren a poblaciones de anticuerpos policlonales.
Una inmunoglobulina es una molécula tetramérica, normalmente compuesta por dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, cada par tiene una cadena "ligera" (aproximadamente 25 kDa) y una cadena "pesada" (aproximadamente 50-70 kDa). La porción del terminal amino de cada cadena incluye una región variable de aproximadamente 100 a 130 o más aminoácidos principalmente responsables del reconocimiento de antígenos. La porción del terminal carboxilo de cada cadena define una región constante principalmente responsable de la función efectora. Las cadenas ligeras humanas se clasifican como cadenas ligeras kappa y lambda. Las cadenas pesadas se clasifican como mu, delta, gamma, alfa o épsilon y definen el isotipo del anticuerpo como IgM, IgD, IgG, IgA o IgE, respectivamente. Dentro de las cadenas ligeras y pesadas, las regiones variable y constante están unidas por una región "J" de aproximadamente 12 o más aminoácidos, incluyendo la cadena pesada también una región "D" de aproximadamente 10 aminoácidos más. Véase, en general, Berzofsky y Berkower, capítulo 7 en Fundamental Immunology (Paul, W., ed., Lippincott Williams & Wilkins (2012). Las regiones variables de cada par de cadenas ligeras/pesadas forman el sitio de unión del anticuerpo de manera que una inmunoglobulina intacta tiene dos sitios de unión primarios.
Una inmunoglobulina puede derivarse de cualquiera de los isotipos comúnmente conocidos, incluidos, entre otros, IgA, IgA secretora, IgG e IgM. Las subclases de IgG también son bien conocidas por los expertos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 humanas. "Isotipo" se refiere a la clase o subclase de Ab (p. ej., IgM o IgG1) que está codificada por los genes de la región constante de la cadena pesada. El término "anticuerpo" incluye, a modo de ejemplo, anticuerpos tanto naturales como no naturales; anticuerpos monoclonales y policlonales; anticuerpos quiméricos y humanizados; anticuerpos humanos o no humanos; anticuerpos totalmente sintéticos; y anticuerpos monocatenarios. Un anticuerpo no humano puede humanizarse mediante métodos recombinantes para reducir su inmunogenicidad en el hombre. Cuando no se indique expresamente, y a menos que el contexto indique lo contrario, el término "anticuerpo" también incluye un fragmento de unión a antígeno o una molécula de unión al antígeno de cualquiera de las inmunoglobulinas mencionadas anteriormente, e incluye un fragmento o porción monovalente y divalente, y un anticuerpo de una sola cadena (es decir, un scFv).
Como se usa en este documento, los términos "anticuerpo de cadena sencilla" y "fragmento variable de cadena sencilla (scFv)" se utilizan indistintamente y significan una molécula de unión al antígeno en la que una región VL y VH se unen mediante un enlazador para formar una cadena de proteína continua en la que el conector es lo suficientemente largo para permitir que la cadena de proteína se pliegue sobre sí misma y forme un sitio de unión de antígeno monovalente (véase, p. ej., Bird et al., (1988) Science 242: 423-26 y Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879 -83 (1988).
Como se usa en este documento, el término "diacuerpo" o dAB significa anticuerpos bivalentes que comprenden dos cadenas polipeptídicas, en las que cada cadena polipeptídica comprende dominios VH y VL unidos por un enlazador que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre dos dominios en la misma cadena, permitiendo así que cada dominio se empareje con un dominio complementario en otra cadena polipeptídica (véase, p. ej., Holliger et al., (1993) Proc Natl Acad Sci USA 90: 6444-48, Poljak et al., (1994) Structure2: 1121-23, y Perisic et al., (1994) Structure 2 (12): 1217-26). Si las dos cadenas polipeptídicas de un diacuerpo son idénticas, entonces un diacuerpo resultante de su apareamiento tendrá dos sitios de unión a antígeno idénticos. Pueden usarse cadenas polipeptídicas que tienen diferentes secuencias para preparar un diacuerpo con dos sitios de unión a antígeno diferentes. De manera similar, los triacuerpos y tetracuerpos son anticuerpos que comprenden tres y cuatro cadenas polipeptídicas, respectivamente, y que forman tres y cuatro sitios de unión al antígeno, respectivamente, que pueden ser iguales o diferentes.
Como se usa en este documento, el término "fragmento Fab" significa que es un fragmento monovalente que tiene los dominios VL, VH, CL y CH; un "fragmento F(ab')2" es un fragmento bivalente que tiene dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región bisagra; un "fragmento Fv" tiene los dominios VH y VL de un solo brazo de un anticuerpo; y un "fragmento dAb" tiene un dominio VH, un dominio VL o un fragmento de unión a antígeno de un dominio VH o VL.
Una "molécula de unión al antígeno", "porción de unión a antígeno" o "fragmento de anticuerpo" se refiere a cualquier molécula que comprende las partes de unión a antígeno (p. ej., CDR) del anticuerpo del que se deriva la molécula. Una molécula de unión al antígeno puede incluir las regiones determinantes de complementariedad antigénicas (CDR). Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen, pero no se limitan a, fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv, dAb, anticuerpos lineales, anticuerpos scFv y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de moléculas de unión a antígeno. Los pepticuerpos (es decir, moléculas de fusión Fc que comprenden dominios de unión a péptidos) son otro ejemplo de moléculas de unión a antígenos adecuadas. En algunas realizaciones, la molécula de unión al antígeno se une a un antígeno en una célula tumoral. En algunas realizaciones, la molécula de unión al antígeno se une a un antígeno en una célula involucrada en una enfermedad hiperproliferativa o a un antígeno viral o bacteriano. En algunas realizaciones, la molécula de unión al antígeno se une a CD70. En realizaciones adicionales, la molécula de unión al antígeno es un anticuerpo o un fragmento del mismo, que incluye una o más de las regiones determinantes de complementariedad (CDR) del mismo. En realizaciones adicionales, la molécula de unión al antígeno es un fragmento variable de cadena sencilla (scFv). En algunas realizaciones, la molécula de unión al antígeno comprende o consta de avímeros.
Una molécula de unión al antígeno puede comprender, p. ej., una estructura proteica alternativa o estructura artificial con regiones determinantes de complementariedad (CDR) injertadas o derivados de CDR. Dichas estructuras incluyen, pero no se limitan a, estructuras derivadas de anticuerpos que comprenden mutaciones introducidas para, p. ej., estabilizar la estructura tridimensional de la molécula de unión al antígeno así como estructuras totalmente sintéticas que comprenden, p. ej., un polímero biocompatible. Véase, p. ej., Korndorfer et al., 2003, Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics, 53 (1): 121-129 (2003); Roque et al., Biotechnol. Prog. 20: 639 - 654 (2004). Además, se pueden usar miméticos de anticuerpos peptídicos ("PAM"), así como estructuras basadas en miméticos de anticuerpos que utilizan varios componentes (p. ej., fibronectina) como estructura. Una molécula de unión al antígeno puede tener, p. ej., la estructura de una inmunoglobulina de origen natural.
Una molécula de unión al antígeno puede formar un componente de un CAR o TCR, y puede servir para dirigir el CAR o TCR para que reconozca una diana de interés (p. ej., CD70). Como se usa en el presente documento, en el contexto de un CAR o TCR divulgado, una molécula de unión al antígeno significa cualquier componente de un CAR o TCR que dirige el CAR o TCR a una diana deseada y se asocia con esa diana. En realizaciones específicas, un componente de molécula de unión al antígeno de un CAR o TCR comprende un scFv que comprende una región variable de cadena pesada y ligera unida por un enlazador. Las regiones variables pesadas y ligeras pueden derivarse del mismo anticuerpo o de dos anticuerpos diferentes. Las moléculas de unión a antígeno utilizadas en un CAR o TCR pueden derivarse de un anticuerpo que se sabe o se sospecha que se une a una diana de interés. En realizaciones específicas, una molécula de unión al antígeno utilizada en un CAR o TCR incluye los pares de secuencias que comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 3 y 5, SEQ ID NOs: 7 y 9, y SEQ ID NOs: 11 y 13, que también se presentan en las Figuras 7A-7F.
Como se usa en este documento, los términos "región variable" o "dominio variable" se usan indistintamente y significan una porción de un anticuerpo, generalmente una porción de una cadena ligera o pesada, típicamente alrededor del extremo terminal amino del anticuerpo y que comprende aproximadamente 100-130 aminoácidos en la cadena pesada y aproximadamente 90 a 115 aminoácidos en la cadena ligera, que difieren ampliamente en secuencia entre anticuerpos y se usan en la unión y especificidad de un anticuerpo particular por su antígeno particular. La variabilidad en la secuencia se concentra en aquellas regiones llamadas regiones determinantes de complementariedad (CDR) mientras que las regiones más altamente conservadas en el dominio variable se denominan regiones marco (FR). Las CDR de las cadenas ligera y pesada son las principales responsables de la interacción y especificidad del anticuerpo con el antígeno.
En algunas realizaciones, la región variable es una región variable humana. En realizaciones adicionales, la región variable comprende CDR de roedor, humano o murino y regiones marco humanas (FR). En realizaciones adicionales, la región variable es una región variable de primates (p. ej., un primate no humano). En otras realizaciones más, la región variable es una región variable de conejo. En otras realizaciones, la región variable comprende CDR humanas y regiones marco (FR) no humanas (p. ej., conejo, murino, rata o primate no humano). En otras realizaciones, la región variable comprende CDR no humanas (p. ej., de conejo, murino, rata o primate no humano) y regiones estructurales humanas (FR).
Los términos "VL", "cadena VL" y "dominio VL" se usan indistintamente y significan la región variable de la cadena ligera de una molécula de unión al antígeno, anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo.
Los términos "VH", "cadena VH" y "dominio VH" se utilizan indistintamente y significan la región variable de la cadena pesada de una molécula de unión al antígeno, anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo.
Como se usa en este documento, el término "región determinante de complementariedad" o "CDR" significa una secuencia de aminoácidos que contribuye a la especificidad y afinidad de unión al antígeno. Las regiones marco pueden ayudar a mantener la confirmación adecuada de las c Dr para promover la unión entre la molécula de unión al antígeno y un antígeno. Se utilizan comúnmente varias definiciones de CDR: numeración de Kabat, numeración de Chothia, numeración de contactos, numeración AbM o numeración IMGT. La definición de AbM es un compromiso entre los dos utilizados por el software de modelado de anticuerpos AbM de Oxford Molecular. La definición de contacto se basa en un análisis de las estructuras cristalinas complejas disponibles. La Tabla 1 resume las definiciones de estos sistemas de nomenclatura.
Tabla 1. Numeración de CDR
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El término "numeración de Kabat" y términos similares se reconocen en la técnica y se refieren a un sistema de numeración de residuos de aminoácidos en las regiones variables de cadena pesada y ligera de un anticuerpo, o una molécula de unión al antígeno del mismo. En algunos aspectos, las CDR de un anticuerpo se pueden determinar de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat (véase, p. ej., Kabat et al. en Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed., publicación del NIH 91-3242, Bethesda, MD, 1991). Usando el sistema de numeración de Kabat, las CDR dentro de una molécula de cadena pesada de anticuerpo están típicamente presentes en las posiciones de aminoácidos 31 a 35, que opcionalmente pueden incluir uno o dos aminoácidos adicionales, después de 35 (referidos en el esquema de numeración de Kabat como 35A y 35B) (CDR1), posiciones de aminoácidos 50 a 65 (CDR2) y posiciones de aminoácidos 95 a 102 (CDR3). Usando el sistema de numeración de Kabat, las CDR dentro de una molécula de cadena ligera de anticuerpo están típicamente presentes en las posiciones de aminoácidos 24 a 34 (CDR1), las posiciones de aminoácidos 50 a 56 (CDR2) y las posiciones de aminoácidos 89 a 97 (CDR3).
En una realización específica, las CDR de los anticuerpos descritos en este documento se pueden describir de acuerdo con el esquema de numeración de Kabat, como se muestra en la Figura 6 (aunque pueden interpretarse fácilmente en otros sistemas de numeración usando la Tabla 1 anterior). La Figura 6 también proporciona los CDR que utilizan los esquemas de numeración de Chothia e IMGT.
En algunos aspectos, las CDR de un anticuerpo se pueden determinar de acuerdo con el esquema de numeración de Chothia, que se refiere a la ubicación de los bucles estructurales de inmunoglobulina (véase, p. ej., Chothia C & Lesk AM, (1987), J Mol Biol 196 : 901-917; Al-Lazikani B et al., (1997) J Mol Biol 273: 927-948; Chothia C et al., (1992) J Mol Biol 227: 799-817; Tramontano A et al., ( 1990) J Mol Biol 215 (1): 175-82; y la patente de los Estados Unidos N° 7.709.226). Normalmente, cuando se utiliza la convención de numeración de Kabat, el bucle de Chothia CDR-H1 está presente en los aminoácidos 26 a 32, 33 o 34 de la cadena pesada, el bucle de Chothia CDR-H2 está presente en los aminoácidos 52 a 56 de la cadena pesada y el bucle de Chothia CDR-H3 está presente en los aminoácidos de la cadena pesada 95 a 102, mientras que el bucle de Chothia CDR-L1 está presente en los aminoácidos 24 a 34 de la cadena ligera, el bucle de Chothia CDR-L2 está presente en los aminoácidos de la cadena ligera 50 a 56, y el bucle de Chothia CDR-L3 está presente en los aminoácidos de la cadena ligera 89 a 97. El final del bucle de Chothia CDR-HI cuando se numera usando la convención de numeración de Kabat varía entre H32 y H34 dependiendo de la longitud del bucle (esto es porque el esquema de numeración de Kabat coloca las inserciones en H35A y H35B; si ni 35A ni 35B están presentes, el bucle termina en 32; si solo hay 35A, el bucle termina en 33; si tanto 35A como 35B están presentes, el bucle termina en 34). Véase la Tabla 1.
En una realización específica, las CDR de los anticuerpos descritos en este documento se han determinado de acuerdo con el esquema de numeración de Chothia, como se muestra en la Figura 6.
Como se usa en este documento, los términos "región constante" y "dominio constante" son intercambiables y tienen un significado común en la técnica. La región constante es una porción de anticuerpo, p. ej., una porción del terminal carboxilo de una cadena ligera y/o pesada que no está involucrada directamente en la unión de un anticuerpo al antígeno pero que puede exhibir varias funciones efectoras, tales como interacción con el receptor Fc. La región constante de una molécula de inmunoglobulina generalmente tiene una secuencia de aminoácidos más conservada en relación con un dominio variable de inmunoglobulina.
Como se usa en este documento, el término "cadena pesada" cuando se usa en referencia a un anticuerpo puede referirse a cualquier tipo distinto, p. ej., alfa (a), delta (8), épsilon (e), gamma (y) y mu (p), basado en la secuencia de aminoácidos del dominio constante, que dan lugar a las clases de anticuerpos IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, respectivamente, incluyendo las subclases de IgG, p. ej., IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4.
Como se usa en este documento, el término "cadena ligera" cuando se usa en referencia a un anticuerpo puede referirse a cualquier tipo distinto, p. ej., kappa (k) o lambda (á) basado en la secuencia de aminoácidos de los dominios constantes. Las secuencias de aminoácidos de la cadena ligera son bien conocidas en la técnica. En realizaciones específicas, la cadena ligera es una cadena ligera humana.
Como se usa en este documento, el término "afinidad de unión" significa la fuerza de la suma total de interacciones no covalentes entre un único sitio de unión de una molécula (p. ej., una molécula de unión al antígeno tal como un anticuerpo) y su par de unión (p. ej., un antígeno). A menos que se indique lo contrario, como se usa en este documento, "afinidad de unión" se refiere a afinidad de unión intrínseca que refleja una interacción 1:1 entre miembros de un par de unión (p. ej., anticuerpo y antígeno). La afinidad de una molécula X por su pareja Y generalmente se puede representar mediante la constante de disociación (Kd). La afinidad se puede medir y/o expresar de varias formas conocidas en la técnica, que incluyen, pero no se limitan a, constante de disociación de equilibrio (Kd) y constante de asociación de equilibrio (Ka). La Kd se calcula a partir del cociente de kd¡soc¡ac¡ón/kasoc¡ac¡ón, mientras que Ka se calcula a partir del cociente de kasoc¡ac¡ón/kd¡soc¡ac¡ón. kasoc¡ac¡ón se refiere a la constante de velocidad de asociación de, p. ej., un anticuerpo a un antígeno, y kd¡soc¡ac¡ón se refiere a la disociación de, p. ej., un anticuerpo de un antígeno. La kasoc¡ac¡ón y kdisociación se pueden determinar mediante técnicas estándar conocidas por un experto en la técnica, tales como BIAcore® o KinExA o resonancia de plasmón de superficie.
Como se usa en este documento, una "sustitución de aminoácidos conservadora" es una en la que el residuo de aminoácido se reemplaza con un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. En la técnica se han definido familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (p. ej., lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (p. ej., ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (p. ej., glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptófano), cadenas laterales apolares (p. ej., alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadenas laterales beta ramificadas (p. ej., treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (p. ej., tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). En algunas realizaciones, uno o más residuos de aminoácidos dentro de una(s) CDR o dentro de una(s) región(es) marco de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo pueden reemplazarse con un residuo de aminoácido con una cadena lateral similar.
Las sustituciones conservadoras de aminoácidos, que están abarcadas por la presente divulgación, pueden abarcar residuos de aminoácidos no naturales, que se incorporan típicamente mediante síntesis química de péptidos en lugar de mediante síntesis en sistemas biológicos. Estos incluyen peptidomiméticos y otras formas invertidas de restos de aminoácidos. Los residuos de origen natural se pueden dividir en clases según las propiedades comunes de la cadena lateral:
hidrófobos: norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
hidrófilos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
ácidos: Asp, Glu;
básicos: His, Lys, Arg;
residuos que influyen en la orientación de la cadena: Gly, Pro; y
aromáticos: Trp, Tyr, Phe.
Las sustituciones no conservadoras pueden implicar el intercambio de un miembro de una de estas clases por un miembro de otra clase. Dichos residuos sustituidos pueden introducirse, p. ej., en regiones de un anticuerpo humano que son homólogas con anticuerpos no humanos, o en regiones no homólogas de la molécula. Los ejemplos de sustituciones de aminoácidos conservadoras se exponen en la Tabla 2 a continuación.
Tabla 2. Sustituciones de aminoácidos
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Como se usa en el presente documento, un "epítopo" es un término en la técnica y se refiere a una región localizada de un antígeno a la que un anticuerpo puede unirse específicamente. Un epítopo puede ser, p. ej., aminoácidos contiguos de un polipéptido (epítopo lineal o contiguo) o un epítopo puede, p. ej., venir junto con dos o más regiones no contiguas de un polipéptido o polipéptidos (epítopo conformacional, no lineal, discontinuo o no contiguo). En algunas realizaciones, el epítopo al que se une un anticuerpo se puede determinar mediante, p. ej., espectroscopia de RMN, estudios de cristalografía de difracción de rayos X, ensayos de ELISA, intercambio de hidrógeno/deuterio acoplado con espectrometría de masas (p. ej., espectrometría de masas por electroaspersión de cromatografía líquida), matriz ensayos de exploración de oligopéptidos basados en y/o mapeo de mutagénesis (p. ej., mapeo de mutagénesis dirigida al sitio). Para la cristalografía de rayos X, la cristalización se puede lograr usando cualquiera de los métodos conocidos en la técnica (p. ej., Giege et al., (1994) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 50 (Pt 4): 339-350; McPherson, (1990) Eur J Biochem 189: 1-23; Chayen, (1997) Structure 5: 1269-1274; McPherson, (1976) J Biol Chem 251: 6300-6303). Anticuerpo: los cristales de antígeno se pueden estudiar usando técnicas de difracción de rayos X bien conocidas y se pueden refinar usando un software informático tal como X-PLOR (Universidad de Yale, 1992, distribuido por Molecular Simulations, Inc.; véase, p. ej., Meth Enzymol (1985) Vols. 114 y 115, eds Wyckoff et al.,) y BUSTER (Bricogne, (1993) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 49 (Pt 1): 37-60; Bricogne, (1997) Meth Enzymol 276A: 361-423, ed. Carter; Roversi et al., (2000) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 56 (Pt 10): 1316-1323). Los estudios de mapeo de mutagénesis se pueden realizar usando cualquier método conocido por un experto en la técnica. Véase, p. ej., Champe et al., (1995) J Biol Chem 270: 1388-94 y Cunningham & Wells, (1989) Science 244: 1081-85 para una descripción de las técnicas de mutagénesis, incluidas las técnicas de mutagénesis de barrido de alanina y arginina.
Como se usa en este documento, el término "competencia cruzada" significa la situación en la que la interacción entre un antígeno (p. ej., CD70) y una primera molécula de unión al antígeno o fragmento de unión de la misma bloquea, limita, inhibe o bien reduce la capacidad de una molécula de unión al antígeno de referencia o un fragmento de unión de la misma (tal como las moléculas de unión a antígeno, CAR y TCR proporcionadas en este documento) para interactuar con el antígeno. La competencia cruzada puede ser completa, p. ej., la unión de la molécula de unión al antígeno bloquea completamente la capacidad de la molécula de unión de referencia para unirse al antígeno, o puede ser parcial, p. ej., la unión de la molécula de unión al antígeno reduce la capacidad de la molécula de unión de referencia para unirse al antígeno. En algunas realizaciones, una molécula de unión al antígeno que compite de forma cruzada con una molécula de unión al antígeno de referencia se une al mismo epítopo o un epítopo superpuesto que la molécula de unión al antígeno de referencia. En otras realizaciones, la molécula de unión al antígeno que compite de forma cruzada con una molécula de unión al antígeno de referencia se une a un epítopo diferente al de la molécula de unión al antígeno de referencia. Se pueden usar numerosos tipos de ensayos de unión competitiva para determinar si una molécula de unión al antígeno compite con otra, p. ej.: radioinmunoensayo directo o indirecto en fase sólida (RIA); inmunoensayo enzimático directo o indirecto en fase sólida (EIA); ensayo de competición en sándwich (Stahli et al., (1983) Method Enzymol 9: 242-53); EIA directo con biotina-avidina en fase sólida (Kirkland et al., (1986) J Immunol 137: 3614-19); ensayo de marcación directa en fase sólida, ensayo en sándwich de marcación directa en fase sólida (Harlow y Lane, 1988, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press); RIA de marcación directa en fase sólida usando como marcador I125(Morel et al., (1988) Molec Immunol 25: 7-15); EIA directo con biotinaavidina en fase sólida (Cheung et al., (1990) Virology 176: 546-52); y RIA marcado directamente (Moldenhauer et al., (1990) Scand J Immunol 32: 77-82).
Como se usa en este documento, los términos "se une inmunoespecíficamente", "reconoce inmunoespecíficamente", "se une específicamente" y "reconoce específicamente" son términos análogos en el contexto de anticuerpos y se refieren a moléculas que se unen a un antígeno (p. ej., epítopo o complejo inmune) tal como dicha unión es entendida por un experto en la técnica. Por ejemplo, una molécula que se une específicamente a un antígeno puede unirse a otros péptidos o polipéptidos, generalmente con menor afinidad determinada, p. ej., por inmunoensayos, BIAcore®, instrumento KinExA 3000 (Sapidyne Instruments, Boise, ID) u otro ensayos conocidos en la técnica. En una realización específica, las moléculas que se unen específicamente a un antígeno se unen al antígeno con un Ka que es al menos 2 logaritmos, 2,5 logaritmos, 3 logaritmos, 4 logaritmos o mayor que el Ka cuando las moléculas se unen a otro antígeno.
En otra realización, las moléculas que se unen específicamente a un antígeno (p. ej., CD70), así como las moléculas que comprenden esta secuencia y las células que presentan dichas moléculas) se unen con una constante de disociación (Kd) de aproximadamente 1 * 10-7 M. En algunas realizaciones, la molécula de unión al antígeno se une específicamente a un antígeno (p. ej., CD70) con "alta afinidad" cuando Kd es de aproximadamente 1 * 10-9 M a aproximadamente 5 * 10-9 M. En algunas realizaciones, la molécula de unión al antígeno se une específicamente a un antígeno (p. ej., CD70) con "afinidad muy alta" cuando la Kd es de 1 * 10-10 M a aproximadamente 5 * 10-10 M.
En otra realización específica, las moléculas que se unen específicamente a un antígeno no reaccionan de forma cruzada con otras proteínas en condiciones de unión similares. En otra realización específica, las moléculas que se unen específicamente a un antígeno no reaccionan de forma cruzada con otras proteínas distintas de CD70. En una realización específica, en el presente documento se proporciona un anticuerpo o fragmento del mismo que se une a CD70 con mayor afinidad que a otro antígeno no relacionado. En algunas realizaciones, se proporciona en el presente documento un anticuerpo o fragmento del mismo que se une a CD70 (p. ej., CD70 humana) con un 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o mayor afinidad que con otro antígeno no relacionado medido, p. ej., por un radioinmunoensayo, resonancia de plasmón de superficie o ensayo de exclusión cinética. En una realización específica, el grado de unión de un anticuerpo anti-CD70 o fragmento de unión a antígeno del mismo descrito en este documento a una proteína diferente a CD70 no relacionada es menos del 10%, 15% o 20% de la unión del anticuerpo a proteína CD70 medida mediante, p. ej., un radioinmunoensayo.
En una realización específica, en el presente documento se proporciona un anticuerpo o fragmento del mismo que se une a la CD70 humana con mayor afinidad que a otra especie de CD70. En algunas realizaciones, en el presente documento se proporciona un anticuerpo o fragmento del mismo que se une a CD70 humana con un 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% o mayor afinidad que con otra especie de CD70 medida, p. ej., por un radioinmunoensayo, resonancia de plasmón de superficie o ensayo de exclusión cinética. En una realización específica, un anticuerpo o fragmento del mismo descrito en este documento, que se une a CD70 humana, se unirá a otra especie de proteína CD70 con menos del 10%, 15% o 20% de la unión del anticuerpo o fragmento del mismo a la proteína CD70 humana medida, p. ej., mediante un radioinmunoensayo, resonancia de plasmón de superficie o ensayo de exclusión cinética.
Un "antígeno" se refiere a cualquier molécula que provoque una respuesta inmune o que sea capaz de unirse a un anticuerpo o una molécula de unión al antígeno. La respuesta inmune puede implicar la producción de anticuerpos o la activación de células inmunológicamente competentes específicas, o ambas. Los expertos en la técnica comprenderán fácilmente que cualquier macromolécula, incluidas prácticamente todas las proteínas o péptidos, puede servir como antígeno. Generalmente, un antígeno puede expresarse de forma endógena, es decir, expresarse mediante ADN genómico, o puede expresarse de manera recombinante, o puede sintetizarse químicamente. Un antígeno puede ser específico de un tejido, tal como una célula cancerosa, o puede expresarse de forma amplia. Además, los fragmentos de moléculas más grandes pueden actuar como antígenos. En una realización, los antígenos son antígenos tumorales. En algunas realizaciones, el antígeno es CD70, que opcionalmente se puede conjugar con un adyuvante tal como hemocianina de lapa californiana (KLH).
El término "neutralizante" se refiere a una molécula de unión al antígeno, scFv, anticuerpo o un fragmento del mismo, que se une a un ligando (p. ej., CD70) y previene o reduce el efecto biológico de ese ligando. En algunas realizaciones, la molécula de unión al antígeno, scFv, anticuerpo o un fragmento del mismo, bloquea directamente un sitio de unión en el ligando o bien altera la capacidad del ligando para unirse a través de medios indirectos (tal como alteraciones estructurales o energéticas en el ligando). En algunas realizaciones, la molécula de unión al antígeno, scFv, anticuerpo o un fragmento del mismo evita que la proteína a la que está unido realice una función biológica.
Como se usa en este documento, el término "CD70" significa una molécula que pertenece a la familia de ligandos del factor de necrosis tumoral (TNF), y también se conoce como CD27LG y TNFSF7. CD70 es un ligando para CD27 (TNFRSF27). Es un antígeno de superficie en linfocitos T y B activados, pero no en reposo. Induce la proliferación de células T coestimuladas, potencia la generación de células T citolíticas y contribuye a la activación de las células T. CD70 también juega un papel en la regulación de la activación de las células B, la función citotóxica de las células asesinas naturales y la síntesis de inmunoglobulinas. Véase, p. ej., Goodwin et al., (1993) Cell 73 (3): 447-56 y Bowman et al., (1994) J. Immunol. 152 (4): 1756-61. El termino CD70 puede incluir, pero no se limita a, CD70 nativa, una isoforma de CD70 o un homólogo de CD70 entre especies de CD70. CD70 (también conocida como CD27LG, CD27L y TNFSF7) se expresa en la superficie de las células de linfoma de células T y B. Se proporciona la secuencia de aminoácidos de CD70 humana (hcD70) en el NCBI acceso N° NP_001243.1 (GI: 4507605) (SeQ ID NO: 1), y tiene la secuencia de aminoácidos:
MPEEGSGCSVRRRPYGCVLRAALVPLVAGLVICLVVCIQRFAQAQQ
QLPLESLGWDVAELQLNHTGPQQDPRLYWQGGPALGRSFLHGPELD
KGQLRIHRDGIYMVHIQ VTL AIC S STT ASRHHPTTL AVGIC SP ASRSIS
LLRLSFHQGCTIASQRLTPLARGDTLCTNLTGTLLPSRNTDETFFGVQ
WVRP
(SEQ ID NO: 1).
Los residuos 1-17 de la SEQ ID NO: 1 corresponden a la región citoplásmica de hCD70, los residuos 18-38 corresponden a la región transmembrana de hCD70 y los residuos 39-193 corresponden a la región extracelular de hCD70. Se conoce al menos otra isoforma de hCD70 y se identifica mediante el identificador UniProt P32970-2.
Como se usa en el presente documento, CD70 incluye homólogos de CD70 humana y CD70 no humana, así como variantes, fragmentos o formas modificadas postraduccionalmente de las mismas, que incluyen, pero no se limitan a, formas glicosiladas ligadas a N y O de CD70. Las proteínas CD70 pueden incluir además fragmentos que comprenden todo o una parte de la SEQ ID NO: 1 (p. ej., los aminoácidos 39-193 de la SEQ ID NO: 1, correspondientes a un componente extracelular de hCD70, los aminoácidos 18-193, correspondientes a un componente transmembrana y extracelular de hCD70).
Como se usa en el presente documento, el término "autólogo" significa cualquier material derivado del mismo individuo al que posteriormente se volverá a introducir. Por ejemplo, los métodos de terapia de células autólogas modificadas (eACTMR) descritos en este documento implican la recolección de linfocitos de un paciente, que luego se manipulan para expresar un constructo, p. ej., un constructo CAR, y luego se administran de nuevo al mismo paciente.
Como se usa en este documento, el término "alogénico" significa cualquier material derivado de un individuo que luego se introduce en otro individuo de la misma especie, p. ej., trasplante alogénico de células T.
Como se usa en este documento, los términos "transducción" y "transducido" significan el proceso por el cual se introduce ADN extraño en una célula a través de un vector viral (véase Hartl y Jones (1997) Genetics: Principles and Analysis, 4a ed, Jones & Bartlett). En algunas realizaciones, el vector es un vector retroviral, un vector de ADN, un vector de ARN, un vector adenoviral, un vector baculoviral, un vector viral de Epstein Barr, un vector papovaviral, un vector viral de vaccinia, un vector viral de herpes simple, un vector de adenovirus asociado, un vector lentiviral o cualquier combinación de los mismos.
Como se usa en este documento, el término "cáncer" se refiere a un amplio grupo de diversas enfermedades caracterizadas por el crecimiento incontrolado de células anormales. La división y el crecimiento celular no regulados en el cuerpo dan como resultado la formación de tumores malignos que invaden los tejidos vecinos y también pueden hacer metástasis en partes distantes del cuerpo a través del sistema linfático o el torrente sanguíneo. Un "cáncer" o "tejido canceroso" puede incluir un tumor. Los ejemplos de cánceres que pueden tratarse mediante los métodos de la presente divulgación incluyen, pero no se limitan a, cánceres del sistema inmunológico que incluyen linfoma, leucemia, mieloma y otras neoplasias malignas de leucocitos. En algunas realizaciones, los métodos de la presente divulgación pueden usarse para reducir el tamaño tumoral de un tumor derivado, p. ej., de cáncer de hueso, cáncer de páncreas, cáncer de piel, cáncer de cabeza o cuello, melanoma maligno cutáneo o intraocular, cáncer útero, cáncer de ovario, cáncer de recto, cáncer de la región anal, cáncer de estómago, cáncer testicular, cáncer de útero, carcinoma de las trompas de Falopio, carcinoma de endometrio, carcinoma de cuello uterino, carcinoma de vagina, carcinoma de vulva, múltiple mieloma, enfermedad de Hodgkin, linfoma no Hodgkin (NHL), linfoma mediastínico primario de células B grandes (PMBC), linfoma difuso de células B grandes (DLBCL), linfoma folicular (FL), linfoma folicular transformado, linfoma esplénico de la zona marginal (SMZL), cáncer de esófago, cáncer de intestino delgado, cáncer del sistema endocrino, cáncer de glándula tiroides, cáncer de la glándula paratiroidea, cáncer de la glándula suprarrenal, sarcoma de tejido blando, cáncer de uretra, cáncer del pene, leucemia crónica o aguda, leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crónica, leucemia linfoblástica aguda (ALL) (incluida la ALL de células diferentes de células T), leucemia linfocítica crónica (CLL), tumores sólidos de la infancia, linfoma linfocítico, cáncer de vejiga, cáncer de riñón o de uréter, carcinoma de pelvis renal, neoplasia del sistema nervioso central (SNC), linfoma primario del SNC, angiogénesis tumoral, tumor del eje espinal, glioma del tronco encefálico, adenoma hipofisario, sarcoma de Kaposi, cáncer epidermoide, cáncer de células escamosas, linfoma de células T, cánceres inducidos por el medio ambiente, incluidos los inducidos por asbesto, otras neoplasias malignas de células B y combinaciones de dichos cánceres. En algunas realizaciones, el cáncer es mieloma múltiple. El cáncer particular puede responder a la quimioterapia o radioterapia, o el cáncer puede ser refractario. El término "cáncer refractario" significa un cáncer que no es susceptible de una intervención quirúrgica y el cáncer inicialmente no responde a la quimioterapia o radioterapia o el cáncer deja de responder con el tiempo.
Como se usa en este documento, el término "efecto antitumoral" significa un efecto biológico que puede presentarse como una disminución en el volumen del tumor, una disminución en el número de células tumorales, una disminución en la proliferación de células tumorales, una disminución en el número de metástasis, un aumento en la supervivencia general o libre de progresión, un aumento en la esperanza de vida o una mejoría de varios síntomas fisiológicos asociados con el tumor. Un efecto antitumoral también puede referirse a la prevención de la aparición de un tumor, p. ej., una vacuna.
Como se usa en este documento, el término "citocina" significa una proteína que no es un anticuerpo que es liberada por una célula en respuesta al contacto con un antígeno específico, en la que la citocina interactúa con una segunda célula para mediar una respuesta en la segunda célula. Una citoquina puede ser expresada de forma endógena por una célula o administrada a un sujeto. Las citocinas pueden ser liberadas por las células inmunes, incluidos los macrófagos, las células B, las células T y los mastocitos para propagar una respuesta inmunitaria. Las citocinas pueden inducir diversas respuestas en la célula receptora. Las citocinas pueden incluir citocinas homeostáticas, quimiocinas, citocinas proinflamatorias, efectoras y proteínas de fase aguda. Por ejemplo, las citocinas homeostáticas, incluidas la interleucina 7 (IL-7) y la interleucina 15 (IL-15), promueven la supervivencia y la proliferación de las células inmunitarias, y las citocinas proinflamatorias pueden promover una respuesta inflamatoria. Los ejemplos de citocinas homeostáticas incluyen, entre otras, IL-2, IL-4, IL-5, IL-7, IL-10, IL-12p40, IL-12p70, IL-15 e interferón (IFN) gamma. Los ejemplos de citocinas proinflamatorias incluyen, pero no se limitan a, IL-1a, IL-1b, IL-6, IL-13, IL-17a, factor de necrosis tumoral (TNF)-alfa, TNF-beta, factor de crecimiento de fibroblastos (FGF)2, factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF), molécula de adhesión intercelular soluble 1 (sICAM-1), molécula de adhesión vascular soluble 1 (sVCAM-1), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), VEGF-C, VEGF-D y factor de crecimiento placentario (PLGF). Los ejemplos de efectores incluyen, pero no se limitan a, granzima A, granzima B, ligando Fas soluble (sFasL) y perforina. Los ejemplos de proteínas de fase aguda incluyen, pero no se limitan a, proteína C reactiva (CRP) y amiloide A sérico (SAA).
Como se usa en el presente documento, el término "quimiocina" significa un tipo de citocina que media la quimiotaxis celular o el movimiento direccional. Los ejemplos de quimiocinas incluyen, entre otros, IL-8, iL-16, eotaxina, eotaxina-3, quimiocinas derivadas de macrófagos (MDC o CCL22), proteína quimiotáctica de monocitos 1 (MCP-1 o CCL2), MCP-4, proteína inflamatoria de macrófagos 1a (MIP-1a, MIP-1a), MIP-1p (MIP-1b), proteína 10 inducida por rayos gamma (IP-10) y quimiocina regulada por activación y el timo (TARC o CCL17).
Como se usa en el presente documento, los términos "cantidad terapéuticamente eficaz", "dosis eficaz", "cantidad eficaz" y "dosis terapéuticamente eficaz" de un agente terapéutico, p. ej., células T CAR modificadas genéticamente o células que expresan un TCR que comprende un cadena alfa, cadena beta o ambas cadenas alfa y beta, se usan indistintamente y significan cualquier cantidad que, cuando se usa sola o en combinación con otro agente terapéutico, protege a un sujeto contra la aparición de una enfermedad o promueve la regresión de la enfermedad evidenciada por una disminución en gravedad de los síntomas de la enfermedad, un aumento en la frecuencia y duración de los períodos sin síntomas de la enfermedad, o una prevención del deterioro o discapacidad debido a la aflicción de la enfermedad. La capacidad de un agente terapéutico para promover la regresión de la enfermedad se puede evaluar usando una variedad de métodos conocidos por el médico experto, tal como en sujetos humanos durante ensayos clínicos, en sistemas de modelos animales que predicen la eficacia en humanos, o ensayando la actividad del agente en ensayos in vitro.
Como se usa en este documento, el término "linfocito" significa un glóbulo blanco que se encuentra en el sistema inmunológico de un vertebrado. Los linfocitos incluyen células asesinas naturales (NK), células T y células B. Las células NK son un tipo de linfocitos citotóxicos (tóxicos para las células) que representan un componente principal del sistema inmunológico inherente. Las células NK rechazan los tumores y las células infectadas por virus mediante el proceso de apoptosis o muerte celular programada. Se les denominó "asesinas naturales" porque no requieren activación para matar células.
Las células T juegan un papel principal en la inmunidad mediada por células (sin participación de anticuerpos). Los tipos de células T incluyen:
1) células T colaboradoras (p. ej., células CD4+);
2) células T citotóxicas (también conocidas como TC, linfocitos T citotóxicos, CTL, células T asesinas, células T citolíticas, células T CD8+ o células T asesinas);
3) células T de memoria, que incluyen:
(i) células Tscm madre de memoria que, al igual que las células no modificadas, son CD45RO—, CCR7+, CD45RA+, CD62L+ (L-selectina), CD27+, CD28+ e IL-7Ra+, pero también expresan grandes cantidades de CD95, IL-2Rp, CXCR3 y LFA-1, y muestran numerosos atributos funcionales distintivos de las células de memoria);
(ii) células Tcm de memoria central, que expresan L-selectina y CCR7, secretan IL-2, pero no IFNy o IL-4; y
(iii) las células Tem efectoras de memoria, sin embargo, no expresan L-selectina o CCR7 pero producen citocinas efectoras tales como IFNy e IL-4);
4) células T reguladoras (Treg, células T supresoras o células T reguladoras CD4+CD25+);
5) células T asesinas naturales (NKT);
6) células T y§ (Gamma Delta); y
7) células T invariantes asociadas a la mucosa (MAIT).
Las células B juegan un papel principal en la inmunidad humoral (con participación de anticuerpos). Las células B producen anticuerpos y antígenos, cumplen la función de células presentadoras de antígenos (APC) y se convierten en células B de memoria después de la activación por interacción de antígenos.
Como se usa en este documento, los términos "modificación genética" o "modificación" se usan indistintamente y significan un método para modificar el genoma de una célula, que incluye, pero no se limita a, eliminar una región codificante o no codificante o una porción del mismo o insertar una región codificante o una parte de la misma. En algunas realizaciones, la célula que se modifica es un linfocito, p. ej., una célula T, que puede obtenerse de un paciente o de un donante. La célula puede modificarse para expresar una construcción exógena, como, p. ej., un receptor de antígeno quimérico (CAR) o un receptor de células T (TCR), que se incorpora al genoma de la célula.
Como se usa en este documento, el término "respuesta inmune" significa la acción de una célula del sistema inmune (p. ej., linfocitos T, linfocitos B, células asesinas naturales (NK), macrófagos, eosinófilos, mastocitos, células dendríticas y neutrófilos) y macromoléculas solubles producidas por cualquiera de estas células o el hígado (incluidos los anticuerpos, las citocinas y el complemento) que dan como resultado un direccionamiento, unión, daño, destrucción y/o eliminación selectivos del cuerpo de un vertebrado de patógenos invasores, células o tejidos infectados con patógenos, células cancerosas u otras células anormales o, en casos de autoinmunidad o inflamación patológica, células o tejidos humanos normales.
Como se usa en este documento, el término "inmunoterapia" significa el tratamiento de un sujeto afligido o en riesgo de contraer o sufrir una recurrencia de una enfermedad mediante un método que comprende inducir, potenciar, suprimir o bien modificar una respuesta inmune. Los ejemplos de inmunoterapia incluyen, pero no se limitan a, terapias con células T. La terapia con células T puede incluir terapia con células T adoptivas, inmunoterapia con linfocitos infiltrantes de tumores (TIL), terapia con células autólogas, terapia con células autólogas modificadas (eACTMR) y trasplante alogénico de células T. Los expertos en la técnica reconocerán que los métodos de acondicionamiento descritos en el presente documento mejorarían la eficacia de cualquier terapia de células T trasplantadas. Se describen ejemplos de terapias con células T en la publicación de patente de los Estados Unidos N° 2014/0154228, las patentes de los Estados Unidos Nos. 5.728.388 y 6.406.699 y la publicación internacional N°WO 2008/081035.
Las células T de una inmunoterapia pueden provenir de cualquier fuente. Por ejemplo, las células T se pueden diferenciar in vitro de una población de células madre, o las células T se pueden obtener de un sujeto. Las células T también se pueden obtener, p. ej., de células mononucleares de sangre periférica (PBMC), médula ósea, tejido de ganglios linfáticos, sangre del cordón umbilical, tejido del timo, tejido de un sitio de infección, ascitis, derrame pleural, tejido del bazo y tumores. Además, las células T pueden derivarse de una o más líneas de células T disponibles. Las células T también pueden obtenerse de una unidad de sangre extraída de un sujeto usando cualquier cantidad de técnicas conocidas por el experto en la materia, tales como separación y/o aféresis FICOLLMR. En la publicación de patente de los Estados Unidos N° 2013/0287748 se describen métodos adicionales de aislamiento de células T para una terapia con células T.
El término "terapia de células autólogas modificadas", abreviado como "eACTMR", también conocido como transferencia de células adoptivas, es un proceso mediante el cual se recolectan las propias células T del paciente y posteriormente se modifican genéticamente para reconocer y dirigir a uno o más antígenos expresados en la superficie celular de una o más células tumorales específicas o neoplasias. Las células T pueden modificarse para expresar, p. ej., un receptor de antígeno quimérico (CAR) o un receptor de células T (TCR). Las células T CAR positivas (CAR+) están modificadas para expresar un CAR. Los CAR pueden comprender, p. ej., un fragmento variable extracelular de cadena sencilla (scFv) con especificidad por un antígeno tumoral particular, que está directa o indirectamente unido a una parte de señalización intracelular que comprende al menos un dominio coestimulador, que está directa o indirectamente unido a al menos un dominio de activación; los componentes pueden disponerse en cualquier orden. El dominio coestimulador se puede derivar, p. ej., de CD28 o CD28T, y el dominio de activación se puede derivar de, p. ej., cualquier forma de CD3-zeta. En algunas realizaciones, el CAR está diseñado para tener dos, tres, cuatro o más dominios coestimuladores. Un scFv de CAR puede diseñarse para dirigirse, p. ej., a CD19, que es una proteína transmembrana expresada por células en el linaje de células B, incluidas todas las células B normales y neoplasias malignas de células B tales como NHL, CLL y ALL que no son de células T. En algunas realizaciones, un CAR se modifica de manera que el dominio coestimulador se exprese como una cadena polipeptídica separada. Se describen ejemplos de terapias y constructos de células T CAR en las publicaciones de patente de los Estados Unidos Nos.
2013/0287748, 2014/0227237, 2014/0099309 y 2014/0050708.
Como se usa en este documento, el término "célula in vitro" se refiere a cualquier célula que se cultiva ex vivo. Una célula in vitro puede incluir una célula humana, tal como una célula T o una célula dendrítica, o puede incluir células CHO, sP2/0, de conejo y otras células no humanas. En algunas realizaciones, una célula in vitro puede incluir una célula T.
Como se usa en este documento, el término "paciente" significa cualquier ser humano que está siendo tratado por una condición fisiológica anormal, tal como cáncer o que ha sido diagnosticado formalmente con un trastorno, aquellos sin trastornos formalmente reconocidos, aquellos que reciben atención médica, aquellos en riesgo de desarrollar los trastornos, etc. Los términos "sujeto" y "paciente" se usan indistintamente en este documento e incluyen sujetos tanto humanos como animales no humanos. Como se usa en este documento, los términos "paciente" y "sujeto" se usan indistintamente. En algunas realizaciones, los términos "sujeto" o "paciente" significan cualquier ser humano que padece un cáncer (p. ej., un linfoma o una leucemia).
Como se usa en este documento, los términos "péptido", "polipéptido" y "proteína" se usan indistintamente y significan un compuesto que comprende dos o más residuos de aminoácidos unidos covalentemente por enlaces peptídicos. Una proteína o péptido debe contener al menos dos aminoácidos, pero no se impone ninguna limitación al número máximo de aminoácidos que pueden comprender la secuencia de una proteína o péptido. Los polipéptidos incluyen cualquier péptido o proteína que comprenda dos o más aminoácidos unidos entre sí por enlaces peptídicos. Como se usa en el presente documento, los términos abarcan tanto cadenas cortas, que también se denominan comúnmente en la técnica péptidos, oligopéptidos y oligómeros, p. ej., tal como cadenas más largas, que generalmente se denominan en la técnica proteínas, de las cuales hay muchos tipos. Los "polipéptidos" incluyen, p. ej., fragmentos biológicamente activos, polipéptidos sustancialmente homólogos, oligopéptidos, homodímeros, heterodímeros, variantes de polipéptidos, polipéptidos modificados, derivados, análogos, proteínas de fusión, entre otros. El término "polipéptidos" incluye péptidos naturales, péptidos recombinantes, péptidos sintéticos o una combinación de los mismos.
En algunos aspectos, los polipéptidos tienen eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de uno o más aminoácidos de la proteína de unión al antígeno, y en algunas realizaciones preferiblemente no más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 sustituciones de aminoácidos en el mismo. Los fragmentos polipeptídicos útiles pueden incluir fragmentos inmunológicamente funcionales de moléculas de unión a antígeno, que incluyen, sin limitarse a, una o más regiones CDR, dominios variables de una cadena pesada y/o ligera, una porción de otras porciones de una cadena de anticuerpo y similares. Los restos que pueden sustituirse por uno o más aminoácidos de una molécula de unión al antígeno incluyen, p. ej., formas D o L de aminoácidos, un aminoácido diferente del aminoácido que normalmente se encuentra en la misma posición de una molécula de unión al antígeno, eliminaciones, aminoácidos no naturales y análogos químicos de aminoácidos. Además, los fragmentos de polipéptidos de moléculas activadoras y/o coestimuladoras y similares están dentro del alcance de la presente divulgación.
Como se usa en este documento, los términos "activación" y "estimulación" y "señal estimuladora" significan una respuesta primaria inducida por la unión de una molécula activadora con su ligando afín, en la que la unión media un evento de transducción de señal. Se proporcionan aquí ejemplos de moléculas activadoras. En un ejemplo, una "molécula activadora" o "molécula estimulante" significa una molécula en una célula T, p. ej., el complejo TCR/CD3, que se une específicamente con un ligando estimulante afín presente en una célula presente en antígeno. Este tipo de señalización a veces se denomina "Señal 1" en el contexto de la activación de las células T.
Como se usa en este documento, un "ligando estimulante" significa un ligando que cuando está presente en una célula presentadora de antígeno (p. ej., una APC, una célula dendrítica, una célula B y similares) puede unirse específicamente con una molécula estimulante en una célula T, mediando así una respuesta primaria de la célula T, que incluye, pero no se limita a, activación, iniciación de una respuesta inmune, proliferación y similares. Los ligandos estimuladores incluyen, pero no se limitan a, una molécula del MHC de clase I cargada con un péptido, un anticuerpo anti-CD3, un anticuerpo superagonista anti-CD28 y un anticuerpo superagonista anti-CD2.
Como se usa en el presente documento, el término "señal coestimuladora" significa una señal que, en combinación con una señal primaria tal como la ligadura de TCR/CD3, conduce a una respuesta de células T, tal como, pero sin limitarse a, proliferación y/o sobrerregulación o subregulación de moléculas clave. En un ejemplo, se induce una señal coestimuladora tras la asociación de CD28 en una célula T con su ligando análogo B7 en una célula presentadora de antígeno. Este tipo de señalización a veces se denomina "Señal 2" en el contexto de la activación de las células T.
Como se usa en este documento, los términos "molécula coestimuladora" y "ligando coestimulador" significan un compañero de unión análogo en una célula T que se une específicamente con un ligando coestimulador, mediando así una respuesta coestimuladora por la célula T, tal como, pero no limitado a, proliferación. Las moléculas coestimuladoras incluyen, entre otras, CD2, CD3 delta, CD3 épsilon, CD3 gamma, Cd4, CD7, CD8a, CD8p, CD11a (ITGAL), CD11b (ITGAM), CD11c (ITGAX), CD11d (ITGAD), CD18 (ITGB2), CD19 (B4), CD27 (TNFRSF7), CD28, CD28T, CD29 (ITGB1), CD30 (TNFRSF8), CD40 (TNFRSF5), CD48 (SLAMF2), CD49a (ITGA1), CD49d (ITGA4), CD49f (ITGA6), CD66a (CEACAM1), CD66b (CEACAM8), CD66c (CEACAM6), CD66d (CEACAM3), CD66e (CEACAM5), CD69 (CLEC2), CD79A (cadena alfa asociada al complejo del receptor del antígeno de células B), CD79B (cadena beta asociada al complejo del receptor del antígeno de células B), CD84 (SLAMF5), CD96 (Tactile), CD100 (SEMA4D), CD103 (ITGAE), CD134 (OX40), CD137 (4-1BB), CD150 (SLAMF1), CD158A ( KIR2DL1), CD158B1 (KIR2DL2), CD158B2 (KIR2DL3), CD158C (KIR3DP1), CD158D (KIRDL4), CD158F1 (KIR2DL5A), CD158F2 (KIR2DL5B), CDPL (CD158K) DNAM1), CD229 (SLAMF3), CD244 (SLAMF4), CD247 (CD3-zeta), CD258 (LIGHT), CD268 (BAFFR), CD270 (TNFSF14), CD272 (BTLA), CD276 (B7-H3), CD279 (PD-1), CD314 (NKG2D), CD319 (SLAMF7), CD335 (NK-p46), CD336 (NK-p44), CD337 (NK-p30), CD352 (SLAMF6), CD353 (SLAMF8), CD355 (CRTAM), CD357 (TNFRSF18), coestimulador inducible de células T (ICOS), LFA-1 (CD11a/CD18), NKG2C, DAP-10, ICAM-1, NKp80 (KLRF1), IL-2R beta, IL-2R gamma, IL-7R alfa, LFA-1, SLAMF9, LAT, GADS (GrpL), SLP-76 (LCP2), PAG1/CBP, Pd-1, un ligando CD83, receptor Fc gamma, molécula MHC clase 1, molécula mHc clase 2, una proteína receptora de TNF, una proteína de inmunoglobulina, un receptor de citocina, una integrina, receptores de células NK activadoras, un receptor de ligando Toll y/o fragmentos o combinaciones de los mismos.
Los términos "reducir" y "disminuir" se usan indistintamente en el presente documento e indican cualquier cambio que sea menor que el original. "Reducir" y "disminuir" son términos relativos que requieren una comparación entre las mediciones previas y posteriores. Los términos "reducir" y "disminuir" incluyen agotamientos completos.
Como se usa en este documento, los términos "tratamiento" de un sujeto y "tratar" a un sujeto significa cualquier tipo de intervención o proceso realizado en, o la administración de un agente activo al sujeto con el objetivo de revertir, aliviar, mejorar, inhibir, ralentizar o prevenir la aparición, progresión, desarrollo, gravedad o recurrencia de un síntoma, complicación o afección, o indicios bioquímicos asociados con una enfermedad. En una realización, "tratamiento" o "tratar" incluye una remisión parcial, como se define ese término en el contexto de un régimen terapéutico dado. En otra realización, "tratamiento" o "tratar" incluye una remisión completa, como se define ese término en el contexto de un régimen terapéutico dado.
Como se usa en este documento, el término "porcentaje de identidad" significa el porcentaje de residuos idénticos entre los aminoácidos o nucleótidos en las moléculas comparadas. Para estos cálculos, los vacíos en las alineaciones (si los hay) deben tratarse mediante un modelo matemático o programa informático particular (es decir, un "algoritmo"). Los métodos que pueden usarse para calcular la identidad de los ácidos nucleicos o polipéptidos alineados incluyen los descritos en Computational Molecular Biology, (Lesk, ed.), (1988) Nueva York: Oxford University Press; Biocomputing Informatics and Genome Projects, (Smith, ed.), 1993, Nueva York: Academic Press; Computer Analysis of Sequence Data, Parte I, (Griffin y Griffin, eds.), 1994, Nueva Jersey: Humana Press; von Heinje, (1987) Sequence Analysis in Molecular Biology, Nueva York: Academic Press; Sequence Analysis Primer, (Gribskov y Devereux, eds.), 1991, Nueva York: M. Stockton Press; y Carillo et al., (1988) J. Applied Math. 48: 1073.
Al calcular el porcentaje de identidad, las secuencias que se comparan se alinean de una manera que proporciona la mayor coincidencia entre las secuencias. El programa informático utilizado para determinar el porcentaje de identidad puede ser, p. ej., MOE (Chemical Computing Group) o DNASTAR (Universidad de Wisconsin, Madison, WI). El algoritmo informático GAP puede usarse para alinear los dos polipéptidos o polinucleótidos para los que se va a determinar el porcentaje de identidad de secuencia. Las secuencias se alinean para un emparejamiento óptimo de sus respectivos aminoácidos o nucleótidos (el "intervalo emparejado", según lo determinado por el algoritmo). Una penalización de apertura de espacio (que se calcula como 3 veces la diagonal promedio, en la que la "diagonal promedio" es el promedio de la diagonal de la matriz de comparación que se está utilizando; la "diagonal" es la puntuación o número asignado a cada coincidencia perfecta de aminoácidos por la matriz de comparación particular) y una penalización por extensión del espacio (que normalmente es 1/10 veces la penalización por apertura del espacio), así como una matriz de comparación como PAM 250 o BLOSUM 62 se utilizan junto con el algoritmo. En algunas realizaciones, el algoritmo también utiliza una matriz de comparación estándar (véase, p. ej., Dayhoff et al., (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure 5: 345-352 para la matriz de comparación PAM 250; Henikoff et al., (1992) Proc. Natl Acad. Sci. USA 89: 10915-10919 para la matriz de comparación BLOSUM 62).
Algunos esquemas de alineación para alinear dos secuencias de aminoácidos pueden dar como resultado el emparejamiento de solo una región corta de las dos secuencias, y esta pequeña región alineada puede tener una identidad de secuencia muy alta aunque no exista una relación significativa entre las dos secuencias de longitud completa. Por consiguiente, el método de alineación seleccionado (p. ej., el programa GAP) se puede ajustar si se desea para dar como resultado una alineación que abarque al menos 50 aminoácidos contiguos del polipéptido diana.
Varios aspectos de la divulgación se describen con más detalle en las siguientes subsecciones.
II. Moléculas de unión a antígenos y polinucleótidos que las codifican
La presente divulgación está dirigida a moléculas de unión a antígeno, incluidos anticuerpos, que se unen específicamente a CD70, moléculas que comprenden esta secuencia (tal como los CAR y TCR descritos en este documento) y células que presentan dichas moléculas, y/o moléculas de unión a antígeno que compiten entre sí con una o más moléculas de unión a antígeno descritas en el presente documento (es decir, una o más de las descritas en las Figuras 7A-7H y/o descritas en el Listado de secuencias adjunto). También se proporcionan polinucleótidos que codifican las moléculas de unión al antígeno y forman un aspecto de la presente divulgación. Las moléculas de unión a antígeno pueden formar un componente de unión a antígeno de uno o más de los CAR y TCR descritos en el presente documento.
Un anticuerpo o molécula de unión al antígeno codificada por la presente divulgación puede ser de cadena sencilla o doble. En algunas realizaciones, el anticuerpo o la molécula de unión al antígeno es de cadena sencilla. En algunas realizaciones, la molécula de unión al antígeno se selecciona del grupo que consiste en un scFv, un Fab, un Fab', un Fv, un F(ab')2, un dAb y cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, el anticuerpo o molécula de unión al antígeno comprende un scFv. En algunas realizaciones, una molécula de unión al antígeno comprende una cadena sencilla, en la que la región variable de la cadena pesada y la región variable de la cadena ligera están conectadas por un enlazador para formar un scFv (p. ej., una molécula de unión al antígeno de la presente divulgación). En algunas realizaciones, la Vh está ubicada en el terminal N del enlazador y la VL está ubicada en el terminal C del enlazador. En otras formas de realización, la VL está ubicada en el terminal N del enlazador y la VH está ubicada en el terminal C del enlazador. En algunas realizaciones, el enlazador comprende al menos aproximadamente 5, al menos aproximadamente 8, al menos aproximadamente 10, al menos aproximadamente 13, al menos aproximadamente 15, al menos aproximadamente 18, al menos aproximadamente 20, al menos aproximadamente 25, al menos aproximadamente 30, al menos aproximadamente 35, al menos aproximadamente 40, al menos aproximadamente 45, al menos aproximadamente 50, al menos aproximadamente 60, al menos aproximadamente 70, al menos aproximadamente 80, al menos aproximadamente 90 o al menos aproximadamente 100 aminoácidos. En algunas realizaciones, el enlazador comprende entre aproximadamente 8 aminoácidos y aproximadamente 18 aminoácidos (p. ej., 10 aminoácidos). Ejemplos de enlazadores adecuados para unir una VH a una VL para formar un scFv (p. ej., una molécula de unión al antígeno de la presente divulgación) incluyen (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3 (SEQ ID NO: 80) y GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 81).
En algunas realizaciones, las moléculas de unión a antígeno de la presente divulgación se unen específicamente a CD70, moléculas que comprenden esta secuencia y células que presentan tales moléculas. En algunas realizaciones, una molécula de unión al antígeno de la presente divulgación se une específicamente a CD70, con una KD de menos de 1 x 10-6 M, menos de 10-7 M, menos de 1 x 10-8 M, o menos de 1 x 10-9 M. En algunas realizaciones, una molécula de unión al antígeno se une específicamente a CD70, con una Kd de menos de 1 x 10-7 M. En otra realización, una molécula de unión al antígeno se une específicamente a la SEQ ID NO: 1, así como las moléculas que comprenden esta secuencia y las células que presentan tales moléculas, con una KD de menos de 1 x 10-8 M. En algunas realizaciones, una molécula de unión al antígeno se une a CD70, con una KD de aproximadamente 1 x 10-7 M, aproximadamente 2 x 10-7 M, aproximadamente 3 x 10-7 M, aproximadamente 4 x 10-7 M, aproximadamente 5 x 10-7 M, aproximadamente 6 x 10-7 M, aproximadamente 7 x 10-7 M, aproximadamente 8 x 10-7 M, aproximadamente 9 x 10-7 M, aproximadamente 1 x 10-8 M, aproximadamente 2 x 10-8 M, aproximadamente 3 x 10-8 M, aproximadamente 4 x 10-8 M, aproximadamente 5 x 10-8 M, aproximadamente 6 x 10-8 M, aproximadamente 7 x 10-8 M, aproximadamente 8 x 10-8 M, aproximadamente 9 x 10-8 M, aproximadamente 1 x 10-9 M, aproximadamente 2 x 10-9 M, aproximadamente 3 x 10-9 M, aproximadamente 4 x 10-9 M, aproximadamente 5 x 10-9 M, aproximadamente 6 x 10-9 M, aproximadamente 7 x 10-9 M, aproximadamente 8 x 10-9 M, aproximadamente 9 x 10-9 M, aproximadamente 1 x 10-10 M, o aproximadamente 5 x 10-10 M. La KD se puede calcular utilizando metodologías estándar, como se describe en este documento.
En realizaciones específicas, una molécula de unión al antígeno de la presente divulgación es un anticuerpo, o scFv formado a partir del mismo, identificado en el presente documento como Clon 8G1 o Clon 1C8 o 6E9. Cada una de las moléculas de unión a antígeno descritas comprende una de las siguientes secuencias de aminoácidos de cadena pesada y ligera, codificantes, variables y CDR, según se proporciona y etiqueta:
Secuencia de codificación de ADN del clon 8G1 VH
C AAG AG C AGCTGGTTGAGTCTGGGGGCGGCGTCGTCC AACCC GGC
CGGAGTCTGAGGTTGTCCTGCGCTGCAAGCGGATTTACATTTTCAT
CTTACGGCATGCACTGGGTTAGGCAGGCTCCTGGAAAAGGGCTGG
AGTGGGTCGCGGTGACTTGGTACGACGGCTCCAATAAGTATTATG
GGGATTCCGTGAAAGGTCGATTCACAATTAGCAGGGATAACTCCA
AAAACACACTGTATCTCCAAATGAACTCCTTGAGGGCCGAGGACA
CGGCCGTCTATTATTGTGCAAGAGACCTCCTCCGGGGCGTAAAGG
GAT AT GC t AT GGAC GT GT GGGGT C AGG GGAC C AC AGT T AC T GT C A
GTTCA (SEQ ID NO: 2)
Clon 8G1 de VH con los AA (CDR subrayadas)
OEOLVESGGGVVOPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVROAPGKGLE
W VAVTW YD G SN KYY GDS VKGRFTISRDN SKNTLYLQMN SLRAEDT
A V Y Y C A R DLLRGVKGYAM DVWGOGTTVTVSS (SEQ ID NO: 3)
Clon 8G1 de la CDR1 de VH con los AA
GFTFSSY
(SEQ ID NO: 71)
Clon 8G1 de la CDR2 de VH con los AA
WYDGSN
(SEQ ID NO: 72)
Clon 8G1 de la CDR3 de VH con los AA
DLLRGVKGYAMDV
(SEQ ID NO: 64)
Secuencia de codificación de ADN del clon 8G1 de VL
GAAATCGTTCTCACTCAGTCTCCGGGCACACTGTCCCTCAGCCCC
GGAGAGCGAGCCACTTTGAGCTGCCGGGCCAGCCAGTCACTTAGA
CGCATTTATTTGGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGCCAGGCGCCC
AGGCTGCTGATATACGATGTGTTCGATAGGGCCACGGGTATCCCC
GATAGGTTCTCTGGCGGGGGGTCCGGGACTGACTTCACCCTCACT
ATATCACGACTCGAGCCCGAAGACTTCGCAGTTTATTATTGCCAG
CAGTACTCCGACTCCCCATTCACCTTCGGCCCTGGTACCAAAGTG
G ATATTAAACGG (SEQ ID NO: 4)
Clon 8G1 de VL con los AA (CDR subrayadas)
EIVLTOSPGTLSLSPGERATLSCRASOSLRRIYLAW YOOKPGOAPRLLI
YDVFDRATGIPDRFSGGGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCOOYSDSPF
TFGPGT KVDIKR (SEQ ID NO: 5)
Clon 8G1 de la CDR1 de VL con los AA
RASQSLRRIYLA
(SEQ ID NO: 53)
Clon 8G1 de la CDR2 de VL con los AA
DVFDRAT
(SEQ ID NO: 54)
Clon 8G1 de la CDR3 de VL con los AA
QQYSDSPFT
(SEQ ID NO: 55)
Secuencia de codificación de ADN del clon 1C8 de VH
CAGGTGCAGCTCCAAGAATCTGGACCGGGTCTCGTCAAGCCATCA
CAGACACTGTCCCTGACCTGCACCGTCTCCGGCGACTCTATCATTT
CAGGCGGCTACTATTGGTCCTGGATTAGACAACATCCGGGAAAGG
GTCTTGAATGGATCGGCTATATTTTCTACAGCGGGAGTACGGATT
ACAATCCTAGTCTCAAGAGCCGCGTTACCATTTCAGTGGATACTT
CAAAAAACCAGTTTAGCCTGAAGCTGTCTTCTGTAACAGCTGCTG
ACACAGCCGTGTACTATTGCGCCAGGAGCGGCTACAGCTATGCCC
T GTTTGACC ACTGGGGGC AAGGC ACTCTTGT GACGGT GT C AAGT
(SEQ ID NO: 6)
Clon 1C8 de VH con los AA (CDR subrayadas)
OVOLOESGPGLVKPSOTLSLTCTVSGDSIISGGYYWSWIROHPGKGL
EW IGYIFYSGS TD YNP SLK SR VTIS VDT SKN QF SLKL S S VT A ADT A V Y
YCARSGYSYALFD H W GQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 7)
Clon 1C8 de la CDR1 de VH con los AA
GDSIISGGY
(SEQ ID NO: 73
Clon 1C8 de la CDR2 de VH con los AA
FYSGS
(SEQ ID NO: 74)
Clon 1C8 de la CDR3 de VH con los AA
SGYSYALFDH
(SEQ ID NO: 67)
Secuencia de codificación de ADN del clon 1C8 de VL
GACATTCAAATGACGCAGTCCCCAAGTTCTCTGTCCGCTAGCGTC
GGCGACCGAGTGACCATCAGCTGCCGAGCATCCCAGTTTATCGGT
AGAT AT TT C A ATTGGT AC C AGC A AC A ACC GGGC A A AGC GCC C A A
GGTCCTGATCTACGCTGAGAGCAGTCTGCAATCCGGCGTACCTAG
CAGGTTCTCCGGAAGTGGCAGCGGAACCGAGTTCACCCTGACAAT
TAGCTCCTTGCAGCCCGAGGATTTCGCTCGCTATTACTGTCAACAG
AGTTATTCAACCCCTTTTACATTCGGACAGGGAACTAAAGTTGAA
ATTAAGAGG (SEQ ID NO: 8)
Clon 1C8 de VL con los AA (CDR subrayadas)
DIOMT O SP S SL S AS V GDRVTISCRASOFIGRYFNW Y OOOPGK APKVLI
Y AESSLOSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLOPEDFARYYCOOSYSTPFT
FGQGTKVEIKR (SEQ ID NO: 9)
Clon 1C8 de la CDR1 de VL con los AA
RASQFIGRYFN
(SEQ ID NO: 56)
Clon 1C8 de la CDR2 de VL con los AA
AESSLQS
(SEQ ID NO: 57)
Clon 1C8 de la CDR3 de VL con los AA
QQSYSTPFT
(SEQ ID NO: 58)
Secuencia de codificación de ADN del clon 6E9 de VH
C AGGT AC AC CTGGT GC AGAGCGGGGCGGAGGTC AAG AAACCG G G
CGCATCCGTACGCGTGAGCTGCAAGGCCTCCGGATACACTTTTAC
TTCTTACTATCTGCATTGGGTCAGGCAGGCACCGGGTCAGGGACT
GGAGT GGAT GGGC AT TGT GGAC C C A AGC GG AGGGAGT AC GT C AT
ATGATCAGAAGTTTCAAGGTAGGTTTACCATGACACGGGACACGT
CAACGAGTACCGTCTACATGGAGCTCAGTAGTCTGCGGAGCGAAG
ACACCGCAGTCTACTACTGCGCACGCGATTATGGAGACTATGTCT
TTGACTATTGGGGGCAGGGGACGCTCGTGACCGTTTCAAGC (SEQ
ID NO: 10)
Clon 6E9 de VH con los AA (CDR subrayadas)
O VH LVO SGAEVKKPGASVRVSCKASGYTFTSYYLHWVROAPGOGL
EWMGIVDPSGGST S YDQKFQGRF TMTRDT S T ST VYMELS SLRSEDT A
YYYCARDYGDYVFDYW GQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 11)
Clon 6E9 de la CDR1 de VH con los AA
GYTFTSY
(SEQ ID NO: 75)
Clon 6E9 de la CDR2 de VH con los AA
DPSGGS
(SEQ ID NO: 76)
Clon 6E9 de la CDR3 de VH con los AA
DYGDYVFDY
(SEQ ID NO: 70)
Secuencia de codificación de ADN del clon 6E9 de VL
CAAAGCGTACTGACACAGCCCCCGAGTGCATCCGGGACCCCCGGC
CAAAGGGTTACAATCAGCTGCTCTGGCAGCTCCAGTAACATAGGT
ACCAACACGGTGAACTGGTACCAGCAGTTGCCTGGCACAGCGCCT
CAGCTGCTCATCTATATCAACAATCAGCGGCCAAGTGGCGTGCCC
GATAGATTCTCAGGCTCAAAGAGCGGAACCAGCGCTAGCTTGGCA
ATCAGTGGCCTTCAATCCGAAGACGAAGCCGATTACTATTGTGCG
ACCTGGGACGATAGCCTGAACGGCCCCGTCGTGGGCGGCGGGAC
GAAACTGACAGTGTTGGGC (SEQ ID NO: 12)
Clon 6E9 de VL con los AA (CDR subrayadas)
OSVLTOPPSASGTPGORVTISCSGSSSNIGTNTVNWYOOLPGTAPOLL
IYINNORPSGYPDRFSGSKSGTSASLAISGLOSEDEADYYCATWDDSL
NGPVVGGGTKLTVLG (SEQ ID NO: 13)
Clon 6E9 de la CDR1 de VL con los AA
SGSSSNIGTNTVN
(SEQ ID NO: 59)
Clon 6E9 de la CDR2 de VL con los AA
INNQRPS
(SEQ ID NO: 60)
Clon 6E9 de la CDR3 de VL con los AA
ATWDDSLNGPVV
(SEQ ID NO: 61)
En una realización, las moléculas de unión a antígeno de la presente divulgación son anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos (p. ej., scFv). En una realización, los anticuerpos y las moléculas de unión a antígeno de la presente divulgación comprenden al menos una CDR expuesta en la Figura 6. En otro aspecto, la presente divulgación proporciona hibridomas capaces de producir los anticuerpos y moléculas de unión a antígenos descritos en este documento, y también métodos para producir anticuerpos a partir de hibridomas, como se describe en este documento y como se conoce en la técnica.
Una molécula de unión al antígeno de la presente divulgación también puede ser un anticuerpo monoclonal humanizado, a partir del cual se puede generar un scFv, que luego puede formar un componente de un CAR o TCR proporcionado en el presente documento. En una realización, un anticuerpo monoclonal humanizado comprende el dominio variable de un anticuerpo murino o de conejo (o todo o parte del sitio de unión al antígeno del mismo) y un dominio constante derivado de un anticuerpo humano. Alternativamente, un fragmento de anticuerpo humanizado puede comprender un sitio de unión al antígeno de un anticuerpo monoclonal murino o de conejo y un fragmento de dominio variable (que carece del sitio de unión al antígeno) derivado de un anticuerpo humano. Los procedimientos para la producción de anticuerpos monoclonales diseñados incluyen los descritos en Riechmann et al., (1988) Nature 332: 323, Liu et al., (1987) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 84: 3439, Larrick et al., (1989) BioTechnology 7: 934, y Winter et al., (1993) TIPS 14: 139. En una realización, el anticuerpo quimérico es un anticuerpo injertado con CDR. Las técnicas para humanizar anticuerpos se discuten, p. ej., en la patente de los Estados Unidos N° 5.869.619; 5.225.539; 5.821.337; 5.859.205; 6.881.557; Padlan et al., (1995) FASEB J. 9: 133-39; Tamura et al., (2000) J. Immunol. 164: 1432-41; Zhang et al., (2005) Mol. Immunol. 42 (12): 1445-1451; Hwang et al., Methods. (2005) 36 (1): 35-42; Dall'Acqua et al., (2005) Methods 36 (1): 43-60; y Clark, (2000) Immunology Today 21 (8): 397-402.
Una molécula de unión al antígeno de la presente divulgación también puede ser un anticuerpo monoclonal completamente humano, a partir del cual se puede generar un scFv, que luego puede formar un componente de un CAR o TCR proporcionado en el presente documento. Pueden generarse anticuerpos monoclonales completamente humanos mediante cualquier cantidad de técnicas con las que estarán familiarizados los expertos en la técnica. Dichos métodos incluyen, pero no se limitan a, transformación del virus de Epstein Barr (EBV) de células sanguíneas periféricas humanas (p. ej., que contienen linfocitos B), inmunización in vitro de células B humanas, fusión de células del bazo de ratones transgénicos inmunizados que portan genes de inmunoglobulina humana injertados, aislamiento de bibliotecas de fagos de la región V de inmunoglobulina humana u otros procedimientos conocidos en la técnica y basados en la divulgación en este documento.
Se han desarrollado procedimientos para generar anticuerpos monoclonales humanos en animales no humanos. Por ejemplo, se han preparado ratones en los que uno o más genes de inmunoglobulina endógenos han sido inactivados por diversos medios. Se han introducido genes de inmunoglobulina humana en ratones para reemplazar los genes inactivados de ratón. En esta técnica, los elementos del locus de la cadena ligera y pesada humana se introducen en cepas de ratones derivadas de líneas de células madre embrionarias que contienen alteraciones específicas de los loci de la cadena pesada y ligera endógena (véase también Bruggemann et al., (1997) Curr Opin. Biotechnol. 8: 455­ 58).
Se describen ejemplos de técnicas para la producción y uso de animales transgénicos para la producción de anticuerpos humanos o parcialmente humanos en las patentes de los Estados Unidos N° 5.814.318, 5.569.825 y 5.545.806; Davis et al., Antibody Engineering: Methods and Protocols, (Lo, ed) Humana Press, NJ, 191-200 (2003); Kellermann et al., (2002) Curr Opin Biotechnol. 13: 593-97; Russel et al., (2000) Infect Immun. 68: 1820-26; Gallo et al., (2000) Eur J. Immun. 30: 534-40; Davis et al., (1999) Cancer Metastasis Rev. 18: 421-25; Green, (1999) J Immunol Methods 231: 11-23; Jakobovits, (1998) Advanced Drug Delivery Reviews 31: 33-42; Green et al., (1998) J Exp Med.
188: 483-95; Jakobovits, (1998) Exp. Opin. Invertir. Drogas. 7: 607-14; Tsuda et al., (1997) Genomics, 42: 413-21; Mendez et al., (1997) Nat. Genet. 15: 146-56; Jakobovits, (1994) Curr Biol. 4: 761-63; Arbones et al., (1994) Immunity 1: 247-60; Green et al., (1994) Nat. Genet. 7: 13-21; Jakobovits et al., (1993) Nature 362: 255-58; Jakobovits et al., (1993) Proc Natl Acad Sci 90: 2551-55; Chen et al., (1993) Intl Immunol 5: 647-656; Choi et al., (1993) Nature Genetics 4: 117-23; Fishwild et al., (1996) Nature Biotechnology 14: 845-51; Lonberg et al., (1994) Nature 368: 856-59; Lonberg, (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113: 49-101; Neuberger, (1996) Nature Biotech 14: 826; Taylor et al., (1992) Nucleic Acids Research 20: 6287-95; Taylor et al., (1994) Intl Immunol 6: 579-91; Tomizuka et al., (1997) Nature Genetics 16: 133-43; Tomizuka et al., (2000) Proc Nat Acad Sci USA 97: 722-27; Tuaillon et al., (1993) Proc Nat Acad Sci 90: 3720-24; Tuaillon et al., (1994) J Immunol 152: 2912-20.; Lonberg et al., (1994) Nature 368: 856; Taylor et al., (1994) Intl Immunol 6: 579; patente de los Estados Unidos N° 5.877.397; Bruggemann et al., (1997) Curr. Opin. Biotechnol. 8: 455-58; Jakobovits et al., (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci. 764: 525-35.
Un método adicional para obtener moléculas de unión a antígeno de la presente divulgación es mediante el uso de presentación en fagos, que está bien establecido para este propósito. Véase, p. ej., Winter et al., (1994) Ann. Rev. Immunol. 12: 433-55; Burton et al., (1994) Adv. Immunol 57: 191-280. Se pueden crear bibliotecas combinatorias de genes de región variable de inmunoglobulina humana o murina en vectores de fagos que se pueden cribar para seleccionar fragmentos de Ig (Fab, Fv, sFv o multímeros de los mismos) que se unen al scFv FMC63, así como moléculas que comprenden esta secuencia y las células que presentan tales moléculas. Véase, p. ej., la patente de los Estados Unidos N° 5.223.409; Huse et al., (1989) Science 246: 1275-81; Sastry et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci.
86: 5728-32; Alting-Mees et al., (1990) Strategies in Molecular Biology 3: 1-9; Kang et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci.
88: 4363-66; Hoogenboom et al., (1992) J. Mol. Biol. 227: 381-388; Schlebusch et al., (1997) Hybridoma 16: 47-52 y las referencias allí citadas. Por ejemplo, una biblioteca que contiene una pluralidad de secuencias de polinucleótidos que codifican fragmentos de la región variable de Ig se puede insertar en el genoma de un bacteriófago filamentoso, tal como los vectores del fago M13 o lambda (AImmunoZapMR (H) y AImmunoZapMR (L) (Stratagene, La Jolla, CA) también se puede usar en este enfoque) o una variante del mismo, en el marco con la secuencia que codifica una proteína de la cubierta del fago.
Brevemente, el ARNm se aísla de una población de células B y se usa para crear bibliotecas de expresión de ADNc de inmunoglobulina de cadena pesada y ligera en los vectores AImmunoZapMR(H) y AImmunoZapMR(L). Estos vectores pueden seleccionarse individualmente o coexpresarse para formar fragmentos Fab o anticuerpos. Las placas positivas se pueden convertir posteriormente en un plásmido no lítico que permite una expresión de alto nivel de fragmentos de anticuerpos monoclonales de E. coli.
En una realización, en un hibridoma, las regiones variables de un gen que expresa un anticuerpo monoclonal de interés se amplifican usando cebadores de nucleótidos. Estos cebadores pueden ser sintetizados por un experto en la técnica, o pueden adquirirse a través de fuentes comerciales, que también venden cebadores para regiones variables de ratón y humano, incluidos, entre otros, cebadores para regiones Vh, Vl, Ch y Cl). Estos cebadores pueden usarse para amplificar regiones variables de cadena ligera o pesada, que luego pueden insertarse en vectores. A continuación, estos vectores pueden introducirse en sistemas basados en E. coli, levaduras o mamíferos para la expresión. Se pueden producir grandes cantidades de una proteína monocatenaria que contiene una fusión de los dominios Vh y Vl usando estos métodos.
Una vez que las células que producen las moléculas de unión a antígeno proporcionadas en este documento se han obtenido usando cualquiera de las técnicas de inmunización y otras técnicas descritas anteriormente, los genes de anticuerpos específicos pueden clonarse aislando y amplificando ADN o ARNm a partir de los mismos de acuerdo con procedimientos estándar como se describe en este documento. Los anticuerpos producidos a partir de los mismos pueden secuenciarse y las CDR identificadas y el ADN que codifica las CDR pueden manipularse como se describe para generar otros anticuerpos de acuerdo con la presente divulgación.
Los expertos en la técnica entenderán que algunas proteínas, tal como los anticuerpos, pueden sufrir diversas modificaciones postraduccionales. El tipo y el alcance de estas modificaciones a menudo depende de la línea de células huésped utilizada para expresar la proteína, así como de las condiciones de cultivo. Tales modificaciones pueden incluir variaciones en la glicosilación, oxidación de metionina, formación de dicetopiperizina, isomerización de aspartato y desamidación de asparagina. Una modificación frecuente es la pérdida de un residuo básico del terminal carboxilo (tal como lisina o arginina) debido a la acción de las carboxipeptidasas (como se describe, p. ej., en Harris, (1995) J Chromatog 705: 129-34).
Un método alternativo para la producción de un anticuerpo monoclonal murino es inyectar las células de hibridoma en la cavidad peritoneal de un ratón singénico, p. ej., un ratón que ha sido tratado (p. ej., cebado con pristano) para promover la formación de fluido ascítico que contiene el anticuerpo monoclonal. Los anticuerpos monoclonales se pueden aislar y purificar mediante una variedad de técnicas bien establecidas. Dichas técnicas de aislamiento incluyen cromatografía de afinidad con proteína A Sefarosa, cromatografía de exclusión por tamaño y cromatografía de intercambio iónico (véase, p. ej., Baines y Thorpe, (1992) en Methods in Molecular Biology, 10: 79-104 (The Humana Press). Los anticuerpos monoclonales pueden purificarse mediante cromatografía de afinidad utilizando un ligando apropiado seleccionado en función de las propiedades particulares del anticuerpo (p. ej., isotipo de cadena pesada o ligera, especificidad de unión, etc.). Ejemplos de un ligando adecuado, inmovilizado sobre un soporte sólido, incluyen Proteína A, Proteína G, un anticuerpo anti-región constante (cadena ligera o cadena pesada) y un anticuerpo antiidiotipo.
La presente divulgación proporciona moléculas de unión a antígenos (p. ej., de scFv) que se unen específicamente a CD70, moléculas que comprenden esta secuencia y células que presentan tales moléculas. Las moléculas de unión a antígeno que compiten de forma cruzada con las moléculas de unión a antígeno descritas en el presente documento forman otro aspecto de la presente divulgación.
En algunas realizaciones, una molécula de unión al antígeno compite de forma cruzada con un anticuerpo de referencia que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 3, 5, 7, 9, 11 o 13. En algunas realizaciones, la molécula de unión al antígeno compite de forma cruzada con un anticuerpo de referencia, en el que el anticuerpo de referencia comprende una CDR1 de VH que comprende una secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 62, 65, 68, 71, 73, 75, 77, 78 y 79.
En algunas realizaciones, una molécula de unión al antígeno compite de forma cruzada con un anticuerpo de referencia que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 3, 5, 7, 9, 11 o 13, en el que el anticuerpo de referencia comprende una CDR2 de VH que comprende una secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 63, 66, 69, 72, 74, 76, 63, 66 y 69.
En algunas realizaciones, una molécula de unión al antígeno compite de forma cruzada con un anticuerpo de referencia que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 3, 5, 7, 9, 11 o 13, en el que el anticuerpo de referencia comprende una CDR3 de VH que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 64, 67 y 70.
En algunas realizaciones, una molécula de unión al antígeno compite de forma cruzada con un anticuerpo de referencia que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 3, 5, 7, 9, 11 o 13, en el que el anticuerpo de referencia comprende una CDR1 de VL que comprende una secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 53, 56 y 59.
En algunas realizaciones, una molécula de unión al antígeno compite de forma cruzada con un anticuerpo de referencia que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 3, 5, 7, 9, 11 o 13, en el que el anticuerpo de referencia comprende una CDR2 de VL que comprende una secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 54, 57 y 60.
En algunas realizaciones, una molécula de unión al antígeno compite de forma cruzada con un anticuerpo de referencia que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 3, 5, 7, 9, 11 o 13, en el que el anticuerpo de referencia comprende una CDR3 de VL que comprende una secuencia de aminoácidos de las s Eq ID NOs: 55, 58 y 61.
En algunas realizaciones, un anticuerpo o molécula de unión al antígeno que se une específicamente a CD70, las moléculas que comprenden esta secuencia y las células que presentan dichas moléculas, se une al mismo o un epítopo superpuesto tal como un anticuerpo de referencia descrito en este documento (p. ej., los que comprenden secuencias presentadas en este documento, que puede comprender una CDR presentada en la Figura 6).
En algunas realizaciones, el anticuerpo o la molécula de unión al antígeno se une al mismo epítopo o al epítopo solapado como anticuerpo de referencia.
II.A. Clon 8G1
En algunas realizaciones, una molécula de unión al antígeno, tal como un scFv, o un anticuerpo que se une específicamente a CD70, las moléculas que comprenden esta secuencia y las células que presentan tales moléculas, comprende una CDR1 de VH que comprende, consiste o consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos GFTFSSY (SEQ ID NO: 71).
En algunas realizaciones, una molécula de unión al antígeno, tal como un scFv, o un anticuerpo que se une específicamente a CD70, las moléculas que comprenden esta secuencia y las células que presentan dichas moléculas, comprende una CDR2 de VH que comprende, consiste o consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos WYDGSN (SEQ ID NO: 72).
En algunas realizaciones, una molécula de unión al antígeno, tal como un scFv, o un anticuerpo que se une específicamente a CD70, las moléculas que comprenden esta secuencia y las células que presentan dichas moléculas, comprende una CDR3 de VH que comprende, consiste o consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos DLLRGVKGYAMDV (SEQ ID NO: 64).
En algunas realizaciones, una molécula de unión al antígeno, tal como un scFv, o un anticuerpo que se une específicamente a CD70, las moléculas que comprenden esta secuencia y las células que presentan dichas moléculas, comprende una VH de cadena pesada que comprende: (a) una CDR1 de VH que comprende, que consiste en, o consiste esencialmente en, la secuencia de aminoácidos GFTFSSY (SEQ ID NO: 71); y/o (b) una CDR2 de VH que comprende, consiste en, o consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos WYDGSN (SEQ ID NO: 72); y/o (c) una CDR3 de VH que comprende, consiste en, o consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos DLLRGVKGYAMDV (SEQ ID NO: 64).
En algunas realizaciones, el anticuerpo o molécula de unión al antígeno, tal como un scFv, que se une específicamente a CD70, las moléculas que comprenden esta secuencia y las células que presentan dichas moléculas, comprende una CDR1 de VH, una CDR2 de VH y una CDR3 de VH, en el que la CDR1 de VH, CDR2 de VH y CDR3 de VH comprenden una secuencia de aminoácidos de CDR1 de VH, CDR2 de VH y CDR3 de VH presentada en la Figura 6.
En algunas realizaciones, el anticuerpo o molécula de unión al antígeno, tal como un scFv, que se une específicamente a CD70, las moléculas que comprenden esta secuencia y las células que presentan tales moléculas, comprende una CDR1 de VH, una CDR2 de VH y una CDR3 de VH, en el que la CDR1 de VH, CDR2 de VH y CDR3 de VH comprenden la secuencia de aminoácidos de CDR1 de VH, CDR2 de VH y CDR3 de VH de una molécula de unión al antígeno presentada en las Figuras. 6 y 7A (SEQ ID NOs: 71, 72 y 64, respectivamente).
En algunas realizaciones, el anticuerpo o molécula de unión al antígeno, tal como un scFv, que se une específicamente a CD70, las moléculas que comprenden esta secuencia y las células que presentan dichas moléculas, comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de la Figura 7A. En algunas realizaciones, el anticuerpo o la molécula de unión al antígeno comprende una secuencia de la región variable de la cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 3.
En algunas realizaciones, el anticuerpo o molécula de unión al antígeno, tal como un scFv, que se une específicamente a CD70, las moléculas que comprenden esta secuencia y las células que presentan dichas moléculas, comprende una o más de cualquiera de las CDR de VH enumeradas anteriormente o descritas en Figura 6. En algunas realizaciones, el anticuerpo o la molécula de unión al antígeno comprende las regiones marco (FR) de VH descritas en el presente documento. En realizaciones específicas, el anticuerpo o molécula de unión al antígeno comprende una FR de VH como se expone en, o puede derivarse de, las secuencias presentadas en la Figura 7A (p. ej., uno, dos, tres o cuatro de las FR en una secuencia de la Figura 7A).
En algunas realizaciones, el anticuerpo o molécula de unión al antígeno, tal como un scFv, que se une específicamente a CD70, las moléculas que comprenden esta secuencia y las células que presentan tales moléculas, comprende una secuencia de cadena pesada descrita en este documento (p. ej., en la Figura 7A). En una realización, el anticuerpo o molécula de unión al antígeno comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos QEQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVTWYD GSNKYYGDSVK GRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLLRGVKGYA MDVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 3), codificada por el ácido nucleico
CAAGAGCAGCTGGTTGAGTCTGGGGGCGGCGTCGTCCAACCCGGCCGGAGTCT
GAGGTTGTCCTGCGCTGCAAGCGGATTTACATTTTCATCTTACGGCATGCACTG
GGTTAGGCAGGCTCCTGGAAAAGGGCTGGAGTGGGTCGCGGTGACTTGGTACG
ACGGCTCC AAT AAGT ATT ATGGGGATTCCGT GAAAGGTCGATTC AC AATT AGC A
GGGATAACTCCAAAAACACACTGTATCTCCAAATGAACTCCTTGAGGGCCGAG
GACACGGCCGTCTATTATTGTGCAAGAGACCTCCTCCGGGGCGTAAAGGGATAT
GCtATGGACGTGTGGGGTCAGGGGACCACAGTTACTGTCAGTTCA (SEQ ID NO:
2).
En varias realizaciones, la región variable de la cadena pesada es 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a la secuencia de la región variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 3.
En algunas realizaciones, una molécula de unión al antígeno, tal como un scFv, o un anticuerpo que se une específicamente a CD70, las moléculas que comprenden esta secuencia y las células que presentan tales moléculas, comprende una CDR1 de VL que comprende, consiste o consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos RASQSLRRIYLA (SEQ ID NO: 53).
En algunas realizaciones, una molécula de unión al antígeno, tal como un scFv, o un anticuerpo que se une específicamente a CD70, las moléculas que comprenden esta secuencia y las células que presentan dichas moléculas, comprende una CDR2 de VL que comprende, consiste o consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos DVFDRAT (SEQ ID NO: 54).
En algunas realizaciones, una molécula de unión al antígeno, tal como un scFv, o un anticuerpo que se une específicamente a CD70, las moléculas que comprenden esta secuencia y las células que presentan tales moléculas, comprende una CDR3 de VL que comprende, consiste o consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos QQYSDSPFT (SEQ ID NO: 55).
En algunas realizaciones, una molécula de unión al antígeno, tal como un scFv, o un anticuerpo que se une específicamente a CD70, las moléculas que comprenden esta secuencia y las células que presentan dichas moléculas, comprende una VL de cadena pesada que comprende: (a) una CDR1 de VL que comprende, que consiste en, o consiste esencialmente en, la secuencia de aminoácidos RASQSLRRIYLA (SEQ ID NO: 53); y/o (b) una CDR2 de VL que comprende, consiste en, o consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos DVFDRAT (SEQ ID NO: 54); y/o (c) una CDR3 de VL que comprende, consiste en, o consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos QQYSDSPFT (SEQ ID NO: 55).
En algunas realizaciones, el anticuerpo o la molécula de unión al antígeno, tal como un scFv, que se une específicamente a CD70, las moléculas que comprenden esta secuencia y las células que presentan dichas moléculas, en donde el anticuerpo o la molécula de unión al antígeno comprende una CDR1 de VL, una CDR2 de VL y una CDR3 de VL, en la que la CDR1 de VL, CDR2 de VL y CDR3 de VL comprenden la secuencia de aminoácidos de una CDR1 de VL, CDR2 de VL y CDR3 de VL presentada en la Figura 6.
En algunas realizaciones, el anticuerpo o molécula de unión al antígeno, tal como un scFv, que se une específicamente a CD70, las moléculas que comprenden esta secuencia y las células que presentan dichas moléculas, comprende una secuencia de región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de la Figura 7B. En algunas realizaciones, el anticuerpo o la molécula de unión al antígeno comprende una secuencia de la región variable de la cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 5.
En algunas realizaciones, el anticuerpo o la molécula de unión al antígeno, tal como un scFv, que se une específicamente a CD70, las moléculas que comprenden esta secuencia y las células que presentan dichas moléculas, en las que el anticuerpo o la molécula de unión al antígeno comprende las regiones marco (FR) de VL descritas en este documento. En realizaciones específicas, el anticuerpo o molécula de unión al antígeno comprende las FR de VL de una secuencia de aminoácidos como se expone en, o puede derivarse de, las secuencias presentadas en la Figura 7B (p. ej., una, dos, tres o cuatro de las FR en una secuencia de la Figura 7B).
En algunas realizaciones, el anticuerpo o molécula de unión al antígeno, tal como un scFv, que se une específicamente a CD70, moléculas que comprenden esta secuencia y células que presentan tales moléculas, comprende una secuencia de cadena ligera descrita en este documento (p. ej., en la Figura 7B). En una realización, el anticuerpo o la molécula de unión al antígeno comprende una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSLRRIYLAWYQQKPGQAPRLLIYDVFDRAT GIPDRFSGGG SGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYSDSPFTFGPGTKVDIKR (SEQ ID NO: 5), Codificada por el ácido nucleico
GAAATCGTTCTCACTCAGTCTCCGGGCACACTGTCCCTCAGCCCCGGAGAGCGA
GCCACTTTGAGCTGCCGGGCCAGCCAGTCACTTAGACGCATTTATTTGGCCTGG
TATCAGCAGAAACCAGGCCAGGCGCCCAGGCTGCTGATATACGATGTGTTCGAT
AGGGCCACGGGTATCCCCGATAGGTTCTCTGGCGGGGGGTCCGGGACTGACTTC
ACCCTCACTATATCACGACTCGAGCCCGAAGACTTCGCAGTTTATTATTGCCAG
CAGTACTCCGACTCCCCATTCACCTTCGGCCCTGGTACCAAAGTGGATATTAAA
CGG (SEQ ID NO:4).
En varias realizaciones, la región variable de cadena ligera es 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a la secuencia de la región variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 4.
En algunas realizaciones, el anticuerpo o molécula de unión al antígeno, tal como un scFv, que se une específicamente a CD70, las moléculas que comprenden esta secuencia y las células que presentan dichas moléculas, comprende una, dos y/o tres secuencias de CDR de VH descritas en el presente documento. En algunas realizaciones, el anticuerpo o molécula de unión al antígeno comprende una CDR1 de VH, una CDR2 de VH y una CDR3 de VH que tiene la secuencia de aminoácidos de cualquier CDR1 de VH, CDR2 de VH y CDR3 de VH descritas en el presente documento, respectivamente. En algunas realizaciones, el anticuerpo o la molécula de unión al antígeno comprende una, dos y/o tres secuencias de CDR de VL descritas en el presente documento. En algunas realizaciones, el anticuerpo o molécula de unión al antígeno comprende una CDR1 de VL, una CDR2 de VL y una CDR3 de VL que tiene la secuencia de aminoácidos de cualquier CDR1 de VL, CDR2 de VL y CDR3 de VL descritas en el presente documento, respectivamente.
En una realización, el anticuerpo o molécula de unión al antígeno, tal como un scFv, que se une específicamente a CD70, las moléculas que comprenden esta secuencia y las células que presentan dichas moléculas, comprende: (a) una región CDR1 de VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 71; (b) una región CDR2 de VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 72; (c) una región CDR3 de VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 64; (d) una región CDR1 de VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 53; (e) una región CDR2 de VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 54; y (f) una región CDR3 de VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 55.
En una realización, el anticuerpo o molécula de unión al antígeno, tal como un scFv, que se une específicamente a CD70, moléculas que comprenden esta secuencia y células que presentan tales moléculas, comprende: (a) una región CDR1 de VH; (b) una región CDR2 de VH; (c) una región CDR3 de VH; (d) una región CDR1 de VL que comprende; (e) una región CDR2 de VL; y (f) una región CDR3 de VL, en la que las CDR de VH y VL se muestran en las Figuras 7A y 7B, respectivamente, y en la Figura 6.
En algunas realizaciones, el anticuerpo o molécula de unión al antígeno, tal como un scFv, que se une específicamente a CD70, las moléculas que comprenden esta secuencia y las células que presentan tales moléculas, comprende una secuencia de región variable de cadena pesada descrita en este documento (p. ej., en la Figura 7A ) y una secuencia de región variable de cadena ligera divulgada en el presente documento (p. ej., en la Figura 7B).
En una realización, el anticuerpo o molécula de unión al antígeno, tal como un scFv, comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5. Las secuencias de nucleótidos que codifican la región variable de cadena pesada y las regiones variables de cadena ligera se proporcionan en el presente documento y en las Figuras 7A y 7B, respectivamente.
En algunas realizaciones, el anticuerpo o molécula de unión al antígeno, tal como un scFv, que se une específicamente a CD70, las moléculas que comprenden esta secuencia y las células que presentan dichas moléculas, comprende una secuencia de cadena pesada descrita en este documento (p. ej., en la Figura 7A) y una secuencia de cadena ligera descrita en este documento (p. ej., en la Figura 7B).
En una realización, el anticuerpo o molécula de unión al antígeno, tal como un scFv, comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de QEQLVESGGGVv Qp GRSLRLSCAASGFTFSSY-GMHWVRQAPGKGLEWV AVTWYD GSNKYYGDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLLRGVK-GYA MDVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 3); y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSLRRIYLAWYQQKPGQAPRLLIYDVFDRAT
GIPDRF S GGGS GTDF TLTISRLEPEDF A Y Y Y CQQYSDSPFTF GPGTK VDIKR (SEQ ID
NO: 5).
En una realización, el anticuerpo o molécula de unión al antígeno comprende: (a) una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que es 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3; y (b) una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que es 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5.
II.B. Clon 1C8
En algunas realizaciones, una molécula de unión al antígeno, tal como un scFv, o un anticuerpo que se une específicamente a CD70, las moléculas que comprenden esta secuencia y las células que presentan dichas moléculas, comprende una CDR1 de VH que comprende, consiste o consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos GDSIISGGY (SEQ ID NO: 73).
En algunas realizaciones, una molécula de unión al antígeno, tal como un scFv, o un anticuerpo que se une específicamente a CD70, las moléculas que comprenden esta secuencia y las células que presentan tales moléculas, comprende una CDR2 de VH que comprende, consiste o consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos FYSGS (SEQ ID NO: 74).
En algunas realizaciones, una molécula de unión al antígeno, tal como un scFv, o un anticuerpo que se une específicamente a CD70, las moléculas que comprenden esta secuencia y las células que presentan dichas moléculas, comprende una CDR3 de VH que comprende, consiste o consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos SGYSYALFDH (SEQ ID NO: 67).
En algunas realizaciones, una molécula de unión al antígeno, tal como un scFv, o un anticuerpo que se une específicamente a CD70, las moléculas que comprenden esta secuencia y las células que presentan dichas moléculas, comprende una VH de cadena pesada que comprende: (a) una CDR1 de VH que comprende, que consiste en, o consiste esencialmente en, la secuencia de aminoácidos GDSIISGGY (SEQ ID n O: 73); y/o (b) una CDR2 de VH que comprende, consiste en, o consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos FYSGS (SEQ ID NO: 74); y/o (c) una CDR3 de VH que comprende, consiste en, o consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos SGYSYALFDH (SEQ ID NO: 67).
En algunas realizaciones, el anticuerpo o molécula de unión al antígeno, tal como un scFv, que se une específicamente a CD70, las moléculas que comprenden esta secuencia y las células que presentan dichas moléculas, comprende una CDR1 de VH, una CDR2 de VH y una CDR3 de VH, en el que la CDR1 de VH, CDR2 de VH y CDR3 de VH comprenden una secuencia de aminoácidos de CDR1 de VH, CDR2 de VH y CDR3 de VH presentada en las Figuras 6 y 7C.
En algunas realizaciones, el anticuerpo o molécula de unión al antígeno, tal como un scFv, que se une específicamente a CD70, las moléculas que comprenden esta secuencia y las células que presentan tales moléculas, comprende una CDR1 de VH, una CDR2 de VH y una CDR3 de VH, en el que la CDR1 de VH, CDR2 de VH y CDR3 de VH comprenden la secuencia de aminoácidos de CDR1 de VH, CDR2 de VH y CDR3 de VH de una molécula de unión al antígeno presentada en las Figuras 7C (SEQ ID NOs: 73, 74 y 67, respectivamente).
En algunas realizaciones, el anticuerpo o molécula de unión al antígeno, tal como un scFv, que se une específicamente a CD70, las moléculas que comprenden esta secuencia y las células que presentan dichas moléculas, comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de la Figura 7C. En algunas realizaciones, el anticuerpo o la molécula de unión al antígeno comprende una secuencia de la región variable de la cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 7.
En algunas realizaciones, el anticuerpo o molécula de unión al antígeno, tal como un scFv, que se une específicamente a CD70, las moléculas que comprenden esta secuencia y las células que presentan dichas moléculas, comprende una o más de cualquiera de las CDR de VH enumeradas anteriormente o descritas en Figura 6. En algunas realizaciones, el anticuerpo o la molécula de unión al antígeno comprende las regiones marco (FR) de VH descritas en el presente documento. En realizaciones específicas, el anticuerpo o molécula de unión al antígeno comprende un FR de VH como se expone en, o puede derivarse de, las secuencias presentadas en la Figura 7C (p. ej., una, dos, tres o cuatro de las FR en una secuencia de la Figura 7C).
En algunas realizaciones, el anticuerpo o molécula de unión al antígeno, tal como un scFv, que se une específicamente a CD70, las moléculas que comprenden esta secuencia y las células que presentan tales moléculas, comprende una secuencia de cadena pesada descrita en este documento (p. ej., en la Figura 7C). En una realización, el anticuerpo o molécula de unión al antígeno comprende una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos QVQLQESGPGL VKPSQTLSL TCTVSGDSIISGGYYWSWIRQHPGKGLEWIGYIFYSG STDYNPSLK-SRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTA VYYCARSGYSY ALFDHWGQG TLVTVSS, codificada por el ácido nucleico
CAGGTGCAGCTCCAAGAATCTGGACCGGGTCTCGTCAAGCCATCACAGACACT
GTCCCTGACCTGCACCGTCTCCGGCGACTCTATCATTTCAGGCGGCTACTATTGG
TCCTGGATTAGACAACATCCGGGAAAGGGTCTTGAATGGATCGGCTATATTTTC
TACAGCGGGAGTACGGATTACAATCCTAGTCTCAAGAGCCGCGTTACCATTTCA
GTGGATACTTCAAAAAACCAGTTTAGCCTGAAGCTGTCTTCTGTAACAGCTGCT
GACACAGCCGTGTACTATTGCGCCAGGAGCGGCTACAGCTATGCCCTGTTTGAC
CACTGGGGGCAAGGCACTCTTGTGACGGTGTCAAGT (SEQ ID NO: 6).
En varias realizaciones, la región variable de la cadena pesada es 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a la secuencia de la región variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 7C.
En algunas realizaciones, una molécula de unión al antígeno, tal como un scFv, o un anticuerpo que se une específicamente a CD70, las moléculas que comprenden esta secuencia y las células que presentan tales moléculas, comprende una CDR1 de VL que comprende, consiste o consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos RASQFIGRYFN (SEQ ID NO: 56).
En algunas realizaciones, una molécula de unión al antígeno, tal como un scFv, o un anticuerpo que se une específicamente a CD70, las moléculas que comprenden esta secuencia y las células que presentan tales moléculas, comprende una CDR2 de VL que comprende, consiste o consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos AESSLQS (SEQ ID NO: 57).
En algunas realizaciones, una molécula de unión al antígeno, tal como un scFv, o un anticuerpo que se une específicamente a CD70, las moléculas que comprenden esta secuencia y las células que presentan tales moléculas, comprende una CDR3 de VL que comprende, consiste o consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos QQSYSTPFT (SEQ ID NO: 58).
En algunas realizaciones, una molécula de unión al antígeno, tal como un scFv, o un anticuerpo que se une específicamente a CD70, las moléculas que comprenden esta secuencia y las células que presentan dichas moléculas, comprende una VL de cadena pesada que comprende: (a) una CDR1 de VL que comprende, que consiste en, o consiste esencialmente en, la secuencia de aminoácidos RASQFIGRYFN (SEQ ID NO: 56); y/o (b) una CDR2 de VL que comprende, consiste en, o consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos AESSLQS (SEQ ID NO: 57); y/o (c) una CDR3 de VL que comprende, consiste en, o consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos QQSYSTPFT (SEQ ID NO: 58).
En algunas realizaciones, el anticuerpo o la molécula de unión al antígeno, tal como un scFv, que se une específicamente a CD70, las moléculas que comprenden esta secuencia y las células que presentan dichas moléculas, en el que el anticuerpo o la molécula de unión al antígeno comprende una CDR1 de VL, una CDR2 de VL y una CDR3 de VL, en el que CDR1 de VL, CDR2 de VL y CDR3 de VL comprenden la secuencia de aminoácidos de CDR1 de VL, CDR2 de VL y CDR3 de VL presentadas en las Figuras 6 y 7D.
En algunas realizaciones, el anticuerpo o molécula de unión al antígeno, tal como un scFv, que se une específicamente a CD70, las moléculas que comprenden esta secuencia y las células que presentan dichas moléculas, comprende una secuencia de región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de la Figura 7D. En algunas realizaciones, el anticuerpo o la molécula de unión al antígeno comprende una secuencia de la región variable de la cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 9.
En algunas realizaciones, el anticuerpo o la molécula de unión al antígeno, tal como un scFv, que se une específicamente a CD70, las moléculas que comprenden esta secuencia y las células que presentan dichas moléculas, en el que el anticuerpo o la molécula de unión al antígeno comprende las regiones marco (FR) de VL descritas en este documento. En realizaciones específicas, el anticuerpo o molécula de unión al antígeno comprende las FR de VL de una secuencia de aminoácidos como se expone en, o puede derivarse de, las secuencias presentadas en la Figura 7D (p. ej., una, dos, tres o cuatro de las FR en una secuencia de la Figura 7D).
En algunas realizaciones, el anticuerpo o molécula de unión al antígeno, tal como un scFv, que se une específicamente a CD70, las moléculas que comprenden esta secuencia y las células que presentan dichas moléculas, comprende una secuencia de cadena ligera descrita en este documento (p. ej., en la Figura 7D). En una realización, el anticuerpo o la molécula de unión al antígeno comprende una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de DIQMTQSPSSLSASVGDRVTISCRASQFIGRYFNWYQQQPGKAPKVLIYAESSLQSG VPSRFSGSG-SGTEFTLTISSLQPEDFARYYCQQSYSTPFTFGQGTKVEIKR (SEQ ID NO: 9), codificada por el ácido nucleico
GACATTCAAATGACGCAGTCCCCAAGTTCTCTGTCCGCTAGCGTCGGCGACCGA
GTGACCATCAGCTGCCGAGCATCCCAGTTTATCGGTAGATATTTCAATTGGTAC
CAGCAACAACCGGGCAAAGCGCCCAAGGTCCTGATCTACGCTGAGAGCAGTCT
GCAATCCGGCGTACCTAGCAGGTTCTCCGGAAGTGGCAGCGGAACCGAGTTCA
CCCTGACAATTAGCTCCTTGCAGCCCGAGGATTTCGCTCGCTATTACTGTCAAC
AGAGTTATTCAACCCCTTTTACATTCGGACAGGGAACTAAAGTTGAAATTAAGA
GG (SEQ ID NO:8).
En varias realizaciones, la región variable de cadena ligera es 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a la secuencia de la región variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 9.
En algunas realizaciones, el anticuerpo o molécula de unión al antígeno, tal como un scFv, que se une específicamente a CD70, las moléculas que comprenden esta secuencia y las células que presentan dichas moléculas, comprende una, dos y/o tres secuencias de CDR de VH descritas en el presente documento. En algunas realizaciones, el anticuerpo o molécula de unión al antígeno comprende una CDR1 de VH, una CDR2 de VH y una CDR3 de VH que tiene la secuencia de aminoácidos de cualquier CDR1 de VH, CDR2 de VH y CDR3 de VH descritas en el presente documento, respectivamente. En algunas realizaciones, el anticuerpo o la molécula de unión al antígeno comprende una, dos y/o tres secuencias de la CDR de VL descritas en el presente documento. En algunas realizaciones, el anticuerpo o molécula de unión al antígeno comprende una CDR1 de VL, una CDR2 de VL y una CDR3 de VL que tiene la secuencia de aminoácidos de cualquier CDR1 de VL, CDR2 de VL y CDR3 de VL descritas en el presente documento, respectivamente.
En una realización, el anticuerpo o molécula de unión al antígeno, tal como un scFv, que se une específicamente a CD70, las moléculas que comprenden esta secuencia y las células que presentan dichas moléculas, comprende: (a) una región CDR1 de VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 73; (b) una región CDR2 de VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 74; (c) una región CDR3 de VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 67; (d) una región CDR1 de VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 56; (e) una región CDR2 de VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 57; y (f) una región CDR3 de VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 58.
En una realización, el anticuerpo o molécula de unión al antígeno, tal como un scFv, que se une específicamente a CD70, moléculas que comprenden esta secuencia y células que presentan tales moléculas, comprende: (a) una región CDR1 de VH; (b) una región CDR2 de VH; (c) una región CDR3 de VH; (d) una región CDR1 de VL que comprende; (e) una región CDR2 de VL; y (f) una región CDR3 de VL, en la que las CDR de VH y VL se muestran en las Figuras 7C y 7D, respectivamente, y en la Figura 6.
En algunas realizaciones, el anticuerpo o molécula de unión al antígeno, tal como un scFv, que se une específicamente a CD70, las moléculas que comprenden esta secuencia y las células que presentan tales moléculas, comprende una secuencia de región variable de cadena pesada descrita en este documento (p. ej., en la Figura 7D).
En una realización, el anticuerpo o molécula de unión al antígeno, tal como un scFv, comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9. Las secuencias de nucleótidos que codifican la región variable de cadena pesada y las regiones variables de cadena ligera se proporcionan en el presente documento y en las Figuras 7C y 7D, respectivamente.
En algunas realizaciones, el anticuerpo o molécula de unión al antígeno, tal como un scFv, que se une específicamente a CD70, las moléculas que comprenden esta secuencia y las células que presentan tales moléculas, comprende una secuencia de cadena pesada descrita en este documento (p. ej., en la Figura 7C) y una secuencia de cadena ligera divulgada en el presente documento (p. ej., en la Figura 7D).
En una realización, el anticuerpo o molécula de unión al antígeno, tal como un scFv, comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de QVQLQESGPGL VKPSQTLSLTCTVSGDSIISGG-YYWSWIR QHPGKGLEWIGYIFYSG STDYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTA ADTAVYYCARSGYSYALF-DHWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 7); y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTISCRASQFIGRYFNWYQQQPGKAPKVLIYAESSLQSG
VPSRFSGSGS GTEF TLTIS SLQPEDF AR Y Y C QQ S YS TPF TF GQGTK VEIKR (SEQ ID
NO: 9).
En una realización, el anticuerpo o molécula de unión al antígeno comprende: (a) una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que es 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7; y (b) una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que es 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9.
II.C. Clon 6E9
En algunas realizaciones, una molécula de unión al antígeno, tal como un scFv, o un anticuerpo que se une específicamente a CD70, las moléculas que comprenden esta secuencia y las células que presentan dichas moléculas, comprende una CDR1 de VH que comprende, consiste o consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos GYTFTSY (SEQ ID NO: 75).
En algunas realizaciones, una molécula de unión al antígeno, tal como un scFv, o un anticuerpo que se une específicamente a CD70, las moléculas que comprenden esta secuencia y las células que presentan dichas moléculas, comprende una CDR2 de VH que comprende, consiste o consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos DPSGGS (SEQ ID NO: 76).
En algunas realizaciones, una molécula de unión al antígeno, tal como un scFv, o un anticuerpo que se une específicamente a CD70, las moléculas que comprenden esta secuencia y las células que presentan dichas moléculas, comprende una CDR3 de VH que comprende, consiste o consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos DYGDYVFDY (SEQ ID NO: 70).
En algunas realizaciones, una molécula de unión al antígeno, tal como un scFv, o un anticuerpo que se une específicamente a CD70, las moléculas que comprenden esta secuencia y las células que presentan dichas moléculas, comprende un VH de cadena pesada que comprende: (a) una CDR1 de VH que comprende, que consiste en, o consiste esencialmente en, la secuencia de aminoácidos GYTFTSY (SEQ ID NO: 75); y/o (b) una CDR2 de VH que comprende, consiste en, o consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos DPSGGS (SEQ ID NO: 76); y/o (c) una CDR3 de VH que comprende, consiste en, o consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos DYGDYVFDY (SEQ ID NO: 70).
En algunas realizaciones, el anticuerpo o molécula de unión al antígeno, tal como un scFv, que se une específicamente a CD70, las moléculas que comprenden esta secuencia y las células que presentan tales moléculas, comprende una CDR1 de VH, una CDR2 de VH y una CDR3 de VH, en el que la CDR1 de VH, CDR2 de VH y CDR3 de VH comprenden una secuencia de aminoácidos de CDR1 de VH, CDR2 de VH y CDR3 de VH presentada en las Figuras 6 y 7E.
En algunas realizaciones, el anticuerpo o molécula de unión al antígeno, tal como un scFv, que se une específicamente a CD70, las moléculas que comprenden esta secuencia y las células que presentan dichas moléculas, comprende una CDR1 de VH, una CDR2 de VH y una CDR3 de VH, en el que la CDR1 de VH, CDR2 de VH y CDR3 de VH comprenden la secuencia de aminoácidos de CDR1 de VH, CDR2 de VH y CDR3 de VH de una molécula de unión al antígeno presentada en la Figura 7E (SEQ ID NO: 75, 76 y 70, respectivamente).
En algunas realizaciones, el anticuerpo o molécula de unión al antígeno, tal como un scFv, que se une específicamente a CD70, las moléculas que comprenden esta secuencia y las células que presentan dichas moléculas, comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de la Figura 7E. En algunas realizaciones, el anticuerpo o la molécula de unión al antígeno comprende una secuencia de la región variable de la cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 11.
En algunas realizaciones, el anticuerpo o molécula de unión al antígeno, tal como un scFv, que se une específicamente a CD70, las moléculas que comprenden esta secuencia y las células que presentan dichas moléculas, comprende una o más de cualquiera de las CDR de VH enumeradas anteriormente o descritas en Figura 6. En algunas realizaciones, el anticuerpo o la molécula de unión al antígeno comprende las regiones marco (FR) de VH descritas en el presente documento. En realizaciones específicas, el anticuerpo o molécula de unión al antígeno comprende una FR de VH como se expone en, o puede derivarse de, las secuencias presentadas en la Figura 7E (p. ej., una, dos, tres o cuatro de las FR en una secuencia de la Figura 7E) .
En algunas realizaciones, el anticuerpo o molécula de unión al antígeno, tal como un scFv, que se une específicamente a CD70, las moléculas que comprenden esta secuencia y las células que presentan tales moléculas, comprende una secuencia de cadena pesada descrita en este documento (p. ej., en la Figura 7E). En una realización, el anticuerpo o la molécula de unión al antígeno comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos QVHLVQSGAEVKKPGASVRVSCKASGYTFTSYYLHWVR QAPGQGLEWMGIVDPS GGSTSYDQKFQ-GRFTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDYGDYVFDYW GQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 11), codificada por el acido nucleico
CAGGTACACCTGGTGCAGAGCGGGGCGGAGGTCAAGAAACCGGGCGCATCCGT
ACGCGTGAGCTGCAAGGCCTCCGGATACACTTTTACTTCTTACTATCTGCATTGG
GT C AGGC AGGC ACCGGGTC AGGGACTGGAGT GGAT GGGC ATTGTGGACCC A AG
CGGAGGGAGT ACGT C AT ATGAT C AGA AGTTTC AAGGT AGGTTT ACC AT GAC AC
GGGACACGTCAACGAGTACCGTCTACATGGAGCTCAGTAGTCTGCGGAGCGAA
GACACCGCAGTCTACTACTGCGCACGCGATTATGGAGACTATGTCTTTGACTAT
TGGGGGCAGGGGACGCTCGTGACCGTTTCAAGC (SEQ ID NO: 10).
En varias realizaciones, la región variable de la cadena pesada es 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a la secuencia de la región variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 7E.
En algunas realizaciones, una molécula de unión al antígeno, tal como un scFv, o un anticuerpo que se une específicamente a CD70, las moléculas que comprenden esta secuencia y las células que presentan tales moléculas, comprende una CDR1 de VL que comprende, consiste o consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos SGSSSNIGTNTVN (SEQ ID NO: 59).
En algunas realizaciones, una molécula de unión al antígeno, tal como un scFv, o un anticuerpo que se une específicamente a CD70, las moléculas que comprenden esta secuencia y las células que presentan tales moléculas, comprende una CDR2 de VL que comprende, consiste o consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos INNQRPS (SEQ ID NO: 60).
En algunas realizaciones, una molécula de unión al antígeno, tal como un scFv, o un anticuerpo que se une específicamente a CD70, las moléculas que comprenden esta secuencia y las células que presentan dichas moléculas, comprende una CDR3 de VL que comprende, consiste o consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos ATWDDSLNGPVV (SEQ ID NO: 61).
En algunas realizaciones, una molécula de unión al antígeno, tal como un scFv, o un anticuerpo que se une específicamente a CD70, las moléculas que comprenden esta secuencia y las células que presentan dichas moléculas, comprende una VL de cadena pesada que comprende: (a) una CDR1 de VL que comprende, que consiste en, o consiste esencialmente en, la secuencia de aminoácidos SGSSSNIGTNTVN (SEQ ID n O: 59); y/o (b) una CDR2 de VL que comprende, consiste en, o consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos INNQRPS (SEQ ID NO: 60); y/o (c) una CDR3 de VL que comprende, consiste en, o consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos ATWDDSLNGPVV (SEQ ID NO: 61).
En algunas realizaciones, el anticuerpo o molécula de unión al antígeno, tal como un scFv, que se une específicamente a CD70, las moléculas que comprenden esta secuencia y las células que presentan dichas moléculas, en el que el anticuerpo o la molécula de unión al antígeno comprende una CDR1 de VL, una CDR2 de VL y una CDR3 de VL, en el que CDR1 de VL, CDR2 de VL y CDR3 de VL comprenden la secuencia de aminoácidos de CDR1 de VL, CDR2 de VL y CDR3 de VL presentadas en la Figura 6 y 7F.
En algunas realizaciones, el anticuerpo o molécula de unión al antígeno, tal como un scFv, que se une específicamente a CD70, las moléculas que comprenden esta secuencia y las células que presentan dichas moléculas, comprende una secuencia de región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de la Figura 7F. En algunas realizaciones, el anticuerpo o la molécula de unión al antígeno comprende una secuencia de la región variable de la cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 13.
En algunas realizaciones, el anticuerpo o la molécula de unión al antígeno, tal como un scFv, que se une específicamente a CD70, las moléculas que comprenden esta secuencia y las células que presentan dichas moléculas, en el que el anticuerpo o la molécula de unión al antígeno comprende las regiones marco (FR) de VL descritas en este documento. En realizaciones específicas, el anticuerpo o la molécula de unión al antígeno comprende las FR de VL de una secuencia de aminoácidos como se expone en, o puede derivarse de, las secuencias presentadas en la Figura 7F (p. ej., una, dos, tres o cuatro de las FR en una secuencia de la Figura 7F).
En algunas realizaciones, el anticuerpo o molécula de unión al antígeno, tal como un scFv, que se une específicamente a CD70, las moléculas que comprenden esta secuencia y las células que presentan tales moléculas, comprende una secuencia de cadena ligera descrita en este documento (p. ej., en la Figura 7F). En una forma de realización, el anticuerpo o molécula de unión al antígeno comprende una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGTNTVNWYQQLPGTAPQLLIYINNQRPSG VPDRFSGS KSGTSASLAISGLQSEDEADYYCATWDDSLNGPVVGGGTKLTVLG (SEQ ID NO: 13) codificada por el ácido nucleico
CAAAGCGTACTGACACAGCCCCCGAGTGCATCCGGGACCCCCGGCCAAAGGGT
TACAATCAGCTGCTCTGGCAGCTCCAGTAACATAGGTACCAACACGGTGAACTG
GTACCAGCAGTTGCCTGGCACAGCGCCTCAGCTGCTCATCTATATCAACAATCA
GCGGCCAAGTGGCGTGCCCGATAGATTCTCAGGCTCAAAGAGCGGAACCAGCG
CTAGCTTGGCAATCAGTGGCCTTCAATCCGAAGACGAAGCCGATTACTATTGTG
CGACCTGGGACGATAGCCTGAACGGCCCCGTCGTGGGCGGCGGGACGAAACTG
ACAGTGTTGGGC (SEQ ID NO: 12).
En varias realizaciones, la región variable de cadena ligera es 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a la secuencia de la región variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 13.
En algunas realizaciones, el anticuerpo o la molécula de unión al antígeno, tal como un scFv, que se une específicamente a CD70, las moléculas que comprenden esta secuencia y las células que presentan dichas moléculas, comprende una, dos y/o tres secuencias de CDR de VH descritas en el presente documento. En algunas realizaciones, el anticuerpo o molécula de unión al antígeno comprende una CDR1 de VH, una CDR2 de VH y una CDR3 de VH que tiene la secuencia de aminoácidos de cualquier CDR1 de VH, CDR2 de VH y CDR3 de VH descritas en el presente documento, respectivamente. En algunas realizaciones, el anticuerpo o la molécula de unión al antígeno comprende una, dos y/o tres secuencias de la CDR de VL descritas en el presente documento. En algunas realizaciones, el anticuerpo o molécula de unión al antígeno comprende una CDR1 de VL, una CDR2 de VL y una CDR3 de VL que tiene la secuencia de aminoácidos de cualquier CDR1 de VL, CDR2 de VL y CDR3 de VL descritas en el presente documento, respectivamente.
En una realización, el anticuerpo o molécula de unión al antígeno, tal como un scFv, que se une específicamente a CD70, las moléculas que comprenden esta secuencia y las células que presentan dichas moléculas, comprende: (a) una región CDR1 de VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 75; (b) una región CDR2 de VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 76; (c) una región CDR3 de VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 70; (d) una región CDR1 de VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 59; (e) una región CDR2 de VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 60; y (f) una región CDR3 de VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 61.
En una realización, el anticuerpo o molécula de unión al antígeno, tal como un scFv, que se une específicamente a CD70, moléculas que comprenden esta secuencia y células que presentan tales moléculas, comprende: (a) una región CDR1 de VH; (b) una región CDR2 de VH; (c) una región CDR3 de VH; (d) una región CDR1 de VL que comprende; (e) una región CDR2 de VL; y (f) una región CDR3 de VL, en la que las CDR VH y VL se muestran en las Figuras 7E y 7F, respectivamente, y en la Figura 6.
En algunas realizaciones, el anticuerpo o molécula de unión al antígeno, tal como un scFv, que se une específicamente a CD70, las moléculas que comprenden esta secuencia y las células que presentan tales moléculas, comprende una secuencia de región variable de cadena pesada descrita en este documento (p. ej., en la Figura 7E ) y una secuencia de región variable de cadena ligera descrita en este documento (p. ej., en la Figura 7F).
En una realización, el anticuerpo o molécula de unión al antígeno, tal como un scFv, comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 11; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 13. Las secuencias de nucleótidos que codifican la región variable de cadena pesada y las regiones variables de cadena ligera se proporcionan en este documento y en las Figuras 7E y 7F, respectivamente.
En algunas realizaciones, el anticuerpo o molécula de unión al antígeno, tal como un scFv, que se une específicamente a CD70, las moléculas que comprenden esta secuencia y las células que presentan tales moléculas, comprende una secuencia de cadena pesada descrita en este documento (p. ej., en la Figura 7E) y una secuencia de cadena ligera divulgada en el presente documento (p. ej., en la Figura 7F).
En una realización, el anticuerpo o molécula de unión al antígeno, tal como un scFv, comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de QVHLVQSGAEVKKPGASVRVSCKASGYTFT-SYYLHWVRQAPGQGLEWMGIVDPS GGSTSYDQKFQGRFTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDYGDYV FDYW GQGTLVTVSS (DEQ ID NO: 11); y b) una cadena ligera de la región variable que comprende la secuencia de aminoácidos de
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGTNTVNWYQQLPGTAPQLLIYINNQRPSG
VPDRF S GSK S GT S ASL AIS GLQ SEDE AD Y Y C AT WDD SLN GP V V GGGTKLT VLG
(SEQ ID NO: 13).
En una realización, el anticuerpo o molécula de unión al antígeno, tal como un scFv, comprende: (a) una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que es 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 11; y (b) una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que es 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 13.
III. Polinucleótidos que codifican moléculas de unión a antígenos, receptores de antígenos quiméricos y receptores de células T que comprenden dichas moléculas de unión a antígenos
La presente divulgación también se dirige a polinucleótidos que codifican anticuerpos y moléculas de unión a antígenos, tales como un scFv, que se unen específicamente a CD70, moléculas que comprenden esta secuencia y células que presentan tales moléculas.
En algunas realizaciones, un polinucleótido de la presente divulgación codifica una molécula de unión al antígeno, tal como un scFv, en el que la molécula de unión al antígeno comprende una secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada que es al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, al menos aproximadamente 99% o 100% idéntica a un secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 3, 7 y 11.
En algunas realizaciones, un polinucleótido de la presente divulgación codifica una molécula de unión al antígeno, tal como un scFv, en el que la molécula de unión al antígeno comprende una secuencia de aminoácidos variable de cadena ligera que es al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, al menos aproximadamente 99% o 100% idéntica a una cadena ligera secuencia de aminoácidos de la región variable seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 5, 9 y 13.
En algunas realizaciones, el polinucleótido comprende una secuencia codificante de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en las s Eq ID NOs: 2, 6 y 10.
En otra realización, el polinucleótido comprende una secuencia codificante de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 4, 8 y 12.
En otra realización, el polinucleótido comprende una secuencia codificante de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 2 y una secuencia codificante de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 4.
En otra realización, el polinucleótido comprende una secuencia codificante de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 6 y una secuencia codificante de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 8.
En otra realización, el polinucleótido comprende una secuencia codificante de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 10 y una secuencia codificante de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 12.
Como apreciarán los expertos en la técnica, las variaciones de las secuencias de polinucleótidos descritas son posibles debido a la degeneración del código genético. Tales variantes de las secuencias de polinucleótidos divulgadas forman, por tanto, un aspecto de la presente divulgación.
IV. Receptores de antígenos quiméricos y receptores de células T
La presente divulgación también está dirigida a receptores de antígenos quiméricos (CAR) o receptores de células T (TCR) que comprenden una molécula de unión al antígeno, tal como un scFv, que se une específicamente a CD70 descrito en este documento, y células T modificadas que comprenden una molécula de unión a antígeno que se une específicamente a CD70 descrita en el presente documento. En algunas realizaciones, un CAR o TCR anti-CD70 de la presente divulgación comprende una molécula de unión al antígeno que se une específicamente a CD70. En algunas realizaciones, el CAR o TCR anti-CD70 comprende además un dominio coestimulador y/o un dominio extracelular (es decir, una región "bisagra" o "espadadora") y/o un dominio transmembrana y/o un dominio intracelular (señalización) y/o un dominio de activación CD3 zeta. En algunas realizaciones, el CAR o TCR anti-CD70 comprende una molécula de unión al antígeno scFv que se une específicamente a CD70 (p. ej., hCD70) divulgada en el presente documento, un dominio coestimulador, un dominio extracelular, un dominio transmembrana y un dominio de activación CD3 zeta.
En algunas realizaciones, un TCR de la presente divulgación comprende una molécula de unión al antígeno que se une específicamente a CD70, y en el que el TCR comprende además una cuarta región determinante de complementariedad (CDR4). En algunas realizaciones, el TCR comprende una molécula de unión al antígeno que se une específicamente a CD70 y una región constante. En algunas realizaciones, la región constante se selecciona de una región constante de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgD, IgE e IgM. El diseño de CAR y TCR se analiza más adelante.
Se apreciará además que, cuando se desee, los diversos dominios y regiones descritos en este documento se pueden expresar en una cadena separada de la molécula de unión al antígeno (p. ej., scFv) y los dominios de activación, en la denominada configuración "trans". Por tanto, en una realización, un dominio de activación se puede expresar en una cadena, mientras que la molécula de unión al antígeno y/o un dominio extracelular y/o un dominio transmembrana y/o un dominio coestimulador (dependiendo de la construcción deseada del CAR o t Cr ) se puede expresar en una cadena separada.
Como se describe más completamente en el presente documento, se apreciará además que el orden terminal N a C, o extracelular a intracelular, de los componentes de un CAR de la presente divulgación se puede variar según se desee. La molécula de unión al antígeno (scFv) será extracelular para asociarse con el antígeno diana, y puede incluir un péptido guía o señal en el extremo terminal N del scFv que está más distal a la membrana celular. Una orientación y orden preferidos para un CAR de la presente divulgación es: secuencia guía opcional (p. ej., la secuencia guía de CD8a)-- scFv anti-CD70--minienlazador opcional, como GSG o AAA-bisagra--minienlazador opcional, tal como GSG o AAA—región transmembrana (p. ej., región transmembrana CD8a)--minienlazador opcional, tal como GSG o AAA— región coestimuladora (p. ej., CD28T o una subsecuencia de 4-1BB)—minienlazador opcional, tal como GSG o AAA —dominio de activación (p. ej., un dominio de CD3 zeta, tal como uno de los proporcionados en este documento).
Otra orientación y orden preferidos para un CAR de la presente divulgación comprende dos dominios coestimuladores y es: secuencia guía opcional (p. ej., la secuencia guía de CD8a)--scFv anti-CD70--minienlazador opcional, tal como GSG o AAA-bisagra-minienlazador opcional, tal como GSG o AAA—región transmembrana (p. ej., región transmembrana CD8a)--minienlazador opcional, tal como GSG o AAA—región coestimuladora (p. ej., CD28T o una subsecuencia de 4-1BB)--región coestimuladora (p. ej., CD28T o una subsecuencia de 4-1BB)--minienlazador opcional, tal como GSG o AAA—dominio de activación (p. ej., un dominio de CD3 zeta, tal como uno de los proporcionados en el presente documento).
A continuación se proporciona una descripción más detallada de los componentes de un CAR.
IV.A. Dominio extracelular o "bisagra"
En una realización, un CAR o TCR de la presente divulgación comprende un dominio o región "extracelular" o "bisagra" o "espaciador", términos que se usan indistintamente en el presente documento. En otra realización, un dominio extracelular es de o se deriva de (p. ej., comprende todo o un fragmento de) CD2, CD3 delta, CD3 épsilon, CD3 gamma, CD4, CD7, CD8a, CD8p, CD11a (ITGAL), CD11b (ITGAM), CD11c (ITGAX), CD11d (ITGAD), CD18 (ITGB2), CD19 (B4), CD27 (TNFRSF7), CD28, CD28T, CD29 (ITGB1), CD30 (TNFRSF8), CD40 (TNFRSF5), CD48 (SLAMF2), CD49a (ITGA1), CD49d (ITGA4), CD49f (ITGA6), CD66a (CEACAM1), CD66b (CEACAM8), CD66c (CEACAM6), CD66d (CEACAM3), CD66e (CEACAM5), CD69 (CLEC2), CD79A (cadena alfa asociada al complejo del receptor del antígeno de células B), CD79B (cadena beta asociada al complejo del receptor del antígeno de células B), CD84 (SLAMF5), CD96 (Tactile), CD100 (SEMA4D), CD103 (ITGAE), CD134 (OX40), CD137 (4-1BB), CD150 (SLAMF1), CD158A (KIR2DL1), CD158B1 (KIR2DL2), CD158B2 (KIR2DL3), CD158C (KIR3DP1), CD158D (KIRDL4), CD158F1 (KIR2D158D5A) CD160 (BY55), CD162 (SELPLG), CD226 (DNAM1), CD229 (SLAMF3), CD244 (SLAMF4), CD247 (CD3-zeta), CD258 (LIGHT), CD268 (BAFFR), C D270 (TNFSF14), CD272 (BTLA), CD276 (B7-H3), CD279 (PD-1), CD314 (NKG2D), CD319 (SLAMF7), CD335 (NK-p46), CD336 (NK-p44), CD337 ( NK-p30), CD352 (SLAMF6), CD353 (SLAMF8), CD355 (CRTAM), CD357 (TNFRSF18), coestimulador de células T inducible (ICOS), LFA-1 (CD11a/CD18), NKG2C, DAP-10, ICAM-1, NKp80 (KLRF1), IL-2R beta, IL-2R gamma, IL-7R alfa, LFA-1, SLAMF9, LAT, GADS (GrpL), SLP-76 (LCP2), PAG1/CBP, un ligando de CD83, receptor de Fc gamma, molécula del MHC de clase 1, molécula del MHC de clase 2, una proteína receptora de TNF, una proteína de inmunoglobulina, un receptor de citocina, una integrina, receptores de células NK activadoras, un receptor de ligando Toll y fragmentos o combinaciones de los mismos. Un dominio o región "extracelular" o "bisagra" o "espaciador" puede derivarse de una fuente natural o sintética.
En algunas realizaciones, un dominio o región "extracelular" o "bisagra" o "espaciador" se coloca entre una molécula de unión al antígeno (p. ej., un scFv) y un dominio transmembrana. En esta orientación, el dominio de bisagra proporciona la distancia entre la molécula de unión al antígeno y la superficie de una membrana celular en la que se expresa el CAR o TCR. En algunas realizaciones, un dominio o región "extracelular" o "bisagra" o "espaciador" es de o se deriva de una inmunoglobulina. En algunas realizaciones, un dominio o región "extracelular" o "bisagra" o "espaciador" se selecciona de las regiones bisagra de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgD, IgE e IgM, o un fragmento de las mismas. En otras realizaciones, un dominio o región "extracelular" o "bisagra" o "espaciador" comprende, es de o se deriva de la región bisagra de CD8 alfa. En algunas realizaciones, un dominio o región "extracelular" o "bisagra" o "espaciador" comprende, es de o se deriva de la región bisagra de CD28T. En algunas realizaciones, un dominio o región "extracelular" o "bisagra" o "espaciador" comprende un fragmento de la región bisagra de CD8 alfa o un fragmento de la región bisagra de CD28T, en el que el fragmento es algo menor que la región bisagra completa. En algunas realizaciones, el fragmento de la región bisagra de CD8 alfa o el fragmento de la región bisagra de CD28 comprende una secuencia de aminoácidos que excluye al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos al menos 19, o al menos 20 aminoácidos en el terminal N o el terminal C, o ambos, de la región bisagra de CD8 alfa, o de la región bisagra de CD28T.
En algunas realizaciones, un dominio o región "extracelular" o "bisagra" o "espaciador" comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, al menos aproximadamente 99% o 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos LDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVWGGVLACYSLLVTVAFNFWV (SEQ ID NO: 15) o un fragmento de la misma. En algunas realizaciones, un dominio o región "extracelular" o "bisagra" o "espaciador" comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 15 o un fragmento de la misma.
En algunas realizaciones, un dominio o región "extracelular" o "bisagra" o "espaciador" comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, al menos aproximadamente 99% o 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos LDNEKs Ng TIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP (SEQ ID NO: 15) o un fragmento de la misma. En algunas realizaciones, un dominio o región "extracelular" o "bisagra" o "espaciador" comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 83, o un fragmento de la misma.
En algunas realizaciones, un dominio o región "extracelular" o "bisagra" o "espaciador" está codificado por una secuencia de nucleótidos al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, al menos aproximadamente 99%, o 100% idéntica a la secuencia de nucleótidos CTTGATAATGAAAAGTCAAACGGAACAATCATTCACGTGAAGGGCAAGCACCT CTGTCCGTCACCCTTGTTCCCTGGTCCATCCAAGCCATTCTGGGTGTTGGTCGTA GTGGGTGGAGTCCTCGCTTGTTACTCTCTGCTCGTCACCGTGGCTTTTATAATCT TCTGGGTT (SEQ ID NO: 14) o un fragmento de la misma. En algunas realizaciones, un dominio o región "extracelular" o "bisagra" o "espaciador" está codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 14 o un fragmento de la misma.
En algunas realizaciones, un dominio o región "extracelular" o "bisagra" o "espaciador" está codificado por una secuencia de nucleótidos al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, al menos aproximadamente 99%, o 100% idéntica a la secuencia de nucleótidos CTTGATAATGAAAAGTCAAACGGAACAATCATTCACGTGAAGGGCAAGCACCT CTGTCCGTCACCCTTGTTCCC TGGTCCATCCAAGCCA (SEQ ID NO: 82) o un fragmento de la misma. En algunas realizaciones, un dominio o región "extracelular" o "bisagra" o "espaciador" está codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 82 o un fragmento de la misma.
En algunas realizaciones, un dominio o región "extracelular" o "bisagra" o "espaciador" comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, al menos aproximadamente 99% o 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos FVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYI WAPLAGTCGVLLLSLVITLY CNHRN (SEQ ID NO: 17) o un fragmento de la misma. En algunas realizaciones, un dominio o región "extracelular" o "bisagra" o "espaciador" comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 17 o un fragmento de la misma.
En algunas realizaciones, un dominio o región "extracelular" o "bisagra" o "espaciador" está codificado por una secuencia de nucleótidos al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, al menos aproximadamente 99%, o 100% idéntica a la secuencia de nucleótidos TTCGTGCCTGTTTTTCTGCCCGCGAAACCCACAACTACCCCCGCCCCTCGGCCCC CAACTCCTGCACCAACTATCGCTTCCCAACCCCTGTCTCTGAGACCTGAGGCAT GCCGCCCCGCGGCAGGCGGCGCCGTGCACACTAGAGGCCTGGACTTCGCCTGC GATATTTATATCTGGGCCCCCCTTGCCGGGACATGCGGGGTACTGCTGCTGTCT CTGGTGATTACCCTCTACT-GCAACCACAGAAAC (SEQ ID NO: 16) o un fragmento de la misma. En algunas realizaciones, un dominio o región "extracelular" o "bisagra" o "espaciador" está codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 16 o un fragmento de la misma.
En algunas realizaciones, un dominio o región "extracelular" o "bisagra" o "espaciador" comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, al menos aproximadamente 99% o 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos FVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD (SEQ ID NO: 85) o un fragmento de la misma. En algunas realizaciones, un dominio o región "extracelular" o "bisagra" o "espaciador" comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 85 o un fragmento de la misma.
En algunas realizaciones, un dominio o región "extracelular" o "bisagra" o "espaciador" comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, al menos aproximadamente 99% o 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIY (SEQ ID NO: 93) o un fragmento de la misma. En algunas realizaciones, un dominio o región "extracelular" o "bisagra" o "espaciador" comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 85 o un fragmento de la misma.
En algunas realizaciones, un dominio o región "extracelular" o "bisagra" o "espaciador" está codificado por una secuencia de nucleótidos al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, al menos aproximadamente 99%, o 100% idéntica a la secuencia de nucleótidos
TTCGTGCCTGTTTTTCTGCCCGCGAAACCCACAACTACCCCCGCCCCTCGGCCCC CAACTCCTGCACCAACTATCGCTTCCCAACCCCTGTCTCTGAGACCTGAGGCAT GCCGCCCCGCGGCAGGCGGCGCCGTGCACACTAGAGGCCTGGACTTCGCCTGC GAT (SEQ ID NO: 84 ) o un fragmento de la misma. En algunas realizaciones, un dominio o región "extracelular" o "bisagra" o "espaciador" está codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 84 o un fragmento de la misma.
En algunas realizaciones, el dominio de CD28T se deriva de una región bisagra de CD28T humana y puede comprender la SEQ ID NO: 15. En otras realizaciones, el dominio de CD28T se deriva de la región bisagra de CD28T de un roedor, murino o primate (p. ej., primate no humano). En algunas realizaciones, el dominio de CD28T se deriva de una región bisagra de CD28T quimérica.
En algunas realizaciones, el dominio de CD28T se deriva de una región bisagra de CD28T humana y puede comprender la SEQ ID NO: 83. En otras realizaciones, el dominio de CD28T se deriva de la región bisagra de CD28T de un roedor, murino o primate (p. ej., primate no humano). En algunas realizaciones, el dominio de CD28T se deriva de una región bisagra de CD28T quimérica.
En algunas realizaciones, el dominio de CD8 se deriva de una región bisagra de CD8 humana y puede comprender la SEQ ID NO: 17. En otras realizaciones, el dominio de CD8 se deriva de la región bisagra de CD28 de un roedor, murino o primate (p. ej., primate no humano). En algunas realizaciones, el dominio de CD8 se deriva de una región bisagra de CD8 quimérica.
En algunas realizaciones, el dominio de CD8 se deriva de una región bisagra de CD8 humana y puede comprender la SEQ ID NO: 85. En otras realizaciones, el dominio de CD8 se deriva de la región bisagra de CD28 de un roedor, murino o primate (p. ej., primate no humano). En algunas realizaciones, el dominio de CD8 se deriva de una región bisagra de CD8 quimérica.
En algunas realizaciones, un dominio extracelular comprende parte o la totalidad de un miembro de la familia de las inmunoglobulinas tales como IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgD, IgE, IgM o un fragmento de las mismas.
Opcionalmente, un péptido o polipéptido enlazador corto, preferiblemente de entre 2 y 10 aminoácidos de longitud, puede formar el enlace entre el dominio de bisagra y el dominio de unión al antígeno, o entre el dominio de bisagra y un dominio transmembrana de un CAR. Opcionalmente, un enlazador oligopéptido o polipéptido corto, preferiblemente de entre 2 y 10 aminoácidos de longitud, puede formar el enlace. Un doblete de glicina-serina (GS), un triplete de glicina-serina-glicina (GSG) o un triplete de alanina-alanina-alanina (AAA) proporcionan un enlazador particularmente adecuado.
IV.B. Dominio transmembrana
Un CAR o TCR de la presente divulgación puede comprender además un dominio transmembrana. Puede diseñarse un dominio transmembrana para fusionarse con el dominio de bisagra. De manera similar, se puede fusionar con un dominio intracelular, tal como un dominio coestimulador. En una realización, se puede usar un dominio transmembrana que naturalmente está asociado con uno de los dominios en un CAR. Por ejemplo, un dominio transmembrana puede comprender la región transmembrana natural de un dominio coestimulador (p. ej., la región TM de un CD28T o 4-1BB empleado como dominio coestimulador) o el dominio transmembrana natural de una región bisagra (p. ej., la región TM de un CD8 alfa o CD28T empleado como dominio de bisagra).
En algunos casos, el dominio transmembrana puede seleccionarse o modificarse mediante sustitución de aminoácidos para evitar la unión de dichos dominios a los dominios transmembrana de las mismas proteínas de membrana de superficie o diferentes para minimizar las interacciones con otros miembros del complejo receptor. Un dominio transmembrana puede derivarse de una fuente natural o sintética. Cuando el dominio transmembrana se deriva de una fuente de origen natural, el dominio se puede derivar de cualquier proteína transmembrana o unida a la membrana. En algunas realizaciones, un dominio transmembrana se deriva de CD2, CD3 delta, CD3 épsilon, CD3 gamma, CD4, CD7, CD8a, CD8p, CD11a (ITGAL), CD11b (ITGAM), CD11c (ITGAX), CD11d (ITGAD), CD18 (ITGB2), CD19 (B4), CD27 (TNFRSF7), CD28, CD28T, CD29 (ITGB1), CD30 (TNFRSF8), CD40 (TNFRSF5), CD48 (SLAMF2), CD49a (ITGA1), CD49d (ITGA4), CD49f ( ITGA6), CD66a (CEACAM1), CD66b (CEACAM8), CD66c (CEACAM6), CD66d (CEACAM3), CD66e (CEACAM5), CD69 (CLEC2), c D79A (cadena alfa asociada al complejo del receptor del antígeno de células B), CD79B (cadena beta asociada al complejo del receptor del antígeno de células B), CD84 (SLAMF5), CD96 (táctil), CD100 (SEMA4D), CD103 (ITGAE), CD134 (OX40), CD137 (4-1BB), CD150 (SLAMF1), CD158A ( KIR2DL1), CD158B1 (KIR2DL2), CD158B2 (KIR2DL3), CD158C (KIR3DP1), CD158D (KIRDL4), CD158F1 (KIR2DL5A), CD158F2 (KIR2DL5B), CDPL (CD158K) DNAM1), CD229 (SLAMF3), CD244 (SLAMF4), CD247 (CD3-zeta), CD258 (LIGHT), CD268 (BAFFR), CD270 (TNFSF14), CD272 (BTLA), CD276 (B7-H3), CD279 (PD-1), CD314 (NKG2D), CD319 (SLAMF7), CD335 (NK-p46), CD336 (NK-p44), CD337 (NK-p30), CD352 (SLAMF6), CD353 (SLAMF8), CD355 (CRTAM), CD357 (TNFRSF18), coestimulador inducible de células T (ICOS), LFA-1 (CD11a/CD18), NKG2C, DAP-10, ICAM-1, NKp80 (KLRF1), IL-2R beta, IL-2R gamma, IL-7R alfa, LFA-1, SLAMF9, LAT, GADS (GrpL), SLP-76 (LCP2), PAG1/CBP, un ligando de CD83, receptor Fc gamma, molécula del MHC de clase 1, molécula del MHC de clase 2, una proteína receptora de TNF, una proteína inmunoglobulina, un receptor de citocina, una integrina, receptores de células NK activadoras, un receptor de ligando Toll y combinaciones de los mismos.
En algunas realizaciones, un dominio transmembrana puede comprender una secuencia que se extiende por una membrana celular, pero se extiende al citoplasma de una célula y/o al espacio extracelular. Por ejemplo, un dominio transmembrana puede comprender una secuencia que atraviesa la membrana que en sí misma puede comprender además 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más aminoácidos que se extienden al citoplasma de una célula, y/o el espacio extracelular. Por tanto, un dominio transmembrana comprende una región que atraviesa la membrana, pero puede comprender además uno o más aminoácidos que se extienden más allá de la superficie interna o externa de la propia membrana; tales secuencias todavía se pueden considerar como un "dominio transmembrana".
En una realización, un dominio transmembrana de un CAR de la presente divulgación comprende el dominio transmembrana de CD28T. En una realización, el dominio transmembrana de CD28T comprende la porción transmembrana de la proteína codificada por la secuencia de ácido nucleico:
CTTGATAATGAAAAGTCAAACGGAACAATCATTCACGTGAAGGGCAAGCACCT
CTGTCCGTCACCCTTGTTCCCTGGTCCATCCAAGCCATTCTGGGTGTTGGTCGTA
GTGGGTGGAGTCCTCGCTTGTTACTCTCTGCTCGTCACCGTGGCTTTTATAATCT
TCTGGGTT (SEQ ID NO: 14).
Por ejemplo, un dominio transmembrana puede estar codificado por una secuencia de ácido nucleico que comprende la secuencia de ácido nucleico
TTCTGGGTGTTGGTCGTAGTGGGTGGAGTCCTCGCTTGTTACTCTCTGCTCGTCA
CCGTGGCTTTTATAATCTTCTGGGTT (SEQ ID NO: 18).
En otra realización, el dominio transmembrana de CD28T comprende la secuencia de aminoácidos transmembrana contenida dentro de la secuencia de aminoácidos:
LDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV
(SEQ ID NO: 15).
Por ejemplo, un dominio transmembrana puede comprender la secuencia de aminoácidos FWVLVVVGGVLACY-SLLVTVAFIIFWV (SEQ ID NO: 19).
En una realización, un dominio transmembrana de un CAR de la presente divulgación comprende el dominio transmembrana de CD8. En una realización, el dominio transmembrana de CD8 comprende la porción transmembrana de la proteína codificada por la secuencia de ácido nucleico:
TTCGTGCCTGTTTTTCTGCCCGCGAAACCCACAACTACCCCCGCCCCTCGGCCCC
CAACTCCTGCACCAACTATCGCTTCCCAACCCCTGTCTCTGAGACCTGAGGCAT
GCCGCCCCGCGGCAGGCGGCGCCGTGCACACTAGAGGCCTGGACTTCGCCTGC
GATATTTATATCTGGGCCCCCCTTGCCGGGACATGCGGGGTACTGCTGCTGTCT
CTGGTGATTACCCTCTACTGCAACCACAGAAAC (SEQ ID NO: 16).
Por ejemplo, un dominio transmembrana puede estar codificado por una secuencia de ácido nucleico que comprende la secuencia de ácido nucleico
ATTTATATCTGGGCCCCCCTTGCCGGGACATGCGGGGTACTGCTGCTGTCTCTG
GTGATTACC (SEQ ID NO: 20).
En otra realización, el dominio transmembrana de CD8 comprende la secuencia de aminoácidos transmembrana contenida dentro de la secuencia de aminoácidos:
FYPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYI
WAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRN (SEQ ID NO: 17).
Por ejemplo, un dominio transmembrana puede comprender la secuencia de aminoácidos IYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT (SEQ ID NO: 21).
En algunas realizaciones, un dominio transmembrana es un dominio transmembrana de CD28T. En algunas realizaciones, el dominio transmembrana comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, al menos aproximadamente 99% o 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFNFWV (SEQ ID NO: 19).
En algunas realizaciones, el dominio transmembrana comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 19.
En algunas realizaciones, el dominio transmembrana de CD28T está codificado por una secuencia de nucleótidos al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, al menos aproximadamente 99% o 100% idéntico a la secuencia de nucleótidos
TTCTGGGTGTTGGTCGTAGTGGGTGGAGTCCTCGCTTGTTACTCTCTGCTCGTCA
CCGTGGCTTTTATAATCTTCTGGGTT (SEQ ID NO: 18).
En algunas realizaciones, el dominio transmembrana está codificado por una secuencia de ácido nucleico que comprende la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 18.
En otra realización, un dominio transmembrana es un dominio transmembrana de CD8. En algunas realizaciones, el dominio transmembrana comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, al menos aproximadamente 99% o 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos IYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT (SEQ ID NO: 21).
En algunas realizaciones, el dominio transmembrana comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 21.
En otra realización, un dominio transmembrana es un dominio transmembrana de CD8. En algunas realizaciones, el dominio transmembrana comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, al menos aproximadamente 99% o 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos IWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC (SEQ ID NO: 94).
En algunas realizaciones, el dominio transmembrana comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 94.
En algunas realizaciones, el dominio transmembrana de CD8 está codificado por una secuencia de nucleótidos al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, al menos aproximadamente 99% o 100% idéntico a la secuencia de nucleótidos
ATTTATATCTGGGCCCCCCTTGCCGGGACATGCGGGGTACTGCTGCTGTCTCTG
GTGATTACC (SEQ ID NO: 20).
En algunas realizaciones, el dominio transmembrana está codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 20.
Como se indica en el presente documento, los diversos dominios de un CAR de la presente divulgación pueden comprender opcionalmente aminoácidos además de las secuencias proporcionadas en el presente documento. Por ejemplo, un dominio transmembrana puede comprender aminoácidos que extienden el dominio hacia el citoplasma y/o el espacio extracelular, que pueden ocurrir naturalmente en la molécula de la que se deriva el dominio transmembrana. Por consiguiente, en algunas realizaciones, un dominio transmembrana de CD8 comprende además la secuencia de aminoácidos contigua LYCNHRN (SEQ ID NO: 87), codificada por la secuencia de ácido nucleico CTCTACTGCAACCACAGAAAC (SEQ ID NO: 86), y que extiende el dominio transmembrana en el citoplasma o espacio intracelular.
Opcionalmente, un péptido o polipéptido enlazador corto, preferiblemente de entre 2 y 10 aminoácidos de longitud, puede formar el enlace entre el dominio transmembrana y un dominio de señalización citoplásmico proximal del CAR, tal como un dominio coestimulador o de activación, o un molécula de unión al antígeno (p. ej., un scFv anti-CD70). Opcionalmente, un enlazador oligopéptido o polipéptido corto, preferiblemente de entre 2 y 10 aminoácidos de longitud, puede formar el enlace. Un doblete de glicina-serina (GS), un triplete de glicina-serina-glicina (GSG) o un triplete de alanina-alanina-alanina (AAA) proporcionan un enlazador particularmente adecuado.
IV.C. Dominio coestimulador
En algunas realizaciones, la presente divulgación comprende un CAR, en el que el CAR comprende una molécula de unión al antígeno que se une específicamente a CD70 (una o más moléculas de unión a antígeno proporcionadas en este documento, en las Figuras y en el Listado de secuencias adjunto), y en el que el CAR comprende además un dominio coestimulador. En algunas realizaciones, se coloca un dominio coestimulador entre una molécula de unión al antígeno (p. ej., un scFv) y un dominio de activación. En algunas realizaciones, un dominio coestimulador puede comprender, pero no es necesario, un dominio extracelular y/o un dominio transmembrana, además de un dominio de señalización intracelular. En algunas realizaciones, un dominio coestimulador puede comprender un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular. En algunas realizaciones, un dominio coestimulador puede comprender un dominio extracelular y un dominio transmembrana. En algunas realizaciones, un dominio coestimulador puede comprender un dominio de señalización intracelular. Un CAR, TCR o célula T modificada de la presente divulgación puede comprender uno, dos o tres dominios coestimuladores, que pueden configurarse en serie o flanqueando uno o más de otros componentes del CAR.
Un dominio coestimulador de los CAR, TCR y linfocitos T modificados genéticamente descritos en el presente documento puede proporcionar señalización a un dominio de activación, que luego activa al menos una de las funciones efectoras normales de la célula inmunitaria. La función efectora de una célula T, p. ej., puede ser actividad citolítica o actividad auxiliar, incluida la secreción de citocinas.
En algunas realizaciones, los dominios coestimuladores adecuados incluyen (es decir, comprenden), pero no se limitan a CD2, CD3 delta, CD3 épsilon, CD3 gamma, CD4, CD7, CD8a, CD8|3, CD11a (ITGAL), CD11b (ITGAM), CD11c (ITGAX), CD11d (ITGAD), CD18 (ITGB2), CD19 (B4), CD27 (TNFRSF7), CD28, CD28T, CD29 (ITGB1), CD30 (TNFRSF8), CD40 (TNFRSF5), CD48 (SLAMF2), CD49a (ITGA1), CD49d (ITGA4), CD49f (ITGA6), CD66a (CEACAM1), CD66b (CEACAM8), CD66c (CEACAM6), CD66d (CEACAM3), CD66e (CEACAM5), CD69 (CLEC2), CD79A (cadena alfa asociada al complejo del receptor del antígeno de células B), CD79B (cadena beta asociada al complejo del receptor del antígeno de células B), CD84 (SLAMF5), CD96 (Tactile), CD100 (SEMA4D), CD103 (ITGAE), CD134 (OX40), CD137 ( 4-1BB), CD150 (SLAMF1), CD158A (KIR2DL1), CD158B1 (KIR2DL2), CD158B2 (KIR2DL3), CD158C (KIR3DP1), CD158D (KIRDL4), CD158F1 (KIR2D158D5A) CD160 (BY55), CD162 (SELPLG), CD226 (DNAM1), CD229 (SLAMF3), CD244 (SLAMF4), CD247 (CD3-zeta), CD258 (LIGHT), CD268 (BAFFR), CD2 70 (TNFSF14), CD272 (BTLA), CD276 (B7-H3), CD279 (PD-1), CD314 (NKG2D), CD319 (SLAMF7), CD335 (NK-p46), CD336 (NK-p44), CD337 (NK-p30), CD352 (SLAMF6), CD353 (SLAMF8), CD355 (CRTAM), CD357 (TNFRSF18), coestimulador de células T inducible (ICOS), LFA-1 (CD11a/CD18), NKG2C, DAP-10, ICAM-1, NKp80 (KLRF1), IL-2R beta, IL-2R gamma, IL-7R alfa, LFA-1, SLAMF9, LAT, GADS (GrpL), SLP-76 (LCP2), PAG1/CBP, un ligando de CD83, receptor de Fc gamma, molécula del MHC de clase 1, molécula del MHC de clase 2, una proteína receptora de TNF, una proteína de inmunoglobulina, un receptor de citocina, una integrina, receptores de células NK activadores, un receptor del ligando Toll y fragmentos o combinaciones de los mismos.
Un ejemplo de una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio coestimulador se expone en la SEQ ID NO. 22:
AGATCCAAAAGAAGCCGCCTGCTCCATAGCGATTACATGAATATGACTCCACGC
CGCCCTGGCCCCACAAGGAAACACTACCAGCCTTACGCACCACCTAGAGATTTC
GCTGCCTATCGGAGC
En una realización, el polinucleótido que codifica el dominio de señalización coestimuladora comprende una secuencia de nucleótidos al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 65%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, al menos aproximadamente 99% o aproximadamente 100% idéntica a la secuencia de nucleótidos de
AGATCCAAAAGAAGCCGCCTGCTCCATAGCGATTACATGAATATGACTCCACGC
CGCCCTGGCCCCACAAGGAAACACTACCAGCCTTACGCACCACCTAGAGATTTC
GCTGCCTATCGGAGC (SEQ ID NO: 22).
Un ejemplo de un dominio de señalización coestimulador es RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRD FAAYRS (SEQ ID NO. 23).
En algunas realizaciones, el dominio de señalización intracelular dentro de un dominio coestimulador comprende una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, al menos aproximadamente 99% o aproximadamente 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos de RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS (SEQ ID NO: 23).
Otro ejemplo de una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio de señalización intracelular es
CGCTTTTCCGTCGTTAAGCGGGGGAGAAAAAAGCTGCTGTACATTTTCAAACAG
CCGTTTATGAGGCCGGTCCAAACGACTCAGGAAGAAGACGGCTGCTCCTGCCG
CTTTCCTGAGGAGGAGGAGGGCGGGTGCGAACTG (SEQ ID NO. 24).
En una realización, el polinucleótido que codifica un dominio de señalización coestimulador comprende una secuencia de nucleótidos al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 65%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, al menos aproximadamente 99% o aproximadamente 100% idéntica a la secuencia de nucleótidos de
CGCTTTTCCGTCGTTAAGCGGGGGAGAAAAAAGCTGCTGTACATTTTCAAACAG
CCGTTTATGAGGCCGGTCCAAACGACTCAGGAAGAAGACGGCTGCTCCTGCCG
CTTTCCTGAGGAGGAGGAGGGCGGGTGCGAACTG (SEQ ID NO: 24).
Otro ejemplo de un dominio de señalización intracelular se expone en la SEQ ID NO. 25: RFSVVKRGRKKLLYIFKQPF-MRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL.
En algunas realizaciones, un dominio de señalización intracelular comprende una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, al menos aproximadamente 99% o aproximadamente 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos de RFSVVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL (SEQ ID NO: 25).
Una secuencia de señalización coestimuladora de un CAR de la presente divulgación se puede unir directamente a otro dominio coestimulador, a un dominio de activación, a un dominio transmembrana u otro componente del CAR en un orden aleatorio o especificado. Opcionalmente, un enlazador oligopéptido o polipéptido corto, preferiblemente de entre 2 y 10 aminoácidos de longitud, puede formar el enlace. Un doblete de glicina-serina (GS), un triplete de glicinaserina-glicina (GSG) o un triplete de alanina-alanina-alanina (AAA) proporcionan un enlazador particularmente adecuado.
Se observa además que se pueden incorporar múltiples dominios coestimuladores en un CAR o TCR de la presente divulgación. Por ejemplo, un dominio coestimulador de CD28T y un dominio coestimulador de 4-1BB pueden incorporarse en un CAR o TCR de la presente divulgación y, en virtud del componente de unión a antígeno del CAR o TCR, seguir dirigiéndose contra CD70 y células que expresan CD70 en sus superficies.
IV.D Dominio de activación
En algunas realizaciones, los dominios intracelulares para su uso en las células T modificadas de la divulgación incluyen secuencias citoplasmáticas del receptor de células T (TCR) y correceptores que actúan en conjunto para iniciar la transducción de señales después de la participación del antígeno/receptor, también como cualquier derivado o variante de estas secuencias y cualquier secuencia sintética que tenga la misma capacidad funcional. El CD3 es un elemento del receptor de linfocitos T en los linfocitos T nativos y se ha demostrado que es un elemento activador intracelular importante en los CAR. En una realización, el dominio de activación es CD3, p. ej., CD3 zeta, cuya secuencia de nucleótidos se expone en la SEQ ID NO: 26:
AGGGT GA AGTTTTC C AGATCTGC AGAT GC AC C AGC GT ATC AGC AGGGC CAGA A
CC AACTGT AT AACGAGCTC AACCTGGGACGC AGGGAAGAGT AT GACGTTTT GG
ACAAGCGCAGAGGACGGGACCCTGAGATGGGTGGCAAACCAAGACGAAAAAA
CCCCCAGGAGGGTCTCTATAATGAGCTGCAGAAGGATAAGATGGCTGAAGCCT
AT TC T GA A AT AGGC AT G A A AGGAGAGC GGAGA AGGGGA A A AGGGC AC GAC GG
TTTGTACCAGGGACTCAGCACTGCTACGAAGGATACTTATGACGCTCTCCACAT
GCAAGCCCTGCCACCTAGG.
En algunas realizaciones, el polinucleótido que codifica un dominio de activación comprende una secuencia de nucleótidos al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 65%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, al menos aproximadamente 99% o aproximadamente 100% idéntica a la secuencia de nucleótidos de
AGGGT GA AGTTTTC C AGATCTGC AGAT GC AC C AGC GT ATC AGC AGGGC CAGA A
CC AACTGT AT AACGAGCTC AACCTGGGACGC AGGGAAGAGT AT GACGTTTT GG
ACA AGC GC AGAGGACGGGACC CTG AGAT GGGT GGC A A AC C A AGAC GA A A A A A
CCCCC AGGAGGGTCTCT AT AATGAGCTGC AGAAGGAT AAGAT GGCTGAAGCCT
ATTCTGAAATAGGCATGAAAGGAGAGCGGAGAAGGGGAAAAGGGCACGACGG
TTTGTACCAGGGACTCAGCACTGCTACGAAGGATACTTATGACGCTCTCCACAT
GCAAGCCCTGCCACCTAGG (SEQ ID NO: 26).
El aminoácido correspondiente de CD3 zeta intracelular es
RVKF SRS AD APAYQQGQNQL YNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNP
QEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQ
ALPPR (SEQ ID NO: 27).
En algunas realizaciones, el dominio de activación comprende una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, al menos aproximadamente 99% o aproximadamente 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos de:
RVKF SRS AD APAYQQGQNQL YNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNP
QEGLYNELQKDKMAEAY SEIGMKGERRRGKGHDGL Y QGLST ATKDT YD ALHMQ
ALPPR (SEQ ID NO: 27).
En algunas realizaciones, el dominio de activación comprende una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, al menos aproximadamente 99% o aproximadamente 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos de:
RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNP
QEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYD ALHMQ
ALPPR (SEQ ID NO: 92).
IV.E. Péptido guía
En algunas realizaciones, un polinucleótido de la presente divulgación codifica un CAR o un TCR, en el que el CAR o el TCR comprende una molécula de unión al antígeno que se une específicamente a CD70, y en el que el CAR o el TCR comprende además un péptido guía (también denominado en el presente documento "péptido señal" o "secuencia señal"). La inclusión de una secuencia de señal en un CAR o TCR de la presente divulgación es opcional. Si se incluye una secuencia guía en un CAR o TCR de la presente divulgación, puede expresarse en el terminal N del CAR o TCR. Por tanto, una secuencia guía puede asociarse con el componente VH o VL de una molécula de unión al antígeno de un CAR o TCR de la presente divulgación, dependiendo de qué dominio esté en el terminal N del CAR o TCR.
Si se desea incluir una secuencia guía, dicha secuencia guía puede sintetizarse o puede derivarse de una molécula de origen natural. Por ejemplo, la secuencia guía de 21 residuos de origen natural de CD8 (véase, p. ej., Littman et al., (1985) Cell 40: 237-46) se puede emplear como secuencia guía en los constructos CAR y TCR divulgados.
Por tanto, en algunas realizaciones, el péptido guía comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, al menos aproximadamente 99% o 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos MALPVTALLLPLALLLHAARP (SEQ ID NO: 28).
En algunas realizaciones, el péptido señal comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 28. En algunas realizaciones, el péptido guía está codificado por una secuencia de nucleótidos al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 65%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, al menos aproximadamente 99%, o aproximadamente el 100% idéntico a
ATGGCACTCCCCGTAACTGCTCTGCTGCTGCCGTTGGCATTGCTCCTGCACGCCG
CACGC (SEQ ID NO: 95).
En algunas realizaciones, el polinucleótido de la presente divulgación codifica un CAR, en el que el CAR comprende un péptido guía (P), una molécula de unión al antígeno tal como un scFv que se asocia con CD70 (B) humano, un dominio de bisagra (H), un dominio transmembrana (T), una o más regiones coestimuladoras (C) y un dominio de activación (A), en el que el CAR se configura de acuerdo con lo siguiente: P-B-H-T-C-A. En algunas realizaciones, los componentes del CAR se unen opcionalmente a través de una secuencia enlazadora, como AAA o GSG. En algunas realizaciones, la molécula de unión al antígeno comprende una VH y una VL, en el que el CAR se configura de acuerdo con lo siguiente: P-VH-VL-H-T-C-A o P-VL-VH-H-T-C-A. En algunas realizaciones, la VH y la VL están conectadas por un enlazador (L) tal como la SEQ ID NO: 80 u 81, en el que el CAR está configurado de acuerdo con lo siguiente, desde el terminal N al terminal C: P-VH-L-VL-H-T-C-A o P-VH-L-VL-H-T-C-A.
En algunas realizaciones, un polinucleótido de la presente divulgación codifica un CAR, en el que el CAR comprende una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, al menos aproximadamente 99% o 100% idéntica a una secuencia de aminoácidos mostrada en las Figuras 8A-8L y en la Tabla 2. En algunas realizaciones, un polinucleótido de la presente divulgación codifica un CAR, en el que el CAR comprende una secuencia de aminoácidos mostrada en las Figuras 8A-8L y en la Tabla 2.
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En algunas realizaciones, un polinucleótido de la presente divulgación codifica un CAR, en el que el CAR comprende una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, al menos aproximadamente 99% o 100% idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50 y 52. En algunas realizaciones, el CAR comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50 y 52. En una realización, el CAR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 30. En otra realización, el CAR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 32. En otra realización, el CAR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 34. En otra realización, el CAR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 36. En otra realización, el CAR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 38. En otra realización, el CAR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 40. En otra realización, el CAR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 42. En otra realización, el CAR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 44. En otra realización, el CAR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 46. En otra realización, el CAR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 48. En otra realización, el CAR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 50. En otra realización, el CAR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 52.
En algunas realizaciones, un polinucleótido de la presente divulgación que codifica un CAR comprende una secuencia de nucleótidos al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 65%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, al menos aproximadamente 99% o 100% idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49 y 51. En algunas realizaciones, el polinucleótido comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 29. En una realización, el polinucleótido comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 31. En otra realización, el polinucleótido comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 33. En otra realización, el polinucleótido comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 35. En otra realización, el polinucleótido comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 37. En otra realización, el polinucleótido comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 39. En otra realización, el polinucleótido comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 41. En otra realización, el polinucleótido comprende el secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 43. En otra realización, el polinucleótido comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 45. En otra realización, el polinucleótido comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 47. En otra realización, el polinucleótido comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 49. En otra realización, el polinucleótido comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 51.
IV. Vectores, células y composiciones farmacéuticas
En algunos aspectos, se proporcionan en este documento vectores que comprenden un polinucleótido de la presente divulgación. En algunas realizaciones, la presente divulgación se dirige a un vector o un conjunto de vectores que comprenden un polinucleótido que codifica un CAR o un TCR, como se describe en el presente documento. En otras realizaciones, la presente divulgación se dirige a un vector o un conjunto de vectores que comprenden un polinucleótido que codifica un anticuerpo o una molécula de unión al antígeno del mismo que se une específicamente a CD70, como se describe en el presente documento.
Cualquier vector conocido en la técnica puede ser adecuado para la presente divulgación. En algunas realizaciones, el vector es un vector viral. En algunas realizaciones, el vector es un vector retroviral, un vector de ADN, un vector del virus de la leucemia murina, un vector de SFG, un plásmido, un vector de ARN, un vector adenoviral, un vector baculoviral, un vector viral de Epstein Barr, un vector papovaviral, un vector viral de vaccinia, un vector viral de herpes simple, un vector asociado a adenovirus (AAV), un vector lentiviral o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones de la presente divulgación se pueden emplear uno, dos o más vectores. Por ejemplo, en una realización, uno o más componentes de un CAR o TCR se pueden disponer en un vector, mientras que uno o más componentes diferentes de un CAR o TCR se pueden disponer en un vector diferente.
En otros aspectos, se proporcionan en este documento células que comprenden un polinucleótido o un vector de la presente divulgación. En algunas realizaciones, la presente divulgación está dirigida a células huésped, tales como células in vitro, que comprenden un polinucleótido que codifica un CAR o un TCR, como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, la presente divulgación está dirigida a células huésped, p. ej., células in vitro, que comprenden un polinucleótido que codifica un anticuerpo o una molécula de unión al antígeno del mismo que se une específicamente a CD70, como se divulga en el presente documento.
En otras realizaciones, la presente divulgación se dirige a células in vitro que comprenden un polipéptido codificado por un polinucleótido que codifica un CAR o un TCR, como se describe en el presente documento. En otras realizaciones, la presente divulgación se dirige a células, células in vitro, que comprenden un polipéptido codificado por un polinucleótido que codifica una molécula de unión al antígeno que se une específicamente a CD70, como se divulga en el presente documento.
Se puede usar cualquier célula como célula huésped para los polinucleótidos, los vectores o los polipéptidos de la presente divulgación. En algunas realizaciones, la célula puede ser una célula procariota, una célula fúngica, una célula de levadura o células eucariotas superiores, tal como una célula de mamífero. Las células procariotas adecuadas incluyen, sin limitación, eubacterias, tales como organismos gramnegativos o grampositivos, p. ej., Enterobacteriaceae tales como Escherichia, p. ej., E. coli; Enterobacter; Erwinia; Klebsiella; Proteo; Salmonella, p. ej., Salmonella typhimurium; Serratia, p. ej., Serratia marcescans y Shigella; Bacilos tales como B. subtilis y B. licheniformis; Pseudomonas tales como P. aeruginosa; y Streptomyces. En algunas realizaciones, la célula huésped es una célula humana. En algunas realizaciones, la célula es una célula inmunitaria. En algunas realizaciones, la célula inmunitaria se selecciona del grupo que consiste en una célula T, una célula B, un linfocito infiltrante de tumor (TIL), una célula que expresa TCR, una célula asesina natural (NK), una célula dendrítica, un granulocito, una célula linfoide innata, un megacariocito, un monocito, un macrófago, una plaqueta, un timocito y una célula mieloide. En una realización, la célula inmunitaria es una célula T. En otra realización, la célula inmunitaria es una célula NK. En algunas realizaciones, la célula T es un linfocito infiltrante de tumor (TIL), una célula T autóloga, una célula T autóloga modificada (eACTMR), una célula T alogénica, una célula T heteróloga o cualquier combinación de los mismos.
Se puede obtener una célula de la presente divulgación a través de cualquier fuente conocida en la técnica. Por ejemplo, las células T se pueden diferenciar in vitro a partir de una población de células madre hematopoyéticas, o las células T se pueden obtener de un sujeto. Las células T pueden obtenerse, p. ej., de células mononucleares de sangre periférica, médula ósea, tejido de ganglios linfáticos, sangre del cordón umbilical, tejido del timo, tejido de un sitio de infección, ascitis, derrame pleural, tejido del bazo y tumores. Además, las células T pueden derivarse de una o más líneas de células T disponibles en la técnica. Las células T también pueden obtenerse de una unidad de sangre extraída de un sujeto usando cualquier cantidad de técnicas conocidas por el experto en la materia, tales como separación y/o aféresis de FICOLLMR. En algunas realizaciones, las células recolectadas por aféresis se lavan para eliminar la fracción de plasma y se colocan en un tampón o medio apropiado para su procesamiento posterior. En algunas realizaciones, las células se lavan con PBS. Como se apreciará, se puede usar una etapa de lavado, tal como usando una centrífuga de flujo continuo semiautomatizada, p. ej., el procesador de células c Ob Emr 2991, el Baxter CYTOMATEMR, o similares. En algunas realizaciones, las células lavadas se resuspenden en uno o más tampones biocompatibles u otra solución salina con o sin tampón. En algunas realizaciones, se eliminan los componentes no deseados de la muestra de aféresis. En la publicación de patente de los Estados Unidos N° 2013/0287748 se divulgan métodos adicionales de aislamiento de células T para una terapia con células T.
En algunas realizaciones, las células T se aíslan de las PBMC lisando los glóbulos rojos y agotando los monocitos, p. ej., usando centrifugación a través de un gradiente PERCOLLMR. En algunas realizaciones, una subpoblación específica de linfocitos T, tal como linfocitos T CD28+, CD4+, CD8+, CD45RA+ y CD45RO+, puede aislarse adicionalmente mediante técnicas de selección positiva o negativa conocidas en el arte. Por ejemplo, el enriquecimiento de una población de células T mediante selección negativa se puede lograr con una combinación de anticuerpos dirigidos a marcadores de superficie únicos para las células seleccionadas negativamente. En algunas realizaciones, se puede usar la clasificación y/o selección celular mediante inmunoadherencia magnética negativa o citometría de flujo que usa un cóctel de anticuerpos monoclonales dirigidos a marcadores de superficie celular presentes en las células seleccionadas negativamente. Por ejemplo, para enriquecer las células CD4+ mediante selección negativa, un cóctel de anticuerpos monoclonales incluye típicamente anticuerpos contra CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR y CD8. En algunas realizaciones, se utilizan la citometría de flujo y la clasificación de células para aislar poblaciones de células de interés para su uso en la presente divulgación. Usando estas técnicas estándar, las células T modificadas administradas a un paciente cuando se realizan los métodos proporcionados en este documento pueden comprender cualquier proporción deseada de células. Por ejemplo, puede ser deseable proporcionar solo células CD8+ diseñadas a un paciente, solo células CD4+ modificadas a un paciente, o una proporción deseada de células CD4+ a CD8+, así como igual número de células CD4+ y CD8+.
En algunas realizaciones, las PBMC se usan directamente para la modificación genética con las células inmunes (tales como CAR o TCR) usando métodos como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, después de aislar las PBMC, los linfocitos T se aíslan adicionalmente y los linfocitos T citotóxicos y colaboradores se clasifican en subpoblaciones de células T sin modificar, de memoria y efectoras antes o después de la modificación y/o expansión genética.
En algunas realizaciones, las células CD8+ se clasifican además en células sin modificar, de memoria central y efectoras identificando los antígenos de la superficie celular que están asociados con cada uno de estos tipos de células CD8+. En algunas realizaciones, la expresión de marcadores fenotípicos de las células T de memoria central incluye CD3, CD28, CD44, CD45RO, CD45RA y CD127 y son negativos para la granzima B. En algunas realizaciones, las células T de memoria central son células T CD8+ CD3+, CD28+, CD44alto, CD45ROalto, CD45RAbajo y CD127alto. En algunas realizaciones, las células T efectoras son negativas para CD62L, CCR7, CD28 y CD127 y positivas para granzima B y perforina. En algunas realizaciones, las células T CD4+ se clasifican además en subpoblaciones. Por ejemplo, las células colaboradoras T CD4+ pueden clasificarse en células sin modificar, de memoria central y efectoras identificando poblaciones de células que tienen antígenos de superficie celular.
En algunas realizaciones, las células inmunes, p. ej., las células T, se modifican genéticamente después del aislamiento usando métodos conocidos, o las células inmunes se activan y expanden (o diferencian en el caso de progenitores) in vitro antes de ser modificadas genéticamente. En otra realización, las células inmunes, p. ej., las células T, se modifican genéticamente con los receptores de antígenos quiméricos descritos en este documento (p. ej., se transducen con un vector viral que comprende una o más secuencias de nucleótidos que codifican un CAR) y luego se activan y/o expanden in vitro. Los métodos para activar y expandir células T se conocen en la técnica y se describen, p. ej., en las patentes de Estados Unidos N° 6.905.874; 6.867.041; y 6.797.514; y en la publicación Pc T N° WO 2012/079000. Generalmente, tales métodos incluyen poner en contacto p Bm C o células T aisladas con un agente estimulante y un agente coestimulador, tal como anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28, generalmente unidos a una perla u otra superficie, en un medio de cultivo con citocinas apropiadas, tales como IL-2. Los anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 unidos a la misma perla sirven como una célula presentadora de antígeno (APC) "sustituta". Un ejemplo es el sistema Dynabeads®, un sistema activador/estimulador de CD3/CD28 para la activación fisiológica de células T humanas. En otras realizaciones, las células T se activan y estimulan para que proliferen con células alimentadoras y anticuerpos y citocinas apropiados usando métodos como los descritos en las patentes de los Estados Unidos N° 6.040.177 y 5.827.642 y la publicación PCT N° WO 2012/129514.
En algunas realizaciones, las células T se obtienen de un sujeto donante. En algunas realizaciones, el sujeto donante es un paciente humano que padece un cáncer o un tumor. En otras realizaciones, el sujeto donante es un paciente humano que no padece un cáncer o un tumor. En otra realización, las células T se derivan de células madre pluripotentes mantenidas en condiciones favorables para la diferenciación de las células madre en células T.
Otros aspectos de la presente divulgación están dirigidos a composiciones que comprenden un polinucleótido proporcionado en el presente documento, un vector proporcionado en el presente documento, un polipéptido proporcionado en el presente documento, o una célula in vitro proporcionada en el presente documento. En algunas realizaciones, la composición comprende un vehículo, diluyente, solubilizante, emulsionante, conservante y/o adyuvante farmacéuticamente aceptable. En algunas realizaciones, la composición comprende un excipiente. En una realización, la composición comprende un polinucleótido que codifica un CAR o un TCR, en el que el CAR o el TCR comprende una molécula de unión al antígeno que se une específicamente a CD70. En otra realización, la composición comprende un CAR o un TCR codificado por un polinucleótido proporcionado en el presente documento, en el que el CAR o el TCR comprende una molécula de unión al antígeno que se une específicamente a CD70. En otra realización, la composición comprende una célula T que comprende un polinucleótido que codifica un CAR o un TCR, en el que el CAR o el TCR comprende una molécula de unión al antígeno que se une específicamente a CD70. En otra realización, la composición comprende un anticuerpo o una molécula de unión al antígeno del mismo codificada por un polinucleótido proporcionado en el presente documento. En otra realización, la composición comprende una célula in vitro que comprende un polinucleótido que codifica un anticuerpo o una molécula de unión al antígeno del mismo codificada por un polinucleótido proporcionado en el presente documento. En otra realización, la composición comprende un CAR o un TCR proporcionado en el presente documento, en el que el CAR o el TCR comprende un componente que comprende una molécula de unión al antígeno que se une específicamente a CD70.
En algunas realizaciones, la composición incluye más de un CAR diferente o el TCR que comprende un componente que comprende una molécula de unión al antígeno que se une específicamente a CD70. En algunas realizaciones, la composición incluía más de un CAR o el TCR que comprende un componente que comprende una molécula de unión al antígeno que se une específicamente a CD70, en el que las moléculas de unión a antígeno para CD70 se unen a más de un epítopo. En algunas realizaciones, los CAR o los TCR que comprenden un componente que comprende una molécula de unión al antígeno que se une específicamente a CD70 no competirán entre sí por la unión a CD70. En algunas realizaciones, cualquiera de los CAR o TCR que comprenden un componente que comprende una molécula de unión al antígeno que se une específicamente a CD70 proporcionados en el presente documento se combinan en una composición farmacéutica.
En otras realizaciones, la composición se selecciona para administración parenteral. La preparación de tales composiciones farmacéuticamente aceptables está dentro de la capacidad de un experto en la técnica. En algunas realizaciones, se usan tampones para mantener la composición a pH fisiológico o a un pH ligeramente más bajo, típicamente dentro de un intervalo de pH de aproximadamente 5 a aproximadamente 8. En algunas realizaciones, cuando se contempla la administración parenteral, la composición está en forma de una solución acuosa parenteralmente aceptable libre de pirógenos que comprende un CAR deseado o el TCR que comprende un componente que comprende una molécula de unión al antígeno que se une específicamente a CD70, con o sin agentes terapéuticos adicionales, en un vehículo farmacéuticamente aceptable. En algunas realizaciones, el vehículo para inyección parenteral es agua destilada estéril en la que un CAR o el TCR que comprende un componente que comprende una molécula de unión al antígeno que se une específicamente a CD70, con o sin al menos un agente terapéutico adicional, se formula como una solución isotónica estéril, debidamente conservada. En algunas realizaciones, la preparación implica la formulación del CAR deseado o el TCR que comprende un componente que comprende una molécula de unión al antígeno que se une específicamente a CD70 con compuestos poliméricos (tales como ácido poliláctico o ácido poliglicólico), perlas o liposomas, que proporcionan la liberación controlada o sostenida del producto, que luego se administra mediante una inyección de depósito. En algunas realizaciones, se utilizan dispositivos de administración de fármacos implantables para introducir la molécula deseada.
V. Métodos de uso de las moléculas de unión a antígenos divulgadas, CAR y TCR
Otro aspecto de la presente divulgación está dirigido a un método para fabricar una célula que expresa un CAR o un TCR que comprende transducir una célula con un polinucleótido divulgado en el presente documento en condiciones adecuadas. En algunas realizaciones, el método comprende transducir una célula con un polinucleótido que codifica un CAR o un TCR, en el que el CAR o el TCR comprende una molécula de unión al antígeno que se une específicamente a CD70, tal como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, el método comprende transducir una célula con un vector que comprende un polinucleótido que codifica un CAR o un TCR, en el que el CAR o el TCR comprende una molécula de unión al antígeno que se une específicamente a CD70. En otras realizaciones, el método comprende transducir una célula con un polinucleótido que codifica un CAR o TCR que comprende una molécula de unión al antígeno que se une específicamente a CD70, como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, el método comprende transducir una célula con un vector que comprende el polinucleótido que codifica el CAR o el TCR comprende una molécula de unión al antígeno que se une específicamente a CD70, como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, el método comprende además aislar la célula.
Otro aspecto de la presente divulgación está dirigido a un método para inducir una inmunidad contra un tumor que comprende administrar a un sujeto una cantidad eficaz de una célula que comprende un polinucleótido descrito en el presente documento, un vector descrito en el presente documento o un c Ar o un t Cr descrito en el presente documento. En una realización, el método comprende administrar a un sujeto una cantidad eficaz de una célula que comprende un polinucleótido que codifica un CAR o un TCR, en el que el CAR o TCR comprende una molécula de unión al antígeno que se une específicamente a CD70, como se describe en el presente documento. En otra realización, el método comprende administrar a un sujeto una cantidad eficaz de una célula que comprende un vector que comprende un polinucleótido que codifica un CAR o un TCR, en el que el CAR o el TCR comprende una molécula de unión al antígeno que se une específicamente a CD70, como se describe en el presente documento. En otra realización, el método comprende administrar a un sujeto una cantidad eficaz de una célula que comprende un CAR o un TCR codificado por un polinucleótido descrito en el presente documento, en el que el CAR o el TCR comprende una molécula de unión al antígeno que se une específicamente a CD70.
En otras realizaciones, el método comprende administrar a un sujeto una cantidad eficaz de una célula que comprende un polinucleótido que codifica un CAR o TCR que comprende una molécula de unión al antígeno que se une específicamente a CD70, como se describe en el presente documento. En otra realización, el método comprende administrar a un sujeto una cantidad eficaz de una célula que comprende un vector que comprende un polinucleótido que codifica un CAR o TCR que comprende una molécula de unión al antígeno que se une específicamente a CD70, como se describe en el presente documento. En otra realización, el método comprende administrar a un sujeto una cantidad eficaz de una célula que comprende un anticuerpo o molécula de unión al antígeno del mismo codificado por un polinucleótido descrito en este documento (p. ej., un CAR o TCR), en el que el anticuerpo o molécula de unión al antígeno del mismo se une específicamente a CD70.
Otro aspecto de la presente divulgación está dirigido a un método para inducir una respuesta inmune en un sujeto que comprende administrar una cantidad eficaz de las células inmunes modificadas de la presente solicitud. En algunas realizaciones, la respuesta inmune es una respuesta inmune mediada por células T. En algunas realizaciones, la respuesta inmune mediada por células T se dirige contra una o más células diana. En algunas realizaciones, la célula inmunitaria modificada comprende un CAR o un TCR, como los que se proporcionan en el presente documento. En algunas realizaciones, la célula diana es una célula tumoral.
Otro aspecto de la presente divulgación está dirigido a un método para tratar o prevenir una neoplasia maligna, comprendiendo dicho método administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad eficaz de al menos una molécula de unión al antígeno aislada descrita en este documento o al menos una célula inmunitaria, en el que la célula inmunitaria comprende al menos un CAR, TCR y/o molécula de unión al antígeno aislada como se describe en el presente documento.
Otro aspecto de la presente divulgación está dirigido a un método para tratar un trastorno hiperproliferativo o una enfermedad inflamatoria en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar al sujeto un polinucleótido descrito en este documento, un vector divulgado en este documento, un CAR o un TCR divulgado en el presente documento, una célula divulgada en el presente documento o una composición divulgada en el presente documento. En algunas realizaciones, la enfermedad inflamatoria se selecciona del grupo que consiste en artritis reumatoide, psoriasis, alergias, asma, enfermedades autoinmunes tales como enfermedad de Crohn, IBD, fibromialgia, mastocitosis, enfermedad celíaca y cualquier combinación de las mismas.
Otro aspecto de la presente divulgación está dirigido a un método para tratar un cáncer en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar al sujeto un polinucleótido divulgado en este documento, un vector divulgado en el presente documento, un CAR o un TCR divulgado en este documento, una célula divulgada en este documento, o una composición divulgada en este documento. En una realización, el método comprende administrar un polinucleótido que codifica un CAR o un TCR, en el que el CAR o el TCR comprende una molécula de unión al antígeno que se une específicamente a CD70, como se divulga en el presente documento. En otra realización, el método comprende administrar un vector que comprende un polinucleótido que codifica un CAR o un TCR, en el que el CAR o el TCR comprende una molécula de unión al antígeno que se une específicamente a CD70, como se divulga en el presente documento. En otra realización, el método comprende administrar un CAR o un TCR codificado por un polinucleótido divulgado en el presente documento, en el que el CAR o el TCR comprende una molécula de unión al antígeno que se une específicamente a CD70. En otra realización, el método comprende administrar una célula que comprende el polinucleótido, o un vector que comprende el polinucleótido, que codifica un CAR o un TCR, en el que el CAR o el TCR comprende una molécula de unión al antígeno que se une específicamente a CD70, como se divulga en el presente documento. En otras realizaciones, el método comprende administrar un polinucleótido que codifica un CAR o un TCR, en el que el CAR o el TCR comprende una molécula de unión al antígeno que se une específicamente a CD70, como se divulga en el presente documento. En otra realización, el método comprende administrar un vector que comprende un polinucleótido que codifica un CAR o un TCR, en el que el CAR o el TCR comprende una molécula de unión al antígeno que se une específicamente a CD70, como se divulga en el presente documento. En otra realización, el método comprende administrar un anticuerpo, CAR o TCR, en el que el CAR o el TCR comprende una molécula de unión al antígeno que se une específicamente a CD70 y está codificada por un polinucleótido divulgado en este documento. En otra realización, el método comprende administrar una célula que comprende el polinucleótido, o un vector que comprende el polinucleótido, que codifica un anticuerpo, CAR o TCR, en el que CAR o t Cr comprende una molécula de unión al antígeno que se une específicamente a CD70, como se divulga en el presente documento.
En algunas realizaciones, un anticuerpo, CAR o TCR, en el que el CAR o el TCR comprende una molécula de unión al antígeno que se une específicamente a CD70, se administra solo. En tales células inmunes, el anticuerpo, CAR o TCR, en el que CAR o TCR comprende una molécula de unión al antígeno que se une específicamente a CD70, puede estar bajo el control de la misma región promotora o un promotor separado. En algunas realizaciones, los genes que codifican agentes proteicos y/o un anticuerpo, CAR o TCR, en los que CAR o TCR comprenden una molécula de unión al antígeno que se une específicamente a CD70, pueden estar en vectores separados.
En algunas realizaciones, los métodos para tratar un cáncer en un sujeto que lo necesita comprenden una terapia con células T. En una realización, la terapia con células T de la presente divulgación se diseña con terapia de células autólogas (eACTMR). De acuerdo con esta realización, el método puede incluir la recogida de células sanguíneas del paciente. Las células sanguíneas aisladas (p. ej., células T) se pueden modificar para expresar un CAR anti-CD70 de la presente divulgación ("células T con CAR anti-CD70"). En una realización particular, las células T CAR anti-CD70 se administran al paciente. En algunas realizaciones, las células T CAR anti-CD70 tratan un tumor o cáncer en el paciente. En una realización, las células T CAR anti-CD70 reducen el tamaño de un tumor o cáncer.
En algunas realizaciones, las células T del donante para su uso en la terapia con células T se obtienen del paciente (p. ej., para una terapia con células T autólogas). En otras realizaciones, las células T del donante para su uso en la terapia con células T se obtienen de un sujeto que no es el paciente (p. ej., terapia con células T alogénicas).
Las células T se pueden administrar en una cantidad terapéuticamente eficaz. Por ejemplo, una cantidad terapéuticamente eficaz de las células T puede ser al menos aproximadamente 104 células, al menos aproximadamente 105 células, al menos aproximadamente 106 células, al menos aproximadamente 107 células, al menos aproximadamente 108 células, al menos aproximadamente 109 células, al menos aproximadamente 1010 células, o al menos aproximadamente 1011 células. En otra realización, la cantidad terapéuticamente eficaz de las células T es aproximadamente 1014 células, aproximadamente 105 células, aproximadamente 106 células, aproximadamente 107 células o aproximadamente 108 células. En algunas realizaciones, la cantidad terapéuticamente eficaz de células T con CAR anti-CD70 es de aproximadamente 1 * 105 células/kg, 2 * 105 células/kg, 3 * 105 células/kg, 4 * 105 células/kg, 5 * 105 células/kg, 1 * 106 células/kg, 2 * 106 células/kg, aproximadamente 3 * 106 células/kg, aproximadamente 4 * 106 células/kg, aproximadamente 5 * 106 células/kg, aproximadamente 6 * 106 células/kg, aproximadamente 7 * 106 células/kg, aproximadamente 8 * 106 células/kg, aproximadamente 9 * 106 células/kg, aproximadamente 1 * 107 células/kg, aproximadamente 2 * 107 células/kg, aproximadamente 3 * 107 células/kg, aproximadamente 4 * 107 células/kg, aproximadamente 5 * 107 células/kg, aproximadamente 6 * 107 células/kg, aproximadamente 7 * 107 células/kg, aproximadamente 8 * 107 células/kg, o aproximadamente 9 * 107 células/kg.
Otro aspecto de la presente divulgación está dirigido a métodos de diagnóstico, detección o validación. En algunas realizaciones, la molécula de unión al antígeno se usa como herramienta de diagnóstico o validación. En algunas realizaciones, las moléculas de unión a antígeno descritas en este documento se utilizan para analizar la cantidad de CD70 presente en una muestra y/o sujeto. En algunas realizaciones, la molécula de unión al antígeno de diagnóstico no es neutralizante. En algunas realizaciones, las moléculas de unión a antígeno descritas en este documento se usan o se proporcionan en un kit de ensayo y/o método para la detección de CD70 en tejidos o células de mamíferos con el fin de cribar/diagnosticar una enfermedad o trastorno asociado con cambios en los niveles de CD70. En algunas realizaciones, el kit comprende una molécula de unión al antígeno que se une a CD70, junto con medios para indicar la unión de la molécula de unión al antígeno con CD70, si está presente, y opcionalmente niveles de proteína CD70. Pueden usarse varios medios para indicar la presencia de una molécula de unión al antígeno. Por ejemplo, los fluoróforos, otras sondas moleculares o enzimas pueden unirse a la molécula de unión al antígeno y la presencia de la molécula de unión al antígeno se puede observar de diversas formas. Ejemplos de fluoróforos incluyen fluoresceína, rodamina, tetrametilrodamina, eosina, eritrosina, cumarina, metilcumarinas, pireno, verde malaquita, estilbeno, Lucifer Yellow, Cascade Blue, Texas Red, IAEDANS, EDANS, BODIPY FL, LC Red 640, Cy 5, Cy 5.5, LC Red 705, Oregon Green, los colorantes Alexa-Fluor (Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 430, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 660, Alexa Fluor 680), Cascade Blue, Cascade Yellow y R-ficoeritrina (PE) (Molecular Probes), FITC, Rodamina, y Texas Red (Pierce), Cy5, Cy5.5, Cy7 (Amersham Life Science). Como apreciará un experto en la técnica, el grado de unión de la molécula de unión al antígeno se puede usar para determinar la cantidad de CD70 que hay en una muestra.
V.A. Tratamiento para el cáncer
Los métodos de la divulgación se pueden usar para tratar un cáncer en un sujeto, reducir el tamaño de un tumor, matar células tumorales, prevenir la proliferación de células tumorales, prevenir el crecimiento de un tumor, eliminar un tumor de un paciente, prevenir la recaída de un tumor, prevenir la metástasis tumoral, inducir la remisión en un paciente o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, los métodos inducen una respuesta completa. En otras realizaciones, los métodos inducen una respuesta parcial.
Los cánceres que se pueden tratar usando los CAR, YCR y los anticuerpos proporcionados en este documento incluyen tumores que no están vascularizados, que aún no están sustancialmente vascularizados o vascularizados. El cáncer también puede incluir tumores sólidos o no sólidos. En algunas realizaciones, el cáncer es un cáncer hematológico. En algunas realizaciones, el cáncer es de glóbulos blancos. En otras realizaciones, el cáncer es de células plasmáticas. En algunas realizaciones, el cáncer es leucemia, linfoma o mieloma. En algunas realizaciones, el cáncer es mieloma múltiple, enfermedad de Hodgkin, linfoma no Hodgkin (NHL), linfoma mediastínico primario de células B grandes (PMBC), linfoma difuso de células B grandes (DLBCL), linfoma folicular (FL), linfoma folicular transformado, linfoma esplénico de la zona marginal (SMZL), leucemia aguda o crónica, enfermedades mieloides que incluyen, entre otras, leucemia mieloide aguda (AML), leucemia mieloide crónica (CML), leucemia linfoblástica aguda (ALL) (incluida ALL no de células T), leucemia linfocítica crónica (CLL), linfoma de células T, uno o más de leucemia linfoide aguda de células B ("BALL"), leucemia linfoide aguda de células T ("TALL"), leucemia linfoide aguda (ALL), leucemia mielógena crónica (CML), Leucemia prolinfocítica de células B, neoplasia de células dendríticas plasmocitoides blásticas, linfoma de Burkitt, leucemia de células pilosas, linfoma folicular de células pequeñas o células grandes, enfermedades linfoproliferativas malignas, linfoma MALT, linfoma de células del manto, linfoma de zona marginal, mielodisplasia y síndrome mielodisplásico (MDS), síndrome hemofagocítico (síndrome de activación de macrófagos (MAS) y linfohistocitosis hemofagocítica (HLH)), enfermedad granulomatosa crónica o aguda, granuloma de células grandes, deficiencia de adhesión de leucocitos, linfoma plasmoblástico, neoplasia de células dendríticas plasmacitoides, macroglobulinemia de Waldenstrom, trastornos proliferativos de células de plasma (p. ej., mieloma asintomático (mieloma múltiple latente o mieloma indolente), gammapatía monoclonal de significado indeterminado (MGUS), plasmacitomas (p. ej., discrasia de células plasmáticas, mieloma solitario, plasmacitoma solitario, plasmacitoma extramedular y plasmacitoma múltiple), amiloidosis de cadenas ligeras de amiloide sistémico, síndrome POEMS (síndrome de Crow-Fukase, enfermedad de Takatsuki, síndrome PEP) o combinaciones de los mismos. En una realización, el cáncer es un mieloma. En algunas realizaciones, el cáncer es mieloma múltiple. En otra realización particular, el cáncer es linfoma de células T o B.
En algunas realizaciones, los métodos comprenden además la administración de un compuesto quimioterapéutico. En algunas realizaciones, el compuesto quimioterapéutico seleccionado es un compuesto quimioterapéutico que agota la linfa (acondicionamiento previo). Los regímenes de tratamiento de acondicionamiento previo beneficiosos, junto con los biomarcadores beneficiosos correlativos, se describen en las solicitudes de patente de los Estados Unidos N° 15/167.977 y 15/295.931 y la solicitud de patente publicada de los Estados Unidos PCT/US2016/034885. Estos describen, p. ej., métodos para acondicionar a un paciente que necesita una terapia con células T que comprenden administrar al paciente dosis beneficiosas específicas de ciclofosfamida (entre aproximadamente 100 mg/m2/día y aproximadamente 2.000 mg/m2/día; p. ej., aproximadamente 100 mg/m2/día, aproximadamente 200 mg/m2/día, aproximadamente 300 mg/m2/día, aproximadamente 400 mg/m2/día, aproximadamente 500 mg/m2/día, aproximadamente 600 mg/m2/día, aproximadamente 700 mg/m2/día, aproximadamente 800 mg/m2/día, aproximadamente 900 mg/m2/día, aproximadamente 1.000 mg/m2/día, aproximadamente 1.500 mg/m2/día o aproximadamente 2.000 mg/m2/día) sola o en combinación con dosis específicas de fludarabina (entre aproximadamente 10 mg/m2/día y aproximadamente 900 mg/m2/día; p. ej., aproximadamente 10 mg/m2/día, aproximadamente 20 mg/m2/día, aproximadamente 30 mg/m2/día, aproximadamente 40 mg/m2/día, aproximadamente 40 mg/m2/día, aproximadamente 50 mg/m2/día, aproximadamente 60 mg/m2/día, aproximadamente 70 mg/m2/día, aproximadamente 80 mg/m2/día, aproximadamente 90 mg/m2/día, aproximadamente 100 mg/m2/día, aproximadamente 500 mg/m2/día o aproximadamente 900 mg/m2/día).
En algunas realizaciones, el régimen de dosis implica el tratamiento de un paciente que comprende administrar diariamente al paciente aproximadamente 500 mg/m2/día de ciclofosfamida y aproximadamente 60 mg/m2/día de fludarabina durante tres días antes de la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de células T modificadas al paciente.
En algunas realizaciones, el régimen de dosis implica tratar a un paciente que comprende administrar diariamente al paciente aproximadamente 600 mg/m2/día de ciclofosfamida y aproximadamente 30 mg/m2/día de fludarabina durante tres días antes de la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de células T modificadas al paciente.
En algunas realizaciones, el régimen de dosis implica tratar a un paciente que comprende administrar diariamente al paciente aproximadamente 500 mg/m2/día de ciclofosfamida durante dos días y aproximadamente 30 mg/m2/día de fludarabina durante cuatro días antes de la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de células T modificadas al paciente.
En algunas realizaciones, el régimen de dosis implica tratar a un paciente que comprende administrar diariamente al paciente aproximadamente 600 mg/m2/día de ciclofosfamida durante tres días y aproximadamente 30 mg/m2/día de fludarabina durante tres días antes de la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de células T modificadas al paciente.
En algunas realizaciones, el régimen de dosis implica tratar a un paciente que comprende administrar diariamente al paciente aproximadamente 550 mg/m2/día de ciclofosfamida durante tres días y aproximadamente 30 mg/m2/día de fludarabina durante tres días antes de la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de células T modificadas al paciente.
En algunas realizaciones, el régimen de dosis implica tratar a un paciente que comprende administrar diariamente al paciente aproximadamente 500 mg/m2/día de ciclofosfamida durante tres días y aproximadamente 30 mg/m2/día de fludarabina durante tres días antes de la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de células T modificadas al paciente.
En algunas realizaciones, el régimen de dosis implica tratar a un paciente que comprende administrar diariamente al paciente aproximadamente 450 mg/m2/día de ciclofosfamida durante tres días y aproximadamente 30 mg/m2/día de fludarabina durante tres días antes de la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de células T modificadas al paciente.
En algunas realizaciones, el régimen de dosis implica tratar a un paciente que comprende administrar diariamente al paciente aproximadamente 400 mg/m2/día de ciclofosfamida durante tres días y aproximadamente 30 mg/m2/día de fludarabina durante tres días antes de la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de células T modificadas al paciente.
En algunas realizaciones, el régimen de dosis implica tratar a un paciente que comprende administrar diariamente al paciente aproximadamente 440 mg/m2/día de ciclofosfamida durante dos días y aproximadamente 100 mg/m2/día de etopósido durante dos días antes de la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de células T modificadas al paciente.
En algunas realizaciones, el régimen de dosis implica tratar a un paciente que comprende administrar diariamente al paciente aproximadamente 2-4 g/m2/día de ciclofosfamida durante tres días y aproximadamente 200 mg/m2/día de etopósido durante tres días antes de la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de células T modificadas al paciente.
En algunas realizaciones, el régimen de dosis implica tratar a un paciente que comprende administrar diariamente al paciente aproximadamente 300 mg/m2/día de ciclofosfamida durante tres días y aproximadamente 30 mg/m2/día de fludarabina durante tres días antes de la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de células T modificadas al paciente.
En algunas realizaciones, el régimen de dosis implica tratar a un paciente que comprende administrar diariamente al paciente aproximadamente 30-60 mg/kg (aproximadamente 1.100 mg/m2 - 2.200 mg/m2) de ciclofosfamida durante tres a cinco días y aproximadamente 25 mg/m2 de fludarabina durante tres a cinco días antes de la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de células T modificadas al paciente.
En algunas realizaciones, el régimen de dosis implica tratar a un paciente que comprende administrar diariamente al paciente aproximadamente 1 g/m2 de ciclofosfamida antes de la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de células T modificadas al paciente.
En algunas realizaciones, el régimen de dosis implica tratar a un paciente que comprende administrar diariamente al paciente aproximadamente 1,2 g/m2 de ciclofosfamida durante cuatro días antes de la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de células T modificadas al paciente.
En algunas realizaciones, el régimen implica tratar a un paciente que comprende administrar diariamente al paciente aproximadamente 2 g/m2 de ciclofosfamida antes de la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de células T modificadas al paciente.
En algunas realizaciones, el régimen de dosis implica tratar a un paciente que comprende administrar diariamente al paciente aproximadamente 25 mg/m2 de fludarabina durante tres días antes de la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de células T modificadas al paciente.
En algunas realizaciones, el régimen de dosis implica tratar a un paciente que comprende administrar diariamente al paciente aproximadamente 90 mg/m2 de bendamustina durante dos días antes de la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de células T modificadas al paciente.
En algunas realizaciones, el régimen de dosis implica tratar a un paciente que comprende administrar diariamente al paciente aproximadamente 500 mg/m2/día de ciclofosfamida durante dos días y aproximadamente 30 mg/m2/día de fludarabina durante cuatro días antes de la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de células T modificadas al paciente.
En algunas realizaciones, el régimen de dosis implica tratar a un paciente que comprende administrar al paciente aproximadamente 1.000 mg/m2 de metotrexato el día 1, aproximadamente 1.000 mg/m2 cada 12 horas los días 2 y 3 antes de la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de células T modificadas al paciente.
Otro régimen de dosis preferido implica tratar a un paciente que comprende administrar al paciente aproximadamente 300 mg/m2 de ciclofosfamida cada 12 horas los días uno, dos y tres, 2 mg de vincristina el día tres y 50 mg/m2 de adriamicina el día tres antes de la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de células T modificadas al paciente.
Otro régimen de dosis preferido implica tratar a un paciente que comprende administrar diariamente al paciente aproximadamente 200 mg/m2/día de ciclofosfamida durante tres días y aproximadamente 20 mg/m2/día de fludarabina durante tres días antes de administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de células T modificadas al paciente.
En algunas realizaciones, la molécula de unión al antígeno, las células transducidas (o modificadas) (tales como CAR o TCR) y el agente quimioterapéutico se administran cada uno en una cantidad eficaz para tratar la enfermedad o afección en el sujeto.
En algunas realizaciones, las composiciones que comprenden células efectoras inmunitarias que expresan CAR y/o TCR divulgadas en el presente documento se pueden administrar junto con cualquier cantidad de agentes quimioterapéuticos. Los ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen agentes alquilantes tales como tiotepa y ciclofosfamida (CYTOXANmr); alquil sulfonatos tales como busulfano, improsulfano y piposulfano; aziridinas tales como benzodopa, carbocuona, meturedopa y uredopa; etileniminas y metilamelaminas que incluyen altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida y trimetilolomelamina resume; mostazas de nitrógeno tales como clorambucilo, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de óxido de mecloretamina, melfalán, novembichina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosoureas tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina; antibióticos tales como aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, caliqueamicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubicina, epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicinas, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorrubicina; antimetabolitos tales como metotrexato y 5-fluorouracilo (5-FU); análogos del ácido fólico tales como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina, 5-FU; andrógenos tales como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; anti-adrenales tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; reforzador de ácido fólico tal como ácido frolínico; aceglatona; glucósido de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elformitina; acetato de eliptinio; etoglúcido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinano; lonidamina; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol; nitracrina; pentostatina; fenamet; pirarrubicina; ácido podofilínico; 2-etilhidrazida; procarbazina; PSK®; razoxano; sizofirano; espirogermanio; ácido tenuazónico; triaziquona; 2,2',2"-triclorotrietilamina; uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinósido ("Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa; taxoides, p. ej., paclitaxel (TAX-OLMR, Bristol- Myers Squibb) y docetaxel (TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer); clorambucilo; gemcitabina; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platino tales como cisplatino y carboplatino; vinblastina; platino; etopósido (VP-16); ifosfamida; mitomicina C; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina; navelbina; novantrona; tenipósido; daunomicina; aminopterina; Xeloda; ibandronato; CPT-11; inhibidor de la topoisomerasa RFS2000; difluorometilomitina (DMFO); derivados del ácido retinoico tales como TARGRETINmr (bexaroteno); PANRETINMR, ONTAKMR (denileucina diftitox); esperamicinas; capecitabina; y sales farmacéuticamente aceptables, ácidos o derivados de cualquiera de los anteriores. En algunas realizaciones, se divulgan composiciones que comprenden células efectoras inmunitarias que expresan CAR y/o TCR divulgadas en este documento se puede administrar junto con un agente antihormonal que actúa para regular o inhibir la acción hormonal en tumores tales como antiestrógenos, incluidos, p. ej., tamoxifeno, raloxifeno, 4(5)-imidazoles que inhiben la aromatasa, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, LY117018, onapristona y toremifeno (FARESTONMR); y antiandrógenos tales como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida y goserelina; y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores. También se administran combinaciones de agentes quimioterapéuticos cuando sea apropiado, que incluyen, pero no se limitan a CHOP, es decir, ciclofosfamida (CYTOXAN®), Doxorrubicina (hidroxidoxorrubicina), Vincristina (ONCOVIN®) y Prednisona; EPOCH (etopósido, prednisona, vincristina (ONCOVIN®) y clorhidrato de doxorrubicina (clorhidrato de hidroxidaunorrubicina)); y carboplatino y gemcitabina.
En algunas realizaciones, el agente quimioterapéutico se administra al mismo tiempo o dentro de una semana después de la administración de la célula o el ácido nucleico modificados. En otras realizaciones, el agente quimioterapéutico se administra de 1 a 4 semanas o de 1 semana a 1 mes, de 1 semana a 2 meses, de 1 semana a 3 meses, de 1 semana a 6 meses, de 1 semana a 9 meses o de 1 semana a 12 meses después de la administración de la célula modificada o del ácido nucleico. En algunas realizaciones, el agente quimioterapéutico se administra al menos 1 mes antes de administrar la célula o el ácido nucleico. En algunas realizaciones, los métodos comprenden además la administración de dos o más agentes quimioterapéuticos.
Se puede usar una variedad de agentes terapéuticos adicionales junto con las composiciones descritas en este documento. Por ejemplo, agentes terapéuticos adicionales potencialmente útiles incluyen inhibidores de PD-1 tales como nivolumab (Op DiYO®), pembrolizumab (KEYTRUDA®), pidilizumab (CureTech) y atezolizumab (TECENTRIQ®).
Los agentes terapéuticos adicionales adecuados para su uso en combinación con la divulgación incluyen, pero no se limitan a, Ibrutinib (IMBRUVICA®), ofatumumab (ARZERRA®), rituximab (RITUXAN®), bevacizumab (a Va STIN®), trastuzumab (HEr Ce PTIN®), trastuzumab emtansina (KADCYLA®), imatinib (GLEEVEC®), cetuximab (ERBITUX®), panitumumab (VECTIBIX®), catumaxomab (REMOVAB®), ibritumomab (ZEVALIN®), tositumomab, brentuximab (ADCETRIS®), alemtuzumab (LEMTRADA®), gemtuzumab, erlotinib (TAr CeVA®), gefitinib (IRESSA®), vandetanib (CAPRELSA®), afatinib (GIOTRIF®), lapatinib (TYKERB®), neratinib, axitinib (INLYTA®), masitinib (MASIVET®), pazopanib (VOTRIENT®), sunitinib (Su TEn T®), sorafenib (NEXAVAR®), lestaurtinib, cediranib, lenvatinib (LENVIMA®), nintedanib (OFEV®), regorafenib (STIVARGA®), semaxanib, tivozanib, entrectinib, cabozantinib (CABOMETYX®), dasatinib (SPRYCEL®), nilotinib (TASIGNA®), ponatinib (ICLUSIG®), radotinib (SUPECT®), bosutinib (BOSULIF®), ruxolitinib (JAKAVI®), pacritinib, cobimetinib (COTELLIC®), selumetinib, trametinib (MEKINIST®), binimetinib, alectinib (ALECENSA®), ceritinib (ZYKADSA®), crizotinib (XALKORI®), aflibercept (EYELEA®), adipotida, denileucina diftitox (ONTAK®), inhibidores de mTOR tales como everolimus (AFINITOR®) y temsirolimus (TORISEL®), inhibidores de hedgehog tales como sonidegib (ODOZMO®) y vismodegib (ERIVEDGE®), inhibidores de CDK tales como inhibidor de CDK (palbociclib; IBRANCE®).
En algunas realizaciones, la composición que comprende un sistema inmunitario que contiene CAR y/o TCR se administra con un agente antiinflamatorio. Los agentes o fármacos antiinflamatorios pueden incluir, entre otros, esteroides y glucocorticoides (incluyendo betametasona, budesonida, dexametasona, acetato de hidrocortisona, hidrocortisona, metilprednisolona, prednisolona, prednisona, triamcinolona), fármacos antiinflamatorios no esteroides (NSAID) incluyendo aspirina, ibuprofeno, naproxeno, metotrexato, sulfasalazina, leflunomida, medicamentos anti-TNF, ciclofosfamida y micofenolato. Los ejemplos de NSAID incluyen ibuprofeno, naproxeno, naproxeno sódico, inhibidores de Cox-2 y sialilatos. Ejemplos de analgésicos incluyen acetaminofén, oxicodona, tramadol o clorhidrato de propoxifeno. Los ejemplos de glucocorticoides incluyen cortisona, dexametasona, hidrocortisona, metilprednisolona, prednisolona o prednisona. Los ejemplos de modificadores de la respuesta biológica incluyen moléculas dirigidas contra marcadores de la superficie celular (p. ej., CD4, CD5, etc.), inhibidores de citocinas, tal como los antagonistas de TNF (p. ej., etanercept (ENBREL®), adalimumab (HUMIRA®) y infliximab (REMICADE®), inhibidores de quimiocinas e inhibidores de moléculas de adhesión. Los modificadores de la respuesta biológica incluyen anticuerpos monoclonales, así como formas recombinantes de moléculas. Ejemplos de DMARD incluyen azatioprina, ciclofosfamida, ciclosporina, metotrexato, penicilamina, leflunomida, sulfasalazina, hidroxicloroquina, Gold (oral (auranofina) e intramuscular) y minociclina.
En algunas realizaciones, las composiciones descritas en el presente documento se administran junto con una citocina. "Citocina", como se usa en el presente documento, se refiere a proteínas liberadas por una población de células que actúan sobre otra célula como mediadores intercelulares. Ejemplos de citocinas son linfocinas, monoquinas y hormonas polipeptídicas tradicionales. Entre las citocinas se incluyen hormonas de crecimiento tales como hormona de crecimiento humana, hormona de crecimiento humana con N-metionilo y hormona de crecimiento bovina; hormona paratiroidea; tiroxina; insulina; proinsulina; relaxina; prorrelaxina; hormonas de glicoproteína tales como la hormona estimulante de folículos (FSH), la hormona estimulante del tiroides (TSH) y la hormona luteinizante (LH); factor de crecimiento hepático (HGF); factor de crecimiento de fibroblastos (FGF); prolactina; lactógeno placentario; sustancia inhibidora mulleriana; péptido asociado a gonadotropina de ratón; inhibina; activina; factor de crecimiento vascular endotelial; integrina; trombopoyetina (TPO); factores de crecimiento nervioso (NGF) tales como NGF-beta; factor de crecimiento plaquetario; factores de crecimiento transformantes (TGF) tales como TGF-alfa y TGF-beta; factor de crecimiento similar a la insulina I y II; eritropoyetina (EPO); factores osteoinductivos; interferones tales como interferón alfa, beta y gamma; factores estimulantes de colonias (CSF) tales como macrófagos-CSF (M-CSF); granulocitosmacrófagos-CSF (GM-CSF); y granulocitos-CSF (G-CSF); interleucinas (IL) tales como IL-1, iL-1 alfa, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12; IL-15, un factor de necrosis tumoral tales como TNF-alfa o TNF-beta; y otros factores polipeptídicos que incluyen LIF y ligando kit (KL). Como se usa en este documento, el término citocina incluye proteínas de fuentes naturales o de cultivo de células recombinantes y equivalentes biológicamente activos de las citocinas de secuencia nativa.
La presente divulgación se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos que no deben interpretarse como limitantes adicionales de la presente invención, que solo está limitada por los términos de las reivindicaciones adjuntas.
Ejemplos
Ejemplo 1
Se midió la expresión de CD70 en varias líneas celulares. Se encontró que CD70 se expresaba, con fragmentos/kilobase de exón/millón de lecturas mapeadas (FPKM) superiores a 35, en el 99% de las líneas celulares de tumores de mieloma múltiple probadas.
Para caracterizar aún más la expresión de CD70, se tiñeron las células CEM (ATCC), EoL-1 (Sigma), HL-60 (ATCC), KG-la (ATCC), MV4; 11 (ATCC), NAMALWA (ATCC), Raji (ATCC), Toledo (ATCC) y U-937 (ATCC) con un anticuerpo anti-CD70 conjugado con PE (BD Pharmingen) en tampón de tinción (BD Pharmingen) durante 30 minutos a 4 °C. A continuación, las células se lavaron y se resuspendieron en tampón de tinción con yoduro de propidio (BD Pharmingen) antes de la adquisición de datos. A continuación, se adquirieron muestras mediante citometría de flujo y se analizaron los datos (Figura 2). Se observó expresión de CD70 en las líneas celulares EoL-1, MV4; 11, NAMALWA, Raji, Toledo y U-937 (Figura 2), pero no en las líneas celulares CEM, HL-60 y KG-la (Figura 2 ).
Ejemplo 2
Se usó un vector de transferencia lentiviral de tercera generación que contiene los constructos CAR CD70 mostrados esquemáticamente en las Figuras 1A-1H, que tiene las secuencias mostradas en las Figuras 8A-8L, y en el Listado de secuencias adjunto (SEQ ID NO: 29-52) junto con la mezcla de empaquetamiento lentiviral ViraPower (Life Technologies) para generar los sobrenadantes lentivirales. Brevemente, se generó una mezcla de transfección mezclando 15 |jg de ADN y 22,5 j l de polietilenimina (Polysciences, 1 mg/ml) en 600 j l de medio OptiMEM. La mezcla de transfección se incubó durante 5 minutos a temperatura ambiente. Simultáneamente, se tripsinizaron y contaron las células 293T (ATCC). A continuación, se sembraron en placa un total de 10 * 106 células 293T totales en un matraz T75 con la mezcla de transfección. Después del cultivo durante tres días, se recogieron los sobrenadantes y se filtraron a través de un filtro de 0,45 jm y se almacenaron a -80°C.
Se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de dos leucopaks de donantes sanos diferentes (Hemacare) usando centrifugación de densidad Ficoll®-Paque de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las PBMC se estimularon usando OKT3 (Muromonab-CD3, 50 ng/ml, Miltenyi Biotec) en medio R10 suplementado con IL-2 (300 Ul/ml, Proleukin®, Prometheus® Therapeutics and Diagnostics). Cuarenta y ocho horas después de la estimulación, las células se transdujeron usando lentivirus que contenían las diferentes constructos CAR CD70 con una multiplicidad de infección (MOI) de 10. Las células se mantuvieron a 0,5 * 106 - 2,0 * 106 células/ml antes de su uso en ensayos de actividad.
En el día 14 después de la estimulación, las células T transducidas se tiñeron con CD70-Fc recombinante (Sino Biological) en tampón de tinción (BD Pharmingen) durante 30 minutos a 4 °C. A continuación, las células se lavaron y se tiñeron con Fc PE de cabra anti-IgG humana (Jackson ImmunoResearch) en tampón de tinción durante 30 minutos a 4 °C. A continuación, las células se lavaron y se resuspendieron en tampón de tinción con yoduro de propidio (BD Pharmingen) antes de la adquisición de datos. Todos los experimentos se realizaron en dos donantes diferentes. Se observó expresión de CAR CD70 para cada uno de los constructos en células transducidas tanto del donante 1 (Figura 3A) como del donante 2 (Figura 3B).
Se cultivaron células efectoras, p. ej., células T con CAR anti-CD70, con células diana en una proporción de célula efectora a célula diana (E:T) de 1:1 en medio R1014 días después de la estimulación de células T. Las líneas celulares probadas incluyeron KG-la, NAMALWA y Raji. Dieciséis horas después del cocultivo, los sobrenadantes fueron analizados por Luminex (EMD Millipore), de acuerdo con las instrucciones del fabricante, para la producción de las citocinas IFNy (Figuras 4A-4B), TNFa (Figuras 4C-4D) e IL-2 (Figuras 4E-4F). Se observaron IFNy (Figuras 4A-4B), TNFa (Figuras 4C-4D) e IL-2 (Figuras 4E-4F) en el sobrenadante de los cocultivos de células diana NAMALWA y Raji para cada célula T con CAR anti-CD70 probada en ambos donantes (Figuras 4A-4F). Sin embargo, se observaron IFNy (Figuras 4A-4B), TNFa (Figuras 4C-4D) e IL-2 (Figuras 4E-4F) a niveles mucho más bajos en el sobrenadante de la célula diana KG-1a cocultivada con varias células T con CAR CD70 (Figuras 4A-4F).
La viabilidad de las células diana se evaluó mediante análisis de citometría de flujo de la captación de yoduro de propidio (Pl) de células CD3 negativas. Las células T con CAR anti-CD70 se cocultivaron con células diana KG-la (Figuras 5A-5B), Raji (Figura 5C) o NAMALWA (Figura 5D) durante 16 horas, 40 horas, 64 horas, 88 horas o 112 horas. Se observó poca actividad citolítica en los cocultivos de KG-la en cualquier período de tiempo para las células T con CAR anti-CD70 (Figuras 5A-5B).
Ejemplo 3
Las células T CD4+ y CD8+ del donante se descongelaron y lavaron dos veces en medio OpTmizer (Life Technologies) suplementado con Penicilina-Estreptomicina-L-Glutamina (PSQ) 1X (Gibco). Las células se contaron usando un analizador de células Vi-Cell y la densidad celular se ajustó a 1 * 106 células/ml en medio OpTmizer que contenía PSQ 1X y 300 Ul/ml de IL-2 (Proleukin®, Prometheus® Therapeutics and Diagnostics). Después de contar y resuspender las células T en medio, se añadió anticuerpo anti-CD28 soluble hasta una concentración final de 1 jg/ml. A continuación, las células se transfirieron a matraces T25 recubiertos con anticuerpo anti-CD3 (Muromonab-CD3, 50

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un polinucleótido aislado que codifica un receptor de antígeno quimérico (CAR) que comprende una molécula de unión al antígeno que se une específicamente a CD70, en el que la molécula de unión al antígeno comprende uno de:
(a) una región CDR1 de VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 71; una región CDR2 de VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 72; una región CDR3 de VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 64; una región CDR1 de VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 53; una región CDR2 de VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 54; y una región CDR3 de VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 55;
(b) una región CDR1 de Vh que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 73; una región CDR2 de VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 74; una región CDR3 de VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 67; una región CDR1 de VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 56; una región CDR2 de VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 57; y una región CDR3 de VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 58; o
(c) una región CDR1 de VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 75; una región CDR2 de VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 76; una región CDR3 de VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 70; una región CDR1 de VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 59; una región CDR2 de VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 60; y una región CDR3 de VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 61.
2. El polinucleótido de la reivindicación 1, en el que la molécula de unión al antígeno comprende uno de:
(a) una VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3; y una VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5;
(b) una VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7; y una VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9; o
(c) una VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 11; y una VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 13,
en el que VH y VL están opcionalmente unidos por un enlazador.
3. El polinucleótido de la reivindicación 1 o 2, en el que el CAR comprende además un dominio transmembrana, en el que el dominio transmembrana es preferiblemente un dominio transmembrana de CD28, 4-1BB/CD137, CD8 alfa, CD4, CD19, CD3 épsilon, CD45, CD5, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, una cadena alfa de un receptor de células T, una cadena beta de un receptor de células T, una cadena zeta de un receptor de células T o cualquier combinación de los mismos.
4. El polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el CAR comprende además una región coestimuladora, en la que la región coestimuladora es preferiblemente una región de señalización de CD2, CD3 delta, CD3 épsilon, CD3 gamma, CD4, CD7, CD8a, CD8p, CD11a (ITGAL), CD11b (ITGAM), CD11c (ITGAX), CD11d (ITGAD), CD18 (ITGB2), CD19 (B4), CD27 (TNFRSF7), CD28, CD28T, CD29 (ITGB1), CD30 (TNFRSF8), CD40 (TNFRSF5), CD48 (SLAMF2), CD49a (ITGA1), CD49d (ITGA4), CD49f (ITGA6), CD66a (CEACAM1), CD66b (CEACAM8), CD66c (CEACAM6), CD66d (CEACAM3), CD66e (CEACAM5), CD69 (CLEC2), CD79A (cadena alfa asociada al complejo del receptor del antígeno de células B), CD79B (cadena beta asociada al complejo del receptor del antígeno de células B), CD84 (SLAMF5), CD96 (Tactile), CD100 (SEMA4D), CD103 (ITGAE), CD134 (OX40), CD137 (4-1BB), CD150 (SLAMF1), CD158A (KIR2DL1), CD158B1 (KIR2DL2), CD158B2 (KIR2DL3), CD158C (KIR3DP1), CD158D (KIRDL4), CD158F1 (KIR2DL5A), CD158F2 (KIR2DL5B), CD158K (KIR3DL2), CD160 (BY55), CD162 (SELPLG), CD226 (DNAM1), CD229 (SLAMF3), CD244 (SLAMF4), CD247 (CD3-zeta), CD258 (LUZ), CD268 (BAFFR), CD270 (TNFSF14), CD272 (BTLA), CD276 (B7-H3), CD279 (PD-1), CD314 (NKG2D), CD319 (SLAMF7), CD335 (NK-p46), CD336 (NK-p44), CD337 (NK-p30), CD352 (SLAMF6), CD353 (SLAMF8), CD355 (CRTAM), CD357 (TNFRSF18), coestimulador de células T inducibles (ICOS), LFA-1 (CD11a / CD18), NKG2C, DAP-10, ICAM-1, NKp80 (KLRF1), IL-2R beta, IL-2R gamma, IL-7R alfa, LFA-1, SLAMF9, LAT, GADS (GrpL), SLP-76 (LCP2), PAG1/CBP, un ligando de CD83, receptor Fc gamma, molécula del MHC de clase 1, molécula del MHC de clase 2, una proteína receptora de TNF, una proteína inmunoglobulina, un receptor de citocina, una integrina, activar receptores de células NK, un receptor de ligando de Toll, y/o fragmentos o combinaciones de los mismos.
5. El polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el CAR comprende además un dominio de activación, en el que el dominio de activación es preferiblemente un dominio de CD3 zeta.
6. El polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el CAR comprende además un péptido guía, en el que el péptido guía preferiblemente comprende una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, al menos aproximadamente 99%, o aproximadamente 100% idéntica a la SEQ ID NO: 28.
7. El polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el polinucleótido se selecciona del grupo que consiste en las SEQC ID NOs: 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41,43, 45, 47, 49 y 51.
8. Un vector que comprende el polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que es preferiblemente un vector retroviral, un vector de ADN, un plásmido, un vector de ARN, un vector adenoviral, un vector asociado a adenovirus, un vector lentiviral, o cualquier combinación de los mismos.
9. Un CAR codificado por el polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 o el vector de la reivindicación 8, en el que el CAR preferiblemente comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50 y 52.
10. Una célula que comprende el polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, el vector de la reivindicación 8, el CAR de la reivindicación 9, o cualquier combinación de los mismos, en la que la célula es preferiblemente una célula T.
11. Una composición que comprende el polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, el vector de la reivindicación 8, el CAR de la reivindicación 9, o la célula de la reivindicación 10.
12. Un método in vitro para producir una célula que expresa un CAR que comprende transducir una célula con el polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 en condiciones adecuadas, que comprende opcionalmente además aislar la célula.
13. Una célula que comprende el polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, el vector de la reivindicación 8 o el CAR de la reivindicación 9 para su uso en un método de tratamiento de un cáncer induciendo una inmunidad contra un tumor.
14. El polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, el vector de la reivindicación 8, el CAR de la reivindicación 9, la célula de la reivindicación 10, o la composición de la reivindicación 11 para su uso en un método de tratamiento de un cáncer en un sujeto, en el que el cáncer es preferiblemente un cáncer hematológico.
15. El método de la reivindicación 14, en el que el cáncer es mieloma múltiple, enfermedad de Hodgkin, linfoma no Hodgkin (NHL), linfoma mediastínico primario de células B grandes (PMBC), linfoma difuso de células B grandes (DLBCL), linfoma folicular (FL), linfoma folicular transformado, linfoma esplénico de la zona marginal (SMZL), leucemia crónica o aguda, leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crónica, leucemia linfoblástica aguda (ALL) (incluida la ALL no de células T), leucemia linfocítica crónica (CLL), linfoma de células T, uno o más de leucemia linfoide aguda de células B ("BALL"), leucemia linfoide aguda de células T ("TALL"), leucemia linfoide aguda (ALL), leucemia mielógena crónica (CML), leucemia prolinfocítica de células B, neoplasia de células dendríticas plasmocitoides blásticas, linfoma de Burkitt, linfoma difuso de células B grandes, linfoma folicular, leucemia de células pilosas, linfoma folicular de células pequeñas o células grandes, afecciones linfoproliferativas malignas, linfoma MALT, linfoma de células del manto, linfoma de la zona marginal, mielodisplasia y mielodisplasia y síndrome mielodisplásico, linfoma plasmoblástico, neoplasia de células dendríticas plasmocitoides, macroglobulinemia de Waldenstrom, un trastorno proliferativo de células plasmáticas (por ejemplo, mieloma asintomático (mieloma múltiple latente o mieloma indolente), gammapatía monoclonal de significado indeterminado (MGUS), plasmacitomas (por ejemplo, discrasias de células plasmáticas, mieloma solitario, plasmacitoma solitario, plasmacitoma extramedular, y plasmacitoma múltiple), amiloidosis de cadena ligera amiloide sistémica, síndrome POEMS (también conocido como síndrome de Crow-Fukase, enfermedad de Takatsuki, y síndrome PEP).
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