TW202321305A - Ｃｄ７０結合分子及使用彼之方法 - Google Patents

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Abstract

本揭露提供包括特異性結合到CD70的抗原結合分子之抗-CD70抗體、其抗原結合片段、嵌合抗原受體(CAR)和經工程處理之T細胞受體(TCR)、編碼彼等之多核苷酸及包含彼等之體外細胞。本文描述之多核苷酸、多肽及體外細胞可用於經工程處理之TCR及/或CAR T細胞療法以用於治療罹患癌症之患者。在一具體實施例中，本文描述之多核苷酸、多肽及體外細胞可用於治療多發性骨髓瘤。

Description

ＣＤ７０結合分子及使用彼之方法
本揭露關於包含與CD70結合之抗原結合分子的嵌合抗原受體(CAR)及經工程處理之T細胞受體(TCR)、編碼彼等之多核苷酸及使用彼等治療患者之癌症的方法。 相關申請案之交叉參考資料
本申請案主張2017年2月14日申請之美國臨時專利申請案號第62/458,879號的優先權；其整體以引用方式併入本文。 序列表
本申請案包含已經以ASCII格式經電子提交之序列表且其整體以引用方式併入本文。該創建於2018年2月8日之ASCII副本稱為K-1034_02_SL.txt且為大小183,361千位元組。
人類癌症本質上係包括經歷遺傳或表觀遺傳轉化而變成異常癌細胞之正常細胞。當如此轉變時，癌細胞開始表現與由正常細胞表現者不同的蛋白質及其他抗原。這些異常腫瘤抗原可被身體之先天免疫系統用來特異性靶向並殺死癌細胞。然而，癌細胞採用各種機制來阻止免疫細胞(諸如T和B淋巴細胞)成功靶向癌細胞。
人類T細胞治療係依賴經富集或修飾之人類T細胞來靶向並殺死患者之癌細胞。為了增加T細胞靶向和殺死特定癌細胞之能力，現已研發用於工程處理T細胞以表現指導T細胞對準特定之靶的癌細胞之構築體的方法。包含能與特定之腫瘤抗原交互作用之結合結構域的嵌合抗原受體(CAR)及經工程處理之T細胞受體(TCR)可允許T細胞靶向並殺死表現該特定之腫瘤抗原的癌細胞。
目前用於血液惡性腫瘤之療法已證明不同程度之效果。因此，存在鑑定新穎且經改良之用於治療與CD70相關之疾病和失調的療法的需求。
在一態樣中，提供編碼嵌合抗原受體(CAR)或T細胞受體(TCR)之單離之多核苷酸包含特異性結合CD70之抗原結合分子。在一具體實施例中，抗原結合分子包含：(a)重鏈可變區(VH)互補決定區(CDR)1，其包含選自下列所組成群組的胺基酸序列、由選自下列所組成群組的胺基酸序列所組成或基本上由選自下列所組成群組的胺基酸序列所組成：GFTFSSY (SEQ ID NO：71)、GDSIISGGY (SEQ ID NO：73)及GYTFTSY (SEQ ID NO：75)；(b)重鏈可變區(VH)互補決定區(CDR)2，其包含選自下列所組成群組的胺基酸序列、由選自下列所組成群組的胺基酸序列所組成或基本上由選自下列所組成群組的胺基酸序列所組成：WYDGSN (SEQ ID NO：72)、FYSGS (SEQ ID NO：74)及DPSGGS (SEQ ID NO：76)；(c)重鏈可變區(VH)互補決定區(CDR)3，其包含選自下列所組成群組的胺基酸序列、由選自下列所組成群組的胺基酸序列所組成或基本上由選自下列所組成群組的胺基酸序列所組成：DLLRGVKGYAMDV (SEQ ID NO：64)、SGYSYALFDH (SEQ ID NO：67)及DYGDYVFDY (SEQ ID NO：76)；(d)輕鏈可變區(VL)互補決定區(CDR)1，其包含選自下列所組成群組的胺基酸序列、由選自下列所組成群組的胺基酸序列所組成或基本上由選自下列所組成群組的胺基酸序列所組成：RASQSLRRIYLA (SEQ ID NO：53)、RASQFIGRYFN (SEQ ID NO：56)、及SGSSSNIGTNTVN (SEQ ID NO：59)；(e)輕鏈可變區(VL)互補決定區(CDR)2，其包含選自下列所組成群組的胺基酸序列、由選自下列所組成群組的胺基酸序列所組成或基本上由選自下列所組成群組的胺基酸序列所組成：DVFDRAT (SEQ ID NO：54)、AESSLQS (SEQ ID NO：57)、及INNQRPS (SEQ ID NOL 60)；(f)輕鏈可變區(VL)互補決定區(CDR)3，其包含選自下列所組成群組的胺基酸序列、由選自下列所組成群組的胺基酸序列所組成或基本上由選自下列所組成群組的胺基酸序列所組成：QQYSDSPFT (SEQ ID NO：55)、QQSYSTPFT (SEQ ID NO：58)、及ATWDDSLNGPVV (SEQ ID NO：61)。在一具體實施例中，VH CDR3包含選自下列所組成群組之胺基酸序列：SEQ ID NO：64、67及70。
在另一態樣中，揭露編碼嵌合抗原受體(CAR)或T細胞受體(TCR)之單離之多核苷酸包含特異性結合CD70之抗原結合分子。在一具體實施例中，抗原結合分子包含VH CDR3，其包含選自下列所組成群組之胺基酸序列：SEQ ID NO：64、67及70。在一具體實施例中，VH CDR1包含選自下列所組成群組之胺基酸序列：SEQ ID NO：71、73及75。
在另一具體實施例中，VH CDR2包含選自由SEQ ID NO：72、74及76所組成群組之胺基酸序列。
在另一具體實施例中，VL CDR1包含選自由SEQ ID NO：53、56及59所組成群組之胺基酸序列。在另一具體實施例中，VL CDR2包含選自由SEQ ID NO：54、57及60所組成群組之胺基酸序列。在另一具體實施例中，VL CDR3包含選自由SEQ ID NO：55、58及61所組成群組之胺基酸序列。
在另一具體實施例中，VH CDR1、VH CDR2、及VH CDR3各包含在圖7A、7C或7E中所示之可變輕鏈的VH CDR1、VH CDR2、及VH CDR3之胺基酸序列。
在另一具體實施例中，VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3各包含圖7B、7D或7F中之抗體之VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的胺基酸序列。在另一具體實施例中，抗原結合分子包含重鏈可變區序列，其包含選自由SEQ ID NO：3、7及11所組成群組之胺基酸序列。
在另一具體實施例中，抗原結合分子包含輕鏈可變區序列，其包含選自由SEQ ID NO：5、9及13所組成群組之胺基酸序列。
在另一具體實施例中，抗原結合分子包括下列之一：(a)VH CDR1區，其包含SEQ ID NO：71之胺基酸序列；VH CDR2區，其包含SEQ ID NO：72之胺基酸序列；VH CDR3區，其包含SEQ ID NO：64之胺基酸序列；VL CDR1區，其包含SEQ ID NO：53之胺基酸序列；VL CDR2區，其包含SEQ ID NO：54之胺基酸序列；及VL CDR3區，其包含SEQ ID NO：55之胺基酸序列；(b)VH CDR1區，其包含SEQ ID NO：73之胺基酸序列；VH CDR2區，其包含SEQ ID NO：74之胺基酸序列；VH CDR3區，其包含SEQ ID NO：67之胺基酸序列；VL CDR1區，其包含SEQ ID NO：56之胺基酸序列；VL CDR2區，其包含SEQ ID NO：57之胺基酸序列；及VL CDR3區，其包含SEQ ID NO：58之胺基酸序列；或(c)VH CDR1區，其包含SEQ ID NO：75之胺基酸序列；VH CDR2區，其包含SEQ ID NO：76之胺基酸序列；VH CDR3區，其包含SEQ ID NO：70之胺基酸序列；VL CDR1區，其包含SEQ ID NO：59之胺基酸序列；VL CDR2區，其包含SEQ ID NO：60之胺基酸序列；及VL CDR3區，其包含SEQ ID NO：61之胺基酸序列。在另一具體實施例中，抗原結合分子包括下列之一：(a)VH，其包含SEQ ID NO：3之胺基酸序列；及VL，其包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列；(b)VH，其包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列；及VL，其包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列；或(c)VH，其包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列；及VL，其包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列。
在另一具體實施例中，核苷酸序列為與選自SEQ ID NO：2及4所組成群組之核苷酸序列至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、或約100%同一性。
在另一具體實施例中，核苷酸序列與選自SEQ ID NO：6及8所組成群組之核苷酸序列為至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、或約100%同一性。
在另一具體實施例中，核苷酸序列與選自SEQ ID NO：10及12所組成群組之核苷酸序列為至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、或約100%同一性。
在另一具體實施例中，抗原結合分子為單鏈。
在各種具體實施例中，抗原結合分子係選自下列所組成群組：scFv、Fab、Fab’、Fv、F(ab’) 2、dAb、及其任何組合，且在一特定具體實施例中，抗原結合分子包含scFv。
在另一具體實施例中，VH及VL藉由連接子連接。在一特定具體實施例中，VH係位於連接子之N端且VL係位於連接子之C端，且在另一具體實施例中，VL係位於連接子之N端且VH係位於連接子之N端。
在另一具體實施例中，連接子包含至少約5、至少約8、至少約10、至少約13、至少約15、至少約18、至少約20、至少約25、至少約30、至少約35、至少約40、至少約45、至少約50、至少約60、至少約70、至少約80、至少約90、或至少約100個胺基酸，且另一具體實施例中，連接子包含與SEQ ID NO：80及81之一的胺基酸序列至少75%、至少85%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同一性的胺基酸序列。
在另一具體實施例中，抗原結合分子以少於約1×10 -6M、少於約1×10 -7M、少於約1×10 -8M、或少於約1×10 -9M之K D結合CD70。
在另一具體實施例中，CAR或TCR進一步包含恆定區，且在另一具體實施例中，CAR或TCR進一步包含跨膜結構域，並在又另外的具體實施例中。跨膜結構域為下列之跨膜結構域：CD28、4-1BB/CD137、CD8 α、CD4、CD19、CD3 ε、CD45、CD5、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、T細胞受體之α鏈、T細胞受體之β鏈、T細胞受體之ζ鏈或彼等之任何組合。在一特定具體實施例中，跨膜結構域為CD28T跨膜結構域。在另一具體實施例中，CD28T跨膜結構域包含與SEQ ID NO：15或19至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、或約100%同一性之胺基酸序列。
在另一具體實施例中，CD28T跨膜結構域係由與SEQ ID NO：16或18至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、或約100%同一性之核苷酸序列編碼。
在另一具體實施例中，跨膜結構域為CD8 α跨膜結構域。在另一具體實施例中，CD8 α跨膜結構域包含與SEQ ID NO：17、21或94至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、或約100%同一性之胺基酸序列。
在另一具體實施例中，CD8 α跨膜結構域係由與SEQ ID NO：16或20至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、或約100%同一性之核苷酸序列編碼。
在另一具體實施例中，CAR或TCR進一步包含介於該跨膜結構域與該抗原結合分子之間的鉸鏈區。在另一具體實施例中，鉸鏈區包含IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgD、IgE、IgM、CD28、或CD8 α之全部或片段。在另一具體實施例中，鉸鏈區為CD28T之鉸鏈區。在另一具體實施例中，其中，鉸鏈區包含與選自SEQ ID NO：15、及83所組成群組之序列至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、或約100%同一性之胺基酸序列。在另一具體實施例中，鉸鏈區係由與選自SEQ ID NO：14及82所組成群組之序列至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、或約100%同一性之核苷酸序列編碼。
在另一具體實施例中，鉸鏈區為CD8 α之鉸鏈區。在另一具體實施例中，鉸鏈區包含與選自SEQ ID NO：17及85所組成群組之序列至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、或約100%同一性之胺基酸序列，且在另一具體實施例中，鉸鏈區係由與選自SEQ ID NO：16及84所組成群組之序列至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、或約100%同一性之核苷酸序列編碼。
在另一具體實施例中，CAR或TCR進一步包含共刺激區。在另一具體實施例中，共刺激區為CD2、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD4、CD7、CD8α、CD8β、CD11a (ITGAL)、CD11b (ITGAM)、CD11c (ITGAX)、CD11d (ITGAD)、CD18 (ITGB2)、CD19 (B4)、CD27 (TNFRSF7)、CD28、CD28T、CD29 (ITGB1)、CD30 (TNFRSF8)、CD40 (TNFRSF5)、CD48 (SLAMF2)、CD49a (ITGA1)、CD49d (ITGA4)、CD49f (ITGA6)、CD66a (CEACAM1)、CD66b (CEACAM8)、CD66c (CEACAM6)、CD66d (CEACAM3)、CD66e (CEACAM5)、CD69 (CLEC2)、CD79A (B-細胞抗原受體複合物-相關之α鏈)、CD79B (B-細胞抗原受體複合物-相關之β鏈)、CD84 (SLAMF5)、CD96 (Tactile)、CD100 (SEMA4D)、CD103 (ITGAE)、CD134 (OX40)、CD137 (4-1BB)、CD150 (SLAMF1)、CD158A (KIR2DL1)、CD158B1 (KIR2DL2)、CD158B2 (KIR2DL3)、CD158C (KIR3DP1)、CD158D (KIRDL4)、CD158F1 (KIR2DL5A)、CD158F2 (KIR2DL5B)、CD158K (KIR3DL2)、CD160 (BY55)、CD162 (SELPLG)、CD226 (DNAM1)、CD229 (SLAMF3)、CD244 (SLAMF4)、CD247 (CD3-ζ)、CD258 (LIGHT)、CD268 (BAFFR)、CD270 (TNFSF14)、CD272 (BTLA)、CD276 (B7-H3)、CD279 (PD-1)、CD314 (NKG2D)、CD319 (SLAMF7)、CD335 (NK-p46)、CD336 (NK-p44)、CD337 (NK-p30)、CD352 (SLAMF6)、CD353 (SLAMF8)、CD355 (CRTAM)、CD357 (TNFRSF18)、可誘導之T細胞共刺激物(ICOS)、LFA-1 (CD11a/CD18)、NKG2C、DAP-10、ICAM-1、NKp80 (KLRF1)、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-7Rα、LFA-1、SLAMF9、LAT、GADS (GrpL)、SLP-76 (LCP2)、PAG1/CBP、CD83配體、Fcγ受體、MHC第1類分子、MHC第2類分子、TNF受體蛋白質、免疫球蛋白蛋白質、細胞介質受體、整合素、活化之NK細胞受體、Toll配體受體、及或其片段或組合之訊號傳導區。
在另一具體實施例中，共刺激區為CD28共刺激區。在另一具體實施例中，共刺激區包含與SEQ ID NO：23至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、或約100%同一性之胺基酸序列，且在另一具體實施例中，共刺激區係由與SEQ ID NO：22至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、或約100%同一性之核苷酸序列編碼。
在另一具體實施例中，共刺激區為CD137 (4-1BB)共刺激區。在另一具體實施例中，共刺激區包含與SEQ ID NO：25至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、或約100%同一性之胺基酸序列且在另一具體實施例中，共刺激區係由與SEQ ID NO：24至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、或約100%同一性之核苷酸序列編碼。
在另一具體實施例中，CAR或TCR進一步包含活化結構域。並且，在另一具體實施例中，活化結構域為CD3 ζ結構域。在另一具體實施例中，活化結構域包含與SEQ ID NO：27或92至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、或約100%同一性之胺基酸序列，且在另一具體實施例中，活化結構域係由與SEQ ID NO：26至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、或約100%同一性之核苷酸序列編碼。
在另一具體實施例中，CAR或TCR進一步包含前導肽。在另一具體實施例中，前導肽包含與SEQ ID NO：28至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、或約100%同一性之胺基酸序列，且在另一具體實施例中，前導肽係由與SEQ ID NO：95至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、或約100%同一性之核苷酸序列編碼。
在另一態樣中，提供編碼CAR或TCR之多核苷酸。在一特定具體實施例中，多核苷酸係選自下列所組成群組：SEQ ID NO：29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49及51。在另一態樣中，包含本文所揭露之多核苷酸任一之載體。在另一具體實施例中，載體為反轉錄病毒載體、DNA載體、質體、RNA載體、腺病毒載體、腺病毒相關載體、慢病毒載體、或其任何組合。
在另一態樣中，CAR或TCR由本文所揭露之多核苷酸或本文所揭露之載體編碼。在另一態樣中，提供包含本文所揭露之多核苷酸、本文所揭露之載體、本文所揭露之CAR或TCR、或其任何組合之細胞。在另一具體實施例中，細胞包含免疫細胞，且在另一具體實施例中，細胞為T細胞。在另一具體實施例中，T細胞為腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)、自體T細胞、經工程處理之自體T細胞(eACT)、同種異體T細胞、或其任何組合，且在另一具體實施例中，細胞為體外細胞。
在另一態樣中，組成物包含本文所揭露之多核苷酸、本文所揭露之載體、本文所揭露之CAR或TCR、或本文所揭露之細胞。在另一具體實施例中，組成物經調配以遞送到個體。
在另一態樣中，製造表現CAR或TCR的細胞之方法包含在適當條件下，以本文所揭露之多核苷酸轉導細胞。在另一具體實施例中，方法進一步包含單離細胞。
在另一態樣中，提供誘導針對腫瘤之免疫性之方法，且在一具體實施例中包含投予到個體有效量的包含本文所揭露之多核苷酸、本文所揭露之載體、或本文所揭露之CAR或TCR之細胞。
在另一態樣中，提供治療有其需要之個體的癌症之方法，且在一具體實施例中包含投予到個體本文所揭露之多核苷酸、本文所揭露之載體、本文所揭露之CAR或TCR、本文所揭露之細胞、或本文所揭露之組成物。在一具體實施例中，癌症為血液癌症。在另一具體實施例中，癌症為白血球之癌症。在進一步具體實施例中，癌症為漿細胞之癌症。在另一具體實施例中，癌症為白血病、淋巴瘤、或骨髓瘤。在一特定具體實施例中，癌症為多發性骨髓瘤、何杰金氏症、非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、原發性縱隔大B細胞淋巴瘤(PMBC)、瀰漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、濾泡性淋巴瘤(FL)、經轉形之濾泡性淋巴瘤、脾邊緣區淋巴瘤(SMZL)、慢性或急性白血病、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、急性淋巴母細胞性白血病(ALL) (包括非T細胞ALL)、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、T細胞淋巴瘤、一或多種B細胞急性淋巴性白血病(“BALLˮ)、T細胞急性淋巴性白血病(“TALLˮ)、急性淋巴性白血病(ALL)、慢性骨髓性白血病(CML)、B細胞幼淋巴細胞性白血病、母細胞性漿細胞樣樹突細胞瘤、伯基特氏(Burkitt’s)淋巴瘤、瀰漫性大B細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、髮細胞性白血病、小細胞或大細胞濾泡性淋巴瘤、惡性淋巴增殖條件、MALT淋巴瘤、套細胞淋巴瘤、邊緣區淋巴瘤、脊髓發育不良和骨髓增生異常症候群、漿母細胞淋巴瘤、漿細胞樣樹突細胞瘤、瓦爾登斯特倫(Waldenstrom)巨球蛋白血症、漿細胞增殖性失調(例如無症狀之骨髓瘤(鬱積型多發性骨髓瘤或無痛骨髓瘤))、意義不明之單株γ球蛋白病(MGUS)、漿細胞瘤(例如漿細胞惡液質、孤立性骨髓瘤、孤立性漿細胞瘤、髓外漿細胞瘤和多發性漿細胞瘤)、全身性澱粉樣蛋白輕鏈澱粉樣變性、POEMS症候群(亦稱為Crow-Fukase症候群、Takatsuki病和PEP症候群)或其組合。在一特定具體實施例中，癌症為多發性骨髓瘤。亦揭露為CAR或TCR，其中，CAR或TCR包含選自下列所組成群組之胺基酸序列：SEQ ID NO：30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50及52。在各種具體實施例中，CAR或TCR包含不存在SEQ ID NO：30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50及52之前導序列。
本揭露關於結合CD70之抗體、其抗原結合分子、嵌合抗原受體(CAR)及經工程處理之T細胞受體(TCR)、編碼彼等之多核苷酸及包含彼等之體外細胞。本文所描述之多核苷酸、多肽及體外細胞可用於經工程處理之CAR T細胞療法(例如自體細胞療法(eACT TM))中以用於治療罹患癌症之患者。尤其是，本文所描述之多核苷酸、多肽和體外細胞可用於治療多發性骨髓瘤。 定義
為了更容易地理解本揭示內容，首先定義一些術語。除非本文另有明確提供外，如本申請案中所使用之下列各術語應具有下文中所闡明之含義。另外之定義闡明於本申請案之全文中。本文提供的標題不為本揭露之各種態樣的限制，參考整個說明書可以理解該些態樣。
應理解的是，每當本文中以語言“包含ˮ描述態樣時，亦提供依據“由......組成ˮ及/或“基本上由......組成ˮ描述之其他類似態樣。
替代(例如“或ˮ)的使用應理解為係指其中之一、二者、或替代的其任何組合。如本文所用，不定冠詞“一(a)ˮ或“一(an)ˮ應理解為係指任何所主張或枚舉之組分的“一或多個ˮ。
本文使用之術語“及/或ˮ將被視為具體揭示該具體指明之二種特性或組分的各者(有或無另一者之存在)。因此，本文之片語(諸如“A及/或Bˮ)中所使用的術語“及/或ˮ旨在包括“A和Bˮ、“A或Bˮ、“Aˮ(單獨)和“Bˮ(單獨)。同樣地，本文之片語(諸如“A、B及/或Cˮ)中所使用之術語“及/或ˮ旨在涵蓋下列各態樣：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(單獨)；B(單獨)；和C(單獨)。
本文所使用之單位、前置代號和符號係使用其國際單位制(Système International de Unites, SI)接受之形式提供。數值範圍包括界定該範圍之數目。
除非另有定義，本文所使用之所有技術和科學術語具有與本發明之相關領域中的一般技術人士所通常理解之相同含義。例如，Juo, The Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, 2 nded., (2001), CRC Press; The Dictionary of Cell & Molecular Biology, 5 thed., (2013), Academic Press；及 The Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Cammack等人eds., 2 nded, (2006), Oxford University Press，提供發明所屬技術領域中具有通常知識者本揭示中所使用之許多術語的一般詞典。
如本文所用，二十種習知(例如天然產生的)胺基酸及彼等之縮寫係遵循常規用法。見，例如 Immunology-A Synthesis(2nd Edition), Golub and Green, eds., Sinauer Assoc., Sunderland, Mass. (1991)，該篇以引用方式併入本文以用於任何目的。二十種習知胺基酸之立體異構物(例如D-胺基酸)、非天然胺基酸，諸如α-,α-二取代之胺基酸、N-烷基胺基酸、乳酸及其他非習知之胺基酸亦可為本揭露多肽之合適組分。非習知胺基酸之實例包括：4-羥基脯胺酸、γ-羧基麩胺酸鹽、ε-N,N,N-三甲基離胺酸、e-N-乙醯基離胺酸、O-磷酸絲胺酸、N-乙醯基絲胺酸、N-甲醯基甲硫胺酸、3-甲基組胺酸、5-羥基離胺酸、σ-N-甲基精胺酸及其他類似之胺基酸和亞胺基酸(例如4-羥基脯胺酸)。在本文所使用之多肽表示法中，根據標準用法和慣例，左手方向為胺基端方向而右手方向為羧基端方向。
如本文所用，術語“約ˮ係指在由發明所屬技術領域中具有通常知識者測定之特定數值或組成之可接受的誤差範圍內的數值或組成，其將部分取決於該數值或組成是如何測量或測定的，即，該測量系統之限制。例如，“約ˮ或“基本上包括ˮ可意指依照本領域實行在一或一個以上之標準偏差內。或者，“約ˮ或“基本上包括ˮ可意指在高達10%之範圍內(即±10%)。例如約5mg可包括介於4.5mg至5.5mg之間的任何數值。再者，尤其當與生物系統或處理程序相關時，該術語可指至多一個數量級或至多為數值之5倍。除非另有說明，當本發明中提供特定之數值或組成時，“約ˮ或“基本上包括ˮ的含義應當被假定為在該特定數值或組成之可接受的誤差範圍內。
除非另外指明，如本文所描述之任何濃度範圍、百分比範圍、比例範圍或整數範圍應被理解為包括在該列舉之範圍內的任何整數之數值，且當適當時，包括該整數之分數(諸如整數的十分之一和百分之一)。
“投予ˮ係指使用發明所屬技術領域中具有通常知識者已知之各種方法和遞送系統的任一者來將試劑物理引入個體中。用於本文所揭示之調配物的示例性投予途徑包括靜脈內、肌肉內、皮下、腹膜內、脊柱或其他腸胃外投予途徑，例如藉由注射或輸注。如本文所使用之片語“腸胃道外投予ˮ意指除了腸內和局部投予外之投予模式，通常係藉由注射投予，包括，但不限於靜脈內、肌肉內、動脈內、鞘內、淋巴管內、病灶內、囊內、眶內、心內、皮內、腹膜內、經氣管、皮下、表皮下、關節內、囊下、蜘蛛網膜下、脊柱內、硬膜外和胸骨內注射和輸注，以及體內電穿孔。在一些具體實施例中，該調配物係經由非腸胃道外途徑投予 ，例如口服。其他非腸胃道外途徑包括局部、表皮或黏膜投予途徑，例如鼻內、陰道、直腸、舌下或局部投予途徑。投予亦可執行，例如一次、多次及/或在一或多個延長之期間內執行。
術語“抗體ˮ(Ab)包括，但不限於與抗原特異性結合之糖蛋白免疫球蛋白。一般而言，抗體可至少包含藉由二硫鍵相互連接之二個重(H)鏈和二個輕鏈(L)鏈，或其抗原結合分子。各H鏈包含重鏈可變區(本文縮寫為VH)及重鏈恆定區。該重鏈恆定區包含三個恆定結構域CH1、CH2和CH3。各輕鏈包含輕鏈可變區(本文縮寫為VL)及輕鏈恆定區。該輕鏈恆定區包含一個恆定結構域，CL。該VH和VL區可被進一步細分為高可變區，稱為互補決定區(CDR)，其間穿插較被保留之區，稱為框架區(FR)。各VH和VL包含三個CDR及四個FR，從胺基端至羧基端依下列順序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。該重鏈和輕鏈之可變區含有與抗原交互作用之結合結構域。該Ab之恆定區可介導免疫球蛋白與宿主組織或因子，包括各種免疫系統細胞(例如效應細胞)及經典補體系統之第一組分(C1q)結合。
抗體可包括，例如天然發生及非天然存在(重組產生的)抗體兩者、人類及非人類抗體、單特異性抗體、多特異性抗體(包括雙特異性抗體)、免疫球蛋白、合成抗體、包含二個重鏈和二個輕鏈分子之四聚體抗體、抗體輕鏈單體、抗體重鏈單體、抗體輕鏈二聚體、抗體重鏈二聚體、抗體輕鏈-抗體重鏈對、胞內抗體(intrabody) (見例如，Stocks, (2004) Drug Discovery Today9(22): 960-66)、抗體融合物(該術語涵蓋抗體-藥物共軛物)且本文中有時稱為“抗體共軛物ˮ)、異源共軛抗體、單結構域抗體、單價抗體、單鏈抗體或單鏈Fv(scFv)、駱駝化抗體、親和體(affybody)、Fab片段、F(ab’) 2片段、二硫鍵(disulfide)連接之Fvs(sdFv)、抗特應型(抗Id)抗體(包括，例如抗-抗-Id抗體)、微型抗體、結構域抗體、合成抗體(本文中有時稱為“抗體模擬物ˮ)及其抗原結合片段。於某些具體實施例中，本文所描述之抗體係指多株抗體群。
免疫球蛋白為四聚體分子，正常由兩對相同的多肽鏈構成，每一對具有一“輕ˮ (約25 kDa)及一“重ˮ鏈(約50-70 kDa)。各鏈的胺基端部分包括主要負責抗原識別之約100至130或更多胺基酸的可變區。各鏈的羧基端部分定義主要負責效應功能之恆定區。人類輕鏈分類為κ與λ輕鏈。重鏈分類為μ、δ、γ、α、或ε，且分別定義抗體的同型為IgM、IgD、IgG、IgA、或IgE。在輕鏈與重鏈中，可變區與恆定區藉由約12或更多個胺基酸之“Jˮ區連接，且重鏈亦包括約10更多胺基酸之“Dˮ區。一般見，Berzofsky & Berkower, Ch. 7在 Fundamental Immunology(Paul, W., ed., Lippincott Williams & Wilkins (2012)中；為所有目的，其章節及卷整體以引用方式併入)。各輕鏈/重鏈對的可變區形成抗體結合位點，使得完整免疫球蛋白具有二個主要結合位點。
免疫球蛋白可衍生自任何普遍所知之同型，包括，但不限於IgA、分泌型IgA、IgG和IgM。IgG子類別亦為發明所屬技術領域中具有通常知識者所熟知，且包括，但不限於人IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。“同型ˮ係指由重鏈恆定區基因編碼之抗體類別或子類別(例如IgM或IgG1)。舉例而言，術語“抗體ˮ包括天然存在及非天然存在之抗體；單株和多株抗體；嵌合及人源化抗體；人類或非人類抗體；全合成抗體；及單鏈抗體。非人類抗體可藉由重組方法人源化以減少其在人體內之免疫原性。除非上下文另有說明，當其中未明確說明時，術語“抗體ˮ亦包括任何上述免疫球蛋白任一之抗原結合片段或抗原結合分子，並包括單價和二價片段或部分及單鏈抗體(即scFv)。
如本文所用，術語“單鏈抗體ˮ及“單鏈片段可變(scFv)ˮ可互換使用且係指抗原結合分子，其中VL與VH區經由連接子連接以形成連續蛋白質鏈，其中，連接子夠長以使得蛋白質鏈自己折回且形成單價抗原結合位點(見例如，Bird等人，(1988) Science242: 423-26及Huston等人，(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.85: 5879-83 (1988)。
如本文所用，術語“雙體抗體(diabody)ˮ或dAB意指包含二個多肽鏈之二價抗體，其中，各多肽鏈包含由連接子連接之VH及VL結構域，連接子太短而不能在相同鏈上的二個結構域之間配對，因此允許各結構域與另一多肽鏈上的互補結構域配對(見例如，Holliger等人，(1993) Proc Natl Acad Sci U. S. A.90: 6444-48, Poljak等人，(1994) Structure2: 1121-23，及Perisic等人，(1994) Strucure2(12): 1217-26)。若雙體抗體的二個多肽鏈相同，則源自其配對的雙體抗體將具有二個相同的抗原結合位點。具有不同序列的多肽鏈可用來製造具有二個不同抗原結合位點之雙體抗體。同樣地，三體抗體(tribody)及四體抗體(tetrabody)為分別包含三及四個多肽鏈之抗體，且分別形成三個及四個抗原結合位點，其可為相同或不同。
如本文所用，術語“Fab片段ˮ意指為具有VL、VH、CL與CH結構域之單價片段；“F(ab’)2片段ˮ為具有二個Fab片段(在鉸鏈區由二硫鍵橋連接)之二價片段；“Fv片段ˮ具有抗體之單一臂的VH與VL結構域；及“dAb片段ˮ具有VH或VL結構域之VH結構域、VL結構域、或抗原-結合片段。
“抗原結合分子ˮ、“抗原結合部分ˮ或“抗體片段ˮ係指包含衍生該分子之抗體的抗原結合部分(例如CDR)之任何分子。抗原結合分子可包括抗原互補決定區(CDR)。抗體片段之實例包括，但不限於Fab、Fab’、F(ab’)2及Fv片段、dAb、線性抗體、scFv抗體及從抗原結合分子形成之多特異性抗體。肽抗體(即，包含肽結合結構域之Fc融合分子)為合適之抗原結合分子的另一實例。在一些具體實施例中，該抗原結合分子與腫瘤細胞上之抗原結合。在一些具體實施例中，該抗原結合分子與涉及過度增殖性疾病之細胞上的抗原或病毒抗原或細菌抗原結合。在一些具體實施例中，抗原結合分子與CD70結合。於進一步之具體實施例中，該抗原結合分子為其片段(包括其一或多個互補決定區(CDR))之抗體。於進一步之具體實施例中，該抗原結合分子為單鏈可變片段(scFv)。在一些具體實施例中，該抗原結合分子包含高親和性多聚體(avimer)或由高親和性多聚體(avimer)所組成。
抗原結合分子可包含，例如替代之蛋白質支架或具有移植之互補決定區(CDR)或CDR衍生物的人工支架。該等支架包括，但不限於衍生自抗體之支架，其包含被引入之突變以，例如穩定該抗原結合分子之三維結構及包含，例如生物相容之聚合物的全合成支架。見，例如Korndorfer等人，2003, Proteins: Structure, Function ，且 Bioinformatics, 53(1): 121-129 (2003); Roque等人， Biotechnol. Prog.20: 639-654 (2004)。此外，可使用肽抗體模擬物(“PAMˮ)及基於抗體模擬物之支架(其利用各種組分(例如纖維接合素)作為支架)。抗原結合分子可具有，例如天然存在之免疫球蛋白的結構。
抗原結合分子可形成CAR或TCR之組分，且可作用指導CAR或TCR辨識有興趣的目標(例如，CD70)。如本文所用，在所揭露的CAR或TCR內文中，抗原結合分子意指指導CAR或TCR到所欲目標且與該目標締合之CAR或TCR的任何組分。在特定具體實施例中，CAR或TCR的抗原結合分子組分包含scFv，其包含由連接子連接的重鏈與輕鏈可變區。重鏈與輕鏈可變區可衍生自相同抗體或二個不同抗體。用在CAR或TCR之抗原結合分子可衍生自已知抗體或懷疑結合到感興趣的目標之抗體。在特定具體實施例中，用在CAR或TCR之抗原結合分子包括包含SEQ ID NO：3與5、SEQ ID NO：7與9、及SEQ ID NO：11與13之胺基酸序列的序列對，其呈現於圖7A-7F。
如本文所使用，術語“可變區ˮ或“可變結構域ˮ可互換使用且係指抗體之一部分，一般而言為輕或重鏈之一部分，通常為抗體的約胺基端尾且包括在重鏈中約100至130個胺基酸及在輕鏈中約90至115個胺基酸，這在抗體間的序列上差異很大且係用於特定抗體為其特定抗原之結合及特異性。序列中之變異性集中在那些稱為互補決定區(CDR)之區域，而在可變結構域中被更高度保留之區域稱為框架區(FR)。輕鏈和重鏈之CDR主要負責抗體與抗原之交互作用和特異性。
在一些具體實施例中，可變區為人類可變區。在進一步的具體實施例中，可變區包含囓齒動物、人類或鼠類CDR與人類框架區(FR)。在進一步的具體實施例中，可變區為靈長類(例如，非人類靈長類)可變區。在又進一步具體實施例中，可變區為兔子可變區。在其他具體實施例中，可變區包含人類CDR與非人類(例如，兔子、鼠類、大鼠或非人類靈長類)框架區(FR)。在其他具體實施例中，可變區包含非人類(例如，兔子、鼠類、大鼠或非人類靈長類)CDR與人類框架區(FR)。
術語“VLˮ、“VL鏈ˮ或“VL結構域ˮ可互換使用且指抗原結合分子、抗體或其抗原結合片段之輕鏈可變區。
術語“VHˮ、“VH鏈ˮ及“VH結構域ˮ可互換使用且指抗原結合分子、指抗體或其抗原結合片段之重鏈可變區。
如本文所用，術語“互補決定區ˮ或“CDRˮ意指有助於抗原結合特異性和親和力之胺基酸序列。框架區可協助維持CDR之正確確認以促進抗原結合分子與抗原之間的結合。常用許多CDR的定義：Kabat編號、Chothia編號、接觸編號、AbM編號或IMGT編號。AbM定義為Oxford Molecular的AbM抗體建模軟體所使用的二種定義之間的折衷。接觸定義係基於對可用之複合物晶體結構之分析。表1摘要這些命名法系統的定義。
Figure 02_image001
術語“Kabat編號ˮ及類似術語為本領域所認可且係指抗體或其抗原結合分子之重鏈和輕鏈可變區中之編號胺基酸殘基的系統。於一些態樣中，抗體之CDR可根據Kabat編號系統測定(見例如，Kabat等人在Sequences of Proteins of lmmunological Interest, 5th Ed., NIH Publication 91-3242, Bethesda MD 1991)。使用Kabat編號系統，抗體重鏈分子內之CDR通常存在於胺基酸位置31至35(其在35之後可視需要地包括一或二個額外之胺基酸，在Kabat編號方案中稱為35A和35B) (CDR1)、胺基酸位置50至65(CDR2)及胺基酸位置95至102(CDR3)。使用該Kabat編號系統，抗體輕鏈分子內之CDR通常出現在胺基酸位置24至34(CDR1)、胺基酸位置50至56(CDR2)及胺基酸位置89至97(CDR3)。
於特定之具體實施例中，本文所描述之抗體的CDR可根據Kabat編號方案描述，如圖6所示(儘管它們可使用上表1之其他編號系統輕易地推斷)。圖6亦提供使用Chothia及IMGT編號方案的CDR。
於一些態樣中，抗體之CDR可根據Chothia編號方案決定，其係指該免疫球蛋白結構環之位置(見例如，Chothia C & Lesk AM, (1987), J Mol Biol196: 901-917; Al-Lazikani B等人，(1997) J Mol Biol273: 927-948; Chothia C等人，(1992) J Mol Biol227: 799-817; Tramontano A等人，(1990) J Mol Biol215(1): 175-82；及美國專利案第7,709,226號)。通常，當使用Kabat編號規則時，該Chothia CDR-H1環存在於重鏈胺基酸26至32、33或34，該Chothia CDR-H2環存在於重鏈胺基酸52至56，且該Chothia CDR-H3環存在於重鏈胺基酸95至102，而Chothia CDR-L1環存在於輕鏈胺基酸24至34，該Chothia CDR-L2環存在於輕鏈胺基酸50至56，且該Chothia CDR-L3環存在於輕鏈胺基酸89至97。當使用Kabat編號規則編號時，該Chothia CDR-HI環之終端根據環之長度而在H32與H34之間變化(這是因為Kabat編號方案將插入子放在H35A及H35B；若35A和35B都不存在，則該環結束於32；若僅有35A存在，則該環結束於33；若35A和35B均存在，則該環結束於34)。見表1。
於一特定之具體實施例中，本文所描述之抗體的CDR已根據Chothia編號方案決定，如圖6所示。
如本文所用，術語“恆定區ˮ及“恆定結構域ˮ可互換且具有本領域中常用之含義。恆定區為一抗體部分，例如不直接參與抗體與抗原結合，但可表現出各種效應子功能(諸如與Fc受體交互作用)之輕鏈及/或重鏈的羧基端部分。相對於免疫球蛋白可變結構域，免疫球蛋白分子之恆定區通常具有較被保留的胺基酸序列。
如本文所用，當相關於抗體使用時，術語“重鏈ˮ基於恆定結構域之胺基酸序列可指任一不同類型，例如α、δ、ε、γ及μ，其分別導致抗體之IgA、IgD、IgE、IgG和IgM類別，包括IgG之子類別，例如IgG 1、IgG 2、IgG 3及IgG 4。
如本文所用，當相關於抗體使用時，術語“輕鏈ˮ基於恆定結構域之胺基酸序列可指任一不同類型，例如κ或λ。輕鏈胺基酸序列為本領域所周知。於特定具體實施例中，該輕鏈為人類輕鏈。
如本文所用，術語“結合親和力ˮ係指介於分子(例如抗原結合分子，諸如抗體)之單一結合位點與其結合伴侶(例如抗原)之間的非共價交互作用之總和強度。除非另有說明，如本文所使用之“結合親和力ˮ係指內在結合親和力，其反映結合對的成員(例如抗體和抗原)之間的1：1交互作用。分子X對其伴侶Y之親和力通常可由解離常數(K D)表示。親和力可以本領域已知之多種方式測量及/或表現，包括，但不限於平衡解離常數(K D)及平衡締合常數(K A)。K D係從k 關/k 開之商數計算得到，而K A係從k 開/k 關之商數計算得到。k 開係指，例如抗體與抗原之締合速率常數，而k 關係指，例如抗體與抗原之解離速率常數。該k 開和k 關可藉由發明所屬技術領域中具有通常知識者已知之標準技術(諸如BIAcore ®或KinExA或表面電漿共振)測定。
如本文所用，“保守性胺基酸取代ˮ為其中胺基酸殘基被具有類似側鏈之胺基酸殘基替代之胺基酸取代。本領域中已定義具有側鏈之胺基酸殘基之家族。這些家族包括具有下列側鏈之胺基酸：鹼性側鏈(例如離胺酸、精胺酸、組胺酸)、酸性側鏈(例如天門冬胺酸、麩胺酸)、不帶電荷之極性側鏈(例如甘胺酸、天門冬醯胺、麩胺醯胺、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸、色胺酸)、非極性側鏈(例如丙胺酸、纈胺酸、亮胺酸、異亮胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸)、β-分支之側鏈(例如蘇胺酸、纈胺酸、異亮胺酸)及芳香族側鏈(例如酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸)。在一些具體實施例中，在抗體或其抗原結合片段之CDR內或在框架區內之一或多個胺基酸殘基可被具有類似側鏈之胺基酸殘基替代。
本揭露所涵蓋之保守性胺基酸取代可涵蓋非天然存在之胺基酸殘基，該非天然存在之胺基酸殘基通常係藉由化學肽合成法併入，而非在生物系統中合成。這些包括肽模擬物及其他反轉或倒置形式之胺基酸部分。天然存在之殘基可根據共同之側鏈性質來區分類別： 疏水性的：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile； 中性親水性的：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln； 酸性的：Asp、Glu； 鹼性的：His、Lys、Arg； 影響鏈方向之殘基：Gly、Pro；及 芳香族的：Trp、Tyr、Phe。
非保守性取代可能涉及將這些類別之一的成員與來自另一類別之成員交換。該等經取代之殘基可被引入，例如到與非人抗體同源之人類抗體的區域中，或引入到分子之非同源區。示例性之保守性胺基酸取代闡述於下列表2中。
Figure 02_image003
如本文所用，“抗原決定位ˮ為本領域中術語且係指抗原之局部區域，抗體可特異性結合此區域。抗原決定位可為，例如多肽之連續胺基酸(線性或連續抗原決定位)或者抗原決定位可，例如從多肽或多肽群之二或更多個非連續區域(構形、非線性、不連續或非連續之抗原決定位)集合在一起。在一些具體實施例中，與抗體結合之抗原決定位可藉由，例如NMR光譜法、X射線繞射結晶學研究、ELISA分析、與質譜分析(例如液相色層分析法、電噴霧質譜分析)聯用之氫/氘交換、基於陣列之寡肽掃描分析及/或誘變映射(mutagenesis mapping)(例如定點誘變映射)測定。在X射線結晶學方面，結晶化可使用本領域任何已知之方法完成(例如Giege等人，(1994) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr50(Pt 4): 339-350; McPherson, (1990) Eur J Biochem189: 1-23; Chayen, (1997) Structure5: 1269-1274; McPherson, (1976) J Biol Chem251: 6300-6303)。抗體：抗原晶體可使用為人周知之X射線繞射技術進行研究並可使用電腦軟體精修，諸如使用X-PLOR(Yale University, 1992，由Molecular Simulations, Inc.分銷；見例如， Meth Enzymol(1985) Vols 114 & 115, eds Wyckoff等人))及BUSTER (Bricogne, (1993) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr49(Pt 1): 37-60；Bricogne, (1997) Meth Enzymol276A: 361-423, ed. Carter；Roversi等人，(2000) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr56(Pt 10): 1316-1323)。誘變映射研究可使用發明所技術領域中具有通常知識者已知之任何方法完成。參見，例如，Champe等人，(1995) J Biol Chem270: 1388-94及Cunningham & Wells, (1989) Science244: 1081-85之關於誘變技術之描述，包括丙胺酸及精胺酸掃描誘變技術。
如本文所用，術語“交叉競爭ˮ係指其中抗原(例如，CD70)與第一抗原結合分子或其結合片段的交互作用阻擋、限制、抑制或者減少參考抗原結合分子或其結合片段(諸如本文提供的抗原結合分子、CAR與TCR)與抗原交互作用的能力之情況。交叉競爭可為完全的，例如結合分子與抗原之結合完全阻斷該參考結合分子與抗原結合之能力，或者交叉競爭可為部分的，例如該結合分子與抗原之結合降低該參考結合分子與抗原結合之能力。在一些具體實施例中，與參考抗原結合分子交叉競爭之抗原結合分子係與該參考抗原結合分子結合至相同或重疊之抗原決定位。於其他具體實施例中，與參考抗原結合分子交叉競爭之抗原結合分子係較該參考抗原結合分子結合至不同之抗原決定位。多種類型之競爭性結合分析可用來測定一個抗原結合分子是否與另一分子競爭，例如：固相直接或間接放射免疫分析(RIA)；固相直接或間接酶免疫分析(EIA)；夾心競爭分析(Stahli等人，(1983) Method Enzymol9:242-53)；固相直接生物素-親和素EIA(Kirkland等人，(1986) J Immunol137:3614-19)；固相直接標記分析、固相直接標記夾心分析(Harlow and Lane, 1988, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press)；使用I 125標記之固相直接標記RIA (Morel等人，(1988) Molec Immunol25:7-15)；固相直接生物素-親和素EIA(Cheung等人，(1990) Virology176:546-52)；及直接標記之RIA (Moldenhauer等人，(1990) Scand J Immunol32:77-82)。
如本文所用，在抗體之背景下，術語“免疫特異性結合ˮ、“免疫特異性識別ˮ、“特異性結合ˮ及“特異性識別ˮ為類似術語且如發明所屬技術領域中具有通常知識者所理解之該等結合係指與抗原(例如抗原決定位或免疫複合物)結合之分子。例如，特異性結合一抗原之分子可以，一般而言，以低親和力與其他肽或多肽類結合，該親和力為藉由，例如免疫分析、BIAcore ®、KinExA 3000儀器(Sapidyne Instruments, Boise, ID)或本領域中已知之其他分析測定。於一特定之具體實施例中，該特異性結合一抗原之分子係以至少2對數(log)、2.5對數、3對數、4對數之K A或以較該分子與另一抗原結合時之K A更大之K A與該抗原結合。
於另一具體實施例中，特異性結合抗原(例如，CD70)之分子，以及包括此序列的分子與呈現此分子的細胞)以約1×10 -7M之解離常數(K d)結合。在一些具體實施例中，當K d為約1×10 -9M至約5×10 -9M時，抗原結合分子以“高親和力ˮ特異性結合抗原(例如，CD70)。在一些具體實施例中，當K d為1×10 -10M至約5×10 -10M時，抗原結合分子以“非常高之親和力ˮ特異性結合抗原(例如，CD70)。
於另一具體實施例中，特異性結合抗原之分子在類似之結合條件下不與其他蛋白質交叉反應。於另一具體實施例中，該特異性結合抗原之分子不與其他非CD70蛋白交叉反應。於一特定具體實施例中，本文提供抗體或其片段，該抗體或其片段與CD70結合之親和力較其與另一無關抗原結合之親和力來得高。於某些具體實施例中，本文提供抗體或其片段，該抗體或其片段與CD70(例如人類CD70)結合之親和力較其與另一無關抗原結合之親和力高出20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更多，該結合親和力係藉由，例如放射免疫分析、表面電漿共振或動力學排除分析測量。於一特定具體實施例中，本文所描述之抗CD70抗體或其抗原結合片段與無關之非CD70蛋白質結合的程度較該抗體與CD70蛋白質結合程度小10%、15%或20%(此係藉由，例如放射免疫分析測量)。
於一特定具體實施例中，本文提供抗體或其片段，該抗體或其片段與人類CD70結合之親和力較其與另一物種之CD70結合之親和力來得高。在一些具體實施例中，本文提供抗體或其片段，該抗體或其片段與人類CD70結合之親和力較其與另一物種之CD70結合之親和力高出5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%或更高，該結合親和力係藉由，例如放射免疫分析、表面電漿共振或動力學排除分析測量。於一特定具體實施例中，本文所描述之與人類CD70結合之抗體或其片段與另一物種之CD70蛋白質結合將較抗體或其片段與人類CD70蛋白質之結合少10%、15%或20%，該結合係藉由，例如放射免疫分析、表面電漿共振或動力學排除分析測量。
“抗原ˮ係指任何能引發免疫反應或能被抗體或抗原結合分子結合之分子。免疫反應可能涉及抗體產生或特異性免疫能力細胞之活化，或此二者。發明所屬技術領域中具有通常知識者將能輕易理解任何大分子(包括幾乎所有的蛋白質或肽)均可作為抗原。一般來說，抗原可內源性地表現，即由基因組DNA表現，或其可重組表現，或其可化學合成。抗原可特異於某些組織，諸如癌細胞或者其可廣泛地表現。此外，較大分子之片段可作為抗原。在一具體實施例中，抗原為腫瘤抗原。在一些具體實施例中，該抗原為CD70，其可視需要與佐劑(諸如鑰孔蟲戚血藍蛋白(keyhole limpet hemocyanin) (KLH))共軛。
術語“中和ˮ係指結合配體(例如，CD70)並防止或降低該配體之生物學效果的抗原結合分子、scFv、抗體或其片段。在一些具體實施例中，抗原結合分子、scFv、抗體或其片段直接阻斷配體上之結合位點或透過間接方式(諸如配體之結構或能量改變)改變配體之結合能力。在一些具體實施例中，抗原結合分子、scFv、抗體或其片段防止與其結合之蛋白質執行生物功能。
如本文所用，術語“CD70ˮ意指屬於腫瘤壞死因子(TNF)配體家族的分子，且亦已知為CD27LG與TNFSF7。CD70為CD27之配體(TNFRSF27)。其為在活化，但非在靜止之T及B淋巴細胞上的表面抗原。其誘導共刺激之T細胞的增生、增強細胞溶解T細胞的產生、且對T細胞的活化有貢獻。CD70亦在調控B-細胞活化、自然殺手細胞之細胞毒殺功能、及免疫球蛋白合成上扮演角色。見例如，Goodwin等人，(1993) Cell73(3): 447-56及Bowman等人，(1994) J. Immunol. 152(4): 1756-61。術語CD70可包括，但不限於天然CD70、CD70之異型體、或CD70之種間CD70同源物。CD70(亦已知為CD27LG、CD27L及TNFSF7)表現在T及B細胞淋巴瘤細胞的表面。人類CD70(hCD70)之胺基酸序列提供在NCBI Accession NP_001243.1 (GI:4507605) (SEQ ID NO：1)，且具有胺基酸序列：
Figure 02_image005
SEQ ID NO：1之殘基1至17對應hCD70之細胞質區，殘基18至38對應hCD70之跨膜區，且殘基39至193對應hCD70之細胞外區。已知hCD70之至少一其他異型體且由UniProt identifier P32970-2所辨識。
如本文所用，CD70包括人類CD70與非人類CD70同源物、以及其變體、片段或轉譯後經修飾的形式，包括但不限於，CD70之N-與O-連接之糖化形式。CD70蛋白質可進一步包括包含SEQ ID NO：1全部或部分之片段(例如，SEQ ID NO：1之胺基酸39至193，對應hCD70之細胞外組分，胺基酸18至193，對應hCD70之跨膜與細胞外組分)。
如本文所用，術語“自體ˮ係指衍生自與其稍後被重新引入之個體為同一個體的任何物質。例如，本文所描述之經工程處理之自體細胞療法(eACT TM)之方法涉及從患者收集淋巴細胞，然後將其經工程處理以表現構築體，例如CAR構築體，然後再投予回同一患者。
術語“同種異體ˮ係指衍生自與其稍後被引入之個體為相同物種之另一個體的任何物質，例如同種異體T細胞移植。
如本文所用，術語“轉導ˮ和“經轉導的ˮ係指一種過程，藉由該過程可將外源DNA經由病毒載體導入細胞中(見Hartl and Jones (1997) Genetics: Principles and Analysis, 4 thed, Jones & Bartlett)。在一些具體實施例中，該載體為反轉錄病毒載體、DNA載體、RNA載體、腺病毒載體、桿狀病毒載體、埃巴病毒載體(Epstein Barr viral載體)、乳多泡病毒載體(papovaviral載體)、牛痘病毒載體、單純皰疹病毒載體、腺病毒相關載體、慢病毒載體或彼等之任何組合。
如本文所用，術語“癌症ˮ係指一大群各種疾病，其特徵為異常細胞在體內不受控制的生長。身體中未經調節之細胞分裂和生長導致形成入侵相鄰組織且亦可透過淋巴系統或血流轉移到身體遠端部分之惡性腫瘤。“癌症ˮ或“癌症組織ˮ可包括腫瘤。可藉由本揭露之方法治療之癌症的實例包括，但不限於免疫系統之癌症，包括淋巴瘤、白血病、骨髓瘤及其他白血球惡性腫瘤。在一些具體實施例中，本揭露之方法可用於縮小，例如衍生自下列群組之腫瘤的腫瘤大小：骨癌、胰臟癌、皮膚癌、頭或頸癌、皮膚或眼內惡性黑色素瘤、子宮癌、卵巢癌、直腸癌、肛區之癌症、胃癌、睪丸癌、子宮癌、輸卵管之癌症、子宮內膜之癌症、子宮頸之癌瘤、陰道之癌瘤、陰戶之癌瘤、多發性骨髓瘤、何杰金氏病、非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、原發性縱隔大B細胞淋巴瘤(PMBC)、瀰漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、濾泡性淋巴瘤(FL)、轉化之濾泡性淋巴瘤、脾邊緣區淋巴瘤(SMZL)、食道之癌症、小腸之癌症、內分泌系統之癌症、甲狀腺之癌症、副甲狀腺之癌症、腎上腺之癌症、軟組織之肉瘤、尿道之癌症、陰莖之癌症、慢性或急性白血病、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、急性淋巴母細胞白血病(ALL)(包括非T細胞ALL)、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、兒童之實體瘤、淋巴細胞性淋巴瘤、膀胱之癌症、腎或輸尿管之癌症、腎盂之癌瘤、中樞神經系統(CNS)之贅瘤、原發性CNS淋巴瘤、腫瘤血管生成、脊柱腫瘤、腦幹神經膠質瘤、垂體腺瘤、卡波西氏肉瘤、表皮樣癌、鱗狀細胞癌、T細胞淋巴瘤、由環境誘發之癌症，包括那些由石棉所誘發者、其他B細胞惡性腫瘤及該癌症之組合。在一些具體實施例中，該癌症為多發性骨髓瘤。該特定癌症可對化療或放射治療有反應或者該癌症可對該等治療不反應。術語“頑固性癌症ˮ係指無法以外科手術矯正之癌症，且該癌症或是最初對化療或放射治療無反應，或是該癌症隨時間變成無反應。
如本文所用，術語“抗腫瘤效果ˮ係指可以腫瘤體積縮小呈現、腫瘤細胞數目減少、腫瘤細胞增殖減少、轉移之數目減少、總體生存或無進展存活期增加、預期之壽命增加或各種與腫瘤相關之生理症狀改善。抗腫瘤效果亦可指預防腫瘤發生，例如疫苗。
如本文所用，術語“細胞介素ˮ係指一細胞與特定抗原接觸產生反應時由該細胞釋出之非抗體蛋白質，其中該細胞介素與第二細胞交互作用以介導在該第二細胞中之反應。細胞介素可由細胞內源性表現或對個體投予。細胞介素可由免疫細胞(包括巨噬細胞、B細胞、T細胞和肥大細胞)釋出以擴大免疫反應。細胞介素可誘導接受體細胞中之各種反應。細胞介素可包括穩態細胞介素、趨化因子、促發炎細胞介素、效應子和急性期蛋白質。例如，穩態細胞介素(包括介白素7(IL-7)和介白素15(IL-15))促進免疫細胞存活和增殖，而促發炎細胞介素可促進炎症反應。穩態細胞介素之實例包括，但不限於IL-2、IL-4、IL-5、IL-7、IL-10、IL-12p40、IL-12p70、IL-15及干擾素(IFN)γ。促發炎細胞介素之實例包括，但不限於IL-1a、IL-1b、IL-6、IL-13、IL-17a、腫瘤壞死因子(TNF)-α、TNF-β、纖維母細胞生長因子(FGF)2、顆粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、可溶性細胞間黏附分子1(sICAM-1)、可溶性血管黏附分子1(sVCAM-1)、血管內皮生長因子(VEGF)、VEGF-C、VEGF-D及胎盤生長因子(PLGF)。效應子之實例包括，但不限於顆粒酶A、顆粒酶B、可溶性Fas配體(sFasL)及穿孔素(perforin)。急性期蛋白之實例包括，但不限於C反應蛋白(CRP)及血清澱粉樣蛋白A(SAA)。
如本文所用，術語“趨化因子ˮ為介導細胞趨化作用或定向運動之細胞介素類型。趨化因子之實例包括，但不限於IL-8、IL-16、伊紅趨素(eotaxin)、伊紅趨素-3、巨噬細胞衍生之趨化因子(MDC或CCL22)、單核細胞趨化蛋白質1(MCP-1或CCL2)、MCP-4、巨噬細胞炎性蛋白質1α(MIP-1α、MIP-1a)、MIP-1β(MIP-1b)、γ-誘導之蛋白質10(IP-10)及胸腺和活化調節之趨化因子(TARC或CCL17)。
如本文所用，術語治療劑(例如，經工程處理之CAR T細胞或表現包括所欲之α鏈、β鏈或α與β鏈兩者的TCR之細胞)之“治療有效量ˮ、“有效劑量ˮ、“有效量ˮ、及“治療有效劑量ˮ可互換使用且係指當單獨使用或與另一治療劑組合使用時能保護個體防止疾病發作或促進疾病消退之任何量，疾病消退之證據為疾病症狀之嚴重性降低、無疾病症狀時期之頻率和期間增加、或防止由於疾病折磨導致之損傷或殘疾。治療劑促進疾病消退之能力可使用技術熟習之從業人員已知之各種方法評估，諸如在臨床試驗期間在人類個體中評估、在用於預測在人體中之效力的動物模型系統中評估、或經由在活體外分析中分析劑之活性評估。
如本文所用，術語“淋巴細胞ˮ係指脊椎動物的免疫系統中發現的白血球。淋巴細胞包括自然殺手(NK)細胞、T細胞及B細胞。NK細胞為代表固有免疫系統之主要組分之細胞毒性(細胞毒殺)(細胞毒性(cell toxic))淋巴細胞類型。NK細胞係透過細胞凋亡或程序性細胞死亡之過程排斥腫瘤及被病毒感染之細胞。由於其不需要活化來殺死細胞，因而被稱為“自然殺手ˮ。
T細胞在由細胞介導之免疫(無抗體參與)中扮演重要角色。T細胞類型包括： 1)輔助性T細胞(例如CD4+細胞)； 2)細胞毒性T細胞(亦稱為TC、細胞毒性T淋巴細胞、CTL、T殺手細胞、溶細胞性T細胞、CD8+T-細胞或殺手T細胞)； 3)記憶T細胞，包括： (i)幹記憶T SCM細胞，像初始細胞，為CD45RO-、CCR7+、CD45RA+、CD62L+(L-選擇素)、CD27+、CD28+及IL-7Rα+，但其亦表現大量CD95、IL-2Rβ、CXCR3及LFA-1，並顯示許多記憶細胞獨特之功能屬性)； (ii)中央記憶T CM細胞，表現L-選擇素及CCR7，其分泌IL-2，但不分泌IFNγ或IL-4；及 (iii)效應記憶T EM細胞，然而，其不表現L-選擇素或CCR7，但產生效應細胞介質，像IFNγ及IL-4)； 4)調節性T細胞(Treg、抑制性T細胞、或CD4+CD25+調節性T細胞)； 5)自然殺手T細胞(NKT)； 6)γδT細胞；以及 7)黏膜相關不變T細胞(MAIT)。
B細胞在體液免疫力(有抗體參與)上扮演主要角色。B細胞製造抗體與抗原，進行抗原呈現細胞(APC)之角色且在由抗原交互作用而活化之後轉成記憶B細胞。
如本文所用，術語“經遺傳工程處理的ˮ或“經工程處理的ˮ係可互換使用且係指修飾細胞之基因組的方法，包括，但不限於刪除編碼或非編碼區或其部分，或插入編碼區或其部分。在一些具體實施例中，該經修飾之細胞為淋巴細胞(例如T細胞)，其可從患者或供體取得。該細胞可經修飾以表現外源構築體，諸如，例如被併入細胞之基因組中之嵌合抗原受體(CAR)或T細胞受體(TCR)。
如本文所用，術語“免疫反應ˮ係指免疫系統之細胞(例如T淋巴細胞、B淋巴細胞、自然殺手(NK)細胞、巨噬細胞、嗜酸性白血球、肥大細胞、樹突細胞及嗜中性白血球)及由這些細胞任一或肝臟製造之可溶性大分子(包括抗體、細胞介質和補體)之作用，該作用導致選擇性靶向、結合、損害、破壞及/或排除脊椎動物體內之入侵病原體、被病原體感染之細胞或組織、癌細胞或其他異常細胞、或者在自體免疫或病理性發炎的情況下之正常之人類細胞或組織。
如本文所用，術語“免疫療法ˮ係指罹患或處於罹患疾病或疾病復發之風險的個體之治療，該治療係藉由包含誘導、增強、抑制或以其他方式修飾免疫反應之方法進行。免疫療法之實例包括，但不限於T細胞療法。T細胞療法可包括過繼性T細胞療法、腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)免疫療法、自體細胞療法、經工程處理之自體細胞療法(eACT™)及同種異體T細胞移植。然而，發明所屬技術領域中具有通常知識者將認知本文所揭示之調理方法將增強任何移植之T細胞療法之有效性。T細胞療法之實例描述於美國專利公開案第2014/0154228號、美國專利案第5,728,388及6,406,699號、及國際公開案第WO 2008/081035號中。
免疫療法之T細胞可來自任何來源。例如T細胞可在體外從幹細胞群分化，或者可從個體取得T細胞。T細胞亦可從，例如周邊血單核細胞(PBMC)、骨髓、淋巴結組織、臍帶血、胸腺組織、來自感染部位之組織、腹水、胸腔積液、脾臟組織及腫瘤取得。此外，T細胞可衍生自一或多個可獲得之T細胞株。T細胞亦可使用本技術熟習人士已知之任何數目的技術(諸如FICOLL TM分離及/或血球分離術)從個體收集之血液單位取得。單離用於T細胞療法之T細胞的額外方法揭示於美國專利公開案第2013/0287748號(其整體內容以引用方式併入本文)中。
術語“經工程處理之自體細胞療法ˮ(縮寫為“eACT TMˮ，亦稱為過繼細胞轉移)為收集患者自身之T細胞，隨後將其經遺傳工程處理成識別並靶向一或多個表現在一或多個特定之腫瘤細胞或惡性腫瘤之細胞表面上的抗原之過程。T細胞可經工程處理以表現，例如嵌合抗原受體(CAR)或T細胞受體(TCR)。CAR陽性(CAR+)T細胞係經工程處理以表現CAR。CAR可包括例如對特定腫瘤抗原具特異性之胞外單鏈可變片段(scFv)，其直接或間接連接到包含至少一個共刺激結構域(其直接或間接連接到至少一個活化結構域)之胞內訊號傳導部分；組分可以任何順序排列。該共刺激結構域可衍生自，例如CD28或CD28T，而該活化結構域可衍生自，例如任何形式之CD3-ζ。在一些具體實施例中，CAR係設計成具有二、三、四或更多個共刺激結構域。CAR scFv可設計成靶向，例如CD19，該CD19為由B細胞譜系(包括所有正常B細胞及B細胞惡性腫瘤，諸如NHL、CLL和非T細胞ALL)之細胞表現的跨膜蛋白質。在一些具體實施例中，該CAR係經工程處理從而使共刺激結構域係以單獨之多肽鏈形式表現。CAR T細胞療法及構築體之例子描述於美國專利公開案第2013/0287748、2014/0227237、2014/0099309及2014/0050708號中，為任何目的其整體內容以引用方式併入本文。
如本文所用，術語“體外細胞ˮ係指在離體培養之任何細胞。體外細胞可包括人類細胞，諸如T細胞或樹狀細胞，或者其可包括CHO、sP2/0、兔子與其他非人類細胞。在一些具體實施例中，體外細胞可包括T細胞。
如本文所用，術語“患者ˮ意指正接受治療異常生理狀況(諸如癌症)或已被正式診斷患有失調之任何人、無被正式識別出之失調之彼等、接受醫療護理之彼等、處於發展出失調之風險中之彼等，等。術語“個體ˮ和“患者ˮ在本文中可互換使用且同時包括人類和非人類動物個體。如本文所用，術語“患者ˮ和“個體ˮ可互換使用。在一些具體實施例中，術語“個體ˮ或“患者ˮ意指罹患癌症(例如，淋巴瘤或白血病)之任何人。
如本文所用，術語“肽ˮ、“多肽ˮ和“蛋白質ˮ可互換使用且係指藉由肽鍵共價連接之包括二或更多個胺基酸殘基之化合物。蛋白質或肽必須含有至少二個胺基酸，但可包括蛋白質或肽之序列的胺基酸的最大數量沒有限制。多肽包括任何包含二或更多個藉由肽鍵彼此連接之胺基酸的肽或蛋白質。如本文所用，該術語係涵蓋短鏈(其在本領域中亦通稱為，例如肽、寡肽和寡聚物)及較長之鏈(其在本領域中通稱為蛋白質，其具有許多類型)兩者。“多肽ˮ包括，例如生物活性片段、基本上同源之多肽、寡肽、同二聚體、異二聚體、多肽之變體、經修飾之多肽、衍生物、類似物、融合蛋白，等。術語“多肽ˮ包括天然之肽、重組之肽、合成之肽或彼等之組合。
於一些態樣中，多肽具有從抗原結合蛋白質之刪除、添加及/或取代一或多個胺基酸，且在一些具體實施例中，較佳地，其中胺基酸取代不超過1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10個。有用之多肽片段可包括抗原結合分子之免疫功能性片段，包括，不限於重鏈及/或輕鏈之一或多個CDR區、可變結構域、抗體鏈之其他部分的一部分，等。可被抗原結合分子之一或多個胺基酸替代的部分包括，例如D或L形式之胺基酸，與抗原結合分子之相同位置中通常發現之胺基酸不同的胺基酸、缺失、非天然存在之胺基酸及胺基酸之化學類似物。此外，活化及/或共刺激分子之多肽片段等係在本揭露之範圍內。
如本文所用，術語“活化ˮ及“刺激ˮ及“刺激訊號ˮ係指由活化分子與其同源配體結合所引起之初級反應，其中該結合介導訊號轉導事件。活化分子的例子為本文提供者。在一例子中，“活化分子ˮ或“刺激分子ˮ係指與存在於抗原呈現細胞上之同源刺激配體特異性結合之T細胞上的分子(例如TCR/CD3複合物)。此類型的訊號傳導在T細胞活化的背景下有時稱為“訊號1ˮ。
如本文所用，“刺激配體ˮ係指當存在於抗原呈現細胞(例如APC、樹突細胞、B細胞，等)上時可與T細胞上之刺激分子特異性結合，從而介導T細胞之初級反應(包括，但不限於活化、啟動免疫反應、增殖，等)的配體。刺激配體包括，但不限於裝載肽之第I類MHC分子、抗CD3抗體、超促效劑抗CD28抗體及超促效劑抗CD2抗體。
如本文所用，術語“共刺激訊號ˮ係指當與主訊號(諸如TCR/CD3接合)組合時導致T細胞反應(諸如，但不限於增殖及/或上調或下調關鍵分子)之訊號。在一實例中，在T細胞上之CD28與在抗原呈現細胞上的其同源配體B7締合時誘導共刺激訊號。此類型的訊號傳導有時在T細胞活化的背景中稱作為“訊號2ˮ。
如本文所用，術語“共刺激分子ˮ及“共刺激配體ˮ係指在T細胞上，與共刺激配體特異性結合，從而介導T細胞之共刺激反應(諸如，但不限於增殖)的同源結合伴侶。共刺激分子包括，但不限於，CD2、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD4、CD7、CD8α CD8β、CD11a (ITGAL)、CD11b (ITGAM)、CD11c (ITGAX)、CD11d (ITGAD)、CD18 (ITGB2)、CD19 (B4)、CD27 (TNFRSF7)、CD28、CD28T、CD29 (ITGB1)、CD30 (TNFRSF8)、CD40 (TNFRSF5)、CD48 (SLAMF2)、CD49a (ITGA1)、CD49d (ITGA4)、CD49f (ITGA6)、CD66a (CEACAM1)、CD66b (CEACAM8)、CD66c (CEACAM6)、CD66d (CEACAM3)、CD66e (CEACAM5)、CD69 (CLEC2)、CD79A (B-細胞抗原受體複合物-相關之α鏈)、CD79B (B-細胞抗原受體複合物-相關之β鏈)、CD84 (SLAMF5)、CD96 (Tactile)、CD100 (SEMA4D)、CD103 (ITGAE)、CD134 (OX40)、CD137 (4-1BB)、CD150 (SLAMF1)、CD158A (KIR2DL1)、CD158B1 (KIR2DL2)、CD158B2 (KIR2DL3)、CD158C (KIR3DP1)、CD158D (KIRDL4)、CD158F1 (KIR2DL5A)、CD158F2 (KIR2DL5B)、CD158K (KIR3DL2)、CD160 (BY55)、CD162 (SELPLG)、CD226 (DNAM1)、CD229 (SLAMF3)、CD244 (SLAMF4)、CD247 (CD3-ζ)、CD258 (LIGHT)、CD268 (BAFFR)、CD270 (TNFSF14)、CD272 (BTLA)、CD276 (B7-H3)、CD279 (PD-1)、CD314 (NKG2D)、CD319 (SLAMF7)、CD335 (NK-p46)、CD336 (NK-p44)、CD337 (NK-p30)、CD352 (SLAMF6)、CD353 (SLAMF8)、CD355 (CRTAM)、CD357 (TNFRSF18)、可誘導之T細胞共刺激物(ICOS)、LFA-1 (CD11a/CD18)、NKG2C、DAP-10、ICAM-1、NKp80 (KLRF1)、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-7Rα、LFA-1、SLAMF9、LAT、GADS (GrpL)、SLP-76 (LCP2)、PAG1/CBP、PD-1、CD83配體、Fcγ受體、MHC第1類分子、MHC第2類分子、TNF受體蛋白質、免疫球蛋白蛋白質、細胞介質受體、整合素、活化之NK細胞受體、Toll配體受體，及或其片段或組合。
術語“減少ˮ和“降低ˮ可互換使用且表示任何小於原來的變化。“減少ˮ和“降低ˮ為相對之術語，需要測量前和測量後之比較。術語“減少ˮ和“降低ˮ包括完全耗竭。
如本文所用，術語個體之“治療ˮ及“治療ˮ個體係指在個體上執行任何類型之干預或過程，或對該個體投予活性劑以達到逆轉、減輕、改善、抑制、減緩或防止與疾病相關之症狀、併發症或病症或生化指標發作、進展、發展、嚴重或復發之目的。在一具體實施例中，“治療(treatment或treating)ˮ包括部分緩解，如同該術語是在給定的治療方案的背景下定義。於另一具體實施例中，“治療(treatment或treating)ˮ包括完全緩解，如同該術語是在給定的治療方案的背景下定義。
如本文所用，術語“百分比同一性ˮ意指在所比較之分子中的胺基酸或核苷酸之間的相同殘基的百分比。在這些計算方面，對齊中之間隙(若有的話)必須藉由特定之數學模型或電腦程式(即“演算法ˮ)處理。可用於計算對齊之核酸或多肽的同一性之方法包括那些描述於下列文獻中者： Computational Molecular Biology, (Lesk, ed.), (1988) New York: Oxford University Press; Biocomputing Informatics and Genome Projects, (Smith, ed.), 1993, New York: Academic Press; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, (Griffin and Griffin, eds.), 1994, New Jersey: Humana Press; von Heinje, (1987) Sequence Analysis in Molecular Biology, New York: Academic Press; Sequence Analysis Primer, (Gribskov and Devereux, eds.), 1991, New York: M. Stockton Press；及Carillo等人，(1988) J. Applied Math.48: 1073。
在計算同一性百分比，相比較之序列通常係以能使該序列之間產生最大匹配的方式對齊。可用於測定同一性百分比之電腦程式可為，例如MOE(Chemical Computing Group)或DNASTAR(University of Wisconsin, Madison, WI)。電腦演算法GAP可用於對齊欲測定序列同一性百分比的二個多肽或多核苷酸。對齊序列以使其各別胺基酸或核苷酸有最佳匹配(藉由演算法測定時之“匹配跨距ˮ)。間隙開放懲罰(其計算值為3×平均對角線，其中該“平均對角線ˮ為所使用之比較矩陣的對角線之平均值；“對角線ˮ為由特定比較矩陣分配給各完美胺基酸匹配的評分或數目)和間隙延伸懲罰(其通常為該間隙開放懲罰之1/10)，以及比較矩陣(諸如PAM 250或BLOSUM 62)與演算法一起使用。在一些具體實施例中，演算法亦使用標準比較矩陣(見例如，Dayhoff等人，(1978) Atlas of Protein Sequence and Structure5: 345-352，用於PAM 250比較矩陣；Henikoff等人，(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.89: 10915-10919，用於BLOSUM 62比較矩陣)。
用於對齊二個胺基酸序列的一些對齊方案可導致僅二個序列之短區域匹配，且該小的對齊區域可具有非常高之序列同一性，即使二個全長序列之間沒有明顯的關係。因此，若需要時，可調整該選定之對齊方法(例如GAP程式)以使對齊能橫跨靶向多肽之至少50個連續胺基酸。
本揭露之各種態樣更詳細地描述於下列小節中。 II. 抗原結合分子及編碼之的多核苷酸
本揭露針對特異性結合CD70之抗原結合分子(包括抗體)、包含這些序列(本文所述之CAR及TCR)之分子及呈現此等分子之細胞，及/或與本文所描述之一或多個抗原結合分子(即，該描述於圖7A至7H中之一或多者及/或揭示於所附之序列表中者)交叉競爭的抗原結合分子。亦提供編碼抗原結合分子之多核苷酸，並形成本揭露之態樣。抗原結合分子可形成本文所揭露之CAR及TCR的一或多者之抗原結合組分。
由本揭露編碼的抗體或抗原結合分子可為單鏈或雙鏈。在一些具體實施例中，該抗體或抗原結合分子為單鏈。在一些具體實施例中，抗原結合分子係選自由下列所組成之群組：scFv、Fab、Fab’、Fv、F(ab’) 2、dAb及彼等之任意組合。在一些具體實施例中，抗體或抗原結合分子包含scFv。在一些具體實施例中，抗原結合分子包含單鏈，其中該重鏈可變區及輕鏈可變區係藉由連接子連接以形成scFv(例如，本揭露之抗原結合分子)。在一些具體實施例中，VH係位於該連接子之N端且VL係位於該連接子之C端。於其他具體實施例中，VL係位於該連接子之N端且VH係位於該連接子之C端。在一些具體實施例中，該連接子包含至少約5、至少約8、至少約10、至少約13、至少約15、至少約18、至少約20、至少約25、至少約30、至少約35、至少約40、至少約45、至少約50、至少約60、至少約70、至少約80、至少約90或至少約100個胺基酸。在一些具體實施例中，連接子包含介於約8個胺基酸至約18個胺基酸(例如10個胺基酸)。用於結合VH到VL以形成scFv(例如，本揭露之抗原結合分子)的適當連接子之實例包括(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser) 3(SEQ ID NO：80)及GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO：81)。
在一些具體實施例中，本揭露之抗原結合分子特異性結合CD70、包含此序列之分子及呈現此分子之細胞。在一些具體實施例中，本揭露之抗原結合分子以低於1×10 -6M、低於1×10 -7M、低於1×10 -8M、或低於1×10 -9M之K D特異性結合CD70。在一些具體實施例中，抗原結合分子以低於1×10 -7M之K D特異性結合CD70。在另一具體實施例中，抗原結合分子以低於1×10 -8M之K D特異性結合SEQ ID NO：1、以及包含此序列之分子與及呈現此分子之細胞。在一些具體實施例中，抗原結合分子以約1×10 -7M、約2×10 -7M、約3×10 -7M、約4×10 -7M、約5×10 -7M、約6×10 -7M、約7×10 -7M、約8×10 -7M、約9×10 -7M、約1×10 -8M、約2×10 -8M、約3×10 -8M、約4×10 -8M、約5×10 -8M、約6×10 -8M、約7×10 -8M、約8×10 -8M、約9×10 -8M、約1×10 -9M、約2×10 -9M、約3×10 -9M、約4×10 -9M、約5×10 -9M、約6×10 -9M、約7×10 -9M、約8×10 -9M、約9×10 -9M、約1×10 -10M、或約5×10 -10M之K D結合CD70。K D可使用本文所述之標準方法計算。
在特定具體實施例中，本揭露之抗原結合分子為抗體、或自其形成的scFv，本文辨識為選殖株8G1或選殖株1C8或6E9。所揭露的抗原結合分子各者包含如所提供及標示之下述重鏈及輕鏈胺基酸、編碼、可變、及CDR序列之一各者：
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在一具體實施例中，本揭露之抗原結合分子為抗體及其抗原結合片段(例如，scFv)。在一具體實施例中，本揭露之抗體及抗原結合分子包含至少一個圖6中所列之CDR。於另一態樣中，本揭露提供如本文所描述和本領域中已知之能夠產生本文揭露之抗體和抗原結合分子的融合瘤及從融合瘤產生抗體之方法。
本揭露之抗原結合分子亦可為人源化單株抗體，自此可產生scFv，其之後可形成本文所提供之CAR或TCR的組分。在一具體實施例中，人源化之單株抗體包含小鼠或兔子抗體之可變結構域(或其抗原結合位點之全部或部分)和衍生自人類抗體之恆定結構域。或者，人源化抗體片段可包含小鼠或兔子單株抗體之抗原結合位點及衍生自人類抗體之可變結構域片段(缺少抗原結合位點)。用於產生經工程處理之單株抗體的程序包括那些描述於下列文獻中者：Riechmann等人，(1988) Nature332: 323, Liu等人，(1987) Proc. Nat. Acad. Sci. USA84: 3439, Larrick等人，(1989) Bio/Technology7: 934，及Winter等人，(1993) TIPS14: 139。在一具體實施例中，嵌合抗體為經移植CDR之抗體。用於人源化抗體之技術討論於，例如下列文獻中：美國專利案第5,869,619；5,225,539；5,821,337；5,859,205；6,881,557號；Padlan等人，(1995) FASEB J.9: 133-39; Tamura等人，(2000) J. Immunol. 164: 1432-41; Zhang等人，(2005) Mol. Immunol.42(12): 1445-1451; Hwang等人， Methods. (2005) 36(1): 35-42; Dall’Acqua等人，(2005) Methods36(1): 43-60；及Clark, (2000) Immunology Today21(8): 397-402。
本揭露之抗原結合分子亦可為全長人類單株抗體，其中可產生scFv，其之後可形成本文所提供之CAR或TCR之組分。全長人類單株抗體可由發明所屬技術領域中具有通常知識者熟悉的藉由任何量之技術產生。該等方法包括，但不限於：人類周邊血細胞(例如含有B淋巴細胞)之以埃巴病毒(EBV)轉形、人類B細胞體外免疫化、來自經免疫化之轉基因小鼠(攜帶插入之人類免疫球蛋白基因)的脾細胞之融合、自人類免疫球蛋白V區噬菌體集合庫中單離、或其他如本領域已知之程序及基於本文揭示之程序。
用於在非人類動物中產生人類單株抗體之程序已研發出。例如其中一或多個內源性免疫球蛋白基因已藉由各種方式去活化的小鼠已被製備。人類免疫球蛋白基因已被引入小鼠中以取代經去活化之小鼠基因。在該技術中，人類重鏈和輕鏈基因座之元素被引入小鼠品系中，該小鼠品系衍生自含有內源性重鏈和輕鏈基因座被靶向中斷之胚胎幹細胞株(亦參見Bruggemann等人，(1997) Curr. Opin. Biotechnol.8: 455-58)。
用於產生和使用轉基因動物以產生人類或部分人類抗體之技術的實例描述於下列文獻中：美國專利案第5,814,318、5,569,825、及5,545,806號；Davis等人， Antibody Engineering: Methods and Protocols, (Lo, ed) Humana Press, NJ, 191-200 (2003); Kellermann等人，(2002) Curr Opin Biotechnol.13: 593-97; Russel等人，(2000) Infect Immun.68: 1820-26; Gallo等人，(2000) Eur J. Immun.30: 534-40; Davis等人，(1999) Cancer Metastasis Rev. 18: 421-25; Green, (1999) J Immunol Methods231:11-23; Jakobovits, (1998) Advanced Drug Delivery Reviews31: 33-42; Green等人，(1998) J Exp Med. 188: 483-95; Jakobovits, (1998) Exp. Opin. Invest. Drugs.7:607-14; Tsuda等人，(1997) Genomics,42: 413-21; Mendez等人，(1997) Nat. Genet.15: 146-56; Jakobovits, (1994) Curr Biol.4: 761-63; Arbones等人，(1994) Immunity1: 247-60; Green等人，(1994) Nat. Genet.7: 13-21; Jakobovits等人，(1993) Nature362: 255-58; Jakobovits等人，(1993) Proc Natl Acad Sci USA90: 2551-55; Chen等人，(1993) Intl Immunol5: 647-656; Choi等人，(1993) Nature Genetics4: 117-23; Fishwild等人，(1996) Nature Biotechnology14:845-51; Lonberg等人，(1994) Nature368: 856-59; Lonberg, (1994) Handbook of Experimental Pharmacology113: 49-101; Neuberger, (1996) Nature Biotech14: 826; Taylor等人，(1992) Nucleic Acids Research20: 6287-95; Taylor等人，(1994) Intl Immunol6: 579-91; Tomizuka等人，(1997) Nature Genetics16: 133-43; Tomizuka等人，(2000) Proc Nat Acad Sci USA97: 722-27; Tuaillon等人，(1993) Proc Nat Acad Sci USA90: 3720-24; Tuaillon等人，(1994) J Immunol152: 2912-20.; Lonberg等人，(1994) Nature368: 856; Taylor等人，(1994) Intl Immunol6: 579；美國專利案第5,877,397號；Bruggemann等人，(1997) Curr. Opin. Biotechnol.8: 455-58; Jakobovits等人，(1995) Ann. N. Y. Acad. Sci.764: 525-35。
用於取得本揭露之抗原結合分子的另外方法係使用噬菌體展示庫，該噬菌體展示庫係經完善建立以用於此目的。參見，例如Winter等人，(1994) Ann. Rev. Immunol.12: 433-55; Burton等人，(1994) Adv. Immunol57: 191-280。人類或小鼠免疫球蛋白可變區基因組合庫可在噬菌體載體中創建，其可經過篩選以選擇與scFv FMC63結合的Ig片段(Fab、Fv、sFv或其多聚體)及包含此序列之分子和呈現該等分子之細胞。見例如，美國專利申請案第5,223,409號；Huse等人，(1989) Science246: 1275-81; Sastry等人，(1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA86:5728-32; Alting-Mees等人，(1990) Strategies in Molecular Biology3: 1-9; Kang等人，(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA88: 4363-66; Hoogenboom等人，(1992) J. Mol. Biol.227: 381-388; Schlebusch等人，(1997) Hybridoma16: 47-52和其中引用之文獻。例如，可將含有複數個編碼Ig可變區片段之多核苷酸序列的集合庫插入絲狀噬菌體(諸如M13或λ噬菌體(λImmunoZap TM(H)和λImmunoZap TM(L)載體(Stratagene, La Jolla, Calif)或其變體亦可用於該方法中)的基因組中，與編碼噬菌體外套蛋白質之序列同框。
簡單地說，從B細胞群單離出mRNA並用於在λImmunoZap TM(H)和λImmunoZap TM(L)載體中創建重鏈和輕鏈免疫球蛋白cDNA表現集合庫。這些載體可經個別篩選或共同表現以形成Fab片段或抗體。隨後可將陽性噬斑轉化成非裂解質體以允許來自大腸桿菌之單株抗體片段高度表現。
在一具體實施例中，使用核苷酸引子擴增在融合瘤中表現有興趣之單株抗體之基因的可變區。這些引子可由發明所屬技術領域中具有通常知識者合成，或可從商業來源購得，該商業來源亦出售用於小鼠和人類可變區之引子(包括，尤其是用於V H、V L、C H和C L區之引子)。該等引子可用於擴增重鏈或輕鏈可變區，然後這些重鏈或輕鏈可變區可再插入載體中。然後，這些載體可被引入用於表現之大腸桿菌、酵母菌或基於哺乳動物的系統中。使用這些方法可製造大量含有V H和V L結構域之融合物的單鏈蛋白質。
一旦使用任何上述之免疫化和其他技術來取得本文提供之產生抗原結合分子的細胞，特定抗體之基因可根據如本文所描述之標準程序藉由單離和擴增來自彼等之DNA或mRNA選殖。由此產生之抗體可經定序並鑑定CDR，且編碼該CDR之DNA可依所述操作以產生根據本揭露之其他抗體。
發明所屬技術領域中具有通常知識者將理解一些蛋白質(諸如抗體)可接受各種轉譯後修飾。這些修飾之類型和程度通常取決於用於表現該蛋白質之宿主細胞株及培養條件。該等修飾可包括在糖基化、甲硫胺酸氧化、二酮哌
Figure 111129700-001
形成、天門冬胺酸異構化和天門冬醯胺脫醯胺中之變體。常見之修飾為由於羧基肽酶之作用而損失羧基端鹼性殘基(諸如離胺酸或精胺酸)(如描述於，例如Harris, (1995) J Chromatog705: 129-34)。
用於產生小鼠單株抗體的另一種方法為將融合瘤細胞注射入同基因小鼠(例如已經過處理之小鼠(例如經降植烷(pristane)致敏的))的腹膜腔中以促進形成含有該單株抗體之腹水。單株抗體可藉由各種完善建立之技術單離並純化。此等單離技術包括以蛋白質A瓊脂糖凝膠進行之親和力層析、尺寸排阻層析和離子交換層析(參見，例如Baines and Thorpe, (1992) in Methods in Molecular Biology, 10: 79-104 (The Humana Press))。單株抗體可使用根據抗體之特定性質(例如重鏈或輕鏈同型、結合特異性等)選擇之適當配體，藉由親和力層析法純化。固定在固體支撐體上之合適配體的實例，包括蛋白質A、蛋白質G、抗恆定區(輕鏈或重鏈)抗體和抗個體遺傳型抗體。
本揭露提供特異性結合CD70、包含此序列之分子及呈現此分子之細胞之抗原結合分子(例如，scFv的)。與本文所揭露之抗原結合分子交叉競爭的抗原結合分子形成本揭露的另一個態樣。
在一些具體實施例中，抗原結合分子與包含選自由下列所組成群組之胺基酸序列的參考抗體交叉競爭：SEQ ID NO：3、5、7、9、11或13。在一些具體實施例中，抗原結合分子與參考抗體交叉競爭，其中，參考抗體包含VH CDR1，其包含SEQ ID NO：62、65、68、71、73、75、77、78及79之胺基酸序列。
在一些具體實施例中，抗原結合分子與包含選自由下列所組成群組之胺基酸序列的參考抗體交叉競爭：SEQ ID NO：3、5、7、9、11或13，其中，參考抗體包含VH CDR2，其包含SEQ ID NO：63、66、69、72、74、76、63、66及69之胺基酸序列。
在一些具體實施例中，抗原結合分子與包含選自由下列所組成群組之胺基酸序列的參考抗體交叉競爭：SEQ ID NO：3、5、7、9、11或13，其中，參考抗體包含VH CDR3，其包含SEQ ID NO：64、67、及70之胺基酸序列。
在一些具體實施例中，抗原結合分子與包含選自由下列所組成群組之胺基酸序列的參考抗體交叉競爭：SEQ ID NO：3、5、7、9、11或13，其中，參考抗體包含VL CDR1，其包含SEQ ID NO：53、56及59之胺基酸序列。
在一些具體實施例中，抗原結合分子與包含選自由下列所組成群組之胺基酸序列的參考抗體交叉競爭：SEQ ID NO：3、5、7、9、11或13，其中，參考抗體包含VL CDR2，其包含SEQ ID NO：54、57及60之胺基酸序列。
在一些具體實施例中，抗原結合分子與包含選自由下列所組成群組之胺基酸序列的參考抗體交叉競爭：SEQ ID NO：3、5、7、9、11或13，其中，參考抗體包含VL CDR3，其包含SEQ ID NO：55、58及61之胺基酸序列。
在一些具體實施例中，特異性結合CD70、包含此序列之分子及呈現此分子之細胞之抗體或抗原結合分子與本文所揭露之參考抗體(例如，包含本文呈現之序列者，其可包含圖6所呈現的CDR)結合相同或重疊的抗原決定位。
在一些具體實施例中，抗體或抗原結合分子與參考抗體結合相同或重疊的抗原決定位。 II.A. 選殖株 8G1在一些具體實施例中，特異性結合CD70、包含此序列之分子及呈現此分子之細胞之抗原結合分子，諸如scFv、或抗體，包含VH CDR1，其包括下述胺基酸序列、由下述胺基酸序列所組成、或基本上由下述胺基酸序列所組成：GFTFSSY (SEQ ID NO：71)。
在一些具體實施例中，特異性結合CD70、包含此序列之分子及呈現此分子之細胞之抗原結合分子，諸如scFv、或抗體，包含VH CDR2，其包括下述胺基酸序列、由下述胺基酸序列所組成、或基本上由下述胺基酸序列所組成：WYDGSN (SEQ ID NO：72)。
在一些具體實施例中，特異性結合CD70、包含此序列之分子及呈現此分子之細胞之抗原結合分子，諸如scFv、或抗體，包含VH CDR3，其包括下述胺基酸序列、由下述胺基酸序列所組成、或基本上由下述胺基酸序列所組成：DLLRGVKGYAMDV (SEQ ID NO：64)。
在一些具體實施例中，特異性結合CD70、包含此序列之分子及呈現此分子之細胞之抗原結合分子，諸如scFv、或抗體，包含重鏈VH，其包含(a)VH CDR1，其包括下述胺基酸序列、由下述胺基酸序列所組成、或基本上由下述胺基酸序列所組成：GFTFSSY (SEQ ID NO：71)；及/或(b)VH CDR2，其包括下述胺基酸序列、由下述胺基酸序列所組成、或基本上由下述胺基酸序列所組成：WYDGSN (SEQ ID NO：72)；及/或(c)VH CDR3，其包括下述胺基酸序列、由下述胺基酸序列所組成、或基本上由下述胺基酸序列所組成：DLLRGVKGYAMDV (SEQ ID NO：64)。
在一些具體實施例中，特異性結合CD70、包含此序列之分子及呈現此分子之細胞之抗體或抗原結合分子，諸如scFv，包含VH CDR1、VH CDR2、及VH CDR3，其中，該VH CDR1、VH CDR2、及VH CDR3包含圖6所呈現的VH CDR1、VH CDR2、及VH CDR3的胺基酸序列。
在一些具體實施例中，特異性結合CD70、包含此序列之分子及呈現此分子之細胞之抗體或抗原結合分子，諸如scFv，包含VH CDR1、VH CDR2、及VH CDR3，其中，該VH CDR1、VH CDR2、及VH CDR3包含圖6及7A所呈現的抗原結合分子之VH CDR1、VH CDR2、及VH CDR3的胺基酸序列(分別為SEQ ID NO：71、72及64)。
在一些具體實施例中，特異性結合CD70、包含此序列之分子及呈現此分子之細胞之抗體或抗原結合分子，諸如scFv，包含含有圖7A之胺基酸序列的重鏈可變區序列。在一些具體實施例中，抗體或抗原結合分子包含含有SEQ ID NO：3之重鏈可變區序列。
在一些具體實施例中，特異性結合CD70、包含此序列之分子及呈現此分子之細胞之抗體或抗原結合分子，諸如scFv，包含上述所列或圖6所述之VH CDR任一的一或多個。在一些具體實施例中，抗體或抗原結合分子包含本文所述之VH框架區(FR)。在特定具體實施例中，抗體或抗原結合分子包含列於圖7A呈現之序列(例如，在圖7A的一序列中FR的一、二、三、或四個)或可衍生自圖7A呈現之序列的VH FR。
在一些具體實施例中，特異性結合CD70、包含此序列之分子及呈現此分子之細胞之抗體或抗原結合分子，諸如scFv，本文所揭露之包含重鏈序列(例如，在圖7A)。在一具體實施例中，抗體或抗原結合分子包含含有下述胺基酸序列之重鏈可變區
Figure 02_image067
於各種具體實施例中，重鏈可變區與SEQ ID NO：3之重鏈可變區序列為80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性。
在一些具體實施例中，特異性結合CD70、包含此序列之分子及呈現此分子之細胞之抗原結合分子，諸如scFv、或抗體，包含VL CDR1，其包括下述胺基酸序列、由下述胺基酸序列所組成、或基本上由下述胺基酸序列所組成：RASQSLRRIYLA (SEQ ID NO：53)。
在一些具體實施例中，特異性結合CD70、包含此序列之分子及呈現此分子之細胞之抗原結合分子，諸如scFv、或抗體，包含VL CDR2，其包括下述胺基酸序列、由下述胺基酸序列所組成、或基本上由下述胺基酸序列所組成：DVFDRAT (SEQ ID NO：54)。
在一些具體實施例中，特異性結合CD70、包含此序列之分子及呈現此分子之細胞之抗原結合分子，諸如scFv、或抗體，包含VL CDR3，其包括下述胺基酸序列、由下述胺基酸序列所組成、或基本上由下述胺基酸序列所組成：QQYSDSPFT (SEQ ID NO：55)。
在一些具體實施例中，特異性結合CD70、包含此序列之分子及呈現此分子之細胞之抗原結合分子，諸如scFv、或抗體，包含重鏈VL，其包含：(a)VL CDR1，其包括下述胺基酸序列、由下述胺基酸序列所組成、或基本上由下述胺基酸序列所組成：RASQSLRRIYLA (SEQ ID NO：53)；及/或(b)VL CDR2，其包括下述胺基酸序列、由下述胺基酸序列所組成、或基本上由下述胺基酸序列所組成：DVFDRAT (SEQ ID NO：54)；及/或(c)VL CDR3，其包括下述胺基酸序列、由下述胺基酸序列所組成、或基本上由下述胺基酸序列所組成：QQYSDSPFT (SEQ ID NO：55)。
在一些具體實施例中，特異性結合CD70、包含此序列之分子及呈現此分子之細胞之抗體或抗原結合分子，諸如scFv，其中，抗體或抗原結合分子包含VL CDR1、VL CDR2、及VL CDR3，其中，VL CDR1、VL CDR2、及VL CDR3包含圖6所呈現的VL CDR1、VL CDR2、及VL CDR3之胺基酸序列。
在一些具體實施例中，特異性結合CD70、包含此序列之分子及呈現此分子之細胞之抗體或抗原結合分子，諸如scFv，包含含有圖7B之胺基酸序列的輕鏈可變區序列。在一些具體實施例中，抗體或抗原結合分子包含含有SEQ ID NO：5之輕鏈可變區序列。
在一些具體實施例中，特異性結合CD70、包含此序列之分子及呈現此分子之細胞之抗體或抗原結合分子，諸如scFv，其中，抗體或抗原結合分子包含本文所述之VL框架區(FR)。在特定具體實施例中，抗體或抗原結合分子包含列於圖7B呈現的序列(例如，在圖7B的一序列中FR的一、二、三、或四個)或可衍生自圖7B呈現的序列之胺基酸序列的VL FR。
在一些具體實施例中，特異性結合CD70、包含此序列之分子及呈現此分子之細胞之抗體或抗原結合分子，諸如scFv，包含本文所揭露之輕鏈序列(例如，在圖7B)。在一具體實施例中，抗體或抗原結合分子包含含有下述胺基酸序列的輕鏈可變區
Figure 02_image069
於各種具體實施例中，輕鏈可變區與SEQ ID NO：4之輕鏈可變區序列為80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性。
在一些具體實施例中，特異性結合CD70、包含此序列之分子及呈現此分子之細胞之抗體或抗原結合分子，諸如scFv，包含本文所揭示之任一、二、及/或三個VH CDR序列。在一些具體實施例中，抗體或抗原結合分子包含包含VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3，其分別具有本文所揭示之任一VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的胺基酸序列。在一些具體實施例中，抗體或抗原結合分子包含本文所揭示之任一、二及/或三個VL CDR序列。在一些具體實施例中，抗體或抗原結合分子包含VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3，其分別具有本文所揭示之任一VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3的胺基酸序列。
在一具體實施例中，特異性結合CD70、包含此序列之分子及呈現此分子之細胞之抗體或抗原結合分子，諸如scFv，包含：(a)VH CDR1區，其包含SEQ ID NO：71之胺基酸序列；(b)VH CDR2區，其包含SEQ ID NO：72之胺基酸序列；(c)VH CDR3區，其包含SEQ ID NO：64之胺基酸序列；(d)VL CDR1區，其包含SEQ ID NO：53之胺基酸序列；(e)VL CDR2區，其包含SEQ ID NO：54之胺基酸序列；及(f)VL CDR3區，其包含SEQ ID NO：55之胺基酸序列。
在一具體實施例中，特異性結合CD70、包含此序列之分子及呈現此分子之細胞之抗體或抗原結合分子，諸如scFv，包含：(a)VH CDR1區；(b)VH CDR2區；(c)VH CDR3區；(d)VL CDR1區，包含；(e)VL CDR2區；及(f)VL CDR3區，其中，VH及VL CDR係分別如圖7A與7B所示，及如圖6所示。
在一些具體實施例中，特異性結合CD70、包含此序列之分子及呈現此分子之細胞之抗體或抗原結合分子，諸如scFv，包含本文所揭露之重鏈可變區序列(例如，在圖7A)及本文所揭露之輕鏈可變區序列 (例如，在圖7B)。
在一具體實施例中，抗體或抗原結合分子，諸如scFv，包含：(a)含有SEQ ID NO：3之胺基酸序列的重鏈可變區；及(b)含有SEQ ID NO：5之胺基酸序列的輕鏈可變區。編碼重鏈可變區及輕鏈可變區的核苷酸序列係於本文提供且分別在圖7A及7B。
在一些具體實施例中，特異性結合CD70、包含此序列之分子及呈現此分子之細胞之抗體或抗原結合分子，諸如scFv，包含本文所揭露之重鏈序列(例如，在圖7A)及本文所揭露之輕鏈序列(例如，在圖7B)。
在一具體實施例中，抗體或抗原結合分子，諸如scFv，包含：(a)含有
Figure 02_image071
之胺基酸序列的輕鏈可變區。
在一具體實施例中，抗體或抗原結合分子包含：(a)重鏈，其包含與SEQ ID NO：3之胺基酸序列為80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性之胺基酸序列；和(b)輕鏈，其包含與SEQ ID NO：5之胺基酸序列為80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性之胺基酸序列。 II.B. 選殖株 1C8在一些具體實施例中，特異性結合CD70、包含此序列之分子及呈現此分子之細胞之抗原結合分子，諸如scFv、或抗體，包含VH CDR1，其包括下述胺基酸序列、由下述胺基酸序列所組成、或基本上由下述胺基酸序列所組成：GDSIISGGY (SEQ ID NO：73)。
在一些具體實施例中，特異性結合CD70、包含此序列之分子及呈現此分子之細胞之抗原結合分子，諸如scFv、或抗體，包含VH CDR2，其包括下述胺基酸序列、由下述胺基酸序列所組成、或基本上由下述胺基酸序列所組成：FYSGS (SEQ ID NO：74)。
在一些具體實施例中，特異性結合CD70、包含此序列之分子及呈現此分子之細胞之抗原結合分子，諸如scFv、或抗體，包含VH CDR3，其包括下述胺基酸序列、由下述胺基酸序列所組成、或基本上由下述胺基酸序列所組成：SGYSYALFDH (SEQ ID NO：67)。
在一些具體實施例中，特異性結合CD70、包含此序列之分子及呈現此分子之細胞之抗原結合分子，諸如scFv、或抗體，包含重鏈VH，其包含(a)VH CDR1，其包括下述胺基酸序列、由下述胺基酸序列所組成、或基本上由下述胺基酸序列所組成：GDSIISGGY (SEQ ID NO：73)；及/或(b)VH CDR2，其包括下述胺基酸序列、由下述胺基酸序列所組成、或基本上由下述胺基酸序列所組成：FYSGS (SEQ ID NO：74)；及/或(c)VH CDR3，其包括下述胺基酸序列、由下述胺基酸序列所組成、或基本上由下述胺基酸序列所組成：SGYSYALFDH (SEQ ID NO：67)。
在一些具體實施例中，特異性結合CD70、包含此序列之分子及呈現此分子之細胞之抗體或抗原結合分子，諸如scFv，包含VH CDR1、VH CDR2、及VH CDR3，其中，VH CDR1、VH CDR2、及VH CDR3包含圖6及7C所呈現之VH CDR1、VH CDR2、及VH CDR3的胺基酸序列。
在一些具體實施例中，特異性結合CD70、包含此序列之分子及呈現此分子之細胞之抗體或抗原結合分子，諸如scFv，包含VH CDR1、VH CDR2、及VH CDR3，其中，該VH CDR1、VH CDR2、及VH CDR3包含在圖7C呈現之抗原結合分子的VH CDR1、VH CDR2、及VH CDR3之胺基酸序列(分別為SEQ ID NO：73、74及67)。
在一些具體實施例中，特異性結合CD70、包含此序列之分子及呈現此分子之細胞之抗體或抗原結合分子，諸如scFv，包含含有圖7C的胺基酸序列之重鏈可變區序列。在一些具體實施例中，抗體或抗原結合分子包含含有SEQ ID NO：7之重鏈可變區序列。
在一些具體實施例中，特異性結合CD70、包含此序列之分子及呈現此分子之細胞之抗體或抗原結合分子，諸如scFv，包含上述所列或圖6所述之VH CDR任一之一或多個。在一些具體實施例中，抗體或抗原結合分子包含本文所述之VH框架區(FR)。在特定具體實施例中，抗體或抗原結合分子包含列於圖7C呈現之序列(例如，在圖7C的一序列中FR的一、二、三、或四個)或可衍生自圖7C呈現之序列的VH FR。
在一些具體實施例中，特異性結合CD70、包含此序列之分子及呈現此分子之細胞之抗體或抗原結合分子，諸如scFv，包含本文所揭露之重鏈序列(例如，在圖7C)。在一具體實施例中，抗體或抗原結合分子包含含有下述胺基酸序列之重鏈可變區
Figure 02_image073
於各種具體實施例中，重鏈可變區與SEQ ID NO：7C之重鏈可變區序列為80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性。
在一些具體實施例中，特異性結合CD70、包含此序列之分子及呈現此分子之細胞之抗原結合分子，諸如scFv、或抗體，包含VL CDR1，其包括下述胺基酸序列、由下述胺基酸序列所組成、或基本上由下述胺基酸序列所組成：RASQFIGRYFN (SEQ ID NO：56)。
在一些具體實施例中，特異性結合CD70、包含此序列之分子及呈現此分子之細胞之抗原結合分子，諸如scFv、或抗體，包含VL CDR2，其包括下述胺基酸序列、由下述胺基酸序列所組成、或基本上由下述胺基酸序列所組成：AESSLQS (SEQ ID NO：57)。
在一些具體實施例中，特異性結合CD70、包含此序列之分子及呈現此分子之細胞之抗原結合分子，諸如scFv、或抗體，包含VL CDR3，其包括下述胺基酸序列、由下述胺基酸序列所組成、或基本上由下述胺基酸序列所組成：QQSYSTPFT (SEQ ID NO：58)。
在一些具體實施例中，特異性結合CD70、包含此序列之分子及呈現此分子之細胞之抗原結合分子，諸如scFv、或抗體，包含重鏈VL，其包含：(a)VL CDR1，其包括下述胺基酸序列、由下述胺基酸序列所組成、或基本上由下述胺基酸序列所組成：RASQFIGRYFN (SEQ ID NO：56)；及/或(b)VL CDR2，其包括下述胺基酸序列、由下述胺基酸序列所組成、或基本上由下述胺基酸序列所組成：AESSLQS (SEQ ID NO：57)；及/或(c)VL CDR3，其包括下述胺基酸序列、由下述胺基酸序列所組成、或基本上由下述胺基酸序列所組成：QQSYSTPFT (SEQ ID NO：58)。
在一些具體實施例中，特異性結合CD70、包含此序列之分子及呈現此分子之細胞之抗體或抗原結合分子，諸如scFv，其中，抗體或抗原結合分子包含VL CDR1、VL CDR2、及VL CDR3，其中，VL CDR1、VL CDR2、及VL CDR3包含圖6及7D所呈現的VL CDR1、VL CDR2、及VL CDR3之胺基酸序列。
在一些具體實施例中，特異性結合CD70、包含此序列之分子及呈現此分子之細胞之抗體或抗原結合分子，諸如scFv，包含含有圖7D的胺基酸序列之輕鏈可變區序列。在一些具體實施例中，抗體或抗原結合分子包含含有SEQ ID NO：9之輕鏈可變區序列。
在一些具體實施例中，特異性結合CD70、包含此序列之分子及呈現此分子之細胞之抗體或抗原結合分子，諸如scFv，其中，抗體或抗原結合分子包含本文所述之VL框架區(FR)。在特定具體實施例中，抗體或抗原結合分子包含列於圖7D呈現之序列(例如，在圖7D的一序列中FR的一、二、三、或四個)、或可衍生自圖7D呈現之序列的胺基酸序列之VL FR。
在一些具體實施例中，特異性結合CD70、包含此序列之分子及呈現此分子之細胞之抗體或抗原結合分子，諸如scFv，包含本文所揭露之輕鏈序列(例如，在圖7D)。在一具體實施例中，抗體或抗原結合分子包含含有下述胺基酸序列之輕鏈可變區
Figure 02_image075
在各種具體實施例中，輕鏈可變區與SEQ ID NO：9之輕鏈可變區序列為80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性。
在一些具體實施例中，特異性結合CD70、包含此序列之分子及呈現此分子之細胞之抗體或抗原結合分子，諸如scFv，包含本文所揭示之任一、二、及/或三個VH CDR序列。在一些具體實施例中，抗體或抗原結合分子包含VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3，其分別具有本文所揭示之任一VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的胺基酸序列。在一些具體實施例中，抗體或抗原結合分子包含本文所揭示之任一、二及/或三個VL CDR序列。在一些具體實施例中，抗體或抗原結合分子包含VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3，其分別具有本文所揭示之任一VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3的胺基酸序列。
在一具體實施例中，特異性結合CD70、包含此序列之分子及呈現此分子之細胞之抗體或抗原結合分子，諸如scFv，包含：(a)VH CDR1區，其包含SEQ ID NO：73之胺基酸序列；(b)VH CDR2區，其包含SEQ ID NO：74之胺基酸序列；(c)VH CDR3區，其包含SEQ ID NO：67之胺基酸序列；(d)VL CDR1區，其包含SEQ ID NO：56之胺基酸序列；(e)VL CDR2區，其包含SEQ ID NO：57之胺基酸序列；及(f)VL CDR3區，其包含SEQ ID NO：58之胺基酸序列。
在一具體實施例中，特異性結合CD70、包含此序列之分子及呈現此分子之細胞之抗體或抗原結合分子，諸如scFv，包含：(a)VH CDR1區；(b)VH CDR2區；(c)VH CDR3區；(d)VL CDR1區，包含；(e)VL CDR2區；及(f)VL CDR3區，其中，VH及VL CDR係分別如圖7C及7D所示，及在圖6所示。
在一些具體實施例中，特異性結合CD70、包含此序列之分子及呈現此分子之細胞之抗體或抗原結合分子，諸如scFv，包含本文所揭露之重鏈可變區序列(例如，在圖7C)及本文所揭露之輕鏈可變區序列(例如，在圖7D)。
在一具體實施例中，抗體或抗原結合分子，諸如scFv，包含：(a)含有SEQ ID NO：7的胺基酸序列之重鏈可變區；及(b)含有SEQ ID NO：9的胺基酸序列之輕鏈可變區。編碼重鏈可變區與輕鏈可變區之核苷酸序列係提供於本文且分別在圖7C與7D。
在一些具體實施例中，特異性結合CD70、包含此序列之分子及呈現此分子之細胞之抗體或抗原結合分子，諸如scFv，包含本文所揭露之重鏈序列(例如，在圖7C)及本文所揭露之輕鏈序列(例如，在圖7D)。
在一具體實施例中，抗體或抗原結合分子，諸如scFv，包含：(a)含有下述胺基酸序列之重鏈可變區
Figure 02_image077
在一具體實施例中，抗體或抗原結合分子包含：(a)重鏈，其包含與SEQ ID NO：7之胺基酸序列為80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性之胺基酸序列；及(b)輕鏈，其包含與SEQ ID NO：9之胺基酸序列為80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性之胺基酸序列。 II.C. 選殖株 6E9
在一些具體實施例中，特異性結合CD70、包含此序列之分子及呈現此分子之細胞之抗原結合分子，諸如scFv、或抗體，包含VH CDR1，其包括下述胺基酸序列、由下述胺基酸序列所組成、或基本上由下述胺基酸序列所組成：GYTFTSY (SEQ ID NO：75)。
在一些具體實施例中，特異性結合CD70、包含此序列之分子及呈現此分子之細胞之抗原結合分子，諸如scFv、或抗體，包含VH CDR2，其包括下述胺基酸序列、由下述胺基酸序列所組成、或基本上由下述胺基酸序列所組成：DPSGGS (SEQ ID NO：76)。
在一些具體實施例中，特異性結合CD70、包含此序列之分子及呈現此分子之細胞之抗原結合分子，諸如scFv、或抗體，包含VH CDR3，其包括下述胺基酸序列、由下述胺基酸序列所組成、或基本上由下述胺基酸序列所組成：DYGDYVFDY (SEQ ID NO：70)。
在一些具體實施例中，特異性結合CD70、包含此序列之分子及呈現此分子之細胞之抗原結合分子，諸如scFv、或抗體，包含重鏈VH，其包含(a)VH CDR1，其包括下述胺基酸序列、由下述胺基酸序列所組成、或基本上由下述胺基酸序列所組成：GYTFTSY (SEQ ID NO：75)；及/或(b)VH CDR2，其包括下述胺基酸序列、由下述胺基酸序列所組成、或基本上由下述胺基酸序列所組成：DPSGGS (SEQ ID NO：76)；及/或(c)VH CDR3，其包括下述胺基酸序列、由下述胺基酸序列所組成、或基本上由下述胺基酸序列所組成：DYGDYVFDY (SEQ ID NO：70)。
在一些具體實施例中，特異性結合CD70、包含此序列之分子及呈現此分子之細胞之抗體或抗原結合分子，諸如scFv，包含VH CDR1、VH CDR2、及VH CDR3，其中，該VH CDR1、VH CDR2、及VH CDR3包含圖6及7E所呈現的VH CDR1、VH CDR2、及VH CDR3的胺基酸序列。
在一些具體實施例中，特異性結合CD70、包含此序列之分子及呈現此分子之細胞之抗體或抗原結合分子，諸如scFv，包含VH CDR1、VH CDR2、及VH CDR3，其中，該VH CDR1、VH CDR2、及VH CDR3包含圖7E呈現的抗原結合分子之VH CDR1、VH CDR2、及VH CDR3的胺基酸序列(分別為SEQ ID NO：75、76及70)。
在一些具體實施例中，特異性結合CD70、包含此序列之分子及呈現此分子之細胞之抗體或抗原結合分子，諸如scFv，包含含有圖7E的胺基酸序列之重鏈可變區序列。在一些具體實施例中，抗體或抗原結合分子包含含有SEQ ID NO：11之重鏈可變區序列。
在一些具體實施例中，特異性結合CD70、包含此序列之分子及呈現此分子之細胞之抗體或抗原結合分子，諸如scFv，包含上述所列或圖6所述之VH CDR任一的一或多個。在一些具體實施例中，抗體或抗原結合分子包含本文所述之VH框架區(FR)。在特定具體實施例中，抗體或抗原結合分子包含列於圖7E呈現之序列(例如，在圖7E的一序列中FR的一、二、三、或四個)、或可衍生自圖7E呈現之序列的VH FR。
在一些具體實施例中，特異性結合CD70、包含此序列之分子及呈現此分子之細胞之抗體或抗原結合分子，諸如scFv，包含本文所揭露之重鏈序列(例如，在圖7E)。在一具體實施例中，抗體或抗原結合分子包含含有下述胺基酸序列之重鏈可變區
Figure 02_image079
在各種具體實施例中，重鏈可變區與SEQ ID NO：7E之重鏈可變區序列為80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性。
在一些具體實施例中，特異性結合CD70、包含此序列之分子及呈現此分子之細胞之抗原結合分子，諸如scFv、或抗體，包含VL CDR1，其包括下述胺基酸序列、由下述胺基酸序列所組成、或基本上由下述胺基酸序列所組成：SGSSSNIGTNTVN (SEQ ID NO：59)。
在一些具體實施例中，特異性結合CD70、包含此序列之分子及呈現此分子之細胞之抗原結合分子，諸如scFv、或抗體，包含VL CDR2，其包括下述胺基酸序列、由下述胺基酸序列所組成、或基本上由下述胺基酸序列所組成：INNQRPS (SEQ ID NO：60)。
在一些具體實施例中，特異性結合CD70、包含此序列之分子及呈現此分子之細胞之抗原結合分子，諸如scFv、或抗體，包含VL CDR3，其包括下述胺基酸序列、由下述胺基酸序列所組成、或基本上由下述胺基酸序列所組成：ATWDDSLNGPVV (SEQ ID NO：61)。
在一些具體實施例中，特異性結合CD70、包含此序列之分子及呈現此分子之細胞之抗原結合分子，諸如scFv、或抗體，包含重鏈VL，其包含：(a)VL CDR1，其包括下述胺基酸序列、由下述胺基酸序列所組成、或基本上由下述胺基酸序列所組成：SGSSSNIGTNTVN (SEQ ID NO：59)；及/或(b)VL CDR2，其包括下述胺基酸序列、由下述胺基酸序列所組成、或基本上由下述胺基酸序列所組成：INNQRPS (SEQ ID NO：60)；及/或(c)VL CDR3，其包括下述胺基酸序列、由下述胺基酸序列所組成、或基本上由下述胺基酸序列所組成：ATWDDSLNGPVV (SEQ ID NO：61)。
在一些具體實施例中，特異性結合CD70、包含此序列之分子及呈現此分子之細胞之抗體或抗原結合分子，諸如scFv，其中，抗體或抗原結合分子包含VL CDR1、VL CDR2、及VL CDR3，其中，VL CDR1、VL CDR2、及VL CDR3包含圖6及7F所呈現的VL CDR1、VL CDR2、及VL CDR3之胺基酸序列。
在一些具體實施例中，特異性結合CD70、包含此序列之分子及呈現此分子之細胞之抗體或抗原結合分子，諸如scFv，包含含有圖7F之胺基酸序列的輕鏈可變區序列。在一些具體實施例中，抗體或抗原結合分子包含含有SEQ ID NO：13之輕鏈可變區序列。
在一些具體實施例中，特異性結合CD70、包含此序列之分子及呈現此分子之細胞之抗體或抗原結合分子，諸如scFv，其中，抗體或抗原結合分子包含本文所述之VL框架區(FR)。在特定具體實施例中，抗體或抗原結合分子包含列於圖7F呈現之序列(例如，在圖7F的一序列中FR的一、二、三、或四個)、或可衍生自圖7F呈現之序列的胺基酸序列之VL FR。
在一些具體實施例中，特異性結合CD70、包含此序列之分子及呈現此分子之細胞之抗體或抗原結合分子，諸如scFv，包含本文所揭露之輕鏈序列(例如，在圖7F)。在一具體實施例中，抗體或抗原結合分子包含含有下述胺基酸序列之輕鏈可變區
Figure 02_image081
在各種具體實施例中，輕鏈可變區為與SEQ ID NO：13之輕鏈可變區序列80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性。
在一些具體實施例中，特異性結合CD70、包含此序列之分子及呈現此分子之細胞之抗體或抗原結合分子，諸如scFv，包含本文所揭示之任一、二、及/或三個VH CDR序列。在一些具體實施例中，抗體或抗原結合分子包含VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3，其分別具有本文所揭示之任一VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的胺基酸序列。在一些具體實施例中，抗體或抗原結合分子包含本文所揭示之任一、二及/或三個VL CDR序列。在一些具體實施例中，抗體或抗原結合分子包含VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3，其分別具有本文所揭示之任一VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3的胺基酸序列。
在一具體實施例中，特異性結合CD70、包含此序列之分子及呈現此分子之細胞之抗體或抗原結合分子，諸如scFv，包含：(a)VH CDR1區，其包含SEQ ID NO：75之胺基酸序列；(b)VH CDR2區，其包含SEQ ID NO：76之胺基酸序列；(c)VH CDR3區，其包含SEQ ID NO：70之胺基酸序列；(d)VL CDR1區，其包含SEQ ID NO：59之胺基酸序列；(e)VL CDR2區，其包含SEQ ID NO：60之胺基酸序列；及(f)VL CDR3區，其包含SEQ ID NO：61之胺基酸序列。
在一具體實施例中，特異性結合CD70、包含此序列之分子及呈現此分子之細胞之抗體或抗原結合分子，諸如scFv，包含：(a)VH CDR1區；(b)VH CDR2區；(c)VH CDR3區；(d)VL CDR1區，包含；(e)VL CDR2區；及(f)VL CDR3區，其中，VH及VL CDR係分別示於圖7E及7F，及在圖6。
在一些具體實施例中，特異性結合CD70、包含此序列之分子及呈現此分子之細胞之抗體或抗原結合分子，諸如scFv，包含本文所揭露之重鏈可變區序列(例如，在圖7E)及本文所揭露之輕鏈可變區序列(例如，在圖7F)。
在一具體實施例中，抗體或抗原結合分子，諸如scFv，包含：(a)重鏈可變區，其包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列；及(b)輕鏈可變區，其包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列。編碼重鏈可變區及輕鏈可變區之核苷酸序列係提供於本文且分別在圖7E及7F。
在一些具體實施例中，特異性結合CD70、包含此序列之分子及呈現此分子之細胞之抗體或抗原結合分子，諸如scFv，包含本文所揭露之重鏈序列(例如，在圖7E)及本文所揭露之輕鏈序列(例如，在圖7F)。
在一具體實施例中，抗體或抗原結合分子，諸如scFv，包含：(a)重鏈可變區，其包含下述胺基酸序列
Figure 02_image083
在一具體實施例中，抗體或抗原結合分子，諸如scFv，包含：(a)含有胺基酸序列之重鏈，胺基酸序列為與SEQ ID NO：11之胺基酸序列80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性；及(b)含有胺基酸序列之輕鏈，胺基酸序列為與SEQ ID NO：13之胺基酸序列80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性。 III. 編碼抗原結合分子之多核苷酸、嵌合抗原受體及包含此等抗原結合分子之 T 細胞受體
本揭露亦針對編碼特異性結合CD70、包含此序列之分子及呈現此分子之細胞之抗體和抗原結合分子，諸如scFv，的多核苷酸。
在一些具體實施例中，本揭露之多核苷酸編碼抗原結合分子(諸如scFv)，其中抗原結合分子包含重鏈可變區胺基酸序列，該重鏈可變區胺基酸序列與選自由SEQ ID NO：3、7、及11所組成群組之重鏈可變區胺基酸序列為至少約75%、至少約85%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、或100%同一性。
在一些具體實施例中，本揭露之多核苷酸編碼抗原結合分子(諸如scFv)，其中抗原結合分子包含輕鏈可變區胺基酸序列，該輕鏈可變區胺基酸序列與選自由SEQ ID NO：5、9及13所組成群組的輕鏈可變區胺基酸序列為至少約75%、至少約85%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、或100%同一性。
在一些具體實施例中，多核苷酸包含選自下列所組成群組之重鏈編碼序列：SEQ ID NO：2、6及10。
在另一具體實施例中，多核苷酸包含選自下列所組成群組之輕鏈編碼序列：SEQ ID NO：4、8及12。
在另一具體實施例中，多核苷酸包含含有SEQ ID NO：2之重鏈編碼序列及含有SEQ ID NO：4之輕鏈編碼序列。
在另一具體實施例中，多核苷酸包含含有SEQ ID NO：6之重鏈編碼序列及含有SEQ ID NO：8之輕鏈編碼序列。
在另一具體實施例中，多核苷酸包含含有SEQ ID NO：10之重鏈編碼序列及含有SEQ ID NO：12之輕鏈編碼序列。
發明所屬技術領域中具有通常知識者將可理解所揭示之多核苷酸序列的變化可能是由於遺傳密碼的簡併性。所揭示之多核苷酸序列的此等變體因而形成本揭露的一個態樣。 IV. 嵌合抗原受體及 T 細胞受體
本揭露亦針對嵌合抗原受體(CAR)或T細胞受體(TCR)及經工程處理之T細胞，嵌合抗原受體(CAR)或T細胞受體(TCR)包含本文中所描述之特異性結合CD70的抗原結合分子(例如scFv)，且經工程處理之T細胞包含本文中所描述之特異性結合CD70的抗原結合分子。在一些具體實施例中，本揭露之抗CD70 CAR或TCR包含特異性結合CD70之抗原結合分子。在一些具體實施例中，抗CD70 CAR或TCR進一步包括共刺激結構域、及/或胞外結構域(即，“鉸鏈ˮ或“間隔子ˮ區)、及/或跨膜結構域、及/或胞內(訊號傳導)結構域、及/或CD3ζ活化結構域。在一些具體實施例中，抗CD70 CAR或TCR包括本文揭露之特異性結合CD70(例如hCD70)之scFv抗原結合分子、共刺激結構域、胞外結構域、跨膜結構域、及CD3ζ活化結構域。
在一些具體實施例中，本揭露之TCR包括特異性結合CD70之抗原結合分子，且其中TCR進一步包括第四互補決定區(CDR4)。在一些具體實施例中，TCR包含特異性結合CD70之抗原結合分子及恆定區。在一些具體實施例中，恆定區係選自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgD、IgE、及IgM之恆定區。CAR及TCR設計於下述進一步討論。
將進一步認識到在需要時，本文所述之各種結構域及區可表現在來自抗原結合分子(例如，scFv)及活化結構域之分開的鏈，以所謂的“反式ˮ配置。因此，在一具體實施例中，活化結構域可表現在一鏈上，而抗原結合分子、及/或細胞外結構域、及/或跨膜結構域及/或共刺激結構域(視所欲的CAR或TCR構造)可表現在分開的鏈上。
如本文更完整描述，將進一步認識到N至C端、或細胞外至細胞內，本揭露的CAR組分順序可如所欲變化。抗原結合分子(scFv)將為細胞外，以與目標抗原締合，且在scFv之N端尾(在細胞膜的最遠端)可包括前導或訊號肽。對本揭露之CAR的較佳定向及排序為：視需要之前導序列(例如，CD8a之前導序列)-抗-CD70 scFv--視需要之微-連接子，諸如GSG或AAA-鉸鏈--視需要之微-連接子，諸如GSG或AAA-跨膜區(例如，CD8a跨膜區)--視需要之微-連接子，諸如GSG或AAA-共刺激區(例如，CD28T或4-1BB之次序列)--視需要之微-連接子，諸如GSG或AAA-活化結構域(例如，CD3ζ結構域，諸如本文提供者之一)。
對於本揭露的CAR之另一較佳定向及排序包含二個共刺激結構域且為：視需要之前導序列(例如，CD8a之前導序列)--抗-CD70 scFv--視需要之微-連接子，諸如GSG或AAA-鉸鏈--視需要之微-連接子，諸如GSG或AAA-跨膜區(例如，CD8a跨膜區)--視需要之微-連接子，諸如GSG或AAA-共刺激區(例如，CD28T或4-1BB之次序列)--共刺激區(例如，CD28T或4-1BB之次序列)--視需要之微-連接子，諸如GSG或AAA-活化結構域(例如，CD3ζ結構域，諸如本文提供者之一)。
以下提供CAR的組分之更詳細描述。 IV.A. 細胞外或“ 鉸鏈ˮ 結構域
在一具體實施例中，本揭露之CAR或TCR包含“細胞外ˮ或“鉸鏈ˮ或“間隔子ˮ結構域或區，其術語在本文可互換使用。在另一具體實施例中，細胞外結構域為來自或衍生自(例如，包含下述之全部或片段)CD2、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD4、CD7、CD8α、CD8β、CD11a (ITGAL)、CD11b (ITGAM)、CD11c (ITGAX)、CD11d (ITGAD)、CD18 (ITGB2)、CD19 (B4)、CD27 (TNFRSF7)、CD28、CD28T、CD29 (ITGB1)、CD30 (TNFRSF8)、CD40 (TNFRSF5)、CD48 (SLAMF2)、CD49a (ITGA1)、CD49d (ITGA4)、CD49f (ITGA6)、CD66a (CEACAM1)、CD66b (CEACAM8)、CD66c (CEACAM6)、CD66d (CEACAM3)、CD66e (CEACAM5)、CD69 (CLEC2)、CD79A (B-細胞抗原受體複合物-相關之α鏈)、CD79B (B-細胞抗原受體複合物-相關之β鏈)、CD84 (SLAMF5)、CD96 (Tactile)、CD100 (SEMA4D)、CD103 (ITGAE)、CD134 (OX40)、CD137 (4-1BB)、CD150 (SLAMF1)、CD158A (KIR2DL1)、CD158B1 (KIR2DL2)、CD158B2 (KIR2DL3)、CD158C (KIR3DP1)、CD158D (KIRDL4)、CD158F1 (KIR2DL5A)、CD158F2 (KIR2DL5B)、CD158K (KIR3DL2)、CD160 (BY55)、CD162 (SELPLG)、CD226 (DNAM1)、CD229 (SLAMF3)、CD244 (SLAMF4)、CD247 (CD3-ζ)、CD258 (LIGHT)、CD268 (BAFFR)、CD270 (TNFSF14)、CD272 (BTLA)、CD276 (B7-H3)、CD279 (PD-1)、CD314 (NKG2D)、CD319 (SLAMF7)、CD335 (NK-p46)、CD336 (NK-p44)、CD337 (NK-p30)、CD352 (SLAMF6)、CD353 (SLAMF8)、CD355 (CRTAM)、CD357 (TNFRSF18)、可誘導之T細胞共刺激物(ICOS)、LFA-1 (CD11a/CD18)、NKG2C、DAP-10、ICAM-1、NKp80 (KLRF1)、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-7Rα、LFA-1、SLAMF9、LAT、GADS (GrpL)、SLP-76 (LCP2)、PAG1/CBP、CD83配體、Fcγ受體、MHC第1類分子、MHC第2類分子、TNF受體蛋白質、免疫球蛋白蛋白質、細胞介質受體、整合素、活化NK細胞受體、Toll配體受體、及其片段或組合。“細胞外ˮ或“鉸鏈ˮ或“間隔子ˮ結構域或區可衍生自天然或合成來源。
在一些具體實施例中，“細胞外ˮ或“鉸鏈ˮ或“間隔子ˮ結構域或區係位於抗原結合分子(例如，scFv)及跨膜結構域之間。在此定向下，鉸鏈結構域提供抗原結合分子及CAR或TCR表現於其上的細胞膜表面之間的距離。在一些具體實施例中，“細胞外ˮ或“鉸鏈ˮ或“間隔子ˮ結構域或區係來自或衍生自免疫球蛋白。在一些具體實施例中，“細胞外ˮ或“鉸鏈ˮ或“間隔子ˮ結構域或區係選自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgD、IgE、及IgM之鉸鏈區、或其片段。在其他具體實施例中，“細胞外ˮ或“鉸鏈ˮ或“間隔子ˮ結構域或區包含、來自、或衍生自CD8 α之鉸鏈區。在一些具體實施例中，“細胞外ˮ或“鉸鏈ˮ或“間隔子ˮ結構域或區包含、來自、或衍生自CD28T之鉸鏈區。在一些具體實施例中，“細胞外ˮ或“鉸鏈ˮ或“間隔子ˮ結構域或區包含CD8 α之鉸鏈區片段或CD28T之鉸鏈區片段，其中，片段為小於整個鉸鏈區之任何物。在一些具體實施例中，CD8 α鉸鏈區片段或CD28鉸鏈區片段包含胺基酸序列，該胺基酸序列排除在CD8 α鉸鏈區、或CD28T鉸鏈區之N-端或C-端、或兩者的至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、或至少20個胺基酸。
在一些具體實施例中，“細胞外ˮ或“鉸鏈ˮ或“間隔子ˮ結構域或區包含胺基酸序列，該胺基酸序列與胺基酸序列
Figure 02_image085
Figure 02_image087
或其片段為至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、或100%同一性。在一些具體實施例中，“細胞外ˮ或“鉸鏈ˮ或“間隔子ˮ結構域或區包含SEQ ID NO：15或其片段之胺基酸序列。
在一些具體實施例中，“細胞外ˮ或“鉸鏈ˮ或“間隔子ˮ結構域或區包含胺基酸序列，該胺基酸序列與胺基酸序列
Figure 02_image089
或其片段為至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、或100%同一性。在一些具體實施例中，“細胞外ˮ或“鉸鏈ˮ或“間隔子ˮ結構域或區包含SEQ ID NO：83、或其片段之胺基酸序列。
在一些具體實施例中，“細胞外ˮ或“鉸鏈ˮ或“間隔子ˮ結構域或區係由與下列核苷酸序列或其片段為至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、或100%同一性之核苷酸序列編碼
Figure 02_image091
Figure 02_image093
。在一些具體實施例中，“細胞外ˮ或“鉸鏈ˮ或“間隔子ˮ結構域或區係由包含SEQ ID NO：14之核苷酸序列或其片段之核苷酸序列編碼。
在一些具體實施例中，“細胞外ˮ或“鉸鏈ˮ或“間隔子ˮ結構域或區係由與下列核苷酸序列或其片段為至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、或100%同一性之核苷酸序列編碼
Figure 02_image095
Figure 02_image097
。在一些具體實施例中，“細胞外ˮ或“鉸鏈ˮ或“間隔子ˮ結構域或區係由包含SEQ ID NO：82之核苷酸序列或其片段之核苷酸序列編碼。
在一些具體實施例中，“細胞外ˮ或“鉸鏈ˮ或“間隔子ˮ結構域或區包含與下列胺基酸序列或其片段為至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、或100%同一性之胺基酸序列
Figure 02_image099
Figure 02_image101
。在一些具體實施例中，“細胞外ˮ或“鉸鏈ˮ或“間隔子ˮ結構域或區包含SEQ ID NO：17或其片段之胺基酸序列。
在一些具體實施例中，“細胞外ˮ或“鉸鏈ˮ或“間隔子ˮ結構域或區係由與下列核苷酸序列或其片段為至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、或100%同一性之核苷酸序列編碼
Figure 02_image103
Figure 02_image105
。在一些具體實施例中，“細胞外ˮ或“鉸鏈ˮ或“間隔子ˮ結構域或區係由包含SEQ ID NO：16之核苷酸序列或其片段之核苷酸序列編碼。
在一些具體實施例中，“細胞外ˮ或“鉸鏈ˮ或“間隔子ˮ結構域或區包含與下列胺基酸序列或其片段為至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、或100%同一性之胺基酸序列
Figure 02_image107
Figure 02_image109
。在一些具體實施例中，“細胞外ˮ或“鉸鏈ˮ或“間隔子ˮ結構域或區包含SEQ ID NO：85之胺基酸序列或其片段。
在一些具體實施例中，“細胞外ˮ或“鉸鏈ˮ或“間隔子ˮ結構域或區包含與下列胺基酸序列或其片段為至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、或100%同一性之胺基酸序列
Figure 02_image111
。在一些具體實施例中，“細胞外ˮ或“鉸鏈ˮ或“間隔子ˮ結構域或區包含SEQ ID NO：85之胺基酸序列或其片段。
在一些具體實施例中，“細胞外ˮ或“鉸鏈ˮ或“間隔子ˮ結構域或區係由與下列核苷酸序列或其片段為至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、或100%同一性之核苷酸序列編碼
Figure 02_image113
。在一些具體實施例中，“細胞外ˮ或“鉸鏈ˮ或“間隔子ˮ結構域或區係由包含SEQ ID NO：84之核苷酸序列或其片段之核苷酸序列編碼。
在一些具體實施例中，CD28T結構域係衍生自人類CD28T鉸鏈區，且可包括SEQ ID NO：15。於其他具體實施例中，CD28T結構域係衍生自囓齒動物、鼠類或靈長類(例如非人類靈長類)CD28T鉸鏈區。在一些具體實施例中，CD28T結構域係衍生自嵌合CD28T鉸鏈區。
在一些具體實施例中，CD28T結構域係衍生自人類CD28T鉸鏈區，且可包含SEQ ID NO：83。在其他具體實施例中，CD28T結構域係衍生自囓齒動物、鼠類、或靈長類(例如，非人類靈長類)CD28T鉸鏈區。在一些具體實施例中，CD28T結構域係衍生自嵌合CD28T鉸鏈區。
在一些具體實施例中，CD8結構域係衍生自人類CD8鉸鏈區，且可包含SEQ ID NO：17。在其他具體實施例中，CD8結構域係衍生自囓齒動物、鼠類、或靈長類(例如，非人類靈長類) CD8鉸鏈區。在一些具體實施例中，CD8結構域係衍生自嵌合CD8鉸鏈區。
在一些具體實施例中，CD8結構域係衍生自人類CD8鉸鏈區，且可包含SEQ ID NO：85。在其他具體實施例中，CD8結構域係衍生自囓齒動物、鼠類、或靈長類 (例如，非人類靈長類) CD8鉸鏈區。在一些具體實施例中，CD8結構域係衍生自嵌合CD8鉸鏈區。
在一些具體實施例中，細胞外結構域包含免疫球蛋白家族成員的一些或全部，諸如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgD、IgE、IgM、或其片段。
視需要地，短肽或多肽連接子，較佳介於2至10個胺基酸長度，可形成CAR之鉸鏈結構域與抗原結合結構域之間、或鉸鏈結構域與跨膜結構域之間的鍵聯。視需要地，短寡-或多肽連接子，較佳地介於2至10個胺基酸長度，可形成鍵聯。甘胺酸-絲胺酸雙重(GS)、甘胺酸-絲胺酸-甘胺酸三重(GSG)、或丙胺酸-丙胺酸-丙胺酸三重(AAA)提供特別適合之連接子。 IV.B. 跨膜結構域
本揭露之CAR或TCR可進一步包含跨膜結構域。跨膜結構域可設計成與鉸鏈結構域融合。類似地，其可與諸如共刺激結構域之胞內結構域融合。在一具體實施例中，可使用天然與CAR中之結構域之一聯結的跨膜結構域。例如，跨膜結構域可包含共刺激結構域之自然跨膜區(例如，CD28T或4-1BB之TM區，作為共刺激結構域)或鉸鏈區之自然跨膜結構域(例如，CD8 α或CD28T之TM區，作為鉸鏈結構域)。
在一些情況下，跨膜結構域可經過選擇或藉由胺基酸取代進行修飾以避免該等結構域與相同或不同之表面膜蛋白的跨膜結構域結合，以使其與受體複合物之其他成員的交互作用減至最少。跨膜結構域可衍生自天然來源或來自合成來源。當跨膜結構域衍生自天然來源時，結構域可衍生自任何膜結合蛋白質或跨膜蛋白質。在一些具體實施例中，該跨膜結構域係衍生自：CD2、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD4、CD7、CD8α、CD8β、CD11a (ITGAL)、CD11b (ITGAM)、CD11c (ITGAX)、CD11d (ITGAD)、CD18 (ITGB2)、CD19 (B4)、CD27 (TNFRSF7)、CD28、CD28T、CD29 (ITGB1)、CD30 (TNFRSF8)、CD40 (TNFRSF5)、CD48 (SLAMF2)、CD49a (ITGA1)、CD49d (ITGA4)、CD49f (ITGA6)、CD66a (CEACAM1)、CD66b (CEACAM8)、CD66c (CEACAM6)、CD66d (CEACAM3)、CD66e (CEACAM5)、CD69 (CLEC2)、CD79A (B-細胞抗原受體複合物-相關之α鏈)、CD79B (B-細胞抗原受體複合物-相關之β鏈)、CD84 (SLAMF5)、CD96 (Tactile)、CD100 (SEMA4D)、CD103 (ITGAE)、CD134 (OX40)、CD137 (4-1BB)、CD150 (SLAMF1)、CD158A (KIR2DL1)、CD158B1 (KIR2DL2)、CD158B2 (KIR2DL3)、CD158C (KIR3DP1)、CD158D (KIRDL4)、CD158F1 (KIR2DL5A)、CD158F2 (KIR2DL5B)、CD158K (KIR3DL2)、CD160 (BY55)、CD162 (SELPLG)、CD226 (DNAM1)、CD229 (SLAMF3)、CD244 (SLAMF4)、CD247 (CD3-ζ)、CD258 (LIGHT)、CD268 (BAFFR)、CD270 (TNFSF14)、CD272 (BTLA)、CD276 (B7-H3)、CD279 (PD-1)、CD314 (NKG2D)、CD319 (SLAMF7)、CD335 (NK-p46)、CD336 (NK-p44)、CD337 (NK-p30)、CD352 (SLAMF6)、CD353 (SLAMF8)、CD355 (CRTAM)、CD357 (TNFRSF18)、可誘導之T細胞共刺激物 (ICOS)、LFA-1 (CD11a/CD18)、NKG2C、DAP-10、ICAM-1、NKp80 (KLRF1)、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-7Rα、LFA-1、SLAMF9、LAT、GADS (GrpL)、SLP-76 (LCP2)、PAG1/CBP、CD83配體、Fcγ受體、MHC第1類分子、MHC第2類分子、TNF受體蛋白質、免疫球蛋白蛋白質、細胞介質受體、整合素、活化之NK細胞受體、Toll配體受體、及其組合。
在一些具體實施例中，跨膜結構域可包含序列，其跨越細胞膜，但延伸到細胞的細胞質及/或到細胞外空間。例如，跨膜可包含膜跨越序列，其本身可進一步包含延伸到細胞之細胞質、及/或細胞外空間之1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多胺基酸。因此，跨膜結構域包含膜跨越區，又可進一步包含延伸超過膜本身的內部或外部表面之胺基酸(群)；此序列亦可視為“跨膜結構域ˮ。
在一具體實施例中，本揭露的CAR之跨膜結構域包含CD28T跨膜結構域。在一具體實施例中，CD28T跨膜結構域包含由下述核酸序列編碼的蛋白質之跨膜部分：
Figure 02_image115
例如，跨膜結構域可由包含下述核酸序列之核酸序列編碼
Figure 02_image117
在另一具體實施例中，CD28T跨膜結構域包含含在下述胺基酸序列之跨膜胺基酸序列：
Figure 02_image119
例如，跨膜結構域可包含胺基酸序列
Figure 02_image121
在一具體實施例中，本揭露的CAR之跨膜結構域包含CD8跨膜結構域。在一具體實施例中，CD8跨膜結構域包含由下述核酸序列編碼的蛋白質之跨膜部分：
Figure 02_image123
例如，跨膜結構域可由包含下述核酸序列之核酸序列編碼
Figure 02_image125
在另一具體實施例中，CD8跨膜結構域包含含在下述胺基酸序列之跨膜胺基酸序列：
Figure 02_image127
例如，跨膜結構域可包含胺基酸序列
Figure 02_image129
在一些具體實施例中，跨膜結構域為CD28T跨膜結構域。在一些具體實施例中，跨膜結構域包含與胺基酸序列
Figure 02_image131
至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或100%同一性的胺基酸序列。
在一些具體實施例中，跨膜結構域包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列。
在一些具體實施例中，CD28T跨膜結構域係由與核苷酸序列
Figure 02_image133
Figure 02_image135
為至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或100%同一性的核苷酸序列編碼。
在一些具體實施例中，跨膜結構域係由包含SEQ ID NO：18核酸序列之核酸序列編碼。
在另一具體實施例中，跨膜結構域為CD8跨膜結構域。在一些具體實施例中，跨膜結構域包含與下列胺基酸序列為至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、或100%同一性之胺基酸序列：
Figure 02_image137
在一些具體實施例中，跨膜結構域包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列。
在另一具體實施例中，跨膜結構域為CD8跨膜結構域。在一些具體實施例中，跨膜結構域包含與下列胺基酸序列為至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、或100%同一性之胺基酸序列：
Figure 02_image139
在一些具體實施例中，跨膜結構域包含SEQ ID NO：94之胺基酸序列。
在一些具體實施例中，CD8跨膜結構域係由與下列核苷酸序列為至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、或100%同一性之核苷酸序列編碼：
Figure 02_image141
在一些具體實施例中，跨膜結構域係由包含SEQ ID NO：20之核苷酸序列的核苷酸序列編碼。
如本文所注意到，本揭露的CAR之各種結構域可視需要地包含除了本文所提供的該些序列以外的胺基酸。例如，跨膜結構域可包含延伸結構域到細胞質及/或細胞外空間的胺基酸，其可為自然發生在分子(跨膜結構域自該分子衍生出來)中。因此，在一些具體實施例中，CD8跨膜結構域進一步包含連續胺基酸序列
Figure 02_image143
，由下述核酸序列編碼
Figure 02_image145
，且延伸跨膜結構域到細胞質或細胞內空間。
視需要地，短肽或多肽連接子，特別是介於2至10個胺基酸長度，可形成CAR之跨膜結構域及近端細胞質訊號傳導結構域之間的鍵聯，諸如共刺激或活化結構域，或到抗原結合分子(例如，抗-CD70 scFv)。視需要地，短寡-或多肽連接子，特別是介於2至10個胺基酸長度，可形成鍵聯。甘胺酸-絲胺酸雙重(GS)、甘胺酸-絲胺酸-甘胺酸三重(GSG)、或丙胺酸-丙胺酸-丙胺酸三重(AAA)提供特別適合的連接子。 IV.C. 共刺激結構域
在一些具體實施例中，本揭露包含CAR，其中，CAR包含特異性結合CD70之抗原結合分子(本文提供之一或多個抗原結合分子，在圖中或在所附之序列表中)，且其中，CAR進一步包含共刺激結構域。在一些具體實施例中，共刺激結構域係位於抗原結合分子(例如，scFv)，及活化結構域之間。在一些具體實施例中，共刺激結構域除了細胞內訊號傳導結構域之外可以，但不需要，包含細胞外結構域、及/或跨膜結構域。在一些具體實施例中，共刺激結構域可包含跨膜結構域及細胞內訊號傳導結構域。在一些具體實施例中，共刺激結構域可包含細胞外結構域及跨膜結構域。在一些具體實施例中，共刺激結構域可包含細胞內訊號傳導結構域。本揭露之CAR、TCR或經工程處理之T細胞可包含一、二或三個共刺激結構域，其可串聯配置或側面配置於CAR的一或多個其他組分。
本文揭露之CAR、TCR及經工程處理之T細胞的共刺激結構域可提供訊號傳導到活化結構域，該結構域之後活化至少一種免疫細胞之正常的效應子功能。T細胞之效應子功能可為，例如細胞溶解活性或輔助子活性，包括分泌細胞介質。
在一些具體實施例中，適合的共刺激結構域包括(即，包含)，但不限於CD2、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD4、CD7、CD8α、CD8β、CD11a (ITGAL)、CD11b (ITGAM)、CD11c (ITGAX)、CD11d (ITGAD)、CD18 (ITGB2)、CD19 (B4)、CD27 (TNFRSF7)、CD28、CD28T、CD29 (ITGB1)、CD30 (TNFRSF8)、CD40 (TNFRSF5)、CD48 (SLAMF2)、CD49a (ITGA1)、CD49d (ITGA4)、CD49f (ITGA6)、CD66a (CEACAM1)、CD66b (CEACAM8)、CD66c (CEACAM6)、CD66d (CEACAM3)、CD66e (CEACAM5)、CD69 (CLEC2)、CD79A (B-細胞抗原受體複合物-相關之α鏈)、CD79B (B-細胞抗原受體複合物-相關之β鏈)、CD84 (SLAMF5)、CD96 (Tactile)、CD100 (SEMA4D)、CD103 (ITGAE)、CD134 (OX40)、CD137 (4-1BB)、CD150 (SLAMF1)、CD158A (KIR2DL1)、CD158B1 (KIR2DL2)、CD158B2 (KIR2DL3)、CD158C (KIR3DP1)、CD158D (KIRDL4)、CD158F1 (KIR2DL5A)、CD158F2 (KIR2DL5B)、CD158K (KIR3DL2)、CD160 (BY55)、CD162 (SELPLG)、CD226 (DNAM1)、CD229 (SLAMF3)、CD244 (SLAMF4)、CD247 (CD3-ζ)、CD258 (LIGHT)、CD268 (BAFFR)、CD270 (TNFSF14)、CD272 (BTLA)、CD276 (B7-H3)、CD279 (PD-1)、CD314 (NKG2D)、CD319 (SLAMF7)、CD335 (NK-p46)、CD336 (NK-p44)、CD337 (NK-p30)、CD352 (SLAMF6)、CD353 (SLAMF8)、CD355 (CRTAM)、CD357 (TNFRSF18)、可誘導之T細胞共刺激物 (ICOS)、LFA-1 (CD11a/CD18)、NKG2C、DAP-10、ICAM-1、NKp80 (KLRF1)、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-7Rα、LFA-1、SLAMF9、LAT、GADS (GrpL)、SLP-76 (LCP2)、PAG1/CBP、CD83配體、Fcγ受體、MHC第1類分子、MHC第2類分子、TNF受體蛋白質、免疫球蛋白蛋白質、細胞介質受體、整合素、活化之NK細胞受體、Toll配體受體、及其片段或組合。
編碼共刺激結構域的核苷酸序列實例列於SEQ ID NO. 22：
Figure 02_image147
在一具體實施例中，編碼共刺激訊號傳導結構域之多核苷酸包含與
Figure 02_image149
Figure 02_image151
之核苷酸序列至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%同一性的核苷酸序列。
共刺激訊號傳導結構域之實例為
Figure 02_image153
在一些具體實施例中，在共刺激結構域內之胞內信號傳導結構域包含與
Figure 02_image155
至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、約97%、至少約98%、至少約99%或約100%同一性的胺基酸序列。
編碼細胞內訊號傳導結構域的核苷酸序列之另一實例為
Figure 02_image157
在一具體實施例中，編碼共刺激訊號傳導結構域之多核苷酸包含與下列核苷酸序列至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、或約100%同一性之核苷酸序列
Figure 02_image159
細胞內訊號傳導結構域之另一實例係列於SEQ ID NO.25：
Figure 02_image161
在一些具體實施例中，細胞內訊號傳導結構域包含與下列之胺基酸序列至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、或約100%同一性之胺基酸序列
Figure 02_image163
本揭露的CAR共刺激訊號傳導序列可以隨機或特定順序直接連接到另一共刺激結構域、到活化結構域、到跨膜結構域、或其他CAR的組分。視需要地，短寡-或多肽連接子，特別是介於2至10個胺基酸長度，可形成鍵聯。甘胺酸-絲胺酸雙重(GS)、甘胺酸-絲胺酸-甘胺酸三重(GSG)、或丙胺酸-丙胺酸-丙胺酸三重(AAA)提供特別適合的連接子。
進一步注意到多共刺激結構域可併到本揭露之CAR或TCR中。例如，CD28T共刺激結構域與4-1BB共刺激結構域兩者可併到本揭露之CAR或TCR且憑藉CAR或TCR之抗原結合組分，仍可針對CD70及表現CD70在其表面的細胞。 IV.D 活化結構域
在一些具體實施例中，用於本揭露之經工程處理之T細胞的胞內結構域包括協同作用以在抗原/受體接合後起始訊號轉導之T細胞受體(TCR)和共受體之細胞質序列，以及這些序列之任何衍生物或變體及具有相同功能性能力之任何合成序列。CD3為天然T細胞上之T細胞受體的元素且已被證明為CAR中之重要的胞內活化元素。在一具體實施例中，活化結構域為CD3，例如CD3ζ，其核苷酸序列列於SEQ ID NO：26：
Figure 02_image165
在一些具體實施例中，編碼活化結構域之多核苷酸包含與
Figure 02_image167
之核苷酸序列至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%同一性的核苷酸序列。
胞內CD3ζ之對應胺基酸為
Figure 02_image169
在一些具體實施例中，活化結構域包含與
Figure 02_image171
Figure 02_image173
之胺基酸序列至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%同一性的胺基酸序列。
在一些具體實施例中，活化結構域包含與
Figure 02_image175
Figure 02_image177
的胺基酸序列至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%同一性的胺基酸序列。 IV.E. 前導肽
在一些具體實施例中，本揭露之多核苷酸編碼CAR或TCR，其中CAR或TCR包含特異性結合CD70之抗原結合分子且其中該CAR或TCR進一步包含前導肽(本文中亦稱為“訊號肽ˮ或“訊號序列ˮ)。視需要包括訊號序列在本揭露之CAR或TCR。若前導序列包括在本揭露之CAR或TCR，其可表現在CAR或TCR之N端。因此，視哪一個結構域位於CAR或TCR之N端，前導序列可與本揭露之CAR或TCR的抗原結合分子之VH或VL組分締合。
若欲包括前導序列，則此前導序列可被合成或其可衍生自天然存在的分子。例如，CD8之天然存在的21殘基前導序列(見例如，Littman等人，(1985) Cell40:237-46)可用作為所揭露之CAR及TCR構築體中的前導序列。
因此，在一些具體實施例中，前導肽包含與胺基酸序列
Figure 02_image179
至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或100%同一性的胺基酸序列。
在一些具體實施例中，訊號肽包含SEQ ID NO：28之胺基酸序列。在一些具體實施例中，前導肽係由與下述至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、或約100%同一性之核苷酸序列編碼
Figure 02_image181
在一些具體實施例中，本揭露之多核苷酸編碼CAR，其中CAR包含前導肽(P)、抗原結合分子(諸如與人類CD70聯結之scFv) (B)、鉸鏈結構域(H)、跨膜結構域(T)、一或多個共刺激區(C)、及活化結構域(A)，其中CAR係根據下列配置：P-B-H-T-C-A。在一些具體實施例中，CAR的組分視需要通過連接子序列(諸如AAA或GSG)連接。在一些具體實施例中，抗原結合分子包含VH及VL，其中CAR係根據下列配置：P-VH-VL-H-T-C-A或P-VL-VH-H-T-C-A。在一些具體實施例中，VH和VL係藉由連接子(L)(諸如SEQ ID NO：80或81)連接，其中CAR從N-端至C-端係根據下列配置：P-VH-L-VL-H-T-C-A或P-VH-L-VL-H-T-C-A。
在一些具體實施例中，本揭露之多核苷酸編碼CAR，其中CAR包含與示於圖8A至8L及於表2中之胺基酸序列至少約75%、至少約85%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或100%同一性的胺基酸序列。在一些具體實施例中，本揭露之多核苷酸編碼CAR，其中CAR包含示於圖8A至8L及於表2中之胺基酸序列。
Figure 02_image183
Figure 02_image185
Figure 02_image187
Figure 02_image189
Figure 02_image191
Figure 02_image193
Figure 02_image195
Figure 02_image197
Figure 02_image199
在一些具體實施例中，本揭露之多核苷酸編碼CAR，其中CAR包含與選自由下列所組成群組之胺基酸序列至少約75%、至少約85%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或100%同一性的胺基酸序列：SEQ ID NO：30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50及52。在一些具體實施例中，CAR包含選自由下列所組成群組之胺基酸序列：SEQ ID NO：30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50及52。在一具體實施例中，CAR包含SEQ ID NO：30之胺基酸序列。於另一具體實施例中，CAR包含SEQ ID NO：32之胺基酸序列。於另一具體實施例中，CAR包含SEQ ID NO：34之胺基酸序列。於另一具體實施例中，CAR包含SEQ ID NO：36之胺基酸序列。於另一具體實施例中，CAR包含SEQ ID NO：38之胺基酸序列。於另一具體實施例中，CAR包含SEQ ID NO：40之胺基酸序列。於另一具體實施例中，CAR包括SEQ ID NO：42之胺基酸序列。於另一具體實施例中，CAR包含SEQ ID NO：44之胺基酸序列。於另一具體實施例中，CAR包含SEQ ID NO：46之胺基酸序列。於另一具體實施例中，CAR包含SEQ ID NO：48之胺基酸序列。於另一具體實施例中，CAR包含SEQ ID NO：50之胺基酸序列。於另一具體實施例中，CAR包含SEQ ID NO：52之胺基酸序列。
在一些具體實施例中，本揭露之編碼CAR的多核苷酸包含與選自由下列所組成群組之胺基酸序列至少約50%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約85%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或100%同一性的核苷酸序列：SEQ ID NO：29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49及51。在一些具體實施例中，多核苷酸包含選自由下列所組成群組之核苷酸序列：SEQ ID NO：29。在一具體實施例中，多核苷酸包含SEQ ID NO：31之核苷酸序列。於另一具體實施例中，多核苷酸包含SEQ ID NO：33之核苷酸序列。於另一具體實施例中，多核苷酸包含SEQ ID NO：35之核苷酸序列。於另一具體實施例中，多核苷酸包含SEQ ID NO：37之核苷酸序列。於另一具體實施例中，多核苷酸包含SEQ ID NO：39之核苷酸序列。於另一具體實施例中，多核苷酸包含SEQ ID NO：41之核苷酸序列。於另一具體實施例中，多核苷酸包含SEQ ID NO：43之核苷酸序列。於另一具體實施例中，多核苷酸包含SEQ ID NO：45之核苷酸序列。於另一具體實施例中，多核苷酸包含SEQ ID NO：47之核苷酸序列。於另一具體實施例中，多核苷酸包含SEQ ID NO：49之核苷酸序列。於另一具體實施例中，多核苷酸包含SEQ ID NO：51之核苷酸序列。 IV. 載體、細胞、及醫藥組成物
於一些態樣中，本發明提供包含本揭露之多核苷酸的載體。在一些具體實施例中，本揭露針對包含如本文所描述之編碼CAR或TCR之多核苷酸的載體或載體組。於其他具體實施例中，本揭露針對包含如本文所揭示之編碼特異性結合CD70之抗體或其抗原結合分子的多核苷酸之載體或載體組。
本領域中已知之任何載體可適合用於本揭露。在一些具體實施例中，載體為病毒載體。在一些具體實施例中，載體為反轉錄病毒載體、DNA載體、鼠白血病病毒載體、SFG載體、質體、RNA載體、腺病毒載體、桿狀病毒載體(baculoviral載體)、埃巴病毒載體(Epstein Barr viral載體)、乳多泡病毒載體(papovaviral載體)、牛痘病毒載體(vaccinia viral載體)、單純皰疹病毒載體(herpes simplex viral載體)、腺病毒相關載體(AAV)、慢病毒載體或彼等之任何組合。在一些具體實施例中，可運用本揭露之一、二或更多載體。例如，在一具體實施例中，CAR或TCR之一或多個組分可配置於一載體，同時CAR或TCR之一或多個不同組分可配置於不同載體。
於其他態樣中，本發明提供包含本揭露之多核苷酸或載體之細胞。一些具體實施例中，本揭露針對包含如本文所描述之編碼CAR或TCR之多核苷酸的宿主細胞，諸如體外細胞。在一些具體實施例中，本揭露針對包含如本揭露所揭示之編碼特異性結合CD70之抗體或其抗原結合分子的多核苷酸之宿主細胞，諸如體外細胞。
於其他具體實施例中，本揭露針對包含由本文所揭示之編碼CAR或TCR之多核苷酸所編碼的多肽之體外細胞。於其他具體實施例中，本揭露針對包含由本文所揭示之編碼特異性結合CD70之抗原結合分子之多核苷酸所編碼的多肽之細胞、體外細胞。
任何細胞均可作為用於本揭露之多核苷酸、載體或多肽之宿主細胞。在一些具體實施例中，該細胞可為原核細胞、真菌細胞、酵母細胞或高等真核細胞，諸如哺乳動物細胞。合適之原核細胞包括，但不限於真細菌，諸如革蘭氏陰性或革蘭氏陽性微生物，例如腸桿菌科( Enterobacteriaceae)，諸如埃希氏菌屬( Escherichia)，例如大腸桿菌( E. coli)；腸桿菌( Enterobacter)；歐文氏菌( Erwinia)；克雷伯氏菌( Klebsiella)；變形桿菌( Proteus)；沙門氏菌( Salmonella)，例如鼠傷寒沙門氏菌( Salmonella typhimurium)；沙雷氏菌( Serratia)，例如黏質沙雷氏菌( Serratia marcescans)及志賀氏菌( Shigella)；桿菌，諸如枯草芽孢桿菌及地衣芽孢桿菌( B. licheniformis)；假單胞菌，諸如綠膿假單胞菌；及鏈黴菌。在一些具體實施例中，宿主細胞為人類細胞。在一些具體實施例中，細胞為免疫細胞。在一些具體實施例中，免疫細胞係選自由下列所組成之群組：T細胞、B細胞、腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)、TCR表現細胞、自然殺手(NK)細胞、樹突細胞、顆粒細胞、固有淋巴樣細胞、巨核細胞、單核細胞、巨噬細胞、血小板、胸腺細胞及髓樣細胞。在一具體實施例中，免疫細胞為T細胞。於另一具體實施例中，免疫細胞為NK細胞。在一些具體實施例中，T細胞為腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)、自體T細胞、經工程處理之自體T細胞(eACT TM)、同種異體T細胞、異源T細胞或彼等之任何組合。
本揭露之細胞可透過本領域已知之任何來源取得。例如，T細胞可在體外從造血幹細胞群分化，或者T細胞可從個體取得。T細胞可從，例如周邊血單核細胞、骨髓、淋巴結組織、臍帶血、胸腺組織、來自感染部位之組織、腹水、胸腔積液、脾組織及腫瘤取得。此外，T細胞可衍生自一或多個本領域中可獲得之T細胞株。T細胞亦可使用具有通常知識者已知之任何數目的技術(諸如FICOLL TM分離術及/或血液成分分離術)從個體採集之血液單位取得。在一些具體實施例中，藉由血液成分分離術收集之細胞係經洗滌以除去血漿部分，且放置在適當之緩衝液或培養基中以進行後續處理。在一些具體實施例中，細胞係以PBS洗滌。可理解的是，洗滌步驟可藉由，諸如使用半自動化無逆流(flowthrough)離心機，例如Cobe TM2991細胞處理器、Baxter CytoMate TM，等來進行。在一些具體實施例中，經洗滌之細胞係再懸浮於一或多種生物相容之緩衝液，或其他具有或不具有緩衝液之鹽水溶液中。在一些具體實施例中，除去血液成分分離術樣品之不欲的組分。單離用於T細胞療法的T細胞之額外方法揭示於美國專利公開案第2013/0287748號(其整體以引用方式併入本文)中。
在一些具體實施例中，T細胞係藉由溶解紅血球並耗盡單核細胞而從PBMC中單離出，例如透過PERCOLL TM梯度，藉由離心來單離。在一些具體實施例中，T細胞之特定亞群，諸如CD28 +、CD4 +、CD8 +、CD45RA +及CD45RO +T細胞可藉由本領域中已知之正或負選擇技術進一步單離出。例如，藉由負選擇進行之T細胞群富集可使用針對該經負選擇之細胞所特有之表面標記的抗體組合來完成。在一些具體實施例中，可使用細胞分選及/或經由負磁性免疫黏附或流式細胞術(其係使用針對存在於該經負選擇之細胞上之細胞表面標記的單株抗體混合物)選擇。例如，為了藉由負選擇來富集CD4 +細胞，單株抗體混合物通常包括針對CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR及CD8之抗體。在一些具體實施例中，使用流式細胞術及細胞分選來單離於本揭露中有興趣使用的細胞群。使用這些標準技術，當進行本文所提供的方法時，投予到患者的經工程處理之T細胞可包含任何所欲的細胞比例。例如，其可為所欲地提供僅經工程處理之CD8 +細胞予患者、僅經工程處理之CD4 +細胞予患者、或所欲比例之CD4 +對CD8 +細胞，諸如等量的CD4 +及CD8 +細胞。
在一些具體實施例中，PBMC可使用如本文所描述之方法而直接用於以免疫細胞(如CAR或TCR)進行之遺傳修飾。在一些具體實施例中，將PBMC單離出後，可進一步單離出T淋巴細胞，並在遺傳修飾及/或擴增之前或之後將細胞毒性及輔助性T淋巴細胞二者分選成初始T細胞、記憶T細胞及效應T細胞亞群。
在一些具體實施例中，藉由鑑別與CD8 +細胞之初始細胞、中央記憶細胞及效應細胞類型各者相關聯之細胞表面抗原來將CD8 +細胞進一步分選成初始細胞、中央記憶細胞及效應細胞。在一些具體實施例中，中央記憶T細胞之表型標記的表現包括CD3、CD28、CD44、CD45RO、CD45RA及CD127且為顆粒酶B陰性。在一些具體實施例中，中央記憶T細胞為CD3 +、CD28 +、CD44 hi、CD45RO hi、CD45RA 低及CD127 hiCD8 +T細胞。在一些具體實施例中，效應T細胞為CD62L、CCR7、CD28及CD127陰性且為顆粒酶B和穿孔素陽性。在一些具體實施例中，CD4 +T細胞被進一步分選成亞群。例如，CD4 +T輔助性細胞可藉由鑑別具有細胞表面抗原之細胞群而被分選為初始細胞、中央記憶及效應細胞。
在一些具體實施例中，免疫細胞，諸如T細胞，係在單離後使用已知方法進行遺傳修飾，或者免疫細胞係在經遺傳修飾之前在體外被活化及擴增(或者，在祖細胞的情況下為分化)。於另一具體實施例中，免疫細胞，諸如T細胞係以本文所描述之嵌合抗原受體進行遺傳修飾(例如以包含一或多個編碼CAR之核苷酸序列的病毒載體轉導)，然後在體外活化及/或擴增。用於活化及擴增T細胞之方法為本領域所已知且描述於，例如美國專利案第6,905,874；6,867,041；及6,797,514號；和PCT公開案第WO 2012/079000號(其整體以引用方式併入本文)中。一般而言，該等方法包括將PBMC或經分離之T細胞在具有適當細胞介質(諸如IL-2)之培養基中與刺激劑和共刺激劑(諸如抗-CD3和抗-CD28抗體，通常係黏附在珠子或其他表面上)接觸。黏附在相同珠子上之抗CD3和抗CD28抗體係作為“替代ˮ抗原呈現細胞(APC)。一種實例為Dynabeads ®系統，此為用於生理活化人類T細胞之CD3/CD28活化子/刺激子系統。於其他具體實施例中，T細胞係使用，諸如美國專利案第6,040,177和5,827,642號及PCT公開案第WO 2012/129514號(其整體以引用方式併入本文)中描述之方法，以飼養細胞及合適之抗體和細胞介質活化並刺激以進行增殖。
在一些具體實施例中，T細胞係從供體個體取得。在一些具體實施例中，供體個體為罹患癌症或腫瘤之人類患者。於其他具體實施例中，該供體個體為未罹患癌症或腫瘤之人類患者。在另一具體實施例中，T細胞係衍生自複能(pluripotent)幹細胞，其維持在有利於幹細胞分化成T細胞之條件下。
本揭露之其他態樣係針對包含本文所提供之多核苷酸、本文所提供之載體、本文所提供之多肽或本文所提供之體外細胞的組成物。在一些具體實施例中，組成物包含醫藥上可接受之載體、稀釋劑、增溶劑、乳化劑、防腐劑及/或佐劑。在一些具體實施例中，組成物包含賦形劑。在一具體實施例中，組成物包含編碼CAR或TCR之多核苷酸，其中CAR或TCR包含特異性結合CD70之抗原結合分子。於另一具體實施例中，該組成物包含由本文提供之多核苷酸編碼的CAR或TCR，其中CAR或TCR包含特異性結合CD70之抗原結合分子。於另一具體實施例中，該組成物包含含有編碼CAR或TCR之多核苷酸的T細胞，其中CAR或TCR包含特異性結合CD70之抗原結合分子。於另一具體實施例中，組成物包含由本文所提供之多核苷酸編碼的抗體或其抗原結合分子。於另一具體實施例中，組成物包含含有多核苷酸之體外細胞，該多核苷酸編碼由本文所提供之多核苷酸編碼之抗體或其抗原結合分子。在另一具體實施例中，組成物包含本文提供之CAR或TCR，其中，CAR或TCR包含含有特異性結合CD70之抗原結合分子的組分。
在一些具體實施例中，組成物包括超過一個的不同CAR或TCR，其包含含有特異性結合CD70之抗原結合分子的組分。在一些具體實施例中，組成物包括超過一個CAR或TCR，其包含含有特異性結合CD70之抗原結合分子的組分，其中，到CD70之抗原結合分子結合超過一個抗原決定位。在一些具體實施例中，包含含有特異性結合CD70之抗原結合分子的組分之CAR或TCR將不會相互競爭結合到CD70。在一些具體實施例中，本文提供的包含含有特異性結合CD70之抗原結合分子的組分之任何CAR或TCR在醫藥組成物中組合在一起。
於其他具體實施例中，組成物係經選擇以用於腸胃道外遞送。製備此醫藥上可接受之組成物係在發明所屬技術領域中具有通常知識者的能力之內。在一些具體實施例中，緩衝液係用於將組成物維持在生理pH或稍低之pH值，通常係在約5至約8之pH範圍內。在一些具體實施例中，當考慮經由腸胃道外投予時，組成物為無熱原、腸胃道外可接受之水溶液形式，其包含在醫藥上可接受之載劑中所欲的CAR或TCR，所欲之CAR或TCR包括含有特異性結合CD70之抗原結合分子的組分，具有或不具有另外之治療劑。在一些具體實施例中，用於腸胃道外注射之載劑為無菌蒸餾水，其中包括含有特異性結合CD70之抗原結合分子的組分之CAR或TCR，具有或不具有另外之至少一治療劑，係調配成經適當保存之無菌的等張溶液。在一些具體實施例中，製備涉及調配包括含有特異性結合CD70之抗原結合分子的組分之CAR或TCR與提供控制或持續釋出產品之聚合性化合物(諸如聚乳酸或聚乙醇酸)、珠子或脂質體，然後係經由儲藏(depot)注射來遞送。在一些具體實施例中，使用可植入之藥物遞送裝置來引入所欲分子。 V. 使用所揭露之抗原結合分子、 CAR 及 TCR 之方法
本揭露之另一態樣係針對製造表現CAR或TCR之細胞的方法，其包含在合適之條件下以本文所揭示之多核苷酸轉導細胞。在一些具體實施例中，方法包含以編碼CAR或TCR之多核苷酸轉導細胞，其中CAR或TCR包含如本文所揭示之特異性結合CD70的抗原結合分子。在一些具體實施例中，方法包含以包含編碼CAR或TCR之多核苷酸的載體轉導細胞，其中CAR或TCR包含特異性結合CD70之抗原結合分子。於其他具體實施例中，方法包含以編碼包括如本文所揭示之特異性結合CD70之抗原結合分子的CAR或TCR之多核苷酸轉導細胞。在一些具體實施例中，方法包含以含有編碼包括如本文所描述之特異性結合CD70之抗原結合分子的CAR或TCR之多核苷酸的載體轉導細胞。在一些具體實施例中，方法進一步包含單離細胞。
本揭露之另一態樣係針對誘導對抗腫瘤之免疫性之方法，其包含對個體投予有效量之細胞，該細胞包含如本文所描述之多核苷酸、如本文所描述之載體或如本文所描述之CAR或TCR。在一具體實施例中，方法包含對個體投予有效量之細胞，該細胞包含編碼CAR或TCR之多核苷酸，其中CAR或TCR包含如本文所揭示之特異性結合CD70的抗原結合分子。於另一具體實施例中，方法包含對個體投予有效量之包含載體的細胞，載體含有編碼CAR或TCR之多核苷酸，其中CAR或TCR包含如本文所揭示之特異性結合CD70之抗原結合分子。於另一具體實施例中，方法包含對個體投予有效量之細胞，該細胞包含由本文所揭示之多核苷酸編碼的CAR或TCR，其中CAR或TCR包含特異性結合CD70之抗原結合分子。
於其他具體實施例中，該方法包含對個體投予有效量之細胞，細胞包含編碼包括如本文所揭示之特異性結合CD70之抗原結合分子之CAR或TCR的多核苷酸。於另一具體實施例中，方法包含對個體投予有效量之包含載體的細胞，該載體包含編碼包括如本文所揭示之特異性結合CD70之抗原結合分子之CAR或TCR的多核苷酸。於另一具體實施例中，方法包含對個體投予有效量之細胞，該細胞包含由本文所揭示之多核苷酸編碼之抗體或其抗原結合分子(例如，CAR或TCR)，其中抗體或其抗原結合分子特異性結合CD70。
本發明之另一態樣係針對誘導個體之免疫反應的方法，其包含投予有效量之本申請案的經工程處理之免疫細胞。在一些具體實施例中，免疫反應為由T細胞介導之免疫反應。在一些具體實施例中，由T細胞介導之免疫反應係針對一或多個目標細胞。在一些具體實施例中，經工程處理之免疫細胞包含CAR或TCR，諸如本文所提供者。在一些具體實施例中，目標細胞為腫瘤細胞。
本揭露之另一態樣係針對用於治療或預防惡性腫瘤之方法，該方法包含對有需要之個體投予有效量之至少一種本文所描述之經單離的抗原結合分子或至少一種免疫細胞，其中免疫細胞包含至少一種CAR、TCR及/或如本文所描述之經單離的抗原結合分子。
本揭露之另一態樣係針對治療有其需要之個體的過度增生失調或炎性疾病之方法，其包含對個體投予本文所揭示之多核苷酸、本文所揭示之載體、本文所揭示之CAR或TCR、本文所揭示之細胞或本文所揭示之組成物。在一些具體實施例中，炎性疾病係選自由下列所組成之群組：類風濕關節炎、牛皮癬、過敏、哮喘、自體免疫疾病(諸如克隆氏症)、IBD、纖維肌痛、肥大細胞病、乳糜瀉及彼等之任何組合。
本揭露之另一態樣係針對治療有其需要之個體的癌症之方法，其包含對個體投予本文所揭示之多核苷酸、本文所揭示之載體、本文所揭示之CAR或TCR、本文所揭示之細胞或本文所揭示之組成物。在一具體實施例中，該方法包含投予編碼CAR或TCR之多核苷酸，其中CAR或TCR包含如本文所揭示之特異性結合CD70的抗原結合分子。於另一具體實施例中，方法包含投予含有編碼CAR或TCR之多核苷酸的載體，其中CAR或TCR包含如本文所揭示之特異性結合CD70的抗原結合分子。於另一具體實施例中，方法包含投予由本文所揭示之多核苷酸編碼的CAR或TCR，其中CAR或TCR包含特異性結合CD70之抗原結合分子。於另一具體實施例中，方法包含投予包括編碼CAR或TCR之多核苷酸或包含編碼CAR或TCR之多核苷酸的載體之細胞，其中CAR或TCR包含如本文所揭示之特異性結合CD70的抗原結合分子。於其他具體實施例中，方法包含投予如本文所揭示之編碼CAR或TCR的多核苷酸，其中CAR或TCR包括特異性結合CD70之抗原結合分子。於另一具體實施例中，方法包含投予載體，該載體包含編碼如本文所揭示之CAR或TCR的多核苷酸，其中CAR或TCR包含特異性結合CD70之抗原結合分子。於另一具體實施例中，方法包含投予抗體、CAR或TCR，其中CAR或TCR包含特異性結合CD70之抗原結合分子，且係由本文所揭示之多核苷酸編碼。於另一具體實施例中，方法包含投予細胞，該細胞具有包含如本文所揭示之編碼抗體、CAR或TCR之多核苷酸，或投予包含編碼抗體、CAR或TCR之多核苷酸的載體，其中CAR或TCR包括特異性結合CD70之抗原結合分子。
在一些具體實施例中，單獨投予抗體、CAR或TCR，其中，CAR或TCR包含特異性結合CD70之抗原結合分子。在此免疫細胞中，抗體、CAR或TCR可在相同啟動子區或不同啟動子的控制下，其中，CAR或TCR包含特異性結合CD70之抗原結合分子。在一些具體實施例中，編碼蛋白質劑及/或抗體、CAR或TCR的基因可在不同的載體中，其中，CAR或TCR包含特異性結合CD70之抗原結合分子。
在一些具體實施例中，治療有其需要之個體的癌症之方法包含T細胞療法。在一具體實施例中，本揭露之T細胞療法為經工程處理之自體細胞療法(eACT TM)。根據此具體實施例，該方法可包括從患者收集血球。然後，經單離之血球(例如T細胞)可經工程處理以表現本揭露之抗-CD70 CAR(“抗-CD70 CAR T細胞ˮ)。於一特定之具體實施例中，抗-CD70 CAR T細胞係被投予患者。在一些具體實施例中，抗-CD70 CAR T細胞治療患者之腫瘤或癌症。在一具體實施例中，抗-CD70 CAR T細胞縮小腫瘤或癌症之尺寸。
在一些具體實施例中，用於T細胞療法之供體T細胞係從患者取得(例如用於自體T細胞療法)。於其他具體實施例中，用於T細胞療法之供體T細胞係從非為該患者之個體取得(例如，同種異體T細胞療法)。
T細胞可以治療有效量投予。例如，T細胞之治療有效量可為至少約10 4個細胞、至少約10 5個細胞、至少約10 6個細胞、至少約10 7個細胞、至少約10 8個細胞、至少約10 9個細胞、至少約10 10個細胞、或至少約10 11個細胞。在另一具體實施例中，T細胞的治療有效量為約10 4個細胞、約10 5個細胞、約10 6個細胞、約10 7個細胞、或約10 8個細胞。在一些具體實施例中，抗-CD70 CAR T細胞的治療有效量為約1 X 10 5個細胞/kg、2 X 10 5個細胞/kg、3 X 10 5個細胞/kg、4 X 10 5個細胞/kg、5 X 10 5個細胞/kg、1 X 10 6個細胞/kg、2 X 10 6個細胞/kg、約3 X 10 6個細胞/kg、約4 X 10 6個細胞/kg、約5 X 10 6個細胞/kg、約6 X 10 6個細胞/kg、約7 X 10 6個細胞/kg、約8 X 10 6個細胞/kg、約9 X 10 6個細胞/kg、約1 X 10 7個細胞/kg、約2 X 10 7個細胞/kg、約3 X 10 7個細胞/kg、約4 X 10 7個細胞/kg、約5 X 10 7個細胞/kg、約6 X 10 7個細胞/kg、約7 X 10 7個細胞/kg、約 8 X 10 7個細胞/kg、或約9 X 10 7個細胞/kg。
本揭露之另一態樣係針對診斷、檢測或驗證之方法。在一些具體實施例中，抗原結合分子係作為診斷或驗證工具。在一些具體實施例中，本文所揭示之抗原結合分子係用於分析存在於樣品及/或個體中之CD70的量。在一些具體實施例中，診斷性抗原結合分子未中和。在一些具體實施例中，本發明所揭示之抗原結合分子係用於或提供在用於檢測哺乳動物組織或細胞中之CD70的分析套組及/或方法中以篩檢/診斷與CD70之量的變化有關的疾病或失調。在一些具體實施例中，套組包含與CD70結合之抗原結合分子，連同用於指示抗原結合分子與CD70結合(若出現的話)，及視需要地，CD70蛋白質量的裝置。用於指示存有抗原結合分子的各種裝置均可使用。例如螢光團、其他分子探針或酶可連接抗原結合分子並可以各種方式觀察該抗原結合分子之存在。螢光團之實例包括螢光素、玫瑰紅、四甲基玫瑰紅、伊紅、紅螢素、香豆素、甲基-香豆素、芘、孔雀綠、茋、Lucifer黃、Cascade藍、Texas紅、IAEDANS、EDANS、BODIPY FL、LC紅640、Cy 5、Cy 5.5、LC紅705、Oregon綠、Alexa-Fluor染料(Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680)、Cascade藍、Cascade黃及R-藻紅素(PE) (Molecular Probes)、FITC、玫瑰紅、及Texas紅(Pierce)、Cy5、Cy5.5、Cy7(Amersham Life Science)。發明所屬技術領域中具有通常知識者將可理解，抗原結合分子之結合程度可用來測定樣品中有多少CD70。 V.A. 癌症治療
本揭露之方法可用於治療個體之癌症、縮小腫瘤尺寸、殺死腫瘤細胞、防止腫瘤細胞增殖、防止腫瘤生長、從患者排除腫瘤、防止腫瘤復發、防止腫瘤轉移、誘導患者緩解或彼等之任何組合。在一些具體實施例中，方法誘導完整反應。於其他具體實施例中，方法引起部分反應。
可使用本文提供之CAR、YCR及抗體治療之癌症包括未血管化、基本上尚未血管化或血管化之腫瘤。癌症亦可包括實體或非實體腫瘤。在一些具體實施例中，癌症為血液癌症。在一些具體實施例中，癌症為白血球之癌症。於其他具體實施例中，癌症為漿細胞之癌症。在一些具體實施例中，癌症為白血病、淋巴瘤或骨髓瘤。在一些具體實施例中，該癌症為多發性骨髓瘤、何杰金(Hodgkin)氏病、非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、原發性縱隔大B細胞淋巴瘤(PMBC)、瀰漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、濾泡性淋巴瘤(FL)、轉形之濾泡性淋巴瘤、脾邊緣區淋巴瘤(SMZL)、慢性或急性白血病、髓細胞性疾病，包括，但不限於急性髓細胞性白血病(AML)、慢性髓細胞性白血病(CML)、急性淋巴母細胞性白血病(ALL)(包括非T細胞ALL)、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、T細胞淋巴瘤、一或多種B細胞急性淋巴性白血病(“BALLˮ)、T細胞急性淋巴性白血病(“TALLˮ)、急性淋巴性白血病(ALL)、慢性髓性白血病(CML)、B細胞幼淋巴細胞性白血病、母細胞性漿細胞樣樹突細胞瘤、伯基特(Burkitt)氏淋巴瘤、髮細胞性白血病、小細胞或大細胞濾泡性淋巴瘤、惡性淋巴增殖條件、MALT淋巴瘤、套細胞淋巴瘤、邊緣區淋巴瘤、骨髓增生異常及骨髓增生異常症候群(MDS)、噬血球症候群(巨噬細胞活化症候群(MAS)和噬血球性淋巴組織球增生(HLH))、慢性或急性肉芽腫病、大細胞肉芽腫、白血球黏附缺陷、漿母細胞淋巴瘤、漿細胞樣樹突細胞瘤、瓦爾登斯特倫巨球蛋白血症(Waldestrom macroglobulinemia)、漿細胞增殖性失調(例如無症狀之骨髓瘤(鬱積型多發性骨髓瘤或無痛骨髓瘤))、意義未明之單株丙種球蛋白病(MGUS)、漿細胞瘤(例如漿細胞惡液質、孤立性骨髓瘤、孤立性漿細胞瘤、髓外漿細胞瘤和多發性漿細胞瘤)、全身性澱粉樣蛋白輕鏈澱粉樣變性、POEMS症候群(Crow-Fukase症候群、Takatsuki病、PEP症候群)或彼等之組合。在一具體實施例中，癌症為骨髓瘤。在一些具體實施例中，癌症為多發性骨髓瘤。於另一特定具體實施例中，癌症為T或B細胞淋巴瘤。
在一些具體實施例中，方法進一步包含投予化療劑。在一些具體實施例中，所選擇之化療劑為淋巴細胞清除(預調節)化療劑。有利之預調節治療方案，連同相關之有利的生物標記描述於美國專利申請案編號第15/167,977號及第15/295,931號與公開之US專利申請案第PCT/US2016/034885號(其整體以引用方式併入本文)。這些文獻描述，例如調節需要T細胞療法之患者的方法，包含對患者單獨投予特定之有益的環磷醯胺劑量(介於約100 mg/m 2/天及約2000 mg/m 2/天之間；例如，約100 mg/m 2/天、約200 mg/m 2/天、約300 mg/m 2/天、約400 mg/m 2/天、約500 mg/m 2/天、約600 mg/m 2/天、約700 mg/m 2/天、約800 mg/m 2/天、約900 mg/m 2/天、約1000 mg/m 2/天、約1500 mg/m 2/天或約2000 mg/m 2/天)或與特定氟達拉濱(fludarabine)劑量(介於約10 mg/m 2/天及約900 mg/m 2/天之間；例如，約10 mg/m 2/天、約20 mg/m 2/天、約30 mg/m 2/天、約40 mg/m 2/天、約40 mg/m 2/天、約50 mg/m 2/天、約60 mg/m 2/天、約70 mg/m 2/天、約80 mg/m 2/天、約90 mg/m 2/天、約100 mg/m 2/天、約500 mg/m 2/天或約900 mg/m 2/天)組合。
在一些具體實施例中，劑量方案涉及包括在對患者投予治療有效量之經工程處理之T細胞之前，每日對患者投予約500mg/m 2/天之環磷醯胺及約60mg/m 2/天之氟達拉濱(fludarabine)達3天，來治療患者。
在一些具體實施例中，劑量方案涉及包含在對患者投予治療有效量之經工程處理之T細胞之前，每日對患者投予約600 mg/m 2/天之環磷醯胺及約30 mg/m 2/天之氟達拉濱(fludarabine)達3天，來治療患者。
在一些具體實施例中，劑量方案涉及在對患者投予治療有效量之經工程處理之T細胞之前，包含每日對患者投予約500 mg/m 2/天之環磷醯胺達2天及約30 mg/m 2/天之氟達拉濱(fludarabine)達4天，來治療患者。
在一些具體實施例中，劑量方案涉及在對患者投予治療有效量之經工程處理之T細胞之前，包含每日對患者投予約600 mg/m 2/天之環磷醯胺達3天及約30 mg/m 2/天之氟達拉濱(fludarabine)達3天，來治療患者。
在一些具體實施例中，劑量方案涉及在對患者投予治療有效量之經工程處理之T細胞之前，包含每日對患者投予約550 mg/m 2/天之環磷醯胺達3天及約30 mg/m 2/天之氟達拉濱(fludarabine)達3天，來治療患者。
在一些具體實施例中，劑量方案涉及在對患者投予治療有效量之經工程處理之T細胞之前，包含每日對患者投予約500 mg/m 2/天之環磷醯胺達3天及約30 mg/m 2/天之氟達拉濱(fludarabine)達3天，來治療患者。
在一些具體實施例中，劑量方案涉及在對患者投予治療有效量之經工程處理之T細胞之前，包含每日對患者投予約450 mg/m 2/天之環磷醯胺達3天及約30 mg/m 2/天之氟達拉濱(fludarabine)達3天，來治療患者。
在一些具體實施例中，劑量方案涉及在對患者投予治療有效量之經工程處理之T細胞之前，包含每日對患者投予約400 mg/m 2/天之環磷醯胺達3天及約30 mg/m 2/天之氟達拉濱(fludarabine)達3天，來治療患者。
在一些具體實施例中，劑量方案涉及在對患者投予治療有效量之經工程處理之T細胞之前，包含每日對患者投予約440 mg/m 2/天之環磷醯胺達2天及約100 mg/m 2/天之依托泊苷(etoposide)達2天，來治療患者。
在一些具體實施例中，劑量方案涉及在對患者投予治療有效量之經工程處理之T細胞之前，包含每日對患者投予約2-4 g/m 2/天之環磷醯胺達3天及約200 mg/m 2/天之依托泊苷(etoposide)達3天，來治療患者。
在一些具體實施例中，劑量方案涉及在對患者投予治療有效量之經工程處理之T細胞之前，包含每日對患者投予約300 mg/m 2/天之環磷醯胺達3天及約30 mg/m 2/天之氟達拉濱(fludarabine)達3天，來治療患者。
在一些具體實施例中，劑量方案涉及在對患者投予治療有效量之經工程處理之T細胞之前，包含每日對患者投予約30-60 mg/kg (約1100 mg/m 2-2200 mg/m 2)之環磷醯胺達3至5天及約25 mg/m 2之氟達拉濱(fludarabine)達3至5天，來治療患者。
在一些具體實施例中，劑量方案涉及在對患者投予治療有效量之經工程處理之T細胞之前，包含每日對患者投予約1 g/m 2)之環磷醯胺，來治療患者。
在一些具體實施例中，劑量方案涉及在對患者投予治療有效量之經工程處理之T細胞之前，包含每日對患者投予約1.2 g/m 2)之環磷醯胺達4天，來治療患者。
在一些具體實施例中，方案涉及在對患者投予治療有效量之經工程處理之T細胞之前，包含每日對患者投予約2 g/m 2)之環磷醯胺，來治療患者。
在一些具體實施例中，劑量方案涉及在對患者投予治療有效量之經工程處理之T細胞之前，包含每日對患者投予約25 mg/m 2之氟達拉濱(fludarabine)達3天，來治療患者。
在一些具體實施例中，劑量方案涉及在對患者投予治療有效量之經工程處理之T細胞之前，包含每日對患者投予約90 mg/m 2之苯達莫司汀(bendamustine)達2天，來治療患者。
在一些具體實施例中，劑量方案涉及在對患者投予治療有效量之經工程處理之T細胞之前，包含每日對患者投予約500 mg/m 2/天之環磷醯胺達2天及約30 mg/m 2/天之氟達拉濱(fludarabine)達4天，來治療患者。
在一些具體實施例中，劑量方案涉及在對患者投予治療有效量之經工程處理之T細胞之前，包含對患者投予在第1天約1000 mg/m 2之胺甲喋呤、在第2及3天每12小時約1000 mg/m 2，來治療患者。
另一較佳劑量方案涉及在對患者投予治療有效量之經工程處理之T細胞之前，包含對患者投予在第1、2及3天每12小時約300 mg/m 2之環磷醯胺、在第3天2 mg之長春新鹼(vincristine)及在第3天50 mg/m 2之阿德力黴素，來治療患者。
另一較佳劑量方案涉及在對患者投予治療有效量之經工程處理之T細胞之前，包含每日對患者投予約200 mg/m 2/天之環磷醯胺達3天及約20 mg/m 2/天之氟達拉濱(fludarabine)達3天，來治療患者。
在一些具體實施例中，抗原結合分子、經轉導(或以其他方式經工程處理)之細胞(諸如CAR或TCR)及化療劑係各自以能有效治療個體之疾病或病症的量投予。
在一些具體實施例中，包含本文所揭示之CAR及/或TCR表現的免疫效應細胞之組成物可與任何數目之化療劑組合投予。化療劑之實例包括烷化劑，諸如塞替派(thiotepa)及環磷醯胺(CYTOXAN TM)；烷基磺酸酯，諸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶類(aziridine)，諸如苯佐替派(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替派(meturedepa)和烏瑞替派(uredopa)；亞乙基亞胺類和甲基蜜胺類，包括六甲蜜胺、三亞乙基蜜胺、三亞乙基磷醯胺、三亞乙基硫代磷醯胺和三羥甲基蜜胺(trimethylolomelamine)摘要；氮芥類，諸如苯丁酸氮芥、萘氮芥、環磷醯胺、雌氮芥、異環磷醯胺、雙氯乙基甲胺(mechlorethamine)、鹽酸氧化氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法崙、新氮芥(novembichin)、苯芥膽留醇(phenesterine)、潑尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亞硝基脲類(nitrosoureas)，諸如卡莫司汀(carmustine)、吡葡亞硝脲(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)、雷莫司汀(ranimustine)；抗生素，諸如阿克拉黴素(aclacinomysin)、放線菌素、胺茴黴素(authramycin)、偶氮絲胺酸、博來黴素、放線菌素(cactinomycin)、卡奇黴素(calicheamicin)、卡拉比星、去甲柔红黴素(carminomycin)、嗜癌黴素(carzinophilin)、色黴素(chromomycin)、更生黴素、柔紅黴素、地托比星(detorubicin)、6-二氮基-5-側氧基-L-正白胺酸、阿黴素、表阿黴素、依索比星、伊達比星(idarubicin)、麻西羅黴素(marcellomycin)、絲裂黴素(mitomycin)、黴酚酸、諾拉黴素(nogalamycin)、橄欖黴素(olivomycin)、培洛黴素(peplomycin)、泊非黴素(potfiromycin)、嘌呤黴素、三鐵阿黴素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、鏈黑菌素(streptonigrin)、鏈佐星(streptozocin)、殺结核菌素(tubercidin)、鳥苯美司(ubenimex)、淨司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代謝物，諸如胺甲喋呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；葉酸類似物，諸如二甲葉酸(denopterin)、胺甲喋呤、蝶羅呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤類似物，諸如氟達拉濱(fludarabine)、6-巰基嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鳥嘌呤(thioguanine)；嘧啶類似物，諸如安西他濱(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮雜尿苷(azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、雙脫氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依諾他濱(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)、5-FU；雄激素類，諸如卡魯睪酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、表硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睪内酯(testolactone)；抗腎上腺類，諸如胺魯米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；葉酸補充劑，諸如亞葉酸；醋葡醛內酯(aceglatone)；醛磷醯胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；胺基乙醯丙酸(aminolevulinic acid)；安吖啶(amsacrine)；曲布賽(bestrabucil )；蒽雙咪腙(bisantrene)；依達曲沙(edatraxate)；地磷胺(defosfamine)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；依氟鳥胺酸(elformithine)；依利醋鞍(elliptinium acetate)；依托格魯(etoglucid)；硝酸鎵；羥基脲；香菇多醣(lentinan)；氯尼達明(lonidamine)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫呢達醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；噴司他汀(pentostatin)；蛋胺氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基醯肼(2-ethylhydrazide)；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK ®；雷佐生(razoxane)；西佐喃(sizofiran)；螺環鍺(spirogermanium)；細交鏈孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亞胺醌(triaziquone)；2,2’,2ˮ-三氯三乙胺；胺基甲酸乙酯(urethan)；長春地辛(vindesine)；達卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴衛矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；加西托辛(gacytosine)；阿拉伯糖苷(arabinoside) (Ara-C)；環磷醯胺；塞替派；類紫杉醇，例如太平洋紫杉醇(TAXOL TM，施貴寶)和多西紫杉醇(doxetaxel) (TAXOTERE ®，羅納-普朗克Rorer公司)；苯丁酸氮芥(chlorambucil)；吉西他濱；6-硫鳥嘌呤；巰基嘌呤；胺甲喋呤；鉑類似物，諸如順鉑和卡鉑；長春鹼；鉑；依托泊苷(VP-16)；異環磷醯胺；絲裂黴素C；米托蒽醌；長春新鹼；長春瑞濱；諾維本(navelbine)；能滅瘤(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；柔紅黴素；胺基蝶呤(aminopterin)；希羅達(xeloda)；伊班膦酸鈉(ibandronate)；CPT-11；拓撲異構酶抑制劑RFS 2000；二氟甲基鳥胺酸(DFMO)；視黃酸(retinoic acid)衍生物，諸如TARGRETIN TM(貝沙羅汀(bexarotene))、PANRETIN TM、(阿利維A酸)；ONTAK TM(尼介白素(denileukin diftitox))；埃斯培拉黴素(esperamicin)；卡培他濱(capecitabine)；及上述任一者之醫藥上可接受之鹽、酸或衍生物。在一些具體實施例中，本文所揭示之包含CAR及/或TCR表現的免疫效應細胞之組成物可與用於調節或抑制激素對腫瘤之作用的抗激素劑聯合投予，抗激素劑諸如抗雌激素，包括，例如他莫昔芬(tamoxifen)、雷洛昔芬(raloxifene)、抑制4(5)-咪唑該之芳香酶、4-羥基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、奇沃昔芬(keoxifene)、LY117018、奧那司酮(onapristone)和托瑞米芬(toremifene)(FARESTON TM)；及抗雄激素，諸如氟他胺(flutamide)、尼魯米特(nilutamide)、比卡魯胺(bicalutamide)、柳菩林(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin)；及上述任一者之醫藥上可接受之鹽、酸或衍生物。當適當時亦投予化療劑之組合，包括，但不限於CHOP，即，環磷醯胺(CYTOXAN ®)、多柔比星(Doxorubicin)(羥基多柔比星(hydroxydoxorubicin))、長春新鹼(ONCOVIN ®)及潑尼松；EPOCH(依托泊苷(etoposide)、強的松(prednisone)、長春新鹼(vincristine) (ONCOVIN ®)及多柔比星鹽酸鹽(羥基柔毛黴素(hydroxydaunorubicin)鹽酸鹽))；以及卡鉑與吉西他濱(gemcitabine)。
在一些具體實施例中，化療劑係在投予經工程處理之細胞或核酸的同一時間或投予後之一週內投予。於其他具體實施例中，化療劑係在投予經工程處理之細胞或核酸後的1至4週或1週至1個月、1週至2個月、1週至3個月、1週至6個月、1週至9個月或1週至12個月投予。在一些具體實施例中，化療劑係在投予該細胞或核酸之前至少1個月投予。在一些具體實施例中，方法進一步包含投予二或多種化療劑。
多種額外之治療劑均可與本文所描述之組成物一起使用。例如，可能有用之額外的治療劑包括PD-1抑制劑，諸如尼渥魯單抗(nivolumab)(OPDIVO ®)、沛洛珠單抗(pembrolizumab)(KEYTRUDA ®)、比迪利珠單抗(pidilizumab) (CureTech)及阿替珠單抗(atezolizumab) (TECENTRIQ ®)。
適合與本揭露組合使用之額外的治療劑包括，但不限於依羅替尼(ibrutinib)(IMBRUVICA ®)、奧法木單抗(ofatumumab) (ARZERRA ®)、利妥昔單抗(rituximab) (RITUXAN ®)、貝伐單抗(bevacizumab)(AVASTIN ®)、曲妥珠單抗(trastuzumab) (HERCEPTIN ®)、賀癌寧(trastuzumab emtansine)(KADCYLA ®)、伊馬替尼(imatinib)(GLEEVEC ®)、西妥昔單抗(cetuximab) (ERBITUX ®)、帕尼單抗(panitumumab) (VECTIBIX ®)、卡莫索單抗(catumaxomab) (REMOVAB ®)、伊妥莫單抗(ibritumomab) (ZEVALIN ®)、托西妥莫單抗(tositumomab)、侖妥昔單抗(brentuximab) (ADCETRIS ®)、阿崙單抗(alemtuzumab) (LEMTRADA ®)、吉妥珠單抗(gemtuzumab)、埃羅替尼(erlotinib) (TARCEVA ®)、吉非替尼(gefitinib) (IRESSA ®)、凡德他尼(vandetanib) (CAPRELSA ®)、阿法替尼(afatinib) (GIOTRIF ®)、拉帕替尼(lapatinib) (TYKERB ®)、來那替尼(neratinib)、阿西替尼(axitinib) (INLYTA ®)、馬賽替尼(masitinib) (MASIVET ®)、帕唑帕尼(pazopanib) (VOTRIENT ®)、舒尼替尼(sunitinib) (SUTENT ®)、索拉非尼(sorafenib) (NEXAVAR ®)、來妥替尼(lestaurtinib)、西地尼布(cediranib)、蘭瓦替尼(lenvatinib) (LENVIMA ®)、尼達尼布(nintedanib) (OFEV ®)、瑞戈非尼(regorafenib) (STIVARGA ®)、司馬沙尼(semaxanib)、替瓦沙尼(tivozanib)、恩崔替尼(entrectinib)、卡博替(cabozantinib)(CABOMETYX ®)、達沙替尼(dasatinib) (SPRYCEL ®)、尼洛替尼(nilotinib) (TASIGNA ®)、普納替尼(ponatinib) (ICLUSIG ®)、雷度替尼(radotinib) (SUPECT ®)、波舒替尼(bosutinib) (BOSULIF ®)、魯索利替尼(ruxolitinib) (JAKAVI ®)、帕利替尼(pacritinib)、可必美替尼(cobimetinib) (COTELLIC ®)、司美替尼(selumetinib)、曲美替尼(trametinib) (MEKINIST ®)、必尼美替尼(binimetinib)、阿崙替尼(alectinib) (ALECENSA ®)、西利替尼(ceritinib) (ZYKADIA ®)、克利舒替尼(crizotinib) (XALKORI ®)、阿柏西普(aflibercept) (EYELEA ®)、阿迪波太(adipotide)、地尼介白素(denileukin diftitox) (ONTAK ®)、mTOR抑制劑，諸如依維莫司(everolimus) (AFINITOR ®)與西羅莫司(temsirolimus) (TORISEL ®)、刺猬抑制劑，諸如索尼得吉(sonidegib) (ODOZMO ®)和維莫得告(vismodegib) (ERIVEDGE ®)、CDK抑制劑，諸如CDK抑制劑(帕博西尼(palbociclib)；IBRANCE ®)。
在一些具體實施例中，包含含有CAR及/或TCR之免疫的組成物係與抗炎劑一起投予。抗炎劑或藥物可包括，但不限於：類固醇和糖皮質激素(包括倍他米松(betamethasone)、布地奈德(budesonide)、地塞米松(dexamethasone)、醋酸氫化可的松(hydrocortisone acetate)、氫化可的松、氫化可的松、甲基強的松龍(methylprednisolone)、強的松龍、潑尼松(prednisone)和曲安西龍(triamcinolone))、非類固醇抗炎藥(NSAIDS)，包括阿斯匹靈(aspirin)、布洛芬(ibuprofen)、萘普生(naproxen)、胺甲喋呤、柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine)、來氟米特(leflunomide)、抗TNF藥物、環磷醯胺和黴酚酸酯(mycophenolate)。示例性NSAID包括布洛芬、萘普生、萘普生鈉、Cox-2抑制劑及唾液酸鹽。示例性鎮痛藥包括對乙醯胺基酚、羥考酮、鹽酸丙氧酚之曲馬多。示例性糖皮質激素包括可的松、地塞米松、氫化可的松、甲基強的松龍、強的松龍或潑尼松。示例性生物反應修飾劑包括針對細胞表面標記物(例如CD4、CD5，等)之分子、細胞因子抑制劑，諸如TNF拮抗劑(例如依那西普(etanercept) (ENBREL ®)、阿達木單抗(adalimumab)(HUMIRA ®)和英夫利昔單抗(infliximab) (REMICADE ®)、趨化因子抑制劑和黏附分子抑制劑。該生物反應修飾劑包括單株抗體及重組形式之分子。示例性DMARD包括硫唑嘌呤(azathioprine)、環磷醯胺、環孢黴素(cyclosporine)、胺甲喋呤、青黴胺、來氟米特(leflunomide)、柳氮磺吡啶(sulfasalazine)、羥氯喹(hydroxychloroquine)、Gold(口服(金諾芬(auranofin))和肌肉內)及米諾環素(minocycline)。
在一些具體實施例中，本文所描述之組成物係與細胞介質一起投予。如本文所使用之“細胞介質ˮ意指由一個細胞群釋出之作用在另一細胞上，作為細胞間介導劑的蛋白質。細胞介質之實例有淋巴介質、單核因子及傳統多肽激素。細胞介質包括生長激素(諸如人類生長激素)、N-甲硫胺醯人生長激素及牛生長激素；副甲狀腺激素；甲狀腺素；胰島素；胰島素原；鬆弛素；鬆弛素原；糖蛋白激素，諸如濾泡刺激素(FSH)、促甲狀腺激素(TSH)和黃體生成素(LH)；肝細胞生長因子(HGF)；纖維母細胞生長因子(FGF)；催乳素(prolactin)；胎盤泌乳素(placental lactogen)；穆勒氏管(mullerian)抑制物質；小鼠促性腺激素相關肽；抑制素；活化素；血管內皮生長因子；整合素；血小板生成素(thrombopoietin)(TPO)；神經生長因子(NGF)，諸如NGF-β；血小板生長因子；轉化生長因子(TGF)，諸如TGF-α和TGF-β；胰島素樣生長因子-I和胰島素樣生長因子-II；紅血球生成素(EPO)；骨誘導因子；干擾素，骨誘導因子如干擾素-α、β和γ；細胞集落刺激因子(CSF)，諸如巨噬細胞-CSF(M-CSF)；粒細胞-巨噬細胞-CSF(GM-CSF)；和粒細胞-CSF(G-CSF)；介白素(IL)，諸如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12；IL-15、腫瘤壞死因子，諸如TNF-α或TNF-β；及其他多肽因子，包括LIF和kit配體(KL)。如本文所用，術語細胞介質包括來自天然來源或來自重組細胞培養物之蛋白質，以及天然序列細胞介質之生物活性同等物。
本專利說明書中所提及之所有出版物、專利及專利申請案以引用方式併入本文，其程度如同個別出版物、專利或專利申請案各自被具體且單獨地指明以引用方式併入本發明中。然而，本文之參考文獻的引用不應被解釋為承認該參考文獻為本揭露之先前技術。任何以引用方式被併入之參考文獻中所提供之任何定義或術語與本文所提供之術語和討論不同時，以本發明之術語和定義為準。
本揭露藉由下列實施例進一步說明，其不應被解釋為進一步限制。本申請案全文中所引用之所有參考文獻的內容以引用方式明確地併入本文。 實施例 實施例1
在各種細胞株中測量CD70表現。CD70被發現表現(片段/千鹼基長之外顯子/百萬對應之測序讀數(FPKM)大於35)在99%所測試之多發性骨髓瘤腫瘤細胞株中。
為了進一步表徵CD70之表現，在4℃下以在染色緩衝液(BD Pharmingen)中之與PE(BD Pharmingen)共軛之抗CD70抗體將CEM (ATCC)、EoL-1 (Sigma)、HL-60 (ATCC)、KG-1a (ATCC)、MV4；11 (ATCC)、NAMALWA (ATCC)、Raji (ATCC)、Toledo (ATCC)、與U-937 (ATCC)細胞染色30分鐘。然後，在數據獲取之前，洗滌細胞並再懸浮於具有碘化丙錠(propidium iodide)(BD Pharmingen)之染色緩衝液中。然後，藉由流式細胞術取得樣品並分析數據(圖2)。在細胞株EoL-1、MV4；11、NAMALWA、Raji、Toledo、與U-937(圖2)中觀察到CD70表現，但未在細胞株CEM、HL-60、與KG-1a中觀察到(圖2)。 實施例2
將含有CD70 CAR構築體之第三代慢病毒轉移載體(如圖1A至1H圖式所示，具有圖8A至8L所示之序列，及在附加的序列表(SEQ ID NO：29至52))連同ViraPower慢病毒包裝混合物(Life Technologies)一起使用以產生該慢病毒上清液。簡單地說，經由將15 μg之DNA及22.5 μl之聚乙烯亞胺(polyethileneimine)(Polysciences，1 mg/ml)在600 μl之OptiMEM培養基中混合以產生轉染混合物。將轉染混合物在室溫下溫育5分鐘。同時，以胰蛋白酶處理293T細胞(ATCC)並計數。然後，將總計10×10 6之293T細胞與轉染混合物置於T75燒瓶中。培養三天後，收集上清液並通過0.45 μm過濾器過濾，並儲存在-80℃。
根據製造商之指示，使用Ficoll ®-Paque密度離心，從二個不同健康供體之白血球濃縮物(leukopak) (Hemacare)單離出周邊血單核細胞(PBMC)。使用在補充有IL-2(300 IU/ml，Proleukin ®，Prometheus ®Therapeutics and Diagnostics)之R10培養基中的OKT3(莫羅單抗(Muromonab)-CD3，50ng/ml，Miltenyi Biotec)刺激PBMC。刺激後48小時，使用含有不同CD70 CAR構築體之慢病毒轉導細胞，感染複數(MOI)為10。在用於活性分析之前，將細胞維持在0.5×10 6至2.0×10 6細胞/ml。
在刺激後第14天，在4℃下以在染色緩衝液(BD Pharmingen)中之重組CD70-Fc(Sino Biological)將經轉導之T細胞染色30分鐘。然後洗滌細胞，並在4℃下以在染色緩衝液中之山羊抗人類IgG Fc PE(Jackson ImmunoResearch)染色30分鐘。然後洗滌細胞並在數據獲取前，再懸浮於具有碘化丙錠(BD Pharmingen)之染色緩衝液中。所有實驗均在二個不同之供體中進行。在供體1(圖3A)和供體2(圖3B)之經轉導的細胞兩者中觀察各構築體之CD70 CAR表現。
T細胞刺激後14天，將效應細胞(例如抗CD70 CAR T細胞)與目標細胞以1：1效應細胞對目標細胞(E：T)之比例培養在R10培養基中。測試之細胞株包括KG-1a、NAMALWA、及Raji。共同培養後16小時，根據製造商之說明書，藉由Luminex(EMD Millipore)分析上清液對於產生之細胞介質IFNγ(圖4A至4B)、TNFα(圖4C至4D)及IL-2(圖4E至4F)。對在二個供體(圖4A至4F)中測試之各抗CD70 CAR T細胞，在NAMALWA與Raji目標細胞共同培養物之上清液中觀察到IFNγ(圖4A至4B)、TNFα(圖4C至4D)及IL-2(圖4E至4F)。然而，在與各種CD70 CAR T細胞共同培養的KG-1a目標細胞之上清液中(圖4A至4F)，觀察到較低量之IFNγ(圖4A至4B)、TNFα(圖4C至4D)及IL-2(圖4E至4F)。
藉由CD3陰性細胞之碘化丙錠(PI)攝入的流式細胞分析評估目標細胞生存力。抗-CD70 CAR T細胞與KG-1a (圖5A-5B)、Raji (圖5C)、或NAMALWA (圖5D)目標細胞共培養16小時、40小時、64小時、88小時、或112小時。在對抗-CD70 CAR T細胞之任何時段，在KG-1a共培養物中觀察到少量細胞溶解活性(圖5A-5B)。 實施例3
將供體CD4+及CD8+T細胞解凍並以OpTmizer 培養基(Life Technologies) (供有1X青黴素-鏈黴素-L-麩醯胺酸(PSQ)(Gibco))洗滌兩次。使用Vi-Cell細胞分析器計數細胞，且將細胞密度調整成在OpTmizer培養基(含有1X PSQ及300 IU/mL IL-2) (Proleukin ®, Prometheus ®Therapeutics and Diagnostics)有1×10 6細胞/mL。計數與重新懸浮T細胞於培養基之後，以最終濃度為1 μg/mL加入可溶抗-CD28抗體。之後將細胞轉移到塗覆有抗-CD3抗體(Muromonab-CD3，50ng/ml，Miltenyi Biotec) (以HBSS稀釋到最終濃度為1.23μg/mL)之T25燒瓶。
24小時(刺激後第1天)之後，將包含CAR構築體(例如，SEQ ID NO：29及30)之CD70慢病毒載體加到各T細胞培養物達MOI為10。對於非轉導的T細胞，在300 IU/mL IL-2存在下，利用相同的程序，刺激細胞並擴增，但在第1天無添加病毒載體到細胞。轉導後24小時，以培養基(含有預先指定的組分)洗滌T細胞、計數、且以0.5×10 6細胞/mL培養基重種。
在刺激後第14天，在4℃以重組的CD70-Fc (Sino Biological)(在染色緩衝液(BD Pharmingen)中)染色轉導之T細胞30分鐘。之後洗滌細胞且以山羊抗-人類IgG Fc PE (Jackson ImmunoResearch)(在染色緩衝液中)在4℃染色30分鐘。之後在數據獲取之前，洗滌細胞且重新懸浮在有碘化丙錠(BD Pharmingen)之染色緩衝液中。在二種不同供體中進行所有實驗。在供體3及供體4兩者轉導之細胞中對構築體各者觀察CD70 CAR表現(圖9)。
在T細胞刺激之後，以1：1或4：1效應細胞對目標細胞(E：T)比在R10培養基中將效應細胞，例如，抗-CD70 CAR T細胞，與目標細胞培養14天。所測試的細胞株包括KG-1a及Raji。共培養後16小時，以Luminex (EMD Millipore)，根據製造商指示分析上清液關於細胞介質IFNγ (圖11A-11D)、TNFα (圖13A-13D)、及IL-2 (圖12A-12D)的產生。在Raji目標細胞共培養物的上清液中為在兩個供體中所測試的各抗-CD70 CAR T細胞(圖11A-12D、12A-12D、及13A-13D)觀察IFNγ (圖11A-11D)、TNFα (圖13A-13D)、及IL-2 (圖12A-12D)。然而，在與各種CD70 CAR T細胞共培養的KG-1a目標細胞之上清液中(圖11A-12D、12A-12D、及13A-13D)，以較低的量觀察到IFNγ (圖11A-11D)、TNFα (圖13A-13D)、及IL-2 (圖12A-12D)。
藉由CD3陰性細胞之碘化丙錠(PI)攝入的流式細胞分析評估目標細胞生存力。抗-CD70 CAR T細胞與KG-1a或Raji目標細胞共培養。對抗-CD70 CAR T細胞，在KG-1a共培養物中觀察到少量細胞溶解活性(圖10A-10D)。
[圖1A-1H]為描述本文所提供之CAR構築體之例子的草圖；顯示代表性組分及其較佳配置。
[圖2]為證實在各種目標細胞株中之CD70表現的一系列圖，目標細胞株對應一範圍的血液癌症；頂排從左格到右格，人類淋巴母細胞細胞株CEM (亦稱為CCRF-CEM)、人類嗜酸性白血球細胞株EoL-1、人類骨髓性細胞株HL-60、人類骨髓性細胞株KG-1a、及人類骨髓性細胞株MV4-11；底排，從左格到右格，人類B細胞株Namalwa、B淋巴細胞細胞株Raji、人類B淋巴細胞細胞株Toledo、及人類骨髓性細胞株U-937。
[圖3A及3B]為一系列圖，證實在慢病毒轉導之T細胞(自第一健康人類T細胞供體(圖3A)單離及自第二健康人類T細胞供體(圖3B)單離)中針對CD70的各種CAR表現；透明直方圖表示模擬轉導而灰色填充的直方圖表示表現轉導之CAR的細胞，格中的數字顯示發現為CAR陽性之細胞的百分比。
[圖4A-4F]為一系列長條圖，描述來自二個表現四種不同CAR(28T-28z、28T-4Bz、8K-28z、8K-4Bz)之健康供體的慢病毒轉導之T細胞的IFNγ、TNFα、及IL-2產生，各包含不同scFv(8G1、1C8及6E9)(16小時與KG-1a、Raji或Namalwa目標細胞株共培養之後)；圖4A及4B顯示在慢病毒轉導之CAR T細胞(來自供體1(圖4A)及來自供體2(圖4B))中之IFNγ(pg/ml；y-軸)產生，圖4C及4D顯示在慢病毒轉導之CAR T細胞(來自供體1(圖4C)及供體2(圖4D))中之TNFα (pg/ml；y-軸)產生，與圖4E及4F顯示在慢病毒轉導之CAR T細胞(得自第一供體(圖4E)與第二供體(圖4F))中的IL-2產生(pg/ml；y-軸)。
[圖5A-5D]顯示表現所示之CAR的慢病毒轉導之T細胞(得自健康供體1(圖5A及5C)或健康供體2(圖5B及5D))與KG-1a (CD70-) (圖5A及5B)、Raji (CD70+) (圖5C)、或Namalwa (CD70+)(圖5D)目標細胞共培養112小時，隨著時間之細胞溶解活性(作為剩餘活目標細胞之百分比；y-軸)。
[圖6]為表，顯示如使用Kabat、Chothia及IGMT系統所編碼，本文所揭露之抗原結合分子的互補決定區(CDR)。
[圖7A-7F]為一系列的表，顯示本文所提供之CAR或TCR各者的可變重(VH)與可變輕(VL)序列；亦呈現CDR且如使用Kabat、Chothia及IGMT系統所編碼地顯示。
[圖8A-8L]描述編碼本文所揭露之各種CAR的核酸序列；亦提供對應的胺基酸序列。
[圖9]為長條圖，證實在慢病毒轉導之T細胞中針對CD70的CD70 CAR C3L表現。
[圖10A-10D]顯示表現所示之CAR的慢病毒轉導之T細胞(得自健康供體3(圖10A與10B)或健康供體4(圖10C與10D))與KG-1a或Raji以E：T比為4：1(圖10A與10C)或1：1(圖10B與10D)共培養112小時，隨著時間之細胞溶解活性(作為剩餘活目標細胞之百分比；y-軸)。
[圖11A-11D]為一系列長條圖，描述與KG-1a或Raji目標細胞株共培養16小時之後，由慢病毒轉導之T細胞(來自二個表現CD70 CAR C3L之健康供體)(28T-28z，包含8G1 scFv)之IFNγ產生；圖11A與11B顯示在慢病毒轉導之CAR T細胞(來自供體3)中以E：T比分別為4：1及1：1之IFNγ(pg/ml；y-軸)產生；圖11C與11D顯示在慢病毒轉導之CAR T細胞(來自供體4)中以E：T比分別為4：1及1：1之IFNγ(pg/ml；y-軸)產生。
[圖12A-12D]為一系列長條圖，描述與KG-1a或Raji目標細胞株共同培養16小時之後，由慢病毒轉導之T細胞(來自二個表現CD70 CAR C3L之健康供體)(28T-28z，包含8G1 scFv)之IL2產生；圖12A與12B顯示在慢病毒轉導之CAR T細胞(來自供體3)中以E：T比分別為4：1及1：1之IL2 (pg/ml；y-軸)產生；圖12C與12D顯示慢病毒轉導之CAR T細胞(來自供體4)中以E：T比分別為4：1及1：1之IL2 (pg/ml；y-軸)產生。
[圖13A-13D]為一系列長條圖，描述與KG-1a或Raji目標細胞株共同培養16小時之後，由慢病毒轉導之T細胞(來自二個表現CD70 CAR C3L之健康供體)(28T-28z，包含8G1 scFv)之TNFα產生；圖13A與13B顯示在慢病毒轉導之CAR T細胞(來自供體3)中以E：T比分別為4：1及1：1之IL2 (pg/ml；y-軸)產生；圖13C與13D顯示在慢病毒轉導之CAR T細胞(來自供體4)中以E：T比分別為4：1及1：1之TNFα (pg/ml；y-軸)產生。
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Claims (23)

  1. 一種經單離之多核苷酸，編碼包含特異性結合CD70之抗原結合分子的嵌合抗原受體(CAR)，其中該抗原結合分子包括下列之一： (a)  VH CDR1區，其包含SEQ ID NO：62之胺基酸序列；VH CDR2區，其包含SEQ ID NO：63之胺基酸序列；VH CDR3區，其包含SEQ ID NO：64之胺基酸序列；VL CDR1區，其包含SEQ ID NO：53之胺基酸序列；VL CDR2區，其包含SEQ ID NO：54之胺基酸序列；及VL CDR3區，其包含SEQ ID NO：55之胺基酸序列； (b)  VH CDR1區，其包含SEQ ID NO：65之胺基酸序列；VH CDR2區，其包含SEQ ID NO：66之胺基酸序列；VH CDR3區，其包含SEQ ID NO: 67之胺基酸序列；VL CDR1區，其包含SEQ ID NO: 56之胺基酸序列；VL CDR2區，其包含SEQ ID NO: 57之胺基酸序列；及VL CDR3區，其包含SEQ ID NO: 58之胺基酸序列； (c)  VH CDR1區，其包含SEQ ID NO: 68之胺基酸序列；VH CDR2區，其包含SEQ ID NO: 69之胺基酸序列；VH CDR3區，其包含SEQ ID NO: 70之胺基酸序列；VL CDR1區，其包含SEQ ID NO: 59之胺基酸序列；VL CDR2區，其包含SEQ ID NO: 60之胺基酸序列；及VL CDR3區，其包含SEQ ID NO: 61之胺基酸序列； (d)  VH CDR1區，其包含SEQ ID NO: 77之胺基酸序列；VH CDR2區，其包含SEQ ID NO: 63之胺基酸序列；VH CDR3區，其包含SEQ ID NO: 64之胺基酸序列；VL CDR1區，其包含SEQ ID NO: 53之胺基酸序列；VL CDR2區，其包含SEQ ID NO: 54之胺基酸序列；及VL CDR3區，其包含SEQ ID NO: 55之胺基酸序列； (e)  VH CDR1區，其包含SEQ ID NO: 78之胺基酸序列；VH CDR2區，其包含SEQ ID NO: 66之胺基酸序列；VH CDR3區，其包含SEQ ID NO：67之胺基酸序列；VL CDR1區，其包含SEQ ID NO：56之胺基酸序列；VL CDR2區，其包含SEQ ID NO：57之胺基酸序列；及VL CDR3區，其包含SEQ ID NO：58之胺基酸序列；或 (f)   VH CDR1區，其包含SEQ ID NO：79之胺基酸序列；VH CDR2區，其包含SEQ ID NO：69之胺基酸序列；VH CDR3區，其包含SEQ ID NO：70之胺基酸序列；VL CDR1區，其包含SEQ ID NO：59之胺基酸序列；VL CDR2區，其包含SEQ ID NO：60之胺基酸序列；及VL CDR3區，其包含SEQ ID NO：61之胺基酸序列。
  2. 如請求項1之多核苷酸，其中，該抗原結合分子包括下列之一： (a)  VH，其包含SEQ ID NO：3之胺基酸序列；及VL，其包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列； (b)  VH，其包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列；及VL，其包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列；或 (c)  VH，其包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列；及VL，其包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列， 其中，該VH與VL視需要藉由連接子連接。
  3. 如請求項1或2之多核苷酸，其中，該CAR進一步包含跨膜結構域，其中，該跨膜結構域為下列群組之跨膜結構域：CD28、4-1BB/CD137、CD8α、CD4、CD19、CD3ε、CD45、CD5、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、T細胞受體之α鏈、T細胞受體之β鏈、T細胞受體之ζ鏈或其任何組合。
  4. 如請求項1或2之多核苷酸，其中，該CAR進一步包含共刺激區，其中，該共刺激區為CD2、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD4、CD7、CD8α、CD8β、CD11a (ITGAL)、CD11b(ITGAM)、CD11c(ITGAX)、CD11d (ITGAD)、CD18(ITGB2)、CD19(B4)、CD27(TNFRSF7)、CD28、CD28T、CD29(ITGB1)、CD30(TNFRSF8)、CD40(TNFRSF5)、CD48(SLAMF2)、CD49a(ITGA1)、CD49d(ITGA4)、CD49f(ITGA6)、CD66a(CEACAM1)、CD66b(CEACAM8)、CD66c(CEACAM6)、 CD66d(CEACAM3)、CD66e(CEACAM5)、CD69(CLEC2)、CD79A(B-細胞抗原受體複合物-相關之α鏈)、CD79B(B-細胞抗原受體複合物-相關之β鏈)、CD84(SLAMF5)、CD96 (Tactile)、CD100(SEMA4D)、CD103(ITGAE)、CD134 (OX40)、CD137(4-1BB)、CD150(SLAMF1)、CD158A (KIR2DL1)、CD158B1(KIR2DL2)、CD158B2(KIR2DL3)、CD158C(KIR3DP1)、CD158D(KIRDL4)、CD158F1 (KIR2DL5A)、CD158F2 (KIR2DL5B)、CD158K (KIR3DL2)、CD160 (BY55)、CD162(SELPLG)、CD226 (DNAM1)、CD229(SLAMF3)、CD244(SLAMF4)、CD247 (CD3-ζ)、CD258(LIGHT)、CD268(BAFFR)、CD270 (TNFSF14)、CD272(BTLA)、CD276(B7-H3)、CD279(PD-1)、CD314(NKG2D)、CD319(SLAMF7)、CD335(NK-p46) 、CD336(NK-p44)、CD337(NK-p30)、CD352(SLAMF6)、CD353(SLAMF8)、CD355(CRTAM)、CD357(TNFRSF18)、可誘導之T細胞共刺激物(ICOS)、LFA-1(CD11a/CD18)、NKG2C、DAP-10、ICAM-1、NKp80(KLRF1)、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-7Rα、LFA-1、SLAMF9、LAT、GADS(GrpL) 、SLP-76(LCP2)、PAG1/CBP、CD83配體、Fcγ受體、MHC第1類分子、MHC第2類分子、TNF受體蛋白質、免疫球蛋白蛋白質、細胞介質受體、整合素、活化之NK細胞受體、Toll配體受體、及或其片段或組合之訊號傳導區。
  5. 如請求項1或2之多核苷酸，其中，該CAR進一步包含活化結構域，其中，該活化結構域為CD3 ζ結構域。
  6. 如請求項1或2之多核苷酸，其中，該CAR進一步包含前導肽，其中，該前導肽包含與SEQ ID NO：28至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、或約100%同一性之胺基酸序列。
  7. 如請求項1或2之多核苷酸，其中，該多核苷酸係選自下列所組成群組：SEQ ID NO：29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49及51。
  8. 如請求項1或2之多核苷酸，其用於治療個體的癌症之方法，其中，該癌症為血液癌症。
  9. 如請求項8之多核苷酸，其中，該癌症為多發性骨髓瘤、何杰金氏症、非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、原發性縱隔大B細胞淋巴瘤(PMBC)、瀰漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、濾泡性淋巴瘤(FL)、經轉形之濾泡性淋巴瘤、脾邊緣區淋巴瘤(SMZL)、慢性或急性白血病、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、急性淋巴母細胞性白血病(ALL)(包括非T細胞ALL)、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、T細胞淋巴瘤、一或多種B細胞急性淋巴性白血病(「BALL」)、T細胞急性淋巴性白血病(「TALL」)、急性淋巴性白血病(ALL)、慢性骨髓性白血病(CML)、B細胞幼淋巴細胞性白血病、母細胞性漿細胞樣樹突細胞瘤、伯基特氏(Burkitt's)淋巴瘤、瀰漫性大B細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、髮細胞性白血病、小細胞或大細胞濾泡性淋巴瘤、惡性淋巴增殖條件、MALT淋巴瘤、套細胞淋巴瘤、邊緣區淋巴瘤、脊髓發育不良和骨髓增生異常症候群、漿母細胞淋巴瘤、漿細胞樣樹突細胞瘤、瓦爾登斯特倫(Waldenstrom)巨球蛋白血症、漿細胞增殖性失調(例如無症狀之骨髓瘤(鬱積型多發性骨髓瘤或無痛骨髓瘤))、意義不明之單株γ球蛋白病(MGUS)、漿細胞瘤(例如漿細胞惡液質、孤立性骨髓瘤、孤立性漿細胞瘤、髓外漿細胞瘤和多發性漿細胞瘤)、全身性澱粉樣蛋白輕鏈澱粉樣變性、POEMS症候群(亦稱為Crow-Fukase症候群、Takatsuki病和PEP症候群)或其組合。
  10. 一種載體，包含如請求項1至7中任一項之多核苷酸，其為反轉錄病毒載體、DNA載體、質體、RNA載體、腺病毒載體、腺病毒相關載體、慢病毒載體或其任何組合。
  11. 如請求項10之載體，其用於治療個體的癌症之方法，其中，該癌症為血液癌症。
  12. 如請求項11之載體，其中，該癌症為多發性骨髓瘤、何杰金氏症、非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、原發性縱隔大B細胞淋巴瘤(PMBC)、瀰漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、濾泡性淋巴瘤(FL)、經轉形之濾泡性淋巴瘤、脾邊緣區淋巴瘤(SMZL)、慢性或急性白血病、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、急性淋巴母細胞性白血病(ALL)(包括非T細胞ALL)、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、T細胞淋巴瘤、一或多種B細胞急性淋巴性白血病(「BALL」)、T細胞急性淋巴性白血病(「TALL」)、急性淋巴性白血病(ALL)、慢性骨髓性白血病(CML)、B細胞幼淋巴細胞性白血病、母細胞性漿細胞樣樹突細胞瘤、伯基特氏(Burkitt's)淋巴瘤、瀰漫性大B細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、髮細胞性白血病、小細胞或大細胞濾泡性淋巴瘤、惡性淋巴增殖條件、MALT淋巴瘤、套細胞淋巴瘤、邊緣區淋巴瘤、脊髓發育不良和骨髓增生異常症候群、漿母細胞淋巴瘤、漿細胞樣樹突細胞瘤、瓦爾登斯特倫(Waldenstrom)巨球蛋白血症、漿細胞增殖性失調(例如無症狀之骨髓瘤(鬱積型多發性骨髓瘤或無痛骨髓瘤))、意義不明之單株γ球蛋白病(MGUS)、漿細胞瘤(例如漿細胞惡液質、孤立性骨髓瘤、孤立性漿細胞瘤、髓外漿細胞瘤和多發性漿細胞瘤)、全身性澱粉樣蛋白輕鏈澱粉樣變性、POEMS症候群(亦稱為Crow-Fukase症候群、Takatsuki病和PEP症候群)或其組合。
  13. 一種CAR，其係由如請求項1至7中任一項之多核苷酸或如請求項10之載體編碼，其中該CAR包含選自下列所組成群組之胺基酸序列：SEQ ID NO：30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50及52。
  14. 如請求項13之CAR，其用於治療個體的癌症之方法，其中，該癌症為血液癌症。
  15. 如請求項14之CAR，其中，該癌症為多發性骨髓瘤、何杰金氏症、非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、原發性縱隔大B細胞淋巴瘤(PMBC)、瀰漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、濾泡性淋巴瘤(FL)、經轉形之濾泡性淋巴瘤、脾邊緣區淋巴瘤(SMZL)、慢性或急性白血病、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、急性淋巴母細胞性白血病(ALL)(包括非T細胞ALL)、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、T細胞淋巴瘤、一或多種B細胞急性淋巴性白血病(「BALL」)、T細胞急性淋巴性白血病(「TALL」)、急性淋巴性白血病(ALL)、慢性骨髓性白血病(CML)、B細胞幼淋巴細胞性白血病、母細胞性漿細胞樣樹突細胞瘤、伯基特氏(Burkitt's)淋巴瘤、瀰漫性大B細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、髮細胞性白血病、小細胞或大細胞濾泡性淋巴瘤、惡性淋巴增殖條件、MALT淋巴瘤、套細胞淋巴瘤、邊緣區淋巴瘤、脊髓發育不良和骨髓增生異常症候群、漿母細胞淋巴瘤、漿細胞樣樹突細胞瘤、瓦爾登斯特倫(Waldenstrom)巨球蛋白血症、漿細胞增殖性失調(例如無症狀之骨髓瘤(鬱積型多發性骨髓瘤或無痛骨髓瘤))、意義不明之單株γ球蛋白病(MGUS)、漿細胞瘤(例如漿細胞惡液質、孤立性骨髓瘤、孤立性漿細胞瘤、髓外漿細胞瘤和多發性漿細胞瘤)、全身性澱粉樣蛋白輕鏈澱粉樣變性、POEMS症候群(亦稱為Crow-Fukase症候群、Takatsuki病和PEP症候群)或其組合。
  16. 一種細胞，包含如請求項1至7中任一項之多核苷酸、如請求項10之載體、如請求項13之CAR或其任何組合，其中該細胞為T細胞。
  17. 如請求項16之細胞，其用於治療個體的癌症之方法，其中，該癌症為血液癌症。
  18. 如請求項17之細胞，其中，該癌症為多發性骨髓瘤、何杰金氏症、非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、原發性縱隔大B細胞淋巴瘤(PMBC)、瀰漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、濾泡性淋巴瘤(FL)、經轉形之濾泡性淋巴瘤、脾邊緣區淋巴瘤(SMZL)、慢性或急性白血病、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、急性淋巴母細胞性白血病(ALL)(包括非T細胞ALL)、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、T細胞淋巴瘤、一或多種B細胞急性淋巴性白血病(「BALL」)、T細胞急性淋巴性白血病(「TALL」)、急性淋巴性白血病(ALL)、慢性骨髓性白血病(CML)、B細胞幼淋巴細胞性白血病、母細胞性漿細胞樣樹突細胞瘤、伯基特氏(Burkitt's)淋巴瘤、瀰漫性大B細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、髮細胞性白血病、小細胞或大細胞濾泡性淋巴瘤、惡性淋巴增殖條件、MALT淋巴瘤、套細胞淋巴瘤、邊緣區淋巴瘤、脊髓發育不良和骨髓增生異常症候群、漿母細胞淋巴瘤、漿細胞樣樹突細胞瘤、瓦爾登斯特倫(Waldenstrom)巨球蛋白血症、漿細胞增殖性失調(例如無症狀之骨髓瘤(鬱積型多發性骨髓瘤或無痛骨髓瘤))、意義不明之單株γ球蛋白病(MGUS)、漿細胞瘤(例如漿細胞惡液質、孤立性骨髓瘤、孤立性漿細胞瘤、髓外漿細胞瘤和多發性漿細胞瘤)、全身性澱粉樣蛋白輕鏈澱粉樣變性、POEMS症候群(亦稱為Crow-Fukase症候群、Takatsuki病和PEP症候群)或其組合。
  19. 一種組成物，包含如請求項1至7中任一項之多核苷酸、如請求項10之載體、如請求項13之CAR或如請求項16之細胞。
  20. 如請求項19之組成物，其用於治療個體的癌症之方法，其中，該癌症為血液癌症。
  21. 如請求項20之組成物，其中，該癌症為多發性骨髓瘤、何杰金氏症、非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、原發性縱隔大B細胞淋巴瘤(PMBC)、瀰漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、濾泡性淋巴瘤(FL)、經轉形之濾泡性淋巴瘤、脾邊緣區淋巴瘤(SMZL)、慢性或急性白血病、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、急性淋巴母細胞性白血病(ALL)(包括非T細胞ALL)、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、T細胞淋巴瘤、一或多種B細胞急性淋巴性白血病(「BALL」)、T細胞急性淋巴性白血病(「TALL」)、急性淋巴性白血病(ALL)、慢性骨髓性白血病(CML)、B細胞幼淋巴細胞性白血病、母細胞性漿細胞樣樹突細胞瘤、伯基特氏(Burkitt's)淋巴瘤、瀰漫性大B細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、髮細胞性白血病、小細胞或大細胞濾泡性淋巴瘤、惡性淋巴增殖條件、MALT淋巴瘤、套細胞淋巴瘤、邊緣區淋巴瘤、脊髓發育不良和骨髓增生異常症候群、漿母細胞淋巴瘤、漿細胞樣樹突細胞瘤、瓦爾登斯特倫(Waldenstrom)巨球蛋白血症、漿細胞增殖性失調(例如無症狀之骨髓瘤(鬱積型多發性骨髓瘤或無痛骨髓瘤))、意義不明之單株γ球蛋白病(MGUS)、漿細胞瘤(例如漿細胞惡液質、孤立性骨髓瘤、孤立性漿細胞瘤、髓外漿細胞瘤和多發性漿細胞瘤)、全身性澱粉樣蛋白輕鏈澱粉樣變性、POEMS症候群(亦稱為Crow-Fukase症候群、Takatsuki病和PEP症候群)或其組合。
  22. 一種製造表現CAR之細胞之方法，包含在合適之條件下以如請求項1至7中任一項之多核苷酸轉導或轉染細胞，其視需要進一步包含單離該細胞。
  23. 一種細胞，包含如請求項1至7中任一項之多核苷酸、如請求項10之載體、或如請求項13之CAR，其用於誘導針對腫瘤之免疫性之方法。
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