TWI855499B - 嵌合受體和使用彼之方法 - Google Patents

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Abstract

本發明揭示抗原結合分子、嵌合受體及經工程處理之免疫細胞。本發明進一步關於載體、組成物和使用該抗原結合分子及經工程處理之免疫細胞的治療及/或檢測方法。

Description

嵌合受體和使用彼之方法
C型凝集素樣-1(CLL-1，亦稱為CLEC-1、CLEC12A、MICL、樹突細胞相關凝集素-1(DCAL-1)和DCAL-2)為糖蛋白受體及參與調節細胞增殖和免疫調節之C型凝集素樣受體家族的成員。CLL-1表現在造血細胞中，主要係在先天免疫細胞(包括單核細胞、粒細胞、樹突細胞以及骨髓祖細胞)上。Van Rhenen et al.,Blood 2007：110(7)。CLL-1已涉及調節骨髓細胞增殖及分化(Bakker et al.,Cancer Res.64：8443-8450(2004)；Marshall et al.,J.Biol.Chem.279：14792-14802(2004))，且存在於急性骨髓性(myeloid)(骨髓性(myelogenous))白血病(AML)細胞上及白血病幹細胞上(Zhao et al.,Haematologica 2010,95(1)：71-78)。
因此，CLL-1已涉及多種疾病，包括，但不限於急性骨髓性(myeloid)(骨髓性(myelogenous))白血病(AML)、慢性骨髓性(myeloid)(骨髓性(myelogenous))白血病(CML)、慢性髓單核細胞白血病(CMML)、幼年型髓單 核細胞白血病、非典型慢性骨髓性白血病、急性早幼粒細胞白血病(acute promyelocytic leukemia)(APL)、急性單核細胞白血病、急性單核母細胞白血病、急性紅血球樣白血病、急性巨核母細胞白血病、骨髓增生異常症候群(MDS)、骨髓增殖性疾病、骨髓性腫瘤、骨髓性肉瘤、母細胞性漿細胞樣樹突細胞腫瘤(Blastic Plasmacytoid Dendritic Cell Neoplasm)(BPDCN)或彼等之組合。
此外，CLL-1可能在炎性或自體免疫疾病(諸如類風濕性關節炎、牛皮癬、過敏、哮喘、克隆氏症、IBD、IBS、纖維肌痛(fibromyalgia)、肥大細胞增多症(mastocytosis)及乳糜瀉)中具有作用。
相關申請案之交叉參考資料
本申請案主張於2016年4月1日提交申請之美國臨時專利申請案第62/317,068號之權益，該申請案之全部內容以引用方式併入本文。
序列表
本申請案包含已經以ASCII格式經電子提交之序列表且其全部內容以引用方式併入本文。該創建於2017年3月31日之ASCII副本稱為K-1029_02_SL.txt且其大小為265,830字節。
人CLL-1蛋白包含以下胺基酸序列的多肽：
Figure 112101087-A0101-12-0003-1
Figure 112101087-A0101-12-0003-2
(SEQ ID NO.140).
另外之序列資訊包含在CLL-1 Uniprot中，列於http：//www.uniprot.或g/uniprot/Q5QGZ9及NCBI參考序列NP_612210.4(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/NP_612210.4)。
當提及CLL-1時，應理解的是對此CLL-1之引用包含其片段及相關之多肽，其包括，但不限於等位變體、剪接變體、衍生之變體、取代變體、缺失變體及/或插入變體，包括添加N-端甲硫胺酸、融合多肽及種間同源物。於某些實施態樣中，CLL-1多肽包括末端殘基，諸如，但不限於前導序列殘基、靶向殘基、胺基端甲硫胺酸殘基、離胺酸殘基、標籤殘基及/或融合蛋白殘基。
某些針對CLL-1之抗體描述於美國專利案第8,536,310號和美國專利第9,163,090號中。
經工程處理之免疫細胞已證明在治療性治療，尤其是在腫瘤學中具有理想的品質。二種主要之經工程處理之免疫細胞的類型為那些含有嵌合抗原受體(稱為“CAR”或“CAR-T”)及T細胞受體(“TCR”)者。這些經工程處理之細胞係經工程處理以賦予它們抗原特異性並同時保留或增強其識別和殺死靶細胞之能力。嵌合抗原受體可包 含，例如(i)抗原特異性組分(“抗原結合分子”)，(ii)胞外結構域，(iii)一或多個共刺激結構域，及(iv)一或多個活化結構域。各結構域可為異源性，即，由源自(或對應於)不同蛋白鏈之序列所組成。表現嵌合抗原受體之免疫細胞(諸如T細胞)可用於各種療法，包括癌症療法中。可理解的是，共刺激結構域可用於增強活化針對靶抗原之CAR表現細胞，因而可增加過繼性免疫療法之效力。
某些針對CLL-1之CAR已描述於，例如美國專利申請案第20160051651(PCT US2015/041337)號中。
T細胞可經工程處理成具有針對一或多個所欲靶的之特異性。例如可以編碼抗原結合分子(諸如一或多個抗體之單鏈可變片段(“scFv”))之DNA或其他遺傳物質，結合一或多個信號轉導分子及/或一或多個活化結構域(諸如CD3ζ)來轉導T細胞。
除了CAR-T細胞識別及破壞經靶向之細胞的能力外，成功之T細胞療法受益於該CAR-T細胞在回應抗原時之持續且保持增殖之能力。
T細胞受體(TCR)為在T細胞表面發現之分子，當肽與主要組織相容性複合物(MHC)分子結合時其負責識別抗原片段。該TCR係由二種不同的蛋白鏈所組成-在約95%之人TCR中，該TCR係由α和β鏈組成。在約5%之人T細胞中，該TCR係由γ和δ(γ/δ)鏈所組成。各鏈係由二個胞外結構域所組成：可變(V)區和恆定(C)區，該二個免疫球蛋白超家族均是。如同在其他免疫球蛋白中，該 TCRα鏈和β鏈(或γ和δ(γ/δ)鏈)之可變結構域各具有三個高可變區或互補決定區(CDR)。當TCR與抗原肽和MHC(肽/MHC)接合時，T細胞被活化，使其能夠攻擊並破壞該靶細胞。
然而，目前之療法顯示出不同程度之效力，伴隨著不理想之副作用。因此，鑑定用於治療CLL-1相關疾病和病症之新穎且經改善之療法是有需要的。
本發明關於對CLL-1具有特異性之經工程處理的免疫細胞(諸如CAR或TCR)、抗原結合分子(包括，但不限於抗體、scFv、重鏈及/或輕鏈及這些抗原結合分子之CDR)。
本發明進一步關於用來作為這些細胞中之共刺激結構域的新穎CD28胞外(鉸鏈)序列。
本發明之嵌合抗原受體通常包含：(i)CLL-1特異性抗原結合分子，(ii)胞外(其可包含鉸鏈)結構域，(iii)一或多個共刺激結構域，及(iv)一或多個活化結構域。可理解的是，各結構域可為異種的，因此係由源自(或對應於)不同蛋白鏈之序列所組成。
於一些實施態樣中，本發明關於包含特異性結合CLL-1之抗原結合分子的嵌合抗原受體，其中該抗原結合分子包含下列至少一者：a)可變重鏈CDR1，其包含選自由下列所組成之群組的胺基酸序列：SEQ ID NO： 17、51、73和95，b)可變重鏈CDR2，其包含選自由下列所組成之群組的胺基酸序列：SEQ ID NO：18、52、74和96，c)可變重鏈CDR3，其包含選自由下列所組成之群組的胺基酸序列：SEQ ID NO：19、53、75和97，d)可變輕鏈CDR1，其包含選自由下列所組成之群組的胺基酸序列：SEQ ID NO：22、56、78和100，e)可變輕鏈CDR2，其包含選自由下列所組成之群組的胺基酸序列：SEQ ID NO：23、57、79和101，及f)可變輕鏈CDR3，其包含選自由下列所組成之群組的胺基酸序列：SEQ ID NO：24、58、80和102。該嵌合抗原受體可進一步包含至少一個共刺激結構域。如申請專利範圍第1項之嵌合抗原受體進一步包含至少一個活化結構域。
於某些實施態樣中，本發明關於與本發明所提出之嵌合抗原受體具有至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或100%同一性的嵌合抗原受體。
本發明亦包含其中具有不超過8個胺基酸取代之嵌合抗原受體。
於某些實施態樣中，該共刺激結構域包含下列群組之信號傳導結構域(或其他合適之部分)：CD28、OX-40、4-1BB/CD137、CD2、CD7、CD27、CD30、CD40、程式性死亡-1(PD-1)、誘導型T細胞共刺激分子(ICOS)、淋巴細胞功能相關抗原-1(LFA-1，CD1 1a/CD18)、 CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD247、CD276(B7-H3)、LIGHT、(TNFSF14)、NKG2C、Igα(CD79a)、DAP-10、Feγ受體、第I類MHC分子、TNF受體蛋白、免疫球蛋白樣蛋白、細胞因數受體、整合素(integrin)、信號傳導淋巴細胞活化分子(SLAM蛋白)、活化NK細胞受體、BTLA、Toll配體受體、ICAM-1、B7-H3、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD1 1d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD1 1a、LFA-1、ITGAM、CD1 1b、ITGAX、CD1 1c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRT AM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a、特異性結合CD83之配體或彼等之任何組合。
於一些實施態樣中，該共刺激結構域可包含SEQ ID NO.141所示之4-1BB核酸序列的全部或部分，及如SEQ ID NO.142所示之對應胺基酸序列。於其他實施態 樣中，該共刺激結構域可包含如SEQ ID NO.143所示之OX40的胺基酸序列之全部或部分。亦參見Hombach et al.,Oncoimmunology.2012 Jul.1；1(4)：458-466。再於其他實施態樣中，該共刺激結構域可包含如Guedan et al.,August 14,2014；Blood：124(7)和Shen et al.,Journal of Hematology&Oncology(2013)6：33所描述之全部或部分之ICOS分子。再於其他實施態樣中，該共刺激結構域可包含如Song et al.,Oncoimmunology.2012 Jul.1；1(4)：547-549所描述之全部或部分之CD27。
較佳之實施態樣包括將一或多個下列序列併入本發明之CAR中：SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.8。另外之較佳的實施態樣包括將SEQ ID NO.14所示之序列併入本發明之CAR中。
於進一步之實施態樣中，該活化結構域包含CD3，較佳為CD3ζ，更佳地，CD3ζ具有SEQ ID NO.10所示之序列。
於其他實施態樣中，本發明關於進一步包含SEQ ID NO.2及進一步包含SEQ ID NO.10之包含抗原結合分子的嵌合抗原受體。
本發明進一步關於編碼該嵌合抗原受體之經分離的多核苷酸及包含該多核苷酸之載體。本技藝已知之任何載體均可適用於本發明。於一些實施態樣中，該載體為病毒載體。於一些實施態樣中，該載體為逆轉錄病毒載體(諸如pMSVG1)、DNA載體、鼠白血病病毒載體、SFG 載體、質粒、RNA載體、腺病毒載體、桿狀病毒載體、埃巴病毒載體(Epstein Barr viral vector)、乳多泡病毒載體(papovaviral vector)、牛痘病毒載體、單純皰疹病毒載體、腺病毒相關載體(AAV)、慢病毒載體(例如pGAR)或彼等之任何組合。該pGAR序列如下：
Figure 112101087-A0101-12-0009-3
Figure 112101087-A0101-12-0010-4
Figure 112101087-A0101-12-0011-5
Figure 112101087-A0101-12-0012-6
該pGAR載體圖譜闡明於下：
合適之另外的示例性載體包括，例如 pBABE-puro、pBABE-neo大TcDNA、pBABE-hygro-hTERT、pMKO.1GFP、MSCV-IRES-GFP、pMSCV PIG(Puro IRES GFP空質粒)、pMSCV-loxp-dsRed-loxp-eGFP-Puro-WPRE、MSCV IRES螢光素酶、pMIG、MDH1-PGK-GFP_2.0、TtRMPVIR、pMSCV-IRES-mCherry FP、pRetroX GFP T2A Cre、pRXTN、pLncEXP及pLXIN-Luc。
示例性免疫細胞包括，但不限於T細胞、腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)、NK細胞、TCR表現細胞、樹突細胞或NK-T細胞。該T細胞可為自體的、同種異體的或異源的。於其他實施態樣中，本發明關於包含本發明所描述之免疫細胞的醫藥組成物。
於某些實施態樣中，本發明關於包含下列至少一者之抗原結合分子(及包含這些分子之嵌合抗原受體)：
(a)包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列的VH區及包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列的VL區；
(b)包含SEQ ID NO：50之胺基酸序列的VH區及包含SEQ ID NO：55之胺基酸序列的VL區；
(c)包含SEQ ID NO：72之胺基酸序列的VH區及包含SEQ ID NO：77之胺基酸序列的VL區；
(d)包含SEQ ID NO：94之胺基酸序列的VH區及包含SEQ ID NO：99之胺基酸序列的VL區；
且其中該VH和VL區係藉由至少一個連接子連接。本發明亦包含其中具有不超過8個胺基酸取代之嵌合抗原受體及/ 或抗原結合分子。
該連接子可為，例如聚-Gly連接子，諸如GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO.130)或GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO.145)。
於其他實施態樣中，本發明關於抗原結合分子(及包含這些分子之嵌合抗原受體)，其中該連接子包含SEQ ID NO.130和SEQ ID NO.132至少一者。
於某些實施態樣中，本發明關於與本發明所提出之抗原結合分子及/或嵌合抗原受體具有至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或100%同一性的抗原結合分子及/或嵌合抗原受體。
於其他實施態樣中，本發明關於經分離之多核苷酸，其包含下列至少一者：SEQ ID NO.27；SEQ ID NO.31；SEQ ID NO.35；SEQ ID NO.39；SEQ ID NO.43；SEQ ID NO.47；SEQ ID NO.61；SEQ ID NO.65；SEQ ID NO.69；SEQ ID NO.83；SEQ ID NO.87；SEQ ID NO.91；SEQ ID NO.105；SEQ ID NO.109；SEQ ID NO.113；SEQ ID NO.117；SEQ ID NO.121；及SEQ ID NO.125。
於某些實施態樣中，本發明關於與本發明所提出之多核苷酸具有至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或100%同一性的經分離之多核苷酸。
本發明進一步關於包含這些多核苷酸之載體及使用這些載體轉導之細胞。
於進一步的實施態樣中，本發明關於經分離之多肽，其包含闡述於下列至少一者之胺基酸序列：SEQ ID NO.28；SEQ ID NO.32；SEQ ID NO.36；SEQ ID NO.40；SEQ ID NO.44；SEQ ID NO.48；SEQ ID NO.62；SEQ ID NO.66；SEQ ID NO.70；SEQ ID NO.84；SEQ ID NO.88；SEQ ID NO.92；SEQ ID NO.106；SEQ ID NO.110；SEQ ID NO.114；SEQ ID NO.118；SEQ ID NO.122；及SEQ ID NO.126。於其他實施態樣中，本發明關於編碼這些多肽之載體、包含這些多肽之免疫細胞。較佳之免疫細胞包括T細胞、腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)、NK細胞、TCR表現細胞、樹突細胞或NK-T細胞。該T細胞可為自體的、同種異體的或異源的。本發明亦包含其中具有不超過8個胺基酸取代之嵌合抗原受體。
於其他實施態樣中，本發明關於編碼嵌合抗原受體(CAR)或T細胞受體(TCR)之經分離之多核苷酸，該嵌合抗原受體(CAR)或T細胞受體(TCR)包含特異性結合CLL-1之抗原結合分子，其中該抗原結合分子包含可變重(VH)鏈CDR3，該可變重(VH)鏈CDR3包含選自由下列所組成之群組的胺基酸序列：SEQ ID NO：19、53、75和97。本發明亦包含其中具有不超過8個胺基酸取代之嵌合抗原受體。該多核苷酸可進一步包含活化結構域。於較佳之實施態樣中，該活化結構域為CD3，更佳為CD3ζ，更佳為該 闡述於SEQ ID NO.9之胺基酸序列。
於其他實施態樣中，本發明包括共刺激結構域，該共刺激結構域包含下列群組之信號傳導結構域(或其他合適之部分)：CD28、CD28T、OX40、4-1BB/CD137、CD2、CD3(α、β、δ、ε、γ、ζ)、CD4、CD5、CD7、CD9、CD16、CD22、CD27、CD30、CD33、CD37、CD40、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、PD-1、ICOS、淋巴細胞功能相關抗原-1(LFA-1(CD1 1a/CD18))、CD247、CD276(B7-H3)、LIGHT(腫瘤壞死因子超家族成員14；TNFSF14)、NKG2C、Igα(CD79a)、DAP-10、Fcγ受體、第I類MHC分子、TNF、TNFγ、整合素、信號傳導淋巴細胞活化分子、BTLA、Toll配體受體、ICAM-1、B7-H3、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD1-1d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD1-1a、LFA-1、ITGAM、CD1-1b、ITGAX、CD1-1c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRT AM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、 SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a、CD83配體或彼等之片段或組合。下文中列舉較佳之共刺激結構域。
於進一步之實施態樣中，本發明關於編碼嵌合抗原受體(CAR)或T細胞受體(TCR)之經分離之多核苷酸，其中該CAR或TCR包含特異性結合CLL-1之抗原結合分子，且其中該抗原結合分子包含可變輕(VL)鏈CDR3，該可變輕(VL)鏈CDR3包含選自由下列所組成之群組的胺基酸序列：SEQ ID NO：24、58、80及102。該多核苷酸可進一步包含活化結構域。該多核苷酸可進一步包含共刺激結構域。
於其他實施態樣中，本發明關於編碼嵌合抗原受體(CAR)或T細胞受體(TCR)之經分離之多核苷酸，該嵌合抗原受體(CAR)或T細胞受體(TCR)包含特異性結合CLL-1之抗原結合分子，其中該抗原結合分子重鏈包含CDR1(SEQ ID NO.17)、CDR2(SEQ ID NO.18)和CDR3(SEQ ID NO.19)且該抗原結合分子輕鏈包含CDR1(SEQ ID NO.22)、CDR2(SEQ ID NO.23)和CDR3(SEQ ID NO.24)。
於某些實施態樣中，本發明關於與上述序列具有至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或100%同一性的經分離之多核苷酸。
於其他實施態樣中，本發明關於編碼嵌合抗 原受體(CAR)或T細胞受體(TCR)之經分離之多核苷酸，該嵌合抗原受體(CAR)或T細胞受體(TCR)包含特異性結合CLL-1之抗原結合分子，其中該抗原結合分子重鏈包含CDR1(SEQ ID NO.51)、CDR2(SEQ ID NO.52)和CDR3(SEQ ID NO.53)且該抗原結合分子輕鏈包含CDR1(SEQ ID NO.56)、CDR2(SEQ ID NO.57)和CDR3(SEQ ID NO.58)。
於某些實施態樣中，本發明關於與上述序列具有至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或100%同一性的經分離之多核苷酸。
於其他實施態樣中，本發明關於編碼嵌合抗原受體(CAR)或T細胞受體(TCR)之經分離之多核苷酸，該嵌合抗原受體(CAR)或T細胞受體(TCR)包含特異性結合CLL-1之抗原結合分子，其中該抗原結合分子重鏈包含CDR1(SEQ ID NO.73)、CDR2(SEQ ID NO.74)和CDR3(SEQ ID NO.75)且該抗原結合分子輕鏈包含CDR1(SEQ ID NO.78)、CDR2(SEQ ID NO.79)和CDR3(SEQ ID NO.80)。
於某些實施態樣中，本發明關於與上述序列具有至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或100%同一性的經分離之多核苷酸。
於其他實施態樣中，本發明關於編碼嵌合抗原受體(CAR)或T細胞受體(TCR)之經分離之多核苷酸，該嵌合抗原受體(CAR)或T細胞受體(TCR)包含特異性結合 CLL-1之抗原結合分子，其中該抗原結合分子重鏈包含CDR1(SEQ ID NO.95)、CDR2(SEQ ID NO.96)和CDR3(SEQ ID NO.97)且該抗原結合分子輕鏈包含CDR1(SEQ ID NO.100)、CDR2(SEQ ID NO.101)和CDR3(SEQ ID NO.102)。
於某些實施態樣中，本發明關於與上述序列具有至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或100%同一性的經分離之多核苷酸。
於進一步之實施態樣中，本發明關於編碼嵌合抗原受體(CAR)或T細胞受體(TCR)之經分離的多核苷酸，其包含特異性結合CLL-1之抗原結合分子，且其中該抗原結合分子包含：
(a)重鏈可變區(VH)互補決定區(CDR)1，其包含胺基酸序列GX2X3X4X5X6X7X8X9(SEQ ID NO：134)，其中：X2為G、F或Y；X3為S或T；X4為I、F或L；X5為S或T；X6不存在或為S；X7不存在或為G；X8不存在或為E或G；且X9為F、L或Y；
(b)重鏈可變區(VH)互補決定區(CDR)2，其包含胺基酸序列X1X2X3X4X5X6(SEQ ID NO：135)，其中：X1為D、H、S或Y；X2為H、P或Y；X3為D、E或S；X4為D或G；X5為G或S；且X6不存在或為D或E；
(c)重鏈可變區(VH)互補決定區(CDR)3，其包含胺基酸序列X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12DY(SEQ ID NO： 136)，其中：X1為E或L；X2為R、S或V；X3為R或Y；X4為C、G或S；X5不存在或為G或I；X6不存在或為G；X7不存在或為D；X8不存在或為C；X9不存在或為W或Y；X10不存在或為P或S；X11不存在或為G或Y；且X12為F或R；
(d)輕鏈可變區(VL)CDR1，其包含胺基酸序列X1ASQX5X6X7X8X9LX11(SEQ ID NO：137)，其中X1為Q或R；X5為D或S；X6為I或V；X7為N或S；X8為N或S；X9為F、L或Y；且X11為N或T；
(e)輕鏈可變區(VL)CDR2，其包含胺基酸序列X1ASX4X5X6X7(SEQ ID NO：138)，其中X1為D或G；X4為N、S或T；X5為L或R；X6為A、E或K；且X7為S或T；及/或
(f)輕鏈可變區(VL)CDR3，其包含胺基酸序列QQX3X4X5X6PX8T(SEQ ID NO：139)，其中X3為S或Y；X4為D、G或Y；X5為N、S或T；X6為L、T或Y；且X8為F或I。
本發明進一步關於針對CLL-1之抗原結合分子，其包含如本發明所提出之可變重鏈CDR3或可變輕鏈CDR3序列至少一者。本發明進一步關於針對CLL-1之抗原結合分子，其包含如本發明所描述之可變重鏈CDR1、CDR2和CDR3序列至少一者。本發明進一步關於針對CLL-1之抗原結合分子，其包含如本發明所描述之可變輕鏈CDR1、CDR2和CDR3序列至少一者。本發明進一步關於針對CLL-1之抗原結合分子，其同時包含如本發明所描述 之可變重鏈CDR1、CDR2、CDR3及可變輕鏈CDR1、CDR2和CDR3序列。
本發明進一步關於治療有治療需要之個體的疾病或病症之方法，其包含對該個體投予根據本發明之抗原結合分子、CAR、TCR、多核苷酸、載體、細胞或組成物。適合治療之疾病包括，但不限於急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、慢性髓單核細胞白血病(CMML)、幼年型髓單核細胞白血病、非典型慢性骨髓性白血病、急性早幼粒細胞白血病(APL)、急性單核母細胞白血病、急性紅血球樣白血病、急性巨核母細胞白血病、骨髓增生異常症候群(MDS)、骨髓增殖性疾病、骨髓性腫瘤、骨髓性肉瘤、母細胞性漿細胞樣樹突細胞腫瘤(BPDCN)或彼等之組合。另外之疾病包括炎性及/或自體免疫性疾病，諸如類風濕性關節炎、牛皮癬、過敏、哮喘、克隆氏症、IBD、IBS、纖維肌痛、肥大細胞增多症及乳糜瀉。
[第1圖]顯示不同癌細胞系中之CLL-1表現。
[第2圖]顯示在mRNA電穿孔後6小時藉由蛋白L測定之CLL-1 CAR表現。
[第3圖]顯示在mRNA電穿孔後24小時來自不同CLL-1 CAR-T細胞構建體之細胞因數釋出分析的結果。
[第4圖]顯示在mRNA電穿孔後24小時不同 CLL-1 CAR-T細胞構建體之細胞溶解活性。
[第5圖]顯示在mRNA電穿孔後24小時不同CLL-1 CAR-T細胞構建體之細胞溶解活性。
[第6圖]顯示在轉導後第12天藉由蛋白L測定之CLL-1 CAR表現。
[第7圖]顯示在與不同靶細胞系共同培養16小時後來自CLL-1 CAR-T細胞之細胞因數釋出分析。
[第8圖]顯示在與不同靶細胞系共同培養16小時和40小時後來自CLL-1 CAR-T細胞之細胞溶解活性分析。
[第9A至9D圖]闡明本發明之CLL-1抗原結合分子的序列比對。CDR被標記在框中。
[第10圖]闡明以根據本發明之CAR處理之NSG小鼠的生物發光結果。
可理解的是，嵌合抗原受體(CAR或CAR-T)和T細胞受體(TCR)為經遺傳工程處理之受體。這些經工程處理之受體可根據本技藝已知之技術輕易地插入免疫細胞(包括T細胞)中並由免疫細胞表現。藉由CAR，單一受體可經編程以識別特異性抗原且當與該抗原結合時，活化該免疫細胞以攻擊並破壞攜帶該抗原之細胞。當這些抗原存在於腫瘤細胞上時，表現該CAR之免疫細胞可靶向並殺死該腫瘤細胞。
CAR可藉由併入與該經靶向之抗原交互作用的抗原結合分子而經工程處理成與抗原(諸如細胞表面抗原)結合。較佳地，該抗原結合分子為其抗體片段，且更佳為一或多個單鏈抗體片段(“scFv”)。scFv為單鏈抗體片段，其具有連接在一起之抗體重鏈和抗體輕鏈的可變區。參見美國專利案第7,741,465和6,319,494號，及Eshhar et al.,Cancer Immunol Immunotherapy(1997)45：131-136。scFv保留親本抗體與該靶抗原特異性交互作用之能力。scFv較宜用於嵌合抗原受體中，因為它們可經工程處理成連同其他CAR組分以單鏈之一部分的形式表現。亦參見Krause et al.,J.Exp.Med.,Volume 188,No.4,1998(619-626)；Finney et al.,Journal of Immunology,1998,161：2791-2797。可理解的是，該抗原結合分子通常被包含在該CAR之胞外部分內，致使其能夠識別並與所欲抗原結合。對一個以上之所欲靶的具特異性之雙特異性和多特異性的CAR係在本發明之範圍的考量內。
共刺激結構域
嵌合抗原受體可合併共刺激(信號傳導)結構域以增加其效力。參見美國專利案第7,741,465和6,319,494號，及Krause et al.和Finney et al.(同上)、Song et al.,Blood 119：696-706(2012)；Kalos et al.,Sci Transl.Med.3：95(2011)；Porter et al.,N.Engl.J.Med.365：725-33(2011)，及Gross et al.,Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol. 56：59-83(2016)。例如，CD28為在T細胞上天然發現之共刺激蛋白。本文闡述各種共刺激分子，但應理解的是，另外之共刺激分子亦包括在本發明之範圍內。
CD28之完整天然胺基酸序列描述於NCBI參考序列：NP_006130.1中。完整之天然CD28核酸序列描述於NCBI參考序列：NM_006139.1中。
某些CD28結構域已用於嵌合抗原受體中。根據本發明，現已發現新穎之CD28胞外(鉸鏈)構建體(稱為“CD28T”)在用於CAR構建體時令人意外地可提供某些益處。儘管從該胞外CD28序列截斷(去除)多個胺基酸，該構建體顯示出保留(且有時超越)該含有CD28之CAR之性質的能力。這些益處包括相等或優異之細胞因數產製、相等或優異之細胞溶解活性及/或相等或優異之CAR現達水準。
該CD28T分子(包括胞外結構域，而該CD28跨膜及胞內結構域)之核苷酸序列闡述於SEQ ID NO.1中：
Figure 112101087-A0101-12-0025-9
該對應之胺基酸序列闡述於SEQ ID NO.2中：
LDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSK RSRLLHSDYM NMTPRRPGPT RKHYQPYAPP RDFAAYRS
該CD28T胞外部分之核苷酸序列闡述於SEQ ID NO.3中：
CTTGATAATGAAAAGTCAAACGGAACAATCATTCACGTGAAGGGCAAGCACCTCTGTCCGTCACCCTTGTTCCCTGGTCCATCCAAGCCA
該CD28T胞外結構域之對應胺基酸序列闡述於SEQ ID NO.4中：LDNEKSNGTI IHVKGKHLCP SPLFPGPSKP
該CD28跨膜結構域之核苷酸序列闡述於SEQ ID NO.5中：
TTCTGGGTGTTGGTCGTAGTGGGTGGAGTCCTCGCTTGTTACTCTCTGCTCGTCACCGTGGCTTTTATAATCTTCTGGGTT
該CD28跨膜結構域之胺基酸序列闡述於SEQ ID NO.6中：FWVLVVVGGV LACYSLLVTV AFIIFWV
該CD28胞內信號傳導結構域之核苷酸序列闡述於SEQ ID NO.7中：
Figure 112101087-A0101-12-0026-10
該CD28胞內信號傳導結構域之胺基酸序列闡述於SEQ ID NO.8中：
RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS
適合用於本發明中之另外的CD28序列包括闡述於SEQ ID NO.11中之CD28核苷酸序列：
Figure 112101087-A0101-12-0026-11
該對應之胺基酸序列闡述於SEQ ID NO.12中：
IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP
應理解的是，本發明關於包含至少一個SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3之經分離的核酸序列之抗原結合分子、CAR、TCR及類似物。應進一步理解的是，本發明關於其中該胞外部分係由至少一個SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3之經分離的核酸序列所組成之抗原結合分子、CAR、TCR及類似物。此外，應理解的是，本發明關於其中該胞外部分基本上係由至少一個SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3之經分離的核酸序列所組成之抗原結合分子、CAR、TCR及類似物。
應理解的是，本發明關於包含至少一個SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4之胺基酸序列之抗原結合分子、CAR、TCR及類似物。應進一步理解的是，本發明關於其中該胞外部分係由至少一個SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4之胺基酸序列所組成之抗原結合分子、CAR、TCR及類似物。亦應理解的是，本發明關於其中該胞外部分基本上由至少一個SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4之胺基酸序列所組成之抗原結合分子、CAR、TCR及類似物。
另一合適之胞外及/或跨膜結構域之來源可源自(或對應於)一些或全部之CD8。合適之CD8胞外和跨膜結構域之核苷酸序列闡述於SEQ ID NO.13中：
Figure 112101087-A0101-12-0028-13
該對應之胺基酸序列闡述於SEQ ID NO.14中：
AAALSNSIMYFSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRN
應理解的是，本發明範圍內之合適的共刺激結構域可源自(或對應於)，例如CD28、CD28T、OX40、4-1BB/CD137、CD2、CD3(α、β、δ、ε、γ、ζ)、CD4、CD5、CD7、CD9、CD16、CD22、CD27、CD30、CD33、CD37、CD40、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、PD-1、ICOS、淋巴細胞功能相關抗原-1(LFA-1(CD1 1a/CD18))、CD247、CD276(B7-H3)、LIGHT(腫瘤壞死因子超家族成員14；TNFSF14)、NKG2C、Igα(CD79a)、DAP-10、Fcγ受體、第I類MHC分子、TNF、TNFr、整合素、信號傳導淋巴細胞活化分子、BTLA、Toll配體受體、ICAM-1、B7-H3、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD1-1d、ITGAE、CD103、 ITGAL、CD1-1a、LFA-1、ITGAM、CD1-1b、ITGAX、CD1-1c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRT AM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a、CD83配體或彼等之片段或組合。應理解的是，未列於上文中之另外的共刺激分子或彼等之片段係在本發明之範圍內。
活化結構域
CD3為天然T細胞上之T細胞受體的元素且已被證明為CAR中之重要的胞內活化元素。於一較佳之實施態樣中，該CD3為CD3ζ，其核苷酸序列闡述於SEQ ID NO.9中：
Figure 112101087-A0101-12-0029-14
該胞內CD3ζ之對應胺基酸闡述於SEQ ID NO.10中：
Figure 112101087-A0101-12-0030-15
相關於該細胞之結構域取向
應理解的是，本發明所描述之結構域在結構上對應於與免疫或其他細胞相關之位置。因此，這些結構域可為下列群組之一部分：(i)“鉸鏈”或胞外(EC)結構域，(ii)跨膜(TM)結構域，及/或(iii)胞內/胞質結構域(IC)。該胞內組分經常包含(某種程度上)活化結構域，諸如一部分CD3族之成員，較佳為CD3ζ。此結構域能在抗原結合分子與其靶的結合時活化T細胞。應理解的是，胞內結構域通常進一步包含一或多個如本發明所描述之共刺激分子。
如本文使用之“活化”或“刺激”係指由活化分子與其同源配體結合所引起之初級反應，其中該結合介導信號轉導事件。
“活化分子”或“刺激分子”係指T細胞上之分子，例如該與存在於抗原呈遞細胞上之同源刺激配體特異性結合之TCR/CD3複合物。合適之活化分子描述於本文中。
如本文所使用之“共刺激分子”係指提供介導T細胞反應(包括，但不限於增殖、活化、分化，等)之信號的分子。共刺激分子可提供除了由如本文所描述之活化分子所提供之主信號外的信號。
合適之共刺激分子包括，但不限於下列群組之全部或部分：CD28、CD28T、OX40、4-1BB/CD137、CD2、CD3(α、β、δ、ε、γ、ζ)、CD4、CD5、CD7、CD9、CD16、CD22、CD27、CD30、CD33、CD37、CD40、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、PD-1、ICOS、淋巴細胞功能相關抗原-1(LFA-1(CD1 1a/CD18))、CD247、CD276(B7-H3)、LIGHT(腫瘤壞死因子超家族成員14；TNFSF14)、NKG2C、Igα(CD79a)、DAP-10、Fcγ受體、第I類MHC分子、TNF、TNFr、整合素、信號傳導淋巴細胞活化分子、BTLA、Toll配體受體、ICAM-1、B7-H3、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL-2RB、IL-2Rγ、IL-7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD1-1d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD1-1a、LFA-1、ITGAM、CD1-1b、ITGAX、CD1-1c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRT AM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、 SLP-76、PAG/Cbp、CD19a、CD83配體或彼等之片段或組合。應理解的是，該鉸鏈區可含有免疫球蛋白家族(諸如IgG1、IgG2、IgG3，IgG4、IgA，1gD，IgE、IgM或其片段)的一些或全部成員。
於一些實施態樣中，該胞外結構域係位於該抗原結合分子與跨膜結構域之間。
根據本發明之示例性CAR構建體闡述於表1中。
Figure 112101087-A0101-12-0032-16
如所指出者，本發明之經工程處理的T細胞包含抗原結合分子(諸如scFv)、胞外結構域(其可包含“鉸 鏈”結構域)、跨膜結構域及胞內結構域。該胞內結構域可包含至少部分之活化結構域，較佳為由CD3族成員(諸如CD3ζ、CD3ε、CD3γ)或其部分所組成。
應進一步理解的是，該抗原結合分子(例如一或多個scFv)係經工程處理，致使其位於該分子/構建體之細胞外部分，從而使其能夠識別並與其靶的結合。
胞外結構域。本發明中具特定用途之胞外結構域可能源自(即，包含)下列群組之全部或一些成員：CD28、OX-40、4-1BB/CD137、CD2、CD7、CD27、CD30、CD40、程式性死亡-1(PD-1)、可誘導性T細胞共刺激分子(ICOS)、淋巴細胞功能相關抗原-1(LFA-1，CD1-1a/CD18)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD247、CD276(B7-H3)、LIGHT、(TNFSF14)、NKG2C、Igα(CD79a)、DAP-10、Fcγ受體、第I類MHC分子、TNF受體蛋白、免疫球蛋白蛋白質、細胞因數受體、整合素、信號傳導淋巴細胞活化分子(SLAM蛋白)、活化NK細胞受體、BTLA、Toll配體受體、ICAM-1、B7-H3、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD1 1d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD1 1a、LFA-1、ITGAM、CD1 1b、ITGAX、CD1 1c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、 NKG2D、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRT AM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a、特異性結合CD83之配體或彼等之任何組合。該胞外結構域可源自天然或合成來源。
胞外結構域通常包含該鉸鏈部分，有時稱為“間隔子”區。多種鉸鏈可以根據本發明使用，包括本文所描述之分子的部分或衍生物。
於某些實施態樣中，該鉸鏈區包含與本發明所提出之胞外結構域胺基酸序列具有至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或100%同一性的胺基酸序列。
於某些實施態樣中，該鉸鏈區包含與本發明所提出之胞外核苷酸胺基酸序列具有至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或100%同一性的胺基酸序列。
跨膜結構域
該CAR可設計成具有與該CAR之胞外結構域 融合的跨膜結構域。類似地，其可與該CAR之胞內結構域融合。於一些情況中，該跨膜結構域可經過選擇或藉由胺基酸取代來修飾以避免該等結構域與相同或不同表面膜蛋白之跨膜結構域結合，以使其與該受體複合物之其他成員的交互作用最少化。該跨膜結構域可源自天然或合成來源。當該來源為天然來源時，該結構域可源自任何膜結合蛋白或跨膜蛋白。本發明中具特定用途之跨膜區可源自(包含或對應於)CD28、CD28T、OX-40、4-1BB/CD137、CD2、CD7、CD27、CD30、CD40、程式性死亡-1(PD-1)、可誘導性T細胞共刺激分子(ICOS)、淋巴細胞功能相關抗原-1(LFA-1、CD1 1a/CD18)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD247、CD276(B7-H3)、LIGHT、(TNFSF14)、NKG2C、Igα(CD79a)、DAP-10、Fcγ受體、第I類MHC分子、TNF受體蛋白、免疫球蛋白蛋白質、細胞因數受體、整合素、信號傳導淋巴細胞活化分子(SLAM蛋白)、活化NK細胞受體、BTLA、Toll配體受體、ICAM-1、B7-H3、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD1 1d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD1 1a、LFA-1、ITGAM、CD1 1b、ITGAX、CD1 1c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、TNFR2、 TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRT AM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a、特異性結合CD83之配體或彼等之任何組合。
可選擇地，短連接子可形成該CAR之任何或一些胞外、跨膜和胞內結構域之間的鍵聯。
於其他實施態樣中，本發明之CAR中的跨膜結構域為CD8跨膜結構域。於一實施態樣中，該CD8跨膜結構域包含SEQ ID NO：13之核酸序列的跨膜部分。於另一實施態樣中，該CD8跨膜結構域包含編碼包含在SEQ ID NO.14內之跨膜胺基酸序列的核酸序列。
於某些實施態樣中，本發明之CAR中的跨膜結構域為CD28跨膜結構域。於一實施態樣中，該CD28跨膜結構域包含SEQ ID NO.5之核酸序列。於一實施態樣中，該CD28跨膜結構域包含編碼SEQ ID NO.6之胺基酸序列的核酸序列。於另一實施態樣中，該CD28跨膜結構域包含SEQ ID NO.6之胺基酸序列。
胞內(胞質)結構域。本發明之經工程處理的T細胞之胞內(胞質)結構域可活化該免疫細胞之正常效應子功能至少一者。T細胞之效應子功能可指，例如細胞溶解活性或輔助活性，包括分泌細胞因數。
應理解的是，合適之胞內分子包括(即，包含)，但不限於源自(或對應於)下列群組之信號傳導結構域：CD28、CD28T、OX-40、4-1BB/CD137、CD2、CD7、CD27、CD30、CD40、程式性死亡-1(PD-1)、可誘導性T細胞共刺激分子(ICOS)、淋巴細胞功能相關抗原-1(LFA-1，CD1-1a/CD18)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD247、CD276(B7-H3)、LIGHT、(TNFSF14)、NKG2C、Igα(CD79a)、DAP-10、Fcγ受體、第I類MHC分子、TNF受體蛋白、免疫球蛋白蛋白質、細胞因數受體、整合素、信號傳導淋巴細胞活化分子(SLAM蛋白)、活化NK細胞受體、BTLA、Toll配體受體、ICAM-1、B7-H3、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD1 1d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD1 1a、LFA-1、ITGAM、CD1 1b、ITGAX、CD1 1c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRT AM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、 SLP-76、PAG/Cbp、CD19a、特異性結合CD83之配體或彼等之任何組合。
於一較佳之實施態樣中，該CAR之胞內/胞質結構域可經設計成本身包含CD3ζ結構域或與任何其他在本發明之CAR的背景下有用的理想胞內結構域組合。例如，該CAR之胞內結構域可包含CD3ζ鏈部分及共刺激信號傳導分子之一部分。本發明之CAR的胞內信號傳導部分內之胞內信號傳導序列可以隨機或具體指定之順序彼此連接。
於另一較佳之實施態樣中，該胞內結構域係經設計成包含CD3ζ之活化結構域和CD28之信號傳導結構域。於另一實施態樣中，該胞內結構域係經設計成包含CD3ζ之活化結構域和4-1BB之信號傳導結構域。於另一實施態樣中，該CAR中之胞內結構域係經設計成包含CD28和CD3ζ之一部分，其中該胞內CD28包含SEQ ID NO.7所闡明之核酸序列及SEQ ID NO.8所闡明之胺基酸序列。該CD3ζ核酸序列闡明於SEQ ID NO.9中且該胺基酸序列闡明於SEQ ID NO.8中。
應理解的是，根據本發明之CAR的一種較佳取向包含抗原結合分子(例如scFv)，其係與胞外及/或鉸鏈結構域、共刺激結構域及活化結構域串列。應進一步理解的是，可將多個結構域串列使用。
於一些實施態樣中，提供包含啟動子(該啟動子係可操作地連接編碼抗原結合分子之第一多核苷 酸)、至少一個共刺激分子及活化結構域之經分離的核酸。於一些實施態樣中，該核酸構建體係包含在病毒載體內。於一些實施態樣中，該病毒載體係選自由下列所組成之群組：逆轉錄病毒載體、鼠白血病病毒載體、SFG載體、腺病毒載體、慢病毒載體、腺相關病毒(AAV)載體、皰疹病毒載體及牛痘病毒載體。於一些實施態樣中，該核酸係包含在質粒內。
於一些實施態樣中，該經工程處理之免疫細胞為T細胞、腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)、NK細胞、TCR表現細胞、樹突細胞或NK-T細胞。於一些實施態樣中，該細胞係從外周血取得或製備。於一些實施態樣中，該細胞係從外周血單核細胞(PBMC)取得或製備。於一些實施態樣中，該細胞係從骨髓取得或製備。於一些實施態樣中，該細胞係從臍帶血取得或製備。於一些實施態樣中，該細胞為人細胞。於一些實施態樣中，該細胞係使用選自由下列所組成之群組的方法藉由核酸載體轉染或轉導：電穿孔、超音波、生物彈射擊法(biolistic)(例如基因槍(Gene Gun))、脂質轉染、聚合物轉染、奈米顆粒或陽離子多聚物(polyplex)。
於一些實施態樣中，嵌合抗原受體係表現在包含本申請案之核酸的經工程處理之免疫細胞中。於一些實施態樣中，本申請案之這些嵌合抗原受體可包含(i)抗原結合分子(諸如scFv)，(ii)跨膜區，及(iii)T細胞活化分子或區域。
應進一步理解的是，本文中以語言“包含”描述之各種態樣亦提供以“由...組成”及/或“基本上由...組成”之術語描述之其他類似態樣。
此外，術語“約”或“基本上由...所組成”係指當由本技藝之一般技術人士測定時，該數值或組成係在該特定數值或組成之可接受的誤差範圍內，該可接受之誤差範圍將部分取決於該數值或組成是如何測量或測定的，即，該測量系統之限制。例如，“約”或“基本上由...所組成”可意指經由本技藝中之實踐在1個標準差之內或超過1個標準差。或者，“約”或“基本上由...所組成”可意指高達10%(即，±10%)之範圍。例如，約3mg可包括在2.7mg至3.3mg(為10%)之間的任何數目。此外，尤其是在生物系統或過程方面，該術語可意指高達一個數量級或高達數值之5倍。當在本申請案和申請專利範圍中提供特定數值或組成時，除非另外指明，“約”或“基本上由...所組成”之含義應假定為係在該特定值或組成之可接受的誤差範圍內。
抗原結合分子
抗原結合分子係在本發明之範圍內。如本文所使用之“抗原結合分子”係指結合具體指定之靶抗原的任何蛋白質。在本申請案中，該具體指定之靶抗原為CLL-1蛋白或其片段。抗原結合分子包括，但不限於抗體及其結合部分，諸如免疫功能片段。肽體(即，包含肽結合結構域之Fc融合分子)為合適之抗原結合分子的另一實例。
於某些實施態樣中，本發明針對包含下列者之抗原結合分子：
(a)重鏈可變區(VH)互補決定區(CDR)1，其包含胺基酸序列GX2X3X4X6X6X7X8X9(SEQ ID NO：134)，其中X2為G、F或Y；X3為S或T；X4為I、F或L；X5為S或T；X6不存在或為S；X7不存在或為G；X8不存在或為E或G；且X9為F、L或Y；
(b)重鏈可變區(VH)互補決定區(CDR)2，其包含胺基酸序列X1X2X3X4X5X6(SEQ ID NO：135)，其中X1為D、H、S或Y；X2為H、P或Y；X3為D、E或S；X4為D或G；X5為G或S；且X6不存在或為D或E；
(c)重鏈可變區(VH)互補決定區(CDR)3，其包含胺基酸序列X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12DY(SEQ ID NO：136)，其中X1為E或L；X2為R、S或V；X3為R或Y；X4為C、G或S；X6不存在或為G或I；X6不存在或為G；X7不存在或為D；X8不存在或為C；X9不存在或為W或Y；X10不存在或為P或S；X11不存在或為G或Y；且X12為F或R；
(d)輕鏈可變區(VL)CDR1，其包含胺基酸序列X1ASQX5X6X7X8X9LX11(SEQ ID NO：137)，其中X1為Q或R；X5為D或S；X6為I或V；X7為N或S；X8為N或S；X9為F、L或Y；且X11為N或T；
(e)輕鏈可變區(VL)CDR2，其包含胺基酸序列X1ASX4X5X6X7(SEQ ID NO：138)，其中X1為D或G；X4為N、S或T；X5為L或R；X6為A、E或K；且X7為S或T；及/ 或
(f)輕鏈可變區(VL)CDR3，其包含胺基酸序列QQX3X4X5X6PX8T(SEQ ID NO：139)，其中X3為S或Y；X4為D、G或Y；X5為N、S或T；X6為L、T或Y；且X8為F或I。
於一些實施態樣中，本發明關於抗原結合分子，其包含下列至少一者：(a)可變重鏈CDR1，其包含選自由下列所組成之群組的胺基酸序列：SEQ ID NO：17、51、73、95、5和97；(b)可變重鏈CDR2，其包含選自由下列所組成之群組的胺基酸序列：SEQ ID NO：18、52、74和96；(c)可變重鏈CDR3，其包含選自由下列所組成之群組的胺基酸序列：SEQ ID NO：19、53、75和97；(d)可變輕鏈CDR1，其包含選自由下列所組成之群組的胺基酸序列：SEQ ID NO：22、56、78和100：(e)可變輕鏈CDR2，其包含選自由下列所組成之群組的胺基酸序列：SEQ ID NO：23、57、79和101：(f)可變輕鏈CDR3，其包含選自由下列所組成之群組的胺基酸序列：SEQ ID NO：24、58、80和102。
於其他實施態樣中，本發明關於包含下列至少一者之抗原結合分子(及包含這些分子之嵌合抗原受體)：(a)包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列的VH區及包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列的VL區；(b)包含SEQ ID NO：50之胺基酸序列的VH區及包含SEQ ID NO：55之胺基酸序列的VL區；(c)包含SEQ ID NO：72之胺基酸序列 的VH區及包含SEQ ID NO：77之胺基酸序列的VL區；(d)包含SEQ ID NO：94之胺基酸序列的VH區及包含SEQ ID NO：99之胺基酸序列的VL區；且其中該VH和VL區係藉由至少一個連接子連接。於其他實施態樣中，本發明關於其中該連接子包含SEQ ID NO.130和SEQ ID NO.132至少一者之抗原結合分子(及包含這些分子之嵌合抗原受體)。
於進一步之實施態樣中，本發明關於包含可變輕(VL)鏈CDR3之抗原結合分子，該可變輕(VL)鏈CDR3包含選自由下列所組成之群組的胺基酸序列：SEQ ID NO：24、58、80和102。
於其他實施態樣中，本發明關於編碼特異性結合CLL-1之抗原結合分子的經分離之多核苷酸，其中該抗原結合分子重鏈包含CDR1(SEQ ID NO.17)、CDR2(SEQ ID NO.18)和CDR3(SEQ ID NO.19)，而該抗原結合分子輕鏈包含CDR1(SEQ ID NO.22)、CDR2(SEQ ID NO.23)和CDR3(SEQ ID NO 24)。
於其他實施態樣中，本發明關於特異性結合CLL-1之抗原結合分子，其中該抗原結合分子重鏈包含CDR1(SEQ ID NO.51)、CDR2(SEQ ID NO.52)和CDR3(SEQ ID NO.53)，而該抗原結合分子輕鏈包含CDR1(SEQ ID NO.56)、CDR2(SEQ ID NO.57)和CDR3(SEQ ID NO.58)。
於其他實施態樣中，本發明關於特異性結合CLL-1之抗原結合分子，其中該抗原結合分子重鏈包含CDR1(SEQ ID NO.73)、CDR2(SEQ ID NO.74)和CDR3(SEQ ID NO.75)，而該抗原結合分子輕鏈包含CDR1(SEQ ID NO.78)、CDR2(SEQ ID NO.79)和CDR3(SEQ ID NO.80)。
於其他實施態樣中，本發明關於編碼特異性結合CLL-1之抗原結合分子的經分離之多核苷酸，其中該抗原結合分子重鏈包含(SEQ ID NO.95)、CDR2(SEQ ID NO.96)和CDR3(SEQ ID NO.97)，而該抗原結合分子輕鏈包含CDR1(SEQ ID NO.100)、CDR2(SEQ ID NO.101)和CDR3(SEQ ID NO.102)。
於某些實施態樣中，本發明針對編碼抗CLL-1抗原結合分子之經分離的多核苷酸，該抗CLL-1抗原結合分子與由該多核苷酸所編碼之本文所描述的一或多種抗體或其抗原結合分子交叉競爭。於一實施態樣中，本發明針對編碼抗CLL-1抗原結合分子之經分離的多核苷酸，該抗CLL-1抗原結合分子與本文所描述之一或多種抗原結合分子結合至相同之抗原決定部位。
於一些實施態樣中，該抗原結合分子與腫瘤細胞上之抗原結合。於一些實施態樣中，該抗原結合分子與涉及過度增殖性疾病之細胞上的抗原或病毒抗原或細菌抗原結合。於進一步之實施態樣中，該抗原結合分子為抗體或其片段，包括其一或多個互補決定區(CDR)。於進一步之實施態樣中，該抗原結合分子為單鏈可變片段(scFv)。
術語抗原結合分子之“免疫功能片段”(或“片段”)為包含抗體之一部分(不論該部分是如何獲得或合成)的抗原結合分子物種，其缺少至少一些存在於全長鏈中之 胺基酸，但其仍能特異性結合抗原。該等片段為生物活性的，因為它們能與靶抗原結合且可與其他抗原結合分子(包括完整的抗體)競爭與指定之抗原決定部位結合。於一些實施態樣中，該片段為中和片段。於一些實施態樣中，該片段可阻斷或降低CLL-1之活性。於一態樣中，該等片段將保留至少一個存在於全長輕鏈或重鏈中之CDR，且於一些實施態樣中將包含單一重鏈及/或輕鏈或其部分。這些片段可藉由重組DNA技術製造，或可藉由酶催化或化學裂解抗原結合分子(包括完整之抗體)來製造。
免疫功能性免疫球蛋白片段包括，但不限於scFv片段、Fab片段(Fab’，F(ab’)2，等)、一或多個CDR、雙功能抗體(重鏈可變結構域與輕鏈可變結構域在相同之多肽上，經由因太短而無法允許在相同鏈上的二個結構域之間形成配對的短肽連接子連接)、結構域抗體及單鏈抗體。這些片段可源自任何哺乳動物來源，包括，但不限於人、小鼠、大鼠、駱駝或兔。如本技藝之技術人員所理解的，抗原結合分子可包括非蛋白質組分。
抗原結合分子之變體亦在本發明之範圍內，例如各自與本發明所描述之序列的胺基酸序列具有至少70至80%、80至85%、85至90%、90至95%、95至97%、97至99%、或99%以上之同一性的可變輕鏈及/或可變重鏈。於一些情況下，該等分子包括至少一個重鏈和一個輕鏈，然而於其他情況中，該變體形式含有二條完全相同之輕鏈和二條完全相同之重鏈(或彼等之子部件)。本技藝之技術熟 習人士將能夠使用為人周知之技術決定如本發明所提出之抗原結合分子之合適變體。於某些實施態樣中，本技藝之技術熟習人士可鑑別該分子之可被改變的合適區域，該合適區域可藉由靶向被認為對活性不重要之區域而在不破壞活性之情況下被改變。
於某些實施態樣中，該抗原結合分子之多肽結構係分別基於包括，但不限於下列群組之抗體：單株抗體、雙特異性抗體、微型抗體、結構域抗體、合成抗體(本文中有時稱為“抗體模擬物”)、嵌合抗體、人化抗體、人抗體、抗體融合物(本文中有時稱為“抗體軛合物”)及彼等之片段。於一些實施態樣中，該抗原結合分子包含avimer或由avimer所組成。
於一些實施態樣中，針對CLL-1之抗原結合分子係以CAR、TCR或其他免疫細胞之一部分的形式投予。於該等免疫細胞中，該針對CLL-1之抗原結合分子可在同一啟動子區之控制下或受分別之啟動子控制。於某些實施態樣中，該編碼針對CLL-1之蛋白劑及/或抗原結合分子之基因可在分別之載體中。
本發明進一步提供包含針對CLL-1之抗原結合分子和醫藥上可接受之稀釋劑、載體、增溶劑、乳化劑、防腐劑及/或佐劑的醫藥組成物。於某些實施態樣中，醫藥組成物將包括一個以上之針對CLL-1的不同抗原結合分子。於某些實施態樣中，醫藥組成物將包括一個以上之針對CLL-1的抗原結合分子，其中該針對CLL-1之抗 原結合分子與一個以上之抗原決定部位結合。於一些實施態樣中，不同抗原結合分子將不會彼此競爭與CLL-1結合。
於其他實施態樣中，該醫藥組成物可經選擇以用於經由腸胃道外投遞、用於吸入、或用於通過消化道投遞(諸如口服)。製備該等醫藥上可接受之組成物之製備方法係在本技藝之技術熟習人士的能力範圍內。於某些實施態樣中，緩衝劑係用於將該組成物維持在生理pH或稍低之pH值，通常係在約5至約8之pH範圍內。於某些實施態樣中，當考慮經由腸胃道外投予時，該治療組成物可為無熱原、腸胃道外可接受之水溶液形式，其包含在醫藥上可接受之載劑中的針對CLL-1之理想的抗原結合分子且具有或不具有另外之治療劑。於某些實施態樣中，該用於腸胃道外注射之載劑為無菌蒸餾水，其中該針對CLL-1之抗原結合分子(具有或不具有至少一種額外之治療劑)係調配成經適當保存之無菌的等張溶液。於某些實施態樣中，該製備方法可能涉及調製所需分子與能夠控制或持續釋出產品之聚合性化合物(諸如聚乳酸或聚乙醇酸)、小珠或脂質體，然後該產品可經由注射投遞。於某些實施態樣中，可植入之藥物投遞裝置可用來引入所需分子。
於一些實施態樣中，該抗原結合分子係用來作為診斷或驗證工具。該抗原結合分子可用於分析存在於樣品及/或個體中之CLL-1的量。於一些實施態樣中，該診斷性抗原結合分子未中和。於一些實施態樣中，本發明所 揭示之抗原結合分子係用於或提供在用於檢測哺乳動物組織或細胞中之CLL-1的分析套組及/或方法中以篩檢/診斷與CLL-1之量的變化有關的疾病或病症。該套組列包含與CLL-1結合之抗原結合分子，連同用於指示該抗原結合分子與CLL-1結合(若出現的話)，及可選擇地，CLL-1蛋白之水準的裝置。
鑑於下文中之定義和描述將可進一步理解該抗原結合分子。
“Fc”區包含二個含有抗體之CH1和CH2結構域的重鏈片段。該二個重鏈片段係藉由二或更多個二硫鍵及該CH3結構域之疏水性交互作用而保持在一起。
“Fab片段”包含一個輕鏈及一個重鏈之CH1和可變區。該Fab分子之重鏈不能與另一重鏈分子形成二硫鍵。“Fab’”片段包含一個輕鏈及一個重鏈的一部分，該重鏈部分包含該VH結構域和CH1結構域，還有介於CH1與CH2結構域之間的區域，從而使該二個Fab’片段的二個重鏈之間可形成鏈間二硫鍵以形成F(ab’)2分子。“F(ab’)2片段”含有二個輕鏈和二個重鏈，該重鏈含有介於CH1與CH2結構域之間的恆定區之一部分，從而使該二個重鏈之間形成鏈間二硫鍵。因此，F(ab’)2片段係由二個Fab’片段所組成，該二個Fab’片段係藉由介於二個重鏈之間的二硫鍵保持在一起。
“Fv區”包含來自重鏈和輕鏈二者之可變區，但缺乏恆定區。
“單鏈可變片段”(“scFv”，亦稱為“單鏈抗體”)係指其中該重鏈和輕鏈可變區已藉由彈性連接子連接以形成單一多肽鏈之Fv分子，該形成之單一多肽鏈可形成抗原結合區。參見PCT申請案WO88/01649和美國專利案第4,946,778和5,260,203號(其全部揭示內容以引用方式併入本文)。
“二價抗原結合分子”包含二個抗原結合位點。在一些情況下，該二個結合位點具有相同之抗原特異性。二價抗原結合分子可為雙特異性。“多特異性抗原結合分子”為靶向一個以上之抗原或抗原決定部位的抗原結合分子。“雙特異性”、“雙重特異性”或“雙功能”抗原結合分子分別為具有二個不同抗原結合部位之混合的抗原結合分子或抗體。雙特異性抗原結合分子的二個結合位點將與二個不同抗原決定部位結合，而該二個不同抗原決定部位可位在相同或不同之蛋白質靶的上。
當該解離常數(Kd)為~1×10-7M時，抗原結合分子被稱為“特異性結合”其靶抗原。當該Kd為1至5×10-9M時，該抗原結合分子係以“高親和力”特異性結合抗原，且當該Kd為1至5×10-10M時，該抗原結合分子係以“非常高之親和力”特異性結合抗原。於一實施態樣中，該抗原結合分子之Kd為10-9M。於一實施態樣中，該解離速率<1×10-5。於其他實施態樣中，該抗原結合分子將以介於約10-7M至10-13M之間的Kd與人CLL-1結合，且於另一實施態樣中，該抗原結合分子將以1.0至5×10-10M之Kd與人CLL-1結合。
於一些實施態樣中，本發明之抗體或抗原結合分子特異性結合CLL-1(例如hCLL-1)。於某些實施態樣中，本發明之抗CLL-1抗體或抗原結合分子以小於1×10-6M、小於1×10-7M、小於1×10-8M或小於1×10-9M之KD與人CLL-1結合。於一特定之實施態樣中，該抗CLL-1抗體或抗原結合分子以小於1×10-7M之KD與人CLL-1結合。於另一實施態樣中，該抗CLL-1抗體或抗原結合分子以小於1×10-8M之KD與人CLL-1結合。於一些實施態樣中，該抗CLL-1抗體或抗原結合分子以約1×10-7M、約2×10-7M、約3×10-7M、約4×10-7M、約5×10-7M、約6×10-7M、約7×10-7M、約8×10-7M、約9×10-7M、約1×10-8M、約2×10-8M、約3×10-8M、約4×10-8M、約5×10-8M、約6×10-8M、約7×10-8M、約8×10-8M、約9×10-8M、約1×10-9M、約2×10-9M、約3×10-9M、約4×10-9M、約5×10-9M、約6×10-9M、約7×10-9M、約8×10-9M、約9×10-9M、約1×10-10M或約5×10-10M之KD與人CLL-1結合。於某些實施態樣中，該KD係從koff/kon之商數計算得到，且kon和koff係使用單價抗體(諸如Fab片段)，藉由，例如BIAcore®表面等離子共振技術測量來確定。於其他實施態樣中，該KD係從koff/kon之商數計算得到，且kon和koff係使用二價抗體(諸如Fab片段)，藉由，例如BIAcore®表面等離子共振技術測量來確定。
於其他實施態樣中，該抗CLL-1抗體或抗原結合分子以小於1×10-9M、小於3×10-9M、小於5×10-9M、小於1×10-10M、小於3×10-10M或小於5×10-10M之KD與人 CLL-1結合。於其他實施態樣中，該抗CLL-1抗體或抗原結合分子以小於1×10-5M、小於1×10-6M、小於1×10-7M、小於1×10-8M、小於1×10-9M或小於1×10-10M之KD與食蟹猴CLL-1-Fc結合。
於一些實施態樣中，該抗CLL-1抗體或抗原結合分子以小於1×10-4M-1s-1、小於2×10-4M-1s-1、小於3×10-4M-1s-1、小於4×10-4M-1s-1、小於5×10-4M-1s-1、小於6×10-4M-1s-1、小於7×10-4M-1s-1、小於8×10-4M-1s-1、小於9×10-4M-1s-1、小於1×10-5M-1s-1、小於2×10-5M-1s-1、小於3×10-5M-1s-1、小於4×10-5M-1s-1、小於5×10-5M-1s-1、小於6×10-5M-1s-1、小於7×10-5M-1s-1、小於8×10-5M-1s-1、小於9×10-5M-1s-1、小於1×10-6M-1s-1、小於2×10-6M-1s-1、小於3×10-6M-1s-1、小於4×10-6M-1s-1、小於5×10-6M-1s-1、小於6×10-6M-1s-1、小於7×10-6M-1s-1、小於8×10-6M-1s-1、小於9×10-6M-1s-1或小於1×10-7M-1s-1之結合速率(kon)與人CLL-1結合。於某些實施態樣中，該kon係使用單價抗體(諸如Fab片段)，藉由，例如BIAcore®表面等離子共振技術測量來確定。於其他實施態樣中，該kon係使用二價抗體，藉由，例如BIAcore®表面等離子共振技術測量來確定。
於一些實施態樣中，該抗CLL-1抗體或抗原結合分子以小於1×10-2s-1、小於2×10-2s-1、小於3×10-2s-1、小於4×10-2s-1、小於5×10-2s-1、小於6×10-2s-1、小於7×10-2s-1、小於8×10-2s-1、小於9×10-2s-1、小於1×10-3s-1、小於2×10-3s-1、小於3×10-3s-1、小於4×10-3s-1、小於5×10-3s-1、小於6×10-3s-1、 小於7×10-3s-1、小於8×10-3s-1、小於9×10-3s-1、小於1×10-4s-1、小於2×10-4s-1、小於3×10-4s-1、小於4×10-4s-1、小於5×10-4s-1、小於6×10-4s-1、小於7×10-4s-1、小於8×10-4s-1、小於9×10-4s-1、小於1×10-4s-1或小於5×10-4s-1之解離速率(koff)與人CLL-1結合。於某些實施態樣中，該koff係使用單價抗體(諸如Fab片段)，藉由，例如BIAcore®表面等離子共振技術測量來確定。於其他實施態樣中，該koff係使用二價抗體，藉由，例如BIAcore®表面等離子共振技術測量來確定。
當抗原結合分子與一個靶的之結合較其與第二靶的之結合更緊密時，該抗原結合分子被稱為是“選擇性的”。
術語“抗體”係指任何同種型之完整免疫球蛋白，或該完整抗體之可與其競爭特異性結合靶抗原的片段，包括，例如嵌合抗體、人化抗體、全人及雙特異性抗體。“抗體”為如本文所定義之抗原結合分子物種。完整抗體一般將包含至少二個全長重鏈和二個全長輕鏈，但在一些情況下可包含較少的鏈，諸如天然存在於駱駝科動物之抗體，其可僅包含重鏈。抗體可僅源自單一來源，或可為嵌合抗體，即，該抗體之不同部分可源自二種不同的抗體(如下文所進一步描述者)。該抗原結合分子、抗體或結合片段可藉由重組DNA技術在雜交瘤中產生或藉由酶催化或化學裂解完整抗體來產生。除非另外指明，除了包含二個全長重鏈和二個全長輕鏈之抗體外，術語“抗體”包括其衍生物、變體、片段及突變蛋白，其實例描述於下文中。此 外，除非明確排除，抗體包括單株抗體、雙特異性抗體、微型抗體、結構域抗體、合成抗體(本文中有時稱為“抗體模擬物”)、嵌合抗體、人化抗體、人抗體，抗體融合物(本文中有時稱為“抗體軛合物”)及彼等之各別片段。
該可變區通常顯示出藉由3個高度可變區(即，“CDR”)接合之被相當保留的框架區(FR)的相同一般結構。該來自每一對的二條鏈之CDR通常藉由框架區對準，如此可促成與特定抗原決定部位結合。輕鏈和重鏈二者之可變區從N端至C端通常包含結構域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。按照慣例，重鏈中之CDR區通常被稱為HC CDR1、CDR2和CDR3。輕鏈中之CDR區通常被稱為LC CDR1、CDR2和CDR3。分配在各個結構域之胺基酸通常係根據Kabat、Chothia定義或AbM定義。
術語“Kabat編號”及類似術語為本技藝所認可且係指抗體或其抗原結合部分之重鏈和輕鏈可變區中之胺基酸殘基編號系統。於某些態樣中，抗體之CDR可根據Kabat編號系統測定(參見，例如Kabat EA&Wu TT(1971)Ann NY Acad Sci 190：382-391及Kabat EA et al.,(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication No.91-3242)。使用Kabat編號系統，抗體重鏈分子內之CDR通常存在於胺基酸位置31至35(其在35之後可選擇性地包括一或二個額外之胺基酸， 在Kabat編號方案中稱為35A和35B)(CDR1)、胺基酸位置50至65(CDR2)及胺基酸位置95至102(CDR3)。使用該Kabat編號系統，抗體輕鏈分子內之CDR通常出現在胺基酸位置24至34(CDR1)、胺基酸位置50至56(CDR2)及胺基酸位置89至97(CDR3)。於一特定之實施態樣中，本發明所描述之抗體的CDR已根據Kabat編號方案決定。
於某些態樣中，抗體之CDR可根據Chothia編號方案決定，其係指該免疫球蛋白結構環之位置(參見，例如Chothia C&Lesk AM,(1987),J Mol Biol 196：901-917；Al-Lazikani B et al.,(1997)J Mol Biol 273：927-948；Chothia C et al.,(1992)J Mol Biol 227：799-817；Tramontano A et al.,(1990)J Mol Biol 215(1)：175-82：及美國專利案第7,709,226號)。通常，當使用Kabat編號規則時，該Chothia CDR-H1環存在於重鏈胺基酸26至32、33或34，該Chothia CDR-H2環存在於重鏈胺基酸52至56，且該Chothia CDR-H3環存在於重鏈胺基酸95至102，而Chothia CDR-L1環存在於輕鏈胺基酸24至34，該Chothia CDR-L2環存在於輕鏈胺基酸50至56，且該Chothia CDR-L3環存在於輕鏈胺基酸89至97。當使用Kabat編號規則編號時，該Chothia CDR-HI環之終端根據環之長度而在H32與H34之間變化(這是因為Kabat編號方案將插入子放在H35A及H35B；若35A和35B都不存在，則該環結束於32；若僅有35A存在，則該環結束於33；若35A和35B均存在，則該環結束於34)。
於一具體之實施態樣中，本發明所描述之抗體的CDR已根據Chothia編號方案決定。
常用之CDR的定義有多種：Kabat編號、Chothia編號、AbM編號或接觸編號。AbM定義為Oxford Molecular AbM抗體建模軟體所使用的二種定義之間的折衷。接觸定義係基於對可用之複合物晶體結構之分析。
Figure 112101087-A0101-12-0055-17
如本文所使用者，當相關於抗體使用時，術語“重鏈”基於該恆定結構域之胺基酸序列可指任一不同類型，例如α、δ、ε、γ及μ，其分別導致抗體之IgA、IgD、IgE、IgG和IgM類別，包括IgG之子類別，例如IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。
如本文所使用者，當相關於抗體使用時，術語“輕鏈”基於恆定結構域之胺基酸序列可指任一不同類型，例如κ或λ。輕鏈胺基酸序列為本技藝所周知。於具體 之實施態樣中，該輕鏈為人輕鏈。
術語“可變區”或“可變結構域”係指抗體之輕鏈或重鏈之一部分，通常包括在重鏈之胺基端約120到130個胺基酸及輕鏈之胺基端約100至110個胺基酸。抗體之可變區通常決定特定抗體對其靶的之特異性。
可變性並非均勻分佈於抗體或抗原結合分子之整個可變結構域；其集中於各重鏈和輕鏈可變區之子結構域。這些子結構域被稱為“高度可變區”或“互補決定區”(CDR)(如本文將進一步描述者)。該可變結構域中較被保留(即，非高度可變的)之部分稱為框架區(FRM或FR)且提供該六個CDR在三維空間中之支架以形成抗原結合表面。天然存在之重鏈和輕鏈的可變結構域各包含四個主要採取β折疊構型之FRM區(FR1、FR2、FR3及FR4)，該四個FRM區係藉由三個形成環連接之高度可變區連接，且在一些情況下該三個高度可變區形成該β折疊結構之一部分。在每條鏈中之高度可變區係藉由FRM保持非常接近，且藉著來自另一條鏈之高度可變區而促成抗原結合位點之形成(參見Kabat，等人，將進一步描述於本文中)。
通常，CDR形成可被歸類為典型結構之環結構。術語“典型結構”係指該抗原結合(CDR)環所採用之主鏈構形。從比較性結構研究，現已發現該6個抗原結合環中有5個僅具有有限之可用構形庫。各典型結構可藉由該多肽主鏈之扭轉角來表徵。因此，抗體之間之對應環可能具有非常相似之三維結構，儘管該環之大多數部分的胺基 酸序列具有高可變性(Chothia and Lesk,J.MoI.Biol.,1987,196：901；Chothia et al.,Nature,1989,342：877；Martin and Thornton,J.Mol.Biol,1996,263：800)。此外，所採用之環結構和包圍它的胺基酸序列之間有關係。特定之典型類別的構型係由該環的長度和位於該環內及該保留之框架內(即，環的外側)之關鍵位置的胺基酸殘基決定。因此，對特定典型類別之劃分可基於是否存有這些關鍵胺基酸殘基來進行。
術語“典型結構”亦可包括關於該抗體之線性序列的考量，例如由Kabat(Kabat et al.，本文)所編目者。Kabat編號方案(系統)為廣泛採用之以一致方式將抗體可變結構域之胺基酸殘基編號的標準且為應用在本發明之較佳方案(如本文他處亦提及者)。另外之結構考量亦可用於決定抗體之典型結構。例如，那些未由Kabat編號完全反映之差異可藉由Chothia等人之編號系統描述及/或藉由其他技術，例如晶體學及二維或三維計算建模揭露。因此，可將指定之抗體序列置於典型類別，除其他用途外，此可允許鑑別適當之框架序列(例如根據所欲在集合庫中包括各種典型結構)。抗體胺基酸序列的Kabat編號和Chothia等人描述之結構考量(本文)及其對分析抗體結構之典型態樣的影響描述於文獻中。不同類別之免疫球蛋白的次單位結構和三維構型為本技藝所熟知。對於抗體結構之綜述，參見Antibodies：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,eds.Harlow et al.,1988。
輕鏈之CDR3，尤其是，重鏈之CDR3可構成輕鏈和重鏈可變區之內在抗原結合中最重要的決定簇。於一些抗體構建體中，該重鏈CDR3顯示出構成該抗原與該抗體之間接觸的主要區域。其中僅單獨改變CDR3之體外選擇方案可用來改變抗體之結合性質或決定哪些殘基對抗原結合作出貢獻。因此，CDR3通常為抗體結合位點內之分子多樣性的最大來源。例如，H3可短如二個胺基酸殘基或超過26個胺基酸。
如本文所使用之術語“恆定區”和“恆定結構域”可互換且具有本技藝中常用之含義。該恆定區為一抗體部分(例如輕鏈及/或重鏈之羧基端部分)，其不直接參與抗體與抗原結合，但可顯示出各種不同之效應子功能(諸如與Fc受體交互作用)。相對於免疫球蛋白可變結構域，免疫球蛋白分子之恆定區通常具有較被保留之胺基酸序列。
“結合親和力”一般係指介於分子(例如抗體)之單一結合位點與其結合伴侶(例如抗原)之間的非共價交互作用之總和強度。除非另外指明，如本文所使用之“結合親和力”係指內在結合親和力，其反映結合對之成員(例如抗體和抗原)之間的1：1交互作用。分子X對其伴侶Y之親和力通常可由解離常數(KD)表示。親和力可以本技藝已知之多種方式測量及/或表現，包括，但不限於平衡解離常數(KD)及平衡結合常數(KA)。KD係從koff/kon之商數計算得到，而KA係從kon/koff之商數計算得到。kon係指，例如抗 體與抗原之結合速率常數，而koff係指，例如抗體與抗原之解離速率常數。該kon和koff可藉由本技藝之一般技術人士已知之技術(諸如BIAcore®或KinExA)測定。
術語“中和”係分別指抗原結合分子、scFv、抗體或其片段結合配體並防止或降低該配體之生物學效果。此可，例如藉由直接阻斷該配體上之結合位點或透過間接方式(諸如改變配體之結構或能量)改變配體之結合能力來完成。於一些實施態樣中，該術語亦可表示抗原結合分子防止與其結合之蛋白質執行生物功能。
術語“靶的”或“抗原”係指能與抗原結合分子結合之分子或分子的一部分。於某些實施態樣中，靶的可具有一或多個抗原決定部位。
當用於抗原結合分子競爭同一抗原決定部位之背景下，術語“競爭”意指當藉由其中該測試之抗原結合分子(例如抗體或其免疫功能片段)防止或抑制(例如減少)參考之抗原結合分子與抗原特異性結合的分析測定時，抗原結合分子之間的競爭。許多類型之競爭性結合分析可用於測定一個抗原結合分子是否與另一抗原結合分子競爭，例如：固相直接或間接放射免疫分析(RIA)、固相直接或間接酶免疫分析(EIA)、夾心競爭分析(Stahli et al.,1983,Methods in Enzymology 9：242-253)；固相直接生物素-親和素EIA(Kirkland et al.,1986,J.Immunol.137：3614-3619)、固相直接標記之分析、固相直接標記之夾心分析(Harlow and Lane,1988,Antibodies,A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press)；使用1-125標記之固相直接標記RIA(Morel et al.,1988,Molec.Immunol.25：7-15)；固相直接生物素-親和素EIA(Cheung,et al.,1990,Virology 176：546-552)；及直接標記之RIA(Moldenhauer et al.,1990,Scand.J.Immunol.32：77-82)。
如本文所用之術語“抗原決定部位”係指可與抗體特異性結合之抗原的局部區域。抗原決定部位可為，例如多肽之連續胺基酸(線性或連續抗原決定部位)或者抗原決定部位可，例如從多肽之二或更多個非連續區域集合在一起(構象的、非線性、不連續或非連續之抗原決定部位)。於某些實施態樣中，與抗體結合之抗原決定部位可藉由，例如NMR光譜法、X射線衍射結晶學研究、ELISA分析、與質譜分析(例如液相色層分析法、電噴霧質譜分析)聯用之氫/氘交換、基於陣列之寡肽掃描分析及/或誘變映射(例如定點誘變映射)。在X射線晶體學方面，結晶化可使用本技藝任何已知之方法完成(例如Giegé R et al.,(1994)Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 50(Pt 4)：339-350；McPhersonA(1990)Eur J Biochem 189：1-23；Chayen NE(1997)Structure 5：1269-1274；McPherson A(1976)J Biol Chem 251：6300-6303)。抗體：抗原晶體可使用為人周知之X射線衍射技術進行研究並可使用電腦軟體精修，諸如使用X-PLOR(Yale University,1992,distributed by Molecular Simulations,Inc.；Meth Enzymol(1985),114& 115冊，eds Wyckoff HW et al.,；U.S.2004/0014194)及 BUSTER(Bricogne G(1993)Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 49(Pt 1)：37-60；Bricogne G(1997)Meth Enzymol 276A：361-423,ed Carter CW；Roversi P et al.,(2000)Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 56(Pt 10)：1316-1323)。誘變映射研究可使用本技藝之技術熟習人士已知之任何方法完成。參見，例如Champe M et al.,(1995)J Biol Chem 270：1388-1394 and Cunningham BC&Wells JA(1989)Science 244：1081-1085之關於誘變技術之描述，包括丙胺酸掃描誘變技術。
如本文所使用之術語“標籤”或“經標記的”係指併入可檢測之標記物，例如併入經放射標記之胺基酸或連接可藉由經標記之抗生物素蛋白(例如含有螢光標記之鏈親和素或可藉由光學或比色方法檢測之酶催化活性)檢測之生物素部分的多肽。於某些實施態樣中，該標籤或標記物亦可為治療性的。本技藝中已知多種不同之標記多肽和糖蛋白之方法並可使用這些方法。
治療方法
使用過繼性免疫治療，天然T細胞可(i)從患者中取出，(ii)經遺傳工程處理以表現與至少一種腫瘤抗原結合之嵌合抗原受體(CAR)(iii)在體外擴增成較大之經工程處理的T細胞群，及(iv)重新導入患者體內。參見，例如美國專利案第7,741,465和6,319,494號，Eshhar et al.(Cancer Immunol，同上)；Krause et al.(同上)；Finney et al.(同上)。經工程處理之T細胞被重新導入患者體內後，它們介導針對表現該腫瘤抗原之細胞的免疫反應。參見，例如Krause et al.,J.Exp.Med.,Volume 188,No.4,1998(619-626)。此種免疫反應包括由T細胞分泌IL-2和其他細胞因數、選殖擴增識別該腫瘤抗原之T細胞及由T細胞介導特異性滅殺靶的陽性細胞。參見Hombach et al.,Journal of Immun.167：6123-6131(2001)。
如本文所使用之術語“淋巴細胞”包括天然殺手(NK)細胞、T細胞或B細胞。NK細胞為代表固有免疫系統之主要組分之細胞毒性(cytotoxic)(細胞毒性(cell toxic))淋巴細胞類型。NK細胞排斥腫瘤及被病毒感染之細胞。其係透過細胞凋亡或程式性細胞死亡之過程作用。由於其不需要活化以殺死細胞，因而被稱為“天然殺手”。T細胞在由細胞介導之免疫(無抗體參與)中具主要作用。其T細胞受體(TCR)區分其自身與其他淋巴細胞類型。胸腺(免疫系統之專門器官)主要負責T細胞之熟化。T細胞之類型有六種，即：輔助性T細胞(例如CD4+細胞)、細胞毒性T細胞(亦稱為TC、細胞毒性T淋巴細胞、CTL、T殺手細胞、溶細胞性T細胞、CD8+T細胞或殺手T細胞)、記憶T細胞((i)幹細胞樣記憶TSCM細胞(如初始細胞)為CD45RO-、CCR7+、CD45RA+、CD62L+(L-選擇素)、CD27+、CD28+及IL-7Rα+，但其亦表現大量CD95、IL-2Rβ、CXCR3及LFA-1，並顯示許多記憶細胞獨特之功能屬性)；(ii)中央記憶TCM細胞表現L-選擇素及CCR7，其分泌IL-2，但不分 泌IFNγ或IL-4，及(iii)效應記憶TEM細胞，然而，其不表現L-選擇素或CCR7，但產生效應細胞因數，像IFNγ及IL-4)、調節性T細胞(Treg、抑制性T細胞或CD4+CD25+調節性T細胞)、天然殺手T細胞(NKT)及γδT細胞。另一方面，B細胞在體液免疫中具有主要作用(有抗體參與)。其製造抗體和抗原並執行抗原呈遞細胞(APC)之作用，且在藉由抗原交互作用活化後轉變成記憶B細胞。在哺乳動物中，未成熟之B細胞係在骨髓中形成，該處為B細胞名字之來源。
術語“經遺傳工程處理的”或“經工程處理的”係指修飾細胞之基因組的方法，包括，但不限於刪除編碼或非編碼區或其部分，或插入編碼區或其部分。於一些實施態樣中，該經修飾之細胞為淋巴細胞(例如T細胞)，其可從患者或供體取得。該細胞可經修飾以表現外源構建體，諸如，例如被併入細胞之基因組中之嵌合抗原受體(CAR)或T細胞受體(TCR)。
“免疫反應”係指免疫系統之細胞(例如T淋巴細胞、B淋巴細胞、天然殺手(NK)細胞、巨噬細胞、嗜酸性粒細胞、肥大細胞、樹突細胞及嗜中性粒細胞)及由這些細胞之任一者或肝臟製造可溶性大分子(包括Ab、細胞因數和補體)之作用，該作用導致選擇性靶向、結合、損害、破壞及/或排除脊椎動物體內之入侵病原體、被病原體感染之細胞或組織、癌細胞或其他異常細胞，或者在自體免疫或病理性發炎的情況下為正常之人細胞或組織。
術語“免疫療法”係指罹患或處於罹患疾病或 疾病復發之風險的個體之治療，該治療係藉由包含誘導、增強、抑制或以其他方式修飾免疫反應之方法進行。免疫療法之實例包括，但不限於T細胞療法。T細胞療法可包括過繼性T細胞療法、腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)免疫療法、自體細胞療法、經工程處理之自體細胞療法(eACT)及同種異體T細胞移植。然而，本技藝之技術熟習人士將認知本發明所揭示之調理方法將增強任何移植之T細胞療法之有效性。T細胞療法之實例描述於美國專利刊物第2014/0154228和2002/0006409號、美國專利案第5,728,388號及國際刊物第WO 2008/081035號中。
免疫療法之T細胞可來自本技藝已知之任何來源。例如T細胞可在體外從造血幹細胞群分化，或者可從個體取得T細胞。T細胞可從，例如外周血單核細胞(PBMC)、骨髓、淋巴結組織、臍帶血、胸腺組織、來自感染部位之組織、腹水、胸腔積液、脾臟組織及腫瘤取得。此外，T細胞可源自本技藝中可用之一或多個T細胞系。T細胞亦可使用本技藝之技術熟習人士已知之任何數目的技術(諸如FICOLLTM分離及/或血液成分分離術)從個體收集之血液單位取得。分離用於T細胞療法之T細胞的額外方法揭示於美國專利刊物第2013/0287748號(其全部內容以引用方式併入本文)中。
術語“經工程處理之自體細胞療法”(其可縮寫為“eACTTM”，亦稱為過繼細胞轉移)為收集患者自身之T細胞，隨後將其經遺傳工程處理改變成識別並靶向一或多 個表現在一或多個特定之腫瘤細胞或惡性腫瘤之細胞表面上的抗原之過程。T細胞可經工程處理以表現，例如嵌合抗原受體(CAR)或T細胞受體(TCR)CAR陽性(+)T細胞係經工程處理以表現對特定腫瘤抗原具特異性之胞外單鏈可變片段(scFv)，其連接包含至少一個共刺激結構域及至少一個活化結構域之胞內信號傳導部分。該共刺激結構域可源自(或對應於)例如CD28，而該活化結構域可源自(或對應於)例如CD3-ζ。於某些實施態樣中，該CAR係設計成具有二、三、四或更多個共刺激結構域。
術語“自體”係指源自與其稍後被重新引入之個體為同一個體的任何物質。例如，本發明所描述之經工程處理之自體細胞療法(eACTTM)之方法涉及從患者收集淋巴細胞，然後將其經工程處理以表現，例如CAR構建體，然後再投予回同一患者。
術語“同種異體”係指源自與其稍後被引入之個體為相同物種之另一個體的任何物質，例如同種異體T細胞移植。
因此，於一些態樣中，本發明包含用於治療或預防與患者之不欲有及/或升高之CLL-1水準相關的病症之方法，其包含對有需要之患者投予有效量之至少一種本發明所揭示之經分離的抗原結合分子、CAR或TCR。
提供用於治療疾病或病症(包括癌症)之方法。於一些實施態樣中，本發明關於在個體中創造由T細胞介導之免疫反應，其包含對個體投予有效量之本申請案 之經工程處理的免疫細胞。於一些實施態樣中，該由T細胞介導之免疫反應係針對靶細胞。於一些實施態樣中，該經工程處理之免疫細胞包含嵌合抗原受體(CAR)或T細胞受體(TCR)。於一些實施態樣中，該靶細胞為腫瘤細胞。於一些態樣中，本發明包含用於治療或預防惡性腫瘤之方法，該方法包含對有治療或預防惡性腫瘤需要之個體投予有效量之至少一種如本發明所描述之經分離的抗原結合分子。於一些態樣中，本發明包含用於治療或預防惡性腫瘤之方法，該方法包含對有治療或預防惡性腫瘤需要之個體投予有效量之至少一種免疫細胞，其中該免疫細胞包含至少一種如本發明所描述之嵌合抗原受體、T細胞受體及/或經分離的抗原結合分子。
供於一些態樣中，本發明包含醫藥組成物，該醫藥組成物包含至少一種本發明所描述之抗原結合分子及醫藥上可接受之賦形劑。於一些實施態樣中，該醫藥組成物進一步包含另外之活性劑。
供本發明之抗原結合分子、CAR、TCR、免疫細胞，等可用於治療骨髓疾病，包括，但不限於急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、慢性髓單核細胞白血病(CMML)、幼年型髓單核細胞白血病、非典型慢性骨髓性白血病、急性早幼粒細胞白血病(APL)、急性單核母細胞白血病、急性紅血球樣白血病、急性巨核母細胞白血病、骨髓增生異常症候群(MDS)、骨髓增殖性疾病、骨髓性腫瘤、骨髓性肉瘤、母細胞性漿細胞樣樹突細 胞腫瘤(BPDCN)或彼等之組合。另外之疾病包括炎性及/或自體免疫性疾病，諸如類風濕性關節炎、牛皮癬、過敏、哮喘、克隆氏症、IBD、IBS、纖維母細胞瘤、肥大細胞增多症及乳糜瀉。
供應理解的是，用於CAR+/CAR-T+/TCR+細胞之靶劑量的範圍可為1×106至2×1010細胞/kg，較佳為2×106細胞/kg。應理解的是，高於和低於此範圍之劑量可能適合某些個體，且適當之劑量水準可由提供醫療保健者根據需要測定。此外，根據本發明可提供多個細胞劑量。
供亦提供用於減少個體之腫瘤大小的方法，其包含對該個體投予本發明之經工程處理的細胞，其中該細胞包含與腫瘤上之抗原結合的嵌合抗原受體、T細胞受體或基於包含抗原結合分子之嵌合抗原受體的T細胞受體。於一些實施態樣中，該個體具有實體瘤或血液惡性腫瘤，諸如淋巴瘤或白血病。於一些實施態樣中，該經工程處理之細胞被投遞至腫瘤床。於一些實施態樣中，該癌症存在於個體之骨髓中。於一些實施態樣中，該經工程處理之細胞為自體T細胞。於一些實施態樣中，該經工程處理之細胞為同種異體T細胞。於一些實施態樣中，該經工程處理之細胞為異源T細胞。於一些實施態樣中，本申請案之經工程處理之細胞係在體內進行轉染或轉導。於其他實施態樣中，該經工程處理之細胞係在體外進行轉染或轉導。如本文所使用之術語“體外細胞”係指在體外培養之任何細胞。尤其是，體外細胞可包括T細胞。
該方法可進一步包含投予一或多種化療劑。於某些實施態樣中，該化療劑為淋巴細胞清除(預調節)化療劑。有利之預調節治療方案，連同相關之有利的生物標記描述於美國臨時專利申請案62/262,143和62/167,750中(其全部內容以引用方式併入本文)。這些文獻描述，例如調節需要T細胞療法之患者的方法，其包含對該患者投予具體指定之有益的環磷醯胺劑量(介於200mg/m2/天至2000mg/m2/天之間)及具體指定之氟達拉濱劑量(介於20mg/m2/天至900mg/m2/天之間)。較佳之劑量方案包含每日對患者投予約500mg/m2/天之環磷醯胺及約60mg/m2/天之氟達拉濱共三天，再對患者投予治療有效量之經工程處理之T細胞來治療患者。
於其他實施態樣中，該抗原結合分子、經轉導(或以其他方式經工程處理)之細胞(諸如CAR或TCR)及化療劑係各自以能有效治療該個體之疾病或病症的量投予。
於某些實施態樣中，該包含本發明所揭示之表現CAR之免疫效應細胞的組成物可與任何數目之化療劑一起投予。化療劑之實例包括烷化劑，諸如塞替派及環磷醯胺(CYTOXANTM)；烷基磺酸酯，諸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶類(aziridine)，諸如苯佐替派(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替派(meturedepa)和烏瑞替派(uredopa)；亞乙基亞胺類和甲基蜜胺類，包括六甲蜜胺(altretamine)、三亞乙基蜜胺、三亞乙基磷醯胺、三亞乙基硫代磷醯胺和 三輕甲蜜胺(trimethylolomelamine)；氮芥類，諸如苯丁酸氮芥、萘氮芥、環磷醯胺、雌氮芥、異環磷醯胺、雙氯乙基甲胺(mechlorethamine)、鹽酸氧化氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法崙、新氮芥(novembichin)、苯芥膽留醇(phenesterine)、潑尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亞硝基脲類(nitrosureas)，諸如卡莫司汀(carmustine)、吡葡亞硝脲(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)、雷莫司汀(ranimustine)；抗生素，諸如阿克拉黴素(aclacinomysin)、放線菌素、胺茴黴素(authramycin)、偶氮絲胺酸、博來黴素、放線菌素(cactinomycin)、卡奇黴素(calicheamicin)、卡拉比星、去甲柔紅黴素(carminomycin)、嗜癌黴素(carzinophilin)、色黴素(chromomycin)、更生黴素、柔紅黴素、地托比星(detorubicin)、6-二氮基-5-合氧基-L-正白胺酸、阿黴素、表阿黴素、依索比星、伊達比星(idarubicin)、麻西羅黴素(marcellomycin)、絲裂黴素(mitomycin)、黴酚酸、諾拉黴素(nogalamycin)、橄欖黴素(olivomycin)、培洛黴素(peplomycin)、泊非黴素(potfiromycin)、嘌呤黴素、三鐵阿黴素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、鏈黑菌素(streptonigrin)、鏈佐星(streptozocin)、殺結核菌素(tubercidin)、鳥苯美司(ubenimex)、淨司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代謝物，諸如甲胺蝶呤(methotrexate)和5-氟尿嘧啶(5-FU)；葉酸類似物，諸如二甲葉酸(denopterin)、甲胺蝶呤(methotrexate)、 蝶羅呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤類似物，諸如氟達拉濱(fludarabine)、6-巰基嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鳥嘌呤(thioguanine)；嘧啶類似物，諸如安西他濱(ancitabine)、阿紮胞苷(azacitidine)、6-氮雜尿苷(azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、雙脫氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依諾他濱(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)、5-FU；雄激素類，諸如卡魯睪酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、表硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睪內酯(testolactone)；抗腎上腺類，諸如胺魯米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；葉酸補充劑，諸如亞葉酸；醋葡醛內酯(aceglatone)；醛磷醯胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；胺基乙醯丙酸(aminolevulinic acid)；安吖啶(amsacrine)；曲布賽(bestrabucil)；蒽雙咪腙(bisantrene)；依達曲沙(edatraxate)；地磷胺(defofamine)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；依氟鳥胺酸(elformithine)；依利醋鞍(elliptinium acetate)；依託格魯(etoglucid)；硝酸鎵；羥基脲；香菇多醣(lentinan)；氯尼達明(lonidamine)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫呢達醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；噴司他汀(pentostatin)；蛋胺氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基醯肼(2-ethylhydrazide)；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK®；雷佐生(razoxane)；西佐喃 (sizofiran)；螺環鍺(spirogermanium)；細交鏈孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亞胺醌(triaziquone)；2,2’,2”-三氯三乙胺；胺基甲酸乙酯(urethan)；長春地辛(vindesine)；達卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴衛矛醇(mitolactol)；呱泊溴烷(pipobroman)；加西托辛(gacytosine)；阿拉伯糖苷(arabinoside)(“Ara-C”)；環磷醯胺；塞替派；類紫杉醇，例如太平洋紫杉醇(TAXOLTM，必治妥施貴寶公司)和多西紫杉醇(doxetaxel)(TAXOTERE®，羅納-普朗克Rorer公司)；苯丁酸氮芥(chlorambucil)；吉西他濱；6-硫鳥嘌呤；巰基嘌呤；甲胺蝶呤；鉑類似物，諸如順鉑和卡鉑；長春鹼；鉑；依託泊苷(VP-16)；異環磷醯胺；絲裂黴素C；米托蒽醌；長春新鹼；長春瑞濱；諾維本(navelbine)；能滅瘤(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；柔紅黴素；胺基蝶呤(aminopterin)；希羅達(xeloda)；伊班膦酸鈉(ibandronate)；CPT-11；拓撲異構酶抑制劑RFS 2000；二氟甲基鳥胺酸(DMFO)；視黃酸(retinoic acid)衍生物，諸如TargretinTM(貝沙羅汀(bexarotene))、PanretinTM、(阿利維A酸)；ONTAKTM(尼介白素(denileukin diftitox))；埃斯培拉黴素(esperamicin)；卡培他濱(capecitabine)；及上述任一者之醫藥上可接受之鹽、酸或衍生物。此定義亦包括用於調節或抑制激素對腫瘤之作用的抗激素劑，諸如抗雌激素劑，包括，例如他莫昔芬(tamoxifen)、雷洛昔芬(raloxifene)、抑制4(5)-咪唑該之芳香酶、4-羥基他莫昔 芬、曲沃昔芬(trioxifene)、奇沃昔芬(keoxifene)、LY117018、奧那司酮(onapristone)和托瑞米芬(toremifene)(Fareston)；及抗雄激素，諸如氟他胺(flutamide)、尼魯米特(nilutamide)、比卡魯胺(bicalutamide)、柳菩林(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin)；及上述任一者之醫藥上可接受之鹽、酸或衍生物。當適當時亦投予化療劑之組合，包括，但不限於CHOP，即，環磷醯胺(Cytoxan®)、多柔比星(Doxorubicin)(hydroxydoxorubicin)、長春新鹼(Oncovin®)及潑尼松(Prednisone)。
於一些實施態樣中，該化療劑係在投予經工程處理之細胞、多肽或核酸的同一時間或投予後之一週內投予。於其他實施態樣中，該化療劑係在投予經工程處理之細胞、多肽或核酸後的1至4週或1週至1個月、1週至2個月、1週至3個月、1週至6個月、1週至9個月或1週至12個月投予。於其他實施態樣中，該化療劑係在投予該細胞、多肽或核酸之前至少1個月投予。於一些實施態樣中，該方法進一步包含投予二或多種化療劑。
多種另外之治療劑可與本發明所描述之組成物一起使用。例如，可能有用之另外的治療劑包括PD-1抑制劑，諸如尼渥魯單抗(nivolumab)(Opdivo®)、沛洛珠單抗(pembrolizumab)(Keytruda®)、沛洛珠單抗、比迪利珠單抗(pidilizumab)及阿替珠單抗(atezolizumab)。
適合與本發明組合使用之另外的治療劑包括，但不限於依羅替尼(ibrutinib)(Imbruvica®)、奧法木 單抗(ofatumumab)(Arzerra®)、利妥昔單抗(rituximab)(Rituxan®)、貝伐單抗(bevacizumab)(阿瓦斯汀®)、曲妥珠單抗(trastuzumab)(赫賽汀®)、賀癌寧(trastuzumab emtansine)(KADCYLA®)、伊馬替尼(imatinib)(格列衛®)、西妥昔單抗(cetuximab)(愛必妥®)、帕尼單抗(panitumumab)(維克替比®)、卡莫索單抗(catumaxomab)、伊妥莫單抗(ibritumomab)、奧法木單抗(ofatumumab)、托西妥莫單抗(tositumomab)、侖妥昔單抗(brentuximab)、阿崙單抗(alemtuzumab)、吉妥珠單抗(gemtuzumab)、埃羅替尼(erlotinib)、吉非替尼(gefitinib)、凡德他尼(vandetanib)、阿法替尼(afatinib)、拉帕替尼(lapatinib)、來那替尼(neratinib)、阿西替尼(axitinib)、馬賽替尼(masitinib)、帕唑帕尼(pazopanib)、舒尼替尼(sunitinib)、索拉非尼(sorafenib)、托西雷尼(toceranib)、來妥替尼(lestaurtinib)、阿西替尼(axitinib)、西地尼布(cediranib)、蘭瓦替尼(lenvatinib)、尼達尼布(nintedanib)、帕唑帕尼(pazopanib)、瑞戈非尼(regorafenib)、司馬沙尼(semaxanib)、索拉非尼(sorafenib)、舒尼替尼(sunitinib)、替瓦沙尼(tivozanib)、托西雷尼(toceranib)、凡德他尼(vandetanib)、恩崔替尼(entrectinib)、卡博替(cabozantinib)、伊馬替尼(imatinib)、達沙替尼(dasatinib)、尼洛替尼(nilotinib)、普納替尼(ponatinib)、雷度替尼(radotinib)、波舒替尼(bosutinib)、來妥替尼(lestaurtinib)、魯索利替尼(ruxolitinib)、帕利替尼(pacritinib)、可必美替尼(cobimetinib)、司美替尼 (selumetinib)、曲美替尼(trametinib)、必尼美替尼(binimetinib)、阿崙替尼(alectinib)、西利替尼(ceritinib)、克利舒替尼(crizotinib)、阿柏西普(aflibercept)、阿迪波太(adipotide)、地尼介白素(denileukin diftitox)、mTOR抑制劑，諸如依維莫司(Everolimus)和西羅莫司(Temsirolimus)、刺蝟抑制劑，諸如索尼得吉(sonidegib)和維莫得告(vismodegib)、CDK抑制劑，諸如CDK抑制劑(帕博西尼(palbociclib))。
於另外之實施態樣中，該包含含有CAR之免疫細胞的組成物可與抗炎劑一起投予。抗炎劑或藥物可包括，但不限於：類固醇和糖皮質激素(包括倍他米松(betamethasone)、布地奈德(budesonide)、地塞米松(dexamethasone)、醋酸氫化可的松(hydrocortisone acetate)、氫化可的松、氫化可的松、甲基強的松龍(methylprednisolone)、強的松龍、潑尼松(prednisolone)和曲安西龍(triamcinolone))、非類固醇抗炎藥(NSAIDS)，包括阿斯匹靈(aspirin)、布洛芬(ibuprofen)、萘普生(naproxen)、甲胺蝶呤、柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine)、來氟米特(leflunomide)、抗TNF藥物、環磷醯胺和黴酚酸酯(mycophenolate)。示例性NSAID包括布洛芬、萘普生、萘普生鈉、Cox-2抑制劑及唾液酸鹽。示例性鎮痛藥包括對乙醯胺基酚、羥考酮、鹽酸丙氧酚之曲馬多。示例性糖皮質激素包括可的松、地塞米松、氫化可的松、甲基強的松龍、強的松龍或潑尼松。示例性 生物反應修飾劑包括針對細胞表面標記物(例如CD4、CD5，等)之分子、細胞因數抑制劑，諸如TNF拮抗劑(例如依那西普(etanercept)(ENBREL®)、阿達木單抗(adalimumab)(HUMIRA®)和英夫利昔單抗(infliximab)(REMICADE®)、趨化因數抑制劑和黏附分子抑制劑。該生物反應修飾劑包括單株抗體及重組形式之分子。示例性DMARD包括硫唑嘌呤(azathioprine)、環磷醯胺、環孢黴素(cyelosporine)、甲胺蝶呤(methotrexate)、青黴胺、來氟米特(leflunomide)、柳氮磺吡啶(sulfasalazine)、羥氯喹(hydroxychloroquine)、Gold(口服(金諾芬(auranofin))和肌肉內)及米諾環素(minocycline)。
於某些實施態樣中，本發明所描述之組成物係與細胞因數一起投予。如本文所使用之“細胞因數”意指由一個細胞群釋出之作用在另一細胞上，作為細胞間介導劑的蛋白質。細胞因數之實例有淋巴因數、單核因數及傳統多肽激素。該細胞因數包括生長激素(諸如人生長激素)、N-甲硫胺醯人生長激素及牛生長激素；副甲狀腺激素；甲狀腺素；胰島素；胰島素原；鬆弛素；鬆弛素原；糖蛋白激素，諸如濾泡刺激素(FSH)、促甲狀腺激素(TSH)和黃體生成素(LH)；肝細胞生長因數(HGF)；纖維母細胞生長因數(FGF)；催乳素(prolactin)；胎盤泌乳素(placental lactogen)；穆勒氏管(mullerian)抑制物質；小鼠促性腺激素相關肽；抑制素；活化素；血管內皮生長因數；整合素；血小板生成素(thrombopoietin)(TPO)；神經生長因數 (NGF)，諸如NGF-β；血小板生長因數；轉化生長因數(TGF)，諸如TGF-α和TGF-β；胰島素樣生長因數-I和胰島素樣生長因數-II；紅血球生成素(EPO)；骨誘導因數；幹擾素，諸如幹擾素-α、β和γ；細胞集落刺激因數(CSF)，諸如巨噬細胞-CSF(M-CSF)；粒細胞-巨噬細胞-CSF(GM-CSF)；和粒細胞-CSF(G-CSF)；介白素(IL)，諸如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12；IL-15、腫瘤壞死因子，諸如TNF-α或TNF-β；及其他多肽因數，包括LIF和kit配體(KL)。如本文所使用者，術語細胞因數包括來自天然來源或來自重組細胞培養物之蛋白質，以及天然序列細胞因數之生物活性同等物。
於一些態樣中，本發明包含以小於100pM之Kd與CLL-1結合之抗原結合分子。於一些實施態樣中，該抗原結合分子以小於10pM之Kd結合。於其他實施態樣中，該抗原結合分子以小於5pM之Kd結合。
製造方法
根據本發明，多種已知技術可用於製造根據本發明之多核苷酸、多肽、載體、抗原結合分子、免疫細胞、組成物，等。
在體外操作或遺傳修飾本發明所描述之免疫細胞之前，可從個體取得該細胞。於一些實施態樣中，該免疫細胞包含T細胞。T細胞可從許多來源取得，包括外周 血單核細胞(PBMC)、骨髓、淋巴結組織、臍帶血、胸腺組織、來自感染部位之組織、腹水、胸腔積液、脾臟組織及腫瘤。於某些實施態樣中，可使用本技藝之技術熟習人士已知之任何數目的技術(諸如FICOLLTM分離術)從個體收集之血液單位取得T細胞。較佳地，可藉由血液成分分離術(apheresis)從個體之循環血液取得細胞。該血液成分分離術製品通常含有淋巴細胞，包括T細胞、單核細胞、粒細胞、B細胞、其他有核之白血球、紅血球和血小板。於某些實施態樣中，藉由血液成分分離術收集之細胞可經洗滌以除去血漿部分，並置於合適之緩衝液或培養基中以用於隨後之加工。該細胞可以PBS洗滌。可理解的是，洗滌步驟可藉由，諸如使用半自動化無逆流離心機，例如CobeTM2991細胞處理器、Baxter CytoMateTM，等來進行。洗滌後，可將該細胞再懸浮於一或多種生物相容之緩衝液，或其他具有或不具有緩衝液之鹽溶液中。於某些實施態樣中，可除去該血液成分分離術樣品之不欲有的組分。
於某些實施態樣中，T細胞係藉由溶解紅血球並耗盡單核細胞而從PBMC中分離出，例如透過PERCOLLTM梯度，使用離心來分離。T細胞之特定亞群，諸如CD28+、CD4+、CD8+、CD45RA+及CD45RO+T細胞可藉由本技藝中已知之正或負選擇技術進一步分離出。例如，藉由負選擇進行之T細胞群富集可使用針對該經負選擇之細胞所特有之表面標記的抗體組合來完成。本發明使用的一種方法為細胞分選及/或經由負磁性免疫黏附或流 式細胞術(其係使用針對存在於該經負選擇之細胞上之細胞表面標記的單株抗體混合物進行)選擇。例如，為了藉由負選擇來富集CD4+細胞，單株抗體混合物通常包括針對CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR及CD8之抗體。流式細胞術和細胞分選亦可用來分離用於本發明之所欲細胞群。
PBMC可使用如本發明所描述之方法而直接用於以免疫細胞(如CAR或TCR)進行之遺傳修飾。於某些實施態樣中，將PBMC分離出後，可進一步分離出T淋巴細胞，並在遺傳修飾及/或擴增之前或之後將細胞毒性及輔助T淋巴細胞二者分選成初始T細胞、記憶T細胞及效應T細胞亞群。
於一些實施態樣中，藉由鑑別與CD8+細胞之初始細胞、中央記憶細胞及效應細胞類型相關聯之細胞表面抗原來將CD8+細胞進一步分選成初始細胞、中央記憶細胞及效應細胞。於一些實施態樣中，中央記憶T細胞之表型標記的表現包括CD45RO、CD62L、CCR7、CD28、CD3及CD127且為粒酶B陰性。於一些實施態樣中，中央記憶T細胞為CD45RO+、CD62L+、CD8+T細胞。於一些實施態樣中，效應T細胞為CD62L、CCR7、CD28及CD127陰性且為粒酶B和穿孔素陽性。於某些實施態樣中，CD4+T細胞被進一步分選成亞群。例如，CD4+T輔助細胞可藉由鑑別具有細胞表面抗原之細胞群而被分選為初始細胞、中央記憶及效應細胞。
該免疫細胞，諸如T細胞，係在分離後使用 已知方法進行遺傳修飾，或者該免疫細胞係在經遺傳修飾之前在體外被活化及擴增(或者，在祖細胞的情況下為分化)。於另一實施態樣中，該免疫細胞，諸如T細胞係以本發明所描述之嵌合抗原受體進行遺傳修飾(例如以包含一或多個編碼CAR之核苷酸序列的病毒載體轉導)，然後在體外活化及擴增。用於活化及擴增T細胞之方法為本技藝所已知且描述於，例如美國專利案第6,905,874；6,867,041；和6,797,514號；和PCT刊物第WO 2012/079000號(其全部內容以引用方式併入本文)中。一般而言，該等方法包括將PBMC或經分離之T細胞在具有適當細胞因數(諸如IL-2)之培養基中與刺激分子和共刺激分子(諸如抗-CD3和抗-CD28抗體，通常係黏附在珠子或其他表面上)接觸。黏附在相同小珠上之抗-CD3和抗-CD28抗體係作為“替代”抗原呈遞細胞(APC)。一種實例為Dynabeads®系統，此為用於生理活化人T細胞之CD3/CD28活化子/刺激子系統。於其他實施態樣中，該T細胞可使用，諸如美國專利案第6,040,177號；美國專利案第5,827,642號及WO 2012129514號(其全部內容以引用方式併入本文)中描述之方法，以飼養細胞及適當之抗體和細胞因數活化並刺激以進行增殖。
用於製造本發明之構建體和經工程處理之免疫細胞的某些方法描述於PCT申請案PCT/US15/14520(其全部內容以引用方式併入本文)中。其他製造構建體和細胞之方法可在美國臨時專利申請案第62/244036號(其全部 內容以引用方式併入本文)中找到。
應理解的是，PBMC可進一步包括其他細胞毒性淋巴細胞，諸如NK細胞或NKT細胞。攜帶如本發明所揭示之嵌合受體的編碼序列之表現載體可被引入人供體T細胞、NK細胞或NKT細胞群體中。除了使用抗-CD3抗體和IL-2或如本文他處描述之本技藝中已知的其他方法來活化細胞外，經成功轉導之攜帶表現載體的T細胞可使用流式細胞術分選出，以分離CD3陽性T細胞，再進一步增殖以增加這些表現CAR之T細胞的數目。使用標準程式來冷凍保存表現CAR之T細胞以儲存及/或準備用於人個體中。於一實施態樣中，在體外轉導、培養及/或擴增T細胞係在沒有源自非人動物之產品(諸如胎牛血清(fetal calf serum 和fetal bovine serum)的存在下進行。
為了選殖多核苷酸，可將該載體引入宿主細胞(經分離之宿主細胞)中以允許載體本身複製，從而擴增其中所包含之多核苷酸的副本。該選殖載體可含有序列組分，通常包括，但不限於複製起點、啟動子序列、轉錄起始序列、增強子序列及選擇性標記。這些元件可由本技藝之一般技術人士依適當情況選擇。例如複製起點可經選擇以促進該載體在宿主細胞中自主複製。
於某些實施態樣中，本揭示內容提供含有本發明所提供之載體的經分離之宿主細胞。含有該載體之宿主細胞可用於表現或選殖該載體所含有之多核苷酸。合適之宿主細胞可包括，但不限於原核細胞、真菌細胞、酵母 細胞或高等真核細胞，諸如哺乳動物細胞。用於此目的之合適的原核細胞包括，但不限於真細菌，諸如革蘭氏陰性或革蘭氏陽性生物，例如腸道菌科(Enterobactehaceae)，諸如埃希氏菌屬(Escherichia)，例如大腸桿菌(E.coli)、腸桿菌(Enterobacter)、歐文氏菌(Erwinia)、克雷伯氏菌(Klebsiella)、變形桿菌(Proteus)、沙門氏菌(Salmonella)，例如鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)、沙雷氏菌(Serratia)，例如黏質沙雷氏菌(Serratia marcescans)和志賀氏菌(Shigella)，以及桿菌，諸如枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)、假單胞菌，諸如綠膿假單胞菌及鏈黴菌。
載體可使用本技藝已知之任何合適的方法引入宿主細胞中，該合適之方法包括，但不限於由DEAE-葡聚醣介導之投遞、磷酸鈣沉澱法、由陽離子脂質介導之投遞、由脂質體介導之轉染、電穿孔、基因槍法(microprojectile bombardment)、由受體介導之基因投遞、由聚離胺酸、組蛋白、殼聚醣及肽介導之投遞。用於轉染和轉化細胞以表現所欲載體之標準方法為本技藝所熟知。於進一步之實施態樣中，不同表現載體之混合物可用於遺傳修飾免疫效應細胞之供體群，其中各載體編碼如本發明所揭示之不同CAR。所產生之經轉導的免疫效應細胞形成經工程處理之細胞的混合群體，一定比例之該經工程處理之細胞表現超過一種不同的CAR。
於一實施態樣中，本發明提供儲存表現針對 CLL-1蛋白之CAR或TCR的經遺傳工程處理之細胞的方法。此涉及冷凍保存該免疫細胞，從而使該細胞在解凍時保持存活。表現該CAR之免疫細胞的一部分可藉由本技藝已知之方法冷凍保存以提供該等細胞未來用於治療罹患惡性腫瘤之患者的永久來源。當需要時，可將該經冷凍保存之經轉化的免疫細胞解凍、生長並擴增以獲得更多該等細胞。
如本文所使用之“冷凍保存”係指藉由冷卻至低於零度之溫度，諸如(通常)77°K或-196℃(液態氮之沸點)來保存細胞。冷凍保存劑通常在低於零度之溫度下使用，以防止細胞由於在低溫下冷凍或升溫至室溫而被破壞。冷凍保存劑和理想之冷卻速率可防止細胞損傷。可根據本發明使用之冷凍保存劑包括，但不限於：二甲基亞碸(DMSO)(Lovelock & Bishop,Nature(1959)；183：1394-1395；Ashwood-Smith、Nature(1961)；190：1204-1205)、甘油、聚乙烯吡咯啶(Rinfret、Ann.N.Y.Acad.Sci.(1960)；85：576)及聚乙二醇(Sloviter & Ravdin,Nature(1962)；196：48)。較佳之冷卻速率為1℃至3℃/min。
術語“基本上純的”係用於表示指定之組分的存在水準高。理想上，該組分為存在於組成物中之主要組分。較佳地，其存在水準超過30%、超過50%、超過75%、超過90%或甚至超過95%，該水準係基於所考量之總組成物的乾重/乾重測定。在非常高之水準下(例如超過90%、超過95%或超過99%之水準)，該組分可被視為“純 型”。本發明之生物活性物質(CAR、TCR、經分離之多肽、經分離之核酸分子、抗原結合分子、部分)可以基本上不含一或多種可能與該生物活性物質聯結之污染物的形式提供。當組成物基本上不含指定之污染物時，該污染物將是處於低水準(例如少於10%、少於5%或少於1%之水準(按上述之乾重/乾重計))。
於一些實施態樣中，該細胞之調配係經由先從培養基中收穫細胞，然後在適合用於投予之培養基和容器系統(“醫藥上可接受的”載體)中洗滌並濃縮該細胞成治療有效量。合適之輸注介質可為任何等張之介質調製劑，通常為生理鹽水，NormosolTM R(Abbott)或Plasma-LyteTM A(Baxter)，但亦可使用在水中之5%右旋糖或林格氏乳酸鹽。該輸注介質可補充以人血清白蛋白。
組成物中之理想的細胞治療量通常為至少2個細胞(例如至少1個CD8+中央記憶T細胞及至少1個CD4+輔助T細胞亞群)或更典型為多於102個細胞，及高達106個，高達包含108個或109個細胞，並可能多於1019個細胞。該細胞數將取決於該組成物所欲之理想用途及其中包含之細胞的類型。所需細胞之密度通常大於106個細胞/ml且通常大於107個細胞/ml，通常為108個細胞/ml或更多。臨床相關之免疫細胞數可分配在累積加總等於或超過105、106、107、108、109、1010、1011或1012個細胞的多個輸注液中。於本發明之一些態樣中，尤其是因為所有輸注之細胞將被重定向到特定之靶抗原(CLL-1)，因而可投予 在106/公斤之範圍內(每一患者106至1011)的較少數量之細胞。可投予數次在這些範圍內之CAR治療。該細胞可為接受治療之患者的自體細胞、同種異體細胞或異源細胞。
本發明之CAR表現細胞群可單獨投予，或與稀釋劑及/或與其他組分，諸如IL-2或其他細胞因數或細胞群組合，以醫藥組成物之形式投予。本發明之醫藥組成物可包含CAR或TCR表現細胞群(諸如本發明所描述之T細胞)，加上一或多種醫藥上或生理上可接受之載體、稀釋劑或賦形劑。該等組成物可以包含緩衝液，諸如中性緩衝鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水，等；碳水化合物，諸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚醣、甘露醇；蛋白質；多肽或胺基酸，諸如甘胺酸；抗氧化劑；螯合劑，諸如EDTA或麩胱甘肽；佐劑(例如氫氧化鋁)；及防腐劑。較佳地，本發明之組成物係配製成用於靜脈內投予。
醫藥組成物(溶液、懸浮液，等)可包括下列群組之一或多者：無菌稀釋劑，諸如注射用水、鹽水溶液，較佳為生理鹽水、林格氏溶液、等張之氯化鈉，經固定之油，諸如可作為溶劑或懸浮介質之合成的甘油單酯或甘油二酯或其他溶劑、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他溶劑；抗菌劑，諸如苯甲醇或對羥基苯甲酸甲酯；抗氧化劑，諸如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑，諸如乙二胺四醋酸；緩衝劑，諸如醋酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽，以及用於調節張力之作用劑，諸如氯化鈉或右旋糖。該腸胃道外製劑可包封在由玻璃或塑膠製成之安瓿、拋棄式注射器或 多劑量小瓶中。較佳地，注射用醫藥組成物為無菌的。
應理解的是，不良事件可藉由以自殺基因轉導免疫細胞(含有一或多個CAR或TCR)來使其減至最少。在免疫細胞中併入可誘導之“開啟”或“加速”開關亦可能是有利的。合適之技術包括在以本發明之CAR構建體轉導細胞之前、之後或同時使用誘導型凋亡蛋白酶-9(美國申請案2011/0286980)或胸苷激酶。用於引入自殺基因及/或“開啟”開關的其他方法包括TALENS、鋅指、RNAi、siRNA、shRNA、反義技術及本技藝已知之其他技術。
根據本發明，本發明可併入另外之開關或其他類型之控制開關技術。這些技術可採用二聚體化結構域及可選擇之該等結構域二聚體化的活化劑。這些技術包括，例如Wu et al.,Science 2014 350(6258)(其全部內容以引用方式併入本文)所描述之利用某些細胞中之FKBP/雷帕黴素類似物(rapalog)二聚體化系統的技術。另外之二聚體化技術描述於，例如Fegan et al.Chem.Rev.2010,110,3315-3336及美國專利案第5,830,462；5,834,266；5,869,337；和6,165,787號(其全部內容以引用方式併入本文)。另外之二聚體化對可包括環孢素A/親環蛋白、受體、雌激素/雌激素受體(可選擇地使用他莫昔芬)、糖皮質激素/糖皮質激素受體、四環素/四環素受體、維生素D/維生素D受體。二聚體化技術之進一步實例可在例如WO 2014/127261、WO 2015/090229、US 2014/0286987、US 2015/0266973、US 2016/0046700、美國專利案第8,486,693號、US 2014/0171649 和US 2012/0130076(其全部內容以引用方式併入本文)中找到。
應理解的是，本文之描述為示例性且僅用於說明，並不像申請專利範圍般限制本發明。在本申請案中，除非另外具體說明，單數之使用包括複數。
本文所使用之章節標題僅用於組織的目的，而不應被解釋為限制所描述之主題。本申請案所引用之所有檔或檔之部分，包括，但不限於專利、專利申請案、文章、書籍和論文在此以引用方式明確併入本文以用於任何目的。除非另有說明，根據本揭示內容所使用之下列術語應被理解為具有以下含義：
本申請案中，除非另有說明，“或”之使用意指“及/或”。此外，術語“包括(“including”)”及其他形式，諸如“包括(“includes”和“included”)”之使用並非限制性的。再者，除非另外具體指明，術語，諸如“元件”或“組分”同時涵蓋包含一個單位之元件和組分及包含超過一個次單位之元件和組分。
術語“CLL-1活性”包括CLL-1之任何生物效果。於某些實施態樣中，CLL-1活性包括CLL-1與受質或受體交互作用或結合之能力。
術語“多核苷酸”、“核苷酸”或“核酸”同時包括單股和雙股核苷酸聚合物。較佳地，這包括如本文所定義之經分離之多核苷酸、核苷酸或核酸。該包含多核苷酸之核苷酸可為核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸或此二 種核苷酸之任一形式的修飾型。該修飾包括鹼基修飾，諸如溴尿苷和肌苷衍生物、核糖修飾，諸如2’,3’-二脫氧核糖及核苷酸間鍵聯修飾，諸如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、苯胺硫代磷酸酯(phosphoroanilothioate)、苯胺硫酸酯(phosphoraniladate)及胺基磷酸酯(phosphoroamidate)。
術語“寡核苷酸”係指包含200個或更少之核苷酸的多核苷酸。寡核苷酸可為單股或雙股的，例如用於構建突變基因。寡核苷酸可為意義或反義寡核苷酸。寡核苷酸可包含標籤，包括用於檢測分析之放射性標記、螢光標記、半抗原或抗原標記。寡核苷酸可作為，例如PCR引物、選殖引物或雜交探針。
術語“控制序列”係指可影響其所連接之編碼序列的表現和加工之多核苷酸序列。該等控制序列之性質可取決於宿主生物體。於特定之實施態樣中，原核細胞之控制序列可包括啟動子、核糖體結合位點及轉錄終止序列。例如，真核生物之控制序列可包括啟動子(其包含一或多個用於轉錄因數之識別位點)、轉錄增強子序列及轉錄終止序列。“控制序列”可包括前導序列(信號肽)及/或融合伴侶序列。
於一些實施態樣中，編碼CAR或TCR之本發明之多核苷酸可進一步包含前導序列或肽(本文中亦稱為“信號肽”)。於某些實施態樣中，該前導肽包含與胺基酸序列MALPVTALLLPLALLLHAARP(SEQ ID NO：144)具有 至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或100%同一性的胺基酸序列。於一些實施態樣中，該前導肽包含SEQ ID NO：144之胺基酸序列。
如本文所使用之“可操作地連接”意指該術語所適用之組分係處於允許該組分在合適之條件下執行其固有功能的關係。
術語“載體”意指用於將編碼資訊之蛋白質轉移到宿主細胞中的任何分子或實體(例如核酸、質粒、噬菌體或病毒)。術語“表現載體”或“表現構建體”係指適合用於轉化宿主細胞之載體且其含有可指導及/或控制(聯合宿主細胞)那些以可操作之方式連接於其上之一或多個異源編碼區的表現之核酸序列。表現構建體可包括，但不限於影響或控制轉錄、轉譯之序列，且若存有內含子時，影響那些以可操作之方式與其連接之編碼區的RNA剪接。
術語“宿主細胞”係指已藉由核酸序列轉化或能夠以核酸序列轉化，從而表現所欲基因之細胞。該術語包括親本細胞之後代，無論該後代之形態或基因組成是否與原始親本細胞完全相同，只要存有所欲基因。
術語“轉化”係指細胞之遺傳特性的改變，當該細胞已經過修飾以含有新的DNA或RNA時該細胞已被轉化。例如當細胞經由轉染、轉導或其他技術引入新的遺傳物質而從其天然狀態被遺傳修飾時，該細胞被轉化。在轉染或轉導後，該轉化DNA可藉由物理整合入該細胞之染色體 中而與細胞之DNA重組，或可以附加體元件之形式暫時維持，而不被複製，或可以質粒之形式獨立複製。當該轉化DNA隨細胞分裂而複製時，該細胞被認為已“經穩定地轉化”。
術語“轉染”係指由細胞攝取外來或外源DNA。許多轉染技術為本技藝所周知且揭示於本文中。參見，例如Graham et al.,1973,Virology 52：456；Sambrook et al.,2001,Molecular Cloning：A Laboratory Manual，同上；Davis et al.,1986,Basic Methods in Molecular Biology,Elsevier；Chu et al.,1981,Gene 13：197。
術語“轉導”係指經由病毒載體將外來DNA引入細胞中所憑藉之過程。參見Jones et al.,(1998).Genetics：principles and analysis.Boston：Jones&Bartlett Publ。
術語“多肽”或“蛋白質”係指具有蛋白質之胺基酸序列的大分子，包括在天然序列中刪除、添加及/或取代一或多個胺基酸，較佳為其中胺基酸取代不超過8個。較佳地，依本文之定義分離多肽或蛋白質。術語“多肽”和“蛋白質”具體包含在抗原結合蛋白中刪除、添加及/或取代一或多個胺基酸之CLL-1抗原結合分子、抗體或序列，較佳為其中胺基酸取代不超過8個。術語“多肽片段”係指與全長天然蛋白質相比較，具有胺基端缺失、羧基端缺失及/或內部缺失之經分離的多肽。該等片段亦可含有與天然蛋白質相較下經修飾之胺基酸。有用之多肽片段包括抗原結合分子之免疫功能片段。有用之片段包括，但不 限於一或多個CDR區、重鏈及/或輕鏈之可變結構域，其他抗體鏈部分之一部分，等。
術語“經分離的”意指(i)不含至少一些通常與其一起被發現的其他蛋白質，(ii)基本上不含來自相同來源(例如來自相同物種)之其他蛋白質，(iii)與至少約50%之與其在自然界中相聯結的多核苷酸、脂質、碳水化合物或其他物質分開，(iv)以可操作之方式聯結(藉由共價或非共價交互作用)該與其在自然界中無關聯之多肽，或(v)不會在自然界產生。
多肽(例如抗原結合分子或抗體)之“變體”包含該相對於另一多肽序列其中插入一或多個胺基酸殘基、從胺基酸序列刪除一或多個胺基酸殘基、及/或在胺基酸序列中取代一或多個胺基酸殘基的胺基酸序列。變體包括融合蛋白。
術語“同一性”係指當藉由比對和比較序列來測定時，二或更多個多肽分子或二或更多個核酸分子的序列之間的關係。“百分比同一性”意指在所比較之分子中的胺基酸或核苷酸之間完全相同之殘基的百分比且該百分比係基於所比較之最小分子的大小來計算。在這些計算方面，比對中之間隙(若有的話)較佳為藉由特定之數學模型或電腦程式(即“演算法”)處理。
為了計算同一性百分比，相比較之序列通常係以能使該序列之間產生最大匹配的方式對齊。可用於測定同一性百分比之電腦程式的一種實例為GCG程式包，其 包括GAP(Devereux,et al,1984,Nucl.Acid Res.12：387；Genetics Computer Group,University of Wisconsin,Madison,Wis.)。該電腦演算法GAP係用於比對欲測定序列同一性百分比的二個多肽或多核苷酸。比對序列以使各別胺基酸或核苷酸有最佳匹配(藉由該演算法測定時之“匹配跨距”)。於某些實施態樣中，該演算法亦使用標準比較矩陣(參見，Dayhoff et al.,1978,Atlas of Protein Sequence and Structure 5：345-352，用於PAM 250比較矩陣；Henikoff et al.,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89：10915-10919，用於BLOSUM 62比較矩陣)。
如本文所使用之20種習知(例如天然存在的)胺基酸及彼等之縮寫係遵循常規用法。參見Immunology-ASynthesis(2nd Edition,Golub and Gren,Eds.,Sinauer Assoc.,Sunderland,Mass.(1991))，其以引用方式併入本文用於任何目的。該20種習知胺基酸之立體異構體(例如D-胺基酸)、非天然胺基酸，諸如α,α-二取代之胺基酸、N-烷基胺基酸、乳酸及其他非習知胺基酸亦為本發明多肽之合適組分。非習知胺基酸之實例包括：4-羥基脯胺酸、γ-羧基麩胺酸、ε-N,N,N-三甲基離胺酸、e-N-乙醯基離胺酸、O-磷酸絲胺酸、N-乙醯基絲胺酸、N-甲醯基甲硫胺酸、3-甲基組胺酸、5-羥基離胺酸、σ-N-甲基精胺酸及其他類似之胺基酸和亞胺基酸(例如4-羥基脯胺酸)。在本文使用之多肽記法中，根據標準用法和慣例，左手方向為胺基端方向，而右手方向為羧基端方向。
保守性胺基酸取代可包含非天然存在之胺基酸殘基，該非天然存在之胺基酸殘基通常係藉由化學肽合成併入，而非在生物系統中合成。這些包括肽模擬物及其他反轉或倒置形式之胺基酸部分。天然存在之殘基可根據共同之側鏈性質來區分類別：
(a)疏水性的：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(b)中性親水性的：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(c)酸性的：Asp、Glu；
(d)鹼性的：His、Lys、Arg；
(e)影響鏈方向之殘基：Gly、Pro；及
(f)芳香族的：Trp、Tyr、Phe。
例如，非保守性取代可能涉及將這些類別之一的成員與另一類別之成員交換。該等經取代之殘基可被引入，例如與非人抗體同源之人抗體的區域中，或引入該分子之非同源區。示例性胺基酸取代闡述於表3中。
Figure 112101087-A0101-12-0093-18
術語“衍生物”係指包含除了插入、缺失或取代胺基酸(或核酸)之外的化學修飾之分子。於某些實施態樣中，衍生物包含共價修飾，包括，但不限於與聚合物、脂質或其他有機或無機部分化學鍵結。於某些實施態樣中，經化學修飾之抗原結合分子可具有較未經化學修飾之 抗原結合分子更長之循環半衰期。於一些實施態樣中，衍生之抗原結合分子係經共價修飾以包含一或多個水溶性聚合物連接物，包括，但不限於聚乙二醇、聚氧乙二醇或聚丙二醇。
肽類似物常用於製藥工業中，作為具有類似於範本肽之性質的非肽藥物。這些非肽化合物類型被稱為“肽模擬物”或“模擬肽(peptidomimetic)”。Fauchere,J.,Adv.Drug Res.,15：29(1986)；Veber&Freidinger,TINS,p.392(1985)；及Evans et al.,J.Med.Chem.,30：1229(1987)，其以引用方式併入本文用於任何目的。
治療劑(例如經工程處理之CAR T細胞)之“治療有效量”、“有效劑量”、“有效量”或“治療有效劑量”所指之量為當單獨使用或與另一治療劑組合使用時能保護個體防止疾病發作或促進疾病消退之任何量，疾病消退之證據為疾病症狀之嚴重性降低、無疾病症狀之頻率和期間增加或防止由於疾病折磨導致之損傷或殘疾。治療劑促進疾病消退之能力可使用技術熟習之從業人員已知之各種方法評估，諸如在臨床試驗期間在人個體中評估、在用於預測在人體中之效力的動物模型系統中評估或經由在活體外分析中分析該作用劑之活性評估。
術語“患者”和“個體”可互換使用且包括人類和非人類動物個體，以及那些具有經正式診斷之病症者、那些不具有經正式承認之病症者、那些接受醫療照顧者、那些處於發展出病症之風險者，等。
術語“治療(treat和treatment)”包括治療性治療、預防性治療及其中降低個體將發展出病症之風險或其他風險因素的應用。治療不需要完全治癒病症且包含其中個體減少症狀或潛在風險因數的實施態樣。術語“預防”並不需要100%排除事件之可能性。相反地，其表示在該化合物或方法之存在下，該事件發生的可能性已降低。
標準技術可用於重組DNA、寡核苷酸合成及組織培養和轉化(例如電穿孔、脂質轉染(lipofection))。酶催化反應和純化技術可根據製造商之說明書或依本技藝中通常完成的或依本文之描述執行。前述技術和程式可大致上根據本技藝公知之習知方法及依循本說明書全文所引用和討論之各種一般和更專門的參考文獻中之描述進行。參見，例如Sambrook et al.,Molecular Cloning：A Laboratory Manual(2d ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989))，其以引用方式併入本文用於任何目的。
以引用方式併入
本專利說明書所提及之所有出版物、專利及專利申請案以引用方式併入本文，其程度如同各個別出版物、專利或專利申請案各自被具體且單獨地指明以引用方式併入本發明中。然而，本文之參考文獻的引用不應被解釋為承認該等參考文獻為本發明之先前技藝。任何以引用方式被併入之參考文獻所提供之任何定義或術語與本文所 提供之術語和討論不同時，以本發明之術語和定義為準。
前述書面說明書被認為足以使本技藝中之技術熟習人士能夠實踐本發明。本發明之前述描述和實施例詳細描述本發明之某些較佳實施態樣並描述本發明者所考量之最佳模式。然而，應理解的是，無論前述內容在文本中多麼詳細，本發明可以許多方式實現且本發明應根據所附之申請專利範圍及其任何同等物來解釋。
下列實施例，包括進行之實驗和所得之結果，僅用於說明且不應被解釋為限制本發明。
實施例1
藉由mRNA電穿孔在人PBMC中測定CLL-1 CAR活性。以EcoRI和BamHI(NEB)將10μgDNA分解一整夜以將編碼T7啟動子、CAR構建體和β球蛋白穩定序列之質粒線性化。然後，以蛋白酶K(Thermo FisherTM，600U/ml)將DNA在50℃下分解2小時，使用苯酚/氯仿純化並經由添加醋酸鈉和二倍體積之乙醇沉澱。將沉澱小丸乾燥，重新懸浮在不含RNA酶/DNA酶之水中並定量之。然後，依照製造商之說明，利用mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra (Thermo FisherTM)，使用1μg之線性DNA產生體外轉錄。依照製造商之說明，利用MEGAClear套組(Thermo FisherTM)將RNA進一步純化並使用NanoDropTM定量。藉由在瓊脂糖凝膠上泳行來評估mRNA之完整性。
評估不同癌細胞系之CLL-1表現。在4℃下， 以在染色緩衝液(BD PharmingenTM)中與PE(BD PharmingenTM)軛合之抗CLL-1抗體將Namalwa(ATCC)、U937(ATCC)、HL-60(ATCC)、EoL-1(Sigma)、KG1a(ATCC)和MV4；11(ATCC)細胞染色30分鐘。然後，洗滌細胞並再懸浮於具有碘化丙錠(BD PharmingenTM)之染色緩衝液中再採集數據。然後，藉由流式細胞術取得樣品，再使用FlowJoTM分析數據並繪製直方圖。CLL-1表現之結果可參見第1圖。
根據製造商之指示，使用ficoll-paque密度離心，從健康供體之白血球濃縮物(leukopak)(HemacareTM)分離出PBMC。使用在R10培養基+IL-2(300IU/ml，Proleukin®，Prometheus® Therapeutics and Diagnostics)中之OKT3(50ng/ml，Miltenyi BiotecTM)刺激PBMC。刺激後7天，將T細胞在Opti-MEMTM(Thermo Fisher ScientificTM)中洗滌二次並再懸浮於Opti-MEM中，使最終濃度為2.5×107個細胞/ml。每次電穿孔使用10μg之mRNA。使用Gemini X2系統(哈佛儀器BTXTM)，將其設定成遞送單一400V脈衝共0.5ms，在2mm比色杯(哈佛儀器BTXTM)中進行細胞電穿孔。將細胞立即轉移至R10+IL-2培養基並使其恢復。在用於活性分析之前將細胞保持在0.5至2.0×106細胞/ml。
mRNA電穿孔後六小時，在4℃下，以在染色緩衝液(BD PharmingenTM)中之生物素化的蛋白L(Thermo ScientificTM)將T細胞染色30分鐘。然後，洗滌細胞並以在染色緩衝液中之PE鏈親和素(BD PharmingenTM)在4℃下染色30分鐘。然後，洗滌細胞並將其再懸浮於具有碘化丙錠 (BD PharmingenTM)之染色緩衝液中再採集數據。CAR檢測之結果顯示於第2圖中。
mRNA電穿孔後6小時，以1：1 E：T比將效應細胞與靶細胞培養在R10培養基中。測試之細胞系包括Namalwa、U937、HL-60、EoL-1、KG1a和MV4；11。培養後16小時，按照製造商之說明藉由Luminex(EMD Millipore)分析上清液並藉由流式細胞術分析攝入之碘化丙啶(PI)來評估靶細胞之存活。對應於該細胞因數釋出分析之結果可在第3圖中找到。溶細胞活性分析之結果可在第4圖和第5圖中找到。
實施例2
藉由慢病毒轉導人PBMC來測定CLL-1 CAR活性。使用含有不同CLL-1 CAR構建體之第三代慢病毒轉移載體連同ViraPowerTM慢病毒包裝混合物(Lentiviral Packaging Mix)(Life TechnologiesTM)以產生該慢病毒上清液。簡而地說，藉由將15μg之DNA和22.5μl之聚乙烯亞胺(PolysciencesTM，1mg/ml)在600ul之OptiMEMTM培養基中混合來產生轉染混合物。將該混合物在室溫下溫育5分鐘。同時，以胰蛋白酶處理293T細胞(ATCC)，計數並將總數為10×106之細胞連同轉染混合物一起接種在T75燒瓶中。轉染後三天，收集上清液，將其通過0.45um之過濾器過濾並保存在-80℃直至使用時。
根據製造商之指示，使用ficoll-paque密度離 心，從健康供體之白血球濃縮物(HemacareTM)分離出PBMC。使用在R10培養基+IL-2(300IU/ml，Proleukin®，Prometheus® Therapeutics and Diagnostics)中之OKT3(50ng/ml，Miltenyi BiotecTM)刺激PBMC。刺激後48小時，使用慢病毒，以MOI=10轉導細胞。在用於活性分析前將細胞保持在0.5至2.0×106細胞/ml。
刺激後第12天，以在染色緩衝液(BD PharmingenTM)中之生物素化蛋白L(Thermo ScientificTM)將T細胞在4℃下染色30分鐘。然後，洗滌細胞並以在染色緩衝液中之PE鏈親和素(BD PharmingenTM)在4℃下染色30分鐘。然後，洗滌細胞並將其再懸浮於具有碘化丙錠(BD PharmingenTM)之染色緩衝液中，然後再採集數據。CAR檢測之結果顯示於第6圖中。
T細胞刺激後12天，以1：1 E：T比將效應細胞與靶細胞培養在R10培養基中。測試之細胞系包括Namalwa、U937、HL-60、EoL-1、KG1a和MV4；11。共同培養後16小時，按照製造商之說明藉由Luminex(EMD MilliporeTM)分析上清液並藉由流式細胞術分析攝入之碘化丙啶(PI)來評估靶細胞之存活力。對應於該細胞因數釋出分析之結果可在第7圖中找到。溶細胞活性分析之結果可在第8圖中找到。
實施例3
本研究中使用5至6週齡之雌Jackson NSG小 鼠(NOD.Cg-Prkdc scid Il2rg tm1Wjl /SzJ)。為小鼠餵食可自由取食之經放射線照射的Harlan 2918.15囓齒類動物食物和水。將小鼠圈養在InnoviveTM拋棄式通風籠中，其在Biobubble® Clean Rooms內具有玉米芯墊料，該通風籠可以每小時100次完整換氣之速率提供H.E.P.A過濾空氣進入該氣泡環境內。所有治療、體重測定及腫瘤測量係在該氣泡環境中進行。將環境控制在70°±2℉之溫度範圍及30-70%之濕度範圍內。所有程式之進行均符合所有法律、法規和國家衛生研究院(NIH)之指導方針並獲得分子成像公司(Molecular Imaging,Inc.)之動物護理和使用委員會的批准。
腫瘤細胞製備方法
取得在Lifor®保存液中之U937-luc細胞。將細胞在200rcf，4℃下離心8分鐘，吸出該上清液並藉由移液將沉澱小丸重新懸浮於冷Dulbecco氏磷酸鹽緩衝鹽水(DPBS)中。將均勻之細胞懸浮液的等分試樣在台盼藍溶液中稀釋並使用LunaTM自動細胞計數器計數。將細胞在200rcf，4℃下離心8分鐘。吸出上清液，並將該細胞沉澱小丸重新懸浮於不含血清之冷培養基中以產生台盼藍染料排除細胞/ml之最終濃度。在植入過程中將細胞懸浮液保持在濕冰上。在第0天，使用27號針頭和注射器經由側尾靜脈為試驗動物靜脈內植入在0.2ml中之1.00E+06細胞。
CAR T細胞製備方法
取得根據本發明之T細胞，在乾冰上冷凍並儲存在液態氮中。在治療當天，從冷凍貯庫移出所提供之冷凍管並在37℃水浴中解凍。在各組別方面，將所提供之T細胞併入具有輔以10%FBS之溫RPMI 1640的單一50ml錐形管中。以輔以10%FBS之溫RPMI 1640漂洗該冷凍管以將細胞的損失減至最少以使各錐形管中之總體積達到50ml。將各50ml錐形管在200rcf，4℃下離心8分鐘。將上清液吸出，並將細胞沉澱小丸重新懸浮於10ml之室溫DPBS中。將均勻之細胞懸浮液的等分試樣在台盼藍溶液中稀釋並使用血細胞計數器手動計數。將細胞懸浮液再次在200rcf，4℃下離心8分鐘。將該上清液吸出並將細胞沉澱小丸重新懸浮於室溫之DPBS中以產生所需之最終濃度。在治療投予期間將細胞懸浮液保持在濕冰上。
生物發光成像
使用IVIS光譜儀(Perkin Elmer，麻薩諸塞州霍普金市)進行體內生物發光成像(BLI)。在約1至2%異氟烷氣體麻醉下每次為動物照像高達5次。為每隻小鼠IP注射150mg/kg(15 mg/ml)之D-螢光素，以俯臥位置照像，然後在注射後10分鐘，以仰臥位置照像。使用大至小分選(binning)之CCD晶片並調整暴露時間(2秒至2分鐘)，以使每一圖像取得至少數百計數並進一步避免CCD晶片飽和。在第3、11、18和25天收集BLI圖像。使用Living Image4.5版(Perkin Elmer，麻薩諸塞州霍普金市))軟體分析圖像。 全身固定體積ROI置於各個別動物之俯臥和仰臥圖像並根據動物識別來標記。計算以光子/秒(p/s)表示之總輻射並導出所有ROI之數值，以幫助組別之間的分析。將俯臥和仰臥ROI加總在一起以估計全身腫瘤負荷。
治療
基於自BLI衍生之全身腫瘤負荷的估計，將所有小鼠分選入研究組。分配小鼠以確保所有組別之平均腫瘤負荷係在該研究群之整體平均腫瘤負荷的10%之內。第3天開始以CAR T細胞治療。給予所有小鼠固定體積為0.2mL之劑量。結果闡述於第10圖中。
副作用之評估
每天觀察所有動物之臨床徵兆至少一次。在治療的每一天為動物稱重。每週記錄個別體重3次。
下列序列將進一步舉例說明本發明。
CD28T DNA胞外、跨膜、胞內
Figure 112101087-A0101-12-0102-19
Figure 112101087-A0101-12-0102-20
(SEQ ID NO.1)
CD 28T胞外、跨膜、胞內AA
Figure 112101087-A0101-12-0103-22
Figure 112101087-A0101-12-0103-24
(SEQ ID NO.2)
CD28T DNA-胞外
CTTGATAATGAAAAGTCAAACGGAACAATCATTCACGTGAAGGGCAAGCACCTCTGTCCGTCACCCTTGTTCCCTGGTCCATCCAAGCCA(SEQ ID NO.3)
CD28T AA-胞外
LDNEKSNGTI IHVKGKHLCP SPLFPGPSKP(SEQ ID NO.4)
CD28 DNA跨膜結構域
TTCTGGGTGTTGGTCGTAGTGGGTGGAGTCCTCGCTTGTTACTCTCTGCTCGTCACCGTGGCTTTTATAATCTTCTGGGTT(SEQ ID NO.5)
CD28 AA跨膜結構域
FWVLVVVGGV LACYSLLVTV AFIIFWV(SEQ ID NO.6)
CD28 DNA胞內結構域
Figure 112101087-A0101-12-0103-25
Figure 112101087-A0101-12-0103-26
(SEQ ID NO.7)
CD28 AA胞內結構域
RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS(SEQ ID NO.8)
CD3ζDNA
Figure 112101087-A0101-12-0104-27
Figure 112101087-A0101-12-0104-30
(SEQ ID NO.9)
CD3ζAA
Figure 112101087-A0101-12-0104-28
Figure 112101087-A0101-12-0104-29
(SEQ ID NO.10)
CD3ζ變體AA
Figure 112101087-A0101-12-0104-32
Figure 112101087-A0101-12-0104-33
(SEQ ID NO.146)
CD28 DNA
Figure 112101087-A0101-12-0104-31
Figure 112101087-A0101-12-0104-34
(SEQ ID NO.11)
CD28 AA
IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP(SEQ ID NO.12)
CD8 DNA胞外&跨膜結構域
Figure 112101087-A0101-12-0105-35
Figure 112101087-A0101-12-0105-36
(SEQ ID NO.13)
CD8 AA胞外&跨膜結構域
AAALSNSIMYFSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRN(SEQ ID NO.14)
選殖株24C1 HC DNA
Figure 112101087-A0101-12-0105-38
Figure 112101087-A0101-12-0105-39
(SEQ ID NO.15)
選殖株24C1 HC AA(CDR下方劃線)
Figure 112101087-A0101-12-0105-40
Figure 112101087-A0101-12-0105-41
(SEQ ID NO.16)
選殖株24C1 HC AA CDR1：
GGSISSY(SEQ ID NO.17)
選殖株24C1 HC AA CDR2：
YYSGS(SEQ ID NO.18)
選殖株24C1 HC AA CDR3：
LVYCGGDCYS GFDY(SEQ ID NO.19)
選殖株24C1 LC DNA
Figure 112101087-A0101-12-0106-44
Figure 112101087-A0101-12-0106-45
(SEQ ID NO.20)
選殖株24C1 LC AA(CDR下方劃線)
Figure 112101087-A0101-12-0106-42
Figure 112101087-A0101-12-0106-43
(SEQ ID NO.21)
選殖株24C1 LC CDR1 AA：
QASQDINNFLN(SEQ ID NO.22)
選殖株24C1 LC CDR2 AA：
DASNLET(SEQ ID NO.23)
選殖株24C1 LC CDR3 AA：
QQYGNLPFT(SEQ ID NO.24)
選殖株24C1 CD28T CD3ζCAR DNA重鏈&輕鏈
Figure 112101087-A0101-12-0107-46
Figure 112101087-A0101-12-0107-47
(SEQ ID NO.25)
選殖株24C1 CD28T CD3ζCAR AA重鏈&輕鏈
(信號肽以粗體表示)
Figure 112101087-A0101-12-0108-48
Figure 112101087-A0101-12-0108-49
(SEQ ID NO.26)
選殖株24C1 CD28T CD3ζCAR DNA重鏈&輕鏈
Figure 112101087-A0101-12-0109-51
Figure 112101087-A0101-12-0109-52
(SEQ ID NO.27)
選殖株24C1 CD28T CD3ζCAR AA重鏈&輕鏈
Figure 112101087-A0101-12-0110-53
Figure 112101087-A0101-12-0110-55
(SEQ ID NO.28)
選殖株24C1 CD28 CD3ζCAR DNA重鏈&輕鏈
Figure 112101087-A0101-12-0110-54
Figure 112101087-A0101-12-0111-56
Figure 112101087-A0101-12-0111-59
(SEQ ID NO.29)
選殖株24C1 CD28 CD3ζCAR AA重型和輕鏈
(信號肽以粗體表示)
Figure 112101087-A0101-12-0111-57
Figure 112101087-A0101-12-0111-58
(SEQ ID NO.30)
選殖株24C1 CD28 CD3ζCAR DNA重鏈&輕鏈
Figure 112101087-A0101-12-0112-60
Figure 112101087-A0101-12-0112-61
(SEQ ID NO.31)
選殖株24C1 CD28 CD3ζCAR AA重鏈&輕鏈
Figure 112101087-A0101-12-0113-62
Figure 112101087-A0101-12-0113-64
(SEQ ID NO.32)
選殖株24C1 CD8 CD3ζCAR DNA重鏈&輕鏈
Figure 112101087-A0101-12-0113-63
Figure 112101087-A0101-12-0114-65
Figure 112101087-A0101-12-0114-68
(SEQ ID NO.33)
選殖株24C1 CD8 CD3ζCAR AA重鏈&輕鏈
(信號肽以粗體表示)
Figure 112101087-A0101-12-0114-66
(SEQ ID NO.34)
選殖株24C1 CD8 CD3ζCAR DNA重鏈&輕鏈
Figure 112101087-A0101-12-0114-67
Figure 112101087-A0101-12-0115-69
(SEQ ID NO.35)
選殖株24C1 CD8 CD3ζCAR AA重鏈&輕鏈
Figure 112101087-A0101-12-0115-70
Figure 112101087-A0101-12-0116-71
Figure 112101087-A0101-12-0116-73
(SEQ ID NO.36)
選殖株24C1 CD28T CD3ζCAR DNA重鏈&輕鏈
Figure 112101087-A0101-12-0117-76
Figure 112101087-A0101-12-0117-77
(SEQ ID NO.37)
選殖株24C1 CD28T CD3ζCAR AA重鏈&輕鏈
(信號肽以粗體表示)
Figure 112101087-A0101-12-0118-78
Figure 112101087-A0101-12-0118-80
(SEQ ID NO.38)
選殖株24C1 CD28T CD3ζCAR DNA重鏈&輕鏈
Figure 112101087-A0101-12-0118-79
Figure 112101087-A0101-12-0119-81
Figure 112101087-A0101-12-0119-82
(SEQ ID NO.39)
選殖株24C1 CD28T CD3ζCAR AA重鏈&輕鏈
Figure 112101087-A0101-12-0120-83
Figure 112101087-A0101-12-0120-84
(SEQ ID NO.40)
選殖株24C1 CD28 CD3ζCAR DNA AA重鏈&輕鏈
Figure 112101087-A0101-12-0121-85
Figure 112101087-A0101-12-0121-86
(SEQ ID NO.41)
選殖株24C1 CD28 CD3ζCAR AA重鏈&輕鏈
(信號肽以粗體表示)
Figure 112101087-A0101-12-0122-88
Figure 112101087-A0101-12-0122-91
(SEQ ID NO.42)
選殖株24C1 CD28 CD3ζCAR DNA重鏈&輕鏈
Figure 112101087-A0101-12-0122-90
Figure 112101087-A0101-12-0123-92
Figure 112101087-A0101-12-0123-94
(SEQ ID NO.43)
選殖株24C1 CD28 CD3ζCAR AA重鏈&輕鏈
Figure 112101087-A0101-12-0123-93
(SEQ ID NO.44)
選殖株24C1 CD8 CD3ζCAR DNA重鏈&輕鏈
Figure 112101087-A0101-12-0124-95
Figure 112101087-A0101-12-0124-96
(SEQ ID NO.45)
選殖株24C1 CD8 CD3ζCAR AA重鏈&輕鏈
(信號肽以粗體表示)
Figure 112101087-A0101-12-0125-98
(SEQ ID NO.46)
選殖株24C1 CD8 CD3ζCAR DNA重鏈&輕鏈
Figure 112101087-A0101-12-0125-97
Figure 112101087-A0101-12-0126-99
(SEQ ID NO.47)
選殖株24C1 CD8 CD3ζCAR AA重鏈&輕鏈
Figure 112101087-A0101-12-0126-100
Figure 112101087-A0101-12-0126-101
(SEQ ID NO.48)
選殖株24C8重鏈(HC)DNA
Figure 112101087-A0101-12-0127-102
Figure 112101087-A0101-12-0127-107
(SEQ ID NO.48)
選殖株24C8 AA HC(CDR下方劃線)
Figure 112101087-A0101-12-0127-103
Figure 112101087-A0101-12-0127-104
(SEQ ID NO.50)
選殖株24C8 HC CDR1 AA：
GGSISSGGF(SEQ ID NO.51)
選殖株24C8 HC CDR2 AA：
HHSGS(SEQ ID NO.52)
選殖株24C8 HC CDR3 AA：
LVYCGGDCYS GFDY(SEQ ID NO.53)
選殖株24C8輕鏈(LC)DNA
Figure 112101087-A0101-12-0127-105
Figure 112101087-A0101-12-0127-106
(SEQ ID NO.54)
選殖株24C8 LC AA(CDR下方劃線)
Figure 112101087-A0101-12-0128-108
Figure 112101087-A0101-12-0128-109
(SEQ ID NO.55)
選殖株24C8 LC CDR1 AA：
QASQDINNFLN(SEQ ID NO.56)
選殖株24C8 LC CDR2 AA：
DASNLET(SEQ ID NO.57)
選殖株24C8 LC CDR3 AA：
QQYGNLPFT(SEQ ID NO.58)
選殖株24C8 CD28T CD3ζCAR DNA重鏈&輕鏈
Figure 112101087-A0101-12-0129-110
Figure 112101087-A0101-12-0129-111
(SEQ ID NO.59)
選殖株24C8 CD28T CD3ζCAR AA重鏈&輕鏈
(信號肽以粗體表示)
Figure 112101087-A0101-12-0130-113
Figure 112101087-A0101-12-0130-116
(SEQ ID NO.60)
選殖株24C8 CD28T CD3ζCAR DNA重鏈&輕鏈
Figure 112101087-A0101-12-0130-115
Figure 112101087-A0101-12-0131-117
Figure 112101087-A0101-12-0131-121
(SEQ ID NO.61)
選殖株24C8 CD28T CD3ζCAR AA重鏈&輕鏈
Figure 112101087-A0101-12-0131-118
Figure 112101087-A0101-12-0131-120
(SEQ ID NO.62)
選殖株24C8 CD28 CD3ζCAR DNA重鏈&輕鏈
Figure 112101087-A0101-12-0131-119
Figure 112101087-A0101-12-0132-122
Figure 112101087-A0101-12-0132-123
(SEQ ID NO.63)
選殖株24C8 CD28 CD3ζCAR AA重鏈&輕鏈
(信號肽以粗體表示)
Figure 112101087-A0101-12-0133-124
Figure 112101087-A0101-12-0133-126
(SEQ ID NO.64)
選殖株24C8 CD28 CD3ζCAR DNA重鏈&輕鏈
Figure 112101087-A0101-12-0133-125
Figure 112101087-A0101-12-0134-127
Figure 112101087-A0101-12-0134-132
(SEQ ID NO.65)
選殖株24C8 CD28 CD3ζCAR AA重鏈&輕鏈
Figure 112101087-A0101-12-0134-128
Figure 112101087-A0101-12-0134-134
(SEQ ID NO.66)
選殖株24C8 CD8 CD3ζCAR DNA重鏈&輕鏈
Figure 112101087-A0101-12-0134-131
Figure 112101087-A0101-12-0135-135
Figure 112101087-A0101-12-0135-136
(SEQ ID NO.67)
選殖株24C8 CD8 CD3ζCAR AA重鏈&輕鏈
(信號肽以粗體表示)
Figure 112101087-A0101-12-0136-137
(SEQ ID NO.68)
選殖株24C8 CD8 CD3ζCAR DNA重鏈&輕鏈
Figure 112101087-A0101-12-0136-138
Figure 112101087-A0101-12-0137-139
Figure 112101087-A0101-12-0137-143
(SEQ ID NO.69)
選殖株24C8 CD8 CD3ζCAR AA重鏈&輕鏈
Figure 112101087-A0101-12-0137-140
Figure 112101087-A0101-12-0137-141
(SEQ ID NO.70)
選殖株20C5.1 HC DNA
Figure 112101087-A0101-12-0137-142
Figure 112101087-A0101-12-0138-144
Figure 112101087-A0101-12-0138-152
(SEQ ID NO.71)
選殖株20C5.1 AA HC(CDR下方劃線)
Figure 112101087-A0101-12-0138-146
Figure 112101087-A0101-12-0138-147
(SEQ ID NO.72)
選殖株20C5.1 HC AA CDR1：
GYTLTEL(SEQ ID NO.73)
選殖株20C5.1 HC AA CDR2：
DPEDGE(SEQ ID NO.74)
選殖株20C5.1 HC AA CDR3：
ESRGIGWPYFDY(SEQ ID NO.75)
選殖株20C5.1 LC DNA
Figure 112101087-A0101-12-0138-148
Figure 112101087-A0101-12-0138-149
(SEQ ID NO.76)
選殖株20C5.1 AA LC(CDR下方劃線)
Figure 112101087-A0101-12-0138-150
Figure 112101087-A0101-12-0138-151
(SEQ ID NO.77)
選殖株20C5.1 AA LC CDR1：
RASQSISSYLN(SEQ ID NO.78)
選殖株20C5.1 AA LC CDR2：
GASSLKS(SEQ ID NO.79)
選殖株20C5.1 AA LC CDR3：
QQSYSTPIT(SEQ ID NO.80)
選殖株20C5.1 CD28T CD3ζCAR DNA重鏈&輕鏈
Figure 112101087-A0101-12-0140-153
Figure 112101087-A0101-12-0140-154
(SEQ ID NO.81)
選殖株20C5.1 CD28T CD3ζCAR AA重鏈&輕鏈
(信號肽以粗體表示)
Figure 112101087-A0101-12-0141-155
Figure 112101087-A0101-12-0141-156
(SEQ ID NO.82)
選殖株20C5.1 CD28T CD3ζCAR DNA重鏈&輕鏈
Figure 112101087-A0101-12-0142-157
Figure 112101087-A0101-12-0142-158
(SEQ ID NO.83)
選殖株20C5.1 CD28T CD3ζCAR AA重鏈&輕鏈
Figure 112101087-A0101-12-0143-159
Figure 112101087-A0101-12-0143-161
(SEQ ID NO.84)
選殖株20C5.1 CD28 CD3ζCAR DNA重鏈&輕鏈
Figure 112101087-A0101-12-0143-160
Figure 112101087-A0101-12-0144-162
Figure 112101087-A0101-12-0144-163
(SEQ ID NO.85)
選殖株20C5.1 CD28 CD3ζCAR AA重鏈&輕鏈
(信號肽以粗體顯示)
Figure 112101087-A0101-12-0145-164
Figure 112101087-A0101-12-0145-165
(SEQ ID NO.86)
選殖株20C5.1 CD28 CD3ζCAR DNA重鏈&輕鏈
Figure 112101087-A0101-12-0146-166
Figure 112101087-A0101-12-0146-167
(SEQ ID NO.87)
選殖株20C5.1 CD28 CD3ζCAR AA重鏈&輕 鏈
Figure 112101087-A0101-12-0147-168
Figure 112101087-A0101-12-0147-169
(SEQ ID NO.88)
選殖株20C5.1 CD8 CD3ζCAR DNA重鏈&輕鏈
Figure 112101087-A0101-12-0147-170
Figure 112101087-A0101-12-0148-171
Figure 112101087-A0101-12-0148-173
(SEQ ID NO.89)
選殖株20C5.1 CD8 CD3ζCAR AA重鏈&輕鏈
(信號肽以粗體表示)
Figure 112101087-A0101-12-0148-172
Figure 112101087-A0101-12-0149-174
Figure 112101087-A0101-12-0149-175
(SEQ ID NO.90)
選殖株20C5.1 CD8 CD3ζCAR DNA重鏈&輕鏈
Figure 112101087-A0101-12-0150-176
(SEQ ID NO.91)
選殖株20C5.1 CD8 CD3ζCAR AA重鏈&輕鏈
Figure 112101087-A0101-12-0151-177
Figure 112101087-A0101-12-0151-182
(SEQ ID NO.92)
選殖株20C5.2 HC DNA
Figure 112101087-A0101-12-0151-178
Figure 112101087-A0101-12-0151-181
(SEQ ID NO.93)
選殖株20C5.2 AA HC(CDR下方劃線)
Figure 112101087-A0101-12-0151-179
Figure 112101087-A0101-12-0151-180
(SEQ ID NO.94)
選殖株20C5.2 HC AA CDR1：
GFTFSSY(SEQ ID NO.95)
選殖株20C5.2 HC AA CDR2：
SYDGSD(SEQ ID NO.96)
選殖株20C5.2 HC AA CDR3：
ERYSGRDY(SEQ ID NO.97)
選殖株20C5.2 LC DNA
Figure 112101087-A0101-12-0152-183
Figure 112101087-A0101-12-0152-184
(SEQ ID NO.98)
選殖株20C5.2 AA LC(CDR下方劃線)
Figure 112101087-A0101-12-0152-185
Figure 112101087-A0101-12-0152-187
(SEQ ID NO.99)
選殖株20C5.2 AA LC CDR1：
RASQSVSSLLT(SEQ ID NO.100)
選殖株20C5.2 AA LC CDR2：
GASTRAT(SEQ ID NO.101)
選殖株20C5.2 AA LC CDR3：
QQYDTWPFT(SEQ ID NO.102)
選殖株20C5.2 CD28T CD3ζCAR DNA重鏈&輕鏈
Figure 112101087-A0101-12-0152-188
Figure 112101087-A0101-12-0153-189
Figure 112101087-A0101-12-0153-190
(SEQ ID NO.103)
選殖株20C5.2 CD28T CD3ζCAR AA重鏈&輕鏈
(信號肽以粗體表示)
Figure 112101087-A0101-12-0154-191
Figure 112101087-A0101-12-0154-192
(SEQ ID NO.104)
選殖株20C5.2 CD28T CD3ζCAR DNA重鏈&輕鏈
Figure 112101087-A0101-12-0155-193
Figure 112101087-A0101-12-0155-194
(SEQ ID NO.105)
選殖株20C5.2 CD28T CD3ζCAR AA重鏈&輕鏈
Figure 112101087-A0101-12-0156-195
Figure 112101087-A0101-12-0156-197
(SEQ ID NO.106)
選殖株20C5.2 CD28 CD3ζCAR DNA重鏈&輕鏈
Figure 112101087-A0101-12-0156-196
Figure 112101087-A0101-12-0157-198
Figure 112101087-A0101-12-0157-199
(SEQ ID NO.107)
選殖株20C5.2 CD28 CD3ζCAR AA重鏈&輕鏈
(信號肽以粗體表示)
Figure 112101087-A0101-12-0157-200
Figure 112101087-A0101-12-0157-201
(SEQ ID NO.108)
選殖株20C5.2 CD28 CD3ζCAR DNA重鏈&輕鏈
Figure 112101087-A0101-12-0158-202
(SEQ ID NO.109)
選殖株20C5.2 CD28 CD3ζCAR AA重鏈&輕鏈
Figure 112101087-A0101-12-0159-204
(SEQ ID NO.110)
選殖株20C5.2 CD8 CD3ζCAR DNA重鏈&輕鏈
Figure 112101087-A0101-12-0159-203
Figure 112101087-A0101-12-0160-205
Figure 112101087-A0101-12-0160-206
(SEQ ID NO.111)
選殖株20C5.2 CD8 CD3ζCAR AA重鏈&輕鏈
(信號肽以粗體表示)
Figure 112101087-A0101-12-0160-207
(SEQ ID NO.112)
選殖株20C5.2 CD8 CD3ζCAR DNA重鏈&輕鏈
Figure 112101087-A0101-12-0161-208
Figure 112101087-A0101-12-0161-209
(SEQ ID NO.113)
選殖株20C5.2 CD8 CD3ζCAR AA重鏈&輕鏈
Figure 112101087-A0101-12-0162-210
Figure 112101087-A0101-12-0162-211
(SEQ ID NO.114)
選殖株20C5.2 CD28T CD3ζCAR DNA重鏈&輕鏈
Figure 112101087-A0101-12-0163-212
Figure 112101087-A0101-12-0163-213
(SEQ ID NO.115)
選殖株20C5.2 CD28T CD3ζCAR AA重鏈&輕鏈
(信號肽以粗體表示)
Figure 112101087-A0101-12-0164-215
Figure 112101087-A0101-12-0164-217
(SEQ ID NO.116)
選殖株20C5.2 CD28T CD3ζCAR DNA重鏈&輕鏈
Figure 112101087-A0101-12-0164-214
Figure 112101087-A0101-12-0165-218
Figure 112101087-A0101-12-0165-219
(SEQ ID NO.117)
選殖株20C5.2 CD28T CD3ζCAR AA重鏈&輕鏈
Figure 112101087-A0101-12-0166-220
Figure 112101087-A0101-12-0166-221
(SEQ ID NO.118)
選殖株20C5.2 CD28 CD3ζCAR DNA重鏈&輕鏈
Figure 112101087-A0101-12-0167-222
Figure 112101087-A0101-12-0167-223
(SEQ ID NO.119)
選殖株20C5.2 CD28 CD3ζCAR AA重鏈&輕鏈
(信號肽以粗體表示)
Figure 112101087-A0101-12-0168-224
Figure 112101087-A0101-12-0168-225
(SEQ ID NO.120)
選殖株20C5.2 CD28 CD3ζCAR DNA重鏈&輕鏈
Figure 112101087-A0101-12-0168-226
Figure 112101087-A0101-12-0169-227
(SEQ ID NO.121)
選殖株20C5.2 CD28 CD3ζCAR AA重鏈&輕鏈
Figure 112101087-A0101-12-0169-228
(SEQ ID NO.122)
選殖株20C5.2 CD8 CD3ζCAR DNA重鏈&輕鏈
Figure 112101087-A0101-12-0170-229
Figure 112101087-A0101-12-0171-231
Figure 112101087-A0101-12-0171-232
(SEQ ID NO.123)
選殖株20C5.2 CD8 CD3ζCAR AA重鏈&輕鏈
(信號肽以粗體表示)
Figure 112101087-A0101-12-0171-230
(SEQ ID NO.124)
選殖株20C5.2 CD8 CD3ζCAR DNA重鏈&輕鏈
Figure 112101087-A0101-12-0172-233
Figure 112101087-A0101-12-0172-234
(SEQ ID NO.125)
選殖株20C5.2 CD8 CD3ζCAR AA重鏈&輕鏈
Figure 112101087-A0101-12-0173-235
Figure 112101087-A0101-12-0173-236
(SEQ ID NO.126)
CAR信號肽DNA
ATGGCACTCCCCGTAACTGCTCTGCTGCTGCCGTTGGCATTGCTCCTGCACGCCGCACGCCCG(SEQ ID NO.127)
CAR信號肽：
MALPVTALLLPLALLLHAARP(SEQ ID NO.128)
scFv G4S連接子DNA
GGCGGTGGAGGCTCCGGAGGGGGGGGCTCTGGCGGAGGGGGCTCC(SEQ ID NO.129)
scFv G4s連接子：
GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO.130)
額外之G4S連接子：
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO.145)
scFv Whitlow連接子DNA
GGGTCTACATCCGGCTCCGGGAAGCCCGGAAGTGGCGAAGGTAGTACAAAGGGG(SEQ ID NO.131)
scFv Whitlow連接子：
GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO.132)
CD28 AA胞外結構域
Figure 112101087-A0101-12-0174-242
Figure 112101087-A0101-12-0174-243
(SEQ ID NO.133)
GX2X3X4X5X6X7X8X9(SEQ ID NO：134)
X1X2X3X4X5X6(SEQ ID NO：135)
X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12DY(SEQ ID NO：136)
X1ASQX5X6X7X8X9LX11(SEQ ID NO：137)
X1ASX4X5X6X7(SEQ ID NO：138)
QQX3X4X5X6PX8T(SEQ ID NO：139)
CLL-1 AA(又名CLEC12A)
Figure 112101087-A0101-12-0174-240
Figure 112101087-A0101-12-0174-241
(SEQ ID NO.140)
4-1BB核酸序列(胞內結構域)
Figure 112101087-A0101-12-0174-238
Figure 112101087-A0101-12-0174-239
(SEQ ID NO.141)
4-1BB AA(胞內結構域)
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(SEQ ID NO.142)
OX40 AA
RRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI(SEQ ID NO.143)
前導序列AA
MALPVTALLLPLALLLHAARP(SEQ ID NO：144)
<110> 美商凱特製藥公司(KITE PHARMA, INC.) 美商艾恩傑股份有限公司(AMGEN INC.)
<120> 嵌合受體和使用彼之方法
<140> 112101087
<141> 2017-04-05
<150> US 62/317,068
<151> 2016-04-01
<160> 147
<170> PatentIn版3.5
<210> 1
<211> 294
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1
Figure 112101087-A0305-02-0178-5
<210> 2
<211> 98
<212> PRT
<213> 智人
<400> 2
Figure 112101087-A0305-02-0178-7
<210> 3
<211> 90
<212> DNA
<213> 智人
<400> 3
Figure 112101087-A0305-02-0179-9
<210> 4
<211> 30
<212> PRT
<213> 智人
<400> 4
Figure 112101087-A0305-02-0179-10
<210> 5
<211> 81
<212> DNA
<213> 智人
<400> 5
Figure 112101087-A0305-02-0179-13
<210> 6
<211> 27
<212> PRT
<213> 智人
<400> 6
Figure 112101087-A0305-02-0179-14
<210> 7
<211> 123
<212> DNA
<213> 智人
<400> 7
Figure 112101087-A0305-02-0179-15
<210> 8
<211> 41
<212> PRT
<213> 智人
<400> 8
Figure 112101087-A0305-02-0180-17
<210> 9
<211> 336
<212> DNA
<213> 智人
<400> 9
Figure 112101087-A0305-02-0180-18
<210> 10
<211> 112
<212> PRT
<213> 智人
<400> 10
Figure 112101087-A0305-02-0180-19
<210> 11
<211> 117
<212> DNA
<213> 智人
<400> 11
Figure 112101087-A0305-02-0181-21
<210> 12
<211> 39
<212> PRT
<213> 智人
<400> 12
Figure 112101087-A0305-02-0181-23
<210> 13
<211> 288
<212> DNA
<213> 智人
<400> 13
Figure 112101087-A0305-02-0181-24
<210> 14
<211> 96
<212> PRT
<213> 智人
<400> 14
Figure 112101087-A0305-02-0181-25
Figure 112101087-A0305-02-0182-26
<210> 15
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之多核苷酸
<400> 15
Figure 112101087-A0305-02-0182-28
<210> 16
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之多肽
<400> 16
Figure 112101087-A0305-02-0182-29
Figure 112101087-A0305-02-0183-30
<210> 17
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之肽
<400> 17
Figure 112101087-A0305-02-0183-34
<210> 18
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之肽
<400> 18
Figure 112101087-A0305-02-0183-36
<210> 19
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之肽
<400> 19
Figure 112101087-A0305-02-0183-40
<210> 20
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之多核苷酸
<400> 20
Figure 112101087-A0305-02-0183-43
Figure 112101087-A0305-02-0184-44
<210> 21
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之多肽
<400> 21
Figure 112101087-A0305-02-0184-46
<210> 22
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之肽
<400> 22
Figure 112101087-A0305-02-0184-48
<210> 23
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之肽
<400> 23
Figure 112101087-A0305-02-0185-50
<210> 24
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之肽
<400> 24
Figure 112101087-A0305-02-0185-51
<210> 25
<211> 1440
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之多核苷酸
<400> 25
Figure 112101087-A0305-02-0185-53
Figure 112101087-A0305-02-0186-54
<210> 26
<211> 479
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之多肽
<400> 26
Figure 112101087-A0305-02-0186-55
Figure 112101087-A0305-02-0187-56
Figure 112101087-A0305-02-0188-57
<210> 27
<211> 1374
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之多核苷酸
<400> 27
Figure 112101087-A0305-02-0188-58
<210> 28
<211> 458
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之多肽
<400> 28
Figure 112101087-A0305-02-0189-59
Figure 112101087-A0305-02-0190-60
<210> 29
<211> 1467
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之多核苷酸
<400> 29
Figure 112101087-A0305-02-0191-61
<210> 30
<211> 488
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之多肽
<400> 30
Figure 112101087-A0305-02-0191-64
Figure 112101087-A0305-02-0192-65
Figure 112101087-A0305-02-0193-66
<210> 31
<211> 1401
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之多核苷酸
<400> 31
Figure 112101087-A0305-02-0193-67
Figure 112101087-A0305-02-0194-68
<210> 32
<211> 467
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之多肽
<400> 32
Figure 112101087-A0305-02-0194-69
Figure 112101087-A0305-02-0195-70
Figure 112101087-A0305-02-0196-71
<210> 33
<211> 1548
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之多核苷酸
<400> 33
Figure 112101087-A0305-02-0196-73
Figure 112101087-A0305-02-0197-74
<210> 34
<211> 515
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之多肽
<400> 34
Figure 112101087-A0305-02-0197-76
Figure 112101087-A0305-02-0198-77
Figure 112101087-A0305-02-0199-78
<210> 35
<211> 1482
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之多核苷酸
<400> 35
Figure 112101087-A0305-02-0199-79
Figure 112101087-A0305-02-0200-81
<210> 36
<211> 494
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之多肽
<400> 36
Figure 112101087-A0305-02-0200-84
Figure 112101087-A0305-02-0201-85
Figure 112101087-A0305-02-0202-86
<210> 37
<211> 1440
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之多核苷酸
<400> 37
Figure 112101087-A0305-02-0202-87
Figure 112101087-A0305-02-0203-88
<210> 38
<211> 458
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之多肽
<400> 38
Figure 112101087-A0305-02-0203-90
Figure 112101087-A0305-02-0204-91
Figure 112101087-A0305-02-0205-92
<210> 39
<211> 1374
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之多核苷酸
<400> 39
Figure 112101087-A0305-02-0205-94
Figure 112101087-A0305-02-0206-95
<210> 40
<211> 458
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之多肽
<400> 40
Figure 112101087-A0305-02-0206-97
Figure 112101087-A0305-02-0207-98
Figure 112101087-A0305-02-0208-99
<210> 41
<211> 1467
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之多核苷酸
<400> 41
Figure 112101087-A0305-02-0208-100
<210> 42
<211> 488
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之多肽
<400> 42
Figure 112101087-A0305-02-0209-101
Figure 112101087-A0305-02-0210-102
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之多核苷酸
<400> 43
Figure 112101087-A0305-02-0211-103
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之多肽
<400> 44
Figure 112101087-A0305-02-0212-104
Figure 112101087-A0305-02-0213-105
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之多核苷酸
<400> 45
Figure 112101087-A0305-02-0213-108
Figure 112101087-A0305-02-0214-111
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之多肽
<400> 46
Figure 112101087-A0305-02-0214-112
Figure 112101087-A0305-02-0215-113
Figure 112101087-A0305-02-0216-114
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<213> 人工序列
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<400> 47
Figure 112101087-A0305-02-0217-115
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之多肽
<400> 48
Figure 112101087-A0305-02-0217-118
Figure 112101087-A0305-02-0218-119
Figure 112101087-A0305-02-0219-120
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之多核苷酸
<400> 49
Figure 112101087-A0305-02-0219-123
Figure 112101087-A0305-02-0220-124
<210> 50
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之多肽
<400> 50
Figure 112101087-A0305-02-0220-125
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之肽
<400> 51
Figure 112101087-A0305-02-0220-126
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之肽
<400> 52
Figure 112101087-A0305-02-0221-127
<210> 53
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之肽 peptide
<400> 53
Figure 112101087-A0305-02-0221-128
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之多核苷酸
<400> 54
Figure 112101087-A0305-02-0221-129
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之多肽
<400> 55
Figure 112101087-A0305-02-0221-130
Figure 112101087-A0305-02-0222-131
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之肽
<400> 56
Figure 112101087-A0305-02-0222-132
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之肽
<400> 57
Figure 112101087-A0305-02-0222-133
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之肽
<400> 58
Figure 112101087-A0305-02-0222-135
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<213> 人工序列
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Figure 112101087-A0305-02-0223-137
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<213> 人工序列
<220>
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<400> 60
Figure 112101087-A0305-02-0223-138
Figure 112101087-A0305-02-0224-139
Figure 112101087-A0305-02-0225-140
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<400> 61
Figure 112101087-A0305-02-0225-141
Figure 112101087-A0305-02-0226-142
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<213> 人工序列
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<223> 人工序列之描述：合成之多肽
<400> 62
Figure 112101087-A0305-02-0226-143
Figure 112101087-A0305-02-0227-144
Figure 112101087-A0305-02-0228-145
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<400> 63
Figure 112101087-A0305-02-0228-146
Figure 112101087-A0305-02-0229-150
<210> 64
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<213> 人工序列
<220>
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<400> 64
Figure 112101087-A0305-02-0229-153
Figure 112101087-A0305-02-0230-154
Figure 112101087-A0305-02-0231-155
<210> 65
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 人工序列之描述：合成之多核苷酸
<400> 65
Figure 112101087-A0305-02-0231-157
Figure 112101087-A0305-02-0232-158
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之多肽
<400> 66
Figure 112101087-A0305-02-0232-159
Figure 112101087-A0305-02-0233-160
Figure 112101087-A0305-02-0234-161
<210> 67
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之多核苷酸
<400> 67
Figure 112101087-A0305-02-0234-163
Figure 112101087-A0305-02-0235-164
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<220>
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<400> 68
Figure 112101087-A0305-02-0235-166
Figure 112101087-A0305-02-0236-167
Figure 112101087-A0305-02-0237-169
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<220>
<223> 人工序列之描述：合成之多核苷酸
<400> 69
Figure 112101087-A0305-02-0237-170
Figure 112101087-A0305-02-0238-171
<210> 70
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<220>
<223> 人工序列之描述：合成之多肽
<400> 70
Figure 112101087-A0305-02-0238-172
Figure 112101087-A0305-02-0239-173
Figure 112101087-A0305-02-0240-174
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<220>
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<400> 71
Figure 112101087-A0305-02-0240-175
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之多肽
<400> 72
Figure 112101087-A0305-02-0240-178
Figure 112101087-A0305-02-0241-179
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<212> PRT
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<220>
<223> 人工序列之描述：合成之肽
<400> 73
Figure 112101087-A0305-02-0241-180
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<220>
<223> 人工序列之描述：合成之肽
<400> 74
Figure 112101087-A0305-02-0241-182
<210> 75
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之肽
<400> 75
Figure 112101087-A0305-02-0241-183
<210> 76
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之多核苷酸
<400> 76
Figure 112101087-A0305-02-0242-184
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之多肽
<400> 77
Figure 112101087-A0305-02-0242-186
<210> 78
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之肽
<400> 78
Figure 112101087-A0305-02-0242-189
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之肽
<400> 79
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之肽
<400> 80
Figure 112101087-A0305-02-0243-191
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Figure 112101087-A0305-02-0243-193
Figure 112101087-A0305-02-0244-194
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<220>
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<400> 82
Figure 112101087-A0305-02-0244-195
Figure 112101087-A0305-02-0245-196
Figure 112101087-A0305-02-0246-197
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<223> 人工序列之描述：合成之多核苷酸
<400> 83
Figure 112101087-A0305-02-0246-199
Figure 112101087-A0305-02-0247-200
<210> 84
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之多肽
<400> 84
Figure 112101087-A0305-02-0247-201
Figure 112101087-A0305-02-0248-202
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之多核苷酸
<400> 85
Figure 112101087-A0305-02-0249-203
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Figure 112101087-A0305-02-0250-205
Figure 112101087-A0305-02-0251-206
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<213> 人工序列
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Figure 112101087-A0305-02-0252-208
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<220>
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Figure 112101087-A0305-02-0252-210
Figure 112101087-A0305-02-0253-211
Figure 112101087-A0305-02-0254-212
<210> 89
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之多核苷酸
<400> 89
Figure 112101087-A0305-02-0254-213
Figure 112101087-A0305-02-0255-214
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<213> 人工序列
<220>
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<400> 90
Figure 112101087-A0305-02-0255-218
Figure 112101087-A0305-02-0256-219
Figure 112101087-A0305-02-0257-220
<210> 91
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之多核苷酸
<400> 91
Figure 112101087-A0305-02-0257-221
Figure 112101087-A0305-02-0258-222
<210> 92
<211> 493
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之多肽
<400> 92
Figure 112101087-A0305-02-0258-223
Figure 112101087-A0305-02-0259-224
Figure 112101087-A0305-02-0260-225
<210> 93
<211> 351
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之多核苷酸
<400> 93
Figure 112101087-A0305-02-0260-226
<210> 94
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之多肽
<400> 94
Figure 112101087-A0305-02-0261-227
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之肽
<400> 95
Figure 112101087-A0305-02-0261-230
<210> 96
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之肽
<400> 96
Figure 112101087-A0305-02-0262-231
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之肽
<400> 97
Figure 112101087-A0305-02-0262-232
<210> 98
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之多核苷酸
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Figure 112101087-A0305-02-0262-235
<210> 99
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之多肽
<400> 99
Figure 112101087-A0305-02-0262-236
Figure 112101087-A0305-02-0263-237
<210> 100
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之肽
<400> 100
Figure 112101087-A0305-02-0263-238
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之肽
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Figure 112101087-A0305-02-0263-239
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之肽
<400> 102
Figure 112101087-A0305-02-0263-240
<210> 103
<211> 1425
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之多核苷酸
<400> 103
Figure 112101087-A0305-02-0263-242
Figure 112101087-A0305-02-0264-243
<210> 104
<211> 474
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之多肽
<400> 104
Figure 112101087-A0305-02-0264-244
Figure 112101087-A0305-02-0265-245
Figure 112101087-A0305-02-0266-246
<210> 105
<211> 1359
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之多核苷酸
<400> 105
Figure 112101087-A0305-02-0266-248
Figure 112101087-A0305-02-0267-249
<210> 106
<211> 453
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之多肽
<400> 106
Figure 112101087-A0305-02-0267-250
Figure 112101087-A0305-02-0268-251
Figure 112101087-A0305-02-0269-252
<210> 107
<211> 1452
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之多核苷酸
<400> 107
Figure 112101087-A0305-02-0269-254
Figure 112101087-A0305-02-0270-255
<210> 108
<211> 483
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之多肽
<400> 108
Figure 112101087-A0305-02-0270-257
Figure 112101087-A0305-02-0271-258
Figure 112101087-A0305-02-0272-259
<210> 109
<211> 1386
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之多核苷酸
<400> 109
Figure 112101087-A0305-02-0272-260
Figure 112101087-A0305-02-0273-261
<210> 110
<211> 462
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之多肽
<400> 110
Figure 112101087-A0305-02-0273-263
Figure 112101087-A0305-02-0274-264
Figure 112101087-A0305-02-0275-1
<210> 111
<211> 1533
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之多核苷酸
<400> 111
Figure 112101087-A0305-02-0275-267
<210> 112
<211> 509
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之多肽
<400> 112
Figure 112101087-A0305-02-0276-268
Figure 112101087-A0305-02-0277-269
Figure 112101087-A0305-02-0278-2
<210> 113
<211> 1467
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之多核苷酸
<400> 113
Figure 112101087-A0305-02-0278-271
<210> 114
<211> 489
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之多肽
<400> 114
Figure 112101087-A0305-02-0279-272
Figure 112101087-A0305-02-0280-273
<210> 115
<211> 1425
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之多核苷酸
<400> 115
Figure 112101087-A0305-02-0281-274
<210> 116
<211> 474
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之多肽
<400> 116
Figure 112101087-A0305-02-0281-276
Figure 112101087-A0305-02-0282-277
Figure 112101087-A0305-02-0283-279
<210> 117
<211> 1359
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之多核苷酸
<400> 117
Figure 112101087-A0305-02-0283-280
Figure 112101087-A0305-02-0284-281
<210> 118
<211> 453
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之多肽
<400> 118
Figure 112101087-A0305-02-0284-282
Figure 112101087-A0305-02-0285-283
Figure 112101087-A0305-02-0286-284
<210> 119
<211> 1452
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之多核苷酸
<400> 119
Figure 112101087-A0305-02-0286-285
Figure 112101087-A0305-02-0287-286
<210> 120
<211> 483
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之多肽
<400> 120
Figure 112101087-A0305-02-0287-292
Figure 112101087-A0305-02-0288-291
Figure 112101087-A0305-02-0289-293
<210> 121
<211> 1386
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之多核苷酸
<400> 121
Figure 112101087-A0305-02-0289-294
Figure 112101087-A0305-02-0290-295
<210> 122
<211> 462
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之多肽
<400> 122
Figure 112101087-A0305-02-0290-296
Figure 112101087-A0305-02-0291-297
Figure 112101087-A0305-02-0292-299
<210> 123
<211> 1533
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之多核苷酸
<400> 123
Figure 112101087-A0305-02-0292-300
Figure 112101087-A0305-02-0293-301
<210> 124
<211> 510
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之多肽
<400> 124
Figure 112101087-A0305-02-0293-302
Figure 112101087-A0305-02-0294-303
Figure 112101087-A0305-02-0295-304
<210> 125
<211> 1467
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之多核苷酸
<400> 125
Figure 112101087-A0305-02-0295-305
Figure 112101087-A0305-02-0296-306
<210> 126
<211> 489
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之多肽
<400> 126
Figure 112101087-A0305-02-0296-313
Figure 112101087-A0305-02-0297-315
Figure 112101087-A0305-02-0298-316
<210> 127
<211> 63
<212> DNA
<213> 智人
<400> 127
Figure 112101087-A0305-02-0298-317
<210> 128
<211> 21
<212> PRT
<213> 智人
<400> 128
Figure 112101087-A0305-02-0298-318
<210> 129
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之寡核苷酸
<400> 129
Figure 112101087-A0305-02-0298-322
<210> 130
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之肽
<400> 130
Figure 112101087-A0305-02-0298-321
<210> 131
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之寡核苷酸
<400> 131
Figure 112101087-A0305-02-0299-325
<210> 132
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之肽
<400> 132
Figure 112101087-A0305-02-0299-326
<210> 133
<211> 152
<212> PRT
<213> 智人
<400> 133
Figure 112101087-A0305-02-0299-327
<210> 134
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Gly,Phe或Tyr
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> Ser或Thr
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> Ile,Phe或Leu
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> Ser或Thr
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(7)
<223> 可能存在或可能不存在
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> Glu,Gly或不存在
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> Phe,Leu或Tyr
<400> 134
Figure 112101087-A0305-02-0300-328
<210> 135
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> Asp,His,Ser或Tyr
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> His,Pro或Tyr
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> Asp,Glu或Ser
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> Asp或Gly
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> Gly或Ser
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> Asp,Glu或不存在
<400> 135
Figure 112101087-A0305-02-0301-329
<210> 136
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> Glu或Leu
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Arg,Ser或Val
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> Arg或Tyr
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> Cys,Gly或Ser
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> Gly,Ile或不存在
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(8)
<223> 可能存在或可能不存在
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> Trp,Tyr或不存在
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(10)
<223> Pro,Ser或不存在
<220>
<221> MOD_RES
<222> (11)..(11)
<223> Gly,Tyr或不存在
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> Phe或Arg
<400> 136
Figure 112101087-A0305-02-0302-331
<210> 137
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> Gln或Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> Asp或Ser
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> Ile或Val
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(8)
<223> Asn或Ser
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> Phe,Leu或Tyr
<220>
<221> MOD_RES
<222> (11)..(11)
<223> Asn或Thr
<400> 137
Figure 112101087-A0305-02-0303-332
<210> 138
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> Asp或Gly
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> Asn,Ser或Thr
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> Leu或Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> Ala,Glu或Lys
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> Ser或Thr
<400> 138
Figure 112101087-A0305-02-0303-333
<210> 139
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> Ser或Tyr
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> Asp,Gly或Tyr
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> Asn,Ser或Thr
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> Leu,Thr或Tyr
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> Phe或Ile
<400> 139
Figure 112101087-A0305-02-0304-334
<210> 140
<211> 265
<212> PRT
<213> 智人
<400> 140
Figure 112101087-A0305-02-0304-335
Figure 112101087-A0305-02-0305-336
<210> 141
<211> 126
<212> DNA
<213> 智人
<400> 141
Figure 112101087-A0305-02-0305-338
<210> 142
<211> 42
<212> PRT
<213> 智人
<400> 142
Figure 112101087-A0305-02-0305-339
<210> 143
<211> 37
<212> PRT
<213> 智人
<400> 143
Figure 112101087-A0305-02-0305-340
Figure 112101087-A0305-02-0306-341
<210> 144
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之肽
<400> 144
Figure 112101087-A0305-02-0306-342
<210> 145
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之肽
<400> 145
Figure 112101087-A0305-02-0306-343
<210> 146
<211> 112
<212> PRT
<213> 智人
<400> 146
Figure 112101087-A0305-02-0306-345
Figure 112101087-A0305-02-0307-346
<210> 147
<211> 6762
<212> DNA
<213> 慢病毒
<400> 147
Figure 112101087-A0305-02-0307-348
Figure 112101087-A0305-02-0308-349
Figure 112101087-A0305-02-0309-350
Figure 112101087-A0305-02-0310-351

Claims (19)

  1. 一種於活體外製備免疫細胞之方法，其包含於活體外導入多核苷酸至免疫細胞，該多核苷酸編碼與C型凝集素樣-1(CLL-1)結合之嵌合抗原受體(CAR)，其中該CAR包含：結合CLL-1之單鏈Fv(scFv)、跨膜結構域及為CD3ζ的信號傳導結構域之胞內活化結構域，且其中該scFv包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)對，該VH和VL對係選自：(a)包含分別具有胺基酸序列SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18及SEQ ID NO：19的互補決定區(CDR)1、CDR2及CDR3之VH，和包含分別具有胺基酸序列SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23及SEQ ID NO：24的CDR1、CDR2及CDR3之VL；(b)包含分別具有胺基酸序列SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52及SEQ ID NO：53的CDR1、CDR2及CDR3之VH，和包含分別具有胺基酸序列SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57及SEQ ID NO：58的CDR1、CDR2及CDR3之VL；(c)包含分別具有胺基酸序列SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：74及SEQ ID NO：75的CDR1、CDR2及CDR3之VH，和包含分別具有胺基酸序列SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：79及SEQ ID NO：80的CDR1、CDR2及CDR3之VL；及(d)包含分別具有胺基酸序列SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：96及SEQ ID NO：97的CDR1、CDR2及CDR3之VH，和包含分別具有胺基酸序列SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：101及SEQ ID NO：102的CDR1、CDR2及CDR3之VL。
  2. 如請求項1之方法，其中該VH和VL對係選自：(a)包含胺基酸序列SEQ ID NO：16之VH和包含胺基酸序列SEQ ID NO：21之VL；(b)包含胺基酸序列SEQ ID NO：50之VH和包含胺基酸序列SEQ ID NO：55之VL；(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO：72之VH和包含胺基酸序列SEQ ID NO：77之VL；及(d)包含胺基酸序列SEQ ID NO：94之VH和包含胺基酸序列SEQ ID NO：99之VL。
  3. 如請求項1之方法，其中該CD3ζ的信號傳導結構域包含胺基酸序列SEQ ID NO：10。
  4. 如請求項1至3中任一項之方法，其中該CAR進一步包含至少1個共刺激結構域信號傳導區。
  5. 如請求項4之方法，其中該共刺激結構域信號傳導區係CD28、OX-40、4-1BB、CD27或ICOS之信號傳導區。
  6. 如請求項4之方法，其中該共刺激結構域信號傳導區包含SEQ ID NO：8。
  7. 如請求項6之方法，其中該CAR包含SEQ ID NO：2。
  8. 如請求項1至3中任一項之方法，其中該 跨膜結構域係CD28或CD8跨膜結構域。
  9. 如請求項8之方法，其中該跨膜結構域係CD28跨膜結構域，該CD28跨膜結構域包含SEQ ID NO：6。
  10. 如請求項8之方法，其中該CAR包含(a)如SEQ ID NO：2所示之CD28胞外和跨膜結構域，或(b)如SEQ ID NO：14所示之CD8胞外和跨膜結構域。
  11. 如請求項1至3中任一項之方法，其中該VH與該VL係藉由連接子連接，該連接子包含SEQ ID NO：130或SEQ ID NO：132之至少一者。
  12. 如請求項1之方法，其中該CAR包含胺基酸序列，該胺基酸序列係選自：(a)SEQ ID NO：26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46或48；(b)SEQ ID NO：60、62、64、66、68或70；(c)SEQ ID NO：82、84、86、88、90或92；及(d)SEQ ID NO：104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124或126。
  13. 如請求項1之方法，其中該多核苷酸包含核酸序列，該核酸序列係選自：(a)SEQ ID NO：25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45或47；(b)SEQ ID NO：59、61、63、65、67或69；(c)SEQ ID NO：81、83、85、87、89或91；及(d)SEQ ID NO：103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123或125。
  14. 如請求項1至3中任一項之方法，其中該多核苷酸係經由載體導入該免疫細胞。
  15. 如請求項14之方法，其中該載體係逆轉錄病毒載體、DNA載體、質粒、RNA載體、腺病毒載體、腺病毒相關載體或慢病毒載體。
  16. 如請求項1至3中任一項之方法，其中該免疫細胞為T細胞、腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)、NK細胞或NK-T細胞。
  17. 如請求項16之方法，其中該免疫細胞為自體T細胞。
  18. 如請求項16之方法，其中該免疫細胞為同種異體T細胞。
  19. 如請求項1至3中任一項之方法，其中該導入係藉由轉染或轉導。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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WO2015142675A2 (en) 2014-03-15 2015-09-24 Novartis Ag Treatment of cancer using chimeric antigen receptor

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