KR20140060541A

KR20140060541A - 암을 치료하기 위한 rna 조작된 t 세포

Info

Publication number: KR20140060541A
Application number: KR1020147007294A
Authority: KR
Inventors: 칼 에이치. 준; 양빙 자오
Original assignee: 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아
Priority date: 2011-09-16
Filing date: 2012-09-17
Publication date: 2014-05-20
Also published as: BR112014006176A2; US10421960B2; MX2014003176A; WO2013040557A2; US20140227237A1; SG11201400527XA; EP2756521A4; EP2756521A2; US20200087659A1; CA2848410A1; US11274298B2; CN103946952A; US20220170012A1; AU2012308205A1; BR112014006176A8; WO2013040557A3; IL231171A0; EA201490636A1; JP2014533928A

Abstract

본 발명은 RNA 키메라 항원 수용체(CAR) 형질감염된 T 세포를 생성하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. RNA-조작된 T 세포는 암을 치료하기 위한 양자 치료에 사용될 수 있다.

Description

암을 치료하기 위한 RNA 조작된 T 세포 {RNA ENGINEERED T CELLS FOR THE TREATMENT OF CANCER}

관련 출원의 상호참조

본원은 2011년 9월 16일자로 제출된 미국 가출원번호 제61/535,608호에 대한 우선권을 주장하고, 이의 내용은 전체가 본원에서 참조로서 도입된다.

이식편-대-백혈병(GVL) 효과는 조혈 간세포 이식(SCT)을 받은 환자에서 확립되어 있고, 이는 급성 림파구성 백혈병(ALL)이 세포 면역-매개된 경로에 의해 조절될 수 있고, ALL에 대한 공여체 림프구 주입의 상대적 효능 결핍은 백혈병 세포가 불충분하게 면역원성임을 시사한다. 불충분한 종양 면역원성을 극복할 수 있고, SCT를 포함하여 고위험성 및 재발성 질환의 치료에 사용된 표준 방법보다 낮은 독성을 갖는 ALL의 치료에 효과적인 가능성을 가질 수 있는 새로운 방법이 추구될 필요가 있다[참조: Horowitz, et al., 1990, Blood 75(3):555-562; Mehta, 1993, Leuk Lymphoma 10(6):427-432].

키메라 항원 수용체(CAR)는 종양 관련 표면 항원에 대한 항체-기반 특이성을, 특이적 항-종양 세포 면역 활성을 갖는 T 세포 수용체-활성화 세포내 도메인과 조합한 분자이다[참조: Eshhar, 1997, Cancer Immunol Immunother 45(3-4) 131-136; Eshhar et al., 1993, Proc Natl Acad Sci U S A 90(2):720-724; Brocker and Karjalainen, 1998, Adv Immunol 68:257-269]. 이들 CAR은, T 세포 활성화 및 공자극 신호를 제공하는 세포내 도메인에 융합된 단일 사슬 Fv(scFv) 항원-특이적 세포외 영역을 통해 T 세포가 MHC-독립적 1차 활성화를 달성하는 것을 가능하게 한다. 제2 및 제3 세대의 CAR은 또한 CD28 및/또는 CD137(4-1BB) 세포내 활성화 모티프를 통해 적절한 공-자극 신호를 제공하고, 이는 다양한 고형 종양 및 백혈병 모델에서 사이토킨 분비 및 항-종양 활성을 증대시킨다[참조: Pinthus, et al,, 2004, J Clin Invest 114(12):1774-1781; Milone, et al., 2009, Mol Ther 17(8):1453-1464; Sadelain, et al., 2009, Curr Opin Immunol 21(2):215-223].

대부분의 연구자들은 레트로바이러스 또는 HIV-유래된 렌티바이러스를 통해 사람 T 세포 내로 사람 종양 및 HIV 항원의 효율적인 CAR 유전자 전달을 달성했고, 이들 세포 치료 생성물 중 일부는 상 I/II 실험으로 진행되었다[참조: Deeks et al., 2002, Mol Ther 5(6):788-797; Kershaw, et al., 2006, Clin Cancer Res 12(20 Pt 1):6106-6115; Pule, et al., 2008, Nat Med 14(11):1264-1270; Till, et al., 2008, Blood 112(6):2261-2271]. 최근 들어, CLL을 갖는 3명의 환자에서 CD19-표적화된 CAR+ T 세포의 사용이 보고되었다[참조: Porter et al., 2011, N Eng J Med, 365: 725-733]. 난치성 질환과 높은 종양 부하로 이들 3명 환자 중의 2명은 4주 후에 완전 관해(remission)에 들어갔다. 이들 반응은 지속되었고, CAR+ T 세포는 6개월 이상 동안 지속했으며, 이는 이러한 기술의 효능을 시사한다. 통합 바이러스 벡터를 사용한 방법은 명백한 잇점을 갖고, 이는 다중 세포 분화 사이에서 주입된 세포에 대한 CAR의 장기간 발현을 포함한다. 그러나, CAR 설계 혁신을 급속하게 도입하는 반복 임상 시험은 방출 시험의 복잡성 및 높은 벡터 생산 비용 때문에 바이러스 벡터를 사용하여 수행하는 것이 곤란할 수 있다. 또한, 이러한 방법을 사용하는 조절 개념이 있다. 이는 X-연쇄 중증 조합된 면역결핍증의 치료에서 조혈 간세포의 유전자 변형에 사용된 레트로바이러스 벡터의 경우에 명백하게 관찰되었다[참조: Hacein-Bey-Abina et al., 2008, J Clin Invest 118(9):3132-3142]. 레트로바이러스 벡터의 경우 또는 성숙 림프구의 유전자 변형의 설정에 있어서, 이는 이론적 관심사지만, 이는 유전자의 조절인자 및 세포 치료 기술의 문제이다.

전기천공-매개된 mRNA 형질감염은 세포의 영구적 유전자 변형을 생성하지 않는 유전자 발현을 위한 잠재적 보완 방법이다. 유전자 치료 적용을 위한 mRNA의 사용은 리포좀 매개된 형질전환과 관련하여 말론 등(Malone et al.)에 의해 최초로 기재되었다[참조: Malone, et al., 1989, Proc Natl Acad Sci U S A 86(16):6077-6081]. 1차 T 림프구 내로 mRNA의 성공적 전기천공은 현재 개발되어 있고 효율적 TCR 유전자 전달을 위해 사용되고 있다[참조: Zhao, et al., 2006, Mol Ther 13(1):151-159; Zhao, et al., 2005, J Immunol. 174(7):4415-4423]. 보다 최근에, Her2/neu 항원에 대해 지시된 CAR은 mRNA 전기천공에 의해 T 세포 내로 도입되었고, 유방암 이종이식 모델에서 Her2/neu 항체보다 더욱 효과적인 것으로 밝혀졌다[참조: Yoon, et al., 2009, Cancer Gene Ther 16(6):489-497]. mRNA 전기 천공에 의해 T 세포 내로 도입된 다른 사람 표적 항원-지시된 CAR은 CEA 및 ErbB2를 표적화하는 것들을 포함한다[참조: Birkholz et al., 2009, Gene Ther 16(5):596-604]. 다수의 논문은 종양내 주사후 또는 국소 주사 복강내 모델에서 고형 종양에서의 방법을 사용한 효능을 보고하고 있지만, 유사한 성공은 일시적 발현 시스템을 사용한 산재성 모델에서 효능 달성의 곤란성으로 인해 산재성 백혈병 임상전 모델에서 입증되지 않았다[참조: Rabinovich, et al., 2009, Hum Gene Ther 20(1):51-61].

CD19는 B 세포로 한정된 표면 항원이고, 초기 프리-B 세포 및 대부분의 B 세포 백혈병 및 림프종 상에서 발현된다[참조: Nadler, et al., 1983 J Immunol 131(1):244-250]. 이는 CD19가, 조혈간세포가 아닌 악성 세포 계통과 조기 및 성숙 B 림프구의 특정의 서브셋 상에서 발현되는 표적 치료를 위한 매력적인 항원으로 되게 한다. CD19 고갈은 CD19 음성 전구체 모집단으로부터 정상 B 세포 풀의 최종적 복구를 가능하게 하는 것으로 추정되었다[참조: Cheadle et al., 2010, J Immunol 184(4):1885-1896]. 리툭시맵의 경험, B 세포 악성종양 및 자가면역 질환의 치료에 사용된 항-CD20 모노클로날 항체는 치료 유도된 B 세포 결손이 양호하게 허용되는 것으로 밝혀졌다[참조: Plosker and Figgitt, 2003, Drugs 63(8):803-843; van Vollenhoven, et al., 2010, J Rheumatol 37(3):558-567].

CTL의 양자 전달은 바이러스 감염 및 암 둘 다에서 큰 기대를 나타내고 있다. 키메라 항원 수용체(CAR) T-세포 치료를 사용한 수년간의 실망스런 결과 후, 개선된 배양 시스템 및 세포 조작 기술은 보다 강력한 항종양 효과를 갖는 CAR T 세포를 유도하고 있다[참조: Sadelain et al., 2009, Curr Opin Immunol 21:215-23]. 최근 임상 시험의 결과는 레트로바이러스 벡터에 도입된 CAR를 사용한 개선된 임상 결과를 나타낸다[참조: Till et al., 2008, Blood 112:2261-71; Pule et al., 2008, Nat Med 14:1264-70]. 놀라운 것은 아니지만, 이들 CAR T 세포는 또한 증강된 독성을 나타낸다[참조: Brentjens et al., 2010, Mol Ther 18:666-8; Morgan et al., 2010, Mol Ther 18:843-51]. 최근의 사설은 보다 안전한 CAR의 필요성이 논의되어 있다[참조: Heslop, 2010, Mol Ther 18:661-2; Buning et al., 2010, Hum Gene Ther 21:1039-42].

따라서, CTL의 양자 전달에 영향을 미치기 위해 추가의 조성물 및 방법을 제공하기 위한 조성물 및 방법에 대한 급박한 필요성이 당해 기술분야에 존재한다. 본 발명은 이러한 필요성을 다루고 있다.

본 발명은 세포외 도메인, 막통과 도메인, 공자극 신호전달 영역 및 CD3-제타의 신호전달 도메인을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 시험관내 전사된 RNA 또는 합성 RNA를 제공한다. 한 가지 실시양태에서, 상기 세포외 도메인은 항원 결합 부분을 포함한다. 한 가지 실시양태에서, 상기 항원 결합 부분은 종양 항원에 결합한다. 한 가지 실시양태에서, 상기 종양 항원은, 뇌암, 방광암, 유방암, 자궁경부암, 결장직장암, 간암, 신장암, 림프종, 백혈병, 폐암, 흑색종, 전이성 흑색종, 중피종, 신경아세포종, 난소암, 전립선암, 췌장암, 신장암, 피부암, 흉선암, 육종, 비-호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 자궁암 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 암과 관련된 항원이다.

한 가지 실시양태에서, RNA는 시험관내 전사 벡터로부터 전사되고, 상기 벡터는 pD-A.ss1.OF.BBZ.2bg.150A이다. 한 가지 실시양태에서, 상기 벡터는 서열번호 4의 핵산 서열을 포함한다. 한 가지 실시양태에서, RNA가 전사되는 DNA는 서열번호 6 및 서열번호 8로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열을 포함한다.

한 가지 실시양태에서, 상기 RNA는 시험관내 전사 벡터로부터 전사되고, 상기 벡터는 pD-A.19.OF.2bg.150A이다. 한 가지 실시양태에서, 상기 벡터는 서열번호 5의 핵산 서열을 포함한다. 한 가지 실시양태에서, RNA가 전사되는 DNA는 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23 및 서열번호 24로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열을 포함한다.

한 가지 실시양태에서, 상기 RNA는 시험관내 전사 벡터로부터 전사되고, 상기 벡터는 pD-A.GD2.OF.8TMBBZ.2bg.150A이다. 한 가지 실시양태에서, 상기 벡터는 서열번호 28의 핵산 서열을 포함한다. 한 가지 실시양태에서, RNA가 전사되는 DNA는 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12 및 서열번호 13으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열을 포함한다.

한 가지 실시양태에서, 상기 RNA는 시험관내 전사 벡터로부터 전사되고, 상기 벡터는 pD-A.cMet.OF.8TMBBZ.2bgUTR.150A이다. 한 가지 실시양태에서, 상기 벡터는 서열번호 27의 핵산 서열을 포함한다. 한 가지 실시양태에서, RNA가 전사되는 DNA는 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 17 및 서열번호 18로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열을 포함한다.

한 가지 실시양태에서, 상기 공자극 신호전달 영역은 CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 림프구 기능 관련 항원-1(LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, CD83에 특이적으로 결합하는 리간드 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 공자극 분자의 세포내 도메인을 포함한다.

한 가지 실시양태에서, 상기 핵산 서열은 약 150개 아데노신 염기를 포함하는 폴리(A) 테일을 포함한다. 한 가지 실시양태에서, 상기 핵산 서열은 사람 베타-글로불린으로부터 유래하는 3' UTR의 적어도 하나의 반복체를 포함하는 3' UTR을 포함한다.

본 발명은 또한, 세포외 도메인, 막통과 도메인, 공자극 신호전달 영역 및 CD3-제타의 신호전달 도메인을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 시험관내 전사된 RNA 또는 합성 RNA를 포함하는 T 세포를 제공한다. 한 가지 실시양태에서, 상기 세포외 도메인은 항원 결합 부분을 포함한다. 한 가지 실시양태에서, 상기 항원 결합 부분은 종양 항원에 결합한다. 한 가지 실시양태에서, 상기 종양 항원은 뇌암, 방광암, 유방암, 자궁경부암, 결장직장암, 간암, 신장암, 림프종, 백혈병, 폐암, 흑색종, 전이성 흑색종, 중피종, 신경아세포종, 난소암, 전립선암, 췌장암, 신장암, 피부암, 흉선암, 육종, 비-호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 자궁암 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 암과 관련된 항원이다.

한 가지 실시양태에서, 상기 RNA는 시험관내 전사 벡터로부터 전사되고, 상기 벡터는 pD-A.ss1.OF.BBZ.2bg.150A이다. 한 가지 실시양태에서, 상기 벡터는 서열번호 4의 핵산 서열을 포함한다. 한 가지 실시양태에서, RNA가 전사되는 DNA는 서열번호 6 및 서열번호 8로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열을 포함한다.

한 가지 실시양태에서, 상기 RNA는 시험관내 전사 벡터로부터 전사되고, 상기 벡터는 pD-A.19.OF.2bg.150이다. 한 가지 실시양태에서, 상기 벡터는 서열번호 5의 핵산 서열을 포함한다. 한 가지 실시양태에서, RNA가 전사되는 DNA는 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23 및 서열번호 24로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열을 포함한다.

한 가지 실시양태에서, 상기 RNA는 시험관내 전사 벡터로부터 전사되고, 상기 벡터는 pD-A.GD2.OF.8TMBBZ.2bg.150A이다. 한 가지 실시양태에서, 상기 벡터는 서열번호 28의 핵산 서열을 포함한다. 한 가지 실시양태에서, RNA가 전사되는 DNA는 서열번호10, 서열번호 11, 서열번호 12 및 서열번호 13으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열을 포함한다.

한 가지 실시양태에서, 상기 RNA는 시험관내 전사 벡터로부터 전사되고, 상기 벡터는 pD-A.cMet.OF.8TMBBZ.2bgUTR.150A이다. 한 가지 실시양태에서, 상기 벡터는 서열번호 27의 핵산 서열을 포함한다. 한 가지 실시양태에서, RNA가 전사되는 DNA는 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17 및 서열번호 18로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열을 포함한다.

본 발명은 또한 외인성 RNA를 일시적으로 발현하는 RNA-조작된 T 세포의 모집단을 생성하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 시험관내 전사된 RNA 또는 합성 RNA를 T 세포에 도입하는 것을 포함하고, 상기 RNA는 세포외 도메인, 막통과 도메인, 공자극 신호전달 영역 및 CD3-제타의 신호전달 도메인을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 한 가지 실시양태에서, 상기 세포외 도메인은 항원 결합 부분을 포함한다. 한 가지 실시양태에서, 상기 항원 결합 부분은 종양 항원에 결합한다. 한 가지 실시양태에서, 상기 종양 항원은 뇌암, 방광암, 유방암, 자궁경부암, 결장직장암, 간암, 신장암, 림프종, 백혈병, 폐암, 흑색종, 전이성 흑색종, 중피종, 신경아세포종, 난소암, 전립선암, 췌장암, 신장암, 피부암, 흉선암, 육종, 비-호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 자궁암 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 암과 관련된 항원이다.

본 발명은 또한, 암 환자를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 외인성 RNA를 일시적으로 발현하도록 조작된 T 세포를 상기 환자에게 투여하는 것을 포함하고, 상기 RNA는 세포외 도메인, 막통과 도메인, 공자극 신호전달 영역 및 CD3-제타의 신호전달 도메인을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 방법을 제공한다. 한 가지 실시양태에서, 상기 세포외 도메인은 항원 결합 부분을 포함한다. 한 가지 실시양태에서, 상기 항원 결합 부분은 종양 항원에 결합한다. 한 가지 실시양태에서, 상기 종양 항원은 뇌암, 방광암, 유방암, 자궁경부암, 결장직장암, 간암, 신장암, 림프종, 백혈병, 폐암, 흑색종, 전이성 흑색종, 중피종, 신경아세포종, 난소암, 전립선암, 췌장암, 신장암, 피부암, 흉선암, 육종, 비-호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 자궁암 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 암과 관련된 항원이다.

한 가지 실시양태에서, 상기 방법은 T 세포의 투여를 반복하는 것을 포함한다. 한 가지 실시양태에서, 상기 방법은 화학치료제를 상기 환자에게 투여하는 것을 포함한다.

한 가지 실시양태에서, 상기 RNA는 시험관내 전사 벡터로부터 전사되고, 상기 벡터는 pD-A.GD2.OF.8TMBBZ.2bg.150A이다. 한 가지 실시양태에서, 상기 벡터는 서열번호 27의 핵산 서열을 포함한다. 한 가지 실시양태에서, RNA가 전사되는 DNA는 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12 및 서열번호 13으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열을 포함한다.

본 발명의 바람직한 실시양태의 하기 상세한 설명은 첨부된 도면과 관련하여 읽을 때에 보다 잘 이해될 것이다. 본 발명을 설명할 목적으로, 현재 바람직한 실시양태가 도면에 도시되어 있다. 그러나, 본 발명은 도면에 도시된 실시양태의 정확한 배열 및 수단으로 한정되지 않는 것으로 이해되어야 한다.
도 1(도 1A 및 1B 포함)은 UTR의 변형에 의한 mRNA의 최적화가 전기천공된 T 세포에서 CAR의 고도 발현을 부여하는 것을 입증하는 일련의 이미지이다. 도 1A는 5' UTR 또는 3' UTR의 상이한 변형을 갖는 ss1-bbz 작제물의 모식도를 나타낸다. ss1-bbz(pGEM-ss1bbz.64A)을 함유하는 pGEM-기반 IVT 벡터는, 본원의 다른 부분에서 기재된 바와 같이, 3' UTR(2bgUTR.64A), 5' UTR(SP163.64A), 보다 긴 폴리(A) 테일(150A), 또는 3' UTR 및 보다 긴 폴리(A)(2bgUTR.150A)를 부가하기 위해 변형시켰다. 도 1B는 변형된 작제물로부터 제조한 RNA가 T 세포 내로 전기천공되었고 도입유전자 발현이 유동 세포계수에 의해 수행되었음을 입증하는 이미지이다. 도 1Bi는 전기천공후 1일에서 도입유전자 발현의 막대그래프를 나타내는 이미지이다. 도 1Bii는 전기천공후 4일에서 CAR의 평균 형광 강도(MFI)를 나타내는 이미지이다. 데이타는 적어도 2회의 독립적 실험의 대표예이다.
도 2(도 2A 내지 2C 포함)는 RNA 캡핑의 최적화가 천기천공된 T 세포 상에서의 CAR 발현을 증강 및 지속시키는 것을 입증하는 일련의 이미지이다. 도 2A는 T 세포가, 2.5㎍/100㎕의 고정된 RNA 용량에서 RC 유사체, ARCA 또는 CE의 사용을 포함하는 지시된 캡핑 방법에 의해 캡핑된 IVT RNA로 전기천공되었음을 입증하는 이미지이다. 도입유전자 발현은 천기천공(EP)후 지시된 시간에서 유동 세포계수를 사용하여 MFI를 측정함으로써 모니터링되었다. 도 2B는 상기 실험으로부터의 T 세포가, 도입유전자를 발현하는 세포 분획을 측정하기 위해 유동 세포계수에 의해 모니터링되었음을 입증하는 이미지이다. 도 2C는, 10㎍ RNA/100㎕ T 세포의 RNA 용량으로, ARCA, CE, 부가 폴리(A)(CE+A)를 갖는 CE, CE 시스템-생성된 cap1 RNA(CE1) 또는 CE 시스템-생성된 cap1 RNA + 효소 폴리(A)(CE1+A)를 포함하는 상이한 캡핑 방법에 의해 캡핑된 ss1-bbz를 인코딩하는 IVT RNA로 전기천공된 T 세포를 나타내는 이미지이다. 도입유전자 발현은 전기천공후 3일 동안 유동 세포계수(MFI)에 의해 모니터링되었다. 데이타는 2회의 독립적 실험의 대표예이다.
도 3(도 3A 내지 3D 포함)은, 조절-순응 벡터 작제물로부터 생성된 RNA를 사용한 지속된 RNA CAR 발현 및 기능을 입증하는 일련의 이미지이다. 전기천공후 4시간에서, 지시된 RNA로 전기천공된 T 세포는 16시간 동안 K562-메소 또는 K562-CD19와 함께 공배양했다. 도 3A는 항원 특이적 T 세포 활성화가 4-1BB 발현의 유도에 의해 측정되었음을 입증하는 이미지이다. 도 3B는 IL-2 생성이 ELISA에 의해 측정되었음을 입증하는 이미지이다. 도 3C는 자극된 T 세포가 pD-A.ss1.OF(상부) 또는 pD-A.19.OF(하부)로부터 생성된 임상 등급 RNA(10㎍ RNA/100㎕ T 세포)로 전기천공되었고 도입유전자 발현이 지시된 시간에서 모니터링되었음을 입증하는 이미지이다. 도 3D는 전기천공후 1일에서 RNA-조작된 T-세포 기능이, 지시된 RNA CAR을 발현하는 T 세포를 K562-CD19 또는 K562-메소 표적과 함께 4시간 동안 공배양한 후에 CD107a 표면 전좌를 측정함으로써 시험되었음을 입증하는 이미지이다. 효과기 세포는 CD3 상에서 게이팅되었다. 데이타는 적어도 2회의 독립적 실험의 대표예이다.
도 4(도 4A 내지 4C 포함)는, RNA-조작된 T 세포로 처리된 마우스에서 고도로 혈관신생된 종양의 퇴화를 입증하는 일련의 이미지이다. 도 4A는 측복부 종양이 NOD/scid/γc(-/-)(NSG) 마우스(n=6)에서 M108 주사(피하)에 의해 확립되었음을 입증하는 이미지이다. 종양 접종후 66일에서, 마우스를 랜덤화하여 종양 부하를 균등화하고, ss1-bbz RNA-전기천공된 T 세포로 처리했다. T 세포(10×10⁶ 내지 15×10⁶)는 동일한 건강한 공여체를 사용하여 4일마다 합계 4회 주사로 종양내 주사하고, 염수로 처리한 마우스를 대조군(n=3)으로 사용했다. 종양 크기는 매주 측정했다. 도 4B는 산재성 복강내 종양이 8×10⁶M108-Luc 세포로 복강내 주사에 의해 NSG 마우스(n=그룹당 6마리)에서 확립되었음을 입증하는 이미지이다. 58일에 개시하여, ss1-bbz을 발현하는 RNA CAR-전기천공된 T 세포(1×10⁷)는 2주 동안 매주 2회 주사했다. CD19-bbz RNA CAR을 발현하는 RNA-조작된 T 세포 또는 염수는 대조군으로 주사했다. 78일에, 형광 신호는 CD19-bbz 마우스와 비교하여 ss1-bbz 마우스에서 유의적으로 감소되었다(P < 0.01). 도 4C는 렌티바이러스 벡터를 사용하여 ss1-bbz CAR을 발현하는 T 세포(1×10⁷)의 58일에서의 단일 주사로 처리한 단일 마우스로부터의 BLI를 나타내는 이미지이다. 도 4B에 기재된 실험용의 BLI 데이타가 플롯팅되어 있다. Bar, SE. *, P < 0.05; **, P < 0.01. 염수 그룹 중의 BLI 신호는 이미지화 시스템의 포화에 기인하여 최고로 절단된다.
도 5(도 5A 내지 5C 포함)은 자가 RNA-조작된 T 세포의 복수 주사가 이종 마우스 모델에서 고도 산재성 암의 성장을 조절한다는 것을 입증하는 일련의 이미지이다. 도 5A는 NOD/scid/γc(-/-) 마우스(n=30)에 8×10⁶ M108-Luc 종양 세포를 주입하고(복강내) 마우스를 3개 그룹으로 랜덤화한 다음, 종양 접종후 56일에서 ss1-bbz CAR, 대조군 CD19-bbz CAR 또는 염수를 발현하는 RNA-전기천공된 자가 T 세포를 사용한 치료를 개시하는 것을 입증하는 이미지이다. 자가 T 세포는 복강내 주사하고, 이미지는 지시된 바와 같이 생존 세포에서 실시했다. 이미지화는 T-세포 처리 개시전 5일에 개시했다. 종양 BLI는 초기 6회 용량 후에 CD19 CAR(243.6%) 및 염수 마우스(237.1%) 둘 다와 비교하여 ss1 CAR 마우스(38.6%)에서 유의적으로 감소되었다(P < 0.05). 도 5B는 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 분석을 입증하는 이미지이다. 중앙 생존은 CD19 CAR 및 염수 마우스와 비교하여 ss1 CAR 마우스에서 유의적으로 더 컸다(P < 0.05). 도 5C는, 총 체중의 평균 변화가 마우스의 CD19 CAR 및 염수 그룹 둘 다와 비교하여 보다 낮기 때문에, 유의적으로 적은 복수가 ss1 CAR 마우스에서 축적되었음을 입증하는 이미지이다(P < 0.001).
도 6은 T 세포 상에서 상이한 수준의 CAR 도입유전자 발현을 나타내는 이미지이다. 활성화된 T 세포는, 지시된 신호전달 부분와 함께 항-메소텔린 scFv ss1 CAR을 인코딩하는 RNA로 전기천공하고, 유동 세포계수를 사용하여 전기천공후 19시간에서 표면 발현을 측정했다. RNA 없이 전기천공한 T 세포를 음성 대조군으로 사용했다. 데이타는 적어도 2회의 독립적 실험의 대표예이다.
도 7은 상이한 방법으로 생성한 ss1 RNA CAR로 천기천공한 T 세포를 전기천공 1일 후에 메소텔린 발현 표적(K562-메소) 또는 대조군 표적(K562-CD19)과 함께 1:1로 공배양하고, 48시간 동안 배양한 후에 표면 도입유전자 발현(MFI)를 유동 세포계수에 의해 측정한 것을 입증하는 이미지이다. 약어: ARCA, 항-역 캡핑 유사체, CE1+A, 캡핑 효소 1 + 긴 폴리(A); CE1, 64 폴리(A)를 갖는 캡핑 효소 1; CE+A, 캡핑 효소 + 긴 폴리(A) 150; RC, 정규 캡핑 유사체; NoEP, 전기천공된 유사체. 데이타는 2회의 독립적 실험의 대표예이다.
도 8은 전기천공후 20시간에서 이들의 모 벡터 pDrive-ss1.2bgUTR.150A (pDrive.ss1) 및 pDrive-19.2bgUTR.150A(pDrive.19)와 비교하여 임상 등급 IVT 벡터 pD-A.ss1.OF(ss1.OF) 및 pD-A.19.OF(19.OF)로부터 생성된 RNA로 전기천공된 T 세포의 도입유전자 발현을 나타내는 이미지이다. 데이타는 적어도 2회의 독립적 실험의 대표예이다.
도 9는 ss1-bbz 또는 19-bbz CAR RNA로 전기천공된 T 세포의 특이적 용해 활성을 나타내는 이미지이다. 전기천공후 20시간에서, 10:1의 효과기:표적 비로 표지된 K562-CD19 또는 K562-메소 표적의 혼합물을 함유하는 4시간 유동-기반 CTL 분석을 사용했다. 우상의 상한에 기록된 퍼센트 값은 관련 표적에 대해 계산된 특이적 사멸이다. 데이타는 적어도 2회의 독립적 실험의 대표예이다.
도 10은 도 4A에 제시된 바와 같이 처리한 마우스를 종양 접종후 98일에 희생시키고 사진촬영한 것을 입증하는 이미지이다. 화살표는 종양을 가리킨다.
도 11은 도 5에 기재된 바와 같이 종양에 대해 자가성인 RNA-조작된 T 세포의 복수 주사를 시험하는 실험을 위한 BLI 및 T 세포의 스케줄을 나타내는 이미지이다. 30마리 마우스에게 8×106 M108-Luc 종양 세포를 주사하고(IP), 마우스를 3개 그룹으로 랜덤화한 다음, 56일에 지시된 CAR로 전기천공한 자가 T 세포를 사용한 치료를 개시했다. T 세포 주사(주사당 1×10⁷ T 세포) 및 BLI의 시간이 지시되어 있다. BLI를 T 세포 주사전 5일에 개시하여 종양 부하의 기준선 측정치를 제공했다.
도 12(도 12A 내지 12D 포함)은 최적화된 mRNA 전기천공 과정이 시험관내에서 RNA-조작된 T 세포의 균일한 고도의 표면 발현 및 특이적 기능을 제공하는 것을 입증하는 일련의 이미지이다. 도 12A는 항-CD3 및 CD28 자극된 말초혈 T 세포(무색 막대그래프)에서 CD19-BBz mRNA로 전기천공한 후에 상이한 시점에서 평균 형광 강도(MFI)에 의해 측정한 CAR 발현을 나타내는 이미지이고; 비-전기천공된 T 세포를 음성 대조군으로 사용했다(도색 막대그래프). 도 12B는 RNA CAR+ T 세포가 CD19 표적을 특이적으로 사멸시키는 것을 입증하는 이미지이다. 유동 기반 CTL 분석은 표적으로서 K562-CD19 및 대조군으로서 K562-메소를 사용한 전기천공후 지시된 일후에 수행했다. 도 12C는 PBL가 ss1-BBz, CD19-BBz 또는 무 mRNA(유사체)로 전기천공된 것을 입증하는 이미지이다. 전기천공후 4시간에서, T 세포를 K562, NALM-6, 또는 CD19(K562-CD19) 또는 메소텔린(K562-메소)를 발현하는 K562와 공배양하고, CD107a 염색에 대해 분석했다. CD3 양성 T 세포는 게이팅되었다. 항원 특이적 CD107a 발현이 유일하게 관찰되었다. 도 12D는 전기천공후 4시간에서, CD19-BBz 또는 ss1-BBz을 인코딩하는 mRNA로 전기천공된 T 세포를 16시간 동안 K562-메소 또는 K562-CD19 표적 세포와 함께 공배양한 것을 입증하는 이미지이다. IL-2 생성은 항원 특이적 방식으로 IL-2 생성의 유의적 증가(* = p < 0.01)와 함께 ELISA에 의해 상청액에서 측정했다. 데이타는 적어도 2회의 독립적 실험의 대표예이다.
도 13(도 13A 내지 13D 포함)은 RNA car+ T 세포의 잠재적 동조가능한 도입유전자 발현 및 효과기 기능을 나타내는 일련의 이미지이다. 도 13A는 지시된 양의 CD19-BBz RNA로 전기천공된 RNA CAR+ T 세포의 도입유전자 발현이 시간의 함수로서 나타나는 것을 입증하는 이미지이다. 전기천공된 19-BBz CAR mRNA의 도입유전자 발현의 막대그래프. 도 13B는 선 그래프로서 플롯팅된 도 13A로부터의 도입유전자 발현 데이타를 나타내는 이미지이다. 하락률은 도 13A에서 관찰된 상이한 MFI에도 불구하고 유사하다. 도 13C는 지시된 양의 RNA로 전기천공된 CAR T 세포와 함께 CD19+ 종양 세포의 특이적 용해를 나타내는 이미지이다. 용해는 전기천공후 1일(좌측 패널) 및 3일(우측 패널)에 K562-CD19를 표적으로 사용하는 유동 세포계수 CTL 분석을 사용하여 측정했다. 차이는 1일에 거의 존재하지 않지만, 3일에 RNA 용량에 대한 특이적 용해의 용량 의존적 감소가 관찰된다. 도 13D는 ELISA에 의해 분석한 연속 희석된 표적 세포(K562-CD19) 또는 대조군 표적(1:1의 K562-메소)과 함께 밤새 공배양한 지시된 양의 RNA로 RNA 조작된 T 세포(전기천공후 4시간)에 의한 IFN-γ 분비를 나타내는 이미지이다. IFN-γ 분비는 표적의 양으로 적정하고, 보다 적은 RNA 용량으로 보다 낮은 사이토킨 분비 경향이 시사되지만, CD19 CAR 양성 그룹 사이에서 통계학적 유의차는 없다.
도 14(도 14A 및 14B 포함)는 생체내에서 RNA CAR의 발현 및 기능을 나타내는 일련의 이미지이다. 도 14A는 NOD/SCID/gc ^-/- 눌(NSG) 마우스에게 ss1-BBz 또는 CD19-BBz으로 전기천공후 4시간에서 10⁷ PBL을 정맥내 또는 복강내(IP)로 주사한 것을 나타내는 일련의 이미지이다. 마우스를 48시간 후에 희생시키고, T 세포 음성 선택 키트(Dynal Magnetic Bead)를 사용하여 사람 PBL을 말초혈, 비장, 골수 및 복강내 세정(IP)으로부터 단리했다. 정제된 세포는 사람 CD3 및 CAR 발현(전체 특이적 염소 항-마우스 IgG)을 위해 염색시키고, 유동 세포계수에 의해 분석했다. 마우스 골수 전구체 세포의 유의적 배경 염색은 음성 선택에도 불구하고 골수 구획에서 관찰되었다. CD3+ CAR+ 세포는 혈액, 비장 및 복강 세정으로부터 회수되지만, 이 시점에서 대퇴골 골수로부터 거의 회수되지 않는다. 도 14B는 CD19-BBz으로 IV 또는 IP 경로에 의한 마우스의 주사후 2일에서 복강내 세정액으로부터 회수된 정제된 T 세포가 유동 기반 CTL 분석에 사용되는 것을 나타내는 이미지이다. CD19-BBz RNA 전기천공된 T 세포를 2일 동안 시험관내에서 배양했고(CD19 In Vitro), 유사 전기천공된 T 세포(무 mRNA)는 대조군으로 사용되었다. 그래프는 K562-CD19 또는 K562-메소 표적에 대한 정제된 PBL의 용해율을 나타낸다. 표적 특이적 용해는 시험관내 배양된 CAR+ PBL의 것에 필적하는 회수된 CAR CTL에서 관찰되었고, 무 mRNA 대조군보다 유의적으로 높다(p < 0.01).
도 15(도 15A 및 15B 포함)는 종양 보유 마우스에서 RNA CAR의 특이적 수송 및 증식을 나타내는 일련의 이미지이다. 도 15A는 NOD/SCID/γc^-/-(NSG) 마우스에게 10⁶ Nalm-6 세포를 정맥내 주사한 다음, 7일 후에 지시된 mRNA 작제물로 전기천공후 4시간에서 5×10⁶ T 세포를 주사한 것을 입증하는 이미지이다. T 세포는 렌티바이러스 작제물에 안정적으로 형질감염되어 반딧불 루시퍼라제를 발현시켰고, 마우스는 생물발광을 위해 이미지화했다. 당해 그래프는 지시된 그룹(n=8) 각각에 대한 개개 총 광자량 ± 표준오차의 평균을 나타낸다. 도 15B는 CD19 RNA CAR이 질환 부위로의 이동 및 RNA-조작된 T 세포 증식과 일치하는 생물발광 신호 및 해부학적 분포의 증가를 나타내는 것을 입증하는 이미지이다. 주사후 3일차에 광자 밀도 열 맵은 유사 T 세포, 또는 비장에서 수동적으로 메소텔린 풀에 대해 무관한 특이성을 갖는 RNA CAR을 발현하는 T 세포가 광자 밀도를 증가시키지 않음(열 맵 상의 좌측면)을 시사하고, 이는 증식의 결여를 나타낸다. 5×10⁶ 세포는 주사 직후 모든 그룹에서 동등한 약 2×10⁷의 p/s/cm²을 생성하는 것에 주목한다. 염수 처리된 마우스는 5×10⁵ p/s/cm²의 배경 자가발광을 나타낸다.
도 16(도 16A 내지 도 16D 포함)은 Nalm-6 이종이식 모델에서 RNA CAR+ T 세포의 단일 주사의 치료학적 효능 및 특이성을 나타내는 일련의 이미지이다. 도 16A는, NSG 마우스에게 도 17에서와 같이 반딧불 루시퍼라제를 안정하게 발현하도록 형질전환된 10⁶ Nalm-6을 주사한 다음, 7일 후에 CD19-BBz 또는 메소-BBz mRNA로 전기천공된 2.5×10⁷ T 세포를 단일 테일 정맥 주사(화살표)한 것을 입증하는 이미지이다. 동물은 주사후 지시된 시점에서 이미지화하고, 총 광자량± SE는 Y 축에 나타냈고, 5×10⁵ p/sec/cm²/sr은 루시퍼라제 함유 세포를 갖지 않는 마우스를 나타낸다(* = p < 0.01). 도 16B는 5일(2일 전처리) 및 8일(CAR+PBL 후의 24시간)에 대표적 마우스에서 반딧불 루시퍼라제 양성 백혈병의 광자 밀도 열 맵을 나타내는 이미지이다. 마우스는 동등한 부하의 백혈병으로 개시하지만, CD19 지시된 CAR+ PBL은 광자 밀도로 측정하여 질병 부하를 2 log까지 감소시킨다(그러나, 이를 배제하지 않는다). 도 16C는 CD19-BBz RNA CAR+ T 세포로 처리한 마우스의 생존이 염수 대조군 및 메소-BBz RNA CAR T 세포 그룹과 비교하여 유의적으로 연장되는 것을 나타내는 이미지이다. (로그 랭크 분석에 의한 p < 0.01). 도 16D는 RNA CAR CTL에 의한 생존이, 장기 생존자가 RNA CAR CTL의 단일 주입으로 관찰되지 않고 우리의 관찰과 일치하게 단일 주입이 질병을 완전히 배제하지 않는 동일한 모델에서 렌티바이러스 생성된 CAR CTL의 것에 양호하게 필적하는 것을 나타내는 이미지이다(n=12, 2회의 독립적 실험의 총합).
도 17은 이종이식된 NSG 마우스에서 Nalm-6의 급속 종양 성장 및 치사를 나타내는 이미지이다. NSG 마우스(n=8)에게 반딧불 루시퍼라제를 안정하게 발현하도록 형질전환된 10⁶ Nalm-6 세포를 주사했다. 동물은 주사후 지시된 시점에서 이미지화했고, 총 광자량은 Y-축에 나타냈고, 5×10⁵ p/sec/cm²/sr은 루시퍼라제 함유 세포를 갖지 않는 마우스의 배경을 나타낸다. 이미지는 모든 시점을 통해 수행된 대표적 마우스의 것이고, 동물은 24일에 반사 상태로 되었다.
도 18(도 18A 내지 18C 포함)은 RNA 적정이 잠재적으로 동조가능한 IL-2 분비를 생성하는 것을 나타내는 일련의 이미지이다. 도 18A는 루미넥스 정렬에 의해 측정된 2:1의 E:T 비에서 표적 세포(K562-CD19)와 함께 밤새 공-배양한 지시된 양의 RNA를 갖는 RNA-조작된 T 세포(전기천공후 4시간)에 의한 IL-2 분비를 나타내는 이미지이다. 도 18B는 RNA CAR CTL 또는 렌티바이러스 CAR CTL의 대표적 마우스에서 시간 경과 및 재발 부위를 나타내는 이미지이다. 마우스는 도 16에 기재된 바와 같이 처리했다. 치주 영역은 RNA 및 렌티바이러스 CTL 처리된 마우스 둘 다에서 백혈병의 잠복 부위이다. 시간 경과에 따라, RNA-조작된 T 세포로 처리한 마우스는 전신 재발하는 반면, 렌티바이러스 처리된 마우스는, 치주 및 척추인접 영역이 정화될 수 없는 한, 국소 합병증 및/또는 전신 재발로 사멸한다. 도 18C는 일치된 치주 보유 부위에서도 재발 변동성을 나타내는 35일차의 마우스 이미지이다. 최우측 마우스는 비장, 척추 및 대퇴골 상의 신호를 갖는 구성 확산 재발을 나타낸다. 제3 마우스는 최종적으로 뒷다리 마비를 일으키는 출아 척추인접 재발을 나타낸다.
도 19는 pD-A.ss1.OF.BBZ.2bg.150A 플라스미드(서열번호 4)의 개략도이다.
도 20은 pD-A.19.OF.2bg.150A 플라스미드(서열번호 5)의 개략도이다.
도 21은 pGEM-64A 기반 IVT GD2-BBZ 벡터의 작제 개략도이다.
도 22는 전기천공후 1일에 GD2 지시된 CAR의 발현을 나타내는 그래프 세트이다.
도 23은 CD107a 분석을 사용하여 GD2 RNA CAR T 세포의 기능을 검사한 실험의 결과를 나타낸다. 다양한 GD2 지시된 CAR RNA로 전기천공된 세포를 SY5Y(GD2+ 종양 세포주) 또는 NLFwt(GD2-종양 세포주)와 공배양하고, CD107a 발현을 4시간 배양 분석으로 유동 세포계수에 의해 검출했다.
도 24는 SY5Y(GD2+ 종양 세포주) 또는 NLFwt(GD2- 종양 세포주)와의 공배양시에 전기천공된 T 세포에 의해 생성 및 분비된 INF-감마의 수준을 나타내는 그래프이다. 상청액은 공배양후 24시간에서 수집하고, INF-감마는 ELISA에 의해 검출했다.
도 25는 GD2 CAR GMP RNA 생성을 위한 pD-A.GD2.OF.8TMBBZ.abg.150A 벡터의 작제를 나타내는 개략도이다. 중첩 PCR을 사용하여 내부 ORF 비함유(OF) GD2-8TMBBZ을 형성했다. 2개의 내부 ORF는 CAR 개방 판독 프레임의 변경 없이 ATG 코돈의 PCR 돌연변이에 의해 제거했다.
도 26은 신경아세포종 GD2 RNA CAR 동물 실험의 스케쥴을 나타내는 이미지이다.
도 27은, 음성 대조군으로 처리된 PBS와 비교하여, GD2 지시된 CAR 또는 CD19 지시된 CAR을 인코딩하는 RNA를 수용하도록 전기천공된 T 세포를 사용한 처리의 시간 경과에 따르는 종양 부하의 정도를 나타내는 그래프이다.
도 28은 GD2 RNA CAR 및 CD19 RNA CAR 처리된 마우스에서 종양 세포의 존재를 나타내는 이미지 세트이다.
도 29는 K562-CD19, K562-cMet, L55, SK-OV3 및 OV79 세포주에서 cMet 발현 수준을 나타내는 그래프 세트이다.
도 30은 내부 ORF 비함유(OF) cMet.BBZ CAR 작제물의 작제를 상세히 나타내는 도면이다.
도 31(도 31A 내지 도 31B 포함)은 cMet 지시된 RNA CAR의 임상 버젼의 발현 및 기능을 검사하는 실험 결과를 나타낸다. 도 31은, cMet 양성 세포주(L55 또는 SK-OV3) 또는 cMet 음성 세포주(K562-CD19)와 공배양하는 경우, 다양한 cMet RNA CAR의 기능을 검사하는 CD107a 분석의 결과를 나타내는 그래프 세트이다. CD107a는 4시간 배양 분석으로 유동 세포계수에 의해 검출했다. 도 31B는 전기천공후 24시간에서 CAR 발현을 나타내는 그래프 세트이다.
도 31(도 32A 및 32B 포함)은, 종양 세포주와 공배양하는 경우, cMet RNA CAR 전기천공된 T 세포의 IFN-감마 생성을 검사하는 실험 결과를 나타낸다. 도 32A는 T 세포를, 다양한 cMet CAR 중의 하나를 인코딩하는 IVT RNA로 전기천공한 다음 cMet 양성 종양 세포주(L55 또는 SK-OV3) 또는 cMet 음성 세포주(K562-CD19)와 함께 공배양한 실험 결과를 설명하는 그래프를 나타낸다. 상청액은 공배양후 24시간에서 수집하고, ELISA로 처리하여 분비된 IFN-감마를 검출했다. 도 32B는 이의 도입유전자 발현 및 기능성에 기반하여 동물 실험 및 잠재적 임상 시험을 위해 선택된 pD-A.cMet.OF.8TMBBZ.2bgUTR.150A 작제물의 맵을 나타낸다.
도 33은 SK-OV3, 888mel, 624mel, 526mel 및 K562 종양 세포주에서 cMet 발현 수준을 나타내는 그래프 세트이다.
도 34는 전기천공된 T 세포에서 CAR 발현 수준을 나타내는 그래프 세트이다. 10일 자극된 T 세포는 CD19 CAR RNA 또는 cMet CAR RNA로 전기천공하거나 전기천공하지 않았다(EP 부재). 밤새 배양한 후, CD19 CAR 또는 cMet CAR 발현은 유동 세포계수에 의해 검출했다.
도 35는 흑색종 자극된 cMet RNA CAR 전기천공된 T 세포의 CD107a 발현을 설명하는 그래프 세트이다. RNA 전기천공된 T 세포를, CD19+ Nalm6, cMet+ SK-OV3 및 cMet+ 흑색종주(888mel, 624mel 및 526mel)를 포함하는 지시된 종양 세포주로 자극시켰다. K562는 CD19- 및 cMet-대조군으로 사용했다. 4시간 자극 후, CD107a 발현은 유동 세포계수에 의해 모니터링했다. 세포는 CD8+ 게이팅되었다.
도 36은 흑색종 자극된 cMet RNA CAR 전기천공된 T 세포의 IFN-감마 생성량을 나타내는 그래프이다. RNA 전기천공된 T 세포를, CD19+ Nalm6, cMet+ SK-OV3 및 cMet+ 흑색종주(888mel, 624mel 및 526mel)를 포함하는 지시된 종양 세포주로 자극시켰다. K562는 CD19- 및 cMet-대조군으로 사용했다. 24시간 자극 후, IFN-감마 생성은 ELISA로 분석했다.
도 37은 cMet RNA CAR의 치료학적 효과를 검사하는 생체내 실험 계획을 나타낸다.
도 38은 PBS(음성 대조군), cMet RNA CAR 전기천공된 T 세포 또는 CD19 RNA CAR 전기천공된 T 세포로 처리된 마우스의 종양 부하를 설명하는 그래프이다. CAR T 세포 치료를 T 세포 주사전 1일에 제공한 사이톡산 치료(복강내 60mg/kg)와 조합했다.
도 39는 IVT RNA 또는 렌티바이러스 벡터에 의해 전달된 CAR로 처리된 CD19 양성 백혈병을 갖는 마우스에서 종양 부하를 나타내는 그래프이다. CD19 RNA 전기천공된 T 세포는 대조군과 비교하여 감소된 종양 부하를 나타내지만, 렌티바이러스 전달된 CD19 CAR에 의해 관찰된 종양은 명확하지 않다. 화살표는 RNA CAR 전기천공된 T 세포의 주사 시간을 지칭한다.
도 40은 조합된 사이톡산 치료의 존재 또는 부재하에 RNA CAR 전기천공된 T 세포로 처리한 마우스에서 종양 부하를 나타내는 그래프이다. 마우스는, 달리 명시하지 않는 한, 조합된 사이톡산(chemo) 및 CAR 처리를 제공받았다. 제시된 데이타는 사이톡산에 의한 이전 CAR T 세포의 고갈이 RNA CAR T 세포의 반복 주입에 의해 부여된 치료를 증강시키는 것을 입증한다.
도 41은 조합된 사이톡산 처리의 존재 또는 부재하에 RNA 전기천공된 T 세포로 처리한 마우스의 생존율을 나타내는 그래프이다. 마우스는, 달리 명시하지 않는 한, 조합된 사이톡산(chemo) 및 CAR 처리를 제공받았다. 데이타는 전체 생존이 조합된 사이톡산 및 RNA CAR T 세포 치료의 반복된 주입에서 연장되는 것을 나타낸다.
도 42는, CAR이 렌티바이러스 벡터 또는 IVT RNA에 의해 전달되는 CAR T 세포로 처리한 마우스에서 종양 부하 정도를 나타내는 그래프이다. RNA 그룹의 경우, 치료는 RNA CAR T 세포의 2차 주입전 24시간에서 전달된 60mg/kg 사이톡산과 조합되었다. 사용된 CAR 작제물은 야생형(WT), 코돈 최적화된 것(CO)이거나 디류신 모티프를 제거하기 위해 돌연변이되었다(LL).
도 43은 CD19-BBZ CAR T 세포(상부) 및 CD19-28BBZ CAR T 세포로 처리한 마우스의 생존율을 나타내는 그래프 세트이다. RNA 그룹의 경우, 치료는 RNA 전기천공된 CAR T 세포의 반복 주입전 24시간에서 전달된 60mg/kg 사이톡산과 조합되었다. 사용된 CAR 작제물은 야생형(WT), 코돈 최적화된 것(CO)이거나 디류신 모티프를 제거하기 위해 돌연변이되었다(LL).
도 44는 CAR T 세포의 단일 주사후 5일의 마우스에서 생물발광으로 측정한 종양 정도를 나타내는 이미지 세트이다. T 세포는, 렌티바이러스 벡터(lenti)에 의해 전달되도록 달리 명시하지 않는 한, CAR을 인코딩하는 IVT RNA의 전달을 통해 변형되었다. 사용된 CAR 작제물은 야생형(WT), 코돈 최적화된 것(CO)이거나 디류신 모티프를 제거하기 위해 돌연변이되었다(LL).
도 45는 21일, CAR T 세포의 2차 주입의 조합 치료 및 사이톡산 치료후 7일의 마우스에서 생물발광으로 측정한 종양 정도를 나타내는 이미지 세트이다. T 세포는, 렌티바이러스 벡터(lenti)에 의해 전달되도록 달리 명시하지 않는 한, CAR을 인코딩하는 IVT RNA의 전달을 통해 변형되었다. 사용된 CAR 작제물은 야생형(WT), 코돈 최적화된 것(CO)이거나 디류신 모티프를 제거하기 위해 돌연변이되었다(LL).
도 46은 19-BBz CAR T 세포로 처리한 마우스에서 종양 부하를 나타내는 그래프이다. 마우스는 단일 용량의 렌티바이러스 전달된 19-BBz T 세포 또는 복수 용량의 19-BBz RNA CAR T 세포로 처리되었다. RNA CAR T 세포는 단독으로 또는 사이톡산 처리(T 세포 주입전 1일에 제공됨)와 조합하여 전달되었다. 각 주입에서 T 세포의 수가 변화되는 RNA CAR T 세포의 복수 용량 전략이 검사되었다.
도 47은 19-BBz CAR T 세포로 처리한 마우스에서 22일차의 종양 정도를 나타내는 이미지 세트이다. 마우스는 단일 용량의 렌티바이러스 전달된 19-BBz T 세포 또는 복수 용량의 19-BBz RNA CAR T 세포로 처리되었다. RNA CAR T 세포는 단독으로 또는 사이톡산 처리(T 세포 주입전 1일에 제공됨)와 조합하여 전달되었다. 각 주입에서 T 세포의 수가 변화되는 RNA CAR T 세포의 복수 용량 전략이 검사되었다.
도 48은 19-BBz CAR T 세포로 처리한 마우스에서 조사 시간 전체에 걸친 종양 정도를 나타내는 이미지 세트이다. 마우스는 단일 용량의 렌티바이러스 전달된 19-BBz T 세포 또는 복수 용량의 19-BBz RNA CAR T 세포로 처리되었다. RNA CAR T 세포는 단독으로 또는 사이톡산 처리(T 세포 주입전 1일에 제공됨)와 조합하여 전달되었다. 각 주입에서 T 세포의 수가 변화되는 RNA CAR T 세포의 복수 용량 전략이 검사되었다.
도 49는 19-BBz CAR T 세포로 처리한 마우스에서 생존율을 나타내는 그래프이다. 마우스는 단일 용량의 렌티바이러스 전달된 19-BBz T 세포 또는 복수 용량의 19-BBz RNA CAR T 세포로 처리되었다. RNA CAR T 세포는 단독으로 또는 사이톡산 처리(T 세포 주입전 1일에 제공됨)와 조합하여 전달되었다. 각 주입에서 T 세포의 수가 변화되는 RNA CAR T 세포의 복수 용량 전략이 검사되었다.
도 50은 19-BBz CAR T 세포, 19-28BBz CAR T 세포 또는 메소-BBz CAR T 세포로 처리한 마우스에서 생존율을 나타내는 그래프 세트이다. 마우스는 단일 용량의 렌티바이러스 전달된 CAR T 세포 또는 복수 용량의 RNA CAR 전기천공된 T 세포로 처리되었다. RNA CAR 전기천공된 T 세포는 단독으로 또는 사이톡산 처리(T 세포 주입전 1일에 제공됨)와 조합하여 전달되었다. 각 주입에서 T 세포의 수가 변화되는 RNA CAR T 세포의 복수 용량 전략이 검사되었다.

본 발명은, 암 환자로부터의 자가 T 세포를 RNA로 조작하여 환자의 치료에 효과적인 치료법을 제공할 수 있다는 발견에 관한 것이다. RNA-조작된 T 세포는 암의 치료를 위한 유연한 플랫폼을 가능하게 하는 양자 세포 전달을 위한 신규한 방법을 제공한다. 일부 예에서, RNA-조작된 T 세포는 레트로바이러스 및 렌티바이러스 조작된 T 세포의 사용을 보완하는 것으로 사용될 수 있다. RNA-조작된 T 세포의 사용은, 숙주 세포 게놈 내로 통합할 가능성을 갖는 바이러스 벡터의 사용과 관련되는 안전성 개념 없이 강력한 활성화 도메인을 발현하도록 조작된 T 세포의 치료 지수를 증가시킬 수 있다.

본 발명은 일반적으로 키메라 항원 수용체(CAR)를 인코딩하는 RNA로 형질감염된 T 세포의 사용에 관한 것이다. CAR을 인코딩하는 RNA로 형질감염된 T 세포는 본원에서 RNA-조작된 T 세포로서 지칭된다. CAR은 특이적 항체의 항원 인식 도메인을 세포내 신호전달 분자와 조합한다. 예를 들면, 세포내 신호전달 분자는 하나 이상의 CD3-제타 쇄, 4-1BB 및 CD28 신호전달 분자를 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명은 RNA-조작된 T 세포 및 양자 치료를 위한 이들의 사용 방법을 제공한다.

RNA-조작된 T 세포를 사용하는 잇점은 CAR이 세포에서 한정된 시간 동안 발현된다는 것이다. CAR의 일시적 발현 후, 세포의 표현형은 야생형으로 복귀한다. 따라서, 치료 기간은 CAR로 일시적으로 형질감염되는 세포를 사용하여 조절될 수 있다.

한 가지 실시양태에서, 본 발명은 항-CD19 CAR, 항-메소텔린 CAR, 항-GD2 CAR 또는 항-cMet CAR을 발현하는 mRNA로 전기천공되는 자가 세포를 포함한다. 그러나, 본 발명은 표적 분자로서 CD19, 메소텔린, GD2 및 cMet로 한정되는 것은 아니다. 오히려, 임의의 표적 분자에 대해 지시된 임의의 항원 결합 도메인이 CAR과 관련하여 사용될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 CAR은 특이적 항체의 항원 인식 도메인을 단일 키메라 단백질 내의 CD3-제타 쇄 또는 FcγRI 단백질의 세포내 도메인과 조합한다. 따라서, 본 발명은 이러한 조합물을 인코딩하는 RNA를 포함한다.

한 가지 실시양태에서, CAR은 4-1BB 신호전달 도메인을 추가로 포함한다. 예를 들면, 본 발명의 RNA-조작된 T 세포는 CAR의 시험관내 전사된 mRNA, 예를 들면, αCD19, CD8α 힌지 및 막통과 도메인, 및 사람 4-1BB 및 CD3-제타 신호전달 도메인을 세포 내로 도입시킴으로써 생성될 수 있다. 본 발명의 RNA-조작된 T 세포는 치료 목적을 위해 환자 내로 주입될 수 있다. 일부 예에서, CAR은 CD28을 추가로 포함할 수 있다.

한 가지 실시양태에서, 본 발명은, T 세포가 변형되어 CAR을 인코딩하는 RNA 서열을 포함하는, 양자 T 세포 치료를 사용하여 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 당해 방법은 암 및 면역 질환을 포함하는 임의 수의 질환을 치료하는데 사용될 수 있다. 일부 예에서, 당해 방법은 치료 과정에 걸쳐 RNA 변형된 T 세포를 복수회 투여하는 것을 포함한다. 한 가지 실시양태에서, 당해 방법은 추가의 치료학적 조성물을 투여하는 것을 추가로 포함한다. 예를 들면, 한 가지 실시양태에서, 당해 방법은 화학치료제를 투여하는 것을 포함한다.

정의

본원에서 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 당해 기술분야의 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에서 개시된 임의의 방법 및 재료와 유사하거나 균등한 임의의 방법 및 재료가 본 발명의 시험을 위한 실시에 사용될 수 있지만, 바람직한 재료 및 방법이 본원에 개시되어 있다. 본 발명을 기재하고 청구할 때 하기 용어가 사용될 것이다.

또한, 본원에 사용된 용어는 특정 실시양태를 개시하기 위한 것이며, 제한하려는 것이 아닌 것으로 이해되어야 한다.

본원에 사용된 바와 같이, 5' 캡(또한 RNA 캡, RNA 7-메틸구아노신 캡 또는 RNA m⁷G 캡으로 지칭됨)은 전사 개시 직후 진핵생물 메신저 RNA의 "전방" 또는 5' 말단에 부가된 변형된 구아니딘 뉴클레오티드이다. 5' 캡은 제1 전사된 뉴클레오티드에 연결된 말단 그룹으로 구성된다. 이의 존재는 리보솜의 인식 및 RNase로부터의 보호에 중요하다. 캡 부가는 전사와 결합되고, 각각 서로 영향을 미치도록 동시 전사에 의해 발생한다. 전사 개시 직후에, 합성되는 mRNA의 5' 말단은 RNA 폴리머라제와 관련된 캡-합성 복합체에 의해 결합된다. 이러한 효소 복합체는 mRNA 캡핑에 요구되는 화학적 반응을 촉매한다. 합성은 다단계 생화학적 반응으로 진행한다. 캡핑 부분은 이의 안정성 또는 번역 효율 등의 mRNA의 기능을 조절하기 위해 변형될 수 있다.

관사 "하나(a, an)"는 관사의 문법상 목적어의 하나 또는 하나 이상(즉, 적어도 하나)를 지칭하기 위해 본원에서 사용된다. 예를 들면, "요소"는 하나의 요소 또는 하나 이상의 요소를 의미한다.

양, 시간적 지속 등과 같은 측정가능한 값을 언급하는 경우에 본원에서 사용되는 "약"은 이러한 변형 값이 본원에 개시된 방법을 수행하기에 적절하기 때문에 특정 값으로부터 ±20% 또는 ±10%, 보다 바람직하게는 ±5%, 보다 더 바람직하게는 ±1% 및 가장 바람직하게는 ±0.1%의 변형값을 포함한다는 것을 의미한다.

본원에서 사용되는 "항체"란 용어는 항원과 특이적으로 결합하는 면역글로불린 분자를 지칭한다. 항체는 천연 공급원 또는 재조합 공급원에서 유래한 온전한 면역글로불린일 수 있으며, 온전한 면역글로불린의 면역반응성 부분일 수 있다. 항체는 전형적으로 면역글로불린 분자의 사량체이다. 본 발명에 따른 항체는, 예를 들면, 단일 사슬 항체 및 인간화된 항체 뿐만 아니라 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, Fv, Fab 및 F(ab)₂를 포함하는 다양한 형태로 존재할 수 있다[참조: Harlow et al., 1999, In: Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow et al., 1989, In: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York; Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Bird et al., 1988, Science 242:423-426].

본원에서 사용되는 "항원" 또는 "Ag"이란 용어는 면역 반응을 유발하는 분자로서 정의된다. 이러한 면역 반응은 항체 생성, 또는 특정 면역학적 적격 세포의 활성화, 또는 이들 둘 모두를 포함할 수 있다. 당업자는 실질적으로 모든 단백질 또는 펩티드를 포함한 임의의 거대분자가 항원으로 작용할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 더욱이, 항원은 재조합 DNA 또는 게놈 DNA로부터 유래할 수 있다. 따라서, 당업자는 면역 반응을 유도하는 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 부분 뉴클레오티드 서열을 포함하는 임의의 DNA가, 이러한 용어가 본원에서 사용됨에 따라, "항원"을 인코딩한다는 것을 이해할 것이다. 더욱이, 당해 기술분야의 숙련자는 항원이 유전자의 전장 뉴클레오티드 서열에 의해서만 인코딩될 필요가 없다는 것을 이해할 것이다. 본 발명이 하나 이상의 유전자의 부분 뉴클레오티드 서열의 용도를 포함하지만 이로써 한정되지 않으며, 이들 뉴클레오티드 서열이 목적하는 면역 반응을 유도하기 위해 다양한 조합으로 정렬된다는 것이 매우 자명하다. 게다가, 당업자는 항원이 전적으로 "유전자"에 의해 인코딩될 필요가 없다는 것을 이해할 것이다. 항원은 생성되거나 합성될 수 있거나, 생물학적 샘플로부터 유래할 수 있다는 것은 매우 자명하다. 이러한 생물학적 샘플로는 조직 샘플, 종양 샘플, 세포 또는 생물학적 유체를 들 수 있지만, 이로써 한정되지 않는다.

본원에서 사용되는 "항-종양 효과"란 용어는 종양 용적에서의 감소, 종양 세포수에서의 감소, 전이수의 감소, 예상 수명의 증가, 또는 암 상태와 연관된 다양한 생리학적 증상의 개선에 의해 증명될 수 있는 생물학적 효과를 지칭한다. "항-종양 효과"는 또한 먼저 종양 발생의 예방에서 본 발명의 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 세포 및 항체의 능력에 의해 증명될 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, "자가"란 용어는 동일한 개체로부터 유래하고, 이후에 다시 상기 개체에게 재도입될 수 있는 임의의 재료를 지칭하는 것으로 의미한다.

"동종성"은 동일한 종의 다른 동물에서 유래한 이식편을 지칭한다.

"이종성"은 상이한 종의 동물에서 유래한 이식편을 지칭한다.

본원에서 사용된 바와 같은 "암"이란 용어는 변종 세포의 신속하고 제어되지 않는 성장을 특징으로 하는 질병으로서 정의된다. 암 세포는 국부적으로 또는 혈류 및 림프계를 통해 체내의 기타 부분으로 확산할 수 있다. 다양한 암의 예로는 뇌암, 방광암, 유방암, 자궁경부암, 결장직장암, 간암, 신장암, 림프종, 백혈병, 폐암, 흑색종, 전이성 흑색종, 중피종, 신경아세포종, 난소암, 전립선암, 췌장암, 신장암, 피부암, 흉선암, 육종, 비-호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 자궁암 등을 들 수 있지만, 이로써 한정되지 않는다.

"인코딩"이란 뉴클레오티드(즉, rRNA, tRNA 및 mRNA)의 제한된 서열 또는 아미노산의 제한된 서열중 하나를 구비한 생물학적 공정에서 기타 고분자 및 거대분자의 합성을 위한 주형으로 사용하기 위해 유전자, cDNA 또는 mRNA와 같은 폴리뉴클레오티드 중의 뉴클레오티드의 특정 서열의 고유 특성, 및 이들로부터 유래한 생물학적 특성을 지칭한다. 따라서, 유전자는 이러한 유전자에 상응하는 mRNA의 전사 및 번역이 세포 또는 기타 생물학적 시스템에서 단백질을 생성하는 경우에 단백질을 인코딩한다. mRNA 서열과 동일하고 일반적으로 서열 목록으로 제공되는 뉴클레오티드 서열인 코딩 쇄 및 유전자 또는 cDNA의 전사를 위한 주형으로 사용되는 비코딩 쇄 둘 모두는 이러한 유전자 또는 cDNA의 단백질 또는 기타 생성물을 코딩하는 것으로 지칭될 수 있다.

달리 명시하지 않는 한, "아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열"은 서로의 축퇴 버젼이고 동일한 아미노산 서열을 인코딩하는 모든 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 단백질 및 RNA를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 인트론을 포함할 수 있다.

"유효량" 또는 "치료학적 유효량"은 본원에서 상호 교대로 사용되며, 특정 생물학적 결과를 달성하는데 효과적인 본원에 기재된 바와 같은 화합물, 제형, 물질 또는 조성물의 양을 지칭한다. 이러한 결과는 당해 기술분야에서 적합한 임의의 수단에 의해 측정된 바이러스 감염의 억제를 포함할 수 있지만, 이로써 한정되지 않는다.

본원에 사용된 바와 같이, "내인성"은 생물, 세포, 조직 또는 시스템으로부터의 임의의 물질 또는 이의 내부에서 생성된 임의의 물질을 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "외인성"은 생물, 세포, 조직 또는 시스템으로부터 도입된 임의의 물질 또는 이의 외부에서 생성된 임의의 물질을 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "발현"은 자신의 프로모터에 의해 유도되는 특정 뉴클레오티드 서열의 전사 및/또는 번역으로서 정의된다.

본원에 사용된 바와 같은 "상동성"은 2개의 고분자 분자, 예를 들면, 2개의 핵산 분자(예: 2개의 DNA 분자 또는 2개의 RNA 분자) 또는 2개의 폴리펩티드 분자 사이의 아단위 서열 동일성을 지칭한다. 2개의 분자 둘 다에서 아단위 위치가 동일한 단량체성 아단위에 의해 점유되는 경우, 예를 들면, 2개의 DNA 분자 각각에서의 위치가 아데닌에 의해 점유되는 경우, 이들은 당해 위치에서 상동성이다. 2개 서열 사이의 상동성은 정합 또는 상동성 위치의 수의 직접 함수이고; 예를 들면, 2개 서열에서 당해 위치의 절반(예를 들면, 고분자 10개 아단위 길이에서 5개 위치)가 상동성인 경우, 2개 서열은 50% 상동성이고; 당해 위치의 90%(예: 10개중 9개)가 정합 또는 상동성인 경우, 2개 서열은 90% 상동성이다.

본원에서 사용된 바와 같이, "교육용 재료"는 간행물, 기록물, 도면, 또는 본 발명의 조성물 및 방법의 유용성을 제공하기 위해 사용될 수 있는 임의의 기타 표현 매체를 포함한다. 본 발명의 키트의 교육용 재료는, 예를 들면, 본 발명의 핵산, 펩티드 및/또는 조성물을 함유하는 용기에 첨부될 수 있거나, 상기 핵산, 펩티드 및/또는 조성물을 함유하는 용기와 함께 출하될 수 있다. 또는, 상기 교육용 재료는 상기 교육용 재료 및 화합물이 수령인에 의해 협조적으로 사용되는 목적으로 본 발명에 따라 상기 용기와는 별도로 출하될 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이 "시험관내 전사된 RNA"는 시험관내에서 합성된 RNA, 바람직하게는 mRNA를 지칭한다. 일반적으로, 시험관내 전사된 RNA는 시험관내 전사 벡터로부터 형성된다. 시험관내 전사 벡터는 시험관내 전사된 RNA를 형성하기 위해 사용되는 주형을 포함한다.

"단리"는 자연 상태로부터 변경되거나 제거된 것을 의미한다. 예를 들면, 살아있는 동물에 자연적으로 존재하는 핵산 또는 펩티드는 "단리"된 것이 아니지만, 이의 자연 상태의 공존 재료로부터 부분적으로 또는 완전하게 분리된 동일한 핵산 또는 펩티드는 "단리"된 것이다. 분리된 핵산 또는 단백질은 실질적으로 정제된 형태로 존재할 수 있거나, 예를 들면, 숙주 세포 등의 비-천연 환경에 존재할 수 있다.

본 발명과 관련하여, 일반적으로 나타나는 핵산 염기에 대한 하기 약어가 사용된다. "A"는 아데노신을 지칭하고, "C"는 시토신을 지칭하고, "G"는 구아닌을 지칭하고, "T"는 티미딘을 지칭하며, "U"는 우리딘을 지칭한다.

달리 명시하지 않는 한, "아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열"은 서로에 대한 축퇴 버젼이고 동일한 아미노산 서열을 인코딩하는 모든 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 단백질 또는 RNA를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 몇몇 버젼에서 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 인트론(들)을 함유하는 정도로 인트론을 또한 포함할 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, "개방 판독 프레임" 또는 "ORF"는 폴리펩티드 또는 단백질을 잠재적으로 인코딩할 수 있는 염기 서열을 함유하는 일련의 뉴클레오티드이다. 개방 판독 프레임은 개시 코드 서열(개시 코돈 또는 출발 코돈) 및 정지-코돈 서열(종결 코돈) 사이에 배치되어 있다.

면역원성 조성물의 "비경구" 투여는, 예를 들면, 피하(s.c.), 정맥 내(i.v.), 근육내(i.m.) 또는 흉골내 주사 또는 주입 기술을 포함한다.

본원에서 사용된 바와 같은 용어 "폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드의 쇄로서 정의된다. 더욱이, 핵산은 뉴클레오티드의 고분자이다. 따라서, 본원에서 사용된 바와 같은 핵산 및 폴리뉴클레오티드는 상호 교환가능하다. 당해 기술분야의 통상의 기술자는 핵산이 단량체성 "뉴클레오티드"로 가수분해될 수 있는 폴리뉴클레오티드라는 일반적인 지식을 갖는다. 단량체성 뉴클레오티드는 뉴클레오시드로 가수분해될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 폴리뉴클레오티드에는, 이로써 한정되지 않지만, 재조합 수단, 즉 통상적인 클로닝 기술 및 PCR^TM 등을 이용하여 재조합 라이브러리 또는 세포 게놈으로부터 핵산 서열의 클로닝을 포함하지만 이로써 한정되지 않는 당해 기술분야에서 이용가능한 임의의 수단, 및 합성 수단에 의해 수득되는 모든 핵산 서열을 포함한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "펩티드", "폴리펩티드" 및 "단백질"은 상호 교대로 사용되며, 펩티드 결합에 의해 공유 결합된 아미노산 부분으로 구성된 화합물을 지칭한다. 단백질 또는 펩티드는 적어도 2개의 아미노산을 함유해야 하며, 단백질 또는 펩티드의 서열을 포함할 수 있는 아미노산의 최대 개수에는 어떠한 제한도 없다. 폴리펩티드는 펩티드 결합에 의해 서로 연결된 2개 이상의 아미노산을 포함하는 임의의 펩티드 또는 단백질을 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 상기 용어는, 당해 기술분야에서 펩티드, 올리고펩티드 및 올리고머로서 일반적으로 지칭되는 보다 짧은 쇄, 및 많은 유형이 존재하는 단백질로서 당해 기술분야에서 일반적으로 지칭되는 보다 긴 쇄 둘 모두를 지칭한다. 기타 펩티드 중에서, "폴리펩티드"는, 예를 들면, 생물학적 활성 단편, 실질적으로 상동성 폴리펩티드, 올리고펩티드, 동종이량체, 이종이량체, 폴리펩티드의 변이체, 변형된 폴리펩티드, 유도체, 유사체 및 융합 단백질을 포함한다. 상기 폴리펩티드는 천연 펩티드, 재조합 펩티드, 합성 펩티드 또는 이의 조합을 포함한다.

본원에 사용된 바와 같이 "폴리(A)"는 mRNA에 폴리아데닐화에 의해 결합된 일련의 아데노신이다. 일시적 발현을 위한 작제물의 바람직한 실시양태에서, 폴리A는 50 내지 5000, 바람직하게는 64 초과, 보다 바람직하게는 100 초과, 가장 바람직하게는 300 또는 400 초과이다. 폴리(A) 서열은 화학적으로 또는 효소적으로 변형되어 국지화, 안정성 및 번역 효율 등의 mRNA 기능을 조정할 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, "폴리아데닐화"는 메신저 RNA 분자에 폴리아데닐릴 부분의 공유 결합 또는 이의 변형된 변이체를 지칭한다. 진핵 생물에서, 대부분의 메신저 RNA(mRNA) 분자는 3' 말단에서 폴리아데닐화되어 있다. 3' 폴리(A) 테일은 효소, 폴리아데닐레이트 폴리머라제의 작용을 통해 프리-mRNA에 부가된 아데닌 뉴클레오티드의 긴 서열이다(종종 수백개). 보다 고등 진핵생물에서, 폴리(A) 테일은 특정 서열, 폴리아데닐화 신호를 함유하는 전사체에 부가된다. 폴리(A) 테일과 그에 결합된 단백질은 엑소뉴클레아제에 의한 분해로부터 mRNA를 보호하는 데 도움을 준다. 폴리아데닐화는 또한 전사 종결, 핵으로부터 mRNA의 배출 및 번역에 중요하다. 폴리아데닐화는 DNA에서 RNA로의 전사 직후 핵에서 일어나지만, 또한 세포질에서 이후에 발생할 수 있다. 전사가 종결된 후, mRNA 쇄는 RNA 폴리머라제와 관련된 엔도뉴클레아제 복합체의 작용에 의해 절단된다. 절단 부위는 일반적으로 절단 부위 근처의 염기 서열 AAUAAA의 존재를 특징으로 한다. mRNA가 절단된 후, 아데노신 부분은 절단 부위에서 유리 3' 말단에 부가된다.

"대상체"라는 용어는 면역 반응을 유도할 수 있는 살아있는 생물(예: 포유동물)을 포함하는 것으로 의도된다.

본원에 사용된 바와 같이, "실질적으로 정제된" 세포는 다른 세포 유형을 실질적으로 포함하지 않는 세포이다. 실질적으로 정제된 세포는 그것이 일반적으로 천연 상태에서 결합하는 다른 세포 유형으로부터 분리된 세포를 지칭한다. 일부 예에서, 실질적으로 정제된 세포의 모집단은 세포의 균질한 모집단을 지칭한다. 다른 예에서, 이 용어는 이들이 자연적으로 이들의 천연 상태로 결합된 세포에서 분리된 세포를 단순히 지칭한다. 일부 실시양태에서, 세포는 시험관내에서 배양된다. 다른 실시양태에서, 세포는 시험관내에서 배양되지 않는다.

본원에서 사용된 "치료"라는 용어는 치료 및/또는 예방을 의미한다. 치료 효과는 질병 상태의 억제, 완화 또는 치료에 의해 수득된다.

본원에서 사용되는 "형질감염" 또는 "형질전환" 또는 "형질도입"이라는 용어는 외인성 핵산이 숙주 세포에 전달 또는 도입되는 과정을 지칭한다. "형질감염" 또는 "형질전환" 또는 "형질도입" 세포는 외인성 핵산으로 형질감염 또는 형질전환 또는 형질도입된 것이다. 세포는 제1 대상 세포 및 이의 자손을 포함한다.

본원에서 사용된 바와 같이, "일시적"은, 게놈에 통합되거나 숙주 세포 내의 안정한 플라스미드 레플리콘에 함유되는 경우, 발현 기간이 유전자의 발현을 위한 기간 미만인 시간, 일 또는 주 동안, 비-통합 도입유전자의 발현을 지칭한다.

"벡터"는 단리된 핵산을 포함하고 세포의 내부에 단리된 핵산을 전달하는 데 사용될 수 있는 조성물이다. 다수의 벡터는 당해 기술분야에서 공지되어 있고, 이로써 한정되지 않지만, 선형 폴리뉴클레오티드, 이온성 또는 양친매성 화합물과 결합된 폴리뉴클레오티드, 및 바이러스를 포함한다. 따라서, 용어 "벡터"는 자가 복제 플라스미드 또는 바이러스를 포함한다. 당해 용어는 또한, 예를 들면, 폴리리신 화합물, 리포좀 등과 같이, 핵산의 세포로의 전달을 촉진하는 비-플라스미드 및 비-바이러스 화합물을 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 바이러스 벡터의 예로는, 이로써 한정되지 않지만, 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 등을 들 수 있다.

본원에서 사용된 용어 "특이적으로 결합하는"은, 샘플에 존재하는 동족 결합 파트너(예: T 세포 상에 존재하는 자극 및/또는 공자극 분자) 단백질을 인식하고 이와 결합하는 항체 또는 리간드를 의미하고, 이러한 항체 또는 리간드는 샘플 중의 다른 분자를 실질적으로 인식하거나 결합하지 않는다.

범위: 본 발명을 통해, 본 발명의 다양한 실시양태가 범위 형식으로 제시될 수 있다. 범위 형식의 기재는 단지 편의상 및 단순화를 위한 것으로 이해되어야 하고, 본 발명의 범위에 대한 부동의 제한으로 해석되지 않는다. 따라서, 범위의 기재는 구체적으로 개시된 당해 범위 내의 모든 가능한 부분 범위 및 개별 수치를 갖는 것으로 간주되어야 한다. 예를 들면, 1 내지 6과 같은 범위의 기재는 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 6, 3 내지 6 등의 구체적으로 개시된 부분 범위, 및 당해 범위 내의 개개 수치, 예를 들면, 1, 2, 2.7, 3, 4, 5, 5.3 및 6을 갖는 것으로 간주되어야 한다.

설명

본 발명은 세포에서 CAR의 발현을 위한 바이러스의 사용에 대한 대체 전략을 제공한다. 본 발명은, 세포로 형질감염되어 일시적으로 그 속에서 발현되는 CAR을 인코딩하는 RNA와 관련된다. 세포에서 CAR의 일시적, 비-통합 발현은 세포에서 CAR의 지속적이고 통합된 발현과 관련된 우려를 완화시킨다. 따라서, 본 발명은 세포에서 CAR 발현이 가역적일 수 있는 추가의 CAR-기반 치료를 제공한다. 세포에서 CAR 발현의 이러한 가역성은 CAR의 비-가역적 발현보다 특정 임상 상황에서 더 바람직할 수도 있다. 따라서, 본 발명은 특정 임상 상황에서 CAR의 영구적 발현에 대해 특정의 바람직한 잇점을 제공한다.

본 발명은 일시적으로 발현하는 CAR 세포를 생성하는 조성물 및 방법을 제공하고, 또한 이러한 세포를 대상체에게 투여하는 조성물 및 방법을 제공한다.

장기(통합) 발현 시스템과 비교하여, RNA 형질감염은 GMP-준거 시스템에 적합한 CAR 설계에서 보다 신속한 반복적 변화를 용이하게 한다. 제조 비용이 훨씬 적다. 방출 시험은 복잡하지 않다.

조성물

본 발명은 직접 세포에 형질감염될 수 있는 RNA 작제물을 포함한다. 형질감염에 사용되는 mRNA를 생성하는 방법은, 3' 및 5' 비번역 서열("UTR"), 5' 캡 및/또는 내부 리보솜 도입 부위(IRES), 발현되는 유전자 및 통상 50 내지 2000개 염기 길이의 폴리A 테일을 함유하는 작제물을 생성하기 위해, 특이적으로 설계된 프라이머를 사용한 주형의 시험관내 전사(IVT) 및 이어서 폴리A 부가를 수반한다. 이렇게 생성된 RNA는 상이한 종류의 세포를 효율적으로 형질감염시킬 수 있다.

한 가지 실시양태에서, RNA 작제물은 인간 β-글로불린으로부터 유래된 적어도 하나의 3' UTR을 포함하는 3' UTR을 포함한다. 한 가지 실시양태에서, RNA 작제물은 인간 β-글로불린(2bgUTR) 유래의 3' UTR의 2개 반복체를 포함하는 3' UTR을 포함한다. 한 가지 실시양태에서, RNA 작제물은 150개 아데노신 염기(150A)를 포함하는 폴리(A) 테일을 포함한다. 한 가지 실시양태에서, RNA 작제물은 5' 캡을 포함하는 5' UTR을 포함한다. 한 가지 실시양태에서, 5' 캡은 항-가역적 캡 유사체(ARCA)를 포함한다. 한 가지 실시양태에서, 5' 캡은 cap1을 포함한다. 본 발명은 특정 구조의 5' UTR, 3' UTR 및 폴리(A) 테일이 RNA 생성 및 생성된 CAR 발현에 영향을 미친다는 발견에 부분적으로 근거한 것이다.

한 가지 실시양태에서, 주형은 CAR을 위한 서열을 포함한다. 바람직하게는, CAR의 세포외 도메인, 막통과 도메인 및 세포질 도메인을 포함한다. 세포외 도메인 및 막통과 도메인은 도메인의 임의의 바람직한 공급원에서 유래할 수 있다.

항원 결합 도메인

세포외 도메인은 리간드 결합 및/또는 신호 형질도입과 관련된 임의의 광범위한 세포외 도메인 또는 분비 단백질로부터 수득할 수 있다. 한 가지 실시양태에서, 세포외 도메인은, CH1 및 힌지 영역의 존재에 의해 Ig 경쇄와 순차로 결합될 수 있거나 힌지, CH2 및 CH3 도메인의 존재에 의해 다른 Ig 중쇄/경쇄 복합체와 공유 결합될 수 있는 Ig 중쇄로 구성될 수 있다. 후자의 경우, 키메라 작제물에 접합되는 중쇄/경쇄 복합체는 키메라 작제물의 항체 특이성과는 구별되는 특이성을 갖는 항체를 구성할 수 있다. 항체의 기능, 목적하는 구조 및 신호 형질도입에 따라, 전체 쇄가 사용될 수 있거나 절단된 쇄가 사용될 수 있고, 여기서 CH1, CH2 또는 CH3 도메인의 전부 또는 일부가 제거될 수 있거나 힌지 영역의 전부 또는 일부가 제거될 수 있다.

세포외 도메인은 임의의 목적하는 항원에 대해 지시될 수 있다. 예를 들면, 항종양 CAR이 요구되는 경우, CAR에 도입되도록 선택된 세포외 도메인은 종양과 관련되는 항원일 수 있다. 종양은, CAR에 의해 인식되는 세포 표면 항원을 갖는 한, 임의 유형의 종양일 수 있다. 다른 실시양태에서, CAR은, 특이적 모노클로날 항체가 현재 존재하거나 장래에 형성될 수 있는 것일 수 있다.

한 가지 실시양태에서, RNA CAR를 위한 주형은 CAR 내로 목적하는 항원을 유전자 조작을 통해 목적하는 항원에 대해 지시되도록 설계된다. 본 발명의 맥락에서, "종양 항원" 또는 "과증식성 질환 항원" 또는 "과증식성 질환과 관련된 항원"은 특정 과증식성 질환에 통상적인 항원을 지칭한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 과증식성 질환 항원은, 이로써 한정되지 않지만, 원발성 또는 전이성 흑색종, 중피종, 흉선종, 림프종, 육종, 신경아세포종, 폐암, 간암, 비호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 백혈병, 자궁암, 자궁경부암, 방광암, 신장암, 및 유방암, 전립선암, 난소암, 췌장암 등의 선암을 포함하는 암으로부터 유래된다.

종양 항원은 면역 반응, 특히 T 세포 매개된 면역 반응을 유발하는 종양 세포에 의해 생산되는 단백질이다. 한 가지 실시양태에서, 본 발명의 종양 항원은 포유동물의 암 종양 유래의 종양 침윤 림프구(TIL)에 의해 면역학적으로 인식되는 하나 이상의 항원성 암 에피토프를 포함한다. 본 발명의 항원 결합 도메인의 선택은 치료되는 암의 특정 형태에 좌우될 것이다. 종양 항원은 당해 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들면, 신경교종 관련 항원, 암배아성 항원(CEA), β-인간 융모성 고나도트로핀, α-페토프로테인(AFP), 렉틴-반응성 AFP, 타이로글로불린, RAGE-1, MN-CA IX, 인간 텔로머라제 역전사 효소, RU1, RU2(AS), 장내 카복실 에스테라제, mut hsp70-2, M-CSF, 프로스타제, 전립선-특이 항원(PSA), PAP, NY-ESO-1, LAGE-1a, p53 프로스테인, PSMA, Her2/neu, 서바이빈 및 텔로머라제, 전립선-암 종양 항원-1(PCTA-1), MAGE, ELF2M, 호중구 엘라스타제, 에프린B2, CD22, 인슐린 성장 인자(IGF)-I, IGF-II, IGF-I 수용체 및 메소텔린을 포함한다.

한 가지 실시양태에서, 종양 항원은 악성 종양과 관련된 하나 이상의 항원성 암 에피토프를 포함한다. 악성 종양은 면역 공격의 표적 항원으로 작용할 수 있는 다수의 단백질을 발현시킨다. 이들 분자로는, 이로써 한정되지 않지만, 흑색종의 경우에 MART-1, 티로시나제(tyrosinase) 및 GP 100, 및 전립선암의 경우에 전립선 산 포스파타제(PAP) 및 전립선 특이적 항원(PSA)과 같은 조직 특이적 항원을 들 수 있다. 표적 분자의 기타 비제한적 예는 종양유전자 HER-2/Neu/ErbB-2와 같은 형질전환 관련 분자의 그룹에 속한다. 표적 항원의 또 다른 비제한적 예는 암태아 항원(CEA)과 같은 종양 태아성 항원이다. B-세포 림프종에서, 상기 종양 특이적 유전자형 면역글로불린은 개별 종양에 특이적인 정확히 종양 특이적 면역글로불린 항원을 구성한다. CD19, CD20 및 CD37과 같은 B-세포 분화 항원은 B-세포 림프종에서 표적 항원의 기타 후보물질이다. 몇몇 이들 항원(CEA, HER-2, CD19, CD20, 유전자형)은 모노클로날 항체를 이용한 수동 면역요법을 위한 표적으로서 사용되어 왔고, 제한적으로 성공하였지만, 본 발명에서 유용한 것으로 생각된다.

본 발명에서 지칭된 종양 항원의 유형은 또한 종양 특이적 항원(TSA) 또는 종양 연관 항원(TAA)일 수 있다. TSA는 종양 세포에 대해 특이적이며, 체내의 기타 세포 상에서 발생하지는 않는다. TAA 관련 항원은 종양 세포에 대해 특이적이지 않으며, 대신에 항원에 대한 면역학적 내성 상태를 유도하지 못하는 조건하에서 정상 세포 상에서 발현된다. 종양 상에서의 항원의 발현은 면역 시스템이 항원에 반응하도록 할 수 있는 조건하에서 발생할 수 있다. TAA는, 면역 시스템이 성숙하지 않아서 반응할 수 없거나, 이들이 정상적으로는 정상 세포 상에서 극도로 낮은 수준으로 존재하지만 종양 세포 상에서는 훨씬 높은 수준으로 발현되는 경우에 태아 발생 도중에 정상 세포 상에서 발현되는 항원일 수 있다.

TSA 또는 TAA 항원의 비제한적 예는 하기를 포함한다: MART-1/MelanA(MART-I), gp100(Pmel 17), 티로시나아제, TRP-1 및 TRP-2와 같은 분화 항원; MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE-1, GAGE-2 및 p15와 같은 종양 특이적 다중 계통 항원; CEA와 같은 과발현된 태아성 항원; p53, Ras, HER-2/neu와 같은 과발현된 종양 유전자 및 돌연변이된 종양-억제 유전자; BCR-ABL, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, MYL-RAR와 같이 염색체 전좌로부터 유래된 독특한 종양 항원; 및 엡스타인-바(Epstein Barr) 바이러스 항원 EBVA 및 인간 파필로마바이러스(HPV) 항원 E6 및 E7과 같은 바이러스성 항원. 기타 대형의 단백질-기반 항원으로는 TSP-180, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6, RAGE, NY-ESO, p185erbB2, p180erbB-3, c-met, nm-23H1, PSA, TAG-72, CA 19-9, CA 72-4, CAM 17.1, NuMa, K-ras, 베타-카테닌(betta-Catenin), CDK4, Mum-1, p 15, p 16, 43-9F, 5T4, 791Tgp72, 알파-페토프로테인, 베타-HCG, BCA225, BTAA, CA 125, CA 15-3/CA 27.29/BCAA, CA 195, CA 242, CA-50, CAM43, CD68/P1, CO-029, FGF-5, G250, Ga733/EpCAM, HTgp-175, M344, MA-50, MG7-Ag, MOV18, NB/70K, NY-CO-1, RCAS1, SDCCAG16, TA-90/Mac-2 결합 단백질/사이클로필린 C 관련 단백질, TAAL6, TAG72, TLP 및 TPS를 들 수 있다.

바람직한 실시양태에서, 상기 CAR의 항원 결합 도메인 일부는, 이로써 한정되지 않지만, CD19, CD20, CD22, ROR1, 메소텔린, CD33/IL3Ra, c-Met, PSMA, 당지질 F77, EGFRvIII, GD-2, MY-ESO-1 TCR, MAGE A3 TCR 등을 포함하는 항원을 표적화한다.

GD2은 신경모세포종 및 흑색종을 포함하는 신경외배엽 기원의 종양 상에서 발현되는 디시알로강글리오사이드이며, 본 발명에서 유용한 또 다른 표적이다. 추가로, 수용체 티로신 키나제 cMet는, 이것이 종종 비소형 세포 폐암(NSCLC), 위암, 난소암, 췌장암, 갑상선암, 유방암, 두경부암, 결장직장암을 포함하는 다양한 암에서 과발현되기 때문에, 본 발명에 유용한 또 다른 표적이다.

종양 항원 및 이의 항원성 암 에피토프는 정제되고, 일차 임상 분리주, 세포주 등과 같은 천연 공급원에서 단리될 수 있다. 암 펩티드 및 이들의 항원 에피토프는 또한 화학적 합성에 의해 또는 당해 기술분야에서 공지된 재조합 DNA 기술에 의해 수득할 수 있다. 화학적 합성에 대한 기술은 문헌[참조: Steward et al. (1969); Bodansky et al. (1976); Meienhofer (1983); and Schroder et al. (1965)]에 기재되어 있다. 추가로, 문헌[참조: Renkvist et al. (2001)]에 기재된 바와 같이, 당해 기술분야에 공지된 다수의 항원이 존재한다. 유사체 또는 인공적으로 변형된 에피토프는 수록되어 있지 않지만, 당업자는 당해 기술분야에서 표준적인 방법으로 이들을 수득하거나 생성하는 방법을 인식하고 있다. 항체에 의해 확인되고 Serex 기술[참조: Sahin et al. (1997) and Chen et al. (2000)]에 의해 검출되는 다른 항원은 암 연구에 대한 루드비히 연구소(the Ludwig Institute for Cancer Research)의 데이타베이스에서 발견된다.

표적화되는 목적 항원에 따라, 본 발명의 CAR은 목적하는 항원 표적에 특이적인 적절한 항원 결합 부위를 포함하도록 조작될 수 있다. 예를 들면, CD19가 표적화되어야 하는 목적하는 항원인 경우, CD19에 대한 항체는 본 발명의 CAR 내로 통합하기 위한 항원 결합 부분으로 사용될 수 있다.

막통과 도메인

막통과 도메인(transmembrane domain)과 관련하여, RNA CAR을 위한 주형은 상기 CAR의 세포외 도메인에 융합되어 있는 막통과 도메인을 포함하도록 설계될 수 있다. 한 가지 실시양태에서, 상기 CAR의 도메인 중 하나와 자연적으로 관련되는 막통과 도메인이 사용된다. 몇몇 경우, 상기 막통과 도메인은 수용체 복합체의 기타 구성원과의 상호작용을 최소화하기 위해 동일하거나 상이한 표면 막 단백질의 막통과 도메인에 대한 이러한 도메인의 결합을 피하기 위해 선택되거나 아미노산 치환에 의해 변형될 수 있다.

막통과 도메인은 천연 및 합성 공급원 중 하나로부터 유래할 수 있다. 상기 공급원이 천연의 것인 경우, 상기 도메인은 임의의 막-결합된 단백질 또는 막통과 단백질로부터 유래할 수 있다. 본 발명에서 특별히 사용되는 막통과 영역은 T-세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타 쇄(적어도 이들의 막통과 영역(들)), CD28, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 및 CD154로부터 유래할 수 있다. 대안적으로, 상기 막통과 도메인은 합성된 것일 수 있으며, 이 경우에 이는 류신 및 발린과 같이 주로 소수성 부분을 포함할 것이다. 바람직하게는, 페닐알라닌, 트립토판 및 발린의 트리플릿(삼중)은 합성 막통과 도메인의 각 말단에서 발견될 것이다. 임의로, 짧은 올리고펩티드 또는 폴리펩티드 링커, 바람직하게는 2 내지 10개 아미노산 길이를 갖는 링커는 막통과 도메인과 CAR의 세포질 신호전달 도메인 사이의 연결을 형성할 수 있다. 글리신-세린 더블릿은 특히 적합한 링커를 제공한다.

한 가지 실시양태에서, 막통과 도메인은 CD8 막통과 도메인, CD28 막통과 도메인, 4-1BB 막통과 도메인 또는 CD3-제타 막통과 도메인으로부터 선택된다. 일부 예에서, 막통과 도메인은 또한 힌지 도메인을 포함할 수 있다. 한 가지 실시양태에서, 힌지 도메인은 CD8a 힌지 도메인이다. 또 다른 실시양태에서, 힌지 도메인은 IgG 힌지 도메인이다.

세포질 도메인

본 발명의 CAR의 세포질 도메인 또는 달리는 세포내 신호전달 도메인은 CAR이 위치하고 있었던 면역 세포의 정상 효과기 기능들 중 적어도 하나를 활성화시키는 역할을 한다. "효과기 기능"이란 용어는 세포의 구체화된 기능을 지칭한다. T 세포의 효과기 기능은, 예를 들면, 사이토킨의 분비를 포함한 세포용해 활성 또는 헬퍼(helper) 활성일 수 있다. 따라서, "세포내 신호전달 도메인"이란 용어는 효과기 기능 신호를 변환하고 세포가 구체화된 기능을 수행하도록 지시하는 단백질의 부분을 지칭한다. 일반적으로 세포내 신호전달 도메인 전체가 사용될 수 있지만, 많은 경우에 전체 쇄를 사용할 필요는 없다. 세포내 신호전달 도메인의 절단된 부분이 사용되는 정도로, 이러한 절단된 부분은, 효과기 기능 신호를 변환하는 한, 온전한 쇄를 대신하여 사용될 수 있다. 따라서, "세포내 신호전달 도메인"이란 용어는 효과기 기능 신호를 변환하기에 충분한 세포내 신호전달 도메인의 임의의 절단된 부분을 포함하는 것을 의미한다.

본 발명의 CAR에 사용하기 위한 세포내 신호전달 도메인의 바람직한 예로는, 항원 수용체 관여(engagement) 이후에 신호 형질도입을 개시하도록 협조적으로 작용하는 T 세포 수용체(TCR) 및 보조 수용체의 세포질 서열 뿐만 아니라, 이들 서열의 임의의 유도체 또는 변이체, 및 동일한 기능적 능력을 갖는 임의의 합성 서열을 들 수 있다.

TCR을 통해 생성된 신호는 단독으로는 T 세포의 완전한 활성화에 불충분하고, 제2 또는 공자극성 신호가 또한 요구된다는 것이 공지되어 있다. 따라서, T 세포 활성화는 세포질 신호전달 서열의 2개의 특이한 부류에 의해 매개되는 것으로 언급될 수 있으며, 상기 2개의 부류에는 TCR을 통한 항원 의존성 1차 활성화를 개시하는 신호전달 서열(1차 세포질 신호전달 서열) 및 제2 또는 공자극성 신호를 제공하기 위해 항원 의존성 방식으로 작용하는 신호전달 서열(2차 세포질 신호전달 서열)이 있다.

1차 세포질 신호전달 서열은 자극 방식 또는 억제 방식 중의 하나로 TCR 복합체의 1차 활성화를 조절한다. 자극 방식으로 작용하는 1차 세포질 신호전달 서열은 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프 또는 ITAM으로 공지되어 있는 신호전달 모티프를 함유할 수 있다.

본 발명에서 특별히 사용되는 1차 세포질 신호전달 서열을 함유하는 ITAM의 예로는 TCR 제타, FcR 감마, FcR 베타, CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD5, CD22, CD79a, CD79b 및 CD66d로부터 유래한 ITAM을 들 수 있다. 본 발명의 CAR 내의 세포질 신호전달 분자는 CD3 제타에서 유래한 세포질 신호전달 서열을 포함하는 것이 특히 바람직하다.

바람직한 실시양태에서, 상기 CAR의 세포질 도메인은 CD3-제타 신호전달 도메인 자체를 포함하거나 본 발명의 CAR와 관련하여 유용한 임의의 기타 목적하는 세포질 도메인(들)과 조합된 CD3-제타 신호전달 도메인을 포함하도록 설계될 수 있다. 예를 들면, 상기 CAR의 세포질 도메인은 CD3 제타 쇄 일부 및 공자극성 신호전달 영역을 포함할 수 있다. 상기 공자극성 신호전달 영역은 공자극성 분자의 세포내 도메인을 포함하는 CAR의 부분을 지칭한다. 공자극성 분자는 항원에 대한 림프구의 효율적인 반응을 위해 요구되는 항원 수용체 또는 이들의 리간드가 아닌 세포 표면 분자이다. 이러한 분자의 예로는 CD27, CD28, 4-1BB(CD137), OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 림프구 기능 관련 항원-1(LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, 및 CD83과 특이적으로 결합하는 리간드 등을 들 수 있다. 따라서, 본 발명이 공자극성 신호전달 요소로서 4-1BB와 함께 주로 예시될지라도, 기타 공자극성 요소는 본 발명의 범주 내에 포함된다.

본 발명의 CAR의 세포질 신호전달 부분 내에 있는 세포질 신호전달 서열은 랜덤 또는 구체화된 순서로 서로 연결될 수 있다. 임의로, 짧은 올리고펩티드 또는 폴리펩티드 링커, 바람직하게는 2 내지 10개 아미노산 길이를 갖는 링커는 연결을 형성할 수 있다. 글리신-세린 더블릿은 특히 적합한 링커를 제공한다.

한 가지 실시양태에서, RNA CAR용 주형은 4-1BB 신호전달 도메인 자체를 포함하도록 설계될 수 있거나, 본 발명의 CAR와 관련하여 유용한 임의의 다른 목적하는 세포질 도메인(들)과 조합될 수 있다. 한 가지 실시양태에서, 세포질 도메인은 CD3-제타의 신호전달 도메인 및 4-1BB의 신호전달 도메인을 포함하도록 설계된다. 다른 실시양태에서, 세포질 도메인은 CD3-제타의 신호전달 도메인, 4-1BB의 신호전달 도메인 및 CD28의 신호전달 도메인을 포함하도록 설계된다.

한 가지 실시양태에서, RNA CAR용 주형은 항-CD19 모노클로날 항체의 단일 사슬 가변 도메인의 세포외 도메인을 포함하고, 막통과 도메인은 힌지 및 CD8a의 막통과 도메인을 포함하고, 세포질 도메인은 CD3-제타의 신호전달 도메인 및 4-1BB의 신호전달 도메인을 포함한다.

한 가지 실시양태에서, RNA CAR용 주형은 항-CD19 모노클로날 항체의 단일 사슬 가변 도메인의 세포외 도메인을 포함하고, 막통과 도메인은 힌지 및 CD8a의 막통과 도메인을 포함하고, 세포질 도메인은 CD3-제타의 신호전달 도메인, CD28의 신호전달 도메인 및 4-1BB의 신호전달 도메인을 포함한다.

한 가지 실시양태에서, RNA CAR용 주형은 항-메소텔린 모노클로날 항체의 단일 사슬 가변 도메인의 세포외 도메인을 포함하고, 막통과 도메인은 힌지 및 CD8a의 막통과 도메인을 포함하고, 세포질 도메인은 CD3-제타의 신호전달 도메인 및 4-1BB의 신호전달 도메인을 포함한다.

한 가지 실시양태에서, RNA CAR용 주형은 항-GD2 모노클로날 항체의 단일 사슬 가변 도메인의 세포외 도메인을 포함하고, 막통과 도메인은 CD8 막통과 도메인을 포함하고, 세포질 도메인은 CD3-제타의 신호전달 도메인 및 4-1BB의 신호전달 도메인을 포함한다.

한 가지 실시양태에서, RNA CAR용 주형은 항-GD2 모노클로날 항체의 단일 사슬 가변 도메인의 세포외 도메인을 포함하고, 막통과 도메인은 CD28의 막통과 도메인을 포함하고, 세포질 도메인은 CD3-제타의 신호전달 도메인 및 4-1BB의 신호전달 도메인을 포함한다.

한 가지 실시양태에서, RNA CAR용 주형은 항-GD2 모노클로날 항체의 단일 사슬 가변 도메인의 세포외 도메인을 포함하고, 막통과 도메인은 CD3-제타의 막통과 도메인을 포함하고, 세포질 도메인은 CD3-제타의 신호전달 도메인 및 4-1BB의 신호전달 도메인을 포함한다.

한 가지 실시양태에서, RNA CAR용 주형은 항-cMet 모노클로날 항체의 단일 사슬 가변 도메인의 세포외 도메인을 포함하고, 막통과 도메인은 CD8의 막통과 도메인을 포함하고, 세포질 도메인은 CD3-제타의 신호전달 도메인 및 4-1BB의 신호전달 도메인을 포함한다.

한 가지 실시양태에서, RNA CAR용 주형은 항-cMet 모노클로날 항체의 단일 사슬 가변 도메인의 세포외 도메인을 포함하고, 막통과 도메인은 CD28의 막통과 도메인을 포함하고, 세포질 도메인은 CD3-제타의 신호전달 도메인 및 4-1BB의 신호전달 도메인을 포함한다.

한 가지 실시양태에서, RNA CAR용 주형은 항-cMet 모노클로날 항체의 단일 사슬 가변 도메인의 세포외 도메인을 포함하고, 막통과 도메인은 4-1BB의 막통과 도메인을 포함하고, 세포질 도메인은 CD3-제타의 신호전달 도메인 및 4-1BB의 신호전달 도메인을 포함한다.

한 가지 실시양태에서, RNA CAR용 주형은 항-cMet 모노클로날 항체의 단일 사슬 가변 도메인의 세포외 도메인을 포함하고, 세포질 도메인은 CD3-제타의 신호전달 도메인 및 CD28의 신호전달 도메인을 포함한다.

한 가지 실시양태에서, RNA CAR용 주형은 항-cMet 모노클로날 항체의 단일 사슬 가변 도메인의 세포외 도메인을 포함하고, 막통과 도메인은 CD28의 막통과 도메인을 포함하고, 세포질 도메인은 CD3-제타의 신호전달 도메인, CD28의 신호전달 도메인 및 4-1BB의 신호전달 도메인을 포함한다.

몇몇 예에서, 주형은 내부 개방 판독 프레임 비함유(OF)인 주형을 생성하기 위해 내부 개방 판독 프레임(ORF)을 제거하도록 변형된다. 한 가지 실시양태에서, 주형은 특정 종류의 사용을 위해 코돈 최적화된다. 예를 들면, 한 가지 실시양태에서, 주형은 인간의 사용을 위해 코돈 최적화된다. 한 가지 실시양태에서, 주형은 디류신 모티프를 제거하도록 변형된다.

한 가지 실시양태에서, 주형은 IVT 벡터 또는 플라스미드에 포함된다. 한 가지 실시양태에서, 플라스미드는 서열번호 4 및 5로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

한 가지 실시양태에서, 주형은 서열번호 6 내지 24로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 RNA 작제물은 서열번호 6 내지 24로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열로부터 전사된다.

한 가지 실시양태에서, 주형은 폴리(A) 테일을 포함한다. 한 가지 실시양태에서, 폴리(A) 테일은 150개 아데노신 염기를 포함한다. 한 가지 실시양태에서, 폴리(A) 테일은 서열번호 25를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

한 가지 실시양태에서, 주형은 인간 β-글로불린에서 유래하는 3' UTR의 적어도 하나의 반복체를 포함하는 3' UTR을 포함한다. 한 가지 실시양태에서, 주형은 서열번호 26을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

RNA 형질감염

본원에는 본 발명의 시험관내 전사된 RNA CAR를 생성하는 방법이 기재되어 있다. 한 가지 실시양태에서, 시험관내 전사된 RNA CAR는 일시적 형질감염의 형태로 세포에 도입될 수 있다. RNA는 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)-생성된 주형을 사용하여 시험관내 전사에 의해 생산된다. 모든 공급원에서 목적하는 DNA는 적절한 프라이머와 RNA 폴리머라제를 이용하여 시험관내 mRNA 합성을 위한 주형으로 PCR에 의해 직접 전환될 수 있다. DNA의 공급원으로는, 예를 들면, 게놈 DNA, 플라스미드 DNA, 파지 DNA, cDNA, 합성 DNA 서열 또는 DNA의 임의의 다른 적절한 공급원일 수 있다. 시험관내 전사를 위한 목적 주형은 본 발명의 CAR이다. 예를 들면, RNA CAR을 위한 주형은 항-종양 항체의 단일 사슬 가변 도메인을 포함하는 세포외 도메인; 막통과 도메인; 및 CD3-제타의 신호전달 도메인을 포함하는 세포질 도메인을 포함한다. 한 가지 실시양태에서, 주형은 서열번호 6 내지 24로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

한 가지 실시양태에서, PCR에 사용되는 DNA는 개방 판독 프레임을 포함한다. DNA는 생물의 게놈 유래의 천연 발생 DNA 서열로부터 기원할 수 있다. 한 가지 실시양태에서, DNA는 유전자 일부의 관심있는 전장 유전자이다. 유전자는 5' 및/또는 3' 비-번역 영역(UTR)의 일부 또는 전부를 포함할 수 있다. 유전자는 엑손과 인트론을 포함할 수 있다. 한 가지 실시양태에서, PCR에 사용되는 DNA는 인간 유전자이다. 다른 실시양태에서, PCR에 사용되는 DNA는 5' 및 3' UTR을 포함하는 인간 유전자이다. DNA는 또는 일반적으로 천연 발생 생물에서 통상 발현되지 않는 인공 DNA 서열일 수 있다. 예시적 인공 DNA 서열은 융합 단백질을 인코딩하는 개방 판독 프레임을 형성하기 위해 함께 연결되는 유전자 부분을 함유하는 것이다. 함께 연결되는 DNA 부분은 단일 생물에서 또는 하나 이상의 생물에서 유래할 수 있다.

PCR을 위한 DNA의 공급원으로 사용될 수 있는 유전자는, 생물에 치료 효과 또는 예방 효과를 제공하거나 생물에서 질병 또는 장애를 진단하는 데 사용될 수 있는 폴리펩티드를 인코딩하는 유전자를 포함한다. 바람직한 유전자는 단기간의 치료에 유용한 유전자이거나, 용량 또는 발현 유전자에 대한 안전성 우려가 있는 유전자이다. 예를 들면, 암, 자가면역 질환, 기생충, 바이러스, 박테리아, 곰팡이 또는 기타 감염의 치료에 있어서, 발현되는 도입유전자(들)는 면역계 세포에 대한 리간드 또는 수용체로서 기능하거나, 동물의 면역계를 자극하거나 억제하도록 기능할 수 있는 폴리펩티드를 인코딩할 수 있다. 이는 새로운 문제를 유발할 수 있으므로, 면역계의 장기간 지속적 자극을 갖는 것은 바람직하지 않고, 또한 성공적인 치료 후에 계속되는 변화를 생성하는 것은 불필요하다. 자가면역 질환의 치료를 위해, 갑작스런 재발 동안 면역계를 억제하거나 억제하는 것이 바람직한 경우가 있지만, 환자가 감염에 대해 과도하게 민감하게 되도록 할 수 있는 장기간은 아니다.

PCR은 형질감염에 사용되는 mRNA의 시험관내 전사용 주형을 형성하는 데 사용된다. PCR을 실시하는 방법은 당해 기술분야에서 공지되어 있다. PCR에 사용하기 위한 프라이머는 PCR을 위한 주형으로 사용되는 DNA 영역에 실질적으로 상보적인 영역을 갖도록 설계된다. "실질적으로 상보적"은, 본원에서 사용된 바와 같이, 프라이머 서열 중의 염기의 대부분 또는 모두가 상보적이거나 하나 이상의 염기가 비-상보적이거나 부정합되는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 실질적으로 상보적 서열은 PCR에 사용된 어닐링 조건하에 의도된 표적 DNA와 어닐링 또는 하이브리드화할 수 있다. 프라이머는 DNA 주형의 임의의 부분과 실질적으로 상보적이도록 설계될 수 있다. 예를 들면, 프라이머는 5' 및 3' UTR을 포함하여 세포에서 통상 전사되는 유전자 부분을 증폭하도록 설계될 수 있다(개방 판독 프레임). 프라이머는 또한 목적하는 특정 도메인을 인코딩하는 유전자 부분을 증폭하도록 설계될 수 있다. 한 가지 실시양태에서, 프라이머는 5' 및 3' UTR의 전부 또는 일부를 포함하여 인간 cDNA의 코딩 영역을 증폭하도록 설계된다. PCR에 유용한 프라이머는 당해 기술분야에서 공지된 합성 방법에 의해 생성된다. "전방향 프라이머"는, 증폭되는 DNA 서열의 상류에 있는 DNA 주형 상의 뉴클레오티드와 실질적으로 상보적인 뉴클레오티드의 영역을 함유하는 프라이머이다. "상류"는 코딩 쇄와 관련하여 증폭되는 DNA 서열에 대해 위치 5'를 지칭하기 위해 본원에서 사용된다. "역방향 프라이머"는 증폭되는 DNA 서열의 하류에 있는 이중 사슬 DNA 주형에 실질적으로 상보적인 뉴클레오티드의 영역을 함유하는 프라이머이다. "하류"는 코딩 쇄와 관련하여 증폭되는 DNA 서열에 대해 위치 3'를 지칭하기 위해 본원에서 사용된다.

PCR에 유용한 모든 DNA 폴리머라제는 본원에 개시된 방법에서 사용될 수 있다. 시약 및 폴리머라제는 다수의 공급업체에서 시판되고 있다.

안정성 및/또는 번역 효율을 촉진하는 능력을 갖는 화학 구조를 또한 사용할 수 있다. RNA는 바람직하게는 5' 및 3' UTR을 갖는다. 한 가지 실시양태에서, 5' UTR은 길이가 0 내지 3000개 뉴클레오티드이다. 코딩 영역에 부가되는 5' 및 3' UTR 서열의 길이는, 이로써 한정되지 않지만, UTR의 상이한 영역에 어닐링하는 PCR용 프라이머의 설계를 포함하는 상이한 방법으로 변화시킬 수 있다. 이 방법을 사용하여, 당업자는 전사된 RNA의 형질감염 후에 최적 번역 효율의 달성에 필요한 5' 및 3' UTR 길이를 변경할 수 있다.

5' 및 3' UTR은 목적하는 유전자를 위한 천연 발생 내인성 5' 및 3' UTR일 수 있다. 또는, 목적하는 유전자에 내인성이 아닌 UTR 서열은 전방향 또는 역방향 프라이머 내로 UTR을 도입하거나 주형의 임의의 기타 변형에 의해 부가될 수 있다. 목적 유전자에 내인성이 아닌 UTR 서열의 사용은 RNA의 안정성 및/또는 번역 효율을 변경하는데 유용할 수 있다. 예를 들면, 3' UTR 서열 중의 AU-농후 요소는 mRNA의 안정성을 저하시킬 수 있는 것으로 공지되어 있다. 따라서, 3' UTR을 선택하거나 설계하여, 당해 기술분야에 공지된 UTR의 특성에 기반하여 전사된 RNA의 안정성을 증가시킬 수 있다.

한 가지 실시양태에서, 5' UTR은 내인성 유전자의 코작 서열을 함유할 수 있다. 또는, 목적하는 유전자에 내인성이 아닌 5' UTR이 상기한 바와 같은 PCR에 의해 부가되는 경우, 공통 코작 서열은 5' UTR 서열을 부가함으로써 재설계될 수 있다. 코작 서열은 일부 RNA 전사체의 번역 효율을 높일 수 있지만, 효율적인 번역을 가능하게 하기 위해 모든 RNA에 필요하다고는 생각되지 않는다. 다수의 mRNA에 대한 코작 서열의 필요성은 당해 기술분야에 공지되어 있다. 다른 실시양태에서, 5' UTR는 RNA 바이러스에서 유래할 수 있고, 이의 RNA 게놈은 세포내에서 안정하다. 다른 실시양태에서, 다양한 뉴클레오티드 유사체는 mRNA의 엑소뉴클레아제 분해를 방지하기 위해 3' 또는 5' UTR에서 사용할 수 있다.

유전자 클로닝을 필요로 하지 않고서 DNA 주형으로부터 RNA의 합성을 가능하게 하기 위해, 전사 프로모터는 전사되는 서열의 상류에 있는 DNA 주형에 부착해야 한다. RNA 폴리머라제에 대한 프로모터로 기능하는 서열이 전방향 프라이머의 5' 말단에 부가되는 경우, RNA 폴리머라제 프로모터는 전사되는 개방 판독 프레임의 상류에 있는 PCR 생성물 내로 도입된다. 한 가지 바람직한 실시양태에서, 프로모터는 본원의 다른 부분에 기재된 바와 같이, T7 폴리머라제 프로모터이다. 다른 유용한 프로모터는, 이로써 한정되지 않지만, T3 및 SP6 RNA 폴리머라제 프로모터를 포함한다. T7, T3 및 SP6 프로모터의 공통 뉴클레오티드 서열은 당해 기술분야에 공지되어 있다.

바람직한 실시양태에서, mRNA는 세포에서 리보솜 결합, 번역 개시 및 안정성 mRNA를 결정하는 5' 말단 및 3' 폴리(A) 테일 상에 캡을 갖는다. 환상 DNA 주형, 예를 들면, 플라스미드 DNA 상에서, RNA 폴리머라제는 진핵 세포에서 발현에 적합하지 않은 긴 콘카타머 생성물을 생성한다. 3' UTR의 말단에서 선형화된 플라스미드 DNA의 전사는, 전사후 폴리아데닐화되어 있어도, 진핵세포 형질감염에 효과적이지 않은 보통 크기의 mRNA를 제공한다.

선형 DNA 주형 상에서, 파지 T7 RNA 폴리머라제는 전사체의 3' 말단을 주형의 최종 염기 이상까지 연장할 수 있다[참조: Schenborn and Mierendorf, Nuc Acids Res., 13:6223-36 (1985); Nacheva and Berzal-Herranz, Eur. J. Biochem., 270:1485-65 (2003)].

DNA 주형 내로 폴리A/T 연장의 전통적 통합 방법은 분자 클로닝이다. 그러나, 플라스미드 DNA에 통합된 폴리A/T 서열은 플라스미드 불안정성을 유발할 수 있고, 이는 박테리아 세포에서 수득된 플라스미드 DNA 주형이 종종 결실 및 기타 변형으로 고도로 오염되는 이유이다. 이는 클로닝 공정을 번거롭고 시간이 걸리게 할 뿐만 아니라 종종 신뢰성 없게 한다. 이는, 클로닝 없이 폴리A/T 3' 연장으로 DNA 주형의 작제를 가능하게 하는 방법이 매우 바람직한 이유이다.

전사 DNA 주형의 폴리A/T 세그먼트는 100T 테일(크기가 50 내지 5000 T일 수 있음) 등의 폴리 T 테일을 함유하는 역방향 프라이머를 사용하여 PCR 동안, 또는 이로써 한정되지 않지만, DNA 결찰 또는 시험관내 재조합을 포함하는 임의의 기타 방법에 의해 PCR 후에 생성될 수 있다. 폴리(A) 테일은 또한 RNA에 안정성을 주고 이의 분해를 감소시킨다. 일반적으로, 폴리(A) 테일의 길이는 전사된 RNA의 안정성과 전적으로 상관한다. 한 가지 실시양태에서, 폴리(A) 테일은 100 내지 5000개 아데노신 사이이다.

RNA의 폴리(A) 테일은 또한 이.콜라이(E. coli) 폴리A 폴리머라제(E-PAP) 등의 폴리(A) 폴리머라제의 사용으로 시험관내 전사 후에 추가로 연장될 수 있다. 한 가지 실시양태에서, 100개 뉴클레오티드로부터 300 내지 400개 뉴클레오티드까지 폴리(A) 테일의 길이 증가는 RNA의 번역 효율에 있어서 약 2배 증가를 생성한다. 또한, 3' 말단에 상이한 화학 그룹의 부착은 mRNA 안정성을 증가시킬 수 있다. 이러한 부착은 변형된/인공 뉴클레오티드, 압타머 및 기타 화합물을 함유할 수 있다. 예를 들면, ATP 유사체는 폴리(A) 폴리머라제를 사용하여 폴리(A) 테일에 도입될 수 있다. ATP 유사체는 또한 RNA의 안정성을 증가시킬 수 있다.

5' 캡은 RNA 분자에 안정성을 또한 제공한다. 바람직한 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에 의해 생성된 RNA는 5' 캡을 포함한다. 5' 캡은 당해 기술분야에 공지되어 있고 본원에 기재된 기술을 사용하여 제공된다[참조: Cougot, et al., Trends in Biochem. Sci., 29:436-444 (2001); Stepinski, et al., RNA, 7:1468-95 (2001); Elango, et al., Biochim. Biophys. Res. Commun., 330:958-966 (2005)].

본원에 개시된 방법에 의해 생성된 RNA는 내부 리보솜 도입 부위(IRES) 서열을 또한 함유할 수 있다. IRES 서열은, mRNA에 대한 캡-독립적 리보솜 결합을 개시하고 번역 개시를 촉진하는 임의의 바이러스, 염색체 또는 인공적으로 설계된 서열일 수 있다. 예를 들면, 당, 펩티드, 지질, 단백질, 산화방지제 및 계면활성제와 같은 세포 침투성 및 생존을 촉진하는 인자를 함유할 수 있는, 세포 전기천공에 적합한 임의의 용질이 포함될 수 있다.

한 가지 실시양태에서, 본 발명은 CAR를 인코딩하는 합성 RNA 및 RNA-유사 유사체를 포함한다. 즉, 본 발명은, 예를 들면, IVT RNA 및 합성된 RNA를 포함하는, 당해 기술분야에 공지된 임의의 방법으로 제조한 CAR-인코딩 RNA 및 RNA-유사 작제물을 포함한다. 한 가지 실시양태에서, RNA는 올리고뉴클레오티드 합성의 공지된 방법에 의해 합성된다. 올리고뉴클레오티드 합성 방법으로는, 예를 들면, H-포스포네이트 합성, 포스포디에스테르 합성, 포스포트리에스테르 합성, 포스파이트 트리에스테르 합성 및 포스포르아미다이트 방법을 포함한다. 일부 예에서, RNA 작제물의 합성은 뉴클레오티드/뉴클레오시드 유도체 또는 유사체의 도입을 포함한다. 이와 같이, 한 가지 실시양태에서, 본 발명의 RNA는 뉴클레오티드/뉴클레오시드 유도체 또는 유사체를 포함한다. 예를 들면, 유사체의 다른 유형은, 예를 들면, β-D-옥시-LNA, α-L-옥시-LNA, β-D-아미노-LNA, β-D-티오-LNA 및 베타-D-옥시-LNA 등의 LNA이다. 합성된 RNA를 생산하는 방법은 당해 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들면, 미국 특허 제8,242,248호, 미국 특허 제6,111,095호, 미국 특허 공개번호 제2010/0324278호, 미국 특허 공개번호 제2010/0137010호 및 PCT 국제공개번호 제WO2007/031081호에 기재되어 있으며, 이들 각각은 참고로 도입된다. 추가로, 본 발명은 지금까지 알려지지 않은 방법에 의해 제조된 CAR-인코딩 RNA 및 RNA-유사 작제물을 포함하고, 단 당해 작제물은 본원에 기재된 CAR의 성분들을 인코딩하는 서열을 포함한다.

RNA는 다수의 임의의 상이한 방법, 예를 들면, 이로써 한정되지 않지만, 전기천공(Amasa Nucleofector-II(AMAXA Biosystems, Cologne, Germany)), (ECM 830 (BTX) (Harvard Instruments, Boston, Mass.), 또는 Gene Pulser II(BioRad, Denver, Colo.), Multiporator(Eppendort, Hamburg, Germany), 리포펙션을 사용하는 양이온성 리포좀 매개된 형질감염, 고분자 캡슐화, 펩티드 매개된 형질감염, 또는 "유전자 총" 등의 바이오리스틱 입자 전달 시스템[참조: Nishikawa, et al. Hum Gene Ther., 12(8):861-70 (2001)]을 포함하는 상업적으로 시판되는 방법을 사용하여 표적 세포 내로 도입될 수 있다.

RNA-조작된 T 세포

시험관내 전사된 mRNA CAR는, 담체로서 형질감염된 세포를 사용하거나 캡슐화된, 결합된 또는 네이키드 mRNA의 세포-비함유 국소 또는 전신 전달을 사용하여 진핵 세포의 상이한 유형에 및 조직 및 전체 생물에 전달될 수 있다. 사용된 방법은 일시적 발현이 필요하거나 충분한 임의의 목적으로 할 수 있다.

개시된 방법은, 발달 경로의 변조를 포함하여, 암, 줄기 세포, 급성 및 만성 감염 및 자가면역 질환의 분야의 기초 연구 및 치료에서 세포 활성의 조절에 적용될 수 있다.

당해 방법은 또한 투입 RNA의 양을 변화시킴으로써 발현 수준을 광범위하게 조절하는 능력을 제공하여, 각각의 형질감염된 유전자의 발현 수준을 개별적으로 조절할 수 있다. 추가로, mRNA 생산의 PCR-기반 기술은 상이한 구조를 갖는 키메라 수용체 mRNA의 설계 및 이들 도메인의 조합을 크게 촉진시킨다. 예를 들면, 동일한 세포에서 복수의 키메라 수용체 상에서 상이한 세포내 효과기/공자극인자 도메인의 변화는 복수-항원성 표적에 대해 최고 수준의 세포독성 및 동시에 정상 세포에 대한 최저 세포독성을 평가하는 수용체 조합물의 구조를 측정하게 한다.

본 발명의 방법의 잇점은 RNA 형질감염이 필수적으로 일시적 및 벡터-비함유라는 점이다. RNA 도입유전자는 림프구에 전달되어, 임의의 추가 바이러스 서열을 필요로 하지 않고서 최소 발현 카세트로서 짧은 시험관내 세포 활성화 후에 그 속에서 발현될 수 있다. 이들 조건하에, 숙주 세포 게놈 내로 도입유전자의 통합은 예상 밖이다. 세포의 클로닝은 RNA의 형질감염 효율 및 전체 림프구 모집단을 균일하게 변형시키는 이들의 능력 때문에 필요하지 않다. 따라서, 개시된 방법에 따라 도입된 RNA 작제물을 함유하는 세포는 치료학적으로 사용될 수 있다. 예를 들면, 림프구 세포 모집단은 환자로부터 회수되고, 상이한 RNA 작제물로 형질감염된 다음, 환자에게 재도입된다. 이어서, 형질감염된 세포 모집단은 CD19 또는 기타 표적 항원을 함유하는 림프종 또는 기타 암 세포를 표적화한다. RNA 형질감염된 세포 사용의 잇점은 RNA 도입유전자가 한정된 반감기를 갖는 것이다. 인코딩된 단백질은 한정된 기간 동안 형질감염된 세포에 의해서만 생산될 것이다. 이는, 유전자 변형된 세포가 환자 내로 도입되는 경우, 임의의 의도하지 않은 결과의 위험을 감소시키는데 도움이 된다.

바람직한 실시양태에서, 당해 기술은 맞춤 치료를 위해 사용된다. 예를 들면, 종양의 치료에 있어서, 환자의 혈액 또는 세포는 아페레시스, 생검 또는 정맥천자 등의 적절한 방법에 의해 수집된다. 세포는, 당해 세포가 종양을 치료하기 위한 적절한 RNA 작제물로 형질감염된 시간 동안에 적어도 24시간 배양된다. 필요에 따라, 세포는 형질감염 전에 동결보존할 수 있다. 이어서, 이들은 적절한 시기에 적절한 용량으로 환자에게 복귀된다. 한 가지 실시양태에서, RNA 변형된 세포는 환자에게 복수회 투여된다.

시험관내 전사된 RNA(IVT-RNA)를 이용한 면역 치료는 다양한 동물 모델에서 성공적으로 시험된 2가지 상이한 전략을 이용한다. 세포는 리포펙션 또는 전기천공에 의해 시험관내 전사된 RNA로 형질감염되고, 대상체에 투여된다. 바람직하게는, 전달된 IVT-RNA의 장기 발현을 달성하기 위해 다양한 변형을 사용하여 IVT-RNA를 안정화시키는 것이 바람직하다.

일부 IVT 벡터는 문헌에 공지되어 있고, 이는 시험관내 전사를 위한 주형으로 표준 방식에서 사용되고 안정화된 RNA 전사체가 생산되는 방식으로 유전자 변형된다. 당해 기술분야에서 사용되는 현재의 프로토콜은 하기 구조를 갖는 플라스미드 벡터에 기반한다: RNA의 전사를 가능하게 하는 5' RNA 폴리머라제 프로모터, 이어서 비번역된 영역(UTR)에 의해 3' 및/또는 5'에 인접하는 목적하는 유전자, 및 A 뉴클레오티드 쇄를 함유하는 3' 폴리아데닐 카세트. 시험관내 전사 전에, 환상 플라스미드는 II형 제한 효소에 의해 폴리아데닐 카세트의 하류에서 선형화된다(인식 서열은 절단 부위에 상응한다). 따라서, 폴리아데닐화 카세트는 전사체 중의 후기 폴리(A) 서열에 상응한다. 이러한 공정의 결과로서, 일부 뉴클레오티드는 선형화 후에 효소 절단 부위의 일부로서 잔류하고, 3' 말단에서 폴리(A) 서열을 연장하거나 마스크한다. 이러한 비생리학적 돌출이 이러한 작제물로부터 세포내 생산된 단백질의 양에 영향을 미치는지는 명확하지 않다.

RNA는 보다 전통적 플라스미드 또는 바이러스성 방법에 비해 몇 가지 잇점을 갖는다. RNA 공급원으로부터 유전자 발현은 전사를 필요로 하지 않고, 단백질 생성물은 형질감염 후에 급속하게 생성된다. 또한, RNA가 핵이 아니라 세포질에만 접근하기 때문에, 통상의 형질감염 방법은 매우 고도의 형질감염을 제공한다. 또한, 플라스미드 기반 접근방식은 목적하는 유전자의 발현을 유도하는 프로모터가 연구하의 세포에서 활성인 것을 필요로 한다.

또 다른 측면에서, RNA 작제물은 전기천공에 의해 세포에 전달될 수 있다. 미국 특허 공개공보 제2004/0014645호, 미국 특허 공개공보 제2005/0052630A1호, 미국 특허 공개공보 제2005/0070841A1호, 미국 특허 공개공보 제2004/0059285A1호, 미국 특허 공개공보 제2004/0092907A1호에 교시된 바와 같이, 예를 들면, 포유동물 세포 내로 핵산 작제물의 전기천공의 제형 및 방법을 참조한다. 임의의 공지된 세포 유형의 전기천공에 요구된 전계 강도를 포함하는 다양한 파라미터는 당해 분야에서 관련 연구 문헌 및 다수의 특허 및 특허원에 일반적으로 공지되어 있다[참조: 미국 특허 제6,678,556호, 미국 특허 제7,171,264호 및 미국 특허 제7,173,116호]. 전기천공의 치료학적 적용을 위한 장치는 시판되고 있고[참조: MedPulser™ DNA 전기천공 치료 시스템(Inovio/Genetronic, San Diego, CA)], 특허[참조: 미국 특허 제6,567,694호, 미국 특허 제6,516,223호, 미국 특허 제5,993,434호, 미국 특허 제6,181,964호, 미국 특허 제6,241,701호 및 미국 특허 제6,233,482호]에 기재되어 있으며; 전기천공은 또한, 예를 들면, 미국 특허 공개공보 제US20070128708A1호에 기재된 바와 같이, 시험관내에서 세포의 형질감염에 사용될 수 있다. 전기천공은 또한 시험관내에서 핵산을 세포 내로 전달하는데 사용될 수 있다. 따라서, 당업자에게 공지된 임의의 다수의 시판 장치 및 전기천공 시스템을 이용하는 발현 작제물을 포함하는 핵산의 세포 내로의 전기천공-매개된 투여는 표적 세포에 목적하는 RNA를 전달하는 흥미로운 새로운 방법을 제시한다.

T 세포의 공급원

증식 및 유전자 변형 전에, T 세포의 공급원은 대상체로부터 수득된다. 용어 "대상체"는 면역 반응을 유발할 수 있는 살아있는 생물체(예: 포유동물)을 포함하는 것으로 의도된다. 대상체의 예는 사람, 개, 고양이, 마우스, 랫트 및 이의 유전자도입 종을 포함한다. T 세포는 말초혈 단핵 세포, 골수, 림프절 조직, 재대혈, 흉선 조직, 감염 부위, 복수 부위 또는 흉막 유출 부위로부터의 조직, 비장 조직 및 종양을 포함한 다수의 공급원으로부터 수득될 수 있다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 당해 기술분야에서 이용가능한 다수의 임의의 T 세포주가 사용될 수 있다. 본 발명의 특정 실시양태에서, T 세포는 피콜^TM(Ficoll^TM) 분리와 같이 당업자에게 공지된 다수의 임의의 기술을 이용하여 대상체로부터 수집된 혈액 단위로부터 수득될 수 있다. 하나의 바람직한 실시양태에서, 개체의 순환 혈액으로부터의 세포는 아페레시스에 의해 수득된다. 아페레시스 생성물은 전형적으로는 T 세포, 단핵 세포, 과립구, B 세포, 기타 핵형성 백혈구 세포, 적혈구 세포 및 혈소판을 포함한 림프구를 포함한다. 하나의 실시양태에서, 상기 아페레시스에 의해 수집된 세포는 혈장 분획을 제거하고 후속적인 가공 단계를 위해 상기 세포를 적절한 완충액 또는 배지에 넣기 위해 세척될 수 있다. 본 발명의 한 가지 실시양태에서, 상기 세포는 인산 완충 식염수(PBS)로 세척한다. 대안적인 실시양태에서, 세척액에는 칼슘이 결핍되고, 마그네슘이 결핍될 수 있거나, 모두가 2가 양이온이 아닌 경우에 많은 것이 결핍될 수 있다. 또한, 놀랍게도, 칼슘의 부재하에서의 초기 활성화 단계는 확대된 활성화를 초래한다. 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 세척 단계가 제조사의 지시에 따라 반자동화된 "통과형(flow-through)" 원심분리기(예를 들면, Cobe 2991 cell processor, the Baxter CytoMate or Haemonetics Cell Saver 5)를 이용하는 것과 같이 당해 기술분야의 숙련자에게 공지된 방법에 의해 달성될 수 있다는 것을 용이하게 인식할 수 있다. 세척 후, 상기 세포는, 예를 들면, Ca-비함유, Mg-비함유 PBS, 플라즈마라이트(PlasmaLyte) A, 또는 완충액의 존재 또는 부재하의 기타 식염수 용액과 같은 다양한 생물적합성 완충액에 재현탁될 수 있다. 대안적으로, 상기 아페레시스 샘플의 바람직하지 못한 성분은 제거될 수 있으며, 상기 세포는 배양 배지에 직접 현탁될 수 있다.

또 다른 실시양태에서, T 세포는 적혈구 세포를 용해하고, 예를 들면, PERCOLL^TM 구배를 통한 원심분리 또는 역류 원심분리 정화에 의해 단핵 세포를 고갈시킴으로써 말초혈 림프구로부터 단리된다. CD3⁺, CD28⁺, CD4⁺, CD8⁺, CD45RA⁺ 및 CD45RO⁺T 세포와 같은 T 세포의 특정 아집단은 양성 또는 음성 선택 기술에 의해 추가로 단리될 수 있다. 예를 들면, 한 가지 실시양태에서, T 세포는 목적하는 T 세포의 양성 선택을 위해 충분한 기간 동안 DYNABEADS^® M-450 CD3/CD28 T 등의 항-CD3/항-CD28(즉, 3×28) 접합 비드와 함께 배양함으로써 단리된다. 한 가지 실시양태에서, 상기 기간은 약 30분이다. 추가의 실시양태에서, 상기 기간은 30분 내지 36시간의 범위 또는 그 이상일 수 있으며, 이들 사이의 모든 값은 정수이다. 추가의 실시양태에서, 상기 기간은 적어도 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간 또는 6시간이다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 상기 기간은 10시간 내지 24시간이다. 한 가지 바람직한 실시양태에서, 상기 배양 기간은 24시간이다. 백혈병을 앓는 환자로부터 T 세포의 분리를 위해, 보다 긴 배양 시간, 예를 들면, 24시간의 사용은 세포 수율을 증가시킬 수 있다. 보다 긴 배양 시간은 기타 세포 유형과 비교하여 T 세포의 수가 적은 임의의 상황, 예를 들면, 종양 조직 또는 면역 무방비(immune-compromising) 개체로부터 종양 침윤성 림프구(TIL)를 분리하는 것과 같은 상황에서 T 세포를 분리하기 위해 사용될 수 있다. 또한, 보다 긴 배양 시간의 사용은 CD8+ T 세포의 포획 효율을 증가시킬 수 있다. 따라서, 시간을 단순히 감소시키거나 증가시킴으로써 T 세포는 CD3/CD28 비드에 결합하게 되고/되거나 T 세포에 대한 비드의 비율을 증가시키거나 감소시킴으로써(본원에서 추가로 개시된 바와 같음) T 세포의 아집단은 배양 개시 시점 또는 공정 도중의 기타 시점에서 우선적으로 선택될 수 있다. 추가로, 비드 또는 기타 표면의 항-CD3 및/또는 항-CD28 항체의 비율을 증가시키거나 감소시킴으로써 T 세포의 아집단은 배양 개시 시점 또는 기타 목적하는 시점에서 우선적으로 선택될 수 있다. 당업자는 복수회의 선택이 또한 본 발명과 관련하여 사용될 수 있다는 것을 인식할 수 있다. 특정 실시양태에서, 선택 과정을 수행하고, 활성화 및 확장 공정에서 "선택되지 않은" 세포를 이용하는 것이 바람직할 수 있다. "선택되지 않은" 세포는 또한 추가 회수의 선택이 적용될 수도 있다.

음성 선택에 의한 T 세포 모집단의 농후화는 음성으로 선택된 세포에 특이적인 표면 마커에 대해 지시된 항체의 조합에 의해 달성될 수 있다. 하나의 방법은 음성으로 선택된 세포 상에 존재하는 세포 표면 마커에 대해 지시된 모노클로날 항체의 칵테일(cocktail)을 이용하는 음자성 면역부착법 또는 유동 세포계수를 통한 세포 선별 및/또는 선택이다. 예를 들면, 음성 선택에 의해 CD4⁺ 세포용으로 농후화하기 위해, 모노클로날 항체 칵테일은 전형적으로는 CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR 및 CD8에 대한 항체를 포함한다. 특정 실시양태에서, 전형적으로 CD4⁺, CD25⁺, CD62L^hi, GITR⁺ 및 FoxP3⁺를 발현하는 조절성 T 세포용으로 농후화하거나 양성으로 선택하는 것이 바람직할 수 있다. 대안적으로는, 특정 실시양태에서, T 조절성 세포는 항-C25 접합 비드 또는 기타 유사한 선택 방법으로 고갈될 수 있다.

양성 또는 음성 선택에 의한 세포의 목적하는 모집단을 단리하기 위해, 세포 및 표면(예를 들면, 비드와 같은 입자)의 농도는 달라질 수 있다. 특정 실시양태에서, 세포 및 비드의 최대 접촉을 확실히 하기 위해 비드 및 세포가 함께 혼합되어 있는 용적을 유의적으로 증가시키는 것(즉, 세포의 농도를 증가시키는 것)이 바람직할 수 있다. 예를 들면, 한 가지 실시양태에서, 1㎖당 20억개의 세포 농도가 사용된다. 한 가지 실시양태에서, 1㎖당 10억개의 세포 농도가 사용된다. 추가의 실시양태에서, 1㎖당 1억개 초과의 세포가 사용된다. 추가의 실시양태에서, 1㎖당 1천만, 1천5백만, 2천만, 2천5백만, 3천만, 3천5백만, 4천만, 4천5백만 또는 5천만개 세포의 세포 농도가 사용된다. 또 다른 실시양태에서, 1㎖당 7천5백만, 8천만, 8천5백만, 9천만, 9천5백만 또는 1억개 세포의 세포 농도가 사용된다. 추가의 실시양태에서, 1㎖당 1억 2천5백만 또는 1억 5천만개의 세포 농도가 사용될 수 있다. 고농도의 사용은 세포 수율, 세포 활성화 및 세포 확장의 증가를 초래할 수 있다. 또한, 높은 세포 농도의 사용은 CD28 음성 T 세포와 같이 목적하는 표적 항원을 약하게 발현할 수 있는 세포의 보다 효율적인 포획을 가능하게 하거나, 다수의 종양 세포가 존재하는 샘플(즉, 백혈병성 혈액, 종양 조직 등)로부터 상기 세포의 보다 효율적인 포획을 가능하게 한다. 이러한 세포의 모집단은 치료적 가치를 가질 수 있으며, 상기 세포의 모집단을 수득하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들면, 고농도의 세포의 사용은 정상적으로 보다 약한 CD28 발현을 갖는 CD8⁺ T 세포의 보다 효율적인 선택을 가능하게 한다.

관련 실시양태에서, 보다 낮은 농도의 세포를 이용하는 것이 바람직할 수 있다. T 세포와 표면(예를 들면, 비드 등의 입자)의 혼합물을 유의적으로 희석함으로써 입자와 세포 사이의 상호작용을 최소화된다. 이는 다량의 목적하는 항원을 발현시켜 상기 입자에 결합되는 세포를 선택된다. 예를 들면, CD4⁺ T 세포는 보다 높은 수준의 CD28을 발현하고, 희석 농도에서 CD8⁺ T 세포보다 더욱 효율적으로 포획된다. 한 가지 실시양태에서, 사용된 세포의 농도는 5×10⁶/㎖이다. 기타 실시양태에서, 사용된 농도는 약 1×10⁵/㎖ 내지 1×10⁶/㎖일 수 있으며, 이들 사이에 있는 임의의 정수 값이다.

기타 실시양태에서, 상기 세포는 2 내지 10℃ 및 실온 중의 하나에서 변하는 속도로 변하는 시간의 길이 동안 회전장치 상에서 배양될 수 있다.

자극을 위한 T 세포는 또한 세척 단계 이후에 동결될 수 있다. 이론에 결부되지 않기를 바라면서, 동결 단계 및 후속적인 해동 단계는 세포 모집단 내의 과립구를 제거하고 어느 정도는 단핵구를 제거함으로써 보다 균일한 생성물을 제공한다. 혈장 및 혈소판을 제거하는 세척 단계 후, 상기 세포는 동결 용액에 현탁될 수 있다. 다수의 동결 용액 및 파라미터가 당해 기술분야에 공지되어 있고 이와 관련하여 유용할지라도, 하나의 방법은 20% DMSO 및 8% 인간 혈청 알부민을 함유하는 PBS, 또는 10% 덱스트란 40 및 5% 덱스트로즈를 함유하는 배양 배지, 20% 인간 혈청 알부민 및 7.5% DMSO, 또는 31.25% 플라즈마라이트-A, 31.25% 덱스트로즈 5%, 0.45% NaCl, 10% 덱스트란 40 및 5% 덱스트로즈, 20% 인간 혈청 알부민, 및 7.5% DMSO, 또는, 예를 들면, 헤스판(Hespan) 및 플라즈마라이트 A를 함유하는 기타 적합한 세포 동결 배지의 이용을 포함한다. 이어서, 상기 세포는 1분당 1°의 속도로 -80℃까지 동결되고, 기상의 액체 질소 저장 탱크에 저장된다. -20℃에서 또는 액체 질소 중에서 제어되지 않는 즉시형 동결 뿐만 아니라 기타 제어된 동결 방법이 사용될 수 있다.

특정 실시양태에서, 동결보존된 세포는 상술한 바와 같이 해동하고 세척하며, 본 발명의 방법을 이용한 활성화 전에 실온에서 1시간 동안 정치한다.

본원에서 개시된 바와 같이 증식된 세포가 필요로 할 시기 이전의 기간에서 대상체로부터 혈액 샘플 또는 아페레시스 생성물을 수집하는 것이 본 발명과 관련하여 또한 고려된다. 이와 같이, 확장될 세포의 공급원은 임의의 필요한 시점에서 수집될 수 있으며, T 세포 등의 목적하는 세포는 본원에서 개시된 바와 같은 T 세포 치료로부터 잇점을 가질 수 있는 다수의 임의의 질병 또는 상태에 대해 T 세포 치료에서 추후 사용하기 위해 단리되고 냉동된다. 한 가지 실시양태에서, 혈액 샘플 또는 아페레시스는 일반적으로 건강한 대상체로부터 수득된다. 특정 실시양태에서, 혈액 샘플 또는 아페레시스는 질병에 걸릴 위험이 있지만 아직까지 질병에 걸리지 않은 일반적으로 건강한 대상체로부터 수득되고, 관심있는 세포는 추후 사용을 위해 단리되고 동결된다. 특정 실시양태에서, 상기 T 세포는 증식되고, 동결되며, 추후 시간에서 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 샘플은 본원에서 기재된 바와 같은 특정한 질병의 진단 직후, 그러나 임의의 치료 이전에 환자로부터 수집된다. 추가의 실시양태에서, 상기 세포는 다수의 임의의 관련된 치료 양식 이전에 대상체에서 혈액 샘플 또는 아페레시스로부터 단리되며, 이때 상기 관련된 치료 양식은, 이로써 한정되지 않지만, 나탈리주맙(natalizumab), 에팔리주맙(efalizumab) 및 항바이러스제 등의 약제, 사이클로스포린, 아자티오프린(azathioprine), 메토트렉세이트(methotrexate), 마이코페놀레이트(mycophenolate) 및 FK506 등의 면역억제제, 항체, 또는 CAMPATH, 항-CD3 항체, 사이톡산(cytoxan), 플루다라빈(fludarabine), 사이클로스포린, FK506, 라파마이신(rapamycin), 마이코페놀산, 스테로이드류 및 FR901228 등의 기타 면역 절제제, 및 방사선요법을 포함한다. 이들 약제는 칼슘 의존성 포스파타제 칼시뉴린(calcineurin)(사이클로스포린 및 FK506)을 억제하거나, 성장 인자 유도된 신호전달(라파마이신)에 중요한 p70S6 키나제를 억제한다[참조: Liu et al., Cell 66: 807-815, 1991; Henderson et al., Immun. 73: 316-321, 1991; Bierer et al., Curr. Opin. Immun. 5: 763-773, 1993]. 추가의 실시양태에서, 상기 세포는 환자를 위해 단리되고, 골수 또는 줄기세포 이식, 및 플루다라빈, 외부 방사선 요법(XRT) 또는 싸이클로포스파미드(cyclophosphamide) 등의 화학요법제 및 OKT3 또는 CAMPATH 등의 항체 중 하나를 이용하는 T 세포 제거 요법(예를 들면, 이전, 동시 또는 이후)과 함께 추후 사용을 위해 동결된다. 또 다른 실시양태에서, 상기 세포는 CD20과 반응하는 약제, 예를 들면, 리툭산(Rituxan) 등의 B-세포 제거 요법 이전에 단리하고, 상기 B-세포 제거 요법 이후에 추후 사용을 위해 동결될 수 있다.

본 발명의 추가의 실시양태에서, T 세포는 비-세포 기반 치료를 사용한 치료 직후에 환자로부터 수득되고, T 세포는 본 발명의 RNA CAR을 포함하도록 조작된다. 이와 관련하여, 특정 암 치료 이후, 특히 면역 시스템을 손상시키는 약제에 의한 치료 이후, 상기 치료에 의해 환자가 정상적으로 회복할 수 있는 기간 동안의 치료 직후에, 수득된 T 세포의 성질은 최적일 수 있고 생체외에서 증식하는 이들의 능력을 위해 개선될 수 있는 것으로 관찰되었다. 마찬가지로, 본원에 기재된 방법을 이용한 생체외 조작 이후에, 이들 세포는 증강된 이식 및 생체내 증식을 위해 바람직한 상태로 존재할 수 있다. 따라서, 이는 이러한 회복 단계 도중에 조혈 계통의 T 세포, 수지상 세포 또는 기타 세포를 포함한 혈액 세포를 수집하기 위해 본 발명과 관련하여 고려된다. 추가로, 특정 실시양태에서, 고정화(예를 들면, GM-CSF에 의한 고정화) 및 컨디셔닝 양생법(conditioning regimen)은, 특히 요법 이후의 소정 시간의 윈도우 도중에, 특정한 세포 유형의 재증식, 재순환, 재생 및/또는 확장이 바람직한 대상체의 상태를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 예시적인 세포 유형은 T 세포, B 세포, 수지상 세포, 및 상기 면역 시스템의 기타 세포를 들 수 있다.

T 세포의 활성화 및 증식

T 세포의 형질감염 전에, 당해 세포는, 예를 들면, 미국 특허 제6,352,694호; 제6,534,055호; 제6,905,680호; 제6,692,964호; 제5,858,358호; 제6,887,466호; 제6,905,681호; 제7,144,575호; 제7,067,318호; 제7,172,869호; 제7,232,566호; 제7,175,843호; 제5,883,223호; 제6,905,874호; 제6,797,514호; 및 제6,867,041호, 및 미국 특허출원 제2006-0121005호에 개시된 방법을 이용하여 활성화되고 증식될 수 있다.

일반적으로, 본 발명의 T 세포는 CD3/TCR 복합체 관련 신호를 자극하는 약제 및 T 세포의 표면 상의 공자극성 분자를 자극하는 리간드가 부착되어 있는 표면과의 접촉에 의해 확장된다. 특히, T 세포 모집단은 항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 표면 상에 고정된 항-CD2 항체와의 접촉, 또는 칼슘 이온 투과 담체(calcium ionophore)와 함께 단백질 키나제 C 활성인자(예를 들면, 브리오스타틴(bryostatin))와의 접촉에 의한 것과 같이 본원에 기재된 바와 같이 자극될 수 있다. T 세포의 표면 상의 보조 분자의 공자극을 위해, 상기 보조 분자와 결합하는 리간드가 사용된다. 예를 들면, T 세포의 모집단은 T 세포의 증식을 자극하기에 적절한 조건하에 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체와 접촉될 수 있다. CD4⁺ T 세포 및 CD8⁺ T 세포 중 하나의 증식을 자극하기 위해, 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체가 사용된다. 항-CD28 항체의 예는 9.3, B-T3 및 XR-CD28(디아클론(Diaclone), 프랑스 베샹송(Besancon) 소재)을 포함하고, 이들은 당해 기술분야에 일반적으로 공지된 기타 방법으로서 사용될 수 있다[참조: Berg et al., Transplant Proc. 30(8): 3975-3977, 1998; Haanen et al., J. Exp. Med. 190(9): 1319-1328, 1999; Garland et al., J. Immunol Meth. 227(1-2): 53-63, 1999].

특정 실시양태에서, T 세포를 위한 1차 자극 신호 및 공자극성 신호는 상이한 프로토콜에 의해 제공될 수 있다. 예를 들면, 각각의 신호를 제공하는 약제는 용액 상태일 수 있거나, 표면에 결합되어 있을 수 있다. 표면에 결합되어 있는 경우, 상기 약제는 동일한 표면(즉, "시스" 형태) 또는 개별 표면(즉, "트랜스" 형태)에 결합될 수 있다. 또는, 하나의 약제가 표면에 결합될 수 있고, 기타 약제는 용액 상태일 수 있다. 하나의 실시양태에서, 공자극성 신호를 제공하는 약제는 세포 표면에 결합되어 있고, 1차 활성화 신호를 제공하는 약제는 용액 상태이거나 표면에 결합되어 있다. 특정 실시양태에서, 상기 약제 둘 모두는 용액 상태일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 상기 약제는 가용성 형태일 수 있으며, 이어서 Fc 수용체를 발현하는 세포 또는 항체, 또는 상기 약제와 결합하는 기타 결합제 등의 표면에 가교결합될 수 있다. 이와 관련하여, 예를 들면, 본 발명에서 T 세포를 활성화시키고 확장하는데 사용하기 위해 고려되는 인공 항원 제시 세포(aAPC)에 대해서는 미국 특허 공개공보 제2004-0101519호 및 제2006-0034810호를 참조한다.

한 가지 실시양태에서, 상기 2개의 약제는 비드 상에 고정되는데, 동일한 비드, 즉 "시스" 상에 또는 분리 비드, 즉 "트랜스"에 고정된다. 예를 들면, 1차 활성화 신호를 제공하는 약제는 항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고, 공자극성 신호를 제공하는 약제는 항-CD28 항체 또는 이의 항원 결합 단편이며, 상기 약제 둘 모두는 등가의 분자량으로 동일한 비드에 동시 고정된다. 한 가지 실시양태에서, CD4⁺ T 세포 확장 및 T 세포 성장을 위해 비드에 결합된 각 항체의 1:1의 비율이 사용된다. 본 발명의 특정한 실시양태에서, 비드에 결합된 항-CD3:CD28 항체의 비율은 1:1의 비율을 이용하여 관찰된 확장에 비해 T 세포 확장의 증가가 관찰되도록 사용된다. 한 가지 특정한 실시양태에서, 1:1의 비율을 이용하여 관찰된 확장에 비해 약 1 내지 약 3배의 증가가 관찰된다. 한 가지 실시양태에서, 비드에 결합된 CD3:CD28 항체의 비율은 100:1 내지 1:100의 범위 및 상기 범위 사이의 모든 정수 값이다. 본 발명의 한 가지 실시양태에서, 항-CD3 항체보다 상기 입자에 더 많은 항-CD28 항체가 결합한다. 즉, CD3:CD28의 비율은 1미만이다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 비드에 결합된 항-CD3 항체에 대한 항-CD28 항체의 비율은 2:1을 초과한다. 한 가지 특정 실시양태에서, 비드에 결합된 항체의 1:100 CD3:CD28의 비율이 사용된다. 또 다른 실시양태에서, 비드에 결합된 항체의 1:75 CD3:CD28의 비율이 사용된다. 또 다른 실시양태에서, 비드에 결합된 항체의 1:50 CD3:CD28의 비율이 사용된다. 또 다른 실시양태에서, 비드에 결합된 항체의 1:30 CD3:CD28의 비율이 사용된다. 한 가지 바람직한 실시양태에서, 비드에 결합된 항체의 1:10 CD3:CD28의 비율이 사용된다. 또 다른 실시양태에서, 비드에 결합된 항체의 1:3 CD3:CD28의 비율이 사용된다. 또 다른 실시양태에서, 비드에 결합된 항체의 3:1 CD3:CD28의 비율이 사용된다.

1:500 내지 500:1의 세포에 대한 입자의 비율, 및 이들 사이의 임의의 정수값은 T 세포 또는 기타 표적 세포를 자극하기 위해 사용될 수 있다. 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 인지하는 바와 같이, 상기 세포에 대한 입자의 비율은 표적 세포에 대한 입자 크기에 의존할 수 있다. 예를 들면, 크기가 작은 비드는 소수의 세포와만 결합하는 반면, 보다 큰 비드는 많은 세포와 결합할 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 입자에 대한 세포의 비율은 1:100 내지 100:1의 범위 및 이들 사이의 임의의 정수 값이며, 또 다른 실시양태에서 상기 비율은 1:9 내지 9:1의 범위 및 이들 사이의 임의의 정수 값이며, 또한 T 세포를 자극하기 위해 사용될 수 있다. T 세포의 자극을 야기하는 T 세포에 대한 항-CD3- 및 항-CD28 결합 입자의 비율은 상술한 바와 같이 변할 수 있지만, 바람직한 특정 값은 1:100, 1:50, 1:40, 1:30, 1:20, 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1 및 15:1을 포함하며, 이때 하나의 바람직한 비율은 T 세포당 적어도 1:1의 입자이다. 한 가지 실시양태에서, 1:1 이하의 세포에 대한 입자의 비율이 사용된다. 한 가지 특정 실시양태에서, 바람직한 입자:세포 비율은 1:5이다. 추가의 실시양태에서, 세포에 대한 입자의 비율은 자극 일수에 따라 다를 수 있다. 예를 들면, 한 가지 실시양태에서, 세포에 대한 입자의 비율은 첫째 날에는 1:1 내지 10:1의 범위이고, 추가의 입자를 그 이후에 최대 10일 동안 매일 또는 하루걸러 1:1 내지 1:10의 최종 비율(첨가일의 세포 계수에 기초함)로 세포에 첨가한다. 한 가지 특정 실시양태에서, 세포에 대한 입자의 비율은 자극 첫째 날에 1:1이고, 자극 3일 및 5일째 날에 1:5로 조절한다. 또 다른 실시양태에서, 입자는 자극 첫째 날에 1:1의 최종 비율, 및 자극 3일 및 5일째 날에 1:5의 최종 비율로 매일 또는 하루걸러 첨가한다. 또 다른 실시양태에서, 세포에 대한 입자의 비율은 자극 첫째 날에 2:1이고, 자극 3일 및 5일째 날에 1:10로 조절한다. 또 다른 실시양태에서, 입자는 자극 첫째 날에 1:1의 최종 비율, 및 자극 3일 및 5일째 날에 1:10의 최종 비율로 매일 또는 하루걸러 첨가한다. 당해 기술분야의 숙련자라면, 다양한 기타 비율이 본 발명에서 사용하기에 적합할 수 있다는 것을 인지할 것이다. 특히, 입자 크기, 및 세포 크기 및 유형에 따라 비율은 변할 것이다.

본 발명의 추가의 실시양태에서, T 세포 등의 세포는 약제 코팅된 비드와 조합되고, 상기 비드 및 세포는 후속적으로 분리된 후, 상기 세포가 배양된다. 대안적 실시양태에서, 배양 이전에, 약제 코팅된 비드 세포는 분지하지 않고 함께 배양한다. 추가의 실시양태에서, 상기 비드 및 세포는 먼저 자력과 같은 힘을 가하여 농축시키고, 이는 세포 표면 마커의 결찰을 증가시켜 세포 자극을 유도한다.

예를 들면, 세포 표면 단백질은 항-CD3 및 항-CD28이 부착된 상자성 비드가 T 세포와 접촉하도록 함으로써 결찰될 수 있다. 한 가지 실시양태에서, 상기 세포(예를 들면, 10⁴ 내지 10⁹개 T 세포) 및 비드(예를 들면, 1:1 비율의 DYNABEADS^® M-450 CD3/CD28 T 상자성 비드)는 완충액, 바람직하게는 PBS(칼슘 및 마그네슘 등의 2가 양이온의 부재)에서 조합된다. 또한, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 임의의 세포 농도가 사용될 수 있다는 것을 용이하게 인지할 수 있다. 예를 들면, 상기 표적 세포는 상기 샘플에 매우 희박할 수 있으며, 상기 샘플의 0.01%만을 포함할 수 있거나, 전체 샘플(즉, 100%)은 관심있는 표적 세포를 포함할 수 있다. 따라서, 임의의 세포 개수는 본 발명의 범위 내에 있다. 특정 실시양태에서, 세포와 입자의 최대 접촉을 확보하기 위해, 세포 및 입자가 함께 혼합되어 있는 용적을 유의적으로 감소시키는 것(즉, 세포의 농도를 증가시키는 것)이 바람직할 수 있다. 예를 들면, 한 가지 실시양태에서, 1㎖당 약 20억개의 세포 농도가 사용된다. 다른 실시양태에서, 1㎖당 1억개 초과의 세포 농도가 사용된다. 추가의 실시양태에서, 1㎖당 1천만, 1천5백만, 2천만, 2천5백만, 3천만, 3천5백, 4천만, 4천5백만 또는 5천만개의 세포 농도가 사용된다. 또 다른 실시양태에서, 1㎖당 7천5백만, 8천만, 8천5백만, 9천만, 9천5백만 또는 1억만개의 세포 농도가 사용된다. 추가의 실시양태에서, 1㎖당 1억2천5백 또는 1억5천만개의 세포 농도가 사용될 수 있다. 고농도의 사용은 세포 수율의 증가, 세포 활성화 및 세포 증식을 초래할 수 있다. 또한, 높은 세포 농도의 사용은 CD28 음성 T 세포 등의 관심있는 표적 항원을 약하게 발현할 수 있는 세포의 더욱 효율적인 포획을 가능하게 한다. 이러한 세포의 모집단은 치료적 값을 가질 수 있으며, 특정 실시양태에서 수득하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들면, 고농도의 세포의 사용은 보다 약한 CD28 발현을 통상 나타내는 CD8⁺ T 세포의 보다 효율적인 선택을 가능하게 한다.

본 발명의 한 가지 실시양태에서, 상기 혼합물은 수 시간(약 3시간) 내지 약 14일 또는 이들 사이의 임의의 정수 값의 시간 동안 배양할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 상기 혼합물은 21일 동안 배양할 수 있다. 본 발명의 한 가지 실시양태에서, 상기 비드 및 T 세포는 약 8일 동안 함께 배양한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 비드 및 T 세포는 2 내지 3일 동안 함께 배양한다. 몇몇 자극 주기는 또한 T 세포의 배양 시간이 60일 이상일 수 있도록 요구될 수 있다. T 세포 배양에 적절한 조건은 증식 및 생존에 필요한 인자를 함유할 수 있는 적절한 배지(예를 들면, 최소 필수 배지 또는 RPMI 배지 1640 또는 X-vivo 15(론자(Lonza)))를 포함하고, 이때 상기 인자는 혈청(예를 들면, 태소 또는 인간 혈청), 인터류킨-2(IL-2), 인슐린, IFN-γ, IL-4, IL-7, GM-CSF, IL-10, IL-12, IL-15, TGFβ 및 TNF-α 또는 당업자에 공지된 세포의 성장을 위한 임의의 기타 첨가제를 포함한다. 세포의 성장을 위한 기타 첨가제는, 이로써 한정되지 않지만, 계면활성제, 플라즈마네이트(plasmanate), 및 N-아세틸-시스테인 및 2-메르캅토에탄올 등의 환원제를 포함한다. 배지는 RPMI 1640, AIM-V, DMEM, MEM, α-MEM, F-12, X-Vivo 15 및 X-Vivo 20을 포함할 수 있으며, 옵티마이저(optimizer)에는 첨가된 아미노산, 피루브산나트륨 및 비타민과 함께 무혈청이거나 적절한 양의 혈청(또는 혈장) 또는 제한된 세트의 호르몬, 및/또는 T 세포의 성장 및 확장에 충분한 양의 사이토킨(들)이 보충된다. 항생제, 예를 들면, 페니실린 및 스트렙토마이신은 대상체 내로 주입되어야 하는 세포의 배양물이 아닌 실험용 배양물에만 포함된다. 표적 세포는 성장을 지원하는데 필요한 조건, 예를 들면, 적절한 온도(예를 들면, 37℃) 및 대기(예를 들면, 공기 + 5% CO₂)하에 유지된다.

다양한 자극 시간에 노출되었던 T 세포는 상이한 특징을 나타낼 수 있다. 예를 들면, 전형적인 혈액 또는 아페레시스 말초혈 단핵 세포 생성물은 세포독성 또는 억제인자 T 세포 모집단(T_C, CD8⁺)보다 많은 헬퍼 T 세포 모집단(T_H, CD4⁺)을 갖는다. CD3 및 CD28 수용체를 자극함으로써 T 세포의 생체외 확장은 약 8 내지 9일 전에 T_H 세포로 주로 이루어진 T 세포의 모집단을 생성하지만, 약 8 내지 9일 후에 상기 T 세포의 모집단은 T_C 세포의 점진적으로 초과하는 모집단을 포함한다. 따라서, 치료 목적에 따라, 주로 T_H 세포를 포함하는 T 세포 모집단을 대상체에 주입하는 것이 유리할 수 있다. 유사하게도, T_C 세포의 항원-특이적 서브셋이 단리되는 경우, 이러한 서브셋을 더욱 크게 확장하는 것이 유익할 수 있다.

추가로, CD4 및 CD8 마커 이외에도, 기타 표현형 마커는 유의적으로 상이하지만, 세포 확장 공정 과정 동안에 대부분 재현가능하게 다르다. 따라서, 이러한 재현성은 특정한 목적을 위해 활성화된 T 세포 생성물를 테일러링(tailoring)하는 능력을 가능케 한다.

치료 적용

본 발명은 T 세포가 키메라 항원 수용체(CAR)을 일시적으로 발현하도록 유전자 변형되고 RNA-조작된 T 세포가 이를 필요로 하는 수용자에게 주입되는 세포 치료 형태를 포함한다. 주입된 세포는 수용자에서 종양 세포를 사멸할 수 있다. 어떠한 특정 이론에 결부시키고자 하는 것을 아니지만, RNA-조작된 T 세포에 의해 유발된 항-종양 면역원성 반응은 능동 또는 수동 면역 반응일 수 있다. 당해 반응은 CART19 세포 등의 RNA 조작된 T 세포에서 양자 면역치료 방법의 일부일 수 있다.

본 발명의 RNA-조작된 T 세포는 포유동물에서 생체외 면역화 및/또는 생체내 치료를 위한 백신 유형일 수 있다. 바람직하게는, 포유동물은 인간이다.

생체외 면역화와 관련하여, 하기들 중 적어도 하나가 세포를 포유동물에 투여하기 전에 시험관내에서 발생한다: i) 세포의 확장, ii) 세포로 RNA CAR의 도입 또는 iii) 세포의 동결보존.

생체외 과정은 당해 기술분야에 널리 공지되어 있으며, 하기에 더욱 상세하게 논의되어 있다. 요약하면, 세포는 포유동물(바람직하게는 인간)로부터 단리되고, 본원의 RNA CAR로 유전적으로 변형된다(즉, 시험관내 형질도입되거나 형질감염됨). RNA-조작된 세포는 치료적 효과를 제공하기 위해 포유동물 수용자에게 투여될 수 있다. 포유동물 수용자는 인간일 수 있으며, RNA-조작된 세포는 상기 수용자에 대해 자가성일 수 있다. 대안적으로는, 상기 세포는 수용자와 관련하여 동종성, 동계성(syngeneic) 또는 이종성일 수 있다.

조혈간세포 및 전구 세포의 생체외 확장 과정은 본원에서 참고로 인용된 미국 특허 제5,199,942호에 기재되어 있으며, 본 발명의 세포에 적용될 수 있다. 기타 적합한 방법은 당해 기술분야에 공지되어 있으며, 따라서 본 발명은 세포의 생체외 확장에 대한 임의의 특정한 방법으로 한정되지 않는다. 요약하면, T 세포의 생체외 배양 및 확장은 (1) 말초혈 채취 또는 골수 외식편으로부터 CD34+ 조혈간세포 및 전구 세포를 수집하는 단계; 및 (2) 이러한 세포를 생체외에서 확장하는 단계를 포함한다. 미국 특허 제5,199,942호에 기재된 세포 성장 인자 이외에도, flt3-L, IL-1, IL-3 및 c-kit 리간드 등의 기타 인자가 세포의 배양 및 확장을 위해 사용될 수 있다.

생체외 면역화의 측면에서 세포 기반 백신을 사용하는 것 이외에도, 본 발명은 또한 환자에서 항원에 대해 지시된 면역 반응을 유도하기 위해 생체내 면역화를 위한 조성물 및 방법을 제공한다.

본 발명의 RNA-조작된 T 세포는 단독으로 투여되거나, 희석제 및/또는 IL-2 또는 기타 사이토킨 등의 기타 성분, 또는 세포 모집단과 함께 약제학적 조성물로서 투여될 수 있다. 요약하면, 본 발명의 약제학적 조성물은 하나 이상의 약제학적으로 또는 생리학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 본원에 기재된 바와 같은 표적 세포 모집단을 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 중성 완충 식염수, 인산 완충 식염수 등과 같은 완충액; 글루코즈, 만노즈, 수크로즈 또는 덱스트란, 만니톨 등과 같은 탄수화물; 단백질; 폴리펩티드 또는 글리신 등의 아미노산; 항산화제; EDTA 또는 글루타티온 등의 킬레이트제; 보조제(예를 들면, 수산화알루미늄); 및 보존제를 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 정맥내 투여를 위해 제형화하는 것이 바람직하다.

본 발명의 약제학적 조성물은 치료(예방)될 질병에 적절한 방식으로 투여될 수 있다. 적절한 용량은 임상 시험에 의해 결정되지만, 투여량 및 투여 빈도는 환자의 조건, 환자 질병의 유형 및 중증도와 같은 인자에 의해 결정될 것이다.

"면역학적 유효량", "항-종양 유효량", "종양 억제 유효량" 또는 "치료량"이 나타나는 경우, 투여되는 본 발명의 조성물의 정확한 양은 연령, 체중, 종양 크기, 감염 또는 전이 정도, 환자(대상체)의 상태에서 개인차를 고려하여 전문의에 의해 결정될 수 있다. 일반적으로, 본원에서 기재된 T 세포를 포함하는 약제학적 조성물은 체중(㎏)당 10⁴ 내지 10⁹개 세포 용량, 바람직하게는 체중당 10⁵ 내지 10⁶개 세포 용량(이들 범위 내의 모든 정수 값을 포함함)으로 투여될 수 있는 것으로 언급될 수 있다. T 세포 조성물은 또한 이들 용량에서 수회 투여될 수 있다. 각 용량에서 투여된 T 세포의 양은 달라질 수 있다. 예를 들면, 한 가지 실시양태에서, 1차 투여는 비교적 고용량을 포함하고, 후속 용량은 비교적 저용량을 포함한다. 상기 세포는 면역 요법에서 통상 공지되어 있는 주입 기술을 사용하여 투여될 수 있다[참조: Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319: 1676, 1988]. 특정한 환자를 위한 최적의 용량 및 치료 섭생은 질병의 징후에 대해 환자를 모니터링하고 이에 따라 치료를 조절함으로써 의약 분야의 숙련자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

특정 실시양태에서, 활성화된 T 세포를 대상체에게 투여한 다음 후속적으로 다시 수혈하고(또는 아페레시스를 수행하고), 본 발명에 따라 이로부터 T 세포를 활성화하고, 이들 활성화되고 증식된 T 세포를 환자에게 재주입하는 것이 요구될 수 있다. 이러한 공정은 수주마다 수회 수행될 수 있다. 특정 실시양태에서, T 세포는 10cc 내지 400cc의 수혈액으로부터 활성화될 수 있다. 특정 실시양태에서, T 세포는 20cc, 30cc, 40cc, 50cc, 60cc, 70cc, 80cc, 90cc 또는 100cc의 수혈액으로부터 활성화된다. 이론에 의해 구속되지 않지만, 복수의 수혈/복수의 재주입 프로토콜은 T 세포의 특정 모집단을 선별하도록 작용할 수 있다.

개별 조성물의 투여는 에어로졸 흡입, 주사, 섭취, 수혈, 주입 또는 이식을 포함한 임의의 편리한 방식으로 수행될 수 있다. 본원에서 기재된 조성물은 환자에 피하, 피내, 종양내, 결절내, 수질내, 근육내 투여될 수 있거나, 정맥내(i.v.) 주사에 의해 투여되거나, 또는 복막내 투여될 수 있다. 한 가지 실시양태에서, 본 발명의 T 세포 조성물은 피내 또는 피하 주사에 의해 환자에 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 T 세포 조성물은 바람직하게는 정맥내 주사에 의해 투여된다. 상기 T 세포의 조성물은 종양, 림프절 또는 감염 부위 내로 직접 주사될 수 있다.

본 발명의 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 방법, 또는 T 세포가 치료적 수준까지 확장된 당해 기술분야에 공지된 기타 방법을 사용하여 활성화 및 증식된 세포는 다수의 임의의 관련된 처리 양식(예를 들면, 이전, 동시 또는 이후)과 함께 환자에 투여되며, 이때 상기 관련된 처리 양식은, 이로써 한정되지 않지만, 항바이러스 치료, 시도포피르(cidofovir) 및 인터류킨-2, 시타라빈(Cytarabine, ARA-C로도 공지됨) 등과 같은 약제의 처리, 또는 MS 환자를 위한 나탈리주맙 처리 또는 건선 환자를 위한 에팔리주맙 처리, 또는 PML 환자를 위한 기타 처리를 포함한다. 추가의 실시양태에서, 본 발명의 T 세포는 화학요법, 방사선, 사이클로스포린, 아자티오프린, 메토트렉세이트, 마이코페놀레이트 및 FK506 등의 면역억제제, 항체, 또는 CAM PATH 등의 기타 면역절제제, 항-CD3 항체 또는 기타 항체 치료, 사이톡신, 플루다리빈(fludaribine), 사이클로스포린, FK506, 라파마이신, 마이코페놀산, 스테로이드류, FR901228, 사이토킨류 및 방사선요법과 함께 사용될 수 있다. 이들 약물은 칼슘 의존성 포스파타제 칼시뉴린(사이클로스포린 및 FK506)을 억제하거나, 성장 인자 유도된 신호전달(라파마이신)에 중요한 p70S6 키나제를 억제한다[참조: Liu et al., Cell 66: 807-815, 1991; Henderson et al., Immun. 73: 316-321, 1991; Bierer et al., Curr. Opin. Immun. 5: 763-773, 1993]. 추가의 실시양태에서, 본 발명의 세포 조성물은 골수 이식, 및 플루다라빈, 외부 방사선 요법(XRT) 또는 사이클로포스파미드 등의 화학요법제, 또는 OKT3 또는 CAMPATH 등의 항체 중 하나를 사용하는 T 세포 제거 치료(예를 들면, 이전, 동시 또는 이후)과 함께 환자에 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 세포 조성물은 CD20과 반응하는 약제, 예를 들면, 리툭산 등의 B-세포 제거 치료 이후에 투여된다. 예를 들면, 한 가지 실시양태에서, 대상체는 고용량의 화학치료, 이어서 말초혈 간세포 이식에 의한 표준 치료를 경험할 수 있다. 특정 실시양태에서, 이식 이후에, 대상체는 본 발명의 확장된 면역 세포의 주입액을 투여 받는다. 추가의 실시양태에서, 확장된 세포는 수술 이전 또는 이후에 투여된다. 예를 들면, RNA CAR T 세포의 복수회 주입과 조합된 사이톡사 치료가 종양 제거 및 생존을 개선시키는 것이 본원에서 발견되었다.

환자에게 투여될 상기 치료 용량은 치료되는 상태의 정확한 성질, 및 치료 수용자에 따라 다를 것이다. 인간 투여를 위한 용량의 조정(scaling)은 당해 기술분야에서 허용된 관행에 따라 수행될 수 있다. 예를 들면, CAMPATH에 대한 용량은 일반적으로 성인 환자에 있어서 1 내지 약 100㎎의 범위일 것이고, 통상적으로 1일 내지 30일의 기간 동안에 매일 투여될 것이다. 바람직한 1일 용량은, 몇몇 경우, 1일당 40㎎ 이하의 최대 용량이 사용될 수 있지만(미국 특허 제6,120,766호에 기재됨), 1일당 1 내지 10㎎이다.

실험예

본 발명은 다음의 실험예를 참조하여 추가로 상세하게 기술한다. 이들 실시예는 단지 예시의 목적으로 제공되며, 별도로 명시되지 않는 한 제한하려는 것이 아니다. 따라서, 본 발명은 다음의 실시예에 한정되는 것으로 결코 해석되지 않아야 하고, 오히려 본원에 제공되는 교시의 결과로 입증되는 임의의 변형 및 모든 변형을 포함하는 것으로 해석되어야 한다.

추가 설명 없이, 당업자는 이전 설명 및 다음의 예시적인 실시예를 사용하여 본 발명의 화합물을 제조하고 사용할 수 있고, 특허청구된 방법을 실시할 수 있다고 간주된다. 따라서, 다음의 실시예는 구체적으로는 본 발명의 바람직한 실시양태를 지적하고, 어떠한 방법으로도 나머지 명세서를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.

실시예 1: 인간 산재성 종양의 회귀를 매개하는 키메라 항원 수용체를 발현시키는 전기천공된 자가 T 세포

유전자 전달에 의해 T 림프구의 항원 특이성을 재유도하는 양자 면역 요법에 대한 다수의 종양 반응성 T 림프구를 제공할 수 있다. 그러나, 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 T 세포의 임상 응용에 있어서 바이러스 벡터 생산과 관련된 안전성 문제가 있을 수 있다. T 림프구는 통합 관련 안전성 문제 없이 RNA 전기천공에 의해 유전자 변형될 수 있다고 간주된다. 양자 면역 요법을 위한 안전한 플랫폼을 구축하기 위해 RNA 시험관내 전사를 위한 벡터 골격을 높은 수준의 도입유전자 발현을 달성하기 위해 최적화했다. RNA 전기천공된 T 세포의 CAR 발현 및 기능은 전기천공 후 1주까지 검출되었다. 본원에 제시된 결과는 RNA CAR-전기천공된 T 세포의 복수 주사가 NOD/scid/γc(-/-) 마우스의 큰 혈관신생 측부 중피종 종양의 회귀를 매개한다는 것을 입증한다. 현저한 종양의 감소는 또한 50일 초과 동안 생체내 성장하고 있던 기존의 복강내 인간 유래의 종양이 항-메소텔린 CAR mRNA로 전기천공된 자가 인간 T 세포의 복수 주사로 치료될 때 발생했다.

이들 실험에 사용된 재료 및 방법을 이하에 기재한다.

재료 및 방법

CAR을 위한 시험관내 전사 mRNA 벡터의 작제

메소텔린(ss1) 및 CD19 특이적 CAR[참조: Carpenito et al., 2009, Proc Natl Acad Sci U S A 106:3360-5; Milone et al., 2009, Mol Ther 17:1453-64]을 프라이머 ss1F(cctaagcttaccgccatggccttaccagtgac, 서열번호 1), CD19F(cctaagcttaccgccatggccttaccagtgaccgcc; 서열번호 2) 및 zetaR(cctgcggccgc ttagcgagggggcagggcc, 서열번호 3)을 사용하여 PCR 증폭시켰다. PCR 생성물을 pGEM.64A 기반 ss1 및 CD19 벡터를 생산하기 위해 pGEM-GFP.64A의 GFP[참조: Zhao et al., 2006, Mol Ther 13:151-9]을 대체하여 pGEM.64A 기반 벡터로 서브클로닝했다. 작제물에 5' 또는 3' 비-번역 영역(UTR)과 긴 폴리(A)를 부가하기 위해, pGEM.ss1.bbz.64A 또는 pGEM-CD19.bbz.64A 벡터 중의 64 폴리(A) 서열을 PCR로 합성하고, 추가로 서열화로 확인된 150 폴리(A) 서열(150A)을 갖거나 갖지 않는 베타 글로불린(2bgUTR)으로부터 3' UTR의 2개 반복체로 대체시켰다. 그러나, pGEM 기반 벡터는 선택을 위한 암피실린을 사용하고, 이것은 GMP 생산 및 이후 임상 응용을 위한 FDA 규제 지침과 적합하지 않다. 따라서, UTR을 갖는 CAR cDNA를 또한 선택을 위한 카나마이신을 사용하는 pDRIVE(Qiagen)로 옮겼다. 먼저, ss1.bbz.2bgUTR.150A 또는 CD19.bbz.2bgUTR.150A는 Hind III 및 NdeI 소화(필-인 평활 말단)에 의해 pGEM 벡터로부터 절단하고, KpnI 및 NotI(필-인 평활 말단)에 의해 pDRIVE에 서브클로닝했다. 정확한 배향을 갖는 삽입체를 pDrive.ss1.bbz.2bgUTR.150A 및 pDrive.CD19.bbz.2bgUTR.150A를 생성하기 위해 서열분석하여 확인했다. 잠재적인 임상 사용을 위한 벡터를 최종 결정하기 위한 두 단계가 있었다: 1) pDRIVE 벡터의 암피실린 내성 유전자는 AhdI 및 BciVI로 이중 소화에 의해 결실되었고; 2) CD19.bbz 및 ss1.bbz 모두에서 내부 개방 판독 프레임은 pD-A.19.OF.2bg.150A(서열번호 5) 및 pD-A.ss1.OF.2bg.150A(서열번호 4)를 생성하기 위해 돌연변이유발 PCR로 결실되었다.

RNA 시험관내 전사

3개의 RNA IVT 시스템을 RNA의 성질, 양 및 비용을 비교하는 데 사용했다: 일반 캡(RC) 유사체 7-메틸GpppG를 사용하는 mMESSAGE mMACHINE® T7 키트(Ambion, Inc); 항-열 캡 유사체(ARCA, 7-메틸(3'-O-메틸) GpppG)m7G(5')ppp(5')G)를 갖는 IVT RNA를 생성하는 mMESSAGE mMACHINE® T7 울트라(Ambion, Inc), 및 Cap 1 IVT RNA(Epicentre)를 생성하기 위해 캡핑 효소(CE) 및 2'-O-메틸트랜스퍼라제 캡핑 효소를 사용하는 mScript™ RNA 시스템(Epicentre, Madison, WI). 캡핑 효율 40% 이하의 RC가 도입되는 반면, ARCA는 캡핑 효율을 80%까지 증가시키고, CE 시스템은 최대 100% 캐핑 효율을 유도할 수 있다. 다양한 IVT RNA 생성물은 RNeasy 미니 키트(Qiagne, Inc., Valencia, CA)를 사용하여 정제하고, 정제된 RNA는 1 내지 2mg/ml에서 RNase 비함유 물로 용출시켰다.

임상 등급 IVT RNA의 제조

내부 ORF 비함유 CAR 개방 판독 프레임(ORF)을 함유하는 조절 준수 플라스미드 DNA 벡터를 생성하기 위해, UTR 및 폴리-A 서열을 갖는 CAR cDNA를 위한 DNA 삽입체를 상기한 바와 같은 pdrive.19bbz(CD19-bbz용) 및 pDrive.ss1bbz(ss1-bbz용)를 생성하기 위해 pGEM 기반 벡터에서 카나마이신 선택 마커를 포함하는 벡터로 서브클로닝했다. CAR ORF 내부에 중첩된 내부 ORF로부터 번역된 잠재적인 비정상적 단백질을 제거하기 위해, 크기가 60bp보다 큰 CD19-bbz 및 ss1-bbz 둘 다에서 모든 내부 ORF를 돌연변이유발 PCR에 의해 변화시켰다. 따라서, 내부 ORF를 함유하지 않는 pD-A.19.OF 및 pD-A.ss1.OF는 각각 19-bbz 및 ss1-bbz를 위해 생성했다. 부모 ORF를 함유하는 ss1-bbz RNA는 서열번호 6을 포함하는 뉴클레오티드 서열로부터 전사시켰다. 내부 ORF 비함유 ss1-bbz 작제물은 서열번호 8을 포함하는 뉴클레오티드 서열로부터 전사시켰다. 부모 ORF를 함유하는 ss1-bbz RNA는 서열번호 7을 포함하는 뉴클레오티드 서열로부터 전사시켰다. 내부 ORF 비함유 CD19-bbz 작제물은 서열번호 9를 포함하는 뉴클레오티드 서열로부터 전사시켰다.

T 세포 배양

익명의 건강한 기증자의 림프구를 기부하고, T 세포는 수력 분급(elutriation)에 의해 정제시켰다. 일부 실험에서, 동일한 환자로부터 동결보존된 T 세포 및 종양 세포를 사용하였다. "환자 108"은 악성 중피종을 갖고 있었다. 이전 임상 시험의 일부로서, 이 환자는 백혈구 성분 채집을 경험하고, 그의 악성 흉막 유출로부터 생성된 종양 세포를 갖고 있었다. T 세포를, 기재된 바와 같이[참조: Levine et al., 1997, J Immunol 159:5921-30], CD3/CD28 비드(Invitrogen)의 첨가 및 단일 자극 사이클에 의해 활성화했다. 도 5에 도시된 실험을 위해, 환자 108 T 세포를 4-1BBL을 발현하는 조사된 인공 항원 제시 세포로 자극시키고, 기재된 바와 같이[참조: Suhoski et al., 2007, Mol THER 15:981-8], 항-CD3 모노클로날 항체(mAb) OKT3 및 CD28을 부하했다. T 세포를 비드 자극 후, 10% FCS 및 1% 페니실린 - 스트렙토마이신(R10)을 갖는 RPMI 1640에서 0.8×10⁶내지 1×10⁶ 세포/mL의 밀도로 유지시켰다.

T 세포의 RNA 전기천공

배양 10일차에 활성화된 T 세포를 수집하여 전기천공시켰다. 두 전기천공 시스템을 사용했다: BTX CM830(하버드 장치 BTX, Holliston, MA, USA) 및 Maxcyte(Maxcyte Inc, Rockville, MD, USA). BTX EM830을 사용하는 전기천공을 위해, 전기천공에 적용된 자극된 T 세포를 OPTI-MEM(Invitrogen)으로 3회 세척하고, 1 내지 3×10⁸/ml의 최종 농도로 OPTI-MEM 중에 재현탁시켰다. 이어서, 0.1 내지 0.2ml의 세포를 IVT RNA의 10μg/0.1ml T 세포와 (또는 표시된 바와 같이) 혼합하고, 2mm 큐벳(하버드 장치 BTX, Holliston, MA, USA)으로 전기천공시켰다. Maxcyte를 사용하는 전기천공을 위해, 취급 설명서는 통합된 프로그램과 함께 OC-400 처리실(Maxcyte Inc, Rockville, MD, USA)를 사용하여 추적했다.

전기천공된 T 세포 상에서의 CAR 검출

세포를 세척하고 FACS 완충액(PBS + 0.1% 나트륨 아지드 및 0.4% BSA)에 현탁시켰다. 비오틴 표지된 폴리클로날 염소 항-마우스 F(ab)2 항체(항-Fab, Jackson Immunoresearch, West Grove, PA)를 튜브에 첨가하고, 세포를 25분 동안 4℃에서 배양하고 2회 세척하였다. 이어서, 세포를 피코에리트린 표지된 스트렙타비딘(BD Pharmingen, San Diego, CA)으로 염색했다.

ELISA

표적 세포를 세척하고, R10에 10⁶ 세포/mL로 현탁시켰다. 100,000 각 표적 세포 유형을 96 웰 환저 플레이트(Corning) 중의 2개의 웰 각각에 첨가하였다. 효과기 T 세포 배양물을 세척하고, R10에 10⁶ 세포/mL로 현탁시켰다. 100,000 효과기 T 세포를 96 웰 플레이트의 지시된 웰에서 표적 세포와 배합시켰다. 또한, T 세포만을 함유하는 웰을 준비했다. 플레이트를 18 내지 20시간 동안 37℃에서 배양하였다. 배양 후, 상청액을 취득하고, 표준 방법(Pierce, Rockford, IL)을 사용하여 ELISA 분석에 적용했다.

CD107a 염색

세포를 96 웰 플레이트 중의 완전 RPMI 배지 160㎕에서 1:1의 E:T(10⁵ 효과기: 10⁵ 표적)로 플레이팅했다. 20㎕의 피코에리트린 표지된 항-CD107a Ab(BD Pharmingen, San Diego, CA)를 첨가하고, 플레이트를 골지 스탑을 첨가하고 추가로 2.5시간 동안 배양하기 전에 1시간 동안 37℃에서 배양시켰다. 2.5시간 후, 10㎕의 FITC-항-CD8 및 APC-항-CD3을 첨가하고, 30분 동안 37℃에서 배양하였다. 배양 후, 샘플을 FACS 완충액으로 1회 세척하였다. 유동 세포계수는 BD FacsCalibur(BD Biosciences)를 사용하여 수행하고, 분석은 FlowJo(Treestar Inc, Ashland, OR)를 사용하여 수행했다.

유동 CTL

유동 세포계수 세포독성 분석의 약간 변형된 버젼을 사용했다[참조: Cao et al., 2010 Cytometry Part A 77:534-45]. 이 분석에서, 표적 세포의 세포독성은 음성 대조군 세포의 생존율에 대한 표적 세포의 생존율을 비교하여 측정한다. 음성 대조군 세포와 표적 세포를 효과기 T 세포와 동일한 튜브에서 배합시킨다. 표적 세포는 기술된 바와 같이 부모 K562 세포에 인간 CD19 또는 메소텔린을 형질도입하여 제조했다[참조: Carpenito et al., 2009, Proc Natl Acad Sci USA 106:3360-5; Milone et al., 2009, Mol Ther 17:1453-64]. 실험에서, CD19-CAR T 세포와 메소-CAR T 세포의 세포 용해 작용은 두 표적 세포(K562-CD19 또는 K562-메소)의 혼합물을 사용하여 시험했다. K562-메소를 R10 배지에 1.5 × 10⁶ 세포/mL의 농도로 현탁시키고, 형광 염료 CellTracker™ 오렌지 CMRA(Invitrogen)를 5μM의 농도로 첨가하였다. 세포를 혼합한 다음, 30분 동안 37℃에서 배양하였다. 이어서, 세포를 세척하고, R10에 현탁시켰다. 이어서, K562-메소를 60분 동안 37℃에서 배양하였다. 이어서, 세포를 2회 세척하고, R10에 현탁시켰다. K562-CD19를 PBS+0.1% BSA에 1 X 10⁶ 세포/mL로 현탁시켰다. 형광 염료 카복시플루오레세인 디아세테이트 석신이미딜 에스테르(CFSE)(Invitrogen)를 이 세포 현탁액에 1μM의 농도로 첨가하였다. 세포를 37℃에서 10분 동안 배양했다. 배양 후, 표지화 반응은 세포 현탁액의 용적과 동일한 FBS 용적을 첨가하여 정지시키고, 세포를 실온에서 2분 동안 배양했다. 세포를 세척하고, R10에 현탁시켰다. 배양물은 다음 T 세포:표적 세포= 10:1, 3:1 및 1:1로 96웰 배양 플레이트에 2회 설정했다. 표적 세포는 항상 0.1ml 중의 10,000 K562-메소였다. 각 배양물은 또한 10⁴ K562-CD19 음성 대조군 세포를 함유한다. 또한, 단지 K562-CD19 + K562-메소 세포를 함유하는 배양물을 설정했다. 배양물을 37℃에서 4시간 동안 배양시켰다. 배양 직후에, 7AAD(7-아미노액티노마이신 D)(BD Pharmingen)를 제조업자가 권장하는 바와 같이 첨가했고, 유동 세포계수를 BD Calibur(BD Biosciences)를 사용하여 수행했다. 분석은 7AAD-음성 (생) 세포에서 게이팅하고, 살아있는 K562-CD19 및 살아있는 K562-메소 세포의 백분율은 각 T 세포 + 표적 세포 배양물에 대해 결정했다. K562-메소의 생존률은 살아있는 K562-메소 비율을 살아있는 K562-CD19 대조군 세포 비율로 나누어 결정했다. K562-메소의 보정된 생존률은 각 T 세포 + 표적 세포 배양물 중의 K562-메소의 생존률을 임의의 효과기 T 세포 없이 K562-메소 표적 세포 및 K562-CD19 대조군 세포만을 함유하는 튜브 중의 K562-메소 표적 세포 비율:K562-메소 음성 대조군 세포 비율의 비로 나누어 계산했다. 이 보정은 출발 세포 수의 변화 및 자연 발생적 표적 세포사를 설명하는 데 필요하였다. 세포독성은 K562-메소의 세포독성 비율 = 100 - K562-메소의 보정된 생존률로서 계산되었다. 모든 효과기:표적 비율을 위해, 세포 독성을 이중으로 측정하였고, 결과를 평균했다.

마우스 이종이식 연구

이전에 특정의 변형으로 기술된 바와 같이 연구를 수행했다[참조: Teachey et al., 2006, Blood 107:1149-55; Teachey et al., 2008, Blood 112:2020-3]. 요약하면, 6 내지 10주령의 NOD-SCID-γc-/-(NSG) 마우스는 잭슨 실험실(Bar Harbor, ME)로부터 입수했거나, 승인된 제도 동물 관리 사용 위원회(IACUC) 프로토콜하에 집에서 사육하고 병원체 비함유 조건하에 유지시켰다. 환자 108로부터 M108 인간 중피종의 도출을 사용하여 이미 상기한 바와 같이 5 × 10⁶ 세포를 사용하여 측복부 종양을 확립했다[참조: Carpenito et al., 2009, Proc Natl Acad Sci U S A 106:3360-5]. M108 종양 세포를 또한 렌티바이러스 벡터로 조작하여 반딧불 루시페라제를 발현시켜 M108-Luc 세포주를 수득했다. 동물은 8×10⁶ 가시성 M108-Luc를 복강내(IP) 주사했다. 종양 성장은 측복부 종양의 경우 캘리퍼스 측정을 사용하여 크기로, IP 종양의 경우 생물발광 이미지화 및 체중으로 모니터링했다.

생물발광 이미지화(BLI)

종양의 성장은 BLI에 의해 모니터링했다. 마취된 마우스는 제노젠 스펙트럼 시스템 및 리빙 이미지 v3.2 소프트웨어를 사용하여 이미지화했다. 마우스에게 멸균 PBS에 15mg/mL 농도로 현탁된(100μL 루시페린 용액/10g 마우스 체중) D-루시페린(Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA) 150mg/kg 체중을 IP 주사했다. M108-Luc의 사전 적정은 6 내지 10분 지속하는 피크 발광과 함께 5분인 광자 방출 피크까지의 시간을 나타낸다. 각 동물은 단독으로(광자 정량화를 위해) 또는 루시페린 주사(6분) 후에 동일한 상대 시점의 전후 엎드린 위치에서 최대 5마리 마우스(표시용) 그룹으로 이미지화했다. 데이타를, 선형 등급의 중간 범위에 도달할 때까지(600 내지 60000카운트) 또는 최대 노출 설정에 도달될 때까지(f/스톱 1, 큰 비닝 및 1 내지 2초) 수집한 다음, 광자/초/cm2/스테라디언으로 전환시켜 노출 시간, f/스톱, 비닝 및 동물 크기에 대해 각 이미지를 표준화한다. 해부학적 국소화를 위해, 빛의 강도를 나타내는 위조색 지도를 그레이 스케일 체표면 참조 이미지 위에 중첩시켰다. 데이타 표시를 위해, 루시페라제 함유 세포의 부재하의 마우스는 최대의 설정에서 이미지화하고, 3.6 x 10⁵p/s/cm²/sr의 평균 값을 수득했다.

통계적 고려사항

분석은 STATA 버젼 10(StataCorp) 또는 프리즘 4(그래프패드 소프트웨어)를 사용하여 수행되었다. 시험관내 데이타는 중복 수단을 나타내고, 수단의 비교는 만-휘트니(Mann-Whitney) 검정을 통해 이루어졌다. 다수의 그룹 간의 비교를 위해, 크루스칼-월리스(Kruskal-Wallis) 분석은 개별 그룹을 비교하는 던(Dunn) 다중 비교 검정으로 수행하였다. 생존 곡선은 여러 곡선을 비교하기 위한 본페로니(Bonferroni) 보정을 사용하는 로그-순위 검정을 사용하여 비교했다.

실험의 결과는 이하 기술한다.

RNA CAR 전기천공은 자극된 T 세포에서 가변 발현을 매개한다.

CD3ζ, CD28 및 4-1BB 활성화 도메인의 조합을 갖는 항-메소텔린 ss1 scFv의 CAR이 렌티바이러스 벡터 기술[참조: Carpenito et al., 2009, Proc Natl Acad Sci USA 106:3360-5]을 사용하여 도입시 매우 안정적으로 T 세포에서 발현되는 것이 이미 보고되어 있다. 인간 T 세포를 이전에 기재된 바와 같이[참조: Levine et al., 1997, J Immunol 159:5921-30] 10일 동안 활성화시키고, 세포가 주변 정지 상태로 반환될 때, 이들은 이미 기재된 부분 신호의 조합을 갖는 ss1 scFv를 인코딩하는 RNA로 전기천공했다. CD3ζ만을 포함하는 CAR(ss1-z)로 전기천공된 T 세포가 가장 높은 도입유전자 발현, 이어서 거의 동일 수준의 ss1-28z(CD28 + CD3ζ) 및 ss1-bbz(4-1BB + CD3ζ) 발현을 나타내기 때문에, 도입유전자 발현 수준은 균일하지 않은 것으로 밝혀졌다(도 6). 공자극 도메인을 함유하는 "2세대" CAR이 바이러스 벡터 시스템으로 발현될 때에 임상전 및 초기 임상 시험에서 우수한 것으로 나타나기 때문에[참조: Carpenito et al., 2009, Proc Natl Acad Sci USA 106:3360-5; Milone et al., 2009, Mol Ther 17:1453-64; Zhao et al., 2009, J Immunol 183:5563-74; Zhong et al., 2009, Mol Ther 18:413-20], 이는 "1세대" ss1-z CAR의 발현을 최적화하지 않는 것으로 결정했다. 오히려, 2세대 ss1-bbz 및 CD19-bbz CAR가 렌티바이러스 벡터 기술을 이용한 임상 시험에서 시험되고 있으므로, RNA의 전기천공을 사용하여 추가의 최적화용으로 선택되었다.

RNA 작제물의 최적화는 자극된 T 세포에서 도입유전자 발현을 개선시킨다.

β-글로불린 및 보다 긴 폴리(A) 서열로부터 3' 비번역 영역(UTR)의 두 반복 서열의 도입에 의한 비코드 영역의 구조적 변형은 RNA 안정성, 번역 효율 및 RNA-형질감염된 수지상 세포의 기능을 증강시키는 것으로 나타났다[참조: Holtkamp et al., 2006, Blood 108:4009-17]. 그러나, 이러한 전략은 RNA 전기천공된 T 세포에서 체계적으로 평가되지 않는다. 이 방법이 인간 T 림프구에 적용되는지 여부를 시험하기 위해, IVT 벡터(pGEM-ss1bbz.64A)를 5' UTR(SP163) 또는 3' UTR[3'UTR의 2개 반복체는 도 1A에 도시된 바와 같은 인간 β-글로빈(2bgUTR) 또는 연장된 폴리(A)(150A) 서열로부터 유도된다]를 첨가하여 변형시켰다. SP163 번역 인핸서는 혈관 내피 성장 인자 유전자의 5'UTR로부터 유도되고, 프로모터 단독에 비해 발현 수준을 2 내지 5배 증가시키는 것으로 보고된다[참조: Stein et al., 1998, Mol Cell Biol 18:3112-9]. 이러한 작제물로부터 제조된 RNA를 자극된 T 세포에 전기천공했다. 도 1B에 도시된 바와 같이, 64-폴리(A) 트랙을 함유하는 염기성 IVT 작제물과 비교하여, β-글로불린(2bgUTR) 및 보다 긴 폴리(A)(150A) 말단으로부터 3' UTR의 추가가, 특히 배합할 때(2bgUTR.150A) 도입유전자 발현을 증강시켰다. 대조적으로, ss1-bbz의 5' 말단에서 SP163 서열의 도입은 도입유전자 발현을 억제하고, 이는 SP163 서열이 첨가될 때에 감소된 캡핑 효율에 기인할 수 있다.

5' 캡 구조의 최적화는 전기천공된 T 세포에서 CAR의 발현 및 기능을 증강시킨다.

mRNA 분자의 말단에 있는 5' 캡은 5' 내지 5' 트리포스페이트 결합을 통해 mRNA에 결합된 구아닌 뉴클레오티드로 구성된다. 캡 0 및 1을 포함하는 일부 캡 구조가 기재되어 있다[참조: Banerjee, 1980, Microbiol Rev 44:175-205]. 몇몇 방법은 도입유전자 및 폴리(A) 테일 작제물에 5 '캡 구조를 도입하기 위하여 사용되어 왔다. 시판되는 시스템은 캡핑된 mRNA를 생산하기 위해 공동전사 또는 효소적 접근법을 사용하여 캡 0 또는 1을 도입한다. 이 과정은 번역 효율성을 향상시키기 위해 최적화하는데 중요하고, 각종 캡핑 시스템의 상당한 비용 때문에 중요하다. 상이한 캡핑 시스템을 사용하여 제조된 RNA를 자극된 T 세포에 전기천공시키고, 도입유전자 발현은 유동 세포계수에 의해 모니터링했다(도 2A 및 2B). 결과는 항-가역적 캡 유사체(ARCA)로 캐핑된 RNA로 전기천공된 T 세포의 도입유전자 발현은 4시간에 일반 캡(RC) 유사체 캡핑된 RNA보다 3배 더 높았다는 것을 나타냈다. 도 2B에 제시된 바와 같이, 전기천공 후 5일에 T 세포의 50% 초과가 여전히 CAR를 발현시키기 때문에, ARCA 캡핑된 RNA의 도입유전자 지속성도 또한 개선되었다.

이어서, ARCA의 비효소 첨가에 대한 캡 0 및 1의 효소적 첨가를 비교했다. 캡핑 효소(CE) 시스템을 사용하는 잠재적인 잇점은, 이 접근법이 ARCA와 매우 유사하고, 많은 생체내 시스템에 뛰어난 번역 효율을 제공하는 캡1 구조를 생성하기 위해 함께 작동하는 CE 및 mScript 2'-O-메틸트랜스퍼라제를 포함한다. ss1-bbz를 인코딩하는 캡 0 또는 1 RNA의 효율을 평가하기 위해, 인간 T 세포를 ARCA CE, 캡1 CE, 또는 CE + 추가의 폴리(A)로 제조된 RNA로 전기천공시켰다. 도 2C에 도시된 바와 같이, 캡1 RNA 전기천공을 이용한 CAR 발현은 ARCA IVT mRNA와 등가였다. 도입유전자의 발현은 도 1의 결과와 일치하여 보다 긴 폴리(A) 테일의 도입으로 추가로 증강되었다.

최적화된 IVT RNA의 하나의 잠재적인 기능적 잇점은 추가 CAR의 번역이 더 지속적인 발현을 유도하고 표적 인식 또는 항상성 증식에 의해 유도된 하양조절을 극복할 수 있기 때문에, CAR의 발현이 지속될 수 있다는 것이다. 활성화된 T 세포는 ss1-bbz를 인코딩하는 각종 RNA 제제로 전기천공시킨 다음, K562-메소 또는 대조군 K562-CD19 표적 세포(도 7)와 공배양했다. ARCA 및 CE1 또는 CE1-A 캡핑된 ss1-bbz RNA로 전기천공된 T 세포는 대조군 표적 세포와 공배양된 동일 T 세포와 비교하여 K562-메소 세포주로 자극된 후에 이들의 도입유전자 발현을 유지시킬 수 있었다. 대조적으로, RC 유사체로 캡핑된 ss1-bbz RNA로 전기천공된 T 세포는 항원 함유 표적과 공동 배양한 후 표면에 검출 가능한 CAR을 갖지 않았다.

상기 결과 및 다른 데이타를 기반으로 하여, ARCA 또는 캡1 및 긴 폴리(A) 테일로 캡핑된 RNA가 시험된 RNA 중에서 최고의 RNA 생산 시스템이라고 결론지을 수 있다. 제조 비용이 또한 고려될 때, IVT RNA의 대규모 GMP 생산을 위해, 캡1이 바람직하다.

최적화된 IVT RNA CAR의 시험관내 기능

부모 또는 내부 ORF 비함유 CAR 서열을 포함하는 2개 플라스미드로부터 제조된 RNA를 T 세포에 전기천공하고, 내부 ORF 비함유 전기천공된 T 세포를 갖는 RNA으로부터 도입유전자 발현은 전기천공후 20시간에서 부모 서열을 갖는 RNA로 천공된 T 세포(도 8)와 동등했다는 것이 밝혀졌다. 그러나, CAR 발현의 실질적인 연장이 2개 캡1 및 연장된 폴리(A)를 IVT RNA에 도입한 CE 시스템(도 3)을 사용하여 내부 ORF 비함유 pD-A.ss1.OF 또는 pD-A.19.OF RNA로부터 생성된 임상 등급 RNA로 전기천공된 활성화된 T 세포에서 관찰된다. 최적화된 IVT RNA의 도입유전자 발현은 메소 및 CD19 RNA CAR 모두에 대해 전기천공후 7일 동안 검출될 수 있었다.

이전의 연구는 4-1BB가 T-세포 수용체 자극 후 CD8⁺ T 세포 상에서 상향조절된다는 것을 나타냈다[참조: Wolfl et al., 2007, Blood 110:201-10]. ss1-bbz 또는 CD19-bbz RNA로 전기천공된 벌크 T 세포는 메소텔린 또는 CD19를 발현시키는 표적 세포로 배양하고, 특히 표적 특이적(도 3A)인 CD8⁺ T 세포 상에서 4-1BB의 강력한 상향조절이 발견되었다. RNA CAR을 발현하는 T 세포는 또한 상?량의 인터류킨-2(IL-2)를 분비하고, 표적 특이적 인식에 CD107a를 전위시켰다(도 3B 및 3D). 최종적으로, 유동 기초 용해성 분석에서, CD19(19.OF) 및 ss1(ss1.OF) CAR RNA 전기천공된 T 세포 모두가 구체적으로 표적 세포를 효율적으로 용해시킬 수 있음이 밝혀졌다(도 9).

RNA 전기천공된 T 세포는 인간 산재성 중피종 이종이식편의 퇴화를 매개한다.

파일럿 실험을 먼저 수행하여 거대한 미리 확립된 종양을 갖는 마우스에서 최적화된 RNA CAR를 발현하는 T 세포의 치료 가능성을 평가했다. 메소텔린-양성 종양은 이미 보고된 바와 같이 NSG 마우스에서 확립되었다[참조: Carpenito et al., 2009, Proc Natl Acad Sci U S A 106:3360-5]. 종양 접종후 66일에서, 건강한 기증자로부터 10×10⁶ 내지 15×10⁶ ss1-bbz RNA CAR-전기천공된 T 세포를 2주 동안 1주일에 2회 종양내 주사했다. 격주 투여 계획은 도 3에 도시된 시험관내 발현 데이타에 기초했다. 도 4A에 제시된 바와 같이, 종양은 ss1 RNA 전기천공된 T 세포로 처리된 마우스에서 퇴화되는 반면, 진행된 종양 증식이 대조군 마우스 그룹에서 관찰되었다. 마우스를 98일차에 희생시킨 시점에서, 종양의 크기는 생리 식염수(도 10)로 처리된 마우스보다 전기천공된 T 세포로 처리된 마우스 모두에서 실질적으로 작았다. 이러한 결과는 RNA-조작된 T 세포의 복수 주사의 치료 가능성을 나타내지만, 이들은 T 세포의 두 종양내 주사가 대부분의 마우스를 치유할 수 있는 렌티바이러스 형질도입된 T 세포를 사용하는 동일한 종양 모델에서는 강력하지 않다[참조: Carpenito et al., 2009, Proc Natl Acad Sci U S A 106:3360-5].

CAR-RNA 전기천공된 T 세포가 거대한 산재성 종양을 포함하는 마우스를 치료할 수 있는지를 시험하기 위해 M108-Luc 모델을 개발했다. M108 부모 세포는 반딧불 루시퍼라제로 안정하게 형질도입하여 생물발광 이미지화(BLI)를 가능하게 하고, 예비 실험에서, NSG 마우스가 진행성 복수를 갖는 산재성 질환을 크게 발병시키고, 모든 마우스가 사망하거나 100일까지 빈사상태가 된다는 것이 밝혀졌다. NSG 마우스(n = 18)에게 M108-Luc를 주사하고, 이들은 3개의 복강내 처리 그룹으로 랜덤화했다. 종양 주사후 58일차에, 모든 마우스가 복수 및 복강을 라이닝하는 전이 결절을 갖는 큰 혈관신생 종양을 가질 때, 건강한 기증자로부터 ss1-bbz RNA CAR-전기천공된 T 세포를 2주 동안 1주 2회 마우스에 주사했다(복강내). CAR 특이성을 위한 대조군으로서, 1개 그룹의 마우스에게 CD19-bbz RNA 조작된 T 세포를 주사하고, 또 다른 그룹은 생리 식염수로 처리했다. ss1-bbz RNA CAR 그룹에서 종양 부하는 53일에 기준선으로부터 점진적으로 감소했다. 또한, 종양 접종후 78일에서 ss1-bbz RNA 조작된 T-세포 처리 그룹에서 종양 증식은 생리 식염수 또는 CD19-bbz RNA T-세포 처리 그룹 모두(도 4B)와 비교하여 상당히 억제되었다(P < 0.01). 도 4B). 사이드 실험에 의한 측면에서, 렌티바이러스 벡터를 사용하여 발현된 ss1-bbz CAR T 세포로 처리된 마우스는 이전에 발표된 데이타[참조: Carpenito et al., 2009, Proc Natl Acad Sci U S A 106:3360-5]와 유사한 보다 강력한 치료 효과를 나타냈다(도 4C). 그러나, ss1-bbz RNA 조작된 T-세포 처리 그룹은 대조군 마우스 모두가 종양 진행(도 4C)으로 사망하는 시점 72일과 92일 사이에 생존 잇점 및 종양 증식의 현저한 감소를 가졌다.

RNA CAR-전기천공된 자기 T 세포는 산재성 중피종의 퇴화를 매개한다

위의 연구는 RNA 조작된 T 세포의 격주 주사는 진행된 측복부 및 복강내 종양을 억제할 수 있고, CD19 RNA CAR를 발현하는 T 세포가 유효하지 않았기 때문에 억제가 CAR의 특이성에 의존할 수 있음을 나타낸다. 그러나, 이 실험에서 T 세포는 건강한 기증자로부터 수득되었고, 종양에 대하여 동종이계였다. 동종이계 항 종양 효과는 RNA CAR T 세포의 반복 장기 투여로 관찰되었기 때문에, M108 종양이 유래된 환자로부터 자가 말초혈 단핵 세포를 사용했다. T 세포를 자극시키고, GMP 등급 RNA를 사용하여 전기천공했다. 30마리의 NSG 마우스를 도 11의 도표에 도시된 바와 같이, 3개의 복강 처리 그룹으로 랜덤화했다. 마우스를 0일째에 M108-Luc(복강)를 접종하고, ss1-bbz 또는 CD19-bbz RNA CAR T 세포 또는 생리 식염수 대조군으로 처리하고, 종양 부하는 지시된 바와 같은 일련의 BLI 및 체중으로 모니터링했다. 치료는, 종양이 신체 검사와 높은 BLI 신호에 복수 발견에 기초하여 진행될 때, 56일째에 개시했다. 종양 부하는 ss1-bbz RNA CAR T 세포로 전기천공된 T 세포로 처리된 그룹에서 극적으로 감소된 반면, 종양은 CD19-bbz RNA CAR T 세포 또는 생리 식염수(도 5A 및 5C)로 처리된 대조군 마우스에서 계속 성장했다. T 세포가 종양에 자기 유래인 이 설정에서도, 이들 마우스에 B 세포가 전혀 없음을 제시한 CD19 scFv CAR과 관련되지 않을 수 있기 때문에, RNA 골격에 기인할 수 있는 적당한 CD19 CAR 치료 효과가 여전히 존재했다. 그러나, T 세포의 첫번째 6회 투여 후, 이미지화는 CD19 CAR(244%) 및 생리 식염수 마우스(237%; P < 0.001) 둘 다와 비교하여 ss1 CAR 마우스에서 낮은 평균 변화 종양 생물발광(39%)을 나타냈다. T 세포 주사후 50% 중앙 생존은 CD19 CAR(62일) 및 생리 식염수 마우스(36일; 도 5B)와 비교하여 ss1 CAR 마우스(73일)에서 유의적(P < 0.05)으로 컷다. 첫번째 6회 투여량을 제공한 후, 전체 체중의 평균 변화는 CD19 CAR(6.21g) 및 생리 식염수 마우스(11.4g; P < 0.001; 도 5C) 모두와 비교하여 ss1 RNA CAR 마우스(1.62g)에서 더 낮았다. ss1 CAR 마우스의 일부에서 이미지화에 의해 질환 안정성 및 규칙적인 "치료"가 관찰되었지만, 종양은 결국 재발했다. 추가의 치료 8회 용량을 제공함에도 불구하고, 종양의 진행이 ss1 CAR 마우스에서 관찰되었다. 따라서, ss1-bbz RNA CAR T 세포의 반복 주사는 고급 산재성 종양에 대한 생존 잇점을 제공할 수 있다. 지속적인 치료에도 불구하고 종양 재발 메커니즘은 조사 중이다.

전기천공된 RNA CAR를 발현하는 활성화된 T 세포의 다중 주사

이 실험의 목적은 전기천공된 RNA CAR를 발현하는 활성화된 T 세포의 치료 가능성을 결정하는 것이었다. 본원에 제시된 결과는 mRNA CAR이 신규 표적의 평가를위한 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터보다 안전하고 보다 경제적인 것으로 예상되는 플랫폼을 제공함을 보여준다. 독성의 경우에, RNA CAR T 세포의 주사를 종료할 수 있고, 독성은 빠르게 완화시킬 것으로 기대된다. 그러나, RNA CAR T 세포는 특히 중피종 등의 구획화된 종양에서 실질적인 치료 가능성을 갖는다. RNA CAR T 세포는 현재 레트로바이러스 및 렌티바이러스 CAR로 개발된 치료를 보완할 것으로 예상된다.

접근법은 RNA의 발현을 먼저 최적화한 다음, 견고한 종양 모델에서 다중 투약 전략을 시험하는 것이었다. 이것은 재표적화된 T 세포가 통합된 벡터 시스템을 사용하지 않고 강력한 생체내 항종양 효과를 가질 수 있음을 보여주는 최초의 보고이다. 최적화된 IVT mRNA를 이용하여, 본원에 제시된 결과는 RNA CAR T 세포가 진행된 측복부 및 복강내 종양에 대한 강력한 항종양 효과를 갖는 것을 나타낸다. 또한, 이러한 연구는 진행성 암 환자에서 수득된 자기 T 세포가 조작될 수 있고 강력한 전임상 모델에서 전이성 종양을 억제하는 것을 보여줄 수 있음을 보여주는 최초의 것이다.

RNA의 전기천공이 시험관내 T 세포의 기능을 변경시킬 수 있음이 이미 제시되었다[참조: Smits et al., 2004, Leukemia 18:1898-902; Schaft et al., 2006, Cancer Immunol Immunother 55:1132-41; Zhao et al., 2006, Mol Ther 13:151-9]. 미첼(Mitchell) 및 동료들[참조: Mitchell et al., 2008, Hum Gene Ther 19:511-21]은 T 세포가 시험관내 및 생체내에서 각종 CXCR2-특이적 케모카인을 향해 효율적으로 이동하는 케모카인 수용체 CXCR2의 RNA 형질감염에 의해 기능적으로 변형될 수 있을을 보고했다. 윤(Yoon) 및 동료들[참조: Yoon et al., 2009, Cancer Gene Ther 16:489-97]은 최근에 SKOV3 이종이식 모델에서 Her2/neu RNA CAR-전기천공된 T 세포의 양자 이동이 모의 형질감염된 T 세포의 이동에 비해 감소된 종양 성장 속도를 유도함을 나타냈다. 최근 보고서는 임상전 모델 또는 생체내 효과의 증거 없이 천연 살해 세포주에서 CD19 키메라 수용체의 mRNA 형질감염의 실현가능성을 나타냈다[참조: Li et al., 2010, Cancer Gene Ther 17:147-54]. 그러나, 이러한 보고 중의 어떤 것도 RNA 전기천공된 T 세포를 사용하는 큰 진행성 종양의 생체내 퇴화 및 생존 연장을 입증하지 않는다.

T 세포를 조작하는 각종 비통합 접근법이 존재한다[참조: June et al., 2009, Nat Rev Immunol 9:704-16]. mRNA의 형질감염 등의 CAR 면역 요법을 위한 일시적인 발현 접근법은 당해 분야의 일반적인 노력에 역행한다. 그러나, RNA 형질감염을 위한 개선 기술이 바이러스 벡터 또는 트랜스포존 시스템을 통합함으로써 안정하게 발현되는 CAR의 사용을 보완할 수 있다. 3' UTR 및 5' UTR의 체계적인 비교, 더 긴 폴리(A) 테일의 도입, RNA의 효율적인 캡핑 및 내부 ORF의 결실로, 본 발명자들은 전기천공된 T 세포에서 RNA CAR의 고수준의 더 긴 발현을 달성할 수 있었다.

양자 이동 분야에서 지배적인 패러다임은 환자 내의 세포의 장기 지속성이 효능에 중요하다는 것이다[참조: June, 2007, J Clin Invest 117:1466-76; Rosenberg et al., 2008, Nat Rev Cancer 8:299-308]. 그러나, 이동된 세포가 종양 미세환경내에서 기능하는 이들의 능력을 오히려 신속하게 소실할 수 있다는 것이 점점 실현되고 있다. 본원에 제시된 데이타는 선택된 도입유전자를 단지 일시적으로 발현시켜 내성화되는 CAR T 세포의 축적을 방지하는 T 세포의 보다 빈번한 다중 주사를 제공할 수 있고, 따라서 개선된 안전성 프로파일과 함께 항종양 효능을 달성할 수 있음을 제안한다. 또는, RNA 형질감염을 위한 개선 기술이 바이러스 벡터 또는 트랜스포존 시스템을 통합함으로써 안정하게 발현되는 CAR의 사용을 보완할 수 있다.

일부 부작용이 관찰되었고, 기타는 이론적으로 CAR T 세포 치료로 가능하다. 2명의 죽음이 최근 레트로바이러스적으로 변형된 CAR T 세포에 의한 치료후에 보고되었고, 초기 독성 사건은 사이토킨 방출로부터의 전신 효과에 관련되었다[참조: Brentjens et al., 2010, Mol Ther 18:666-8; Morgan et al., 2010, Mol Ther 18:843-51]. 이러한 임상 사건의 결과로, 최근 사설은 보다 안전한 CAR의 필요성을 논의했다[참조: Heslop, 2010, Mol Ther 18:661-2; Buning et al., 2010, Hum Gene Ther 21:1039-42]. 안정적으로 형질도입된 CAR T 세포로 직면하는 다른 독성은 표적물 상에 CD19 CAR 치료 후 정상적인 B 세포 고갈 또는 탄산 탈수효소 IX 치료후 간 독성 유도와 같은 기관외 효과를 가졌다[참조: Lamers et al., 2006, J Clin Oncol 24:e20-2]. 어떠한 특정 이론에 결부시키지 않고, RNA CAR 반복 투여가 이 독성 형태를 유발하는데 필요하고, 독성이 후속되는 RNA CAR T 세포 주입의 중지를 해결한다고 간주된다. 최종적으로, CTL에 CAR의 레트로바이러스 도입에 대한 우려가 삽입 돌연변이 유발로부터의 악성 형질전환의 공지된 위험을 포함한다[참조: Nienhuis et al., 2006, Mol Ther 13:1031-49; Bushman et al., 2007, J Clin Invest 117:2083-6]. 숙주 세포 게놈으로의 통합은 없고 CAR의 발현이 자체 제한되기 때문에, 이러한 우려는 mRNA의 형질감염에 의해 해결된다.

어떠한 특정 이론에 구속되는 것을 바라지 않지만, CAR 치료의 주요 잠재적인 제한은 RNA CAR의 비교적 짧은 지속성이라고 간주된다. RNA CAR T 세포가 림프구 고갈된 숙주에게 투여되는 경우에 악화될 것으로 기대될 수 있고, 이는 CAR T 세포의 항상성 증식 유도를 일으키고, 이 결과로서, T 세포 표면에서 가속된 CAR 발현 손실을 유도할 것으로 기대된다. 따라서, 중피종 또는 중추신경계 종양 등의 구획화된 종양을 위해 제공될 때, RNA CAR T 세포가 더 효과적일 수 있다. 또한, RNA CAR의 보다 빈번한 투여가 림프구 고갈된 숙주에서 필요할 수 있다.

본원의 다른 부분에서 논의된 독성의 관리 형태를 제공하는 것 이외에, RNA CAR T 세포 치료를 위한 몇 가지 잠재적인 기회가 있다. 첫째, RNA CAR은 클리닉에 융통성 있고 빠른 경로를 제공하고 이를 통해 CAR 설계 및 효능을 최적화하기 위해 효율적인 반복 접근을 가능하게 함으로써 CAR 개발 속도를 가속시킬 가능성을 제공한다. 본원에 제시된 데이타를 기반으로, 항-메소텔린의 RNA CAR를 시험하는 단계 I 실험을 개방할 예정이다. 규제 당국의 승인 프로세스는 게놈 통합을 필요로 하는 안정적으로 발현된 CAR보다 RNA CAR로 방해가 덜 된다. 임상 등급 mRNA는 형질감염 또는 트랜스포존 기반 프로토콜에 사용되는 플라스미드 DNA보다 더 비싸지만[참조: Till et al., 2008, Blood 112:2261-71; Singh et al., 2008, Cancer Res 68:2961-71], 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터를 통합하는 것보다 제조 비용이 낮다. 둘째, 메모리의 가능성을 갖는 CAR 세포를 제공하기 위한 전략으로서 안정적으로 발현된 CAR를 사용하여 통합 및 유지 요법으로 인해 유도를 위한 강력하지만 잠재적으로 유독한 CAR을 사용하여 RNA CAR "녹다운" 요법을 배합하는 것이 흥미로울 수 있다.

요약하면, RNA-조작된 T 세포의 복수 주사는 암 질환의 치료를 위한 비용 효율적이고 유통성 있는 플랫폼을 제공하는 양자 세포 이동에 대한 새로운 접근법이다. 또한, 이 접근법은 바이러스 벡터를 통합하는 관련 안전성 우려 없이 강력한 활성화 도메인을 발현하도록 조작된 T 세포의 치료 지수를 증가시킬 수 있다.

실시예 2: mRNA 조작된 T 세포를 갖는 마우스의 진행된 백혈병의 치료

바이러스 벡터를 통합함으로써 생성된 안정하게 발현된 CAR을 포함하는 세포독성 T 림프구(CTL)가 효과적이고 잠재적인 장기 지속 가능성을 갖는 반면, 대체 요법은 T 세포가 목적하는 표적(예: CD19)에 대해 CAR을 인코딩하는 최적화된 시험관내 전사된 RNA로 전기천공된 일시적으로 발현하는 CAR을 사용하는 것이다. 본원에 제시된 결과는 최적화된 mRNA에 의한 전기천공으로 도입된 항-CD19 CAR를 발현하는 T 세포가 CD19 표적 세포의 강력하고 특이적인 킬러였음을 입증한다. 이종이식된 백혈병을 갖는 면역결핍 마우스에 제공된 CD19 RNA CAR T 세포는 급속하게 질환 부위로 이동하고 중요한 표적 특이적 용해 활성을 보유한다. 예상외로, CD19 RNA CAR T 세포의 단일 주사는 투여후 1일 이내에 질환 부하를 감소시켜 공격적인 백혈병 이종이식 모델에서 상당한 생존 연장을 유도한다. RNA CAR의 표면 발현을 적정하여 사이토킨 방출 및 세포독성과 같은 효과기 기능의 잠재적으로 조정가능한 수준의 T 세포를 제공할 수 있다. RNA CAR은 유전 독성에 적용되지 않아야 하고, 비용이 더 많이 들고 번거로운 안정된 발현 시스템으로 진행하기 전에 CAR 설계를 신속하게 최적화하기 위한 플랫폼을 제공해야 하는 유전 공학 기법이다.

이 실험에 사용된 재료 및 방법을 이하 기술한다.

재료 및 방법

시험관내 전사(IVT) 벡터의 작제 및 RNA 전기천공

4-1BB 및 CD3ζ 신호 도메인(각각 19-BBZ 및 ss1-BBz)을 갖는 CD19 및 메소텔린(메소)-표적화 CAR은 이미 기재되어 있다[참조: Milone, et al., 2009, Mol Ther 17(8):1453-1464; Carpenito et al., 2009, Proc Natl Acad Sci U S A 106(9):3360-3365]. PCR 생성물은 pGEM-GFP.64A로부터 GFP[참조: Zhao, et al., 2006, Mol Ther 13(1):151-159]를 Hind III 및 Not I을 갖는 제한 효소 소화된 PCR 생성물로 대체하여 pGEM.64A 기반 벡터에 서브클로닝하여 pGEM-ss1.bbz.64A 및 pGEM-CD19bbz.64A를 생성한다. 유사하게는, CAR의 3세대 변형물은 CD28 신호 도메인을 이용하여 작제했다. 대체된 CAR cDNA를 직접 서열화로 확인하고, RNA IVT 이전에 SpeI 소화로 선형화했다. mScript RNA 시스템(Epicentre, Madison, WI)을 사용하여 캡핑된 IVT RNA를 생성했다. IVT RNA는 RNeasy 미니 키트(Qiagen, Inc., Valencia, CA)를 사용하여 정제하고, 정제된 RNA는 1 내지 2mg/ml에서 RNase 비함유 물로 용출시켰다. 인간 T 세포를 기재된 바와 같이, CD3/CD28 비드로 자극했다[참조: Carpenito et al., 2009, Proc Natl Acad Sci U S A 106(9):3360-3365]. 자극된 T 세포를 OPTI-MEM으로 3회 세척하고, 전기천공 이전에 OPTI-MEM에 최종 농도 1 내지 3×10⁸/ml로 재현탁시켰다. 후속적으로, 자극된 T 세포를 IVT RNA의 10μg/0.1ml T 세포(지시된 바와 같이)와 혼합하고, ECM830 전기 방형파 포레이터(Electro Square Wave Porator, Harvard Apparatus BTX)를 사용하여 2mm 큐벳(Harvard Apparatus BTX, Holliston, MA, USA)으로 전기천공시켰다. 형질감염 후 생존률은 50 내지 80%의 범위이며, 모든 경우에 있어서 주사용 생존가능한 T 세포는 사용시 99% 초과의 CAR 발현을 가졌다. 트래피킹 실험을 위해, T 세포를 mRNA 형질감염 이전에 반딧불이 루시페라제 렌티바이러스 작제물로 안정하게 형질도입했다.

상이한 CAR를 사용한 렌티바이러스 벡터의 작제

EF-1α 프로모터의 전사 조절하에 각종 CAR를 코딩하는 렌티바이러스 벡터는 상기한 바와 같이 생성했다[참조: Imai et al., 2004, Leukemia 18(4): 676-684; Milone, et al., 2009, Mol Ther 17(8):1453-1464]. CAR 서열이 eGFP 서열 또는 반딧불 루시페라제(FFluc) 중 하나에 의해, 이어서 FMDV로부터 리보솜 스키핑 서열에 의해 프레임에서 선행하는 CAR-발현 렌티바이러스 벡터가 또한 생성되었다. 이들 벡터는 단일 RNA 전사체로부터 GFP 또는 FFluc 및 CAR의 이중 발현을 허용한다. 모든 작제물을 서열분석에 의해 확인되었다.

전기천공된 T 세포의 CAR 검출

세포를 세척하고, FACS 완충액(0.1% 나트륨 아지드 및 0.4% 소 혈청 알부민(BSA)을 포함하는 인산염 완충 식염수(PBS))에 현탁시켰다. 세포를 비오틴-표지된 폴리클로날 염소 항-마우스 F(ab)2 항체(항-Fab, Jackson Immunoresearch, West Grove, PA)와 함께 4℃에서 25분 동안 배양한 다음, FACS 완충액으로 2회 세척했다. 이어서, 세포를 피코에리트린-표지된 스트렙트아비딘(BD Pharmingen, San Diego, CA)으로 염색시켰다. 유동 세포계수 취득은 BD FacsCalibur(DB Biosciences)로 수행하고, 분석은 FlowJo(Treestar Inc, Ashland, OR)로 수행했다.

ELISA 및 루미넥스 분석

표적 세포를 세척하고, C10(10% 태소 혈청(FCS)이 보충된 RPMI 1640, Invitrogen)에서 10⁶개 세포/ml로 현탁시켰다. 각 유형의 10⁵개 표적 세포를 96웰 환저 플레이트(Corning)의 2개 웰 각각에 첨가했다. 효과기 T 세포 배양물을 세척하고, C10에서 10⁶개 세포/ml로 현탁시켰다. 10⁵개 효과기 T 세포를 96웰 플레이트의 지시된 웰에서 표적 세포와 조합했다. 또한, T 세포를 단독으로 함유하는 웰을 제조했다. 플레이트를 37℃에서 18 내지 20시간 동안 배양했다. 배양 후, ELISA 분석은 제조업자의 지시를 사용하여 상청액으로 수행했다(Pierce, Rockford, IL). 배양 상청액 50㎕를 이중으로 시험했고, 결과를 pg/ml로 보고했다.

CD107a 염색

세포를 평저 96웰 플레이트 중의 C10 배지 160㎕에서 1:1(10⁵ 효과기: 10⁵ 표적)의 효과기:표적(E:T)로 플레이팅했다. 대조군은 CD107a의 배경 수준을 평가하기 위해 표적 세포 부재하의 웰을 포함했다. 피코에리트린-표지된 항-CD107a AB(BD Pharmingen, San Diego, CA) 20㎕를 첨가하고, 플레이트를 온화하게 교반하고, 37℃에서 1시간 동안 배양했다. 골지 정지 용액을 첨가하고, 플레이트를 추가로 2.5시간 동안 배양했다. 이어서, 세포를 10㎕ FITC-항-CD8 및 APC-항-CD3(BD Pharmingen, San Diego, CA)로 염색시키고, 세척했다. 유동 세포계수 취득은 BD FacsCalibur(BD Biosciences)로 수행했고, 분석은 FlowJo(Treestar Inc, Ashland, OR)로 수행했다.

유동 세포계수 세포독성 T 림프구 분석

약간 변형된 버젼의 유동 세포계수 세포독성 분석을 사용했다[참조: Hermans et al., 2004, J Immunol Methods 285(1):25-40]. 이 분석에서, 표적 세포의 세포독성은 효과기 세포로서 동일한 튜브 내의 음성 대조군 세포의 생존과 비교하여 표적 세포의 생존을 비교함으로써 측정했다. 본원에 기재된 실험에서, 표적 세포는 인간 CD19(K562-CD19)를 발현하는 K562 세포이고, 음성 대조군 세포는 메소텔린(K562-메소)를 발현하는 K562 세포이다. K562-메소는 형광 염료 5-(및-6)-(((4-클로로메틸)벤조일)아미노)테트라메틸로다민(CMTMR)(Invitrogen)로 표지했다. K562-CD19 세포는 카복시플루오레세인 디아세테이트 석신이미딜 에스테르(CFSE)(Invitrogen)로 표지했다. 배양물은 10⁴ CD19+ 표적 세포 및 10⁴ 메소+ 대조군 세포를 사용하여 하기 T 세포:표적 세포 비율로 96웰 배양 플레이트에 이중으로 설정했다: 10:1, 3:1 및 1:1. K562-CD19 및 K562-메소가 표적 세포로서 사용되고 CFSE로 표지된 일부 실험에 있어서, CD19에 음성인 골수종 세포주 NSO를 음성 대조군으로서 CMRA로 표지했다. 배양물은 4시간 동안 37℃에서 배양했다. 배양 직후, 7-AAD(7-아미노아세티노마이신 D)(BD Pharmingen)을 제조업자가 권장한 바와 같이 첨가했다. 분석은 7AAD-음성(살아있는) 세포로 게이팅하고, 살아있는 K562-CD19 및 살아있는 K562-메소 세포의 비율은 각각의 T 세포+표적 세포 배양을 위해 측정했다. 각 배양물에 있어서, K562-CD19의 생존율은 살아있는 K562-CD19 비율을 살아있는 K562-메소 대조군 세포 비율로 나누어서 결정했다. K562-CD19의 보정후 생존율은 각 T 세포+표적 세포 배양물 중의 K562-CD19의 생존율을, 임의의 효과기 T 세포 부재하에 K562-CD19 표적 세포 및 K562-메소 음성 대조군 세포만을 함유하는 튜브에서 K562-CD19 표적 세포 비율:K562-메소 음성 대조군 세포 비율의 비로 나누어서 결정했다. 이러한 보정은 출발 세포 수의 변화 및 자발적 표적 세포 사멸을 설명하기 위해 필요하다. 세포독성은 100-(K562-CD19의 보정후 생존율)로서 계산했다. 모든 효과기:표적 비에 있어서, 세포독성은 이중으로 측정했고, 결과는 평균했다.

마우스 이종이식 연구

연구는 특정 변형과 함께 상기한 바와 같이 수행했다[참조: Teachey, et al., 2006, Blood 107(3): 1149-1155 Teachey, et al., 2008, Blood 112(5): 2020-2023]. 요약하면, 6 내지 10주령 NOD-SCID-γc^-/-(NSG) 마우스는 잭슨 라보라토리(Bar Harbor, ME)에서 수득하거나, 승인된 시설 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC) 프로토콜에 따라 집에서 사육하고, 병원체 비함유 조건하에서 유지했다. CD19+ 사람 ALL 균주 Nalm-6은 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC, Manassas, VA)으로부터 수득했다. 동물은 꼬리 정맥을 통해 0.2mL 멸균 PBS 중의 10⁶ 생존 Nalm-6 세포로 주사했다. T 세포는 Nalm-6 주사후 7일에 0.2mL 멸균 PBS의 용적으로 5×10⁶, 1×10⁷ 또는 2.5×10⁷ 세포로 꼬리 정맥을 통해 주사했다. 이러한 용량의 Nalm-6은, 무처리하여 방치하면, 22 내지 25일내에 NSG 마우스에서 치명적 백혈병을 확실하게 생성한다. 이전 실험은, 대퇴 골수에서 질병의 초기 확실한 검출(> 0.1%)이 주사후 7일이었기 때문에, 이 시점은 치료적 개입을 위해 선택되었고 생물발광 질환과 상관되어 있음을 입증했다. 동물은, 백혈병 관련된 뒷다리 마비 뿐만 아니라, > 10%의 체중 감소, 모 손실, 설사 또는 결막염에 의해 입증된 바와 같이 이식편 대 숙주 질환 및 기타 독성 징후를 주의하여 모니터링했다. 말초혈을 안와정맥총 출혈에 의해 수득했고, ALL 및 T 세포 생착(engraftment)의 존재는 제조업자의 설명서에 기재된 바와 같이 BD 트루카운트(BD Trucount, BD Biosciences) 튜브를 사용하여 유동 세포계수에 의해 측정했다. CD19, CD20, CD4, CD3, CD10 및/또는 CD8의 발현은 (필요에 따라) 형광-접합된 모노클로날 항체(BD Biosciences)로 염색시켜 검출했다. CD19 또는 SS1 scFv CAR의 발현은 염소 항-마우스 IgG 혈청(쥐 유래의 scFv에 특이적)(Jackson ImmunoResearch)으로부터 비오틴화 F(ab')2를 사용한 다음, 스트렙트아비딘-PE(BD Biosciences/Pharmingen)으로 염색시켜 검출했다.

발광생물 이미지화

마취된 마우스는 제노겐 스펙트럼 시스템 및 리빙 이미지 V4.0 소프트웨어를 사용하여 이미지화했다. 마우스에게 150mg/kg D-루시페린(Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA)의 복강내 주사를 제공했다. Nalm-6 및 반딧불 루시퍼라제 벡터로 형질전환된 인간 T 세포 둘 다의 이전 적정은 6 내지 10분 동안 지속하는 피크 방출과 함께 광자 방출의 피크까지의 시간이 5분임을 나타냈다. 각각의 동물은 단독으로(광자 정량화) 또는 루시페린 주사후 동일한 상대 시점(6분)에서 전후 복와(prone) 위치에서 최대 5마리 마우스(표시용)의 그룹으로 이미지화했다. 데이타는 선형 규모의 중간 범위가 (600 내지 60000 계수)에 도달하거나, 최대 노출 설정이 (f 정지 1, 거대 상자 및 120초)에 도달한 다음, 광자/초/cm²/입체호도법으로 전환시켜 노출 시간, f 정지, 상자 및 동물 크기에 대해 각각의 이미지를 규정화할 때까지 수집했다. 해부학적 국지화를 위해, 광 강도를 나타내는 의사컬러 맵은 흑백 몸체-표면 기준 이미지 위에 겹쳤다. 데이타 표시를 위해, 루시퍼라제 함유 세포의 갖지 않는 마우스를 최대 설정으로 이미지화하고, 3.6×10⁵ p/s/cm²/sr의 평균 값을 수득했다. 루시퍼라제 함유 Nalm-6을 갖는 마우스는, 광자 양이 5×10¹¹ p/s/cm²/sr에 도달한 때에 백혈병으로 빈사상태로 되어, 크기의 6차수의 검출 범위를 제공했다. 유사하게는, 다양한 CAR의 루시퍼라제 발현 버젼을 사용하여, T 세포의 종양 부위로의 수송을 검출하고 숙주 마우스에서 전달된 T 세포의 확장을 평가했다.

세포주 동정 시험

Nalm-6 및 K562 부 세포주는 ATCC(Manassas, VA)로부터 수득했고, 짧은 직렬식 반복 분석[참조: Masters, et al., 2001, Proc Natl Acad Sci U S A 98(14):8012-8017]에 의해 유전자형을 동정했다. 세포주는 6개월마다 또는 CD19 또는 루시퍼라제 형질도입 등의 임의의 유전자 변형 후에 확인하여 실체를 보장했다.

통계학적 고려사항

분석은 STATA 버젼 10(Statacorp, College Station, Texas) 또는 프리즘 4(Graphpad Software, La Jolla, CA)로 수행했다. 시험관내 데이타는 이중 평균을 나타내고, 평균의 비교는 만-휘트니(Mann-Whitney) 시험을 통해 수행했다. 복수 그룹 사이의 비교를 위해, 크르스칼-왈리스(Kruskal-Wallis) 분석을 둔(Dunn) 다중 비교 시험으로 수행하여 개개 그룹을 비교했다. 생존 곡선은 복수의 데이타세트를 비교하는 본페로니(Bonferroni) 보정과 함께 로그-랭크 시험을 사용하여 비교했다.

실험 결과는 이제 기재된다.

mRNA 형질감염에 의한 CAR 발현 T 세포의 생성은 검출가능한 용해 활성을 갖는 최대 10일의 표면 발현을 생성한다.

mRNA-형질감염된 CAR+ CTL(RNA CAR)의 발현 및 세포용해 활성의 지속성은 시험관내에서 평가했다. 높은 표면 발현은 10일까지 기준선 비-발현 세포를 향해 표류하기 전에 시험관내에서 6일 동안 지속했다(도 1A 및 데이타는 도시하지 않음). 이러한 연장된 고도 도입유전자 지속성은, 가능하게는 최적화된 IVT 벡터 및 RNA 생성(데이타는 도시하지 않음) 때문에, mRNA 형질감염후 표면 항원의 피크 및 발현 기간의 대부분 보고와 상이했다[참조: Birkholz et al., 2009, Gene Ther 16(5):596-604; Rabinovich, et al., 2009, Hum Gene Ther 20(1):51-61; Yoon, et al., 2009, Cancer Gene Ther 16(6):489-497; Li, et al., 2010, Cancer Gene Ther 17(3):147-154]. 평행하게, 시험관내에서 CAR-발현 T 세포의 세포독성 가능성은 유동 세포계수 기반 사멸 분석으로 평가했다. 2:1의 E:T 비에서 50% 초과의 표적 세포의 특이적 용해는 1 내지 4일로부터 주목되었다. 세포독성 활성은 CAR의 표면 발현에서 2 내지 3Log 감소와 함께 5일 내지 6일에 감소하지만, 일부 용해 활성이 관찰되었고, 유사 형질감염된 세포의 배경 용해의 것을 초과했다(도 12B). 특이적 용해 활성은 발현된 도입유전자의 MFI 감소와 평행하게 감소되었지만, 20:1의 E:T 비에서 비전기천공된 대조군에 비해 유의적 용해 활성(p<0.05)이 전기천공후 6일에 관찰되었다.

RNA CAR+ T 세포의 용해 활성을 추가로 평가하기 위해, 이들을 상기와 같이 자극하여 전기천공한 다음, 전기천공후 4시간에서 다양한 표적 세포와 함께 공배양하여 세포용해 가능성 및 표적 특이성을 검사했다. CD107a의 발현은 세포용해 세포 탈과립화의 마커로서 사용했다[참조: Betts and Koup, 2004, Methods Cell Biol 75:497-512]. 관심있는 표적(CD19) 이외에, 무관한 항원 메소텔린에 대해 지시된 CAR(림프구 상에서 발현되지 않음)은 대조군으로 사용했다. K562 세포는 CD19 또는 메소텔린을 발현하지 않지만, 용이하게 형질도입되어 다양한 유전자를 발현시킴으로써 이들을 시험관내 세포독성 평가를 위한 유연한 표적 세포로 되게 했다[참조: Suhoski et al., 2007, Mol Ther 15(5):981-988]. CD19-지시된 RNA CAR+ T 세포는 탈과립화하고 CD19⁺ 표적의 존재하에서만 CD107a를 발현시키며, 이는 항원-특이적 인식 및 용해 기능을 나타낸다(도 12C). 이는 CD19를 발현하기 위해 형질전환된 K562 세포 뿐만 아니라 CD19⁺ 표적 백혈병 세포주 Nalm-6 둘 다를 포함했다. 대조군으로서, 메소텔린 단독을 인식하는 CAR은 동일한 CD107a 분석으로 측정한 바와 같이 메소텔린 + K562 세포를 특이적으로 용해시킨다. 메소텔린-지시된 CAR⁺ T 세포는 메소텔린-음성 모 K562, CD19⁺/메소텔린-ALL 균주 Nalm-6, 또는 메소텔린이 아닌 표면 CD19를 발현시키기 위해 형질도입된 K562의 존재하에 CD107a를 발현시키지 않는다. 4-1BB 및 TCR 제타 신호전달 도메인(BBz)을 갖는 항-메소 CAR 및 항-CD19-BBz CAR 둘 다를 사용한 공배양 실험은 또한, 항원-특이적 T 세포 활성화를 암시하는 상청액의 ELISA에 의해 측정된 바와 같이, 적절한 표적의 존재하에 인터류킨-2(IL-2)의 특이적 방출을 입증했다(도 12D).

투입 RNA 용량에 대한 CAR 발현 수준의 관계

레트로바이러스 유전자 전달에 의해 조작된 CAR T 세포의 투여후 심각한 부작용의 최근 보고[참조: Brentjens et al., 2010, Molecular Therapy 18(4):666-668; Morgan, et al., 2010, Mol Ther 18(4):843-851]는 소정 수준의 표면 발현을 갖거나 자가 제한된 발현을 보장하는 CAR을 발현하는 플랫폼(예: RNA)이 바람직할 수 있음을 암시한다. mRNA 용량을 적정함으로써, MFI에 의해 RNA CAR 표면 발현의 대략 100배 변이가 관찰된다(도 13A). 표면 MFI의 변화에도 불구하고, 발현의 감소율(퍼센트로서 나타냄)은 유사하다(도 13B). RNA CAR+ T 세포는 전기천공후 1일에 유사한 용해 활성(도 13C, 좌측 패널) 및 IFN-γ의 분비(도 13D)를 나타낸다. IL-2의 분비가 또한 시험되었다. 이는 상이한 방법을 사용한 최근의 보고와 일치한다[참조: James, et al., 2010, The Journal of Immunology 184(8):4284]. 그러나, 3일차에, 용해 활성의 용량 의존적 감소가 관찰되고, 여기서 보다 낮은 RNA 용량은 1일차의 이들의 효과와 비교하여 덜 효과적인 반면, 보다 높은 용량(40 및 20㎍)은 3일차에 각각의 E:T 비에서 1일차와 유사한 용해 프로파일을 갖는다. 이는, 투입 RNA에 비례하여 나타나는 초기 표면 발현이 용해 활성의 시간 및 정도를 결정지을 수 있음을 암시한다. 이는, 연구로 남아 있지만, 효과 지속기간 및 잠재적으로는 사이토킨 방출 기간을 조절하는데 유용할 수 있다.

CAR + CTL의 생체내 수송

최대 1주 동안 RNA CAR 발현을 입증하는 상기 시험관내 데이타에 기반하여, 이종이식 마우스 모델에서 48시간후 mRNA-형질감염된 CAR⁺ T 세포의 세포용해 기능을 평가했다. NSG 마우스에게, 10⁷ 19-BBz 또는 항-메소(SS1)-BBZ RNA CAR + T 세포의 주입전 7일에서 CD19⁺ ALL 균주 Nalm-6을 꼬리 정맥으로 접종했다(도 14). 마우스는 T 세포 주입후 48시간에서 희생시키고, T 세포를 회수하고, 음성 선택 프로토콜을 사용하여 말초혈, 비장, 대퇴 골수 및 복막 세정으로부터 농후화시켰다. 생체내 증식 및 CD19⁺ Nalm-6 표적에 대한 노출 48시간 후, CAR을 발현하는 T 세포는 말초혈, 비장 및 복막에서 여전히 검출할 수 있다. 표면 항-CD19 CAR 발현은 시험관내에서 배양된 비교 대조군 T 세포의 것보다 적정하게 낮다(도 14A). 동족 메소텔린 대리 항원을 발현하는 표적에 노출되지 않은 메소-BBz CAR T 세포는 또한 이들 구획으로부터 회수했다. 비장으로부터 전체 CAR 양성 모집단은 이 시점에서 CD19의 경우에 75%(회수된 전체 인간 CD3+ 세포의 퍼센트로서) 및 메소텔린의 경우에 68%였다. CD19 CAR CTL은 생물발광(도 15)에 기반하여 확장하고 메소텔린 CAR CTL은 확장하지 않지만, 증식하는 CD19 CAR CTL은 CAR+ 자손을 생성하는 것 같다. CAR 매개된 증식은 CAR 음성 자손을 생성하지만, CD19 CAR 양성 세포의 비율은 비증식성 메소텔린 CAR CTL에 대한 것보다 낮아야 한다. 어느 하나의 작제물에 대한 일부 인간 CD3⁺ 세포는, 골수(척추 바디, 두개관)의 접근불가능한 영역을 통해 T 세포의 희석 분포에 부분적으로 기인하여, 이 시점에서 대퇴골로부터 회수되었다. 또한, CAR의 염색에 사용된 염소-항-마우스 IgG 혈청은 이러한 구획의 평가에서 높은 배경을 제공하는 다수의 골수 전구체 세포와 교차 반응한다.

48시간 복막 세척액에서 회수한 세포를 사용했고, 이는 추가의 시험관내 특성화를 위해 T 세포가 IP 또는 IV로 투여되는지의 여부에 상관없이 대부분 인간 CD3⁺ 및 CAR⁺ 농후화 모집단을 갖는다. 10⁷ CAR⁺ T 세포의 주사후 48시간에서 마우스의 복막에서 회수한 T 세포는 유동 세포계수 기반 CTL 분석에서 항원-특이적 세포독성에 대해 시험했다(도 14B). 유의한 항원-특이적 표적 용해는, 48시간 동안 시험관내에서 배양된 것에 필적하는, 48시간후 마우스로부터 회수한 RNA CAR+ T 세포로 수득되었다.

이어서, RNA CAR CTL의 해부학적 분포는 생체내 생물발광을 사용하여 3일 동안 평가했다. 마우스에게 Nalm-6을 주입하고, 7일차에 5×10⁶ RNA CAR+ T 세포(50% CD4⁺ 및 50% CD8⁺, 둘 다 IV)를 주입했다. 생물분포에 대한 항원 인식 및 CAR 신호전달의 효과를 평가하기 위해, 유사 형질감염된 T 세포 뿐만 아니라 19-BBz 및 ss1-BBz을 발현하는 RNA CAR+ T 세포를 비교했다. mRNA 형질감염 전에 반딧불 루시퍼라제 렌티바이러스 작제물로 안정하게 형질도입된 T 세포를 사용하여 생체내 생물발광 추적 및 상대적 정량화를 가능하게 했다. 공지된 질환 부위에 비해 열 맵 뿐만 아니라 전체 생물발광 신호의 증가에 의해 나타낸 바와 같이 질환 부위에서의 체류 및 후속 증식은 표적 항원의 인식을 필요로 했다(도 15). 항원에 대해 CAR을 갖는 T 세포는 당해 모델(메소텔린) 또는 비장에서 농축된 유사-형질감염된 세포에 존재하지 않고 주사로부터 시간 경과에 따라 생물발광의 증가를 나타내지 않았다. 생물발광 활성 증가의 결여는 발광 신호가 세포수에 정비례하기 때문에 생체내에서 T 세포 확장의 결여를 암시한다[참조: Zhao, et al., 2005, J Biomed Opt 10(4):41210; Dobrenkov et al., 2008, J Nucl Med 49(7):1162-1170]. 전달된 19-BBz을 갖는 T 세포는 유지되었고, 질환 부위(우측 간 뿐만 아니라 축 골격 및 대퇴 골수, 비장)에서 증식했다(도 15B). 또한, 전체 생물발광 신호는, T 세포수의 증식성 확장과 일치하게, Nalm-6에 의한 공지된 관여 부위 뿐만 아니라 전체 마우스에 비해 증가했다(도 15A). 반딧불 루시퍼라제로 안정하게 형질도입된 Nalm-6을 갖는 경시적 실험은 질환이 동일한 위치(축 골격, 대퇴 골수, 비장 및 간)에 존재하고 생물발광 신호의 4log 증가가 증가하는 질환 부하에 상응한다는 것을 나타냈다(도 17 및 18). 이전 실험과 일치하여, 소수 존재하지만, CTL은 T 세포 주사후 초기 3일 동안 말초혈 구획에 존재하고, 이때 <10 인간 T 세포/㎕는 트루카운트 정량화에 의해 검출되는 반면, 다수의 인간 T 세포는 후기 시점에서 말초혈에서 검출된다. 유사하게는, 말초혈에서 Nalm-6의 출현은 이 모델에서 후기 사상이고, 이때 마우스는 동물이 빈사상태로 되기 직전, 통상 21일까지 <10 인간 ALL 세포/말초혈 ㎕를 나타낸다(데이타는 도시하지 않음). 이러한 실험 모델의 복수회 반복에 걸쳐, 이는 말초혈 중의 CTL 또는 아세포를 정량화하기 위해 유동 세포계수를 사용한 전통적 평가에 비해 생물발광의 감도를 강조하는 일치된 발견이다.

이종이식 모델에서 CD19+ ALL에 대한 CAR+ CTL의 생체내 효능

RNA CAR CTL의 잠재적 생체내 효능을 평가하기 위해, 동물은 전과 같이 처리하지만, 종양 접종후 7일에 보다 높은 단일 용량의 T 세포(2.5×10⁷)를 제공했다. 수용체 발현이 수일로 자가-한정되었기 때문에, 세포의 CAR-유도된 확장이 유사하게 한정될 수 있고 보다 높은 용량이 높은 종양 부하에서 효능의 증명에 필요할 수 있다는 것을 가정함으로써 2.5×10⁷의 용량은 10⁷ 세포 대신에 선택되었다. 렌티바이러스에 안정하게 형질도입된 CD19 CAR+ T 세포를 사용한 임상전 모델은 유사한 모델에서 3-4×10⁷ 전체 T 세포에 의한 3 또는 4회의 분리된 주사 계획을 사용했다[참조: Shaffer, et al., 2011, Blood 117(16):4304-14; Brentjens et al., 2007, Clin Cancer Res 13(18 Pt 1):5426-5435]. 놀랍게도, 생물발광 신호의 2log 감소가 주사후 24시간과 같이 초기에 관찰되었고, 당해 감소는 경시적으로 지속되었다(p < 0.01, 도 5A). 생물발광 신호는 CTL이 투과하지 않는 저장소의 증거 없이 전반적으로 감소하고(도 16B), 신호는 검출불가능한 수준에 도달하지만 완전하게 사라지지 않음을 나타낸다. 주목되는 것 중에서, 2차원 열 맵은 뇌, 두개관, 척추 및 척추의 이러한 생체외 이미지화가 수행된 기타 부위로부터 CNS 질환을 분리할 수 없고, 이는 CNS가 이러한 시점(5일)에서 유의적으로 관여하지 않음을 나타냈다. 오히려, 두개관/두개골 기저 및 척추 바디는 백혈병과 관련되어, 마우스의 두부 및 등부에 대한 열 맵을 생성시킨다. 이는 최정 이미지화에 의해 평가된 면역결핍 마우스에서 인간 조혈 세포의 초기 이동에 대한 다른 보고와 일치한다[참조: Kalchenko, et al., 2006, J Biomed Opt 11(5):050507].

메소텔린-지시된 CAR CTL은 생물발광 질환 부하에 대한 현저한 효과를 갖지 않고, 이는 비특이적 동종 또는 이종 효과를 거의 나타내지 않는다. 질환 부하의 초기 감소는 신속하지만, 생물발광 질환이 주사 4일 이내에 상승하기 시작하기 때문에 단명한다. 질환 감소, 및 치명적 질환 부하에 도달하는 후속 지연(>2×10¹¹ p/s/cm²/sr)의 정도는 생존과 직접 상관한다. 마지막으로, RNA CAR+ CTL 주사는, CTL을 제공받지 않은 대조군 동물 및 무관한 항원 메소텔린에 대해 지시된 2.5×10⁷ RNA CAR+ CTL의 동일 용량을 제공받은 대조군 동물과 비교하여 생존의 유의한 연장(생존 데이타의 log 랭크 시험에 의해 p<0.01)을 초래했다(도 16C). 이와 함께, 이들 결과는 RNA CAR+ CTL이 진행된 산재성 백혈병 이종이식편을 갖는 마우스에서 이동 및 증식후에 표적 세포를 명확하게 사멸시킴으로써 강력한 항종양 효과를 나타내는 것을 보여준다. 중요하게는, RNA CAR+ CTL의 생존은 동일한 Nalm-6 모델에서 안정하게 발현된 렌티바이러스 생성된 CAR CTL의 생존과 비교되었다. 이 경우, CAR CTL은 RNA 생성된 CTL로서 동일한 19-BBz CAR을 함유하도록 렌티바이러스 형질도입에 의해 생성되었다. 10⁷ 렌티바이러스 CAR CTL은 상기 측정된 용량화에 기반하여 Nalm-6 후의 7일에 주사되었다. 마우스는 전과 같이 수행했고, 하나의 장기 생존자가 지속적으로 발현하는 렌티바이러스 CAR CTL에서 관찰되지만, RNA CAR 또는 렌티바이러스 CAR CTL 사이에서 차이는 없었다(도 5D).

mRNA 조작된 T 세포를 갖는 마우스에서 진행된 백혈병의 치료

최근 임상 실험의 결과는 레트로바이러스 벡터로 도입된 CAR에서 개선된 임상 결과를 나타낸다[참조: Pule, et al., 2008, Nat Med 14(11):1264-1270; Till, et al., 2008, Blood 112(6):2261-2271]. 최근의 사설에서는 보다 안전한 CAR에 대한 필요성이 논의되어 있다[참조: Buning et al., 2010, Human Gene Therapy 21(9):1039-42; Heslop, 2010, Molecular Therapy 18(4):661-662]. 본원에 기재된 데이타는 강력한 신호전달 도메인을 보다 더 함유하는 CAR로 치료학적 윈도우를 증가시킬 가능성을 갖는 플랫폼의 개발을 기재한다. 본원에서 제공된 발견은 임상전 모델에서 산재성 백혈병에 대한 RNA CAR+ CTL의 치료학적 효과를 입증하는 최초의 것이다.

mRNA 형질감염 등의 CAR 면역치료에 대한 일시적 발현 방법은 본 발명자들의 이전의 노력 및 당해 기술분야의 대부분 연구자들의 노력에 역행한다. 본원에 기재된 데이타는 mRNA 형질감염된 CAR+ T 세포의 단일 주사가 전신 효과를 달성할 수 있고, 이에 의해 생체내에서 충분하게 확장 및 지속하여 산재성 백혈병의 원격 부위로 이동하고 이들의 세포독성 효과를 유지할 수 있다는 것을 나타내는 최초의 것이다. T 세포의 괴상 CAR-유도된 확장은 CAR 발현 기간 동안에 관찰된다. 본 결과는 백혈병 부하의 2-log 감소 및 연장된 생존을 입증하고, 공격적 이종이식 모델은 급속한 인간 ALL 생착을 특징으로 했다. 중요하게는, RNA CAR CTL의 단일 주사를 투여한 이종이식된 백혈병을 함유하는 마우스의 생존은 안정한 렌티바이러스 CAR CTL에 의해 달성된 생존에 필적한다. 재발 부위 및 시간은, 안정한 발현된 CAR만이 장기간 치유(>180일)를 초래하지만, 이들 그룹 사이에서 유사하다. RNA CAR 모델에서의 생존은, 치주 및 방추주 영역이 RNA 및 렌티바이러스 CAR 모델 둘 다에서 최초 재발 부위를 잔류시키지만, 초기 질환 감소 정도와 직접 상관된다.

경시적으로 비교적 mRNA-용량-의존성 IFN-γ 및 IL-2 사이토킨 분비를 생성하면서 CAR 표면 발현이 비교적 mRNA 용량-의존성이라는 현재의 발견은 독성을 초래할 수도 있는 사이토킨의 방출을 완화시키기 위해 발현 수준을 조정할 추가의 가능성을 제기한다. 안정하게 형질도입된 CAR T 세포에서 직면한 기타 독성은 온-표적/오프-기관 효과, 예들 들면, CD19 CAR 치료 후의 정상 B 세포의 예상된 고갈, 또는 탄소 안하이드라제 IX 치료 후의 간 독성의 유도였다[참조: Lamers, et al., 2006, J.Clin Oncol. 24(13):e20-e22]. 어떠한 특정 이론에 구속되는 것을 원하지 않지만, RNA CAR의 반복된 투여는 이러한 형태의 독성의 유발에 요구될 수 있다고 생각된다. 마지막으로, CTL 내로 CAR의 렌티바이러스 또는 레트로바이러스 도입에 대한 개념은 삽입 돌연변이유발, 즉 성숙 T 세포의 경우에도 중요한 규제 감독의 대상로부터 악성 형질전환의 이론적 가능성을 포함한다[참조: Nienhuis, et al., 2006, Molecular Therapy 13(6):1031-1049; Bushman, 2007, J Clin Invest 117(8):2083-2086]. 숙주 세포 게놈 내로 통합되지 않고 CAR 발현이 자가-한정되기 때문에, 이들 개념은 mRNA 형질감염에 의해 잠재적으로 회피된다. 또한, 중요하게는, RNA 발현된 CAR이 짧은 기간 내에 임상전 동물 모델에서 시험관내 및 생체내 둘 다에서 안정하게 발현된 CAR과 유사하게 기능하는 것으로 보이기 때문에, 이러한 플랫폼은 안정한 발현 시스템으로 다시 번역될 수 있는 CAR 설계에서 반복체를 평가하는 잠재적으로 보다 신속한 방법을 제공한다.

본원에서 검사한 RNA CAR CTL을 사용한 데이타는 이들의 렌티바이러스 대응물의 모든 표적 기반 세포독성 특성을 나타내는 것을 재보증한다[참조: Carpenito et al., 2009, Proc Natl Acad Sci U S A 106(9):3360-3365; Milone, et al., 2009, Mol Ther 17(8):1453-1464]. RNA CAR CTL은 단일 IV 주사 후에 산재성 백혈병 부위에서 이동 및 확장하는 동시 능력과 함께 항원 특이성을 나타냈다. 질환 부위로 CAR CTL의 수송은, 전립선암 이종이식 모델에서 입증되었기 때문에[참조: Dobrenkov et al., 2008, J Nucl Med 49(7):1162-1170], 이들의 항-종양 기능에 중요하고, 이러한 연구는 CD19 RNA CAR CTL이 단일 꼬리 정맥 주사 후에 산재성 백혈병의 모든 부위로 수송 및 기능할 수 있다는 것을 입증하는 최초의 것이다. 중요하게는, 본원에서는 RNA CAR이 이종이식편 함유 종양에서 순환 및 확장 후에 여전히 고도로 발현되는 것으로 기재되어 있고, 이는 항원 관여 후의 증식으로부터 잠재적 수용체 내재화 및 RNA의 희석에도 불구하고 기능적 CTL을 나타낸다. RNA CAR CTL 치료를 위한 몇몇 잠재적 기회가 있다. 첫째, 이들은, 안정하게 발현된 CAR을 사용한 자살 시스템의 도입 가능성을 제외하고는, 안정하게 발현된 CAR에서는 불가능한 독성 이동을 위한 잠재적 전략(자기-제한 발현)을 제공한다[참조: Marktel, et al., 2003, Blood 101(4):1290-1298; Sato, et al., 2007, Mol.Ther. 15(5):962-970]. 둘째, RNA CAR은 임상에 대한 유연한 및 보다 신속한 경로를 제공하여 CAR 설계 및 효력을 최적화하는 효율적인 반복 방법을 가능하게 함으로써 CAR 개발 속도를 촉진시킬 가능성을 제공한다. 규제 승인 절차는 게놈 통합을 필요로 하는 안정하게 발현된 CAR보다 RNA CAR에 의해 덜 방해될 가능성을 갖는다. 임상 등급 mRNA는 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터의 통합보다 훨씬 저렴하게 생산되고, 형질감염 또는 트랜스포손 기반 프로토콜에 사용되는 플라스미드 DNA보다 다소 고가이다[참조: Singh, et al., 2008, Cancer Research 68(8):2961-2971; Till, et al., 2008, Blood 112(6):2261-2271]. 진정한 비용-효과가 나오는 방법은 T 세포의 수, 아직 알려져 있지 않은 인자의 주입 수 및 반응 기간에 의해 결국 결정될 것이다. 마지막으로, 관해 유도를 위해 강력하지만 잠재적으로 독성 CAR을 사용하는 RNA CAR "녹 다운" 치료를, 기억 CAR+ 세포를 제공하는 전략으로서 안정하게 발현된 CAR을 사용하는 통합 및 유지 치료와 조합하는 것이 매력적일 수 있다. 요약하면, 이의 개발이 본원에 기재되어 있는 단기간 발현 플랫폼은 세포 치료를 위한 대안을 제공하고, 특정 적용을 위한 잇점을 가질 수 있으며, 시간 경과에 따르는 반복된 주입과 함께 기타 치료 내성 백혈병의 장기간 질환 조절 및 제거를 달성할 수 있다.

실시예 3: 자가 재-지시된 T 세포의 임상 시험

본 프로토콜에서의 조사 제제는 키메라 항-메소텔린 면역수용체 scFv로 형질감염된 자가 T 세포이다. 안전성을 최대화하기 위해, 시험은 메소텔린 CAR mRNA로 전기천공된 T-세포를 사용한다. 대표적인 CAR mRNA는 pD-A.ss1.OF.BBZ.2bg.150A 플라스미드(도 19 참조) 또는 pD-A.19.OF.2bg.150A(도 20 참조)의 시험관내 전사에 의해 생성될 수 있다. 본원의 다른 부분에서 논의된 바와 같이, CAR mRNA를 사용하는 것은 한정된 기간 발현을 가능하게 한다. 부작용이 주목되는 경우, T 세포 주입이 종료될 수 있고, mRNA CAR의 발현이 수일로 제한되어 부작용을 보다 일시적으로 및 관리가능하게 하기 때문에, 독성은 급속하게 완화될 수 있다.

이러한 프로토콜은 IV 자가 항-메소텔린 재지시된 CAR T-세포 투여의 안전성을 결정하기 위해 설계된다. 예상될 수 있는 주요 독성은 조작된 T 세포가 이들 혈청 표면 상의 정상 저수준 메소텔린 발현에 기인하여 복막 및 흉막-심막 표면 상에 염증, 즉 장막염을 유발할 수 있다는 것이다.

이들 실험에 사용되는 재료 및 방법을 다음에 기재한다.

재료 및 방법

플라스미드

최종 플라스미드 작제물의 도출은 중간 플라스미드 내로의 클로닝을 수반하는 다단계 공정이었다. 두 가지 플라스미드는 ss1.bbz 단편을 클로닝하기 위해 사용되었다. 메소텔린 scFv 단편(ss1)은 먼저 파스탄 박사(Dr. Pastan)(Chowdhury et al., 1998)에 이미 공개된 작제물로부터 번역 연구 프로그램(TRP) 연구실에서 먼저 클로닝되었다. 41BB 및 CD3ζ 서열과 함께 인간 CD8α 힌지 및 막통과 도메인은 상기한 pELNS.CD19-BB-ζ 플라스미드로부터 PCR로 클로닝했다[참조: Milone et al., 2009]. ss1.bbz 단편은 pGEM.GFP.64A 벡터에서 먼저 클로닝했다. 이 벡터는 강화된 도입유전자 발현을 위해 2개의 3' UTRβ 글로빈 반복체 및 150bp의 폴리A 서열(pGEM.GFP.64A 중의 64 폴리A 서열을 대체함)의 부가에 의해 변형되었다[참조: Holtkamp 2006]. 임상 사용을 위한 GMP-준수 플라스미드는 pDrive 벡터 내로 pGEM의 ss1.bbz.2bgUTR.150A 단편을 서브클로닝하여 수득했다. pDrive 클로닝 벡터(Qiagen)는 UA 하이브리드화를 통해 PCR 생성물의 고도로 효율적인 클로닝을 위해 설계되었다. 이것은 재조합 클론의 암피실린 및 카나마이신 선택 둘 다를 가능하게 하고, 범용 서열분석 프라이머 부위, 및 시험관내 전사를 위한 T7 및 SP6 프로모터 둘 다를 제공한다. 먼저, ss1.bbz.2bgUTR.150A은 HindIII 및 NdeI(대리 블런트)에 의해 pGEM 벡터로부터 절단하고, KpnI 및 NotI(대리 블런트)로 절단된 pDrive내로 서브클로닝했다. 정확한 방향으로의 삽입은 pDrive.ss1.bbz.2bgUTR.150A을 생성하는 것으로 확인된 서열이다. pDrive 벡터 중의 암피실린 내성 유전자는 AhdI 및 BciVI을 사용한 이중 소화에 의해 결실되었다. CAR ORF 내부의 내부 개방 판독 프레임(ORF)으로부터 번역된 잠재적 이상 단백질을 제거하기 위해, 크기 60bp보다 큰 모든 내부 ORF는 돌연변이유발 PCR에 의해 돌연변이되었고, ss1 CAR의 ORF는 그대로 유지되었다. 수득된 플라스미드는 pD-A.ss1.bbz.OF.2bg.150A로 지정되었다.

박테리아 형질전환

최종 pD-A.ss1.bbz.OF.2bg.150A 작제물은 CVPF SOP 1188에 따라 원샷 톱10(OneShot TOP10) 화학적 경쟁 이 콜라이 세포(Invtrogen) 내로 도입되었다. 마스터 세포 은행을 생성했고, 세포는 TCEF SOP 1190에 기재된 바와 같이 안전성, 순도 및 속성에 대해 시험중이었다.

DNA 제조

하나의 배치로 제조한 10mg 이하의 플라스미드 DNA는 100㎍/ml 카나마이신을 함유하는 LB-배지의 2개 1.25L로부터 SOP 1191에 따라 퀴아필터 플라스미드 기가(QIAfilter Plasmid Giga) DNA 분리 키트를 사용하여 생성했다. 소정 시간에서 1mg의 DNA를 37℃에서 밤새 SpeI 제한 효소로 선형화했다. 선형화는 퀴아겐(Qiagen) 플라스미드 맥시(Maxi) 키트를 사용한 대규모 정제 전에 겔 전기영동에 의해 확인했다. DNA에 대한 방출 기준은 외관, 농도, 순도, 멸균 및 선형화의 젤 확인을 포함한다.

RNA 제조

번역 효율성을 시험하기 위해, RNA는 본원의 다른 부분에 기재된 바와 같이 다수의 상이한 시판 시스템으로부터 생성했다. 공-전사 시스템과 비교하여, mScript mRNA이 선택되었는데, 이는 실질적으로 전사체의 100% 캡핑 및 100% 적절한 캡 배향을 제공하고, 번역 효능을 증강시킬 수 있는 캡 1 번역 증가 구조를 도입하기 때문이다. 키트용 분석 증명서가 동반된 mScript^TM mRNA 시스템의 사용자 로트가 제공되었다. RNA는 RNeasy Maxi 키트(Qiagen)를 사용하여 단리시켰다. 시험관내 전사된 RNA는 1mg/mL의 농도로 0.5mL의 분획으로 동결보존했다. RNA 성질 및 양은 mRNA 변성 완충액(Invitrogen, Carlsbad, CA)에서 70℃로 15분 변성 후에 1% 아가로즈 겔 전기영동에 의해 분석하고, UV 분광광도계(OD260/280)으로 정량화했다. 이러한 mRNA로 전기천공된 T 세포의 도입유전자 발현의 평가는 또한 기능적 특성화의 일부로서 수행되었다.

CAR T 세포 생성물 제조

CD3+ T 세포는, 단독 사용 폐쇄 시스템 일회용 세트를 사용하는, 카리디안BCT 엘루트라(CaridianBCT ELUTRA) 위에서 역류 원심분리 용출을 통해 단구의 고갈에 의해 백혈구반출 생성물로부터 농후화된다. 0일차에, T 세포 제조 공정은 항-CD3/CD28 모노클로날 항체-코팅된 자기 비드를 사용한 활성화로 개시하고, 확장은 정적 조직 배양 백에서 개시한다. 5일에서, 세포는 추가의 확장을 위해 필요에 따라 웨이브(WAVE) 생물반응기로 옮길 수 있다. 배양 종료시에, 세포는 자기 비드가 고갈되고, 세척되며, 하에모네틱 세포 세이버(Haemonetics Cell Saver) 시스템을 사용하여 농축시켰다. 수거후 세포는 다음날 아침에 전기천공을 위해 37℃에서 밤새 배양한다. 세포를 세척하고, 전기천공 완충액(Maxcyte)에 재현탁시키고, 맥스사이트(Maxcyte) 처리 어셈블리 내로 부하했다. 세포는 ss1 RNA로 전기천공하고, 4시간 동안 회복시킨 다음, 주입가능한 동결보존 배지에서 제형화한다.

전기천공된 세포의 수거 동안 세포의 전체 수는 동결보존될 수 있는 6개 용량을 계산하기 위해 사용할 수 있다. ≥80%의 CD3+ 방출 및 동결보존전 ≥80% 생존율 및 센티넬 바이알의 경우에 ≥70 생존율의 공정시 기준으로, 모든 대상체는 동일한 양의 생존가능한 및 CD3+ T 세포 +/- 20%가 투여될 수 있다. 샘플은 유동 세포계수를 사용하여 CAR 발현을 측정하기 위해 동결보존시에 채취할 수 있지만, 이러한 정보는 실시간으로 이용가능하지 않다. 따라서, CAR 양성 세포의 퍼센트는 후속적으로 계산되고 방출 기준으로 사용되며, 최종 생성물 용량은 CAR 양성 세포에 대해 표준화될 수 없다. CAR 발현의 경우에 ≥20% 양성의 방출 기준을 만족하고 당해 프로토콜에서 언급된 바와 같이 다른 방출 기준을 만족하는 이들 최종 생성물만이 투여될 것이다.

추가로, 1차 주입시에 내독소 겔 응괴 및 생존력 계수를 수행하기 위해 및 각각의 후속 주입시에 생존력의 평가를 위해, SS1 T 세포의 대략 10개 바이알은 동결보존될 수 있고, 센티넬 바이알로서 유지될 수 있다. 나머지 바이알은 "단지 정보용(FIO)" 기능 분석을 수행하기 위해 사용될 수 있다. 모든 동결보존된 세포는 ≤-130℃로 모니터링된 냉동고에서 저장될 수 있다.

전기천공 후의 CAR 발현은 최종 세포 생성물에 대한 방출 기준의 이루이다. 이는 염소 항-마우스 IgG, F(ab')2 항체(Jackson ImmunoResearch)를 사용한 세포의 표면 염색, 이어서 PE-표지된 스트렙트아비딘(BD Pharmingen) 및 유동 세포계수 분석에 의해 수행된다. 방출 기준은 ≥20% 양성 세포로 설정된다.

CAR T 세포 생성물 안정성

ss1 CAR T 세포는 전기천공후 4시간 동안 동결보존될 수 있고, T 세포 제조후 3개월 범위 내에 해동되어 투여될 수 있다. ≤-130℃에서 대략 30일 동안 동결보존된 ss1 CAR T 세포의 메소텔린 scFv 발현은 동결보존시(96.9%)와 거의 동일한 97.4%이었고, 기타 동결보존된 T 세포 생성물은 적어도 6개월 동안 안정하다. 트리판 블루 계수에 기반한 해동후 생존율은 98.7%와 비교하여 75.2%였다. 발현 데이타는 최종 생성물이 시험 저장 동안 안정하고 추가 용량을 위한 센티넬 바이알이 70% 생존율 및 ≥20% CAR 발현의 방출 기준을 만족시켜야 한다는 것을 암시한다. ss1 CAR T 세포의 추가 바이알은 동결보존후 3, 6, 9 및 12개월에서 해동시킬 수 있고, 추가의 생성물 안정성 데이타를 생성하기 위해 생존율 및 도입유전자 발현을 시험했다.

CAR T 세포 IV 투여

· 주입은 면역억제된 환자를 위한 예방을 사용하여 CTRC로 격리실에서 수행할 수 있다.

· 형질감염된 T 세포의 1개 또는 2개 백은 펜실베니아 대학병원에서 임상 세포 및 백신 생산 설비(Clinical Cell and VAccine Production Facility(CVPF))로부터 조사 약물 조사 약물 서비스(IDS)로 프로토콜 코디네이터 또는 간호사에 의해 습윤 아이스 상에서 수송된다.

· IDS는 설명책임을 위해 생성물에 기록하고, 임상 시험 코디네이터에 의해 제공된 바와 같이 환자의 성명 및 식별자를 확인하고, IDS 기록물에 유지하기 위해 백에 부착된 2부분 천공된 라벨로부터의 1개 라벨을 떼어낸다. 형질감염된 T 세포는 CTRC에서 IDS로부터 대상체 침상으로 프로토콜 코디네이터 또는 간호사에 의해 수송된다.

· 형질감염된 T 세포는 IDS로부터의 수송 직후에 대상체 침상에서 37℃ 수욕에서 다수의 CVPF 스태프에 의해 해동된다. CAR T 세포 생성물이 손상 또는 누출된 백을 갖거나 위험한 것처럼 보이는 경우, 주입하지 말고 하기 명시한 바와 같이 CVPF로 반환해야 한다.

· 세포는 해동후 대략 10 내지 15분 이내에 CTRC 간호사에 의해 냉각 상태로 대상체에게 주입된다. 형질감염된 T 세포(대략 100mL의 용적)는 삼방 활전(3-way stopcock)으로 설정된 18게이지 라텍스 비함유 Y형 혈액을 통해 신속하게 정맥내 주입된다. 약품 주입은 중력 투입에 의한다. 중력에 의한 주입 속도가 너무 느린 경우, 형질감염된 T 세포 약물 생성물은 활전을 통해 50mL 시린지 내로 해동되어 요구된 속도로 수동 주입될 수 있다. 백에는 잔류된 동결 응집물이 없어야 한다.

· 주입 전에, 2명의 개인은 대상체의 존재하에 각 백 중의 라벨에 정보를 독립적으로 확인하고, 당해 정보가 참가자와 정확하게 일치한다는 것을 확인한다.

· 환자는 형질감염된 T 세포의 주입 동안 및 주입 후에 모니터링된다. 혈압, 심박수, 호흡수 및 펄스 산소농도는 투약 직전 및 주입 완료후 2시간 동안 15분마다 수득되어 기록된다. 크래시 카트는 응급 상황을 위해 이용가능해야 한다.

· 어떠한 증상도 발생하지 않고 환자의 바이탈 징후가 주입후 3시간 동안 정상으로 유지되는 경우, 환자는 어떠한 증상이 발생하면 병원으로 돌아오라는 지시와 함께 귀가시킨다. 바이탈 징후 측정이 안정하지 않으면, 환자의 바이탈 징후가 안정화되거나 의사가 환자를 해방할 때까지 대략 15분마다 계속 수득되어야 한다. 대상체는, 그 또는 그녀가 그렇게 하는 것이 안전하다고 의사가 생각할 때까지 떠나지 않을 것이 요구된다.

· 형질도입된 CAR T 세포 투약의 완료후 60분 이내(±5분)에, 혈액 샘?은 형질도입된 CIRT 세포 수의 기준선 측정을 위해 수득된다.

· 대상체는 혈액 시험 및 추적 조사 검사를 위해 24시간 이내에 CTRC로 돌아와야 한다고 지시받는다.

어떠한 특정 이론에 구속되는 것을 원하지 않지만, 제안된 연구는 몇몇 이유로 치명적 위험을 최소화해야 한다고 생각된다: 1) 주입전 림프구 고갈 섭생은 이용되지 않고; 2) T 세포 형질도입은 레트로바이러스가 아니라 mRNA로 발생하고, 이에 의해 수일까지 이들 세포의 지속성을 감소시키고; 3) 메소텔린은 심막, 흉막 및 복막강에서 장막 표면으로 자연 발현을 제한했다. 유체 축적을 유도하는 메소텔린 교차 반응 및 염증 과정의 경우에, 이들 강은 항-림프구 치료가 개시됨(스테로이드)에 따라 유체를 제거하기 위해 최소 침략적 방식으로 신속하게 및 용이하게 접근할 수 있다.

이는 신규 분자 속성의 최소 인간 임상 시험이지만, 기타 상 I 시험은 유사한 CAR T 세포로 수행했다. NOD/SCID/c-/- 마우스 종양 이종이식편에서 CAR T 세포의 약리학적 유효 용량(PED)은 1×10⁷ CAR T 세포/마우스이다. 이러한 용량에서, 마우스 중의 일부는 이종이식 이식편 대 숙주 질환을 발달한다.

코호트 1 환자(n = 3)은 0일에 항-메소 RNA CAR T 세포에 의한 평탄한 투약을 사용한 1×10⁸의 단일 주입 및 7일에 1×10⁹ RNA CAR T 세포의 1회 주입을 제공하고, 단 환자는 7일 주입 전에 프로토콜-명시된 안전성 평가를 만족한다.

코호트 2 대상체(n = 6)는 주입 독성을 평가하기 위해 1주간 분리된 변형된 CAR T 세포의 2사이클을 제공한다. 하나의 사이클은 매 상이한 날(월요일, 수요일, 금요일)에 3회 주입으로 구성된다. 사이클 1은 MWF(0일, 2일, 4일)에 투약된 1×10⁸ CAR T 세포의 3회 용량으로 구성되고, 안전성 평가를 통과한 후, 사이클 2는 MWF(14일, 16일, 18일)에 투약된 1×10⁹ CAR T 세포의 3회 용량으로 구성된다. 예측하지 못한 상황이 계획된 바와 같이 14일에 개시로부터 주입할 수 없는 경우, 코호트 2의 사이클 2는 21일까지 연기할 수 있다. 21일 내지 35일은 또한 이에 따라 재조정된다. 2개월, 3개월, 4개월은 동일하다.

코호트 1 상의 대상체는, 이들이 모든 포함/제외 기준을 충족시키는 경우, 이들의 모니터링 기간(최종 주입후 3개월)의 말기에 호코트 2에 등록될 수 있다. 환자 등록은, 이전 환자가 안전성 평가를 완료할 때까지 새로운 환자가 치료되지 않도록, 당해 코호트에서 시차를 둘 수 있다. 대상체 캠은, 후속 환자의 치료 전에, 코호트 1의 경우에 7일 독성 관찰 기간(14일) 및 코호트 2의 경우에 10일 독성 관찰 기간(28일)에 계속하여, 처리 사이클 둘 다를 완성하는 각각의 대상체에서 순차로 등록될 수 있다.

DLT의 경우, 용량은 10배까지 점차 감소될 수 있다. 따라서, 독성이 10⁸ CART T 세포에서 사이클 1 동안 발생하는 경우, 모든 주입(용량 1 내지 6)은 10⁷ CIR로 감소될 수 있다. 10⁷ CART T 세포에서 관리 불가능한 독성의 경우에, 시험은 중단될 것이다.

주입당 표적 용량은 제1 사이클의 경우에 1×10⁸ ±20% 세포(코호트 1의 경우에 1회 용량 및 코호트 2의 경우에 3회 용량) 및 제2 사이클의 경우에 1×10⁹ ±20% 세포(코호트 1의 경우에 1회 용량 및 코호트 2의 경우에 3회 용량)이다. 최소 허용되는 용량은 1×10⁸이다. 전체 세포 확장이 전체 허용되는 세포 용량보다 낮은 경우, 환자는 보다 많은 세포를 확장하고 전체 표적 용량을 충족시키기 위해 제2 아페레시스를 받을 수 있다. 제2 아페레시스에 대한 금기가 있거나 제2 아페레시스 및 확장이 최소 허용되는 용량을 생성하지 못하는 경우, 용량은 제조 불량으로 간주될 것이다.

실시예 4: RNA-조작된 CAR T 세포의 예외적 사용

이 프로토콜은 메소텔린에 특이적인 RNA CART T 세포의 IV 주사를 시험하기 위해 설계되었다. IV ROA에 의한 9회 이하의 계획된 주사의 내성을 측정한 후, 대상체는 RNA CAR T 세포×2의 IT 투여를 제공받는다. IV 및 IT RNA CART T 세포의 사이클은 진행성 질환의 부재하에 약 6 내지 8주 간격으로 허용되는 바와 같이 반복된다. 이 환자로부터의 결과는 개념 프로토콜의 완전 개발된 상 I 증거의 후속적 발달을 안내한다.

암 치료를 위한 CAR T 세포의 개발에 있어서 주요 문제는 치료학적 범위의 안전성, 이 경우에 잠재적 항종양 효과와 에메소텔린의 표적화에 의해 발생할 수 있는 장막염의 균형을 결정하는 것이다. RNA CAR T 세포는 이러한 목적으로 개발되었고, 따라서 항종양 효과는 임상전 2 강건한 임상전 모델에서 관찰될 수 있다. 독성 관리 계획은, 독성의 경우에, RNA CAR T 세포가 CAR T 세포 주사의 중단후 2 내지 3일 내에 급속하게 소실된다는 사실에 의해 유도된다. 이러한 예외적 사용의 파이럿 연구는 전이성 췌장암을 갖는 환자에서 메소텔린 특이적 T 세포의 안전성, 내성 및 생착 가능성을 결정한다. IT 및 IV 투여 경로의 안전성 및 실행가능성은 이 프로토콜에서 확인된다. 일반적 프로토콜 도식은 도 21에 제시되어 있다.

당해 연구는 1) 스크리닝 상, 2) 이어서 사혈/아페레시스, T 세포의 주입 및 주사, 종양 생검으로 구성되는 대략 8주 개입/치료 상, 및 3) 휴식 및 추적 조사로 구성된다. 세포의 반복 사이클은 평가가 안정한 질환 또는 보다 양호한 것을 갖는 경우에 대상체에 제공된다.

아페레시스/사혈(phlebotomy)

환자 또는 한쌍의 기증자는 당해 과정 전에 표준 백혈구반출 스크리닝을 가질 것이다. IT T 세포의 경우, 100ml 사혈은 제조를 위한 충분한 림프구 제공할 수 있다. 7 내지 12L 아페레시스는 대략 1×10⁹ T 세포 이상을 수집하기 위해 T 세포의 IV 용량에 요구될 수 있다. 불량한 정맥 접근을 갖는 대상체는 아페레시스 사용을 위해 일시 카테터 배치를 가질 수 있다. 이러한 카테터는 아페레시스 전에 삽입되고, 아페레시스 공정이 완료되면 제거된다. 주변 샘플은 기준선 면역분석을 위해 취해진다. FDA 룩-백 요건 및 연구를 위한 기준선 혈액 백혈구도 또한 수득되어 동결보존된다.

주사전 평가

연구 약제의 투약전의 주에서, 환자는 간격사 및 신체 검사, 병용약 검사, ECOG 성능 상태 및 AE 스크리닝을 갖는다. 다음은 투약전 2주 이내에 수행되어야 한다: EKG 및 CXR(장막염에 대한 기준선 스크리닝), CBC, 화학적 (LFT), CEA 및 CA-19-9.

연구 약물의 제조 및 투여

T 세포는 임상 세포 및 백신 제조 설비(Clinical Cell and Vaccine Production Facility, CVPF)에서 제조되고, 주입된 세포에 대한 FDA 명시된 방출 기준(예: 세포 순도, 멸균성, 발열 등)이 충족될 때까지 방출되지 않는다.

임상 및 번역 연구 센터(CTRC)에서의 IV 투여

투여에 적절한 1 또는 2개 백 중의 T 세포는 CTRC에서 환자의 침상으로 냉각 팩(신선한 경우) 및 드라이 아이스(동결보존된 경우)로 수송된다. 세포는 삼방 활전(3-way stopcock)으로 설정된 18게이지 라텍스 비함유 Y형 혈액을 통해 1분당 대략 10 내지 20ml의 유속으로 급손 정맥 주사에 의해 제공된다. 당해 백은 세포가 해동될 때까지 부드럽게 마사지한다. 용기 내에 잔류된 동결 응집물이 없어야 한다. 주입 기간은 대략 15분이다. 각각의 주입 백에는 하기를 함유하는 라벨이 부착된다: "자가/동계에만 사용해 주십시오". 또한, 라벨은 적어도 2개의 독특한 식별자, 예를 들면, 환자의 이니셜, 생년월일 및 연구 번호를 갖는다. 주입 전에, 2명의 개인은 환자의 존재하에 모든 이러한 정보을 독립적으로 확인하고, 당해 정보가 참가자와 정확하게 일치하는 것은 확인한다. T 세포 생성물이 손상된 또는 누출 백을 갖거나 다른 위험이 있는 것으로 보이면, 주입하지 않아야 한다.

응급 의료 장비(즉, 응급 트롤리)는, 환자가 알러지 반응, 또는 심각한 저혈압 위험 또는 주입에 대한 기타 임의의 반응을 갖는 경우에 주입 동안 이용가능하다. 바이탈 징후(온도, 호흡수, 펄스 및 혈압)는 주입 전후에 취하고, 이어서 적어도 1시간 동안 15분마다 및 이들 징후가 만족하여 안정해질 때까지 취한다. 상세는 다음과 같다:

· 병용약은 검사한다.

· T 세포는 임상 세포 및 백신 생산 설비(CVPF)로부터 환자의 침상으로 냉동 팩으로 수송한다.

· 주입은 CTRC에서 실시한다.

· 동결된 경우, 자가 T 세포는 환자-대상체 침상에서 37℃ 수욕에서 해동한다. 세포는 해동후 대략 10 내지 40분 이내에 주입한다. T 세포(동결보존된 경우에 약 50 내지 100mL 용적 및 신선한 경우에 100 내지 300mL 용적)는 삼방 활전(3-way stopcock)으로 설정된 18게이지 또는 라텍스 비함유 Y형 혈액을 통해 대략 10mL/분의 속도로 정맥내 주입한다. 약품 주입은 중력 투입에 의한다. 중력에 의한 주입 속도가 너무 느린 경우, 자가 T 세포 약물 생성물은 활전을 통해 50mL 시린지로 뽑아내어 요구된 속도로 수동 주입한다.

· 혈압, 심박수, 호흡수 및 펄스 산소측정을 수득하고, 투약 직전 및 주입 개시후 2시간 동안 15분마다 기록한다. 크리시 카트는 응급 상황에 이용가능해야 한다.

· T 세포의 투약 완료후 15분(±5분) 이내에, 혈액 샘플은 주입된 T 세포의 수의 기준선 측정을 위해 수득한다.

· 어떠한 증상도 발생하지 않고 환자-대상체의 바이탈 징후가 주입후 1시간 동안 정상으로 유지되는 경우, 환자-대상체는 퇴원시킨다. 바이탈 징후 측정이 안정하지 않으면, 환자-대상체의 바이탈 징후가 안정화되거나 의사가 환자를 해방할 때까지 대략 15분마다 계속 수득되어야 한다.

· 환자는 초기 주입후 밤새 관찰을 위해 입원시킨다. 주입은 격일 M-W-F 기준으로 제공되고, 내성이 측정되면, 대상체는, 가능한 경우, 외래로 주입되며, 환자를 혈액 시험 및 SOE에 따르는 추적 조사을 위해 24시간 이내에 돌아오도록 지시받는다.

예비투약

T 세포 주입 후의 부작용은 일시적의 발열, 오한, 피로 및/또는 구토를 포함한다. 주입 전에, 대상체는 입에 의해 아세트아미노펜 650mg 및 T 세포의 주입 전에 입 또는 IV에 의해 디펜하이드라민 하이드로클로라이드 25 내지 50mg으로 예비 투약하도록 권장된다. 이들 투약은 필요에 따라 6시간마다 반복할 수 있다. 비-스테로이드 소염 투약의 과정은, 환자가 발열을 계속 갖거나 아세트아미노펜에 의해 완화되지 않는 경우에 처방될 수 있다. 환자는, 이들이 T 세포에 대해 부작용을 가질 수 있기 때문에, 생명 위협 응급상황을 제외하고, 언제라도 하이드로코르티손, 프레드니손, 프레드니솔론(SoluMedrol) 또는 덱사메타손(Decadron) 등의 전신 코르티코스테로이드을 제공받지 않는 것이 권장된다. 코리티코스테로이드가 급성 주입 반응에 요구되는 경우, 하이드로코르티손 100mg의 초기 용량이 권장된다. IT 주사의 경우, 환자는 주사 통증을 위한 마취제를 제외하고는 예비 투약을 통상 제공하지 않는다.

IV T 세포 주사

제제 주사의 연구 전에, 환자는 검사된 ECOG 성능 상태, AE 스트리닝, CBC 및 LFT를 가질 것이다. 당해 목적은 T 세포를 3주 동안 1주 3회(즉, MWF) 투여하는 것이다. 예를 들면, 개재 합병증 또는 휴일은 스케쥴을 변화시킬 수 있고, 계획된 주입은 허용된 바와 같이 주당 3회 주사의 목적으로 prn 조정될 수 있다.

대상체는 격리실에서 주입물을 제공받는다. 세포는 환자의 침상에서 해동된다. 해동된 세포는 각각의 주입 기간이 대략 10 내지 15분으로 되도록 허용된 바와 같이 신속하게 주입 속도록 제공된다. 혼합을 촉진시키기 위해, 세포는 Y-어댑터를 사용하여 동시에 투여될 것이다. 기준선 T 세포 수준의 측정을 위한 혈액 샘플은 주입전 및 주입후 20분에서 수득된다. 환자는 주입되고, 필요에 따라 예비투약할 수 있다. 환자의 바이탈 징후를 평가하고, 펄스 산소측정은 투약 전에, 주입 말기에 및 그후 1시간 동안 15분마다 및 이들이 안정해질 때까지 수행한다. 환자는 1차 주입후에 밤새 입원시킨다. 이후의 주입은 허용되는 바와 같이 외래 기준으로 투여된다. 환자-대상체는 혈액 시험 및 추적 조사를 위해 24시간 내에 HUP 사무소로 돌아오도록 지시받는다.

T 세포 주입의 지연을 보장하는 특정한 독성은 1) 폐: 95% 초가의 포화도를 유지하기 위한 산소 보충, 또는 진행성인 흉부 X선으로 촬영 이상의 존재에 대한 요건; 2) 심장: 의학적 관리로 제어되지 않는 새로운 심장 부정맥; 3) 승압 지지를 필요로 하는 저혈압; 4) 활성 감염: T 세포 주입 48시간 이내에 박테리아, 진균 또는 바이러스에 대한 양성 혈액 배양물.

연구 제제 주입 후, 혈액은 사이토킨에 대한 주사/주입 및 유동 세포계수 후에 약 20분에서 수득되어야 한다. 혈청은 사이토킨의 측정을 위해 수득된다.

간섭 방사선(IT 주사) T 세포 주사 및 종양 생검

T 세포는 침략적 방사선에 의해 권장된 바와 같이 초음파 가이드라인 또는 기타 이미지화를 사용하여 종애 병변 내로 주사된다. 환자는 항불안약(즉, 아티반)을 예비 투약하거나, 의식 진정하에 주사될 수 있다. 환자는 국소 마취를 위한 절차 적어도 30분 전에 주사 부위에 적용된 2.5 내지 5.0g의 리도카인/프리로카인 크림(EMLA)을 가질 수 있다. 주사되는 피부 부분은 베타딘으로 세정하고, 이어서 보다 많은 리도카인(1%)를 피부, 피하 조직, 및 T 세포로 침윤된 종양 및 종양 주변 부분에 주사하여, 종양 가장자리로부터 중심 부분으로 주사를 시도한다.

CAR T 세포 주사 전에, 16Ga 바늘을 사용한 코어 바늘 생검은 메소텔린 발현을 위한 기준선 및 2차 종점에 수록된 기타 파라미터로서 사용하기 위해 수득된다. 말초혈은 사이토킨의 주사 및 유동 세포계수 후에 수득되어야 한다.

종양 반응 평가는 복부 이미지화(PET/CT, CT 또는 MRI)에 의해 +4 및 +8주에서 개시하고, 이어서 T 세포 주입 후 2년 동안 표준 치료 및 관행에 따라 2개월마다 또는 환자가 질환에 대한 대체 치료를 필요로 할 때까지 이루어진다. T 세포의 전이 활성은, T 세포에 의해 유발된 염증으로부터 종양 전이 활성을 해석하는 것이 곤란하기 때문에, PET 스캔의 해석을 불명료하게 할 것으로 예상된다.

추가 T 세포 치료

진행성 질환의 부재하에, IT 및 IV T 세포 주입은 지속된 6 내지 8주 사이클로 제공될 수 있다. CAR T 세포에 대한 체액성 면역 반응의 경우에, T 세포의 전신(IV) 주사는 지속되지 않을 것이다. 그러나, 질환 진행의 부재하에, 환자는 허용되는 바와 같이 활성 질환 부위에 매월 IT T 세포 주사를 계속 제공받을 수 있다.

대상체는 T 세포 주입후 3 및 6개월에 돌아올 것이다. 이들 연구 방문에서, 환자는 하기 시험을 받을 것이다: 신체 검사, 유해 사상의 기록 및 혈액학을 위한 혈액 채취, 화학, 뇨검사, CA-19-9 및 연구실.

실시예 5: GD2 지시된 RNA CAR

GD2는 신경아세포종 및 흑색종을 포함하여 신경외배엽 기원의 종양 상에서 발현된 디시알로강글리오사이드이다. GD2의 종양 특이성은 RNA CAR을 발현하는 유전자 변형된 CTL을 표적화하기 위한 이의 사용을 가능하게 한다. 본원에 제공된 데이타는 GD2 scFv(scFv가 GD2에 결합하는 경우)를 포함하는 CAR을 인코딩하는 IVT RNA로 전기천공된 CTL이 GD2 발현 종양을 효과적으로 검출하고 치료한다는 것을 입증한다.

pGEM-64A 벡터는 IVT GD2-BBZ 벡터를 작제하는데 사용되었다. 중첩 PCR은, GD2 scFv를 제공하는 GD2-제타 CAR 및 IgG 힌지, 및 4-1BB-제타를 제공하는 PD-A.cMet.OF.8TMBBZ를 포함하는 렌티바이러스 벡터를 사용하여, pGEM-GD2-8TMBBZ, pGEM-GD2-28TMBBZ 및 pGEM-GD2-ZTMBBZ을 생성하기 위해 사용했다(도 21). 각각의 막통과는 PCR 프라이머에 의해 도입했다. 이들 벡터로 생산된 IVT RNA는 각각 GD2 scFv 항원 결합 도메인, 및 4-1BB 및 CD3-제타 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 추가로, 3개의 상이한 벡터가 생산되었고, 각각은 막통과 도메인의 속성이 상이하다. 이와 같이, GD2 RNA CAR은 CD8 막통과 도메인, CD28 막통과 도메인 또는 CD3-제타 막통과 도메인 중의 하나를 포함했다.

GD2-8TMBBZ RNA((CD8 막통과 도메인 함유)는 서열번호 10을 포함하는 뉴클레오티드 서열로부터 전사된다. GD2-28TMBBZ(CD28 막통과 영역 함유)는 서열번호 11을 포함하는 뉴클레오티드 서열로부터 전사된다. GD2-ZTMBBZ(CD3-제타 막통과 도메인 함유)는 서열번호 12를 포함하는 뉴클레오티드 서열로부터 전사된다.

유동 세포계수는 전기천공후 1일에서 다양한 GD2 CAR 조성물의 표면 발현을 측정하기 위해 사용했다. 도 22에 제시된 바와 같이, GD2-8TMBBZ 및 GD2-28TMBBZ는 전기천공된 세포 상에서 고도로 발현되었다.

GD2 RNA CAR T 세포의 기능을 검사하기 위해, CD107a 분석을 천기천공된 T 세포 상에서 수행했다. T 세포는 지시된 바와 같이 상이한 GD2 CAR RNA로 전기천공하고(대조군으로 CD19 CAR 사용), GD2 양성 종양주(SY5Y) 또는 음성 대조군(NLFwt) 중의 하나와 공배양했다. CD107a 상향조절은 본원의 다른 부분에 기재된 바와 같이 4시간 배양 분석으로 유동 세포계수에 의해 검출했다. 도 23은 표적 인식을 나타내는 GD2 RNA CAR 전기천공된 세포에서 CD107a의 상향조절을 입증한다.

또한, 전기천공된 T 세포는 다양한 종양 세포주와의 공배양 후에 IFN-감마 분비에 대해 평가했다. 지시된 바와 같이 상이한 GD2 CAR RNA로 전기천공된 T 세포(대조군으로 CD19 CAR 사용)는 GD2 양성 종양주(SY5Y) 및 음성 대조군(NLFwt)와 공배양했다. 상청액은 공배양후 24시간에서 회수하고, IFN-감마 분비의 검출에 대해 ELISA 분석으로 처리했다. 도 24는, CD19 CAR로 전기천공된 세포 또는 전기천공되지 않은 세포가 아닌, GD2 RNA CAR 전기천공된 세포가 GD2 발현 종양과의 배양후에 IFN-감마를 분비했음을 설명한다.

GD2-8TMBBZ 작제물 내에 존재하는 내부 개방 판독 프레임(ORF)를 제거하기 위해, 중첩 PCR을 사용하여 pD-A.GD2.OF.8TMBBZ을 생성했다. pGEM-GD2-8TMBBZ은 주형으로 사용했고, PCR 생성물은 pD-A.19OF.2bgUTR.150A로부터 PD-벡터 내로 서브클로닝했다. 2개의 내부 ORF는 CAR ORF의 변화를 생성하지 않고서 ATG 코돈의 PCR 돌연변이유발에 의해 제거했다(도 25). 내부 개방 판독 프레임 비함유 GD2.OF.8TMBBZ는 서열번호 13을 포함하는 뉴클레오티드 서열로부터 전사된다.

생체내에서 GD2 발현 종양을 치료하기 위한 GD2 RNA CAR의 효과를 평가하기 위해, 루시퍼라제를 발현하도록 변형된 SY5Y 신경아세포종 세포를 주사한 마우스를 사용하여 동물 연구를 수행했다. T 세포는 pD-A.GD2.OF.8TMBBZ.2bg.150A로 제조한 RNA로 전기천공했다. 이 벡터는 인간 β-글로불린 및 150 A 염기를 포함하는 폴리(A) 테일로부터 유래된 3' UTR의 2개 반복체를 포함한다. pD-A.GD2.OF.8TMBBZ.2bg.150A 벡터는 서열번호 26을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 도 26은 종양이 전기천공된 T 세포(5M RNA T 세포)의 1차 투여전 8일에 주사된 연구 시간 라인을 도시한다. 전기천공된 T 세포의 후속 용량은 14일(14M RNA T 세포) 및 16일(16M RNA T 세포)에 정맥내로 제공했다. 생물발광 이미지화(BLI)는 제시된 바와 같이 연구의 시간 과정 전체에 걸쳐 수행했다.

종양 주사된 마우스에서 GD2 발현 신경아세포종의 양의 정량화는 도 27에 제시되어 있다. GD2 CAR RNA로 전기천공된 T 세포가 주사된 마우스는, CD19 CAR RNA로 전기천공된 것들 및 PBS 단독으로 처리된 것들과 비교하여, 감소된 종양 부하를 입증했다. 도 28은 GD2 RNA CAR 및 CD19 RNA CAR로 처리된 마우스에서 종양 세포의 열 맵을 제공하고, 이는 GD2 RNA CAR 처리된 동물에서 감소된 종양을 입증한다.

실시예 6: cMet 지시된 RNA CAR

cMet는 비소세포암(NSCLC), 위암, 난소암, 췌장암, 갑상선암, 유방암, 두경부암, 대장암, 신장암을 포함하는 다양한 유형의 암에서 발견되는 수용체 티로신 키나제이다. 따라서, 본원에 제시된 바와 같이, cMet을 표적화하는 IVT RNA CAR를 개발하는 능력은 다양한 형태의 암을 치료하는데 유용하다고 입증될 것이다.

다양한 종양주 상에서의 cMet 발현을 먼저 시험했다. 상이한 세포주의 cMet 발현은 항-cMet 항체(항-인간 HGF R/c-MET 플루오레세인 MAb, R&D System)를 사용하여 유동 세포계수에 의해 검출했다. 도 29에 제시된 바와 같이, K562-cMet, L55, SK-OV3 및 OV79 종양 세포주는 모두 cMet를 어느 정도 발현시키고, 따라서 cMet RNA CAR 기능적 활성을 시험하는 실험에 사용할 수 있다.

초기 스크리닝 시험에 기초하여, 상이한 막통과(TM) 영역(CD8, CD28 또는 4-1BB로부터 TM 영역)을 갖고 내부 ORF를 함유하지 않는(cMet.OF) cMet.BBZ CAR(도 30)은 중첩 PCR에 의해 생성하고, pD-A.19OF.BBZ.2bgUTR.150A의 CD19.OF.BBZ를 cMet.OF.BBZ로 대체하여 pDrive 기반 벡터에 서브클로닝했다. 여기에서 작제되고 시험된 cMet RNACAR는 다음과 같다: cMet.OF.8TM.BBZ, cMet.OF.28TMBBZ, cMet.OF.BBTMBBZ, cMet.28TM28BBZ 및 cMet.28Z. 따라서, 본원에 기재된 작제물은 모두 cMet 표적화된 scFv 항원 결합 도메인, 및 CD28, 4-1BB 및 CD3-ζ 세포내 도메인 중의 적어도 하나를 함유한다. cMet.OF.8TMBBZ는 서열번호 14를 포함하는 뉴클레오티드 서열로부터 전사된다. cMet.OF.28TMBBZ는 서열번호 15를 포함하는 뉴클레오티드 서열로부터 전사된다. cMet.OF.BBTMBBZ는 서열번호 16을 포함하는 뉴클레오티드 서열로부터 전사된다. cMet.28TM28BBZ는 서열번호 17을 포함하는 뉴클레오티드 서열로부터 전사된다. cMet.28Z는 서열번호 18을 포함하는 뉴클레오티드 서열로부터 전사된다.

다양한 형태의 cMET RNA CAR의 기능은 CD107a 분석으로 평가했다. 도 31에 나타낸 바와 같이, 상이한 cMet CAR RNA로 전기천공된 T 세포(대조군으로 CD19 CAR, CD19.OF BBZ 사용)는 cMet 양성 종양주, L55 및 SL-OV3 및 음성 대조군 K562-CD19와 공배양했다. CD107a 상향조절은 4시간 배양 분석(도 31A)에서 유동 세포계수에 의해 검출했다. 도 31B는 전기천공후 24시간에서 CAR 발현 수준을 나타낸다.

cMet RNA CAR 전기천공된 T 세포에 의한 IFN-γ 생산 및 분비는 또한 다양한 세포주와 공배양한후 시험했다. 도 32(대조군으로 CD19 CAR, 19BBZ 사용)에 나타낸 바와 같이, 상이한 cMet CAR RNA로 전기천공된 T 세포를 cMet 양성 종양주 L55 및 SL-OV3 및 음성 대조군 K562-CD19와 공배양했다. 상청액을 공배양후 24시간에 수거하고, IFN-γ 분비(도 32A)에 대한 ELISA 분석에 적용했다. 도입유전자의 발현과 기능 모두에 기초하여, cMet CAR RNA 전기천공된 T 세포, pD-A.cMet.OF.8TMBBZ.2bgUTR.150A(도 32B에 도시된 작제물)는 동물 실험 및 잠재적 임상 시험을 위해 선택했다. 이 벡터는 인간 β-글로불린 및 150 A 염기를 포함하는 폴리(A) 테일로부터 유도된 3' UTR의 2개 반복체를 포함한다. pD-A.cMet.OF.8TMBBZ.2bgUTR.150A 벡터는 서열번호 27를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. cMet.OF.8TMBBZ CAR는 서열번호 14를 포함하는 뉴클레오티드 서열로부터 전사되고, cMet scFv 항원 결합 도메인, CD8 막통과 영역, 4-1BB 세포내 신호 전달 도메인 및 CD3-ζ 신호전달 도메인을 포함한다.

다음 세트의 실험을 위해, cMet.OF.8TMBBZ가 cMET RNA CAR로 사용되었다. 추가 흑색종 종양 세포주는 이들의 cMet 표면 발현에 대해 평가했다(도 33). 세포는 PE 접합된 항-cMet Ab 또는 동종형 IgG Ab로 염색했고, 이는 SK-OV3, 888mel, 624mel 및 526mel 세포주 모두가 cMet를 발현시켰지만 K562 균주는 발현시키지 않았음을 나타냈다.

cMet.OF.8TMBBZ RNA CAR의 CAR 발현은 유동 세포계수에 의해 평가했다. 10일 자극된 T 세포를 CD19 CAR RNA 또는 cMet CAR RNA으로 전기천공하거나 전기천공하지 않았다(EP 없음). 밤새 배양 후, CD19 CAR 또는 cMet CAR 발현은 유동 세포계수로 검출하고, 이는 cMet.OF.8TMBBZ로 전기천공된 T 세포가 실질적인 CAR 발현을 갖고 있다는 것을 나타냈다(도 34).

이어서, CD107a의 분석을 수행하여 다양한 종양 세포주와 공배양할 때에 cMet.OF.8TMBBZ RNA CAR의 기능적 활성을 검사했다. RNA 전기천공된 T 세포를, CD19 + Nalm6, cMet + SK-OV3 및 cMet + 흑색종 균주(888mel, 624mel 및 526mel)를 포함한 종양 세포주로 자극했다. K562는 CD19-대조군 및 cMet-대조군으로 사용했다. 4시간 자극 후, CD107a 발현은 유동 세포계수에 의해 모니터했다. 세포는 CD8+ 게이팅되었다. 도 35에 제시된 바와 같이, CD107a는 cMet + 종양 세포주와 공배양된 cMet RNA CAR 전기천공된 T 세포의 모든 조건에서 상향조절되었다.

다양한 종양주와 공배양된 cMet RNA CAR 전기천공된 T 세포에 의한 IFN-γ 생산 및 분비를 평가했다. cMet.OF.8TMBBZ CAR RNA 전기천공된 T 세포는 CD19 + Nalm6, cMet + SK-OV3 및 cMet + 흑색종 균주(888mel, 624mel 및 526mel)를 포함한 종양 세포주로 자극했다. K562는 CD19-대조군 및 cMet-대조군으로 사용했다. 24시간 자극 후, IFN-γ 생산은 ELISA에 의해 분석했다. 도 36에 제시된 바와 같이, IFN-γ 분비는 cMet + 종양 세포주와 공배양된 cMet RNA CAR 전기천공된 T 세포의 모든 조건에서 증가된다.

이어서, 생체내에서 cMet + 종양을 cMet RNA CAR로 치료하는 효과를 평가하기 위해 동물 실험을 계획하고 수행했다. 도 37은 SKOV3-Luc 종양 세포가 0일차에 피하 이식되고, cMet.OF.8TMBBZ CAR RNA 전기천공된 T 세포가 7, 9 및 11주에 종양내 투여된 연구 계획을 제공한다. 또한, 동물은 각 T 세포 투여전 24시간에서 사이톡산으로 처리했다.

전체 유량 변화의 배율로 측정된 종양 부하의 정량화는 도 38에 제시되어 있다. 이는, 종양 부하가 cMet RNA CAR + 사이톡산으로 처리된 마우스에서 감소된다는 것을 나타낸다. 이 데이타는 cMet로 표적화된 RNA CAR가 cMet + 종양을 치료하는데 효과적임을 입증한다.

실시예 7: RNA CAR 및 사이톡산의 병용 치료

RNA CAR를 사용하는 복수 동물의 종양 치료 실험에 기초하여, 수일 처리 후, 렌티-CD19z 및 CD19 RNA T 세포는 모두 유사한 치료 효과를 나타낸 것으로 밝혀졌다. CD19 RNA CAR T 세포가 대조군 T 세포, 또는 생리 식염수로 처리한 마우스(1-2 Log 낮은 BLI)보다 훨씬 낮은 종양 부하를 나타내는 반면, 이들은 CD19 CAR을 인코딩하는 렌티바이러스(도 39)와 같이 효과적으로 종양을 제거하지 않는다. 추가의 T 세포 주사(두 번째 및 세 번째)는, 지속적인 종양 억제(도 39)를 나타내는 렌티-CD19Z T 세포 처리한 마우스와 비교하여, 임의의 추가 치료 잇점을 부가하는 것으로 나타나지 않는다. 복수의 T 세포 주입의 치료 효과는 단일 용량 T 세포 주입을 사용하는 이전 실험에 필적하고, 이는 관찰된 재주입 T 세포의 치료 효과의 부족이 제1 T 세포 주입으로부터 확장된 기존의 비기능성 T 세포에서 기인할 수 있음을 나타낸다. 본원에 제시된 바와 같이, 새로운 T 세포 주사 이전에 이들 비기능성 T 세포를 제거하는 것이 RNA CAR T 세포의 다수 주사의 치료를 향상시키는지의 여부를 검사한다.

초기 실험을 위해, T 세포를 CD19-Z, CD19-BBZ, CD19-28z 및 CD19-28BBz 중의 하나로 전기천공시켰다. SS1-BBz로 전기천공된 T 세포를 대조군으로 사용했다. CD19-z는 서열번호 19를 포함하는 뉴클레오티드 서열로부터 전사된다. CD19-BBZ는 서열번호 7을 포함하는 뉴클레오티드 서열로부터 전사된다. CD19-28z는 서열번호20을 포함하는 뉴클레오티드 서열로부터 전사된다. CD19-28BBz는 서열번호 21을 포함하는 뉴클레오티드 서열로부터 전사된다.

NSG 마우스에 NalM-6-Luc 주사후 5일에서, 10⁷ RNA 전기천공된 T 세포를 주입했다(정맥내). 제1 T 세포 주사후 7일에서, 화학치료제(사이톡산; CYTX, 80mg/kg)을 기존의 T를 제거하기 위해 투여했다(복강내). 화학치료 1일 후, 10⁷ T 세포의 제2 주사를 투여했다. 사이톡산(CYTX, 50mg/kg의)을 제3 및 제4 T 세포 주사 1일 전에 투여했다. 생리 식염수 또는 생리 식염수 + 화학치료제로 처리한 마우스를 대조군으로 사용했다. 마우스를 이미지화하고, 종양 및 T 세포 부하를 모니터링하기 위해 매주 채혈했다. 도 40은 CYTX 화학요법 치료가 CD19 지시된 RNA CAR의 반복 주입에 의해 매개된 종양 고갈을 증강시킨다는 것을 입증한다. 도 41은 다양한 처리 그룹에서 동물의 전체 생존을 나타내고, 이는 이전 주입의 사이톡산 기초 고갈과 조합할 때에 RNA CAR T 세포의 반복 주입만이 생존을 연장한다는 것을 보여준다.

다음 세트의 실험에서, 5일 원발성 백혈병-CBG/NSG 마우스를 사용했다. 클릭 딱정벌레 그린(CBG) 유전자를 발현하도록 변형된 원발성 백혈병 세포주로부터 세포 투여후 5일에서 10⁷ RNA 전기천공된 T 세포를 주사했다(정맥내). 제1 T 세포 주사후 7일에서, 화학치료제(사이톡산, 60mg/kg)를 기존의 T 세포를 제거하기 위해 투여했다(복강내). 화학치료 1일 후, 10⁷ T 세포의 제2 주사를 투여했다. 사이톡산을 제3 T 세포 주사 1일 전에 투여했다. 마우스를 이미지화하고, 종양 및 T 세포 부하를 모니터링하기 위해 매주 채혈했다. 다음 처리 그룹을 사용했다: 렌티바이러스 벡터.19.28BBZ, IVT RNA. 19.28BBZ CO(코돈 최적화된 CD19-28BBZ CAR DNA 서열), IVT RNA 19.28BBZ LL(CD28 디류신 모티프가 돌연변이되었다), IVT RNA 19.28BBZ wt(디류신 모티프를 갖는 CD28), 렌티바이러스 벡터 19BBZ, IVT RNA 19BBZ CO(코돈 최적화된 CD19-BBZ CAR DNA 서열), IVT RNA 19BBZ wt. 19.28 BBZ CO는 서열번호 22를 포함하는 뉴클레오티드 서열로부터 전사된다. 19.28BBZ LL은 서열번호 23을 포함하는 뉴클레오티드 서열로부터 전사된다. 19BBZ CO는 서열번호 24를 포함하는 뉴클레오티드 서열로부터 전사된다.

IVT RNA ss1BBZ로 전기천공된 T 세포를 대조군으로 사용했다. 다수의 T 세포 주사는 RNA 전기천공된 T 세포(렌티바이러스 형질도입된 T 세포 아님)로의 처리 그룹에서만 실시했다. 도 42는 첫 3주 연구 동안 종양 부하를 나타내고, 이는 사이톡산의 효과가 반복되고, 복수 용량의 RNA CAR이 사이톡산과 병용될 때에 종양 부하가 추가로 감소한다는 것을 나타낸다. 도 43은 처리된 동물의 생존율을 나타낸다.

도 44는 10일차, 즉 10⁷ CAR T 세포의 단일 주사후 5일에서 각 처리 그룹에서 동물의 열 맵을 나타내는 반면, 도 45는 21일차, 사이톡신 처리 및 10⁷ 세포의 제2 주사(제2 주사는 RNA CAR 그룹 단독)후 7일에서 각 처리 그룹에서 동물의 열 맵을 도시한다. 열 맵은 사이톡산과 복수 RNA CAR 주사의 병용 치료가 렌티바이러스 CAR 처리와 유사하게 종양 세포를 감소시킨다는 것을 입증한다.

다음 연구는 복수 주사로 투여된 T 세포의 양의 상이한 투여 전략을 시험했다. 7일 Nalm-6-Luc/NSG 마우스를 사용했다. 백혈병 세포 전달후 7일에서, RNA 전기천공된 T 세포를 상이한 용량으로 주사했다(정맥내). 제1 T 세포 주사후 7일에서, 화학치료제(사이톡산, 60mg/kg)을 기존의 T를 제거하기 위해 투여했다(복강내). 화학치료 1일 후, T 세포의 제2 주사를 투여했다. 사이톡산을 제3 T 세포 주사 1일 전에 투여했다. 마우스를 이미지화하고, 종양 및 T 세포 부하를 모니터링하기 위해 매주 채혈했다. 다음 처리 그룹을 사용했다: 렌티바이러스 벡터-CD19BBZ- 10e6/마우스; 모든 3개 주사에 대해 CD19BBZ RNA, 10e6/마우스; CD19BBZ RNA, 1차 주사 - 20e6/마우스, 2차 및 3차 - 10e6/마우스; CD19BBZ RNA, 1차 주사 - 20e6/마우스, 2차 및 3차 - 5e6/마우스; 모든 3개 주사에 대해 CD19BBZ RNA, 10e6/마우스 - 사이톡산 없음; CD19BBZ RNA, 1차 주사 - 20e6/마우스, 2차 및 3차 - 10e6/마우스 - 사이톡산 없음. ss1BBZ RNA로 전기천공된 T 세포 - 1차 주사: 20e6/마우스, 2차 및 3차 - 10e6/마우스를 대조군으로 사용했다. 도 46은 연구 첫 3주 동안 각 처리 그룹에서 동물의 종양 부하를 도시한다. 본원에 제시된 데이타는 사이톡산과 병용된 CD19-BBZ RNA CAR T 세포의 복수 주사를 제공받은 동물이 CD19-BBZ RNA CAR T 세포 단독을 복수 제공받은 것들보다 종양 부하가 덜했다는 것을 입증한다.

도 47은 연구 22일에서 각 처리 그룹에서 동물의 열 맵을 제공한다. 이는, 사이톡산에 의해 제공된 바와 같은 화학치료제가 RNA CAR의 복수 주사로 처리된 마우스에서 종양을 제거하는데 중요하다는 것을 알 수 있다. 도 48은 연구 시간 전반에 걸쳐 동물의 추가의 열 맵을 제공하고, 이는 사이톡산 치료와 병용될 때에 20-5-5 및 20-10-10 그룹에서 종양의 지속적인 감소를 나타낸다.

생존율은, 도 49 및 도 50에 도시된 바와 같이, 또한 사이톡산이 RNA CAR T 세포의 복수 주사에 의해 제공되는 치료를 증강시킨다는 것을 보여준다. 제공된 결과는 사이톡산 치료와 함께 고용량의 RNA CAR 섭생(20-5-5)이 백혈병 유도후 약 75일에서 약 40% 생존율을 유도하는 반면, 사이톡산을 포함하지 않는 모든 처리 그룹은 최후 65일까지 0% 생존율을 가졌다는 것을 보여준다. 본원에 제시된 데이타는 화학치료가 RNA CAR에 의해 제공되는 치료 및 종양 축소를 현저하게 증강시킨다는 것을 입증한다.

본원에 인용된 각각 및 모든 특허, 특허 출원 및 공보의 기술 내용은 전부 본원에 참조로 인용된다. 본 발명은 구체적 실시양태를 참조하여 기술되었지만, 본 발명의 기타 실시양태 및 변형이 본 발명의 진정한 취지 및 범위를 벗어나지 않고도 당업자에 의해 고안될 수 있음이 자명하다. 첨부된 특허청구범위는 이러한 실시양태 및 등가의 변형 모두를 포함하는 것으로 해석되도록 의도된다.

<110> The Trustees of the University of Pennsylvania <120> RNA ENGINEERED T CELLS FOR THE TREATMENT OF CANCER <130> IPA140180-CN <150> US 61/535,608 <151> 2011-09-16 <160> 28 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 1 cctaagctta ccgccatggc cttaccagtg ac 32 <210> 2 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 2 cctaagctta ccgccatggc cttaccagtg accgcc 36 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 3 cctgcggccg cttagcgagg gggcagggcc 30 <210> 4 <211> 4893 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 4 gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca 60 cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaatg tgagttagct 120 cactcattag gcaccccagg ctttacactt tatgcttccg gctcgtatgt tgtgtggaat 180 tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa cagctatgac catgattacg ccaagctcta 240 atacgactca ctatagggaa 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ctgcttgcaa acaaaaaaac caccgctacc 4500 agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct accaactctt tttccgaagg taactggctt 4560 cagcagagcg cagataccaa atactgtcct tctagtgtag ccgtagttag gccaccactt 4620 caagaactct gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta atcctgttac cagtggctgc 4680 tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg gttggactca agacgatagt taccggataa 4740 ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag cccagcttgg agcgaacgac 4800 ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga gctatgagaa agcgccacgc ttcccgaagg 4860 gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga acaggagagc gcacgaggga 4920 gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc gggtttcgcc acctctgact 4980 tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc ctatggaaaa acgccagcaa 5040 cgcggccttt ttacggttcc tggccttttg ctggcctttt gctcacatgt tctttcctgc 5100 gttatcccct gattctgtgg ataaccgtat taccgccttt gagtgagctg ataccgctcg 5160 ccgcagccga acgaccgagc gcagcgagtc agtgagcgag gaagcggaag agcgcccaat 5220 acgcaaaccg cctctccccg cgcgttggcc gattcattaa tgcagctggc acgacaggtt 5280 tcccgactgg aaagcgggca gtgagcgcaa 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aagagccttg aatggattgg agctattgat 660 ccttactatg gtggaactag ctacaaccag aagttcaagg gcagggccac attgactgta 720 gacaaatcgt ccagcacagc ctacatgcac ctcaagagcc tgacatctga ggactctgca 780 gtctattact gtgtaagcgg aatggagtac tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc 840 tcagccaaaa cgacaccccc atcagtctac ggaagggtca ccgtctcttc agcggagccc 900 aaatcttgtg acaaaactca cacctgccca ccgtgcccgg gatccatcta catctgggcc 960 cctctggccg gcacctgtgg cgtgctgctg ctgtccctgg tcatcaccct gtactgcaag 1020 cggggcagaa agaagctgct gtacatcttc aagcagccct tcatgcggcc tgtgcagacc 1080 acacaggaag aggacggctg tagctgtaga ttccccgagg aagaggaagg cggctgcgag 1140 ctgagagtga agttcagcag aagcgccgac gcccctgcct atcagcaggg ccagaaccag 1200 ctgtacaacg agctgaacct gggcagacgg gaggaatacg acgtgctgga caagagaaga 1260 ggccgggacc ctgagatggg cggcaagccc agacggaaga acccccagga aggcctgtat 1320 aacgaactgc agaaagacaa gatggccgag gcctacagcg agatcggcat gaagggcgag 1380 cggagaagag gcaagggcca tgacggcctg taccagggcc tgagcaccgc caccaaggac 1440 acctacgacg ccctgcacat gcaggccctg cctccaagat gagcggccgc ctcgagagct 1500 cgctttcttg ctgtccaatt tctattaaag gttcctttgt tccctaagtc caactactaa 1560 actgggggat attatgaagg gccttgagca tctggattct gcctaataaa aaacatttat 1620 tttcattgct gcgtcgagag ctcgctttct tgctgtccaa tttctattaa aggttccttt 1680 gttccctaag tccaactact aaactggggg atattatgaa gggccttgag catctggatt 1740 ctgcctaata aaaaacattt attttcattg ctgcgtcgac gaattcaaaa aaaaaaaaaa 1800 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1860 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1920 aaaaaaaaaa aaaaaagaag agcactagtg gcgcctgatg cggtattttc tccttacgca 1980 tctgtgcggt atttcacacc gcataggccg ctgtattcta tagtgtcacc taaatggccg 2040 cacaattcac tggccgtcgt tttacaacgt cgtgactggg aaaaccctgg cgttacccaa 2100 cttaatcgcc ttgcagcaca tccccctttc gccagctggc gtaatagcga agaggcccgc 2160 accgatcgcc cttcccaaca gttgcgcagc ctgaatggcg aatggaaatt gtaagcgtta 2220 atattttgtt aaaattcgcg ttaaattttt gttaaatcag ctcatttttt aaccaatagg 2280 ccgaaatcgg caaaatccct tataaatcaa aagaatagac cgagataggg ttgagtgttg 2340 ttccagtttg gaacaagagt ccactattaa agaacgtgga ctccaacgtc aaagggcgaa 2400 aaaccgtcta tcagggcgat ggcccactac gtgaaccatc accctaatca agttttttgg 2460 ggtcgaggtg ccgtaaagca ctaaatcgga accctaaagg gagcccccga tttagagctt 2520 gacggggaaa gccggcgaac gtggcgagaa aggaagggaa gaaagcgaaa ggagcgggcg 2580 ctagggcgct ggcaagtgta gcggtcacgc tgcgcgtaac caccacaccc gccgcgctta 2640 atgcgccgct acagggcgcg tcaggtggca cttttcgggg aaatgtgcgc ggaaccccta 2700 tttgtttatt tttctaaata cattcaaata tgtatccgct catgagtcag gcaactatgg 2760 atgaacgaaa tagacagatc gctgagatag gtgcctcact gattaagcat tggtaactgt 2820 cagaccaagt ttactcatat atactttaga ttgatttaaa acttcatttt taatttaaaa 2880 ggatctaggt gaagatcctt tttgataatc tcatgaacaa taaaactgtc tgcttacata 2940 aacagtaata caaggggtgt tatgagccat attcaacggg aaacgtcttg ctctaggccg 3000 cgattaaatt ccaacatgga tgctgattta tatgggtata aatgggctcg cgataatgtc 3060 gggcaatcag gtgcgacaat ctatcgattg tatgggaagc ccgatgcgcc agagttgttt 3120 ctgaaacatg gcaaaggtag cgttgccaat gatgttacag atgagatggt cagactaaac 3180 tggctgacgg aatttatgcc tcttccgacc atcaagcatt ttatccgtac tcctgatgat 3240 gcatggttac tcaccactgc gatccccggg aaaacagcat tccaggtatt agaagaatat 3300 cctgattcag gtgaaaatat tgttgatgcg ctggcagtgt tcctgcgccg gttgcattcg 3360 attcctgttt gtaattgtcc ttttaacagc gatcgcgtat ttcgtctcgc tcaggcgcaa 3420 tcacgaatga ataacggttt ggttgatgcg agtgattttg atgacgagcg taatggctgg 3480 cctgttgaac aagtctggaa agaaatgcat aaacttttgc cattctcacc ggattcagtc 3540 gtcactcatg gtgatttctc acttgataac cttatttttg acgaggggaa attaataggt 3600 tgtattgatg ttggacgagt cggaatcgca gaccgatacc aggatcttgc catcctatgg 3660 aactgcctcg gtgagttttc tccttcatta cagaaacggc tttttcaaaa atatggtatt 3720 gataatcctg atatgaataa attgcagttt catttgatgc tcgatgagtt tttctaagaa 3780 ttaattcatg accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt cagaccccgt 3840 agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct gctgcttgca 3900 aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc taccaactct 3960 ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc gcagatacca aatactgtcc ttctagtgta 4020 gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc tcgctctgct 4080 aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg ggttggactc 4140 aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt cgtgcacaca 4200 gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga actgagatac ctacagcgtg agctatgaga 4260 aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg gcagggtcgg 4320 aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt atagtcctgt 4380 cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag gggggcggag 4440 cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt gctggccttt 4500 tgctcacatg ttctttcctg cgttatcccc tgattctgtg gataaccgta ttaccgcctt 4560 tgagtgagct gataccgctc gccgcagccg aacgaccgag cgcagcgagt cagtgagcga 4620 ggaagcggaa gagcgcccaa tacgcaaacc gcctctcccc gcgcgttggc cgattcatta 4680 atgcagctgg cacgacaggt ttcccgactg gaaagcgggc agtgagcgca acgcaattaa 4740 tgtgagttag ctcactcatt aggcacccca ggctttacac tttatgcttc cggctcgtat 4800 gttgtgtgga attgtgagcg gataacaatt tcacacagga aacagctatg accatgatta 4860 cgccaagctc 4870

Claims

세포외 도메인, 막통과(trnasmembrane) 도메인, 공자극 신호전달 영역 및 CD3-제타의 신호전달 도메인을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 시험관내 전사된 RNA 또는 합성 RNA.
제1항에 있어서, 상기 세포외 도메인이 항원 결합 부분을 포함하는, RNA.
제2항에 있어서, 상기 항원 결합 부분이 종양 항원에 결합하는, RNA.
제3항에 있어서, 상기 종양 항원이, 뇌암, 방광암, 유방암, 자궁경부암, 결장직장암, 간암, 신장암, 림프종, 백혈병, 폐암, 흑색종, 전이성 흑색종, 중피종, 신경아세포종, 난소암, 전립선암, 췌장암, 신장암, 피부암, 흉선암, 육종, 비-호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 자궁암 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 암과 관련된 항원인, RNA.
제1항에 있어서, RNA가 시험관내 전사 벡터로부터 전사되고, 상기 벡터가 pD-A.ss1.OF.BBZ.2bg.150A이고, 상기 벡터가 서열번호 4의 핵산 서열을 포함하는, RNA.
제1항에 있어서, RNA가 전사되는 DNA가, 서열번호 6 및 서열번호 8로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열을 포함하는, RNA.
제1항에 있어서, RNA가 시험관내 전사 벡터로부터 전사되고, 상기 벡터가 pD-A.19.OF.2bg.150A이고, 상기 벡터가 서열번호 5의 핵산 서열을 포함하는, RNA.
제1항에 있어서, RNA가 전사되는 DNA가, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23 및 서열번호 24로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열을 포함하는, RNA.
제1항에 있어서, RNA가 시험관내 전사 벡터로부터 전사되고, 상기 벡터가 pD-A.GD2.OF.8TMBBZ.2bg.150A이고, 상기 벡터가 서열번호 28의 핵산 서열을 포함하는, RNA.
제1항에 있어서, RNA가 전사되는 DNA가, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12 및 서열번호 13으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열을 포함하는, RNA.
제1항에 있어서, RNA가 시험관내 전사 벡터로부터 전사되고, 상기 벡터가 pD-A.cMet.OF.8TMBBZ.2bgUTR.150A이고, 상기 벡터가 서열번호 27의 핵산 서열을 포함하는, RNA.
제1항에 있어서, RNA가 전사되는 DNA가, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17 및 서열번호 18로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열을 포함하는, RNA.
제1항에 있어서, 상기 공자극 신호전달 영역이 CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 림프구 기능 관련 항원-1(LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, CD83에 특이적으로 결합하는 리간드 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 공자극 분자의 세포내 도메인을 포함하는, RNA.
제1항에 있어서, 상기 핵산 서열이 약 150개 아데노신 염기를 포함하는 폴리(A) 테일을 포함하는, RNA.
제1항에 있어서, 상기 핵산 서열이 사람 베타-글로불린으로부터 유래하는 3' UTR의 적어도 하나의 반복체를 포함하는 3' UTR을 포함하는, RNA.
시험관내 전사된 RNA 또는 합성 RNA를 포함하는 T 세포로서,
상기 RNA가 세포외 도메인, 막통과 도메인, 공자극 신호전달 영역 및 CD3-제타의 신호전달 도메인을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는, T 세포.
제16항에 있어서, 상기 세포외 도메인이 항원 결합 부분을 포함하는, T 세포.
제17항에 있어서, 상기 항원 결합 부분이 종양 항원에 결합하는, T 세포.
제18항에 있어서, 상기 종양 항원이, 뇌암, 방광암, 유방암, 자궁경부암, 결장직장암, 간암, 신장암, 림프종, 백혈병, 폐암, 흑색종, 전이성 흑색종, 중피종, 신경아세포종, 난소암, 전립선암, 췌장암, 신장암, 피부암, 흉선암, 육종, 비-호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 자궁암 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 암과 관련된 항원인, T 세포.
제16항에 있어서, 상기 RNA가 시험관내 전사 벡터로부터 전사되고, 상기 벡터가 pD-A.ss1.OF.BBZ.2bg.150A이고, 상기 벡터가 서열번호 4의 핵산 서열을 포함하는, T 세포.
제16항에 있어서, RNA가 전사되는 DNA가 서열번호 6 및 서열번호 8로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열을 포함하는, T 세포.
제16항에 있어서, RNA가 시험관내 전사 벡터로부터 전사되고, 상기 벡터가 pD-A.19.OF.2bg.150A이고, 상기 벡터가 서열번호 5의 핵산 서열을 포함하는, T 세포.
제16항에 있어서, RNA가 전사되는 DNA가, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23 및 서열번호 24로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열을 포함하는, T 세포.
제16항에 있어서, RNA가 시험관내 전사 벡터로부터 전사되고, 상기 벡터가 pD-A.GD2.OF.8TMBBZ.2bg.150A이고, 상기 벡터가 서열번호 28의 핵산 서열을 포함하는, T 세포.
제16항에 있어서, RNA가 전사되는 DNA가, 서열번호10, 서열번호 11, 서열번호 12 및 서열번호 13으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열을 포함하는, T 세포.
제16항에 있어서, RNA가 시험관내 전사 벡터로부터 전사되고, 상기 벡터가 pD-A.cMet.OF.8TMBBZ.2bgUTR.150A이고, 상기 벡터가 서열번호 27의 핵산 서열을 포함하는, T 세포.
제16항에 있어서, RNA가 전사되는 DNA가, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17 및 서열번호 18로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열을 포함하는, T 세포.
제16항에 있어서, 상기 공자극 신호전달 영역이 CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 림프구 기능 관련 항원-1(LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, CD83에 특이적으로 결합하는 리간드 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 공자극 분자의 세포내 도메인을 포함하는, T 세포.
제16항에 있어서, 상기 핵산 서열이 약 150개 아데노신 염기를 포함하는 폴리(A) 테일을 포함하는, T 세포.
제16항에 있어서, 상기 핵산 서열이 사람 베타-글로불린으로부터 유래하는 3' UTR의 적어도 하나의 반복체를 포함하는 3' UTR을 포함하는, T 세포.
외인성 RNA를 일시적으로 발현하는 RNA-조작된 T 세포의 모집단을 생성하는 방법으로서,
상기 방법은 시험관내 전사된 RNA 또는 합성 RNA를 T 세포에 도입하는 것을 포함하고,
상기 RNA는 세포외 도메인, 막통과 도메인, 공자극 신호전달 영역 및 CD3-제타의 신호전달 도메인을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 방법.
제31항에 있어서, 상기 세포외 도메인이 항원 결합 부분을 포함하는, 방법.
제32항에 있어서, 상기 항원 결합 부분이 종양 항원에 결합하는, 방법.
제33항에 있어서, 상기 종양 항원이, 뇌암, 방광암, 유방암, 자궁경부암, 결장직장암, 간암, 신장암, 림프종, 백혈병, 폐암, 흑색종, 전이성 흑색종, 중피종, 신경아세포종, 난소암, 전립선암, 췌장암, 신장암, 피부암, 흉선암, 육종, 비-호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 자궁암 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 암과 관련된 항원인, 방법.
제31항에 있어서, RNA가 시험관내 전사 벡터로부터 전사되고, 상기 벡터가 pD-A.ss1.OF.BBZ.2bg.150A이고, 상기 벡터가 서열번호 4의 핵산 서열을 포함하는, 방법.
제31항에 있어서, RNA가 전사되는 DNA가, 서열번호 6 및 서열번호 8로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열을 포함하는, 방법.
제31항에 있어서, RNA가 시험관내 전사 벡터로부터 전사되고, 상기 벡터가 pD-A.19.OF.2bg.150A이고, 상기 벡터가 서열번호 5의 핵산 서열을 포함하는, 방법.
제31항에 있어서, RNA가 전사되는 DNA가, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23 및 서열번호 24로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열을 포함하는, 방법.
제31항에 있어서, RNA가 시험관내 전사 벡터로부터 전사되고, 상기 벡터가 pD-A.GD2.OF.8TMBBZ.2bg.150A이고, 상기 벡터가 서열번호 28의 핵산 서열을 포함하는, 방법.
제31항에 있어서, RNA가 전사되는 DNA가, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12 및 서열번호 13으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열을 포함하는, 방법.
제31항에 있어서, RNA가 시험관내 전사 벡터로부터 전사되고, 상기 벡터가 pD-A.cMet.OF.8TMBBZ.2bgUTR.150A이고, 상기 벡터가 서열번호 27의 핵산 서열을 포함하는, 방법.
제31항에 있어서, RNA가 전사되는 DNA가, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17 및 서열번호 18로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열을 포함하는, 방법.
제31항에 있어서, 상기 공자극 신호전달 영역이 CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 림프구 기능 관련 항원-1(LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, CD83에 특이적으로 결합하는 리간드 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 공자극 분자의 세포내 도메인을 포함하는, 방법.
제31항에 있어서, 상기 핵산 서열이 약 150개 아데노신 염기를 포함하는 폴리(A) 테일을 포함하는, 방법.
제31항에 있어서, 상기 핵산 서열이 사람 베타-글로불린으로부터 유래하는 3' UTR의 적어도 하나의 반복체를 포함하는 3' UTR을 포함하는, 방법.
암 환자를 치료하는 방법으로서,
상기 방법은 외인성 RNA를 일시적으로 발현하도록 조작된 T 세포를 상기 환자에게 투여하는 것을 포함하고,
상기 RNA는 세포외 도메인, 막통과 도메인, 공자극 신호전달 영역 및 CD3-제타의 신호전달 도메인을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 방법.
제46항에 있어서, 상기 세포외 도메인이 항원 결합 부분을 포함하는, 방법.
제47항에 있어서, 상기 항원 결합 부분이 종양 항원에 결합하는, 방법.
제48항에 있어서, 상기 종양 항원이, 뇌암, 방광암, 유방암, 자궁경부암, 결장직장암, 간암, 신장암, 림프종, 백혈병, 폐암, 흑색종, 전이성 흑색종, 중피종, 신경아세포종, 난소암, 전립선암, 췌장암, 신장암, 피부암, 흉선암, 육종, 비-호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 자궁암 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 암과 관련된 항원인, 방법.
제46항에 있어서, T 세포의 투여를 반복하는 것을 포함하는, 방법.
제46항에 있어서, 화학치료제를 상기 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.
제46항에 있어서, RNA가 시험관내 전사 벡터로부터 전사되고, 상기 벡터가 pD-A.ss1.OF.BBZ.2bg.150A이고, 상기 벡터가 서열번호 4의 핵산 서열을 포함하는, 방법.
제46항에 있어서, RNA가 전사되는 DNA가, 서열번호 6 및 서열번호 8로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열을 포함하는, 방법.
제46항에 있어서, RNA가 시험관내 전사 벡터로부터 전사되고, 상기 벡터가 pD-A.19.OF.2bg.150A이고, 상기 벡터가 서열번호 5의 핵산 서열을 포함하는, 방법.
제46항에 있어서, RNA가 전사되는 DNA가, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23 및 서열번호 24로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열을 포함하는, 방법.
제46항에 있어서, RNA가 시험관내 전사 벡터로부터 전사되고, 상기 벡터가 pD-A.GD2.OF.8TMBBZ.2bg.150A이고, 상기 벡터가 서열번호 28의 핵산 서열을 포함하는, 방법.
제46항에 있어서, RNA가 전사되는 DNA가, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12 및 서열번호 13으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열을 포함하는, 방법.
제46항에 있어서, RNA가 시험관내 전사 벡터로부터 전사되고, 상기 벡터가 pD-A.cMet.OF.8TMBBZ.2bgUTR.150A이고, 상기 벡터가 서열번호 27의 핵산 서열을 포함하는, 방법.
제46항에 있어서, RNA가 전사되는 DNA가, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17 및 서열번호 18로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열을 포함하는, 방법.
제46항에 있어서, 상기 공자극 신호전달 영역이 CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 림프구 기능 관련 항원-1(LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, CD83에 특이적으로 결합하는 리간드 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 공자극 분자의 세포내 도메인을 포함하는, 방법.
제46항에 있어서, 상기 핵산 서열이 약 150개 아데노신 염기를 포함하는 폴리(A) 테일을 포함하는, 방법.
제46항에 있어서, 상기 핵산 서열이 사람 베타-글로불린으로부터 유래하는 3' UTR의 적어도 하나의 반복체를 포함하는 3' UTR을 포함하는, 방법.