TW202334400A - 表現il-10及嵌合抗原受體之cd4+ t細胞及其用途 - Google Patents
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Abstract
本發明提供藉由對CD4
+T細胞進行基因修飾以表現IL-10及嵌合抗原受體而產生的CD4
IL - 10 / CAR細胞群(自體或同種異體單供體及同種異體多供體)。另外提供產生CD4
IL - 10 / CAR細胞的方法及使用CD4
IL - 10 / CAR細胞達成免疫耐受、治療GvHD、細胞及器官移植、癌症以及其他自體免疫及發炎病症的方法。
Description
本發明係關於CD4
+T細胞及其用途，且特定言之，係關於表現IL-10及嵌合抗原受體之CD4
+T細胞及其用途。
調控T細胞屬於小但重要的T細胞亞群，其維持針對自身及非病原性抗原的免疫耐受性且維持免疫穩態。調控T細胞存在兩種主要群體 - CD4
+FOXP3
+CD25
+T細胞(FOXP3
+細胞)及1型調控T (Tr1)細胞。在器官及胰島移植、移植物抗宿主疾病(GvHD)及各種自體免疫及發炎疾病的各種臨床前模型中，FOXP3
+與Tr1細胞均下調病原性T細胞反應。
Tr1細胞在臨床研究中已顯示為有效的。經選殖之抗原特異性自體Tr1細胞投與正患有中度至重度克羅恩氏病(Crohn's disease)之患者引起客觀、暫時的緩解(Desreumaux等人, Gastroenterology. 2012;143(5):1207-1217.e2.)。另外，同種異體造血幹細胞移植(同種異體HSCT)之後，富含同種異體特異性Tr1細胞之供體源CD4
+T細胞群授受性轉移至白血病患者引起免疫系統快速重建且防止微生物及病毒感染，而不出現重度GvHD。在有反應的患者中，達成長期緩解及耐受性(＞7年)，從而治癒(Bacchetta等人,
Front Immunol .2014;5:16)。
儘管此等結果令人鼓舞，但生產大規模療法用的供體源或自體Tr1細胞用於未滿足之醫療需求高的患者並非總是可行的，極其繁瑣且無法產生大量的純Tr1細胞。
最近，Locafaro及同事藉由用含有人類IL-10基因的雙向慢病毒載體轉導來自單一供體之純化CD4
+T細胞而規避了一些此等問題。所得單供體CD4
IL - 10群體共享天然存在之Tr1細胞的主要功能。如同Tr1細胞，單供體CD4
IL - 10細胞產生高含量的IL-10且使同種異體CD4
+T細胞與同種異體CD8
+T細胞的增殖均下調。另外，其對正常骨髓細胞(包括抗原呈遞細胞APC)與骨髓性白血病細胞均具有直接的細胞毒性。在人源化異種移植物抗宿主疾病(GvHD)模型中，此等單供體CD4
IL - 10細胞顯示可有效減少GvHD，同時保留移植物抗白血病(GvL)活性。參見Locafaro等人, Mol Ther. 2017;25(10):2254-2269及WO 2016/146,542。
需要將CD4
IL - 10細胞之細胞毒性能力重新引導至非骨髓細胞、同時保持此等細胞之免疫抑制及免疫穩態維持活性的方式。
本發明提供一種新型免疫細胞CD4
IL - 10 / CAR細胞，其經工程改造以表現外源IL-10與嵌合抗原受體(CAR)。吾等已發現，除IL-10之外，表現CAR亦將此等Tr1樣細胞之細胞毒性特性重新引導至除骨髓目標之外的治療適用目標，同時驚人地使細胞的免疫調節特性保持完整。亦描述使用CD4
IL - 10 / CAR細胞治療的方法、CD4
IL - 10 / CAR細胞用於治療的用途，及CD4
IL - 10 / CAR細胞用於製造供治療各種病症用之藥劑的用途，其中CAR將此等Tr1樣細胞的細胞毒性特性引導至除骨髓細胞之外的治療適用目標，同時使細胞的免疫調節特性保持完整。
本發明提供一種經基因修飾的CD4
+T細胞(CD4
IL10 / CAR)，其包含：(a)編碼嵌合抗原受體(CAR)的第一外源聚核苷酸區段；及(b)編碼介白素-10 (IL-10)的第二外源聚核苷酸區段。
在一些實施例中，第一外源聚核苷酸區段包含可操作地連接至CAR編碼序列的調控元件。在一些實施例中，調控元件驅動CAR組成性表現。
在一些實施例中，CAR包含抗原結合域、鉸鏈區、跨膜域及胞內信號傳導域。
在一些實施例中，抗原結合域包含單鏈抗體片段。在一些實施例中，單鏈抗體片段包含單鏈Fv (scFv)。
在一些實施例中，抗原結合域靶向與自體免疫疾病、發炎病症或癌症有關的抗原。
在一些實施例中，在相關MHC分子之上下文中，該抗原係選自由以下組成之群：CD19、CD20、CD22、BCMA、CD27、CD38、B7-H3、CD23、Lyml、Lym2、CLEC5A、CDH179b、FLT3、GCC、Muc、CSF2RA、GFRa4、CD32、CD33、CEA、IL1lRa、IL13Ra、NYBRI、SLea、CD200R、TGFBetaR2、CD276、TROP2、LAMP1、PTK7、DLL3、CDH1、CDH6、CDH17、CDH19、TSHR、酪胺酸酶、HLA-A*02、HLA-A*24或瓜胺酸化肽、胰島素、MOG、GAD65、IA2、麥膠蛋白(gliadin)及橋粒醣蛋白(desmoglein)。
在一些實施例中，抗原結合域包含抗CD19抗原結合域。在一些實施例中，抗CD19抗原結合域包含SEQ ID NO: 11之序列。
在一些實施例中，抗原結合域為抗CD20抗原結合域。在一些實施例中，抗CD20抗原結合域包含SEQ ID NO: 18之序列。
在一些實施例中，鉸鏈區係選自人類CD8鉸鏈區、人類CD28鉸鏈區、IgG1鉸鏈區或IgG4鉸鏈區。在一些實施例中，鉸鏈區源於人類CD8。
在一些實施例中，跨膜域係選自TNFRSF 19跨膜域、CD3ζ跨膜域、CD8α跨膜域、CD4跨膜域、CD28跨膜域或B7家族誘導型共刺激(ICOS)跨膜域。在一些實施例中，跨膜域源於CD8α跨膜域。
在一些實施例中，CAR進一步包含一或多個共刺激域。
在一些實施例中，CAR包含兩個共刺激域。
在一些實施例中，一或多個共刺激域選自由以下組成之群：4-1BB、CD28、OX40、ICOS、CD27、MYD88-CD40及KIR2DS2。
在一些實施例中，一或多個共刺激域中之一者源於CD28。
在一些實施例中，第二共刺激域源於4-1BB。
在一些實施例中，胞內信號傳導域包含基於酪胺酸之免疫受體活化模體(ITAM)。在一些實施例中，基於酪胺酸之免疫受體活化模體(ITAM)源於CD3ζ。
在一些實施例中，CAR包含：抗CD19抗原結合域、抗BCMA抗原結合域或抗CD20抗原結合域；人類CD8鉸鏈區；TNFRSF 19跨膜區；4-1BB共刺激域；及CD3ζ鏈胞內信號傳導域。在一些實施例中，CAR包含：抗CD19抗原結合域、抗BCMA抗原結合域或抗CD20抗原結合域；人類CD8鉸鏈區；CD8α跨膜區；4-1BB共刺激域；及CD3ζ鏈胞內信號傳導域。
在一些實施例中，CAR包含SEQ ID NO: 9、16、22、34、41-49或54之序列。
在一些實施例中，第一外源聚核苷酸區段包含SEQ ID NO: 10、17、23、35或55之序列。
在一些實施例中，第一外源聚核苷酸區段整合於T細胞核基因體中。
在一些實施例中，第一外源聚核苷酸區段不整合於T細胞核基因體中。
在一些實施例中，第一外源聚核苷酸區段存在於載體中。
在一些實施例中，第二外源聚核苷酸區段包含可操作地連接至IL-10編碼序列的調控元件。在一些實施例中，IL-10為人類IL-10。在一些實施例中，IL-10為病毒IL-10。
在一些實施例中，IL-10為具有SEQ ID NO: 1之序列的蛋白質。
在一些實施例中，第二外源聚核苷酸區段包含SEQ ID NO: 2之序列。
在一些實施例中，調控元件驅動IL-10組成性表現。
在一些實施例中，第二外源聚核苷酸區段整合於T細胞核基因體中。
在一些實施例中，第二外源聚核苷酸區段不整合於T細胞核基因體中。
在一些實施例中，第二外源聚核苷酸區段存在於載體中。
在一些實施例中，第一外源聚核苷酸區段及第二外源聚核苷酸區段存在於同一載體中。在一些實施例中，載體為慢病毒載體。在一些實施例中，載體為慢病毒載體。
在一些實施例中，以10
6個CD4
+T細胞/mL培養基計，CD4
+T細胞組成性表現至少100 pg IL-10。
在一些實施例中，以10
6個CD4
+T細胞/mL計，CD4
+T細胞組成性表現至少100 pg、200 pg、500 pg、1 ng、5 ng、10 ng或50 ng IL-10。
在一些實施例中，用抗CD3及抗CD28抗體活化之後，以10
6個CD4
+T細胞/mL計，CD4
+T細胞表現至少1 ng IL-10。
在一些實施例中，用抗CD3及抗CD28抗體活化之後，以10
6個CD4
+T細胞/mL計，CD4
+T細胞表現至少2 ng、5 ng、10 ng、100 ng、200 ng或500 ng IL-10。
在一些實施例中，CD4
+T細胞對以比未修飾的CD4
+T細胞高至少5倍之量表現IL-10。在一些實施例中，CD4
+T細胞以比未修飾的CD4
+T細胞高至少10倍之量表現IL-10。
在一些實施例中，以10
6個CD4
+T細胞/mL計，CD4
+T細胞表現至少100 pg IL-5。在一些實施例中，以10
6個CD4
+T細胞/mL計，CD4
+T細胞表現至少100 pg、200 pg、500 pg、1 ng、5 ng、10 ng或50 ng IL-5。
在一些實施例中，用抗CD3及抗CD28抗體活化之後，以10
6個CD4
+T細胞/mL計，CD4
+T細胞表現至少1 ng IL-5。
在一些實施例中，用抗CD3及抗CD28抗體活化之後，以10
6個CD4
+T細胞/mL計，CD4
+T細胞表現至少2 ng、5 ng、10 ng、100 ng、200 ng或500 ng IL-5。
在一些實施例中，以10
6個CD4
+T細胞/mL計，CD4
+T細胞表現至少100 pg IFN-γ。
在一些實施例中，以10
6個CD4
+T細胞/mL計，CD4
+T細胞表現至少100 pg、200 pg、500 pg、1 ng、5 ng、10 ng或50 ng IFN-γ。
在一些實施例中，用抗CD3及抗CD28抗體活化之後，以10
6個CD4
+T細胞/mL計，CD4
+T細胞表現至少1 ng IFN-γ。
在一些實施例中，用抗CD3及抗CD28抗體活化之後，以10
6個CD4
+T細胞/mL計，CD4
+T細胞表現至少2 ng、5 ng、10 ng、100 ng、200 ng或500 ng IFN-γ。
在一些實施例中，以10
6個CD4
+T細胞/mL計，CD4
+T細胞表現至少25 pg IL-4。
在一些實施例中，以10
6個CD4
+T細胞/mL計，CD4
+T細胞表現至少25 pg、50 pg、75 pg、100 pg、200 pg、500 pg、1 ng、5 ng、10 ng或50 ng IL-4。
在一些實施例中，用抗CD3及抗CD28抗體活化之後，以10
6個CD4
+T細胞/mL計，CD4
+T細胞表現至少100 pg IL-4。
在一些實施例中，用抗CD3及抗CD28抗體活化之後，以10
6個CD4
+T細胞/mL計，CD4
+T細胞表現至少100 pg、200 pg、300 pg、400 pg、500 pg、600 pg、700 pg、800 pg、900 pg、1000 pg、2 ng、5 ng、10 ng、100 ng、200 ng或500 ng IL-4。
在一些實施例中，一或多輪再刺激之後，IL-10、IL-4、IFN-γ及IL-5中之一或多者的表現穩定。
在一些實施例中，第一外源聚核苷酸區段或第二外源聚核苷酸區段進一步包含編碼選擇標記物的序列。
在一些實施例中，選擇標記物為ΔNGFR。
在一些實施例中，ΔNGFR具有SEQ ID NO: 3之序列。
在一些實施例中，第二外源聚核苷酸區段包含SEQ ID NO: 4之序列。
在一些實施例中，選擇標記物為EGFR多肽的截斷形式。
在一些實施例中，CD4
+T細胞能夠對CD19
+目標細胞產生活體外細胞毒性。
在一些實施例中，CD4
+T細胞能夠對CD19
+目標細胞產生活體內細胞毒性。
在一些實施例中，CD19
+目標細胞為產生自體抗體的B細胞。
在一些實施例中，CD19
+目標細胞為CD19
+癌細胞。
在一些實施例中，CD4
+T細胞能夠對骨髓目標細胞產生活體外細胞毒性。
在一些實施例中，CD4
+T細胞能夠對骨髓目標細胞產生活體內細胞毒性。
在一些實施例中，CD4
+T細胞能夠對CD19
+目標細胞及骨髓目標細胞產生細胞毒性。
在一些實施例中，骨髓目標細胞表現I類MHC、CD13、CD54及CD112中之一或多者。
在一些實施例中，一或多輪活體外再刺激之後，對CD19
+目標細胞維持細胞毒性。在一些實施例中，一或多輪活體外擴增之後，對CD19
+目標細胞維持細胞毒性。
在一些實施例中，一或多輪活體外再刺激之後，對骨髓目標細胞維持細胞毒性。在一些實施例中，一或多輪活體外擴增之後，對骨髓目標細胞維持細胞毒性。
在一些實施例中，CD4
+T細胞能夠抑制同種異體CD4
+T細胞增殖。
在一些實施例中，CD4
+T細胞能夠抑制同種異體CD8
+T細胞增殖。
在一些實施例中，CD4
+T細胞能夠抑制同種異體CD4
+T細胞增殖、同種異體CD8
+T細胞增殖及PBMC增殖。
在一些實施例中，一或多輪再刺激之後，抑制特性得以維持。
在另一態樣中，本發明的特徵為CD4
+T細胞群，其包含本文所提供之任一種經基因修飾之CD4
+細胞。
在一些實施例中，基因修飾之前，自兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個或十個不同T細胞供體獲得CD4
+T細胞且彙集。
在一些實施例中，群體中的CD4
+T細胞總共具有六種、七種、八種、九種、十種、十一種、十二種或更多種不同HLA單倍型。
在一些實施例中，群體中的所有CD4
+T細胞在HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1及HLA-DQB1基因座彼此具有至少1/10、2/10、3/10、4/10、5/10、6/10、7/10、8/10或9/10匹配。
在一些實施例中，群體中的所有CD4
+T細胞在HLA-A、HLA-B、HLA-C及HLA-DRB1基因座彼此具有至少1/8、2/8、3/8、4/8、5/8、6/8、7/8或8/8匹配。
在一些實施例中，群體中的所有CD4
+T細胞在HLA-A基因座彼此具有2/2匹配。
在一些實施例中，群體中的所有CD4
+T細胞在HLA-B基因座彼此具有2/2匹配。
在一些實施例中，群體中的所有CD4
+T細胞在HLA-C基因座彼此具有2/2匹配。
在一些實施例中，群體中的所有CD4
+T細胞在HLA-DRB1及HLA-DQB1基因座彼此具有至少3/4或4/4匹配。
在一些實施例中，群體中的所有CD4
+T細胞在HLA-A、HLA-B、HLA C、HLA-DRB1及HLA-DQB1基因座彼此具有小於5/10、6/10、7/10、8/10或9/10匹配。
在一些實施例中，群體中的所有CD4
+T細胞在HLA-A、HLA-B、HLA C及HLA DRB1基因座彼此具有小於4/8、5/8、6/8、7/8或8/8匹配。
在一些實施例中，群體中的所有CD4
+T細胞在HLA-A基因座彼此具有小於2/2匹配。
在一些實施例中，群體中的所有CD4
+T細胞在HLA-B基因座彼此具有小於2/2匹配。
在一些實施例中，群體中的所有CD4
+T細胞在HLA-C基因座彼此具有小於2/2匹配。
在一些實施例中，群體中的所有CD4
+T細胞在HLA-DRB1及HLA DQB1基因座彼此具有小於2/4、3/4或4/4匹配。
在一些實施例中，群體中的所有CD4
+T細胞具有A*02對偶基因或呈A*02陰性。
在一些實施例中，群體中的所有CD4
+T細胞具有A*24對偶基因或呈A*24陰性。
在一些實施例中，NGFR
+細胞群體內至少30%的CD4
+T細胞表現CAR。
在一些實施例中，NGFR
+細胞群體內至少60%的CD4
+T細胞表現CAR。
在一些實施例中，NGFR
+細胞群內至少90%的CD4
+T細胞表現CAR。
在一些實施例中，CD4
+T細胞存在於冷凍懸浮液中。
在一些實施例中，CD4
+T細胞存在於液體懸浮液中。
在一些實施例中，液體懸浮液先前已冷凍。
在另一態樣中，本發明的特徵為本文所提供之任一種醫藥組合物，其包含本文所提供之任一種CD4
+T細胞或本文所提供之任一種CD4
+T細胞群。
在另一態樣中，本發明的特徵為一種製備CD4
IL10 / CAR細胞之方法，其包含以下步驟：(a)自一或多個T細胞供體獲得原代CD4
+T細胞；及(b)藉由引入以下來修飾CD4
+T細胞：(i)編碼嵌合抗原受體(CAR)的第一外源聚核苷酸區段，及(ii)編碼IL-10的第二外源聚核苷酸區段。
在一些實施例中，在步驟(a)中，自兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個或十個不同T細胞供體獲得原代CD4
+T細胞。
在一些實施例中，該方法進一步包含彙集來自步驟(b)的經基因修飾之CD4
+T細胞。
在一些實施例中，其中在步驟(a)中，原代CD4
+T細胞對於患者而言為自體的。
在一些實施例中，在步驟(a)之後且在步驟(b)之前，或在步驟(b)之後，該方法進一步包含在抗CD3抗體及抗CD28抗體或經抗CD3抗體及CD28抗體塗覆之珠粒存在下培育CD4
+T細胞。
在一些實施例中，該方法包含進一步在IL-2存在下培育CD4
+T細胞。
在一些實施例中，使用一或多個病毒載體將第一外源聚核苷酸區段、第二外源聚核苷酸區段或兩者引入原代CD4
+T細胞中。在一些實施例中，病毒載體為慢病毒載體。
在一些實施例中，第一外源聚核苷酸區段包含CAR編碼序列。
在一些實施例中，CAR對與自體免疫疾病、發炎病症或癌症相關之目標抗原具有特異性。
在一些實施例中，目標抗原與自體免疫疾病、發炎病症或癌症相關。
在一些實施例中，CAR為抗CD19 CAR、抗CD20 CAR、抗CD22 CAR、抗BCMA CAR、抗B7-H3 CAR、抗CD27 CAR或抗CD38 CAR。
在一些實施例中，CAR包含SEQ ID NO: 9、16、22、34、41-49或54之序列。
在一些實施例中，第一外源聚核苷酸區段包含SEQ ID NO: 10、17、23、35或55之序列。
在一些實施例中，IL-10包含SEQ ID NO: 1之序列。
在一些實施例中，第二外源聚核苷酸區段包含SEQ ID NO: 2之序列。
在一些實施例中，第一外源聚核苷酸區段或第二外源聚核苷酸區段進一步包含編碼選擇標記物的區段。
在一些實施例中，所編碼的選擇標記物為ΔNGFR。
在一些實施例中，所編碼的選擇標記物具有SEQ ID NO: 3之序列。
在一些實施例中，選擇標記物為EGFR多肽的截斷形式。
在一些實施例中，在步驟(b)之後，該方法進一步包含分離出表現選擇標記物之經基因修飾之CD4
+T細胞的步驟，藉此產生經富集之經基因修飾之CD4
+T細胞群。
在一些實施例中，富集群體中至少30%或至少60%的經基因修飾之CD4
+T細胞表現IL-10及CAR。
在一些實施例中，富集群體中至少90%的經基因修飾之CD4
+T細胞表現IL-10及CAR。
在一些實施例中，富集群體中至少40%的經基因修飾之CD4
+T細胞表現選擇標記物。
在一些實施例中，富集群體中至少75%的經基因修飾之CD4
+T細胞表現選擇標記物。
在一些實施例中，富集群體中至少90%的經基因修飾之CD4
+T細胞表現選擇標記物。
在一些實施例中，該方法進一步包含培育經富集之經基因修飾之CD4
+T細胞群的步驟。
在一些實施例中，培育經富集之經基因修飾之CD4
+T細胞群的步驟係在抗CD3抗體及抗CD28抗體或經CD3抗體及CD28抗體塗覆之珠粒存在下、在IL-2存在下執行。
在一些實施例中，該方法進一步包含冷凍經基因修飾之CD4
+T細胞的後續步驟。
在一些實施例中，至少兩個T細胞供體在HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1及HLA-DQB1基因座彼此具有至少1/10、2/10、3/10、4/10、5/10、6/10、7/10、8/10或9/10匹配。
在一些實施例中，至少兩個T細胞供體在HLA-A、HLA-B、HLA-C及HLA-DRB1基因座彼此具有至少1/8、2/8、3/8、4/8、5/8、6/8、7/8或8/8匹配。
在一些實施例中，至少兩個T細胞供體在HLA-A基因座彼此具有2/2匹配。
在一些實施例中，至少兩個T細胞供體在HLA-B基因座彼此具有2/2匹配。
在一些實施例中，至少兩個T細胞供體在HLA-C基因座彼此具有2/2匹配。
在一些實施例中，至少兩個T細胞供體在HLA-DRB1及HLA-DQB1基因座彼此具有至少3/4或4/4匹配。
在一些實施例中，至少兩個T細胞供體在HLA-A、HLA-B、HLA C、HLA-DRB1及HLA-DQB1基因座彼此具有小於5/10、6/10、7/10、8/10或9/10匹配。
在一些實施例中，至少兩個T細胞供體在HLA-A、HLA-B、HLA C及HLA DRB1基因座彼此具有小於4/8、5/8、6/8、7/8或8/8匹配。
在一些實施例中，至少兩個T細胞供體在HLA-A基因座彼此具有小於2/2匹配。
在一些實施例中，至少兩個T細胞供體在HLA-B基因座彼此具有小於2/2匹配。
在一些實施例中，至少兩個T細胞供體在HLA-C基因座彼此具有小於2/2匹配。
在一些實施例中，至少兩個T細胞供體在HLA-DRB1及HLA DQB1基因座彼此具有小於2/4、3/4或4/4匹配。
在一些實施例中，至少兩個T細胞供體中之每一者具有A*02對偶基因或呈A*02陰性。在一些實施例中，至少兩個T細胞供體中之每一者具有A*02對偶基因或呈A*02陰性。
在一些實施例中，在步驟(a)中，原代CD4
+T細胞獲自一或多個冷凍儲備液。
在一些實施例中，在步驟(a)中，原代CD4
+T細胞獲自至少兩個不同T細胞供體的未冷凍周邊血液單核細胞。
在一些實施例中，該方法進一步包含自周邊血液單核細胞中分離出CD4
+T細胞的步驟。
在另一態樣中，本發明的特徵為一種治療血液學癌症之方法，其包含：向血液學癌症患者投與足以誘導抗癌作用之治療有效量的所提供之任一種CD4
IL - 10 / CAR細胞、本文所提供之任一種CD4
IL - 10 /CAR細胞群，或本文所提供之任一種醫藥組合物。
在一些實施例中，該方法進一步包含在多供體CD4
IL - 10 / CAR投與之前或之後向患者投與同種異體HSCT移植物的步驟。
在另一態樣中，本發明的特徵為一種治療患有惡性疾病之患者的方法，其包含：向該患者投與同種異體HSCT移植物，及投與治療有效量之所提供之任一種CD4
IL - 10 / CAR細胞、本文所提供之任一種CD4
IL - 10 / CAR細胞或本文所提供之任一種醫藥組合物。
在一些實施例中，CD4
IL - 10 / CAR細胞的量進一步足以抑制或預防移植物抗宿主疾病(GvHD)，而不抑制同種異體HSCT之移植物抗白血病(GvL)或移植物抗腫瘤(GvT)功效。
在一些實施例中，惡性疾病或血液學癌症為骨髓性白血病。
在一些實施例中，CD4
IL - 10 / CAR細胞靶向且殺滅表現CD13的癌細胞。
在一些實施例中，CD4
IL - 10 / CAR細胞靶向且殺滅表現I類HLA的癌細胞。
在一些實施例中，骨髓性白血病為急性骨髓性白血病(AML)。
在一些實施例中，惡性疾病或血液學癌症為CD19
+、CD20
+、CD22
+、CD27
+、CD38
+、BCMA+或B7-H3
+血液學癌症。
在一些實施例中，CD19
+、CD20
+、CD22
+、CD27
+、CD38
+、BCMA+或B7-H3
+血液學癌症係選自慢性淋巴球性白血病、急性淋巴母細胞白血病(ALL)及非霍奇金氏淋巴瘤。
在一些實施例中，同種異體HSCT獲自與患者相關或不相關的供體。
在一些實施例中，CD4
IL-10/CAR細胞對於患者而言為非自體的。
在一些實施例中，CD4
IL - 10 / CAR細胞對於患者而言為自體的。
在一些實施例中，CD4
IL - 10 / CAR細胞對於患者而言為同種異體的。
在一些實施例中，CD4
IL - 10 / CAR細胞在投與患者之前，對宿主同種異體抗原未失能。
在一些實施例中，CD4
IL - 10 / CAR細胞為Tr1樣細胞。
在一些實施例中，CD4
IL - 10 / CAR細胞為多株的。
在一些實施例中，CD4
IL - 10 / CAR細胞為多株的且對於患者而言非自體的。
在一些實施例中，CD4
IL - 10 / CAR細胞為多株的且對於患者而言為自體的。
在一些實施例中，在對該等CD4
IL - 10 / CAR細胞進行基因修飾之前，自至少兩個供體分離出該等細胞。
在一些實施例中，至少兩個供體中無一者為與同種異體HSCT供體相同的供體。
在一些實施例中，同種異體HSCT移植物獲自與患者匹配或錯配的供體。
在一些實施例中，CD4
IL - 10 / CAR細胞靶向且殺滅表現CD19、CD20或BCMA的細胞。
在一些實施例中，CD4
IL - 10 / CAR細胞靶向且殺滅表現CD54的細胞。
在一些實施例中，CD4
IL - 10 / CAR細胞靶向且殺滅表現I類HLA及CD54的癌細胞。
在一些實施例中，CD4
IL - 10 / CAR細胞靶向且殺滅表現CD112及CD155的癌細胞。
在一些實施例中，CD4
IL - 10 / CAR細胞靶向且殺滅表現CD58的癌細胞。
在一些實施例中，CD4
IL - 10 / CAR細胞靶向且殺滅患者的癌細胞。
在一些實施例中，CD4
IL - 10 / CAR細胞靶向且殺滅患者的實體腫瘤細胞。
在另一態樣中，本發明的特徵為一種藉由同種異體造血幹細胞移植體(同種異體HSCT)治療血液學癌症的方法，其包含：
向患者投與同種異體HSCT移植物；
將足以抑制或預防移植物抗宿主疾病(GvHD)而不抑制該同種異體HSCT移植物之移植物抗白血病(GvL)或移植物抗腫瘤(GvT)功效之量的CD4
IL - 10 / CAR細胞投與該患者；
其中該等CD4
IL - 10 / CAR細胞包含藉由載體介導之一或多個載體之基因轉移而經基因修飾的CD4
+T細胞，該一或多個載體包含處於組成型啟動子或誘導型啟動子控制下的人類IL-10編碼序列及處於組成型啟動子或誘導型啟動子控制下的CAR編碼序列；
其中該等CD4
IL - 10 / CAR細胞靶向且殺滅該患者中的癌細胞；
其中該等CD4
IL - 10 / CAR細胞在投與該患者之前，對宿主同種異體抗原未失能；及
其中該等CD4
IL - 10 / CAR細胞對於該患者而言為非自體的且為Tr1樣的。
在另一態樣中，本發明的特徵為藉由同種異體造血幹細胞移植體(同種異體HSCT)治療血液學癌症的方法，其包含：
向患者投與同種異體HSCT移植物；
將一量之CD4
IL - 10 / CAR細胞投與該患者，視情況其中該量足以抑制或預防移植物抗宿主疾病(GvHD)而不抑制該同種異體HSCT移植物之移植物抗白血病(GvL)或移植物抗腫瘤(GvT)功效，
其中該等CD4
IL - 10 / CAR細胞包含藉由載體介導之一或多個載體之基因轉移而經基因修飾的CD4
+T細胞，該一或多個載體包含處於組成型啟動子或誘導型啟動子控制下的人類IL-10編碼序列及處於組成型啟動子或誘導型啟動子控制下的CAR編碼序列；
其中該等CD4
IL - 10 / CAR細胞靶向且殺滅該患者中的癌細胞；
其中該等CD4
IL - 10 / CAR細胞在投與該患者之前，對宿主同種異體抗原未失能；及
其中該等CD4
IL - 10 / CAR細胞對於該患者而言為自體的且為Tr1樣的。
在另一態樣中，本發明的特徵為一種預防患者之CD19
+、CD20
+、CD22
+、CD27
+、CD38
+、BCMA
+或B7-H3
+血液學癌症復發的方法，其包含：
將足以誘導抗癌作用之治療有效量之所提供之該等CD4
IL - 10 / CAR細胞中之任一者、本文所提供之該CD4
IL - 10 / CAR細胞群中之任一者或本文所提供之該等醫藥組合物中之任一者投與患者，該患者經鑑別患有CD19
+、CD20
+、CD22
+、BCMA+或B7-H3
+血液學癌症或處於CD19
+、CD20
+、CD22
+、BCMA
+或B7-H3
+血液學癌症復發之風險中。在一些實施例中，投與HSCT之後，投與CD4
IL - 10 / CAR細胞。
在另一態樣中，本發明的特徵為一種預防患者之B7-H3
+癌症復發的方法，其包含：將足以誘導抗癌作用之治療有效量之所提供之任一種CD4
IL - 10 / CAR細胞、本文所提供之任一種CD4
IL - 10 / CAR細胞群或本文所提供之任一種醫藥組合物投與經鑑別患有B7-H3
+癌症的患者。
在一些實施例中，B7-H3
+癌症為實體腫瘤。
在一些實施例中，實體腫瘤係選自由以下組成之群：乳癌、腦癌、肺癌、肝癌、胃癌、脾癌、大腸癌、腎癌、胰臟癌、前列腺癌、子宮癌、皮膚癌、頭癌、頸癌、肉瘤、神經母細胞瘤及卵巢癌。
在另一態樣中，本發明的特徵為一種治療患有微量殘存疾病之患者的方法，其包含：
將足以誘導抗癌作用之治療有效量之所提供之該等CD4
IL - 10 / CAR細胞中之任一者、本文所提供之該CD4
IL - 10 / CAR細胞群中之任一者或本文所提供之該等醫藥組合物中之任一者投與經鑑別患有微量殘存疾病或處於患有微量殘存疾病之風險中的患者。
在另一態樣中，本發明的特徵為一種治療患者的方法，其包含：向需要免疫耐受之患者投與治療有效量之所提供之任一種CD4
IL - 10 / CAR細胞、本文所提供之任一種CD4
IL - 10 / CAR細胞群或本文所提供之任一種醫藥組合物。
在一些實施例中，該方法進一步包含將CD4
IL - 10 / CAR細胞或CD4
IL - 10 / CAR細胞群之冷凍懸浮液解凍的先行步驟。
在一些實施例中，患者患有發炎或自體免疫疾病。
在一些實施例中，發炎或自體免疫疾病係選自由以下組成之群：自體免疫葡萄膜炎、牛皮癬、白斑病、斑禿、牛皮癬性關節炎、發炎性腸病、橋本氏甲狀腺炎(Hashimoto's thyroiditis)、自體免疫血管炎、潰瘍性大腸炎、大皰性疾病、硬皮病、乳糜瀉、葛瑞夫茲氏病(graves disease)、全身性硬化症、重症肌無力、抗NMDA腦炎、類天疱瘡疾病(尋常性類天疱瘡及落葉狀類天疱瘡)、後天大皰性表皮鬆懈、血栓性血小板減少性紫癲、特發性血小板性紫癜、自體抗體誘導血管發炎、自體抗體誘導心臟炎、類風濕性關節炎、自體抗體誘導類風濕性關節炎、視神經脊髓炎譜系疾病、全身性紅斑狼瘡(SLE)、多發性硬化症(MS)、休格連氏症候群(sjögren's syndrome)、自體免疫肌病、I型糖尿病、艾迪生疾病(addison disease)、惡性貧血、自體免疫肝炎、原發性膽汁性膽管炎(PBC)、自體免疫胰臟炎、古巴士德氏疾病(goodpasture's disease)、原發膜性腎病變、卵巢功能不全、自體免疫睪丸炎、乾眼病、再生障礙性貧血、自體免疫嗜中性球減少症及特發性間質性肺炎。
在一些實施例中，發炎或自體免疫疾病為克羅恩氏病(Crohn's disease)、潰瘍性大腸炎、乳糜瀉、1型糖尿病、狼瘡、牛皮癬、牛皮癬性關節炎、僵直性脊椎炎或類風濕性關節炎。
在一些實施例中，患者患有涉及NLPR3發炎體高度活化的疾病或病症。
在一些實施例中，患者患有2型糖尿病、神經退化性疾病、心血管疾病或發炎性腸病。
在一些實施例中，患者患有涉及活化單核球、巨噬細胞或樹突狀細胞之IL-1β產生增加的疾病或病症。
在一些實施例中，患者患有涉及活化單核球、巨噬細胞或樹突狀細胞之IL-18產生增加的疾病或病症。
在一些實施例中，患者患有涉及活化單核球、巨噬細胞或樹突狀細胞之成熟凋亡蛋白酶1產生增加的疾病或病症。
在一些實施例中，患者患有過敏性或異位性疾病。
在一些實施例中，其中過敏性或異位性疾病係選自由哮喘、異位性皮炎及鼻炎組成之群。
在一些實施例中，患者具有食物過敏。
在一些具體例中，患者患有實體腫瘤。
在一些實施例中，實體腫瘤係選自由以下組成之群：乳癌、腦癌、肺癌、肝癌、胃癌、脾癌、大腸癌、腎癌、胰臟癌、前列腺癌、子宮癌、皮膚癌、頭癌、頸癌、肉瘤、神經母細胞瘤及卵巢癌。
在一些實施例中，該方法進一步包含在投與CD4
IL - 10 / CAR細胞、CD4
IL - 10 / CAR細胞群或醫藥組合物之前或之後將器官移植至患者的步驟。在一些實施例中，CD4
IL - 10 / CAR細胞、CD4
IL - 10 / CAR細胞群或醫藥組合物預防器官移植之宿主排斥反應或降低該宿主排斥反應的嚴重程度。
在一些實施例中，該方法進一步包含在投與CD4
IL - 10 / CAR細胞、CD4
IL - 10 / CAR細胞群或醫藥組合物之前或之後將iPS細胞衍生的細胞或組織移植至患者的步驟。在一些實施例中，CD4
IL - 10 / CAR細胞、CD4
IL - 10 / CAR細胞群或醫藥組合物預防細胞移植之宿主排斥反應或降低該宿主排斥反應的嚴重程度。
在一些實施例中，該方法進一步包含在投與CD4
IL - 10 / CAR細胞、CD4
IL - 10 / CAR細胞群或醫藥組合物之前或之後將重組AAV投與患者的步驟。在一些實施例中，CD4
IL - 10 / CAR細胞、CD4
IL - 10 / CAR細胞群或醫藥組合物減少針對重組AAV的免疫反應。
在一些實施例中，該方法進一步包含在投與CD4
IL - 10 / CAR細胞、CD4
IL - 10 / CAR細胞群或醫藥組合物之前或之後將除AAV之外的重組病毒載體投與患者的步驟。在一些實施例中，CD4
IL - 10 / CAR細胞、CD4
IL - 10 / CAR細胞群或醫藥組合物減少針對除AAV之外之重組病毒載體的免疫反應。
在一些實施例中，該方法進一步包含在投與CD4
IL - 10 / CAR細胞、CD4
IL - 10 / CAR細胞群或醫藥組合物之前或之後將免疫原性治療蛋白投與患者的步驟。在一些實施例中，CD4
IL - 10 / CAR細胞、CD4
IL - 10 / CAR細胞群或醫藥組合物減少針對免疫原性治療蛋白的免疫反應。在一些實施例中，免疫原性治療蛋白係選自治療抗體、因子VIII替代品、細胞介素及細胞介素突變蛋白。
在一些實施例中，患者對病毒或細菌感染具有過度的免疫反應。在一些實施例中，個體具有冠狀病毒感染。在一些實施例中，患者具有器官及/或組織損傷。
在一些實施例中，該方法進一步包含偵測獲自患者之生物樣品中之選擇標記物的步驟，藉此偵測CD4
IL - 10 / CAR細胞的存在或不存在。
在一些實施例中，生物樣品為來自患者的生檢或血液。
在另一態樣中，本發明的特徵為一種治療或抑制患者之自體免疫疾病、過敏性疾病或發炎疾病的方法，其包含：將足以治療或抑制自體免疫疾病、過敏性疾病或發炎疾病之治療有效量的所提供之任一種CD4
IL - 10 / CAR細胞、本文所提供之任一種CD4
IL - 10 / CAR細胞群或本文所提供之任一種醫藥組合物投與經鑑別患有自體免疫疾病、過敏性疾病或發炎疾病的患者。
在另一態樣中，本發明的特徵為一種減少移植有造血幹細胞、骨髓細胞、臍帶血細胞、組織幹細胞或實體器官之患者之移植排斥反應的方法，其包含：將足以減少移植排斥反應之治療有效量之所提供之任一種CD4
IL - 10 / CAR細胞、本文所提供之任一種CD4
IL - 10 / CAR細胞群或本文所提供之任一種醫藥組合物投與經鑑別具有所移植之造血幹細胞、骨髓細胞、組織幹細胞或實體器官之排斥反應的患者。
在另一態樣中，本發明的特徵為一種治療患者之移植物抗宿主疾病(GvHD)的方法，其包含：將足以抑制或預防GvHD之治療有效量之所提供之任一種CD4
IL - 10 / CAR細胞、本文所提供之任一種CD4
IL - 10 / CAR細胞群或本文所提供之任一種醫藥組合物投與經鑑別患有移植物抗宿主疾病(GvHD)或處於患有移植物抗宿主疾病(GvHD)風險中的患者。
在一些實施例中，移植物抗宿主疾病(GvHD)包含急性GvHD。
在一些實施例中，移植物抗宿主疾病(GvHD)包含慢性GvHD。
在另一態樣中，本發明的特徵為一種治療患者之組織或器官損傷的方法，其包含：將足以誘導組織或器官損傷修復之治療有效量之本文所提供之任一種CD4
IL - 10 / CAR細胞、本文所提供之任一種CD4
IL - 10 / CAR細胞群或本文所提供之醫藥組合物投與經鑑別具有組織或器官損傷或處於具有組織或器官損傷風險中的患者。
在另一態樣中，本發明的特徵為聚核苷酸構築體，其包含：(a)編碼嵌合抗原受體(CAR)的第一聚核苷酸區段；及(b)編碼介白素-10 (IL-10)的第二聚核苷酸區段。
在一些實施例中，第一聚核苷酸區段包含可操作地連接至CAR編碼序列的調控元件。在一些實施例中，調控元件驅動CAR組成性表現。
在一些實施例中，第二聚核苷酸區段包含可操作地連接至IL-10編碼序列的調控元件。在一些實施例中，調控元件驅動IL-10組成性表現。
在一些實施例中，該方法進一步包含介於第一聚核苷酸區段與第二聚核苷酸區段之間的內部核糖體進入位點(IRES)或自裂解肽。在一些實施例中，自裂解肽係選自由F2A、P2A、T2A及E2A組成之群。
在一些實施例中，CAR包含抗原結合域、鉸鏈區、跨膜域及胞內信號傳導域。
在一些實施例中，抗原結合域包含單鏈抗體片段。在一些實施例中，單鏈抗體片段包含單鏈Fv (scFv)。
在一些實施例中，抗原結合域靶向與自體免疫疾病、發炎病症或癌症有關的抗原。
在一些實施例中，該抗原係選自由以下組成之群：CD19、CD20、CD22、BCMA、B7-H3、CD27、CD38、CEA. BCMA、CD23、Lyml、Lym2、CLEC5A、CDH179b、FLT3、GCC、Muc、CSF2RA、GFRa4、CD32、CD33、IL1lRa、IL13Ra、NYBRI、SLea、CD200R、TGFBetaR2、CD276、TROP2、LAMP1、PTK7、DLL3、CDH1、CDH6、CDH17、CDH19、TSHR、酪胺酸酶、HLA-A2、瓜胺酸化肽、胰島素、GAD65、IA2、麥膠蛋白及橋粒醣蛋白。
在一些實施例中，抗原結合域為抗CD19抗原結合域。在一些實施例中，抗CD19抗原結合域包含SEQ ID NO: 11之序列。
在一些實施例中，抗原結合域為抗CD20抗原結合域。在一些實施例中，抗CD20抗原結合域包含SEQ ID NO: 18之序列。
在一些實施例中，鉸鏈區係選自人類CD8鉸鏈區、人類CD28鉸鏈區、IgG1鉸鏈區或IgG4鉸鏈區。在一些實施例中，鉸鏈區源於人類CD8。
在一些實施例中，跨膜域係選自TNFRSF 19跨膜域、CD3ζ跨膜域、CD8α跨膜域、CD4跨膜域、CD28跨膜域或B7家族誘導型共刺激(ICOS)跨膜域。在一些實施例中，跨膜域源於CD8α。
在一些實施例中，CAR進一步包含一或多個共刺激域。
在一些實施例中，CAR包含兩個共刺激域。
在一些實施例中，一或多個共刺激域選自由以下組成之群：4-1BB、CD28、OX40、ICOS、CD27、MYD88-CD40及KIR2DS2。
在一些實施例中，一或多個共刺激域中之一者源於CD28。
在一些實施例中，第二共刺激域源於4-1BB。
在一些實施例中，胞內信號傳導域包含基於酪胺酸之免疫受體活化模體(ITAM)。在一些實施例中，基於酪胺酸之免疫受體活化模體(ITAM)源於CD3ζ。
在一些實施例中，CAR包含：抗CD19抗原結合域、BCMA或抗CD20抗原結合域；人類CD8鉸鏈區；CD8跨膜區；4 CD28共刺激域；及CD3ζ鏈胞內信號傳導域。
在一些實施例中，CAR包含SEQ ID NO: 9、16、22或34之序列。
在一些實施例中，第一聚核苷酸區段包含SEQ ID NO: 10、17、23、35或55之序列。
在一些實施例中，IL-10為人類IL-10。在一些實施例中，IL-10為病毒IL-10。
在一些實施例中，IL-10為具有SEQ ID NO: 1之序列的蛋白質。
在一些實施例中，第二聚核苷酸區段包含SEQ ID NO: 2之序列。
在一些實施例中，第一聚核苷酸區段或第二聚核苷酸區段進一步包含編碼選擇標記物的序列。
在一些實施例中，選擇標記物為ΔNGFR。在一些實施例中，ΔNGFR具有SEQ ID NO: 3之序列。
在一些實施例中，聚核苷酸構築體包含SEQ ID NO: 4之序列。
在一些實施例中，選擇標記物為EGFR多肽的截斷形式。
在一些實施例中，構築體為載體。在一些實施例中，載體為病毒載體。在一些實施例中，載體為慢病毒載體。
在另一態樣中，本發明的特徵為一種聚核苷酸構築體，其包含：具有SEQ ID NO: 10、17、23、35或55之序列的第一聚核苷酸區段；及具有SEQ ID NO: 2之序列的第二聚核苷酸區段。
在另一態樣中，本發明的特徵為一種聚核苷酸構築體，其包含：具有SEQ ID NO: 10、17、23、35或55之序列的第一聚核苷酸區段；具有SEQ ID NO: 2之序列的第二聚核苷酸區段；及介於第一聚核苷酸區段與第二聚核苷酸區段之間的具有SEQ ID NO: 33之序列之第三聚核苷酸區段。
在另一態樣中，本發明的特徵為一種聚核苷酸構築體，其包含：具有SEQ ID NO: 10、17、23、35或55之序列的第一聚核苷酸區段；具有SEQ ID NO: 2之序列的第二聚核苷酸區段；介於第一聚核苷酸區段與第二聚核苷酸區段之間的具有SEQ ID NO: 27之序列之第三聚核苷酸區段；及具有SEQ ID NO: 4之序列的第四聚核苷酸區段。
在另一態樣中，本發明的特徵為單供體或多供體的CD4
IL - 10細胞，其中IL-10為病毒IL-10。病毒IL-10具有SEQ ID NO: 6或18之序列。在一些實施例中，病毒IL-10係由具有SEQ ID NO: 7之序列的聚核苷酸編碼。在一些實施例中，IL-10為人類IL-10，其中來自人類IL-10的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個或十個胺基酸經來自病毒IL-10的相應胺基酸序列置換。在一些實施例中，用處於組成型啟動子控制下的外源病毒IL-10轉導CD4
+T細胞。在一些實施例中，表現控制元件驅動活化的CD4
+T細胞表現病毒IL-10。在一些實施例中，編碼病毒IL-10的外源聚核苷酸整合於T細胞核基因體中。在一些實施例中，編碼病毒IL-10的外源聚核苷酸不整合於T細胞核基因體中。在一些實施例中，編碼病毒IL-10的外源聚核苷酸具有SEQ ID NO: 7之序列。
在另一態樣中，本發明的特徵為來自單供體或多供體的CD4
IL - 10細胞，其中IL-10為小家鼠「小鼠」(SEQ ID NO: 58)；褐家鼠「大鼠」(SEQ ID NO: 59)；恆河獼猴「MACMU」(SEQ ID NO: 60)；金剛猩猩「大猩猩」(SEQ ID NO: 61)；食蟹獼猴「CYNO」(SEQ ID NO: 62)；阿努比斯狒狒「東非狒狒」(SEQ ID NO: 63)；倭黑猩猩「BONOBO」(SEQ ID NO: 64)；黑猩猩「CHIMP」(SEQ ID NO: 65)；及EBVB9 (SEQ ID NO: 66)的IL-10。在一些實施例中，IL-10為蛋白質，該蛋白質與小家鼠「小鼠」(SEQ ID NO: 58)；褐家鼠「大鼠」(SEQ ID NO: 59)；恆河獼猴「MACMU」(SEQ ID NO: 60)；金剛猩猩「大猩猩」(SEQ ID NO: 61)；食蟹獼猴「CYNO」(SEQ ID NO: 62)；阿努比斯狒狒「東非狒狒」(SEQ ID NO: 63)；倭黑猩猩「BONOBO」(SEQ ID NO: 64)；黑猩猩「CHIMP」(SEQ ID NO: 65)；及EBVB9 (SEQ ID NO: 66)之IL-10具有至少90%、95%、98%或99%序列一致性。
在另一態樣中，本發明的特徵為來自單供體或多供體的CD4
IL - 10細胞，其中IL-10為人類IL-10變異體。人類IL-10變異體具有SEQ ID NO: 67或SEQ ID NO: 68之序列。在一些實施例中，IL-10為人類IL-10，其中來自人類IL-10的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個或十個胺基酸經來自另一物種之IL-10 (例如小家鼠「小鼠」(SEQ ID NO: 58)；褐家鼠「大鼠」(SEQ ID NO: 59)；恆河獼猴「MACMU」(SEQ ID NO: 60)；金剛猩猩「大猩猩」(SEQ ID NO: 61)；食蟹獼猴「CYNO」(SEQ ID NO: 62)；阿努比斯狒狒「東非狒狒」(SEQ ID NO: 63)；倭黑猩猩「BONOBO」(SEQ ID NO: 64)；黑猩猩「CHIMP」(SEQ ID NO: 65)；及EBVB9 (SEQ ID NO: 66)之IL-10)的相應胺基酸序列置換。在一些實施例中，用組成型啟動子控制下的外源IL-10變異體轉導CD4
+T細胞。在一些實施例中，表現控制元件驅動活化的CD4
+T細胞表現IL-10變異體。在一些實施例中，編碼IL-10變異體的外源聚核苷酸整合於T細胞核基因體中。在一些實施例中，編碼IL-10變異體的外源聚核苷酸不整合於T細胞核基因體中。
在又另一態樣中，本發明提供一種製備病毒IL-10 CD4
IL - 10的方法，該方法包含以下步驟：
(i)自T細胞單供體獲得原代CD4
+T細胞；及
(ii)藉由引入編碼病毒IL-10的外源聚核苷酸來修飾該等供體CD4
+T細胞，
藉此獲得經基因修飾的CD4
+T細胞。
在一些實施例中，在步驟(i)之後或在步驟(ii)之後，該方法進一步包含在抗CD3抗體及抗CD28抗體或經抗CD3抗體及CD28抗體塗覆的珠粒存在下培育原代CD4
+T細胞的步驟。
在一些實施例中，該方法包含進一步在IL-2存在下培育原代CD4
+T細胞。在一些實施例中，使用載體遞送編碼病毒IL-10的外源聚核苷酸。
在一些實施例中，編碼病毒IL-10的外源聚核苷酸包含編碼選擇標記物的區段。在一些實施例中，所編碼的選擇標記物為ΔNGFR。在一些實施例中，所編碼的選擇標記物具有SEQ ID NO: 3之序列。在一些實施例中，所編碼的選擇標記物為截斷的EGFR多肽。在一些實施例中，所編碼的選擇標記物為截斷的人類EGFR多肽。
在一些實施例中，在步驟(ii)之後，該方法進一步包含分離出表現選擇標記物之經基因修飾之CD4
+T細胞的步驟，藉此產生經富集之經基因修飾之CD4
+T細胞群。
在一些實施例中，該方法進一步包含培育經富集之經基因修飾之CD4
+T細胞群的步驟。在一些實施例中，培育經富集之經基因修飾之CD4
+T細胞群的步驟係在抗CD3抗體及抗CD28抗體或經CD3抗體及CD28抗體塗覆之珠粒存在下、在IL-2存在下執行。
在一些實施例中，在步驟(i)中，原代CD4
+T細胞係獲自冷凍儲備液。在一些實施例中，在步驟(i)中，原代CD4
+T細胞係獲自T細胞單供體的未冷凍周邊血液單核細胞。
在一些實施例中，該方法進一步包含自周邊血液單核細胞中分離出CD4
+T細胞的步驟。在一些實施例中，周邊血液單核細胞獲自白血球層或血球分離術。
1. 相關申請案之交叉參考
本申請案主張2021年12月30日申請之美國臨時申請案第63/295,491號的權益，該案以全文引用之方式併入本文中。
2. 序列表
本申請案含有序列表，該序列表已以XML格式提交且以全文引用的方式併入本文中。該XML複本於2022年12月24日創建，命名為37104-50735-Sequence-Listing.xml，且大小為95.2千位元組(KB)。
6.1. 定義
除非另外定義，否則本文所用之所有技術及科學術語均具有熟習本發明所屬技術者通常所瞭解的含義。如本文所用，以下術語具有下文中賦予其之含義。
「
移植物抗白血病效應」或「
GvL」係指同種異體造血幹細胞移植(HSCT)或骨髓移植(BMT)之後出現的效應。同種異體移植物中的T淋巴球排除殘餘的宿主惡性白血病細胞。
「
移植物抗腫瘤效應」或「
GvT」係指同種異體造血幹細胞移植(HSCT)或骨髓移植(BMT)之後出現的效應。同種異體移植物中的T淋巴球排除殘餘的宿主惡性癌細胞，例如骨髓瘤及淋巴及骨髓白血病、淋巴瘤、多發性骨髓瘤及可能乳癌的細胞。術語GvT與GvL通用。
術語「
治療 ( treatment )」、「
治療 ( treating )」及類似術語在本文中以最廣泛的意義使用，如醫學技術中所瞭解。特定而言，該術語通常意謂獲得所需的藥理學及/或生理學作用。如本文所用，「治療」涵蓋對哺乳動物(尤其人類)之疾病或病狀的任何治療，且包括：(a)預防易患該疾病或病狀、但尚未確診之個體發生該疾病或病狀；(b)抑制該疾病或病狀(例如遏制其發展)；或(c)減輕該疾病或病狀(例如促使該疾病或病狀消退，從而達成一或多種症狀的改善)。任何病狀之改善可容易根據此項技術中已知的標準方法及技術評估。藉由該方法治療該疾病之個體群包括罹患非所要病狀或疾病之個體以及處於發生該病狀或疾病之風險下的個體。
如本文所用，「
HLA 匹配」係指一對個體在I類HLA (HLA-A、HLA-B及HLA-C)及II類HLA (HLA-DRB1及HLA-DQB1)基因座中存在匹配的HLA對偶基因，此允許該等個體在免疫學上彼此間相容。可使用在此項技術中可利用的任一種方法測定HLA相容性，例如如Tiervy, Haematologica 2016 Volume 101(6):680-687中所述，該文獻以引用的方式併入本文中。
對於指定的基因座而言，當一位個體的兩個對偶基因中之每一者與另一位個體之兩個對偶基因匹配時，個體對存在2/2匹配。當一位個體的兩個對偶基因中僅一者與另一位個體的兩個對偶基因之一匹配時，個體對存在½匹配。當一位個體的十個對偶基因(HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1及HLA-DQB1基因座中之每一者存在兩個對偶基因)全部與另一位個體的所有十個對偶基因匹配時，個體對在HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1及HLA-DQB1基因座具有10/10匹配。
在較佳實施例中，利用對偶基因層面的分型測定HLA相容性。對偶基因層面的分型對應於HLA基因的獨特核苷酸序列，如藉由在第一、第二、第三及第四區域中使用所有數字所定義，例如A*02:01:01:01。在功能上，表徵其中差異分別為編碼序列中之靜默取代及非編碼序列中之取代之對偶基因的第三與第四區域不相關，但當取代有礙於HLA對偶基因表現時除外(例如無效對偶基因B*15:01:01:02N)。缺失無效對偶基因將引起錯配，該錯配有很大可能被同種異體反應性T細胞識別且具有有害的臨床影響。非編碼序列中的取代可影響表現量(例如A24低對偶基因A*24:02:01:02L)。此類可變性亦可影響抗HLA同種異體識別。
如本文所用，術語「
HLA 錯配」係指一對個體在I類HLA (HLA-A、HLA-B及HLA-C)及II類HLA (HLA-DRB1及HLA-DQB1)基因座中存在錯配的HLA對偶基因，此使得該等個體在免疫學上彼此間不相容。
如本文所用，術語「
HLA 部分錯配」係指一對個體在I類HLA (HLA-A、HLA-B及HLA-C)及II類HLA (HLA-DRB1及HLA-DQB1)基因座中存在錯配的HLA對偶基因，此使得該等個體在免疫學上彼此間存在可容許程度的不相容。一些研究已鑑別出容許錯配。一些I類HLA不相容性被認為容許程度較大。
「
HLA 單倍型」係指染色體上的一系列HLA基因座對偶基因：一個傳自母親且一個傳自父親。可利用I類HLA (HLA-A、HLA-B及HLA-C)及II類HLA (HLA-DRB1及HLA-DQB1)基因座的基因型確定HLA單倍型。
術語「
治療有效量」為有效治療疾病且從而改善疾病之症狀之量。
術語「
預防有效量」為就完全或部分地預防疾病、病狀或其症狀而言有效的量。
術語「
改善」係指治療疾病狀態(例如神經退化性疾病狀態)時的任何治療有益結果，包括其預防、嚴重程度減輕或進展減緩、緩解或治癒。
術語「
CD4
IL - 10 / CAR 」係指經基因修飾以表現嵌合抗原受體的任何CD4
IL - 10細胞。在其中CD4
IL - 10 / CAR係指特定嵌合抗原受體的情況下，命名法可包括CAR之特異性標識，例如「CD4
IL - 10 / 抗 [ 抗原 ] CAR」細胞。舉例而言，CD4
IL - 10 / CAR與CD4
IL - 10 / CD19 CAR可互換使用。
如本文所用，術語「
自體」係指源於細胞再引入之同一個體(例如患者)的細胞。
如本文所用，術語「
同種異體」係指獲自相同物種之不相同基因之兩個或更多個不同個體的細胞。
6.2. 其他詮釋性慣例
本文所列舉之範圍應理解為範圍內所有值之簡寫，包括所述端點。舉例而言，範圍1至50應理解為包括選自由以下組成之群之任何數字、數字組合或子範圍：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49及50。
6.3. CD4
IL-10/CAR細胞
在第一態樣中，描述CD4
+T細胞或CD4
+T細胞群(CD4
IL - 10 / CAR細胞)，其已經基因修飾以經由編碼CAR之第一外源聚核苷酸表現嵌合抗原受體(CAR)以及經由編碼IL-10之第二外源聚核苷酸表現IL-10。
6.3.1. CD4
+T細胞及T細胞供體
可使用此項技術中可利用的方法，自來自供體(較佳為人類供體)之周邊血液、臍帶血或其他血液樣品中分離出用於產生CD4
IL - 10 / CAR(自體或同種異體單供體CD4
IL - 10 / CAR或同種異體多供體CD4
IL - 10 / CAR)群體的CD4
+T細胞。在典型實施例中，自周邊血液中分離出CD4
+T細胞。在某些實施例中，使用白血球清除術及白血球層分離出CD4
+T細胞。在某些實施例中，自獲自第三方的周邊血液中分離出CD4
+T細胞。
在一些實施例中，自預先冷凍的血液儲備液或預先冷凍的周邊血液單核細胞(PBMC)儲備液或預先冷凍的CD4
+T細胞儲備液中分離出CD4
+T細胞。在一些實施例中，自未預先冷凍的周邊血液或PBMC中分離出CD4
+T細胞。在一些實施例中，自獲自個別供體之血液或PBMC中分別分離出CD4
+T細胞且接著彙集。在一些實施例中，首先彙集來自複數個供體的血液或PBMC，自該血液或PBMC中分離出CD4
+T細胞。
在一些實施例中，自T細胞單供體獲得CD4
+T細胞。在一些實施例中，自兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個或十個不同T細胞供體獲得原代CD4
+T細胞。
在一些實施例中，自將經CD4
IL - 10 / CAR細胞治療的患者獲得CD4
+T細胞。
在一些實施例中，不考慮基因型來選擇一或多個T細胞供體。在一些實施例中，基於基因型來選擇一或多個T細胞供體。
在某些實施例中，基於HLA單倍型來選擇一或多個T細胞供體。
在一些實施例中，至少兩個不同T細胞供體中的一些或全部存在匹配的HLA單倍型。在一些實施例中，至少兩個不同T細胞供體中的一些或全部存在錯配的HLA單倍型。
在一些實施例中，群體中的所有CD4
+T細胞在HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1及HLA-DQB1基因座彼此具有至少1/10、2/10、3/10、4/10、5/10、6/10、7/10、8/10或9/10匹配。在一些實施例中，群體中的所有CD4
+T細胞在HLA-A、HLA-B、HLA-C及HLA-DRB1基因座彼此具有至少1/8、2/8、3/8、4/8、5/8、6/8、7/8或8/8匹配。在一些實施例中，群體中的所有CD4
+T細胞在HLA-A基因座彼此具有2/2匹配。在一些實施例中，群體中的所有CD4
+T細胞在HLA-B基因座彼此具有2/2匹配。在一些實施例中，群體中的所有CD4
+T細胞在HLA-C基因座彼此具有2/2匹配。在一些實施例中，群體中的所有CD4
+T細胞在HLA-DRB1及HLA-DQB1基因座彼此具有至少3/4或4/4匹配。在一些實施例中，群體中的所有CD4
+T細胞具有A*02對偶基因或A*24對偶基因。
在一些實施例中，一或多個T細胞供體中無一者為待經CD4
IL - 10 / CAR細胞治療之宿主。在一些實施例中，一或多個T細胞供體中無一者為將聯合CD4
IL - 10 / CAR細胞用於本文所述之治療方法中之幹細胞(例如HSC)、組織或器官的供體。在一些實施例中，T細胞供體中之一或多者為待經CD4
IL - 10 / CAR細胞治療之宿主。
在一些實施例中，一或多個T細胞供體與待治療之患者(宿主)為HLA錯配或部分的HLA錯配。在一些實施例中，一或多個T細胞供體與患者在HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1及HLA-DQB1基因座具有小於5/10、6/10、7/10、8/10、9/10或10/10匹配。在一些實施例中，一或多個T細胞供體與患者在HLA-A、HLA-B、HLA-C及HLA-DRB1基因座具有小於4/8、5/8、6/8、7/8或8/8匹配。在一些實施例中，一或多個T細胞供體與患者在HLA-A、HLA-B或HLA-C基因座具有小於2/2匹配。在一些實施例中，一或多個T細胞供體與患者在HLA-DRB1及HLA-DQB1基因座具有小於2/4、3/4或4/4匹配。
在一些實施例中，一或多個T細胞供體與HSC供體為HLA錯配或部分的HLA錯配。在一些實施例中，一或多個T細胞供體與HSC供體在HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1及HLA-DQB1基因座具有小於5/10、6/10、7/10、8/10、9/10或10/10匹配。在一些實施例中，一或多個T細胞供體與HSC供體在HLA-A、HLA-B、HLA-C及HLA-DRB1基因座具有小於4/8、5/8、6/8、7/8或8/8匹配。在一些實施例中，一或多個T細胞供體與HSC供體在HLA-A、HLA-B或HLA-C基因座具有小於2/2匹配。在一些實施例中，一或多個T細胞供體與HSC供體在HLA-DRB1及HLA-DQB1基因座具有小於3/4或4/4匹配。
在較佳實施例中，CD4
+T細胞皆未永生化。
6.3.2. 編碼CAR的外源聚核苷酸
本發明之CD4
IL10 / CAR細胞為CD4
+T細胞，其已經基因修飾以經由編碼CAR之第一外源聚核苷酸區段表現編碼嵌合抗原受體(CAR)且包含編碼嵌合抗原受體(CAR)的第一外源聚核苷酸區段。CAR採用模組化設計，其具有四種主要組件：抗原結合域、鉸鏈、跨膜域及胞內信號傳導域。此等元件中之每一者具有獨特的功能且CAR的最佳分子設計可經由組成性蛋白域的多種變型來達成，如(
Nat . Rev . Clin . Onco ., 17: 147-167 (2020)，該文獻以全文引用之方式併入本文)中所述。
在一些實施例中，編碼聚核苷酸區段的CAR編碼第一代CAR、第二代CAR或第三代CAR。在一些實施例中，第一代CAR包括抗原結合域、鉸鏈區、跨膜域及胞內信號傳導域。在一些實施例中，第二代CAR包括抗原結合域、鉸鏈區、跨膜域、共刺激域及胞內信號傳導域。第二代CAR之非限制性實例包括美國專利公開案第2004/0043401號、第2013/0287748號、第2014/0227237號、第2014/0099309號及第2014/0050708號；WO 2012/079000；及WO 2015/157252中所述的彼等CAR，該等文獻以全文引用的方式併入本文中。
在一些實施例中，第二代CAR為pCAR。在一些實施例中，pCAR包含第二代CAR，其包含：(i)(a)信號傳導區；(b)共刺激信號傳導區；(c)跨膜域；及(d)與目標抗原上之第一抗原決定基特異性相互作用的第一結合元件；及(ii)嵌合共刺激受體(CCR)，其包含：(e)不同於(b)的共刺激信號傳導區；(f)跨膜域；及(g)與第二目標抗原上之第二抗原決定基特異性相互作用的第二結合元件。pCAR之非限制性實例如美國專利第10,703,794號中所述，該專利以全文引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，第三代CAR包含抗原結合域、鉸鏈區、跨膜域、第一共刺激域及第二共刺激域以及胞內信號傳導域。第三代CAR之非限制性實例包括美國專利公開案第2014/0322275A1號；第2019/0345217號；第2019/0112380A1號；及第2020/0031904A1號中所述的彼等CAR，該等專利以全文引用的方式併入本文中。
在一些實施例中，抗原結合域包含單鏈抗體片段(例如scFv)、奈米抗體(例如駱駝科V
HH域)、細胞介素、配位體或肽(艾連素(adenectins)及錨蛋白重複蛋白(DARPins))。
6.3.2.1. 抗原結合域
在一些實施例中，CAR之抗原結合域包含單鏈抗體片段。在一些實施例中，單鏈抗體片段包含單鏈Fv (scFv)。
在一些實施例中，抗原結合域靶向與自體免疫疾病、發炎病症或癌症相關之抗原。在一些實施例中，抗原結合域靶向自體抗原。
在一些實施例中，抗原結合域靶向與自體免疫疾病或發炎病症相關之抗原。在一些實施例中，在相關MHC分子之上下文中，與自體免疫疾病或發炎病症有關的抗原係選自由但不限於以下組成之群：抗HLA-A*02、抗HLA-A*24或瓜胺酸化肽、胰島素、MOG、GAD65、IA2、麥膠蛋白及橋粒醣蛋白。在一些實施例中，與自體免疫疾病或發炎病症相關之抗原選自由以下組成之群：CD19、CD20、CD22、CD27、BCMA及CD38。
在一些實施例中，抗原結合域靶向癌症相關抗原。在一些實施例中，癌症相關抗原係選自由以下組成之群：CD19、CD20、CD22、BCMA、B7-H3、CEA、BCMA、CD23、Lyml、Lym2、CLEC5A、CDH179b、FLT3、GCC、Muc、CSF2RA、GFRa4、CD32、CD33、IL1lRa、IL13Ra、NYBRI、SLea、CD200R、TGFBetaR2、CD276、TROP2、LAMP1、PTK7、DLL3、CDH1、CDH6、CDH17、CDH19、TSHR及酪胺酸酶。
在一些實施例中，抗原結合域靶向B細胞抗原。在一些實施例中，部分地基於B細胞抗原在B細胞分化期間的表現來選擇B細胞抗原，例如如圖4中所示。靶向B細胞抗原之抗原結合域之非限制性實例描述於WO 2020/010235中，該文獻以全文引用的方式併入本文中。在一些實施例中，抗原結合域靶向CD19。在一些實施例中，抗原結合域靶向CD20。在一些實施例中，抗原結合域靶向CD22。在一些實施例中，抗原結合域靶向BCMA。在一些實施例中，抗原結合域靶向B7-H3。在一些實施例中，抗原結合域靶向CD27。在一些實施例中，抗原結合域靶向CD38。在一些實施例中，抗原結合域靶向B細胞成熟抗原(BCMA)。在一些實施例中，抗原結合域靶向癌胚抗原(CEA)。
在一些實施例中，單鏈抗體片段包含結合至CD19 (例如分化簇19蛋白(CD19)(例如OMIM登錄號107265))的單鏈Fv (scFv)。
在一些實施例中，靶向CD19的scFv源於抗人類CD19特異性mAb殖株FMC63 (Nicholson等人,
Mol . Immunol ., 34(16-17): 1157-65 (1997)，該文獻以全文引用之方式併入本文中)。在一些實施例中，靶向CD19的scFv描述於美國專利公開案第2018/0355052號或第2020/0392200號或WO 2020/010235中，該等文獻各自以全文引用的方式併入本文中。
在一些實施例中，抗CD19抗原結合域包含SEQ ID NO: 11之序列。在一些實施例中，抗CD19抗原結合域包含與SEQ ID NO: 11具有至少80%、85%、90%、95%、98%或99%序列一致性之序列。在一些實施例中，編碼抗CD19抗原結合域之聚核苷酸區段包含SEQ ID NO: 12。在一些實施例中，編碼抗CD19抗原結合域之聚核苷酸區段包含與SEQ ID NO: 12具有至少80%、85%、90%、95%、98%或99%序列一致性之序列。
在一些實施例中，抗CD19抗原結合域包含重鏈可變域，該重鏈可變域包含與SEQ ID NO: 13具有至少80%、85%、90%、95%、98%或99%序列一致性的序列。在一些實施例中，抗CD19抗原結合域包含輕鏈可變域，該輕鏈可變域包含與SEQ ID NO: 14具有至少80%、85%、90%、95%、98%或99%序列一致性的序列。在一些實施例中，抗CD19抗原結合域包含：重鏈可變域，其包含與SEQ ID NO: 13具有至少80%、85%、90%、95%、98%或99%序列一致性的序列；及輕鏈可變域，其包含與SEQ ID NO: 14具有至少80%、85%、90%、95%、98%或99%序列一致性的序列。
在一些實施例中，單鏈抗體片段包含結合至CD20 (例如分化簇20蛋白(CD20)(例如OMIM登錄號112210))的單鏈Fv (scFv)。靶向CD20之scFv之非限制性實例包括WO 2020/010235及美國專利公開案第2020/0392200號中所述之實例，該公開案以全文引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，抗CD20抗原結合域包含SEQ ID NO: 18之序列。在一些實施例中，抗CD20抗原結合域包含與SEQ ID NO: 18具有至少90%、95%、98%或99%序列一致性之序列。在一些實施例中，編碼抗CD20抗原結合域之聚核苷酸區段包含SEQ ID NO: 19。在一些實施例中，編碼抗CD20抗原結合域之聚核苷酸區段包含與SEQ ID NO: 19具有至少80%、85%、90%、95%、98%或99%序列一致性之序列。
在一些實施例中，抗CD20抗原結合域包含重鏈可變域，該重鏈可變域包含與SEQ ID NO: 20具有至少80%、85%、90%、95%、98%或99%序列一致性之序列。在一些實施例中，抗CD20抗原結合域包含輕鏈可變域，該輕鏈可變域包含與SEQ ID NO: 21具有至少80%、85%、90%、95%、98%或99%序列一致性之序列。在一些實施例中，抗CD20抗原結合域包含重鏈可變域，其包含與SEQ ID NO: 20具有至少80%、85%、90%、95%、98%或99%序列一致性之序列；及輕鏈可變域，其包含與SEQ ID NO: 21具有至少80%、85%、90%、95%、98%或99%序列一致性之序列。
在一些實施例中，單鏈抗體片段包含結合至CD22 (例如分化簇22蛋白(CD22)(例如OMIM登錄號107266))的單鏈Fv (scFv)。靶向CD22之scFv之非限制性實例包括WO 2020/010235及美國專利公開案第2020/0392200號中所述之非限制性實例，該等文獻以全文引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，抗CD22抗原結合域包含SEQ ID NO: 24之序列。在一些實施例中，抗CD22抗原結合域包含與SEQ ID NO: 24具有至少80%、85%、90%、95%、98%或99%序列一致性之序列。在一些實施例中，編碼抗CD22抗原結合域之聚核苷酸區段包含SEQ ID NO: 25。在一些實施例中，編碼抗CD22抗原結合域之聚核苷酸區段包含與SEQ ID NO: 25具有至少80%、85%、90%、95%、98%或99%序列一致性之序列。
在一些實施例中，抗CD22抗原結合域包含重鏈可變域，其包含與SEQ ID NO: 26具有至少80%、85%、90%、95%、98%或99%序列一致性之序列。在一些實施例中，抗CD22抗原結合域包含輕鏈可變域，該輕鏈可變域包含與SEQ ID NO: 27具有至少80%、85%、90%、95%、98%或99%序列一致性之序列。在一些實施例中，抗CD22抗原結合域包含重鏈可變域，其包含與SEQ ID NO: 26具有至少80%、85%、90%、95%、98%或99%序列一致性之序列；及輕鏈可變域，其包含與SEQ ID NO: 27具有至少80%、85%、90%、95%、98%或99%序列一致性之序列。
在一些實施例中，單鏈抗體片段包含單鏈Fv (scFv)，其結合至B細胞成熟抗原(BCMA)，亦稱為腫瘤壞死因子受體超家族成員17 (TNFRSF17)。
靶向BCMA之scFv之非限制性實例包括US9765342B2或WO 2010/104949中所述的彼等實例，該等文獻以全文引用之方式併入。舉例而言，如WO 2010/104949中所述，抗BCMA scFv可包括A7D12.2、C11 D5.3、C12A3.2或C13F12.1抗體之抗原結合域。
在一些實施例中，抗BCMA抗原結合域包含重鏈可變域，該重鏈可變域包含與SEQ ID NO: 50或52具有至少80%、85%、90%、95%、98%或99%序列一致性的序列。在一些實施例中，抗BCMA抗原結合域包含輕鏈可變域，該輕鏈可變域包含與SEQ ID NO: 51或53具有至少80%、85%、90%、95%、98%或99%序列一致性的序列。在一些實施例中，抗BCMA抗原結合域包含重鏈可變域，其包含與SEQ ID NO: 50或52具有至少80%、85%、90%、95%、98%或99%序列一致性的序列；及輕鏈可變域，其包含與SEQ ID NO: 51或53具有至少80%、85%、90%、95%、98%或99%序列一致性的序列。
在一些實施例中，單鏈抗體片段包含結合至B7-H3 (例如CD276 (例如分化簇276蛋白(CD276)(例如OMIM登錄號605715))的單鏈Fv (scFv)。
靶向B7-H3之scFv之非限制性實例包括美國專利公開案第2016/0053017號及第2018/0346544號中所述之實例，該等公開案以全文引用之方式併入本文中。舉例而言，如美國專利公開案第2018/0346544號中所述，抗CD276 scFv可包括MGA271 (CD276.MG)、CD276.N1、CD276.N2、CD276.N3、CD276.N4或CD276.N5抗體之抗原結合域。
在一些實施例中，抗B7-H3抗原結合域包含SEQ ID NO: 36之序列。在一些實施例中，抗B7-H3抗原結合域包含與SEQ ID NO: 36具有至少80%、85%、90%、95%、98%或99%序列一致性之序列。在一些實施例中，編碼抗B7-H3抗原結合域之聚核苷酸區段包含SEQ ID NO: 37。在一些實施例中，編碼抗B7-H3抗原結合域之聚核苷酸區段包含與SEQ ID NO: 37具有至少80%、85%、90%、95%、98%或99%序列一致性之序列。
在一些實施例中，抗B7-H3抗原結合域包含重鏈可變域，該重鏈可變域包含與SEQ ID NO: 38具有至少80%、85%、90%、95%、98%或99%序列一致性之序列。在一些實施例中，抗B7-H3抗原結合域包含輕鏈可變域，該輕鏈可變域包含與SEQ ID NO: 39具有至少80%、85%、90%、95%、98%或99%序列一致性之序列。在一些實施例中，抗B7H3抗原結合域包含重鏈可變域，其包含與SEQ ID NO: 38具有至少80%、85%、90%、95%、98%或99%序列一致性之序列；及輕鏈可變域，其包含與SEQ ID NO: 39具有至少80%、85%、90%、95%、98%或99%序列一致性之序列。
在一些實施例中，單鏈抗體片段包含結合至CD27 (例如OMIM登錄號186711)之單鏈Fv (scFv)。
在一些實施例中，單鏈抗體片段包含結合至CD38 (例如OMIM登錄號107270)的單鏈Fv (scFv)。
在一些實施例中，單鏈抗體片段包含結合至CEA (例如癌胚抗原蛋白(CEA)(例如OMIM登錄號114890))的單鏈Fv (scFv)。
在一些實施例中，單鏈抗體片段包含結合至BCMA (例如B細胞成熟抗原(BCMA)(例如OMIM登錄號109545))的單鏈Fv (scFv)。
6.3.2.2. 鉸鏈區
鉸鏈區使胞外抗原結合域經由跨膜域連接至胞內信號傳導域(例如一或多個共刺激域及胞內信號傳導域)。鉸鏈提供足以克服空間位阻的柔性及促進抗原結合域近接及結合至目標抗原的適當長度。在一些實施例中，鉸鏈長度及組成方面的差異可影響經由CAR發生的抗原結合及信號傳導。舉例而言，鉸鏈區中之間隔子序列或添加至鉸鏈區中之間隔子序列促進抗原結合域近接及結合至目標抗原。在一些實施例中，鉸鏈區影響細胞介素產生。
在一些實施例中，鉸鏈區係選自人類CD8鉸鏈區、人類CD28鉸鏈區、IgG1鉸鏈區或IgG4鉸鏈區。在一些實施例中，鉸鏈區源於人類CD8。在一些實施例中，源於人類CD8之鉸鏈區包含SEQ ID NO: 28之序列。在一些實施例中，源於人類CD8之鉸鏈區包含與SEQ ID NO: 28具有至少80%、85%、90%、95%、98%或99%序列一致性之序列。
6.3.2.3. 跨膜域
跨膜區使CAR錨定於CD4
IL10 / CART細胞中。在一些實施例中，跨膜域影響CAR之穩定性及功能。
在一些實施例中，跨膜域係選自由以下組成之群：TNFRSF 19跨膜域、CD3ζ跨膜域、CD8α跨膜域、CD4跨膜域、CD28跨膜域或B7家族誘導型共刺激(ICOS)跨膜域。在一些實施例中，跨膜域源於TNFRSF 19。在一些實施例中，源於TNFRSF 19之跨膜域包含SEQ ID NO: 29之序列。在一些實施例中，源於TNFRSF 19之跨膜域包含與SEQ ID NO: 29具有至少80%、85%、90%、95%、98%或99%序列一致性之序列。
6.3.2.4. 胞內信號傳導域及共刺激域
胞內信號傳導域活化CD4
IL10 / CART細胞。在一些實施例中，胞內信號傳導域參與T細胞功能、代謝及持久性。
在一些實施例中，胞內信號傳導域包含基於酪胺酸之免疫受體活化模體(ITAM)。在一些實施例中，胞內信號傳導域包含兩個或更多個基於酪胺酸之免疫受體活化模體(ITAM)。在一些實施例中，基於酪胺酸之免疫受體活化模體(ITAM)源於CD3ζ。在一些實施例中，源於CD3ζ的胞內信號傳導域包含SEQ ID NO: 30之序列。在一些實施例中，源於CD3ζ之胞內信號傳導域包含與SEQ ID NO: 3024具有至少80%、85%、90%、95%、98%或99%序列一致性之序列。
在一些實施例中，胞內信號傳導域進一步包含一或多個共刺激域。在此類情況下，相較於包含不具有一或多個共刺激域之CAR的CD4
+T細胞，一或多個共刺激域增強T細胞活化、功能、代謝及持久性。CAR除含有活化域之外亦含有共刺激域的CD4
+(例如CD4
IL10 / CAR) T細胞產生IL-2且可在重複的抗原暴露後增殖。
在一些實施例中，源於不同來源(例如4-1BB及CD28)的共刺激域誘導CD4
+(例如CD4
IL10 / CAR) T細胞的不同功能及代謝概況。舉例而言，CAR包含源於CD28之共刺激域的CD4
+(例如CD4
IL10 / CAR) T細胞經歷增強的分化而分化成效應記憶T細胞。在另一實例中，CAR包含源於4-1BB之共刺激域的CD4
+(例如CD4
IL10 / CAR) T細胞經歷增強的分化而分化成中樞記憶T細胞。
在一些實施例中，一或多個共刺激域為4-1BB、CD28、OX40、ICOS、CD27、MYD88-CD40及KIR2DS2。
在一些實施例中，一或多個共刺激域源於4-1BB。在一些實施例中，源於4-1BB的共刺激域包含SEQ ID NO: 31之序列。在一些實施例中，源於4-1BB之共刺激域包含與SEQ ID NO: 31具有至少80%、85%、90%、95%、98%或99%序列一致性之序列。
在一些實施例中，一或多個共刺激域源於CD28。在一些實施例中，一或多個共刺激域包含CD28共刺激域。在一些實施例中，源於CD28的共刺激域包含SEQ ID NO: 32之序列。在一些實施例中，源於CD28的共刺激域包含與SEQ ID NO: 32具有至少80%、85%、90%、95%、98%或99%序列一致性的序列。
在一些實施例中，CAR包含兩個共刺激域。在一些實施例中，CAR包括第一共刺激域，其包含源於4-1BB的共刺激域；及第二共刺激域，其包含源於CD28共刺激域的共刺激域。
6.3.2.5. 嵌合抗原受體(CAR)
在一些實施例中，編碼CAR之聚核苷酸區段編碼包含靶向與自體免疫疾病、發炎病症或癌症相關之抗原之抗原結合域的CAR。
在一些實施例中，編碼CAR之聚核苷酸區段編碼包含靶向與自體免疫疾病或發炎病症相關之抗原之抗原結合域的CAR。在一些實施例中，在相關MHC分子之上下文中，與自體免疫疾病或發炎病症有關的抗原係選自由但不限於以下組成之群：抗HLA-A*02、抗HLA-A*24或瓜胺酸化肽、胰島素、MOG、GAD65、IA2、麥膠蛋白及橋粒醣蛋白。
在一些實施例中，編碼CAR之聚核苷酸區段編碼包含靶向癌症相關抗原之抗原結合域的CAR。在一些實施例中，癌症相關抗原係選自由以下組成之群：CD19、CD20、CD22、B7-H3、CEA、BCMA、CD23、Lyml、Lym2、CLEC5A、CDH179b、FLT3、GCC、Muc、CSF2RA、GFRa4、CD32、CD33、IL1lRa、IL13Ra、NYBRI、SLea、CD200R、TGFBetaR2、CD276、TROP2、LAMP1、PTK7、DLL3、CDH1、CDH6、CDH17、CDH19、TSHR及酪胺酸酶。
在一些實施例中，編碼CAR之聚核苷酸區段編碼包含靶向B細胞抗原之抗原結合域的CAR。在一些實施例中，部分地基於B細胞抗原在B細胞分化期間的表現來選擇B細胞抗原，例如如圖4中所示。靶向B細胞抗原之抗原結合域之非限制性實例描述於WO 2020/010235中，該文獻以全文引用的方式併入本文中。在一些實施例中，抗原結合域靶向CD19。在一些實施例中，抗原結合域靶向CD20。在一些實施例中，抗原結合域靶向CD22。在一些實施例中，抗原結合域靶向B7-H3。在一些實施例中，抗原結合域靶向CD27。在一些實施例中，抗原結合域靶向CD38。在一些實施例中，抗原結合域靶向B細胞成熟抗原(BCMA)。在一些實施例中，抗原結合域靶向癌胚抗原(CEA)。
在一些實施例中，編碼CAR之聚核苷酸區段編碼包含抗CD19抗原結合域之CAR。在一些實施例中，編碼CAR之聚核苷酸區段編碼包含抗CD19抗原結合域之第二代CAR。在一些實施例中，編碼CAR之聚核苷酸區段編碼包含抗CD19抗原結合域之第三代CAR。
在一些實施例中，編碼CAR之聚核苷酸區段編碼抗CD19 CAR，包括：抗CD19抗原結合域、鉸鏈區、跨膜域、共刺激域及胞內信號傳導域。在一些實施例中，編碼CAR之聚核苷酸區段編碼抗CD19抗原結合域；人類CD8鉸鏈區；TNFRSF 19跨膜區；4-1BB共刺激域；及CD3ζ鏈胞內信號傳導域。在一些實施例中，抗CD19 CAR包含SEQ ID NO: 9之序列。在一些實施例中，抗CD19 CAR包含與SEQ ID NO: 9具有至少80%、85%、90%、95%、98%或99%序列一致性之序列。在一些實施例中，第一外源聚核苷酸區段包含SEQ ID NO: 10之序列。在一些實施例中，第一外源聚核苷酸區段包含與SEQ ID NO: 10具有至少80%、85%、90%、95%、98%或99%序列一致性之序列。
包含抗CD19抗原結合域之CAR之非限制性實例包括：美國專利公開案第2020/0392200號、WO 2020/010235或WO 2012/079000，該等文獻以全文引用的方式併入本文中。
在一些實施例中，編碼CAR之聚核苷酸區段編碼包含抗CD20抗原結合域之CAR。在一些實施例中，編碼CAR之聚核苷酸區段編碼包含抗CD20抗原結合域之第二代CAR。在一些實施例中，編碼CAR之聚核苷酸區段編碼包含抗CD20抗原結合域之第三代CAR。
在一些實施例中，編碼CAR之聚核苷酸區段編碼抗CD20 CAR，包括：抗CD20抗原結合域、跨膜域、共刺激域及胞內信號傳導域。在一些實施例中，編碼CAR之聚核苷酸區段編碼抗CD20抗原結合域、人類CD8跨膜區、4-1BB共刺激域；及CD3ζ鏈胞內信號傳導域。在一些實施例中，抗CD20 CAR包含SEQ ID NO: 16之序列。在一些實施例中，抗CD20 CAR包含與SEQ ID NO: 16具有至少80%、85%、90%、95%、98%或99%序列一致性之序列。在一些實施例中，第一外源聚核苷酸區段包含SEQ ID NO: 17之序列。在一些實施例中，第一外源聚核苷酸區段包含與SEQ ID NO: 17具有至少80%、85%、90%、95%、98%或99%序列一致性之序列。
包含抗CD20抗原結合域之CAR之非限制性實例包括：美國專利公開案第2020/0392200號或WO 2020/010235，兩者均以全文引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，編碼CAR之聚核苷酸區段編碼包含抗CD22抗原結合域之CAR。在一些實施例中，編碼CAR之聚核苷酸區段編碼包含抗CD22抗原結合域之第二代CAR。在一些實施例中，編碼CAR之聚核苷酸區段編碼包含抗CD22抗原結合域之第三代CAR。
在一些實施例中，抗CD22 CAR包含SEQ ID NO: 22之序列。在一些實施例中，抗CD22CAR包含與SEQ ID NO: 22具有至少80%、85%、90%、95%、98%或99%序列一致性之序列。在一些實施例中，第一外源聚核苷酸區段包含SEQ ID NO: 23之序列。在一些實施例中，第一外源聚核苷酸區段包含與SEQ ID NO: 23具有至少80%、85%、90%、95%、98%或99%序列一致性之序列。
包括抗CD22 CAR之CAR之非限制性實例包括WO 2020/010235及美國專利公開案第2020/0392200號中所述之實例，該等文獻以全文引用之方式併入本文中。
包括抗B7-H3 CAR之CAR之非限制性實例包括美國專利公開案第2016/0053017號、2017/0369585號及2018/0346544號中所述之實例，該等公開案以全文引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，編碼CAR之聚核苷酸區段編碼包含抗B7-H3抗原結合域之CAR。在一些實施例中，編碼CAR之聚核苷酸區段編碼包含抗B7-H3抗原結合域之第二代CAR。在一些實施例中，編碼CAR之聚核苷酸區段編碼包含抗B7-H3抗原結合域之第三代CAR。
在一些實施例中，抗B7-H3 CAR包含SEQ ID NO: 34之序列。在一些實施例中，抗B7-H3 CAR包含與SEQ ID NO: 34具有至少80%、85%、90%、95%、98%或99%序列一致性之序列。在一些實施例中，第一外源聚核苷酸區段包含SEQ ID NO: 35之序列。在一些實施例中，第一外源聚核苷酸區段包含與SEQ ID NO: 35具有至少80%、85%、90%、95%、98%或99%序列一致性之序列。
在一些實施例中，編碼CAR之聚核苷酸區段編碼包含抗CD27抗原結合域之CAR。在一些實施例中，編碼CAR之聚核苷酸區段編碼包含抗CD27抗原結合域之第二代CAR。在一些實施例中，編碼CAR之聚核苷酸區段編碼包含抗CD27抗原結合域之第三代CAR。
在一些實施例中，編碼CAR之聚核苷酸區段編碼包含抗CD38抗原結合域之CAR。在一些實施例中，編碼CAR之聚核苷酸區段編碼包含抗CD38抗原結合域之第二代CAR。在一些實施例中，編碼CAR之聚核苷酸區段編碼包含抗CD38抗原結合域之第三代CAR。
在一些實施例中，編碼CAR之聚核苷酸區段編碼包含抗CEA抗原結合域之CAR。在一些實施例中，編碼CAR之聚核苷酸區段編碼包含抗CEA抗原結合域之第二代CAR。在一些實施例中，編碼CAR之聚核苷酸區段編碼包含抗CEA抗原結合域之第三代CAR。
在一些實施例中，編碼CAR之聚核苷酸區段編碼包含抗BCMA抗原結合域之CAR。在一些實施例中，編碼CAR之聚核苷酸區段編碼包含抗BCMA抗原結合域之第二代CAR。在一些實施例中，編碼CAR之聚核苷酸區段編碼包含抗BCMA抗原結合域之第三代CAR。在一些實施例中，抗BCMA CAR包含SEQ ID NO: 41-49及54之序列。在一些實施例中，抗BCMA CAR包含與SEQ ID NO: 41-49及54具有至少80%、85%、90%、95%、98%或99%序列一致性之序列。
第一外源聚核苷酸進一步包含一或多個可操作地連接至CAR編碼序列的調控元件(例如本文所述或此項技術中已知之任一種調控元件)。在一些實施例中，調控元件為啟動子。
在一些實施例中，調控元件包含能夠引導CD4
+T細胞表現CAR的啟動子。在一些實施例中，啟動子驅動CAR在CD4
+T細胞中的組成性表現。在一些實施例中，啟動子驅動活化的CD4
+T細胞表現CAR。
在一些實施例中，第一外源聚核苷酸區段進一步包含編碼選擇標記物(例如本文所述或此項技術中已知之任一種選擇標記物)的區段，從而允許成功轉導之CD4
+T細胞得以選擇。
在一些實施例中，使用載體將第一外源聚核苷酸區段遞送至CD4
+T細胞中。在一些實施例中，載體為質體載體。在一些實施例中，載體為病毒載體。在一些實施例中，載體為逆轉錄病毒載體(例如γ逆轉錄病毒載體)。在一些實施例中，載體為慢病毒載體。
在一些實施例中，使用慢病毒載體將第一外源聚核苷酸區段遞送至CD4
+T細胞中且第一外源聚核苷酸區段包含慢病毒載體序列。在某些實施例中，使用Mátrai等人,
Molecular Therapy18(3):477-490 (2010) (「Mátrai」)中所揭示之慢病毒載體。在一些實施例中，編碼嵌合抗原受體(CAR)的第一外源聚核苷酸區段及編碼介白素-10 (IL-10)的第二外源聚核苷酸區段存在於單一慢病毒載體中。在此類情況下，第一外源聚核苷酸及第二外源聚核苷酸區段可操作地連接至第一啟動子。舉例而言，慢病毒載體包括人類PGK啟動子、經由內部核糖體進入位點(IRES)可操作地連接至第二外源聚核苷酸區段的第一外源聚核苷酸，或自裂解肽(例如2A自裂解肽)。
在一些實施例中，第一外源聚核苷酸區段整合於T細胞核基因體中。在一些實施例中，第一外源聚核苷酸區段不整合於核基因體中。在一些實施例中，第一外源聚核苷酸區段存在於T細胞的細胞質中。
6.3.3. 編碼IL-10的外源聚核苷酸
本發明之單供體CD4
IL - 10 / CAR細胞或多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞已進一步經基因修飾以包含編碼IL-10的第二外源聚核苷酸區段。第二外源聚核苷酸區段包含可操作地連接至一或多個調控元件(例如本文所述或此項技術中已知之一或多個調控元件中的任一者)的編碼IL-10之聚核苷酸區段。
編碼IL-10的聚核苷酸區段可編碼人類、倭黑猩猩或恆河猴之IL-10。在一些實施例中，編碼IL-10的聚核苷酸區段編碼具有SEQ ID NO: 1之序列的人類IL-10。在一些實施例中，編碼IL-10之聚核苷酸區段編碼與SEQ ID NO: 1具有至少90%、95%、98%或99%序列一致性的人類IL-10變異體。在一些實施例中，編碼IL-10的聚核苷酸區段具有SEQ ID NO: 2之核苷酸序列。在一些實施例中，編碼IL-10的聚核苷酸區段與SEQ ID NO: 2具有至少90%、95%、98%或99%序列一致性。
在一些實施例中，外源聚核苷酸編碼病毒IL-10。在各種實施例中，外源多肽編碼來自HCMV、GMCMV、RhCMV、BaCMV、MOCMV、SMCMV、EBV、Bonobo-HV、BaLCV、OvHV-2、EHV-2、CyHV-3、AngHV-1、ORFV、BPSV、PCPV、LSDV、SPV、GPV或CNPV之IL-10。在一些實施例中，外源多肽編碼來自EBV或ORFV之病毒IL-10。
在一些實施例中，病毒IL-10包含SEQ ID NO: 6之序列。在一些實施例中，病毒IL-10包含與SEQ ID NO: 6或18具有至少80%、85%、90%、95%、97%、98%、98%或99%序列一致性的序列。在一些實施例中，編碼病毒IL-10的外源多肽包含SEQ ID NO: 7之序列。在一些實施例中，編碼病毒IL-10的外源多肽包含與SEQ ID NO: 7具有至少80%、85%、90%、95%、97%、98%、98%或99%序列一致性的序列。
在一些實施例中，IL-10為蛋白質，包含具有一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個或十個胺基酸修飾的人類IL-10。在一些實施例中，一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個或十個胺基酸修飾係在相應胺基酸位置經病毒IL-10之胺基酸取代。
在一些實施例中，編碼IL-10的聚核苷酸區段編碼人類IL-10變異體，相較於人類IL-10 (例如SEQ ID NO: 1)，該變異體具有一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個胺基酸取代。在一些實施例中，一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個或十個胺基酸取代係在相應胺基酸位置經病毒IL-10之胺基酸取代。在一些實施例中，編碼IL-10的聚核苷酸區段編碼人類IL-10變異體，相較於人類IL-10 (例如SEQ ID NO: 1)，該變異體具有一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個胺基酸插入、缺失或修飾。在一些實施例中，人類IL-10變異體具有SEQ ID NO: 56或57之序列。
在一些實施例中，編碼IL-10的聚核苷酸區段編碼小家鼠「小鼠」(SEQ ID NO: 58)；褐家鼠「大鼠」(SEQ ID NO: 59)；恆河獼猴「MACMU」(SEQ ID NO: 60)；金剛猩猩「大猩猩」(SEQ ID NO: 61)；食蟹獼猴「CYNO」(SEQ ID NO: 62)；阿努比斯狒狒「東非狒狒」(SEQ ID NO: 63)；倭黑猩猩「BONOBO」(SEQ ID NO: 64)；黑猩猩「CHIMP」(SEQ ID NO: 65)；及EBVB9 (SEQ ID NO: 66)之IL-10。在一些實施例中，編碼IL-10的聚核苷酸區段編碼一種蛋白質，該蛋白質與小家鼠「小鼠」(SEQ ID NO: 58)；褐家鼠「大鼠」(SEQ ID NO: 59)；恆河獼猴「MACMU」(SEQ ID NO: 60)；金剛猩猩「大猩猩」(SEQ ID NO: 61)；食蟹獼猴「CYNO」(SEQ ID NO: 62)；阿努比斯狒狒「東非狒狒」(SEQ ID NO: 63)；倭黑猩猩「BONOBO」(SEQ ID NO: 64)；黑猩猩「CHIMP」(SEQ ID NO: 65)；及EBVB9 (SEQ ID NO: 66)之IL-10具有至少90%、95%、98%或99%序列一致性。
在一些實施例中，編碼IL-10的聚核苷酸區段編碼人類IL-10變異體，相較於人類IL-10 (例如SEQ ID NO: 1)，該變異體具有一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個胺基酸取代、插入及/或缺失。在一些實施例中，該等修飾為小家鼠「小鼠」(SEQ ID NO: 58)；褐家鼠「大鼠」(SEQ ID NO: 59)；恆河獼猴「MACMU」(SEQ ID NO: 60)；金剛猩猩「大猩猩」(SEQ ID NO: 61)；食蟹獼猴「CYNO」(SEQ ID NO: 62)；阿努比斯狒狒「東非狒狒」(SEQ ID NO: 63)；倭黑猩猩「BONOBO」(SEQ ID NO: 64)；黑猩猩「CHIMP」(SEQ ID NO: 65)；及EBVB9 (SEQ ID NO: 66)之胺基酸在相應位置的取代、插入及/或缺失。在一些實施例中，人類IL-10變異體具有SEQ ID NO: 67或SEQ ID NO: 68之序列。
在一些實施例中，編碼IL-10的聚核苷酸區段編碼人類IL-10變異體，相較於人類IL-10，該變異體的免疫刺激活性降低。在一些實施例中，人類IL-10變異體包括I105A取代。在一些實施例中，使用A Single Amino Acid Determines the Immunostimulatory Activity of Interleukin 10, J Exp Med, 191, 2, 2000, 第213-223頁中所述之方法製備人類IL-10變異體。
第二外源聚核苷酸區段進一步包含一或多個可操作地連接至IL-10編碼序列的調控元件，其中一或多個調控元件引導所編碼之IL-10在經轉導之CD4
+T細胞中的表現。
在一些實施例中，調控元件包含能夠引導CD4
+T細胞表現IL-10的啟動子。在一些實施例中，啟動子驅動IL-10在CD4
+T細胞中的組成性表現。在一些實施例中，啟動子驅動IL-10在活化之CD4
+T細胞中的表現。
在一些實施例中，第二外源聚核苷酸區段進一步包含編碼選擇標記物(例如本文所述或此項技術中已知之任一種選擇標記物)的區段，從而允許成功轉導之CD4
+T細胞得以選擇。
在典型實施例中，使用載體將外源聚核苷酸遞送至CD4+ T細胞中。在一些實施例中，載體為質體載體。在一些實施例中，載體為病毒載體。
在一些實施例中，編碼CAR的第一外源聚核苷酸區段及編碼IL-10的第二外源聚核苷酸區段存在於同一載體中。在一些實施例中，編碼CAR的第一外源聚核苷酸區段及編碼IL-10的第二外源聚核苷酸區段存在於同一病毒載體中。在一些實施例中，編碼CAR的第一外源聚核苷酸區段及編碼IL-10的第二外源聚核苷酸區段存在於同一慢病毒載體中。
在某些實施例中，使用慢病毒載體將外源聚核苷酸遞送至CD4+ T細胞中且外源聚核苷酸包含慢病毒載體序列。在某些實施例中，使用Mátrai等人,
Molecular Therapy18(3):477-490 (2010) (「Mátrai」)中所揭示之慢病毒載體。
在一些實施例中，第二外源聚核苷酸區段整合於T細胞核基因體中。在一些實施例中，第二外源聚核苷酸區段不整合於核基因體中。在一些實施例中，第二外源聚核苷酸區段存在於T細胞的細胞質中。
在特定實施例中，第二外源聚核苷酸區段具有SEQ ID NO: 5之序列。在一些實施例中，外源聚核苷酸與SEQ ID NO: 5具有至少80%、85%、90%、95%、98%或99%序列一致性。
6.3.4. 調控元件
在一些實施例中，第一及/或第二外源聚核苷酸區段進一步分別包含可操作地連接至CAR或IL-10之編碼序列的調控元件。在一些實施例中，調控元件包含啟動子序列、增強子序列、非編碼序列或其任何組合。
在一些實施例中，第一外源聚核苷酸區段進一步包含可操作地連接至CAR編碼序列之調控元件，其中該調控元件引導所編碼之CAR在經轉導之CD4
+T細胞中的表現。在一些實施例中，當在治療上適當時，使用誘導型啟動子誘導CAR表現。
在一些實施例中，第二外源聚核苷酸區段進一步包含可操作地連接至IL-10編碼序列的調控元件，其中該調控元件引導所編碼之IL-10在經轉導之CD4
+T細胞中的表現。在一些實施例中，當在治療上適當時，使用誘導型啟動子誘導IL-10表現。在一些實施例中，使用IL-10啟動子。
在一些實施例中，啟動子為組織特異性啟動子。在一些實施例中，啟動子為譜系特異性啟動子。在一些實施例中，啟動子為可用於驅動CAR或IL-10廣泛表現的啟動子。
在一些實施例中，啟動子為原生人類啟動子。在一些實施例中，啟動子為人類延伸因子(EF) 1α啟動子。在一些實施例中，啟動子為人類磷酸甘油酯激酶啟動子(PGK)。在一些實施例中，啟動子為人類泛素C啟動子(UBI-C)。
在一些實施例中，啟動子為合成啟動子。在某些實施例中，啟動子為最小CMV核心啟動子。在特定實施例中，啟動子為誘導型或組成型雙向啟動子。在特定實施例中，使用Amendola等人,
Nature Biotechnology, 23(1):108-116 (2005)中所揭示之合成雙向啟動子。此啟動子可介導兩個mRNA以廣泛或組織特異性方式協同轉錄。在某些實施例中，雙向啟動子誘導CAR及選擇標記物或IL10及選擇標記物之表現。
在一些實施例中，啟動子為原生人類啟動子。在一些實施例中，啟動子為人類延伸因子(EF) 1α啟動子。在一些實施例中，啟動子為人類磷酸甘油酯激酶啟動子(PGK)。在一些實施例中，啟動子為人類泛素C啟動子(UBI-C)。
在一些實施例中，第一及/或第二外源聚核苷酸區段進一步包含一或多個位於編碼序列3'的非編碼序列。位於編碼序列3'之非編碼序列之非限制性實例包括3'非轉譯區(UTR)、聚(腺苷酸)信號及土撥鼠肝炎病毒轉錄後調控元件(WPRE)。
在一些實施例中，外源聚核苷酸包含超過一個編碼序列。舉例而言，外源聚核苷酸以單一的鄰接聚核苷酸序列(例如單一聚核苷酸構築體)包括第一外源聚核苷酸區段及第二外源聚核苷酸區段。在一些實施例中，一或多個編碼序列包括編碼CAR的序列及編碼選擇標記物的序列。在一些實施例中，一或多個編碼序列包括編碼IL-10的序列及編碼選擇標記物的序列。在一些實施例中，一或多個編碼序列包括編碼CAR的序列、編碼IL-10的序列及一或多個編碼選擇標記物的序列。在一些實施例中，外源聚核苷酸不含選擇標記物。
在一些實施例中，多個編碼序列藉由一或多個內部核糖體進入位點(IRES)分隔。
在一些實施例中，多個編碼序列藉由一或多個自裂解肽分隔。在一些實施例中，自裂解肽可為2A自裂解肽。自裂解肽之非限制性實例包括2A肽(18至22個胺基酸)，包括來自口蹄疫病毒(F2A)、豬鐵士古病毒(porcine teschovirus)-1 (P2A)、明脈扁刺蛾病毒(T2A)或馬鼻炎A病毒(E2A)的肽。在一些實施例中，第一外源聚核苷酸、第二外源聚核苷酸或兩者均包含編碼弗林蛋白酶(Furin) P2A肽的序列。在一些實施例中，第一外源聚核苷酸、第二外源聚核苷酸或兩者均包含編碼T2A肽的序列。在一些實施例中，第一外源聚核苷酸、第二外源聚核苷酸或兩者均包含編碼E2A肽的序列。
在一些實施例中，編碼序列進一步包含重鏈編碼序列與輕鏈編碼序列之間的自裂解肽。在一些實施例中，自裂解肽係選自由F2A、P2A、T2A及E2A組成之群。
6.3.5. 選擇標記物
在一些實施例中，第一外源聚核苷酸區段、第二外源核苷酸區段或兩者均進一步包含編碼選擇標記物的聚核苷酸區段，從而允許成功轉導之CD4
+T細胞得以選擇。在一些實施例中，第一外源聚核苷酸區段、第二外源核苷酸區段或兩者均不含選擇標記物。
在一些實施例中，外源聚核苷酸以單一的鄰接聚核苷酸序列(例如單一聚核苷酸構築體)包括第一外源聚核苷酸區段及第二外源聚核苷酸區段。在此類情況下，外源聚核苷酸包括一或多個選擇標記物，從而允許成功轉導之CD4
+T細胞得以選擇。
在一些實施例中，選擇標記物為ΔNGFR。在某些實施例中，選擇標記物為具有SEQ ID NO: 3之序列的多肽。在某些實施例中，選擇標記物為與SEQ ID NO: 3具有至少90%、95%、98%或99%序列一致性的多肽。在特定實施例中，編碼ΔNGFR選擇標記物的核苷酸序列具有SEQ ID NO: 4之序列。在一些實施例中，編碼ΔNGFR選擇標記物的核苷酸序列與SEQ ID NO: 4具有至少90%、95%、98%或99%序列一致性。
在一些實施例中，選擇標記物的表現與來自外源聚核苷酸之IL-10的表現相關。在一些實施例中，選擇標記物的表現與來自外源聚核苷酸之IL-10的表現線性相關。相應地，在一些實施例中，量測選擇標記物的表現以推測來自外源聚核苷酸之IL-10的表現。
在一些實施例中，選擇標記物為EGFR多肽的截斷形式。在一些實施例中，選擇標記物為人類EGFR多肽的截斷形式，視情況為以下文獻中所揭示之huEGFR：Wang等人「A transgene-encoded cell surface polypeptide for selection, in vivo tracking, and ablation of engineered cells」
Blood, 第118卷，第5期(2011)，該文獻以全文引用的方式併入本文中。
在一些實施例中，外源聚核苷酸進一步包含編碼抗生素抗性基因的序列。在一些實施例中，外源聚核苷酸包含編碼胺苄青黴素(ampicillin)抗性基因的序列。
6.3.6. CD4
IL - 10 / CAR細胞或多供體CD4
IL - 10 / CAR之基因表現
CD4
IL - 10 / CAR細胞表現IL-10。在一些實施例中，CD4
IL - 10 / CAR細胞組成性表現IL-10。在一些實施例中，CD4
IL - 10 / CAR細胞當活化時表現IL-10。
在一些實施例中，以10
6個CD4
+T細胞/mL培養物計，CD4
IL - 10 / CAR細胞(例如自體單供體或同種異體單供體)或多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞組成性表現至少100 pg IL-10。在一些實施例中，以10
6個CD4
+T細胞/mL培養物計，CD4
IL - 10 / CAR細胞或多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞組成性表現至少200 pg、500 pg、1 ng、5 ng、10 ng或50 ng IL-10。
在一些實施例中，在用抗CD3與抗CD28抗體之組合或經抗CD3抗體及抗CD28抗體塗覆之珠粒活化之後，以10
6個CD4
+T細胞/mL培養物計，CD4
IL - 10 / CAR細胞(例如自體單供體或同種異體單供體)或多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞表現至少1 ng或2 ng IL-10。在一些實施例中，多供體CD4
IL - 10T細胞在用抗CD3及抗CD28抗體或經CD3抗體及CD28抗體塗覆之珠粒活化之後，以10
6個CD4
+T細胞/mL培養物計，表現至少5 ng、10 ng、100 ng、200 ng或500 ng IL-10。
在各種實施例中，在活化之後的12小時、24小時或48小時，使用用於蛋白質偵測及量測的各種方法測定IL-10產生量，諸如ELISA、即時聚合酶鏈反應(PCR)、光譜程序、比色法、胺基酸分析、放射性標記、艾德曼降解(Edman degradation)、HPLC、西方墨點法等。在較佳實施例中，在用抗CD3及抗CD28抗體活化之後的48小時，藉由ELISA測定IL-10產生量。
在一些實施例中，CD4
IL - 10 / CAR細胞(例如自體單供體或同種異體單供體)或多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞以比未修飾的CD4
+T細胞高至少5倍之量表現IL-10。在一些實施例中，多供體CD4
IL - 10T細胞以比未修飾的CD4
+T細胞高至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、40或50倍之量表現IL-10。
在一些實施例中，以10
6個CD4
+T細胞/mL計，CD4
IL - 10 / CAR細胞(例如自體單供體或同種異體單供體)或多供體CD4
IL -10/ CAR細胞表現至少100 pg IL-5。在一些實施例中，以10
6個CD4
+T細胞/mL計，CD4
IL - 10 / CAR細胞(例如自體單供體或同種異體單供體)或多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞表現至少100 pg、200 pg、500 pg、1 ng、5 ng、10 ng或50 ng IL-5。
在一些實施例中，用抗CD3及抗CD28抗體活化之後，以10
6個CD4
+T細胞/mL計，CD4
IL - 10 / CAR細胞(例如自體單供體或同種異體單供體)或多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞表現至少1 ng IL-5。在一些實施例中，用抗CD3及抗CD28抗體活化之後，以10
6個CD4
+T細胞/mL計，CD4
IL - 10 / CAR細胞(例如自體單供體或同種異體單供體)或多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞表現至少2 ng、5 ng、10 ng、100 ng、200 ng或500 ng IL-5。
在各種實施例中，在活化之後的12小時、24小時或48小時，使用用於蛋白質偵測及量測之各種方法測定IL-5產生量，諸如ELISA、即時聚合酶鏈反應(PCR)、光譜程序、比色法、胺基酸分析、放射性標記、艾德曼降解、HPLC、西方墨點法等。在較佳實施例中，在用抗CD3及抗CD28抗體活化之後的48小時，藉由ELISA測定IL-5產生量。
在一些實施例中，以10
6個CD4
+T細胞/mL計，CD4
IL - 10 / CAR細胞(例如自體單供體或同種異體單供體)或多供體CD4
IL -10/ CAR細胞表現至少100 pg IFN-γ。在一些實施例中，以10
6個CD4
+T細胞/mL計，CD4
IL - 10 / CAR細胞(例如自體單供體或同種異體單供體)或多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞表現至少100 pg、200 pg、500 pg、1 ng、5 ng、10 ng或50 ng IFN-γ。
在一些實施例中，用抗CD3及抗CD28抗體活化之後，以10
6個CD4
+T細胞/mL計，CD4
IL - 10 / CAR細胞(例如自體單供體或同種異體單供體)或多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞表現至少1 ng I IFN-γ。在一些實施例中，用抗CD3及抗CD28抗體活化之後，以10
6個CD4
+T細胞/mL計，CD4
IL - 10 / CAR細胞(例如自體單供體或同種異體單供體)或多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞表現至少2 ng、5 ng、10 ng、100 ng、200 ng或500 ng IFN-γ。
在各種實施例中，在活化之後的12小時、24小時或48小時，使用用於蛋白質偵測及量測之各種方法測定IFN-γ產生量，諸如ELISA、即時聚合酶鏈反應(PCR)、光譜程序、比色法、胺基酸分析、放射性標記、艾德曼降解、HPLC、西方墨點法等。在較佳實施例中，在用抗CD3及抗CD28抗體活化之後的48小時，藉由ELISA測定IFN-γ產生量。
在一些實施例中，以10
6個CD4
+T細胞/mL計，CD4
IL - 10 / CAR細胞(例如自體單供體或同種異體單供體)或多供體CD4
IL -10/ CAR細胞表現至少25 pg IL-4。在一些實施例中，以10
6個CD4
+T細胞/mL計，CD4
IL - 10 / CAR細胞(例如自體單供體或同種異體單供體)或多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞表現至少25 pg、50 pg、75 pg、100 ng、200 ng、500 pg、1 ng、5 ng、10 ng或50 ng IL-4。
在一些實施例中，用抗CD3及抗CD28抗體活化之後，以10
6個CD4
+T細胞/mL計，CD4
IL - 10 / CAR細胞(例如自體單供體或同種異體單供體)或多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞表現至少100 pg IL-4。在一些實施例中，用抗CD3及抗CD28抗體活化之後，以10
6個CD4
+T細胞/mL計，CD4
IL - 10 / CAR細胞(例如自體單供體或同種異體單供體)或多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞表現至少100 pg、200 pg、300 pg、400 pg、500 pg、600 pg、700 pg、800 pg、900 pg、1000 pg、2 ng、5 ng、10 ng、100 ng、200 ng或500 ng IL-4。
在各種實施例中，在活化之後的12小時、24小時或48小時，使用用於蛋白質偵測及量測之各種方法測定IL-4產生量，諸如ELISA、即時聚合酶鏈反應(PCR)、光譜程序、比色法、胺基酸分析、放射性標記、艾德曼降解、HPLC、西方墨點法等。在較佳實施例中，在用抗CD3及抗CD28抗體活化之後的48小時，藉由ELISA測定IL-4產生量。
在一些實施例中，一或多輪再刺激之後，IL-10、IL-4、IFN-γ、IL-22及IL-5中之一或多者的表現穩定。
在一些實施例中，CD4
IL - 10 / CAR細胞(例如自體單供體或同種異體單供體)或多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞進一步表現選擇標記物。在一些實施例中，CD4
IL - 10 / CAR細胞或多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞表現典型地在Tr1細胞中表現的蛋白質。在一些實施例中，CD4
IL - 10 / CAR細胞或多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞表現Tr1細胞特有的標記蛋白。
在一些實施例中，CD4
IL - 10 / CAR細胞(例如自體單供體或同種異體單供體)或多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞表現CD49b。在一些實施例中，CD4
IL - 10 / CAR細胞或多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞表現LAG-3。在一些實施例中，CD4
IL - 10 / CAR細胞或多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞表現TGF-β。在一些實施例中，CD4
IL - 10 / CAR細胞或多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞表現IFN-γ。在一些實施例中，CD4
IL - 10 / CAR細胞或多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞表現GzB。在一些實施例中，多供體CD4
IL - 10細胞當用骨髓抗原呈遞細胞活化時釋放GzB。在一些實施例中，CD4
IL - 10 / CAR細胞或多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞表現穿孔素。在一些實施例中，CD4
IL - 10 / CAR細胞或多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞當用骨髓抗原呈遞細胞活化時釋放穿孔素。在一些實施例中，CD4
IL - 10 / CAR細胞或多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞表現CD18。在一些實施例中，CD4
IL - 10 / CAR細胞或多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞表現CD2。在一些實施例中，CD4
IL - 10 / CAR細胞或多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞表現CD226。在一些實施例中，多供體CD4
IL - 10細胞表現IL-22。在一些實施例中，CD4
IL - 10 / CAR細胞或多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞表現IL-10。
在一些實施例中，CD4
IL - 10 / CAR細胞(例如自體單供體或同種異體單供體)或多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞展現Tr1細胞的至少一個功能。在各種實施例中，該功能為分泌IL-10、分泌TGF-β，及經由釋放顆粒酶B (GzB)及穿孔素而特異性殺滅骨髓抗原呈遞細胞。
6.3.7. CD4
IL - 10 / CAR細胞的其他特性
在一些實施例中，CD4
IL - 10 / CAR細胞包含抗CD19 CAR。在一些實施例中，CD4
IL - 10 / CAR細胞能夠在活體外對CD19
+目標細胞產生細胞毒性。在一些實施例中，CD4
IL - 10 / CAR細胞能夠在活體內對CD19
+目標細胞產生細胞毒性。在一些實施例中，CD19
+目標細胞為產生自體抗體的B細胞。在一些實施例中，CD19
+目標細胞為CD19
+癌細胞。在一些實施例中，在一或多輪再刺激(參見例如圖5A至圖5C中所述的產生方法)之後，對CD19
+目標細胞維持細胞毒性。
在一些實施例中，CD4
IL - 10 / CAR細胞能夠在活體外對骨髓目標細胞產生細胞毒性。在一些實施例中，CD4
IL - 10 / CAR細胞能夠在活體內對骨髓目標細胞產生細胞毒性。在一些實施例中，CD4
IL - 10 / CAR細胞能夠對CD19
+目標細胞及骨髓目標細胞產生細胞毒性。在一些實施例中，骨髓目標細胞表現I類MHC、CD13、CD54及CD112中之一或多者。在一些實施例中，在一或多輪再刺激(參見例如圖5A至圖5C中所述的產生方法)之後，對骨髓目標細胞維持細胞毒性。
在一些實施例中，CD4
IL - 10 / CAR細胞能夠抑制同種異體CD4
+T細胞增殖。在一些實施例中，CD4
IL - 10 / CAR細胞能夠將同種異體CD4
+T細胞增殖抑制至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%。
在一些實施例中，CD4
IL - 10 / CAR細胞能夠抑制同種異體CD8
+T細胞增殖。在一些實施例中，CD4
IL - 10 / CAR細胞能夠將同種異體CD8
+T細胞增殖抑制至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%。
在一些實施例中，CD4
IL - 10 / CAR細胞能夠抑制同種異體CD4
+T細胞增殖及同種異體CD8
+T細胞增殖。在一些實施例中，CD4
IL - 10 / CAR細胞能夠將同種異體CD4
+T細胞增殖抑制至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%且將同種異體CD8
+T細胞增殖抑制至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%。
在一些實施例中，由CD4
IL - 10 / CAR細胞介導之抑制如下計算：100-([有反應細胞在CD4
IL - 10T細胞(對照)及CD4
IL - 10 / CART細胞存在下的增殖/有反應細胞的增殖]×100)。
在一些實施例中，一或多輪再刺激之後，抑制特性穩定。
6.3.8. 處理產物
在一些實施例中，藉由用編碼CAR之外源聚核苷酸區段及編碼IL-10之外源聚核苷酸區段修飾CD4
+T細胞來獲得CD4
IL - 10 / CART細胞(自體或同種異體單供體或同種異體多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞)。在一些實施例中，用編碼CAR之第一外源聚核苷酸區段及編碼IL-10之第二外源聚核苷酸區段修飾CD4
+T細胞包含：(i)使用編碼IL-10之聚核苷酸區段進行的第一次轉導，隨後為使用編碼CAR之外源聚核苷酸區段進行的第二次轉導；(ii)使用編碼CAR之聚核苷酸區段進行的第一次轉導，隨後為使用編碼IL-10之外源聚核苷酸區段進行的第二次轉導；(iii)編碼IL-10之聚核苷酸區段與編碼CAR之外源聚核苷酸區段的同時轉導(亦即，共轉導)；或(iv)包含編碼IL-10之聚核苷酸區段與編碼CAR之聚核苷酸區段之單一聚核苷酸構築體的轉導。在一些實施例中，編碼IL-10的聚核苷酸進一步包含標記蛋白(例如deltaNGFR)編碼序列。
在一些實施例中，藉由用以下修飾CD4
+T細胞來獲得CD4
IL - 10 / CAR細胞(單供體或多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞)：(i)包含編碼CAR之聚核苷酸區段的第一聚核苷酸構築體及包含編碼IL-10之聚核苷酸區段的第二聚核苷酸構築體或(ii)包含編碼CAR之聚核苷酸區段及編碼IL-10之聚核苷酸區段的單一聚核苷酸構築體。
在一些實施例中，藉由病毒載體或質體載體將編碼CAR的第一外源聚核苷酸區段、編碼IL-10的第二外源聚核苷酸區段或包含第一與第二外源聚核苷酸區段的聚核苷酸構築體引入CD4
+T細胞中。在一些實施例中，CD4
+T細胞用含有編碼IL-10之聚核苷酸區段的第一病毒載體(例如本文所述之任一種病毒載體)轉導，隨後用含有編碼CAR之聚核苷酸區段的第二病毒載體(例如本文所述之任一種病毒載體)進行第二次轉導。在另一個實施例中，CD4
+T細胞用含有第一外源聚核苷酸區段之第一病毒載體(例如本文所述之任一種病毒載體)及含有第二外源聚核苷酸區段之第二病毒載體共轉導。在又另一個實施例中，CD4
+T細胞用含有第一與第二外源聚核苷酸區段的病毒載體(例如本文所述之任一種病毒載體)轉導。
在一些實施例中，如下產生多供體CD4
IL - 10 / CAR：(i)彙集獲自至少兩個不同T細胞供體的原代CD4
+T細胞；及(ii)根據本文所述方法修飾彙集的CD4
+T細胞。在一些實施例中，如下產生多供體CD4
IL - 10 / CART細胞：(i)自至少兩個不同T細胞供體獲得原代CD4
+T細胞；(ii)根據本文所述方法分別修飾各供體的CD4
+T細胞；及接著(iii)彙集經基因修飾的CD4
+T細胞。
在一些實施例中，CD4
IL - 10 / CART細胞已在能夠活化CD4
+T細胞的蛋白質存在下培養。在一些實施例中，CD4
IL - 10 / CART細胞已在抗CD3抗體及抗CD28抗體或經抗CD3抗體及抗CD28抗體塗覆之珠粒存在下培養。在一些實施例中，CD4
IL - 10 / CART細胞已在抗CD3抗體、抗CD28抗體及IL-2存在下或在經抗CD3抗體及抗CD28抗體塗覆之珠粒及IL-2存在下培養。在一些實施例中，CD4
IL - 10 / CART細胞已在聚合物奈米基質試劑存在下培養，以經由CD3及CD28活化且擴增人類T細胞。在一些實施例中，CD4
IL - 10 / CART細胞已在其他T細胞特異性免疫細胞培養基、活化劑及補充劑存在下培養。
在一些實施例中，CD4
IL - 10 / CAR(單供體或多供體CD4
IL - 10 / CART細胞)存在於冷凍儲備液(例如冷凍懸浮液)中。在一些實施例中，CD4
IL - 10 / CAR(單供體或多供體CD4
IL - 10 / CART細胞)存在於液體懸浮液中。
6.4. CD4
IL10 / CART細胞群
在另一態樣中，本發明的特徵為如上文所述之CD4
IL10 / CART細胞群。在一些實施例中，該群體進一步包含CD4
+T細胞(例如原代CD4
+T細胞)。
在一些實施例中，CD4
+T細胞群包含獲自自體或同種異體T細胞單供體的CD4
+T細胞(單供體CD4
IL - 10 / CAR細胞)。在一些實施例中，原代CD4
+T細胞來自T細胞單供體。在一些實施例中，原代CD4
+T細胞來自同一個體(亦即，同一患者)。在一些實施例中，CD4
+T細胞群包含獲自至少兩個不同T細胞供體的CD4
+T細胞(多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞)。在一些實施例中，原代CD4
+T細胞來自同種異體HSCT之供體。
在一些實施例中，自兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個或十個不同T細胞供體獲得CD4
+T細胞且彙集。多供體CD4
IL - 10T細胞及其製備及使用方法描述於PCT/US2021/039464中，該文獻以全文引用之方式併入本文中。其中所述的方法及/或組合物可用於產生多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞。
在一些實施例中，原代CD4
+T細胞來自選自分析供體遺傳資訊之後之供體的供體。在一些實施例中，不分析供體(亦即，原代CD4
+T細胞之供體)的遺傳資訊。在一些實施例中，原代CD4
+T細胞來自基於HLA單倍型選擇的供體。在一些實施例中，群體中的CD4
+T細胞總共具有六種、七種、八種、九種、十種、十一種、十二種或更多種不同HLA單倍型。在一些實施例中，群體中的所有CD4
+T細胞在HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1及HLA-DQB1基因座彼此具有至少1/10、2/10、3/10、4/10、5/10、6/10、7/10、8/10或9/10匹配。在一些實施例中，群體中的所有CD4
+T細胞在HLA-A、HLA-B、HLA-C及HLA-DRB1基因座彼此具有至少1/8、2/8、3/8、4/8、5/8、6/8、7/8或8/8匹配。
在一些實施例中，群體中的所有CD4
+T細胞在HLA-A基因座彼此具有2/2匹配。在一些實施例中，群體中的所有CD4
+T細胞在HLA-B基因座彼此具有2/2匹配。在一些實施例中，群體中的所有CD4
+T細胞在HLA-C基因座彼此具有2/2匹配。在一些實施例中，群體中的所有CD4
+T細胞在HLA-DRB1及HLA-DQB1基因座彼此具有至少3/4或4/4匹配。在一些實施例中，群體中的所有CD4
+T細胞具有A*02對偶基因或A*24對偶基因。在一些實施例中，所有CD4+ T細胞呈A*02或A*24陰性。
在一些實施例中，群體中的所有CD4
+T細胞在HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1及HLA-DQB1基因座彼此具有小於5/10、6/10、7/10、8/10或9/10匹配。在一些實施例中，群體中的所有CD4
+T細胞在HLA-A、HLA-B、HLA-C及HLA-DRB1基因座彼此具有小於4/8、5/8、6/8、7/8或8/8匹配。在一些實施例中，群體中的所有CD4
+T細胞在HLA-A基因座彼此具有小於2/2匹配。在一些實施例中，群體中的所有CD4
+T細胞在HLA-B基因座彼此具有小於2/2匹配。在一些實施例中，群體中的所有CD4
+T細胞在HLA-C基因座彼此具有小於2/2匹配。在一些實施例中，群體中的所有CD4
+T細胞在HLA-DRB1及HLA DQB1基因座彼此具有小於3/4或4/4匹配。
在一些實施例中，群體內至少30%(例如至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或至少98%)的CD4
+T細胞表現CAR及IL-10，如根據ΔNGFR表現所推測。
在一些實施例中，CD4
+T細胞存在於冷凍懸浮液中。在一些實施例中，CD4
+T細胞存在於液體懸浮液中。在一些實施例中，液體懸浮液先前已冷凍。
6.5. 醫藥組合物
在另一態樣中，提供醫藥組合物。在一些實施例中，醫藥組合物包含本文所提供之任一種單供體CD4
IL - 10 / CART細胞、本文所提供之任一種多供體CD4
IL - 10 / CART細胞或本文所提供之任一種多供體CD4
IL - 10 / CART細胞群及醫藥學上可接受之載劑或稀釋劑。
醫藥組合物可調配成藉由適於人類或獸醫學的任何投藥途徑投與。在典型實施例中，組合物調配成用於靜脈內(IV)投與。在一些實施例中，組合物調配成用於靜脈內(IV)輸注。在針對靜脈內投與而調配的實施例中，醫藥組合物呈非經腸可接受的水溶液形式，其不含熱原質且具有適合的pH、等張性及穩定性。
在一些實施例中，醫藥學上可接受之載劑或稀釋劑為生理鹽水、乳酸林格氏溶液(lactated Ringer's solution)或其他生理學上相容的溶液。在各種實施例中，醫藥組合物溶液包含2%至20%，較佳5%人類血清白蛋白。
在一些實施例中，提供醫藥組合物的單位劑型，其經調適以藉由全身投與(尤其靜脈內投與)來投與醫藥組合物。
在一些實施例中，單位劑型含有10
4至10
11個CD4
IL - 10 / CAR細胞或多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞、10
4至10
10個CD4
IL - 10 / CAR細胞或多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞、10
4至10
9個CD4
IL - 10 / CART細胞或多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞、10
5至10
10個CD4
IL - 10 / CAR細胞或多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞、10
5至10
9個CD4
IL - 10 / CAR細胞或多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞、10
5至10
8個CD4
IL - 10 / CAR細胞或多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞、或10
5至10
7個CD4
IL - 10 / CAR細胞或多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞。
在典型實施例中，醫藥組合物的單位劑型呈液體形式。
6.6. 單供體CD4
IL10 / CAR細胞或多供體CD4
IL10 / CAR細胞製備方法
在另一態樣中，本發明提供CD4
IL10 / CAR細胞或多供體CD4
IL10 / CAR細胞製備方法。
在一些實施例中，本文所提供之方法包括藉由將編碼CAR之外源聚核苷酸區段及編碼IL-10之外源聚核苷酸區段引入來修飾CD4
+T細胞或經彙集的CD4
+T細胞。在一些實施例中，用編碼CAR之外源聚核苷酸區段及編碼IL-10之外源聚核苷酸區段修飾CD4
+T細胞或經彙集的CD4
+T細胞包含：(i)使用編碼IL-10之聚核苷酸區段進行的第一次轉導，隨後為使用編碼CAR之外源聚核苷酸區段進行的第二次轉導；(ii)使用編碼CAR之聚核苷酸區段進行的第一次轉導，隨後為使用編碼IL-10之外源聚核苷酸區段進行的第二次轉導；(iii)編碼IL-10之聚核苷酸區段與編碼CAR之外源聚核苷酸區段的同時轉導(亦即，共轉導)；或(iv)包含編碼IL-10之聚核苷酸區段與編碼CAR之聚核苷酸區段之單一聚核苷酸構築體的轉導。
在一些實施例中，包含編碼IL-10之聚核苷酸區段及編碼CAR之聚核苷酸區段的單一聚核苷酸構築體為雙向載體，其中IL-10處於一個啟動子(例如PGK或EF1a)控制下且CAR處於第二個啟動子(例如CMV)控制下。在此類情況下，若構築體包括編碼選擇標記物的聚核苷酸序列，則聚核苷酸序列可位於IL-10或CAR下游。
在一些實施例中，包含編碼IL-10之聚核苷酸區段及編碼CAR之聚核苷酸區段的單一聚核苷酸構築體自5'至3'包含編碼IL-10之序列及編碼CAR之序列。在此類實施例中，編碼IL-10之序列及編碼CAR之序列可操作地連接至單一啟動子(例如組成型或誘導型)。在此類實施例中，編碼內部核糖體進入位點(IRES)之序列或編碼2A肽之序列位於編碼IL-10之序列與編碼CAR之序列之間。
在一些實施例中，包含編碼IL-10之聚核苷酸區段及編碼CAR之聚核苷酸區段的單一聚核苷酸構築體自5'至3'包含編碼CAR之序列及編碼IL-10之序列。在此類實施例中，編碼CAR之序列及編碼IL-10之序列可操作地連接至單一啟動子(例如組成型或誘導型)。在此類實施例中，編碼內部核糖體進入位點(IRES)之序列或編碼2A肽之序列位於編碼CAR之序列與編碼IL-10之序列之間。
在一些實施例中，該方法包含以下步驟：(a)彙集獲自一或多個T細胞供體的原代CD4
+T細胞；及(b) 藉由根據本文所提供之方法引入編碼CAR的第一外源聚核苷酸區段及編碼IL-10的第二外源聚核苷酸區段來修飾經彙集的CD4
+T細胞。在其他實施例中，該方法包含以下步驟：(a)獲得來自一或多個T細胞供體的原代CD4
+T細胞；(b)藉由引入編碼CAR的第一外源聚核苷酸區段及編碼IL-10的第二外源聚核苷酸區段 (例如根據本文所提供之方法)來分別修飾各供體的CD4
+T細胞；及接著彙集經基因修飾的CD4
+T細胞，藉此獲得CD4
IL - 10 / CAR細胞。此項技術中已知之各種方法可用於將編碼CAR的第一外源聚核苷酸區段、編碼IL-10的第二外源聚核苷酸區段或兩者引入原代CD4
+T細胞。
在一些實施例中，該方法進一步包含在抗CD3抗體及抗CD28抗體或經抗CD3抗體及抗CD28抗體塗覆之珠粒存在下培育原代CD4
+T細胞或經基因修飾之CD4
+T細胞的步驟。在一些實施例中，該方法進一步包含在抗CD3抗體、抗CD28抗體及IL-2或經抗CD3抗體及抗CD28抗體塗覆之珠粒及IL-2存在下培育原代CD4
+T細胞或經基因修飾之CD4
+T細胞的步驟。在一些實施例中，該方法進一步包含在餵養細胞之混合物存在下培育原代CD4
+T細胞或經基因修飾之CD4
+T細胞的步驟。在一些實施例中，該方法進一步包含在抗CD3抗體及抗CD28抗體之奈米製劑存在下培育原代CD4
+T細胞或經基因修飾之CD4
+T細胞的步驟。在一些實施例中，在聚合物奈米基質試劑存在下進行培育，以經由CD3及CD28活化且擴增人類T細胞。在一些實施例中，CD4
IL - 10 / CART細胞已在其他T細胞特異性免疫細胞培養基、活化劑及補充劑存在下培養。
在一些實施例中，在根據本文所提供之方法引入編碼CAR的第一外源聚核苷酸區段及編碼IL-10的第二外源聚核苷酸區段之前，執行培育步驟。在一些實施例中，在(a)彙集獲自一或多個不同T細胞供體的原代CD4
+T細胞之後，但在(b)藉由根據本文所提供之方法引入編碼CAR的第一外源聚核苷酸區段及編碼IL-10的第二外源聚核苷酸區段來修飾經彙集的CD4
+T細胞之前，執行培育步驟。在一些實施例中，在(a)自一或多個不同T細胞供體獲得原代CD4
+T細胞之後，但在(b)藉由根據本文所提供之方法引入編碼CAR的第一外源聚核苷酸區段及編碼IL-10的第二外源聚核苷酸區段來分別修飾各供體的CD4
+T細胞之前，執行培育步驟。
在一些實施例中，在步驟(b)之後執行培育步驟。換言之，在一些實施例中，在(b)藉由根據本文所提供之方法引入編碼CAR的第一外源聚核苷酸區段及編碼IL-10的第二外源聚核苷酸區段來修飾經彙集的CD4
+T細胞之後，執行培育步驟。在一些實施例中，在(b)藉由根據本文所提供之方法引入編碼CAR的第一外源聚核苷酸區段及編碼IL-10的第二外源聚核苷酸區段分別修飾各供體的CD4
+T細胞之後，但在彙集經基因修飾的CD4
+T細胞之前，執行培育步驟，藉此獲得經基因修飾之CD4
+T細胞。在一些實施例中，在彙集經基因修飾的CD4
+T細胞之後，執行培育步驟，藉此獲得CD4
IL - 10 / CAR細胞。
在一些實施例中，培育步驟執行超過一次。在一些實施例中，在基因修飾CD4
+T細胞之前與之後均執行培育步驟。
在一些實施例中，使用病毒載體將第一外源聚核苷酸區段、第二外源聚核苷酸區段或兩者引入原代CD4
+T細胞中。在一些實施例中，第一及第二外源聚核苷酸區段位於同一病毒載體上。在一些實施例中，病毒載體為慢病毒載體。
在一些實施例中，第一外源聚核苷酸包含編碼具有SEQ ID NO: 9、16、22、34、41-49及54之序列之CAR的區段及編碼具有SEQ ID NO: 1之序列之IL-10的第二外源聚核苷酸區段。在一些實施例中，第一外源聚核苷酸包含編碼與SEQ ID NO: 9、16、22、34、41-49及54具有至少80%、85%、90%、95%、98%或99%序列一致性之CAR的區段且第二外源聚核苷酸包含編碼與SEQ ID NO: 1具有至少80%、85%、90%、95%、98%或99%序列一致性之IL-10的區段。
在一些實施例中，編碼CAR之聚核苷酸區段具有SEQ ID NO: 10、17、23、35或55的序列且編碼IL-10之聚核苷酸區段具有SEQ ID NO: 2的序列。在一些實施例中，編碼CAR的聚核苷酸區段與SEQ ID NO: 10、17、22、35或55具有至少80%、85%、90%、95%、98%或99%序列一致性且編碼IL-10的聚核苷酸區段與SEQ ID NO: 2具有至少80%、85%、90%、95%、98%或99%序列一致性。在一些實施例中，第一外源聚核苷酸區段、第二外源聚核苷酸區段或兩者進一步包含編碼標記物的區段，從而允許成功轉導之CD4
+T細胞得以選擇。在一些實施例中，所編碼的選擇標記物為ΔNGFR。在某些實施例中，所編碼的選擇標記物具有SEQ ID NO: 4之序列。在一些實施例中，所編碼的選擇標記物為人類EGFR多肽的截斷形式。
在一些實施例中，該方法進一步包含分離出表現一或多種選擇標記物之經基因修飾之CD4
+T細胞的步驟，藉此產生經富集之經基因修飾之CD4
IL - 10 / CAR細胞群。
在一些實施例中，富集群體中至少40% (例如至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或至少98%)的經基因修飾之CD4
+T細胞表現選擇標記物，其中該選擇標記物為IL-10表現之指標。在一些實施例中，富集群體中至少75% (例如至少80%、至少90%、至少95%或至少98%)的經基因修飾之CD4
+T細胞表現選擇標記物，其中該選擇標記物為IL-10表現之指標。在一些實施例中，富集群體中至少75%的經基因修飾之CD4
+T細胞表現選擇標記物。在一些實施例中，富集群體中至少95%的經基因修飾之CD4
+T細胞表現選擇標記物。在一些實施例中，富集群體中至少96、97、98或99%的經基因修飾之CD4
+T細胞表現選擇標記物。
在一些實施例中，富集群體中至少75% (例如至少80%、至少90%、至少95%或至少98%)的經基因修飾之CD4
+T細胞表現IL-10。在一些實施例中，富集群體中至少75%的經基因修飾之CD4
+T細胞表現IL-10。在一些實施例中，富集群體中至少95%的經基因修飾之CD4
+T細胞表現IL-10。在一些實施例中，富集群體中至少96、97、98或99%的經基因修飾之CD4
+T細胞表現IL-10。
在一些實施例中，富集群體中至少30% (例如至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或至少98%)的經基因修飾之CD4
+T細胞表現CAR。在一些實施例中，富集群體中至少50%的經基因修飾之CD4
+T細胞表現CAR。在一些實施例中，富集群體中至少75%的經基因修飾之CD4
+T細胞表現CAR。在一些實施例中，富集群體中至少95%的經基因修飾之CD4
+T細胞表現CAR。在一些實施例中，富集群體中至少96、97、98或99%的經基因修飾之CD4
+T細胞表現CAR。
在一些實施例中，富集群體中至少30% (例如至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或至少98%)的經基因修飾之CD4
+T細胞表現IL-10及CAR。在一些實施例中，富集群體中至少50%的經基因修飾之CD4
+T細胞表現IL-10及CAR。在一些實施例中，富集群體中至少75%的經基因修飾之CD4
+T細胞表現IL-10及CAR。在一些實施例中，富集群體中至少95%的經基因修飾之CD4
+T細胞表現IL-10及CAR。在一些實施例中，富集群體中至少96、97、98或99%的經基因修飾之CD4
+T細胞表現IL-10及CAR。
在一些實施例中，該方法進一步包含培育經富集之經基因修飾之CD4
+T細胞群的步驟。在一些實施例中，在抗CD3抗體及抗CD28抗體或經抗CD3抗體及抗CD28抗體塗覆之珠粒存在下執行培育。在一些實施例中，在IL-2存在下進一步執行培育。在一些實施例中，在餵養細胞存在下執行培育。在一些實施例中，在抗CD3抗體與抗CD28抗體之奈米製劑存在下執行培育。在一些實施例中，在聚合物奈米基質試劑存在下執行培育，以經由CD3及CD28活化且擴增人類T細胞。在一些實施例中，CD4
IL - 10 / CART細胞已在其他T細胞特異性免疫細胞培養基、活化劑及補充劑存在下培養。
在一些實施例中，該方法進一步包含冷凍經基因修飾之CD4
+T細胞的步驟。
在一些實施例中，原代CD4
+T細胞來自基於HLA單倍型選擇的供體。在一些實施例中，該方法進一步包含藉由分析其遺傳資訊來選擇T細胞供體的步驟。在一些實施例中，該方法包含分析潛在T細胞供體之遺傳資訊或HLA單倍型的步驟。
在一些實施例中，原代CD4
+T細胞來自與待經原代CD4
+T細胞或其修飾治療之宿主具有至少部分HLA匹配的供體。在一些實施例中，原代CD4
+T細胞來自與幹細胞(HSC)、組織或器官供體具有至少部分HLA匹配的供體。在一些實施例中，CD4
+T細胞來自與幹細胞(HSC)、組織或器官供體匹配的供體HLA。在一些實施例中，原代CD4
+T細胞獲自在生物學上與宿主不相關的第三方供體。在一些實施例中，原代CD4
+T細胞獲自在生物學上與幹細胞、組織或器官供體不相關的第三方供體。
在一些實施例中，在步驟(a)中，自兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個或十個不同T細胞供體獲得原代CD4
+T細胞。在一些實施例中，至少兩個T細胞供體在HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1及HLA-DQB1基因座彼此具有至少1/10、2/10、3/10、4/10、5/10、6/10、7/10、8/10或9/10匹配。在一些實施例中，至少兩個T細胞供體在HLA-A、HLA-B、HLA-C及HLA-DRB1基因座彼此具有至少1/8、2/8、3/8、4/8、5/8、6/8、7/8或8/8匹配。在一些實施例中，至少兩個T細胞供體在HLA-A基因座彼此具有2/2匹配。在一些實施例中，至少兩個T細胞供體在HLA-B基因座彼此具有2/2匹配。在一些實施例中，至少兩個T細胞供體在HLA-C基因座彼此具有2/2匹配。在一些實施例中，至少兩個T細胞供體在HLA-DRB1及HLA-DQB1基因座彼此具有至少3/4或4/4匹配。在一些實施例中，至少兩個T細胞供體中之每一者具有A*02或A*24對偶基因。在一些實施例中，T細胞供體呈HLA-A*02陰性。在一些實施例中，至少兩個T細胞供體中之每一者呈HLA-A*02或HLA-A*24陰性。
在一些實施例中，至少兩個T細胞供體在HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1及HLA-DQB1基因座彼此具有小於5/10、6/10、7/10、8/10或9/10匹配。在一些實施例中，至少兩個T細胞供體在HLA-A、HLA-B、HLA-C及HLA-DRB1基因座彼此具有小於4/8、5/8、6/8、7/8或8/8匹配。在一些實施例中，至少兩個T細胞供體在HLA-A基因座彼此具有小於2/2匹配。在一些實施例中，至少兩個T細胞供體在HLA-B基因座彼此具有小於2/2匹配。在一些實施例中，至少兩個T細胞供體在HLA-C基因座彼此具有小於2/2匹配。在一些實施例中，至少兩個T細胞供體在HLA-DRB1及HLA-DQB1基因座彼此具有小於3/4或4/4匹配。
在一些實施例中，在步驟(a)中，原代CD4
+T細胞獲自一或多個冷凍儲備液。在一些實施例中，在步驟(a)中，原代CD4
+T細胞獲自至少兩個不同T細胞供體的未冷凍周邊血液單核細胞。在一些實施例中，該方法進一步包含自周邊血液單核細胞中分離出CD4
+T細胞的步驟。在一些實施例中，在步驟(a)中，原代CD4
+T細胞獲自液體懸浮液。在一些實施例中，液體懸浮液獲自預先冷凍儲備液。
在一些實施例中，該方法不包含在來自宿主的周邊血液單核細胞(PBMC)存在下使CD4
+T細胞失能的步驟。在一些實施例中，該方法不包含在重組IL-10蛋白存在下使CD4
+T細胞失能的步驟，其中CD4
+T細胞不表現重組IL-10蛋白。在一些實施例中，該方法不包含在來自宿主的DC10細胞存在下使CD4
+T細胞失能的步驟。
在一些實施例中，本文所提供之方法包括在彙集、純化、再刺激及擴增步驟中之一或多者之後，藉由引入編碼CAR的外源聚核苷酸區段及編碼IL-10的外源聚核苷酸區段來修飾CD4
+T細胞或經彙集的CD4
+T細胞。
6.7. 使用CD4
IL - 10 / CAR細胞或多供體CD4
IL - 10 / CAR之方法
在另一態樣中，本發明提供一種治療患者的方法，包含將本文所提供之任一種CD4
IL - 10 / CAR細胞(例如自體單供體或同種異體單供體)、本文所提供之任一種同種異體多供體CD4
IL - 10 / CART細胞、本文所提供之任一種多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞群或本文所提供之任一種醫藥組合物投與有需要之患者的步驟。
在一些實施例中，該方法進一步包含將CD4
IL - 10 / CAR細胞之冷凍懸浮液解凍的先行步驟。
在一些實施例中，自體單供體或同種異體單供體CD4
IL - 10 / CAR細胞或同種異體多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞或醫藥組合物預防患者之病原性T細胞反應或降低該病原性T細胞反應的嚴重程度。
在一些實施例中，多供體CD4
IL -10細胞或醫藥組合物預防發炎或自體免疫反應或降低發炎或自體免疫反應的嚴重程度。
在一些實施例中，多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞或醫藥組合物預防患者的病原性T細胞反應或降低病原性T細胞反應的嚴重程度。在一些實施例中，多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞或醫藥組合物減輕發炎。在一些實施例中，多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞或醫藥組合物增強組織修復。在一些實施例中，多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞或醫藥組合物增強對自身及非病原性抗原的免疫耐受性且維持免疫穩態。在一些實施例中，多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞或醫藥組合物使與器官移植、GvHD及各種自體免疫及發炎疾病有關的病原性T細胞反應下調。在一些實施例中，多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞或醫藥組合物治療自體免疫疾病。在一些實施例中，多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞或醫藥組合物減少NLPR3發炎體的高度活化或減少與NLPR3發炎體高度活化有關的症狀。在一些實施例中，多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞或醫藥組合物誘導腫瘤細胞死亡或減少腫瘤生長。在一些實施例中，多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞或醫藥組合物增加無疾病存活率(例如不存在微量殘存疾病)。在一些實施例中，多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞或醫藥組合物誘導傷口癒合或組織修復。
在一些實施例中，多供體CD4
IL - 10細胞或醫藥組合物係以有效預防患者之病原性T細胞反應或降低患者之病原性T細胞反應嚴重程度的量投與。在一些實施例中，多供體CD4
IL - 10細胞或醫藥組合物係以有效減輕發炎的量投與。在一些實施例中，多供體CD4
IL - 10細胞或醫藥組合物係以有效增強組織修復的量投與。在一些實施例中，多供體CD4
IL - 10細胞或醫藥組合物係以有效增強針對自身及非病原性抗原之免疫耐受性且維持免疫穩態的量投與。在一些實施例中，多供體CD4
IL - 10細胞或醫藥組合物係以有效下調病原性T細胞反應的量投與，該等病原性T細胞反應與器官移植、GvHD及各種自體免疫或發炎疾病有關。在一些實施例中，多供體CD4
IL - 10細胞或醫藥組合物係以有效治療自體免疫疾病的量投與。在一些實施例中，多供體CD4
IL - 10細胞或醫藥組合物係以有效減少NLPR3發炎體高度活化或減輕與NLPR3發炎體高度活化有關之症狀的量投與。在一些實施例中，多供體CD4
IL - 10細胞或醫藥組合物係以有效誘導腫瘤細胞死亡或減少腫瘤生長的量投與。在一些實施例中，多供體CD4
IL - 10細胞或醫藥組合物係以有效增加無疾病存活率(例如不存在微量殘存疾病)的量投與。
在一些實施例中，單供體CD4
IL - 10 / CAR細胞(例如自體或同種異體)或醫藥組合物預防患者的病原性T細胞反應或降低病原性T細胞反應的嚴重程度。在一些實施例中，單供體CD4
IL - 10 / CAR細胞或醫藥組合物減輕發炎。在一些實施例中，單供體CD4
IL - 10 / CAR細胞或醫藥組合物增強組織修復。在一些實施例中，單供體CD4
IL - 10 / CAR細胞或醫藥組合物增強對自身及非病原性抗原的免疫耐受性且維持免疫穩態。在一些實施例中，單供體CD4
IL - 10 / CAR細胞或醫藥組合物使與器官移植、GvHD及各種自體免疫及發炎疾病有關的病原性T細胞反應下調。在一些實施例中，單供體CD4
IL - 10 / CAR細胞或醫藥組合物治療自體免疫疾病。在一些實施例中，單供體CD4
IL - 10 / CAR細胞或醫藥組合物減少NLPR3發炎體的高度活化或減少與NLPR3發炎體高度活化有關的症狀。在一些實施例中，單供體CD4
IL - 10 / CAR細胞或醫藥組合物誘導腫瘤細胞死亡或減少腫瘤生長。在一些實施例中，單供體CD4
IL - 10 / CAR細胞或醫藥組合物增加無疾病存活率(例如不存在微量殘存疾病)。在一些實施例中，單供體CD4
IL - 10 / CAR細胞或醫藥組合物誘導傷口癒合或組織修復。
在一些實施例中，治療方法進一步包含在投與之後監測患者中的CD4
IL - 10 / CAR細胞。在一些實施例中，該方法包含偵測獲自患者之生物樣品中之選擇標記物的步驟，藉此偵測CD4
IL - 10 / CAR細胞或多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞的存在或不存在。在一些實施例中，該方法包含在投與患者後偵測患者中之選擇標記物及利用選擇標記物偵測來追蹤及/或監測CD4
IL - 10 / CAR細胞的步驟。在一些實施例中，在多個時間點偵測選擇標記物，以追蹤患者體內在CD4
IL - 10 / CAR細胞存在下發生的變化。在一些實施例中，生物樣品為來自患者的生檢或血液樣品。
以治療有效量投與CD4
IL - 10 / CAR細胞(自體單供體、同種異體單供體或同種異體多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞)。可基於體重及其他臨床因素確定該量。在一些實施例中，投與10
3至10
11個細胞/kg。在一些實施例中，投與10
3至10
10個細胞/kg。在一些實施例中，投與10
3至10
9個細胞/kg。在一些實施例中，投與10
3至10
8個細胞/kg。在一些實施例中，投與10
3至10
7個細胞/kg。在一些實施例中，投與10
3至10
6個細胞/kg。在一些實施例中，投與10
3至10
5個細胞/kg。在一些實施例中，投與10
3至10
4個細胞/kg。
在各種實施例中，依治療有效時程投與CD4
IL - 10 / CAR細胞(自體單供體、同種異體單供體或同種異體多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞)。在一些實施例中，CD4
IL - 10 / CAR細胞(自體單供體、同種異體單供體或同種異體多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞)投與一次。在一些實施例中，每天、每3天、每7天、每14天、每21天或每個月投與CD4
IL - 10 / CAR細胞(自體單供體、同種異體單供體或同種異體多供體CD
4IL - 10 / CAR細胞)。
可根據不同投與途徑，諸如全身性、皮下或腹膜內投與途徑，投與CD4
IL - 10 / CAR細胞(自體單供體、同種異體單供體或同種異體多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞)。在一些實施例中，細胞在生理鹽水或可含有2%至20% (較佳5%)人類血清白蛋白之生理溶液內投與。
6.7.1. 減少或預防GvHD之方法
在一些實施例中，在造血幹細胞(HSC)移植體(HSCT)之前、與HSCT同時或在HSCT之後，使用CD4
IL - 10 / CAR細胞(自體單供體、同種異體單供體或同種異體多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞)、單供體或多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞群或本文所提供之任一種醫藥組合物治療患者。
在各種實施例中，HSCT為匹配相關HSCT或匹配不相關HSCT。在各種實施例中，HSCT為單倍型相合HSCT、錯配相關HSCT或錯配不相關HSCT。
在一些實施例中，患者患有需要用同種異體HSCT治療的血液學惡性疾病。在一些實施例中，血液學惡性疾病由異常骨髓細胞介導。在一些實施例中，惡性疾病或血液學癌症為骨髓性白血病。在一些實施例中，惡性疾病或血液學癌症為CD19
+、CD20
+、CD22
+、BCMA+或B7-H3
+血液學癌症。在一些實施例中，CD19
+、CD20
+、CD22
+或B7-H3
+血液學癌症係選自慢性淋巴球性白血病、急性淋巴母細胞白血病(ALL)及非霍奇金氏淋巴瘤。
在一些實施例中，基於待經CD4
IL - 10 / CAR(自體單供體或同種異體單供體)或同種異體多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞及HSC治療之患者的遺傳資訊及/或HSC供體的遺傳資訊來選擇T細胞供體。在一些實施例中，基於待用多供體CD4
IL - 10細胞及HSC治療之患者的HLA單倍型及/或HSC供體的HLA單倍型來選擇T細胞供體。在一些實施例中，該方法進一步包含在投與CD4
IL - 10細胞之前分析T細胞供體之遺傳資訊或HLA單倍型的步驟。在一些實施例中，該方法進一步包含分析宿主之遺傳資訊或HLA單倍型的步驟。在一些實施例中，該方法進一步包含分析HSC供體之遺傳資訊或HLA單倍型的步驟。
在一些實施例中，T細胞供體、宿主及HSC供體在生物學上不相關。在一些實施例中，T細胞供體、宿主及HSC供體具有不同HLA單倍型。在一些實施例中，T細胞供體、宿主及HSC供體的HLA單倍型具有至少部分錯配。在一些實施例中，當T細胞供體具有HLA匹配超過臨限值的HLA單倍型時，選擇該等T細胞供體。
在一些實施例中，HSC供體與患者為部分的HLA錯配。在一些實施例中，HSC供體與患者在HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1及HLA-DQB1基因座具有小於5/10、6/10、7/10、8/10、9/10或10/10匹配。在一些實施例中，HSC供體與患者在HLA-A、HLA-B、HLA-C及HLA-DRB1基因座具有小於4/8、5/8、6/8、7/8或8/8匹配。在一些實施例中，HSC供體與患者在HLA-A、HLA-B或HLA-C基因座具有小於2/2匹配。在一些實施例中，HSC供體與患者在HLA-DRB1及HLA-DQB1基因座具有小於3/4或4/4匹配。
在一些實施例中，一或多個T細胞供體與患者為HLA錯配或部分的HLA錯配。在一些實施例中，一或多個T細胞供體與患者在HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1及HLA-DQB1基因座具有小於5/10、6/10、7/10、8/10、9/10或10/10匹配。在一些實施例中，一或多個T細胞供體與患者在HLA-A、HLA-B、HLA-C及HLA-DRB1基因座具有小於4/8、5/8、6/8、7/8或8/8匹配。在一些實施例中，一或多個T細胞供體與患者在HLA-A、HLA-B或HLA-C基因座具有小於2/2匹配。在一些實施例中，一或多個T細胞供體與患者在HLA-DRB1及HLA-DQB1基因座具有小於2/4、3/4或4/4匹配。
在一些實施例中，一或多個T細胞供體與HSC供體為HLA錯配或部分的HLA錯配。在一些實施例中，一或多個T細胞供體與HSC供體在HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1及HLA-DQB1基因座具有小於5/10、6/10、7/10、8/10、9/10或10/10匹配。在一些實施例中，一或多個T細胞供體與HSC供體在HLA-A、HLA-B、HLA-C及HLA-DRB1基因座具有小於4/8、5/8、6/8、7/8或8/8匹配。在一些實施例中，一或多個T細胞供體與HSC供體在HLA-A、HLA-B或HLA-C基因座具有小於2/2匹配。在一些實施例中，一或多個T細胞供體與HSC供體在HLA-DRB1及HLA-DQB1基因座具有小於3/4或4/4匹配。
在一些實施例中，CD4
IL - 10 / CAR細胞(單供體或多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞)、單供體或多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞群或本文所提供之任一種醫藥組合物當投與患者時預防移植之造血幹細胞所致的GvHD或降低該GvHD的嚴重程度。
在一些實施例中，CD4
IL - 10 / CAR細胞(單供體或多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞)、單供體或多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞群或本文所提供之任一種醫藥組合物當投與患者時預防移植之造血細胞所致的病理性T細胞反應或降低該病理性T細胞反應的嚴重程度。在特定實施例中，CD4
IL - 10 / CAR或多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞預防或減少GvHD。
在一些實施例中，多供體CD4
IL - 10細胞或醫藥組合物預防由病原性T細胞誘導的組織損傷或發炎或降低其嚴重程度。
6.7.2. 癌症治療方法
在一些實施例中，CD4
IL - 10 / CAR細胞(自體單供體、同種異體單供體或同種異體多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞)、單供體或多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞群或本文所提供之任一種醫藥組合物係用於治療癌症。在一些實施例中，CD4
IL - 10 / CAR細胞(自體單供體、同種異體單供體或同種異體多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞)、單供體或多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞群或本文所提供之任一種醫藥組合物係用於治療惡性疾病。
在較佳實施例中，CD4
IL - 10 / CAR細胞(自體單供體、同種異體單供體或同種異體多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞)直接介導抗腫瘤作用且在特定實施例中介導抗白血病作用。
在一些實施例中，在造血幹細胞移植(HSCT)、周邊血液幹細胞(PBSC)、臍帶血(CB)或骨髓(BM)移植之前或之後，投與CD4
IL - 10 / CAR細胞(自體單供體、同種異體單供體或同種異體多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞)、單供體或多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞群或本文所提供之任一種醫藥組合物及同種異體細胞。
在一些實施例中，贅生性細胞表現CD19。在一些實施例中，贅生性細胞表現CD20。在一些實施例中，贅生性細胞表現CD22。在一些實施例中，贅生性細胞表現BCMA。在一些實施例中，贅生性細胞表現B7-H3。在一些實施例中，贅生性細胞表現CD13。在一些實施例中，贅生性細胞表現I類HLA。在一些實施例中，贅生性細胞表現CD54。在一些實施例中，贅生性細胞表現CD13、I類HLA及CD54。在一些實施例中，贅生性細胞表現CD112。在一些實施例中，贅生性細胞表現CD58。在一些實施例中，贅生性細胞表現CD155。在一些實施例中，腫瘤表現CD112、CD58或CD155。在各種實施例中，腫瘤為實體或血液學腫瘤。在一些實施例中，腫瘤為實體腫瘤。在一些實施例中，實體腫瘤表現B7-H3。在一些實施例中，實體腫瘤係選自由以下組成之群：乳癌、腦癌、肺癌、肝癌、胃癌、脾癌、大腸癌、腎癌、胰臟癌、前列腺癌、子宮癌、皮膚癌、頭癌、頸癌、肉瘤、神經母細胞瘤及卵巢癌。
在一些實施例中，患者患有選自由以下組成之群的癌症：腎上腺癌、肛門癌、膽管癌、膀胱癌、骨癌、成人之腦/CNS腫瘤、兒童之腦/CNS腫瘤、乳癌、男性乳癌、原發部位不明癌、卡斯特曼氏疾病(Castleman Disease)、子宮頸癌、大腸/直腸癌、子宮內膜癌、食道癌、尤文氏腫瘤(Ewing Family Of Tumors)家族、眼癌、膽囊癌、胃腸類癌腫瘤、胃腸基質腫瘤(GIST)、妊娠期滋養層疾病、霍奇金病(Hodgkin Disease)、卡波西肉瘤(Kaposi Sarcoma)、腎臟癌、喉及下咽癌、白血病、急性淋巴球性白血病(ALL)、急性骨髓白血病(AML，包括骨髓肉瘤及皮膚白血病)、慢性淋巴球性白血病(CLL)、慢性骨髓白血病(CML)、兒童之慢性骨髓單核球性白血病(CMML)、肝癌、肺癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、肺類癌腫瘤、淋巴瘤、皮膚淋巴瘤、惡性間皮瘤、多發性骨髓瘤、骨髓發育不良症候群、鼻腔及副鼻竇癌、鼻咽癌、神經母細胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、兒童之非霍奇金淋巴瘤、口腔及口咽癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰臟癌、陰莖癌、腦垂體腫瘤、前列腺癌、視網膜母細胞瘤、橫紋肌肉瘤、唾液腺癌、肉瘤 - 成人軟組織癌、皮膚癌、皮膚癌 - 基底及鱗狀細胞、皮膚癌 - 黑色素瘤、皮膚癌 - 梅克爾細胞(Merkel Cell)、小腸癌、胃癌、睪丸癌、胸腺癌、甲狀腺癌、子宮肉瘤、陰道癌、外陰癌、瓦爾登斯特倫巨球蛋白血症(Waldenstrom Macroglobulinemia)及威爾姆斯腫瘤(Wilms Tumor)。
在一些實施例中，癌症為骨髓腫瘤。在特定實施例中，癌症為AML或CML。在一些實施例中，癌症為骨髓腫瘤。在一些實施例中，癌症為ALL。
在一些實施例中，該方法用於治療影響血液、骨髓及淋巴結的血液學癌症。在各種實施例中，血液學癌症為淋巴瘤(例如霍奇金氏淋巴瘤)、淋巴球性白血病、骨髓瘤。在各種實施例中，血液學癌症為急性或慢性骨髓性(骨髓)白血病(AML、CML)或骨髓發育不良症候群。
在一些實施例中，惡性疾病或血液學癌症為CD19
+、CD20
+、CD22
+、BCMA+或B7-H3
+血液學癌症。在一些實施例中，CD19
+、CD20
+、CD22
+、BCMA
+或B7-H3
+血液學癌症係選自慢性淋巴球性白血病、急性淋巴母細胞白血病(ALL)及非霍奇金氏淋巴瘤。
在一些實施例中，CD4
IL - 10 / CAR細胞(自體單供體、同種異體單供體或同種異體多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞)係用於治療血液學癌症患者，其中方法包括將治療有效量之CD4
IL - 10 / CAR細胞(自體單供體、同種異體單供體或同種異體多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞)、單供體或多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞群或本文所提供之任一種醫藥組合物投與患者。
在一些實施例中，CD4
IL - 10 / CAR細胞係用於治療CD19
+血液學癌症患者，其中方法包括將治療有效量之CD4
IL - 10 / 抗 CD19 CAR細胞(自體單供體、同種異體單供體或同種異體多供體CD4
IL - 10 / 抗 CD19 CAR)、單供體或多供體CD4
IL - 10 / 抗 CD19 CAR細胞群或本文所提供之任一種醫藥組合物投與患者。
在一些實施例中，CD4
IL - 10 / CAR細胞係用於治療CD20
+血液學癌症患者，其中方法包括將治療有效量之CD4
IL - 10 / 抗 CD20 CAR細胞(自體單供體、同種異體單供體或同種異體多供體CD4
IL - 10 / 抗 CD20 CAR)、單供體或多供體CD4
IL - 10 / 抗 CD20 CAR細胞群或本文所提供之任一種醫藥組合物投與患者。
在一些實施例中，CD4
IL - 10 / CAR細胞係用於治療CD22
+血液學癌症患者，其中方法包括將治療有效量之CD4
IL - 10 / 抗 CD22 CAR細胞(自體單供體、同種異體單供體或同種異體多供體CD4
IL - 10 / 抗 CD22 CAR)、單供體或多供體CD4
IL - 10 / 抗 CD22 CAR細胞群或本文所提供之任一種醫藥組合物投與患者。
在一些實施例中，CD4
IL - 10 / CAR細胞係用於治療B7-H3
+癌症(例如實體癌症)患者，其中方法包括將治療有效量之CD4
IL - 10 / 抗 B7 - H3 CAR細胞(自體單供體、同種異體單供體或同種異體多供體CD4
IL - 10 / 抗 B7 - H3 CAR)、單供體或多供體CD4
IL - 10 / 抗 B7 - H3 CAR細胞群或本文所提供之任一種醫藥組合物投與患者。
在一些實施例中，CD4
IL - 10 / CAR細胞係用於治療BCMA
+癌症(例如實體癌症)患者，其中方法包括將治療有效量之CD4
IL - 10 / 抗 BCMA CAR細胞(自體單供體、同種異體單供體或同種異體多供體CD4
IL - 10 / 抗 BCMA CAR)、單供體或多供體CD4
IL - 10 / 抗 BCMA CAR細胞群或本文所提供之任一種醫藥組合物投與患者。
在一些實施例中，癌症對於治療性干預而言為難治性的或具有抗性。
在一些實施例中，本文所提供之方法係用於預防患者之CD19
+、CD20
+、CD22
+、BCMA
+或B7-H3
+血液學癌症及實體癌復發，包含：將足以誘導抗癌作用之治療有效量之CD4
IL - 10 / CAR細胞(自體單供體、同種異體單供體或同種異體多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞)、單供體或多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞群或本文所提供之任一種醫藥組合物投與患者，該患者經鑑別患有CD19
+、CD20
+、CD22
+BCMA
+或B7-H3
+血液學癌症或實體癌或處於CD19
+、CD20
+、CD22
+、BCMA
+或B7-H3
+血液學癌症或實體癌復發的風險中。
在一些實施例中，CD4
IL - 10 / CAR細胞(自體單供體、同種異體單供體或同種異體多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞)與治療性干預組合使用。可同時執行或在不同時間執行組合。治療性干預較佳選自由以下組成之群：化學療法、放射療法、同種異體HSCT、免疫抑制、輸血、骨髓移植體、生長因子、生物製劑。
在一些實施例中，CD4
IL - 10 / CAR細胞(自體單供體、同種異體單供體或同種異體多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞)係用於治療患有惡性疾病的患者，其中方法包括將同種異體HSCT移植物投與患者及將治療有效量之CD4
IL - 10 / CAR細胞(自體單供體、同種異體單供體或同種異體多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞)、單供體或多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞群或本文所提供之任一種醫藥組合物投與患者。
在一些實施例中，使用CD4
IL - 10 / CAR細胞(自體單供體、同種異體單供體或同種異體多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞)治療接受同種異體HSCT (同種異體HSCT)的癌症患者，以便預防GvHD及誘導長期耐受性(除直接的抗腫瘤作用之外)。CD4
IL - 10 / CAR細胞的量足以抑制或預防移植物抗宿主疾病(GvHD)，而不抑制同種異體HSCT之移植物抗白血病(GvL)或移植物抗腫瘤(GvT)功效(由存在於幹細胞製劑中的供體T細胞介導)。
本文亦提供用於治療患有微量殘存疾病之患者的方法，包含：將足以誘導抗癌作用之治療有效量的CD4
IL - 10 / CAR細胞(自體單供體、同種異體單供體或同種異體多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞)、單供體或多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞群或本文所提供之任一種醫藥組合物投與經鑑別患有微量殘存疾病或處於患有微量殘存疾病風險中的患者。
在一些實施例中，CD4
IL - 10 / CAR細胞(自體單供體、同種異體單供體或同種異體多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞)、單供體或多供體CD4
IL - 10 / CA R細胞群或本文所提供之任一種醫藥組合物誘導腫瘤浸潤性腫瘤生長細胞死亡，從而促進骨髓譜系細胞(例如單核球、巨噬細胞、嗜中性球)。
在一些實施例中，CD4
IL - 10 / CAR細胞(自體單供體、同種異體單供體或同種異體多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞)、單供體或多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞群或本文所提供之任一種醫藥組合物誘導B細胞(例如CD19
+B細胞、CD20
+B細胞、CD22
+B細胞、BCMA
+、B7-H3
+B細胞或B7-H3
+實體腫瘤細胞)之細胞死亡。
6.7.3. 治療發炎或自體免疫疾病的方法
在一些實施例中，投與單供體或多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞以治療發炎或自體免疫疾病。在一些實施例中，投與單供體或多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞以治療涉及NLPR3發炎體高度活化的疾病或病症。
NOD樣受體家族(NLR)蛋白質NLRP3為一種胞內信號傳導分子，其感測來自病原性、環境或內源來源的危險信號。活化之後，NLPR3與凋亡蛋白酶-1相互作用，形成稱為發炎體的複合物。由此引起凋亡蛋白酶-1活化，該凋亡蛋白酶使促炎性細胞介素IL-1β及IL-18裂解成其活性形式且介導一種類型的發炎細胞死亡，稱為細胞焦亡。
在一些實施例中，投與單供體或多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞以治療選自以下的發炎疾病：穆-韋二氏症候群(Muckle-Wells syndrome，MWS)、家族性冷自體發炎症候群(FCAS)及新生兒發作多系統發炎疾病(NOMID)。在一些實施例中，投與單供體或多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞以治療選自以下之慢性疾病：代謝症候群、2型糖尿病、動脈粥樣硬化、阿茲海默症(Alzheimer)、帕金森病(Parkinson)、ALS、非酒精性脂肪變性肝炎、骨關節炎、矽肺病、石綿沉著病、痛風及肺纖維化。在一些實施例中，投與單供體或多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞以治療克羅恩氏病(Crohn's disease)、潰瘍性大腸炎、多發性硬化症及全身紅斑狼瘡或發炎眼病，諸如糖尿病性視網膜病變、急性青光眼及年齡相關黃斑變性。
在一些實施例中，投與單供體或多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞以治療與NLRP3有關的疾病。該疾病可選自由以下組成之群：CAPS、NASH、阿茲海默症、帕金森病、心血管疾病、骨關節炎、痛風、假性痛風、腎鈣沈積病、II型糖尿病、休格連症候群(Sjogren syndrome)、鐮狀細胞疾病(SCD)、AMD、感染、大腦型瘧疾、石綿沉著病、接觸型過敏、曬傷、矽肺病、囊腫性纖維化、發炎性腸病、ALS、骨髓發育不良症候群及葡萄膜炎。
在一些實施例中，該疾病為腦病症，其選自帕金森病、阿茲海默症、年齡相關之認知障礙、額顳葉型癡呆症、創傷性腦損傷、腦內出血、敗血症相關腦病變、大腦局部缺血、蛛網膜下出血、癲癇症、丙烯醯胺中毒、類鴉片誘導的神經炎症、慢性偏頭痛、圍手術期神經認知病症、中風後認知障礙、心跳驟停後的認知障礙、社交孤立誘導的認知障礙、焦慮症及創傷後應激障礙。
在一些實施例中，該疾病為肺病，其選自哮喘、IR肺損傷、ARDS/COPD、微粒物質誘導的肺損傷、輻射肺炎、肺高血壓、類肉瘤病、囊腫性纖維化及過敏性鼻炎。
在一些實施例中，該疾病為心臟病症，其選自動脈粥樣硬化、心臟衰竭、高血壓、心肌梗塞、心房纖顫、代謝功能異常誘導的心臟損傷、心臟衰竭及內皮功能障礙。
在一些實施例中，該疾病為胃腸疾病，諸如大腸炎。在一些實施例中，該疾病為肝病，其選自急性肝衰竭、免疫晝夜調節、NASH、糖尿病的認知功能障礙、IR肝損傷、特異藥物誘導之肝損傷及肝纖維化。在一些實施例中，該疾病為胰臟或腎臟病症，其選自糖尿病性腦病變、與糖尿病相關之動脈粥樣硬化、抗胰島素症、胰島移植排斥反應、慢性結晶腎病變、腎纖維化、I/R腎損傷、與肥胖症相關之腎病，及腎高血壓。在一些實施例中，該疾病為選自牛皮癬及視網膜新血管生成的皮膚病或眼病。在一些實施例中，該疾病為生殖病症，諸如早產。在一些實施例中，該疾病為免疫病症，其選自原發痛經、先天性免疫、先天性變成後天性免疫、全身性紅斑狼瘡-狼瘡性腎炎，及多發性硬化症。在一些實施例中，該疾病為可遺傳的病症，其選自穆-韋二氏症候群、類風濕性關節炎、鐮狀細胞疾病及VCP相關疾病。在一些實施例中，該疾病為疼痛病症，其選自多發性硬化症相關的神經病變性疼痛、慢性前列腺炎/慢性骨盆疼痛、癌症誘導的骨痛及痛覺過敏。在一些實施例中，該疾病為癌症，諸如人類頭頸癌鱗狀細胞癌。在一些實施例中，該疾病為感染性病症，諸如細菌、病毒或寄生蟲感染。
在一些實施例中，單供體或多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞與當前可用於NLRP3相關疾病之療法(諸如靶向IL-1的生物藥劑)組合使用。生物藥劑包括重組IL-1受體拮抗劑阿那白滯素(Anakinra)、中和IL-1β抗體康納單抗(Canakinumab)及可溶性誘餌IL-1受體利納西普(Rilonacept)。
在一些實施例中，投與單供體或多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞以治療選自以下之疾病：2型糖尿病、代謝症候群、心血管疾病、SLE、MS、CD、潰瘍性大腸炎(UC)、骨關節炎、非酒精性脂肪變性肝炎(Nash)、帕金森病、ALS、肺纖維化、矽肺病、石綿沉著病、糖尿病性視網膜病變及年齡相關黃斑變性。
在一些實施例中，投與單供體或多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞以治療發炎。發炎可與冠狀動脈疾病(CAD)、2型糖尿病、神經退化性疾病或發炎性腸病(但不限於此)相關。
在一些實施例中，投與單供體或多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞以治療涉及活化單核球、巨噬細胞或樹突狀細胞之IL-1β產生增加的疾病或病症。在一些實施例中，投與單供體或多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞以治療涉及活化單核球、巨噬細胞或樹突狀細胞之IL-18產生增加的疾病或病症。在一些實施例中，投與單供體或多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞以治療涉及活化單核球、巨噬細胞或樹突狀細胞之成熟凋亡蛋白酶1產生增加的疾病或病症。
在一些實施例中，投與單供體或多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞以減少活化單核球、巨噬細胞或樹突狀細胞的IL-1β產生。在一些實施例中，投與單供體或多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞以減少活化單核球、巨噬細胞或樹突狀細胞的IL-18產生。在一些實施例中，投與單供體或多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞以減少活化單核球、巨噬細胞或樹突狀細胞的成熟凋亡蛋白酶1產生。
6.7.4. 治療其他病症之方法
在一些實施例中，將CD4
IL - 10 / CAR細胞(自體單供體、同種異體單供體或同種異體多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞)投與需要免疫耐受的患者。在一些實施例中，本文所提供之方法包括將治療有效量的CD4
IL - 10 / CAR細胞(自體單供體、同種異體單供體或同種異體多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞)、單供體或多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞群或本文所提供之任一種醫藥組合物投與需要免疫耐受之患者。
在一些實施例中，將CD4
IL - 10 / CAR細胞(自體單供體、同種異體單供體或同種異體多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞)、單供體或多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞群或本文所提供之任一種醫藥組合物投與患者以治療自體免疫疾病。
在一些實施例中，自體免疫疾病係選自由以下組成之群：自體免疫葡萄膜炎、牛皮癬、白斑病、斑禿、牛皮癬性關節炎、發炎性腸病、橋本氏甲狀腺炎(Hashimoto's thyroiditis)、自體免疫血管炎、潰瘍性大腸炎、大皰性疾病、硬皮病、乳糜瀉、葛瑞夫茲氏病(graves disease)、全身性硬化症、重症肌無力、抗NMDA腦炎、類天疱瘡疾病(尋常性類天疱瘡及落葉狀類天疱瘡)、後天大皰性表皮鬆懈、血栓性血小板減少性紫癲、特發性血小板性紫癜、自體抗體誘導血管發炎、自體抗體誘導心臟炎、類風濕性關節炎、自體抗體誘導類風濕性關節炎、視神經脊髓炎譜系疾病、全身性紅斑狼瘡(SLE)、多發性硬化症(MS)、休格連氏症候群(sjögren's syndrome)、自體免疫肌病、I型糖尿病、艾迪生疾病(addison disease)、惡性貧血、自體免疫肝炎、原發性膽汁性膽管炎(PBC)、自體免疫胰臟炎、古巴士德氏疾病(goodpasture's disease)、原發膜性腎病變、卵巢功能不全、自體免疫睪丸炎、乾眼病及特發性間質性肺炎。在一些實施例中，自體免疫疾病為克羅恩氏病、潰瘍性大腸炎、乳糜瀉、1型糖尿病、狼瘡、牛皮癬、牛皮癬性關節炎或類風濕性關節炎。在一些實施例中，患者患有過敏性或異位性疾病。過敏性或異位性疾病可選自由哮喘、異位性皮炎及鼻炎組成之群。在一些實施例中，患者具有食物過敏。
在一些實施例中，投與CD4
IL - 10 / CAR細胞(自體單供體、同種異體單供體或同種異體多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞)、單供體或多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞群或本文所提供之任一種醫藥組合物，以預防對除HSCT之外之細胞及器官移植的病原性T細胞反應或降低該病原性T細胞反應的嚴重程度。在一些實施例中，該方法包含在投與CD4
IL - 10 / CAR細胞(自體單供體、同種異體單供體或同種異體多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞)、單供體或多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞群或本文所提供之任一種醫藥組合物之前或之後，將器官移植至患者的步驟。在某些實施例中，該器官為腎臟、心臟、肺、肝臟或胰島細胞。在較佳實施例中，CD4
IL - 10 / CAR細胞(自體單供體、同種異體單供體或同種異體多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞)、單供體或多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞群或本文所提供之任一種醫藥組合物預防器官移植的宿主排斥反應或降低該宿主排斥反應的嚴重程度。
在一些實施例中，投與CD4
IL - 10 / CAR細胞(自體單供體、同種異體單供體或同種異體多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞)、單供體或多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞群或本文所提供之任一種醫藥組合物，以預防或減少與基因療法有關之免疫反應，例如投與重組腺病毒、腺相關病毒(AAV)、單純疱疹病毒(HSV)、逆轉錄病毒、慢病毒、非整合慢病毒、α病毒、黃病毒、棒狀病毒、麻疹病毒、新城雞瘟病毒、痘病毒或小核糖核酸病毒。在一些實施例中，該方法進一步包含在CD4
IL - 10 / CAR細胞或醫藥組合物投與之前或之後，將重組腺病毒、腺相關病毒(AAV)、單純疱疹病毒(HSV)、逆轉錄病毒、慢病毒、非整合慢病毒、α病毒、黃病毒、棒狀病毒、麻疹病毒、新城雞瘟病毒、痘病毒或小核糖核酸病毒投與患者的步驟。
在一些實施例中，投與CD4
IL - 10 / CAR細胞(自體單供體、同種異體單供體或同種異體多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞)、單供體或多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞群或本文所提供之任一種醫藥組合物，以預防或減少針對除AAV之外之重組病毒載體的免疫反應。在此等實施例中，該方法進一步包含在投與CD4
IL - 10 / CAR細胞、CD4
IL - 10 / CAR細胞群或醫藥組合物之前或之後，將除AAV之外的重組病毒載體投與患者的步驟。除AAV之外之病毒載體的非限制性實例包括：單純疱疹病毒(HSV)、逆轉錄病毒、慢病毒、α病毒、黃病毒、棒狀病毒、麻疹病毒、新城雞瘟病毒、痘病毒或小核糖核酸病毒。
在一些實施例中，投與CD4
IL - 10 / CAR細胞(自體單供體、同種異體單供體或同種異體多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞)、單供體或多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞群或本文所提供之任一種醫藥組合物，以預防或減少與iPS衍生之組織或細胞移植有關的免疫反應。iPS衍生的組織及細胞包括但不限於心肌細胞、肝細胞、上皮細胞、軟骨、骨骼及肌肉細胞、神經元。
在一些實施例中，該方法進一步包含在投與CD4
IL - 10 / CAR細胞、CD4
IL - 10 / CAR細胞群或醫藥組合物之前或之後將免疫原性治療蛋白投與患者的步驟。在一些實施例中，CD4
IL - 10 / CAR細胞、CD4
IL - 10 / CAR細胞群或醫藥組合物減少針對免疫原性治療蛋白的免疫反應。在一些實施例中，免疫原性治療蛋白係選自治療抗體、因子VIII替代品、細胞介素及細胞介素突變蛋白。
在一些實施例中，將CD4
IL - 10 / CAR細胞(自體單供體、同種異體單供體或同種異體多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞)、單供體或多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞群或本文所提供之任一種醫藥組合物投與患者以治療發炎。發炎可與冠狀動脈疾病(CAD)、2型糖尿病、神經退化性疾病、非酒精脂肪變性肝炎(NASH)或發炎性腸病(但不限於此)相關。
在一些實施例中，投與CD4
IL - 10 / CAR細胞(自體單供體、同種異體單供體或同種異體多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞)、單供體或多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞群或本文所提供之任一種醫藥組合物，以治療涉及NLPR3發炎體高度活化的疾病或病症。在一些實施例中，投與CD4
IL - 10 / CAR細胞(自體單供體、同種異體單供體或同種異體多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞)、單供體或多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞群或本文所提供之任一種醫藥組合物，以治療涉及活化單核球、巨噬細胞或樹突狀細胞之IL-1β產生增加的疾病或病症。在一些實施例中，投與CD4
IL - 10 / CAR細胞(自體單供體、同種異體單供體或同種異體多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞)、單供體或多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞群或本文所提供之任一種醫藥組合物，以治療涉及活化單核球、巨噬細胞或樹突狀細胞之IL-18產生增加的疾病或病症。在一些實施例中，投與CD4
IL - 10 / CAR細胞(自體單供體、同種異體單供體或同種異體多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞)、單供體或多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞群或本文所提供之任一種醫藥組合物，以治療涉及活化單核球、巨噬細胞或樹突狀細胞之成熟凋亡蛋白酶1產生增加的疾病或病症。
在一些實施例中，投與CD4
IL - 10 / CAR細胞(自體單供體、同種異體單供體或同種異體多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞)、單供體或多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞群或本文所提供之任一種醫藥組合物，以減少活化單核球、巨噬細胞或樹突狀細胞之IL-1β產生。在一些實施例中，投與CD4
IL - 10 / CAR細胞(自體單供體、同種異體單供體或同種異體多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞)、單供體或多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞群或本文所提供之任一種醫藥組合物，以減少活化單核球、巨噬細胞或樹突狀細胞之IL-18產生。在一些實施例中，投與CD4
IL - 10 / CAR細胞(自體單供體、同種異體單供體或同種異體多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞)、單供體或多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞群或本文所提供之任一種醫藥組合物，以減少活化單核球、巨噬細胞或樹突狀細胞之成熟凋亡蛋白酶1產生。
在一些實施例中，投與CD4
IL - 10 / CAR細胞(自體單供體、同種異體單供體或同種異體多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞)、單供體或多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞群或本文所提供之任一種醫藥組合物，以減少患者對病毒感染的高度活化免疫反應。在一些實施例中，病毒為SARS-coV-2。在一些實施例中，投與CD4
IL - 10 / CAR細胞(自體單供體、同種異體單供體或同種異體多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞)、單供體或多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞群或本文所提供之任一種醫藥組合物，以減少對細菌感染的高度活化免疫反應，諸如中毒休克、細胞介素風暴、治療抗體、因子VIII替代品、細胞介素及細胞介素突變蛋白。
在另一態樣中，本發明提供一種治療或抑制患者之自體免疫疾病、過敏性疾病或發炎疾病的方法，其包含將足以治療或抑制自體免疫疾病、過敏性疾病或發炎疾病之治療有效量之CD4
IL - 10 / CAR細胞(自體單供體、同種異體單供體或同種異體多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞)、單供體或多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞群或本文所提供之任一種醫藥組合物投與經鑑別患有自體免疫疾病、過敏性疾病或發炎疾病之患者的步驟。
在另一態樣中，本發明提供一種減少移植有造血幹細胞、骨髓細胞或實體器官之患者之移植排斥反應的方法，其包含將足以減少移植排斥反應之治療有效量之CD4
IL - 10 / CAR細胞(自體單供體、同種異體單供體或同種異體多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞)、單供體或多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞群或本文所提供之任一種醫藥組合物投與經鑑別具有所移植之造血幹細胞、骨髓細胞或實體器官之排斥反應之患者的步驟。
在另一態樣中，本發明提供一種治療患者之移植物抗宿主疾病(GvHD)的方法，其包含：將足以抑制或預防GvHD之治療有效量之CD4
IL - 10 / CAR細胞(自體單供體、同種異體單供體或同種異體多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞)、單供體或多供體CD4
IL - 10 / CAR細胞群或本文所提供之任一種醫藥組合物投與經鑑別患有移植物抗宿主疾病(GvHD)或處於患有移植物抗宿主疾病(GvHD)風險中的患者。在一些實施例中，GvHD為急性GvHD。在一些實施例中，GvHD為慢性GvHD。
在另一態樣中，本發明的特徵為一種治療患者之組織或器官損傷(例如傷口癒合)的方法，其包含：將足以誘導組織或器官損傷修復之治療有效量之本文所提供之任一種CD4
IL - 10 / CAR細胞、本文所提供之任一種CD4
IL - 10 / CAR細胞群或本文所提供之醫藥組合物投與經鑑別具有組織或器官損傷或處於具有組織或器官損傷風險中的患者。
6.8. 聚核苷酸及載體
本發明的特徵亦為一或多種聚核苷酸構築體，其包含(a)編碼嵌合抗原受體(CAR)(例如本文所提供之任一種CAR)的第一聚核苷酸區段；及(b)編碼介白素-10 (IL-10)的第二聚核苷酸區段及(c)編碼截斷形式之NGFR的第三聚核苷酸區段。在一些實施例中，第一聚核苷酸區段及第二及第三聚核苷酸存在於同一構築體中。在一些實施例中，第一聚核苷酸存在於第一聚核苷酸構築體中，且第二及第三聚核苷酸區段存在於第二聚核苷酸構築體中。在一些實施例中，第三聚核苷酸區段為視情況存在的。
在一些實施例中，第一聚核苷酸區段包含可操作地連接至CAR編碼序列的調控元件(例如本文所述之任一種調控元件(例如任一種啟動子))。在一些實施例中，調控元件驅動CAR表現。
在一些實施例中，第二聚核苷酸區段包含可操作地連接至IL-10編碼序列的調控元件(例如本文所述之任一種例示性調控元件(例如任一種啟動子))。在一些實施例中，調控元件驅動IL-10組成性表現。
在一些實施例中，第三聚核苷酸區段包含可操作地連接至選擇標記物(例如ΔNGFR)之編碼序列的調控元件(例如本文所述之任一種例示性調控元件(例如任一種啟動子))。在一些實施例中，調控元件驅動ΔNGFR組成性表現。
在一些實施例中，聚核苷酸構築體包括介於第一聚核苷酸區段與第二聚核苷酸區段之間的內部核糖體進入位點(IRES)或自裂解肽。在一些實施例中，聚核苷酸構築體包括介於第二聚核苷酸區段與第一聚核苷酸區段之間的內部核糖體進入位點(IRES)或自裂解肽。在一些實施例中，自裂解肽係選自由F2A、P2A、T2A及E2A組成之群。
在一些實施例中，聚核苷酸構築體自5'至3'包括：可操作地連接至第一聚核苷酸區段的啟動子、自裂解肽或IRES，及第二聚核苷酸區段。在一些實施例中，聚核苷酸構築體自5'至3'包括：可操作地連接至第一聚核苷酸區段的啟動子、自裂解肽或IRES，及第二聚核苷酸區段，及可操作地連接至第三聚核苷酸區段的第二啟動子。
在一些實施例中，聚核苷酸構築體自5'至3'包括：可操作地連接至第二聚核苷酸區段的啟動子、自裂解肽或IRES，及第一聚核苷酸區段。
在一些實施例中，聚核苷酸構築體包括可操作地連接至第一聚核苷酸區段的第一啟動子及可操作地連接至第二聚核苷酸區段的第二啟動子。在一些實施例中，聚核苷酸構築體包括可操作地連接至第一聚核苷酸區段的第一啟動子、可操作地連接至第二聚核苷酸區段的第二啟動子，及可操作地連接至第三聚核苷酸區段的第三啟動子。
在一些實施例中，聚核苷酸構築體編碼靶向與自體免疫疾病、發炎病症或癌症相關之抗原的抗原結合域。在一些實施例中，在相關MHC分子之上下文中，該抗原係選自由以下組成之群：CD19、CD20、CD22、CD27、BCMA、CD38、HLA*A2、HLA*A24或瓜胺酸化肽、胰島素、MOG、GAD65、IA2、麥膠蛋白及橋粒醣蛋白。
在一些實施例中，聚核苷酸構築體包括編碼靶向癌症相關抗原之抗原結合域的序列。在一些實施例中，癌症相關抗原係選自由以下組成之群：CD19、CD20、CD22、CD23、CD27、CD38、CEA、BCMA、Lyml、Lym2、CLEC5A、CDH179b、FLT3、GCC、Muc、CSF2RA、GFRa4、CD32、CD33、IL1lRa、IL13Ra、NYBRI、SLea、CD200R、TGFBetaR2、CEA、CD276、TROP2、LAMP1、PTK7、DLL3、CDH1、CDH6、CDH17、CDH19、TSHR、B7-H3及酪胺酸酶。
在一些實施例中，第一聚核苷酸區段包含SEQ ID NO: 10、17、23、35或55之序列。
在一些實施例中，第二聚核苷酸區段包含SEQ ID NO: 2之序列。
在一些實施例中，聚核苷酸構築體進一步包含一或多種選擇標記物(例如本文所提供之任一種選擇標記物)。在一些實施例中，第一聚核苷酸區段、第二聚核苷酸區段或兩者均進一步包含編碼選擇標記物的序列。
在一些實施例中，聚核苷酸構築體包括ΔNGFR作為選擇標記物。
在一些實施例中，聚核苷酸構築體包括含有SEQ ID NO: 4之序列的ΔNGFR。
在一些實施例中，聚核苷酸構築體包括EGFR的截斷形式作為選擇標記物。
在一些實施例中，一或多種聚核苷酸構築體為一或多種載體。在一些實施例中，載體為病毒載體。病毒載體之非限制性實例包括：慢病毒、逆轉錄病毒、γ逆轉錄病毒、腺相關病毒、腺病毒、輔助依賴型腺病毒、仙台病毒(sendai virus)或桿狀病毒。在一些實施例中，聚核苷酸構築體為慢病毒載體。
在一些實施例中，第一聚核苷酸存在於第一慢病毒載體中，且第二聚核苷酸區段存在於第二慢病毒載體中。
在一些實施例中，慢病毒載體能夠整合至T細胞核基因體中。在一些實施例中，慢病毒載體不能夠整合至T細胞核基因體中。在一些實施例中，使用整合缺乏型慢病毒載體。舉例而言，在一些實施例中，使用整合缺乏型慢病毒載體或Mátrai所揭示之其他慢病毒載體。在一些實施例中，使用整合酶缺乏型慢病毒。舉例而言，可使用如Mátrai等人,
Hepatology53:1696-1707 (2011)所述的含有整合酶中之不活化突變(D64V)的整合酶缺乏型慢病毒，該文獻以引用的方式併入本文中。
6.9. 實例
以下實例係為了說明，而非為了限制而提供。
6.9.1. 實驗觀測之概述
總體而言，下述實驗中的資料證明，人類CD4+T細胞可用兩種不同慢病毒載體轉導：1)編碼合成CAR的LVV，該合成CAR包含人類B細胞表面抗原結合域、CD8α鉸鏈及CD8α跨膜域、CD28共刺激域及CD3ζ活化域以及2)編碼人類IL-10基因外加截斷形式之NGFR基因的雙向載體。所得經轉導的CD4
+T細胞表現CD19 CAR (根據CD19表現所量測)與IL-10/NGFR (根據NGFR表現所量測)。當用兩種不同慢病毒載體依序或同時轉導之後產生經雙重轉導的CD4
+T細胞(一般命名為CD4
IL - 10 / CAR細胞或當表現抗CD19 CAR時命名為CD4
IL - 10 抗 CD19CAR細胞，如圖2A至2B中所述)時，發現轉導效率無差異。
經由CD3及CD28活化之後，CD4
IL - 10 / CAR細胞顯示的細胞介素產生概況類似於CD4
IL - 10細胞的細胞介素產生概況及針對Tr1細胞所述的細胞介素產生概況。舉例而言，CD4
IL - 10 / CAR細胞產生高含量的IL-10，以及不產生或低含量的IL-4、IFN-γ及IL-5。值得注意的是，在延長的培養期之後，此細胞介素產生概況穩定。
有趣的是，CD19
+目標細胞與CD4
IL - 10 抗 CD19CAR細胞共培養引起CD4
IL - 10 抗 CD19 CAR細胞特異性活化及誘導IL-10產生。
CD4
IL - 10 抗 CD19CAR細胞在活體外抑制PBMC增殖、同種異體CD4
+T細胞增殖及同種異體CD8
+T細胞增殖，如在CD4
IL - 10細胞的情況下亦所見。
CD4
IL - 10 抗 CD19CAR細胞在活體外特異性殺滅CD19
+目標細胞，而像CD4
IL - 10細胞，其維持其殺滅骨髓目標細胞的能力，此視I類MHC、CD13、CD54及CD112中之一或多者的表現而定。另外，CD4
IL - 10 抗 CD19 CART細胞在活體內強烈抑制CD19
+目標細胞。重要的是，類似於如針對單供體及多供體CD4
IL - 10細胞所述，單供體及多供體CD4
IL - 10 抗 CD19 CAR細胞不誘導異種GvHD，而PBMC誘導重度異種GvHD。最後，CD4
IL - 10 抗 CD19 CAR細胞與PBMC協同發揮其抗腫瘤作用，表明其不干擾保護性GvL反應，如針對CD4
IL - 10細胞所述(Locafaro等人, Mol Ther. 2017;25(10):2254-2269)。另外，在同種異體PBMC誘導GvHD之人源化小鼠模型中，單供體及多供體CD4
IL - 10 抗 CD19 CAR細胞保護小鼠免患異種GvHD (參見
圖 18A 至 圖 18C)。
此資料顯示，CD4
IL - 10 抗 CD19 CAR與目標細胞上所表現之CD19之間的特異性相互作用誘導此等細胞活化，從而引起CD19
+目標細胞被特異性殺滅及IL-10產生。
總之，資料顯示CD4
IL - 10 / CART細胞在治療B細胞及T細胞介導之所有自體免疫疾病方面具有獨特的臨床效用，原因在於其不僅排除產生自體抗體的B細胞，而且經由IL-10的產生來同時抑制病原性自體免疫CD4
+T細胞及CD8
+T細胞反應。資料亦顯示單供體或多供體CD4
IL - 10 抗 CD19 CAR細胞在治療/排除CD19
+腫瘤細胞及防止腫瘤復發方面具有獨特的臨床效用，尤其是經歷同種異體HSCT的患者，原因為CD4
IL - 10 抗 CD19 CAR細胞本身不誘導GvHD且不干擾PBMC的保護性抗腫瘤作用(GvL作用)。
重要的是，即使在高濃度下，CD4
IL - 10 抗 CD19 CAR細胞(自體或同種異體)本身不誘導GvHD。此等結果證明，CD4
IL - 10 / CAR細胞可用於治療i)白血病及表現目標抗原的其他惡性疾病；ii)經歷同種異體HSCT或BM移植以減少GvHD、同時保持HSCT之GvL或GvT治療效果之患者的白血病及其他惡性疾病；iii)移除自體免疫B細胞以及下調病原性T細胞反應及NLPR3發炎體所致的自體免疫疾病；iv)下調病原性T細胞反應及NLPR3發炎體所致的發炎疾病；v)細胞及器官移植排斥反應；vi)表現腫瘤相關抗原(包括但不限於B7-H3)的實體腫瘤；以及vii)組織修復及傷口癒合所致的免疫介導性疾病。
6.9.2. 實例1：產生CD4
IL - 10 / 抗 CD19 CAR細胞
6.9.2.1. IL-10/ΔNGFR及抗CD19 CAR之載體產生
使用第二代CD19 CAR產生CD4
IL - 10 抗 CD19 CAR細胞。CD19 CAR包括來自完整人類抗CD19單株抗體的scFv (SEQ ID NO: 12)、CD8α鉸鏈及CD8α跨膜域、CD28共刺激域及CD3ζ (CD3 zeta)活化域(圖2A)。將如圖2中所示的CD19 CAR插入慢病毒載體(LVV)(參見圖2B)。關於靶向CD19、CD20、CD22、BCMA或B7H3之例示性CAR的圖解說明，參見圖1。藉由將抗CD19 scFv (FMC63)編碼序列接入慢病毒骨架中來產生慢病毒載體，該慢病毒骨架包括人類CD8α鉸鏈區及CD8α跨膜區、CD28共刺激域及CD3ζ胞內信號傳導域。使用抗CD19-CAR偵測劑(Miltenyi)監測抗CD19 CAR的表面表現。
為了將編碼IL-10的聚核苷酸引入CD4
+T細胞中以產生CD4
IL - 10 抗 CD19 CAR細胞，使用含有人類IL-10 (SEQ ID NO: 2)及截斷形式之NGFR (亦稱為CD271)(ΔNGFR)(SEQ ID NO: 4)之編碼序列的慢病毒載體(LVV)(圖4)。含有IL-10及∆NGFR編碼序列的LVV進一步描述於WO2016/146542中，該文獻以全文引用的方式併入本文中。
藉由將來自pH15C (ATCC 68192)之549 bp片段的人類IL-10編碼序列接入質體pLVIL-10中來產生慢病毒載體。雙向啟動子(方向相反的人類PGK啟動子外加CMV啟動子的最小核心元件)的存在允許兩種轉殖基因共表現。質體進一步含有抗生素抗性基因(例如胺苄青黴素(ampicillin)或康黴素(kanamycin))之編碼序列。關於IL-10構築體的例示性圖解說明，參見圖3。
藉由Ca
3PO
4將四個質體短暫共轉染至293T細胞中來產生慢病毒載體且藉由超速離心濃縮：將1 μM丁酸鈉添加至培養物中用於收集載體。藉由限制稀釋法估算對293T細胞的效價，且藉由HIV-1 Gag p24抗原免疫捕捉(NEN Life Science Products; Waltham, MA)量測載體顆粒。載體感染力依照效價與顆粒之間的比率計算。濃縮載體的效價範圍為1x10
8至6x10
9個轉導單位/mL，且感染力範圍為5xl0
4至5x10
5個轉導單位/ng。
6.9.2.2. 產生CD4
IL - 10 / CAR細胞
如圖5A至圖5C中所示，使用三種不同方法產生CD4
IL - 10 抗 CD19 CAR細胞。對於不同方法中之每一者而言，純化來自健康人類供體的CD4
+T細胞。經純化的人類CD4
+T細胞在補充有5%人類AB血清及rhIL-2 (50 U/mL)的完全培養基(X-vivo)中用抗CD3/抗CD28珠粒(Miltenyi)(3:1細胞:珠粒比率)活化。
圖5A顯示活化CD4
+T細胞在活化之後的48小時用編碼抗CD19 CAR (LVV
CD19 - CAR)之慢病毒載體轉導且在24小時後(亦即，活化之後的72小時)用編碼人類IL-10及截斷形式之人類NGF受體的雙向慢病毒載體(LVV
IL - 10 - NGFR)轉導。兩種LVV均以20的感染倍率(MOI)使用。
圖5B顯示活化CD4
+T細胞在活化之後的48小時用LVV
IL - 10 - NGFR轉導且在24小時後(亦即，活化之後的72小時)用LVV
CD19 - CAR轉導。
圖5C顯示活化CD4
+T細胞在活化之後的48小時用LVV
IL - 10 - NGFR及LVV
CD19 - CAR同時轉導。藉由在活化之後的48小時僅用LVV
IL - 10 - NGFR轉導活化CD4
+T細胞來產生對照CD4
IL10細胞。對於圖5A至圖5C中之每一者而言，在凝聚胺(8 µg/mL)存在下執行轉導。另外，對於圖5A至圖5C中之每一者而言，在轉導之後的10至28天，使用抗CD271微珠(Miltenyi)及抗CD19 CAR微珠(Miltenyi)純化經轉導的細胞(亦即，∆NGFR
+細胞)。如先前(Andolfi等人, Mol. Ther. 20(9):1778-1790 (2012)及Locafaro等人, Mol. Ther. 25(10): 2254-2269 (2017))所述，每14天對純化的細胞再刺激。第二輪(TF2)及第三輪(TF3)再刺激之後，活體外及活體內表徵所得細胞(CD4
IL - 10 抗 CD19 CAR)。在整個培養期期間，根據需要，每2至3天更新培養基。
在TF3 (亦即，第三輪再刺激之後)，藉由用抗CD271 mAb (Biolegend)及抗CD19 CAR偵測試劑(Miltenyi)染色分析且藉由流式細胞術分析CD4
IL - 10 抗 CD19 CAR細胞。染色表明，依據NGFR與抗CD19 CAR之共表現所測定之CD4
IL - 10 抗 CD19 CAR細胞的標識及純度在三種不同轉導方法中分別為88.6% (圖6A，利用圖5A中所述之方法)、64.1% (圖6B，利用圖5B中所述之方法)及52.6% (圖6C，利用圖5C中所述之方法)。正如所料，利用圖5C中所述之方法自同一供體(供體26.1及26.2)分別產生且用作對照的CD4
IL - 10細胞不表現CD19 CAR (圖7)。
如圖7中所示，CD4
IL - 10 抗 CD19 CAR細胞表現IL-10 (根據NGFR的表現所量測)與抗CD19 CAR。在此實驗中，來自兩個不同供體(26.1及26.2)的CD4
+T細胞在珠粒活化之後的48小時用LVV
IL - 10 - NGFR及LVV
抗 CD19 CAR同時轉導(方法5C)。為了產生CD4
IL - 10T細胞(對照)，來自供體26.1及26.2的CD4
+T細胞在珠粒活化之後的48小時僅用LVV
IL - 10 - NGFR轉導。就此分析而言，在用餵養細胞進行第二輪再刺激(亦即，TF2)之後，分析CD4
IL - 10細胞(對照)及CD4
IL - 10 抗 CD19 CAR細胞。CD4
IL - 10細胞(對照)與CD4
IL - 10 抗 CD19 CART細胞均用抗CD271 mAb (Biolegends)及CD19-CAR偵測試劑(Miltenyi)染色且藉由流式細胞術加以分析。如圖7中所示，經LVV
IL - 10 - NGFR及LVV
CD19 - CAR轉導的大部分細胞表現CD271及CD19-CAR (圖7，右圖)，而僅經LVV
IL - 10 - NGFR轉導的大部分細胞表現CD271，但不表現CD19-CAR (圖7，左圖)。
此等結果表明，不依賴於兩種不同LVV的轉導時序及順序，可成功地產生CD4
IL - 10 抗 CD19 CAR細胞。另外，此表明可使用編碼IL-10與CAR之單一LVV產生CD4
IL - 10 / CAR。
6.9.2.3. CD4
IL - 10 抗 CD19 CAR細胞的細胞介素產生概況類似於天然來源之Tr1細胞及CD4
IL - 10細胞的細胞介素產生概況
根據圖5C中所述的方法，藉由用(i)含有抗CD19-CAR的LVV及(ii)含有IL-10及∆NGFR的LVV同時轉導來產生來自3個不同健康供體(26.1、26.2及26.3)的CD4
IL - 10 抗 CD19 CAR細胞。詳言之，為了產生CD4
IL - 10 抗 CD19 CAR細胞，來自三個不同供體(26.1、26.2及26.3)的CD4
+T細胞在珠粒活化之後的48小時用LVV
IL - 10 - NGFR及LVV
CD19 - CAR同時轉導。為了產生CD4
IL - 10T細胞(對照)，來自三個不同供體(26.1、26.2及26.3)的CD4
+T細胞在珠粒活化之後的48小時用LVV
IL - 10 - NGFR轉導。
就此分析而言，如先前在Andolfi等人, Mol. Ther. 20(9): 1778-1790 (2012)及Locafaro等人, Mol. Ther. 25(10): 2254-2269 (2017)中所述，對各CD4
IL - 10細胞(對照)及CD4
IL - 10 / CART細胞的2x10
5個細胞(200 µL)進行再刺激。在第二輪(TF2)再刺激之後的第14天，細胞用固著的抗CD3及可溶性抗CD28 mAb刺激48小時。收集培養上清液且藉由ELISA測定IL-10、IL-4、IL-5及IFN-γ含量。
如圖8A至圖8D中所示，儘管觀測到細胞介素產生量存在一些個別差異，但CD4
IL - 10 / CAR細胞，如CD4
IL - 10細胞及Tr1細胞(未圖示)，產生高含量的IL-10、低含量的IL-4及可變含量的IFN-γ，及IL-5。
在TF 3收集的源於供體24.2之CD4
IL - 10 抗 CD19 CAR細胞獲得類似結果(圖9)。為了產生CD4
IL - 10 抗 CD19 CAR細胞用於此實驗，來自供體24.2的CD4
+T細胞在珠粒活化之後的48小時用LVV
IL - 10 - NGFR及LVV
CD19 - CAR同時轉導(參見圖5C)。為了產生CD4
IL - 10T細胞(對照)，來自供體24.2的CD4
+T細胞在珠粒活化之後的48小時僅用LVV
IL - 10 - NGFR轉導。就此分析而言，如先前在Andolfi等人, Mol. Ther. 20(9): 1778-1790 (2012)及Locafaro等人, Mol. Ther. 25(10): 2254-2269 (2017)中所述，對各CD4
IL - 10T細胞(對照)及CD4
IL - 10 / CART細胞的2x10
5個細胞(200 µL)進行再刺激。簡言之，在第三輪(TF3)再刺激之後的第14天，細胞用固著的抗CD3及可溶性抗CD28 mAb刺激48小時。收集培養上清液且藉由ELISA測定IL-10、IL-4、IL-5及IFN-γ含量。
如圖9中所示，即使在延長培養之後，此等細胞仍然產生高含量的IL-10、低含量的IL-4以及可變含量的IL-5及IFN-γ。
總體而言，圖8及圖9中的資料表明，用LVV
IL - 10 - NGFR及LVV
CD19 - CAR同時轉導經純化的CD4
IL - 10細胞係可行的且產生的CD4
IL - 10 - CART細胞具有與CD4
IL - 10T細胞及Tr1細胞相同的獨特及特徵性細胞介素產生概況。另外，當在TF2或TF3收集CD4
IL - 10 - CART時，觀測到細胞介素產生概況無差異，表明此等細胞介素產生概況在延長的時段內係穩定的。
6.9.3. 實例2：CD4
IL - 10 抗 CD19 CAR細胞的細胞毒性及在與CD19
+目標細胞接合之後發生的活化
已知CD4
IL - 10細胞能夠在限定的條件下殺滅骨髓腫瘤細胞，諸如ALL-CM (Andolfi等人, Mol Ther. 2012;20(9):1778-1790)。設計此實驗係為了評估抗CD19 CAR的共表現是否產生當與表現CD19之細胞株(例如NALM6)共培養時可殺滅CD19
+細胞的細胞(CD4
IL - 10 抗 CD19 CAR)。
詳言之，第三輪再刺激(TF3)(參見圖5C)之後，收集CD4
IL - 10細胞(對照)及CD4
IL - 10 抗 CD19 CAR細胞，兩者均由自供體24.2分離的CD4
+T細胞產生，且與K562、NALM6 (CD19+)或ALL-CM目標細胞(10
5每孔)以1:1比率共培養三天。共培養三天之後，使用流式細胞術測定各種共培養物中之殘餘目標細胞的存在。
資料顯示，CD4
IL - 10 抗 CD19 CAR細胞經由CD19-CAR與CD19
+目標細胞之接合來殺滅CD19
+NALM6細胞。相比之下，用作對照的CD4
IL - 10細胞無效且不殺滅CD19
+NALM6細胞(圖10)。另外，CD4
IL - 10 抗 CD19 CAR細胞，如CD4
IL - 10細胞，殺滅骨髓腫瘤細胞株ALL CM。CD4
IL - 10 抗 CD19 CAR細胞與CD4
IL - 10細胞對K562細胞均無細胞毒性效應或細胞毒性效應極低，K562細胞極易遭受非特異性細胞毒性且極易被NK細胞殺滅(圖10)。
此等結果表明，CD4
IL - 10 抗 CD19 CAR細胞上所表現之CD19-CAR與NALM6淋巴瘤細胞上所表現之CD19的接合觸發CD4
IL - 10 抗 CD19 CAR細胞的細胞毒性機制，使得CD19
+目標細胞被選擇性及高效殺滅。另外，CD4
IL - 10 抗 CD19 CAR細胞，如CD4
IL - 10細胞，維持殺滅骨髓目標細胞的能力，該等目標細胞表現CD13、I類MHC抗原、CD54及CD112，如先前(Andolfi等人, Mol Ther. 2012;20(9):1778-1790)所述。
除誘導選擇性細胞毒性活性之外，CD4
IL - 10 抗 CD19 CAR與CD19
+NALM6目標的接合亦引起CD4
IL - 10 抗 CD19 CAR細胞的選擇性活化及IL-10產生。
在此等實驗中，由自三個不同供體(26.1、26.2及26.3)分離出的CD4
+T細胞產生CD4
IL - 10細胞(對照)及CD4
IL - 10 抗 CD19 CAR細胞。評估IL-10產生之前，證實由三個不同供體中之每一者產生之CD4
IL - 10 抗 CD19 CAR細胞對CD19
+細胞進行選擇性殺滅。
詳言之，在第二輪再刺激(TF2)之後，收集由自三個不同供體(26.1、26.2及26.3)分離出之CD4
+T細胞產生的CD4
IL - 10細胞(對照)及CD4
IL - 10 抗 CD19 CAR細胞(參見圖5C)，且與K562細胞、NALM6 (CD19
+)細胞或ALL-CM目標細胞(每孔10
5)以1:1比率共培養三天。共培養三天之後，使用流式細胞術測定各種共培養物中之殘餘白血病目標細胞的存在。極易遭受非特異性細胞毒性且極易被NK細胞殺滅的K562細胞株充當對照。資料顯示於圖11A中。
如圖11A中所示，由3個不同供體(26.1、26.2及26.3)產生的CD4
IL - 10 抗 CD19 CAR細胞有效殺滅CD19
+NALM6細胞。CD4
IL - 10 抗 CD19 CAR細胞維持其殺滅骨髓腫瘤細胞株ALL-CM的能力，而其對不表現CD19、但已知對非特異性細胞毒性及NK細胞殺滅敏感的K562細胞無細胞毒性或僅具弱細胞毒性(圖11A)。CD4
IL - 10 抗 CD19 CAR亦殺滅ALL-CM (一種骨髓性白血病細胞株)。與NALM6細胞共培養僅3天之後，在細胞毒性分析中量測上清液中存在大量IL-10(圖11B)。相比之下，在NALM6細胞與來自同一供體之CD4
IL - 10細胞的共培養物中不可偵測到IL-10 (定量限值：31 pg/mL)(圖11B)。
總之，資料顯示，CD19-CAR與相關目標細胞上所表現之CD19的接合使CD4
IL - 10 抗 CD19 CAR細胞選擇性地活化。此活化引起(i)細胞的細胞毒性/溶胞活性，從而殺滅CD19
+目標細胞；及(ii)誘導IL-10產生，此為CD4
IL - 10 抗 CD19 CAR細胞免疫調節及抑制功能所必需的。另外，CD4
IL - 10 抗 CD19 CAR細胞對骨髓腫瘤目標細胞維持與先前對CD4
IL - 10細胞所觀測相同的細胞毒性能力。最後，CD4
IL - 10細胞不能殺滅CD19
+NALM6細胞(圖11B)證明，CD4
IL - 10 抗 CD19 CAR細胞的細胞毒性活性歸因於抗CD19 CAR與CD19
+目標細胞的接合。
6.9.4. 實例3：CD4
IL - 10 抗 CD19 CAR細胞抑制同種異體CD4
+T細胞與CD8
+T細胞的增殖反應
由於在TF2或TF3收集的CD4
IL - 10 抗 CD19 CAR細胞及CD4
IL - 10細胞各自產生高含量的IL-10，因此測試兩者抑制獲自健康供體之同種異體CD4
+及CD8
+T細胞增殖的能力。
為了評估同種異體CD4
+T細胞的增殖，同種異體PBMC細胞用eFluor® 670 (每孔個1x10
5細胞)標記且在第二輪再刺激之後分離出(參見圖5C)之CD4
IL - 10細胞(對照)或CD4
IL - 10 抗 CD19 CAR細胞(每孔1x10
5個細胞)存在或不存在下用同種異體成熟樹突狀細胞(DC)(每孔5x10
4個細胞)及可溶性抗CD3 mAb刺激，有反應細胞:受抑制細胞的比率為1:1。培養4天之後，藉由eFluor®670稀釋、使用流式細胞術測定有反應之CD4
+增殖T細胞的百分比。對於流式細胞術而言，對細胞中的CD4
+∆NGFR
-T細胞設門。
為了評估同種異體CD8
+T細胞的增殖，同種異體PBMC細胞用eFluor® 670 (每孔個1x10
5細胞)標記且在第二輪再刺激之後分離出(參見圖5C)之CD4
IL - 10細胞(對照)或CD4
IL - 10 抗 CD19 CAR細胞(每孔1x10
5個細胞)存在或不存在下用同種異體成熟樹突狀細胞(DC)(每孔5x10
4個細胞)及可溶性抗CD3 mAb刺激，有反應細胞:受抑制細胞的比率為1:1。培養4天之後，藉由eFluor®670稀釋、使用流式細胞術測定有反應之CD8
+增殖T細胞的百分比。對於流式細胞術而言，對細胞中的CD8
+∆NGFR
-T細胞設門。
為了評估同種異體PBMC的增殖，同種異體PBMC細胞用eFluor® 670 (每孔個1x10
5細胞)標記且在第二輪再刺激之後分離出(參見圖5C)之CD4
IL - 10(對照)或CD4
IL - 10 抗 CD19CAR細胞(每孔1x10
5個細胞)存在或不存在下用同種異體成熟樹突狀細胞(DC)(每孔5x10
4個細胞)及可溶性抗CD3 mAb刺激，有反應細胞:受抑制細胞的比率為1:1。培養4天之後，藉由eFluor®670稀釋、使用流式細胞術測定有反應之CD8
+增殖T細胞的百分比。對於流式細胞術而言，對細胞中的CD3
+∆NGFR
-T細胞設門。
如圖12中所示，在TF2收集之源於3個不同健康供體26.1、26.2及26.3的CD4
IL - 10 抗 CD19 CAR細胞將同種異體CD4
+T細胞的增殖分別抑制78%、48%及74%。其亦將同種異體CD8
+T細胞的增殖分別抑制77%、41%及42% (圖13)。由相同3個供體(亦即，26.1、26.2及26.3)產生之CD4
IL - 10細胞獲得類似結果，其將同種異體CD4
+T細胞的增殖分別抑制83%、81%及61%且將CD8
+T細胞的增殖分別抑制77%、41%及68% (圖12及圖13)。最後，CD4
IL - 10 抗 CD19 CAR細胞及CD4
IL - 10細胞當在TF3收集時亦有效抑制同種異體T細胞增殖。詳言之，CD4
IL - 10 抗 CD19 CAR細胞，如CD4
IL - 10細胞，將PBMC的增殖分別抑制69%及60% (圖14)。
總之，此等結果顯示，CD4
IL - 10 / CAR細胞對同種異體CD4
+T細胞與同種異體CD8
+T細胞均具有免疫抑制作用，且該等免疫抑制作用類似於CD4
IL - 10細胞的免疫抑制作用；CAR的共表現不消除或不改變CD4
IL - 10細胞的免疫抑制作用。結果亦顯示，在延長的培養期(亦即，TF3之後分離出的CD4
IL - 10 抗 CD19 CART細胞)之後，免疫抑制功能穩定。
6.9.5. 實例4：使用CD4
IL - 10 抗 CD19 CAR細胞治療或預防GvHD及癌症
CD4
IL - 10 抗 CD19 CAR 細胞在活體內的作用 .
測試CD4
IL - 10 抗 CD19 CAR細胞群在人源化異種GvHD疾病及腫瘤移植體NSG小鼠模型中對CD19
+腫瘤生長、GvL效應及GvHD誘導的影響。
根據體重對NSG小鼠進行175-200 Gr亞致死量的輻射。第0天，向NSG小鼠注射：(i) NALM6-螢光素酶(1x10
5/小鼠)；(ii) NALM6-螢光素酶(1x10
5/小鼠) + PBMC (2.5x10
6/小鼠)；(iii) NALM6-螢光素酶(1x10
5/小鼠) + CD4
IL - 10 抗 CD19 CAR細胞(2.5x10
6/小鼠)；或(iv) NALM6-螢光素酶(1x10
5/小鼠) + PBMC (2.5x10
6/小鼠) + CD4
IL - 10 抗 CD19 CAR細胞(2.5x10
6/小鼠)(參見圖15)。
根據標準生物發光量測結果來確定對白血病細胞生長的影響(參見圖16A至圖16B)。另外，藉由在PBMC及/或CD4
IL - 10 抗 CD19 CAR細胞投與之後的第0、9、12及15天量測體重來監測小鼠是否出現GvHD (參見圖17)。
如圖16A至圖16B中所示，儘管PBMC抑制NALM6細胞生長(圖16A至圖16B)，但根據同種異體HSCT在人類患者中的移植物抗白血病效應模型，其在小鼠中誘導異種GvHD (圖17)，類似於人類同種異體HSCT療法中所見的GvHD。相比之下，CD4
IL - 10 抗 CD19 CAR細胞抑制NALM6細胞生長(圖16A至圖16B)且不引起異種GvHD的任何徵象(圖17)，如根據體重損失所測定。用PBMC + CD4
IL - 10 / CART細胞處理具有最大的抗白血病作用(圖16A至圖16B)及最大的抗腫瘤作用(圖17)。
此等資料表明，CD4
IL - 10 抗 CD19 CART細胞具有很強的細胞毒性且在活體內選擇性地殺滅CD19
+目標細胞。另外，其不干擾PBMC的保護性GvL作用；實際上，其協同發揮作用。與PBMC相比，用單獨的CD4
IL - 10 抗 CD19 CART細胞處理或聯合PBMC處理不誘導異種GvHD。
6.9.6. 實例5：CD4
IL - 10 抗 CD19 CAR細胞的活體內抑制活性有效地預防重度異種GvHD
使用圖18A中所述的另一研究評估單供體或多供體CD4
IL - 10 抗 CD19 CAR細胞是否誘導GvHD及其是否預防PBMC所誘導的GvHD。詳言之，對人源化NSG小鼠進行亞致死量的輻射且藉由同種異體PBMC誘導GvHD。根據圖18A處理小鼠。第3天，小鼠靜脈內給與：i) PBMC (2.5E6個細胞/小鼠)；ii)單供體(BC26.3) CD4
IL - 10 抗 CD19 CAR細胞(2.5E6個細胞/小鼠)；iii)多供體(BC-26.1、BC26.2及BC26.3) CD4
IL - 10 抗 CD19 CAR細胞(2.5E6個細胞/小鼠)；iv) PBMC (2.5E6個細胞/小鼠)及單供體(BC26.3) CD4
IL - 10 抗 CD19 CAR細胞(2.5E6個細胞/小鼠)；或v) PBMC (2.5E6個細胞/小鼠)及多供體(BC-26.1、BC26.2及BC26.3) CD4
IL - 10 抗 CD19 CAR細胞(2.5e6個細胞/小鼠)(參見圖18A)。使用體重損失、毛皮外觀、皮膚外觀、背部弓起及活動性之綜合評分來確定GvHD (Bondanza等人, 2006)。組合分數≥6及/或體重損失≥20%的小鼠出於人道原因而安樂死。PBMC供體與用於產生單供體CD4
IL - 10 抗 CD19CAR及多供體CD4
IL - 10 抗 CD19 CAR的供體不相關。
如圖18B及圖18C中所示，截至第16天，2.5E6個PBMC細胞的注射誘導爆發性及快速致死性異種GvHD，而接受2.5E6個單供體CD4
IL - 10 抗 CD19 CAR細胞(圖18B)或2.5E6個多供體CD4
IL - 10 抗 CD19 CAR細胞(圖18C)的小鼠未出現異種GvHD的任何徵象。另外，當小鼠接受2.5E6個PBMC與2.5E6個單供體CD4
IL - 10 抗 CD19 CAR細胞(圖18B)或2.5E6個PBMC與2.5E6個多供體CD4
IL - 10 抗 CD19 CAR細胞(圖18C)時，PBMC與單供體CD4
IL - 10 抗 CD19 CAR細胞或多供體CD4
IL - 10 抗 CD19 CAR的共投與保護小鼠以防PBMC誘導的異種GvHD。
此等結果表明，單供體CD4
IL - 10 抗 CD19 CAR細胞及多供體CD4
IL - 10 抗 CD19 CAR在活體內不誘導異種GvHD。另外，單供體CD4
IL - 10 抗 CD19 CAR細胞及多供體CD4
IL - 10 抗 CD19 CAR有效地預防PBMC所誘導的重度異種GvHD，證明其在活體內具有抑制活性。
其他實驗
監測治療組小鼠額外的時段，以測定CD4
IL - 10 / CAR細胞對長期存活率的影響。
投與之後，亦監測周邊血液及組織中之CD4
IL - 10 / CAR細胞的量及定位。具體而言，監測周邊血液及發炎部位：淋巴結、脾臟、腸道及骨髓中之CD4
IL - 10 / CAR細胞的存在。監測治療組小鼠額外3週以測定長期存活率。
結果證明異種GvHD的減輕及預防持久存在。
6.9.7. 實例6：使用CD4
IL - 10 / CAR細胞治療慢性發炎及自體免疫疾病
NLPR3發炎體的活化已牽涉到多種慢性發炎及自體免疫疾病。NLPR3發炎體可藉由「危險信號」活化，引起凋亡蛋白酶1介導單核球/巨噬細胞產生促炎性細胞介素IL-1β及IL-18。執行一系列活體外實驗以研究CD4
IL - 10 / 抗 CD19 CAR細胞對NLPR3發炎體及人類單核球產生IL-1β/IL-18的影響。
首先，在Ficoll/Paque (Sigma-Aldrich)上藉由標準密度離心自周邊血液中分離出人類PBMC。使用單核球分離套組II (Miltenyi)，根據製造商說明書，藉由負向選擇自人類PBMC中分離出單核球。由於正向選擇或黏附可引起細胞發生非所需的活化，因此負向選擇較佳。在來自CD4
IL - 10 / 抗 CD19 CAR細胞/200 µl/孔之上清液的各種稀釋液存在下，將分離出的單核球於含有3%無毒素人類AB血清之培養基中以5x10
4個細胞/200 µl接種於96孔微量滴定盤中。
表1概述應用於不同組單核球的處理條件，各組包括6個孔的細胞。藉由LPS與NLPR3發炎體活化劑尼日利亞菌素的組合來活化單核球。如所指示添加凋亡蛋白酶1抑制劑Z-YVADfmk及特異性NLPR3抑制劑MC950作為對照。
* Z-YVADfmk為對凋亡蛋白酶1具有特異性的抑制劑。使用溶解於DMSO中的20 µM Z-YVADfmk (Biovision, Enzo Life Sciences或Axxora Life Sciences)。
** 在LPS培育的最後30分鐘期間，添加100 ng/mL LPS (Sigma-Aldrich) + 10 µM尼日利亞菌素(Nig, Invivogen)，10 µM MCC950 (Invivogen)。
*** 藉由將1X10
6/mL的CD4
IL - 10或CD4 GFP細胞培育3天且收集上清液來獲得CD4
IL - 10及CD4 GFP或NGFR培養物的上清液。藉由IL-10特異性ELISA量測IL-10產生量。30 µg/mL抗IL-10R抗體(Biolegend)。
| 表 1 | ||||||
| 組 # | 單核球 | CD4 細胞 / 上清液 | YVADfmk* | LPS ** + 尼日利亞菌素 | 其他 | |
| 培養基對照培育時間：1小時；隨後藉由LPS活化4小時 | ||||||
| 1 | 單核球 | 否 | 否 | 否 | ||
| 2 | 單核球 | 否 | 否 | LPS + Nig | ||
| 3 | 單核球 | 否 | Z-YVADfmk | LPS + Nig | ||
| 4 | 單核球 | 否 | MCC950 | LPS + Nig | ||
| 在獲自單供體或多供體 CD4 IL - 10 / CAR 細胞培養物或獲自 CD4 GFP 細胞培養物之 上清液 *** 存在下培養單核球 | ||||||
| 5 | 單核球 | 單供體CD4 IL - 10 / CAR細胞的50%上清液 | 否 | LPS + Nig | ||
| 6 | 單核球 | 單供體CD4 IL - 10 / CAR細胞的25%上清液 | 否 | LPS + Nig | ||
| 7 | 單核球 | 單供體CD4 IL - 10 / CAR細胞的12.5%上清液 | 否 | LPS + Nig | ||
| 8 | 單核球 | 單供體CD4 IL - 10 / CAR細胞的50%上清液 | 否 | LPS + Nig | 抗IL-10受體抗體 | |
| 9 | 單核球 | 多供體CD4 IL - 10 / CAR細胞的50%上清液 | 否 | LPS + Nig | ||
| 10 | 單核球 | 多供體CD4 IL - 10 / CAR細胞的25%上清液 | 否 | LPS + Nig | ||
| 11 | 單核球 | 多供體CD4 IL - 10 / CAR細胞的12.5%上清液 | 否 | LPS + Nig | ||
| 12 | 單核球 | 多供體CD4 IL - 10 / CAR細胞的50%上清液 | 否 | LPS + Nig | 抗IL-10受體抗體 | |
| 13 | 單核球 | CD4 GFP細胞的50%上清液 | 否 | LPS + Nig |
如表1概述處理之後，收集各組6個孔的上清液且藉由特異性針對成熟IL-1β或IL-18的ELISA (Biolegend)量測IL-1β/IL-18產生。藉由西方墨點法分析自所選群組收集的細胞，以測定活化凋亡蛋白酶1含量.
實驗資料顯示，自體單供體、同種異體單供體及同種異體多供體CD4
IL - 10 / 抗 CD19 CAR細胞下調活化單核球的IL-1β及IL-18產生。其進一步顯示，自體單供體、同種異體單供體及同種異體多供體CD4
IL - 10 / 抗 CD19 CAR細胞下調活化單核球的成熟凋亡蛋白酶-1產生。另外，多供體CD4
IL - 10所產生的自體單供體、同種異體單供體及同種異體多供體CD4
IL - 10 / 抗 CD19 CAR及IL-10下調發炎體。
使用人類巨噬細胞或樹突狀細胞而非單核球執行類似實驗。實驗結果證明，CD4
IL - 10 / 抗 CD19 CAR細胞進一步下調活化巨噬細胞及樹突狀細胞的IL-1β、IL-18及成熟凋亡蛋白酶-1產生。
此等資料表明，自體單供體、同種異體單供體及同種異體多供體CD4
IL - 10 / 抗 CD19 CAR細胞可用於治療涉及NLPR3發炎體過度活化的疾病或病症。特定言之，自體單供體、同種異體單供體及同種異體多供體CD4
IL - 10 / 抗 CD19 CAR細胞可用於治療慢性發炎及自體免疫疾病。NLPR3發炎體可藉由外源或內源「危險信號」活化，諸如病原體相關分子模式(PAMP)、二氧化矽、石棉、危險相關分子模式(DAMP)，如來自受損粒線體、壞死及應激細胞的產物及尿酸晶體。
6.9.8. 實例 7 ： 產生多供體 CD4
IL - 10 細胞 載體產生
藉由用含有人類IL-10與截斷形式之NGFR (ΔNGFR)之編碼序列的慢病毒載體轉導(圖3)來產生多供體CD4
IL - 10細胞，如WO2016/146542中所述，該文獻以全文引用的方式併入本文中。載體序列以SEQ ID NO: 5形式提供。簡而言之，藉由將來自pH15C (ATCC 68192)之549 bp片段的人類IL-10編碼序列接入質體#1074.1071.hPGK.GFP.WPRE.mhCMV.dNGFR.SV40PA來產生慢病毒載體。雙向啟動子(方向相反的人類PGK啟動子外加CMV啟動子的最小核心元件)的存在允許兩種轉殖基因共表現。質體進一步含有抗生素抗性基因(例如胺苄青黴素(ampicillin)或康黴素(kanamycin))之編碼序列。
藉由Ca
3PO
4將四個質體短暫共轉染至293T細胞中來產生慢病毒載體且藉由超速離心濃縮：將1 μM丁酸鈉添加至培養物中用於收集載體。藉由限制稀釋法估算對293T細胞的效價，且藉由HIV-1 Gag p24抗原免疫捕捉(NEN Life Science Products; Waltham, MA)量測載體顆粒。載體感染力依照效價與顆粒之間的比率計算。濃縮載體的效價範圍為5x10
8至6x10
9個轉導單位/mL，且感染力範圍為5xl0
4至5x10
5個轉導單位/ng。
產生 CD4
IL - 10 細胞
圖19為CD4
IL - 10細胞的生產製程示意圖。純化來自健康供體之CD4
+T細胞。用編碼人類IL-10及截斷形式之人類NGF受體的雙向慢病毒載體(LV-IL-10/ΔNGFR)以感染倍率(MOI) 20轉導之前，用可溶性抗CD3、可溶性抗CD28 mAb及rhIL-2 (50 U/mL)活化人類CD4
+T細胞48小時。
11天之後，藉由FACS分析經轉導細胞中之ΔNGFR表現，且藉由微滴式數位PCR (ddPCR)定量載體複本數(VCN)。
來自10位不同供體之CD4
+T細胞的平均轉導效率為45±17%，VCN為2.7±0.6%。圖20A顯示經LV-IL-10/ΔNGFR (雙向慢病毒載體，其編碼人類IL-10及截斷形式的人類NGF受體)轉導之人類CD4
+T細胞中的CD4
+ΔNGFR
+細胞百分比(平均值±SD，n=10，左條柱)及載體複本數(VCN，平均值±SD，n=10，右條柱)。藉由微滴式數位PCR (ddPCR)定量CD4
IL - 10細胞中的CD4
+ΔNGFR
+細胞頻率及載體複本數。
Δ使用抗CD271 mAb塗覆的微珠純化NGFR
+T細胞且得到純度＞95%的CD4
IL - 10細胞群。純化之後，細胞用CD4及ΔNGFR的標記物染色且藉由FACS分析。資料顯示純化步驟得到的純度逾98%。圖20B顯示所測試之10個供體中之兩個代表性供體(供體B及供體C)的FACS資料。純化的CD4
IL - 10細胞以14天間隔再刺激3次且在第二輪(TF2)及/或第三輪再刺激(TF3)之後測試其活體外及活體內功能。
休眠的CD4
IL - 10細胞組成性產生IL-10。活化後，IL-10產生量大大增加。
CD4
IL - 10 細胞具有類似於天然來源之 Tr1 細胞的細胞介素產生概況。
第二輪(TF2)及第三輪(TF3)再刺激之後，分析單供體CD4
IL - 10細胞的細胞介素產生概況且結果提供於圖21中。具體而言，如先前(Andolfi等人, Mol Ther. 2012;20(9):1778-1790及Locafaro等人, Mol Ther. 2017;25(10):2254-2269)所述，再刺激CD4
IL - 10細胞(2x10
5個細胞/200 µl)。第14天，在第2輪(TF2)及第3輪(TF3)再刺激之後，CD4
IL - 10細胞不加以刺激(橙色條柱)或用固著的抗CD3及可溶性抗CD28 mAb (灰色條柱)刺激48小時。收集培養上清液且藉由ELISA測定IL-10、IL-4、IL-5、IFN-γ及IL-22含量。所有樣品三重複測試。展示所測試之n=8個供體的平均值±SD。圖20中所提供的結果顯示，經固著之抗CD3及可溶性抗CD28 mAb刺激的CD4
IL - 10細胞顯示Tr1細胞的細胞介素產生概況。
儘管觀測到不同供體之間的巨大差異，但第二輪(TF2)或第三輪(TF3)再刺激之後的總體細胞介素產生概況類似且反映Tr1細胞的細胞介素產生概況(Roncarolo等人, Immunity, 2018)。如Tr1細胞，CD4
IL - 10細胞產生高含量的IL-10、IL-5、IFN-γ及IL-22，但產生低含量的IL-4及含量不可偵測的IL-2。
CD4
IL - 10 細胞高量表現顆粒酶 B 且選擇性地殺滅骨髓性白血病細胞
第2輪(TF2)再刺激之後，進一步分析CD4
IL - 10細胞對顆粒酶B (GzB)的表現。圖22A中的資料顯示，大部分CD4
IL - 10細胞表現GzB。源於7個不同供體之所有CD4
IL - 10細胞超過95%高量表現顆粒酶B。
進一步分析來自第2輪(TF2)再刺激之CD4
IL - 10細胞針對骨髓性白血病細胞(ALL-CM)及紅血球系白血病細胞株(K562)的細胞毒性作用。將CD4
IL - 10細胞(每孔10
5個)與K562及ALL-CM細胞(每孔10
5個)以1:1比率共培養3天。藉由FACS對殘餘白血病細胞株(CD45
低CD33
+)中的各目標細胞進行計數。
CD4
IL - 10細胞選擇性地殺滅骨髓性白血病細胞(ALL-CM)，如圖22B中所示。被殺滅的ALL-CM細胞%在62%與100%之間變化，而對紅血球系白血病細胞株K562 (對非特異性細胞毒性活性具有高度敏感性)的殺滅在0與27%之間變化(測試4個不同供體)。總之，此等資料證實CD4
IL - 10細胞表現顆粒酶B且有效殺滅骨髓性白血病細胞。正如所料，觀測到源於個別供體之CD4
IL - 10細胞在殺滅能力上存在一些差異。
CD4
IL - 10 細胞抑制同種異體 CD4 + T 細胞與 CD8 + T 細胞的 增殖反應
亦分析CD4
IL - 10細胞對同種異體CD4
+T細胞或CD8
+T細胞的作用。具體而言，同種異體PBMC細胞用eFluor® 670 (每孔10
5個細胞)標記且在CD4
IL - 10細胞(每孔10
5個細胞)不存在或存在下用同種異體成熟樹突狀細胞(DC)(每孔5x10
4個細胞)及可溶性抗CD3 mAb刺激，有反應細胞:受抑制細胞的比率為1:1。培養4天之後，在對CD4
+ΔNGFR
-T細胞或CD8
+ΔNGFR
-T細胞設門之後，藉由eFluor® 670稀釋、使用流式細胞術測定有反應之增殖細胞的百分比。圖23A及圖23B以增殖及抑制百分比顯示來自未彙集之六個不同供體(圖23A中的供體-C、供體-E及供體-F以及圖23B中的供體-H、供體-I及供體-L)之CD4
IL - 10細胞對CD4
+T細胞的作用。圖24A及圖24B顯示未彙集之六個不同供體(圖24A中之供體-C、供體-E及供體-F以及圖24B中之供體-H、供體-I及供體-L)之CD4
IL - 10細胞對CD8
+T細胞的作用。
結果證明，來自所測試之未彙集之6個不同供體的CD4
IL - 10細胞分別下調同種異體CD4
+T細胞與CD8
+T細胞的增殖反應。對CD4
+T細胞的抑制作用在51%與96%之間變化，而對CD8
+T細胞的抑制作用在62%與73%之間變化。
多供體 CD4
IL - 10 細胞的產生及表徵
如上文及圖19所述，使用來自多供體的CD4
+細胞產生CD4
IL - 10細胞。藉由第二輪(TF2)及第三輪(TF3)再刺激來刺激各供體的CD4
IL - 10細胞。第三輪刺激之後，以1:1:1比率彙集來自三個供體的CD4
IL - 10細胞且用固著的抗CD3及可溶性抗CD28 mAb刺激48小時。
多供體 CD4
IL - 10 細胞的細胞介素產生概況類似於個別供體之 CD4
Il - 10 細胞及 Tr1 細胞的細胞介素產生概況。
收集培養上清液且藉由ELISA測定IL-10、IL-4、IL-5、IFN-γ及IL-22含量。圖25中所提供的結果顯示，自3個不同同種異體供體彙集之多供體CD4
IL - 10細胞(1:1:1彙集)的細胞介素產生(紅點)類似於源於個別供體(n=8)之CD4
IL - 10細胞中的CD4
IL - 10細胞(灰色條柱)。多供體CD4
IL - 10細胞產生高含量的IL-10、IL-5、IFN-γ及IL-22以及低含量的IL-4及含量不可偵測的IL-2 (未圖示)。此等資料表明，彙集CD4
IL - 10細胞係可行的，且此等多供體CD4
IL - 10細胞維持單供體源CD4
IL - 10細胞及Tr1細胞的細胞介素產生標誌。重要的是，所彙集的同種異體細胞群含有＞95%活細胞，表明其不會將彼此殺滅。
多供體 CD4
IL - 10 細胞高量表現顆粒酶 B 且選擇性地殺滅骨髓性白血病細胞。
第3輪(TF3)再刺激之後，進一步分析多供體CD4
IL - 10細胞對顆粒酶B (GzB)的表現。圖26A中的資料顯示，大部分多供體CD4
IL - 10細胞表現GzB。類似於單供體源CD4
IL - 10細胞對GzB的表現，多供體CD4
IL - 10細胞逾95%表現顆粒酶B。
進一步分析來自第3輪(TF3)再刺激的CD4
IL - 10細胞對骨髓性白血病細胞(ALL-CM細胞株)或K562的細胞毒性作用。將多供體CD4
IL - 10細胞(每孔10
5個)與K562及ALL-CM細胞(每孔10
5個)以1:1比率共培養3天。藉由FACS對殘餘白血病細胞株(CD45
低CD33
+)中的各目標細胞進行計數。圖26B中提供的結果顯示對K562細胞存在某種程度的細胞毒性，該等K562細胞對非特異性細胞毒性及NK細胞的細胞毒性高度敏感。然而，對骨髓性白血病細胞(ALL-CM)達成的選擇性程度類似於單供體源CD4
IL - 10細胞。
多供體 CD4
IL - 10 細胞抑制同種異體 CD4 + T 細胞與 CD8 + T 細胞的 增殖反應。
亦分析多供體CD4
IL - 10細胞對同種異體CD4
+T細胞或CD8
+T細胞的作用。具體而言，同種異體PBMC細胞用eFluor® 670 (每孔10
5個細胞)標記且在多供體CD4
IL - 10細胞(每孔10
5個細胞)不存在或存在下用同種異體成熟樹突狀細胞(DC)(每孔5x10
4個細胞)及可溶性抗CD3 mAb刺激，有反應細胞:受抑制細胞的比率為1:1。培養4天之後，在對CD4
+ΔNGFR
-T細胞及CD8
+ΔNGFR
-T細胞設門之後，藉由eFluor® 670稀釋、使用流式細胞術測定有反應之增殖細胞的百分比。圖27A顯示含有來自供體-C、供體-E及供體-F之CD4
IL - 10細胞之多供體CD4
IL - 10細胞的結果。圖27B顯示來自多供體CD4
IL - 10細胞的結果，該等多供體細胞含有來自供體-H、供體-I及供體-L的CD4
IL - 10細胞，該等細胞已冷凍、儲存且解凍後進行測試。
圖27A顯示多供體CD4
IL - 10細胞(來自3個不同供體)將CD4
+及CD8
+T細胞反應分別抑制96%及74%。第二批不同多供體CD4
IL - 10細胞在已冷凍、儲存及測試之前的解凍之後，經測試獲得類似結果(圖27B)。對CD4
+及CD8
+T細胞增殖的抑制分別為68%及75%。此等資料表明多供體CD4
IL - 10細胞可在無功能喪失的情況下冷凍及儲存。
總體而言，用多供體CD4
IL10細胞獲得的資料表明可彙集此等細胞製劑而無任何問題。其含有＞95%活細胞且維持單供體CD4
IL - 10細胞的所有相關功能(細胞介素產生、細胞毒性能力，及同種異體T細胞反應之抑制)。使用較大的多供體CD4
IL - 10細胞池應減少源於不同個別供體之CD4
IL - 10細胞批次之間所觀測到的天然差異，且應向人類療法提供大量的現成CD4
IL - 10細胞。
多供體CD4
IL - 10細胞產物具有產物更均質的顯著優勢，從而允許確定界限分明、批次間變化小、有效力的測試完成準則。另外，其能夠開發大規模的細胞連續生產製程。
用於產生多供體 CD4
IL - 10 細胞的其他方法
慢病毒轉導之前，彙集來自最少3至5個不同供體的白血球層。使用抗CD4抗體、藉由正向選擇而自白血球層中分離出CD4
+細胞。藉由FACS檢查所彙集之CD4
+細胞的純度。或者，自最少3至5個正常健康供體獲得冷凍的人類CD4
+細胞。冷凍的人類CD4
+細胞在使用之前解凍。來自白血球層或冷凍儲備液的CD4
+細胞在IL-2存在下藉由CD3與CD28抗體的組合或經CD3抗體及CD28抗體塗覆之珠粒活化24至48小時。在一些情況下，來自白血球層或冷凍儲備液的CD4
+細胞用可溶性抗CD3、可溶性抗CD28 mAb及rhIL-2 (50 U/mL)活化48小時且如上文所述用編碼人類IL-10之雙向慢病毒載體轉導以便產生CD4
IL - 10細胞。
在一些情況下，首先測定T細胞供體(或自供體分離出的CD4
+細胞)的HLA單倍型且選擇性地彙集及使用具有所需HLA單倍型的CD4
+細胞。
藉由用含有上述人類IL-10及ΔNGFR編碼序列的慢病毒載體轉導上述活化CD4
+細胞來產生多供體CD4
IL - 10細胞。
第7天至第11天(轉導之後的5天至9天)，收集細胞且使用抗NGFR抗體純化成功轉導的T細胞。此過程通常產生95%純度的多供體CD4
IL - 10細胞群。
對純化的多供體CD4
IL - 10細胞進行計數且在IL-2存在下、視情況在餵養細胞存在下、用CD3抗體與CD28抗體的混合物、經CD3抗體及CD28抗體塗覆之珠粒再刺激另外8至10天。在一些情況下，在餵養細胞存在下再刺激經純化的多供體CD4
IL - 10細胞。
培養總共14至18天時段之後，收集CD4
IL - 10細胞，計數且測試其自發地或在CD3與CD28抗體或經CD3及CD28抗體塗覆之珠粒活化之後產生IL-10的能力。另外，量測GrzB及穿孔素含量。亦測試其抑制人類T細胞(PBMC)的能力及純化CD4
+及CD8
+T細胞的增殖。
另外，組成性地量測以及在活化200,000個CD4
IL - 10細胞/200微升體積之後量測IL-22的產生，該活化如先前所述係使用CD3與CD28抗體之組合進行以便產生其他細胞介素，諸如IFNγ、IL-10、IL-4及IL-5。所彙集的CD4
IL - 10細胞在儲存之前冷凍。
6.9.9. 實例 8 ： 使用多供體 CD4
IL - 10 細胞治療或預防 GvHD 多供體 CD4
IL - 10 細胞在活體內的作用 .
測試多供體CD4
IL - 10細胞群在人源化異種GvHD疾病模型、NSG小鼠模型中對人類PBMC所誘導之異種GvHD的影響，如圖28中所繪示。對NSG小鼠進行亞致死量的輻射且靜脈內注射人類PBMC (5x10
6個細胞/小鼠)、多供體(三個供體) CD4
IL - 10細胞(5x10
6個細胞/小鼠)，或人類PBMC (5x10
6個細胞/小鼠)與多供體CD4
IL - 10細胞(BC-C/E/F)之組合(5x10
6個細胞/小鼠)。如先前(Bondanza等人, Blood 2006)所述，基於體重損失(＞20%體重損失)、皮膚病變、皮毛狀況、活動性及背部弓起來評價異種GvHD。
圖29顯示注射後每一天展現GvHD之NSG小鼠%。將5×10
6個人類PBMC投與經輻射的NSG小鼠出乎意料地引起異常爆發性GvHD。所有小鼠皆在第10天死亡，反映異種GvHD極具致死性。5x10
6個多供體CD4
IL - 10細胞共投與使此爆發性GvHD延遲，但小鼠在第14天處死，原因在於其夠到體重損失20%的預定人道處死準則(圖29)。然而，此等結果表明多供體CD4
IL - 10可延遲極其嚴重的異種GvHD。重要的是，以與PBMC (5x10
6個細胞)相同劑量單獨投與的多供體CD4
IL - 10細胞未能誘導異種GvHD的任何徵象。
亦測試注射後14天之NSG小鼠之脾臟(圖30，左圖)及骨髓(圖30，右圖)中之人類CD4
IL - 10細胞的存在，該等NSG小鼠注射有人類PBMC (5x10
6個細胞/小鼠)、多供體(三個供體；BC-C/E/F) CD4
IL - 10細胞(5x10
6個細胞/小鼠)，或人類PBMC (5x10
6個細胞/小鼠)與多供體CD4
IL - 10細胞(三個供體；BC-C/E/F)(5x10
6個細胞/小鼠)的組合。圖30提供的結果顯示多供體CD4
IL - 10細胞遷移至脾臟及骨髓。在輸注細胞之後的14天發現此等細胞存在的百分比較低。此等結果表明，多供體CD4
IL - 10細胞延遲人類PBMC誘導的爆發性異種GvHD，且其自身不誘導任何異種GvHD。
多供體 CD4
IL - 10 細胞抑制經純化之 CD4 + 細胞所致的重度異種 GvHD 。
在人源化異種GvHD模型中測試多供體CD4
IL - 10細胞，在該模型中，藉由投與2.5×10
6個純化人類CD4+ T細胞來誘導GvHD疾病，如圖31中所繪示。第0天對NSG小鼠進行亞致死量的輻射且第3天靜脈內注射單獨或與以下組合的人類CD4
+T細胞(2.5x10
6個細胞/小鼠)：多供體CD4
IL - 10細胞(三個不同供體；BC-H/I/L)(2.5x10
6個細胞/小鼠)，或來自細胞池之單供體(BC-H) CD4
IL - 10細胞(2.5x10
6個細胞/小鼠)。如先前(Bondanza等人, Blood 2006)所述，基於體重損失(＞20%體重損失)、皮膚病變、皮毛狀況、活動性及背部弓起來評價異種GvHD。
圖32顯示注射後每一天展現GvHD之NSG小鼠%。結果顯示，多供體CD4
IL - 10(BC-H/I/L)細胞可抑制人類同種異體CD4
+T細胞介導的異種GvHD。在此實驗中，由於對照組中接受CD4+ T細胞的所有小鼠在第20天死亡，因此異種GvHD極其嚴重。相比之下，2.5 x 10
6個多供體CD4
IL - 10的共投與將GvHD抑制75%。單供體CD4
IL - 10細胞亦具防護性，但作用不是太強。
其他實驗
測試多供體CD4
IL - 10細胞在四組不同小鼠中的治療效果：(i)接受與CD4
IL - 10細胞不相關之供體之人類PBMC的小鼠(異種GvHD陽性對照組)；(ii)接受多供體CD4
IL - 10細胞的小鼠(陰性對照組)；(iii)以1:1比率接受PBMC與多供體CD4
IL - 10細胞之組合的小鼠；及(iv)以2:1比率或以不同比率接受PBMC與多供體CD4
IL - 10細胞之組合的小鼠。在接受PBMC與多供體CD4
IL - 10細胞之組合的動物中，一些動物同時接受PBMC及多供體CD4
IL - 10細胞，一些動物在接受PBMC之後的若干天(例如5天)接受多供體CD4
IL - 10細胞，且一些動物在接受PBMC之前的若干天(例如5天)接受多供體CD4
IL - 10細胞。
在PBMC及/或多供體CD4
IL - 10細胞投與之後，藉由在第1、2、3、4週及必要時第5週量測體重來監測小鼠是否產生GvHD。除體重損失之外，亦檢查小鼠的皮膚病變、皮毛狀況及活動性。監測治療組小鼠額外的時段，以測定多供體CD4
IL - 10細胞對長期存活率的影響。
投與之後，亦監測周邊血液及組織中之多供體CD4
IL - 10細胞的量及定位。具體而言，監測周邊血液及發炎部位：淋巴結、脾臟、腸道及骨髓中之多供體CD4
IL - 10細胞的存在。監測治療組小鼠額外3週以測定長期存活率。
結果證明，多供體CD4
IL - 10細胞有效減輕及預防異種GvHD。
6.9.10. 實例 9 ： 抑制 GvHD 及治療癌症
測試多供體CD4
IL - 10細胞群在移植有人類PBMC及AML腫瘤細胞之NSG小鼠模型中對人類PBMC所誘導之異種GvHD的影響及抗腫瘤作用。如先前在WO 2016/146542中所述，靜脈內投與AML細胞(ALL-CM)。3天後投與PBMC或多供體CD4
IL - 10細胞或其組合。
如實例1中所述獲得多供體CD4
IL - 10細胞。測試多供體CD4
IL - 10細胞在四組不同小鼠中的治療效果，該等小鼠各自已在第0天接受輻射及5x10
6個ALL-CM細胞(AML小鼠)：(i)不另經處理的AML小鼠；(ii)接受與多供體CD4
IL - 10細胞不相關之供體之5x10
6個人類PBMC (該等PBMC引起重度異種GvHD)的AML小鼠；(iii)接受2.5x10
6個多供體CD4
IL - 10細胞的AML小鼠；及(iv)以1:1或2:1比率或以不同比率接受PBMC與多供體CD4
IL - 10細胞之組合的AML小鼠。另一組小鼠不接受ALL-CML細胞，但在輻射之後的第3天接受5x10
6個人類PBMC。
基於體重損失、皮膚病變、皮毛狀況、活動性、死亡率及長期存活率，測試多供體CD4
IL - 10細胞對人類PBMC所誘導之異種GvHD的影響。基於循環中之腫瘤細胞的減少及長期無腫瘤存活率，測試多供體CD4
IL - 10細胞的抗腫瘤作用或移植物抗白血病(GvL)作用。
監測一些小鼠長達7週以便監測長期存活率及完全的腫瘤緩解。
結果證明，多供體CD4
IL - 10細胞在抑制異種GvHD與治療癌症方面均有效。
6.9.11. 實例 10 ： 使用多供體 CD4
IL - 10 細胞治療癌症
在NSG小鼠中，在使用T細胞療法的ALL-CM白血病模型中測試多供體CD4
IL - 10細胞群。
第0天對NSG小鼠進行亞致死量的輻射且靜脈內注射骨髓性白血病細胞(ALL-CM)(5x10
6)。第一組動物在第3天注射PBMC (5x10
6)或單供體(供體BC-I及供體BC-H) CD4
IL - 10細胞(2.5x10
6)。第二組動物在第3天注射PBMC (5x10
6)或多供體CD4
IL - 10細胞(2.5x10
6)。基於循環白血病細胞之減少及長期無白血病存活率，測試動物的移植物抗白血病(GvL)作用。如先前所述(Locafaro G.等人, Molecular Therapy 2017)量測白血病。
如圖33A及圖33B所提供，注射ALL-CM骨髓性白血病細胞的所有小鼠在第17天出現大範圍的白血病惡化。投與5x10
6個PBMC使得白血病惡化受到強烈的抑制。有趣的是，較低數目(2.5x10
6)個單供體CD4
IL10(圖33A)或多供體CD4
IL10(圖33B)在抑制白血病惡化方面達到類似的程度。此等資料表明單供體及多供體CD4
IL10具有很強的直接抗骨髓性白血病作用。
進一步測試單供體CD4
IL10及多供體CD4
IL10與PBMC之組合在注射有ALL-CM骨髓性白血病細胞之小鼠中的移植物抗白血病(GvL)作用。投與5x10
6個PBMC對白血病惡化產生強烈的抑制且5x10
6個PBMC與單供體CD4
IL10(2.5x10
6)組合投與具有協同作用(圖34A)。有趣的是，5x10
6個PBMC與2.5x10
6個多供體CD4
IL10組合投與具有類似的協同GvL作用(圖34B)。此等資料表明，多供體CD4
IL10與PBMC協同發揮作用以介導強GvL作用。
6.9.12. 實例 11 ： 使用多供體 CD4
IL - 10 細胞治療慢性發炎性及自體免疫疾病
NLPR3發炎體的活化已牽涉到多種慢性發炎及自體免疫疾病。NLPR3發炎體可藉由「危險信號」活化，引起凋亡蛋白酶1介導單核球/巨噬細胞產生促炎性細胞介素IL-1β及IL-18。執行一系列活體外實驗以研究多供體CD4
IL - 10細胞對人類單核球產生NLPR3發炎體及IL-1β/IL-18的影響。
首先，在Ficoll/Paque (Sigma-Aldrich)上藉由標準密度離心自周邊血液中分離出人類PBMC。使用單核球分離套組II (Miltenyi)，根據製造商說明書，藉由負向選擇自人類PBMC中分離出單核球。由於正向選擇或黏附可引起細胞發生非所需的活化，因此負向選擇較佳。將分離的單核球在含有3%無毒素人類AB血清的培養基中、在2x10
5或1x10
5個多供體CD4
IL - 10細胞/200 µl/孔存在下、以5x10
4個細胞/200 µl接種於96孔微量滴定盤中。
表2概述應用於17組單核球的處理條件，各組包括6個孔的細胞。已知單獨的LPS可在ATP所提供之第二信號不存在的情況下活化人類單核球。
* YVADfmk為對凋亡蛋白酶1具有特異性的抑制劑。使用溶解於DMSO中的20 mM Z-YVADfmk (Biovision, Enzo Life Sciences或Axxora Life Sciences)。
** LPS (Signa-Aldrich) 100 ng/mL
*** 藉由將1X10
6/mL的CD4
IL - 10或CD4 GFP細胞培育3天且收集上清液來獲得CD4
IL - 10及CD4 GFP或NGFR培養物的上清液。藉由IL-10特異性ELISA量測IL-10產生量。
| 表 2 | |||||
| 組 # | 單核球 | CD4 細胞 / 上清液 | YVADfmk* | LPS** | 其他 |
| 培養基對照培育時間：1.5小時；隨後藉由LPS活化4小時 | |||||
| 1 | 單核球 | 否 | 否 | 否 | |
| 2 | 單核球 | 否 | 否 | LPS | |
| 3 | 單核球 | 否 | YVADfmk | LPS | |
| 單核球與多供體 CD4 IL - 10 細胞的共培養 | |||||
| 4 | 單核球 | CD4 IL-10細胞 | 否 | 否 | |
| 5 | 單核球 | CD4 IL-10細胞 | 否 | LPS | |
| 6 | 單核球 | CD4 IL-10細胞 | YVADfmk | LPS | |
| 單核球與對照 CD4 GFP + 細胞的共培養 | |||||
| 7 | 單核球 | CD4 GFP細胞 | 否 | 否 | |
| 8 | 單核球 | CD4 GFP細胞 | 否 | LPS | |
| 9 | 單核球 | CD4 GFP細胞 | YVADfmk | LPS | |
| 在多供體 CD4 IL - 10 細胞或 CD4 GFP + 細胞培養 上清液 *** 存在下培養單核球 | |||||
| 10 | 單核球 | CD4 IL - 10細胞的50%上清液 | 否 | LPS | |
| 11 | 單核球 | CD4 IL - 10細胞的25%上清液 | 否 | LPS | |
| 12 | 單核球 | CD4 IL - 10細胞的12.5%上清液 | 否 | LPS | |
| 13 | 單核球 | CD4 IL - 10細胞的50%上清液 | 否 | LPS | 抗IL-10抗體 |
| 14 | 單核球 | CD4 GFP細胞的50%上清液 | 否 | LPS | |
| 15 | 單核球 | CD4 GFP細胞的25%上清液 | 否 | LPS | |
| 16 | 單核球 | CD4 GFP細胞的12.5%上清液 | 否 | LPS | |
| 17 | 單核球 | CD4 GFP細胞的50%上清液 | 否 | LPS | 抗IL-10抗體 |
如表2概述處理之後，收集各組6個孔的上清液且藉由特異性針對成熟IL-1β或IL-18的ELISA (Biolegend)量測IL-1β/IL-18產生。藉由西方墨點法分析自第3組、第10組、第13組、第14組及第17組之6個孔收集的細胞，以測定活化凋亡蛋白酶1的含量。
實驗資料顯示，多供體CD4
IL - 10細胞下調活化單核球的IL-1β及IL-18產生。其進一步顯示，多供體CD4
IL - 10細胞下調活化單核球的成熟凋亡蛋白酶-1產生。另外，多供體CD4
IL - 10所產生的多供體CD4
IL - 10及IL-10下調發炎體。
使用人類巨噬細胞或樹突狀細胞而非單核球執行類似實驗。實驗結果證明，多供體CD4
IL - 10細胞進一步下調活化巨噬細胞及樹突狀細胞的IL-1β、IL-18及成熟凋亡蛋白酶-1產生。
此等資料表明，多供體CD4
IL - 10細胞可用於治療涉及NLPR3發炎體過度活化的疾病或病症。特定言之，多供體CD4
IL - 10細胞可用於治療慢性發炎及自體免疫疾病。NLPR3發炎體可藉由外源或內源「危險信號」活化，諸如病原體相關分子模式(PAMP)、二氧化矽、石棉、危險相關分子模式(DAMP)，如來自受損粒線體、壞死及應激細胞的產物及尿酸晶體。
6.9.13. 實例 12 ： 多供體 CD4
IL - 10 細胞上清液抑制 NLPR3 發炎體活化以及人類單核球產生 IL - 1β 及 IL - 18
使用泛單核球分離套組(Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany)自PBMC中分離出CD14
+單核球且以每孔2x10
5/200 µL接種於96孔平坦微量滴定盤中且在LPS存在下培養。進一步在Z-YVADfmk (20 μMol)、MMC950 (10 μMol)、IL-10 (10 ng/mL)或如表1中概述之各種濃度之單供體或彙集供體CD4
IL - 10細胞上清液存在下培養細胞。
上清液係獲自單供體或彙集供體CD4
IL - 10細胞，該等細胞如先前所述經CD3與CD28抗體之組合活化72小時。(Andolfi等人, 2012, Mol. Therapy第20卷, 1778-1790；Locafaro等人, Mol Ther 2017, 25, 2254)。在一些情況下(圖19C及圖19D)，將單核球與LPS與NLPR3發炎體活化劑尼日利亞菌素(「NIG」)的組合一起培育，該組合係在LPS活化的最後30分鐘期間添加。
NLPR3發炎體藉由LPS活化，從而產生成熟凋亡蛋白酶1及具有生物活性形式的IL-1β及IL-18。在培育期期間，在LPS活化不存在下接種的單核球不產生可偵測含量的IL-10 (未圖示)。
以50%、25%及12.5%的濃度分別添加單供體源CD4
IL - 10細胞上清液(含有1769 pg IL-10/mL)以劑量依賴性方式抑制來自供體#1及#2之LPS活化單核球產生IL-1β (圖35A及圖35B)。經GFP轉導之CD4+細胞上清液用作對照。在50%及25%的濃度下觀測到IL-1β產生被完全抑制，而經GFP轉導之對照CD4+細胞上清液在50%濃度下無效。
針對經LPS及尼日利亞菌素(「NIG」)活化之單核球進一步測試各種濃度之CD4
IL - 10T細胞上清液(50%、25%或12.5%)、Z-YVADfmk或MCC950。單供體(BC-E)或彙集供體CD4
IL - 10細胞上清液分別含有5295或3532 pg IL-10/mL。單供體CD4
IL - 10細胞上清液亦極其有效地抑制經LPS誘導、經NLPR3發炎體活化劑尼日利亞菌素增強的IL-1β產生(圖35C及圖35D)。
資料證明濃度為50%的CD4
IL - 10細胞上清液與不可逆凋亡蛋白酶1抑制劑Z-YVADfmk (Guo等人, 2015, Nature Med 21, 677)、選擇性NLPR3發炎體抑制劑MCC950 (Coll等人, 2019, Nature Chem. Biol 15, 556)及重組IL-10同樣有效，表明含IL-10上清液抑制NLPR3發炎體活化及成熟凋亡蛋白酶1產生，從而很強地抑制促炎性細胞介素IL-1β產生(圖35A至圖35D)。
在第二系列實驗中，使用單供體(BC-E)及自2個不同供體(BC-C/E)彙集之CD4
IL - 10細胞的上清液獲得類似結果。藉由CD3與CD28抗體之組合活化CD4
IL - 10細胞，如(Andolfi等人, 2012)所述。3天之後，收集CD4
IL - 10細胞上清液。此等上清液分別含有5295及3532 pg IL-10/mL，且以劑量依賴性方式抑制LPS誘導供體#3之單核球產生IL-1β (圖35E)。濃度為50%的上清液與Z-YVADfmk及MCC950同樣有效。抗IL-10受體抗體完全中和所彙集之CD4
IL - 10細胞之上清液的抑制效應。類似地，自3個不同供體彙集之含有2589 pg IL-10/mL的上清液以劑量依賴性方式抑制供體#4之單核球產生IL-1β (圖35F)。IL-10受體抗體完全地中和上清液的抑制效應，證明NLPR3活化係由IL-10介導。結果表明，多供體CD4
IL - 10T細胞所產生的IL-10強烈抑制促炎性細胞介素IL-1β的產生。正如所料，抗IL-10受體抗體不具有抑制Z-VADfmk及MCC950介導IL-1β產生的作用(圖35E)。
針對LPS及尼日利亞菌素活化之來自供體#4之單核球進一步測試CD4
IL - 10T細胞。使用分別含有2583或2589 pg IL-10/mL的各種濃度之單供體(BC-V)或多供體(三個供體；BC-T/U/V) CD4
IL - 10細胞上清液測試ZYVADfmk或MCC950。圖35G提供的資料顯示，3個不同供體(BC T-U-V)彙集的上清液下調LPS與尼日利亞菌素組合所誘導的IL-18產生。
總體而言，此等資料表明，單供體及多供體CD4
IL - 10細胞產生的IL-10很強地下調NLPR3發炎體，從而很強地抑制促炎性細胞介素IL-1β及IL-18。
6.9.14. 實例13：單供體及多供體CD4
IL - 10細胞在活體內抑制異種GvHD及骨髓腫瘤生長
如Andolfi等人, Mol Ther 2012, 20, 177及Locafaro等人, Mol Ther 2017, 25, 2254中所述，測試單供體(BC-T、BC-V及BC-E)或多供體(BC-V/T/E) CD4
IL - 10細胞的功能特性及品質。單供體與多供體CD4
IL - 10細胞均產生高含量的IL-10、可變含量的IFN-γ、極低含量的IL-4及不可偵測的IL-2 (後者未顯示)，反映Tr1細胞的特徵性細胞介素產生概況(圖37)。
另外，活體外針對同種異體PBMC量測單供體(BC-T、BC-V及BC-E)或多供體(BC-V/T/E) CD4
IL - 10細胞對CD4
+及CD8
+T細胞增殖的抑制能力。PBMC用eFLuor670 (Invitrogen)標記。經標記的PBMC (1x10
5)用固著的CD3 (10 mg/mL)及可溶性CD28抗體(1 mg/mL)活化。在圓底96孔盤中，以0.2 mL的最終體積、以1:1比率添加單供體及多供體CD4
IL - 10細胞。共培養4天之後，如(Locafaro等人, Mol Ther 2017, 25, 2254)所述，藉由eFluor670稀釋、使用流式細胞術測定其對經eFluor670標記之有反應細胞之增殖的抑制作用。圖38提供流式細胞術的結果。單供體及多供體CD4
IL - 10細胞很強地將同種異體CD4+與CD8+ T細胞的活體外增殖均抑制超過80% (圖38)。
進一步分析CD4
IL - 10細胞針對骨髓性白血病細胞(ALL-CM)及紅血球系白血病細胞株(K562)的細胞毒性作用。單供體(BC-E及BC-V)或多供體(BC-V/T/E) CD4
IL - 10細胞與ALL-CM或K562細胞以1:1比率共培養。3天之後，收集細胞且對存活的CD45低、CD3-目標細胞進行計數且藉由FACS、如(Locafaro等人, Mol Ther 2017, 25, 2254)所述加以分析。單供體及多供體CD4
IL - 10細胞亦介導直接針對ALL-CM骨髓腫瘤細胞的強細胞毒性作用，而其未能殺滅敏感性K562細胞，K562細胞缺乏其細胞毒性活性所必需的I類MHC表現(圖39)。單供體(BC-E及BC-V)或多供體(BC-V/T/E) CD4
IL - 10細胞針對此兩種目標細胞株(ALL-CM及K562)的細胞毒性活性類似。
亦使用人源化異種GvHD疾病模型 - 靜脈內注射有ALL-CM細胞(2.5x10
6)的NSG小鼠，在活體內測試單供體(BC-E)及多供體(BC-V/T/E) CD4
IL - 10細胞的細胞毒性作用。如圖36中所繪示，測試其對來自同種異體供體之人類PBMC所誘導之GvHD的影響以及其在治療背景下對細胞株ALL CM之急性骨髓性白血病生長的影響。
自Charles-River Italia (Calco, Italy)獲得八至十週齡雌性NOD scid γ (NSG)小鼠。實驗方案經Ospedale San Raffaele動物研究內部委員會(實驗動物照護及使用委員會(IACUC))批准。第0天，小鼠接受來自線性加速器的全身輻射。第0天注射ALL-CM細胞(2.5x10
6)。第0天，不同組的小鼠注射：無、同種異體PBMC (2.5x10
6)、單供體(BC-E，2.5x10
6)或以1:1:1比率自3個不同供體(BC-V/T/E，2.5 x10
6)彙集之多供體CD4
IL - 10細胞與同種異體PBMC (2.5x10
6)的組合，或第3天注射多供體CD4
IL - 10細胞(2.5x10
6)。所有細胞於250 μl體積的經伊氏修改之杜氏培養基(Iscove's modified Dulbecco's medium)中靜脈內投與。小鼠每週監測3至4次。
將NSG小鼠分成五組各5隻小鼠且各組在第0天用以下處理：(i)空白對照；(ii)同種異體單核細胞(PBMC)；(iii)同種異體PBMC及多供體CD4
IL - 10細胞(BC-V/T/E)；(iv)同種異體PBMC及單供體CD4
IL - 10細胞(BC-E)；或(v)第3天投與多供體CD4
IL - 10(BC-V/T/E)細胞。如先前(Locafaro等人, Mol Ther 2017, 25, 2254)所述量測骨髓性白血病惡化。
ALL-CM細胞投與NSG小鼠引起此等細胞快速擴增且所有小鼠在第20天死亡或必須處死。正如所料，注射PBMC防止白血病惡化。單供體及多供體CD4
IL10細胞與同種異體PBMC組合給與不干擾PBMC的抗骨髓性白血病效應。
ALL-CM細胞(當此等細胞的已大規模擴增正在進行時)投與之後3天注射多供體CD4
IL - 10(BC-V/T/E)細胞使得腫瘤生長被抑制。此等結果表明多供體CD4
IL - 10細胞在活體內具有直接的抗骨髓性白血病治療作用(圖40)。
然而，PBMC儘管具有有益的抗骨髓性白血病效應，但誘導極其嚴重的異種GvHD形式且截至第24天，所有小鼠死亡(圖41)。在研究中，測試單供體(BC-E)及多供體(BC-V/T/E) CD4
IL - 10細胞在投與NSG小鼠後抑制PBMC所誘導之異種GvHD的能力。第0天向NSG小鼠注射ALL-CM細胞(2.5x10
6)。將小鼠分成五組且各組用以下處理：(i)空白對照；(ii)同種異體單核細胞(PBMC)；(iii)同種異體PBMC及多供體(BC-V/T/E) CD4
IL - 10細胞(BC-E、BC-V、BC-T)；(iv)同種異體PBMC及單供體CD4
IL - 10細胞(BC-E)或第3天注射多供體(BC-V/T/E) CD4
IL - 10細胞。根據存活率及體重損失來量測動物的異種GvHD。另外，如(Bondanza等人, Blood, 2006, 107, 1828)所述監測背部弓起、皮毛狀況及皮膚完整性。若體重損失達到超過20%，則出於倫理原因而處死小鼠。圖41顯示第1天注射ALL-CM細胞(2.5x10
6)後每一天的無GvHD之NSG小鼠%及隨後用PBMC聯合或不聯合單供體或多供體CD4
IL - 10細胞處理後之每一天的無GvHD之NSG小鼠%。
結果顯示，多供體CD4
IL - 10細胞不誘導異種GvHD且下調同種異體PBMC所誘導的異種GvHD。總體而言，此等結果表明，多供體CD4
IL - 10細胞下調重度異種GvHD，在治療背景下具有直接的抗骨髓性白血病作用且不干擾PBMC的保護性抗骨髓性白血病作用。
6.9.15. 實例14：源於四個不同供體之多供體CD4IL-10細胞的授受性轉移
測試源於四個不同供體之多供體CD4
IL - 10細胞的授受性轉移抑制PBMC所誘導之異種GvHD的轉移能力。
在此等實驗中，在同種異體PBMC所誘導之GvHD的人源化小鼠模型中測試單供體CD4
IL - 10細胞(供體C；批號C)及源於4個不同供體的多供體CD4
IL - 10細胞(供體C、E、F及H；批號CEFH)。在此模型中，第0天對NSG小鼠進行亞致死量的輻射且第3天注射(靜脈內緩慢推注) (i) 2.5E+06個同種異體PBMC；(ii) 2.5E+06個同種異體PBMC與2.5E+06個單供體CD4
IL - 10細胞(批號C)的組合；(iii) 2.5E+06個同種異體PBMC與2.5E+06個細胞多供體CD4
IL - 10細胞(批號CEFH)的組合；或(iv) 2.5E+06個單獨細胞多供體CD4
IL - 10細胞(批號CEFH)。利用體重損失、毛皮外觀、皮膚外觀、背部弓起及活動性之綜合評分(參見Bondanza A等人,
Blood2006;107:1828-36)確定GvHD。如圖42中所示，僅投與多供體CD4
IL - 10細胞的小鼠在研究結束時100%無GvHD。
總之，此資料證明，源於四個不同供體之多供體CD4
IL - 1 0細胞的授受性轉移抑制PBMC所誘導的異種GvHD而不誘導異種GvHD。
6.9.16. 實例15：產生IL-10變異體
考慮其他物種的IL-10序列，藉由引入胺基酸修飾(例如取代、插入、缺失)來產生人類IL-10變異體。藉由如圖43A所提供之序列比對來確定修飾位點。利用比對鑑別出各物種中具有不同胺基酸的胺基酸位置且藉由引入胺基酸之取代、插入或缺失加以修飾。
人類IL-10變異體之兩個實例提供於圖43B中。藉由在相應位置用病毒IL-10 (EBVB9)之三個不同胺基酸(E、A及D)取代人類IL-10之三個胺基酸(D、I及A)來產生可能的huIL-10雜合體#1 (SEQ ID NO: 21)。藉由在相應位置用病毒IL-10 (EBVB9)之另一胺基酸(A105)取代人類IL-10之一個胺基酸(I105)來產生可能的huIL-10雜合體#2 (SEQ ID NO: 22)。圖43C顯示人類IL-10 (SEQ ID NO: 1)與IL10 EBVB9 (SEQ ID NO: 18)的比對，其中「*」指示IL-10雜合體#1中發生取代的一或多個胺基酸位置且「#」指示IL-10雜合體#2的較佳I105→A105胺基酸取代。
如上文章節中所述將人類IL-10變異體選殖入表現載體中且測試變異體蛋白質的表現及功能。使用所選的人類IL-10變異體產生CD4
IL - 10細胞。如本文所提供，測試CD4
IL - 10細胞的效率。
6.9.17. 實例 1 至 11 之其他實驗方法及材料
細胞製備及細胞株 .藉由Ficoll-Hypaque梯度離心製備周邊血液單核細胞(PBMC)。使用CD4 T細胞分離套組(Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany)純化CD4
+T細胞，所得純度＞95%。由周邊血液CD14
+單核球產生成熟樹突狀細胞(DC)，使用CD14
+微珠(Miltenyi Biotech, Germany)、根據製造商說明書正向選擇且在37℃下、在補充有10%胎牛血清(FBS；Lonza, Italy)、100 U/mL青黴素/鏈黴素(Lonza, Italy)、2 mM L-麩醯胺酸(Lonza, Italy)的RPMI 1640 (Lonza, Italy)中、在10 ng/mL重組人類(rh) IL-4 (R&D Systems, Minneapolis MN, USA)及100 ng/mL rhGM-CSF (Genzyme, Seattle, WA, USA)存在下培養5天且用1 mg/mL脂多醣(LPS, Sigma, CA, USA)成熟額外兩天。
質體構築 .自pH15C (ATCC n°68192)切得人類IL-10編碼序列，且將549 bp片段選殖入pBluKSM (Invitrogen)的多選殖位點中以獲得pBluKSM-hIL-10。如下獲得555 bp片段：自pBluKSM-hIL-10切得hIL-10且連接至1074.1071.hPGK.GFP.WPRE.mhCMV.dNGFR.SV40PA (在此稱為LV-ΔNGFR)，以獲得LV-IL-10/ΔNGFR。雙向啟動子(方向相反的人類PGK啟動子外加CMV啟動子的最小核心元件)的存在允許兩種轉殖基因共表現(Locafaro等人 Mol Ther. 2017;25(10):2254-2269)。藉由焦磷酸定序(Primm)驗證LV-IL-10/ΔNGFR序列。
載體產生及滴定 .藉由Ca
3PO
4將四個質體短暫共轉染至293T細胞中來產生VSV-G假型化第三代雙向慢病毒載體且藉由超速離心濃縮，如(Locafaro等人, Mol Ther. 2017;25(10):2254-2269)所述。藉由限制稀釋法估算效價，藉由HIV-1 Gag p24抗原免疫捕捉(NEN Life Science Products; Waltham, MA)量測載體顆粒，且載體感染力依照效價與顆粒之間的比率計算。效價範圍為5x10
8至6x10
9個轉導單位/mL，且感染力範圍為5x10
4至10
5個轉導單位/ng p24。
CD4
IL - 10 細胞株的產生 .如先前(Andolfi等人, Mol Ther. 2012;20(9):1778-1790)所述，獲得經CD4轉導的多株細胞。簡言之，純化的CD4 T細胞用可溶性抗CD3單株抗體(mAb, 30 ng/mL, OKT3, Janssen-Cilag, Raritan, NJ, USA)、抗CD28 mAb (1 μg/mL, BD)及rhIL-2 (50 U/mL, PROLEUKIN, Novartis, Italy)活化48小時。以20的感染倍率(MOI)用LV-IL-10/ΔNGFR (CD4
IL - 10)轉導T細胞。第11天，使用CD271
+微珠(Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany)對CD4
+ΔNGFR
+細胞進行珠粒分選且在含有5%人類血清(BioWhittaker-Lonza, Washington)、100 U/mL青黴素-鏈黴素(BioWhittaker)及50 U/mL rhIL-2 (PROLEUKIN, Novartis, Italy)的X-VIVO15培養基中擴增。第7天及第10天，培養基用補充有50 U/mL rhIL-2的新鮮培養基置換。第14天，收集細胞，洗滌，且如先前(Andolfi等人, Mol Ther. 2012;20(9):1778-1790)所述用同種異體餵養細胞混合物再刺激。14天後，收集細胞且冷凍。將解凍的CD4
IL - 10細胞再刺激且在第2輪及第3輪再刺激及擴增之後，進行活體外功能表徵且用於活體內實驗。
載體複本數分析 .轉導之後培養細胞11天，以便除去未整合的載體形式。使用QIAamp DNA血液小型套組(QIAGEN, 51106)，根據製造商說明書分離出基因體DNA。使用QX200液滴式數位PCR系統(Bio-Rad)，根據製造商說明書定量載體整合。
細胞介素測定 .為了量測細胞介素產生，在第2輪及第3輪再刺激之後，單供體及多供體CD4
IL - 10細胞不加以刺激或在最終體積為200 μl的培養基(圓底96孔盤，2x10
5/孔)中用固著的抗CD3 (10 µg/mL)及可溶性抗CD28 (1 µg/mL) mAb加以刺激。培養48小時之後收集上清液且藉由ELISA、根據製造商說明書(BD Biosciences)測定IL-10、IL-4、IL-5、IFN-γ及IL-22含量。
流式細胞術分析 .對於顆粒酶B (殖株MHGB04, Invitrogen, USA)的表現而言，CD4
IL - 10細胞在用CD4進行表面染色之後加以固定，滲透且使用BD Cytofix/Cytoperm™套組、根據製造商說明書(目錄號554714, Biolegend, USA)染色。染色的細胞用補充有1% FBS的PBS洗滌兩次且使用BD LSRFortessa分析(使用FlowJo 10軟體分析)。
殺滅分析 .在第2輪及第3輪再刺激之後，在共培養實驗中分析單供體及多供體CD4
IL - 10細胞的細胞毒性。簡言之，分別使用非骨髓性白血病細胞株K562及骨髓性白血病細胞株ALL-CM作為目標細胞且與CD4
IL - 10細胞一起以1:1比率(10
5個目標細胞及10
5個CD4
IL - 10細胞)接種3天。在共培養結束時，收集細胞且分析K562及ALL-CM細胞且藉由FACS計數。
抑制分析 .為了量測單供體及多供體CD4
IL - 10細胞的抑制能力，同種異體PBMC在用同種異體成熟DC (5x10
4個細胞/孔)及可溶性抗CD3 (50 ng/mL) mAb刺激之前，根據製造商說明書，用細胞增殖染料eFluor® 670 (Invitrogen, CA, USA)標記。PBMC及抑制細胞以1:1比率(10
5個PBMC及10
5個CD4
IL - 10細胞)添加。培養3天之後，藉由FACS分析CD4
+ΔNGFR
-或CD8
+ΔNGFR
-T細胞之eFluor670稀釋來測定有反應細胞的增殖。
移植物抗宿主疾病模型：在所有實驗中使用6/8週齡雌性NSG小鼠。第0天，根據小鼠體重，小鼠接受單次劑量為175至200 cGy之來自線性加速器的全身輻射，且靜脈內注射PBMC細胞(5x10
6)或CD4
IL - 10細胞(單供體或多供體-三個供體之細胞池-5x10
6或2.5x10
6)，或靜脈內注射PBMC (5x10
6)與CD4
IL - 10細胞(5x10
6或2.5x10
6)的組合。如先前(Bondanza等人, Blood. 2006;107(5):1828-1836)所述，每週監測存活率、體重損失、活動性、毛皮、皮膚及背部弓起至少3次。當小鼠體重損失為20%時，出於倫理原因將小鼠安樂死。
或者，在第0天，小鼠如上所述接受全身輻射。第3天，向小鼠注射CD4
+T細胞(5x10
6或2.5x10
6)、單供體及多供體(三個供體之細胞池) CD4
IL - 10細胞(5x10
6或2.5x10
6)，或CD4
+T細胞(5x10
6或2.5x10
6)與單供體及多供體(三個供體之細胞池) CD4
IL - 10細胞(5x10
6或2.5x10
6)的組合。如上文所指示監測GvHD誘導情況。
7. 以引用方式之併入
本申請案中所引用之所有出版物、專利、專利申請案及其他文獻皆以全文引用之方式併入本文中以用於所有目的，其引用的程度就如同各個別出版物、專利、專利申請案及其他文獻經個別地指示以引用之方式併入以用於所有目的一樣。
8. 等效物
雖然已說明且描述各種特定實施例，但以上說明不具限制性。應瞭解，可進行各種變化而不背離本發明之精神及範疇。熟習此項技術者在審閱本說明書後將顯而易知諸多變型。
9. 序列
SEQ ID NO : 1 ( 人類 IL - 10 胺基酸序列 -- 蛋白質序列 ： Ref P22301 ) SEQ ID NO : 2 ( 人類 IL - 10 例示性聚核苷酸序列 ) SEQ ID NO: 3 ( Δ NGFR 胺基酸序列 ) SEQ ID NO : 4 ( ΔNGFR 例示性聚核苷酸序列 ) SEQ ID NO: 5 (pLV-IL10 之核苷酸序列 ) ： SEQ ID NO : 6 ( 病毒介白素 - 10 同源物 ， 亦稱為介白素 - 10 BCRF1 ， 亦稱為 IL10H _ EBVB9 )蛋白質序列：Ref：P03180
SEQ ID NO : 7 ( 病毒介白素 - 10 同源物 cDNA 序列 )核苷酸序列(cDNA)：Ref：NC_007605.1
SEQ ID NO : 9 ( 抗 CD19 CAR 胺基酸序列 ) SEQ ID NO : 10 ( 抗 CD19 CAR 聚核苷酸序列 ) SEQ ID NO : 11 ( FMC63 之 抗 CD19 scFV 胺基酸序列 ) SEQ ID NO : 12 ( 抗 CD19 scFV 聚核苷酸序列 ) SEQ ID NO : 13 ( FMC63 之 抗 CD19 scFV VH ) SEQ ID NO : 14 ( FMC63 之 抗 CD19 scFV VL ) SEQ ID NO : 16 ( 抗 CD20 CAR 胺基酸序列 ) SEQ ID NO : 17 ( 抗 CD20 CAR 聚核苷酸序列 ) SEQ ID NO : 18 ( 抗 CD20 scFV 胺基酸序列 ) SEQ ID NO : 19 ( 抗 CD20 scFV 聚核苷酸序列 ) SEQ ID NO: 20 ( 抗 CD20 scFV VH) SEQ ID NO: 21 ( 抗 CD20 scFV VL) SEQ ID NO: 22 ( 抗 CD22 CAR 胺基酸序列 ) SEQ ID NO: 23 ( 抗 CD22 CAR 聚核苷酸序列 ) SEQ ID NO: 24 ( 抗 CD22 scFV 胺基酸序列 ) SEQ ID NO: 25 ( 抗 CD22 scFV 聚核苷酸序列 ) SEQ ID NO: 26 ( 抗 CD22 scFV VH) SEQ ID NO: 27 ( 抗 CD22 scFV VL) SEQ ID NO : 28 ( 人類 CD8 鉸鏈區 ) SEQ ID NO : 29 ( TNFRSF 19 跨膜域 ) SEQ ID NO : 30 ( CD3ζ ) SEQ ID NO : 31 ( 4 - 1BB 共刺激域 ) SEQ ID NO: 32 (CD28 共刺激域 ) SEQ ID NO: 33 (2A 序列 ) SEQ ID NO: 34 ( 抗 B7-H3 CAR 胺基酸序列 ) SEQ ID NO: 35 ( 抗 B7-H3 CAR 聚核苷酸序列 ) SEQ ID NO: 36 ( 抗 B7-H3 scFV 胺基酸序列 ) SEQ ID NO: 37 ( 抗 B7-H3 scFV 聚核苷酸序列 ) SEQ ID NO: 38 ( 抗 B7-H3 scFV VH) SEQ ID NO: 39 ( 抗 B7-H3 scFV VL) SEQ ID NO : 40 ( CD8α 跨膜區 ) SEQ ID NO: 41 ( 抗 BCMA CAR 胺基酸序列 ) SEQ ID NO: 42 ( 抗 BCMA CAR 胺基酸序列 ) SEQ ID NO: 43 ( 抗 BCMA CAR 胺基酸序列 ) SEQ ID NO: 44 ( 抗 BCMA CAR 胺基酸序列 ) SEQ ID NO: 45 ( 抗 BCMA CAR 胺基酸序列 ) SEQ ID NO: 46 ( 抗 BCMA CAR 胺基酸序列 ) SEQ ID NO: 47 ( 抗 BCMA CAR 胺基酸序列 ) SEQ ID NO: 48 ( 抗 BCMA CAR 胺基酸序列 ) SEQ ID NO: 49 ( 抗 BCMA CAR 胺基酸序列 ) SEQ ID NO: 50 ( 抗 BCMA 重鏈胺基酸序列 ) SEQ ID NO: 51 ( 抗 BCMA 輕鏈胺基酸序列 ) SEQ ID NO: 52 ( 抗 BCMA CAR 重鏈胺基酸序列 ) SEQ ID NO: 53 ( 抗 BCMA 輕鏈胺基酸序列 ) SEQ ID NO: 54 ( 抗 BCMA CAR 胺基酸序列 ) SEQ ID NO : 55 ( 包含抗 BCMA CAR 編碼序列的核酸序列 ) SEQ ID NO: 56 (取代基於病毒IL-10的例示性人類IL-10變異體)
SEQ ID NO:57 (例示性人類IL-10變異體，其中胺基酸取代基於病毒IL-10)
SEQ ID NO: 58 (小家鼠；「小鼠」)
SEQ ID NO: 59 (褐家鼠；「大鼠」)
SEQ ID NO: 60 (恆河獼猴；「MACMU」)
SEQ ID NO: 61 (金剛猩猩；「大猩猩」)
SEQ ID NO: 62 (食蟹獼猴；「CYNO」)
SEQ ID NO: 63 (阿努比斯狒狒；「東非狒狒」)
SEQ ID NO: 64 (倭黑猩猩；「BONOBO」)
SEQ ID NO: 65 (黑猩猩；「CHIMP」)
SEQ ID NO: 66 (EBVB9)
SEQ ID NO: 67 huIL-10雜合體#1
SEQ ID NO: 68 huIL-10雜合體#2
圖 1非限制性繪示本文所提供之各種嵌合抗原受體(CAR)的結構。
圖 2A繪示用於慢病毒載體中之抗CD19 CAR編碼序列的部分結構，包括來自完整人類抗CD19單株抗體FMC63的scFv、CD8α鉸鏈、CD8α跨膜域、CD28共刺激域及CD3ζ活化域，該慢病毒載體用於將抗CD19 CAR遞送至CD4
+T細胞中以產生CD4
IL - 10 抗 CD19 CAR細胞。
圖 2B繪示慢病毒載體(pLV抗CD19 CAR)，其用於將抗CD19 CAR遞送至CD4
+T細胞中以產生CD4
IL - 10 抗 CD19CAR細胞。
圖 3A 至 圖 3B繪示用於產生慢病毒載體(LVV；LVV
IL - 10 - NGFR)的雙向質體(pLVIL-10)，該慢病毒載體用於將人類IL-10及ΔNGFR編碼序列遞送至CD4
+T細胞中以產生CD4
IL - 10細胞或CD4
IL - 10 抗 CD19CAR細胞。
圖 3A繪示雙向慢病毒載體的部分結構，其用於將人類IL-10及ΔNGFR編碼序列遞送至來自多供體的CD4+ T細胞中以產生多供體CD4IL-10細胞。
圖 3B繪示雙向慢病毒載體(hPGK.IL10.WPRE.mhCMV. ΔNGFR.SV40PA)的完整及環狀結構，其用於將人類IL-10及ΔNGFR編碼序列遞送至來自多供體的CD4
+T細胞中，以產生多供體CD4
IL - 10細胞。
圖 4出於繪示性目的顯示天然B細胞分化期間的抗原表現。
圖 5A 至圖 5C顯示CD4
IL - 10 抗 CD19CAR細胞產生方法之非限制性實例的示意圖。在各種方法中，人類CD4
+T細胞在補充有5%人類AB血清及rhIL-2 (50 U/mL)的完全培養基(X-vivo)中用抗CD3/抗CD28珠粒(Miltenyi)(3:1細胞:珠粒比率)活化。
圖 5A顯示活化CD4
+T細胞在活化之後的48小時用編碼抗CD19 CAR (LVV
CD19 - CAR)之慢病毒載體轉導且在24小時後(亦即，活化之後的72小時)用編碼人類IL-10及截斷形式之人類NGF受體的雙向慢病毒載體(LVV
IL - 10 - NGFR)轉導。兩種LVV均以20的感染倍率(MOI)使用。
圖 5B顯示活化CD4
+T細胞在活化之後的48小時用LVV
IL - 10 - NGFR轉導且在24小時後(亦即，活化之後的72小時)用LVV
CD19 - CAR轉導。
圖 5C顯示活化CD4
+T細胞在活化之後的48小時用LVV
IL - 10 - NGFR及LVV
CD19 - CAR同時轉導。藉由在活化之後的48小時僅用LVV
IL - 10 - NGFR轉導活化CD4
+T細胞來產生對照細胞(不表現CAR)。對於
圖 5A 至圖 5C中之每一者而言，在凝聚胺(8 µg/mL)存在下執行轉導。另外，對於
圖 5A 至圖 5C中之每一者而言，在轉導之後的10至28天，使用抗CD271微珠(Miltenyi)及抗CD19 CAR微珠(Miltenyi)純化經轉導的細胞(亦即，∆NGFR+細胞)。如先前(Andolfi等人, Mol. Ther. 20(9):1778-1790 (2012)及Locafaro等人, Mol. Ther. 25(10): 2254-2269 (2017))所述，每14天對純化的細胞再刺激。第二輪(TF2)及第三輪(TF3)再刺激之後，活體外及活體內表徵所得細胞(CD4
IL - 10 抗 CD19CAR細胞或對照CD4
IL - 10細胞)。在整個培養期期間，根據需要，每2至3天更新培養基。
圖 6A顯示根據
圖 5A所述方法產生之對照細胞(左圖)及CD4
IL - 10 抗 CD19 CAR(右圖)的流式細胞分析圖(x軸為抗CD19 CAR表現且y軸為NGFR表現(IL-10的指標))。
圖 6B顯示根據
圖 5B所述方法產生之對照細胞(左圖)及CD4
IL - 10 抗 CD19CAR(右圖)的流式細胞分析圖(x軸為CD19且y軸為NGFR)。
圖 6C顯示根據
圖 5C所述方法產生之對照細胞(左圖)及CD4
IL - 10 抗 CD19 CAR(右圖)的流式細胞分析圖(x軸為CD19且y軸為NGFR)。
圖 7顯示CD4
IL - 10T細胞(對照)及CD4
IL - 10 抗 CD19 CART細胞的流式細胞分析圖(x軸為抗CD19 CAR表現且y軸為NGFR表現)。上圖顯示根據
圖 5C中所示之方法由供體26.1產生的CD4
IL - 10T細胞(對照)及CD4
IL - 10 抗 CD19 CART細胞。下圖顯示根據
圖 5C中所示之方法由供體26.2產生的CD4
IL - 10T細胞(對照)及CD4
IL - 10 抗 CD19CART細胞。
圖 8A 至 圖 8D顯示自三個不同供體(26.1、26.2及26.3)分離出之CD4
IL - 10T細胞(對照)及由CD4
+T細胞產生之CD4
IL - 10 / CART細胞的細胞介素產生概況。細胞介素產生概況包括IL-10 (
圖 8A)、IFN-γ (
圖 8B)、IL-4 (
圖 8C)及IL-5 (
圖 8D)。
圖 9顯示自供體24.2分離出之CD4
IL - 10T細胞(對照)及由CD4
+T細胞產生之CD4
IL - 10 / CART細胞的細胞介素產生概況。
圖 10顯示自供體24.2分離出之由CD4
+T細胞產生的CD4
IL - 10 抗 CD19CAR細胞在活體外殺滅表現CD19的NALM6細胞。ALL-CM為骨髓細胞株且對NK殺滅敏感的細胞株K562作為對照細胞納入。
圖 11A顯示自三個不同供體(26.1、26.2及26.3)分離出之由CD4
+T細胞產生的CD4
IL - 10 抗 CD19CAR細胞在活體外殺滅CD19
+NALM6細胞。
圖 11B顯示NALM6細胞與CD4
IL - 10T細胞(對照)或NALM6細胞與CD4
IL - 10 抗 CD19CAR細胞共培養第3天時之上清液中的IL-10含量。BLQ：低於定量水平(31 pg/mL)。
圖 12顯示第二輪再刺激(TF2)之後分離出(參見
圖 5C)之CD4
IL - 10T細胞(對照)與CD4
IL - 10 抗 CD19CAR細胞共培養之後，同種異體CD4+ T細胞增殖分析的流式細胞分析圖(計數對eFluor®670)。上圖顯示CD4
+T細胞在與CD4
IL - 10 抗 CD19CAR細胞共培養之後的增殖。下圖顯示CD4
+T細胞與CD4
IL - 10T細胞(對照)共培養之後的增殖。流式細胞分析圖顯示「未分裂」細胞及「分裂」細胞，其中由於每次分裂之後均發生稀釋，因此分裂細胞中的eFluor®670含量愈來愈少。由CD4
IL - 10T細胞(對照)及CD4
IL - 10 抗 CD19CAR細胞介導的抑制如下計算：100-([有反應細胞在CD4
IL - 10T細胞(對照)或CD4
IL - 10 抗 CD19CAR細胞存在下的增殖/有反應細胞的增殖]×100)。
圖 13顯示第二輪再刺激(TF2)之後分離出(參見
圖 5C)之CD4
IL - 10T細胞(對照)與CD4
IL - 10 抗 CD19CAR細胞共培養之後，同種異體CD8
+T細胞增殖分析的流式細胞分析圖(計數對eFluor®670)。上圖顯示CD8
+T細胞在與CD4
IL - 10 抗 CD19CAR細胞共培養之後的增殖。下圖顯示CD8
+T細胞與CD4
IL - 10T細胞(對照)共培養之後的增殖。流式細胞分析圖顯示「未分裂」細胞及「分裂」細胞，其中由於每次分裂之後均發生稀釋，因此分裂細胞中的eFluor®670含量愈來愈少。由CD4
IL - 10T細胞(對照)及CD4
IL - 10 抗 CD19CAR細胞介導的抑制如下計算：100-([有反應細胞在CD4
IL - 10T細胞(對照)或CD4
IL - 10 抗 CD19CAR細胞存在下的增殖/有反應細胞的增殖]×100)。
圖 14顯示第三輪再刺激(TF3)之後分離出(參見
圖 5C)之CD4
IL - 10T細胞(對照)與CD4
IL - 10 抗 CD19CAR細胞共培養之後，同種異體PBMC增殖分析的流式細胞分析圖(計數對eFluor®670)。流式細胞分析圖顯示「增殖」細胞，其中由於每次分裂之後均發生稀釋，因此分裂細胞中的eFluor®670含量愈來愈少。由CD4
IL - 10T細胞(對照)及CD4
IL - 10 抗 CD19CAR細胞介導的抑制如下計算：100-([有反應細胞在CD4
IL - 10T細胞(對照)或CD4
IL - 10 抗 CD19CAR細胞存在下的增殖/有反應細胞的增殖]×100)。
圖 15顯示用於評估小鼠活體內之CD19+腫瘤細胞生長之實驗大綱示意圖。第0天，向NSG小鼠注射：(i) NALM6-螢光素酶(1x10
5/小鼠)；(ii) NALM6-螢光素酶(1x10
5/小鼠) + PBMC (2.5x10
6/小鼠)；(iii) NALM6-螢光素酶(1x10
5/小鼠) + CD4
IL - 10 抗 CD19CAR細胞(2.5x10
6/小鼠)；或(iv) NALM6-螢光素酶(1x10
5/小鼠) + PBMC (2.5x10
6/小鼠) + CD4
IL - 10 抗 CD19CAR細胞(2.5x10
6/小鼠)。
圖 16A顯示NSG小鼠在依
圖 15中所述的條件(i)至(iv)注射之後的第3天、第6天、第9天及第12天，來自NALM6-螢光素酶細胞的生物發光。
圖 16B顯示定量
圖 16A中之影像之生物發光的線圖。條件(i)至(iv)中之每一者之總通量[p/s]對時間(NALM6-螢光素酶注射後的天數)描述於
圖 15中。第12天利用曼-惠特尼檢驗(Mann-Whitney test)量測P值，從而對條件(ii)至(iv)與條件(i)(單獨的NALM6-螢光素酶)進行比較。
圖 17顯示圖15中所述之小鼠在條件(i)、(ii)及(iii)下發生之體重損失對時間的線圖。體重損失用作異種移植物抗宿主疾病(GvHD)的指標。
圖 18A 至 圖 18C顯示人源化小鼠異種GvHD模型中的單供體CD4
IL - 10 抗 CD19CAR細胞及多供體CD4
IL - 10 抗 CD19CAR細胞。
圖 18A顯示人源化小鼠異種GvHD模型中所測試的單供體CD4
IL - 10 抗 CD19CAR細胞，該異種GvHD係由同種異體PBMC誘導，其中經輻射的NSG小鼠在第3天靜脈內(i.v.)注射同種異體PBMC (2.5E6個細胞/小鼠)或單供體CD4
IL - 10 抗 CD19CAR細胞(2.5E6個細胞/小鼠)或多供體CD4
IL - 10 抗 CD19CAR細胞(2.5E6個細胞/小鼠)或PBMC + 單供體CD4
IL - 10 抗 CD19CAR細胞或PBMC + 多供體CD4
IL - 10 抗 CD19CAR細胞(2.5E6個細胞/小鼠)。
圖 18B顯示人源化小鼠異種GvHD模型中所測試的CD4
IL - 10 抗 CD19CAR細胞，該異種GvHD由同種異體PBMC誘導，其中經輻射的NSG小鼠在第3天靜脈內(i.v.)注射同種異體PBMC (2.5E6個細胞/小鼠)及/或單供體CD4
IL - 10 抗 CD19CAR細胞。
圖 18C顯示人源化小鼠異種GvHD模型中所測試的CD4
IL - 10 抗 CD19CAR細胞，該異種GvHD由同種異體PBMC誘導，其中經輻射的NSG小鼠在第3天靜脈內(i.v.)注射同種異體PBMC (2.5E6個細胞/小鼠)及/或多供體CD4
IL - 10 抗 CD19CAR細胞(2.5E6個細胞/小鼠)。PBMC：周邊單核細胞；GvHD：移植物抗宿主疾病。
圖 19繪示用於產生CD4
IL - 10細胞的例示性方案。
圖 20A顯示經LV-IL-10/ΔNGFR (雙向慢病毒載體，其編碼人類IL-10及截斷形式的人類NGF受體)轉導之人類CD4
+T細胞中的CD4
+ΔNGFR
+細胞百分比(平均值±SD，n=10)及載體複本數(VCN，平均值±SD，n=10)。
圖 20B顯示來自兩個代表性供體(供體B及供體C)之人類CD4
+T細胞中之CD4及ΔNGFR表現的FACS分析，該等T細胞經LV-IL-10/ΔNGFR轉導且使用抗CD271微珠純化。
圖 21顯示單供體CD4
IL - 10細胞在第二輪(TF2)及第三輪(TF3)再刺激之後的細胞介素產生概況。TF2及TF3 CD4
IL - 10細胞不加以刺激(箭頭指示自發/未刺激之樣品)或用固著的CD3 (10 μg/mL)及可溶性CD28 mAb (1 μg/mL)刺激48小時。收集培養上清液且藉由ELISA測定IL-10、IL-4、IL-5、IFN-γ及IL-22含量。所有樣品三重複測試。展示所測試之n=8個供體的平均值±SD。
圖 22A顯示表現顆粒酶B (GzB)之CD4
IL - 10細胞在第2輪刺激(TF2)之後的百分比，如藉由FACS所分析。展示n=7個供體及單供體的盒鬚圖。
圖 22B顯示CD4
IL - 10細胞(每孔10
5個)與K562及ALL-CM細胞(每孔10
5個)以1:1比率共培養3天時的死細胞%。盒鬚圖代表n=4個供體的資料且圓點代表單供體的資料。
圖 23A 及圖 23B顯示單供體CD4
IL - 10細胞可抑制同種異體CD4
+T細胞增殖。同種異體PBMC細胞用eFluor® 670 (每孔10
5個細胞)標記且在CD4
IL - 10細胞(每孔10
5個細胞)不存在或存在下用同種異體成熟樹突狀細胞(DC)(每孔5x10
4個細胞)及可溶性抗CD3 mAb刺激，有反應細胞:受抑制細胞的比率為1:1。培養4天之後，在對CD4
+ΔNGFR
-T細胞設門之後，藉由eFluor® 670稀釋、使用流式細胞術測定有反應之增殖細胞的百分比。
圖 23A顯示來自供體-C、供體-E及供體-F的結果且
圖 23B顯示來自供體-H、供體-I及供體-L的結果。指示增殖及抑制之百分比。如下計算由CD4
IL - 10細胞介導的抑制作用：100-([有反應細胞在CD4
IL - 10細胞存在下的增殖/單獨的有反應細胞之增殖]×100)。
圖 24A 及圖 24B顯示單供體CD4
IL - 10細胞可抑制同種異體CD8
+T細胞增殖。同種異體PBMC細胞用eFluor® 670 (每孔10
5個細胞)標記且在CD4
IL - 10細胞(每孔10
5個細胞)不存在或存在下用同種異體成熟樹突狀細胞(DC)(每孔5x10
4個細胞)及可溶性抗CD3 mAb刺激，有反應細胞:受抑制細胞的比率為1:1。培養4天之後，在對CD4
+ΔNGFR
-T細胞設門之後，藉由eFluor® 670稀釋、使用流式細胞術測定有反應之增殖細胞的百分比。
圖 24A顯示來自供體-C、供體-E及供體-F的結果且
圖 24B顯示來自供體-H、供體-I及供體-L的結果。指示增殖及抑制之百分比。如下計算由CD4
IL - 10細胞介導的抑制作用：100-([有反應細胞在CD4
IL - 10細胞存在下的增殖/單獨的有反應細胞之增殖]×100)。
圖 25顯示多供體CD4
IL - 10細胞在第三輪(TF3)再刺激之後的細胞介素產生概況相較於8位個別供體之CD4
IL - 10細胞所產生的平均值水平(+/-SD)。將來自三個供體的TF3 CD4
IL - 10細胞以1:1:1比率彙集且用固著的CD3 (10 μg/mL)及可溶性CD28 mAb (1 μg/mL)刺激48小時。收集培養上清液且藉由ELISA測定IL-10、IL-4、IL-5、IFN-γ及IL-22含量。圓點為多供體CD4
IL - 10細胞的結果；灰色條柱代表n=8個單供體的平均值±SD。
圖 26A顯示表現顆粒酶B (GzB)之多供體CD4
IL - 10細胞的百分比相較於為了產生細胞池而使用之n=3個單供體之CD4
IL - 10細胞之顆粒酶B平均表現量% (+/-SD)。第3輪刺激(TF3)之後，藉由FACS分析細胞。
圖 26B顯示多供體CD4
IL - 10細胞(每孔10
5個)與K562及ALL-CM細胞(每孔10
5個)以1:1比率共培養3天時的死細胞%。藉由FACS對殘餘白血病細胞(CD45
+CD33
+)中的各目標細胞進行計數。圓點為多供體CD4
IL - 10的結果且灰色條柱代表為了產生細胞池而使用之n=3個單供體的平均值±SD。
圖 27A 及圖 27B顯示多供體CD4
IL - 10細胞可抑制同種異體CD4
+T細胞及CD8
+T細胞增殖。同種異體PBMC細胞用eFluor® 670 (每孔10
5個細胞)標記且在多供體CD4
IL - 10細胞(每孔10
5個細胞)不存在或存在下用同種異體成熟樹突狀細胞(DC)(每孔5x10
4個細胞)及可溶性抗CD3 mAb刺激，有反應細胞:受抑制細胞的比率為1:1。培養4天之後，在對CD4
+ΔNGFR
-T細胞及CD8
+ΔNGFR
-T細胞設門之後，藉由eFluor® 670稀釋、使用流式細胞術測定有反應之增殖細胞的百分比。
圖 27A顯示自供體-C、供體-E及供體-F彙集之含有CD4
+細胞之多供體CD4
IL - 10細胞的結果。
圖 27B顯示自供體-H、供體-I及供體-L彙集之含有CD4
+細胞之多供體CD4
IL - 10細胞的結果。如下計算由CD4
IL - 10細胞介導的抑制作用：100-([有反應細胞在CD4
IL - 10細胞存在下的增殖/單獨的有反應細胞之增殖]×100)。
圖 28繪示用於測試利用人類PBMC及/或多供體CD4
IL - 10細胞誘導GvHD的方案，該等細胞在輻射後第0天注射。
圖 29顯示注射以下各者後之每一天展現GvHD的NSG小鼠%：PBMC (5x10
6個細胞/小鼠)、多供體(三個供體) CD4
IL - 10細胞(5x10
6個細胞/小鼠)，或PBMC (5x10
6個細胞/小鼠)與多供體CD4
IL - 10細胞(三個供體)(5x10
6個細胞/小鼠)之組合。
圖 30顯示在PBMC (5x10
6個細胞/小鼠)、多供體(三個供體) CD4
IL - 10細胞(5x10
6個細胞/小鼠)或PBMC (5x10
6個細胞/小鼠)與多供體CD4
IL - 10細胞(三個供體)(5x10
6個細胞/小鼠)組合注射之NSG小鼠中，CD4
IL -10細胞向脾臟(左圖)及骨髓(右圖)遷移。展示n=8個供體及單供體的盒鬚圖。
圖 31繪示用於測試利用CD4+ T細胞及多供體或單供體(BC-H) CD4
IL - 10細胞誘導GvHD的方案，該等細胞在輻射後第0天注射。
圖 32顯示注射後每一天展現GvHD之NSG小鼠%。
圖 33A 至 圖 33C顯示基於循環白血病細胞之減少及長期無白血病存活率所測試的移植物抗白血病(GvL)效果。如先前所述(Locafaro G.等人, Molecular Therapy 2017)量測白血病。第0天對NSG小鼠進行亞致死量的輻射且靜脈內注射骨髓性白血病細胞(ALL-CM)(5x10
6)。
圖 33A為實驗之圖解說明。
圖 33B顯示第3天注射PBMC (5x10
6)或單供體(供體BC-I及供體BC-H) CD4
IL - 10細胞(2.5x10
6)之動物的無白血病存活率。
圖 33C顯示第3天注射PBMC (5x10
6)或多供體CD4
IL - 10細胞(來自供體BC-I及供體BC-H)(2.5x10
6)之動物的無白血病存活率。
圖 34A 至 圖 34C顯示第0天經亞致死量之輻射且靜脈內注射ALL-CM細胞(5x10
6)之NSG小鼠的長期無白血病存活率量測值。
圖 34A顯示實驗之圖解說明。
圖 34B顯示第3天注射單獨的單核細胞(PBMC)(5x10
6)或單核細胞(PBMC)(5x10
6) + 單供體(供體BC-H及供體BC-I) CD4
IL - 10細胞(2.5x10
6)之動物的資料。
圖 34C顯示第3天注射單獨的單核細胞(PBMC)(5x10
6)或單核細胞(PBMC)(5x10
6) + 多供體CD4
IL - 10細胞(BC-I/H)(2.5x10
6)之動物的資料。
圖 35A 至 圖 35G顯示CD4
IL - 10細胞對NLPR3發炎體活化的抑制作用。
圖 35A顯示單供體(#1)之CD4
IL - 10細胞上清液對LPS活化之單核球產生IL-1β的影響。
圖 35B顯示來自另一單供體(#2)之CD4
IL - 10細胞上清液對LPS活化之單核球產生IL-1β的影響。
圖 35C顯示單供體(#1)之CD4
IL - 10細胞上清液抑制經LPS誘導、經NLPR3發炎體活化劑尼日利亞菌素(nigericine)(NIG)增強之IL-1β產生的作用。
圖 35D顯示單供體(#2)之CD4
IL - 10細胞上清液抑制經LPS誘導、經NLPR3發炎體活化劑尼日利亞菌素(NIG)增強之IL-1β產生的作用。
圖 35E為條形圖，其顯示單供體(BC-E)之CD4
IL - 10細胞上清液及自2個不同供體彙集之細胞在抗IL-10受體(抗IL-10R) mAb存在或不存在下對LPS誘導單核球產生IL-1β的影響。
圖 35F顯示多供體CD4
IL - 10細胞上清液在抗IL-10受體(抗IL-10R) mAb存在或不存在下對單核球產生IL-1β的影響。
圖 35G顯示多供體CD4
IL - 10細胞上清液在抗IL-10R mAb存在或不存在下對LPS與尼日利亞菌素組合誘導IL-18產生的影響。
圖 36繪示用於測試移植物抗骨髓白血病及異種GvHD影響的實驗方案。第0天向NSG小鼠靜脈內注射ALL-CM細胞(2.5x10
6)。第3天，將小鼠分成五組且各組用以下處理：(i)空白對照；(ii)同種異體單核細胞(PBMC)；(iii)同種異體PBMC及多供體CD4
IL - 10細胞(BC-E、BC-V、BC-T，1:1:1彙集)；(iv)同種異體PBMC及單供體CD4
IL - 10細胞(BC-E)；或(v)多供體CD4
IL - 10細胞，濃度如
圖 36所指示。
圖 37為條形圖，其描繪單供體(BC-T、BC-V及BC-E)及多供體CD4
IL - 10細胞(細胞池：1:1:1彙集的BC-E、BC-V及BC-T)的細胞介素分泌概況。
圖 38顯示單供體(BC-V及BC-E)及多供體CD4
IL - 10細胞(BC-V/E/T之細胞池)對同種異體CD4+及CD8+ T細胞之活體外增殖的抑制作用。同種異體PBMC細胞用eFluor® 670 (每孔5x10
4個細胞)標記且在CD4
IL - 10細胞(每孔5x10
4個細胞)不存在或存在下用同種異體成熟樹突狀細胞(DC)(每孔1x10
4個細胞)及可溶性抗CD3 mAb刺激，有反應細胞:受抑制細胞的比率為1:1。培養3天之後，在對CD4
+- ΔNGFR
-(上)或CD8+ ΔNGFR
-(下) T細胞設門之後，藉由eFluor® 670稀釋、使用流式細胞術測定有反應之增殖細胞的百分比。
圖 38顯示單供體BC-V及BC-E以及自供體BC-V、BC-E及BC-T彙集之細胞的結果。指示增殖及抑制之百分比。如下計算由CD4
IL - 10細胞介導的抑制作用：100-([有反應細胞在CD4
IL - 10細胞存在下的增殖/單獨的有反應細胞之增殖]×100)。
圖 39顯示單供體(BC-E及BC-V)或多供體CD4
IL - 10細胞(BC-E+BC-V+BC-T)與ALL-CM骨髓腫瘤細胞或K562細胞共培養中之活細胞%。結果顯示單供體及多供體CD4
IL - 10細胞對ALL-CM骨髓腫瘤細胞具有選擇性細胞毒性效應，但對缺乏I類MHC表現的K562細胞則不然。
圖 40顯示第0天靜脈內注射ALL-CM細胞(2.5x10
6)之NSG小鼠的無白血病存活率量測值。第3天，將小鼠分成五組且各組用以下處理：(i)空白對照；(ii)同種異體單核細胞(PBMC)；(iii)同種異體PBMC及多供體CD4
IL - 10細胞(B BC-V/T/ET)；(iv)同種異體PBMC及單供體CD4
IL - 10細胞(BC-E)或(v)多供體CD4
IL - 10細胞。圖形顯示各組動物的無白血病存活率。
圖 41顯示ALL-CM細胞(2.5x10
6)注射後每一天的無GvHD之NSG小鼠%及隨後投與以下各者後每一天的無GvHD之NSG小鼠%：(i)空白對照；(ii)同種異體單核細胞(PBMC)；(iii)同種異體PBMC及多供體CD4
IL - 10細胞(BC-E、BC-V、BC-T)；(iv)同種異體PBMC及單供體CD4
IL - 10細胞(BC-E)或(v)第3天投與多供體CD4
IL - 10細胞。
圖 42顯示給與2.5E+06個PBMC (對於供體C、E、F及H為同種異體的)的NSG小鼠在第22天皆死於急性及致死性異種GvHD。單供體CD4
IL - 10細胞(批號C)或多供體CD4
IL - 10細胞(批號CEFH)與PBMC組合投與分別防止75%小鼠(3/4小鼠)及80%小鼠(4/5小鼠)出現致死性異種GvHD。相比之下，2.5E+06個多供體CD4
IL - 10細胞的轉移不誘導GvHD的任何徵象。總之，此等結果表明，來自4個不同供體的多供體CD4
IL - 10細胞抑制病原性人類T細胞反應，其抑制效力如同或稍微大於單供體CD4
IL - 10細胞。PBMC：周邊單核細胞；GvHD：移植物抗宿主疾病。
圖 43A顯示不同物種之IL-10蛋白序列的比對，包括人類(SEQ ID NO: 1)、小家鼠「小鼠」(SEQ ID NO: 58)；褐家鼠「大鼠」(SEQ ID NO: 59)；恆河獼猴「MACMU」(SEQ ID NO: 60)；金剛猩猩「大猩猩」(SEQ ID NO: 61)；食蟹獼猴「CYNO」(SEQ ID NO: 62)；阿努比斯狒狒(Papio Anubis)「東非狒狒」「SEQ ID NO: 63」；倭黑猩猩「BONOBO」(SEQ ID NO: 64)；黑猩猩「CHIMP」(SEQ ID NO: 65)；及EBVB9 (SEQ ID NO: 66)。
圖 43B提供藉由在相應位置用病毒IL-10 (EBVB9)之胺基酸取代人類IL-10之一或多個胺基酸而產生之IL-10變異體的序列。亦提供例示性變異體之序列，其可為huIL-10雜合體#1 (SEQ ID NO: 67)且可為huIL-10雜合體#2 (SEQ ID NO: 68)。「*」表示一或多個發生取代的胺基酸位置。「#」表示IL-10雜合體#2 (SEQ ID NO: 68)的較佳I105→A105胺基酸取代。
圖 43C顯示人類IL-10 (SEQ ID NO: 1)與IL10 EBVB9 (SEQ ID NO: 66)的比對。「*」表示IL-10雜合體#1中發生取代的一或多個胺基酸位置。「#」表示IL-10雜合體#2的較佳I105→A105胺基酸取代。
該等圖僅出於繪示的目的而描繪本發明之各種實施例。熟習此項技術者自以下論述將容易認識到可以使用本文所繪示之結構及方法的替代實施例而此等替代實施例不悖離本文所述之本發明原理。
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Claims (254)
- 一種經基因修飾之CD4 +T細胞(CD4 IL - 10 / CAR)，其包含： (a)編碼嵌合抗原受體(CAR)的第一外源聚核苷酸區段；及 (b)編碼介白素-10 (IL-10)的第二外源聚核苷酸區段。
- 如請求項1之經基因修飾之CD4 +T細胞，其中該第一外源聚核苷酸區段包含可操作地連接至該CAR之編碼序列的第一調控元件。
- 如請求項2之經基因修飾之CD4 +T細胞，其中該調控元件驅動該CAR之組成性表現。
- 如請求項1至3中任一項之經基因修飾之CD4 +T細胞，其中該CAR包含抗原結合域、鉸鏈區、跨膜域及胞內信號傳導域。
- 如請求項4之經基因修飾之CD4 +T細胞，其中該抗原結合域為單鏈抗體片段。
- 如請求項5之經基因修飾之CD4 +T細胞，其中該單鏈抗體片段包含單鏈Fv (scFv)。
- 如請求項4至6中任一項之經基因修飾之CD4 +T細胞，其中該抗原結合域靶向與自體免疫疾病、發炎病症或癌症有關的抗原。
- 如請求項7之經基因修飾之CD4 +T細胞，其中該抗原係選自由以下組成之群：CD19、CD20、CD22、CD27、CD38、B7-H3、CD23、Lyml、Lym2、CLEC5A、CDH179b、FLT3、GCC、Muc、BCMA、CSF2RA、GFRa4、CD32、CD33、CEA、IL1lRa、IL13Ra、NYBRI、SLea、CD200R、TGFBetaR2、CD276、TROP2、LAMP1、PTK7、DLL3、CDH1、CDH6、CDH17、CDH19、TSHR、酪胺酸酶、HLA-A*02、HLA-A*24或瓜胺酸化肽、胰島素、MOG、GAD65、IA2、麥膠蛋白(gliadin)及橋粒醣蛋白(desmoglein)。
- 如請求項4至8中任一項之經基因修飾之CD4 +T細胞，其中該抗原結合域包含抗CD19抗原結合域。
- 如請求項9之經基因修飾之CD4 +T細胞，其中該抗CD19抗原結合域具有SEQ ID NO: 11之序列。
- 如請求項4至8中任一項之經基因修飾之CD4 +T細胞，其中抗原結合域為抗BCMA抗原結合域。
- 如請求項10之經基因修飾之CD4 +T細胞，其中該抗BCMA抗原結合域包含SEQ ID NO: 42之序列。
- 如請求項1至12中任一項之經基因修飾之CD4 +T細胞，其中該鉸鏈區選自人類CD8α鉸鏈區、人類CD28鉸鏈區、IgG1鉸鏈區或IgG4鉸鏈區。
- 如請求項13之經基因修飾之CD4 +T細胞，其中該鉸鏈區源於人類CD8α。
- 如請求項1至14中任一項之經基因修飾之CD4 +T細胞，其中該跨膜域選自TNFRSF 19跨膜域、CD3ζ跨膜域、CD8α跨膜域、CD4跨膜域、CD28跨膜域或B7家族誘導型共刺激(ICOS)跨膜域。
- 如請求項15之經基因修飾之CD4 +T細胞，其中該跨膜域源於CD8α。
- 如請求項1至16中任一項之經基因修飾之CD4 +T細胞，其中該CAR進一步包含一或多個共刺激域。
- 如請求項17之經基因修飾之CD4 +T細胞，其中該CAR包含兩個共刺激域。
- 如請求項1至18中任一項之經基因修飾之CD4 +T細胞，其中該一或多個共刺激域係選自由4-1BB、CD28、OX40、ICOS、CD27、MYD88-CD40及KIR2DS2組成之群。
- 如請求項19之經基因修飾之CD4 +T細胞，其中該一或多個共刺激域中之一者源於CD28。
- 如請求項18至20中任一項之經基因修飾之CD4 +T細胞，其中第二共刺激域源於4-1BB。
- 如請求項1至21中任一項之經基因修飾之CD4 +T細胞，其中該胞內信號傳導域包含基於酪胺酸之免疫受體活化模體(ITAM)。
- 如請求項1至22中任一項之經基因修飾之CD4 +T細胞，該基於酪胺酸之免疫受體活化模體(ITAM)源於CD3ζ。
- 如請求項1至23中任一項之經基因修飾之CD4 +T細胞，其中該CAR包含： 抗CD19抗原結合域、抗BCMA抗原結合域或抗CD20抗原結合域； 人類CD8α鉸鏈區； 人類CD8α跨膜區； CD28共刺激域；及 CD3ζ鏈胞內信號傳導域。
- 如請求項1至24中任一項之經基因修飾之CD4 +T細胞，其中該CAR包含SEQ ID NO: 9、16、22、34、41至49或54之序列。
- 如請求項25之經基因修飾之CD4 +T細胞，其中該第一外源聚核苷酸區段包含SEQ ID NO: 10、17、23、35或55之序列。
- 如請求項1至26中任一項之經基因修飾之CD4 +T細胞，其中該第一外源聚核苷酸區段整合於T細胞核基因體中。
- 如請求項1至27中任一項之經基因修飾之CD4 +T細胞，其中該第一外源聚核苷酸區段未整合於該T細胞核基因體中。
- 如請求項27或28之經基因修飾之CD4 +T細胞，其中該第一外源聚核苷酸區段存在於載體中。
- 如請求項1至29中任一項之經基因修飾之CD4 +T細胞，其中該第二外源聚核苷酸區段包含可操作地連接至該IL-10編碼序列的第二調控元件。
- 如請求項1至30中任一項之經基因修飾之CD4 +T細胞，其中該IL-10為人類IL-10。
- 如請求項1至30中任一項之經基因修飾之CD4 +T細胞，其中該IL-10為病毒IL-10。
- 如請求項1至30中任一項之經基因修飾之CD4 +T細胞，其中該IL-10為具有SEQ ID NO: 1之序列的蛋白質。
- 如請求項33之經基因修飾之CD4 +T細胞，其中該第二外源聚核苷酸區段具有SEQ ID NO: 2之序列。
- 如請求項30至34中任一項之經基因修飾之CD4 +T細胞，其中該第二調控元件驅動該IL-10之組成性或誘導性表現。
- 如請求項1至35中任一項之經基因修飾之CD4 +T細胞，其中該第二外源聚核苷酸區段整合於該T細胞核基因體中。
- 如請求項1至35中任一項之經基因修飾之CD4 +T細胞，其中該第二外源聚核苷酸區段未整合於該T細胞核基因體中。
- 如請求項36或37之經基因修飾之CD4 +T細胞，其中該第二外源聚核苷酸區段存在於載體中。
- 如請求項1至38中任一項之經基因修飾之CD4 +T細胞，其中該第一外源聚核苷酸區段及該第二外源聚核苷酸區段存在於同一載體中。
- 如請求項29、38或39中任一項之經基因修飾之CD4 +T細胞，其中該載體為病毒載體。
- 如請求項40之經基因修飾之CD4 +T細胞，其中該載體為慢病毒載體。
- 如請求項1至41中任一項之經基因修飾之CD4 +T細胞，其中以10 6個CD4 +T細胞/mL培養基計，該CD4 +T細胞組成性表現至少100 pg IL-10。
- 如請求項42之經基因修飾之CD4 +T細胞，其中以10 6個CD4 +T細胞/mL計，該CD4 +T細胞組成性表現至少100 pg、200 pg、500 pg、1 ng、5 ng、10 ng或50 ng IL-10。
- 如請求項1至43中任一項之經基因修飾之CD4 +T細胞，其中在用抗CD3及抗CD28抗體活化之後，以10 6個CD4 +T細胞/mL計，該CD4 +T細胞表現至少1 ng IL-10。
- 如請求項44之經基因修飾之CD4 +T細胞，其中在用抗CD3及抗CD28抗體活化之後，以10 6個CD4 +T細胞/mL計，該等CD4 +T細胞表現至少2 ng、5 ng、10 ng、100 ng、200 ng或500 ng IL-10。
- 如請求項1至45中任一項之經基因修飾之CD4 +T細胞，其中該CD4 +T細胞以比未修飾的CD4 +T細胞高至少5倍之量表現IL-10。
- 如請求項46之經基因修飾之CD4 +T細胞，其中該CD4 +T細胞以比未修飾的CD4 +T細胞高至少10倍之量表現IL-10。
- 如請求項1至47中任一項之經基因修飾之CD4 +T細胞，其中該第一外源聚核苷酸區段、第二外源聚核苷酸區段或兩者均進一步包含編碼選擇標記物的序列。
- 如請求項48之經基因修飾之CD4 +T細胞，其中該選擇標記物為ΔNGFR。
- 如請求項49之經基因修飾之CD4 +T細胞，其中該ΔNGFR具有SEQ ID NO: 3之序列。
- 如請求項50之經基因修飾之CD4 +T細胞，其中該第二外源聚核苷酸區段包含SEQ ID NO: 4之序列。
- 如請求項48之經基因修飾之CD4 +T細胞，其中該選擇標記物為EGFR多肽的截斷形式。
- 如請求項9至10或依附於請求項9之請求項13至52中任一項之經基因修飾之CD4 +T細胞，其中該CD4 +T細胞能夠對CD19 +目標細胞產生活體外細胞毒性。
- 如請求項9至10或依附於請求項9之請求項13至52中任一項之經基因修飾之CD4 +T細胞，其中該CD4 +T細胞能夠對CD19 +目標細胞產生活體內細胞毒性。
- 如請求項53或54之經基因修飾之CD4 +T細胞，其中該CD19 +目標細胞為產生自體抗體的B細胞。
- 如請求項53或54之經基因修飾之CD4 +T細胞，其中該CD19 +目標細胞為CD19 +癌細胞。
- 如請求項1至56中任一項之經基因修飾之CD4 +T細胞，其中該CD4 +T細胞能夠對骨髓目標細胞產生活體外細胞毒性。
- 如請求項1至56中任一項之經基因修飾之CD4 +T細胞，其中該CD4 +T細胞能夠對骨髓目標細胞產生活體內細胞毒性。
- 如請求項53至58中任一項之經基因修飾之CD4 +T細胞，其中該CD4 +T細胞能夠對CD19 +目標細胞及骨髓目標細胞產生細胞毒性。
- 如請求項57至59中任一項之經基因修飾之CD4 +T細胞，其中該骨髓目標細胞表現I類MHC、CD13、CD54及CD112中之一或多者。
- 如請求項53至60中任一項之經基因修飾之CD4 +T細胞，其中在一或多輪活體外再刺激之後，對CD19 +目標細胞維持細胞毒性。
- 如請求項53至60中任一項之經基因修飾之CD4 +T細胞，其中在一或多輪活體外再刺激之後，對骨髓目標細胞維持細胞毒性。
- 如請求項1至62中任一項之經基因修飾之CD4 +T細胞，其中該CD4 +T細胞能夠抑制同種異體CD4 +T細胞增殖。
- 如請求項1至63中任一項之經基因修飾之CD4 +T細胞，其中該CD4 +T細胞能夠抑制同種異體CD8 +T細胞增殖。
- 如請求項1至64中任一項之經基因修飾之CD4 +T細胞，其中該CD4 +T細胞能夠抑制同種異體CD4 +T細胞增殖、同種異體CD8 +T細胞增殖及同種異體PBMC。
- 如請求項63至65中任一項之經基因修飾之CD4 +T細胞，其中在一或多輪活體外再刺激之後，抑制特性得以維持。
- 一種CD4 +T細胞群，其包含如請求項1至66中任一項之經基因修飾之CD4 +細胞。
- 如請求項67之CD4 +T細胞群，其中該等CD4 +T細胞在基因修飾之前自一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個或十個T細胞供體獲得且彙集。
- 如請求項68之CD4 +T細胞群，其中該群體中的該等CD4 +T細胞總共具有六種、七種、八種、九種、十種、十一種、十二種或更多種不同HLA單倍型。
- 如請求項67至69中任一項之CD4 +T細胞群，其中該群體中的所有該等CD4 +T細胞在HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1及HLA-DQB1基因座彼此具有至少1/10、2/10、3/10、4/10、5/10、6/10、7/10、8/10或9/10匹配。
- 如請求項67至70中任一項之CD4 +T細胞群，其中該群體中的所有該等CD4 +T細胞在HLA-A、HLA-B、HLA-C及HLA-DRB1基因座彼此具有至少1/8、2/8、3/8、4/8、5/8、6/8、7/8或8/8匹配。
- 如請求項67至71中任一項之CD4 +T細胞群，其中該群體中的所有該等CD4 +T細胞在HLA-A基因座彼此具有2/2匹配。
- 如請求項67至72中任一項之CD4 +T細胞群，其中該群體中的所有該等CD4 +T細胞在HLA-B基因座彼此具有2/2匹配。
- 如請求項67至73中任一項之CD4 +T細胞群，其中該群體中的所有該等CD4 +T細胞在HLA-C基因座彼此具有2/2匹配。
- 如請求項67至74中任一項之CD4 +T細胞群，其中該群體中的所有該等CD4 +T細胞在HLA-DRB1及HLA-DQB1基因座彼此具有至少3/4或4/4匹配。
- 如請求項67至69中任一項之CD4 +T細胞群，其中該群體中的所有該等CD4 +T細胞在HLA-A、HLA-B、HLA C、HLA-DRB1及HLA-DQB1基因座彼此具有小於5/10、6/10、7/10、8/10或9/10匹配。
- 如請求項76之CD4 +T細胞群，其中該群體中的所有該等CD4 +T細胞在HLA-A、HLA-B、HLA C及HLA DRB1基因座彼此具有小於4/8、5/8、6/8、7/8或8/8匹配。
- 如請求項76至77中任一項之CD4 +T細胞群，其中該群體中的所有該等CD4 +T細胞在HLA-A基因座彼此具有小於2/2匹配。
- 如請求項76至78中任一項之CD4 +T細胞群，其中該群體中的所有該等CD4 +T細胞在HLA-B基因座彼此具有小於2/2匹配。
- 如請求項76至79中任一項之CD4 +T細胞群，其中該群體中的所有該等CD4 +T細胞在HLA-C基因座彼此具有小於2/2匹配。
- 如請求項76至80中任一項之CD4 +T細胞群，其中該群體中的所有該等CD4 +T細胞在HLA-DRB1及HLA DQB1基因座彼此具有小於2/4、3/4或4/4匹配。
- 如上述請求項67至81中任一項之CD4 +T細胞群，其中該群體中的所有該等CD4 +T細胞均具有A*02對偶基因或皆呈A*02陰性。
- 如上述請求項67至81中任一項之CD4 +T細胞群，其中該群體中的所有該等CD4 +T細胞均具有A*24對偶基因或皆呈A*24陰性。
- 如請求項67至83中任一項之CD4 +T細胞群，其中NGFR +細胞群內至少30%的該等CD4 +T細胞表現該CAR。
- 如請求項84之CD4 +T細胞群，其中該NGFR +細胞群內至少60%的該等CD4 +T細胞表現該CAR。
- 如請求項85之CD4 +T細胞群，其中該NGFR +細胞群內至少90%的該等CD4 +T細胞表現該CAR。
- 如請求項67至86中任一項之CD4 +T細胞群，其中該等CD4 +T細胞存在於冷凍懸浮液中。
- 如請求項67至86中任一項之CD4 +T細胞群，其中該等CD4 +T細胞存在於液體懸浮液中。
- 如請求項88之CD4 +T細胞群，其中該液體懸浮液先前已冷凍。
- 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至66中任一項之經基因修飾之CD4 +T細胞或如請求項67至89中任一項之CD4 +T細胞群。
- 一種製備經基因修飾之CD4 +T細胞(CD4 IL - 10 / CAR)細胞的方法，其包含以下步驟： (a)自一或多個T細胞供體獲得原代CD4 +T細胞；及 (b)藉由引入以下來修飾該等CD4 +T細胞 (i)編碼嵌合抗原受體(CAR)的第一外源聚核苷酸區段，及 (ii)編碼IL-10的第二外源聚核苷酸區段。
- 如請求項91之方法，其中在步驟(a)中，自兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個或十個不同T細胞供體獲得該等原代CD4 +T細胞。
- 如請求項92之方法，其進一步包含彙集來自步驟(b)的該等經基因修飾之CD4 +T細胞。
- 如請求項91之方法，其中在步驟(a)中，該等原代CD4 +T細胞對於患者而言為自體的。
- 如請求項91至94中任一項之方法，在步驟(a)之後且在步驟(b)之前，或在步驟(b)之後，該方法進一步包含以下步驟： 該等CD4 +T細胞在抗CD3抗體及抗CD28抗體或經抗CD3抗體及CD28抗體塗覆之珠粒存在下培育，或在聚合物奈米基質試劑存在下培育以經由CD3及CD28活化及擴增人類T細胞，或在其他T細胞特異性免疫細胞培養基、活化劑及補充劑存在下培育。
- 如請求項95之方法，進一步在IL-2存在下培育該等CD4 +T細胞。
- 如請求項91至96中任一項之方法，其中使用一或多個病毒載體將該第一外源聚核苷酸區段、第二外源聚核苷酸區段或兩者引入該等原代CD4 +T細胞中。
- 如請求項97之方法，其中該病毒載體為慢病毒載體。
- 如請求項91至98中任一項之方法，其中該CAR對與自體免疫疾病、發炎病症或癌症相關之目標抗原具有特異性。
- 如請求項99之方法，其中該目標抗原與自體免疫疾病、發炎病症或癌症相關。
- 如請求項91至100中任一項之方法，其中該CAR為抗CD19 CAR、抗CD20 CAR、抗CD22 CAR、抗BCMA CAR、抗B7-H3 CAR、抗CD27 CAR或抗CD38 CAR。
- 如請求項91至101中任一項之方法，其中該CAR具有SEQ ID NO: 9、16、22、34、41至49、或54之序列。
- 如請求項91至102中任一項之方法，其中該第一外源聚核苷酸區段具有SEQ ID NO: 10、17、23、35或55之序列。
- 如請求項91至103中任一項之方法，其中該IL-10具有SEQ ID NO: 1之序列。
- 如請求項91至104中任一項之方法，其中該第二外源聚核苷酸區段具有SEQ ID NO: 2之序列。
- 如請求項91至105中任一項之方法，其中該第一外源聚核苷酸區段、第二外源聚核苷酸區段或兩者均進一步包含編碼選擇標記物的區段。
- 如請求項106之方法，其中該經編碼之選擇標記物為ΔNGFR。
- 如請求項107之方法，其中該經編碼之選擇標記物具有SEQ ID NO: 3之序列。
- 如請求項106之方法，其中該選擇標記物為EGFR多肽的截斷形式。
- 如請求項91至109中任一項之方法，在步驟(b)之後，該方法進一步包含以下步驟： (c)分離出表現該選擇標記物之該等經基因修飾的CD4 +T細胞，藉此產生經富集的經基因修飾之CD4 +T細胞群。
- 如請求項110之方法，其中該富集群體中至少30%或至少60%的該等經基因修飾之CD4 +T細胞表現IL-10及該CAR。
- 如請求項111之方法，其中該富集群體中至少90%的該等經基因修飾之CD4 +T細胞表現IL-10及該CAR。
- 如請求項110至112中任一項之方法，其中該富集群體中至少75%的該等經基因修飾之CD4 +T細胞表現該選擇標記物。
- 如請求項113之方法，其中該富集群體中至少90%的該等經基因修飾之CD4 +T細胞表現該選擇標記物。
- 如請求項110至114中任一項之方法，其進一步包含在步驟(c)之後培育該經富集之經基因修飾之CD4 +T細胞群的步驟。
- 如請求項115之方法，其中培育該經富集之經基因修飾之CD4 +T細胞群的該步驟係在(i)抗CD3抗體及抗CD28抗體或(ii)經抗CD3抗體及抗CD28抗體塗覆之珠粒存在下、在IL-2存在下執行，或在聚合物奈米基質試劑存在下執行以經由CD3及CD28活化且擴增人類T細胞或(iii)在其他T細胞特異性免疫細胞培養基、活化劑及補充劑存在下執行。
- 如請求項91至116中任一項之方法，其進一步包含冷凍該等經基因修飾之CD4 +T細胞的後續步驟。
- 如請求項92至117中任一項之方法，其中該等至少兩個T細胞供體在HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1及HLA-DQB1基因座彼此具有至少1/10、2/10、3/10、4/10、5/10、6/10、7/10、8/10或9/10匹配。
- 如請求項92至118中任一項之方法，其中該等至少兩個T細胞供體在HLA-A、HLA-B、HLA-C及HLA-DRB1基因座彼此具有至少1/8、2/8、3/8、4/8、5/8、6/8、7/8或8/8匹配。
- 如請求項92至119中任一項之方法，其中該等至少兩個T細胞供體在HLA-A基因座彼此具有2/2匹配。
- 如請求項92至120中任一項之方法，其中該等至少兩個T細胞供體在HLA-B基因座彼此具有2/2匹配。
- 如請求項92至121中任一項之方法，其中該等至少兩個T細胞供體在HLA-C基因座彼此具有2/2匹配。
- 如請求項92至122中任一項之方法，其中該等至少兩個T細胞供體在HLA-DRB1及HLA-DQB1基因座彼此具有至少3/4或4/4匹配。
- 如請求項92至117中任一項之方法，其中該等至少兩個T細胞供體在HLA-A、HLA-B、HLA C、HLA-DRB1及HLA-DQB1基因座彼此具有小於5/10、6/10、7/10、8/10或9/10匹配。
- 如請求項124之方法，其中該等至少兩個T細胞供體在HLA-A、HLA-B、HLA C及HLA DRB1基因座彼此具有小於4/8、5/8、6/8、7/8或8/8匹配。
- 如請求項124至125中任一項之方法，其中該等至少兩個T細胞供體在HLA-A基因座彼此具有小於2/2匹配。
- 如請求項124至126中任一項之方法，其中該等至少兩個T細胞供體在HLA-B基因座彼此具有小於2/2匹配。
- 如請求項124至127中任一項之方法，其中該等至少兩個T細胞供體在HLA-C基因座彼此具有小於2/2匹配。
- 如請求項124至128中任一項之方法，其中該等至少兩個T細胞供體在HLA-DRB1及HLA DQB1基因座彼此具有小於2/4、3/4或4/4匹配。
- 如請求項92至129中任一項之方法，其中該等至少兩個T細胞供體中之每一者具有A*02對偶基因或呈A*02陰性。
- 如請求項92至129中任一項之方法，其中該等至少兩個T細胞供體中之每一者具有A*24對偶基因或呈A*24陰性。
- 如請求項92至131中任一項之方法，其中在步驟(a)中，自一或多個冷凍儲備液獲得該等原代CD4 +T細胞。
- 如請求項92至132中任一項之方法，其中在步驟(a)中，自該等至少兩個不同T細胞供體的未冷凍周邊血液單核細胞中獲得該等原代CD4 +T細胞。
- 如請求項133之方法，其進一步包含自該等周邊血液單核細胞中分離出CD4 +T細胞的步驟。
- 一種治療血液學癌症之方法，其包含： 將足以誘導抗癌作用之治療有效量的如請求項1至66中任一項之CD4 IL - 10 / CAR細胞、如請求項67至89中任一項之CD4 IL - 10 / CAR細胞群或如請求項90之醫藥組合物投與血液學癌症患者。
- 如請求項135之方法，其進一步包含在該CD4 IL - 10 / CAR投與之前或之後向該患者投與同種異體HSCT移植物的步驟。
- 一種治療患有惡性疾病之患者的方法，其包含： 向該患者投與同種異體HSCT移植物，及 投與治療有效量之如請求項1至66中任一項之CD4 IL - 10 / CAR細胞、如請求項67至89中任一項之CD4 IL - 10 / CAR細胞群或如請求項90之醫藥組合物。
- 如請求項137之方法，其中CD4 IL - 10 / CAR細胞的量進一步足以抑制或預防移植物抗宿主疾病(GvHD)，而不抑制該同種異體HSCT之移植物抗白血病(GvL)或移植物抗腫瘤(GvT)功效。
- 如請求項135至138中任一項之方法，其中該惡性疾病或血液學癌症為骨髓性白血病。
- 如請求項135至139中任一項之方法，其中該等CD4 IL - 10 / CAR細胞靶向且殺滅表現CD13之癌細胞。
- 如請求項135至140中任一項之方法，其中該等CD4 IL - 10 / CAR細胞靶向且殺滅表現I類HLA的癌細胞。
- 如請求項135至141中任一項之方法，其中該骨髓性白血病為急性骨髓性白血病(AML)。
- 如請求項135至138中任一項之方法，其中該惡性疾病或血液學癌症為CD19 +、CD20 +、CD22 +、BCMA +、CD27 +、CD38 +或B7-H3 +血液學癌症。
- 如請求項143之方法，其中該CD19 +、CD20 +、CD22 +、BCMA +、CD27 +、CD38 +或B7-H3 +血液學癌症係選自慢性淋巴球性白血病、急性淋巴母細胞白血病(ALL)及非霍奇金氏淋巴瘤。
- 如請求項136至144中任一項之方法，其中該同種異體HSCT移植物獲自與該患者相關或不相關的供體。
- 如請求項135至144中任一項之方法，其中該等CD4 IL - 10 / CAR細胞對於該患者而言為非自體的。
- 如請求項135至144中任一項之方法，其中該等CD4 IL - 10 / CAR細胞對於該患者而言為自體的。
- 如請求項135至144中任一項之方法，其中該等CD4 IL - 10 / CAR細胞對於該患者而言為同種異體的。
- 如請求項135至144中任一項之方法，其中該等CD4 IL - 10 / CAR細胞在投與該患者之前，對宿主同種異體抗原未失能。
- 如請求項135至144中任一項之方法，其中該等CD4 IL - 10 / CAR細胞為Tr1樣細胞。
- 如請求項135至144中任一項之方法，其中該等CD4 IL - 10 / CAR細胞為多株的。
- 如請求項135至144中任一項之方法，其中該等CD4 IL - 10 / CAR細胞為多株的且對於該患者而言為非自體的。
- 如請求項135至144中任一項之方法，其中該等CD4 IL - 10 / CAR細胞為多株的且對於該患者而言為自體的。
- 如請求項135至144中任一項之方法，其中在對該等CD4 IL - 10 / CAR細胞進行基因修飾之前，自至少兩個供體分離出該等細胞。
- 如請求項154之方法，其中該等至少兩個供體中無一者為與該同種異體HSCT供體相同的供體。
- 如請求項135至155中任一項之方法，其中該同種異體HSCT移植物獲自與該患者匹配或錯配的供體。
- 如請求項135至156中任一項之方法，其中該等CD4 IL - 10 / CAR細胞靶向且殺滅表現CD19、CD20或BCMA之細胞。
- 如請求項135至157中任一項之方法，其中該等CD4 IL - 10 / CAR細胞靶向且殺滅表現CD54的細胞。
- 如請求項135至158中任一項之方法，其中該等CD4 IL - 10 / CAR細胞靶向且殺滅表現I類HLA及CD54的癌細胞。
- 如請求項135至159中任一項之方法，其中該等CD4 IL - 10 / CAR細胞靶向且殺滅表現CD112及CD155之癌細胞。
- 如請求項135至160中任一項之方法，其中該等CD4 IL - 10 / CAR細胞靶向且殺滅表現CD58之癌細胞。
- 如請求項135至161中任一項之方法，其中該等CD4 IL - 10 / CAR細胞靶向且殺滅該患者中的癌細胞。
- 如請求項135至162中任一項之方法，其中該等CD4 IL - 10 / CAR細胞靶向且殺滅該患者中的實體腫瘤細胞。
- 如請求項136至163中任一項之方法，其中該等CD4 IL - 10 / CAR細胞抑制同種異體CD4 +T細胞增殖。
- 如請求項136至164中任一項之方法，其中該等CD4 IL - 10 / CAR細胞抑制同種異體CD8 +T細胞增殖。
- 如請求項136至163中任一項之方法，其中該等CD4 IL - 10 / CAR細胞抑制同種異體CD4 +T細胞增殖、同種異體CD8 +T細胞增殖及PBMC。
- 一種藉由同種異體造血幹細胞移植體(同種異體HSCT)治療血液學癌症之方法，其包含： 向患者投與同種異體HSCT移植物； 將一量之CD4 IL - 10 / CAR細胞投與該患者，視情況其中該量足以抑制或預防移植物抗宿主疾病(GvHD)而不抑制該同種異體HSCT移植物之移植物抗白血病(GvL)或移植物抗腫瘤(GvT)功效， 其中該等CD4 IL - 10 / CAR細胞包含藉由載體介導處於組成型或誘導型啟動子控制下之人類IL-10編碼序列之基因轉移及載體介導處於組成型或誘導型啟動子控制下之CAR編碼序列之基因轉移而經基因修飾的CD4 +T細胞； 其中該等CD4 IL - 10 / CAR細胞靶向且殺滅該患者中的癌細胞； 其中該等CD4 IL - 10 / CAR細胞在投與該患者之前，對宿主同種異體抗原未失能；及 其中該等CD4 IL - 10 / CAR細胞對於該患者而言為非自體的且為Tr1樣的。
- 一種藉由同種異體造血幹細胞移植體(同種異體HSCT)治療血液學癌症之方法，其包含： 向患者投與同種異體HSCT移植物； 將一量之CD4 IL - 10 / CAR細胞投與該患者，視情況其中該量足以抑制或預防移植物抗宿主疾病(GvHD)而不抑制該同種異體HSCT移植物之移植物抗白血病(GvL)或移植物抗腫瘤(GvT)功效， 其中該等CD4 IL - 10 / CAR細胞包含藉由載體介導處於組成型或誘導型啟動子控制下之人類IL-10編碼序列之基因轉移及載體介導處於組成型或誘導型啟動子控制下之CAR編碼序列之基因轉移而經基因修飾的CD4 +T細胞； 其中該等CD4 IL - 10 / CAR細胞靶向且殺滅該患者中的癌細胞； 其中該等CD4 IL - 10 / CAR細胞在投與該患者之前，對宿主同種異體抗原未失能；及 其中該等CD4 IL - 10 / CAR細胞對於該患者而言為自體的且為Tr1樣的。
- 一種用於預防患者之CD19 +或CD20 +、CD22 +、BCMA +、CD27 +、CD38 +或B7-H3 +血液學癌症復發的方法，其包含： 將治療有效量之如請求項1至66中任一項之CD4 IL - 10 / CAR細胞、如請求項67至89中任一項之CD4 IL - 10 / CAR細胞群或如請求項90之醫藥組合物投與經鑑別處於CD19 +、CD20 +、CD22 +、BCMA +、CD27 +、CD38 +或B7-H3 +血液學癌症復發風險中之患者，其中該治療有效量足以誘導抗癌作用。
- 一種用於預防患者之B7-H3 +癌症復發的方法，其包含： 將足以誘導抗癌作用之治療有效量的如請求項1至66中任一項之CD4 IL - 10 / CAR細胞、如請求項67至89中任一項之CD4 IL - 10 / CAR細胞群或如請求項90之醫藥組合物投與經鑑別患有B7-H3 +癌症的患者。
- 如請求項170之方法，其中該B7-H3 +癌症為實體腫瘤。
- 如請求項171之方法，其中該實體腫瘤係選自由以下組成之群：乳癌、腦癌、肺癌、肝癌、胃癌、脾癌、大腸癌、腎癌、胰臟癌、前列腺癌、子宮癌、皮膚癌、頭癌、頸癌、肉瘤、神經母細胞瘤及卵巢癌。
- 一種用於治療患有微量殘存疾病之癌症患者的方法，其包含： 將治療有效量之如請求項1至66中任一項之CD4 IL - 10 / CAR細胞、如請求項67至89中任一項之CD4 IL - 10 / CAR細胞群或如請求項90之醫藥組合物投與經鑑別患有微量殘存疾病或處於患有微量殘存疾病風險中的患者，其中該治療有效量足以誘導抗癌作用。
- 一種治療患者的方法，其包含： 將治療有效量之如請求項1至66中任一項之CD4 IL - 10 / CAR細胞、如請求項67至89中任一項之CD4 IL - 10 / CAR細胞群或如請求項90之醫藥組合物投與需要免疫耐受之患者。
- 如請求項174之方法，其進一步包含將CD4 IL - 10 / CAR細胞或CD4 IL - 10 / CAR細胞群之冷凍懸浮液解凍的先行步驟。
- 如請求項174或175之方法，其中該患者患有發炎或自體免疫疾病。
- 如請求項176之方法，其中該發炎或自體免疫疾病係選自由以下組成之群：1型糖尿病、自體免疫葡萄膜炎、自體免疫肝炎、類風濕性關節炎、牛皮癬、牛皮癬性關節炎、白斑病、斑禿、多發性硬化症、全身狼瘡、發炎性腸病、艾迪森氏病(Addison's disease)、葛瑞夫茲氏病(Graves' disease)、休格連氏症候群(Sjögren's syndrome)、橋本氏甲狀腺炎(Hashimoto's thyroiditis)、重症肌無力、自體免疫血管炎、惡性貧血、潰瘍性大腸炎、大皰性疾病、硬皮病及乳糜瀉。
- 如請求項177之方法，其中該發炎或自體免疫疾病為克羅恩氏病(Crohn's disease)、潰瘍性大腸炎、乳糜瀉、1型糖尿病、狼瘡、牛皮癬、牛皮癬性關節炎、關節黏連性脊椎炎或類風濕性關節炎。
- 如請求項174之方法，其中該患者患有涉及NLPR3發炎體高度活化的疾病或病症。
- 如請求項174之方法，其中該患者患有2型糖尿病、神經退化性疾病、心血管疾病或發炎性腸病。
- 如請求項174之方法，其中該患者患有涉及活化單核球、巨噬細胞或樹突狀細胞之IL-1β產生增加的疾病或病症。
- 如請求項174之方法，其中該患者患有涉及活化單核球、巨噬細胞或樹突狀細胞之IL-18產生增加的疾病或病症。
- 如請求項174之方法，其中該患者患有涉及活化單核球、巨噬細胞或樹突狀細胞之成熟凋亡蛋白酶1產生增加的疾病或病症。
- 如請求項174之方法，其中該患者患有過敏性或異位性疾病。
- 如請求項184之方法，其中該過敏性或異位性疾病係選自由以下組成之群：哮喘、異位性皮炎及鼻炎。
- 如請求項174之方法，其中該患者具有食物過敏。
- 如請求項174之方法，其中該患者患有實體腫瘤。
- 如請求項187之方法，其中該實體腫瘤係選自由以下組成之群：乳癌、腦癌、肺癌、肝癌、胃癌、脾癌、大腸癌、腎癌、胰臟癌、前列腺癌、子宮癌、皮膚癌、頭癌、頸癌、肉瘤、神經母細胞瘤及卵巢癌。
- 如請求項174之方法，其進一步包含在投與該等CD4 IL - 10 / CAR細胞、該CD4 IL - 10 / CAR細胞群或該醫藥組合物之前或之後將器官移植至該患者的步驟。
- 如請求項189之方法，其中該等CD4 IL - 10 / CAR細胞、該CD4 IL - 10 / CAR細胞群或該醫藥組合物預防該器官移植之宿主排斥反應或降低該宿主排斥反應的嚴重程度。
- 如請求項174之方法，其進一步包含在投與該等CD4 IL - 10 / CAR細胞、該CD4 IL - 10 / CAR細胞群或該醫藥組合物之前或之後將iPS細胞衍生的細胞或組織移植至該患者的步驟。
- 如請求項191之方法，其中該等CD4 IL - 10 / CAR細胞、該CD4 IL - 10 / CAR細胞群或該醫藥組合物預防該細胞移植之宿主排斥反應或降低該宿主排斥反應的嚴重程度。
- 如請求項174之方法，其進一步包含在投與該等CD4 IL - 10 / CAR細胞、該CD4 IL - 10 / CAR細胞群或該醫藥組合物之前或之後將重組AAV投與該患者的步驟。
- 如請求項193之方法，其中該等CD4 IL - 10 / CAR細胞、該CD4 IL - 10 / CAR細胞群或該醫藥組合物減少針對該重組AAV的免疫反應。
- 如請求項174之方法，其進一步包含在投與該等CD4 IL - 10 / CAR細胞、該CD4 IL - 10 / CAR細胞群或該醫藥組合物之前或之後將除AAV之外的重組病毒載體投與該患者的步驟。
- 如請求項195之方法，其中該等CD4 IL - 10 / CAR細胞、該CD4 IL - 10 / CAR細胞群或該醫藥組合物減少針對除AAV之外之該重組病毒載體的免疫反應。
- 如請求項196之方法，其進一步包含在投與該等CD4 IL - 10 / CAR細胞、該CD4 IL - 10 / CAR細胞群或該醫藥組合物之前或之後，向該患者投與免疫原性治療蛋白。
- 如請求項197之方法，其中該等CD4 IL - 10 / CAR細胞、該CD4 IL - 10 / CAR細胞群或該醫藥組合物減少針對該免疫原性治療蛋白的免疫反應。
- 如請求項197或198之方法，其中該免疫原性治療蛋白係選自治療抗體、因子VIII替代品、細胞介素及細胞介素突變蛋白。
- 如請求項174之方法，其中該患者對病毒或細菌感染具有過度的免疫反應。
- 如請求項200之方法，其中該患者具有冠狀病毒感染。
- 如請求項174之方法，其進一步包含偵測獲自該患者之生物樣品中之選擇標記物的步驟，藉此偵測CD4 IL - 10 / CAR細胞的存在或不存在。
- 如請求項202之方法，其中該生物樣品為來自該患者之生檢或血液。
- 一種治療或抑制患者之自體免疫疾病、過敏性疾病或發炎疾病的方法，其包含： 將足以治療或抑制該自體免疫疾病、過敏性疾病或發炎疾病之治療有效量的如請求項1至52中任一項之CD4 IL - 10 / CAR細胞、如請求項67至89中任一項之CD4 IL - 10 / CAR細胞群或如請求項90之醫藥組合物投與經鑑別患有自體免疫疾病、過敏性疾病或發炎疾病的患者。
- 一種用於減少移植有造血幹細胞、骨髓細胞、臍帶血細胞、組織幹細胞或實體器官之患者之移植排斥反應的方法，其包含： 將足以減少移植排斥反應之治療有效量的如請求項1至66中任一項之CD4 IL - 10 / CAR細胞、如請求項67至89中任一項之CD4 IL - 10 / CAR細胞群或如請求項90之醫藥組合物投與經鑑別具有所移植造血幹細胞、骨髓細胞或實體器官之排斥反應的患者。
- 一種用於治療患者之移植物抗宿主疾病(GvHD)的方法，其包含： 將足以抑制或預防GvHD之治療有效量的如請求項1至66中任一項之CD4 IL - 10 / CAR細胞、如請求項67至89中任一項之CD4 IL - 10 / CAR細胞群或如請求項90之醫藥組合物投與經鑑別患有移植物抗宿主疾病(GvHD)或處於患有移植物抗宿主疾病(GvHD)風險中的患者。
- 如請求項206之方法，其中該移植物抗宿主疾病(GvHD)包含急性GvHD。
- 如請求項206之方法，其中該移植物抗宿主疾病(GvHD)包含慢性GvHD。
- 一種用於治療患者之組織或器官損傷的方法，其包含： 將足以誘導組織或器官損傷修復之治療有效量的如請求項1至66中任一項之CD4 IL - 10 / CAR細胞、如請求項67至89中任一項之CD4 IL - 10 / CAR細胞群或如請求項90之醫藥組合物投與經鑑別具有組織或器官損傷或處於具有組織或器官損傷風險中的患者。
- 一種聚核苷酸構築體，其包含： (a)編碼嵌合抗原受體(CAR)的第一聚核苷酸區段；及 (b)編碼介白素-10 (IL-10)的第二聚核苷酸區段。
- 如請求項210之聚核苷酸構築體，其中該第一聚核苷酸區段包含可操作地連接至該CAR之編碼序列的第一調控元件。
- 如請求項211之聚核苷酸構築體，其中該第一調控元件驅動該CAR之組成性表現。
- 如請求項210至212中任一項之聚核苷酸構築體，其中該第二聚核苷酸區段包含可操作地連接至該IL-10之編碼序列的第二調控元件。
- 如請求項213之聚核苷酸構築體，其中該第二調控元件驅動該IL-10之組成性表現。
- 如請求項210至214中任一項之聚核苷酸構築體，其進一步包含介於該第一聚核苷酸區段與該第二聚核苷酸區段之間的內部核糖體進入位點(IRES)或自裂解肽。
- 如請求項215之聚核苷酸構築體，其中該自裂解肽選自由F2A、P2A、T2A及E2A組成之群。
- 如請求項210至216中任一項之聚核苷酸構築體，其中該CAR包含抗原結合域、鉸鏈區、跨膜域及胞內信號傳導域。
- 如請求項217之聚核苷酸構築體，其中該抗原結合域包含單鏈抗體片段。
- 如請求項218之聚核苷酸構築體，其中該單鏈抗體片段包含單鏈Fv (scFv)。
- 如請求項210至219中任一項之聚核苷酸構築體，其中該抗原結合域靶向與自體免疫疾病、發炎病症或癌症有關的抗原。
- 如請求項220之聚核苷酸構築體，其中該抗原係選自由以下組成之群：CD19、CD20、CD22、BCMA、CD27、CD38、CEA、B7-H3、CD23、Lyml、Lym2、CLEC5A、CDH179b、FLT3、GCC、Muc、CSF2RA、GFRa4、CD32、CD33、IL1lRa、IL13Ra、NYBRI、SLea、CD200R、TGFBetaR2、CD276、TROP2、LAMP1、PTK7、DLL3、CDH1、CDH6、CDH17、CDH19、TSHR、酪胺酸酶、HLA-A*02、HLA-A*24、瓜胺酸化肽、胰島素、MOG、GAD65、IA2、麥膠蛋白及橋粒醣蛋白。
- 如請求項210至221中任一項之聚核苷酸構築體，其中該抗原結合域為抗CD19抗原結合域。
- 如請求項222之聚核苷酸構築體，其中該抗CD19抗原結合域具有SEQ ID NO: 11之序列。
- 如請求項210至221中任一項之聚核苷酸構築體，其中該抗原結合域為抗BCMA抗原結合域。
- 如請求項224之聚核苷酸構築體，其中該抗BCMA抗原結合域具有SEQ ID NO: 41-49或54中之任一者的序列。
- 如請求項210至225中任一項之聚核苷酸構築體，其中該鉸鏈區選自人類CD8α鉸鏈區、人類CD28鉸鏈區、IgG1鉸鏈區或IgG4鉸鏈區。
- 如請求項226之聚核苷酸構築體，其中該鉸鏈區源於人類CD8α。
- 如請求項210至227中任一項之聚核苷酸構築體，其中該跨膜域選自TNFRSF 19跨膜域、CD3ζ跨膜域、CD8α跨膜域、CD4跨膜域、CD28跨膜域或B7家族誘導型共刺激(ICOS)跨膜域。
- 如請求項228之聚核苷酸構築體，其中該跨膜域源於CD8α。
- 如請求項210至229中任一項之聚核苷酸構築體，其中該CAR進一步包含一或多個共刺激域。
- 如請求項230之聚核苷酸構築體，其中該CAR包含兩個共刺激域。
- 如請求項210至231中任一項之聚核苷酸構築體，其中該一或多個共刺激域係選自由以下組成之群：4-1BB、CD28、OX40、ICOS、CD27、MYD88-CD40及KIR2DS2。
- 如請求項232之聚核苷酸構築體，其中該一或多個共刺激域中之一者源於CD28。
- 如請求項231至233中任一項之聚核苷酸構築體，其中第二共刺激域源於4-1BB。
- 如請求項210至234中任一項之聚核苷酸構築體，其中該胞內信號傳導域包含基於酪胺酸之免疫受體活化模體(ITAM)。
- 如請求項210至235中任一項之聚核苷酸構築體，該基於酪胺酸之免疫受體活化模體(ITAM)源於CD3ζ。
- 如請求項210至236中任一項之聚核苷酸構築體，其中該CAR包含： 抗CD19抗原結合域、抗BCMA抗原結合域或抗CD20抗原結合域； 人類CD8鉸鏈區； CD8跨膜區； CD28共刺激域；及 CD3ζ鏈胞內信號傳導域。
- 如請求項210至237中任一項之聚核苷酸構築體，其中該CAR包含SEQ ID NO: 9、16、22、34、41-49或54之序列。
- 如請求項238之聚核苷酸構築體，其中該第一聚核苷酸區段包含SEQ ID NO: 10、17、23、35或55之序列。
- 如請求項210至239中任一項之聚核苷酸構築體，其中該IL-10為人類IL-10。
- 如請求項210至239中任一項之聚核苷酸構築體，其中該IL-10為病毒IL-10。
- 如請求項210至239中任一項之聚核苷酸構築體，其中該IL-10為具有SEQ ID NO: 1之序列的蛋白質。
- 如請求項242之聚核苷酸構築體，其中該第二聚核苷酸區段具有SEQ ID NO: 2之序列。
- 如請求項210至243中任一項之聚核苷酸構築體，其中該第一聚核苷酸區段或該第二聚核苷酸區段進一步包含編碼選擇標記物的序列。
- 如請求項244之聚核苷酸構築體，其中該選擇標記物為ΔNGFR。
- 如請求項245之聚核苷酸構築體，其中該ΔNGFR具有SEQ ID NO: 3之序列。
- 如請求項245之聚核苷酸構築體，其中該聚核苷酸構築體包含SEQ ID NO: 4之序列。
- 如請求項244至247中任一項之聚核苷酸構築體，其中該選擇標記物為EGFR多肽的截斷形式。
- 如請求項210至248中任一項之聚核苷酸構築體，其中該構築體為載體。
- 如請求項249之聚核苷酸構築體，其中該載體為病毒載體。
- 如請求項250之聚核苷酸構築體，其中該載體為慢病毒載體。
- 一種聚核苷酸構築體，其包含： (a)具有SEQ ID NO: 10、17、23、35或55之序列的第一聚核苷酸區段；及 (b)具有SEQ ID NO: 2之序列的第二聚核苷酸區段。
- 一種聚核苷酸構築體，其包含： (a)具有SEQ ID NO: 10、17、23、35或55之序列的第一聚核苷酸區段； (b)具有SEQ ID NO: 2之序列的第二聚核苷酸區段；及 (c)第三聚核苷酸區段，其具有SEQ ID NO: 33之序列且介於該第一聚核苷酸區段與該第二聚核苷酸區段之間。
- 一種聚核苷酸構築體，其包含： (a)具有SEQ ID NO: 10、17、23、35或55之序列的第一聚核苷酸區段； (b)具有SEQ ID NO: 2之序列的第二聚核苷酸區段； (c)第三聚核苷酸區段，其具有SEQ ID NO: 27之序列且介於該第一聚核苷酸區段與該第二聚核苷酸區段之間；及 (d)具有SEQ ID NO: 4之序列的第四聚核苷酸區段。
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