TW202140530A - 前列腺特異性膜抗原car及其使用方法 - Google Patents

前列腺特異性膜抗原car及其使用方法 Download PDF

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趙陽兵
思華 林
劉曉軍
安 周
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賓夕法尼亞大學董事會
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Abstract

本揭示提供經修飾的免疫細胞(例如，經修飾的T細胞)，其包含對前列腺特異性膜抗原(PSMA)(例如，人類PSMA)具有親和力的嵌合抗原受體(CAR)。本揭示提供經修飾的免疫細胞(例如，經修飾的T細胞)，其包含對PSMA具有親和力的CAR和顯性負性受體及/或開關受體。本揭示提供經修飾的免疫細胞(例如，經修飾的T細胞)，其包含對PSMA具有親和力的CAR和顯性負性受體及/或開關受體，其中經修飾的細胞能夠表現並分泌雙特異性抗體。

Description

前列腺特異性膜抗原CAR及其使用方法
本申請根據35 U.S.C.§365(b)有權享有於2019年3月5日申請的國際申請PCT/US2019/020729(其特此藉由引用以其整體併入本文)的優先權。
本案係關於前列腺特異性膜抗原CAR及其使用方法。
打破對自身抗原的耐受性是實體惡性腫瘤免疫療法應用的一大挑戰。旨在利用內源性抗腫瘤T細胞的疫苗策略受到T細胞受體(TCR)庫的限制，T細胞受體庫作為中樞耐受的部分可在胸腺內被刪除，或由於周邊耐受的胸腺後機制而失去功能。克服這些障礙的一個策略是利用嵌合抗原受體(CAR)方法產生重新定向於腫瘤抗原的基因工程改造的T細胞。CART細胞利用轉導有嵌合受體基因的基因程序化的患者來源的淋巴細胞，將特異性抗體的抗原識別結構域與TCR的信號傳導結構域結合起來。
前列腺特異性膜抗原(PSMA)是一種表現於細胞表面的膜結合蛋白，並且據報道在前列腺癌組織中高度過表現。PSMA表現與腫瘤的分級和分期直接相關，並且被認為賦予前列腺癌細胞選擇性生長優勢。由此，PSMA可能是前列腺癌免疫療法的理想目標。
癌症免疫療法的另一個主要挑戰是靶向的腫瘤所處的不利微環境。例如，與PD1(CD279)結合的免疫抑制受體配體，如PDL1(CD274)，在腫瘤微環境中上調並負向調節T細胞活性。此外，在前列腺腫瘤細胞中過表現的TGF-β可充當免疫抑制分子。
因此，本領域需要針對PSMA的新型癌症免疫療法。本發明滿足了這一需要。
本發明基於發現了人源化前列腺特異性膜抗原(PSMA)嵌合抗原受體(CAR)T細胞表現出強力的抗腫瘤活性。本發明還基於發現了包含顯性負性受體(dominant negative receptor)及/或開關受體的PSMA-CART細胞表現出顯著增強的抗腫瘤活性。
因此，在某些方面中，本揭示提供了經修飾的免疫細胞或其前體細胞，其包含：(a)能夠結合前列腺特異性膜抗原(PSMA)的嵌合抗原受體(CAR)，包含抗原結合結構域、跨膜結構域和細胞內結構域，其中抗原結合結構域包含：包含SEQ ID NO：183的共通序列的重鏈可變區(VH)；和包含SEQ ID NO：184的共通序列的輕鏈可變區(VL)；和(b)顯性負性受體及/或開關受體。
在某些例示性實施方式中，VH包含SEQ ID NO：191的序列。在某些例示性實施方式中，VL包含SEQ ID NO：192的序列。
在某些例示性實施方式中，抗原結合結構域包含抗體或其抗原結合片段。在某些例示性實施方式中，抗原結合片段選自Fab、單鏈可變區片段(scFv)、或單結構域抗體。
在某些例示性實施方式中，跨膜結構域包含源自CD8的跨膜區。在某些例示性實施方式中，源自CD8的跨膜區包含SEQ ID NO：88中列出的胺基酸序列。在某些例示性實施方式中，跨膜結構域進一步包含源自CD8的鉸鏈區。在某些例示性實施方式中，源自CD8的鉸鏈區包含SEQ ID NO：86中列出的胺基酸序列。
在某些例示性實施方式中，細胞內結構域包含4-1BB信號傳導結構域和CD3 ζ信號傳導結構域。在某些例示性實施方式中，細胞內結構域包含ICOS信號傳導結構域和CD3 ζ信號傳導結構域。在某些例示性實施方式中，細胞內結構域包含變體ICOS信號傳導結構 域和CD3 ζ信號傳導結構域。在某些例示性實施方式中，4-1BB信號傳導結構域包含SEQ ID NO：92中列出的胺基酸序列。在某些例示性實施方式中，ICOS信號傳導結構域包含SEQ ID NO：203中列出的胺基酸序列。在某些例示性實施方式中，變體ICOS信號傳導結構域包含SEQ ID NO：95中列出的胺基酸序列。在某些例示性實施方式中，CD3 ζ信號傳導結構域包含SEQ ID NO：97或100中列出的胺基酸序列。
在某些例示性實施方式中，顯性負性受體是與負信號關聯的野生型蛋白質的截短變體。在某些例示性實施方式中，與負信號關聯的野生型蛋白質的截短變體包含SEQ ID NO：115中列出的胺基酸序列。
在某些例示性實施方式中，開關受體包含：第一結構域，其中第一結構域源自與負信號關聯的第一多肽；和第二結構域，其中第二結構域源自與正信號關聯的第二多肽。在某些例示性實施方式中，第一結構域包含與負信號關聯的第一多肽的細胞外結構域的至少一部分，並且其中第二結構域包含與正信號關聯的第二多肽的細胞內結構域的至少一部分。在某些例示性實施方式中，開關受體進一步包含開關受體跨膜結構域。在某些例示性實施方式中，開關受體跨膜結構域包含：與負信號關聯的第一多肽的跨膜結構域；或與正信號關聯的第二多肽的跨膜結構域。
在某些例示性實施方式中，與負信號關聯的第一多肽選自CTLA4、PD-1、BTLA、TIM-3、和TGFβR。在某些例示性實施方式中，與正信號關聯的第二多肽選自CD28、ICOS、4-1BB、和IL-12R。
在某些例示性實施方式中，開關受體包含：第一結構域，包含PD1的細胞外結構域的至少一部分；開關受體跨膜結構域，包含CD28的跨膜結構域的至少一部分；和第二結構域，包含CD28的細胞內結構域的至少一部分。在某些例示性實施方式中，開關受體包含SEQ ID NO：117中列出的胺基酸序列。
在某些例示性實施方式中，開關受體包含：第一結構域， 包含PD1的細胞外結構域的至少一部分；開關受體跨膜結構域，包含PD1的跨膜結構域的至少一部分；和第二結構域，包含CD28的細胞內結構域的至少一部分。在某些例示性實施方式中，開關受體包含SEQ ID NO：119中列出的胺基酸序列。
在某些例示性實施方式中，第一結構域包含PD1的細胞外結構域的至少一部分，PD1的細胞外結構域包含在胺基酸位置132處丙胺酸(A)至亮胺酸(L)的取代。在某些例示性實施方式中，開關受體包含SEQ ID NO：121中列出的胺基酸序列。
在某些例示性實施方式中，開關受體包含：包含PD1的細胞外結構域的至少一部分的第一結構域，PD1的細胞外結構域包含在胺基酸位置132處丙胺酸(A)至亮胺酸(L)的取代；和包含CD28的細胞內結構域的至少一部分的第二結構域。在某些例示性實施方式中，開關受體包含SEQ ID NO：121中列出的胺基酸序列。
在某些例示性實施方式中，開關受體包含：包含PD1的細胞外結構域的至少一部分的第一結構域，PD1的細胞外結構域包含在胺基酸位置132處丙胺酸(A)至亮胺酸(L)的取代；和包含4-1BB的細胞內結構域的至少一部分的第二結構域。在某些例示性實施方式中，開關受體包含SEQ ID NO：215中列出的胺基酸序列。
在某些例示性實施方式中，開關受體包含：第一結構域，包含TIM-3的細胞外結構域的至少一部分；和第二結構域，包含CD28的細胞內結構域的至少一部分。在某些例示性實施方式中，開關受體包含SEQ ID NO：127中列出的胺基酸序列。
在某些例示性實施方式中，開關受體包含：第一結構域，包含TGFβR的細胞外結構域的至少一部分；和第二結構域，包含IL12Rα1的細胞內結構域的至少一部分。在某些例示性實施方式中，開關受體包含SEQ ID NO：123中列出的胺基酸序列。
在某些例示性實施方式中，開關受體包含：第一結構域，包含TGFβR的細胞外結構域的至少一部分；和第二結構域，包含 IL12Rβ1的細胞內結構域的至少一部分。在某些例示性實施方式中，開關受體包含SEQ ID NO：125中列出的胺基酸序列。
另一方面，本揭示提供了經修飾的免疫細胞或其前體細胞，其包含：嵌合抗原受體(CAR)，對目標細胞上的前列腺特異性膜抗原(PSMA)具有親和力，其中CAR包含PSMA結合結構域，PSMA結合結構域包含：包含SEQ ID NO：191的序列的重鏈可變區(VH)；和包含SEQ ID NO：192的序列的輕鏈可變區(VL)；和顯性負性受體，包含SEQ ID NO：115中列出的胺基酸序列。
另一方面，本揭示提供了經修飾的免疫細胞或其前體細胞，其包含：嵌合抗原受體(CAR)，對目標細胞上的前列腺特異性膜抗原(PSMA)具有親和力，其中CAR包含PSMA結合結構域，PSMA結合結構域包含：包含SEQ ID NO：191的序列的重鏈可變區(VH)；和包含SEQ ID NO：192的序列的輕鏈可變區(VL)；和開關受體，包含SEQ ID NO：213或215中列出的胺基酸序列。
另一方面，本揭示提供了經修飾的免疫細胞或其前體細胞，其包含：嵌合抗原受體(CAR)，對目標細胞上的前列腺特異性膜抗原(PSMA)具有親和力，其中CAR包含PSMA結合結構域，PSMA結合結構域包含：包含序列SEQ ID NO：191的重鏈可變區(VH)；和包含SEQ ID NO：192的序列的輕鏈可變區(VL)；和開關受體，包含SEQ ID NO：117或119中列出的胺基酸序列。
另一方面，本揭示提供了經修飾的免疫細胞或其前體細胞，其包含：嵌合抗原受體(CAR)，對目標細胞上的前列腺特異性膜抗原(PSMA)具有親和力，其中CAR包含PSMA結合結構域，PSMA結合結構域包含：包含SEQ ID NO：191的序列的重鏈可變區(VH)；和包含SEQ ID NO：192的序列的輕鏈可變區(VL)；和開關受體，包含SEQ ID NO：121中列出的胺基酸序列。
另一方面，本揭示提供了經修飾的免疫細胞或其前體細胞，其包含：嵌合抗原受體(CAR)，對目標細胞上的前列腺特異性膜 抗原(PSMA)具有親和力，其中CAR包含PSMA結合結構域，PSMA結合結構域包含：包含SEQ ID NO：191的序列的重鏈可變區(VH)；和包含SEQ ID NO：192的序列的輕鏈可變區(VL)；和開關受體，包含SEQ ID NO：127中列出的胺基酸序列。
另一方面，本揭示提供了經修飾的免疫細胞或其前體細胞，其包含：嵌合抗原受體(CAR)，對目標細胞上的前列腺特異性膜抗原(PSMA)具有親和力，其中CAR包含PSMA結合結構域，PSMA結合結構域包含：包含SEQ ID NO：191的序列的重鏈可變區(VH)；和包含SEQ ID NO：192的序列的輕鏈可變區(VL)；和開關受體，包含SEQ ID NO：123中列出的胺基酸序列。
另一方面，本揭示提供了經修飾的免疫細胞或其前體細胞，其包含：嵌合抗原受體(CAR)，對目標細胞上的前列腺特異性膜抗原(PSMA)具有親和力，其中CAR包含PSMA結合結構域，PSMA結合結構域包含：包含SEQ ID NO：191的序列的重鏈可變區(VH)；和包含SEQ ID NO：192的序列的輕鏈可變區(VL)；和開關受體，包含SEQ ID NO：125中列出的胺基酸序列。
在某些例示性實施方式中，經修飾的細胞是經修飾的T細胞。在某些例示性實施方式中，經修飾的T細胞是自體細胞。在某些例示性實施方式中，經修飾的T細胞是同種異體細胞。在某些例示性實施方式中，經修飾的細胞是細胞毒性T淋巴細胞(CTL)。在某些例示性實施方式中，經修飾的細胞源自人類細胞。
另一方面，本揭示提供了單離的核酸，其包含：(a)第一核酸序列，編碼能夠結合前列腺特異性膜抗原(PSMA)的嵌合抗原受體(CAR)，嵌合抗原受體(CAR)包含抗原結合結構域、跨膜結構域、和細胞內結構域，其中抗原結合結構域包含：包含SEQ ID NO：183的共通序列的重鏈可變區(VH)；和包含SEQ ID NO：184的共通序列的輕鏈可變區(VL)；和(b)第二核酸序列，編碼顯性負性受體及/或開關受體。
在某些例示性實施方式中，VH包含SEQ ID NO：191的序列。在某些例示性實施方式中，VL包含SEQ ID NO：192的序列。
在某些例示性實施方式中，第一核酸序列包含SEQ ID NO：246、248、250、252、254、或256任一個中列出的核酸序列。在某些例示性實施方式中，第二核酸序列包含SEQ ID NO：116、118、120、122、124、126、128、214、或216任一個中列出的核酸序列。
在某些例示性實施方式中，第一核酸序列和第二核酸序列由連接子分隔。在某些例示性實施方式中，連接子包含編碼內部核糖體進入位點(IRES)的核酸序列。在某些例示性實施方式中，連接子包含編碼自切割肽的核酸序列。在某些例示性實施方式中，自切割肽是2A肽。在某些例示性實施方式中，2A肽選自豬捷申病毒-l 2 A(porcine teschovirus-l 2 A)(P2A)、明脈扁刺蛾β四體病毒2A(Thoseaasigna virus 2A)(T2A)、馬甲型鼻炎病毒2A(equine rhinitis virus 2A)(E2A)、和口蹄疫病毒2A(E2A)。在某些例示性實施方式中，2A肽是T2A。在某些例示性實施方式中，2A肽是E2A。
在某些例示性實施方式中，單離的核酸從5’至3’包含第一核酸序列、連接子、和第二核酸序列。
在某些例示性實施方式中，單離的核酸從5’至3’包含第二核酸序列、連接子、和第一核酸序列。
另一方面，本揭示提供了單離的核酸，其包含：第一核酸序列，編碼能夠結合前列腺特異性膜抗原(PSMA)的嵌合抗原受體(CAR)，嵌合抗原受體(CAR)包含抗原結合結構域、跨膜結構域、和細胞內結構域，其中抗原結合結構域包含：包含SEQ ID NO：191的共通序列的重鏈可變區(VH)；和包含SEQ ID NO：192的共通序列的輕鏈可變區(VL)；和第二核酸序列，編碼包含SEQ ID NO：116、118、120、122、124、126、128、214、或216任一個中列出的核酸序列的顯性負性受體及/或開關受體。
另一方面，本揭示提供了單離的核酸，其包含：第一核酸 序列，編碼能夠結合前列腺特異性膜抗原(PSMA)的嵌合抗原受體(CAR)，嵌合抗原受體(CAR)包含抗原結合結構域、跨膜結構域、和細胞內結構域，其中抗原結合結構域包含：包含SEQ ID NO：191的共通序列的重鏈可變區(VH)；和包含SEQ ID NO：192的共通序列的輕鏈可變區(VL)；和第二核酸序列，編碼包含SEQ ID NO：116中列出的核酸序列的顯性負性受體及/或開關受體。
在某些例示性實施方式中，第一核酸序列和第二核酸序列由包含編碼T2A的核酸序列的連接子分隔。在某些例示性實施方式中，第一核酸序列和第二核酸序列由包含編碼F2A的核酸序列的連接子分隔。
另一方面，本揭示提供了包含上文中描述的單離的核酸的表現構建物。
在某些例示性實施方式中，表現構建物是選自以下的病毒載體：逆轉錄病毒載體、慢病毒載體、腺病毒載體、和腺相關病毒載體。在某些例示性實施方式中，表現構建物是慢病毒載體。在某些例示性實施方式中，慢病毒載體進一步包含EF-1 a啟動子。在某些例示性實施方式中，慢病毒載體進一步包含rev應答元件(RRE)。在某些例示性實施方式中，慢病毒載體進一步包含土撥鼠肝炎病毒轉錄後調控元件(WPRE)。在某些例示性實施方式中，慢病毒載體進一步包含cPPT序列。
在某些例示性實施方式中，慢病毒載體進一步包含EF-1 a啟動子、rev應答元件(RRE)、土撥鼠肝炎病毒轉錄後調控元件(WPRE)、和cPPT序列。
在某些例示性實施方式中，慢病毒載體是自失活慢病毒載體。
另一方面，本揭示提供了用於產生上文中描述的經修飾的免疫細胞或其前體細胞的方法，其包含將上文中描述的核酸，或上文中描述的表現構建物中的一個或多個導入免疫細胞中。
另一方面，本揭示提供了治療對其需要的對象中的癌症的方法，所述方法包含向所述對象給予治療有效量的包含上文中描述的經修飾的免疫細胞的組合物。
在某些例示性實施方式中，所述方法進一步包含向對象給予淋巴細胞耗竭化療(淋巴細胞清除化療，lymphodepleting chemotherapy)。在某些例示性實施方式中，淋巴細胞耗竭化療包含向對象給予治療有效量的環磷醯胺及/或氟達拉濱(fludarabine)。
另一方面，本揭示提供了治療對其需要的對象中的前列腺癌的方法，所述方法包含：向對象給予淋巴細胞耗竭化療，淋巴細胞耗竭化療包含向對象給予治療有效量的環磷醯胺；和向對象給予經修飾的T細胞，經修飾的T細胞包含：嵌合抗原受體(CAR)，對目標細胞上的前列腺特異性膜抗原(PSMA)具有親和力，其中CAR包含抗原結合結構域、跨膜結構域、和細胞內結構域，其中抗原結合結構域包含：包含SEQ ID NO：191的共通序列的重鏈可變區(VH)；和包含SEQ ID NO：192的共通序列的輕鏈可變區(VL)；和顯性負性受體，包含SEQ ID NO：115中列出的胺基酸序列。
另一方面，本揭示提供了治療對其需要的對象中的轉移性去勢抵抗性前列腺癌(metastatic castrate resistant prostate cancer)的方法，所述方法包含：向對象給予淋巴細胞耗竭化療，淋巴細胞耗竭化療包含向對象給予治療有效量的環磷醯胺；和向對象給予經修飾的T細胞，經修飾的T細胞包含：嵌合抗原受體(CAR)，對目標細胞上的前列腺特異性膜抗原(PSMA)具有親和力，其中CAR包含抗原結合結構域、跨膜結構域、和細胞內結構域，其中抗原結合結構域包含：包含SEQ ID NO：191的共通序列的重鏈可變區(VH)；和包含SEQ ID NO：192的共通序列的輕鏈可變區(VL)；和顯性負性受體，包含SEQ ID NO：115中列出的胺基酸序列。
藉由結合附圖對例示性實施方式進行以下詳細描述，將更充分地理解本發明的前述和其它特徵及優點。應當理解，本發明不限於附圖中所示的實施方式的精確佈置和手段(instrumentalities)。
圖1A示例了使用在瓊脂糖凝膠上分離的純化的IVT PSMA RNA CAR和全長PSMA RNA的結果。
圖1B顯示了使用電穿孔到ND444 T細胞中的純化的PSMA RNA CAR和藉由流式細胞術檢查的CAR表現的結果。在圖下方標記了平均螢光強度。
圖1C示例了PSMA表現。純化的全長PSMA RNA被電穿孔到Nalm6細胞或K5 62細胞(中間圖和右圖)中。藉由流式細胞術檢查PSMA表現。
圖1D示例了使用組合的PC3.PSMA單細胞選殖的結果。對PC3.PSMA細胞進行限度稀釋(左圖)，將七個單菌落分離併合並到新的細胞系，PC3.PSMA.7SC中(右圖)。藉由流式細胞術檢查PSMA表現。
圖2A示例了使用與腫瘤細胞孵育的各種PSMA RNA CAR和所進行的CD107a測定的結果。藉由CD3閘控細胞。
圖2B示例了使用與腫瘤細胞孵育的各種PSMA RNA CAR和所進行的基於螢光素酶的CTL測定的結果。結果報告為在T細胞不存在，僅有腫瘤的情況下孔中基於螢光素酶活性的百分比殺傷。
圖2C顯示了使用與腫瘤細胞孵育的各種PSMA RNA CAR和所進行的ELISA測定的結果(IL-2，左圖；IFN-γ，右圖)。
圖3A示例了使用經構建並轉導到人類原代T細胞中的PSMA Lenti CAR的結果(MOI=3)。在第8天藉由流式細胞術檢查CAR表現。
圖3B顯示了使用與腫瘤細胞孵育或不與腫瘤細胞孵育的各種PSMA Lenti CAR和所進行的CD107a的結果。藉由CD3閘控細胞。顯示了來自第12天的結果。
圖3C顯示了使用與腫瘤細胞孵育的各種PSMA Lenti CAR和所進行的基於螢光素酶的CTL測定的結果。結果報告為在T細胞不存在，僅有腫瘤的情況下孔中基於螢光素酶活性的百分比殺傷。顯示了來自第12天的結果。
圖3D示例了使用與PC3細胞或PC3.PSMA細胞孵育的各種PSMA Lenti CAR和所進行的ELISA測定的結果(IL-2，左圖；IFN-γ，右圖)。顯示了來自第12天的結果。
圖4A示例了使用經由F2A連接至各個人類PSMA Lenti CAR的開關受體PD1*PTM.CD28或PD1.CD28並轉導到人類原代T細胞中的結果。在第12天藉由流式細胞術檢查PD1和CAR表現。
圖4B示例了使用經由T2A連接至各個人類PSMA Lenti CAR的顯性負性(dn)轉化生長因子β受體II(TGFRβII)序列的結果。在第7天藉由流式細胞術分析Dn-TGFRβII- PSMA CAR轉導的T細胞。
圖4C示例了使用電穿孔到PC3.PSMA細胞中的純化的全長PDL1 RNA的各種量和在第13天藉由流式細胞術檢查的PDL1表現的結果。
圖4D顯示了使用與PC3.PSMA細胞或PDL1電穿孔的PC3.PSMA細胞孵育的各種PSMA Lenti CAR和所進行的CD107a測定的結果。藉由CD3閘控細胞。顯示了來自第14天的結果。
圖4E顯示了使用與PC3.PSMA細胞或PDL1電穿孔的PC3.PSMA細胞孵育的各種PSMA Lenti CAR和所進行的CD107a測定的結果。藉由CD3閘控細胞。顯示了來自第14天的結果。
圖4F顯示了使用與PC3.PSMA細胞或PDL1電穿孔的PC3.PSMA細胞孵育的各種PSMA Lenti CAR和所進行的CD107a測定的結果。藉由CD3閘控細胞。顯示了來自第14天的結果。
圖4G顯示了使用與PC3.PSMA細胞或PDL1電穿孔的PC3.PSMA細胞孵育的各種PSMA Lenti CAR和所進行的CD107a測 定的結果。藉由CD3閘控細胞。顯示了來自第14天的結果。
圖4H顯示了使用與PC3.PSMA細胞孵育的各種PSMA Lenti CAR和所進行的基於螢光素酶的CTL測定的結果。結果報告為在T細胞不存在，僅有腫瘤的情況下孔中基於螢光素酶活性的百分比殺傷。
圖4I顯示了使用與PC3.PSMA細胞或PDL1電穿孔的PC3.PSMA細胞孵育的各種PSMA Lenti CAR和所進行的ELISA測定的結果(IL-2，上圖；IFN-γ，下圖)。
圖5A顯示了使用經由F2A連接至各個人類PSMA Lenti CAR的開關受體PD1.CD28並轉導到人類原代T細胞中的結果。藉由流式細胞術檢查PD1和CAR表現。
圖5B顯示了使用經由T2A連接至人類2A10 PSMA Lenti CAR的顯性負性(dn)TGFRβII序列的結果。藉由流式細胞術分析CAR轉導的T細胞。
圖5C顯示了使用與PC3.PSMA.7SC細胞孵育的各種PSMA Lenti CAR和所進行的CD107a測定的結果。藉由CD3閘控細胞。
圖5D顯示了使用與PDL1電穿孔的PC3.PSMA.7SC細胞孵育的各種PSMA Lenti CAR和所進行的CD107a測定的結果。藉由CD3閘控細胞。
圖5E顯示了使用與腫瘤細胞孵育的各種PSMA Lenti CAR和所進行的基於螢光素酶的CTL測定的結果。結果報告為在T細胞不存在，僅有腫瘤的情況下孔中基於螢光素酶活性的百分比殺傷。
圖5F顯示了使用與PC3細胞、PC3.PSMA.7SC細胞或PDL1電穿孔PC3.PSMA.PDL1細胞孵育的各種PSMA Lenti CAR和所進行的ELISA測定的結果(IL-2，上圖；IFN-γ，下圖)。
圖5G顯示了使用用於PSMA表現的定量PCR的結果。倍數變化(δ δ CT)被標準化為Nalm6.CBG細胞。縮寫參見表1。
圖5H顯示了使用與腫瘤細胞或人類原代細胞孵育的各種PSMA Lenti CAR和所進行的CD107a測定的結果。藉由CD3閘控細胞。
圖5I顯示了來自圖5H中所示實驗的定量數據。HSAEpC：人類小氣道上皮細胞。HPMEC：人類肺微血管上皮細胞。
圖5J顯示了使用與人類原代細胞孵育的各種PSMA Lenti CAR和所進行的ELISA測定的結果(IL-2，左圖；IFN-γ，右圖)。HREpC：人類腎上皮細胞。HSAEpC：人類小氣道上皮細胞。HPMEC：人類肺微血管上皮細胞。
圖5K顯示了使用轉導有叩頭蟲的2 x 106個PC3.PSMA.7SC細胞並注射到小鼠中(靜脈內)的結果。27天后，2 x 106個PSMA CAR-T陽性的經轉導的T細胞被注射到攜帶腫瘤的小鼠中(靜脈內)。在多個時間點處實施生物發光成像(BLI)。上圖的最低平均輻射率為5 x 105；下圖的最低平均輻射率為3 x 105。
圖5L示例了圖5K的定量平均輻射率。
圖6是dn-TGFRβII PSMA CAR構建物和pTRPE構建物圖譜的圖示的示意圖。
圖7顯示了對如所指示僅用2F5 PSMA CAR(2F5 ICOS)，或用連同各種開關受體共轉導的2F5 PSMA CAR所轉導的T細胞中CAR表現的流式細胞術檢查。
圖8顯示了對如所指示僅用2F5 PSMA CAR(2F5 ICOS)，或用連同各種開關受體共轉導的2F5 PSMA CAR所轉導的T細胞的PD1和Tim3表現的流式細胞術檢查。
圖9是描繪了如所指示僅用2F5 PSMA ICOS-CAR(ICOS)，僅用PSMA 41BB-CAR(41BB)，或用連同各種開關受體共轉導的2F5 PSMA CAR所轉導的T細胞中CD107a表現的圖。UTD意指未轉導。
圖10是描繪了如所指示僅用2F5 PSMA ICOS-CAR (ICOS)，僅用PSMA 41BB-CAR(41BB)，或用連同各種開關受體共轉導的2F5 PSMA CAR所轉導的T細胞中顆粒酶B表現的圖。UTD意指未轉導。
圖11A是描繪了如所指示僅用2F5 PSMA ICOS-CAR(ICOS)，僅用PSMA 41BB-CAR(41BB)，或用連同各種開關受體共轉導的2F5 PSMA CAR所轉導的T細胞的IL-2分泌的圖。NTD意指未轉導。
圖11B是描繪了如所指示僅用2F5 PSMA ICOS-CAR(ICOS)，僅用PSMA 41BB-CAR(41BB)，或用連同各種開關受體共轉導的2F5 PSMA CAR所轉導的T細胞的IFNγ分泌的圖。UTD意指未轉導。
圖12A是描繪了從對用如所指示轉導的T細胞處理的攜帶PC3-PSMA.CBG誘導的腫瘤的NSG小鼠成像所獲得的生物發光的定量的圖。
圖12B是描繪了從對用如所指示轉導的T細胞處理的攜帶PC3-PSMA.CBG誘導的腫瘤的NSG小鼠成像所獲得的生物發光的定量的圖。
圖13是描繪了用如所指示轉導的T細胞處理的攜帶PC3-PSMA.CBG誘導的腫瘤的NSG小鼠腫瘤大小的圖。
圖14A是描繪了從對用如所指示轉導的T細胞處理的攜帶PC3-PSMA.CBG誘導的腫瘤的NSG小鼠成像獲得的生物發光的定量的圖。
圖14B是描繪了從對用如所指示轉導的T細胞處理的攜帶PC3-PSMA.CBG誘導的腫瘤的NSG小鼠成像獲得的生物發光的定量的圖。
圖14C是描繪了從對用如所指示轉導的T細胞處理的攜帶PC3-PSMA.CBG誘導的腫瘤的NSG小鼠成像獲得的生物發光的定量的圖。
圖14D是描繪了從對用如所指示轉導的T細胞處理的攜帶PC3-PSMA.CBG誘導的腫瘤的NSG小鼠成像獲得的生物發光的定量的圖。
圖14E是描繪了從對用如所指示轉導的T細胞處理的攜帶PC3-PSMA.CBG誘導的腫瘤的NSG小鼠成像獲得的生物發光的定量的圖。
圖14F是描繪了從對用如所指示轉導的T細胞處理的攜帶PC3-PSMA.CBG誘導的腫瘤的NSG小鼠成像獲得的生物發光的定量(左)和腫瘤大小(右)的圖。
圖14G是自上而下以腫瘤控制能力排序的如所指示轉導的T細胞的表格列表。ICOSYMNM優於WT ICOS。當用ICOSz或ICOSzYMNM時，PD1*BB比PD1*CD28更好。圖15A是顯示了CART-PSMA-TGFβRdn細胞(dnTGFBR2-T2A-Pbbz)證實在42天內與表現PSMA的腫瘤細胞(箭頭)共培養和用其重複刺激相對於CART-PSMA(Pbbz)增強的抗原特異性增殖的圖。CD19-BBz CART(19bbz)和經轉導的T細胞(模擬試驗)被用作對照。
圖15B是顯示了使用CART-PSMA-TGFβRdn細胞(dnTGFBR2-T2A-Pbbz)、CART-PSMA細胞(Pbbz)的T細胞注射後長達27天在攜帶腫瘤的小鼠中檢測到的平均輻射率且未經轉導的細胞被用作對照(模擬試驗)的圖。
圖15C是顯示了藉由每週一次的生物發光成像(BLI)評價的腫瘤位置和全身負荷(systemic burden)的照片。
圖16示例了1期臨床試驗中所採用的研究模式。
圖17是顯示了經由對在對象中的CART-PSMA-TGFβRdn DNA進行qPCR來評估CAR-T細胞動力學的圖。對象32816-02、-04、和-05處在第一群組中，而對象32816-06、-07、和-08處在第二群組中。
圖18A是顯示了炎性細胞因子(IL-6、IL-15、IL-2、 IFNγ)和鐵蛋白顯著增長(與對象32816-06中的3級細胞因子釋放綜合征事件相關)的圖。
圖18B是顯示了炎性細胞因子(IL-6、IL-15、IL-2、IFNγ)和鐵蛋白顯著增長(與對象32816-07中的3級細胞因子釋放綜合征事件相關)的圖。
圖19是顯示了在第一群組患者和第二群組患者中前列腺特異性抗原(PSA)反應的圖。
圖20A是顯示了對象32816-07中PSMA-TGFβRDN CART(左y軸以拷貝數/ug基因組DNA為單位)的表現和IL-6的水平(右y軸以pg/ml為單位)的圖，指示了輸注後一天在對象中表現出的細胞因子釋放綜合征。
圖20B是顯示了細胞因子釋放綜合征管理伴隨瞬時PSA降低(如藉由C反應蛋白的水平(CRP；左y軸以mg/L為單位)和血清鐵蛋白的水平(右y軸以ng/L為單位)測量)的圖。
圖21是顯示了隨時間推移在各個對象中檢測到的PSMA陽性的循環腫瘤細胞(CTC)數目的圖。
圖22A是顯示了兩種人源化J591 CAR，dnTGF.hJ591VHVK.BBZ和dnTGF.hJ591VKVH.BBZ的示意圖。
圖22B顯示了對如所指示的經轉導的細胞中CAR和顯性負性TGFRβII表現的流式細胞術檢查。
圖22C顯示了對如所指示的經轉導的細胞中CD107a表現的流式細胞術檢查。
圖23A是顯示了共培養物中如所指示的經轉導的細胞對PC3-PSMA細胞的殺傷效率的圖。
圖23B是顯示了如所指示的各種細胞因子的產生，在與PC3-PSMA細胞的共培養物中如所指示的各種經轉導的細胞的產生的圖。
圖24A是顯示了如所指示的各種人源化J591 CAR的示 意圖。
圖24B顯示了使用流式細胞術測量的在經轉導的T細胞上如所指示的各種CAR的表面表現。
圖24C顯示了當經轉導的細胞與PC3細胞或PC3-PSMA細胞共培養時，對如所指示的經轉導的細胞中CD107a表現的流式細胞術檢查。
圖24D是顯示了共培養物中如所指示的經轉導的細胞對PC3-PSMA細胞的殺傷效率的圖。
圖24E是顯示了如所指示的細胞因子的產生，在與PC3-PSMA細胞的共培養物中如所指示的各種經轉導的細胞的產生的圖。
圖25顯示了使用流式細胞術測量的在經轉導的T細胞上如所指示的各種CAR的表面表現。
圖26A顯示了對如所指示的經轉導的細胞中顯性負性TGFRβII和PD1表現的流式細胞術檢查。
圖26B顯示了對如所指示的經轉導的細胞中CD107a表現的流式細胞術檢查。
圖27A是顯示了共培養物中如所指示的經轉導的細胞對PC3-PSMA細胞的殺傷效率的圖。
圖27B是顯示了共培養物中如所指示的經轉導的細胞對PC3細胞的殺傷效率的圖。
圖28A是顯示了在與PC3細胞或PC3-PSMA細胞的共培養物中如所指示的各種經轉導的細胞的IFN-γ的產生的圖。
圖28B是顯示了在與PC3細胞或PC3-PSMA細胞的共培養物中如所指示的各種經轉導的細胞的IL-2的產生的圖。
圖29是顯示了在如所指示的天數使用生物發光成像評價的如所指示的給予了經轉導的細胞的各種小鼠的腫瘤位置和全身負荷的照片。
圖30A是顯示了在如所指示的天數從如所指示的給予了 經轉導的細胞的各種小鼠中的腫瘤檢測到的平均通量的定量的圖。
圖30B是顯示了在第21天從如所指示的給予了經轉導的細胞的各種小鼠中的腫瘤檢測到的平均通量的定量的圖。
本發明提供了組合物和方法，其用於經修飾的免疫細胞，例如，T細胞和NK細胞，或其前體，例如，經修飾的T細胞，其包含嵌合抗原受體(CAR)。在一些實施方式中，該CAR包含前列腺特異性膜抗原(PSMA)結合結構域(PSMA-CAR)，並且對目標細胞(例如，前列腺癌細胞)上的PSMA具有親和力。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞包含：包含鼠PSMA結合結構域的PSMA-CAR。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞包含：包含人類PSMA結合結構域的PSMA-CAR。還提供了產生這種基因工程改造的細胞的方法。在一些實施方式中，細胞和組合物可用於過繼性細胞療法，例如，過繼性腫瘤免疫療法。
在一些實施方式中，所提供的免疫細胞包含另外的受體(例如，顯性負性受體及/或開關受體)以增強腫瘤微環境中免疫細胞的功效。這種細胞能夠改變或減少腫瘤微環境中免疫抑制信號的作用。本發明的經修飾的免疫細胞抵消負向控制T細胞活化和T細胞功能的抑制劑受體或配體的上調及/或表現。例如，某些免疫檢查點蛋白(例如，PD-1或PD-L1)在T細胞上及/或在腫瘤微環境中的表現可降低過繼性T細胞療法的效力和功效。例如，TGF-β在T細胞上及/或在腫瘤微環境中的表現可降低過繼性T細胞療法的效力和功效。這種免疫抑制信號在過繼性細胞療法的情況下可以其它方式損害某些期望的效應物功能。腫瘤細胞及/或腫瘤微環境中的細胞通常使免疫抑制蛋白(例如，PD-L1)上調，從而傳遞免疫抑制信號。這種免疫抑制蛋白還可在腫瘤微環境中的T細胞(例如，在腫瘤浸潤性T細胞(tumor-infiltrating T cells))上被上調，這可在藉由抗原受體或某些其它活化信號的信號 傳導後發生。這種事件可導致獲得耗竭表型(諸如當靠近表現這種蛋白的細胞存在時)的基因工程改造的免疫細胞(例如，靶向PSMA的)T細胞，其進而可導致降低的功能性。因此，本發明的經修飾的免疫細胞解決了T細胞耗竭及/或T細胞持久性的缺乏──這是對常規過繼性細胞療法的功效和治療結果的阻礙。
本發明包括PSMA CAR和其在治療癌症上的用途。在某些實施方式中，本發明包括具有顯性負性受體及/或開關受體的人類PSMA CAR。癌症免疫療法的主要障礙之一是腫瘤微環境。免疫抑制分子(例如，PD-1)的上調負向調控T細胞活性。
本發明基於發現了包含PSMA-CAR和顯性負性受體及/或開關受體的T細胞能夠繞過腫瘤微環境中免疫抑制分子的作用，從而提供持續且強力的抗腫瘤活性。
應當理解，本揭示中描述的方法不限於本文公開的特定方法和實驗條件，因為這些方法和條件可以改變。還應理解，本文中使用的術語僅用於描述特定實施方式的目的，而不是旨在限制。
此外，除非另有說明，否則本文描述的實驗使用本領域技術範圍內的常規分子生物學和細胞生物學技術以及免疫學技術。這些技術對於熟練工作者來說是公知的，並且在文獻中有充分的解釋。參見，例如，Ausubel等人編輯，Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,Inc.,NY,N.Y.(1987-2008)，包括所有附錄；由MR Green和J.Sambrook著的Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第四版)；和Harlow等人，Antibodies：A Laboratory Manual,第14章，Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor(2013，第2版)。
A.定義
除非另有定義，否則本文中使用的科學術語和技術術語具有本領域普通技術人員通常理解的含義。如果存在任何潛在的歧義，本 文提供的定義優先於任何詞典或外部定義。除非上下文另有要求，否則單數術語應包括複數，並且複數術語應包括單數。除非另有說明，否則「或」的使用是指「及/或」。術語「包括(including)」以及諸如「包括(includes)」和「包括(included)」等其它形式的使用不受限制。
總體上，本文所述的與細胞培養和組織培養、分子生物學、免疫學、微生物學、遺傳學和蛋白質及核酸化學和雜交相關的術語是本領域公知的和常用的。除非另有說明，否則本文提供的方法和技術通常根據本領域公知的常規方法來執行，並且如在本說明書全篇中所引用和討論的各種一般性和更具體的參考文獻中描述的那樣。酶促反應和純化技術根據製造商的說明書執行，如本領域中通常完成的那樣或如本文所描述的那樣。本文描述的與分析化學、合成有機化學以及醫藥化學結合使用的術語及其實驗室程序與技術是本領域中公知且常用的術語和實驗室程序與技術。標準技術用於化學合成、化學分析、藥物製備、配製和遞送、以及患者治療。
為了更容易理解本揭示，選擇術語進行如下定義。
本文使用的冠詞「一個」和「一種」是指該冠詞語法對象的一個(種)或多於一個(種)(即，是指至少一個(種))。舉例說明，「一個(種)元素」意指一個(種)元素或多於一個(種)的元素。
如本文使用的「約」，當指的是可測量的值(如量、時間期間等)時，意指包含從給定值±20%或±10%的變化，更優選±5%，甚至更優選±1%，以及還更優選±0.1%的變化，只要這種變化適於執行所公開的方法。
如本文所用的「活化」是指已經被充分刺激以誘導可檢測的細胞增殖的T細胞的狀態。活化也可與誘導的細胞因子產生和可檢測的效應物功能相關。術語「活化的T細胞」是指經歷細胞分裂等等的T細胞。
如本文所用，「減輕」疾病意指降低疾病的一種或多種症狀的嚴重性。
如本文所用的術語「抗體」是指與抗原特異性地結合的免疫球蛋白分子。抗體可以是源於自然源或源於重組源的完整的免疫球蛋白，並可以是完整免疫球蛋白的免疫反應部分(例如，抗體的結合片段)。抗體通常是免疫球蛋白分子的四聚物。本發明中的抗體可以以多種形式存在，包括例如，多株抗體、單株抗體、Fv、Fab和F(ab)2，以及單鏈抗體(scFv)和人源化抗體(Harlow等人，1999,In：Using Antibodies：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY；Harlow等人，1989,In：Antibodies：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,New York；Houston等人，1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883；Bird等人，1988,Science 242：423-426)。
術語「抗體片段」是指完整抗體的一部分，並且是指完整抗體的抗原決定可變區。抗體片段的實例包括但不限於Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段、由抗體片段形成的線性抗體、scFv抗體和多特異性抗體。
如本文所用的「抗體重鏈」是指以它們天然發生的構象存在於所有抗體分子的兩種類型的多肽鏈中較大的鏈。
如本文所用的「抗體輕鏈」是指以它們天然發生的構象存在於所有抗體分子的兩種類型的多肽鏈中較小的鏈。α輕鏈和β輕鏈是指兩種主要的抗體輕鏈同種型。
如本文所用的術語「合成抗體」意指利用重組DNA技術產生的抗體，諸如例如，由如本文所述的噬菌體表現的抗體。該術語也應當被解釋為意指已經由DNA分子的合成產生的抗體，所述DNA分子編碼所述抗體並且所述DNA分子表現抗體蛋白或規定所述抗體的胺基酸序列，其中DNA序列或胺基酸序列已經利用本領域可獲得的和公知的合成DNA序列或胺基酸序列技術獲得。
如本文所用的術語「抗原」或「Ag」被定義為激發免疫反應的分子。該免疫反應可涉及抗體產生，或特異性免疫活性細胞的活化， 或兩者。技術人員將理解任何大分子──實際上包括所有的蛋白質或肽，都可充當抗原。
此外，抗原可源自重組DNA或基因組DNA。技術人員將理解任何DNA──其包含編碼引起免疫反應的蛋白質的核苷酸序列或部分核苷酸序列，因此編碼如本文使用的術語「抗原」。此外，本領域技術人員將理解抗原不必單獨地由基因的全長核苷酸序列編碼。容易顯而易見的是本發明包括但不限於，多於一個的基因的部分核苷酸序列的用途，並且這些核苷酸序列以不同的組合進行佈置，以引起期望的免疫反應。此外，技術人員將理解抗原根本不必由「基因」進行編碼。容易顯而易見的是抗原可被產生、合成或可源自生物學樣品。這種生物學樣品可包括但不限於組織樣品、腫瘤樣品、細胞、或生物學流體。
如本文所用的，術語「自體的」意指關於源自相同個體的任意物質，其隨後被再次導入該個體。「同種異體的」是指源自相同物種的不同動物的任意物質。「異種的」是指是源自不同物種的動物的任意物質。
如本文使用的術語「嵌合抗原受體」或「CAR」是指被工程改造以在免疫效應細胞上表現並特異性地結合抗原的人工T細胞受體。CAR可以被用作使用過繼性細胞轉移的療法。T細胞從患者移出並且被修飾，使得它們表現特異於抗原或特定形式的抗原的受體。例如，在一些實施方式中，該CAR對所選的目標(例如，表現前列腺特異性膜抗原的細胞)具有特異性。CAR還可以包含細胞內活化結構域、跨膜結構域和細細胞外結構域，該細細胞外結構域包含腫瘤相關抗原結合區。
如本文使用的術語「共刺激配體」包括特異性地結合T細胞上的關聯共刺激分子的抗原呈遞細胞(例如，人工APC(aAPC)、樹突細胞、B細胞等)上的分子，從而除藉由例如將TCR/CD3複合體與使用肽負載的MHC分子結合提供的初級信號之外，還提供了介導T細胞反應的信號，該T細胞反應包括但不限於增殖、活化、分化等。共 刺激配體可以包括但不限於CD7、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L、可誘導的共刺激配體(ICOS-L)、細胞間粘附分子(ICAM)、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、MICB、HVEM、淋巴毒素β受體、3/TR6、ILT3、ILT4、HVEM、結合Toll配體受體的激動劑或抗體和與B7-H3特異性地結合的配體。共刺激配體也涵蓋，特別是與存在於T細胞上的共刺激分子特異性地結合的抗體，諸如，但不限於CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴細胞功能相關抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、和與CD83特異性地結合的配體。
「共刺激分子」是指與共刺激配體特異性地結合從而介導藉由T細胞的共刺激反應──諸如但不限於增殖──的T細胞上的關聯(cognate)結合伴侶(夥伴，partner)。共刺激分子包括但不限於MHC I類分子、BTLA、和Toll配體受體。
如本文所用的「共刺激信號」是指與初級信號結合，諸如TCR/CD3連接，導致T細胞增殖及/或關鍵分子的上調或下調的信號。
「疾病」是動物的一種健康狀態，其中動物不能保持穩態，以及其中如果不改善該疾病，則動物的健康繼續惡化。與之相比，動物中的「障礙是一種健康狀態，其中動物能夠保持穩態，但其中動物的健康狀態與它沒有處於該障礙相比不太有利。保持不治療，障礙不必定引起動物健康狀態的進一步降低。
如本文所用的術語「下調」是指一個或多個基因的基因表現的減少或消除。
「有效量」或「治療有效量」在本文可交換地使用，並且是指對實現特定的生物學結果或提供治療或預防益處有效的如本文描述的化合物、製劑、材料、或組合物的量。這樣的結果可以包括但不限於當向哺乳動物給予時引起相比於在缺少本發明的組合物的情況下檢測到的免疫反應而言可檢測到的免疫抑制水平或耐受水平的量。免疫反應可以很容易地由本領域認知的多種方法來評價。技術人員將理解，本 文中所給予的組合物的量是變化的，並且可以基於多種因素容易(諸如所治療的疾病或狀況、所治療的哺乳動物的年齡和健康以及身體狀況、疾病的嚴重性、所給予的特定化合物等)地確定。
「編碼」是指多核苷酸諸如基因、cDNA或mRNA中核苷酸的特異性序列充當模板合成在生物學過程中的其它多聚體和大分子的固有性質，所述多聚體和大分子具有核苷酸(即，rRNA、tRNA和mRNA)的限定序列或胺基酸的限定序列中的任一個和由其產生的生物學性質。因此，如果相應於基因的mRNA的轉錄和翻譯在細胞或其它生物學系統中產生蛋白質，則該基因編碼蛋白質。核苷酸序列等同mRNA序列並通常提供在序列表中的編碼鏈，和用作轉錄基因或cDNA的模板的非編碼鏈兩者，都可被稱為編碼該基因或cDNA的蛋白質或其它產物。
如本文所用的「內源的」是指來自有機體、細胞、組織或系統的或在有機體、細胞、組織或系統內產生的任何物質。
如本文所用的術語「表位」被定義為抗原上的可引發免疫反應(誘導B細胞反應及/或T細胞反應)的小化學分子。抗原可具有一個或多個表位。大多數抗原具有多個表位；即，它們是多價的。總體上，一個表位的大小約10個胺基酸及/或糖。優選地，表位約4-18個胺基酸，更優選約5-16個胺基酸，甚至更優選6-14個胺基酸，更優選約7-12個胺基酸，以及最優選約8-10個胺基酸。本領域技術人員理解，通常而言分子的整體三維結構而非分子的特異性線性序列是抗原特異性的主要標準，因此來區分一個表位與另一個表位。基於本揭示，本發明的肽可以是表位。
如本文所用的，術語「外源的」是指從有機體、細胞、組織或系統導入的或在有機體、細胞、組織或系統外產生的任何物質。
如本文使用的術語「擴大」是指數目的增加，如T細胞數目的增加。在一個實施方式中，離體擴大的T細胞的數目相對於培養物中原始存在的數目增加。在另一個實施方式中，離體擴大的T細胞的數 目相對於培養物中的其它細胞類型的數目增加。如本文使用的術語「離體」是指已經從活的生物體(例如，人類)移出，並且在該生物體外(例如，在培養皿、試管、或生物反應器中)繁殖的細胞。
如本文使用的術語「表現」被定義為由特定核苷酸序列的啟動子驅動的該序列的轉錄及/或翻譯。
「表現載體」是指包含重組多核苷酸的載體，該重組多核苷酸包含可操作地連接至待表現的核苷酸序列的表現控制序列。表現載體包含足夠的用於表現的順式作用元件；用於表現的其它元件可以由宿主細胞供應或在體外表現系統中供應。表現載體包括所有本領域已知的表現載體，諸如併入重組多核苷酸的粘粒、質粒(例如，裸露的或包含在脂質體中)和病毒(例如，仙台病毒、慢病毒、逆轉錄病毒、腺病毒、和腺相關病毒)。
非人類(例如，鼠)抗體的「人源化」形式是嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或抗體的其它抗原-結合子序列)，其包含源自非人類免疫球蛋白的最小序列。就大部分而言，人源化抗體是人類免疫球蛋白(受體抗體)，其中來自受體的互補決定區(CDR)的殘基被替換為來自非人類物種(供體抗體)諸如小鼠、大鼠或兔的CDR的殘基，其具有期望的特異性、親和力和能力。在一些情況下，人類免疫球蛋白的Fv框架區(FR)殘基被替換為對應的非人類殘基。另外，人源化抗體可以包含既沒有在受體抗體中也沒有在輸入的CDR或框架序列中發現的殘基。進行這些修飾以進一步改進和優化抗體性能。一般而言，人源化抗體將包含基本上所有的至少一種和通常兩種可變結構域，其中所有或基本上所有的CDR區對應於非人類免疫球蛋白的那些並且所有或基本上所有的FR區是人類免疫球蛋白序列的那些。人源化抗體還可包含至少部分免疫球蛋白恒定區(Fc)，通常是人類免疫球蛋白的恒定區。進一步的細節參見Jones等人，Nature,321：522-525,1986；Reichmann等人，Nature,332：323-329,1988；Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,2：593-596,1992。「全 人類(Fully human)」是指免疫球蛋白(如抗體、或其結合片段)，其中完整分子具有人類起源或由同一於人類形式的抗體的胺基酸序列構成。
如本文使用的術語「免疫球蛋白」或「Ig」被定義為起抗體作用的一類蛋白質。包括在此類蛋白質中的五個成員是IgA、IgG、IgM、IgD和IgE。IgA是存在於身體分泌物，如唾液、淚液、母乳、胃腸分泌物和呼吸道與泌尿生殖道的粘液分泌物中的初次抗體。IgG是最常見的循環抗體。IgM是在大多數對象中的初次免疫反應中產生的主要免疫球蛋白。它在凝集、補體結合、和其它抗體反應中是最有效的免疫球蛋白，並且在抵禦細菌和病毒方面是重要的。IgD是不具有已知抗體功能的免疫球蛋白，但是可以充當抗原受體。IgE是在暴露於過敏原之後，藉由引起從肥大細胞和嗜鹼性粒細胞釋放介體，介導超敏的免疫球蛋白。
如本文使用的「同一性」是指兩個多聚體分子之間，特別是兩個胺基酸分子之間，諸如，兩個多肽分子之間的亞基序列同一性。當兩個胺基酸序列在相同的位置處具有相同的殘基時；例如，如果兩個多肽分子中的每個中的位置均被精胺酸佔據，則它們在該位置處是同一的。在比對中，兩個胺基酸序列在相同的位置處具有相同殘基的同一性或程度經常表現為百分數。兩個胺基酸序列之間的同一性是匹配或同一位置的直接函數；例如，如果兩個序列中的一半位置(例如，十個胺基酸長度的多聚體中的五個位置)是同一的，則兩個序列是50%同一的；如果90%的位置(例如，10個中的9個)是匹配的或同一的，則兩個胺基酸序列是90%同一的。
如本文使用的術語「免疫反應」被定義為當淋巴細胞將抗原分子識別為異物和誘發形成抗體及/或活化淋巴細胞以去除抗原時發生的對抗原的細胞反應。
術語「免疫抑制」在本文中用於指減少整體免疫反應。
「單離的」意指從自然狀態改變或移出。例如，天然存在 於活動物中的核酸或肽不是「單離的」，但是部分或完全與它的自然狀態的共存物質分開的相同的核酸或肽是「單離的」。單離的核酸或蛋白質可以以基本上純化的形式存在，或可以存在於非自然環境，諸如，例如，宿主細胞。
如本文使用的「慢病毒」是指逆轉錄病毒科的一種屬。在逆轉錄病毒中慢病毒是唯一能夠感染非分裂細胞的；它們可以遞送顯著量的遺傳信息進入宿主細胞的DNA，因此它們是基因遞送載體的最有效的方法之一。HIV、SIV和FIV是慢病毒的所有實例。源自慢病毒的載體提供了實現顯著水平的基因體內轉移的手段。
如本文使用的術語「修飾的」意指本發明的分子或細胞的改變的狀態或結構。分子可以以多種方式被修飾，包括化學地、結構地、和功能地。細胞可以藉由導入核酸被修飾。
如本文使用的術語「調節」意指與不存在治療或化合物的對象中的反應水平相比，及/或與在其它方面相同但未治療的對象中的反應水平相比，介導對象中的反應水平中的可檢測的增加或減少。該術語涵蓋擾亂及/或影響天然信號或反應，從而介導對象(優選地，人類)中的有益的治療性反應。
在本發明的背景下，使用常見核酸堿基的下列縮寫。「A」是指腺苷，「C」是指胞嘧啶，「G」是指鳥苷，「T」是指胸苷，以及「U」是指尿苷。
除非另外規定，否則「編碼胺基酸序列的核苷酸序列」包括是彼此的簡並譯本(version)並且編碼相同的胺基酸序列的所有核苷酸序列。短語編碼蛋白質或RNA的核苷酸序列還可以包括內含子，就編碼該蛋白質的核苷酸序列可以在一些譯本中包含內含子(一個或多個)而言。
術語「可操作地連接」或「操作地連接」是指調控序列和異源核酸序列之間的功能連接，其導致後者的表現。例如，當第一核酸序列處於與第二核酸序列的功能關係中時，第一核酸序列與第二核酸序列 可操作地連接。例如，如果啟動子影響編碼序列的轉錄或表現，則啟動子被可操作地連接至該編碼序列。
如本文使用的術語「多核苷酸」被定義為核苷酸鏈。另外，核酸是核苷酸的多聚體。因而，如本文使用的核酸和多核苷酸是可互換的。本領域技術人員具有核酸是可以被水解為單體「核苷酸」的多核苷酸的一般知識。單體核苷酸可以被水解為核苷。如本文使用的多核苷酸包括但不限於藉由本領域可獲得的任何手段──非限制性地包括重組手段，即，使用普通選殖技術和PCR等從重組文庫或細胞基因組選殖核酸序列，和藉由合成手段──獲得的所有核酸序列。
如本文使用的，術語「肽」、「多肽」和「蛋白質」可互換地使用，並且是指由肽鍵共價連接的胺基酸殘基組成的化合物。蛋白質或肽必須包含至少兩個胺基酸，並且對可以包含蛋白質或肽的序列的胺基酸的最大數目沒有限制。多肽包括任何肽或蛋白質，該肽或蛋白質包含藉由肽鍵相互連接的兩個或更多個胺基酸。如本文使用的，該術語是指短鏈(在本領域中也通常被稱為例如肽、寡肽和寡聚物)；和較長鏈(在本領域中通常被稱為蛋白質，其具有多種類型)兩者。「多肽」包括例如生物學活性片段、基本上同源的多肽、寡肽、同二聚體、異二聚體、多肽的變體、修飾的多肽、衍生物、類似物、融合蛋白等。多肽包括天然肽、重組肽、合成肽、或其組合。
如本文使用的關於抗體的術語「特異性地結合」意指識別特異性抗原但是基本上不識別或不結合樣品中的其它分子的抗體。例如，特異性地結合至來自一個物種的抗原的抗體也結合至來自一個或多個物種的該抗原。但是，這樣的跨物種反應性本身不將抗體的類別改變為特異性的。在另一個實例中，特異性地結合至抗原的抗體也可以結合至抗原的不同等位基因形式。然而，這樣的交叉反應性本身不將抗體的類別改變為特異性的。在一些情況下，術語「特異性結合」或「特異性地結合」可以關於抗體、蛋白質或肽與第二化學物質的相互作用使用，意指相互作用依賴該化學物質上特定結構(例如，抗原決定簇或表位) 的存在；例如，抗體識別和結合至特異性蛋白質結構，而不是一般地識別和結合至蛋白質。如果抗體特異於表位「A」，則在包含標示的「A」和該抗體的反應中存在包含表位A(或游離的、未標示的A)的分子將降低結合至該抗體的標示的A的量。
術語「刺激」意指藉由結合刺激分子(例如，TCR/CD3複合體)與其關聯配體，從而介導信號轉導事件──諸如，但不限於經由TCR/CD3複合體的信號轉導──誘導的初次反應。刺激可以介導某些分子的改變的表現，比如TGF-β的下調、及/或細胞骨架結構的再組織等。
「刺激分子」，作為本文使用的術語，意指與存在於抗原呈遞細胞上的關聯刺激配體特異性地結合的T細胞上的分子。
如本文使用的「刺激配體」意指如下配體：其當存在於抗原呈遞細胞(例如，aAPC、樹突細胞、B細胞等)時，可以與T細胞上的關聯結合伴侶(在本文稱為「刺激分子」)特異性地結合，從而介導T細胞的初次反應，其包括但不限於活化、起始免疫反應、增殖等。刺激配體在本領域是熟知的，並且涵蓋，特別是使用肽、抗CD3抗體、超激動劑抗CD28抗體、和超激動劑抗CD2抗體負載的MHC I類分子。
術語「對象」意圖包括其中可以引發免疫反應的活的生物體(例如，哺乳動物)。如其中使用的「對象」或「患者」可以是人類或非人類哺乳動物。非人類哺乳動物包括，例如，家畜和寵物，如羊、牛、豬、狗、貓和鼠哺乳動物。優選地，對象是人類。
「目標位點」或「目標序列」是指基因組核酸序列，其限定了在足以發生結合的條件下結合分子可以特異性地結合至的核酸的部分。
如本文使用的術語「治療性的」意指治療及/或預防。治療性效果藉由疾病狀態的抑制、緩解、或根除獲得。
「移植物」是指要移植的生物相容性格柵(網格，lattice) 或供者組織、器官或細胞。移植物的實例可包括但不限於皮膚細胞或組織、骨髓、以及諸如心臟、胰腺、腎臟、肺及肝臟等實體器官。移植物也可以指將要給予宿主的任何材料。例如，移植物可以指核酸或蛋白質。
如本文使用的術語「轉染的」或「轉化的」或「轉導的」是指如下過程：藉由該過程外源性核酸被轉移或導入宿主細胞。「轉染的」或「轉化的」或「轉導的」細胞是已經用外源性核酸轉染、轉化或轉導的細胞。細胞包括原代對象細胞和其子代。
「治療」疾病，作為本文使用的術語，意指降低對象經歷的疾病或障礙的至少一種跡象或症狀的頻率或嚴重性。
「載體」是物質的組合物，其包含單離的核酸，並且其可以被用於遞送單離的核酸至細胞內部。眾多載體在本領域是已知的，包括但不限於線性多核苷酸、與離子化合物或兩親性化合物相關聯的多核苷酸、質粒和病毒。因而，術語「載體」包括自主複製的質粒或病毒。該術語也應當解釋為包括便於將核酸轉移入細胞的非質粒化合物和非病毒化合物，諸如，例如，聚賴胺酸化合物、脂質體等。病毒載體的實例包括但不限於仙台病毒載體、腺病毒載體、腺相關病毒載體、逆轉錄病毒載體、慢病毒載體等。
範圍：貫穿本揭示內容，本發明的多個方面可以以範圍格式呈現。應當理解，以範圍格式的描述僅僅出於方便和簡潔，並且不應當解釋為對本發明的範圍的死板限制。因此，範圍的描述應當被認為已經具體地公開了所有可能的子範圍以及該範圍內的單個數值。例如，諸如1至6的範圍的描述應當被認為已經具體地公開了子範圍諸如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及該範圍內的單個數字，例如，1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。不管範圍的寬度如何，這均適用。
B.嵌合抗原受體
本發明提供了組合物和方法，其用於包含嵌合抗原受體 (CAR)的經修飾的免疫細胞或其前體(例如，經修飾的T細胞)。因此，在一些實施方式中，免疫細胞已被基因修飾以表現CAR。本發明的CAR包含抗原結合結構域、跨膜結構域、鉸鏈結構域、和細胞內信號傳導結構域。
抗原結合結構域可以可操作地連接至CAR的其它結構域，如跨膜結構域或細胞內結構域，兩者均在本文其它部分有所描述，以供在細胞中表現。在一個實施方式中，編碼抗原結合結構域的第一核酸序列可操作地連接至編碼跨膜結構域的第二核酸，並且進一步可操作地連接至編碼細胞內結構域的第三核酸序列。
本文所述的抗原結合結構域可與本文所述的任意跨膜結構域組合、可與本文所述的任意細胞內結構域或細胞質結構域組合、可與可包括在本發明的CAR中的本文所述的任意其它結構域組合。本發明的對象CAR還可包括如本文所述的間隔子結構域。在一些實施方式中，抗原結合結構域、跨膜結構域、和細胞內結構域中的每一個均由連接子分隔。
抗原結合結構域
CAR的抗原結合結構域是CAR的用於與包括蛋白質、碳水化合物、和糖脂在內的特異性目標抗原結合的細胞外區域。在一些實施方式中，該CAR包含與目標細胞上的目標抗原的親和力。目標抗原可包括與該目標細胞關聯的任意類型的蛋白質，或其表位。例如，CAR可包含與目標細胞上的指示目標細胞特定疾病狀態的目標抗原的親和力。
在例示性實施方式中，目標細胞抗原是前列腺特異性膜抗原(PSMA)。PSMA是表現在細胞表面上且據報道在前列腺癌組織中高度過表現的膜結合蛋白。PSMA表現與漸進性(advancing)腫瘤分級和分期直接相關，並且被認為賦予前列腺癌細胞選擇性生長優勢。由此，本揭示的例示性CAR對目標細胞上的PSMA具有親和力。
如本文所述，對目標細胞上的特異性目標抗原具有親和力的本揭示的CAR可包含目標特異性結合結構域。在一些實施方式中，目標特異性結合結構域是鼠目標特異性結合結構域，例如，鼠源的目標特異性結合結構域。在一些實施方式中，目標特異性結合結構域是人類目標特異性結合結構域，例如，人源的目標特異性結合結構域。在例示性實施方式中，對目標細胞上的PSMA具有親和力的本揭示的CAR可包含PSMA結合結構域。在一些實施方式中，PSMA結合結構域是鼠PSMA結合結構域，例如，鼠源的PSMA結合結構域。在一些實施方式中，PSMA結合結構域是人類PSMA結合結構域，例如，人源的PSMA結合結構域。
在一些實施方式中，本揭示的CAR可對一個或多個目標細胞上的一個或多個目標抗原具有親和力。在一些實施方式中，該CAR可對目標細胞上的一個或多個目標抗原具有親和力。在這樣的實施方式中，CAR是雙特異性CAR，或多特異性CAR。在一些實施方式中，該CAR包含賦予對一個或多個目標抗原的親和力的一個或多個目標特異性結合結構域。在一些實施方式中，該CAR包含賦予對相同目標抗原的親和力的一個或多個目標特異性結合結構域。例如，包含具有對相同目標抗原的親和力的一個或多個目標特異性結合結構域的CAR可結合目標抗原的不同表位。當多個目標特異性結合結構域存在於CAR中時，結合結構域可一前一後地佈置並且可由連接子肽分隔。例如，在包含兩個目標特異性結合結構域的CAR中，結合結構域藉由寡肽或多肽連接子、Fc鉸鏈區、或膜鉸鏈區彼此共價連接在單條多肽鏈上。
在一些實施方式中，抗原結合結構域選自抗體、抗原結合片段(Fab)、和單鏈可變區片段(scFv)。在一些實施方式中，本發明的PSMA結合結構域選自PSMA特異性抗體、PSMA特異性Fab、和PSMA特異性scFv。在一個實施方式中，PSMA結合結構域是PSMA特異性抗體。在一個實施方式中，PSMA結合結構域是PSMA特異性Fab。在一個實施方式中，PSMA結合結構域是PSMA特異性scFv。
抗原結合結構域可包括與抗原結合的任意結構域並且可包括但不限於單株抗體、多株抗體、合成抗體、人類抗體、人源化抗體、非人類抗體、及其任意片段。在一些實施方式中，抗原結合結構域部分包含哺乳動物抗體或其片段。抗原結合結構域的選擇可取決於目標細胞表面上存在的抗原的類型和數目。
如本文所用，術語「單鏈可變區片段」或「scFv」是免疫球蛋白(例如，小鼠或人類)的經共價連接以形成VH：：VL異二聚體的重鏈(VH)和輕鏈(VL)的可變區的融合蛋白。重鏈(VH)和輕鏈(VL)直接連接或藉由編碼肽的連接子連接，編碼肽的連接子將VH的N-末端與VL的C-末端連接，或將VH的C-末端與VL的N-末端連接。在一些實施方式中，抗原結合結構域(例如，PSMA結合結構域)包含具有N-末端至C-末端的構型(VH-連接子-VL)的ScFv。在一些實施方式中，抗原結合結構域(例如，PSMA結合結構域)包含具有N-末端至C-末端的構型(VL-連接子-VH)的scFv。本領域技術人員將能夠選擇出用於本發明的適合的構型。
連接子通常富含甘胺酸以實現柔性，以及富含絲胺酸或蘇胺酸以實現溶解性。連接子可連接細胞外抗原結合結構域的重鏈可變區和輕鏈可變區。連接子的非限制性實例在Shen等人，Anal.Chem.80(6)：1910-1917(2008)和WO 2014/087010(其內容特此藉由引用以其整體併入)中公開。各種連接子序列是本領域已知的，非限制性地包括甘胺酸絲胺酸(GS)連接子，如(GS)n、(GSGGS)n(SEQ ID NO：1)、(GGGS)n(SEQ ID NO：2)、和(GGGGS)n(SEQ ID NO：3)，其中n代表至少是1的整數。例示性連接子序列可包含胺基酸序列，非限制性地包括GGSG(SEQ ID NO：4)、GGSGG(SEQ ID NO：5)、GSGSG(SEQ ID NO：6)、GSGGG(SEQ ID NO：7)、GGGSG(SEQ ID NO：8)、GSSSG(SEQ ID NO：9)、GGGGS(SEQ ID NO：10)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：11)等。本領域技術人員將能夠選擇出用於本發明的適合的連接子序列。在一個實施方 式中，本發明的抗原結合結構域(例如，PSMA結合結構域)包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，其中VH和VL由具有胺基酸序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：11)的連接子序列分隔，該胺基酸序列可由核酸序列GGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATCT(SEQ ID NO：12)編碼。
儘管去除了恒定區並導入了連接子，但是scFv蛋白仍保持原始免疫球蛋白的特異性。如Huston，等人(Proc.Nat.Acad.Sci.USA,85：5879-5883,1988)描述的，單鏈Fv多肽抗體可由包含編碼VH和VL的序列的核酸表現。另外參見美國專利號5,091,513、5,132,405和4,956,778；以及美國專利公開號20050196754和20050196754。已經描述了具有抑制活性的拮抗性scFv(參見，例如，Zhao等人，Hyrbidoma(Larchmt)2008 27(6)：455-51；Peter等人，J Cachexia Sarcopenia Muscle 2012 August 12；Shieh等人，J Imunol 2009 183(4)：2277-85；Giomarelli等人，Thromb Haemost 2007 97(6)：955-63；Fife等，J Clin Invst 2006 116(8)：2252-61；Brocks等人，Immunotechnology 1997 3(3)：173-84；Moosmayer等人，Ther Immunol 1995 2(10：31-40))。已經描述了具有刺活化性的激動性scFv(參見，例如，Peter等人，J Bioi Chem 2003 25278(38)：36740-7；Xie等人，Nat Biotech 1997 15(8)：768-71；Ledbetter等人，Crit Rev Immunol 1997 17(5-6)：427-55；Ho等人，BioChim Biophys Acta 2003 1638(3)：257-66)。
如本文所用，「Fab」是指結合抗原但為單價且不具有Fc部分的抗體結構的片段，例如，由木瓜蛋白酶消化的抗體產生兩個Fab片段和一個Fc片段(例如，重(H)鏈恒定區；不結合抗原的Fc區)。
如本文所用，「F(ab')2」是指藉由胃蛋白酶消化整個IgG抗體產生的抗體片段，其中該片段具有兩個抗原結合(ab')(二價)區，其中每個(ab')區包含兩條單獨的胺基酸鏈，由S-S鍵連接的H鏈和 輕(L)鏈的部分用於結合抗原，並且其中其餘的H鏈部分連接在一起。一個F(ab')2片段可以分成兩個單獨的Fab'片段。
在一些實施方式中，抗原結合結構域可源自相同物種，CAR最終將會用於該物種中。例如，對於在人類中使用，CAR的抗原結合結構域可包含如本文其它部分描述的人類抗體，或其片段。
在例示性實施方式中，本發明的PSMA-CAR包含PSMA結合結構域，例如，PSMA特異性scFv。
(a)鼠PSMA結合結構域及其變體
在某些實施方式中，本發明的PSMA-CAR包含鼠PSMA結合結構域或其變體。
在某些實施方式中，本發明的PSMA-CAR包含非人類PSMA抗體(例如，小鼠或大鼠PSMA抗體)的PSMA結合結構域，或其變體。如本領域公知，鼠抗體或其它非人類抗體可藉由用人類PSMA或其片段免疫非人類(例如，小鼠)產生。
在一個實施方式中，PSMA結合結構域是鼠J591 PSMA結合結構域，鼠J591 PSMA結合結構域包含在以下列出的胺基酸序列中：
Figure 110107653-A0202-12-0035-1495
(SEQ ID NO：14)， 該胺基酸序列可由以下列出的核酸序列編碼：
Figure 110107653-A0202-12-0035-1494
Figure 110107653-A0202-12-0036-1496
Figure 110107653-A0202-12-0036-1497
(SEQ ID NO：15)。
鼠J591 PSMA結合結構域的可容許的改變對本領域技術人員將是已知的，同時保持與PSMA結合。例如，在一些實施方式中，PSMA結合結構域是鼠J591 PSMA結合結構域，鼠J591 PSMA結合結構域包含與包含在SEQ ID NO：14中的鼠J591 PSMA結合結構域胺基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的胺基酸序列。在一個實施方式中，PSMA結合結構域是包含在SEQ ID NO：14中列出的胺基酸序列中的鼠J591 PSMA結合結構域。
在一些實施方式中，PSMA結合結構域是鼠J591 PSMA結合結構域，鼠J591 PSMA結合結構域由與包含在SEQ ID NO：15中的鼠J591 PSMA結合結構域編碼序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的核酸序列編碼。在一個實施方式中，PSMA結合結構域是由包含在SEQ ID NO：15中列出的核酸序列中的編碼序列編碼的鼠J591 PSMA結合結構域。
在例示性實施方式中，本發明的PSMA-CAR包含PSMA結合結構域，例如，PSMA特異性scFv。在一個實施方式中，PSMA結合結構域是鼠J591 PSMA結合結構域，鼠J591 PSMA結合結構域包含以下列出的胺基酸序列：
Figure 110107653-A0202-12-0037-1499
Figure 110107653-A0202-12-0037-1500
(SEQ ID NO：13)，該胺基酸序列可由以下列出的核酸序列編碼：
Figure 110107653-A0202-12-0037-1498
Figure 110107653-A0202-12-0038-1501
Figure 110107653-A0202-12-0038-1502
(SEQ ID NO：180)。
鼠J591 PSMA結合結構域的可容許的改變對本領域技術人員將是已知的，同時保持與人PSMA結合。例如，在一些實施方式中，PSMA結合結構域是鼠J591 PSMA結合結構域，鼠J591 PSMA結合結構域包含與SEQ ID NO：13中列出的胺基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的胺基酸序列。在一個實施方式中，PSMA結合結構域是包含SEQ ID NO：13中列出的胺基酸序列的鼠J591 PSMA結合結構域。
在一些實施方式中，PSMA結合結構域是鼠J591 PSMA結合結構域，鼠J591 PSMA結合結構域由與SEQ ID NO：180中列出的核酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的核酸序列編碼。在一個實施方式中，PSMA結合結構域是由SEQ ID NO：180中列出的核酸序列編碼的鼠J591 PSMA結合結構域。
在一個實施方式中，鼠J591 PSMA結合結構域包含：包含以下列出的胺基酸序列的輕鏈可變區：
Figure 110107653-A0202-12-0039-1503
Figure 110107653-A0202-12-0039-1504
(SEQ ID NO：16)，該胺基酸序列可由以下列出的核酸序列編碼：
Figure 110107653-A0202-12-0039-1505
Figure 110107653-A0202-12-0039-1506
(SEQ ID NO：17)。
輕鏈可變區的可容許的改變對本領域技術人員將是已知的，同時保持其對人類PSMA的結合的貢獻。例如，在一些實施方式中，鼠J591 PSMA結合結構域包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含與SEQ ID NO：16中列出的胺基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的胺基酸序列。在一個實施方式中，鼠J591 PSMA結合結構域包含：包含SEQ ID NO：16中列出的胺基酸序列的輕鏈可變區。
在一些實施方式中，鼠J591 PSMA結合結構域包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區由與SEQ ID NO：17中列出的核酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至 少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的核酸序列編碼。在一個實施方式中，鼠J591 PSMA結合結構域包含由SEQ ID NO：17中列出的核酸序列編碼的輕鏈可變區。
在一個實施方式中，鼠J591 PSMA結合結構域包含NCBI GenBank序列數據庫ID：CCA78125.1中描述的輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含以下列出的胺基酸序列：
Figure 110107653-A0202-12-0040-1507
Figure 110107653-A0202-12-0040-1508
(SEQ ID NO：181)。
輕鏈可變區的可容許的改變對本領域技術人員將是已知的，同時保持其對人類PSMA的結合的貢獻。例如，在一些實施方式中，鼠J591 PSMA結合結構域包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含與SEQ ID NO：181中列出的胺基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的胺基酸序列。在一個實施方式中，鼠J591 PSMA結合結構域包含：包含SEQ ID NO：181中列出的胺基酸序列的輕鏈可變區。鼠J591 PSMA結合結構域的輕鏈可變區包含三個輕鏈互補決定區(CDR)。如本文所用，「互補決定區」或「CDR」是指抗原結合分子的可變區的與特異性抗原結合的區域。因此，鼠J591 PSMA結合結構域可包含：包含由胺基酸序列KASQDVGTAVD(SEQ ID NO：18)表示的CDR1；由胺基酸序列WASTRHT(SEQ ID NO：19)表示的CDR2；和由胺基酸序列QQYNSYPLT(SEQ ID NO：20)表示的CDR3的輕鏈可變區。輕鏈CDR的可容許的改變對本領域技術人員將是已知的，同時保持其對 PSMA的結合的貢獻。例如，鼠J591 PSMA結合結構域可包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：包含與SEQ ID NO：18中列出的CDR1胺基酸序列具有至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的胺基酸序列的CDR1。例如，鼠J591 PSMA結合結構域可包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：包含與SEQ ID NO：19中列出的CDR2胺基酸序列具有至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的胺基酸序列的CDR2。例如，鼠J591 PSMA結合結構域可包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：包含與SEQ ID NO：20中列出的CDR3胺基酸序列具有至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的胺基酸序列的CDR3。在一個實施方式中，鼠J591 PSMA結合結構域包含：包含三個前述輕鏈可變區CDR的輕鏈可變區。
在一個實施方式中，鼠J591 PSMA結合結構域包含：包含以下列出的胺基酸序列的重鏈可變區：
Figure 110107653-A0202-12-0041-1509
Figure 110107653-A0202-12-0041-1510
(SEQ ID NO：21)，該胺基酸序列可由以下列出的核酸序列編碼：
Figure 110107653-A0202-12-0041-1511
Figure 110107653-A0202-12-0042-1512
Figure 110107653-A0202-12-0042-1513
(SEQ ID NO：22)。
重鏈可變區的可容許的改變對本領域技術人員將是已知的，同時保持其對人類PSMA的結合的貢獻。例如，在一些實施方式中，鼠J591 PSMA結合結構域包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含與SEQ ID NO：21中列出的胺基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的胺基酸序列。在一個實施方式中，鼠J591 PSMA結合結構域包含：包含SEQ ID NO：21中列出的胺基酸序列的重鏈可變區。
在一些實施方式中，鼠J591 PSMA結合結構域包含重鏈可變區，該重鏈可變區由與SEQ ID NO：22中列出的核酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的核酸序列編碼。在一個實施方式中，鼠J591 PSMA結合結構域包含由SEQ ID NO：22中列出的核酸序列編碼的重鏈可變區。
在一個實施方式中，鼠J591 PSMA結合結構域包含NCBI GenBank序列數據庫ID：CCA78124.1中描述的重鏈可變區，該重鏈可變區包含以下列出的胺基酸序列：
Figure 110107653-A0202-12-0042-1514
Figure 110107653-A0202-12-0042-1515
(SEQ ID NO：182)。
重鏈可變區的可容許的改變對本領域技術人員將是已知的，同時保持其對PSMA的結合的貢獻。例如，在一些實施方式中，鼠J591 PSMA結合結構域包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含與SEQ ID NO：182中列出的胺基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的胺基酸序列。在一個實施方式中，鼠J591 PSMA結合結構域包含：包含SEQ ID NO：182中列出的胺基酸序列的重鏈可變區。
鼠J591 PSMA結合結構域的重鏈可變區包含三個重鏈互補決定區(CDR)。因此，鼠J591 PSMA結合結構域可包含：包含由胺基酸序列GYTFTEYTIH(SEQ ID NO：23)表示的CDR1；由胺基酸序列NINPNNGGTTYNQKFED(SEQ ID NO：24)表示的CDR2；和由胺基酸序列GWNFDY(SEQ ID NO：25)CDR3表示的重鏈可變區。重鏈CDR的可容許的改變對本領域技術人員將是已知的，同時保持其對人類PSMA的結合的貢獻。例如，鼠J591 PSMA結合結構域可包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含：包含與SEQ ID NO：23中列出的CDR1胺基酸序列具有至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的胺基酸序列的CDR1。例如，鼠J591 PSMA結合結構域可包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含：包含與SEQ ID NO：24中列出的CDR2胺基酸序列具有至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的胺基酸序列的CDR2。例如，鼠J591 PSMA結合結構域可包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含：包含與SEQ ID NO：25中列出的胺基酸序列CDR3具 有至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的胺基酸序列的CDR3。在一個實施方式中，鼠J591 PSMA結合結構域包含：包含三個前述重鏈可變區CDR的重鏈可變區。
在一個實施方式中，PSMA結合結構域是鼠J591 PSMA結合結構域，鼠J591 PSMA結合結構域包含：包含與SEQ ID NO：16和21中列出的胺基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的胺基酸序列。
在一個實施方式中，PSMA結合結構域是鼠J591 PSMA結合結構域，J591 PSMA結合結構域包含：包含與SEQ ID NO：181和182中列出的胺基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的胺基酸序列。
(b)人源化PSMA結合結構域
在某些實施方式中，本發明的PSMA-CAR包含非人類PSMA抗體的PSMA結合結構域或其變體或片段的人源化變體。在某些例示性實施方式中，PSMA CAR包含結合人類PSMA的鼠J591抗體的人源化變體。用於使鼠抗體人源化的方法是本領域公知的。
在一個實施方式中，PSMA結合結構域是人源化PSMA特異性結合結構域。在某些實施方式中，PSMA結合結構域是人源化J591 PSMA結合結構域。在某些實施方式中，PSMA結合結構域包含 PCT公開號WO2017212250A1和WO2018033749A1(其公開內容特此藉由引用以其全部併入本文)中公開的重鏈可變區和輕鏈可變區中的任意個。例如，本發明的PSMA結合結構域可包含：包含其中公開的重鏈可變區和輕鏈可變區中的任意個的scFv。因此，本發明的PSMA-CAR包含結合人類PSMA的鼠J591抗體的人源化變體，如WO2017212250A1和WO2018033749A1中公開的。
在某些實施方式中，本發明的PSMA結合結構域可包含表19中列出的任意個任意重鏈可變區和輕鏈可變區：
Figure 110107653-A0202-12-0045-1516
Figure 110107653-A0202-12-0046-1517
Figure 110107653-A0202-12-0047-1518
Figure 110107653-A0202-12-0048-1519
在某些實施方式中，本揭示的PSMA-CAR包含人源化PSMA特異性結合結構域。在一個實施方式中，PSMA結合結構域是包含以下列出的胺基酸序列的人源化J591(「huJ591」)結合結構域：
Figure 110107653-A0202-12-0048-1522
Figure 110107653-A0202-12-0048-1523
(SEQ ID NO：237)，該胺基酸序列可由以下列出的核酸序列編碼：
Figure 110107653-A0202-12-0048-1520
Figure 110107653-A0202-12-0048-1521
(SEQ ID NO：238)。
在某些實施方式中，PSMA結合結構域是包含以下列出的胺基酸序列的huJ591結合結構域：
Figure 110107653-A0202-12-0049-1524
Figure 110107653-A0202-12-0049-1525
(SEQ ID NO：239)，該胺基酸序列可由以下列出的核酸序列編碼：
Figure 110107653-A0202-12-0049-1526
Figure 110107653-A0202-12-0049-1527
(SEQ ID NO：240)。
在某些實施方式中，PSMA結合結構域是包含以下列出的胺基酸序列的huJ591結合結構域：
Figure 110107653-A0202-12-0049-1528
Figure 110107653-A0202-12-0049-1529
(SEQ ID NO：241)。
huJ591 PSMA結合結構域的可容許的改變對本領域技術 人員將是已知的，同時保持與人類PSMA結合。例如，在一些實施方式中，PSMA結合結構域是huJ591 PSMA結合結構域，huJ591 PSMA結合結構域包含與SEQ ID NO：237、SEQ ID NO：239、或SEQ ID NO：241中列出的胺基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的胺基酸序列。在一個實施方式中，PSMA結合結構域是包含SEQ ID NO：237、SEQ ID NO：239、或SEQ ID NO：241中列出的胺基酸序列的huJ591 PSMA結合結構域。
在一些實施方式中，PSMA結合結構域是由與SEQ ID NO：238或SEQ ID NO：240中列出的核酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的核酸序列編碼的huJ591 PSMA結合結構域。在一個實施方式中，PSMA結合結構域是由SEQ ID NO：238或SEQ ID NO：240中列出的核酸序列編碼的huJ591 PSMA結合結構域。
在一個實施方式中，huJ591 PSMA結合結構域包含：包含SEQ ID NO：191中列出的胺基酸序列的重鏈可變區，該胺基酸序列可由以下列出的核酸序列編碼：
Figure 110107653-A0202-12-0050-1530
Figure 110107653-A0202-12-0051-1531
Figure 110107653-A0202-12-0051-1532
(SEQ ID NO：242)。
重鏈可變區的可容許的改變對本領域技術人員將是已知的，同時保持其對人類PSMA的結合的貢獻。例如，在一些實施方式中，huJ591 PSMA結合結構域包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含與SEQ ID NO：191中列出的胺基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的胺基酸序列。在一個實施方式中，huJ591 PSMA結合結構域包含：包含SEQ ID NO：191中列出的胺基酸序列的重鏈可變區。
在一些實施方式中，huJ591 PSMA結合結構域包含由與SEQ ID NO：242中列出的核酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的核酸序列編碼的重鏈可變區。在一個實施方式中，huJ591 PSMA結合結構域包含由SEQ ID NO：242中列出的核酸序列編碼的重鏈可變區。
huJ591 PSMA結合結構域的重鏈可變區包含三個重鏈互補決定區(CDR)。因此，huJ591 PSMA結合結構域可包含：包含由胺基酸序列EYTIH(SEQ ID NO：243)表示的CDR1；由胺基酸序列NINPNNGGTTYNQKFED(SEQ ID NO：24)表示的CDR2；和由胺基酸序列GWNFDY(SEQ ID NO：25)表示的CDR3的重鏈可變區。重鏈CDR的可容許的改變對本領域技術人員將是已知的，同時 保持其對PSMA的結合的貢獻。例如，huJ591 PSMA結合結構域可包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含：包含與SEQ ID NO：243中列出的CDR1胺基酸序列具有至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的胺基酸序列的CDR1。例如，huJ591 PSMA結合結構域可包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含：包含與SEQ ID NO：24中列出的CDR2胺基酸序列具有至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的胺基酸序列的CDR2。例如，huJ591 PSMA結合結構域可包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含：包含與SEQ ID NO：25中列出的CDR3胺基酸序列具有至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的胺基酸序列的CDR3。在一個實施方式中，huJ591 PSMA結合結構域包含：包含三個前述重鏈可變區CDR的重鏈可變區。
在一個實施方式中，huJ591 PSMA結合結構域包含：包含SEQ ID NO：192中列出的胺基酸序列的輕鏈可變區，該胺基酸序列可由以下列出的核酸序列編碼：
Figure 110107653-A0202-12-0052-1533
Figure 110107653-A0202-12-0052-1534
(SEQ ID NO：244)。
輕鏈可變區的可容許的改變對本領域技術人員將是已知的，同時保持其對人類PSMA的結合的貢獻。例如，在一些實施方式中，huJ591 PSMA結合結構域包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含與SEQ ID NO：192中列出的胺基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的胺基酸序列。在一個實施方式中，huJ591 PSMA結合結構域包含：包含SEQ ID NO：192中列出的胺基酸序列的輕鏈可變區。
在一些實施方式中，huJ591 PSMA結合結構域包含由與SEQ ID NO：244中列出的核酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的核酸序列編碼的輕鏈可變區。在一個實施方式中，huJ591 PSMA結合結構域包含：包含由SEQ ID NO：244中列出的核酸序列編碼的輕鏈可變區。
huJ591 PSMA結合結構域的輕鏈可變區包含三個輕鏈互補決定區(CDR)。因此，huJ591 PSMA結合結構域可包含：包含由胺基酸序列KASQDVGTAVD(SEQ ID NO：18)表示的CDR1；由胺基酸序列WASTRHT(SEQ ID NO：19)表示的CDR2；和由胺基酸序列QQYNSYPLT(SEQ ID NO：20)表示的CDR3的輕鏈可變區。輕鏈CDR的可容許的改變對本領域技術人員將是已知的，同時保持其對PSMA的結合的貢獻。例如，huJ591 PSMA結合結構域可包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：包含與SEQ ID NO：18中列出的CDR1胺基酸序列具有至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、 至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的胺基酸序列的CDR1。例如，huJ591 PSMA結合結構域可包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：包含與SEQ ID NO：19中列出的CDR2胺基酸序列具有至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的胺基酸序列的CDR2。例如，huJ591 PSMA結合結構域可包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：包含與SEQ ID NO：20中列出的CDR3胺基酸序列具有至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的胺基酸序列的CDR3。在一個實施方式中，huJ591 PSMA結合結構域包含：包含三個前述輕鏈可變區CDR的輕鏈可變區。
(c)人類PSMA結合結構域
在某些實施方式中，本發明的PSMA-CAR包含人類PSMA抗體的PSMA結合結構域，或其變體。在一個實施方式中，PSMA結合結構域是包含以下列出的胺基酸序列的人類1C3 PSMA結合結構域：
Figure 110107653-A0202-12-0054-1535
Figure 110107653-A0202-12-0054-1536
(SEQ ID NO：26)， 該胺基酸序列可由以下列出的核酸序列編碼：
Figure 110107653-A0202-12-0055-1537
(SEQ ID NO：27)。
人類1C3 PSMA結合結構域的可容許的改變對本領域技術人員將是已知的，同時保持與人類PSMA結合。例如，在一些實施方式中，PSMA結合結構域是包含與SEQ ID NO：26中列出的胺基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的胺基酸序列的人類1C3 PSMA結合結構域。在一個 實施方式中，PSMA結合結構域是包含SEQ ID NO：26中列出的胺基酸序列的人類1C3 PSMA結合結構域。
在一些實施方式中，PSMA結合結構域是由與SEQ ID NO：27中列出的核酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的核酸序列編碼的人類1C3 PSMA結合結構域。在一個實施方式中，PSMA結合結構域是由SEQ ID NO：27中列出的核酸序列編碼的人類1C3 PSMA結合結構域。
在一個實施方式中，人類1C3 PSMA結合結構域包含：包含以下列出的胺基酸序列的重鏈可變區：
Figure 110107653-A0202-12-0056-1538
(SEQ ID NO：28)，該胺基酸序列可由以下列出的核酸序列編碼：
Figure 110107653-A0202-12-0056-1539
Figure 110107653-A0202-12-0056-1540
(SEQ ID NO：29)。
重鏈可變區的可容許的改變對本領域技術人員將是已知 的，同時保持其對人類PSMA的結合的貢獻。例如，在一些實施方式中，人類1C3 PSMA結合結構域包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含與SEQ ID NO：28中列出的胺基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的胺基酸序列。在一個實施方式中，人類1C3 PSMA結合結構域包含：包含SEQ ID NO：28中列出的胺基酸序列的重鏈可變區。
在一些實施方式中，人類1C3 PSMA結合結構域包含重鏈可變區，該重鏈可變區由與SEQ ID NO：29中列出的核酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的核酸序列編碼。在一個實施方式中，人類1C3 PSMA結合結構域包含由SEQ ID NO：29中列出的核酸序列編碼的重鏈可變區。
人類1C3 PSMA結合結構域的重鏈可變區包含三個重鏈互補決定區(CDR)。因此，人類1C3 PSMA結合結構域可包含：包含由胺基酸序列SYAMH(SEQ ID NO：30)表示的CDR1；由胺基酸序列VISYDGNNKYYADSVKG(SEQ ID NO：31)表示的CDR2；和由胺基酸序列AVPWGSRYYYYGMDV(SEQ ID NO：32)表示的CDR3的重鏈可變區。重鏈CDR的可容許的改變對本領域技術人員將是已知的，同時保持其對PSMA的結合的貢獻。例如，人類1C3 PSMA結合結構域可包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含：包含與SEQ ID NO：30中列出的CDR1胺基酸序列具有至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少 99%序列同一性的胺基酸序列的CDR1。例如，人類1C3 PSMA結合結構域可包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含：包含與SEQ ID NO：31中列出的CDR2胺基酸序列具有至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的胺基酸序列的CDR2。例如，人類1C3 PSMA結合結構域可包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含：包含與SEQ ID NO：32中列出的CDR3胺基酸序列具有至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的胺基酸序列的CDR3。在一個實施方式中，人類1C3 PSMA結合結構域包含：包含三個前述重鏈可變區CDR的重鏈可變區。
在一個實施方式中，人類1C3 PSMA結合結構域包含：包含以下列出的胺基酸序列的輕鏈可變區：
Figure 110107653-A0202-12-0058-1541
Figure 110107653-A0202-12-0058-1544
(SEQ ID NO：33)， 該胺基酸序列可由以下列出的核酸序列編碼：
Figure 110107653-A0202-12-0058-1542
Figure 110107653-A0202-12-0058-1543
(SEQ ID NO：34)。
輕鏈可變區的可容許的改變對本領域技術人員將是已知的，同時保持其對人類PSMA的結合的貢獻。例如，在一些實施方式 中，人類1C3 PSMA結合結構域包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含與SEQ ID NO：33中列出的胺基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的胺基酸序列。在一個實施方式中，人類1C3 PSMA結合結構域包含：包含SEQ ID NO：33中列出的胺基酸序列的輕鏈可變區。
在一些實施方式中，人類1C3 PSMA結合結構域包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區由與SEQ ID NO：34中列出的核酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的核酸序列編碼。在一個實施方式中，人類1C3 PSMA結合結構域包含由SEQ ID NO：34中列出的核酸序列編碼的輕鏈可變區。
人類1C3 PSMA結合結構域的輕鏈可變區包含三個輕鏈互補決定區(CDR)。因此，人類1C3 PSMA結合結構域可包含：包含由胺基酸序列RASQGISSALA(SEQ ID NO：35)表示的CDR1；由胺基酸序列DASSLES(SEQ ID NO：36)表示的CDR2；和由胺基酸序列QQFNSYPLT(SEQ ID NO：37)表示的CDR3的輕鏈可變區。輕鏈CDR的可容許的改變對本領域技術人員將是已知的，同時保持其對PSMA的結合的貢獻。例如，人類1C3 PSMA結合結構域可包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：包含與SEQ ID NO：35中列出的CDR1胺基酸序列具有至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的胺基酸序列的CDR1。例如，人類1C3 PSMA結合結構域可包含輕鏈可變 區，該輕鏈可變區包含：包含與SEQ ID NO：36中列出的CDR2胺基酸序列具有至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的胺基酸序列的CDR2。例如，人類1C3 PSMA結合結構域可包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：包含與SEQ ID NO：37中列出的CDR3胺基酸序列具有至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的胺基酸序列的CDR3。在一個實施方式中，人類1C3 PSMA結合結構域包含：包含三個前述輕鏈可變區CDR的輕鏈可變區。
在一個實施方式中，PSMA結合結構域是包含以下列出的胺基酸序列的人類2A10 PSMA結合結構域：
Figure 110107653-A0202-12-0060-1546
(SEQ ID NO：38)，該胺基酸序列可由以下列出的核酸序列編碼：
Figure 110107653-A0202-12-0060-1545
Figure 110107653-A0202-12-0061-1547
Figure 110107653-A0202-12-0061-1548
(SEQ ID NO：39)。
人類2A10 PSMA結合結構域的可容許的改變對本領域技術人員將是已知的，同時保持與人類PSMA結合。例如，在一些實施方式中，PSMA結合結構域是人類2A10 PSMA結合結構域，人類2A10 PSMA結合結構域包含與SEQ ID NO：38中列出的胺基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的胺基酸序列。在一個實施方式中，PSMA結合結構域是包含SEQ ID NO：38中列出的胺基酸序列的人類2A10 PSMA結合結構域。
在一些實施方式中，PSMA結合結構域是由與SEQ ID NO：39中列出的核酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的核酸序列編碼的人類2A10 PSMA結合結構域。在一個實施方式中，PSMA結合結構域是由SEQ ID NO：39中列出的核酸序列編碼的人類2A10 PSMA結合結構域。
在一個實施方式中，人類2A10 PSMA結合結構域包含：包含以下列出的胺基酸序列的重鏈可變區：
Figure 110107653-A0202-12-0062-1549
Figure 110107653-A0202-12-0062-1550
(SEQ ID NO：40)，該胺基酸序列可由以下列出的核酸序列編碼：
Figure 110107653-A0202-12-0062-1551
Figure 110107653-A0202-12-0062-1552
(SEQ ID NO：41)。
重鏈可變區的可容許的改變對本領域技術人員將是已知的，同時保持其對人類PSMA的結合的貢獻。例如，在一些實施方式中，人類2A10 PSMA結合結構域包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含與SEQ ID NO：40中列出的胺基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的胺基酸序列。在一個實施方式中，人類2A10 PSMA結合結構域包含：包含SEQ ID NO：40中列出的胺基酸序列的重鏈可變區。
在一些實施方式中，人類2A10 PSMA結合結構域包含由與SEQ ID NO：41中列出的核酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的核酸序列編碼的重鏈可變區。在一個實施方式中，人類2A10 PSMA結合結構域包含由SEQ ID NO：41中列出的核酸序列編碼的重鏈可變區。
人類2A10 PSMA結合結構域的重鏈可變區包含三個重鏈互補決定區(CDR)。因此，人類2A10 PSMA結合結構域可包含：包含由胺基酸序列SNWIG(SEQ ID NO：42)表示的CDR1；由胺基酸序列IIYPGDSDTRYSPSFQG(SEQ ID NO：43)表示的CDR2；和由胺基酸序列QTGFLWSSDL(SEQ ID NO：44)表示的CDR3的重鏈可變區。重鏈CDR的可容許的改變對本領域技術人員將是已知的，同時保持其對人類PSMA的結合的貢獻。例如，人類2A10 PSMA結合結構域可包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含：包含與SEQ ID NO：42中列出的CDR1胺基酸序列具有至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的胺基酸序列的CDR1。例如，人類2A10 PSMA結合結構域可包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含：包含與SEQ ID NO：43中列出的CDR2胺基酸序列具有至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的胺基酸序列的CDR2。例如，人類2A10 PSMA結合結構域可包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含：包含與SEQ ID NO：44中列出的CDR3胺基酸序列具有至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、 至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的胺基酸序列的CDR3。在一個實施方式中，人類2A10 PSMA結合結構域包含：包含三個前述重鏈可變區CDR的重鏈可變區。
在一個實施方式中，人類2A10 PSMA結合結構域包含：包含以下列出的胺基酸序列的輕鏈可變區：
Figure 110107653-A0202-12-0064-1553
Figure 110107653-A0202-12-0064-1554
(SEQ ID NO：45)，該胺基酸序列可由以下列出的核酸序列編碼：
Figure 110107653-A0202-12-0064-1556
Figure 110107653-A0202-12-0064-1555
(SEQ ID NO：46)。
輕鏈可變區的可容許的改變對本領域技術人員將是已知的，同時保持其對人類PSMA的結合的貢獻。例如，在一些實施方式中，人類2A10 PSMA結合結構域包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含與SEQ ID NO：45中列出的胺基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的胺基酸序列。在一個實施方式中，人類2A10 PSMA結合結構域包含：包含SEQ ID NO：45中列出的胺基酸序列的輕鏈可變區。
在一些實施方式中，人類2A10 PSMA結合結構域包含 由與SEQ ID NO：46中列出的核酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的核酸序列編碼的輕鏈可變區。在一個實施方式中，人類2A10 PSMA結合結構域包含由SEQ ID NO：46中列出的核酸序列編碼的輕鏈可變區。
人類2A10 PSMA結合結構域的輕鏈可變區包含三個輕鏈互補決定區(CDR)。因此，人類2A10 PSMA結合結構域可包含：包含由胺基酸序列CRASQDISSAL(SEQ ID NO：47)表示的CDR1；由胺基酸序列YDASSLES(SEQ ID NO：48)表示的CDR2；和由胺基酸序列CQQFNSYPLT(SEQ ID NO：49)表示的CDR3的輕鏈可變區。輕鏈CDR的可容許的改變對本領域技術人員將是已知的，同時保持其對PSMA的結合的貢獻。例如，人類2A10 PSMA結合結構域可包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：包含與SEQ ID NO：47中列出的CDR1胺基酸序列具有至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的胺基酸序列的CDR1。例如，人類2A10 PSMA結合結構域可包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：包含與SEQ ID NO：48中列出的CDR2胺基酸序列具有至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的胺基酸序列的CDR2。例如，人類2A10 PSMA結合結構域可包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：包含與SEQ ID NO：49中列出的CDR3胺基酸序列具有至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的胺基 酸序列的CDR3。在一個實施方式中，人類2A10 PSMA結合結構域包含：包含三個前述輕鏈可變區CDR的輕鏈可變區。
在一個實施方式中，PSMA結合結構域是包含以下列出的胺基酸序列的人類2F5 PSMA結合結構域：
Figure 110107653-A0202-12-0066-1558
(SEQ ID NO：50)，該胺基酸序列可由以下列出的核酸序列編碼：
Figure 110107653-A0202-12-0066-1557
Figure 110107653-A0202-12-0067-1737
Figure 110107653-A0202-12-0067-1560
(SEQ ID NO：51)。
人類2F5 PSMA結合結構域的可容許的改變對本領域技術人員將是已知的，同時保持與人類PSMA結合。例如，在一些實施方式中，PSMA結合結構域是包含與SEQ ID NO：50中列出的胺基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的胺基酸序列的人類2F5 PSMA結合結構域。在一個實施方式中，PSMA結合結構域是包含SEQ ID NO：50中列出的胺基酸序列的人類2F5 PSMA結合結構域。
在一些實施方式中，PSMA結合結構域是由與SEQ ID NO：51中列出的核酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的核酸序列編碼的人類2F5 PSMA結合結構域。在一個實施方式中，PSMA結合結構域是由SEQ ID NO：51中列出的核酸序列編碼的人類2F5 PSMA結合結構域。
在一個實施方式中，人類2F5 PSMA結合結構域包含：包含以下列出的胺基酸序列的重鏈可變區：
Figure 110107653-A0202-12-0067-1561
Figure 110107653-A0202-12-0067-1562
(SEQ ID NO：52)， 該胺基酸序列可由以下列出的核酸序列編碼：
Figure 110107653-A0202-12-0068-1563
Figure 110107653-A0202-12-0068-1564
(SEQ ID NO：53)。
重鏈可變區的可容許的改變對本領域技術人員將是已知的，同時保持其對人類PSMA的結合的貢獻。例如，在一些實施方式中，人類2F5 PSMA結合結構域包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含與SEQ ID NO：52中列出的胺基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的胺基酸序列。在一個實施方式中，人類2F5 PSMA結合結構域包含：包含SEQ ID NO：52中列出的胺基酸序列的重鏈可變區。
在一些實施方式中，人類2F5 PSMA結合結構域包含由與SEQ ID NO：53中列出的核酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的核酸序列編碼的重鏈可變區。在一個實施方式中，人類2F5 PSMA結合結構域包含由SEQ ID NO：53中列出的核酸序列編碼的重鏈可變區。
人類2F5 PSMA結合結構域的重鏈可變區包含三個重鏈互補決定區(CDR)。因此，人類2F5 PSMA結合結構域可包含：包含由胺基酸序列SNWIG(SEQ ID NO：54)表示的CDR1；由胺基酸序列IIYPGDSDTRYSPSFQG(SEQ ID NO：55)表示的CDR2；和由胺基酸序列QTGFLWSFDL(SEQ ID NO：56)表示的CDR3的重鏈可變區。重鏈CDR的可容許的改變對本領域技術人員將是已知的，同時保持其對PSMA的結合的貢獻。例如，人類2F5 PSMA結合結構域可包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含：包含與SEQ ID NO：54中列出的CDR1胺基酸序列具有至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的胺基酸序列的CDR1。例如，人類2F5 PSMA結合結構域可包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含：包含與SEQ ID NO：55中列出的CDR2胺基酸序列具有至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的胺基酸序列的CDR2。例如，人類2F5 PSMA結合結構域可包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含：包含與SEQ ID NO：56中列出的CDR3胺基酸序列具有至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的胺基酸序列的CDR3。在一個實施方式中，人類2F5 PSMA結合結構域包含：包含三個前述重鏈可變區CDR的重鏈可變區。
在一個實施方式中，人類2F5 PSMA結合結構域包含：包含以下列出的胺基酸序列的輕鏈可變區：
Figure 110107653-A0202-12-0069-1566
Figure 110107653-A0202-12-0069-1565
(SEQ ID NO：57)， 該胺基酸序列可由以下列出的核酸序列編碼：
Figure 110107653-A0202-12-0070-1567
Figure 110107653-A0202-12-0070-1568
(SEQ ID NO：58)。
輕鏈可變區的可容許的改變對本領域技術人員將是已知的，同時保持其對人類PSMA的結合的貢獻。例如，在一些實施方式中，人類2F5 PSMA結合結構域包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含與SEQ ID NO：57中列出的胺基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的胺基酸序列。在一個實施方式中，人類2F5 PSMA結合結構域包含：包含SEQ ID NO：57中列出的胺基酸序列的輕鏈可變區。
在一些實施方式中，人類2F5 PSMA結合結構域包含由與SEQ ID NO：58中列出的核酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的核酸序列編碼的輕鏈可變區。在一個實施方式中，人類2F5 PSMA結合結構域包含由SEQ ID NO：58中列出的核酸序列編碼的輕鏈可變區。
人類2F5 PSMA結合結構域的輕鏈可變區包含三個輕鏈互補決定區(CDR)。因此，人類2F5 PSMA結合結構域可包含：包含由胺基酸序列RASQDISSALA(SEQ ID NO：59)表示的CDR1；由胺基酸序列DASSLES(SEQ ID NO：60)表示的CDR2；和由胺基酸序列QQFNSYPLT(SEQ ID NO：61)表示的CDR3的輕鏈可變區。輕鏈CDR的可容許的改變對本領域技術人員將是已知的，同時保持其對PSMA的結合的貢獻。例如，人類2F5 PSMA結合結構域可包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：包含與SEQ ID NO：59中列出的CDR1胺基酸序列具有至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的胺基酸序列的CDR1。例如，人類2F5 PSMA結合結構域可包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：包含與SEQ ID NO：60中列出的CDR2胺基酸序列具有至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的胺基酸序列的CDR2。例如，人類2F5 PSMA結合結構域可包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：包含與SEQ ID NO：61中列出的CDR3胺基酸序列具有至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的胺基酸序列的CDR3。在一個實施方式中，人類2F5 PSMA結合結構域包含：包含三個前述輕鏈可變區CDR的輕鏈可變區。
在一個實施方式中，PSMA結合結構域是包含以下列出的胺基酸序列的人類2C6 PSMA結合結構域：
Figure 110107653-A0202-12-0071-1569
Figure 110107653-A0202-12-0072-1570
(SEQ ID NO：62)，
該胺基酸序列可由以下列出的核酸序列編碼：
Figure 110107653-A0202-12-0072-1572
Figure 110107653-A0202-12-0072-1573
(SEQ ID NO：63)。
人類2C6 PSMA結合結構域的可容許的改變對本領域技術人員將是已知的，同時保持與人類PSMA結合。例如，在一些實施方式中，PSMA結合結構域是包含與SEQ ID NO：62中列出的胺基酸序 列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的胺基酸序列的人類2C6 PSMA結合結構域。在一個實施方式中，PSMA結合結構域是包含SEQ ID NO：62中列出的胺基酸序列的人類2C6 PSMA結合結構域。
在一些實施方式中，PSMA結合結構域是由與SEQ ID NO：63中列出的核酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的核酸序列編碼的人類2C6 PSMA結合結構域。在一個實施方式中，PSMA結合結構域是由SEQ ID NO：63中列出的核酸序列編碼的人類2C6 PSMA結合結構域。
在一個實施方式中，人類2C6 PSMA結合結構域包含：包含以下列出的胺基酸序列的重鏈可變區：
Figure 110107653-A0202-12-0073-1575
Figure 110107653-A0202-12-0073-1576
(SEQ ID NO：64)，該胺基酸序列可由以下列出的核酸序列編碼：
Figure 110107653-A0202-12-0073-1574
Figure 110107653-A0202-12-0074-1577
Figure 110107653-A0202-12-0074-1578
(SEQ ID NO：65)。
重鏈可變區的可容許的改變對本領域技術人員將是已知的，同時保持其對人類PSMA的結合的貢獻。例如，在一些實施方式中，人類2C6 PSMA結合結構域包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含與SEQ ID NO：64中列出的胺基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的胺基酸序列。在一個實施方式中，人類2C6 PSMA結合結構域包含：包含SEQ ID NO：64中列出的胺基酸序列的重鏈可變區。
在一些實施方式中，人類2C6 PSMA結合結構域包含由與SEQ ID NO：65中列出的核酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的核酸序列編碼的重鏈可變區。在一個實施方式中，人類2C6 PSMA結合結構域包含由SEQ ID NO：65中列出的核酸序列編碼的重鏈可變區。
人類2C6 PSMA結合結構域的重鏈可變區包含三個重鏈互補決定區(CDR)。因此，人類2C6 PSMA結合結構域可包含：包含由胺基酸序列TNYWI(SEQ ID NO：66)表示的CDR1；由胺基酸序列GIIYPGDSDTRYSPSFQG(SEQ ID NO：67)表示的CDR2；和由胺基酸序列SPGYTSSWTS(SEQ ID NO：68)表示的CDR3的重鏈可變區。重鏈CDR的可容許的改變對本領域技術人員將是已知的， 同時保持其對PSMA的結合的貢獻。例如，人類2C6 PSMA結合結構域可包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含與SEQ ID NO：66中列出的CDR1胺基酸序列具有至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的胺基酸序列的CDR1。例如，人類2C6 PSMA結合結構域可包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含：包含與SEQ ID NO：67中列出的CDR2胺基酸序列具有至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的胺基酸序列的CDR2。例如，人類2C6 PSMA結合結構域可包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含：包含與SEQ ID NO：68中列出的CDR3胺基酸序列具有至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的胺基酸序列的CDR3。在一個實施方式中，人類2C6 PSMA結合結構域包含：包含三個前述重鏈可變區CDR的重鏈可變區。
在一個實施方式中，人類2C6 PSMA結合結構域包含：包含以下列出的胺基酸序列的輕鏈可變區：
Figure 110107653-A0202-12-0075-1580
Figure 110107653-A0202-12-0075-1581
(SEQ ID NO：69)，該胺基酸序列可由以下列出的核酸序列編碼：
Figure 110107653-A0202-12-0075-1579
Figure 110107653-A0202-12-0076-1582
Figure 110107653-A0202-12-0076-1583
(SEQ ID NO：70)。
輕鏈可變區的可容許的改變對本領域技術人員將是已知的，同時保持其對人類PSMA的結合的貢獻。例如，在一些實施方式中，人類2C6 PSMA結合結構域包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含與SEQ ID NO：69中列出的胺基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的胺基酸序列。在一個實施方式中，人類2C6 PSMA結合結構域包含：包含SEQ ID NO：69中列出的胺基酸序列的輕鏈可變區。
在一些實施方式中，人類2C6 PSMA結合結構域包含由與SEQ ID NO：70中列出的核酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的核酸序列編碼的輕鏈可變區。在一個實施方式中，人類2C6 PSMA結合結構域包含由SEQ ID NO：70中列出的核酸序列編碼的輕鏈可變區。
人類2C6 PSMA結合結構域的輕鏈可變區包含三個輕鏈互補決定區(CDR)。因此，人類2C6 PSMA結合結構域可包含：包含由胺基酸序列CRASQSVSSYL(SEQ ID NO：71)表示的CDR1；由胺基酸序列YDASNRAT(SEQ ID NO：72)表示的CDR2；和由胺基酸序列CQQRSNWPLFT(SEQ ID NO：73)表示的CDR3的輕鏈可變區。輕鏈CDR的可容許的改變對本領域技術人員將是已知的，同時保持其對PSMA的結合的貢獻。例如，人類2C6 PSMA結合結構域 可包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：包含與SEQ ID NO：71中列出的CDR1胺基酸序列具有至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的胺基酸序列的CDR1。例如，人類2C6 PSMA結合結構域可包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：包含與SEQ ID NO：72中列出的CDR2胺基酸序列具有至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的胺基酸序列的CDR2。例如，人類2C6 PSMA結合結構域可包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：包含與SEQ ID NO：73中列出的CDR3胺基酸序列具有至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的胺基酸序列的CDR3。在一個實施方式中，人類2C6 PSMA結合結構域包含：包含三個前述輕鏈可變區CDR的輕鏈可變區。
跨膜結構域
本發明的CAR(例如，PSMA-CAR)可包含將CAR的抗原結合結構域與CAR的細胞內結構域連接的跨膜結構域。對象CAR的跨膜結構域是能夠跨越細胞(例如，免疫細胞或其前體)的質膜的區域。跨膜結構域用於插入到細胞膜(例如，真核細胞膜)中。在一些實施方式中，跨膜結構域被插入到CAR的抗原結合結構域和細胞內結構域之間。
在一些實施方式中，跨膜結構域天然地與CAR中的結構域中的一個或多個關聯。在一些實施方式中，跨膜結構域可藉由一個或多個胺基酸取代來選擇或修飾，以避免這樣的結構域與相同或不同的表面膜蛋白的跨膜結構域結合，從而使與受體複合體的其它成員的相互作 用最小。
跨膜結構域可源自天然來源或合成來源。在天然來源的情況下，該結構域可源自任意膜結合蛋白或跨膜蛋白，例如，I型跨膜蛋白。在合成來源的情況下，跨膜結構域可以是促進將CAR插入到細胞膜中的任意的人工序列，例如，人工疏水序列。具體用於本發明的跨膜結構域的實例非限制性地包括源自(即至少包含以下中的跨膜區(一個或多個))T細胞受體的α、β或ζ鏈、CD28、CD3 ε、CD45、CD4、CD5、CD7、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134(OX-40)、CD137(4-1BB)、CD154(CD40L)、Toll樣受體1(TLR1)、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、和TLR9的跨膜結構域。在一些實施方式中，跨膜結構域可以是合成的，在該情況下，它將包含占主導的疏水殘基，如亮胺酸和纈胺酸。優選地，將在合成跨膜結構域的每一端處發現苯基丙胺酸、色胺酸和纈胺酸的三聯體。
本文所述的跨膜結構域可與本文所述的任意抗原結合結構域組合、可與本文所述的任意細胞內結構域組合、或可與可包括在對象CAR中的本文所述的任意其它結構域組合。
在一些實施方式中，跨膜結構域進一步包含鉸鏈區。本發明的對象CAR還可包括鉸鏈區。CAR的鉸鏈區是位於抗原結合結構域和跨膜結構域之間的親水區。在一些實施方式中，該結構域促進關於CAR的適當的蛋白質折疊。鉸鏈區是CAR的任選的組分。鉸鏈區可包括選自抗體的Fc片段、抗體的鉸鏈區、抗體的CH2區、抗體的CH3區、人工鉸鏈序列或其組合的結構域。鉸鏈區的實例非限制性地包括CD8a鉸鏈、由可少至三個甘胺酸(Gly)的多肽構成的人工鉸鏈、以及IgG(如人類IgG4)的CH1結構域和CH3結構域。
在一些實施方式中，本揭示的對象CAR包括將抗原結合結構域與跨膜結構域連接的鉸鏈區，跨膜結構域進而與細胞內結構域連接。鉸鏈區優選能夠支持抗原結合結構域識別目標細胞上的目標抗原並 與其結合(參見，例如，Hudecek等人，Cancer Immunol.Res.(2015)3(2)：125-135)。在一些實施方式中，鉸鏈區是柔性結構域，因而允許抗原結合結構域具有以最佳方式識別細胞(如腫瘤細胞)上目標抗原的特異性結構和密度的結構(Hudecek等人，見上文)。鉸鏈區的柔性允許鉸鏈區採取多種不同的構象。
在一些實施方式中，鉸鏈區是免疫球蛋白重鏈鉸鏈區。在一些實施方式中，鉸鏈區是源自受體的鉸鏈區多肽(例如，CD8來源的鉸鏈區)。
鉸鏈區的長度可為4個胺基酸至約50個胺基酸，例如，約4aa至約10aa、約10aa至約15aa、約15aa至約20aa、約20aa至約25aa、約25aa至約30aa、約30aa至約40aa、或約40aa至約50aa。
合適的鉸鏈區可以容易地選擇並且可以具有任意多種合適的長度，如1個胺基酸(例如，Gly)至20個胺基酸、2個胺基酸至15個胺基酸、3個胺基酸至12個胺基酸，包括4個胺基酸至10個胺基酸、5個胺基酸至9個胺基酸、6個胺基酸至8個胺基酸、或7個胺基酸至8個胺基酸，並且可以是1、2、3、4、5、6、或7個胺基酸。
例如，鉸鏈區包括甘胺酸多聚體(G)n、甘胺酸-絲胺酸多聚體(包括，例如，(GS)n、(GSGGS)n(SEQ ID NO：1)和(GGGS)n(SEQ ID NO：2)，其中n是至少為1的整數)、甘胺酸-丙胺酸多聚體、丙胺酸-絲胺酸多聚體、和本領域已知的其它柔性連接子。可以使用甘胺酸多聚體和甘胺酸-絲胺酸多聚體；Gly和Ser兩者是相對非結構的(unstructured)，因此可充當這些組分之間的中性連接物(tether)。可以使用甘胺酸多聚體；甘胺酸實現了比均一的丙胺酸顯著更多的φ-ψ(phi-psi)空間，並且比具有較長側鏈的殘基受到的限制要少得多(參見，例如，Scheraga,Rev.Computational.Chem.(1992)2：73-142)。例示性鉸鏈區可包含胺基酸序列，該胺基酸序列包括但不限於GGSG(SEQ ID NO：4)、GGSGG(SEQ ID NO：5)、GSGSG(SEQ ID NO：6)、GSGGG(SEQ ID NO：7)、GGGSG(SEQ ID NO：8)、GSSSG(SEQ ID NO：9)等。
在一些實施方式中，鉸鏈區是免疫球蛋白重鏈鉸鏈區。免疫球蛋白鉸鏈區胺基酸序列是本領域已知的；參見，例如，Tan等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1990)87(1)：162-166；和Huck等人，Nucleic Acids Res.(1986)14(4)：1779-1789。作為非限制性實例，免疫球蛋白鉸鏈區可包括以下胺基酸序列中的一個：DKTHT(SEQ ID NO：74)；CPPC(SEQ ID NO：75)；CPEPKSCDTPPPCPR(SEQ ID NO：76)(參見，例如，Glaser等人，J.Biol.Chem.(2005)280：41494-41503)；ELKTPLGDTTHT(SEQ ID NO：77)；KSCDKTHTCP(SEQ ID NO：78)；KCCVDCP(SEQ ID NO：79)；KYGPPCP(SEQ ID NO：80)；EPKSCDKTHTCPPCP(SEQ ID NO：81)(人類IgG1鉸鏈)；ERKCCVECPPCP(SEQ ID NO：82)(人類IgG2鉸鏈)；ELKTPLGDTTHTCPRCP(SEQ ID NO：83)(人類IgG3鉸鏈)；SPNMVPHAHHAQ(SEQ ID NO：84)(人類IgG4鉸鏈)；等。
鉸鏈區可包含人類IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4、鉸鏈區的胺基酸序列。在一個實施方式中，該鉸鏈區相比於野生型(天然存在的)鉸鏈區可包括一個或多個胺基酸取代及/或插入及/或缺失。例如，人類IgG1鉸鏈的His229可用Tyr取代，使得該鉸鏈區包含序列EPKSCDKTYTCPPCP(SEQ ID NO：85)；參見，例如，Yan等人，J.Biol.Chem.(2012)287：5891-5897。在一個實施方式中，鉸鏈區可包含源自人類CD8，或其變體的胺基酸序列。
跨膜結構域可與任意鉸鏈區組合及/或可包含本文所述的一種或多種跨膜結構域。在一個實施方式中，跨膜結構域包含CD8跨膜結構域。在一個實施方式中，跨膜結構域包含CD8鉸鏈區和CD8跨膜結構域。在一些實施方式中，對象CAR包含具有以下列出的胺基酸序列的CD8鉸鏈區： TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD(SEQ ID NO：86)，該胺基酸序列可由以下列出的核酸序列編碼：
Figure 110107653-A0202-12-0081-1585
Figure 110107653-A0202-12-0081-1584
(SEQ ID NO：87)。
跨膜結構域的可容許的改變對本領域技術人員將是已知的，同時保持其預期功能。例如，在一些實施方式中，本發明的對象CAR包含跨膜結構域，該跨膜結構域包含：包含與SEQ ID NO：86中列出的胺基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的胺基酸序列的CD8鉸鏈區。在一個實施方式中，該CAR包含跨膜結構域，該跨膜結構域包含：包含SEQ ID NO：86中列出的胺基酸序列的CD8鉸鏈區。
在一些實施方式中，本發明的對象CAR包含：包含由與SEQ ID NO：87中列出的核酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的核酸序列編碼的CD8鉸鏈區的跨膜結構域。在一個實施方式中，該CAR包含：包含由SEQ ID NO：87中列出的核酸序列編碼的CD8鉸鏈區的跨膜結構域。
在一些實施方式中，對象CAR包含具有以下列出的胺基酸序列的CD8跨膜結構域：IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC(SEQ ID NO：88)， 該胺基酸序列可由以下列出的核酸序列編碼：ATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGC(SEQ ID NO：89)。
跨膜結構域的可容許的改變對本領域技術人員將是已知的，同時保持其預期功能。例如，在一些實施方式中，本發明的對象CAR包含跨膜結構域，該跨膜結構域包含：包含與SEQ ID NO：88中列出的胺基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的胺基酸序列的CD8跨膜結構域。在一個實施方式中，該CAR包含跨膜結構域，該跨膜結構域包含：包含SEQ ID NO：88中列出的胺基酸序列的CD8跨膜結構域。
在一些實施方式中，本發明的對象CAR包含跨膜結構域，該跨膜結構域包含由與SEQ ID NO：89.中列出的核酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的核酸序列編碼的CD8跨膜結構域。在一個實施方式中，該CAR包含跨膜結構域，該跨膜結構域包含由SEQ ID NO：89中列出的核酸序列編碼的CD8跨膜結構域。
在一些實施方式中，跨膜結構域包含具有以下列出的胺基酸序列的CD8鉸鏈區和CD8跨膜結構域：TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC(SEQ ID NO：90)，該胺基酸序列可由以下列出的核酸序列編碼：
Figure 110107653-A0202-12-0083-1586
Figure 110107653-A0202-12-0083-1587
(SEQ ID NO：91)。
跨膜結構域的可容許的改變對本領域技術人員將是已知的，同時保持其預期功能。例如，在一些實施方式中，本發明的對象CAR包含跨膜結構域，該跨膜結構域包含：包含與SEQ ID NO：90中列出的胺基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的胺基酸序列的CD8鉸鏈區和CD8跨膜結構域。在一個實施方式中，該CAR包含跨膜結構域，該跨膜結構域包含：包含SEQ ID NO：90中列出的胺基酸序列的CD8鉸鏈區和CD8跨膜結構域。
在一些實施方式中，本發明的對象CAR包含跨膜結構域，該跨膜結構域包含由與SEQ ID NO：91中列出的核酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的核酸序列編碼的CD8鉸鏈區和CD8跨膜結構域。在一個實施方式中，該CAR包含跨膜結構域，該跨膜結構域包含由SEQ ID NO：91中列出的核酸序列編碼的CD8鉸鏈區和CD8跨膜結構域。
在CAR的細胞外結構域和跨膜結構域之間，或在CAR的細胞內結構域和跨膜結構域之間，可併入間隔子結構域。如本文所用， 術語「間隔子結構域」總體上意指起到將跨膜結構域與多肽鏈中的細胞外結構域或細胞內結構域連接的作用的任意寡肽或多肽。間隔子結構域可包含多達300個胺基酸，例如，10至100個胺基酸，或25至50個胺基酸。在一些實施方式中，間隔子結構域可以是例如長度在2和10個胺基酸之間的短的寡肽連接子或多肽連接子。例如，甘胺酸-絲胺酸雙聯體提供了對象CAR的跨膜結構域和細胞內信號傳導結構域之間尤其合適的連接子。
細胞內信號傳導結構域
本發明的對象CAR還包括細胞內信號傳導結構域。術語「細胞內信號傳導結構域」和「細胞內結構域」在本文中可互換使用。CAR的細胞內信號傳導結構域負責CAR所表現的細胞(例如，免疫細胞)的效應物功能中的至少一種的活化。細胞內信號傳導結構域轉導效應物功能信號並指導細胞(例如，免疫細胞)執行其專門的功能，例如，傷害及/或毀壞目標細胞。
用於本發明的細胞內結構域的實例包括但不限於表面受體的細胞質部分、共刺激分子和一致作用以發起T細胞中信號轉導的任意分子，以及這些元件的任意衍生物或變體和具有相同功能能力的任意合成序列。
細胞內信號傳導結構域的實例非限制性地包括T細胞受體複合體的ζ鏈或其任意同系物，例如，η鏈、FcsRIγ和β鏈、MB 1(Iga)鏈、B29(Ig)鏈等、人類CD3 ζ鏈、CD3多肽(△、δ和ε)、syk家族酪胺酸激酶(Syk、ZAP 70等)、src家族酪胺酸激酶(Lck、Fyn、Lyn等)，以及參與T細胞轉導的其它分子，如CD2、CD5和CD28。在一個實施方式中，細胞內信號傳導結構域可以是人類CD3 ζ鏈、FcyRIII、FcsRI、Fc受體的胞質尾區、攜帶免疫受體酪胺酸活化基序(ITAM)的細胞質受體、及其組合。
在一個實施方式中，該CAR的細胞內信號傳導結構域包 括一種或多種共刺激分子的任意部分，諸如來自CD3、CD8、CD27、CD28、ICOS、4-1BB、PD-1、其任意衍生物或變體、其具有相同功能能力的任意合成序列、及其任意組合的至少一個信號傳導結構域。
細胞內結構域的其它實例包括來自一種或多種分子或受體的片段或結構域，這些分子或受體包括但不限於TCR、CD3 ζ、CD3 γ、CD3 δ、CD3 ε、CD86、普通的FcR γ、FcR β(Fc ε Rib)、CD79a、CD79b、Fcγ Rlla、DAP10、DAP 12、T細胞受體(TCR)、CD8、CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX9、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、KIR家族蛋白、淋巴細胞功能相關抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、與CD83特異性地結合的配體、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、CD127、CD 160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2R β、IL2R γ、IL7R α、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD1 Id、ITGAE、CD 103、ITGAL、CD 11a、LFA-1、ITGAM、CD lib、ITGAX、CD 11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD 18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD 96(觸覺)、CEACAM1、CRT AM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD 162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、NKG2D、Toll樣受體1(TLR1)、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、本文所述的其它共刺激分子、其任意衍生物、變體或片段、具有相同功能能力的共刺激分子的任意合成序列、及其任意組合。
細胞內結構域的其它實例非限制性地包括若干類型的各種其它免疫信號傳導受體的細胞內信號傳導結構域，包括但不限於第一代、第二代、和第三代T細胞信號傳導蛋白，其包括CD3、B7家族共 刺激、和腫瘤壞死因子受體(TNFR)超家族受體(參見，例如，Park和Brentjens,J.Clin.Oncol.(2015)33(6)：651-653)。另外，細胞內信號傳導結構域可包括NK細胞與NKT細胞所用的信號傳導結構域(參見，例如，Hermanson和Kaufman,Front.Immunol.(2015)6：195)，如NKp30(B7-H6)的信號傳導結構域(參見，例如，Zhang等人，J.Immunol.(2012)189(5)：2290-2299)，以及DAP 12(參見，例如，Topfer等人，J.Immunol.(2015)194(7)：3201-3212)、NKG2D、NKp44、NKp46、DAP10、和CD3z的信號傳導結構域。
適用於本發明的對象CAR的細胞內信號傳導結構域包括響應於CAR的活化(即，由抗原和二聚試劑活化)提供有區別的且可檢測到的信號(例如，該細胞增加產生一種或多種細胞因子；目標基因轉錄的變化；蛋白質活性的變化；細胞行為的變化，例如，細胞死亡；細胞增殖；細胞分化；細胞存活；細胞信號傳導反應的調節；等等)的任意期望的信號傳導結構域。在一些實施方式中，細胞內信號傳導結構域包括至少一個(例如，一個、兩個、三個、四個、五個、六個等)如下所述的ITAM基序。在一些實施方式中，細胞內信號傳導結構域包括DAP10/CD28型信號傳導鏈。在一些實施方式中，細胞內信號傳導結構域不共價地與膜結合CAR連接，而代替地在細胞質中擴散。
適用於本發明的對象CAR的細胞內信號傳導結構域包括含有免疫受體酪胺酸活化基序(ITAM)的細胞內信號傳導多肽。在一些實施方式中，ITAM基序在細胞內信號傳導結構域中重複兩次，其中ITAM基序的第一實例和第二實例彼此由6至8個胺基酸分隔。在一個實施方式中，對象CAR的細胞內信號傳導結構域包含3個ITAM基序。
在一些實施方式中，細胞內信號傳導結構域包括含有免疫受體酪胺酸活化基序(ITAM)的人類免疫球蛋白受體，諸如但不限於FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIC、FcγRIIIA、FcRL5的信號傳導結構域(參見，例如，Gillis等人，Front.Immunol.(2014)5：254)。
合適的細胞內信號傳導結構域可以是源自含有ITAM基序的多肽的含有ITAM基序的部分。例如，合適的細胞內信號傳導結構域可以是來自任意含有ITAM基序的蛋白的含有ITAM基序的結構域。因此，合適的細胞內信號傳導結構域無需含有其所源自的整個蛋白的整個序列。合適的含有ITAM基序的多肽的實例包括但不限於：DAP12、FCER1G(Fc ε受體I γ鏈)、CD3D(CD3 δ)、CD3E(CD3 ε)、CD3G(CD3 γ)、CD3Z(CD3 ζ)、和CD79A(抗原受體複合體相關蛋白α鏈)。
在一個實施方式中，細胞內信號傳導結構域源自DAP12(也稱為TYROBP；TYRO蛋白酪胺酸激酶結合蛋白；KARAP；PLOSL；DNAX-活化蛋白12；KAR相關蛋白；TYRO蛋白酪胺酸激酶結合蛋白；殺傷活化受體相關蛋白；殺傷-活化受體-相關蛋白；等等)。在一個實施方式中，細胞內信號傳導結構域源自FCER1G(也稱為FCRG；Fc ε受體I γ鏈；Fc受體γ-鏈；fc-εRI-γ；fcRγ；fceR1 γ；高親和力免疫球蛋白ε受體亞基γ；免疫球蛋白E受體，高親和力γ鏈；等等)。在一個實施方式中，細胞內信號傳導結構域源自T-細胞表面糖蛋白CD3 δ鏈(也稱為CD3D；CD3-DELTA；T3D；CD3抗原，δ亞基；CD3 δ；CD3d抗原，δ多肽(TiT3複合體)；OKT3，δ鏈；T-細胞受體T3 δ鏈；T-細胞表面糖蛋白CD3 δ鏈；等等)。在一個實施方式中，細胞內信號傳導結構域源自T-細胞表面糖蛋白CD3 ε鏈(也稱為CD3e、T-細胞表面抗原T3/Leu-4 ε鏈、T-細胞表面糖蛋白CD3 ε鏈、AI504783、CD3、CD3ε、T3e等)。在一個實施方式中，細胞內信號傳導結構域源自T-細胞表面糖蛋白CD3 γ鏈(也稱為CD3G、T-細胞受體T3 γ鏈、CD3-Γ、T3G、γ多肽(TiT3複合體)等)。在一個實施方式中，細胞內信號傳導結構域源自T-細胞表面糖蛋白CD3 ζ鏈(也稱為CD3Z、T-細胞受體T3 ζ鏈、CD247、CD3-Z、CD3H、CD3Q、T3Z、TCRZ等)。在一個實施方式中，細胞內信號傳導結構域源自CD79A(也稱為B-細胞抗原受體複合體相關蛋白α鏈；CD79a 抗原(免疫球蛋白相關α)；MB-1膜糖蛋白；ig-α；膜結合免疫球蛋白相關蛋白；表面IgM相關蛋白；等等)。在一個實施方式中，適用於本揭示的FN3 CAR的細胞內信號傳導結構域包括DAP10/CD28型信號傳導鏈。在一個實施方式中，適用於本揭示的FN3 CAR的細胞內信號傳導結構域包括ZAP70多肽。在一些實施方式中，細胞內信號傳導結構域包括TCR ζ、FcR γ、FcR β、CD3 γ、CD3 δ、CD3 ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、或CD66d的細胞質信號傳導結構域。在一個實施方式中，CAR中的細胞內信號傳導結構域包括人類CD3 ζ的細胞質信號傳導結構域。
儘管通常可以使用整個細胞內信號傳導結構域，但是在許多情況下無需使用整個鏈。就使用細胞內信號傳導結構域的截短部分而言，這樣的截短部分可用於代替完整的鏈，只要其轉導效應物功能信號即可。細胞內信號傳導結構域包括足以轉導效應物功能信號的細胞內信號傳導結構域的任意截短部分。
本文所述的細胞內信號傳導結構域可與本文所述的任意抗原結合結構域組合、可與本文所述的任意跨膜結構域組合、或可與可包括在CAR中的本文所述的任意其它結構域組合。
在一個實施方式中，對象CAR的細胞內結構域包含：包含以下列出的胺基酸序列的4-1BB結構域：KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(SEQ ID NO：92)，該胺基酸序列可由以下列出的核酸序列編碼：
Figure 110107653-A0202-12-0088-1588
(SEQ ID NO：93)，或由以下列出的核酸序列編碼：
Figure 110107653-A0202-12-0089-1589
(SEQ ID NO：94)。
細胞內結構域的可容許的改變對本領域技術人員將是已知的，同時保持其預期功能。例如，在一些實施方式中，本發明的對象CAR包含細胞內結構域，該細胞內結構域包含：包含與SEQ ID NO：92中列出的胺基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的胺基酸序列的4-1BB結構域。在一個實施方式中，該CAR包含細胞內結構域，該細胞內結構域包含：包含SEQ ID NO：92中列出的胺基酸序列的4-1BB結構域。
在一些實施方式中，本發明的對象CAR包含細胞內結構域，該細胞內結構域包含由與SEQ ID NO：93或94中列出的核酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的核酸序列編碼的4-1BB結構域。在一個實施方式中，該CAR包含細胞內結構域，該細胞內結構域包含由SEQ ID NO：93或94中列出的核酸序列編碼的4-1BB結構域。
在一個實施方式中，對象CAR的細胞內結構域包含：包含以下列出的胺基酸序列的ICOS結構域：TKKKYSSSVHDPNGEYMFMRAVNTAKKSRLTDVTL(SEQ ID NO：203)，該胺基酸序列可由以下列出的核酸序列編碼：
Figure 110107653-A0202-12-0090-1590
Figure 110107653-A0202-12-0090-1591
(SEQ ID NO：204)。
細胞內結構域的可容許的改變對本領域技術人員將是已知的，同時保持其預期功能。例如，在一些實施方式中，本發明的對象CAR包含細胞內結構域，該細胞內結構域包含：包含與SEQ ID NO：203中列出的胺基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的胺基酸序列的ICOS結構域。在一個實施方式中，該CAR包含細胞內結構域，該細胞內結構域包含：包含SEQ ID NO：203中列出的胺基酸序列的ICOS結構域。
在一些實施方式中，本發明的對象CAR包含細胞內結構域，該細胞內結構域包含由與SEQ ID NO：204中列出的核酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的核酸序列編碼的ICOS結構域。在一個實施方式中，該CAR包含細胞內結構域，該細胞內結構域包含由SEQ ID NO：204中列出的核酸序列編碼的ICOS結構域。
在一個實施方式中，對象CAR的細胞內結構域包含：包含以下列出的胺基酸序列的變體ICOS結構域：TKKKYSSSVHDPNGEYMNMRAVNTAKKSRLTDVTL(SEQ ID NO：95)，該胺基酸序列可由以下列出的核酸序列編碼：
Figure 110107653-A0202-12-0091-1592
Figure 110107653-A0202-12-0091-1593
(SEQ ID NO：96)。
變體ICOS結構域在本文還被稱為ICOS(YMNM)。
細胞內結構域的可容許的改變對本領域技術人員將是已知的，同時保持其預期功能。例如，在一些實施方式中，本發明的對象CAR包含細胞內結構域，該細胞內結構域包含：包含與SEQ ID NO：95中列出的胺基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的胺基酸序列的ICOS結構域。在一個實施方式中，該CAR包含細胞內結構域，該細胞內結構域包含：包含SEQ ID NO：95中列出的胺基酸序列的ICOS結構域。
在一些實施方式中，本發明的對象CAR包含細胞內結構域，該細胞內結構域包含由與SEQ ID NO：96中列出的核酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的核酸序列編碼的ICOS結構域。在一個實施方式中，該CAR包含細胞內結構域，該細胞內結構域包含由SEQ ID NO：96中列出的核酸序列編碼的ICOS結構域。
在一個實施方式中，對象CAR的細胞內結構域包含：包含以下列出的胺基酸序列的CD3 ζ結構域：
Figure 110107653-A0202-12-0091-1595
Figure 110107653-A0202-12-0091-1594
(SEQ ID NO：97)， 該胺基酸序列可由以下列出的核酸序列編碼：
Figure 110107653-A0202-12-0092-1596
Figure 110107653-A0202-12-0092-1599
(SEQ ID NO：98)，或由以下列出的核酸序列編碼：
Figure 110107653-A0202-12-0092-1597
Figure 110107653-A0202-12-0092-1598
(SEQ ID NO：99)。
細胞內結構域的可容許的改變對本領域技術人員將是已知的，同時保持其預期功能。例如，在一些實施方式中，本發明的對象CAR包含細胞內結構域，該細胞內結構域包含：包含與SEQ ID NO：97中列出的胺基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的胺基酸序列的CD3 ζ結構域。 在一個實施方式中，本發明的對象CAR包含細胞內結構域，該細胞內結構域包含：包含SEQ ID NO：97中列出的胺基酸序列的CD3 ζ結構域。
在一些實施方式中，本發明的對象CAR包含細胞內結構域，該細胞內結構域包含由與SEQ ID NO：98或99中列出的核酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的核酸序列編碼的CD3 ζ結構域。在一個實施方式中，本發明的對象CAR包含細胞內結構域，該細胞內結構域包含由SEQ ID NO：98或99中列出的核酸序列編碼的CD3 ζ結構域。
CD3 ζ結構域可包含以下列出的胺基酸序列：
Figure 110107653-A0202-12-0093-1600
Figure 110107653-A0202-12-0093-1603
(SEQ ID NO：100)，該胺基酸序列可由以下列出的核酸序列編碼：
Figure 110107653-A0202-12-0093-1602
Figure 110107653-A0202-12-0093-1601
(SEQ ID NO：101)。
細胞內結構域的可容許的改變對本領域技術人員將是已知的，同時保持其預期功能。例如，在一些實施方式中，本發明的對象 CAR包含細胞內結構域，該細胞內結構域包含：包含與SEQ ID NO：100中列出的胺基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的胺基酸序列的CD3 ζ結構域。在一個實施方式中，本發明的對象CAR包含細胞內結構域，該細胞內結構域包含：包含SEQ ID NO：100中列出的胺基酸序列的CD3 ζ結構域。
在一些實施方式中，本發明的對象CAR包含細胞內結構域，該細胞內結構域包含由與SEQ ID NO：101中列出的核酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的核酸序列編碼的CD3 ζ結構域。在一個實施方式中，本發明的對象CAR包含細胞內結構域，該細胞內結構域包含由SEQ ID NO：101中列出的核酸序列編碼的CD3 ζ結構域。
在一個實施方式中，該CAR包含細胞內結構域，該細胞內結構域包含：包含SEQ ID NO：97或100中列出的胺基酸序列的CD3 ζ結構域。
在一個例示性實施方式中，對象CAR的細胞內結構域包含：包含以下列出的胺基酸序列的4-1BB結構域和CD3 ζ結構域：
Figure 110107653-A0202-12-0094-1605
Figure 110107653-A0202-12-0094-1604
(SEQ ID NO：102)，該胺基酸序列可由以下列出的核酸序列編碼：
Figure 110107653-A0202-12-0095-1606
Figure 110107653-A0202-12-0095-1609
(SEQ ID NO：103)，或由以下列出的核酸序列編碼：
Figure 110107653-A0202-12-0095-1607
Figure 110107653-A0202-12-0095-1608
(SEQ ID NO：104)。
細胞內結構域的可容許的改變對本領域技術人員將是已知的，同時保持其預期功能。例如，在一些實施方式中，本發明的對象CAR包含細胞內結構域，該細胞內結構域包含：包含與SEQ ID NO： 102中列出的胺基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的胺基酸序列的4-1BB結構域和CD3 ζ結構域。在一個實施方式中，該CAR包含細胞內結構域，該細胞內結構域包含：包含SEQ ID NO：102中列出的胺基酸序列的4-1BB結構域和CD3 ζ結構域。
在一些實施方式中，本發明的對象CAR包含細胞內結構域包含由與SEQ ID NO：103或104中列出的核酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的核酸序列編碼的4-1BB結構域和CD3 ζ結構域。在一個實施方式中，該CAR包含細胞內結構域，該細胞內結構域包含由SEQ ID NO：103或104中列出的核酸序列編碼的4-1BB結構域和CD3 ζ結構域。
在一個例示性實施方式中，對象CAR的細胞內結構域包含：包含以下列出的胺基酸序列的ICOS結構域和CD3 ζ結構域：
Figure 110107653-A0202-12-0096-1612
Figure 110107653-A0202-12-0096-1610
(SEQ ID NO：205)，該胺基酸序列可由以下列出的核酸序列編碼：
Figure 110107653-A0202-12-0096-1611
Figure 110107653-A0202-12-0097-1613
Figure 110107653-A0202-12-0097-1614
(SEQ ID NO：206)。
細胞內結構域的可容許的改變對本領域技術人員將是已知的，同時保持其預期功能。例如，在一些實施方式中，本發明的對象CAR包含細胞內結構域，該細胞內結構域包含：包含與SEQ ID NO：205中列出的胺基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的胺基酸序列的ICOS結構域和CD3 ζ結構域。在一個實施方式中，該CAR包含細胞內結構域，該細胞內結構域包含：包含SEQ ID NO：205中列出的胺基酸序列的ICOS結構域和CD3 ζ結構域。
在一些實施方式中，本發明的對象CAR包含細胞內結構域，該細胞內結構域包含由與SEQ ID NO：206中列出的核酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的核酸序列編碼的ICOS結構域和CD3 ζ結構域。在一個實施方式中，該CAR包含細胞內結構域，該細胞內結構域包含由SEQ ID NO：206中列出的核酸序列編碼的ICOS結構域和CD3 ζ結構域。
在一個例示性實施方式中，對象CAR的細胞內結構域包 含：包含以下列出的胺基酸序列的變體ICOS結構域和CD3 ζ結構域：
Figure 110107653-A0202-12-0098-1618
Figure 110107653-A0202-12-0098-1615
(SEQ ID NO：207)，該胺基酸序列可由以下列出的核酸序列編碼：
Figure 110107653-A0202-12-0098-1617
Figure 110107653-A0202-12-0098-1616
(SEQ ID NO：208)。
細胞內結構域的可容許的改變對本領域技術人員將是已知的，同時保持其預期功能。例如，在一些實施方式中，本發明的對象CAR包含細胞內結構域，該細胞內結構域包含：包含與SEQ ID NO：207中列出的胺基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的胺基酸序列的變體ICOS結構域和CD3 ζ結構域。在一個實施方式中，該CAR包含細胞內結構域，該細胞內結構域包含：包含SEQ ID NO：207中列出的胺基酸序列的變體ICOS結構域和CD3 ζ結構域。
在一些實施方式中，本發明的對象CAR包含細胞內結構域，該細胞內結構域包含由與SEQ ID NO：208中列出的核酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的核酸序列編碼的變體ICOS結構域和CD3 ζ結構域。在一個實施方式中，該CAR包含細胞內結構域，該細胞內結構域包含由SEQ ID NO：208中列出的核酸序列編碼的變體ICOS結構域和CD3 ζ結構域。
CAR序列
本發明的對象CAR可選自J591鼠PSMA-CAR、人源化J591 PSMA-CAR、1C3人類PSMA-CAR、2A10人類PSMA-CAR、2F5人類PSMA-CAR、和2C6人類PSMA-CAR。
在一個實施方式中，本發明的對象CAR是J591鼠PSMA-CAR。在一個實施方式中，J591鼠PSMA-CAR包含以下列出的胺基酸序列：
Figure 110107653-A0202-12-0099-1619
Figure 110107653-A0202-12-0100-1620
Figure 110107653-A0202-12-0100-1621
(SEQ ID NO：105)，該胺基酸序列可由以下列出的核酸序列編碼：
Figure 110107653-A0202-12-0100-1622
Figure 110107653-A0202-12-0101-1623
Figure 110107653-A0202-12-0101-1624
(SEQ ID NO：106)。
在一個實施方式中，本發明的對象CAR是人源化PSMA-CAR，例如，人源化J591 PSMA-CAR。在這樣的實施方式中，人源化PSMA-CAR包含PCT公開號WO2017212250A1和WO2018033749A1中公開的任意重鏈可變區和輕鏈可變區。例如，本發明的人源化PSMA-CAR可包含：包含其中公開的任意重鏈可變區和輕鏈可變區(參見，例如，本揭示的表19中列出的序列)的scFv。
在一個實施方式中，本發明的對象CAR是huJ591 PSMA-CAR。在一個實施方式中，huJ591 PSMA-CAR包含以下列出的胺基酸序列：
Figure 110107653-A0202-12-0101-1625
Figure 110107653-A0202-12-0102-1626
Figure 110107653-A0202-12-0102-1627
(SEQ ID NO：245)，該胺基酸序列可由以下列出的核酸序列編碼：
Figure 110107653-A0202-12-0102-1628
Figure 110107653-A0202-12-0103-1629
Figure 110107653-A0202-12-0103-1630
(SEQ ID NO：246)。
在一個實施方式中，本發明的對象CAR是huJ591 PSMA-CAR。在一個實施方式中，huJ591 PSMA-CAR包含以下列出的胺基酸序列：
Figure 110107653-A0202-12-0103-1632
Figure 110107653-A0202-12-0103-1631
(SEQ ID NO：247)，該胺基酸序列可由以下列出的核酸序列編碼：
Figure 110107653-A0202-12-0104-1633
Figure 110107653-A0202-12-0105-1634
Figure 110107653-A0202-12-0105-1635
(SEQ ID NO：248)。
在一個實施方式中，本發明的對象CAR是huJ591 PSMA-CAR。在一個實施方式中，huJ591 PSMA-CAR包含以下列出的胺基酸序列：
Figure 110107653-A0202-12-0105-1638
Figure 110107653-A0202-12-0105-1636
(SEQ ID NO：249)，該胺基酸序列可由以下列出的核酸序列編碼：
Figure 110107653-A0202-12-0105-1637
Figure 110107653-A0202-12-0106-1639
Figure 110107653-A0202-12-0107-1640
(SEQ ID NO：250)。
在一個實施方式中，本發明的對象CAR是huJ591 PSMA-CAR。在一個實施方式中，huJ591 PSMA-CAR包含以下列出的胺基酸序列：
Figure 110107653-A0202-12-0107-1643
Figure 110107653-A0202-12-0107-1642
(SEQ ID NO：251)，該胺基酸序列可由以下列出的核酸序列編碼：
Figure 110107653-A0202-12-0107-1641
Figure 110107653-A0202-12-0108-1644
Figure 110107653-A0202-12-0109-1645
(SEQ ID NO：252)。
在一個實施方式中，本發明的對象CAR是huJ591 PSMA-CAR。在一個實施方式中，huJ591 PSMA-CAR包含以下列出的胺基酸序列：
Figure 110107653-A0202-12-0109-1646
(SEQ ID NO：253)，該胺基酸序列可由以下列出的核酸序列編碼：
Figure 110107653-A0202-12-0109-1647
Figure 110107653-A0202-12-0110-1648
Figure 110107653-A0202-12-0110-1649
(SEQ ID NO：254)。
在一個實施方式中，本發明的對象CAR是huJ591 PSMA-CAR。在一個實施方式中，huJ591 PSMA-CAR包含以下列出的胺基酸序列：
Figure 110107653-A0202-12-0111-1650
(SEQ ID NO：255)，該胺基酸序列可由以下列出的核酸序列編碼：
Figure 110107653-A0202-12-0111-1651
Figure 110107653-A0202-12-0112-1652
Figure 110107653-A0202-12-0112-1654
(SEQ ID NO：256)。
在一個實施方式中，本發明的對象CAR是1C3人類PSMA-CAR。在一個實施方式中，1C3人類PSMA-CAR包含以下列出的胺基酸序列：
Figure 110107653-A0202-12-0112-1653
Figure 110107653-A0202-12-0113-1655
Figure 110107653-A0202-12-0113-1657
(SEQ ID NO：107)，該胺基酸序列可由以下列出的核酸序列編碼：
Figure 110107653-A0202-12-0113-1656
Figure 110107653-A0202-12-0114-1658
(SEQ ID NO：108)。
在一個實施方式中，本發明的對象CAR是2A10人類PSMA-CAR。在一個實施方式中，2A10人類PSMA-CAR包含以下列出的胺基酸序列：
Figure 110107653-A0202-12-0114-1659
Figure 110107653-A0202-12-0115-1660
Figure 110107653-A0202-12-0115-1662
(SEQ ID NO：109)，該胺基酸序列可由以下列出的核酸序列編碼：
Figure 110107653-A0202-12-0115-1661
Figure 110107653-A0202-12-0116-1663
Figure 110107653-A0202-12-0116-1664
(SEQ ID NO：110)。
在一個實施方式中，本發明的對象CAR是2F5人類PSMA-CAR。在一個實施方式中，2F5人類PSMA-CAR包含：包含以下列出的胺基酸序列的4-1BB結構域和CD3 ζ結構域：
Figure 110107653-A0202-12-0116-1665
Figure 110107653-A0202-12-0117-1667
Figure 110107653-A0202-12-0117-1666
(SEQ ID NO：111)，該胺基酸序列可由以下列出的核酸序列編碼：
Figure 110107653-A0202-12-0117-1668
Figure 110107653-A0202-12-0118-1669
Figure 110107653-A0202-12-0118-1671
(SEQ ID NO：112)。
在一個實施方式中，本發明的對象CAR是2F5人類PSMA-CAR。在一個實施方式中，2F5人類PSMA-CAR包含：包含以下列出的胺基酸序列的ICOS結構域和CD3 ζ結構域：
Figure 110107653-A0202-12-0118-1670
(SEQ ID NO：209)，該胺基酸序列可由以下列出的核酸序列編碼：
Figure 110107653-A0202-12-0119-1672
Figure 110107653-A0202-12-0120-1673
Figure 110107653-A0202-12-0120-1676
(SEQ ID NO：210)。
在一個實施方式中，本發明的對象CAR是2F5人類PSMA-CAR。在一個實施方式中，2F5人類PSMA-CAR包含：包含以下列出的胺基酸序列的變體ICOS結構域和CD3 ζ結構域：
Figure 110107653-A0202-12-0120-1674
(SEQ ID NO：211)，該胺基酸序列可由以下列出的核酸序列編碼：
Figure 110107653-A0202-12-0120-1675
Figure 110107653-A0202-12-0121-1677
Figure 110107653-A0202-12-0122-1679
Figure 110107653-A0202-12-0122-1678
(SEQ ID NO：212)。
在一個實施方式中，本發明的對象CAR是2C6人類PSMA-CAR。在一個實施方式中，2C6人類PSMA-CAR包含以下列出的胺基酸序列：
Figure 110107653-A0202-12-0122-1682
Figure 110107653-A0202-12-0122-1680
(SEQ ID NO：113)，該胺基酸序列可由以下列出的核酸序列編碼：
Figure 110107653-A0202-12-0122-1681
Figure 110107653-A0202-12-0123-1683
Figure 110107653-A0202-12-0123-1684
(SEQ ID NO：114)。
對象CAR的序列的可容許的改變對本領域技術人員將是已知的，同時保持其功能。
例如，在一些實施方式中，本發明的對象CAR是包含與SEQ ID NO：105中列出的胺基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的胺基酸序列的J591鼠PSMA-CAR。在一個實施方式中，該CAR是包含SEQ ID NO：105中列出的胺基酸序列的J591鼠PSMA-CAR。
例如，在一些實施方式中，本發明的對象CAR是人源化J591 PSMA-CAR。人源化J591 PSMA-CAR包含人源化J591 PSMA結合結構域，人源化J591 PSMA結合結構域包含選自表19中列出的任意重鏈可變區序列和輕鏈可變區序列的重鏈可變區和輕鏈可變區。在一些實施方式中，人源化J591 PSMA-CAR包含4-1BB結構域和CD3 ζ結構域。
例如，在一些實施方式中，本發明的對象CAR是包含與SEQ ID NO：245、247、249、251、253、或255中列出的胺基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的胺基酸序列的huJ591 PSMA-CAR。在一個實施方式中，該CAR是包含SEQ ID NO：245、247、249、251、253、或255中列出的胺基酸序列的huJ591 PSMA-CAR。
例如，在一些實施方式中，本發明的對象CAR是包含與SEQ ID NO：107中列出的胺基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至 少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的胺基酸序列的1C3人類PSMA-CAR。在一個實施方式中，該CAR是包含SEQ ID NO：107中列出的胺基酸序列的1C3人類PSMA-CAR。
例如，在一些實施方式中，本發明的對象CAR是包含與SEQ ID NO：109中列出的胺基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的胺基酸序列的2A10人類PSMA-CAR。在一個實施方式中，該CAR是包含SEQ ID NO：109中列出的胺基酸序列的2A10人類PSMA-CAR。
例如，在一些實施方式中，本發明的對象CAR是2F5人類PSMA-CAR。在一個實施方式中，該CAR是2F5人類PSMA-CAR，2F5人類PSMA-CAR包含：包含與SEQ ID NO：111中列出的胺基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的胺基酸序列的4-1BB結構域和CD3 ζ結構域。在一個實施方式中，該CAR是包含：包含SEQ ID NO：111中列出的胺基酸序列的4-1BB結構域和CD3 ζ結構域的2F5人類PSMA-CAR。在一個實施方式中，該CAR是2F5人類PSMA-CAR，2F5人類PSMA-CAR包含：包含與SEQ ID NO：209中列出的胺基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的胺基酸序列的ICOS結構域和CD3 ζ結構域。在一個實施方式 中，該CAR是2F5人類PSMA-CAR，2F5人類PSMA-CAR包含：包含SEQ ID NO：209中列出的胺基酸序列的ICOS結構域和CD3 ζ結構域。在一個實施方式中，該CAR是2F5人類PSMA-CAR，2F5人類PSMA-CAR包含：包含與SEQ ID NO：211中列出的胺基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的胺基酸序列的變體ICOS結構域和CD3 ζ結構域。在一個實施方式中，該CAR是2F5人類PSMA-CAR包含：包含SEQ ID NO：211中列出的胺基酸序列的變體ICOS結構域和CD3 ζ結構域。例如，在一些實施方式中，本發明的對象CAR是包含與SEQ ID NO：113中列出的胺基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的胺基酸序列的2C6人類PSMA-CAR。在一個實施方式中，該CAR是包含SEQ ID NO：113中列出的胺基酸序列的2C6人類PSMA-CAR。
在一些實施方式中，本發明的對象CAR是由與SEQ ID NO：106中列出的核酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的核酸序列編碼的J591鼠PSMA-CAR。在一個實施方式中，該CAR是由SEQ ID NO：106中列出的核酸序列編碼的J591鼠PSMA-CAR。
例如，在一些實施方式中，本發明的對象CAR是由與SEQ ID NO：246、248、250、252、254、或256中列出的核酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的核酸序列編碼的huJ591 PSMA-CAR。在一個實施方式中，該CAR是由SEQ ID NO：246、248、250、252、254、或256中列出的核酸序列編碼的huJ591 PSMA-CAR。
例如，在一些實施方式中，本發明的對象CAR是由與SEQ ID NO：108中列出的核酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的核酸序列編碼的1C3人類PSMA-CAR。在一個實施方式中，該CAR是由SEQ ID NO：108中列出的核酸序列編碼的1C3人類PSMA-CAR。例如，在一些實施方式中，本發明的對象CAR是由與SEQ ID NO：110中列出的核酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的核酸序列編碼的2A10人類PSMA-CAR。在一個實施方式中，該CAR是由SEQ ID NO：110中列出的核酸序列編碼的2A10人類PSMA-CAR。例如，在一些實施方式中，本發明的對象CAR是2F5人類PSMA-CAR。在一個實施方式中，該CAR是2F5人類PSMA-CAR，2F5人類PSMA-CAR包含由與SEQ ID NO：112中列出的核酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少 86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的核酸序列編碼的4-1BB結構域和CD3 ζ結構域。在一個實施方式中，該CAR是包含由SEQ ID NO：112中列出的核酸序列編碼的4-1BB結構域和CD3 ζ結構域的2F5人類PSMA-CAR。在一個實施方式中，該CAR是2F5人類PSMA-CAR，2F5人類PSMA-CAR包含由與SEQ ID NO：210中列出的核酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的核酸序列編碼的ICOS結構域和CD3 ζ結構域。在一個實施方式中，該CAR是包含由SEQ ID NO：210中列出的核酸序列編碼的ICOS結構域和CD3 ζ結構域的2F5人類PSMA-CAR。在一個實施方式中，該CAR是2F5人類PSMA-CAR，2F5人類PSMA-CAR包含由與SEQ ID NO：212中列出的核酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的核酸序列編碼的變體ICOS結構域和CD3 ζ結構域。在一個實施方式中，該CAR是包含由SEQ ID NO：212中列出的核酸序列編碼的變體ICOS結構域和CD3 ζ結構域的2F5人類PSMA-CAR。例如，在一些實施方式中，本發明的對象CAR是由與SEQ ID NO：114中列出的核酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序 列同一性的核酸序列編碼的2C6人類PSMA-CAR。在一個實施方式中，該CAR是由SEQ ID NO：114中列出的核酸序列編碼的2C6人類PSMA-CAR。
在某些實施方式中，本發明的對象CAR可包含對應於SEQ ID NO：209、211、227-236、245、247、249、251、253、或255的胺基酸序列中的任一個。
Figure 110107653-A0202-12-0129-1685
Figure 110107653-A0202-12-0130-1686
Figure 110107653-A0202-12-0131-1687
Figure 110107653-A0202-12-0132-1688
Figure 110107653-A0202-12-0133-1689
Figure 110107653-A0202-12-0134-1690
Figure 110107653-A0202-12-0135-1691
Figure 110107653-A0202-12-0136-1692
Figure 110107653-A0202-12-0137-1693
Figure 110107653-A0202-12-0138-1694
因此，本發明提供了經修飾的免疫細胞或其前體細胞(例如，經修飾的T細胞)，其包含對目標細胞(例如，前列腺癌細胞)上的前列腺特異性膜抗原(PSMA)具有親和力的嵌合抗原受體(CAR)。在一些實施方式中，該CAR包含PSMA結合結構域。在一些實施方式中，該CAR包含鼠PSMA結合結構域。在一個實施方式中，該CAR包含J591鼠PSMA結合結構域。在一個實施方式中，該CAR包含人源化J591 PSMA結合結構域。在一些實施方式中，該CAR包含人類PSMA結合結構域。在一些實施方式中，該CAR包含選自1C3、2A10、2F5、和2C6人類PSMA結合結構域的人類PSMA結合結構域。
因此，本發明的對象CAR包含PSMA結合結構域和跨膜結構域。在一個實施方式中，該CAR包含PSMA結合結構域和跨膜結構域，其中跨膜結構域包含CD8鉸鏈區。在一個實施方式中，該CAR包含PSMA結合結構域和跨膜結構域，其中跨膜結構域包含CD8跨膜結構域。在一個實施方式中，該CAR包含PSMA結合結構域和跨膜結 構域，其中跨膜結構域包含CD8鉸鏈區和CD8跨膜結構域。
因此，本發明的對象CAR包含PSMA結合結構域、跨膜結構域、和細胞內結構域。在一個實施方式中，該CAR包含PSMA結合結構域、跨膜結構域、和細胞內結構域，其中細胞內結構域包含4-1BB結構域。在一個實施方式中，該CAR包含PSMA結合結構域、跨膜結構域、和細胞內結構域，其中細胞內結構域包含CD3 ζ結構域。在一個實施方式中，該CAR包含PSMA結合結構域、跨膜結構域、和細胞內結構域，其中細胞內結構域包含4-1BB結構域和CD3 ζ結構域。
C.顯性負性受體和開關受體
本發明提供了組合物和方法，其用於包含顯性負性受體及/或開關受體的經修飾的免疫細胞或其前體(例如，經修飾的T細胞)。因此，在一些實施方式中，已將免疫細胞基因修飾以表現顯性負性受體及/或開關受體。如本文所用，術語「顯性負性受體」是指被設計以減少負信號轉導分子的作用，例如，本發明的經修飾的免疫細胞上負信號轉導分子的作用的分子。本發明的顯性負性受體可借助與負信號關聯的細胞外結構域結合負信號轉導分子(例如，TGF-β或PD-1)，並減少負信號轉導分子的作用。本文描述了這種顯性負性受體。例如，包含顯性負性受體的經修飾的免疫細胞可在該經修飾的免疫細胞的微環境下結合負信號轉導分子，並減少負信號轉導分子可對經修飾的免疫細胞的作用。
本發明的開關受體除了減少負信號轉導分子的作用之外，可被設計以借助包含與正信號關聯的細胞內結構域將負信號轉換成正信號。本文描述了被設計以將負信號轉換成正信號的開關受體。因此，開關受體包含與負信號關聯的細胞外結構域及/或與正信號關聯的細胞內結構域。
腫瘤細胞產生用於使其免於免疫識別和去除的免疫抑制微環境。該免疫抑制微環境可限制免疫抑制療法(如CAR-T細胞療法) 的有效性。所分泌的細胞因子，轉化生長因子β(TGFβ)直接抑制細胞毒性T細胞的功能並且還誘發調節T細胞形成，以抑制免疫反應。先前已證明了前列腺癌的背景下TGFβ引起的T細胞免疫抑制(Donkor等人，2011；Shalapour等人，2015)。為了減少TGFβ的免疫抑制作用，免疫細胞可被修飾以表現顯性負性受體，作為TGF-β的顯性負性受體。
在一些實施方式中，顯性負性受體是與負信號關聯的野生型蛋白質的截短變體。在一些實施方式中，顯性負性受體是TGF-β的顯性負性受體。因此，在一些實施方式中，TGF-β的顯性負性受體是野生型TGF-β受體的截短變體。在一些實施方式中，顯性負性受體是II型TGF-β受體的截短顯性負性變體(TGFβRII-DN)。在一個實施方式中，TGFβRII-DN包含以下列出的胺基酸序列：
Figure 110107653-A0202-12-0140-1696
Figure 110107653-A0202-12-0140-1695
(SEQ ID NO：115)，該胺基酸序列可由以下列出的核酸序列編碼：
Figure 110107653-A0202-12-0140-1697
Figure 110107653-A0202-12-0141-1698
Figure 110107653-A0202-12-0141-1699
(SEQ ID NO：116)。
TGFβRII-DN的序列的可容許的改變對本領域技術人員將是已知的，同時保持其預期功能。例如，在一些實施方式中，本發明的顯性負性受體是包含與SEQ ID NO：115中列出的胺基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的胺基酸序列的TGFβRII-DN。在一個實施方式中，顯性負性受體是包含SEQ ID NO：115中列出的胺基酸序列的TGFβRII-DN。
在一些實施方式中，本發明的顯性負性受體是由與SEQ ID NO：116中列出的核酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的核酸序列編碼的TGFβRII-DN。在一個實施方式中，顯性負性受體是由SEQ ID NO：116中列出的核酸序列編碼的TGFβRII-DN。
在一個實施方式中，適用於本發明的開關受體是PD1-CTM-CD28受體。當在細胞中表現時，PD1-CTM-CD28受體將負PD1信號轉換成正CD28信號。PD1-CTM-CD28受體包含PD1細胞外結構域的變體、CD28跨膜結構域、和CD28細胞質結構域。在一個實施方式中，PD1-CTM-CD28受體包含以下列出的胺基酸序列：
Figure 110107653-A0202-12-0141-1700
Figure 110107653-A0202-12-0142-1703
Figure 110107653-A0202-12-0142-1701
(SEQ IDNO：117)，該胺基酸序列可由以下列出的核酸序列編碼：
Figure 110107653-A0202-12-0142-1702
(SEQ ID NO：118)。
PD1-CTM-CD28受體的可容許的改變對本領域技術人員將是已知的，同時保持其預期的生物活性(例如，當在細胞中表現時，將負PD1信號轉換成正CD28信號)。因此，本發明的PD1-CTM-CD28受體可包含與SEQ ID NO：117中列出的PD1-CTM-CD28受體胺基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、 至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的胺基酸序列。因此，本發明的PD1-CTM-CD28受體可由包含與SEQ ID NO：118中列出的PD1-CTM-CD28受體核酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的核酸序列的核酸編碼。
在一個實施方式中，適用於本發明的開關受體是PD1-PTM-CD28受體。當在細胞中表現時，PD1-PTM-CD28受體將負PD1信號轉換成正CD28信號。PD1-PTM-CD28受體包含PD1細胞外結構域的變體、PD1跨膜結構域、和CD28細胞質結構域。在一個實施方式中，PD1-PTM-CD28受體包含以下列出的胺基酸序列：
Figure 110107653-A0202-12-0143-1706
Figure 110107653-A0202-12-0143-1705
(SEQ ID NO：119)，該胺基酸序列可由以下列出的核酸序列編碼：
Figure 110107653-A0202-12-0143-1704
Figure 110107653-A0202-12-0144-1707
Figure 110107653-A0202-12-0144-1708
(SEQ ID NO：120)。
PD1-PTM-CD28受體的可容許的改變對本領域技術人員將是已知的，同時保持其預期的生物活性(例如，當在細胞中表現時，將負PD1信號轉換成正CD28信號)。因此，本發明的PD1-PTM-CD28受體可包含與SEQ ID NO：119中列出的PD1-PTM-CD28受體胺基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的胺基酸序列。因此，本發明的PD1-PTM-CD28受體可由包含與SEQ ID NO：120中列出的PD1-PTM-CD28受體核酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的核酸序列的核酸編碼。
在一個實施方式中，適用於本發明的開關受體是PD1A132L-PTM-CD28受體。當在細胞中表現時，PD1A132L-PTM-CD28 受體將負PD1信號轉換成正CD28信號。發現PD1的第132位胺基酸的點突變──用亮胺酸取代丙胺酸(A132L)──提高其與PD-L1的親和力兩倍(參見，例如，Zhang等人，Immunity(2004)20(3),337-347)。PD1A132L-PTM-CD28受體包含在第132位具有胺基酸取代的PD1細胞外結構域的變體(A132L)、PD1跨膜結構域、和CD28細胞質結構域。在一個實施方式中，PD1A132L-PTM-CD28受體包含以下列出的胺基酸序列：
Figure 110107653-A0202-12-0145-1711
Figure 110107653-A0202-12-0145-1709
(SEQ ID NO：121)，該胺基酸序列可由以下列出的核酸序列編碼：
Figure 110107653-A0202-12-0145-1710
Figure 110107653-A0202-12-0146-1739
Figure 110107653-A0202-12-0146-1712
(SEQ ID NO：122)。
PD1A132L-PTM-CD28受體的可容許的改變對本領域技術人員將是已知的，同時保持其預期的生物活性(例如，當在細胞中表現時，將負PD1信號轉換成正CD28信號)。因此，本發明的PD1A132L-PTM-CD28受體可包含與SEQ ID NO：121中列出的PD1A132L-PTM-CD28受體胺基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的胺基酸序列。因此，本發明的PD1A132L-PTM-CD28受體可由包含與SEQ ID NO：122中列出的PD1A132L-PTM-CD28受體核酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的核酸序列的核酸編碼。
在一個實施方式中，適用於本發明的開關受體是PD1-4-1BB受體。當在細胞中表現時，PD1-4-1BB受體(也被稱為PD1-BB)將負PD1信號轉換成正4-1BB信號。在一個實施方式中，PD1-4-1BB受體包含以下列出的胺基酸序列：
Figure 110107653-A0202-12-0146-1738
Figure 110107653-A0202-12-0147-1717
Figure 110107653-A0202-12-0147-1715
(SEQ ID NO：213)，該胺基酸序列可由以下列出的核酸序列編碼：
Figure 110107653-A0202-12-0147-1718
Figure 110107653-A0202-12-0147-1716
(SEQ ID NO：214)。
PD1-4-1BB受體的可容許的改變對本領域技術人員將是已知的，同時保持其預期的生物活性(例如，當在細胞中表現時，將負PD1信號轉換成正4-1BB信號)。因此，本發明的PD1-4-1BB受體可包含與SEQ ID NO：213中列出的PD1-4-1BB受體胺基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、 至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的胺基酸序列。因此，本發明的PD1-4-1BB受體可由包含與SEQ ID NO：214中列出的PD1-4-1BB受體核酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的核酸序列的核酸編碼。
在一個實施方式中，適用於本發明的開關受體是PD1A132L-4-1BB受體。當在細胞中表現時，PD1A132L-4-1BB受體(也被稱為PD1*BB)將負PD1信號轉換成正4-1BB信號。在一個實施方式中，PD1A132L-4-1BB受體包含以下列出的胺基酸序列：
Figure 110107653-A0202-12-0148-1721
Figure 110107653-A0202-12-0148-1719
(SEQ ID NO：215)，該胺基酸序列可由以下列出的核酸序列編碼：
Figure 110107653-A0202-12-0148-1720
Figure 110107653-A0202-12-0149-1722
Figure 110107653-A0202-12-0149-1723
(SEQ ID NO：216)。
PD1A132L-4-1BB受體的可容許的改變對本領域技術人員將是已知的，同時保持其預期的生物活性(例如，當在細胞中表現時，將負PD1信號轉換成正4-1BB信號)。因此，本發明的PD1A132L-4-1BB受體可包含與SEQ ID NO：215中列出的PD1A132L-4-1BB受體胺基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的胺基酸序列。因此，本發明的PD1A132L-4-1BB受體可由包含與SEQ ID NO：216中列出的PD1A132L-4-1BB受體核酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的核酸序列的核酸編碼。
在一個實施方式中，適用於本發明的開關受體是TGFβR-IL12Rβ1受體。當在細胞中表現時，TGFβR-IL12Rβ1受體將負TGF-β信號轉換成正IL-12信號。在一個實施方式中，TGFβR-IL12Rβ1受體包含以下列出的胺基酸序列：
Figure 110107653-A0202-12-0150-1725
Figure 110107653-A0202-12-0150-1724
(SEQ ID NO：123)，該胺基酸序列可由以下列出的核酸序列編碼：
Figure 110107653-A0202-12-0150-1727
Figure 110107653-A0202-12-0150-1726
(SEQ ID NO：124)。
TGFβR-IL12Rβ1受體的可容許的改變對本領域技術人員將是已知的，同時保持其預期的生物活性(例如，當在細胞中表現時，將負TGF-β信號轉換成正IL-12信號)。因此，本發明的TGFβR- IL12Rβ1受體可包含與SEQ ID NO：123中列出的TGFβR-IL12Rβ1受體胺基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的胺基酸序列。因此，本發明的TGFβR-IL12Rβ1受體可由包含與SEQ ID NO：124中列出的TGFβR-IL12Rβ1受體核酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的核酸序列的核酸編碼。
在一個實施方式中，適用於本發明的開關受體是TGFβR-IL12Rβ2受體。當在細胞中表現時，TGFβR-IL12Rβ2受體將負TGF-β信號轉換成正IL-12信號。在一個實施方式中，TGFβR-IL12Rβ2受體包含以下列出的胺基酸序列：
Figure 110107653-A0202-12-0151-1729
Figure 110107653-A0202-12-0151-1728
(SEQ ID NO：125)，該胺基酸序列可由以下列出的核酸序列編碼：
Figure 110107653-A0202-12-0152-1730
Figure 110107653-A0202-12-0153-1732
Figure 110107653-A0202-12-0153-1731
(SEQ ID NO：126)。
TGFβR-IL12Rβ2受體的可容許的改變對本領域技術人員將是已知的，同時保持其預期的生物活性(例如，當在細胞中表現時，將負TGF-β信號轉換成正IL-12信號)。因此，本發明的TGFβR-IL12Rβ2受體可包含與SEQ ID NO：125中列出的TGFβR-IL12Rβ2受體胺基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的胺基酸序列。因此，本發明的TGFβR-IL12Rβ2受體可由包含與SEQ ID NO：126中列出的TGFβR-IL12Rβ2受體核酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的核酸序列的核酸編碼。
在一個實施方式中，適用於本發明的開關受體是TIM3-CD28受體。當在細胞中表現時，TIM3-CD28受體將負TIM-3信號轉換成正CD28信號。在一個實施方式中，TIM3-CD28受體包含以下列出的胺基酸序列：
Figure 110107653-A0202-12-0153-1733
Figure 110107653-A0202-12-0153-1734
(SEQ ID NO：127)， 該胺基酸序列可由以下列出的核酸序列編碼：
Figure 110107653-A0202-12-0154-1735
(SEQ ID NO：128)。
TIM3-CD28受體的可容許的改變對本領域技術人員將是已知的，同時保持其預期的生物活性(例如，當在細胞中表現時，將負TIM-3信號轉換成正CD28信號)。因此，本發明的TIM3-CD28受體可包含與SEQ ID NO：127中列出的TIM3-CD28受體胺基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少 93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的胺基酸序列。因此，本發明的TIM3-CD28受體可由包含與SEQ ID NO：128中列出的TIM3-CD28受體核酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的核酸序列的核酸編碼。
PCT公開號WO2013019615A2(其公開內容藉由引用併入本文)中描述了用於本發明的其它合適的顯性負性受體和開關受體。
D.雙特異性抗體
本發明提供了組合物和方法，其用於包含編碼雙特異性抗體的核酸的經修飾的免疫細胞或其前體(例如，經修飾的T細胞)。因此，在一些實施方式中，已將免疫細胞基因修飾以表現雙特異性抗體。如本文所用，"雙特異性抗體"是指對至少兩個不同的抗原表位具有結合特異性的抗體。在一個實施方式中，表位來自相同的抗原。在另一實施方式中，表位來自兩個不同的抗原。用於製備雙特異性抗體的方法是本領域已知的。例如，可利用兩個免疫球蛋白重鏈/輕鏈對的共表現，以重組方式產生雙特異性抗體。參見，例如，Milstein等人(1983)Nature 305：537-39。可選地，可利用化學連接製備雙特異性抗體。參見，例如，Brennan等人(1985)Science 229：81。雙特異性抗體包括雙特異性抗體片段。參見，例如，Holliger等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90：6444-48,Gruber等人(1994)J.Immunol.152：5368。
在某些實施方式中，本發明的經修飾的細胞包含對目標細胞上的前列腺特異性膜抗原(PSMA)具有親和力的CAR和雙特異性抗體。在某些實施方式中，本發明的經修飾的細胞分泌雙特異性抗體。
在一個實施方式中，雙特異性抗體包含與第一抗原結合的 第一抗原結合結構域和與第二抗原結合的第二抗原結合結構域。在一些實施方式中，雙特異性抗體包含：包含第一和第二單鏈可變區片段(scFv)分子的抗原結合結構域。在一個實施方式中，第一和第二抗原結合結構域結合目標細胞上的抗原並活化T細胞上的抗原。
在一個實施方式中，雙特異性抗體包含對活化T細胞上的至少一種抗原的特異性。活化T細胞抗原包括發現在可活化另一細胞的T細胞表面上的抗原。活化T細胞抗原可結合共刺激分子。共刺激分子是細胞表面分子--除抗原受體或其配體之外--是淋巴細胞對抗原進行有效反應所需要的。活化T細胞抗原的實例可包括但不限於CD3、CD4、CD8、T細胞受體(TCR)、CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴細胞功能相關抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、與CD83特異性地結合的配體、或其任意片段。在一些實施方式中，雙特異性抗體包含對T細胞抗原CD28的特異性。
其它共刺激元件也在本發明的範圍內。在這些實例中，雙特異性抗體識別T細胞抗原並且可被稱為雙特異性T細胞銜接器(BiTE)。然而，本發明不限於任何具體雙特異性抗體的使用。確切地說，任何雙特異性抗體或BiTE都可以使用。雙特異性抗體或BiTE分子還可作為可溶性蛋白表現，對至少一種目標細胞相關抗原具有特異性。
在一個實施方式中，雙特異性抗體包含多於一個的抗原結合結構域。在該實施方式中，至少一個抗原結合結構域包括合成抗體、人類抗體、人源化抗體、單鏈可變區片段、單結構域抗體、其抗原結合片段、及其任意組合。本文其它部分描述了用於製備人類抗體和人源化抗體的技術。
在一些實施方式中，雙特異性抗體包含多於一個的抗原結合結構域，其中至少一個抗原結合結構域與負信號轉導分子(例如，可在分泌雙特異性抗體的細胞的微環境中發現的負信號轉導分子)或其互 作伴侶(例如，受體)結合。在一些實施方式中，雙特異性抗體的至少一個抗原結合結構域與TGF-β或其互作伴侶(例如，受體)結合。在一些實施方式中，雙特異性抗體的至少一個抗原結合結構域與PD-1或其互作伴侶結合。在一個實施方式中，雙特異性抗體的至少一個抗原結合結構域與TGF-βR結合。在另一實施方式中，雙特異性抗體的至少一個抗原結合結構域與PD-L1結合。
在一些實施方式中，雙特異性抗體包含與T細胞上的分子結合並活化T細胞的至少一個抗原結合結構域。例如，本揭示的雙特異性抗體可包含如美國專利號7,585,960(其內容以其整體併入本文)中描述的超激動抗CD28結合結構域。
在一些實施方式中，雙特異性抗體包含結合PD-L1的至少一個抗原結合結構域。例如，本揭示的雙特異性抗體可非限制性地包含如PCT公開號WO2007005874A2(其內容以其整體併入本文)中描述的源自10A5、13G4、或1B12的PD-L1結合結構域。在一些實施方式中，雙特異性抗體包含結合TGF-β受體(例如，TGFβRII)的至少一個抗原結合結構域。例如，本揭示的雙特異性抗體可非限制性地包含如美國專利號8,147,834(其內容以其整體併入本文)中描述的源自TGF1或TGF3的TGFβRII結合結構域。
因此，在一個實施方式中，本揭示的雙特異性抗體包含結合PD-L1或TGFβRII的至少一個抗原結合結構域和結合CD28的抗原結合結構域。
在一些實施方式中，目標細胞抗原可以是T細胞受體所結合的相同抗原或可以是不同的抗原。目標細胞抗原包括任意腫瘤相關抗原(TAA)或病毒性、細菌性和寄生性抗原、或其任意片段。目標細胞抗原可包括限定目標細胞的任意類型的配體。例如，可選擇目標細胞抗原以識別充當與具體疾病狀態關聯的目標細胞上的細胞標記物的配體。因此，細胞標記物可充當雙特異性抗體中抗原結合結構域的配體，包括與病毒性、細菌性和寄生性感染、自身免疫疾病和癌症細胞關聯的 配體。
在一些實施方式中，目標細胞抗原是與活化T細胞抗原相同的抗原，活化T細胞抗原包括但不限於CD3、CD4、CD8、T細胞受體(TCR)、CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴細胞功能相關抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、與CD83特異性地結合的配體、及其片段。一方面，本發明包括編碼雙特異性抗體的核酸，該雙特異性抗體包含對目標細胞上的抗原和活化T細胞上的抗原的雙特異性，其中T細胞瞬時分泌雙特異性抗體。用於工程改造並表現雙特異性抗體的技術包括但不限於具有不同特異性的兩個免疫球蛋白重鏈-輕鏈對的重組共表現(參見，例如，Milstein和Cuello,Nature 305：537(1983),WO 93/08829，和Traunecker等人，EMBO J.10：3655(1991))，和"杵臼"(knob-in-hole)工程改造(參見，例如，美國專利號5,731,168)。多特異性抗體還可藉由以下製備：用於製備抗體Fc-異二聚體分子的工程改造靜電轉向作用(WO 2009/089004A1)；使兩個或更多個抗體或片段交聯(參見，例如，美國專利號4,676,980，和Brennan等人，Science 229：81(1985))；使用亮胺酸拉鍊產生雙特異性抗體(參見，例如，Kostelny等人，J.Immunol.148(5)：1547-1553(1992))；使用製備雙特異性抗體片段的"雙抗體"技術(參見，例如，Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90：6444-6448(1993))；和使用單鏈Fv(scFv)二聚體(參見，例如，Gruber等人，J.Immunol,152：5368(1994))；以及製備例如在Tutt等人J.Immunol.147：60(1991)中描述的三特異性抗體。本文中還包括具有三個或更多個功能性抗原結合位點的工程改造的抗體，包括"章魚抗體(Octopus antibodies)"(參見，例如US 2006/0025576A1)。雙特異性抗體可藉由連接兩種不同的抗體或其部分來構建。例如，雙特異性抗體可包含來自兩種不同抗體的Fab、F(ab')2、Fab'、scFv、和sdAb。
本發明的雙特異性抗體包括對PD-L1和CD28具有親和 力的雙特異性抗體。在一個實施方式中，本發明的13G4-1211 PD-L1/CD28雙特異性抗體包含以下列出的胺基酸序列：
Figure 110107653-A0202-12-0159-1352
Figure 110107653-A0202-12-0159-1350
(SEQ ID NO：129)，該胺基酸序列可由以下列出的核酸序列編碼：
Figure 110107653-A0202-12-0159-1351
Figure 110107653-A0202-12-0160-1353
Figure 110107653-A0202-12-0160-1354
(SEQ ID NO：130)。
13G4-1211 PD-L1/CD28雙特異性抗體的可容許的改變對本領域技術人員將是已知的，同時保持其預期的生物活性(例如，與PD-L1和CD28結合)。因此，本發明的13G4-1211 PD-L1/CD28雙特異性抗體可包含與SEQ ID NO：129中列出的13G4-1211 PD- L1/CD28雙特異性抗體胺基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的胺基酸序列。因此，本發明的13G4-1211 PD-L1/CD28雙特異性抗體可由包含與SEQ ID NO：130中列出的13G4-1211 PD-L1/CD28雙特異性抗體核酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的核酸序列的核酸編碼。
本發明的雙特異性抗體包括對PD-L1和CD28具有親和力的雙特異性抗體。在一個實施方式中，本發明的10A5-1412 PD-L1/CD28雙特異性抗體包含以下列出的胺基酸序列：
Figure 110107653-A0202-12-0161-1356
Figure 110107653-A0202-12-0161-1355
(SEQ ID NO：131)，該胺基酸序列可由以下列出的核酸序列編碼：
Figure 110107653-A0202-12-0162-1357
Figure 110107653-A0202-12-0163-1358
Figure 110107653-A0202-12-0163-1359
(SEQ ID NO：132)。
10A5-1412 PD-L1/CD28雙特異性抗體的可容許的改變對本領域技術人員將是已知的，同時保持其預期的生物活性(例如，與PD-L1和CD28結合)。因此，本發明的10A5-1412 PD-L1/CD28雙特異性抗體可包含與SEQ ID NO：131中列出的10A5-1412 PD-L1/CD28雙特異性抗體胺基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的胺基酸序列。因此，本發明的10A5-1412 PD-L1/CD28雙特異性抗體可由包含與SEQ ID NO：132中列出的10A5-1412 PD-L1/CD28雙特異性抗體核酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的核酸序列的核酸編碼。
本發明的雙特異性抗體包括對PD-L1和CD28具有親和力的雙特異性抗體。在一個實施方式中，本發明的1B12-1412 PD-L1/CD28雙特異性抗體包含以下列出的胺基酸序列：
Figure 110107653-A0202-12-0164-1361
Figure 110107653-A0202-12-0164-1360
(SEQ ID NO：133)，該胺基酸序列可由以下列出的核酸序列編碼：
Figure 110107653-A0202-12-0164-1362
Figure 110107653-A0202-12-0165-1363
(SEQ ID NO：134)。
1B12-1412 PD-L1/CD28雙特異性抗體的可容許的改變對本領域技術人員將是已知的，同時保持其預期的生物活性(例如，與PD-L1和CD28結合)。因此，本發明的1B12-1412 PD-L1/CD28雙特異性抗體可包含與SEQ ID NO：133中列出的1B12-1412 PD-L1/CD28雙特異性抗體胺基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少 84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的胺基酸序列。因此，本發明的1B12-1412 PD-L1/CD28雙特異性抗體可由包含與SEQ ID NO：134中列出的1B12-1412 PD-L1/CD28雙特異性抗體核酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的核酸序列的核酸編碼。
本發明的雙特異性抗體包括對II型TGF-β受體(TGFβRII)和CD28具有親和力的雙特異性抗體。在一個實施方式中，本發明的TGFβR-1-1412 TGFβRII/CD28雙特異性抗體包含以下列出的胺基酸序列：
Figure 110107653-A0202-12-0166-1365
Figure 110107653-A0202-12-0166-1364
(SEQ ID NO：135)，該胺基酸序列可由以下列出的核酸序列編碼：
Figure 110107653-A0202-12-0167-1366
Figure 110107653-A0202-12-0168-1367
Figure 110107653-A0202-12-0168-1368
(SEQ ID NO：136)。
TGFβR-1-1412 TGFβRII/CD28雙特異性抗體的可容許的改變對本領域技術人員將是已知的，同時保持其預期的生物活性(例如，與TGFβRII和CD28結合)。因此，本發明的TGFβR-1-1412 TGFβRII/CD28雙特異性抗體可包含與SEQ ID NO：135中列出的TGFβR-1-1412 TGFβRII/CD28雙特異性抗體胺基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的胺基酸序列。因此，本發明的TGFβR-1-1412 TGFβRII/CD28雙特異性抗體可由包含與SEQ ID NO：136中列出的TGFβR-1-1412 TGFβRII/CD28雙特異性抗體核酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的核酸序列的核酸編碼。
本發明的雙特異性抗體包括對II型TGF-β受體(TGFβRII)和CD28具有親和力的雙特異性抗體。在一個實施方式 中，本發明的TGFβR-3-1412 TGFβRII/CD28雙特異性抗體包含以下列出的胺基酸序列：
Figure 110107653-A0202-12-0169-1371
Figure 110107653-A0202-12-0169-1369
(SEQ ID NO：137)，該胺基酸序列可由以下列出的核酸序列編碼：
Figure 110107653-A0202-12-0169-1370
Figure 110107653-A0202-12-0170-1372
Figure 110107653-A0202-12-0170-1373
(SEQ ID NO：138)。
TGFβR-3-1412 TGFβRII/CD28雙特異性抗體的可容許的改變對本領域技術人員將是已知的，同時保持其預期的生物活性(例如，與TGFβRII和CD28結合)。因此，本發明的TGFβR-3-1412 TGFβRII/CD28雙特異性抗體可包含與SEQ ID NO：137中列出的 TGFβR-3-1412 TGFβRII/CD28雙特異性抗體胺基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的胺基酸序列。因此，本發明的TGFβR-3-1412 TGFβRII/CD28雙特異性抗體可由包含與SEQ ID NO：138中列出的TGFβR-3-1412 TGFβRII/CD28雙特異性抗體核酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的核酸序列的核酸編碼。
PCT公開號WO2016122738A1(其公開內容藉由引用併入本文)中描述了用於本發明的其它合適的雙特異性抗體。
E.核酸和表現載體
本發明提供了編碼CAR及/或顯性負性受體及/或開關受體的核酸。在一個實施方式中，本揭示的核酸包含編碼本發明的對象CAR(例如，PSMA-CAR)的核酸序列。在一個實施方式中，本揭示的核酸包含編碼顯性負性受體及/或開關受體(例如，PD1-PTM-CD28受體)的核酸序列。
在一些實施方式中，本揭示的核酸提供例如在哺乳動物細胞中如本文所述的CAR及/或顯性負性受體及/或開關受體的產生。在一些實施方式中，本揭示的核酸提供編碼CAR及/或顯性負性受體及/或開關受體的核酸的擴增。
如本文所述，對象CAR包含抗原結合結構域、跨膜結構域、和細胞內結構域。因此，本揭示提供了編碼抗原結合結構域、跨膜 結構域、和對象CAR的細胞內結構域的核酸。如本文所述，提供了各種顯性負性受體和開關受體。因此，本發明提供了編碼顯性負性受體及/或開關受體的核酸。
在一些實施方式中，編碼CAR的核酸與編碼顯性負性受體及/或開關受體的核酸分隔。在例示性實施方式中，編碼CAR的核酸和編碼顯性負性受體及/或開關受體的核酸處於同一核酸中。
在一些實施方式中，本發明的核酸包含：包含CAR編碼序列和顯性負性受體及/或開關受體編碼序列的核酸。在一些實施方式中，本發明的核酸包含：包含由連接子分隔的CAR編碼序列和顯性負性受體及/或開關受體編碼序列的核酸。用於本發明的連接子(例如，在連接CAR編碼序列和顯性負性受體及/或開關受體編碼序列的情況下)允許多個蛋白由同一核酸序列編碼(例如，多順反子序列或雙順反子序列)，其被翻譯為解離成單獨的蛋白組分的多蛋白。例如，包含CAR編碼序列和顯性負性受體及/或開關受體編碼序列的用於本揭示的核酸的連接子，允許CAR和顯性負性受體及/或開關受體翻譯為解離成單獨的CAR和顯性負性受體及/或開關受體組分的多蛋白。
在一些實施方式中，連接子包含編碼內部核糖體進入位點(IRES)的核酸序列。如本文所用，「內部核糖體進入位點」或「IRES」是指促進內部核糖體直接進入蛋白編碼區的起始密碼子(如ATG)，進而引起對該基因的帽獨立性(cap-independent)翻譯的元件。各種內部核糖體進入位點是本領域技術人員已知的，其非限制性地包括可獲自以下的IRES：病毒或細胞mRNA來源，例如，免疫球蛋白重鏈結合蛋白(BiP)；血管內皮生長因子(VEGF)；成纖維細胞生長因子2；胰島素樣生長因子；翻譯起始因子eIF4G；酵母轉錄因子TFIID和HAP4；和可獲自以下的IRES：例如，心病毒、鼻病毒、口蹄疫病毒、HCV、弗蘭德鼠白血病病毒(FrMLV)、和莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)。本領域技術人員將能夠選擇用於本發明的適合的IRES。
在一些實施方式中，連接子包含編碼自切割肽的核酸序 列。如本文所用，「自切割肽」或「2A肽」是指允許多個蛋白編碼為多蛋白的寡肽，多蛋白在轉錄後解離成組分蛋白。術語「自切割」的使用不意圖暗示蛋白水解切割反應。各種自切割肽或2A肽是本領域技術人員已知的，其非限制性地包括在小核糖核酸病毒科病毒家族成員中發現的那些，例如，口蹄疫病毒(FMDV)、馬甲型鼻炎病毒(ERAV0、明脈扁刺蛾β四體病毒(TaV)和豬捷申病毒-1(PTV-1)；和心病毒，如泰勒病毒(Theilovirus)和腦心肌炎病毒。源自FMDV、ERAV、PTV-1、和TaV的2A肽在本文中分別被稱為「F2A」、「E2A」、「P2A」和「T2A」。本領域技術人員將能夠選擇用於本發明的適合的自切割肽。
在一些實施方式中，本揭示的核酸包含：包含由包含T2A肽序列的連接子分隔的CAR編碼序列和顯性負性受體及/或開關受體編碼序列的核酸序列。在一些實施方式中，T2A肽序列包含胺基酸序列EGRGSLLTCGDVEENPGP(SEQ ID NO：139)，該胺基酸序列可由核酸序列GAGGGCAGAGGAAGTCTTCTAACATGCGGTGACGTGGAGGAGAATCCCGGCCCT(SEQ ID NO：140)編碼。在一些實施方式中，包含T2A肽序列的連接子可進一步包含如本文所述的間隔子序列。例如，包含T2A肽序列的連接子可進一步包含：包含胺基酸序列SGRSGGG(SEQ ID NO：141)的間隔子序列，該胺基酸序列可由核酸序列TCCGGAAGATCTGGCGGCGGA(SEQ ID NO：142)編碼。
在一些實施方式中，本揭示的核酸包含：包含由包含F2A肽序列的連接子分隔的CAR編碼序列和顯性負性受體及/或開關受體編碼序列的核酸序列。在一些實施方式中，F2A肽序列包含胺基酸序列VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP(SEQ ID NO：143)，該胺基酸序列可由核酸序列GTGAAACAGACTTTGAATTTTGACCTTCTCAAGTTGGCGGGAGACGTGGAGTCCAACCCAGGGCCG(SEQ ID NO：144)編碼。
在一些實施方式中，連接子進一步包含編碼弗林蛋白酶切割位點的核酸序列。弗林蛋白酶是無所不在地表現的蛋白酶，位於反式高爾基體中並在蛋白前體分泌前對其加工。弗林蛋白酶在其共有識別序列的COOH-端切割。各種弗林蛋白酶共有識別序列(或「弗林蛋白酶切割位點」)是本領域技術人員已知的，其非限制性地包括Arg-X-Lys-Arg(SEQ ID NO：145)或Arg-X-Arg-Arg(SEQ ID NO：146)，和Arg-X-X-Arg(SEQ ID NO：147)，如Arg-Gln-Lys-Arg(SEQ ID NO：148)，其中X任意天然存在的胺基酸。弗林蛋白酶切割位點的另一實例是X1-Arg-X2-X3-Arg(SEQ ID NO：149)，其中X1是Lys或Arg，X2是任意天然存在的胺基酸，並且X3是Lys或Arg。本領域技術人員將能夠選擇用於本發明的適合的弗林蛋白酶切割位點。
在一些實施方式中，連接子包含編碼弗林蛋白酶切割位點和2A肽的組合的核酸序列。實例非限制性地包括：包含編碼弗林蛋白酶和F2A的核酸序列的連接子、包含編碼弗林蛋白酶和E2A的核酸序列的連接子、包含編碼弗林蛋白酶和P2A的核酸序列的連接子、包含編碼弗林蛋白酶和T2A的核酸序列的連接子。本領域技術人員將能夠選擇用於本發明的適合的組合。在這樣的實施方式中，連接子可進一步包含在弗林蛋白酶和2A肽之間的間隔子序列。各種間隔子序列是本領域已知的，其非限制性地包括甘胺酸絲胺酸(GS)間隔子，如(GS)n、(GSGGS)n(SEQ ID NO：1)和(GGGS)n(SEQ ID NO：2)，其中n代表至少為1的整數。例示性間隔子序列可包含胺基酸序列，其非限制性地包括GGSG(SEQ ID NO：4)、GGSGG(SEQ ID NO：5)、GSGSG(SEQ ID NO：6)、GSGGG(SEQ ID NO：7)、GGGSG(SEQ ID NO：8)、GSSSG(SEQ ID NO：9)等。本領域技術人員將能夠選擇用於本發明的適合的間隔子序列。
在一些實施方式中，本揭示的核酸包含：包含由弗林蛋白酶-(G4S)2-T2A(F-GS2-T2A)連接子分隔的CAR編碼序列和顯性負性受體及/或開關受體編碼序列的核酸序列。F-GS2-T2連接子可由核酸 序列
Figure 110107653-A0202-12-0175-1375
Figure 110107653-A0202-12-0175-1374
(SEQ ID NO：150)編碼，並且可包含胺基酸序列RAKRGGGGSGGGGSEGRGSLLTCGDVEENPGP(SEQ ID NO：151)。本領域技術人員將理解本發明的連接子可包含可容許的序列變化。
在一些實施方式中，本發明提供了包含如本文所述的編碼顯性負性受體及/或開關受體的核酸序列的核酸。在一些實施方式中，核酸包含編碼顯性負性受體及/或開關受體的核酸序列和編碼如本文所述的CAR(例如，PSMA-CAR)的核酸序列。在一個實施方式中，編碼顯性負性受體及/或開關受體的核酸序列和編碼CAR的核酸序列處於單獨的核酸上。在一個實施方式中，編碼顯性負性受體及/或開關受體的核酸序列和編碼CAR的核酸序列處於同一核酸內。在這樣的實施方式中，編碼顯性負性受體及/或開關受體的核酸序列和編碼CAR的核酸序列由如本文所述的連接子分隔。
例如，本揭示的核酸可包含編碼顯性受體的核酸序列、連接子、和編碼CAR的核酸序列。在一個實施方式中，連接子包含編碼2A肽(例如，T2A)的核酸序列。在例示性實施方式中，本揭示的核酸可包含由包含編碼T2A的核酸序列的連接子序列分隔的編碼顯性負性受體及/或開關受體的核酸序列和編碼CAR的核酸序列。
因此，在一個實施方式中，本揭示的核酸從5’至3’包含：編碼顯性負性受體及/或開關受體的核酸序列、編碼連接子的核酸序列、和編碼CAR的核酸序列。在一個實施方式中，本揭示的核酸從5’至3’包含：編碼CAR的核酸序列、編碼連接子的核酸序列、和編碼顯性負性受體及/或開關受體的核酸序列。
在一些實施方式中，本揭示的核酸從5’至3’包含：編碼顯性負性受體及/或開關受體的核酸序列、編碼包含T2A的連接子的核 酸序列、和編碼CAR的核酸序列。在一個實施方式中，顯性負性受體是TGFβRII-DN。在一個實施方式中，該CAR是鼠J591 PSMA-CAR。因此，在例示性實施方式中，本發明的核酸從5’至3’包含：編碼TGFβRII-DN的核酸序列、編碼包含T2A的連接子的核酸序列、和編碼鼠J591 PSMA-CAR的核酸序列。在一個實施方式中，從5’至3’包含編碼TGFβRII-DN的核酸序列、編碼包含T2A的連接子的核酸序列、和編碼鼠J591 PSMA-CAR的核酸序列的核酸包含以下列出的核酸序列：
Figure 110107653-A0202-12-0176-1376
Figure 110107653-A0202-12-0177-1377
Figure 110107653-A0202-12-0178-1379
Figure 110107653-A0202-12-0178-1378
(SEQ ID NO：152)。
在一個實施方式中，該CAR是人源化J591 PSMA-CAR。因此，在例示性實施方式中，本發明的核酸從5’至3’包含：編碼TGFβRII-DN的核酸序列、編碼包含2A肽(例如，T2A)的連接子的核酸序列、和編碼人源化J591 PSMA-CAR的核酸序列。在一個實施方式中，本揭示的核酸從5’至3’包含：編碼人源化PSMA-CAR的核酸、編碼包含2A肽(例如，T2A)的連接子的核酸、和編碼顯性負性受體及/或開關受體的核酸。
在一個實施方式中，該CAR是人源化J591 PSMA-CAR。因此，在例示性實施方式中，本發明的核酸從5’至3’包含：編碼TGFβRII-DN的核酸序列、編碼包含T2A的連接子的核酸序列、和編碼人源化J591 PSMA-CAR的核酸序列。在一個實施方式中，核酸從5’至3’包含：編碼TGFβRII-DN的核酸序列、編碼包含T2A的連接子的核酸序列、和編碼人源化J591 PSMA-CAR的核酸序列。
人源化PSMA-CAR可包含PCT公開號WO2017212250A1和WO2018033749A1中公開的任意重鏈可變區和輕鏈可變區。例如，本發明的人源化PSMA-CAR可包含：包含其中公開的任意重鏈可變區和輕鏈可變區的scFv。在一些實施方式中，人源化J591 PSMA-CAR包含人源化J591 PSMA結合結構域，人源化J591 PSMA結合結構域包含選自表19中列出的任意重鏈可變區序列和輕鏈可變區序列的重鏈可變區和輕鏈可變區。
在一些實施方式中，本發明的從5’至3’包含：編碼TGFβRII-DN的核酸序列、編碼包含2A肽(例如，T2A)的連接子的核酸序列、和編碼人源化J591 PSMA-CAR的核酸序列的核酸包含以下列出的核酸序列：
Figure 110107653-A0202-12-0179-1380
Figure 110107653-A0202-12-0180-1381
(SEQ ID NO：258)。
在一些實施方式中，本發明的從5’至3’包含：編碼TGFβRII-DN的核酸序列、編碼包含2A肽(例如，T2A)的連接子的核酸序列、和編碼人源化J591 PSMA-CAR的核酸序列的核酸包含以下列出的核酸序列：
Figure 110107653-A0202-12-0180-1382
Figure 110107653-A0202-12-0181-1383
(SEQ ID NO：260)。
在一些實施方式中，本發明的從5’至3’包含：編碼TGFβRII-DN的核酸序列、編碼包含2A肽(例如，T2A)的連接子的核酸序列、和編碼人源化J591 PSMA-CAR的核酸序列的核酸包含以下列出的核酸序列：
Figure 110107653-A0202-12-0181-1384
Figure 110107653-A0202-12-0182-1385
Figure 110107653-A0202-12-0182-1386
(SEQ ID NO：262)。
在一個實施方式中，該CAR是人類1C3 PSMA-CAR。因此，在例示性實施方式中，本發明的核酸從5’至3’包含：編碼TGFβRII-DN的核酸序列、編碼包含T2A的連接子的核酸序列、和編碼人類1C3 PSMA-CAR的核酸序列。在一個實施方式中，從5’至3’包含：編碼TGFβRII-DN的核酸序列、編碼包含T2A的連接子的核酸序列、和編碼人類1C3 PSMA-CAR的核酸序列的核酸包含以下列出的核酸序列：
Figure 110107653-A0202-12-0183-1387
Figure 110107653-A0202-12-0184-1388
Figure 110107653-A0202-12-0185-1389
Figure 110107653-A0202-12-0185-1390
(SEQ ID NO：153)。
在一個實施方式中，該CAR是人類2A10 PSMA-CAR。 因此，在例示性實施方式中，本發明的核酸從5’至3’包含：編碼TGFβRII-DN的核酸序列、編碼包含T2A的連接子的核酸序列、和編碼人類2A10 PSMA-CAR的核酸序列。在一個實施方式中，從5’至3’包含：編碼TGFβRII-DN的核酸序列、編碼包含T2A的連接子的核酸序列、和編碼人類2A10 PSMA-CAR的核酸序列的核酸包含以下列出的核酸序列：
Figure 110107653-A0202-12-0185-1391
Figure 110107653-A0202-12-0186-1740
Figure 110107653-A0202-12-0187-1393
Figure 110107653-A0202-12-0187-1394
(SEQ ID NO：154)。
在一個實施方式中，該CAR是人類2F5 PSMA-CAR。因此，在例示性實施方式中，本發明的核酸從5’至3’包含：編碼TGFβRII-DN的核酸序列、編碼包含T2A的連接子的核酸序列、和編碼人類2F5 PSMA-CAR的核酸序列。在一個實施方式中，從5’至3’包含：編碼TGFβRII-DN的核酸序列、編碼包含T2A的連接子的核酸序列、和編碼人類2F5 PSMA-CAR的核酸序列的核酸包含以下列出的核酸序列：
Figure 110107653-A0202-12-0187-1395
Figure 110107653-A0202-12-0188-1396
Figure 110107653-A0202-12-0189-1397
Figure 110107653-A0202-12-0189-1398
(SEQ ID NO：155)。
在一個實施方式中，該CAR是人類2C6 PSMA-CAR。因此，在例示性實施方式中，本發明的核酸從5’至3’包含：編碼TGFβRII-DN的核酸序列、編碼包含T2A的連接子的核酸序列、和編碼人類2C6 PSMA-CAR的核酸序列。在一個實施方式中，從5’至3’包含：編碼TGFβRII-DN的核酸序列、編碼包含T2A的連接子的核酸序列、和編碼人類2C6 PSMA-CAR的核酸序列的核酸包含以下列出的核酸序列：
Figure 110107653-A0202-12-0189-1399
Figure 110107653-A0202-12-0190-1400
Figure 110107653-A0202-12-0191-1401
Figure 110107653-A0202-12-0191-1402
(SEQ ID NO：156)。
編碼TGFβRII-DN和PSMA-CAR的核酸序列的可容許的改變對本領域技術人員將是已知的。例如，在一些實施方式中，該核酸序列與SEQ ID NO：152-156、258、260、或262任一個中列出的核酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性。在一個實施方式中，編碼TGFβRII-DN和鼠J591 PSMA-CAR的核酸序列包含SEQ ID NO：152中列出的核酸序列。在一個實施方式中，編碼TGFβRII-DN和人類1C3 PSMA-CAR的核酸序列包含SEQ ID NO：153中列出的核酸序列。在一個實施方式中，編碼TGFβRII-DN和人類2A10 PSMA-CAR的核酸序列包含SEQ ID NO：154中列出的核酸序列。在一個實施方式中，編碼TGFβRII-DN和人類2F5 PSMA-CAR的核酸序列包含SEQ ID NO：155中列出的核酸序列。在一個實施方式中，編碼TGFβRII-DN和人類2C6 PSMA-CAR的核酸序列包含SEQ ID NO：156中列出的核酸序列。在一個實施方式中，編碼TGFβRII-DN和人源化J591 PSMA-CAR的核酸序列 包含SEQ ID NO：258、260、或262中列出的核酸序列。
在一些實施方式中，本揭示的核酸從5’至3’包含：編碼開關受體的核酸序列、編碼包含F2A的連接子的核酸序列、和編碼CAR的核酸序列。在一個實施方式中，開關受體是PD1-CTM-CD28。
在一個實施方式中，該CAR是人源化J591 CAR(huJ591 PSMA-CAR)。因此，在例示性實施方式中，本發明的核酸從5’至3’包含：編碼PD1-CTM-CD28的核酸序列、編碼連接子(例如，2A連接子)的核酸序列、和編碼huJ591 PSMA-CAR的核酸序列。在一些實施方式中，本發明的核酸從5’至3’包含編碼具有SEQ ID NO：117中列出的胺基酸序列的PD1-CTM-CD28的核酸序列、編碼連接子(例如，2A連接子)的核酸序列、和編碼具有SEQ ID NO：245或247中列出的胺基酸序列的huJ591 PSMA-CAR的核酸序列。
在一個實施方式中，該CAR是人類1C3 PSMA-CAR。因此，在例示性實施方式中，本發明的核酸從5’至3’包含：編碼PD1-CTM-CD28的核酸序列、編碼包含F2A的連接子的核酸序列、和編碼人類1C3 PSMA-CAR的核酸序列。在一個實施方式中，從5’至3’包含：編碼PD1-CTM-CD28的核酸序列、編碼包含F2A的連接子的核酸序列、和編碼人類1C3 PSMA-CAR的核酸序列的核酸包含以下列出的核酸序列：
Figure 110107653-A0202-12-0192-1403
Figure 110107653-A0202-12-0193-1404
Figure 110107653-A0202-12-0194-1405
Figure 110107653-A0202-12-0194-1406
(SEQ ID NO：157)。
在一些實施方式中，本揭示的核酸從5’至3’包含：編碼開關受體的核酸序列、編碼包含F2A的連接子的核酸序列、和編碼CAR的核酸序列。在一個實施方式中，開關受體是PD1-CTM-CD28。在一個實施方式中，該CAR是人類2A10 PSMA-CAR。因此，在例示性實施方式中，本發明的核酸從5’至3’包含：編碼PD1-CTM-CD28的核酸序列、編碼包含F2A的連接子的核酸序列、和編碼人類2A10 PSMA-CAR的核酸序列。在一個實施方式中，從5’至3’包含：編碼PD1-CTM-CD28的核酸序列、編碼包含F2A的連接子的核酸序列、和編碼人類2A10 PSMA-CAR的核酸序列的核酸包含以下列出的核酸序列：
Figure 110107653-A0202-12-0194-1407
Figure 110107653-A0202-12-0195-1408
Figure 110107653-A0202-12-0196-1409
Figure 110107653-A0202-12-0196-1410
(SEQ ID NO：158)。
在一些實施方式中，本揭示的核酸從5’至3’包含：編碼開關受體的核酸序列、編碼包含F2A的連接子的核酸序列、和編碼CAR的核酸序列。在一個實施方式中，開關受體是PD1-CTM-CD28。在一個實施方式中，該CAR是人類2F5 PSMA-CAR。因此，在例示性實 施方式中，本發明的核酸從5’至3’包含：編碼PD1-CTM-CD28的核酸序列、編碼包含F2A的連接子的核酸序列、和編碼人類2F5 PSMA-CAR的核酸序列。在一個實施方式中，從5’至3’包含：編碼PD1-CTM-CD28的核酸序列、編碼包含F2A的連接子的核酸序列、和編碼人類2F5 PSMA-CAR的核酸序列的核酸包含以下列出的核酸序列：
Figure 110107653-A0202-12-0197-1411
Figure 110107653-A0202-12-0198-1412
Figure 110107653-A0202-12-0199-1413
Figure 110107653-A0202-12-0199-1414
(SEQ ID NO：159)。
在一些實施方式中，本揭示的核酸從5’至3’包含：編碼開關受體的核酸序列、編碼包含F2A的連接子的核酸序列、和編碼CAR的核酸序列。在一個實施方式中，開關受體是PD1-CTM-CD28。在一個實施方式中，該CAR是人類2C6 PSMA-CAR。因此，在例示性實施方式中，本發明的核酸從5’至3’包含：編碼PD1-CTM-CD28的核酸序列、編碼包含F2A的連接子的核酸序列、和編碼人類2C6 PSMA-CAR的核酸序列。在一個實施方式中，從5’至3’包含：編碼PD1-CTM-CD28的核酸序列、編碼包含F2A的連接子的核酸序列、和編碼人類2C6 PSMA-CAR的核酸序列的核酸包含以下列出的核酸序列：
Figure 110107653-A0202-12-0199-1415
Figure 110107653-A0202-12-0200-1416
Figure 110107653-A0202-12-0201-1417
Figure 110107653-A0202-12-0201-1418
(SEQ ID NO：160)。
編碼PD1-CTM-CD28和PSMA-CAR的核酸序列的可容許的改變對本領域技術人員將是已知的。例如，在一些實施方式中，該核酸序列與SEQ ID NO：157-160任一個中列出的核酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性。在一個實施方式中，編碼PD1-CTM-CD28和人類1C3 PSMA-CAR的核酸序列包含SEQ ID NO：157中列出的核酸序列。在一個實施方式中，編碼PD1-CTM-CD28和人類2A10 PSMA-CAR的核酸序列包含SEQ ID NO：158中列出的核酸序列。在一個實施方式中，編碼PD1-CTM-CD28和人類2F5 PSMA-CAR的核酸序列包含SEQ ID NO：159中列出的核酸序列。在一個實施方式中，編碼PD1-CTM-CD28和人類2C6 PSMA-CAR的核酸序列包含SEQ ID NO：160中列出的核酸序列。
在一些實施方式中，本揭示的核酸從5’至3’包含：編碼開關受體的核酸序列、編碼包含F2A的連接子的核酸序列、和編碼CAR的核酸序列。在一個實施方式中，開關受體是PD1A132L-PTM-CD28。 在一個實施方式中，該CAR是人類1C3 PSMA-CAR。因此，在例示性實施方式中，本發明的核酸從5’至3’包含：編碼PD1A132L-PTM-CD28的核酸序列、編碼包含F2A的連接子的核酸序列、和編碼人類1C3 PSMA-CAR的核酸序列。在一個實施方式中，從5’至3’包含：編碼PD1A132L-PTM-CD28的核酸序列、編碼包含F2A的連接子的核酸序列、和編碼人類1C3 PSMA-CAR的核酸序列的核酸包含以下列出的核酸序列：
Figure 110107653-A0202-12-0202-1419
Figure 110107653-A0202-12-0203-1420
Figure 110107653-A0202-12-0204-1421
Figure 110107653-A0202-12-0204-1422
(SEQ ID NO：161)。
在一些實施方式中，本揭示的核酸從5’至3’包含：編碼開關受體的核酸序列、編碼包含F2A的連接子的核酸序列、和編碼CAR的核酸序列。在一個實施方式中，開關受體是PD1A132L-PTM-CD28。
在一個實施方式中，該CAR是人源化J591 CAR(huJ591 PSMA-CAR)。因此，在例示性實施方式中，本發明的核酸從5’至3’包含：編碼PD1A132L-PTM-CD28的核酸序列、編碼連接子(例如，2A連接子)的核酸序列、和編碼huJ591 PSMA-CAR的核酸序列。在一些實施方式中，本發明的核酸從5’至3’包含編碼具有SEQ ID NO：121中列出的胺基酸序列的PD1A132L-PTM-CD28的核酸序列、編碼連接子(例如，2A連接子)的核酸序列、和編碼具有SEQ ID NO：245或247中列出的胺基酸序列的huJ591 PSMA-CAR的核酸序列。
在一個實施方式中，該CAR是人類2A10 PSMA-CAR。因此，在例示性實施方式中，本發明的核酸從5’至3’包含：編碼PD1A132L-PTM-CD28的核酸序列、編碼包含F2A的連接子的核酸序列、和編碼人類2A10 PSMA-CAR的核酸序列。在一個實施方式中，從5’至3’包含：編碼PD1A132L-PTM-CD28的核酸序列、編碼包含F2A的連接子的核酸序列、和編碼人類2A10 PSMA-CAR的核酸序列的核酸包含以下列出的核酸序列：
Figure 110107653-A0202-12-0204-1423
Figure 110107653-A0202-12-0205-1424
Figure 110107653-A0202-12-0206-1425
Figure 110107653-A0202-12-0206-1426
(SEQ ID NO：162)。
在一些實施方式中，本揭示的核酸從5’至3’包含：編碼開關受體的核酸序列、編碼包含F2A的連接子的核酸序列、和編碼CAR的核酸序列。在一個實施方式中，開關受體是PD1A132L-PTM-CD28。在一個實施方式中，該CAR是人類2F5 PSMA-CAR。因此，在例示性實施方式中，本發明的核酸從5’至3’包含：編碼PD1A132L-PTM-CD28的核酸序列、編碼包含F2A的連接子的核酸序列、和編碼人類2F5 PSMA-CAR的核酸序列。在一個實施方式中，從5’至3’包含：編碼PD1A132L-PTM-CD28的核酸序列、編碼包含F2A的連接子的核酸 序列、和編碼人類2F5 PSMA-CAR的核酸序列的核酸包含以下列出的核酸序列：
Figure 110107653-A0202-12-0207-1427
Figure 110107653-A0202-12-0208-1428
Figure 110107653-A0202-12-0208-1429
(SEQ ID NO：163)。
在一些實施方式中，本揭示的核酸從5’至3’包含：編碼開關受體的核酸序列、編碼包含F2A的連接子的核酸序列、和編碼CAR的核酸序列。在一個實施方式中，開關受體是PD1A132L-PTM-CD28。在一個實施方式中，該CAR是人類2C6 PSMA-CAR。因此，在例示性實施方式中，本發明的核酸從5’至3’包含：編碼PD1A132L-PTM-CD28的核酸序列、編碼包含F2A的連接子的核酸序列、和編碼人類2C6 PSMA-CAR的核酸序列。在一個實施方式中，從5’至3’包含：編碼PD1A132L-PTM-CD28的核酸序列、編碼包含F2A的連接子的核酸序列、和編碼人類2C6 PSMA-CAR的核酸序列的核酸包含以下列出的核酸序列：
Figure 110107653-A0202-12-0209-1430
Figure 110107653-A0202-12-0210-1431
Figure 110107653-A0202-12-0211-1432
Figure 110107653-A0202-12-0211-1433
(SEQ ID NO：164)。
編碼PD1A132L-PTM-CD28和PSMA-CAR的核酸序列的可容許的改變對本領域技術人員將是已知的。例如，在一些實施方式中，該核酸序列與SEQ ID NO：161-164任一個中列出的核酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性。在一個實施方式中，編碼PD1A132L-PTM-CD28和人類1C3 PSMA-CAR的核酸序列包含SEQ ID NO：161中列出的核酸序列。在一個實施方式中，編碼PD1A132L-PTM-CD28和人類2A10 PSMA-CAR的核酸序列包含SEQ ID NO：162中列出的核酸序列。在一個實施方式中，編碼PD1A132L-PTM-CD28和人類2F5 PSMA-CAR的核酸序列包含SEQ ID NO：163中列出的核酸序列。在一個實施方式中，編碼PD1A132L-PTM-CD28和人類2C6 PSMA-CAR的核酸序列包含SEQ ID NO：164中列出的核酸序列。
在一些實施方式中，本揭示的核酸從5’至3’包含：編碼開關受體的核酸序列、編碼包含F2A的連接子的核酸序列、和編碼CAR的核酸序列。在一個實施方式中，開關受體是TIM3-CD28。在一個實施方式中，該CAR是人類1C3 PSMA-CAR。因此，在例示性實施方式中，本發明的核酸從5’至3’包含：編碼TIM3-CD28的核酸序列、 編碼包含F2A的連接子的核酸序列、和編碼人類1C3 PSMA-CAR的核酸序列。在一個實施方式中，從5’至3’包含：編碼TIM3-CD28的核酸序列、編碼包含F2A的連接子的核酸序列、和編碼人類1C3 PSMA-CAR的核酸序列的核酸包含以下列出的核酸序列：
Figure 110107653-A0202-12-0212-1434
Figure 110107653-A0202-12-0213-1435
Figure 110107653-A0202-12-0214-1436
Figure 110107653-A0202-12-0214-1437
(SEQ ID NO：165)。
在一些實施方式中，本揭示的核酸從5’至3’包含：編碼開關受體的核酸序列、編碼包含F2A的連接子的核酸序列、和編碼CAR的核酸序列。在一個實施方式中，開關受體是TIM3-CD28。
在一個實施方式中，該CAR是人源化J591 CAR(huJ591 PSMA-CAR)。因此，在例示性實施方式中，本發明的核酸從5’至3’包含：編碼TIM3-CD28的核酸序列、編碼連接子(例如，2A連接子)的核酸序列、和編碼huJ591 PSMA-CAR的核酸序列。在一些實施方式中，本發明的核酸從5’至3’包含編碼具有SEQ ID NO：127中列出的胺基酸序列的TIM3-CD28的核酸序列、編碼連接子(例如，2A連接子)的核酸序列、和編碼具有SEQ ID NO：245或247中列出的胺基酸序列的huJ591 PSMA-CAR的核酸序列。
在一個實施方式中，該CAR是人類2A10 PSMA-CAR。因此，在例示性實施方式中，本發明的核酸從5’至3’包含：編碼TIM3-CD28的核酸序列、編碼包含F2A的連接子的核酸序列、和編碼人類2A10 PSMA-CAR的核酸序列。在一個實施方式中，從5’至3’包含：編碼TIM3-CD28的核酸序列、編碼包含F2A的連接子的核酸序列、和編碼人類2A10 PSMA-CAR的核酸序列的核酸包含以下列出的核酸序列：
Figure 110107653-A0202-12-0214-1438
Figure 110107653-A0202-12-0215-1439
Figure 110107653-A0202-12-0216-1440
Figure 110107653-A0202-12-0216-1441
(SEQ ID NO：166)。
在一些實施方式中，本揭示的核酸從5’至3’包含：編碼開關受體的核酸序列、編碼包含F2A的連接子的核酸序列、和編碼CAR的核酸序列。在一個實施方式中，開關受體是TIM3-CD28。在一個實施方式中，該CAR是人類2F5 PSMA-CAR。因此，在例示性實施方式中，本發明的核酸從5’至3’包含：編碼TIM3-CD28的核酸序列、編碼包含F2A的連接子的核酸序列、和編碼人類2F5 PSMA-CAR的 核酸序列。在一個實施方式中，從5’至3’包含：編碼TIM3-CD28的核酸序列、編碼包含F2A的連接子的核酸序列、和編碼人類2F5 PSMA-CAR的核酸序列的核酸包含以下列出的核酸序列：
Figure 110107653-A0202-12-0217-1442
Figure 110107653-A0202-12-0218-1443
Figure 110107653-A0202-12-0219-1444
Figure 110107653-A0202-12-0219-1445
(SEQ ID NO：167)。
在一些實施方式中，本揭示的核酸從5’至3’包含：編碼開關受體的核酸序列、編碼包含F2A的連接子的核酸序列、和編碼CAR的核酸序列。在一個實施方式中，開關受體是TIM3-CD28。在一個實施方式中，該CAR是人類2C6 PSMA-CAR。因此，在例示性實施方式中，本發明的核酸從5’至3’包含：編碼TIM3-CD28的核酸序列、編碼包含F2A的連接子的核酸序列、和編碼人類2C6 PSMA-CAR的核酸序列。在一個實施方式中，從5’至3’包含：編碼TIM3-CD28的核酸序列、編碼包含F2A的連接子的核酸序列、和編碼人類2C6 PSMA-CAR的核酸序列的核酸包含以下列出的核酸序列：
Figure 110107653-A0202-12-0219-1446
Figure 110107653-A0202-12-0220-1447
Figure 110107653-A0202-12-0221-1448
Figure 110107653-A0202-12-0221-1449
(SEQ ID NO：168)。
編碼TIM3-CD28和PSMA-CAR的核酸序列的可容許的改變對本領域技術人員將是已知的。例如，在一些實施方式中，該核酸序列與SEQ ID NO：165-168任一個中列出的核酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性。在一個實施方式中，編碼TIM3-CD28和人類1C3 PSMA-CAR的核酸序列包含SEQ ID NO：165中列出的核酸序列。在一個實施方式中，編碼TIM3-CD28和人類2A10 PSMA-CAR的核酸序列包含SEQ ID NO：166中列出的核酸序列。在一個實施方式中，編碼TIM3-CD28和人類2F5 PSMA-CAR的核酸序列包含SEQ ID NO：167中列出的核酸序列。在一個實施方式中，編碼TIM3-CD28和人類2C6 PSMA-CAR的核酸序列包含SEQ ID NO：168中列出的核酸序列。
在一些實施方式中，本揭示的核酸從5’至3’包含：編碼開關受體的核酸序列、編碼包含F2A的連接子的核酸序列、和編碼CAR 的核酸序列。在一個實施方式中，開關受體是PD1-CTM-CD28。
在一個實施方式中，該CAR是包含ICOS結構域和CD3 ζ結構域的人類2F5 PSMA-CAR。因此，在例示性實施方式中，本發明的核酸從5’至3’包含：編碼PD1-CTM-CD28的核酸序列、編碼包含F2A的連接子的核酸序列、和編碼包含ICOS結構域和CD3 ζ結構域的人類2F5 PSMA-CAR的核酸序列。在一個實施方式中，從5’至3’包含：編碼PD1-CTM-CD28的核酸序列、編碼包含F2A的連接子的核酸序列、和編碼包含ICOS結構域和CD3 ζ結構域的人類2F5 PSMA-CAR的核酸序列的核酸包含以下列出的核酸序列：
Figure 110107653-A0202-12-0222-1450
Figure 110107653-A0202-12-0223-1451
Figure 110107653-A0202-12-0224-1452
Figure 110107653-A0202-12-0224-1453
(SEQ ID NO：217)。
編碼PD1-CTM-CD28和包含ICOS結構域和CD3 ζ結構域的人類2F5 PSMA-CAR的核酸序列的可容許的改變對本領域技術人員將是已知的。例如，在一些實施方式中，該核酸序列與SEQ ID NO：217中列出的核酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性。在一個實施方式中，編碼PD1-CTM-CD28和包含ICOS結構域和CD3 ζ結構域的人類2F5 PSMA-CAR的核酸序列包含SEQ ID NO：217中列出的核酸序列。
在一些實施方式中，本揭示的核酸從5’至3’包含：編碼開關受體的核酸序列、編碼包含F2A的連接子的核酸序列、和編碼CAR的核酸序列。在一個實施方式中，開關受體是PD1-CTM-CD28。在一個實施方式中，該CAR是包含變體ICOS結構域和CD3 ζ結構域的人類2F5 PSMA-CAR。因此，在例示性實施方式中，本發明的核酸從5’至3’包含：編碼PD1-CTM-CD28的核酸序列、編碼包含F2A的連接子的核酸序列、和編碼包含變體ICOS結構域和CD3 ζ結構域的人類2F5 PSMA-CAR的核酸序列。在一個實施方式中，從5’至3’包含：編碼PD1-CTM-CD28的核酸序列、編碼包含F2A的連接子的核酸序列、和編碼包含變體ICOS結構域和CD3 ζ結構域的人類2F5 PSMA-CAR的核酸序列的核酸包含以下列出的核酸序列：
Figure 110107653-A0202-12-0225-1454
Figure 110107653-A0202-12-0226-1455
Figure 110107653-A0202-12-0226-1456
(SEQ ID NO：218)。
編碼PD1-CTM-CD28和包含變體ICOS結構域和CD3 ζ結構域的人類2F5 PSMA-CAR的核酸序列的可容許的改變對本領域 技術人員將是已知的。例如，在一些實施方式中，該核酸序列與SEQ ID NO：218中列出的核酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性。在一個實施方式中，編碼PD1-CTM-CD28和包含變體ICOS結構域和CD3 ζ結構域的人類2F5 PSMA-CAR的核酸序列包含SEQ ID NO：218中列出的核酸序列。
在一些實施方式中，本揭示的核酸從5’至3’包含：編碼開關受體的核酸序列、編碼包含F2A的連接子的核酸序列、和編碼CAR的核酸序列。在一個實施方式中，開關受體是PD1A132L-PTM-CD28。在一個實施方式中，該CAR是包含ICOS結構域和CD3 ζ結構域的人類2F5 PSMA-CAR。因此，在例示性實施方式中，本發明的核酸從5’至3’包含：編碼PD1A132L-PTM-CD28的核酸序列、編碼包含F2A的連接子的核酸序列、和編碼包含ICOS結構域和CD3 ζ結構域的人類2F5 PSMA-CAR的核酸序列。在一個實施方式中，從5’至3’包含：編碼PD1A132L-PTM-CD28的核酸序列、編碼包含F2A的連接子的核酸序列、和編碼包含ICOS結構域和CD3 ζ結構域的人類2F5 PSMA-CAR的核酸序列的核酸包含以下列出的核酸序列：
Figure 110107653-A0202-12-0227-1457
Figure 110107653-A0202-12-0228-1458
Figure 110107653-A0202-12-0229-1459
Figure 110107653-A0202-12-0229-1460
(SEQ ID NO：219)。
編碼PD1A132L-PTM-CD28和包含ICOS結構域和CD3 ζ結構域的人類2F5 PSMA-CAR的核酸序列的可容許的改變對本領域技術人員將是已知的。例如，在一些實施方式中，該核酸序列與SEQ ID NO：219中列出的核酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性。在一個實施方式中，編碼PD1A132L-PTM-CD28和包含ICOS結構域和CD3 ζ結構域的人類2F5 PSMA-CAR的核酸序列包含SEQ ID NO：219中列出的核酸序列。
在一些實施方式中，本揭示的核酸從5’至3’包含：編碼開關受體的核酸序列、編碼包含F2A的連接子的核酸序列、和編碼CAR 的核酸序列。在一個實施方式中，開關受體是PD1A132L-PTM-CD28。在一個實施方式中，該CAR是包含變體ICOS結構域和CD3 ζ結構域的人類2F5 PSMA-CAR。因此，在例示性實施方式中，本發明的核酸從5’至3’包含：編碼PD1A132L-PTM-CD28的核酸序列、編碼包含F2A的連接子的核酸序列、和編碼包含變體ICOS結構域和CD3 ζ結構域的人類2F5 PSMA-CAR的核酸序列。在一個實施方式中，從5’至3’包含：編碼PD1A132L-PTM-CD28的核酸序列、編碼包含F2A的連接子的核酸序列、和編碼包含變體ICOS結構域和CD3 ζ結構域的人類2F5 PSMA-CAR的核酸序列的核酸包含以下列出的核酸序列：
Figure 110107653-A0202-12-0230-1461
Figure 110107653-A0202-12-0231-1462
Figure 110107653-A0202-12-0232-1464
Figure 110107653-A0202-12-0232-1463
(SEQ ID NO：220)。
編碼PD1A132L-PTM-CD28和包含變體ICOS結構域和CD3 ζ結構域的人類2F5 PSMA-CAR的核酸序列的可容許的改變對本領域技術人員將是已知的。例如，在一些實施方式中，該核酸序列與SEQ ID NO：220中列出的核酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性。在一個實施方式中，編碼PD1A132L-PTM-CD28和包含變體ICOS結構域和CD3 ζ結構域的人類2F5 PSMA-CAR的核酸序列包含SEQ ID NO：220中列出的核酸序列。
在一些實施方式中，本揭示的核酸從5’至3’包含：編碼開關受體的核酸序列、編碼包含F2A的連接子的核酸序列、和編碼CAR的核酸序列。在一個實施方式中，開關受體是PD1A132L-4-1BB。在一個實施方式中，該CAR是包含ICOS結構域和CD3 ζ結構域的人類2F5 PSMA-CAR。因此，在例示性實施方式中，本發明的核酸從5’至3’包含：編碼PD1A132L-4-1BB的核酸序列、編碼包含F2A的連接子的核酸序列、和編碼包含ICOS結構域和CD3 ζ結構域的人類2F5 PSMA-CAR的核酸序列。在一個實施方式中，從5’至3’包含：編碼PD1A132L-4-1BB的核酸序列、編碼包含F2A的連接子的核酸序列、和編碼包含ICOS結構域和CD3 ζ結構域的人類2F5 PSMA-CAR的核酸序列的核酸包含以下列出的核酸序列：
Figure 110107653-A0202-12-0233-1465
Figure 110107653-A0202-12-0234-1466
Figure 110107653-A0202-12-0234-1467
(SEQ ID NO：221)。
編碼包含ICOS結構域和CD3 ζ結構域的PD1A132L-4-1BB和人類2F5 PSMA-CAR的核酸序列的可容許的改變對本領域技 術人員將是已知的。例如，在一些實施方式中，該核酸序列與SEQ ID NO：221中列出的核酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性。在一個實施方式中，編碼PD1A132L-4-1BB和包含ICOS結構域和CD3 ζ結構域的人類2F5 PSMA-CAR的核酸序列包含SEQ ID NO：221中列出的核酸序列。
在一些實施方式中，本揭示的核酸從5’至3’包含：編碼開關受體的核酸序列、編碼包含F2A的連接子的核酸序列、和編碼CAR的核酸序列。在一個實施方式中，開關受體是PD1A132L-4-1BB。在一個實施方式中，該CAR是包含變體ICOS結構域和CD3 ζ結構域的人類2F5 PSMA-CAR。因此，在例示性實施方式中，本發明的核酸從5’至3’包含：編碼PD1A132L-4-1BB的核酸序列、編碼包含F2A的連接子的核酸序列、和編碼包含變體ICOS結構域和CD3 ζ結構域的人類2F5 PSMA-CAR的核酸序列。在一個實施方式中，從5’至3’包含：編碼PD1A132L-4-1BB的核酸序列、編碼包含F2A的連接子的核酸序列、和編碼包含變體ICOS結構域和CD3 ζ結構域的人類2F5 PSMA-CAR的核酸序列的核酸包含以下列出的核酸序列：
Figure 110107653-A0202-12-0235-1468
Figure 110107653-A0202-12-0236-1469
Figure 110107653-A0202-12-0237-1470
Figure 110107653-A0202-12-0237-1471
(SEQ ID NO：222)。
編碼PD1A132L-4-1BB和包含變體ICOS結構域和CD3 ζ結構域的人類2F5 PSMA-CAR的核酸序列的可容許的改變對本領域技術人員將是已知的。例如，在一些實施方式中，該核酸序列與SEQ ID NO：222中列出的核酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性。在一個實施方式中，編碼PD1A132L-4-1BB和包含變體ICOS結構域和CD3 ζ結構域的人類2F5 PSMA-CAR的核酸序列包含SEQ ID NO：222中列出的核酸序列。
在一些實施方式中，本揭示的核酸從5’至3’包含：編碼 開關受體的核酸序列、編碼包含F2A的連接子的核酸序列、和編碼CAR的核酸序列。在一個實施方式中，開關受體是TIM3-CD28。在一個實施方式中，該CAR是包含ICOS結構域和CD3 ζ結構域的人類2F5 PSMA-CAR。因此，在例示性實施方式中，本發明的核酸從5’至3’包含：編碼TIM3-CD28的核酸序列、編碼包含F2A的連接子的核酸序列、和編碼包含ICOS結構域和CD3 ζ結構域的人類2F5 PSMA-CAR的核酸序列。在一個實施方式中，從5’至3’包含：編碼TIM3-CD28的核酸序列、編碼包含F2A的連接子的核酸序列、和編碼包含ICOS結構域和CD3 ζ結構域的人類2F5 PSMA-CAR的核酸序列的核酸包含以下列出的核酸序列：
Figure 110107653-A0202-12-0238-1472
Figure 110107653-A0202-12-0239-1473
Figure 110107653-A0202-12-0240-1474
Figure 110107653-A0202-12-0240-1475
(SEQ ID NO：223)。
編碼TIM3-CD28和包含ICOS結構域和CD3 ζ結構域的人類2F5 PSMA-CAR的核酸序列的可容許的改變對本領域技術人員將是已知的。例如，在一些實施方式中，該核酸序列與SEQ ID NO：223中列出的核酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性。在一個實施方式中，編碼TIM3-CD28和包含ICOS結構域和CD3 ζ結構域的人類2F5 PSMA-CAR的核酸序列包含SEQ ID NO：223中列出的核酸序列。
在一些實施方式中，本揭示的核酸從5’至3’包含：編碼開關受體的核酸序列、編碼包含F2A的連接子的核酸序列、和編碼CAR的核酸序列。在一個實施方式中，開關受體是TIM3-CD28。在一個實施方式中，該CAR是包含變體ICOS結構域和CD3 ζ結構域的人類2F5 PSMA-CAR。因此，在例示性實施方式中，本發明的核酸從5’至3’包含：編碼TIM3-CD28的核酸序列、編碼包含F2A的連接子的核酸序列、和編碼包含變體ICOS結構域和CD3 ζ結構域的人類2F5 PSMA-CAR的核酸序列。在一個實施方式中，從5’至3’包含：編碼 TIM3-CD28的核酸序列、編碼包含F2A的連接子的核酸序列、和編碼包含變體ICOS結構域和CD3 ζ結構域的人類2F5 PSMA-CAR的核酸序列的核酸包含以下列出的核酸序列：
Figure 110107653-A0202-12-0241-1476
Figure 110107653-A0202-12-0242-1477
Figure 110107653-A0202-12-0243-1478
Figure 110107653-A0202-12-0243-1479
(SEQ ID NO：224)。
編碼TIM3-CD28和包含變體ICOS結構域和CD3 ζ結構域的人類2F5 PSMA-CAR的核酸序列的可容許的改變對本領域技術人員將是已知的。例如，在一些實施方式中，該核酸序列與SEQ ID NO：224中列出的核酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性。在一個實施方式中，編碼TIM3-CD28和包含變體ICOS結構域和CD3 ζ結構域的人類2F5 PSMA-CAR的核酸序列包含SEQ ID NO：224中列出的核酸序列。
在一些實施方式中，本揭示的核酸從5’至3’包含：編碼第一開關受體的核酸序列、編碼包含F2A的第一連接子的核酸序列、編碼第二開關受體的核酸序列、編碼包含F2A的第二連接子的核酸、和編碼CAR的核酸序列。在一個實施方式中，第一開關受體是TIM3-CD28，並且第二開關受體是PD1A132L-4-1BB。在一個實施方式中，第一開關受體是PD1A132L-4-1BB，並且第二開關受體是TIM3-CD28。在一個實施方式中，該CAR是包含ICOS結構域和CD3 ζ結構域的人類2F5 PSMA-CAR。在一個實施方式中，第一連接子和第二連接子是相同的。在一個實施方式中，第一連接子和第二連接子是不同的。因此，在例示性實施方式中，本發明的核酸從5’至3’包含：編碼PD1A132L-4-1BB的核酸序列、編碼包含F2A的第一連接子的核酸序列、編碼TIM3-CD28的核酸序列、編碼包含F2A的第二連接子的核酸序列、和編碼包含ICOS結構域和CD3 ζ結構域的人類2F5 PSMA-CAR的核酸序列。在一個實施方式中，從5’至3’包含：編碼PD1A132L-4-1BB的核酸序列、編碼包含F2A的第一連接子的核酸序列、編碼TIM3-CD28的核 酸序列、編碼包含F2A的第二連接子的核酸、和編碼包含ICOS結構域和CD3 ζ結構域的人類2F5 PSMA-CAR的核酸序列的核酸包含以下列出的核酸序列：
Figure 110107653-A0202-12-0244-1480
Figure 110107653-A0202-12-0245-1481
Figure 110107653-A0202-12-0246-1482
Figure 110107653-A0202-12-0246-1483
(SEQ ID NO：225)。
編碼PD1A132L-4-1BB、TIM3-CD28、和包含ICOS結構域和CD3 ζ結構域的人類2F5 PSMA-CAR的核酸序列的可容許的改變對本領域技術人員將是已知的。例如，在一些實施方式中，該核酸序列與SEQ ID NO：225中列出的核酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、 至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性。在一個實施方式中，編碼PD1A132L-4-1BB、TIM3-CD28、和包含ICOS結構域和CD3 ζ結構域的人類2F5 PSMA-CAR的核酸序列包含SEQ ID NO：225中列出的核酸序列。
在一些實施方式中，本揭示的核酸從5’至3’包含：編碼第一開關受體的核酸序列、編碼包含F2A的第一連接子的核酸序列、編碼第二開關受體的核酸序列、編碼包含F2A的第二連接子的核酸、和編碼CAR的核酸序列。在一個實施方式中，第一開關受體是TIM3-CD28，並且第二開關受體是PD1A132L-4-1BB。在一個實施方式中，第一開關受體是PD1A132L-4-1BB，並且第二開關受體是TIM3-CD28。在一個實施方式中，該CAR是包含變體ICOS結構域和CD3 ζ結構域的人類2F5 PSMA-CAR。在一個實施方式中，第一連接子和第二連接子是相同的。在一個實施方式中，第一連接子和第二連接子是不同的。因此，在例示性實施方式中，本發明的核酸從5’至3’包含：編碼PD1A132L-4-1BB的核酸序列、編碼包含F2A的第一連接子的核酸序列、編碼TIM3-CD28的核酸序列、編碼包含F2A的第二連接子的核酸序列、和編碼包含變體ICOS結構域和CD3 ζ結構域的人類2F5 PSMA-CAR的核酸序列。在一個實施方式中，從5’至3’包含：編碼PD1A132L-4-1BB的核酸序列、編碼包含F2A的第一連接子的核酸序列、編碼TIM3-CD28的核酸序列、編碼包含F2A的第二連接子的核酸、和編碼包含變體ICOS結構域和CD3 ζ結構域的人類2F5 PSMA-CAR的核酸序列的核酸包含以下列出的核酸序列：
Figure 110107653-A0202-12-0247-1484
Figure 110107653-A0202-12-0248-1485
Figure 110107653-A0202-12-0249-1486
Figure 110107653-A0202-12-0250-1487
Figure 110107653-A0202-12-0250-1488
(SEQ ID NO：226)。
編碼PD1A132L-4-1BB、TIM3-CD28、和包含變體ICOS結構域和CD3 ζ結構域的人類2F5 PSMA-CAR的核酸序列的可容許的改變對本領域技術人員將是已知的。例如，在一些實施方式中，該核酸序列與SEQ ID NO：226中列出的核酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性。在一個實施方式中，編碼PD1A132L-4-1BB、TIM3-CD28、和包含變體ICOS結構域和CD3 ζ結構域的人類2F5 PSMA-CAR的核酸序列包含SEQ ID NO：226中列出的核酸序列。
在一些實施方式中，本發明提供了包含編碼如本文所述的顯性負性受體和開關受體的核酸序列的核酸。在一些實施方式中，核酸包含如本文所述的編碼顯性負性受體和開關受體的核酸序列和編碼CAR的核酸序列(例如，PSMA-CAR)。在一個實施方式中，編碼顯性負性受體和開關受體的核酸序列和編碼CAR的核酸序列處於單獨的 核酸上。在一個實施方式中，編碼顯性負性受體和開關受體的核酸序列和編碼CAR的核酸序列處於同一核酸內。在這樣的實施方式中，編碼顯性負性受體和開關受體的核酸序列和編碼CAR的核酸序列由如本文所述的連接子分隔。
本揭示的核酸可包含編碼顯性負性受體的核酸序列、編碼開關受體的核酸序列、和編碼CAR的核酸序列以任意順序的5’至3’取向。本領域技術人員將容易能夠確定編碼顯性負性受體的核酸序列、編碼開關受體的核酸序列、和編碼CAR的核酸序列的最佳5’至3’取向。
在一些實施方式中，本揭示的核酸從5’至3’包含：編碼顯性負性受體的核酸序列、編碼第一連接子的核酸序列、編碼開關受體的核酸序列、編碼第二連接子的核酸、和編碼CAR的核酸序列。
在一個實施方式中，顯性負性受體是TGFβRII-DN(例如，具有SEQ ID NO：115中列出的胺基酸序列)，並且開關受體是PD1-CTM-CD28(例如，具有SEQ ID NO：117中列出的胺基酸序列)。在一個實施方式中，顯性負性受體是TGFβRII-DN(例如，具有SEQ ID NO：115中列出的胺基酸序列)，並且開關受體是PD1-PTM-CD28(例如，具有SEQ ID NO：119中列出的胺基酸序列)。在一個實施方式中，顯性負性受體是TGFβRII-DN(例如，具有SEQ ID NO：115中列出的胺基酸序列)，並且開關受體是PD1A132L-PTM-CD28(例如，具有SEQ ID NO：121中列出的胺基酸序列)。在一個實施方式中，顯性負性受體是TGFβRII-DN(例如，具有SEQ ID NO：115中列出的胺基酸序列)，並且開關受體是PD1-4-1BB(例如，具有SEQ ID NO：213中列出的胺基酸序列)。在一個實施方式中，顯性負性受體是TGFβRII-DN(例如，具有SEQ ID NO：115中列出的胺基酸序列)，並且開關受體是PD1A132L-4-1BB(例如，具有SEQ ID NO：215中列出的胺基酸序列)。在一個實施方式中，顯性負性受體是TGFβRII-DN(例如，具有SEQ ID NO：115中列出的胺基酸序列)，並且開關受體是TGFβR-IL12Rβ1(例如，具有SEQ ID NO：123中列出的胺 基酸序列)。在一個實施方式中，顯性負性受體是TGFβRII-DN(例如，具有SEQ ID NO：115中列出的胺基酸序列)，並且開關受體是TGFβR-IL12Rβ2(例如，具有SEQ ID NO：125中列出的胺基酸序列)。在一個實施方式中，顯性負性受體是TGFβRII-DN(例如，具有SEQ ID NO：115中列出的胺基酸序列)，並且開關受體是TIM3-CD28(例如，具有SEQ ID NO：127中列出的胺基酸序列)。
在例示性實施方式中，本揭示的核酸從5’至3’包含：編碼TGFβRII-DN(例如，具有SEQ ID NO：115中列出的胺基酸序列)的核酸序列、編碼第一連接子的核酸序列、編碼PD1-CTM-CD28(例如，具有SEQ ID NO：117中列出的胺基酸序列)的核酸序列、編碼第二連接子的核酸、和編碼J591鼠PSMA-CAR(例如，具有SEQ ID NO：105中列出的胺基酸序列)的核酸序列。在例示性實施方式中，本揭示的核酸從5’至3’包含：編碼TGFβRII-DN(例如，具有SEQ ID NO：115中列出的胺基酸序列)的核酸序列、編碼第一連接子的核酸、編碼PD1-PTM-CD28(例如，具有SEQ ID NO：119中列出的胺基酸序列)的核酸序列、編碼第二連接子的核酸、和編碼J591鼠PSMA-CAR(例如，具有SEQ ID NO：105中列出的胺基酸序列)的核酸序列。
在例示性實施方式中，本揭示的核酸從5’至3’包含：編碼TGFβRII-DN(例如，具有SEQ ID NO：115中列出的胺基酸序列)的核酸序列、編碼第一連接子的核酸、編碼PD1-CTM-CD28(例如，具有SEQ ID NO：117中列出的胺基酸序列)的核酸序列、編碼第二連接子的核酸、和編碼huJ591 PSMA-CAR(例如，具有SEQ ID NO：245、247、249、251、253、或255中列出的胺基酸序列)的核酸序列。在例示性實施方式中，本揭示的核酸從5’至3’包含：編碼TGFβRII-DN(例如，具有SEQ ID NO：115中列出的胺基酸序列)的核酸序列、編碼第一連接子的核酸、編碼PD1-PTM-CD28(例如，具有SEQ ID NO：119中列出的胺基酸序列)的核酸序列、編碼第二連接子的核酸、 和編碼huJ591 PSMA-CAR(例如，具有SEQ ID NO：245、247、249、251、253、或255中列出的胺基酸序列)的核酸序列。
在例示性實施方式中，本揭示的核酸從5’至3’包含：編碼TGFβRII-DN(例如，具有SEQ ID NO：115中列出的胺基酸序列)的核酸序列、編碼第一連接子的核酸、編碼PD1-CTM-CD28(例如，具有SEQ ID NO：117中列出的胺基酸序列)的核酸序列、編碼第二連接子的核酸、和編碼huJ591 PSMA-CAR(例如，具有SEQ ID NO：245中列出的胺基酸序列)的核酸序列。在例示性實施方式中，本揭示的核酸從5’至3’包含：編碼TGFβRII-DN(例如，具有SEQ ID NO：115中列出的胺基酸序列)的核酸序列、編碼第一連接子的核酸、編碼PD1-PTM-CD28(例如，具有SEQ ID NO：119中列出的胺基酸序列)的核酸序列、編碼第二連接子的核酸、和編碼huJ591 PSMA-CAR(例如，具有SEQ ID NO：247中列出的胺基酸序列)的核酸序列。
在一些實施方式中，本揭示的核酸可以可操作地連接至轉錄控制元件，例如，啟動子和增強子等。合適的啟動子元件和增強子元件對本領域技術人員是已知的。
為了在細菌細胞中表現，合適的啟動子包括但不限於lacI、lacZ、T3、T7、gpt、λP和trc。為了在真核細胞中表現，合適的啟動子包括但不限於輕鏈及/或重鏈免疫球蛋白基因啟動子元件和增強子元件；巨細胞病毒即時早期啟動子；單純皰疹病毒胸腺嘧啶激酶啟動子；早期和晚期SV40啟動子；存在於來自逆轉錄病毒的長末端重複序列的啟動子；小鼠金屬硫蛋白-I啟動子；和各種本領域已知的組織特異性啟動子。合適的可逆啟動子(包括可逆誘導型啟動子)是本領域已知的。這樣的可逆啟動子可從多種生物體分離和源自多種生物體，例如，真核生物和原核生物。對源自第一生物體的可逆啟動子的修飾用於第二生物體(例如，第一原核生物和第二真核生物、第一真核生物和第二原核生物等)是本領域公知的。這樣的可逆啟動子和基於這樣的可逆啟動子的系統還包含其它控制蛋白，包括但不限於醇調控啟動子(例如，醇 脫氫酶I(alcA)基因啟動子、響應於醇反式激活蛋白(A1cR)的啟動子等)、四環素調控啟動子(例如，包括Tet活化子(TetActivators)、TetON、TetOFF等的啟動子系統)、類固醇調控啟動子(例如，大鼠糖皮質激素受體啟動子系統、人類雌性激素受體啟動子系統、類視黃醇啟動子系統、甲狀腺啟動子系統、蛻皮素啟動子系統、米非司酮啟動子系統等)、金屬調控啟動子(例如，金屬硫蛋白啟動子系統等)、發病機理相關調控啟動子(例如，水楊酸調控啟動子、乙烯調控啟動子、苯並噻二唑調控啟動子等)、溫度調控啟動子(例如，熱激誘導型啟動子(例如，HSP-70、HSP-90、大豆熱激啟動子等)、光調控啟動子、合成誘導型啟動子等。
在一些實施方式中，啟動子是CD8細胞特異性啟動子、CD4細胞特異性啟動子、嗜中性粒細胞特異性啟動子、或NK特異性啟動子。例如，可以使用CD4基因啟動子；參見，例如，Salmon等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1993)90：7739；和Marodon等人(2003)Blood 101：3416。作為另一實例，可以使用CD8基因啟動子。可藉由使用NcrI(p46)啟動子實現NK細胞特異性表現；參見，例如，Eckelhart等人Blood(2011)117：1565。
為了在酵母細胞中表現，合適的啟動子是組成型啟動子，如ADH1啟動子、PGK1啟動子、ENO啟動子、PYK1啟動子等；或可調控啟動子，如GAL1啟動子、GAL10啟動子、ADH2啟動子、PHOS啟動子、CUP1啟動子、GALT啟動子、MET25啟動子、MET3啟動子、CYC1啟動子、HIS3啟動子、ADH1啟動子、PGK啟動子、GAPDH啟動子、ADC1啟動子、TRP1啟動子、URA3啟動子、LEU2啟動子、ENO啟動子、TP1啟動子、和AOX1(例如，用於畢赤酵母屬)。對適合的載體和啟動子進行選擇完全是在本領域普通技術人員的水平內的。用於原核宿主細胞的合適的啟動子包括但不限於噬菌體T7 RNA聚合酶啟動子；trp啟動子；lac操縱子啟動子；雜合啟動子，例如，lac/tac雜合啟動子、tac/trc雜合啟動子、trp/lac啟動子、T7/lac啟動子；trc 啟動子；tac啟動子等；araBAD啟動子；體內調控啟動子，如ssaG啟動子或相關啟動子(參見，例如，美國專利公開號20040131637)、pagC啟動子(Pulkkinen和Miller,J.Bacteriol.(1991)173(1)：86-93；Alpuche-Aranda等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1992)89(21)：10079-83)、nirB啟動子(Harborne等人Mol.Micro.(1992)6：2805-2813)等(參見，例如，Dunstan等人，Infect.Immun.(1999)67：5133-5141；McKelvie等人，Vaccine(2004)22：3243-3255；和Chatfield等人，Biotechnol.(1992)10：888-892)；σ70啟動子，例如，共有σ70啟動子(參見，例如，GenBank登錄號AX798980、AX798961、和AX798183)；穩定期啟動子，例如，dps啟動子、spv啟動子等；源自毒力島SPI-2(pathogenicity island SPI-2)的啟動子(參見，例如，WO96/17951)；actA啟動子(參見，例如，Shetron-Rama等人，Infect.Immun.(2002)70：1087-1096)；rpsM啟動子(參見，例如，Valdivia和Falkow Mol.Microbiol.(1996).22：367)；tet啟動子(參見，例如，Hillen,W.和Wissmann,A.(1989)In Saenger,W.和Heinemann,U.(eds),Topics in Molecular and Structural Biology,Protein--Nucleic Acid Interaction.Macmillan,London,UK，第10卷，第143-162頁)；SP6啟動子(參見，例如，Melton等人，Nucl.Acids Res.(1984)12：7035)；等等。用於原核生物(如大腸桿菌)的合適的強啟動子包括但不限於Trc、Tac、T5、T7、和PA。用於細菌宿主細胞的操縱子的非限制性實例包括乳糖啟動子操縱子(當與乳糖接觸時，LacI抑制蛋白改變構象，進而防止Lad抑制蛋白與操縱子結合)、色胺酸啟動子操縱子(當與色胺酸複合時，TrpR抑制蛋白具有結合操縱子的構象；在色胺酸不存在時，TrpR抑制蛋白具有不與操縱子結合的構象)、和tac啟動子操縱子(參見，例如，deBoer等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1983)80：21-25)。
合適的啟動子的其它實例包括即時早期巨細胞病毒(CMV)啟動子序列。該啟動子序列是強組成型啟動子序列，能夠驅動 與其可操作地連接的任意多核苷酸序列的高水平表現。還可以使用其它組成型啟動子序列，包括但不限於猿猴病毒40(SV40)早期啟動子、小鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV)或人類免疫缺陷病毒(HIV)長末端重複序列(LTR)啟動子、MoMuLV啟動子、禽白血病病毒啟動子、愛潑斯坦-巴爾病毒即時早期啟動子、勞斯肉瘤病毒啟動子、EF-1 α啟動子、以及人類基因啟動子，諸如但不限於，肌動蛋白啟動子、my肌球蛋白啟動子、血紅蛋白啟動子、和肌酸激酶啟動子。進一步，本發明不應限於組成型啟動子的使用。誘導型啟動子也被考慮作為本發明的一部分。誘導型啟動子的使用提供了分子開關，該分子開關能夠能夠開啟誘導型啟動子可操作地連接的多核苷酸序列的表現(當期望這種表現時)，或使該表現關閉(當不期望該表現時)。誘導型啟動子的實例包括但不限於金屬硫蛋白(metallothionine)啟動子、糖皮質激素啟動子、孕酮啟動子、和四環素啟動子。
在一些實施方式中，含有合適的啟動子的基因座或構建物或轉基因藉由誘導系統的誘導，是不可逆地開關的。用於誘導不可逆開關的合適的系統是本領域公知的，例如，不可逆開關的誘導可利用Cre-lox介導的重組(參見，例如，Fuhrmann-Benzakein，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2000)28：e99，其公開內容藉由引用併入本文)。本領域已知的重組酶、核酸內切酶、連接酶、重組位點等的任意合適的重組都可用於產生不可逆地開關的啟動子。本文其它部分描述的用於執行位點特異性重組的方法、機理、和要求可用於產生不可逆地開關的啟動子，並且是本領域公知的，參見，例如，Grindley等人Annual Review of Biochemistry(2006)567-605；和Tropp,Molecular Biology(2012)(Jones & Bartlett Publishers,Sudbury,Mass.)(其公開內容藉由引用併入本文)。
在一些實施方式中，本揭示的核酸進一步包含編碼TCR/CAR誘導表現盒的核酸序列。在一個實施方式中，TCR/CAR誘導表現盒用於產生一經TCR/CAR信號傳導就釋放的轉基因多肽產物。 參見，例如，Chmielewski和Abken,Expert Opin.Biol.Ther.(2015)15(8)：1145-1154；和Abken,Immunotherapy(2015)7(5)：535-544。在一些實施方式中，本揭示的核酸進一步包含編碼可操作地連接至T-細胞活化響應啟動子的細胞因子的核酸序列。在一些實施方式中，可操作地連接至T-細胞活化響應啟動子的細胞因子存在於單獨的核酸序列上。在一個實施方式中，細胞因子是IL-12。
本揭示的核酸可存在於表現載體及/或選殖載體內。表現載體可包括可選標記物、複製起始點、和提供載體的複製及/或維護的其它特徵。合適的表現載體包括，例如，質粒、病毒載體等。本領域技術人員已知多種合適的載體和啟動子；很多都可商業獲得以用於產生對象重組構建物。以下載體藉由實例的方式提供並且不應以任何方式解釋為是限制性的：細菌的：pBs、phagescript、PsiX174、pBluescript SK、pBs KS、pNH8a、pNH16a、pNH18a、pNH46a(Stratagene,La Jolla,Calif.,USA)；pTrc99A、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、和pRIT5(Pharmacia,Uppsala,Sweden)。真核生物的：pWLneo、pSV2cat、pOG44、PXR1、pSG(Stratagene)pSVK3、pBPV、pMSG和pSVL(Pharmacia)。
表現載體通常具有靠近啟動子序列的便利的限制性位點，以提供編碼異源蛋白質的核酸序列的插入。在表現宿主中有效的(operative)可選標記物可以存在。合適的表現載體包括但不限於病毒載體(例如基於以下的病毒載體：牛痘病毒；脊髓灰質炎病毒；腺病毒(參見，例如，Li等人，Invest.Opthalmol.Vis.Sci.(1994)35：2543-2549；Borras等人，Gene Ther.(1999)6：515-524；Li和Davidson,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1995)92：7700-7704；Sakamoto等人，H.Gene Ther.(1999)5：1088-1097；WO 94/12649,WO 93/03769；WO 93/19191；WO 94/28938；WO 95/11984和WO 95/00655)；腺相關病毒(參見，例如，Ali等人，Hum.Gene Ther.(1998)9：81-86,Flannery等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1997)94：6916-6921； Bennett等人，Invest.Opthalmol.Vis.Sci.(1997)38：2857-2863；Jomary等人，Gene Ther.(1997)4：683 690,Rolling等人，Hum.Gene Ther.(1999)10：641-648；Ali等人，Hum.Mol.Genet.(1996)5：591-594；Srivastava in WO 93/09239,Samulski等人，J.Vir.(1989)63：3822-3828；Mendelson等人，Virol.(1988)166：154-165；和Flotte等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1993)90：10613-10617)；SV40；單純皰疹病毒；人類免疫缺陷病毒(參見，例如，Miyoshi等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1997)94：10319-23；Takahashi等人，J.Virol.(1999)73：7812-7816)；逆轉錄病毒載體(例如，鼠白血病病毒、脾壞死病毒、和源自以下逆轉錄病毒的載體：如勞斯肉瘤病毒、哈維肉瘤病毒、禽白血病病毒、人類免疫缺陷病毒、骨髓增生肉瘤病毒、和乳腺腫瘤病毒)；等等。
適合使用的其它表現載體是，例如，但不限於慢病毒載體、γ逆轉錄病毒載體、泡沫病毒載體、腺相關病毒載體、腺病毒載體、痘病毒載體、皰疹病毒載體、工程改造的雜合病毒載體、轉座子介導的載體等。病毒載體技術在本領域是公知的，並且例如在Sambrook等人，2012,Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第1-4卷，Cold Spring Harbor Press,NY)和其它病毒學和分子生物學手冊中描述。可用作載體的病毒包括但不限於逆轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、皰疹病毒、和慢病毒。
總體上，合適的載體包含在至少一種生物體中具有功能的複製起始點、啟動子序列、便利的限制性核酸內切酶位點、和一個或多個可選標記物(例如，WO 01/96584；WO 01/29058；和美國專利號6,326,193)。
在一些實施方式中，表現載體(例如，慢病毒載體)可用於將TCR/CAR及/或顯性負性受體及/或開關受體導入到免疫細胞或其前體(例如，T細胞)中。因此，本發明的表現載體(例如，慢病毒載體)可包含編碼TCR/CAR及/或顯性負性受體及/或開關受體的核酸。 在一些實施方式中，表現載體(例如，慢病毒載體)將包含將輔助其中所編碼的TCR/CAR及/或顯性負性受體及/或開關受體的功能表現的其它元件。在一些實施方式中，包含編碼TCR/CAR及/或顯性負性受體及/或開關受體的核酸的表現載體進一步包含哺乳動物啟動子。在一個實施方式中，載體進一步包含延長因子-1-α啟動子(EF-1α啟動子)。EF-1α啟動子的使用可提高下游轉基因(例如，編碼TCR/CAR及/或顯性負性受體及/或開關受體的核酸序列)表現的效率。生理啟動子(例如，EF-1α啟動子)不太可能誘導整合介導的基因毒性，而可能廢除逆轉錄病毒載體轉化幹細胞的能力。適用於載體(例如，慢病毒載體)的其它生理啟動子對本領域技術人員是已知的，並且可併入到本發明的載體中。在一些實施方式中，載體(例如，慢病毒載體)進一步包含可提供可提高滴定度和基因表現的非必需順式作用序列。非必需順式作用序列的一個非限制實例是中心多聚嘌呤區(central polypurine tract)和中心終止序列(cPPT/CTS)，其對高校逆轉錄和核輸入是很重要的。其它非必需順式作用序列對本領域技術人員是已知的，並且可併入到本發明的載體(例如，慢病毒載體)中。在一些實施方式中，載體進一步包含轉錄後調控元件。轉錄後調控元件可提高RNA轉錄、提高轉基因表現和穩定RNA轉錄物。轉錄後調控元件的一個實例是土撥鼠肝炎病毒轉錄後調控元件(WPRE)。因此，在一些實施方式中，本發明的載體進一步包含WPRE序列。各種轉錄後調控元件對本領域技術人員是已知的，並且可併入到本發明的載體(例如，慢病毒載體)中。本發明的載體可進一步包含其它元件，如用於RNA運輸、包裝序列的rev應答元件(RRE)，和5’和3’長末端重複序列(LTR)。術語「長末端重複序列」或「LTR」是指堿基對的位於逆轉錄病毒DNA末端的包含U3、R和U5區域的結構域。LTR總體上提供逆轉錄病毒基因表現(例如，啟動、起始和基因轉錄物的聚腺苷酸化)和病毒複製所需的功能。在一個實施方式中，本發明的載體(例如，慢病毒載體)包括3’U3缺失的LTR。因此，本發明的載體(例如，慢病毒載體)可包含本文所述的元 件的任意組合，以增強轉基因的功能表現的效率。例如，本發明的載體(例如，慢病毒載體)除編碼TCR/CAR及/或顯性負性受體及/或開關受體的核酸外可包括WPRE序列、cPPT序列、RRE序列、5’LTR、3’U3缺失的LTR’。
本發明的載體可以是自失活載體。如本文所用，術語「自失活載體」是指3’LTR增強啟動子區(U3區)已被修飾(例如，藉由缺失或取代)的載體。自失活載體可防止病毒轉錄超出第一輪病毒複製。因此，自失活載體能夠感染，然後僅一次就能整合到宿主基因組(例如，哺乳動物基因組)中，並且無法進一步去除(passed)。因此，自失活載體可大大地降低產生具有複製能力的病毒的風險。
在一些實施方式中，本發明的核酸可以是RNA，例如，體外合成的RNA。用於體外合成RNA的方法是本領域技術人員已知的；可以使用任何已知的方法來合成包含編碼本揭示的TCR/CAR及/或顯性負性受體及/或開關受體的序列的RNA。用於將RNA導入到宿主細胞的方法是本領域已知的。參見，例如，Zhao等人Cancer Res.(2010)15：9053。將包含編碼本揭示的TCR/CAR及/或顯性負性受體及/或開關受體的核苷酸序列的RNA導入到宿主細胞可在體外或離體或者體內實施。例如，可用包含編碼本揭示的TCR/CAR及/或顯性負性受體及/或開關受體的核苷酸序列的RNA將宿主細胞(例如，NK細胞、細胞毒性T淋巴細胞等)體外或離體電穿孔。
為了評估多肽或其部分的表現，待導入細胞的表現載體還可以包含可選標記基因或報告基因，或兩者，以便於從尋求藉由病毒載體轉染或感染的細胞群中鑒定和選擇表現細胞。在一些實施方式中，可選標記物可攜帶在單獨的DNA片段上並在共轉染程序中使用。可選標記物和報告基因的兩側都可以有適當的調控序列，以能夠在宿主細胞中表現。有用的可選標記物非限制性地包括抗生素抗性基因。
報告基因用於鑒定潛在轉染的細胞和用於評價調控序列的功能性。一般來說，報告基因是不存在於受體生物體或組織中或由其 表現的編碼多肽的基因，該多肽的表現藉由某些易於檢測的特性(例如，酶活性)來表現。報告基因的表現在DNA導入受體細胞後的適當時間進行評估。合適的報告基因可非限制性地包括編碼螢光素酶、β-半乳糖苷酶、氯黴素乙醯轉移酶、分泌型鹼性磷酸酶的基因，或綠色螢光蛋白基因(例如，Ui-Tei等人，2000 FEBS Letters 479：79-82)。
F.經修飾的免疫細胞
本發明提供了包含CAR及/或顯性負性受體及/或開關受體的經修飾的免疫細胞或其前體細胞(例如，T細胞)。因此，這種經修飾的細胞具備由在其中表現的CAR所指導的特異性。例如，本發明的包含PSMA-CAR的經修飾的細胞具備對目標細胞上的PSMA的特異性。
在一些實施方式中，本發明的經修飾的細胞包含CAR。在一個實施方式中，本發明的經修飾的細胞包含對目標細胞上的前列腺特異性膜抗原(PSMA)具有親和力的CAR。在一些實施方式中，本發明的經修飾的細胞包含顯性負性受體及/或開關受體。在一個實施方式中，本發明的經修飾的細胞包含能夠減少微環境中負信號轉導分子的作用的顯性負性受體。在一個實施方式中，本發明的經修飾的細胞包含能夠減少微環境中負信號轉導分子的作用，並將經修飾的細胞內負信號轉換成正信號的開關受體。在一些實施方式中，本發明的經修飾的細胞包含CAR和顯性負性受體及/或開關受體。在一個實施方式中，本發明的經修飾的細胞包含對目標細胞上的PSMA具有親和力的CAR，和顯性負性受體及/或開關受體。本發明的包含顯性負性受體及/或開關受體的經修飾的細胞能夠借助其分別的細胞外結構域接合(engage)微環境中的負信號轉導分子(例如，抑制性配體)。在一些實施方式中，本發明的包含顯性負性受體的經修飾的細胞能夠減少微環境中負信號轉導分子的作用，其中顯性負性受體包含與負信號關聯的細胞外結構域。在一些實施方式中，本發明的包含開關受體的經修飾的細胞能夠將微環境中 負信號轉導分子的作用轉換成正信號，其中開關受體包含與負信號關聯的細胞外結構域和與正信號關聯的細胞內結構域。
在例示性實施方式中，本發明的經修飾的細胞包含能夠減少負信號轉導分子的作用的顯性負性受體。在一個實施方式中，本發明的經修飾的細胞包含TGFβRII-DN。
在例示性實施方式中，本發明的經修飾的細胞包含能夠將經修飾的細胞內負信號轉導分子的作用轉換成正(例如，活化)信號的開關受體。在一個實施方式中，本發明的經修飾的細胞包含PD1-CTM-CD28。在一個實施方式中，本發明的經修飾的細胞包含PD1A132L-PTM-CD28。在一個實施方式中，本發明的經修飾的細胞包含TIM3-CD28。
在例示性實施方式中，本發明的經修飾的細胞包含PSMA-CAR和能夠減少負信號轉導分子的作用的顯性負性受體。在一個實施方式中，本發明的經修飾的細胞包含鼠J591 PSMA-CAR和TGFβRII-DN。在一個實施方式中，本發明的經修飾的細胞包含人源化J591 PSMA-CAR和TGFβRII-DN。在一個實施方式中，本發明的經修飾的細胞包含人類1C3 PSMA-CAR和TGFβRII-DN。在一個實施方式中，本發明的經修飾的細胞包含人類2A10 PSMA-CAR和TGFβRII-DN。在一個實施方式中，本發明的經修飾的細胞包含人類2F5 PSMA-CAR和TGFβRII-DN。在一個實施方式中，本發明的經修飾的細胞包含人類2C6 PSMA-CAR和TGFβRII-DN。這種經修飾的細胞(例如，經修飾的T細胞)除了對目標細胞上的PSMA具有親和力外，還能夠減少來自其所處的微環境的抑制性TGF-β信號。
在例示性實施方式中，本發明的經修飾的細胞包含PSMA-CAR和能夠將經修飾的細胞內負信號轉導分子的抑制性作用轉換成正信號的開關受體。在一個實施方式中，本發明的經修飾的細胞包含鼠J591 PSMA-CAR和PD1-CTM-CD28。在一個實施方式中，本發明的經修飾的細胞包含人源化J591 PSMA-CAR(huJ591 PSMA- CAR)和PD1-CTM-CD28。在一個實施方式中，本發明的經修飾的細胞包含人類1C3 PSMA-CAR和PD1-CTM-CD28。在一個實施方式中，本發明的經修飾的細胞包含人類2A10 PSMA-CAR和PD1-CTM-CD28。在一個實施方式中，本發明的經修飾的細胞包含人類2F5 PSMA-CAR和PD1-CTM-CD28。在一個實施方式中，本發明的經修飾的細胞包含人類2C6 PSMA-CAR和PD1-CTM-CD28。在一個實施方式中，本發明的經修飾的細胞包含鼠J591 PSMA-CAR和PD1-PTM-CD28。在一個實施方式中，本發明的經修飾的細胞包含人源化J591 PSMA-CAR(huJ591 PSMA-CAR)和PD1-PTM-CD28。在一個實施方式中，本發明的經修飾的細胞包含人類1C3 PSMA-CAR和PD1-PTM-CD28。在一個實施方式中，本發明的經修飾的細胞包含人類2A10 PSMA-CAR和PD1-PTM-CD28。在一個實施方式中，本發明的經修飾的細胞包含人類2F5 PSMA-CAR和PD1-PTM-CD28。在一個實施方式中，本發明的經修飾的細胞包含人類2C6 PSMA-CAR和PD1-PTM-CD28。在一個實施方式中，本發明的經修飾的細胞包含鼠J591 PSMA-CAR和PD1A132L-PTM-CD28。在一個實施方式中，本發明的經修飾的細胞包含人源化J591 PSMA-CAR(huJ591 PSMA-CAR)和PD1A132L-PTM-CD28。在一個實施方式中，本發明的經修飾的細胞包含人類1C3 PSMA-CAR和PD1A132L-PTM-CD28。在一個實施方式中，本發明的經修飾的細胞包含人類2A10 PSMA-CAR和PD1A132L-PTM-CD28。在一個實施方式中，本發明的經修飾的細胞包含人類2F5 PSMA-CAR和PD1A132L-PTM-CD28。在一個實施方式中，本發明的經修飾的細胞包含人類2C6 PSMA-CAR和PD1A132L-PTM-CD28。在一個實施方式中，本發明的經修飾的細胞包含鼠J591 PSMA-CAR和TIM3-CD28。在一個實施方式中，本發明的經修飾的細胞包含人源化J591 PSMA-CAR(huJ591 PSMA-CAR)和TIM3-CD28。在一個實施方式中，本發明的經修飾的細胞包含人類1C3 PSMA-CAR和TIM3-CD28。在一個實施方式中，本發明的經修飾的細胞包含人類2A10 PSMA-CAR和 TIM3-CD28。在一個實施方式中，本發明的經修飾的細胞包含人類2F5 PSMA-CAR和TIM3-CD28。在一個實施方式中，本發明的經修飾的細胞包含人類2C6 PSMA-CAR和TIM3-CD28。在一個實施方式中，本發明的經修飾的細胞包含鼠J591 PSMA-CAR和PD1-4-1BB。在一個實施方式中，本發明的經修飾的細胞包含人源化J591 PSMA-CAR(huJ591 PSMA-CAR)和PD1-4-1BB。在一個實施方式中，本發明的經修飾的細胞包含人類1C3 PSMA-CAR和PD1-4-1BB。在一個實施方式中，本發明的經修飾的細胞包含人類2A10 PSMA-CAR和PD1-4-1BB。在一個實施方式中，本發明的經修飾的細胞包含人類2F5 PSMA-CAR和PD1-4-1BB。在一個實施方式中，本發明的經修飾的細胞包含人類2C6 PSMA-CAR和PD1-4-1BB。在一個實施方式中，本發明的經修飾的細胞包含鼠J591 PSMA-CAR和PD1A132L-4-1BB。在一個實施方式中，本發明的經修飾的細胞包含人源化J591 PSMA-CAR(huJ591 PSMA-CAR)和PD1A132L-4-1BB。在一個實施方式中，本發明的經修飾的細胞包含人類1C3 PSMA-CAR和PD1A132L-4-1BB。在一個實施方式中，本發明的經修飾的細胞包含人類2A10 PSMA-CAR和PD1A132L-4-1BB。在一個實施方式中，本發明的經修飾的細胞包含人類2F5 PSMA-CAR和PD1A132L-4-1BB。在一個實施方式中，本發明的經修飾的細胞包含人類2C6 PSMA-CAR和PD1A132L-4-1BB。在一個實施方式中，本發明的經修飾的細胞包含鼠J591 PSMA-CAR和TGFβR-IL12Rβ1。在一個實施方式中，本發明的經修飾的細胞包含人源化J591 PSMA-CAR(huJ591 PSMA-CAR)和TGFβR-IL12Rβ1。在一個實施方式中，本發明的經修飾的細胞包含人類1C3 PSMA-CAR和TGFβR-IL12Rβ1。在一個實施方式中，本發明的經修飾的細胞包含人類2A10 PSMA-CAR和TGFβR-IL12Rβ1。在一個實施方式中，本發明的經修飾的細胞包含人類2F5 PSMA-CAR和TGFβR-IL12Rβ1。在一個實施方式中，本發明的經修飾的細胞包含人類2C6 PSMA-CAR和TGFβR-IL12Rβ1。在一個實施方式中，本發明 的經修飾的細胞包含鼠J591 PSMA-CAR和TGFβR-IL12Rβ2。在一個實施方式中，本發明的經修飾的細胞包含人源化J591 PSMA-CAR(huJ591 PSMA-CAR)和TGFβR-IL12Rβ2。在一個實施方式中，本發明的經修飾的細胞包含人類1C3 PSMA-CAR和TGFβR-IL12Rβ2。在一個實施方式中，本發明的經修飾的細胞包含人類2A10 PSMA-CAR和TGFβR-IL12Rβ2。在一個實施方式中，本發明的經修飾的細胞包含人類2F5 PSMA-CAR和TGFβR-IL12Rβ2。在一個實施方式中，本發明的經修飾的細胞包含人類2C6 PSMA-CAR和TGFβR-IL12Rβ2。這種經修飾的細胞(例如，經修飾的T細胞)除了對目標細胞上的PSMA具有親和力外，還能夠將經修飾的細胞內來自微環境的抑制性PD-1或TGFβ信號轉換成正(例如，活化)信號。這種經修飾的細胞(例如，經修飾的T細胞)除了對目標細胞上的PSMA具有親和力外，還能夠將經修飾的細胞內來自微環境的抑制性PD-1或TIM-3信號轉換正(例如，活化)CD28信號。
在例示性實施方式中，本發明的經修飾的細胞包含鼠J591 PSMA-CAR、TGFβRII-DN、和PD1-CTM-CD28。在例示性實施方式中，本發明的經修飾的細胞包含鼠J591 PSMA-CAR、TGFβRII-DN、和PD1-PTM-CD28。
在例示性實施方式中，本發明的經修飾的細胞包含人源化J591 PSMA-CAR(huJ591 PSMA-CAR)、TGFβRII-DN、和PD1-CTM-CD28。在例示性實施方式中，本發明的經修飾的細胞包含人源化J591 PSMA-CAR(huJ591 PSMA-CAR)、TGFβRII-DN、和PD1-PTM-CD28。
在例示性實施方式中，本發明的經修飾的細胞包含核酸編碼雙特異性抗體。在一個實施方式中，這種經修飾的細胞可將雙特異性抗體分泌到經修飾的細胞外。在一個實施方式中，本發明的經修飾的細胞包含編碼雙特異性抗體的核酸，其中雙特異性抗體包含多於一個的抗原結合結構域，其中至少一個抗原結合結構域與負信號轉導分子(例如， 在經修飾的細胞的微環境中發現的負信號轉導分子)結合，並且該至少一個抗原結合結構域結合經修飾的細胞表面上的共刺激分子。在一個實施方式中，本發明的經修飾的細胞包含編碼如本文所述的13G4-1211 PD-L1/CD28雙特異性抗體的核酸。在一個實施方式中，本發明的經修飾的細胞包含編碼如本文所述的10A5-1412 PD-L1/CD28雙特異性抗體的核酸。在一個實施方式中，本發明的經修飾的細胞包含編碼如本文所述的1B12-1412 PD-L1/CD28雙特異性抗體的核酸。在一個實施方式中，本發明的經修飾的細胞包含編碼如本文所述的TGFβR-1-1412 TGFβRII/CD28雙特異性抗體的核酸。在一個實施方式中，本發明的經修飾的細胞包含編碼如本文所述的TGFβR-3-1412 TGFβRII/CD28雙特異性抗體的核酸。
在例示性實施方式中，本發明的經修飾的細胞包含PSMA-CAR、顯性負性受體及/或開關受體，並且可進一步包含編碼雙特異性抗體的核酸。這種經修飾的細胞(例如，經修飾的T細胞)除了對目標細胞上的PSMA具有親和力之外，還能夠減少來自其所處的微環境的抑制性信號，並將雙特異性抗體分泌到其所處的微環境中。在這種細胞中，雙特異性抗體的活性可進一步提高經修飾的細胞(例如，經修飾的T細胞)的活化。在一個實施方式中，本發明的經修飾的細胞包含選自以下的PSMA-CAR：鼠J591 PSMA-CAR、人源化J591 PSMA-CAR(huJ591 PSMA-CAR)、人類1C3 PSMA-CAR、人類2A10 PSMA-CAR、人類2F5 PSMA-CAR、和人類2C6 PSMA-CAR；TGFβRII-DN；並表現和分泌選自以下的雙特異性抗體：13G4-1211 PD-L1/CD28雙特異性抗體、10A5-1412 PD-L1/CD28雙特異性抗體、1B12-1412 PD-L1/CD28雙特異性抗體、TGFβR-1-1412 TGFβRII/CD28雙特異性抗體、和TGFβR-3-1412 TGFβRII/CD28雙特異性抗體。
在例示性實施方式中，本發明的經修飾的細胞包含PSMA-CAR、開關受體，並且可進一步包含編碼雙特異性抗體的核酸。 這種經修飾的細胞(例如，經修飾的T細胞)除了對目標細胞上的PSMA具有親和力之外，還能夠將經修飾的細胞內來自其所處的微環境的抑制性信號轉換成正(例如，活化)信號，並將雙特異性抗體分泌到其所處的微環境中。在這種細胞中，雙特異性抗體可的活性可進一步提高經修飾的細胞(例如，經修飾的T細胞)的活化。在一個實施方式中，本發明的經修飾的細胞包含選自以下的PSMA-CAR：鼠J591 PSMA-CAR、人源化J591 PSMA-CAR(huJ591 PSMA-CAR)、人類1C3 PSMA-CAR、人類2A10 PSMA-CAR、人類2F5 PSMA-CAR、和人類2C6 PSMA-CAR；選自以下的開關受體：PD1-CTM-CD28開關受體、PD1A132L-PTM-CD28開關受體、和TIM3-CD28開關受體；並表現和分泌選自以下的雙特異性抗體：13G4-1211 PD-L1/CD28雙特異性抗體、10A5-1412 PD-L1/CD28雙特異性抗體、1B12-1412 PD-L1/CD28雙特異性抗體、TGFβR-1-1412 TGFβRII/CD28雙特異性抗體、和TGFβR-3-1412 TGFβRII/CD28雙特異性抗體。
設想了包含本發明的PSMA-CAR、本發明的顯性負性受體及/或開關受體，及/或表現和分泌本發明的雙特異性抗體的任何經修飾的細胞，並且在考慮到本文的公開內容的情況下可容易被本領域技術人員理解。
G.產生經修飾的免疫細胞的方法
本發明提供了產生或生成用於腫瘤免疫療法(例如，過繼性免疫療法)的本發明的經修飾的免疫細胞或其前體(例如，T細胞)。這些細胞總體上是藉由將編碼對象CAR的一個或多個核酸、顯性負性受體及/或開關受體、及/或雙特異性抗體、及/或其組合導入來進行工程改造的。
在一些實施方式中，藉由表現載體將編碼對象CAR的一個或多個核酸、顯性負性受體及/或開關受體、及/或雙特異性抗體導入細胞中。本文提供了包含本發明的編碼對象CAR的核酸序列、顯性負 性受體及/或開關受體、及/或雙特異性抗體、及/或其組合的表現載體。合適的表現載體包括慢病毒載體、γ逆轉錄病毒載體、泡沫病毒載體、腺相關病毒(AAV)載體、腺病毒載體、工程改造的雜合病毒、裸DNA，包括但不限於轉座子介導的載體，如睡美人、Piggybak、和整合酶類，如Phi31。一些其它合適的表現載體包括單純皰疹病毒(HSV)表現載體和逆轉錄病毒表現載體。
腺病毒表現載體基於腺病毒，腺病毒整合到基因組DNA的能力低，但轉染宿主細胞的效率高。腺病毒表現載體包含的腺病毒序列足以：(a)支持表現載體的包裝並(b)在宿主細胞中最終表現對象CAR、顯性負性受體及/或開關受體、及/或雙特異性抗體、及/或其組合。在一些實施方式中，腺病毒基因組是36kb的線性雙鏈DNA，其中外來DNA序列(例如，編碼對象CAR、顯性負性受體及/或開關受體、及/或雙特異性抗體、及/或其組合的核酸)可進行插入，以取代腺病毒DNA的大片段，從而製成本發明的表現載體(參見，例如，Danthinne和Imperiale,Gene Therapy(2000)7(20)：1707-1714)。
另一表現載體基於腺相關病毒，腺相關病毒利用腺病毒偶聯的系統。該AAV表現載體整合到宿主基因組的頻率高。其可感染非分裂細胞，從而使其用於例如在組織培養物中或體內將基因遞送到哺乳動物細胞中。AAV載體對寬泛的宿主範圍具有感染性。有關AAV載體的生成和使用的細節在美國專利號5,139,941和4,797,368中描述。
逆轉錄病毒表現載體能夠整合到宿主基因組中，從而遞送大量的外來基因物質、感染廣譜的物種和細胞類型、並被包裝到特殊的細胞系中。逆轉錄病毒載體藉由將核酸(例如，編碼對象CAR、顯性負性受體及/或開關受體、及/或雙特異性抗體、及/或其組合的核酸)插入到病毒基因組中的某些位置從而產生複製缺陷的病毒來構建。儘管逆轉錄病毒載體能夠感染多種細胞類型，但是對象CAR、顯性負性受體及/或開關受體、及/或雙特異性抗體、及/或其組合的整合與穩定表現要求宿主細胞的分裂。
慢病毒載體源自慢病毒，慢病毒是複合體逆轉錄病毒，除了常見的逆轉錄病毒基因gag、pol、和env之外，慢病毒載體還包含具有調控和結構功能的其它基因(參見，例如，美國專利號6,013,516和5,994,136)。慢病毒的一些實例包括人類免疫缺陷病毒(HIV-1、HIV-2)和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。慢病毒載體是藉由多次消減HIV毒力基因而產生的，例如，使基因env、vif、vpr、vpu和nef缺失，從而使得該載體在生物學上是安全的。慢病毒載體能夠感染非分裂細胞並且可用於例如編碼對象CAR、顯性負性受體及/或開關受體、及/或雙特異性抗體、及/或其組合的核酸的體內和離體基因轉移和表現(參見，例如，美國專利號5,994,136)。
包括本發明的核酸的表現載體可藉由本領域技術人員已知的任何手段導入到宿主細胞中。如果需要，表現載體可包括用於轉染的病毒序列。可選地，表現載體可藉由融合、電穿孔、生物射彈、轉染、脂質轉染等導入。在導入表現載體之前，宿主細胞可在培養物中生長和擴大，之後對載體的導入和整合進行適當處理。宿主細胞然後被擴大並且可借助載體中存在的標記物來篩選。本領域已知可以使用的各種標記物，並且可以包括hprt、新黴素抗性、胸腺嘧啶激酶、潮黴素抗性等。如本文所用，術語「細胞」、「細胞系」和「細胞培養」可以互換使用。在一些實施方式中，宿主細胞是免疫細胞或其前體，例如T細胞、NK細胞、或NKT細胞。
本發明還提供了基因工程改造的細胞，其包括並且穩定表現本揭示的對象CAR、顯性負性受體及/或開關受體、及/或雙特異性抗體、及/或其組合。在一些實施方式中，基因工程改造的細胞是能夠引起治療相關的成果的基因工程改造的T-淋巴細胞(T細胞)、幼稚T細胞(TN)、記憶T細胞(例如，中樞記憶T細胞(TCM)、效應記憶細胞(TEM))、自然殺傷細胞(NK細胞)、和巨噬細胞。在一個實施方式中，基因工程改造的細胞是自體細胞。
經修飾的細胞(例如，包含對象CAR、顯性負性受體及/ 或開關受體、及/或表現和分泌雙特異性抗體、及/或其組合)可藉由用包括本揭示的核酸的表現載體穩定轉染宿主細胞產生。產生本揭示的經修飾的細胞的其它方法非限制性地包括化學轉變方法(例如，使用磷酸鈣、樹枝狀大分子、脂質體及/或陽離子聚合物)、非化學轉變方法(例如，電穿孔、光學轉變、基因電轉移及/或流體動力學遞送)及/或基於粒子的方法(例如，穿刺轉染(impalefection)、使用基因槍及/或磁性轉染(magnetofection))。表現本揭示的對象CAR、顯性負性受體及/或開關受體、及/或雙特異性抗體、及/或其組合的轉染後的細胞可離體擴大。
將表現載體導入宿主細胞的物理方法包括磷酸鈣沉澱、脂質體轉染、粒子轟擊、顯微注射、電穿孔等。用於產生包括載體及/或外源核酸的細胞的方法在本領域是公知的。參見，例如，Sambrook等人(2001),Molecular Cloning：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York。將表現載體導入宿主細胞的化學方法包括膠體分散系統，如大分子複合物、納米膠囊、微球、珠子、和基於脂質的系統，包括水包油乳液、膠束、混合膠束、和脂質體。
適合使用的脂質可從商業來源獲得。例如，可以從Sigma,St.Louis,MO獲得二肉豆蔻醯磷脂醯膽鹼(「DMPC」)；雙十六烷基磷酸(dicetyl phosphate)(「DCP」)可從K & K Laboratories(PlannView,NY)獲得；膽固醇(「Choi」)可從Calbiochem-Behring獲得；二肉豆蔻醯磷脂醯甘油(「DMPG」)和其它脂質可從Avanti Polar Lipids,Inc.(Birmingham,AL)獲得。氯仿或氯仿/甲醇中的脂質儲備溶液可儲存在-20℃左右。氯仿可作為唯一溶劑，因為它比甲醇更容易蒸發。「脂質體」是上位術語，其涵蓋由封閉的脂質雙層或聚集物的生成所形成的多種單一和多層的脂質載體。脂質體的特徵可在於具有囊泡結構，該囊泡結構具有磷脂雙層膜和內部水性介質。多層膜脂質體具有由水性介質分開的多個脂質層。當磷脂懸浮在過量的水溶液中時，它們會自發形成。脂質組分在形成封閉結構之前經歷自重排，並在 脂質雙層之間截留水和溶解的溶質(Ghosh等人，1991 Glycobiology 5：505-10)。還涵蓋在溶液中結構不同於正常囊泡結構的組合物。例如，脂質可以呈膠束結構，或者僅僅作為脂質分子的非均勻聚集物而存在。也考慮了lipofectamine-核酸複合物。
無論用於將外源核酸導入宿主細胞或以其它方式將細胞暴露於本發明的抑制劑的方法如何，為了確認宿主細胞中存在核酸，可以執行各種測定。此類測定包括，例如，本領域技術人員公知的分子生物學測定，如索瑟恩和諾澤恩印跡、RT-PCR和PCR；生物化學測定，諸如，例如藉由免疫手段(ELISA和西部吸印技術)或藉由落入本發明範圍的本文所述的用於鑒別試劑的測定來檢測特定肽的存在或不存在。
在一個實施方式中，導入到宿主細胞中的核酸是RNA。在另一實施方式中，RNA是包含體外轉錄的RNA或合成RNA的mRNA。RNA可利用聚合酶鏈式反應(PCR)產生的模板，藉由體外轉錄產生。來自任意來源的感興趣的DNA都可藉由PCR直接轉換成模板，以供使用適當的引子和RNA聚合酶體外合成mRNA。DNA的來源可以是，例如，基因組DNA、質粒DNA、噬菌體DNA、cDNA、合成DNA序列或任意其它適當的DNA來源。
PCR可用於產生mRNA體外轉錄的模板，然後將其導入細胞中。執行PCR的方法在本領域是公知的。用於PCR的引子被設計成具有與用作PCR模板的DNA區域基本上互補的區域。如本文所用，「基本上互補的」是指引子序列中的大多數或所有堿基互補的核苷酸序列。基本上互補的序列能夠在用於PCR的退火條件下與預期DNA模板退火或雜交。引子可被設計成與DNA模板的任何部分基本上互補。例如，可以設計引子來擴增基因的通常在細胞中轉錄的部分(開放閱讀框)，包括5' UTR和3' UTR。引子還可被設計用於擴增基因的編碼特定的感興趣結構域的部分。在一個實施方式中，引子被設計成擴增人類cDNA的編碼區，包括5'UTR和3'UTR的全部或部分。用於PCR的引子藉由本領域公知的合成方法產生。「正向引子」是指含有核苷酸區 域的引子，該核苷酸與待擴增DNA序列上游的DNA模板上的核苷酸基本上互補。「上游」在本文中用於指代相對於編碼鏈擴增的DNA序列的5'位。「反向引子」是指含有核苷酸區域的引子，該核苷酸與待擴增DNA序列下游的雙鏈DNA模板基本上互補。「下游」在本文中用於指代相對於編碼鏈擴增的DNA序列的3'位。
也可以使用能夠促進RNA的穩定性及/或翻譯效率的化學結構。該RNA優選具有5' UTR和3' UTR。在一個實施方式中，5' UTR的長度在0和3000個核苷酸之間。添加到編碼區的5' UTR序列和3' UTR序列的長度可以藉由不同的方法改變，包括但不限於設計對UTR的不同區域退火的PCR引子。使用該方法，本領域普通技術人員可以修改在經轉錄的RNA轉染之後實現最佳翻譯效率所需的5' UTR和3' UTR長度。
5' UTR和3' UTR可以是感興趣的基因的天然存在的內源性5' UTR和3' UTR。可選地，可以藉由將對感興趣的基因而言是非內源性的UTR序列併入正向引子和反向引子中或藉由模板的任意其它修改來添加這些UTR序列。對感興趣的基因而言是非內源性的UTR序列的使用可用於改變RNA的穩定性及/或翻譯效率。例如，已知3' UTR序列中富含AU的元件會降低mRNA的穩定性。因此，可以基於本領域公知的UTR的特性來選擇或設計3' UTR以提高經轉錄的RNA的穩定性。
在一個實施方式中，5' UTR可包含內源基因的Kozak序列。可選地，當如上所述藉由PCR添加對感興趣的基因而言是非內源性的5' UTR時，可以藉由添加該5' UTR序列來重新設計共有Kozak序列。Kozak序列可以提高一些RNA轉錄物的翻譯效率，但並不是所有RNA都需要Kozak序列才能實現高效翻譯。許多mRNA對Kozak序列的要求是本領域已知的。在其它實施方式中，5' UTR可源自這樣的RNA病毒：其RNA基因組在細胞中是穩定的。在其它實施方式中，可在3' UTR或5' UTR中使用各種核苷酸類似物以阻止mRNA的核酸 外切酶降解。
為了能夠從DNA模板合成RNA而不需要基因選殖，轉錄啟動子應附著在待轉錄的序列上游的DNA模板上。在充當RNA聚合酶啟動子的序列被添加到正向引子的5'端時，RNA聚合酶啟動子被併入到待轉錄的開放閱讀框上游的PCR產物中。在一個實施方式中，如本文其它部分所述，啟動子是T7聚合酶啟動子。其它有用的啟動子包括但不限於T3和SP6 RNA聚合酶啟動子。本領域已知T7、T3和SP6啟動子的共有核苷酸序列。
在一個實施方式中，mRNA在5'端有一個帽子和一個3'多聚(A)尾，其決定核糖體結合、翻譯的起始和mRNA在細胞中的穩定性。在環狀DNA模板(例如，質粒DNA)上，RNA聚合酶產生不適合在真核細胞中表現的長的多聯體產物。在3' UTR端線性化的質粒DNA的轉錄產生正常大小的mRNA，其即使在轉錄後經過聚腺苷酸化，在真核轉染中也是沒有作用的。
在線性DNA模板上，噬菌體T7 RNA聚合酶可以將轉錄物的3'端延伸到模板的最後一個堿基之外(Schenborn和Mierendorf,Nuc Acids Res.,13：6223-36(1985)；Nacheva和Berzal-Herranz,Eur.J.Biochem.,270：1485-65(2003)。
轉錄DNA模板的多聚A/T片段可在PCR期間藉由使用包含多聚T尾(如100T尾(大小可為50-5000T))的反向引子產生，或在PCR之後藉由任意其它方法(包括但不限於DNA連接或體外重組)產生。多聚(A)尾也提供RNA的穩定性並減少其降解。一般來說，多聚(A)尾的長度與經轉錄的RNA的穩定性呈正相關。在一個實施方式中，多聚(A)尾在100和5000個腺苷之間。
利用多聚(A)聚合酶，如大腸桿菌多聚A聚合酶(E-PAP)，在體外轉錄後，RNA的多聚(A)尾可以進一步延伸。在一個實施方式中，將多聚(A)尾的長度從100個核苷酸增加到300和400個核苷酸之間導致RNA的翻譯效率提高約兩倍。另外，不同化學基團在3'端的附著可 以提高mRNA的穩定性。這種附著可以包含經修飾的/人工的核苷酸、適體和其它化合物。例如，可以使用多聚(A)聚合酶將ATP類似物併入多聚(A)尾中。ATP類似物可以進一步提高RNA的穩定性。
5'帽子也為RNA分子提供穩定性。在優選實施方式中，藉由本文公開的方法產生的RNA包括5'帽子。利用本領域已知並在本文中描述的技術提供5'帽子(Cougot，等人，Trends in Biochem.Sci.,29：436-444(2001)；Stepinski，等人，RNA,7：1468-95(2001)；Elango，等人，Biochim.Biophys.Res.Commun.,330：958-966(2005))。
在一些實施方式中，諸如以體外轉錄的RNA的形式將RNA電穿孔到細胞中。可包括適合細胞電穿孔的任何溶質--其可含有促進細胞通透性和活力的因子，如糖、肽、脂質、蛋白質、抗氧化劑、和表面活性劑。
在一些實施方式中，編碼本揭示的對象CAR、顯性負性受體及/或開關受體、及/或雙特異性抗體、及/或其組合的核酸將是RNA，例如，體外合成的RNA。用於體外合成RNA的方法是本領域已知的；可以使用任何已知的方法來合成包含編碼對象CAR、顯性負性受體及/或開關受體、及/或雙特異性抗體、及/或其組合的序列的RNA。用於將RNA導入宿主細胞的方法是本領域已知的。參見，例如，Zhao等人Cancer Res.(2010)15：9053。將包含編碼對象CAR、顯性負性受體及/或開關受體、及/或雙特異性抗體、及/或其組合的核苷酸序列的RNA導入宿主細胞可在體外或離體或者在體內實施。例如，可用包含編碼對象CAR、顯性負性受體及/或開關受體、及/或雙特異性抗體、及/或其組合的核苷酸序列的RNA，在體外或離體對宿主細胞(例如，NK細胞、細胞毒性T淋巴細胞等)電穿孔。
所公開的方法可應用於在癌症、幹細胞、急慢性感染、和自身免疫疾病領域中對基礎研究和治療中的T細胞活性進行調節，包括評估轉基因T細胞殺死目標癌細胞的能力。
該方法還提供了藉由改變例如啟動子或輸入RNA的量，在寬範圍內控制表現水平的能力，從而使單獨調控表現水平成為可能。此外，基於PCR的mRNA產生技術大大促進了具有不同結構及其結構域組合的mRNA的設計。
本發明的RNA轉染方法的一個優點是RNA轉染基本上是瞬時的並且是無載體的。RNA轉基因可被遞送到淋巴細胞中並在短暫的(brief)體外細胞活化後在其中表現--作為最小表現盒而不需要任何其它的病毒序列。在這些條件下，轉基因整合到宿主細胞基因組是不可能的。由於RNA的轉染效率以及能夠均一地修飾整個淋巴細胞群，因此不需要對細胞選殖。
用體外轉錄的RNA(IVT-RNA)對T細胞進行基因修飾，採用了兩種不同的策略，這兩種策略都已在各種動物模型上進行了測試。藉由脂質體轉染或電穿孔，用體外轉錄的RNA轉染細胞。為了實現所轉移的IVT-RNA的長時間表現，期望使用各種修飾來穩定IVT-RNA。
一些IVT載體在文獻中是已知的，它們以標準化的方式被用作體外轉錄的模板，並且以產生穩定RNA轉錄物的方式被基因修飾。本領域中目前使用的方案基於具有以下結構的質粒載體：實現RNA轉錄的5' RNA聚合酶啟動子，之後是在3'及/或5'側有非翻譯區(UTR)的感興趣的基因，以及含有50-70個A核苷酸的3'聚腺苷盒。在體外轉錄之前，環狀質粒在聚腺苷盒下游被II型限制酶線性化(識別序列對應於切割位點)。因此，聚腺苷盒對應於轉錄物中後來的多聚(A)序列。該程序導致一些核苷酸在線性化後仍然作為酶切位點的部分，並延伸或掩蓋3'端的多聚(A)序列。尚不清楚這種非生理性的突出端是否會影響在細胞內由這種構建物產生的蛋白質的量。
另一方面，藉由電穿孔將RNA構建物遞送到細胞中。例如，參見US 2004/0014645、US 2005/0052630A1、US 2005/0070841A1、US 2004/0059285A1、US 2004/0092907A1中教 導的將核酸構建物電穿孔到哺乳動物細胞中的製劑和方法。任何已知細胞類型的電穿孔所需的各種參數(包括電場強度)在相關研究文獻以及該領域的眾多專利和申請中是普遍知曉的。參見美國專利號6,678,556、美國專利號7,171,264、和美國專利號7,173,116。用於電穿孔的治療性應用的設備可商業獲得，例如MedPulserTM DNA Electroporation Therapy System(Inovio/Genetronics,San Diego,Calif.)，並在諸如美國專利號6,567,694；美國專利號6,516,223、美國專利號5,993,434、美國專利號6,181,964、美國專利號6,241,701、和美國專利號6,233,482的專利中描述；電穿孔也可用於體外對細胞轉染，如US20070128708A1中所述。電穿孔也可用於在體外將核酸傳遞到細胞中。因此，利用本領域技術人員已知的多種可獲得的裝置和電穿孔系統中的任意種進行的電穿孔介導的將核酸(包括表現構建物)給予細胞，展示了用於將感興趣的RNA遞送到目標細胞的令人興奮的新手段。
在一些實施方式中，可在導入編碼對象CAR、顯性負性受體及/或開關受體、及/或雙特異性抗體、及/或其組合的核酸分子之前、期間及/或之後孵育或培養免疫細胞(例如T細胞)。在一些實施方式中，可在導入編碼對象CAR、顯性負性受體及/或開關受體、及/或雙特異性抗體、及/或其組合的核酸分子之前、期間及/或之後孵育或培養細胞(例如T細胞)，如在轉導具有編碼對象CAR、顯性負性受體及/或開關受體、及/或雙特異性抗體、及/或其組合的表現載體(例如慢病毒載體)的細胞之前、期間及/或之後。在一些實施方式中，該方法包括在導入編碼對象CAR、顯性負性受體及/或開關受體、及/或雙特異性抗體、及/或其組合的核酸分子之前，用刺激劑或活化劑(例如抗CD3/抗CD28抗體)活化或刺激細胞。
在一些實施方式中，在編碼本發明的對象CAR、顯性負性受體及/或開關受體、及/或雙特異性抗體、及/或其組合的核酸序列位於一個或多個單獨核酸序列上的情況下，導入一個或多個核酸序列中的每一個的順序可以變化。例如，編碼對象CAR和顯性負性受體及/或開 關受體的核酸序列可先導入到宿主細胞中，之後導入編碼對象雙特異性抗體的核酸序列。例如，編碼對象雙特異性抗體的核酸序列可先導入到宿主細胞中，之後導入編碼對象CAR和顯性負性受體及/或開關受體的核酸序列。在一些實施方式中，一個或多個核酸序列中的每一個可同時導入宿主細胞中。本領域技術人員將能夠確定將一個或多個核酸序列中的每一個導入宿主細胞中的順序。
H.免疫細胞的來源
在擴大之前，從對象獲得免疫細胞的來源以供離體操縱。供離體操縱的目標細胞的來源還可包括，例如，自體或異源供體血液、臍帶血、或骨髓。例如，免疫細胞的來源可來自待用本發明的經修飾的免疫細胞處理的對象，例如，對象的血液、對象的臍帶血、或對象的骨髓。對象的非限制性實例包括人類、狗、貓、小鼠、大鼠、及其轉基因種屬。優選地，對象是人類。
免疫細胞可從多種來源獲得，包括血液、周邊血單核細胞、骨髓、淋巴結組織、脾組織、臍帶、淋巴、或淋巴器官。免疫細胞是免疫系統的細胞，如先天性免疫或適應性免疫的細胞，例如，髓樣細胞或淋巴樣細胞，包括淋巴細胞，一般是T細胞及/或NK細胞。其它例示性細胞包括幹細胞，如多能幹細胞和多潛能幹細胞，包括誘導多潛能幹細胞(iPSC)。在某些方面中，這些細胞是人類細胞。對於待治療的對象，這些細胞可以是同種異體及/或自體的。這些細胞一般是原代細胞，諸如那些從對象直接分離及/或從對象分離並冷凍的細胞。
在某些實施方式中，免疫細胞是T細胞，例如，CD8+ T細胞(例如，CD8+幼稚T細胞、中樞記憶T細胞、或效應記憶T細胞)、CD4+ T細胞、自然殺傷T細胞(NKT細胞)、調節T細胞(Treg)、幹細胞記憶T細胞、淋巴祖細胞、造血幹細胞、自然殺傷細胞(NK細胞)或樹枝狀細胞。在一些實施方式中，細胞是單核細胞或粒細胞，例如，髓樣細胞、巨噬細胞、嗜中性粒細胞、樹枝狀細胞、肥大細胞、嗜 酸性粒細胞、及/或嗜鹼性粒細胞。在一個實施方式中，目標細胞是誘導多潛能幹(iPS)細胞或源自iPS細胞的細胞，例如，從對象產生的iPS細胞，經操縱以改變(例如，誘導一個或多個目標基因的突變)或操縱一個或多個目標基因的表現，並分化成例如T細胞，例如CD8+ T細胞(例如，CD8+幼稚T細胞、中樞記憶T細胞、或效應記憶T細胞)、CD4+ T細胞、幹細胞記憶T細胞、淋巴祖細胞或造血幹細胞。
在一些實施方式中，細胞包括一個或多個T細胞亞群或其它細胞類型，如整個T細胞群、CD4+細胞、CD8+細胞、及其亞群，如由功能、活化狀態、成熟度、分化潛能、擴大、再循環、定位、及/或持久能力、抗原特異性、抗原受體類型、在特定器官或隔室中的存在、標記物或細胞因子分泌分佈(profile)、及/或分化程度所定義的那些。在T細胞及/或CD4+ T細胞及/或CD8+ T細胞的亞型和亞群中的是幼稚T(TN)細胞、效應T細胞(TEFF)、記憶T細胞及其亞型，如幹細胞記憶T細胞(TSCM)、中樞記憶T細胞(TCM)、效應記憶T(TEM)、或終末分化效應記憶T細胞、腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)、未成熟T細胞、成熟T細胞、輔助性T細胞、細胞毒性T細胞、粘膜相關恒定T(MAIT)細胞、天然存在的和適應性調節T(Treg)細胞、輔助性T細胞，如TH1細胞、TH2細胞、TH3細胞、TH17細胞、TH9細胞、TH22細胞、濾泡輔助性T細胞、α/β T細胞、和δ/γ T細胞。在某些實施方式中，可以使用本領域中可獲得的任意數量的T細胞系。
在一些實施方式中，方法包括從對象分離免疫細胞，對其製備、處理、培養、及/或工程改造。在一些實施方式中，工程改造的細胞的製備包括一個或多個培養及/或製備步驟。所述用於工程改造的細胞可從樣品(如生物樣品，例如，獲自或源自對象的生物樣品)中分離。在一些實施方式中，從中分離細胞的對象是患有疾病或狀況或需要細胞療法或將要對其給予細胞療法的對象。在一些實施方式中，對象是需要特定治療干預(諸如細胞進行分離、處理、及/或工程改造的過繼性細胞療法)的人類。因此，一些實施方式中的細胞是原代細胞，例如，原代 人類細胞。樣品包括組織、流體、和直接取自對象的其它樣品，以及得自一個或多個處理步驟，如分離、離心、基因工程改造(例如用病毒載體轉導)、洗滌、及/或孵育的樣品。生物樣品可以是直接從生物來源獲得的樣品，或者是經過處理的樣品。生物樣品包括但不限於體液，如血液、血漿、血清、腦脊液、滑液、尿液和汗液、組織和器官樣品，包括源自其中的經處理的樣品。
在一些方面中，細胞所源自或分離的樣品是血液樣品或源自血液的樣品，或是單採血液成分術產物或白細胞提取法產物，或者源自單採血液成分術產物或白細胞提取法產物。例示性樣品包括全血、周邊血單核細胞(PBMC)、白細胞、骨髓、胸腺、組織活檢、腫瘤、白血病、淋巴瘤、淋巴結、腸相關淋巴組織、粘膜相關淋巴組織、脾、其它淋巴組織、肝、肺、胃、腸、結腸、腎、胰腺、乳腺、骨、前列腺、子宮頸、睾丸、卵巢、扁桃體、或其它器官、及/或源自其的細胞。在細胞療法(例如，過繼性細胞療法)的背景下，樣品包括來自自體來源和同種異體來源的樣品。
在一些實施方式中，細胞源自細胞系，例如T細胞系。一些實施方式中的細胞來自異種來源，例如來自小鼠、大鼠、非人類靈長類動物、和豬。在一些實施方式中，細胞的分離包括一個或多個製備步驟及/或基於非親和力的細胞分離步驟。在一些實例中，細胞在一種或多種試劑的存在下被洗滌、離心、及/或孵育，從而例如去除不需要的組分、富集所期望的組分、裂解或去除對特定試劑敏感的細胞。在一些實例中，基於一種或多種特性(如密度、粘附特性、大小、敏感性及/或對特定組分的抗性)分離細胞。
在一些實例中，例如藉由單採血液成分術或白細胞提取法從對象的循環血液中獲得細胞。在一些方面中，樣品含有淋巴細胞，淋巴細胞包括T細胞、單核細胞、粒細胞、B細胞、其它有核白細胞、紅細胞、及/或血小板，並且在一些方面中包含除紅細胞和血小板之外的細胞。在一些實施方式中，洗滌從對象收集的血細胞，從而例如去除血漿 部分並將細胞置於適當的緩衝液或介質中以用於後續處理步驟。在一些實施方式中，用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)洗滌細胞。在一些方面中，根據製造商的說明書，藉由切向流過濾(TFF)來完成洗滌步驟。在一些實施方式中，細胞在洗滌後重懸於多種生物相容性緩衝液中。在某些實施方式中，去除血細胞樣品的組分並且將細胞直接重懸於培養基中。在一些實施方式中，方法包括基於密度的細胞分離方法，諸如藉由裂解紅細胞並藉由Percoll或Ficoll梯度離心從周邊血製備白細胞。
在一個實施方式中，藉由單採血液成分術或白細胞提取法獲得來自個體的循環血液的免疫細胞。單採血液成分術產物通常含有淋巴細胞，包括T細胞、單核細胞、粒細胞、B細胞、其它有核白細胞、紅細胞、和血小板。可洗滌藉由單採血液成分術收集的細胞以去除血漿部分並將細胞置於適當的緩衝液或介質中，如磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)，或洗滌溶液缺乏鈣並且可能缺乏鎂或可能缺乏許多(甚至所有的)二價陽離子以用於後續處理步驟。洗滌後，細胞可重懸於多種生物相容性緩衝液中，諸如，例如無鈣無鎂的PBS。可選地，可以去除單採血液成分術樣品的不期望的組分，並將細胞直接重懸於培養基中。
在一些實施方式中，分離方法包括基於一種或多種特異性分子，如表面標記物(例如，表面蛋白)、細胞內標記物、或核酸在細胞中的表現或存在來分離不同的細胞類型。在一些實施方式中，可以使用基於這些標記物的任意已知的分離方法。在一些實施方式中，分離是基於親和力或免疫親和力的分離。例如，在一些方面中，分離包括基於細胞的表現或一種或多種標記物(通常是細胞表面標記物)的表現水平對細胞和細胞群進行的分離，例如，藉由與特異性地結合到這種標記物的抗體或結合伴侶孵育，之後大體上是洗滌步驟和將結合了抗體或結合伴侶的細胞與未結合該抗體或結合伴侶的細胞分離。
這種分離步驟可以基於陽性選擇，其中保留已結合試劑的細胞以供進一步使用；及/或基於陰性選擇，其中保留未結合抗體或結合伴侶的細胞。在一些實例中，這兩部分都被保留以供進一步使用。在一 些方面中，陰性選擇在沒有可用於在異種群體中特異性地識別細胞類型的抗體的情況下會特別有用，使得基於由除了所期望的群體之外的細胞所表現的標記物進行分離是最佳的。分離無需導致特定細胞群或表現特定標記物的細胞的100%富集或去除。例如，對特定類型的細胞(諸如表現標記物的細胞)的陽性選擇或富集是指增加此類細胞的數量或百分比，但不必導致不表現該標記物的細胞的完全缺失。同樣地，特定類型細胞(諸如表現標記物的細胞)的陰性選擇、去除、或耗竭是指減少此類細胞的數量或百分比，但不必導致完全去除所有此類細胞。
在一些實例中，進行多輪分離步驟，其中從一個步驟經陽性選擇或陰性選擇的部分經歷另一分離步驟，諸如後續的陽性選擇或陰性選擇。在一些實例中，單個分離步驟可同時耗竭表現多個標記物的細胞，諸如藉由將細胞與多個抗體或結合伴侶孵育，每個抗體或結合伴侶都對陰性選擇所靶向的標記物具有特異性。同樣地，藉由將細胞與在各種細胞類型上表現的多個抗體或結合伴侶孵育，可以同時陽性選擇出多種細胞類型。
在一些實施方式中，針對對一個或多個特定標記物(如表面標記物)呈陽性(標記物+)或表現高水平(標記物高)的一個或多個特定標記物的細胞來富集T細胞群中的一個或多個或使其從上述細胞中耗竭，或針對對一個或多個標記物呈陰性(標記物-)或表現低水平(標記物低)的一個或多個標記物的細胞來富集T細胞群中的一個或多個或使其從上述細胞中耗竭。例如，在一些方面中，藉由陽性選擇技術或陰性選擇技術分離T細胞的特異性亞群，諸如呈陽性的或表現高水平的一個或多個表面標記物的細胞，例如CD28+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD127+、CD4+、CD8+、CD45RA+、及/或CD45RO+ T細胞。在一些情況下，此類標記物是在某些T細胞群(如非記憶細胞)上缺失或以相對較低水平表現，但在某些其它T細胞群(如記憶細胞)上存在或以相對較高水平表現的標記物。在一個實施方式中，針對呈陽性的或表現高表面水平CD45RO、CCR7、CD28、CD27、CD44、CD127、及/或 CD62L的細胞來富集(即，陽性選擇)細胞(如CD8+細胞或T細胞，例如，CD3+細胞)及/或使其從呈陽性的或表現高表面水平CD45RA的細胞中耗竭(例如，陰性選擇)。在一些實施方式中，針對呈陽性的或表現高表面水平CD122、CD95、CD25、CD27、及/或IL7-Ra(CD127)的細胞來富集細胞或使其從上述細胞中耗竭。在一些實例中，針對對CD45RO呈陽性(或對CD45RA呈陰性)且對CD62L呈陽性的細胞來富集CD8+ T細胞。例如，可以使用CD3/CD28共軛磁珠(例如，DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T Cell Expander)陽性選擇CD3+，CD28+ T細胞。
在一些實施方式中，藉由在非T細胞(如B細胞、單核細胞、或其它白細胞)上表現的標記物(如CD14)的陰性選擇，從PBMC樣品中分離T細胞。在一些方面中，CD4+或CD8+選擇步驟用於分離CD4+輔助T細胞和CD8+細胞毒性T細胞。藉由對在一個或多個幼稚、記憶、及/或效應T細胞亞群上表現或表現到相對較高程度的標記物進行陽性選擇或陰性選擇，可將此類CD4+和CD8+群體進一步分類為亞群。在一些實施方式中，藉由基於與相應亞群相關聯的表面抗原的陽性選擇或陰性選擇，針對幼稚、中樞記憶、效應記憶、及/或中樞記憶幹細胞來進一步富集CD8+細胞或使其從上述細胞中耗竭。在一些實施方式中，對中樞記憶T(TCM)細胞進行富集以提高功效，從而在給予後諸如提高長期存活、擴大、及/或移植，這在某些方面在此類亞群中是尤其穩健的(robust)。在一些實施方式中，將富集TCM的CD8+ T細胞和CD4+ T細胞組合，進一步增強了功效。
在實施方式中，記憶T細胞存在於CD8+周邊血淋巴細胞的CD62L+和CD62L-亞群中。可諸如使用抗CD8抗體和抗CD62L抗體，針對CD62L-CD8+及/或CD62L+CD8+部分來富集PBMC或將其從上述部分中耗竭。在一些實施方式中，CD4+ T細胞群和CD8+ T細胞亞群，例如，是針對中樞記憶T(TCM)細胞富集的亞群。在一些實施方式中，對中樞記憶T(TCM)細胞的富集基於CD45RO、CD62L、 CCR7、CD28、CD3、及/或CD127的陽性或高表面表現；在一些方面中，其基於對表現或高表現CD45RA及/或顆粒酶B的細胞的陰性選擇。在一些方面中，藉由耗竭表現CD4、CD14、CD45RA的細胞和對表現CD62L的細胞陽性選擇或富集來進行針對TCM細胞富集的CD8+群體的分離。一方面，對中樞記憶T(TCM)細胞進行的富集以基於CD4表現所選擇的細胞的陰性部分開始，該陰性部分經歷基於CD14和CD45RA的表現的陰性選擇，並且經歷基於CD62L的陽性選擇。在一些方面中，這種選擇是同時進行的，而在其它方面中，是以任一順序按順序進行的。在一些方面中，用於製備CD8+細胞群或亞群的相同的基於CD4表現的選擇步驟也用於產生CD4+細胞群或亞群，使得來自基於CD4的分離的陽性部分和陰性部分都得以保留，並且任選地在一個或多個其它陽性選擇或陰性向選擇步驟之後用於方法的後續步驟中。
藉由鑒定具有細胞表面抗原的細胞群，將CD4+ T輔助細胞分類為幼稚細胞、中樞記憶細胞、和效應細胞。CD4+淋巴細胞可藉由標準方法獲得。在一些實施方式中，幼稚CD4+ T淋巴細胞是CD45RO-、CD45RA+、CD62L+、CD4+ T細胞。在一些實施方式中，中樞記憶CD4+細胞是CD62L+和CD45RO+。在一些實施方式中，效應CD4+細胞是CD62L-和CD45RO。在一個實例中，為了藉由陰性選擇富集CD4+細胞，單株抗體混合物通常包括針對CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR、和CD8的抗體。在一些實施方式中，抗體或結合伴侶結合到固體載體或基質，如磁珠或順磁珠，以允許分離供陽性選擇及/或陰性選擇的細胞。
在一些實施方式中，細胞在基因工程改造之前或與之相關時被孵育及/或培養。孵育步驟可以包括培養(culture)、培養(cultivation)、刺激、活化、及/或繁殖。在一些實施方式中，在刺激條件或刺激劑存在下孵育組合物或細胞。這種條件包括那些被設計用於誘導細胞在群體中增殖、擴大、活化、及/或存活以模擬抗原暴露，及/或為基因工程改造(諸如為導入重組抗原受體)準備(prime)細胞的 條件。這些條件可包括以下中的一個或多個：特定的培養基、溫度、氧含量、二氧化碳含量、時間、試劑，例如，營養素、胺基酸、抗生素、離子、及/或刺激因子(如細胞因子、趨化因子、抗原、結合伴侶、融合蛋白、重組可溶性受體)、以及被設計以使細胞活化的任意其它試劑。在一些實施方式中，刺激條件或試劑包括一種或多種試劑，例如，配體，其能夠活化TCR複合物的細胞內信號傳導結構域。在一些方面中，該試劑在T細胞中開啟或啟動TCR/CD3細胞內信號傳導級聯。此類試劑可包括抗體，諸如對TCR組分及/或共刺激受體具有特異性的抗體，例如，例如結合到固體載體(諸如珠)的抗CD3、抗CD28，及/或一種或多種細胞因子。任選地，擴大方法可進一步包含向培養基中添加抗CD3及/或抗CD28抗體的步驟(例如，以至少約0.5ng/ml的濃度)。在一些實施方式中，刺激劑包括IL-2及/或IL-15，例如，至少約10單位/mL的IL-2濃度。
在另一實施方式中，藉由裂解紅細胞並耗竭單核細胞，例如藉由PERCOLLTM梯度離心將T細胞從周邊血中分離出來。可選地，T細胞可以從臍帶中分離出來。在任何情況下，特定的T細胞亞群都可以藉由陽性選擇技術或陰性選擇技術進一步分離。
可以從表現某些抗原，包括但不限於CD34、CD8、CD14、CD19、和CD56的細胞中耗竭如此分離的臍帶血單核細胞。可使用單離的抗體、包含抗體的生物樣品(如腹水)、結合到物理載體的抗體、和細胞結合抗體來完成對這些細胞的耗竭。
藉由陰性選擇富集T細胞群可以使用針對以陰性方式選擇的細胞所特有的表面標記物的抗體的組合來實現。優選方法是藉由使用針對陰性選擇的細胞上存在的細胞表面標記物的單株抗體混合物的陰性磁性免疫粘附或流式細胞術進行細胞分選及/或選擇。例如，為了藉由陰性選擇富集CD4+細胞，單株抗體混合物通常包括針對CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR、和CD8的抗體。
為了藉由陽性選擇或陰性選擇來分離所期望的細胞群，可 以改變細胞的濃度和表面(例如，顆粒，如珠子)。在某些實施方式中，會期望顯著減少珠子和細胞混合在一起的體積(即，增加細胞的濃度)，以確保細胞和珠子的最大接觸。例如，在一個實施方式中，使用20億個細胞/ml的濃度。在一個實施方式中，使用10億個細胞/ml的濃度。在其它實施方式中，使用大於1億個細胞/ml。在其它實施方式中，使用1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、或5000萬個細胞/ml的細胞濃度。在又一實施方式中，使用7500、8000、8500、9000、9500萬個或1億個細胞/ml的細胞濃度。在其它實施方式中，可使用1.25億或1.5億個細胞/ml的濃度。使用高濃度可導致細胞產量增加、細胞活化、和細胞擴大。
T細胞也可以在洗滌步驟後冷凍，不需要去除單核細胞的步驟。雖然不希望受到理論的束縛，但冷凍和隨後的解凍步驟藉由去除細胞群中的粒細胞和在某種程度上去除單核細胞提供了更為均一的產物。在去除血漿和血小板的洗滌步驟之後，細胞可以懸浮在冷凍溶液中。雖然許多冷凍溶液和參數在本領域中是已知的並且在此背景下將是有用的，但在非限制性實例中，一種方法涉及使用含有20%DMSO和8%人類血清白蛋白的PBS，或其它合適的細胞冷凍介質。然後以每分鐘1℃的速率將細胞冷凍至-80℃，並儲存在液氮儲罐的汽相中。可使用受控冷凍的其它方法，也可在-20℃下或在液氮中立即進行非受控冷凍。
在一個實施方式中，T細胞群包含在諸如周邊血單核細胞、臍帶血細胞、純化的T細胞群、和T細胞系的細胞內。在另一實施方式中，周邊血單核細胞包含T細胞群。在又一實施方式中，純化的T細胞包含T細胞群。
在某些實施方式中，可從樣品中分離T調節細胞(Treg)。樣品可包括但不限於臍帶血或周邊血。在某些實施方式中，藉由流式細胞術分選分離Treg。在分離之前，可藉由本領域已知的任何手段對樣品進行Treg富集。可將單離的Treg冷凍保存，及/或在使用前擴大。分離Treg的方法在美國專利號7,754,482、8,722,400和9,555,105以 及美國專利申請號13/639,927(其內容以其整體併入本文中)中描述。
I.免疫細胞的擴大
不管是在對細胞進行修飾以表現對象CAR、顯性負性受體、及/或開關受體及/或雙特異性抗體、及/或其組合之前還是之後，都可以使用例如在美國專利號6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；6,867,041；和美國公開號20060121005中描述的方法使細胞活化並在數量上擴大細胞。例如，本發明的T細胞可藉由接觸附著了刺激CD3/TCR複合物相關信號的試劑和刺激T細胞表面上的共刺激分子的配體的表面來擴大。具體而言，T細胞群可藉由接觸抗CD3抗體或其抗原結合片段、或固定在表面上的抗CD2抗體，或藉由與結合鈣離子載體的蛋白激酶C活化劑(例如，苔蘚抑制素)接觸來刺激。為了對T細胞表面的輔助分子進行共刺激，使用結合輔助分子的配體。例如，在適合刺激T細胞增殖的條件下，T細胞可與抗CD3抗體和抗CD28抗體接觸。抗CD28抗體的實例包括9.3、B-T3、XR-CD28(Diaclone,Besancon,France)，並且這些可如本領域已知的其它方法和試劑那樣在本發明中使用(參見，例如，ten Berge等人，Transplant Proc.(1998)30(8)：3975-3977；Haanen等人，J.Exp.Med.(1999)190(9)：1319-1328；和Garland等人，J.Immunol.Methods(1999)227(1-2)：53-63)。
藉由本文公開的方法擴大T細胞可乘以約10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍、2000倍、3000倍、4000倍、5000倍、6000倍、7000倍、8000倍、9000倍，10,000倍、100,000倍、1,000,000倍、10,000,000倍、或更大，以及在其之間的任意和全部或部分整數。在一個實施方式中，T 細胞在約20倍至約50倍的範圍內擴大。
培養後，T細胞可在培養設備中的細胞培養基中孵育一段時間，或直到細胞達到融合(confluency)或高細胞密度以供最佳傳代，之後再將細胞遞送至另一培養設備。培養設備可以是通常用於體外培養細胞的任何培養設備。優選地，在將細胞遞送到另一培養設備之前，融合水平為70%或更高。更優選地，融合水平為90%或更高。一段時間可以是適合細胞體外培養的任何時間。在T細胞培養過程中，可隨時更換T細胞培養基。優選地，大約每2到3天更換一次T細胞培養基。然後從培養設備中獲取T細胞，隨之可立即使用T細胞或將其冷凍保存以供之後使用。在一個實施方式中，本發明包括冷凍保存經擴大的T細胞。在將核酸導入T細胞之前使冷凍保存的T細胞解凍。
在另一實施方式中，該方法包含分離T細胞並擴大T細胞。在另一實施方式中，本發明還包含在擴大之前冷凍保存T細胞。在又一實施方式中，將冷凍保存的T細胞解凍以用編碼嵌合膜蛋白的RNA進行電穿孔。
另一種離體擴大細胞的程序在美國專利號5,199,942(藉由引用併入本文)中描述。擴大，如美國專利號5,199,942中描述的，可以是本文所述其它擴大方法的替代方案或除此之外的其它方法。簡而言之，T細胞的離體培養和擴大包含添加細胞生長因子(如美國專利號5,199,942中描述的細胞生長因子)或其它因子(如flt3-L、IL-1、IL-3、和c-kit配體)。在一個實施方式中，擴大T細胞包含用選自flt3-L、IL-1、IL-3和c-kit配體的因子來培養T細胞。
如本文所述的培養步驟(如本文所述與試劑接觸或在電穿孔後)可以非常短暫，例如小於24小時，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23小時。如本文進一步所述的培養步驟(如本文所述與試劑接觸)可以更長，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14天或更多天。
各種術語被用來描述培養中的細胞。細胞培養通常是指從活的生物體中取出並在受控條件下生長的細胞。原代細胞培養是在第一次繼代培養之前，直接從生物體中取出的細胞、組織或器官的培養。當細胞被置於有利於細胞生長及/或分裂的條件下的生長培養基中時，細胞在培養中擴大，從而產生更多的細胞群。當細胞在培養中擴大時，細胞增殖的速率通常是藉由細胞數量加倍所需的時間來衡量的，也就是所謂的加倍時間。
每一輪繼代培養都被稱為一次傳代。當細胞進行繼代培養時，它們被稱為已經傳代。特定的細胞群或細胞系，有時指代其已傳代的次數或以其已傳代的次數為特徵。例如，傳代十次的所培養的細胞群可被稱為P10培養。原代培養，即從組織中分離細胞後的第一次培養，稱為P0。第一次繼代培養後，細胞被描述為次代培養(P1或第1代)。第二次繼代培養後，細胞變成第三代培養(P2或第2代)，依此類推。本領域技術人員將理解，在傳代期間可能存在多種群體加倍；因此培養物的群體加倍的數大於傳代數。傳代期間細胞的擴大(即，群體加倍的數)取決於許多因素，包括但不限於接種密度、底物、培養基、和傳代間隔時間。
在一個實施方式中，細胞可培養數小時(約3小時)至約14天或其間的任意小時整數值。適合T細胞培養的條件包括適合的培養基(例如，極限必需培養基或RPMI培養基1640或，X-vivo 15,(Lonza))，其可包含增殖和存活所必需的因子，包括血清(例如，胎牛血清或人類血清)、白介素-2(IL-2)、胰島素、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、TGF-β和TNF-α，或本領域技術人員已知的用於細胞生長的任意其它添加劑。用於細胞生長的其它添加劑包括但不限於表面活性劑、人類血漿蛋白製劑(plasmanate)和還原劑，如N-乙醯半胱胺酸和2-巰基乙醇。培養基可包括RPMI 1640、AIM-V、DMEM、MEM、α-MEM、F-12、X-Vivo 15和X-Vivo 20、Optimizer，添加胺基酸、丙酮酸鈉和維生素，無血清或補充適量的血 清(或血漿)或一組確定的激素，及/或足以使T細胞生長和擴大的量的細胞因子(一種或多種)。抗生素(例如，青黴素和鏈黴素)只包含在實驗培養物中，而不包含在待輸注到對象體內的細胞培養物中。目標細胞維持在支持生長所需的條件下，例如，適當的溫度(例如，37℃)和大氣(例如，空氣加5%的二氧化碳)。
用於培養T細胞的培養基可包括可共同刺激T細胞的試劑。例如，能夠刺激CD3的試劑是針對CD3的抗體，而能夠刺激CD28的試劑是針對CD28的抗體。藉由本文公開的方法單離的細胞可擴大約10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍、2000倍、3000倍、4000倍、5000倍、6000倍、7000倍、8000倍、9000倍，10,000倍、100,000倍、1,000,000倍、10,000,000倍或更大。在一個實施方式中，T細胞在約20倍至約50倍或更大的範圍內擴大。在一個實施方式中，藉由抗CD3抗體包被的KT64.86人工抗原呈遞細胞(aAPC)來擴大人類T調節細胞。在一個實施方式中，藉由抗CD3抗體包被的K562人工抗原呈遞細胞(aAPC)來擴大人類T調節細胞。用於使T細胞擴大和活化的方法可在美國專利號7,754,482、8,722,400、和9,555,105(其內容以其整體併入本文)中找到。
在一個實施方式中，擴大T細胞的方法可進一步包含分離擴大的T細胞以供進一步應用。在另一實施方式中，擴大的方法可進一步包含隨後對擴大的T細胞進行電穿孔，之後進行培養。隨後的電穿孔可包括向擴大的T細胞群中導入編碼試劑的核酸，諸如用核酸對擴大的T細胞轉導、對擴大的T細胞轉染、或對擴大的T細胞電穿孔，其中試劑進一步刺激T細胞。試劑可刺激T細胞(諸如藉由刺激進一步的擴大)、效應物功能、或其它T細胞功能。
J.治療方法
本文所述的經修飾的細胞(例如，T細胞)可包括在組合物中用於免疫療法。組合物可包括藥物組合物並且進一步包括藥學上可接受的載體。治療有效量的包含經修飾的T細胞的藥物組合物可被給予。
一方面，本發明包括用於過繼性細胞轉移療法的方法，其包含向對其需要的對象給予本發明的經修飾的T細胞。另一方面，本發明包括治療對象中的疾病或狀況的方法，其包含向對其需要的對象給予經修飾的T細胞群。
還包括的是治療對其需要的對象中的疾病或狀況的方法，其包含向對象給予本發明的經修飾的細胞(例如，經修飾的T細胞)。在一個實施方式中，治療對其需要的對象中的疾病或狀況的方法包含向對象給予經修飾的細胞(例如，經修飾的T細胞)，經修飾的細胞包含對象CAR、顯性負性受體及/或開關受體、及/或雙特異性抗體、及/或其組合。在一個實施方式中，治療對其需要的對象中的疾病或狀況的方法包含向對象給予經修飾的細胞(例如，經修飾的T細胞)，經修飾的細胞包含對象CAR(例如，對目標細胞上的PSMA具有親和力的CAR)和顯性負性受體及/或開關受體。在一個實施方式中，治療對其需要的對象中的疾病或狀況的方法包含向對象給予經修飾的細胞(例如，經修飾的T細胞)，經修飾的細胞包含對象CAR(例如，對目標細胞上的PSMA具有親和力的CAR)、顯性負性受體及/或開關受體，並且其中經修飾的細胞能夠表現並分泌雙特異性抗體。
給予免疫細胞以用於過繼性細胞療法的方法是已知的，並且可結合所提供的方法和組合物使用。例如，過繼性T細胞療法方法在授權Gruenberg等人的美國專利申請公開號2003/0170238；授權Rosenberg的美國專利號4,690,915；Rosenberg(2011)Nat Rev Clin Oncol.8(10)：577-85)中進行了描述。參見，例如，Themeli等人(2013)Nat Biotechnol.31(10)：928-933；Tsukahara等人(2013)Biochem Biophys Res Commun 438(1)：84-9；Davila等人(2013)PLoS ONE 8(4)：e61338。在一些實施方式中，細胞療法(例如，過繼性T細胞療法)藉由自體轉移進行，其中細胞從待接受細胞療法的對象中分離或以其它方式從待接受細胞療法的對象製備，或來自源自這樣的對象的樣品。因此，在某些方面中，細胞源自對象(例如，需要治療的患者)，並且細胞在分離和處理之後被給予至同一個對象。
在一些實施方式中，細胞療法(例如，過繼性T細胞療法)藉由同種異體轉移來實施，其中細胞從除了待接受或最終接受細胞療法的對象以外的對象(例如，第一對象)分離及/或以其它方式製備。在這樣的實施方式中，然後將細胞給予至同一物種的不同對象，例如，第二對象。在一些實施方式中，第一對象和第二對象在遺傳上是相同的。在一些實施方式中，第一對象和第二對象在遺傳上是相似的。在一些實施方式中，第二對象表現與第一對象相同的HLA類型或超型。
在一些實施方式中，在給予細胞或含有細胞的組合物之前，對象已用靶向疾病或狀況(例如，腫瘤)的治療劑治療。在一些方面中，對象是其它治療劑是難治的或對其無反應。在一些實施方式中，對象例如在用其它治療干預(包括化療、放射、及/或造血幹細胞移植(HSCT)，例如，同種異體HSCT)治療之後患有持久性或復發性疾病。在一些實施方式中，儘管對象已對其它療法有抗性，但給予仍有效地治療對象。
在一些實施方式中，對象對其它治療劑有反應，並且用該治療劑治療減輕了疾病負擔。在一些方面中，對象最初對治療劑有反應，但隨著時間的推移表現出疾病或狀況的復發。在一些實施方式中，對象沒有復發。在一些這樣的實施方式中，對象被確定處於復發風險，諸如處於高復發風險，因此預防性地給予細胞，從而例如降低復發的可能性或防止復發。在一些方面中，對象之前沒有接受其它治療劑的治療。
在一些實施方式中，對象例如在用其它治療干預(包括化療、放射、及/或造血幹細胞移植(HSCT)，例如，同種異體HSCT)治療之後患有持久性或復發性疾病。在一些實施方式中，儘管對象已對 其它療法有抗性，但給予仍有效地治療對象。
本發明的經修飾的免疫細胞可給予動物，優選哺乳動物，甚至更優選是人類，以治療癌症。此外，本發明的細胞可用於治療與癌症相關的任何狀況，特別是針對腫瘤細胞(一種或多種)的細胞介導的免疫反應，其中期望治療或減輕疾病。待用本發明的經修飾的細胞或藥物組合物治療的癌症類型包括癌、胚細胞瘤和肉瘤，和某些白血病或淋巴惡性腫瘤、良性和惡性腫瘤、和惡性瘤，例如肉瘤、癌和黑素瘤。其它例示性癌症包括但不限於乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、子宮頸癌、皮膚癌、胰腺癌、結直腸癌、腎癌、肝癌、腦癌、淋巴瘤、白血病、肺癌、甲狀腺癌等。癌症可以是非實體瘤(如血液腫瘤)或實體瘤。成人腫瘤/癌症和兒童腫瘤/癌症也包括在內。
實體瘤是通常不包含囊腫或液體區的組織的異常腫塊。實體瘤可以是良性或惡性的。不同類型的實體瘤以形成它們的細胞類型命名(如肉瘤、癌和淋巴瘤)。實體瘤(如肉瘤和癌)的實例包括纖維肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、骨肉瘤和其它肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤因氏腫瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結腸癌、淋巴惡性腫瘤、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝細胞癌、鱗狀細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、甲狀腺髓樣癌、乳頭狀甲狀腺癌、嗜鉻細胞瘤皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、髓樣癌、支氣管癌、腎細胞癌、肝細胞瘤、膽管癌、絨膜癌、維爾姆斯氏腫瘤、子宮頸癌、睾丸腫瘤、精原細胞瘤、膀胱癌、黑素瘤和CNS腫瘤(如神經膠質瘤(如腦幹神經膠質瘤和混合神經膠質瘤)、成膠質細胞瘤(也被稱為多形性成膠質細胞瘤)星形細胞瘤、CNS淋巴瘤、生殖細胞瘤、成神經管細胞瘤、神經鞘瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、成血管細胞瘤、聽神經瘤、少突神經膠質瘤、腦膜瘤、神經細胞瘤、視網膜母細胞瘤和腦轉移)。
可順應(amenable to)本文公開方法所進行的療法的癌包括但不限於食管癌、肝細胞癌、基底細胞癌(一種皮膚癌形式)、鱗狀細胞癌(各種組織)、膀胱癌(包括移行細胞癌(膀胱惡性腫瘤))、 支氣管癌、結腸癌、結直腸癌、胃癌、肺癌(包括肺部小細胞癌和非小細胞癌)、腎上腺皮質癌、甲狀腺癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、囊腺癌、髓樣癌、腎細胞癌、導管原位癌或膽管癌、絨膜癌、精原細胞瘤、胚胎性癌、維爾姆斯氏腫瘤、子宮頸癌、子宮癌、睾丸癌、成骨癌、上皮癌、和鼻咽癌。
可順應本文公開方法所進行的療法的肉瘤包括但不限於纖維肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、脊索瘤、成骨肉瘤、骨肉瘤、血管肉瘤、內皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內皮肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤因氏肉瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、和其它軟組織肉瘤。
前列腺癌是一種非常常見且致命的疾病。前列腺癌是男性最常見的惡性腫瘤。前列腺癌是男性癌症相關死亡的第二大病因，估計占每年男性癌症死亡人數的10%。PSMA在惡性前列腺組織中高表現，在一些正常人體組織中低表現。在正常生理條件下，PSMA表現於前列腺(分泌腺泡上皮)、腎臟(近端小管)、神經系統神經膠質(星形膠質細胞和許旺細胞)、和小腸(空腸刷狀緣(jejunal brush border))。PSMA在前列腺上皮中要高表現得多，並且在惡性前列腺組織中顯著上調。PSMA在正常細胞中的表現比在前列腺癌細胞中低100倍到1000倍。在從良性前列腺增生向前列腺腺癌轉變過程中，PSMA表現顯著增加。PSMA表現與惡性前列腺組織的組織學分級直接相關，並隨著疾病的進展而增加(即在淋巴結和骨中前列腺癌轉移中發現PSMA表現最高)。
在一個實施方式中，本發明的方法可用於治療前列腺癌，例如晚期去勢抵抗性前列腺癌。本領域普通技術人員應當容易理解，可以使用本發明的方法治療其中表現PSMA腫瘤抗原的任何類型的癌症。例如，在非小細胞肺癌中發現PSMA的新生血管表現，參見，例如，PLoS One.2017 Oct 27；12(10)。因此，本發明的方法也可用於治療非小細胞肺癌(NSCLC)。
在某些例示性實施方式中，本發明的經修飾的免疫細胞用於治療前列腺癌。在一個實施方式中，本揭示的方法用於治療去勢抵抗性前列腺癌。在一個實施方式中，本揭示的方法用於治療晚期去勢抵抗性前列腺癌。在一個實施方式中，本揭示的方法用於治療轉移性去勢抵抗性前列腺癌。在一個實施方式中，本揭示的方法用於治療轉移性去勢抵抗性性前列腺癌，其中患有轉移性去勢抵抗性前列腺癌的患者具有
Figure 110107653-A0202-12-0294-401
10%的表現PSMA的腫瘤細胞。在一個實施方式中，本揭示的方法用於治療去勢抵抗性前列腺腺癌，其中患者在使用或不使用雄激素剝奪療法的情況下具有去勢水平的睾酮(例如，<50ng/mL)。
在某些實施方式中，對象被提供二次治療(secondary treatment)。二次治療包括但不限於化療、放射、手術、和藥療。
本發明的細胞可按劑量和途徑給予，並且有時在適當的臨床前與臨床實驗和試驗中確定。細胞組合物可按在這些範圍內的劑量多次給予。本發明的細胞的給予可與可用於治療由本領域技術人員所確定的期望的疾病或狀況的其它方法組合。
就經歷療法的對象而言，待給予的本發明的細胞可以是自體的。
本發明的細胞的給予可以本領域技術人員已知的任何便利方式實施。本發明的細胞可藉由霧化吸入、注射、攝取、輸注、植入、或移植給予對象。本文所述的組合物可經動脈、皮下、皮內、瘤內(intratumorally)、節內(intranodally)、髓內(intramedullary)、肌肉內、藉由靜脈內(i.v.)注射、或腹膜內給予患者。在其它情況下，將本發明的細胞直接注射到對象的炎症部位、對象的局部疾病部位、淋巴結、器官、腫瘤等。
在一些實施方式中，以所期望劑量(dosage)給予細胞，所期望劑量在一些方面中包括所期望劑量(dose)或細胞數或細胞類型(一種或多種)及/或所期望的細胞類型比。因此，在一些實施方式中，細胞的劑量基於細胞的總數(或每kg體重的數量)和單獨的群體或亞 型的期望的比，諸如CD4+與CD8+的比。在一些實施方式中，細胞的劑量基於單獨的群體或單獨的細胞類型中所期望的細胞總數(或每kg體重的數量)。在一些實施方式中，劑量基於這些特徵的組合，如單獨的群體中所期望的總的細胞數、所期望的比、和所期望的總的細胞數。
在一些實施方式中，在總細胞的所期望劑量(如T細胞的所期望劑量)的容許差異下或在該容許差異內給予細胞群或細胞亞型(如CD8+ T細胞和CD4+ T細胞)。在一些方面中，所期望劑量是所期望的細胞數或給予細胞的對象的每單位體重所期望的細胞數，例如，細胞數/kg。在一些方面中，所期望劑量等於最小細胞數或每單位體重最小細胞數，或在最小細胞數或每單位體重最小細胞數以上。在一些方面中，在以所期望劑量給予的總細胞中，單獨的群體或亞型以所期望的輸出比(如CD4+與CD8+的比)或接近所期望的輸出比(例如，在這種比的某個容許差異或誤差內)存在。
在一些實施方式中，在一種或多種單獨的細胞群或細胞亞型的所期望劑量(如CD4+細胞的所期望劑量及/或CD8+細胞的所期望劑量)的容許差異下或在該容許差異內給予細胞。在一些方面中，所期望劑量是該亞型或群體細胞的所期望數量，或是給予細胞的對象的每單位體重此類細胞的所期望的數量，例如，細胞數/kg。在一些方面中，所期望劑量等於該群體或亞型細胞的最小數或在該群體或亞型細胞的最小數以上，或等於每單位體重該群體或亞型細胞的最小數或在每單位體重該群體或亞型細胞的最小數以上。因此，在一些實施方式中，劑量基於總細胞的所期望的固定劑量和所期望的比，及/或基於單獨的亞型或亞群中一種或多種(例如，每一種)的所期望的固定劑量。因此，在一些實施方式中，劑量基於T細胞的所期望的固定劑量或最小劑量和CD4+與CD8+細胞的所期望的比，及/或基於CD4+及/或CD8+細胞的所期望的固定劑量或最小劑量。
在某些實施方式中，這些細胞，或細胞亞型的單獨的群體以如下範圍向對象給予：約100萬至約1000億個細胞，諸如，例如， 100萬至約500億個細胞(例如，約500萬個細胞、約250萬個細胞、約5億個細胞、約10億個胞、約50億個細胞、約200億個細胞、約300億個細胞、約400億個細胞，或上述值中任意兩個所限定的範圍)，如約1000萬至約1000億個細胞(例如，約2000萬個細胞、約3000萬個細胞、約4000萬個細胞、約6000萬個細胞、約7000萬個細胞、約8000萬個細胞、約9000萬個細胞、約100億個細胞、約250億個細胞、約500億個細胞、約750億個細胞、約900億個細胞，或上述值中任意兩個所限定的範圍)，並且在某些情況下約1億個細胞至約500億個細胞(例如，約1.2億個細胞、約2.5億個細胞、約3.5億個細胞、約4.5億個細胞、約6.5億個細胞、約8億個細胞、約9億個細胞、約30億個細胞、約300億個細胞、約450億個細胞)或在這些範圍內的任意值。
在一些實施方式中，總細胞的劑量及/或細胞的單獨亞群的劑量在以下範圍內：在等於或約1x105個細胞/kg至約1x1011個細胞/kg之間，104，和等於或約1011個細胞/千克(kg)體重，如在105與106個細胞/kg體重之間，例如，等於或約1 x 105個細胞/kg體重、1.5 x 105個細胞/kg體重、2 x 105個細胞/kg體重、或1 x 106個細胞/kg體重。例如，在一些實施方式中，在以下某個誤差範圍下或在該誤差範圍內給予細胞：在等於或約104與等於或約109個T細胞/千克(kg)體重之間，如在105與106個T細胞/kg體重之間，例如，等於或約1 x 105個T細胞/kg體重、1.5 x 105個T細胞/kg體重、2 x 105個T細胞/kg體重、或1 x 106個T細胞/kg體重。在其它例示性實施方式中，用於本揭示方法的經修飾的細胞的合適的劑量範圍非限制性地包括約1x105個細胞/kg至約1x106個細胞/kg、約1x106個細胞/kg至約1x107個細胞/kg、約1x107個細胞/kg約1x108個細胞/kg、約1x108個細胞/kg約1x109個細胞/kg、約1x109個細胞/kg約1x1010個細胞/kg、約1x1010個細胞/kg約1x1011個細胞/kg。在例示性實施方式中，用於本揭示方法的合適的劑量是約1x108個細胞/kg。在例示性實施方式中， 用於本揭示方法的合適的劑量是約1x107個細胞/kg。在其它實施方式中，合適的劑量是約1x107個總細胞至約5x107個總細胞。在一些實施方式中，合適的劑量是約1x108個總細胞至約5x108個總細胞。在一些實施方式中，合適的劑量是約1.4x107個總細胞至約1.1x109個總細胞。在例示性實施方式中，用於本揭示方法的合適的劑量是約7x109個總細胞。在例示性實施方式中，合適的劑量是約1x107個總細胞至約3x107個總細胞。
在一些實施方式中，總細胞的劑量及/或細胞的單獨亞群的劑量在等於或約1x105個細胞/m2至約1x1011個細胞/m2之間的範圍內。在例示性實施方式中，總細胞的劑量及/或細胞的單獨亞群的劑量在等於或約1x107/m2至等於或約3x107/m2之間的範圍內。在例示性實施方式中，總細胞的劑量及/或細胞的單獨亞群的劑量在等於或約1x108/m2至等於或約3x108/m2之間的範圍內。在一些實施方式中，總細胞的劑量及/或細胞的單獨亞群的劑量是給定患者的最大容許劑量。
在一些實施方式中，在以下某個誤差範圍下或在該誤差範圍內給予細胞：在等於或約104與等於或約109個CD4+及/或CD8+細胞/千克(kg)體重之間，如在105與106個CD4+及/或CD8+細胞/kg體重之間，例如，等於或約1 x 105個CD4+及/或CD8+細胞/kg、1.5 x 105個CD4+及/或CD8+細胞/kg體重、2 x 105個CD4+及/或CD8+細胞/kg體重、或1 x 106個CD4+及/或CD8+細胞/kg體重。在一些實施方式中，在以下某個誤差範圍下或在該誤差範圍內給予細胞：大於，及/或至少約1 x 106、約2.5 x 106、約5 x 106、約7.5 x 106、或約9 x 106個CD4+細胞，及/或至少約1 x 106、約2.5 x 106、約5 x 106、約7.5 x 106、或約9 x 106個CD8+細胞，及/或至少約1 x 106、約2.5 x 106、約5 x 106、約7.5 x 106、或約9 x 106個T細胞。在一些實施方式中，在以下某個誤差範圍下或在該誤差範圍內給予細胞：在約108與1012個T細胞之間或在約1010與1011個T細胞之間、在約108與1012個CD4+細胞之間或在約1010與1011個CD4+細胞之間、及/或在約108 與1012個CD8+細胞之間或在約1010與1011個CD8+細胞之間。
在一些實施方式中，在多個細胞群或亞型(如CD4+和CD8+細胞或亞型)的所期望的輸出比的容許範圍下或在該容許範圍內給予細胞。在一些方面中，所期望的比可以是具體的比或者可以是比的範圍，例如，在一些實施方式中，所期望的比(例如，CD4+細胞與CD8+細胞的比)在等於或約5：1與等於或約5：1(或大於約1：5與小於約5：1)之間，或在等於或約1：3與等於或約3：1(或大於約1：3與小於約3：1)之間，如在等於或約2：1與等於或約1：5之間(或大於約1：5與小於約2：1之間，如等於或約5：1、4.5：1、4：1、3.5：1、3：1、2.5：1、2：1、1.9：1、1.8：1、1.7：1、1.6：1、1.5：1、1.4：1、1.3：1、1.2：1、1.1：1、1：1、1：1.1、1：1.2、1：1.3、1：1.4、1：1.5、1：1.6、1：1.7、1：1.8、1：1.9、1：2、1：2.5、1：3、1：3.5、1：4、1：4.5或1：5)。在一些方面中，容許差異在所期望的比的約1%、約2%、約3%、約4%、約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%內，包含這些範圍之間的任意值。
在一些實施方式中，以單劑量或多劑量向對其需要的對象給予經修飾的細胞的劑量。在一些實施方式中，以多劑量給予經修飾的細胞的劑量，例如，一週一次或每7天一次、每2週一次或每14天一次、每3週一次或每21天一次、每4週一次或每28天一次。在例示性實施方式中，向對其需要的對象給予單劑量的經修飾的細胞。在例示性實施方式中，藉由快速靜脈內輸注向對其需要的對象給予單劑量的經修飾的細胞。
對於疾病的預防或治療，適當的劑量可取決於待治療疾病的類型、細胞或重組受體的類型、疾病的嚴重程度和過程、是否出於預防或治療目的給予細胞、先前療法、對象的臨床病史和對細胞的反應、以及主治醫師的判斷。在一些實施方式中，組合物和細胞一次或藉由一系列治療適當地給予對象。
在一些實施方式中，作為組合治療的一部分來給予細胞， 諸如與其它治療性干預(如抗體或工程改造的細胞或受體或試劑，如細胞毒性劑或治療劑)同時給予或以任意順序與其按順序給予。在一些實施方式中細胞同時或以任意順序按順序與一種或多種其它治療劑共同給予，或結合另一治療性干預給予。在一些情況下，細胞與另一種療法在時間上足夠接近地共同給予，使得細胞群增強一種或多種其它治療劑的效果，反之亦然。在一些實施方式中，在一種或多種其它治療劑之前給予細胞。在一些實施方式中，在一種或多種其它治療劑之後給予細胞。在一些實施方式中，一種或多種其它試劑包括細胞因子，如IL-2，從而例如增強持久性。在一些實施方式中，方法包含化療劑的給予。
在細胞給予後，在一些實施方式中，例如藉由多種已知方法中的任意種來測量的工程改造的細胞群的生物活性。評估參數包括工程改造的或天然的T細胞或其它免疫細胞在體內(例如，藉由成像)或在體外(例如，藉由ELISA或流式細胞術)與抗原的特異性結合。在某些實施方式中，可使用本領域已知的任何合適的方法測量工程改造的細胞破壞目標細胞的能力，如，Kochenderfer等人，J.Immunotherapy,32(7)：689-702(2009)，和Herman等人J.Immunological Methods,285(1)：25-40(2004)中描述的細胞毒性測定。在某些實施方式中，藉由測定一種或多種細胞因子(如CD 107a、IFNy、IL-2和TNF)的表現及/或分泌來測量細胞的生物活性。在一些方面中，生物活性是藉由評估臨床結果，如腫瘤負擔或負荷的減少來衡量的。
在一些實施方式中，本揭示的具體劑量方案包括在給予經修飾的T細胞之前的淋巴細胞耗竭步驟(lymphodepletion step)。在例示性實施方式中，淋巴細胞耗竭步驟包括環磷醯胺及/或氟達拉濱的給予。
在一些實施方式中，淋巴細胞耗竭步驟包括以約200mg/m2/天與約2000mg/m2/天之間(例如，200mg/m2/天、300mg/m2/天、或500mg/m2/天)的劑量給予環磷醯胺。在例示性實施方式中，環磷醯胺的劑量是約300mg/m2/天。在一些實施方式中，淋巴細胞耗 竭步驟包括以約20mg/m2/天與約900mg/m2/天之間(例如，20mg/m2/天、25mg/m2/天、30mg/m2/天、或60mg/m2/天)的劑量給予氟達拉濱。在例示性實施方式中，氟達拉濱的劑量是約30mg/m2/天。
在一些實施方式中，淋巴細胞耗竭步驟包括以約200mg/m2/天與約2000mg/m2/天之間(例如，200mg/m2/天、300mg/m2/天、或500mg/m2/天)的劑量給予環磷醯胺，和以約20mg/m2/天與約900mg/m2/天之間(例如，20mg/m2/天、25mg/m2/天、30mg/m2/天、或60mg/m2/天)的劑量給予氟達拉濱。在例示性實施方式中，淋巴細胞耗竭步驟包括以約300mg/m2/天的劑量給予環磷醯胺，和以約30mg/m2/天的劑量給予氟達拉濱。
在例示性實施方式中，對於患有去勢抵抗性前列腺癌的對象，該對象在給予經修飾的T細胞前接受淋巴細胞耗竭化療。在例示性實施方式中，對於患有去勢抵抗性前列腺癌的對象，該對象接受包括靜脈內輸注等於或約500mg/m2至等於或約1g/m2環磷醯胺的淋巴細胞耗竭化療。在例示性實施方式中，對於患有去勢抵抗性前列腺癌的對象，該對象在給予經修飾的T細胞前接受包括靜脈內輸注約3天(±1天)等於或約500mg/m2至等於或約1g/m2環磷醯胺的淋巴細胞耗竭化療。在例示性實施方式中，對於患有去勢抵抗性前列腺癌的對象，該對象在給予經修飾的T細胞前接受包括靜脈內輸注長達4天等於或約500mg/m2至等於或約1g/m2環磷醯胺的淋巴細胞耗竭化療。在例示性實施方式中，對於患有去勢抵抗性前列腺癌的對象，該對象在給予經修飾的T細胞前接受包括靜脈內輸注4天等於或約500mg/m2至等於或約1g/m2環磷醯胺的淋巴細胞耗竭化療。在例示性實施方式中，對於患有去勢抵抗性前列腺癌的對象，該對象在給予經修飾的T細胞前接受包括靜脈內輸注3天等於或約500mg/m2至等於或約1g/m2環磷醯胺的淋巴細胞耗竭化療。在例示性實施方式中，對於患有去勢抵抗性前列腺癌的對象，該對象在給予經修飾的T細胞前接受包括靜脈內輸注2天等於或約500mg/m2至等於或約1g/m2環磷醯胺的淋巴細胞耗竭化療。
在例示性實施方式中，對於患有去勢抵抗性前列腺癌的對象，該對象在給予經修飾的T細胞前接受包括靜脈內輸注3天300mg/m2環磷醯胺的淋巴細胞耗竭化療。在例示性實施方式中，對於患有去勢抵抗性前列腺癌的對象，該對象在給予經修飾的T細胞前接受包括靜脈內輸注3天300mg/m2環磷醯胺的淋巴細胞耗竭化療。
在例示性實施方式中，對於患有去勢抵抗性前列腺癌的對象，該對象接受淋巴細胞耗竭化療包括劑量為約20mg/m2/天與約900mg/m2/天之間(例如，20mg/m2/天、25mg/m2/天、30mg/m2/天、或60mg/m2/天)的氟達拉濱。在例示性實施方式中，對於患有去勢抵抗性前列腺癌的對象，該對象接受包括劑量為30mg/m2氟達拉濱達3天的淋巴細胞耗竭化療。
在例示性實施方式中，對於患有去勢抵抗性前列腺癌的對象，該對象接受淋巴細胞耗竭化療，淋巴細胞耗竭化療包括劑量為約200mg/m2/天與約2000mg/m2/天之間(例如，200mg/m2/天、300mg/m2/天、或500mg/m2/天)的環磷醯胺，和劑量為約20mg/m2/天與約900mg/m2/天之間(例如，20mg/m2/天、25mg/m2/天、30mg/m2/天、或60mg/m2/天)的氟達拉濱。在例示性實施方式中，對於患有去勢抵抗性前列腺癌的對象，該對象接受淋巴細胞耗竭化療，淋巴細胞耗竭化療包括劑量為約300mg/m2/天的環磷醯胺和劑量為30mg/m2的氟達拉濱達3天。
本發明的細胞可按劑量和途徑給予，並且有時在適當的臨床前與臨床實驗和試驗中確定。細胞組合物可按在這些範圍內的劑量多次給予。本發明的細胞的給予可與可用於治療由本領域技術人員所確定的期望的疾病或狀況的其它方法組合。
本領域已知，輸注CAR T細胞後的不良反應之一是免疫活化的開始，免疫活化的開始被稱為細胞因子釋放綜合征(CRS)。CRS是導致炎症細胞因子升高的免疫活化。臨床測量和實驗室測量的範圍從輕度CRS(全身症狀及/或2級器官毒性)到嚴重CRS(sSCR；3級以 上的器官毒性、攻擊性臨床干預、及/或潛在的生命威脅)。臨床特徵包括：高熱、不適、疲勞、肌痛、噁心、厭食、心動過速/低血壓、毛細血管滲漏、心機能障礙、腎功能損害、肝功能衰竭、和彌散性血管內凝血。CAR T-細胞輸注後，細胞因子，包括干擾素-γ、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子、IL-10、和IL-6顯示出顯著升高。CRS的存在通常與過繼轉移的細胞的擴大和進行性免疫活化有關。已經證明，CRS的嚴重程度取決於輸注時的疾病負擔，因為腫瘤負擔重的患者經歷更多的sCRS。
因此，本發明提供了在CRS診斷之後適當的CRS管理策略，以減輕不受控制的炎症的生理症狀，而不減少工程改造的細胞(例如，CAR T細胞)的抗腫瘤功效。CRS管理策略是本領域已知的。例如，可給予全身性皮質類固醇以快速逆轉sCRS(例如，3級CRS)的症狀，而不損害初始抗腫瘤反應。
在一些實施方式中，可給予抗IL-6R抗體。抗IL-6R抗體的實例是食品和藥品監督管理局批准的單株抗體托珠單抗(tocilizumab)，也稱為atlizumab(市場上稱為Actemra或RoActemra)。托珠單抗是一種針對白介素-6受體(IL-6R)的人源化單株抗體。托珠單抗的給予已證明CRS幾乎立即被逆轉。
CRS通常是根據觀察到的綜合征的嚴重程度進行管理的，而干預因此受到調整。CRS管理決策可基於臨床跡象和症狀以及對干預的反應，而不僅僅是實驗室值。
輕中度病例一般採用充分緩解症狀所需的流體療法、非甾體抗炎藥(NSAID)和抗組胺劑進行症狀管理。更嚴重的病例包括任意程度的血液動力學不穩定的患者；患有任意的血液動力學不穩定，建議給予托珠單抗。在一些實施方式中，CRS的一線管理可以是60分鐘內IV 8mg/kg的標記劑量(不超過800mg/劑量)的托珠單抗；托珠單抗可重複Q8小時。如果對第一劑量的托珠單抗反應不理想，可以考慮額外劑量的托珠單抗。托珠單抗可以單獨給予，也可以與皮質類固醇療法聯用。持續性或進行性CRS症狀、12-18小時內臨床改善不足或對 托珠單抗反應差的患者可採用大劑量皮質類固醇療法進行治療，一般IV氫化可的松100mg或甲潑尼龍1-2mg/kg。對於血液動力學不穩定或呼吸症狀較嚴重的患者，可在CRS早期給予大劑量皮質類固醇療法。CRS管理指南可基於已發佈的標準(Lee等人(2019)Biol Blood Marrow Transplant,doi.org/10.1016/j.bbmt.2018.12.758；Neelapu等人(2018)Nat Rev Clin Oncology,15：47；Teachey等人(2016)Cancer Discov,6(6)：664-679)。
在用CAR-T療法治療的患者中觀察到與巨噬細胞活化綜合征(MAS)或噬血細胞性淋巴組織細胞增多症(HLH)一致的特徵(Henter,2007)，與CRS的臨床表現一致。MAS似乎是對CRS引起的免疫活化的反應，因此應被視為CRS的一種表現。MAS類似於HLH(也是對免疫刺激的反應)。MAS的臨床綜合征的特點是高等級的非緩解性發熱、影響三個譜系中至少兩個譜系的細胞減少、以及肝脾大。它與高血清鐵蛋白、可溶性白介素-2受體和甘油三酯，以及循環的自然殺傷(NK)活性的降低有關。
在一些實施方式中，本發明的方法涉及選擇和治療至少一個先前癌症療法標準療程失敗的對象。例如，合適的對象可以確診為復發性前列腺癌。在一些實施方式中，本發明的方法涉及選擇和治療受到至少一個先前癌症療法標準療程的對象。例如，合適的對象可以已經受到使用至少一種標準17α裂解酶抑制劑的先前療法或第二代抗雄激素療法來治療轉移性去勢抵抗性前列腺癌。
在例示性實施方式中，合適的對象是患有轉移性去勢抵抗性前列腺癌的對象。在例示性實施方式中，合適的對象是患有轉移性去勢抵抗性前列腺癌的對象，其具有藉由對新鮮組織進行免疫組織化學分析所證明的
Figure 110107653-A0202-12-0303-402
10%的表現PSMA的腫瘤細胞。
在一些實施方式中，合適的對象是有骨轉移性疾病及/或可測量的非骨轉移性疾病(結的或內臟的)的放射照相證據的對象。
在一些實施方式中，合適的對象是具有0-1的ECOG表 現狀態的對象。
在一些實施方式中，合適的對象是具有充足的器官功能的對象，充足的器官功能被定義為：血清肌酐
Figure 110107653-A0202-12-0304-403
1.5mg/dl或肌酐清除率
Figure 110107653-A0202-12-0304-404
60cc/min；及/或血清總膽紅素<1.5x ULN；血清ALT/AST<2x ULN。
在一些實施方式中，合適的對象是具有足夠的血液儲備的對象，足夠的血液儲備被定義為：Hgb>10g/dl；PLT>100k/ul；及/或ANC>1.5k/ul。
在一些實施方式中，合適的對象是不依賴於輸血的對象。
在一些實施方式中，合適的對象是有進行性去勢抵抗性前列腺腺癌的證據的對象，該證據被定義為：在使用或不使用雄激素剝奪療法的情況下的去勢睾酮水平(<50ng/ml)；及/或以下的進行性疾病衡量之一的證據：按照RECIST 1.1標準的軟組織進展、骨掃描出現2個或更多個新病變的骨疾病進展(根據PCWG2標準)、血清PSA至少增加25%、以及從最低點絕對增加2ng/ml或更多(根據PCWG2標準)。
在一些實施方式中，合適的對象先前已使用至少一種第二代雄激素信號傳導抑制劑進行過治療。在一些實施方式中，合適的對象先前已用阿比特龍(abiraterone)進行過治療。在一些實施方式中，合適的對象先前已用恩雜魯胺(enzalutamide)進行過治療。
在一些實施方式中，合適的對象具有在轉移性組織活檢上藉由免疫組織化學(IHC)的
Figure 110107653-A0202-12-0304-405
10%的表現PSMA的腫瘤細胞。
在一些實施方式中，合適的對象有轉移性疾病(骨的或結的/內臟的)的放射照相證據。
在一些實施方式中，合適的對象的轉移性CRPC治療線
Figure 110107653-A0202-12-0304-406
4。
K.藥物組合物和製劑
還提供了本發明的免疫細胞群，含有這種細胞及/或針對這種細胞而富集的組合物，例如其中表現重組受體的細胞占組合物中的總細胞或某種類型的細胞(如T細胞或CD8+細胞或CD4+細胞)的至少50%、60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或更多。在組合物當中，是用於給予以諸如用於過繼性細胞療法的藥物組合物和製劑。還提供了用於向對象(例如，患者)給予細胞和組合物的治療方法。
還提供了包括用於給予的細胞的組合物，該組合物包括藥物組合物和製劑，如單位劑型組合物，單位劑型組合物包括以給定劑量或其部分來給予的細胞的數量。藥物組合物和製劑通常包括一種或多種任選的藥學上可接受的載體或賦形劑。在一些實施方式中，組合物包括至少一種其它的治療劑。
術語「藥物製劑」是指這樣的製劑：這種形式的該製劑允許其中所含活性成分的生物活性有效且不含有對將給予該製劑的對象具有不可接受的毒性的其它成分。「藥學上可接受的載體」是指藥物製劑中除活性成分外，對於對象無毒的成分。藥學上可接受的載體包括但不限於緩衝劑、賦形劑、穩定劑、或防腐劑。在一些方面中，載體的選擇部分地由特定細胞及/或給予方法確定。因此，存在多種合適的製劑。例如，藥物組合物可以含有防腐劑。合適的防腐劑可包括，例如，羥苯甲酯、羥苯丙酯、苯甲酸鈉、和苯紮氯銨。在一些方面中，使用兩種或更多種防腐劑的混合物。防腐劑或其混合物通常以按總組合物的重量計約0.0001%至約2%的量存在。例如，Remington's Pharmaceutical Sciences第16版，Osol,A.Ed.(1980)對載體進行了描述。所採用的劑量和濃度下的藥學上可接受的載體通常對接受者是無毒的，並且包括但不限於：緩衝劑，如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其它有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸和甲硫胺酸；防腐劑(如十八烷基二甲基苄基氯化銨；六甲氯銨)；苯紮氯銨；苄索氯銨；苯酚、丁醇或苯甲醇；對羥基苯甲酸烷基酯類，如羥苯甲酯或羥苯丙酯；鄰苯二酚；間苯二酚；環己醇；3-戊 醇；和間甲酚)；低分子量(少於約10個殘基)多肽；蛋白質，如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；胺基酸，如甘胺酸、穀胺醯胺、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或賴胺酸；單糖、雙糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，如EDTA；糖，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成鹽反離子，如鈉；金屬絡合物(例如鋅-蛋白質絡合物)；及/或非離子表面活性劑，如聚乙二醇(PEG)。
在一些方面中，緩衝劑包括在組合物中。合適的緩衝劑包括，例如，檸檬酸、檸檬酸鈉、磷酸、磷酸鉀、和各種其它酸和鹽。在一些方面中，使用兩種或更多種緩衝劑的混合物。緩衝劑或其混合物通常以按總組合物的重量計約0.001%至約4%的量存在。製備可給予的藥物組合物的方法是已知的。例示性方法在例如Remington：The Science and Practice of Pharmacy,Lippincott Williams & Wilkins；21st ed.(2005年5月1日)中有更詳細的描述。
製劑可包括水溶液。製劑或組合物還可包含多於一種的活性成分，活性成分可用於用細胞治療的特定適應症、疾病或狀況，優選活性與所述細胞互補的活性成分，其中各自的活性彼此不產生不利影響。此類活性成分適當地以對預期目的有效的量組合存在。因此，在一些實施方式中，藥物組合物進一步包括其它藥學活性劑或藥物，如化療劑，例如天門冬醯胺酶、白消安、卡鉑、順鉑、柔紅黴素、阿黴素、氟尿嘧啶、吉西他濱(gemcitabine)、羥基脲、甲胺蝶呤、紫杉醇、利妥昔單抗(rituximab)、長春花堿、及/或長春新堿。在一些實施方式中，藥物組合物含有有效治療或預防疾病或狀況的量(如治療有效或預防有效量)的細胞。在一些實施方式中，藉由對所治療的對象週期性評估來監測治療或預防功效。所期望的劑量可藉由細胞的單次彈丸給予、細胞的多次彈丸給予，或藉由細胞的連續輸注給予來遞送。
製劑包括口服、靜脈內、腹膜內、皮下、肺部、經皮、肌內、鼻內、口腔、舌下、或栓劑給予的製劑。在一些實施方式中，腸胃 外給予細胞群。如本文所用，術語「腸胃外」包括靜脈內、肌內、皮下、直腸、陰道、和腹膜內給予。在一些實施方式中，利用周邊全身性遞送，藉由靜脈內注射、腹膜內注射、或皮下注射將細胞給予對象。在一些實施方式中，組合物作為無菌液體製劑提供，例如等滲水溶液、懸浮液、乳液、分散體、或粘性組合物，其在某些方面可緩衝至選定的pH值。液體製劑通常比凝膠、其它粘性組合物和固體組合物更容易製備。另外，液體組合物更便於給予，尤其是藉由注射。另一方面，粘性組合物可在適當的粘度範圍內配製以提供與特定組織的較長接觸時間。液體組合物或粘性組合物可包含載體，其可以是溶劑或分散介質，溶劑或分散介質含有，例如，水、鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液體聚乙二醇)及其合適的混合物。
無菌可注射溶液可藉由將細胞併入溶劑中製備，諸如與合適的載體、稀釋劑或賦形劑(如無菌水、生理鹽水、葡萄糖、右旋糖等)混合。組合物可包含輔助物質，如潤濕劑、分散劑或乳化劑(例如，甲基纖維素)、pH緩衝劑、凝膠或粘性增強添加劑、防腐劑、調味劑、及/或色素，這取決於給予途徑和所期望的製劑。在某些方面可以參考標準文本來製備合適的製劑。
可以添加各種增強組合物的穩定性和無菌性的添加劑，包括抗菌防腐劑、抗氧化劑、螯合劑、和緩沖劑。各種抗菌劑和抗真菌劑，例如，對羥基苯甲酸酯類、氯丁醇、苯酚和山梨酸可以確保對微生物作用的預防。藉由使用延遲吸收的試劑(例如，單硬脂酸鋁和明膠)可以延長可注射的藥物形式的吸收。
待用於體內給予的製劑通常是無菌的。無菌性可以很容易地實現，例如藉由無菌過濾膜來過濾。
本文提到或引用的文章、專利和專利申請以及所有其它文件和可以電子方式獲得的信息的內容特此藉由引用以其整體併入，其程度與所指示藉由引用將每一個獨立的出版物具體且獨立地併入一樣。申請人保留將來自任何此類文章、專利、專利申請、或其它實體和電子文 件中的任何以及所有材料和信息實體併入本申請的權利。
雖然參考本發明的具體實施方式描述了本發明，但本領域技術人員應當理解，可以進行各種改變，並且可以在不脫離本發明的真正精神和範圍的情況下替代等效物。本領域技術人員將很容易地明顯看到，可以使用適合的等效物做出本文所述方法的其它合適的修改和調整，而不脫離本文公開的實施方式的範圍。另外，可以做出多種修改，以使特定情況、材料、物質組成、過程、過程的一個或多個步驟適合本發明的目標、精神和範圍。所有此類修改均意圖在所附權利要求的範圍內。現在已經詳細描述了某些實施方式，藉由參考以下實例，這些實施方式將更清楚地理解，將這些實例進行包括僅是出於說明目的而不意圖是限制性的。
實施例
現在參考以下實例來描述本發明。提供這些實施例僅出於說明目的，並且本發明不限於這些實施例，而是涵蓋因本文提供的教導而顯而易見的所有變型。
現對這些實驗所用的材料和方法進行描述。
RNA CAR構建物設計：由IDT合成特異性地靶向人類PSMA的4個人類scFv，1C3、2A10、2C6和2F5，作為gBlocks。採用重疊PCR將具有4-1BB-ζ(BBZ)的CAR進行組裝並選殖到RNA體外轉錄載體pD-A中。優化pD-A載體的T細胞轉染、CAR表現和RNA產生。在RNA IVT之前，藉由SpeI消化將四個人類PSMA CAR和一個小鼠PSMA CAR(J591)線性化。利用T7 mScript Standard mRNA Production System(Cellscript,Inc.,Madison,WI)生成加帽的/加尾的IVT RNA。藉由RNeasy Mini試劑盒(Qiagen,Inc.,Valencia,CA)純化IVT RNA。純化的RNA在1-2mg/mL無核糖核酸酶的水中洗脫，並在-80℃下儲存直至使用。RNA的完整性藉由260/280的吸光度和瓊脂糖凝膠的目測來確認。
Lenti CAR構建物設計：將所有PSMA-CAR次選殖到pTRPE Lenti載體中。然後將開關受體：PD1.CD28-F2A(SW)--PD1A132LPTM.CD28-F2A(SW*)，和顯性負性TGFRβII序列--dnTGFRβII-T2A(dn)次選殖到每個Lenti載體中，之後是人類PSMA scFv。
以下是Lenti載體所包含的序列的實施例：
1C3(SEQ ID NO：169)
Figure 110107653-A0202-12-0309-1489
2A10(SEQ ID NO：170)
Figure 110107653-A0202-12-0310-1490
2F5(SEQ ID NO：171)
Figure 110107653-A0202-12-0310-1491
Figure 110107653-A0202-12-0311-1493
2C6(SEQ ID NO：172)
Figure 110107653-A0202-12-0311-1492
Figure 110107653-A0202-12-0312-1073
PD1.CD28-F2A(SW)(SEQ ID NO：173)
Figure 110107653-A0202-12-0312-1074
Figure 110107653-A0202-12-0313-1075
PD1 A132L -PTM.CD28-F2A(SW*)(SEQ ID NO：174)
Figure 110107653-A0202-12-0313-1076
dnTGFRβII-T2A(dn)(SEQ ID NO：175)
Figure 110107653-A0202-12-0313-1077
Figure 110107653-A0202-12-0314-1078
轉導方案：將從Human Immunology Core獲得的本體(Bulk)T細胞(CD4和CD8)稀釋至106個細胞/mL，並用CD3/28珠子(T細胞擴大器，Invitrogen)以1：3的細胞：珠子比來刺激。在刺激後第1天利用3：1的MOI進行包裝的慢病毒載體的轉導，並允許其在37℃/5% CO2培養箱中擴大。
轉導效力：藉由流式細胞術，使用生物素-SP-AffiniPure山羊抗小鼠IgG(Cat#：115-065-072,Jackson ImmunoResearch Labs)或生物素-SP-AffiniPure兔子抗人IgG(Cat#：309-065-082,Jackson ImmunoResearch Labs)，之後是鏈黴親和素APC(Cat#：17-4317-82,eBioscience)或鏈黴親和素PE(Cat#：554061,BD Pharmingen)來評價CAR轉導效力。使用APC抗人CD279(PD-1)抗體(Cat#：329908,BioLegend)和人類TGF-β RII APC綴合抗體(Catalog # FAB241A,R&D systems)檢查開關受體或顯性陰性 TGFRβII部分。
T細胞擴大：在刺激後第3天開始，細胞每2天得以飼喂並分裂。在第4天對T細胞去珠(de-beaded)，並在第10天冷凍以備日後使用。
RNA電穿孔：使用BTX830，在500V和700μs下用10或20μg IVT PSMA RNA CAR對靜息T細胞電穿孔。使用BTX830，在300V和500μs下用5μg或15μg PSMA IVT RNA對Nalm6.CBG或K562細胞電穿孔。使用BTX830，在300V和500μs下用0.5μg、2μg或5μg PDL1 IVT RNA對PC3.PSMA細胞電穿孔。電穿孔後，立即將細胞置於37℃和5% CO2的預熱培養基中。18hr後，用APC抗人PSMA(FOLH1)抗體(Cat#：342507,BioLegend))或APC抗人CD274(PDL-1或B7-H1)抗體(Cat#：17-5983-42,BD Biosciences)PSMA或PDL1電穿孔的腫瘤細胞染色，並藉由流式細胞術分析。
細胞計數：在擴大-靜息週期過程中的各種時間點，將細胞輕柔地混合，並從已知培養體積中收集40μL整分試樣的細胞，並將其置於accuvettes(Beckman Coulter)中，其中有20mL Isoton II稀釋緩衝液，用於根據CCI實驗室SOP使用Coulter Multisizer 3(Beckman Coulter)進行計數。這些試驗測定了細胞濃度、總細胞數、生長速率和細胞體積，並用於計算稀釋體積和確定何時使細胞靜息而進行冷凍。
定量PCR：將原代細胞或腫瘤細胞系裂解並藉由QIA撕碎機(Cat#79656)。根據製造商的方案，藉由RNeasy Mini試劑盒(Cat#74104)提取總RNA。進行逆轉錄(Cat#：11904-018,Invitrogen)以獲得cDNA。用對PSMA有特異性的引子：(正向引子：AGGAAGTCTCAAAGTGCCCT(SEQ ID NO：176)，反向引子：GAACAACAGCTGCTCCACTC(SEQ ID NO：177))或對GAPDH有特異性的引子：(正向引子：GCTACACTGAGCACCAGGTGGTCTC (SEQ ID NO：178)，反向引子：CCCAGCAGTGAGGGTCTCTCTCTTC(SEQ ID NO：179))對cDNA進行定量PCR。
針對IL-2和IFN-γ的ELISA：將T細胞或目標細胞洗滌並以1x106個細胞/mL懸浮在R10培養基中。將各個細胞系的大約0.1mL添加到96孔板(Corning)的孔中，並在37℃下孵育18至20小時。收集上清液並進行ELISA。
CD107a測定：在100μL R10培養基中製備E：T比為1：2(5×104個效應物：1×105個目標)的細胞，並將其鋪板於96孔板中。加入10μL藻紅蛋白標記的抗CD107a抗體，並將孔板在37℃下孵育1小時。加入Golgi Stop(3ml R10培養基中2ul Golgi Stop,10ul/孔；BD Biosciences,51-2092KZ)，並將孔板再孵育2.5小時。然後加入2μL FITC-抗CD8(Cat#：551347,BD Pharmingen)和2μL APC-抗CD3(Cat#：555342,BD Pharmingen)，並在37℃下孵育30min。孵育後用FACS緩衝液洗滌樣品，並藉由流式細胞術分析。
基於螢光素酶的CTL測定：以1×105個細胞/mL使Nalm6-CBG、PC3-CBG、PC3.PSMA-CBG腫瘤細胞重懸於R10培養基中，並在37℃下與不同比(例如，10：1、5：1、2.5等)的T細胞孵育18hr。加入等體積的底物，並立即測定發光。結果報告為在T細胞不存在，僅有腫瘤的情況下孔中基於螢光素酶活性的百分比殺傷(%殺傷=100-((來自具有效應物與目標細胞共培養的孔的RLU)/(來自具有目標細胞的孔的RLU)×100)。
PC3.PSMA腫瘤模型：對小鼠注射(i.v.)轉導有叩頭蟲的2E6 PC3.PSMA.7SC細胞，並在28天后對攜帶腫瘤的小鼠注射(i.v.)2E6 PSMA CAR-T陽性轉導的T細胞。在多個時間點進行生物發光成像(BLI)。
現在描述實驗的結果。
實施例1：人類RNA PSMA CAR具有與小鼠RNA PSMA CAR，即 J591等同的抗腫瘤活性
使用四個scFv序列，1C3(SEQ ID NO：169)、2A10(SEQ ID NO：170)、2C6(SEQ ID NO：172)和2F5(SEQ ID NO：171)(來自美國專利申請US 2009/0297438 A1，其藉由引用以其整體併入本文)中的一個構建靶向PSMA的四個人類RNA CAR。將scFv連接到CD8跨膜結構域和4-1BB和CD3 ζ細胞內信號傳導結構域。在瓊脂糖凝膠上將純化的RNA可視化(圖1A)，並將其電穿孔到靜息的人類原代T細胞中。在測試條件下，所有的CAR都有幾乎100%的CAR表現。10ug IVT RNA CAR，無論是人類PSMA CAR還是小鼠PSMA CAR，都達到了CAR表現的最大平均螢光強度(MFI)；因此，10ug IVT RNA用於進一步的實驗(圖1B)。CAR表現在不同的人類CAR中存在差異，CAR表現的最高MFI為1C3.BBZ。小鼠J591 CAR表現的MFI是1C3.BBZ的4倍；然而，由於抗體源的種屬不同，10ug小鼠J591 RNA CAR也用於進一步的實驗。
將全長PSMA選殖到PD-A載體中以供最佳的RNA表現。在瓊脂糖凝膠上將純化的RNA可視化(圖1A)，並將其電穿孔到Nalm6.CBG或K562腫瘤細胞中，並藉由流式細胞術分析PSMA的表現(圖1C)。分別用15ug和5ug的PSMA RNA對Nalm6.CBG和K562腫瘤細胞進行進一步的實驗。先前構建了PSMA表現減弱(37.5%)的PC3.PSMA.PSCA.CBG腫瘤細胞(圖1C)。對PC3.PSMA.CBG腫瘤細胞進行限度稀釋，並將7個單細胞選殖分離並組合成新的細胞系，PC3.PSMA.7SC.CBG(圖1D)。
將用PSMA RNA電穿孔的Nalm6.CBG或K562、PC3或PC3.PSMA.PSCA.CBG腫瘤細胞與各種PSMA RNA CAR共培養。進行CD107a測定、基於螢光素酶的CTL測定和ELISA測定以確定四個新型人類CAR的功能性。當與PSMA陽性細胞共培養時，所有四個人類PSMA CAR都具有與小鼠PSMA CAR，即J591等同的脫粒活性(圖2A)。然而，四分之三的人類PSMA CAR發揮出比J591 CAR 對PC3細胞更高的非特異性活化(圖2A)。與J591 CAR相比，所有四個人類CAR都具有對PSMA陽性細胞相當的細胞毒性和抗腫瘤活性(圖2B和圖2C)。對於1C3.BBZ、2A10.BBZ和2F5.BBZ CAR來說，細胞因子的產生具有PSMA目標特異性(圖2C)。
實施例2：人類Lenti PSMA CAR特異性地靶向PSMA陽性細胞
將4個人類PSMA CAR次選殖到pTRPE Lenti載體中。轉導有人類PSMA CAR的原代人類T細胞具有不同的CAR表現水平：1C3.BBZ為40%，2A10.BBZ為66%，2C6.BBZ為50%，以及2F5.BBZ為61%(圖3A)。顯性負性TGFRβII序列藉由T2A序列與小鼠J591.BBZ CAR連接(dnTGFRβII-J591.BBZ)。用PSMA RNA電穿孔的Nalm6.CBG、PC3或PC3.PSMA.CBG細胞與各種PSMA Lenti CAR共培養。進行CD107a測定、基於螢光素酶的CTL測定和ELISA測定以確定四個新型人類PSMA Lenti CAR的功能性，並且與小鼠J591 CAR相比，1C3.BBZ、2A10.BBZ和2F5.BBZ在脫粒測定和基於螢光素酶的殺傷測定中發揮出與dnTGFRβII-J591相似的抗腫瘤活性(圖3B和圖3C)。就細胞因子的產生而言，所有四個人類PSMA Lenti CAR都引起特異性IL-2和INF-γ的產生，但在人類CAR中，量有所不同(圖3D)。
實施例3：連接開關受體或顯性負性-TGFRβII的人類Lenti CAR的構建
設計包含PD1的截短細胞外結構域和CD28的跨膜結構域與細胞質信號傳導結構域的開關受體(PD1.CD28)，並經由T2A序列將其與各個人類PSMA CAR連接。PD1上的132位(小鼠是99位)丙胺酸點突變為亮胺酸增加了其與PDL1的親和力兩倍(Zhang等人Immunity 20,337-347,2004)。因此，將第二種版本的開關受體，「PD1A132LPTM.CD28」(具有PD1的截短細胞外結構域與跨膜結構 域和CD28的細胞質信號傳導結構域)與各個人類PSMA CAR連接。也將顯性負性TGFRβII序列次選殖到各個人類PSMA CAR。進行流式細胞術以檢查各個開關受體-CAR(圖4A)和dnTGFRβII CAR(圖4B)的轉導效率。所有轉導開關受體-CAR的T細胞都觀察到了不同的CAR/PD1雙陽性群體。人類PSMA Lenti CAR與其兩種開關受體對應物之間的轉導效率相似(圖4A)。每個2C6 CAR都具有最低的轉導效率。不存在單獨的dnTGFRβII群體，但每個連接了dnTGFRβII的人類PSMA CAR都觀察到了明顯的移位(圖4B)。
為了檢查開關受體的功能性，將各種量的PDL1 RNA(0.5μg、2μg和5μg)電穿孔到PC3.PSMA細胞中(圖4C)。將用5ug PDL1 RNA電穿孔的PC3.PSMA細胞與各個PSMA CAR共培養。dnTGFRβII-J591.BBZ在共培養實驗前被標準化為50%的轉導效率。當與PSMA陽性細胞共培養時，四分之三的人類PSMA CAR及其開關受體或dnTGFRβII對應物顯示出與dnTGFRβII-J591.BBZ CAR相當的脫粒活性(圖4D、圖4E和圖4F)。2C6.BBZ CAR及其相關的對應物顯示出較低的脫粒活性，這可能是較低的轉導效率所致(圖4G)。所有四個人類PSMA CAR及其開關受體或dnTGFRβII對應物都對PC3.PSMA細胞顯示出相似的細胞毒性(圖4H)。所有人類PSMA CAR都引起與dnTGFRβII-J591.BBZ CAR相當的量的細胞因子(圖4I)。當與PDL1電穿孔的PC3.PSMA細胞共培養時，每個開關受體CAR分泌的IL-2幾乎是其非開關受體或dnTGFRβII CAR對應物的兩倍(圖4I)。
實施例4：PC3.PSMA.7SC異種移植模型
選擇以下6個人類PSMA CAR用於PC3.PSMA.7SC小鼠異種移植模型：1C3.BBZ、PD1CD28.1C3.BBZ、2A10.BBZ、PD1CD28.2A10.BBZ、dnTGFRβII-2A10.BBZ和dnTGFRβII-J591.BBZ。藉由流式細胞術測試CAR表現(圖5A和圖5B)。小鼠 J591.BBZ Lenti CAR包括在功能測試中。所有測試的PSMA CAR在CD107a測定中顯示出相似的脫粒活性(圖5C和圖5D)，和在基於螢光素酶的CTL測定中顯示出相似的殺傷活性，其中2A10.BBZ最低，而dnTGFRβII-J591.BBZ最高(圖5E)。當與PDL1電穿孔的PC3.PSMA.7SC細胞共培養時，每個開關受體CAR分泌的IL-2幾乎是其非開關受體或dnTGFRβII CAR對應物的兩倍(圖5F)。
為了確保使用上述人類PSMA CAR的安全性，藉由定量PCR對一組原代人類細胞(表1)進行PSMA表現測試(圖5G)。藉由Nalm6.CBG標準化，所有測試的原代細胞都有各種PSMA表現水平，甚至對PSMA RNA CAR只有有限反應性(圖2A)但對PSMA Lenti CAR的反應性並非有限(圖5H)的PC3細胞也是如此，(PC3.PSMA的PSMA表現比PC3細胞高1800倍)。將HREpC、HSAEpC和HPMEC人類原代與上述CAR共培養。進行CD107a測定和ELISA測定。當與HPMEC共培養時，所有測試的PSMA CAR都具有最低可檢測到的脫粒活性(圖5H和圖5I)。當與HPMEC共培養時，與1C3.BBZ相比，PD1CD28.1C3.BBZ引發IL-2增加(圖5J)。即使原代人類細胞，具體為HPMEC所引起的細胞因子的水平在與PC3.PSMA.7SC所引起的細胞因子的水平相比時可忽略不計(圖5J與圖5F相比)。
Figure 110107653-A0202-12-0320-1079
Figure 110107653-A0202-12-0321-1080
體內NSG小鼠實驗設計為7組(每組5只小鼠)以測試上述6個PSMA CAR和1個未轉導的對照組。將轉導有叩頭蟲綠的2E6 PC3.PSMA.7SC細胞注射到小鼠中(i.v.)，並在28天后將2E6 CAR陽性轉導的T細胞注射到攜帶腫瘤的小鼠中(i.v.)。在腫瘤注射後的不同時間點：第27、34、42、49天進行生物發光成像(BLI)(圖5K和圖5L)。在不受任何理論約束的情況下，本實驗結果表明，所有PSMA CAR都具有與dnTGFRβII.J591.BBZ相當的抗腫瘤活性。
圖6顯示了dnTGFRII-T2A PSMA-CAR構建物的不同結構域和pTRPE dnTGFRII-T2A PSMA CAR載體圖。
實施例5：PSMA CAR-T細胞的體內腫瘤控制
轉導方案：將從Human Immunology Core獲得的本體T細胞(CD4和CD8)稀釋至106個細胞/mL，並用CD3/28珠子(T細胞擴大器，Invitrogen)以1：3的細胞：珠子比來刺激。在刺激後第1天利用3：1的MOI進行包裝的慢病毒載體的轉導，並允許其在37℃/5% CO2培養箱中擴大。
轉導效力：藉由流式細胞術，使用PE抗人TCR Vβ8抗體(Cat#：348104,BioLegend)和APC抗人CD279(PD-1)抗體(Cat#：329908,BioLegend)來評價CAR轉導效力。
T細胞擴大：在刺激後第3天開始，細胞每2天得以飼喂並分裂。在第3天或第4天對T細胞去珠，並在第12天冷凍以備日後使用。
細胞計數：在擴大-靜息週期過程中的各種時間點，將細胞輕柔地混合，並從已知培養體積中收集40μL整分試樣的細胞，並將其置於accuvettes(Beekman Coulter)中，其中有20mL Isoton II 稀釋緩衝液，用於根據CCI實驗室SOP使用Coulter Multisizer 3(Beekman Coulter)進行計數。這些試驗測定了細胞濃度、總細胞數、生長速率和細胞體積，並用於計算稀釋體積和確定何時使細胞靜息而進行冷凍。
針對IL-2和IFNγ的ELISA：將T細胞洗滌並以1x106個細胞/mL懸浮在R10培養基中。將各個細胞系的大約0.1mL添加到96孔板(Corning)的孔中，並在37℃下孵育18至20小時。收集上清液並進行ELISA。
CD107a測定：於96孔板中在160μL R/10培養基中以1：1(105個效應物：105個目標)的效應物：目標(E：T)細胞比將細胞鋪板。加入抗CD107a抗體並在37℃下與細胞孵育1小時，之後添加Golgi Stop並再孵育2.5小時。加入抗CD8抗體和抗CD3抗體，並在37℃下孵育30min。孵育後，洗滌樣品一次，並用BD Accuri C6使其經歷流式細胞術。用FlowJo軟件分析數據。
PC3-PMSA腫瘤模型：對小鼠皮下(s.c.)注射1E6 PC3-PMSA-CBG細胞，並在21天后對攜帶腫瘤的小鼠靜脈內(i.v.)注射慢病毒轉導的T細胞。在多個時間點進行生物發光成像(BLI)和腫瘤測量。
結果：產生表2中列出的序列並測試其在體內控制腫瘤的能力。
Figure 110107653-A0202-12-0322-1081
Figure 110107653-A0202-12-0323-1082
Figure 110107653-A0202-12-0324-1083
構建了具有ICOS或ICOS.YMNM信號傳導結構域的PSMA CAR和CAR+PD1(或Tim3)開關受體的組合，並將其選殖到慢病毒載體中(序列參見表2)。對於大多數CAR構建物而言，經轉導的T細胞中CAR表現水平是相當的(圖7)，並且開關受體適當表現(圖8)。當用PSMA陽性細胞系PC3.PSMA或PC3.PSMA.PD-L1刺激並檢查CD107a上調時，具有ICOS.YMNM信號傳導結構域(ICOS ymnm)的PSMA CAR顯示出明顯高於野生型ICOS(ICOS)或4-1BB(41BB)CAR(圖9)的CD107a表現。關於ICOS和ICOS.YMNM PSMA CAR兩者的顆粒酶B表現與4-1BB PSMA CAR相似(圖10)。當用表現PD-L1的PC3.PSMA刺激時，與包含ICOS、ICOS.YMNM、或4-1BB ICOS的PSMA CAR共轉導的PD1開關受體的細胞因子產生(IL-2和IFN-γ)明顯更高(圖11A和11B)。
圖12顯示了攜帶PC3-PSMA.CBG誘導的腫瘤的NSG小鼠生物發光成像的定量，該誘導的腫瘤如所指示用轉導有CAR的T細胞治療長達86天(圖12A)，和長達151天(圖12B)。圖13顯示了攜帶PC3-PSMA.CBG誘導的腫瘤的NSG小鼠的腫瘤大小，該誘導的腫瘤如所指示用轉導有CAR的T細胞治療長達164天。如圖所示，ICOS(2F5.ICOSz)和ICOS.YMNM PSMA CAR(2F5.ICOSzYMNM)兩者都顯示出比4-1BB PSMA CAR(2F5.BBZ) 更差的腫瘤控制。PD1-CD28開關受體藉由4-1BB共刺激結構域(PD1.CD28.2F5.BBZ)改進了PSMA CAR，但對於ICOS(PD1CD28.2F5ICOSz)或ICOS.YMNM(PD1CD28.2F5ICOSzYMNM)PSMA CAR則不行。PD1.CD28.2F5.BBZ和PD1CD28.2F5ICOSzYMNM兩者都顯示出比4-1BB PMSA CAR差的腫瘤控制。當這些基於ICOS的CAR與具有4-1BB信號傳導結構域的高親和力PD1開關受體(PD1*BB)共同遞送至T細胞時，腫瘤的控制效率可與4-1BB PMSA CAR一樣。如圖14A-14F中所示，經ICOS.YMNM CAR和具有4-1BB信號傳導結構域的PD1開關受體(PD1*BB.2F5ICOSzYMNM)共同遞送的T細胞消除了腫瘤。圖14G提供了以腫瘤控制能力排序的T細胞的列表。
實施例7：PSMA CAR-T細胞共表現PD1-CD28開關或TGFβ受體II-CD28開關的雙特異性抗體
設計了五種雙特異性抗體，這些雙特異性抗體使用可結合PD-L1(10A5、13G4和1B12，參見，例如，PCT公開號WO2007005874A2)或TGFβ受體II(TGFbRII-1和TGFbRII-3(TGFb1和TGFb3，參見，例如，美國專利號8,147,834)的scFv和抗CD28 scFv(1412，參見，例如，美國專利號7,585,960)，並藉由PCR合成基因。將序列驗證後的DNA選殖到基於PGEM.64A的RNA體外轉錄載體中，產生pGEM.aTGFbR-1-1412和pGEM.aTGFbR-3-1412。參見，例如，PCT公開號WO2016122738A1。
產生共表現選自上述的雙特異性抗體的PSMA CAR-T細胞。
實施例8：臨床CART-PSMA-TGFβRDN自體T細胞的製備和給予
根據臨床細胞和疫苗生產中心(Clinical Cell and Vaccine Production Facility)(CVPF)的標準操作規程(SOP)， 如下描述了CART-PSMA-TGFβRDN試驗細胞產品製備、最終配製、測試和標記。CVPF是賓夕法尼亞大學病理和實驗室醫學部輸血醫學和治療病理系的一個單位。在該系內，除了CVPF和單採血液成分術收集設施外，還有單獨的造血幹細胞加工實驗室，負責骨髓和周邊血幹細胞產品，主要致力於支持臨床造血幹細胞移植服務。CVPF是一個註冊的HCT中心，並由細胞療法認證基金會(FACT)認可。
Dynabeads CD3/C28 CTSTM(以前稱為ClinExVivo)珠用於T細胞活化和擴大。
CART-PSMA-TGFβRDN試驗產品的製造是從一種白細胞提取法產物開始的。根據基於Beckman Coulter Multisizer和BD FACS Calibur裝置評估的白細胞提取法產物的組成，進行以下操作：在TerumoBCT Elutra上藉由逆流離心淘析耗竭單核細胞，TerumoBCT Elutra採用單次使用(single use)的封閉系統一次性裝置(set)；利用半自動封閉系統裝置Haemonetics CellSaver 5的洗滌步驟；及/或對PBMC的淡黃色部分進行Ficoll分離。在第0天，用Dynabeads CD3/CD28 CTS珠活化T淋巴細胞來起始CART-PSMATGFβRDN的製造工藝。在第1天，以總的最終MOI添加PSMA-TGFbRIIDN CAR LV載體。在第1天和第3天之間發生了載體轉導。在第3天，洗滌細胞並更換培養基。在GE Wave Bioreactor System中使培養物繼續擴大。在培養的最後一天，收集細胞並使用Cell Saver濃縮。在收集前，將細胞產物放置在Baxter MaxSep上去除Dynabeads CD3/CD28 CTS珠。在去除珠後，利用Haemonetics CellSaver 5洗滌細胞擴大物(cell expansion)以去除殘留的載體、病毒顆粒和細胞碎片。使CART-PSMA-TGFβRDN細胞重懸於含有31.25%的勃脈力-A(Plasmalyte-A)、31.25%的右旋糖5%、0.45%的NaCl、1%的右旋糖酐40與5%的右旋糖、5%的人類血清白蛋白、和7.5%的DMSO的冷凍保存介質中。使用受控速率冷凍機，將細胞冷凍在Cryostore乙烯-醋酸乙烯酯(EVA)(OriGen Biomedical)或同等透明袋中。
冷凍保存的CART-PSMA-TGFβRDN：每個輸注袋含有約10-50mL的細胞。冷凍保存的細胞也以與輸液劑量相同濃度的少量等分試樣保留並用作前哨小瓶(sentinel vials)，以在輸注前進行成活力和內毒素測試，以及用於穩定性測試。
白細胞提取法收集和細胞分離/當集：藉由賓夕法尼亞大學醫院(HUP)的單採血液成分術單位(Apheresis Unit)的白細胞提取法收集，獲得自體周邊血淋巴細胞。進入研究前從患者收集的冷凍保存的歷史單採血液成分術產物可用於CART-PSMA-TGFβRDN細胞的製造。如果使用，則樣品必須在適當認證的單採血液成分術中心收集，而產物必須滿足足夠的單核細胞產量。
在COBE Spectra Apheresis System或同等系統上處理約10-15L的血液，以獲得約5x109個白細胞的群體。除了方案中提供的篩選測試要求外，所有單採血液成分術供體的血液都接受了由美國紅十字會國家檢測實驗室進行的傳染病測試。
單採血液成分術產物用絕緣容器運輸至CVPF，並在接收時記錄溫度。移出樣品進行細菌和真菌培養，流式細胞術實時分型，並用於調查和相關研究目的。單採血液成分術產物經冷凍保存或淘洗處理。淘洗或細胞洗滌後，在Coulter Multisizer M3/M4上測定細胞數，並藉由台盼藍染料排阻試驗測定細胞成活力。淘洗產物被冷凍保存或進行進一步處理。冷凍保存的單採血液成分術產物或淘洗產物在培養前解凍和洗滌，以去除冷凍保存介質。然後通過1)洗滌和接種淘洗的淋巴細胞，2)用CD3/CD28珠進行陽性選擇，或3)基於Ficoll的梯度分離進一步選擇T-細胞來處理這些產物。
培養超始和擴大：在靜態組織培養瓶中，用Dynabeads CD3/CD28 CTS對在補充有5%人類AB血清、2mM L-GlutaMAX、20mM Hepes、1mM丙酮酸鈉、1% MEM維生素基本混合物(Vitamin Essential Mixture)、10mM N-乙醯半胱胺酸、和100IU/ml IL-2的XVIVO-15培養基(改良的X-VIVO 15培養基)中細胞範圍在8 x 105- 1 x 106個的經富集的淋巴細胞進行刺激。以3：1的珠：細胞比添加珠。在培養的第5天，如果獲得了可接受的細胞數，則將細胞轉移到WAVE 2/10EH生物反應器中以擴大至適當的細胞數，以便收集、電穿孔、取樣和最終配製。在培養的最後一天，收集細胞並用Cell Saver Wash系統濃縮。在收集前將細胞產物放置在Baxter MaxSep上去除抗CD3/CD28磁性微珠。收集後，以2 x 106個細胞/mL補充有5%人類AB血清的X-VIVO培養基使擴大的T細胞重懸。將細胞置於37℃培養箱中過夜。
CART-PSMA-TGFBRDN劑量配方：一個群組的劑量配方以1-3x107/m2劑量的CART-PSMA-TGFBRDN細胞起始，而其它群組的劑量配方以1-3x108/m2劑量的CART-PSMA-TGFBRDN細胞起始。劑量基於抗PSMA CAR的表現。總劑量被配製成單次劑量。
最終配製：孵育後，在去除所有釋放測試樣品和存檔品(archives)後，將細胞重懸於含有31.25%的勃脈力-A、NaCl(0.45%)中31.25%的右旋糖(5%)、7.5%的DMSO、5%的人類血清白蛋白、和1%的低分子量右旋糖酐冷凍保存介質中。
產品給予：
細胞解凍：由訓練有素的人員使用水浴裝置或相當的裝置在36℃至38℃下在CVPF或床邊解凍細胞。在容器連接到I.V.管時，容器中不應留有冷凍的團塊。如果CART-PSMA-TGFβRDN細胞產品出現破損或漏袋，或受損，則不輸注，並返回CVPF。
給予：輸注發生在CTRC或賓夕法尼亞大學醫院其它地方的隔離室，對免疫抑制患者採取預防措施。輸注前，兩名個人在對象在場的情況下獨立驗證輸注產品標簽上的信息，並確認信息與參與者正確匹配。解凍後約30分鐘內輸注細胞。CART細胞靜脈內輸注到18 gauge靜脈內導管中，通過周邊靜脈(優選)或中心靜脈。使用宏滴靜脈內管材，經由帶有三通旋塞的無乳膠Y型血型裝置，以約10mL/min的速率藉由重力(即，不使用輸注泵)輸注CART細胞。去白細胞過濾 器(leukoreduction filter)不用於CART細胞產品的輸注。如果對象對輸注有過敏反應、嚴重低血壓危象或任何其它反應，則在輸注過程中可使用急救醫療設備(即，急救手推車)。在輸注前和輸注後測量生命體征(體溫、呼吸速率、脈搏、血壓、和脈搏血氧飽和度)。如果對象的生命體征不滿意且不穩定，則最少每小時或根據臨床指示持續監測生命體征，直至穩定。在管理其護理的醫師確定對象處於令人滿意的狀況後，讓對象出院。
實施例9：CART-PSMA-TGFβRDN臨床試驗設計
該方案測試了兩種劑量水平的CART-PSMA-TGFβRDN細胞的安全性，僅僅靜脈內給予或在CART-PSMA-TGFβRDN細胞之前的三天用中等劑量環磷醯胺進行淋巴細胞耗竭後給予。劑量遞增遵循3+3設計。向著抗PSMA CAR與4-1BB和TCRζ的信號傳導結構域融合的PSMA蛋白，對CART-PSMA-TGFβRDN細胞進行永久性修飾。研究人群包括患有去勢抵抗性前列腺癌的患者，放射照相表明淋巴結轉移、內臟轉移、或骨轉移。所有患者在用了至少一種標準17α裂解酶抑制劑或第二代抗雄激素療法後都必須有進展。
第一位患者的給藥日期是2017年8月31日。
作為知情同意書的一部分，對象被要求允許對他們的腫瘤進行PSMA測試，作為合格標準之一。優選在新鮮腫瘤活檢上評估PSMA的表現；然而，如果活檢不可行或在臨床上不合適，則使用最近轉移組織活檢(如果是在過去90天內獲得的話)的存檔組織來確定合格性。
經確認
Figure 110107653-A0202-12-0329-802
10%的腫瘤細胞有PSMA表現且符合所有其它入選標準的患者有資格參加。
第1群組對象(N=3或6)在第0天接受單次劑量1-3 x 107個慢病毒轉導的CART-PSMA-TGFβRDN細胞/m2，無任何調節性化療方案。如果所製造的CAR T細胞的數量不符合預先規定的1 x 107 個細胞/m2的最小輸注劑量，則不給予該劑量，並在研究中將對象替換。如果發生1例DLT/3名對象，則該研究將在此劑量水平下再招收3名對象。如果發生0例DLT/3名對象或發生1例DLT/6名對象，則該研究推進到第2群組。如果在1-3 x 107個細胞/m2的劑量下發生2例DLT/3名對象，則停止該群組的招收，並將劑量降低10倍至1-3 x 106個細胞/m2(群組-1)。在這種情況下，多達6名對象被招收到群組-1中。
第2群組對象(N=3或6)在第0天接受單劑量1-3 x 108個慢病毒轉導的CART-PSMA-TGFβRDN細胞/m2，無任何調節性化療方案。如果所製造的CAR T細胞的數量不符合方案規定的最小值--1 x 108個細胞/m2，但滿足最低劑量要求--至少1 x 107個細胞/m2，則對象接受該劑量，並且不包括在第2群組的DLT評估中。此對象將被替換，以進行此劑量下的DLT評估。如果所製造的CAR T細胞的數量不符合關於第1群組概述的預先規定的最低輸注劑量，則不給予劑量，並在研究中將對象替換。如果發生1例DLT/3名對象，則該研究將在此劑量水平下再招收3名對象。如果發生0例DLT/3名對象或發生1例DLT/6名對象，則該研究推進到第3群組。如果發生2例DLT/3名對象，則停止該研究並宣佈最大耐受劑量(MTD)。
第1群組和第2群組用於確定CART-PSMA-TGFβRDN細胞的MTD。MTD被定義為發生0/3或1/6 DLT的最高劑量。
第3群組對象(N=3或6)在第0天接受MTD下慢病毒轉導的CART-PSMA-TGFβRDN細胞的單次輸注，在此之前，在CAR T細胞之前長達4天(第3±1天)給予單次劑量1.0g/m2的環磷醯胺。如果發生0例DLT/3名對象，該研究將另外招收3名患者以確認耐受性。如果發生1例DLT/3名對象，該研究在此劑量水平下再招收3名對象。如果最初的三名對象中有兩名經歷了DLT，則再增加三名對象，在CAR T細胞之前長達4天(第3天±1天)的淋巴細胞耗竭化療中給予減少至500mg/m2的劑量。
對象是連續招收的。輸注是交錯的，以便對DLT進行群組進展、擴展、或劑量降低的評估。每個群組中前2名對象的輸注錯開28天；第2名對象直到第一名對象輸注後28天才輸注。每個群組中的第2名和第3名對象平行地接受輸注和跟蹤，但僅在該群組中第1名對象實現28天訪視而未出現DLT之後。
DLT被定義為任何新的3級以上的至少可能與T細胞輸注後28天內發生的T細胞方案有關的不良事件。如果前3名對象在同一劑量水平下出現1例DLT，則該研究將在該劑量水平下再招收3名對象。如果發生2例DLT/3名對象，則研究停止並宣佈最大耐受劑量，但發生劑量降低10倍的第1群組除外。如果在某一劑量水平下0例DLT/3名對象或1例DLT/6名對象，則研究將推進到下一群組。對於第3群組，如果最初的三名對象中有兩名經歷了DLT，則再增加三名對象，在CAR T細胞之前長達4天(第3天±1天)的淋巴細胞耗竭化療中給予減少至500mg/m2的劑量。否則，如果第3群組中出現0-1例DLT/3名對象，則研究再招收3名患者以確認耐受性。
然後對對象進行安全性評估和研究評估。對象在第1天、第3天、第7天、第10天、第14天、第21天和第28天返回進行研究追蹤以評估安全性。在第28(±5)天，藉由CT胸/腹/骨盆、骨掃描、和血清PSA進行疾病分期。在第28天進行早期成像評估的原因是為了評估全身炎症的影響，並監測CART-PSMA-TGFβRDN細胞預期歸巢時的疾病狀態。在第3個月和第6個月進行重複疾病評估(包括成像)，並作為此後的護理標準。如果對象在第3個月及/或第6個月的4周內有相關的成像數據(CT腹/骨盆、MRI腹/骨盆、骨掃描)--作為其護理標準的一部分，則在第3個月及/或第6個月不進行重複。
不良事件報告從同意時開始，並一直持續到對象退出研究。在研究過程中，持續重新評估對象的急性毒性和累積毒性的證據。在中斷了最初的追蹤期後，對象從CART-PSMA-TGFβRDN輸注開始進入長達5年的長期追蹤。在長期追蹤期間，監測對象是否出現可能與 給予CART-PSMA-TGFβRDN細胞有關的延遲性不良事件。
在限定的時間點獲取周邊血樣品以監測對安全性和效力的度量。關於臨床適應症獲得的其它血液樣品和組織樣品(例如流體、組織活檢)也可送去進行研究分析。在獲得組織或體液的任何時候(例如，胸水或腹水的引流)，原本會被丟棄的流體樣品被用於研究目的。這些研究包括但不限於通過Q-PCR的CART-PSMA-TGFβRDN細胞的持久性，以及用基於Luminex的細胞因子和趨化因子組進行炎症標記物評估。
在發生意外AE的情況下，另外收集血液和組織進行研究分析，重點是評估意外事件與輸注的CART-PSMA-TGFβRDN細胞的潛在因果關係。供研究而收集的另外的樣品不超過3湯匙血液，一周兩次，並且每月一次組織樣品收集程序。
入選標準：
1.轉移性去勢抵抗性前列腺癌
2.對活檢組織免疫組織化學分析顯示
Figure 110107653-A0202-12-0332-803
10%的表現PSMA的腫瘤細胞
3.骨轉移性疾病及/或可測量的非骨轉移性疾病(結或內臟)的放射照相證據
4.患者年齡
Figure 110107653-A0202-12-0332-804
18歲
5.0-1的ECOG體力狀況(performance status)
6.充足的器官功能，其藉由以下定義：
a.血清肌酐
Figure 110107653-A0202-12-0332-805
1.5mg/dl或肌酐清除率
Figure 110107653-A0202-12-0332-806
60cc/min
b.血清總膽紅素<1.5x ULN
c.血清ALT/AST<2x ULN
7.在研究招收的4周內有充足的血液儲備，其藉由以下定義：
a.Hgb>10g/dl
b.PLT>100k/ul
c.ANC>1.5k/ul
注：對象不能依賴輸血
8.進行性去勢抵抗性前列腺腺癌的證據，其藉由以下定義：
a.在使用或不使用雄激素剝奪療法的情況下睾酮的去勢水平(<50ng/ml)，以及
b.在研究招收前12周內，以下進行性疾病度量之一的證據：
i.RECIST 1.1標準下的軟組織進展
ii.骨掃描發現2個或更多個新病灶的骨疾病進展(根據PCWG2標準)
iii.血清PSA至少增加25%，並且從最低點起絕對增加2ng/ml以上(根據PCWG2標準)
9.先前至少用一種標準17α裂解酶抑制劑或第二代抗雄激素療法治療轉移性去勢抵抗性前列腺癌
10.提供書面知情同意書
11.具有生殖能力的對象必須同意使用可接受的節育方法。
排除標準：
1.先前用免疫療法治療前列腺癌，包括癌症疫苗療法(如SipuleucelT、PROSTVAC)、免疫檢查點抑制劑、鐳-223和免疫連接物療法
2.過去5年內活動性的未治癒的非前列腺原發性惡性腫瘤的病史
3.需要長期使用全身皮質類固醇療法的對象
4.先前接受過>3次治療去勢抵抗性前列腺癌的療法的對象(不包括促黃體生成激素釋放激素激動劑或拮抗劑，或第一代抗雄激素療法)。這包括在非去勢抵抗性環境下接受泰索帝(Taxotere)的對象。
5.根據紐約心臟協會分類(New York Heart Association Classification)(見附件2)，具有III/IV級心血管無能的對象
6.有症狀的脊椎轉移影響脊髓功能的對象(由臨床病史、體檢、或MRI成像確定)
7.需要免疫抑制療法的活動性自身免疫疾病史
8.持續性或活動性感染的患者。
9.對研究產品賦形劑(人類血清白蛋白、DMSO、和右旋糖酐40)的過敏史或超敏史
10.活動性乙型肝炎、丙型肝炎或HIV感染。
實施例10：1期臨床安全性數據
截至2018年7月25日，共輸注了六名對象，並且兩名對象仍在研究中。第1群組中輸注三名對象，第2群組中輸注三名對象。因此，第2群組滿了(filled)。與第1群組相比，第2群組中的三名對象均經歷了細胞因子釋放綜合征(CRS)：兩名對象有3級CRS，一名對象有1級CRS，所有這些患者都在12小時CART細胞輸注內發展。這些毒性是按照方案/機構指南進行管理和解決的。因此，第2群組在沒有DLT的情況下完成。
研究中心啟動訪視(Site Initiation Visit)於2017年2月22日星期三舉行，而研究是在2017年3月8日啟動的。截至2018年7月25日，臨床現場准許了8名對象。8名准許的對象中，1名對象篩查失敗，1名對象在治療前退出，6名對象接受輸注。
表3顯示了篩查對象的人口統計資料的概要(N=8)。
表3：篩查對象的人口統計資料
Figure 110107653-A0202-12-0335-1085
N/A=不適用
*長期追蹤死亡。因此，該事件不符合PDAE的條件，且認定為與IP無關。
表4顯示了輸注對象的當前方案狀態的概要(N=6)。
Figure 110107653-A0202-12-0335-1084
Figure 110107653-A0202-12-0336-1086
表5顯示了輸注對象的偏差或例外(異常，exceptions)的概要(N=6)。
表5：輸注對象的偏差或例外
Figure 110107653-A0202-12-0337-1087
表6顯示了輸注日期和輸注對象中的劑量概要(N=6)。
表6：PSMA-TGFβRDN輸注日期和輸注對象中的劑量概要
Figure 110107653-A0202-12-0338-1088
表7是輸注對象的疾病反應的概要(N=6)。
Figure 110107653-A0202-12-0338-1089
Figure 110107653-A0202-12-0339-1090
NE=無法評價
PD=進行性疾病
SD=穩定的疾病
未決=對象還未達到該時間點
未評估=在該時間點未作出評價
N/A=不適用/對象在該時間點前中斷了最開始的追蹤
表8是輸注對象的血清PSA水平的概要(N=6)。
Figure 110107653-A0202-12-0339-1091
Figure 110107653-A0202-12-0340-1092
N/A=不適用
¥=對象於2017年11月1日進入LTFU；2017年11月2日抽取(drawn)第2個月的PSA
---=該對象無未排期數據
未決=對象還未達到該時間點
表9是顯示藉由qPCR的在輸注對象周邊血中作出標記(marking)的PSMA-TGFβRDN細胞的概要(N=6)。
Figure 110107653-A0202-12-0340-1093
Figure 110107653-A0202-12-0341-1094
ND=未檢測到
N/A=不適用-對象在該訪視前中斷了最開始的追蹤
未決=對象還未達到該時間點
未收集=未收集研究樣品以供分析
還未出結果=還未測試樣品
表10是顯示藉由qPCR的在輸注對象其它組織中作出標記的PSMA-TGFβRDN細胞的概要(N=6)。
Figure 110107653-A0202-12-0341-1095
Figure 110107653-A0202-12-0342-1096
FFPE=經福爾馬林固定，經石蠟包埋
BMBMX=骨髓活檢
BX=活檢
ND=未檢測到
表11是顯示藉由免疫組織化學測定的所招收對象的PSMA陽性腫瘤細胞百分比的概要(N=7)。
Figure 110107653-A0202-12-0342-1097
Figure 110107653-A0202-12-0343-1098
NA=未賦值
ND=未檢測到
實施例11：轉移性去勢抵抗性前列腺癌中PSMA定向的/TGFβ不敏感的CAR-T細胞的1期臨床試驗
背景：
CAR-T細胞過繼性免疫療法在癌症治療方面具有變革性的(transformative)潛力。這些療法在前列腺癌上取得成功的主要挑戰是免疫抑制微環境，包括在腫瘤浸潤後重新定向的T細胞所遇到的高水平TGFβ。重要的是，TGFβ的這些免疫抑制功能可以在T細胞中使用顯性負性TGFβ受體(TGFβRdn)而得到抑制，從而增強抗腫瘤免疫。在體內散播性腫瘤模型中，TGFβRdn在PSMA定向的CAR-T細胞上的共表現可導致T細胞增殖增加、細胞因子分泌增強、長期的持續性、和更大程度誘導腫瘤根除。適應性的腫瘤抗性的機制尚不清楚。
圖15顯示了CART-PSMA-TGFβRdn細胞在體內散播性腫瘤模型中的效力。圖15A是顯示在與表現PSMA的腫瘤細胞共培養並對其重複刺激的42天內，CART-PSMA-TGFβRdn細胞與CART-PSMA相比顯示出增強的抗原特異性增殖的圖。圖15B是顯示在體內，CART-PSMA-TGFβRdn細胞與CART-PSMA相比顯示出顯著增加的腫瘤減少(每週藉由BLI成像測量以評估腫瘤負荷)的圖。圖15C是顯示每週進行BLI評估的腫瘤位置和全身負荷的照片。圖15中使用的縮寫：Pbbz=CAR-T PSMA；dnTGFBR2-T2A-Pbbz=CART-PSMA-TGFβRdn；19bbz=抗CD19 CAR。
研究設計：
研究概述：啟動首次人體1期臨床試驗以評估慢病毒轉導的PSMA定向的/TGFβ不敏感的CAR-T細胞(CART-PSMA-TGFβRdn)在人體中對治療難治性轉移性去勢抵抗性前列腺癌(CRPC) 的安全性和初步效力(NCT03089203)。在初步劑量遞增群組中，患者在3+3設計中接受單次劑量：1-3 x 107個CART-PSMA-TGFβRdn細胞/m2(第1群組)或1-3 x 108個CART-PSMA-TGFβRdn細胞/m2(第2群組)而不進行淋巴細胞耗竭化療。在第3群組中，患者在使用環磷醯胺300mg/m2和氟達拉濱30mg/m2進行淋巴細胞耗竭化療3天后接受CART-PSMA-TGFβRdn細胞的最大耐受劑量(MTD)。所有經治療的患者接受基線轉移性腫瘤活檢，以及在輸注CAR-T細胞後第10天接受轉移性腫瘤活檢。
主要合格標準：轉移性CRPC，之前至少使用過一種第二代雄激素信號傳導抑制劑(阿比特龍或恩雜魯胺)治療；對轉移性組織活檢進行IHC，表現PSMA的腫瘤細胞
Figure 110107653-A0202-12-0344-807
10%；轉移性疾病(骨的或結的/內臟的)的放射照相證據；轉移性CRPC治療線
Figure 110107653-A0202-12-0344-808
4。
研究綱要： 圖16顯示了本臨床試驗中使用的研究綱要。
相關分析：在連續時間點對CART-PSMA-TGFβrdn DNA進行定量PCR，以評價CAR-T在周邊血中的擴大和持久性以及向目標組織的販運(trafficking)。藉由免疫因子和炎症因子的Luminex分析評價周邊血中CART-PSMA-TGFβRdn細胞的生物活性。在連續時間點收集循環腫瘤物質並與臨床反應關聯。
研究狀態和初步發現：6名患者接受了特定劑量水平的CART-PSMA-TGFβRdn細胞輸注(第1群組，N=3；第2群組，N=3)。所有CART-PSMA-TGFβRdn輸注產品均達到目標轉導效率。在初步劑量遞增中未觀察到劑量限制毒性。
藉由CART-PSMA-TGFβRdn DNA的qPCR，對CAR-T細胞動力學進行評估，顯示周邊血T細胞擴大(圖17)以及治療後腫瘤活檢中腫瘤組織的販運(表17)。
Figure 110107653-A0202-12-0344-1099
Figure 110107653-A0202-12-0345-1100
*拷貝數/ug gDNA
FFPE=經福爾馬林固定，經石蠟包埋
ND=未檢測到
在第2群組中，兩名患者出現預期的3級細胞因子釋放綜合征(CRS)，這是CAR-T療法生物活性的關鍵標誌，而一名患者出現3級CAR-T神經毒性，需要皮質類固醇。
炎症細胞因子(IL-6、IL-15、IL-2、IFNγ)和鐵蛋白的顯著增加與所有3級CRS事件相關(對象32816-06：圖18A；對象32816-07：圖18B)。所有CRS事件都藉由托珠單抗(抗IL6R)救助迅速解決。
第3群組招收(淋巴細胞耗竭化療下進行MTD)於2018 年9月開始。
實施例12：第1群組和第2群組觀察結果以及病例研究
圖19顯示了第1群組和第2群組患者中前列腺特異性抗原(PSA)反應的圖。
對象32816-07：74歲，患有轉移性去勢抵抗性前列腺癌(mCRPC；初始診斷：2014年5月)。在PSMA-TGFβRDN CART輸注後數小時，觀察到發燒至103F(未進行淋巴細胞耗竭)。PSMA-TGFβRDN CART後約6小時，在83/44mmHg的最低點觀察到低血壓。在PSMA-TGFβRDN CART輸注後第二天，決定藉由類晶體輸注(ICU入院期間未要求藥理學管理)和托珠單抗管理低血壓。
PSMA-TGFβRDN CART輸注後，在患者32816-07中觀察到細胞因子釋放綜合征(CRS)(圖20A)。在圖20A中，左y軸指示周邊血中PSMA-TGFβRDN CART的水平，單位為拷貝數/ug基因組DNA(32816-07)，而右y軸指示IL-6的水平，單位為pg/ml(IL6)。CRS伴有瞬時PSA降低(圖20B)。在圖20B中，左y軸指示C反應蛋白(CRP)的血清水平，單位為mg/L，而右y軸指示鐵蛋白的血清水平，單位為ng/L。
第1群組和第2群組中PSMA陽性CTC觀察結果：表18顯示了每名對象中在各種時間點處檢測到的PSMA陽性循環腫瘤細胞(CTC)數的概要，其數據如圖21所示。
Figure 110107653-A0202-12-0346-1101
Figure 110107653-A0202-12-0347-1102
實施例13：人源化PSM嵌合抗原受體
嵌合抗原受體(CAR)是利用來源於抗PSMA單株抗體J591的完全人源化抗體產生的。
材料和方法
細胞系和原代人類T淋巴細胞培養：PC3是前列腺癌腫瘤細胞系(ATCC；Cat#：CRL-1435)。將前列腺特異性膜抗原(PSMA)慢病毒轉導到PC3中產生PC3-PSMA。將CBG慢病毒轉導到PC3和PC3-PSMA中產生PC3-CBG和PC3-PSMA-CBG。
採用RosetteSep試劑盒(Stem Cell Technologies)進行陰性選擇，從健康志願者中分離出原代人類CD4 T細胞和CD8 T細胞。所有樣本均在經大學制度審查委員會(University Institutional Review Board)批准的方案下收集，並獲得每位供者的書面知情同意書。用抗CD3/CD28 Dynabeads(Life Technologies)刺激混合的原代人類CD4 T細胞和CD8 T細胞(1：1)。
CAR構建物和慢病毒轉導：針對PSMA的CAR scFv結構域藉由PCR合成及/或擴增，被連接到CD8跨膜結構域和4-1BB或ICOS和CD3 ζ細胞內信號傳導結構域，並被次選殖到pTRPE慢病毒載體中。在MOI為5下，用慢病毒載體轉導T細胞。
流式細胞術：在用生物素標記的多株抗小鼠F(ab)2抗體(Jackson Immunoresearch)染色後，用流式細胞術測定轉導細胞的轉導效率。在流式細胞術實驗中使用以下抗體：PE綴合的鏈黴親和素。在FACSCalibur(BC Biosciences)上進行數據採集，並藉由FlowJo分析。
CD107a測定：於96孔板中在160μL R10培養基中以1：2的E：T(1 x 105個效應物：2 x 105)將細胞鋪板。值得注意的是，加入20μL藻紅蛋白標記的抗CD107a Ab，並將孔板在37℃下孵育1小時，之後加入Golgi Stop(3ml R10培養基中2mL Golgi Stop,20mL/孔；BD Biosciences,51-2092KZ)，並將孔板再孵育2.5小時。然後加入5mL FITC-抗CD8和5mL鏈黴親和素-別藻藍蛋白(APC)-抗CD3，並在37℃下孵育30分鐘。孵育後用FACS緩衝液洗滌樣品，並藉由流式細胞術分析。
酶聯免疫吸附測定(ELISA)：洗滌目標細胞並以1 x 106個細胞/mL使其懸浮於R10培養基中。值得注意的是，將每種目標細胞類型100μL，三次重複，加入96孔圓底平板(Corning)中。洗滌效應T細胞並以1 x 106個細胞/mL使其重懸於R10細胞中，然後在指示的孔中將100μL T細胞與目標細胞組合。在37℃下孵育平板18至24小時。孵育後，收集上清液並進行ELISA測定(eBioscience)。
基於螢光素酶的細胞溶解性T細胞(CTL)測定：將叩頭蟲綠螢光素酶(CBG)-T2A-eGFP慢病毒轉導到PC3和PC3-PSMA腫瘤細胞中，並進行GFP表現分選。在37℃下使腫瘤細胞與不同比例的T細胞孵育8小時。值得注意的是，將100mL混合物轉移到96孔白色發光計平板，加入100mL底物，並立即測定發光。結果報告為有腫瘤而無T細胞的情況下孔中基於螢光素酶活性的百分比殺傷。(%殺傷=100-((來自具有效應物與目標細胞共培養的孔的RLU)/(來自具有目標細胞的孔的RLU)×100)。
結果
在圖22A-22C、圖23A-23B和圖24A-24E中，dnTGF-hJ591VHVK.BBZ表示包含藉由T2A序列與人源化J591(hJ591)BBZ CAR連接的顯性負性TGFRβII序列的經轉導的T細胞，其中hJ591 CAR包含4-1BB共刺激結構域和CD3 ζ信號結構域，並且其中hJ591結合序列從5’至3’包含hJ591重鏈可變區序列和hJ591輕鏈可變區序列(VHVK)；dnTGF-hJ591VKVH.BBZ表示包含藉由T2A序列與人源化J591(hJ591)BBZ CAR連接的顯性負性TGFRβII序列的經轉導的T細胞，其中hJ591 CAR包含4-1BB共刺激結構域和CD3 ζ信號傳導結構域，並且其中hJ591結合序列從5’至3’包含hJ591輕鏈可變區序列和hJ591重鏈可變區序列(VKVH)；dnTGF-mJ591.BBZ表示包含藉由T2A序列與小鼠J591(mJ591)BBZ CAR連接的顯性負性TGFRβII序列的經轉導的T細胞(在本文中也稱為dnTGFRβII.J591.BBZ)。
構建兩個人源化的J591 CAR，dnTGF.hJ591VHVK.BBZ和dnTGF.hJ591VKVH.BBZ，並將其選殖到慢病毒載體中(圖22A)。圖22B顯示了藉由流式細胞術測量的慢病毒轉導的T細胞的轉基因表現，慢病毒轉導的T細胞表現PSMA CAR或TGF-b受體II(TGFbRII)，PSMA CAR用人類重組PSMA-Fc蛋白(PMSA)或抗hIgG染色。將表現所指示的PMSA CAR構建物的CAR-T細胞與PC3-PMSA共培養4小時，並藉由流式細胞術定量CD107a表現的百分比，顯示人源化J591 CAR賦予T細胞功能性(圖22C)。
以PC3-PMSA細胞為目標，測試表現所指示的PMSA CAR構建物的CAR-T細胞的裂解活性，顯示包含hJ591 CAR的T細胞特異性地殺傷目標細胞(圖23A)。藉由Luminex分析細胞因子的產生，顯示VKVH hJ591 CAR優於VHVK hJ591 CAR(圖23B)。
對不同共刺激結構域的人源化J591(hJ591)CAR進行 了測試。圖24A顯示了用於研究的編碼靶向PSMA的CAR的hJ591 CAR載體的示意圖，這些靶向PSMA的CAR在跨膜結構域和細胞內結構域上有所不同。圖24B顯示hJ591-CAR在慢病毒轉導的CAR T細胞上的表面表現。將CAR T細胞與PC3細胞或PC3-PSMA細胞共培養4小時，並定量CD107a表現的百分比(圖24C)。共培養後18小時測量hJ591-CAR對PC3-PSMA的特異性裂解(圖24D)。圖24E顯示了在與PC3-PSMA細胞共培養(E：T=1：1)24小時後藉由ELISA測量的CAR T細胞的上清液的細胞因子產生。
產生若干構建物並將其選殖到慢病毒載體中用於體外和體內測試。結果顯示在圖25-30中。在圖25-30中，UTD表示未經轉導的細胞；mJ591.BBZ表示包含小鼠J591 BBZ CAR的經轉導的T細胞，其中mJ591 CAR包含4-1BB共刺激結構域和CD3 ζ信號傳導結構域；dnTGFβR-mJ591.BBZ表示包含藉由T2A序列與小鼠J591 BBZ CAR連接的顯性負性TGFRβII序列的經轉導的T細胞，其中mJ591 CAR包含4-1BB共刺激結構域和CD3 ζ信號傳導結構域；PD1.CD28-mJ591-hJ591KH.BBZ表示dnTGFβR-mJ591.BBZ，其中該細胞還包含PD1-CD28開關受體；hJ591KH.BBZ表示包含人源化J591(hJ591)BBZ CAR的經轉導的T細胞，其中hJ591 CAR包含4-1BB共刺激域和CD3 ζ信號傳導結構域，並且其中hJ591結合序列從5’至3’包含hJ591輕鏈可變區序列和hJ591重鏈可變區序列(VKVH)；dnTGFβR-hJ591KH.BBZ表示包含藉由T2A序列與人源化J591(hJ591)BBZ CAR連接的顯性負性TGFRβII序列的經轉導的T細胞，其中hJ591 CAR包含4-1BB共刺激結構域和CD3 ζ信號傳導結構域，並且其中hJ591結合序列從5’至3’包含hJ591輕鏈可變區序列和hJ591重鏈可變區序列(VKVH)；並且PD1.CD28-dnTGFβR-hJ591KH.BBZ表示dnTGFβR-hJ591KH.BBZ，其中該細胞還包含PD1-CD28開關受體。
藉由流式細胞術測試如所指示的經轉導的細胞中的CAR表現(圖25)。將CAR T細胞與PC3細胞或PC3-PSMA細胞共培養 4小時，並定量顯性負性TGFRβII和PD1表現的百分比(圖26A)。將CAR T細胞與PC3細胞或PC3-PSMA細胞共培養4小時，並定量CD107a表現的百分比(圖26B)。用PC3-PMSA細胞作為目標，測試表現所指示的PMSA CAR構建物的CAR-T細胞的裂解活性，顯示如所指示的包含CAR的T細胞特異性地殺傷目標細胞(圖27A)。在對照實驗中，用PC3細胞作為目標，測試表現所指示的PMSA CAR構建物的CAR-T細胞的裂解活性(圖27B)。藉由Luminex分析細胞產生IFN-γ和IL-2的情況(分別為圖28A和圖28B)。如圖28A-28B中所示，細胞因子的產生僅在PC3-PSMA細胞存在時受到介導，而在PC3細胞存在時不受介導。
評估各種細胞的體內腫瘤殺傷效力。將所指示的各種經轉導的細胞給予小鼠PSMA腫瘤模型，並在給予後第1天、第7天、第12天和第21天評估腫瘤的生物發光(圖29)。圖30A顯示在給予後第1天、第7天、第12天和第21天，從如所指示的給予了經轉導的細胞的小鼠中的腫瘤檢測到的平均通量的定量。圖30B顯示在給予後第21天，從如所指示的給予了經轉導的細胞的小鼠中的腫瘤檢測到的平均通量的定量。
特此藉由引用將本文所引用的每項專利、專利申請和出版物的公開內容以其整體併入本文。雖然本發明已參照具體的實施方式進行了公開，但顯而易見的是，本領域其它技術人員可在不脫離本發明的真正精神和範圍的情況下設計出本發明的其它實施方式和變型。所附權利要求旨在被理解為包括所有這樣的實施方式和等同變型。
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<160> 262
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子
<220>
<221> REPEAT
<222> (1)..(5)
<223> 重複n次，其中n代表至少為1的整數
<400> 1
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<210> 2
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 連接子
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<222> (1)..(4)
<223> 重複n次，其中n代表至少為1的整數
<400> 2
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<210> 3
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子
<220>
<221> REPEAT
<222> (1)..(5)
<223> 重複n次，其中n代表至少為1的整數
<400> 3
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<210> 5
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<213> 人工序列
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<223> 連接子
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<210> 8
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<213> 人工序列
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<210> 9
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<213> 人工序列
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<210> 11
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<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<213> 小鼠
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<213> 小鼠
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<213> 小鼠
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<213> 小鼠
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<213> 小鼠
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<213> 小鼠
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<213> 小鼠
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<213> 小鼠
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<213> 小鼠
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<213> 小鼠
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<213> 智人
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Figure 110107653-A0202-12-0366-1143
<210> 34
<211> 321
<212> DNA
<213> 智人
<400> 34
Figure 110107653-A0202-12-0366-1144
<210> 35
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 35
Figure 110107653-A0202-12-0366-1145
Figure 110107653-A0202-12-0367-1146
<210> 36
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<400> 36
Figure 110107653-A0202-12-0367-1147
<210> 37
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 37
Figure 110107653-A0202-12-0367-1148
<210> 38
<211> 262
<212> PRT
<213> 智人
<400> 38
Figure 110107653-A0202-12-0367-1149
Figure 110107653-A0202-12-0368-1150
<210> 39
<211> 786
<212> DNA
<213> 智人
<400> 39
Figure 110107653-A0202-12-0368-1151
Figure 110107653-A0202-12-0369-1152
<210> 40
<211> 120
<212> PRT
<213> 智人
<400> 40
Figure 110107653-A0202-12-0369-1153
Figure 110107653-A0202-12-0370-1154
<210> 41
<211> 360
<212> DNA
<213> 智人
<400> 41
Figure 110107653-A0202-12-0370-1155
<210> 42
<211> 5
<212> PRT
<213> 智人
<400> 42
Figure 110107653-A0202-12-0370-1156
<210> 43
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人
<400> 43
Figure 110107653-A0202-12-0370-1157
<210> 44
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 44
Figure 110107653-A0202-12-0371-1158
<210> 45
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人
<400> 45
Figure 110107653-A0202-12-0371-1159
<210> 46
<211> 321
<212> DNA
<213> 智人
<400> 46
Figure 110107653-A0202-12-0371-1160
Figure 110107653-A0202-12-0372-1161
<210> 47
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 47
Figure 110107653-A0202-12-0372-1162
<210> 48
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 48
Figure 110107653-A0202-12-0372-1163
<210> 49
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 49
Figure 110107653-A0202-12-0372-1164
<210> 50
<211> 264
<212> PRT
<213> 智人
<400> 50
Figure 110107653-A0202-12-0372-1165
Figure 110107653-A0202-12-0373-1166
Figure 110107653-A0202-12-0374-1167
<210> 51
<211> 792
<212> DNA
<213> 智人
<400> 51
Figure 110107653-A0202-12-0374-1168
<210> 52
<211> 120
<212> PRT
<213> 智人
<400> 52
Figure 110107653-A0202-12-0374-1169
Figure 110107653-A0202-12-0375-1170
<210> 53
<211> 360
<212> DNA
<213> 智人
<400> 53
Figure 110107653-A0202-12-0375-1171
<210> 54
<211> 5
<212> PRT
<213> 智人
<400> 54
Figure 110107653-A0202-12-0375-1172
<210> 55
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人
<400> 55
Figure 110107653-A0202-12-0376-1173
<210> 56
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 56
Figure 110107653-A0202-12-0376-1174
<210> 57
<211> 109
<212> PRT
<213> 智人
<400> 57
Figure 110107653-A0202-12-0376-1175
Figure 110107653-A0202-12-0377-1176
<210> 58
<211> 327
<212> DNA
<213> 智人
<400> 58
Figure 110107653-A0202-12-0377-1179
<210> 59
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 59
Figure 110107653-A0202-12-0377-1177
<210> 60
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<400> 60
Figure 110107653-A0202-12-0377-1178
<210> 61
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 61
Figure 110107653-A0202-12-0378-1180
<210> 62
<211> 265
<212> PRT
<213> 智人
<400> 62
Figure 110107653-A0202-12-0378-1181
Figure 110107653-A0202-12-0379-1183
<210> 63
<211> 795
<212> DNA
<213> 智人
<400> 63
Figure 110107653-A0202-12-0379-1182
Figure 110107653-A0202-12-0380-1184
<210> 64
<211> 122
<212> PRT
<213> 智人
<400> 64
Figure 110107653-A0202-12-0380-1185
<210> 65
<211> 366
<212> DNA
<213> 智人
<400> 65
Figure 110107653-A0202-12-0380-1186
Figure 110107653-A0202-12-0381-1187
<210> 66
<211> 4
<212> PRT
<213> 智人
<400> 66
Figure 110107653-A0202-12-0381-1188
<210> 67
<211> 18
<212> PRT
<213> 智人
<400> 67
Figure 110107653-A0202-12-0381-1189
<210> 68
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 68
Figure 110107653-A0202-12-0381-1190
<210> 69
<211> 108
<212> PRT
<213> 智人
<400> 69
Figure 110107653-A0202-12-0381-1191
Figure 110107653-A0202-12-0382-1192
<210> 70
<211> 324
<212> DNA
<213> 智人
<400> 70
Figure 110107653-A0202-12-0382-1194
<210> 71
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 71
Figure 110107653-A0202-12-0382-1193
<210> 72
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 72
Figure 110107653-A0202-12-0383-1195
<210> 73
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 73
Figure 110107653-A0202-12-0383-1196
<210> 74
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 鉸鏈
<400> 74
Figure 110107653-A0202-12-0383-1197
<210> 75
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 鉸鏈
<400> 75
Figure 110107653-A0202-12-0383-1198
<210> 76
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 鉸鏈
<400> 76
Figure 110107653-A0202-12-0384-1199
<210> 77
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 鉸鏈
<400> 77
Figure 110107653-A0202-12-0384-1200
<210> 78
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 鉸鏈
<400> 78
Figure 110107653-A0202-12-0384-1201
<210> 79
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 鉸鏈
<400> 79
Figure 110107653-A0202-12-0384-1202
<210> 80
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 鉸鏈
<400> 80
Figure 110107653-A0202-12-0385-1203
<210> 81
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 鉸鏈
<400> 81
Figure 110107653-A0202-12-0385-1204
<210> 82
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 鉸鏈
<400> 82
Figure 110107653-A0202-12-0385-1206
<210> 83
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 鉸鏈
<400> 83
Figure 110107653-A0202-12-0385-1205
<210> 84
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 鉸鏈
<400> 84
Figure 110107653-A0202-12-0386-1207
<210> 85
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 鉸鏈
<400> 85
Figure 110107653-A0202-12-0386-1208
<210> 86
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD8鉸鏈
<400> 86
Figure 110107653-A0202-12-0386-1209
<210> 87
<211> 135
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD8鉸鏈
<400> 87
Figure 110107653-A0202-12-0387-1210
<210> 88
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD8跨膜域
<400> 88
Figure 110107653-A0202-12-0387-1211
<210> 89
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD8跨膜域
<400> 89
Figure 110107653-A0202-12-0387-1212
<210> 90
<211> 69
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD8鉸鏈及CD8跨膜域
<400> 90
Figure 110107653-A0202-12-0388-1213
<210> 91
<211> 207
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD8鉸鏈及CD8跨膜域
<400> 91
Figure 110107653-A0202-12-0388-1214
<210> 92
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4-1BB
<400> 92
Figure 110107653-A0202-12-0388-1215
Figure 110107653-A0202-12-0389-1216
<210> 93
<211> 126
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 4-1BB
<400> 93
Figure 110107653-A0202-12-0389-1217
<210> 94
<211> 126
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 4-1BB
<400> 94
Figure 110107653-A0202-12-0389-1218
<210> 95
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ICOS(YMNM)
<400> 95
Figure 110107653-A0202-12-0389-1219
Figure 110107653-A0202-12-0390-1220
<210> 96
<211> 105
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ICOS(YMNM)
<400> 96
Figure 110107653-A0202-12-0390-1221
<210> 97
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3 ζ結構域
<400> 97
Figure 110107653-A0202-12-0390-1222
<210> 98
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3 ζ結構域
<400> 98
Figure 110107653-A0202-12-0391-1223
<210> 99
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3 ζ結構域
<400> 99
Figure 110107653-A0202-12-0391-1224
<210> 100
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3 ζ結構域
<400> 100
Figure 110107653-A0202-12-0392-1225
<210> 101
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3 ζ結構域
<400> 101
Figure 110107653-A0202-12-0392-1226
<210> 102
<211> 154
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4-1BB結構域及CD3 ζ結構域
<400> 102
Figure 110107653-A0202-12-0393-1227
<210> 103
<211> 462
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 4-1BB結構域及CD3 ζ結構域
<400> 103
Figure 110107653-A0202-12-0393-1228
Figure 110107653-A0202-12-0394-1229
<210> 104
<211> 462
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 4-1BB結構域及CD3 ζ結構域
<400> 104
Figure 110107653-A0202-12-0394-1230
<210> 105
<211> 487
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> J591鼠類PSMA-CAR
<400> 105
Figure 110107653-A0202-12-0394-1231
Figure 110107653-A0202-12-0395-1232
Figure 110107653-A0202-12-0396-1233
Figure 110107653-A0202-12-0397-1234
<210> 106
<211> 1461
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> J591鼠類PSMA-CAR
<400> 106
Figure 110107653-A0202-12-0397-1235
Figure 110107653-A0202-12-0398-1236
<210> 107
<211> 490
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1C3人類PSMA-CAR
<400> 107
Figure 110107653-A0202-12-0398-1237
Figure 110107653-A0202-12-0399-1238
Figure 110107653-A0202-12-0400-1239
<210> 108
<211> 1470
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1C3人類PSMA-CAR
<400> 108
Figure 110107653-A0202-12-0400-1240
Figure 110107653-A0202-12-0401-1241
<210> 109
<211> 485
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 2A10人類PSMA-CAR
<400> 109
Figure 110107653-A0202-12-0402-1242
Figure 110107653-A0202-12-0403-1243
Figure 110107653-A0202-12-0404-1244
<210> 110
<211> 1455
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 2A10人類PSMA-CAR
<400> 110
Figure 110107653-A0202-12-0404-1245
Figure 110107653-A0202-12-0405-1246
<210> 111
<211> 487
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 2F5人類PSMA-CAR
<400> 111
Figure 110107653-A0202-12-0405-1247
Figure 110107653-A0202-12-0406-1248
Figure 110107653-A0202-12-0407-1249
<210> 112
<211> 1461
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 2F5人類PSMA-CAR
<400> 112
Figure 110107653-A0202-12-0407-1250
Figure 110107653-A0202-12-0408-1251
<210> 113
<211> 488
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 2C6人類PSMA-CAR
<400> 113
Figure 110107653-A0202-12-0409-1252
Figure 110107653-A0202-12-0410-1253
Figure 110107653-A0202-12-0411-1254
<210> 114
<211> 1464
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 2C6人類PSMA-CAR
<400> 114
Figure 110107653-A0202-12-0411-1255
Figure 110107653-A0202-12-0412-1256
<210> 115
<211> 201
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TGFBRII-DN
<400> 115
Figure 110107653-A0202-12-0412-1257
Figure 110107653-A0202-12-0413-1258
<210> 116
<211> 603
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TGFBRII-DN
<400> 116
Figure 110107653-A0202-12-0413-1259
Figure 110107653-A0202-12-0414-1260
<210> 117
<211> 238
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PD1-CTM-CD28開關受體
<400> 117
Figure 110107653-A0202-12-0414-1261
Figure 110107653-A0202-12-0415-1262
<210> 118
<211> 714
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PD1-CTM-CD28開關受體
<400> 118
Figure 110107653-A0202-12-0415-1263
<210> 119
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PD1-PTM-CD28開關受體
<400> 119
Figure 110107653-A0202-12-0416-1264
Figure 110107653-A0202-12-0417-1265
<210> 120
<211> 696
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PD1-PTM-CD28開關受體
<400> 120
Figure 110107653-A0202-12-0417-1266
<210> 121
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PD1A132L-PTM-CD28開關受體
<400> 121
Figure 110107653-A0202-12-0418-1267
Figure 110107653-A0202-12-0419-1268
<210> 122
<211> 693
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PD1A132L-PTM-CD28開關受體
<400> 122
Figure 110107653-A0202-12-0419-1269
<210> 123
<211> 238
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TGPBR-IL12RB1受體
<400> 123
Figure 110107653-A0202-12-0419-1270
Figure 110107653-A0202-12-0420-1271
Figure 110107653-A0202-12-0421-1272
<210> 124
<211> 714
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TGFBR-IL12RB1受體
<400> 124
Figure 110107653-A0202-12-0421-1273
<210> 125
<211> 403
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TGFBR-IL12RB2受體
<400> 125
Figure 110107653-A0202-12-0421-1274
Figure 110107653-A0202-12-0422-1275
Figure 110107653-A0202-12-0423-1276
<210> 126
<211> 1209
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TGFBR-IL12RB2受體
<400> 126
Figure 110107653-A0202-12-0423-1277
Figure 110107653-A0202-12-0424-1278
<210> 127
<211> 268
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TIM3-CD28受體
<400> 127
Figure 110107653-A0202-12-0424-1279
Figure 110107653-A0202-12-0425-1280
Figure 110107653-A0202-12-0426-1281
<210> 128
<211> 804
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TIM3-CD28受體
<400> 128
Figure 110107653-A0202-12-0426-1282
<210> 129
<211> 503
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 13G4-1211 PD-L1/CD28雙特異性抗體
<400> 129
Figure 110107653-A0202-12-0426-1283
Figure 110107653-A0202-12-0427-1284
Figure 110107653-A0202-12-0428-1285
Figure 110107653-A0202-12-0429-1286
<210> 130
<211> 1508
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 13G4-1211 PD-L1/CD28雙特異性抗體
<400> 130
Figure 110107653-A0202-12-0429-1287
Figure 110107653-A0202-12-0430-1288
<210> 131
<211> 500
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 10A5-1412 PD-L1/CD28雙特異性抗體
<400> 131
Figure 110107653-A0202-12-0430-1289
Figure 110107653-A0202-12-0431-1290
Figure 110107653-A0202-12-0432-1291
<210> 132
<211> 1499
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 10A5-1412 PD-L1/CD28雙特異性抗體
<400> 132
Figure 110107653-A0202-12-0433-1292
<210> 133
<211> 507
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1B12-1412 PD-L1/CD28雙特異性抗體
<400> 133
Figure 110107653-A0202-12-0434-1293
Figure 110107653-A0202-12-0435-1294
Figure 110107653-A0202-12-0436-1295
<210> 134
<211> 1520
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1B12-1412 PD-L1/CD28雙特異性抗體
<400> 134
Figure 110107653-A0202-12-0436-1296
Figure 110107653-A0202-12-0437-1297
<210> 135
<211> 504
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TGFBR-1-1412 TGFBRII/CD28雙特異性抗體
<400> 135
Figure 110107653-A0202-12-0437-1298
Figure 110107653-A0202-12-0438-1299
Figure 110107653-A0202-12-0439-1300
Figure 110107653-A0202-12-0440-1301
<210> 136
<211> 1512
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TGFBR-1-1412 TGFBRII/CD28雙特異性抗體
<400> 136
Figure 110107653-A0202-12-0440-1302
Figure 110107653-A0202-12-0441-1303
<210> 137
<211> 504
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TGFBR-3-1412 TGFBRII/CD28雙特異性抗體
<400> 137
Figure 110107653-A0202-12-0441-1304
Figure 110107653-A0202-12-0442-1305
Figure 110107653-A0202-12-0443-1306
<210> 138
<211> 1512
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TGFBR-3-1412 TGFBRII/CD28雙特異性抗體
<400> 138
Figure 110107653-A0202-12-0443-1307
Figure 110107653-A0202-12-0444-1308
<210> 139
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> T2A
<400> 139
Figure 110107653-A0202-12-0445-1309
<210> 140
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> T2A
<400> 140
Figure 110107653-A0202-12-0445-1310
<210> 141
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 間隔子
<400> 141
Figure 110107653-A0202-12-0445-1311
<210> 142
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 間隔子
<400> 142
Figure 110107653-A0202-12-0445-1312
<210> 143
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> F2A
<400> 143
Figure 110107653-A0202-12-0446-1313
<210> 144
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> F2A
<400> 144
Figure 110107653-A0202-12-0446-1314
<210> 145
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 弗林蛋白酶切割位點
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> Xaa可為任何天然存在的胺基酸
<400> 145
Figure 110107653-A0202-12-0446-1315
<210> 146
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 弗林蛋白酶切割位點
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> Xaa可為任何天然存在的胺基酸
<400> 146
Figure 110107653-A0202-12-0447-1316
<210> 147
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 弗林蛋白酶切割位點
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(3)
<223> Xaa可為任何天然存在的胺基酸
<400> 147
Figure 110107653-A0202-12-0447-1317
<210> 148
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 弗林蛋白酶切割位點
<400> 148
Figure 110107653-A0202-12-0447-1318
<210> 149
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 弗林蛋白酶切割位點
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Xaa可為任何天然存在的胺基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(4)
<223> Xaa可為任何天然存在的胺基酸
<400> 149
Figure 110107653-A0202-12-0448-1319
<210> 150
<211> 96
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> F-GS2-T2A連接子
<400> 150
Figure 110107653-A0202-12-0448-1320
<210> 151
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> F-GS2-T2A連接子
<400> 151
Figure 110107653-A0202-12-0448-1321
<210> 152
<211> 2142
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TGFbRDN-PSMA-CAR
<400> 152
Figure 110107653-A0202-12-0449-1322
Figure 110107653-A0202-12-0450-1323
<210> 153
<211> 2151
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TGFbRDN-1C3PSMA-CAR
<400> 153
Figure 110107653-A0202-12-0450-1324
Figure 110107653-A0202-12-0451-1325
<210> 154
<211> 2136
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TGFbRDN-2A10PSMA-CAR
<400> 154
Figure 110107653-A0202-12-0452-1326
Figure 110107653-A0202-12-0453-1327
<210> 155
<211> 2142
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TGFbRDN-2F5PSMA-CAR
<400> 155
Figure 110107653-A0202-12-0453-1328
Figure 110107653-A0202-12-0454-1329
<210> 156
<211> 2145
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TGFbRDN-2C6PSMA-CAR
<400> 156
Figure 110107653-A0202-12-0455-1330
Figure 110107653-A0202-12-0456-1331
<210> 157
<211> 2250
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PD1-CTM-CD28-1C3PSMA-CAR
<400> 157
Figure 110107653-A0202-12-0456-1332
Figure 110107653-A0202-12-0457-1333
<210> 158
<211> 2235
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PD1-CTM-CD28-2A10PSMA-CAR
<400> 158
Figure 110107653-A0202-12-0458-1334
Figure 110107653-A0202-12-0459-1335
<210> 159
<211> 2241
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PD1-CTM-CD28-2F5PSMA-CAR
<400> 159
Figure 110107653-A0202-12-0459-1336
Figure 110107653-A0202-12-0460-1337
Figure 110107653-A0202-12-0461-1338
<210> 160
<211> 2244
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PD1-CTM-CD28-2C6PSMA-CAR
<400> 160
Figure 110107653-A0202-12-0461-1339
Figure 110107653-A0202-12-0462-1340
<210> 161
<211> 2232
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PD1A132L-PTM-CD28-1C3PSMA-CAR
<400> 161
Figure 110107653-A0202-12-0462-1341
Figure 110107653-A0202-12-0463-1342
Figure 110107653-A0202-12-0464-1343
<210> 162
<211> 2217
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PD1A132L-PTM-CD28-2A10PSMA-CAR
<400> 162
Figure 110107653-A0202-12-0464-1344
Figure 110107653-A0202-12-0465-1345
<210> 163
<211> 2223
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PD1A132L-PTM-CD28-25FPSMA-CAR
<400> 163
Figure 110107653-A0202-12-0465-1346
Figure 110107653-A0202-12-0466-1347
Figure 110107653-A0202-12-0467-1348
<210> 164
<211> 2226
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PD1A132L-PTM-CD28-2C6PSMA-CAR
<400> 164
Figure 110107653-A0202-12-0467-1349
Figure 110107653-A0202-12-0468-802
<210> 165
<211> 2340
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TIM3-CD28-1C3PSMA-CAR
<400> 165
Figure 110107653-A0202-12-0469-803
Figure 110107653-A0202-12-0470-804
<210> 166
<211> 2325
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TIM3-CD28-2A10PSMA-CAR
<400> 166
Figure 110107653-A0202-12-0470-805
Figure 110107653-A0202-12-0471-806
Figure 110107653-A0202-12-0472-808
<210> 167
<211> 2331
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TIM3-CD28-25FPSMA-CAR
<400> 167
Figure 110107653-A0202-12-0472-809
Figure 110107653-A0202-12-0473-810
<210> 168
<211> 2334
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TIM3-CD28-2C6PSMA-CAR
<400> 168
Figure 110107653-A0202-12-0473-811
Figure 110107653-A0202-12-0474-812
Figure 110107653-A0202-12-0475-813
<210> 169
<211> 821
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1C3
<400> 169
Figure 110107653-A0202-12-0475-814
<210> 170
<211> 806
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 2A10
<400> 170
Figure 110107653-A0202-12-0476-815
<210> 171
<211> 812
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 2F5
<400> 171
Figure 110107653-A0202-12-0476-816
Figure 110107653-A0202-12-0477-817
<210> 172
<211> 815
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 2C6
<400> 172
Figure 110107653-A0202-12-0477-819
<210> 173
<211> 780
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PD1.CD28-F2A
<400> 173
Figure 110107653-A0202-12-0478-820
<210> 174
<211> 762
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PD1A132L-PTM.CD28-F2A
<400> 174
Figure 110107653-A0202-12-0478-821
Figure 110107653-A0202-12-0479-822
<210> 175
<211> 681
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dnTGFRBII-T2A
<400> 175
Figure 110107653-A0202-12-0479-823
<210> 176
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 176
Figure 110107653-A0202-12-0480-824
<210> 177
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 177
Figure 110107653-A0202-12-0480-825
<210> 178
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 178
Figure 110107653-A0202-12-0480-827
<210> 179
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 179
Figure 110107653-A0202-12-0480-829
<210> 180
<211> 711
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> J591 PSMA scFv
<400> 180
Figure 110107653-A0202-12-0480-830
Figure 110107653-A0202-12-0481-831
<210> 181
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> J591 VL
<400> 181
Figure 110107653-A0202-12-0481-832
Figure 110107653-A0202-12-0482-833
<210> 182
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> J591 VH
<400> 182
Figure 110107653-A0202-12-0482-834
<210> 183
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化PSMA VH共通
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> X is A or P
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> X is V or L
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(24)
<223> X is A or T
<220>
<221> misc_feature
<222> (38)..(38)
<223> X is R or K
<220>
<221> misc_feature
<222> (41)..(41)
<223> X is P or H
<220>
<221> misc_feature
<222> (55)..(55)
<223> X is N or Q
<220>
<221> misc_feature
<222> (68)..(68)
<223> X is V or A
<220>
<221> misc_feature
<222> (70)..(70)
<223> X is I or L
<400> 183
Figure 110107653-A0202-12-0483-835
Figure 110107653-A0202-12-0484-836
<210> 184
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化PSMA VL共通
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> X為Q或V
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> X為T或F
<220>
<221> misc_feature
<222> (63)..(63)
<223> X為S或T
<220>
<221> misc_feature
<222> (80)..(80)
<223> X為P或S
<220>
<221> misc_feature
<222> (85)..(85)
<223> X為V或D
<220>
<221> misc_feature
<222> (87)..(87)
<223> X為Y或F
<220>
<221> misc_feature
<222> (103)..(103)
<223> X為K或M
<400> 184
Figure 110107653-A0202-12-0485-837
<210> 185
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化PSMA VH
<400> 185
Figure 110107653-A0202-12-0485-838
Figure 110107653-A0202-12-0486-839
<210> 186
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化PSMA VL
<400> 186
Figure 110107653-A0202-12-0486-840
Figure 110107653-A0202-12-0487-841
<210> 187
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化PSMA VH
<400> 187
Figure 110107653-A0202-12-0487-842
<210> 188
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化PSMA VL
<400> 188
Figure 110107653-A0202-12-0488-843
<210> 189
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化PSMA VH
<400> 189
Figure 110107653-A0202-12-0488-844
Figure 110107653-A0202-12-0489-845
<210> 190
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化PSMA VL
<400> 190
Figure 110107653-A0202-12-0489-846
Figure 110107653-A0202-12-0490-847
<210> 191
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化PSMA VH
<400> 191
Figure 110107653-A0202-12-0490-848
<210> 192
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化PSMA VL
<400> 192
Figure 110107653-A0202-12-0491-849
<210> 193
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化PSMA VH
<400> 193
Figure 110107653-A0202-12-0491-851
Figure 110107653-A0202-12-0492-852
<210> 194
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化PSMA VH共通
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> X為A或P
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> X為V或L
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(24)
<223> X為A或T
<220>
<221> misc_feature
<222> (37)..(37)
<223> X為R或K
<220>
<221> misc_feature
<222> (38)..(38)
<223> Xaa可為任何天然存在的胺基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (40)..(40)
<223> X為P或H
<220>
<221> misc_feature
<222> (41)..(41)
<223> Xaa可為任何天然存在的胺基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (54)..(54)
<223> X為N或Q
<220>
<221> misc_feature
<222> (55)..(55)
<223> Xaa可為任何天然存在的胺基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (68)..(68)
<223> X為V或A
<220>
<221> misc_feature
<222> (70)..(70)
<223> X為I或L
<220>
<221> misc_feature
<222> (86)..(86)
<223> Xaa可為任何天然存在的胺基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (98)..(102)
<223> 為AYWLF,GGWTF，或GAWTM
<400> 194
Figure 110107653-A0202-12-0493-853
Figure 110107653-A0202-12-0494-854
<210> 195
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化PSMA VL共通
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> X為Q或V
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> X為T或F
<220>
<221> misc_feature
<222> (63)..(63)
<223> X為S或T
<220>
<221> misc_feature
<222> (80)..(80)
<223> X為P或S
<220>
<221> misc_feature
<222> (85)..(85)
<223> X為V或D
<220>
<221> misc_feature
<222> (87)..(87)
<223> X為Y或F
<220>
<221> misc_feature
<222> (91)..(95)
<223> 為FTRYP或YNAYS
<220>
<221> misc_feature
<222> (103)..(103)
<223> X為K或M
<400> 195
Figure 110107653-A0202-12-0495-855
<210> 196
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化PSMA VH
<400> 196
Figure 110107653-A0202-12-0495-856
Figure 110107653-A0202-12-0496-858
<210> 197
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化PSMA VL
<400> 197
Figure 110107653-A0202-12-0496-859
Figure 110107653-A0202-12-0497-860
<210> 198
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化PSMA VH
<400> 198
Figure 110107653-A0202-12-0497-861
<210> 199
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化PSMA VL
<400> 199
Figure 110107653-A0202-12-0498-862
<210> 200
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化PSMA VH
<400> 200
Figure 110107653-A0202-12-0498-863
Figure 110107653-A0202-12-0499-864
<210> 201
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化PSMA VL
<400> 201
Figure 110107653-A0202-12-0499-865
Figure 110107653-A0202-12-0500-866
<210> 202
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化PSMA VH
<400> 202
Figure 110107653-A0202-12-0500-867
<210> 203
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ICOS ICD
<400> 203
Figure 110107653-A0202-12-0501-868
<210> 204
<211> 105
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ICOS ICD
<400> 204
Figure 110107653-A0202-12-0501-869
<210> 205
<211> 148
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ICOS CD3zeta ICD
<400> 205
Figure 110107653-A0202-12-0501-870
Figure 110107653-A0202-12-0502-873
<210> 206
<211> 444
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ICOS CD3zeta ICD
<400> 206
Figure 110107653-A0202-12-0502-874
<210> 207
<211> 148
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 變體ICOS CD3zeta ICD
<400> 207
Figure 110107653-A0202-12-0503-875
<210> 208
<211> 444
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 變體ICOS CD3zeta ICD
<400> 208
Figure 110107653-A0202-12-0503-877
Figure 110107653-A0202-12-0504-878
<210> 209
<211> 481
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 2F5人類PSMA-CAR ICOS CD3z
<400> 209
Figure 110107653-A0202-12-0504-879
Figure 110107653-A0202-12-0505-880
Figure 110107653-A0202-12-0506-881
<210> 210
<211> 1443
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 2F5人類PSMA-CAR ICOS CD3z
<400> 210
Figure 110107653-A0202-12-0506-882
Figure 110107653-A0202-12-0507-883
<210> 211
<211> 481
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 2F5人類PSMA-CAR varICOS CD3z
<400> 211
Figure 110107653-A0202-12-0507-884
Figure 110107653-A0202-12-0508-886
Figure 110107653-A0202-12-0509-889
Figure 110107653-A0202-12-0510-890
<210> 212
<211> 1443
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 2F5人類PSMA-CAR varICOS CD3z
<400> 212
Figure 110107653-A0202-12-0510-892
Figure 110107653-A0202-12-0511-893
<210> 213
<211> 237
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PD1-4-1BB開關受體
<400> 213
Figure 110107653-A0202-12-0511-894
Figure 110107653-A0202-12-0512-895
<210> 214
<211> 711
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PD1-4-1BB開關受體
<400> 214
Figure 110107653-A0202-12-0512-896
Figure 110107653-A0202-12-0513-897
<210> 215
<211> 237
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PD1A132L-4-1BB開關受體
<400> 215
Figure 110107653-A0202-12-0513-898
Figure 110107653-A0202-12-0514-900
<210> 216
<211> 711
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PD1A132L-4-1BB開關受體
<400> 216
Figure 110107653-A0202-12-0514-901
Figure 110107653-A0202-12-0515-902
<210> 217
<211> 2223
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PD1-CD28-F2A-2F5PSMA-CAR ICOS CD3z
<400> 217
Figure 110107653-A0202-12-0515-904
Figure 110107653-A0202-12-0516-905
<210> 218
<211> 2223
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PD1-CD28-2F5PSMA-CAR varICOS CD3z
<400> 218
Figure 110107653-A0202-12-0516-906
Figure 110107653-A0202-12-0517-907
Figure 110107653-A0202-12-0518-908
<210> 219
<211> 2205
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PD1A132L-CD28-2F5PSMA-CAR ICOS CD3z
<400> 219
Figure 110107653-A0202-12-0518-909
Figure 110107653-A0202-12-0519-910
<210> 220
<211> 2205
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PD1A132L-CD28-2F5PSMA-CAR varICOS CD3z
<400> 220
Figure 110107653-A0202-12-0519-912
Figure 110107653-A0202-12-0520-914
Figure 110107653-A0202-12-0521-915
<210> 221
<211> 2220
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PD1A132L-41BB-2F5PSMA-CAR ICOS CD3z
<400> 221
Figure 110107653-A0202-12-0521-916
Figure 110107653-A0202-12-0522-917
<210> 222
<211> 2220
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PD1A132L-41BB-2F5PSMA-CAR varICOS CD3z
<400> 222
Figure 110107653-A0202-12-0522-919
Figure 110107653-A0202-12-0523-921
Figure 110107653-A0202-12-0524-922
<210> 223
<211> 2313
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TIM3-CD28-2F5PSMA-CAR ICOS CD3z
<400> 223
Figure 110107653-A0202-12-0524-923
Figure 110107653-A0202-12-0525-924
<210> 224
<211> 2313
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TIM3-CD28-2F5PSMA-CAR varICOS CD3z
<400> 224
Figure 110107653-A0202-12-0526-925
Figure 110107653-A0202-12-0527-926
<210> 225
<211> 3090
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PD1A132L-4-1BB-TIM3-CD28-2F5PSMA-CAR ICOS CD3z
<400> 225
Figure 110107653-A0202-12-0527-927
Figure 110107653-A0202-12-0528-928
Figure 110107653-A0202-12-0529-929
<210> 226
<211> 3090
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PD1A132L-4--1BB-TIM3-CD28-2F5PSMA-CAR varICOS CD3z
<400> 226
Figure 110107653-A0202-12-0529-930
Figure 110107653-A0202-12-0530-931
Figure 110107653-A0202-12-0531-932
<210> 227
<211> 741
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PD1-CD28-2F5PSMA-CAR ICOS CD3z
<400> 227
Figure 110107653-A0202-12-0531-933
Figure 110107653-A0202-12-0532-934
Figure 110107653-A0202-12-0533-935
Figure 110107653-A0202-12-0534-936
Figure 110107653-A0202-12-0535-938
<210> 228
<211> 735
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PD1-CD28-2F5PSMA-CAR varICOS CD3z
<400> 228
Figure 110107653-A0202-12-0535-939
Figure 110107653-A0202-12-0536-941
Figure 110107653-A0202-12-0537-942
Figure 110107653-A0202-12-0538-943
<210> 229
<211> 740
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PD1A132L-41BB-2F5PSMA-CAR ICOS CD3z
<400> 229
Figure 110107653-A0202-12-0539-944
Figure 110107653-A0202-12-0540-945
Figure 110107653-A0202-12-0541-946
Figure 110107653-A0202-12-0542-948
<210> 230
<211> 771
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TIM3-CD28-2F5PSMA-CAR ICOS CD3z
<400> 230
Figure 110107653-A0202-12-0542-949
Figure 110107653-A0202-12-0543-950
Figure 110107653-A0202-12-0544-952
Figure 110107653-A0202-12-0545-953
Figure 110107653-A0202-12-0546-954
<210> 231
<211> 1030
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PD1A132L-4-1BB-TIM3-CD28-2F5PSMA-CAR ICOS CD3z
<400> 231
Figure 110107653-A0202-12-0546-955
Figure 110107653-A0202-12-0547-956
Figure 110107653-A0202-12-0548-957
Figure 110107653-A0202-12-0549-958
Figure 110107653-A0202-12-0550-959
Figure 110107653-A0202-12-0551-960
<210> 232
<211> 741
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PD1-CD28-2F5PSMA-CAR varICOS CD3z
<400> 232
Figure 110107653-A0202-12-0551-961
Figure 110107653-A0202-12-0552-963
Figure 110107653-A0202-12-0553-964
Figure 110107653-A0202-12-0554-965
<210> 233
<211> 735
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PD1A132L-CD28-2F5PSMA-CAR ICOS CD3z
<400> 233
Figure 110107653-A0202-12-0554-966
Figure 110107653-A0202-12-0555-968
Figure 110107653-A0202-12-0556-969
Figure 110107653-A0202-12-0557-970
Figure 110107653-A0202-12-0558-972
<210> 234
<211> 740
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PD1A132L-41BB-2F5PSMA-CAR varICOS CD3z
<400> 234
Figure 110107653-A0202-12-0558-973
Figure 110107653-A0202-12-0559-974
Figure 110107653-A0202-12-0560-976
Figure 110107653-A0202-12-0561-979
<210> 235
<211> 771
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TIM3-CD28-2F5PSMA-CAR varICOS CD3z
<400> 235
Figure 110107653-A0202-12-0561-978
Figure 110107653-A0202-12-0562-980
Figure 110107653-A0202-12-0563-982
Figure 110107653-A0202-12-0564-983
Figure 110107653-A0202-12-0565-984
<210> 236
<211> 1030
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PD1A132L-4-1BB-TIM3-CD28-2F5PSMA-CAR varICOS CD3z
<400> 236
Figure 110107653-A0202-12-0565-985
Figure 110107653-A0202-12-0566-986
Figure 110107653-A0202-12-0567-987
Figure 110107653-A0202-12-0568-988
Figure 110107653-A0202-12-0569-989
Figure 110107653-A0202-12-0570-990
<210> 237
<211> 237
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> huJ591 VH-VK scfv
<400> 237
Figure 110107653-A0202-12-0570-991
Figure 110107653-A0202-12-0571-992
<210> 238
<211> 711
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> huJ591 VH-VK scfv
<400> 238
Figure 110107653-A0202-12-0571-994
Figure 110107653-A0202-12-0572-996
<210> 239
<211> 237
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> huJ591 VK-VH scFv
<400> 239
Figure 110107653-A0202-12-0572-997
Figure 110107653-A0202-12-0573-998
<210> 240
<211> 711
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> huJ591 VK-VH scfv
<400> 240
Figure 110107653-A0202-12-0573-1000
Figure 110107653-A0202-12-0574-1001
<210> 241
<211> 222
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> huJ591 VK-VH scfv序列無連接子
<400> 241
Figure 110107653-A0202-12-0574-1002
Figure 110107653-A0202-12-0575-1003
<210> 242
<211> 345
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> huJ591 VH
<400> 242
Figure 110107653-A0202-12-0575-1006
<210> 243
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> huJ591 CDR1
<400> 243
Figure 110107653-A0202-12-0576-1007
<210> 244
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> huJ591 VL
<400> 244
Figure 110107653-A0202-12-0576-1008
<210> 245
<211> 482
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> huJ591VHVK.BBZ CAR
<400> 245
Figure 110107653-A0202-12-0576-1009
Figure 110107653-A0202-12-0577-1010
Figure 110107653-A0202-12-0578-1011
<210> 246
<211> 1446
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> huJ591VHVK.BBZ CAR
<400> 246
Figure 110107653-A0202-12-0579-1013
<210> 247
<211> 482
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> huJ591VKVH.BBZ CAR
<400> 247
Figure 110107653-A0202-12-0580-1014
Figure 110107653-A0202-12-0581-1015
Figure 110107653-A0202-12-0582-1016
<210> 248
<211> 1446
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> huJ591VKVH.BBZ CAR
<400> 248
Figure 110107653-A0202-12-0582-1017
Figure 110107653-A0202-12-0583-1018
<210> 249
<211> 517
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hJ591VKVH.ICOSBBZ CAR
<400> 249
Figure 110107653-A0202-12-0583-1019
Figure 110107653-A0202-12-0584-1020
Figure 110107653-A0202-12-0585-1021
Figure 110107653-A0202-12-0586-1023
<210> 250
<211> 1551
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hJ591VKVH.ICOSBBZ CAR
<400> 250
Figure 110107653-A0202-12-0586-1026
Figure 110107653-A0202-12-0587-1027
<210> 251
<211> 517
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hJ591VKVH.ICOSBBZYMNM CAR
<400> 251
Figure 110107653-A0202-12-0587-1028
Figure 110107653-A0202-12-0588-1029
Figure 110107653-A0202-12-0589-1030
<210> 252
<211> 1551
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hJ591VKVH.ICOSBBZYMNM CAR
<400> 252
Figure 110107653-A0202-12-0590-1031
<210> 253
<211> 475
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hJ591VKVH.ICOSZ CAR
<400> 253
Figure 110107653-A0202-12-0591-1032
Figure 110107653-A0202-12-0592-1033
Figure 110107653-A0202-12-0593-1034
<210> 254
<211> 1425
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hJ591VKVH.ICOSZ CAR
<400> 254
Figure 110107653-A0202-12-0593-1035
Figure 110107653-A0202-12-0594-1036
<210> 255
<211> 475
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hJ591VKVH.ICOSZYMNM CAR
<400> 255
Figure 110107653-A0202-12-0594-1037
Figure 110107653-A0202-12-0595-1038
Figure 110107653-A0202-12-0596-1039
<210> 256
<211> 1425
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hJ591VKVH.ICOSZYMNM CAR
<400> 256
Figure 110107653-A0202-12-0596-1041
Figure 110107653-A0202-12-0597-1042
<210> 257
<211> 706
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> dnTGF.hJ591VHVK.BBZ CAR
<400> 257
Figure 110107653-A0202-12-0597-1043
Figure 110107653-A0202-12-0598-1045
Figure 110107653-A0202-12-0599-1047
Figure 110107653-A0202-12-0600-1048
Figure 110107653-A0202-12-0601-1049
<210> 258
<211> 2118
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dnTGF.hJ591VHVK.BBZ CAR
<400> 258
Figure 110107653-A0202-12-0601-1050
Figure 110107653-A0202-12-0602-1051
<210> 259
<211> 706
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> dnTGF.hJ591VKVH.BBZ CAR
<400> 259
Figure 110107653-A0202-12-0602-1052
Figure 110107653-A0202-12-0603-1053
Figure 110107653-A0202-12-0604-1054
Figure 110107653-A0202-12-0605-1055
Figure 110107653-A0202-12-0606-1057
<210> 260
<211> 2118
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dnTGF.hJ591VKVH.BBZ CAR
<400> 260
Figure 110107653-A0202-12-0606-1058
Figure 110107653-A0202-12-0607-1059
<210> 261
<211> 699
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> dnTGF.hJ591VKVH.ICOSZYMNM CAR
<400> 261
Figure 110107653-A0202-12-0607-1061
Figure 110107653-A0202-12-0608-1062
Figure 110107653-A0202-12-0609-1063
Figure 110107653-A0202-12-0610-1065
Figure 110107653-A0202-12-0611-1067
<210> 262
<211> 2097
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dnTGF.hJ591VKVH.ICOSZYMNM CAR
<400> 262
Figure 110107653-A0202-12-0611-1069
Figure 110107653-A0202-12-0612-1072

Claims (85)

  1. 一種經修飾的免疫細胞或其前體細胞，其包含
    (a)能夠結合前列腺特異性膜抗原(PSMA)的嵌合抗原受體(CAR)，包含抗原結合結構域、跨膜結構域、和細胞內結構域，其中所述抗原結合結構域包含：
    包含SEQ ID NO：183的共通序列的重鏈可變區(VH)；和包含SEQ ID NO：184的共通序列的輕鏈可變區(VL)；和
    (b)顯性負性受體及/或開關受體。
  2. 如請求項1所述的經修飾的細胞，其中所述VH包含SEQ ID NO：191的序列。
  3. 如請求項1或2所述的經修飾的細胞，其中所述VL包含SEQ ID NO：192的序列。
  4. 如請求項1-3中任一項所述的經修飾的細胞，其中所述抗原結合結構域包含抗體或其抗原結合片段。
  5. 如請求項4中任一項所述的經修飾的細胞，其中所述抗原結合片段選自Fab、單鏈可變區片段(scFv)、或單結構域抗體。
  6. 如請求項1所述的經修飾的細胞，其中所述跨膜結構域包含源自CD8的跨膜區。
  7. 如請求項6所述的經修飾的細胞，其中所述源自CD8的跨膜區包含SEQ ID NO：88中列出的胺基酸序列。
  8. 如請求項6或7所述的經修飾的細胞，其中所述跨膜結構域進一步包含源自CD8的鉸鏈區。
  9. 如請求項8所述的經修飾的細胞，其中所述源自CD8的鉸鏈區包含SEQ ID NO：86中列出的胺基酸序列。
  10. 如請求項6至9中任一項所述的經修飾的細胞，其中所述細胞內結構域包含4-1BB信號傳導結構域和CD3 ζ信號傳導結構域。
  11. 如請求項6至10中任一項所述的經修飾的細胞，其中所述細胞內結構域包含ICOS信號傳導結構域和CD3 ζ信號傳導結構域。
  12. 如請求項6至11中任一項所述的經修飾的細胞，其中所述細胞內結構域包含變體ICOS信號傳導結構域和CD3 ζ信號傳導結構域。
  13. 如請求項10所述的經修飾的細胞，其中所述4-1BB信號傳導結構域包含SEQ ID NO：92中列出的胺基酸序列。
  14. 如請求項11所述的經修飾的細胞，其中所述ICOS信號傳導結構域包含SEQ ID NO：203中列出的胺基酸序列。
  15. 如請求項12所述的經修飾的細胞，其中所述變體ICOS信號傳導結構域包含SEQ ID NO：95中列出的胺基酸序列。
  16. 如請求項10至15中任一項所述的經修飾的細胞，其中所述CD3 ζ信號傳導結構域包含SEQ ID NO：97或100中列出的胺基酸序列。
  17. 如前述請求項中任一項所述的經修飾的細胞，其中所述顯性負性受體是與負信號關聯的野生型蛋白質的截短變體。
  18. 如請求項17所述的經修飾的細胞，其中所述與負信號關聯的野生型蛋白質的截短變體包含SEQ ID NO：115中列出的胺基酸序列。
  19. 如請求項1至18中任一項所述的經修飾的細胞，其中所述開關受體包含：第一結構域，其中所述第一結構域源自與負信號關聯的第一多肽；和第二結構域，其中所述第二結構域源自與正信號關聯的第二多肽。
  20. 如請求項19所述的經修飾的細胞，其中所述第一結構域包含所述與負信號關聯的第一多肽的細胞外結構域的至少一部分，並且其中所述第二結構域包含所述與正信號關聯的第二多肽的細胞內結構域的至少一部分。
  21. 如前述如請求項中任一項所述的經修飾的細胞，其中所述開關受體進一步包含開關受體跨膜結構域。
  22. 如請求項21所述的經修飾的細胞，其中所述開關受體跨膜結構域包含：所述與負信號關聯的第一多肽的跨膜結構域；或所述與正信號關聯的第二多肽的跨膜結構域。
  23. 如請求項19至22中任一項所述的經修飾的細胞，其中所述與負信號關聯的第一多肽選自CTLA4、PD-1、BTLA、TIM-3、和TGFβR。
  24. 如請求項19至23中任一項所述的經修飾的細胞，其中所述與正信號關聯的第二多肽選自CD28、ICOS、4-1BB、和IL-12R。
  25. 如請求項19至22中任一項所述的經修飾的細胞，其中所述開關受體包含：第一結構域，包含PD1的細胞外結構域的至少一部分；開關受體跨膜結構域，包含CD28的跨膜結構域的至少一部分；和第二結構域，包含CD28的細胞內結構域的至少一部分。
  26. 如請求項25所述的經修飾的細胞，其中所述開關受體包含SEQ ID NO：117中列出的胺基酸序列。
  27. 如請求項19至22中任一項所述的經修飾的細胞，其中所述開關受體包含：第一結構域，包含PD1的細胞外結構域的至少一部分；開關受體跨膜結構域，包含PD1的跨膜結構域的至少一部分；和第二結構域，包含CD28的細胞內結構域的至少一部分。
  28. 如請求項27所述的經修飾的細胞，其中所述開關受體包含SEQ ID NO：119中列出的胺基酸序列。
  29. 如請求項27所述的經修飾的細胞，其中所述第一結構域包含PD1的細胞外結構域的至少一部分，所述PD1的細胞外結構域包含在胺基酸位置132處丙胺酸(A)至亮胺酸(L)的取代。
  30. 如請求項29所述的經修飾的細胞，其中所述開關受體包含SEQ ID NO：121中列出的胺基酸序列。
  31. 如請求項19至22中任一項所述的經修飾的細胞，其中所述開關受體包含：包含PD1的細胞外結構域的至少一部分的第一結構域，所述PD1的細胞外結構域包含在胺基酸位置132處丙胺酸(A)至亮胺酸(L)的取代；和包含CD28的細胞內結構域的至少一部分的第二結構域。
  32. 如請求項31所述的經修飾的細胞，其中所述開關受體包含SEQ ID NO：121中列出的胺基酸序列。
  33. 如請求項19至21中任一項所述的經修飾的細胞，其中所述開關受體包含：包含PD1的細胞外結構域的至少一部分的第一結構域，所述PD1的細胞外結構域包含在胺基酸位置132處丙胺酸(A)至亮胺酸(L)的取代；和包含4-1BB的細胞內結構域的至少一部分的第二結構域。
  34. 如請求項33所述的經修飾的細胞，其中所述開關受體包含SEQ ID NO：215中列出的胺基酸序列。
  35. 如請求項19至21中任一項所述的經修飾的細胞，其中所述開關受體包含：第一結構域，包含TIM-3的細胞外結構域的至少一部分；和第二結構域，包含CD28的細胞內結構域的至少一部分。
  36. 如請求項35所述的經修飾的細胞，其中所述開關受體包含SEQ ID NO：127中列出的胺基酸序列。
  37. 如請求項19至21中任一項所述的經修飾的細胞，其中所述開關受體包含：第一結構域，包含TGFβR的細胞外結構域的至少一部分；和第二結構域，包含IL12Rα1的細胞內結構域的至少一部分。
  38. 如請求項37所述的經修飾的細胞，其中所述開關受體包含SEQ ID NO：123中列出的胺基酸序列。
  39. 如請求項19至21中任一項所述的經修飾的細胞，其中所述開關受體包含：第一結構域，包含TGFβR的細胞外結構域的至 少一部分；和第二結構域，包含IL12Rβ1的細胞內結構域的至少一部分。
  40. 如請求項39所述的經修飾的細胞，其中所述開關受體包含SEQ ID NO：125中列出的胺基酸序列。
  41. 一種經修飾的免疫細胞或其前體細胞，其包含：
    嵌合抗原受體(CAR)，對目標細胞上的前列腺特異性膜抗原(PSMA)具有親和力，其中所述CAR包含PSMA結合結構域，所述PSMA結合結構域包含：包含SEQ ID NO：191的序列的重鏈可變區(VH)；和包含SEQ ID NO：192的序列的輕鏈可變區(VL)；和
    顯性負性受體，包含SEQ ID NO：115中列出的胺基酸序列。
  42. 一種經修飾的免疫細胞或其前體細胞，其包含：
    嵌合抗原受體(CAR)，對目標細胞上的前列腺特異性膜抗原(PSMA)具有親和力，其中所述CAR包含PSMA結合結構域，所述PSMA結合結構域包含：包含SEQ ID NO：191的序列的重鏈可變區(VH)；和包含SEQ ID NO：192的序列的輕鏈可變區(VL)；和
    開關受體，包含SEQ ID NO：213或215中列出的胺基酸序列。
  43. 一種經修飾的免疫細胞或其前體細胞，其包含：
    嵌合抗原受體(CAR)，對目標細胞上的前列腺特異性膜抗原(PSMA)具有親和力，其中所述CAR包含PSMA結合結構域，所述PSMA結合結構域包含：包含序列SEQ ID NO：191的重鏈可變區(VH)；和包含SEQ ID NO：192的序列的輕鏈可變區(VL)；和
    開關受體，包含SEQ ID NO：117或119中列出的胺基酸序列。
  44. 一種經修飾的免疫細胞或其前體細胞，其包含：
    嵌合抗原受體(CAR)，對目標細胞上的前列腺特異性膜抗原(PSMA)具有親和力，其中所述CAR包含PSMA結合結構域，所述PSMA結合結構域包含：包含SEQ ID NO：191的序列的重鏈可變區(VH)；和包含SEQ ID NO：192的序列的輕鏈可變區(VL)；和
    開關受體，包含SEQ ID NO：121中列出的胺基酸序列。
  45. 一種經修飾的免疫細胞或其前體細胞，其包含：
    嵌合抗原受體(CAR)，對目標細胞上的前列腺特異性膜抗原(PSMA)具有親和力，其中所述CAR包含PSMA結合結構域，所述PSMA結合結構域包含：包含SEQ ID NO：191的序列的重鏈可變區(VH)；和包含SEQ ID NO：192的序列的輕鏈可變區(VL)；和
    開關受體，包含SEQ ID NO：127中列出的胺基酸序列。
  46. 一種經修飾的免疫細胞或其前體細胞，其包含：
    嵌合抗原受體(CAR)，對目標細胞上的前列腺特異性膜抗原(PSMA)具有親和力，其中所述CAR包含PSMA結合結構域，所述PSMA結合結構域包含：包含SEQ ID NO：191的序列的重鏈可變區(VH)；和包含SEQ ID NO：192的序列的輕鏈可變區(VL)；和
    開關受體，包含SEQ ID NO：123中列出的胺基酸序列。
  47. 一種經修飾的免疫細胞或其前體細胞，其包含：
    嵌合抗原受體(CAR)，對目標細胞上的前列腺特異性膜抗原(PSMA)具有親和力，其中所述CAR包含PSMA結合結構域，所述PSMA結合結構域包含：包含SEQ ID NO：191的序列的重鏈可變區(VH)；和包含SEQ ID NO：192的序列的輕鏈可變區(VL)；和
    開關受體，包含SEQ ID NO：125中列出的胺基酸序列。
  48. 如前述如請求項中任一項所述的經修飾的細胞，其中所述經修飾的細胞是經修飾的T細胞。
  49. 如請求項48所述的經修飾的T細胞，其中所述經修飾的T細胞是自體細胞。
  50. 如請求項48所述的經修飾的T細胞，其中所述經修飾的T細胞是同種異體細胞。
  51. 如請求項1至50中任一項所述的經修飾的細胞，其中所述經修飾的細胞是細胞毒性T淋巴細胞(CTL)。
  52. 如前述請求項中任一項所述的經修飾的細胞，其中所述經修飾的細胞源自人類細胞。
  53. 一種單離的核酸，其包含：
    (a)第一核酸序列，編碼能夠結合前列腺特異性膜抗原(PSMA)的嵌合抗原受體(CAR)，所述嵌合抗原受體(CAR)包含抗原結合結構域、跨膜結構域、和細胞內結構域，其中所述抗原結合結構域包含：包含SEQ ID NO：183的共通序列的重鏈可變區(VH)；和包含SEQ ID NO：184的共通序列的輕鏈可變區(VL)；和
    (b)第二核酸序列，編碼顯性負性受體及/或開關受體。
  54. 如請求項53所述的單離的核酸，其中所述VH包含SEQ ID NO：191的序列。
  55. 如請求項53或54所述的單離的核酸，其中所述VL包含SEQ ID NO：192的序列。
  56. 如請求項53所述的單離的核酸，其中所述第一核酸序列包含SEQ ID NO：246、248、250、252、254或256任一個中列出的核酸序列。
  57. 如請求項53所述的單離的核酸，其中所述第二核酸序列包含SEQ ID NO：116、118、120、122、124、126、128、214或216任一個中列出的核酸序列。
  58. 如請求項53至57中任一項所述的單離的核酸，其中所述第一核酸序列和所述第二核酸序列由連接子分隔。
  59. 如請求項58所述的單離的核酸，其中所述連接子包含編碼內部核糖體進入位點(IRES)的核酸序列。
  60. 如請求項58所述的單離的核酸，其中所述連接子包含編碼自切割肽的核酸序列。
  61. 如請求項60所述的單離的核酸，其中所述自切割肽是2A肽。
  62. 如請求項61所述的單離的核酸，其中所述2A肽選自豬捷申病毒-l 2 A(P2A)、明脈扁刺蛾β四體病毒2A(T2A)、馬甲型鼻炎病毒2A(E2A)和口蹄疫病毒2A(F2A)。
  63. 如請求項61所述的單離的核酸，其中所述2A肽是T2A。
  64. 如請求項61所述的單離的核酸，其中所述2A肽是F2A。
  65. 如請求項53至64中任一項所述的單離的核酸，其中所述單離的核酸從5’至3’包含所述第一核酸序列、所述連接子、和所述第二核酸序列。
  66. 如請求項53至64中任一項所述的單離的核酸，其中所述單離的核酸從5’至3’包含所述第二核酸序列、所述連接子和所述第一核酸序列。
  67. 一種單離的核酸，其包含：
    第一核酸序列，編碼能夠結合前列腺特異性膜抗原(PSMA)的嵌合抗原受體(CAR)，所述嵌合抗原受體(CAR)包含抗原結合結構域、跨膜結構域和細胞內結構域，其中所述抗原結合結構域包含：包含SEQ ID NO：191的共通序列的重鏈可變區(VH)；和包含SEQ ID NO：192的共通序列的輕鏈可變區(VL)；和
    第二核酸序列，編碼包含SEQ ID NO：116、118、120、122、124、126、128、214或216任一個中列出的核酸序列的顯性負性受體及/或開關受體。
  68. 一種單離的核酸，其包含：
    第一核酸序列，編碼能夠結合前列腺特異性膜抗原(PSMA)的嵌合抗原受體(CAR)，所述嵌合抗原受體(CAR)包含抗原結合結構域、跨膜結構域、和細胞內結構域，其中所述抗原結合結構域包含：包含SEQ ID NO：191的共通序列的重鏈可變區(VH)；和包含SEQ ID NO：192的共通序列的輕鏈可變區(VL)；和
    第二核酸序列，編碼包含SEQ ID NO：116中列出的核酸序列的顯性負性受體及/或開關受體。
  69. 如請求項68所述的單離的核酸，其中所述第一核酸序列和所述第二核酸序列由包含編碼T2A的核酸序列的連接子分隔。
  70. 如請求項68所述的單離的核酸，其中所述第一核酸序列和所述第二核酸序列由包含編碼F2A的核酸序列的連接子分隔。
  71. 一種表現構建物，其包含如請求項53至70中任一項所述的單離的核酸。
  72. 如請求項71所述的表現構建物，其中所述表現構建物是選自以下的病毒載體：逆轉錄病毒載體、慢病毒載體、腺病毒載體和腺相關病毒載體。
  73. 如請求項71所述的表現構建物，其中所述表現構建物是慢病毒載體。
  74. 如請求項73所述的表現構建物，其中所述慢病毒載體進一步包含EF-l a啟動子。
  75. 如請求項72至74中任一項所述的表現構建物，其中所述慢病毒載體進一步包含rev應答元件(RRE)。
  76. 如請求項72至75中任一項所述的表現構建物，其中所述慢病毒載體進一步包含土撥鼠肝炎病毒轉錄後調控元件(WPRE)。
  77. 如請求項72至76中任一項所述的表現構建物，其中所述慢病毒載體進一步包含cPPT序列。
  78. 如請求項77所述的表現構建物，其中所述慢病毒載體進一步包含EF-l a啟動子、rev應答元件(RRE)、土撥鼠肝炎病毒轉錄後調控元件(WPRE)和cPPT序列。
  79. 如請求項72至78中任一項所述的表現構建物，其中所述慢病毒載體是自失活慢病毒載體。
  80. 一種用於產生如請求項1至52中任一項所述的經修飾的免疫細胞或其前體細胞的方法，其包含將如請求項53至70中任一項所述的核酸，或如請求項71至79中任一項所述的表現構建物中的一個或多個導入所述免疫細胞中。
  81. 一種在需要的對象中治療癌症的方法，所述方法包含向所述對象給予治療有效量的包含如請求項1至52中任一項所述的經修飾的免疫細胞的組合物。
  82. 如請求項81所述的方法，進一步包含向所述對象給予淋巴細胞耗竭化療。
  83. 如請求項82所述的方法，其中所述淋巴細胞耗竭化療包含向所述對象給予治療有效量的環磷醯胺及/或氟達拉濱。
  84. 一種在需要的對象中治療前列腺癌的方法，所述方法包含：
    向所述對象給予淋巴細胞耗竭化療，所述淋巴細胞耗竭化療包含向所述對象給予治療有效量的環磷醯胺；和
    向所述對象給予經修飾的T細胞，所述經修飾的T細胞包含：
    嵌合抗原受體(CAR)，對目標細胞上的前列腺特異性膜抗原(PSMA)具有親和力，其中所述CAR包含抗原結合結構域、跨膜結構域、和細胞內結構域，其中所述抗原結合結構域包含：包含SEQ ID NO：191的共通序列的重鏈可變區(VH)；和包含SEQ ID NO：192的共通序列的輕鏈可變區(VL)；和
    顯性負性受體，包含SEQ ID NO：115中列出的胺基酸序列。
  85. 一種在需要的對象中治療轉移性去勢抵抗性前列腺癌的方法，所述方法包含：
    向所述對象給予淋巴細胞耗竭化療，所述淋巴細胞耗竭化療包含向所述對象給予治療有效量的環磷醯胺；和
    向所述對象給予經修飾的T細胞，所述經修飾的T細胞包含：
    嵌合抗原受體(CAR)，對目標細胞上的前列腺特異性膜抗原(PSMA)具有親和力，其中所述CAR包含抗原結合結構域、跨膜結構域、和細胞內結構域，其中所述抗原結合結構域包含：包含SEQ ID NO：191的共通序列的重鏈可變區(VH)；和包含SEQ ID NO：192的共通序列的輕鏈可變區(VL)；和
    顯性負性受體，包含SEQ ID NO：115中列出的胺基酸序列。
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