TW202019474A - 抗bcma嵌合抗原受體之用途 - Google Patents

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Abstract

本發明提供抗B細胞成熟抗原(BCMA)嵌合抗原受體(CARs)之用途，其用於治療B細胞相關病狀，諸如表現BCMA之癌症。

Description

抗BCMA嵌合抗原受體之用途
本發明係關於治療B細胞相關病狀之方法。更特定言之，本發明係關於包含鼠科抗BCMA抗體或其抗原結合片段之經改良之嵌合抗原受體(CAR)，經基因改造以表現此等CAR之免疫效應細胞，及此等組合物有效治療B細胞相關病狀之用途。
若干重大疾病涉及B淋巴細胞，即，B細胞。異常B細胞生理學亦可導致自體免疫性疾病(包括但不限於全身性紅斑狼瘡(SLE))之發展。B細胞之惡性轉形導致癌症，包括(但不限於)淋巴瘤，例如，多發性骨髓瘤及非霍奇金氏(non-Hodgkins')淋巴瘤。
患有B細胞惡性腫瘤(包括非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)及多發性骨髓瘤(MM))之大多數患者為癌症死亡率之重要貢獻者。B細胞惡性腫瘤對各種治療形式之反應係混合的。由於毒性副作用，治療B細胞惡性腫瘤之傳統方法(包括化療及放射療法)具有有限效用。利用抗CD19、抗CD20、抗CD22、抗CD23、抗CD52、抗CD80及抗HLA-DR治療性抗體之免疫療法已取得有限成功，部分歸因於差的藥物動力學特性、抗體藉由血清蛋白酶之快速消除及在腎小球處過濾、及有限滲透至腫瘤部位及癌細胞上之靶抗原之表現水平。試圖使用表現嵌合抗原受體(CAR)之基因改造細胞亦已取得有限成功。此外，CAR中使用之給定抗原結合域之治療功效係不可預測的：若該抗原結合域結合太強烈，則CAR T細胞誘導大量細胞激素釋放，從而導致視作「細胞激素風暴」之潛在致命性免疫反應，及若該抗原結合域結合太弱，則CAR T細胞於清除癌細胞中不顯示足夠治療功效。
本發明大體上提供改良之治療B細胞相關疾病(例如，多發性骨髓瘤)之方法。
於一實施例中，本文中提供一種清除有需要受試者中之表現B細胞成熟抗原(BCMA)之細胞的方法，其包括對該受試者投與表現針對BCMA之嵌合抗原受體(CAR)之免疫細胞，其中該等免疫細胞以150 x 106 個細胞至450 x 106 個細胞之劑量投與，且其中在該投與之前，該受試者已接受一線或多線先前療法。
於一實施例中，本文中提供一種清除有需要受試者中之表現BCMA之細胞的方法，其包括對該受試者投與表現針對BCMA之嵌合抗原受體(CAR)之免疫細胞，其中該等免疫細胞以150 x 106 個細胞至450 x 106 個細胞之劑量投與，且其中在該投與之前，該受試者已接受一線或多線先前療法，該等先前療法包括下列中之一或多者：蛋白酶體抑制劑、來那度胺(lenalidomide)、泊馬度胺(pomalidomide)、沙利度胺(thalidomide)、硼替佐米(bortezomib)、地塞米松(dexamethasone)、環磷醯胺(cyclophosphamide)、多柔比星(doxorubicin)、卡非佐米(carfilzomib)、伊沙佐米(ixazomib)、順鉑(cisplatin)、多柔比星、依託泊苷(etoposide)、抗CD38抗體、帕比司他(panobinostat)及埃羅妥珠單抗(elotuzumab)。於一實施例中，該抗CD38抗體為達雷木單抗(daratumumab)。
於一實施例中，本文中提供一種清除有需要受試者中之表現BCMA之細胞的方法，其包括對該受試者投與治療上有效量之表現針對B細胞成熟抗原(BCMA)之嵌合抗原受體(CAR)之免疫細胞，其中該等免疫細胞以150 x 106 個細胞至450 x 106 個細胞之劑量投與，且其中在該投與之前，該受試者已接受一線或多線先前療法，該等先前療法包括下列中之一或多者：蛋白酶體抑制劑、來那度胺、泊馬度胺、沙利度胺、硼替佐米、地塞米松、環磷醯胺、多柔比星、卡非佐米、伊沙佐米、順鉑、多柔比星、依託泊苷、抗CD38抗體(諸如達雷木單抗)、帕比司他或埃羅妥珠單抗。
於另一實施例中，本文中提供一種治療有需要受試者中之由表現BCMA之細胞引起之疾病的方法，其包括對該受試者投與表現針對BCMA之嵌合抗原受體(CAR)之免疫細胞，其中該等免疫細胞以150 x 106 個細胞至450 x 106 個細胞之劑量投與，且其中在該投與之前，該受試者已接受一線或多線先前療法。於某些實施例中，根據本文中所述方法治療之由表現BCMA之細胞引起之疾病包括(但不限於)：全身性紅斑狼瘡、類風濕性關節炎、重症肌無力、自體免疫性溶血性貧血、特發性血小板減少性紫癜、抗磷脂症候群、恰加斯氏病(Chagas’ disease)、格雷夫氏病(Grave’s disease)、韋格納氏(Wegener's)肉芽腫病、結節性多動脈炎、斯耶葛籣氏(Sjogren’s)症候群、尋常型天皰瘡、硬皮病、多發性硬化、抗磷脂症候群、ANCA相關血管炎、古德帕斯徹氏病(Goodpasture's disease)、川崎氏病(Kawasaki disease)及急進性腎小球性腎炎。於某些實施例中，根據本文中所述方法治療之由表現BCMA之細胞引起之疾病亦包括(但不限於)：重鏈疾病、原發性或免疫細胞相關聯之澱粉樣變性及未知臨床意義之單株球蛋白增多症(MGUS)。
於另一實施例中，本文中提供一種治療有需要受試者中之由表現BCMA之細胞引起之疾病的方法，其包括對該受試者投與表現針對BCMA之嵌合抗原受體(CAR)之免疫細胞，其中該等免疫細胞以150 x 106 個細胞至450 x 106 個細胞之劑量投與，且其中在該投與之前，該受試者已接受一線或多線先前療法，該等先前療法包括下列中之一或多者：蛋白酶體抑制劑、來那度胺、泊馬度胺、沙利度胺、硼替佐米、地塞米松、環磷醯胺、多柔比星、卡非佐米、伊沙佐米、順鉑、多柔比星、依託泊苷、抗CD38抗體、帕比司他及埃羅妥珠單抗。於一實施例中，該抗CD38抗體為達雷木單抗。
於另一實施例中，本文中提供一種治療有需要受試者中之由表現BCMA之細胞引起之疾病的方法，其包括對該受試者投與治療上有效量之表現針對B細胞成熟抗原(BCMA)之嵌合抗原受體(CAR)之免疫細胞，其中該等免疫細胞以150 x 106 個細胞至450 x 106 個細胞之劑量投與，且其中在該投與之前，該受試者已接受一線或多線先前療法，該等先前療法包括下列中之一或多者：蛋白酶體抑制劑、來那度胺、泊馬度胺、沙利度胺、硼替佐米、地塞米松、環磷醯胺、多柔比星、卡非佐米、伊沙佐米、順鉑、多柔比星、依託泊苷、抗CD38抗體(諸如達雷木單抗)、帕比司他或埃羅妥珠單抗。
於另一實施例中，本文中提供一種治療有需要受試者中之表現BCMA之癌症的方法，其包括對該受試者投與表現針對BCMA之嵌合抗原受體(CAR)之免疫細胞，其中該等免疫細胞以150 x 106 個細胞至450 x 106 個細胞之劑量投與，其中在該投與之前，該受試者已接受一線或多線先前療法。
於另一實施例中，本文中提供一種治療有需要受試者中之表現BCMA之癌症的方法，其包括對該受試者投與表現針對BCMA之嵌合抗原受體(CAR)之免疫細胞，其中該等免疫細胞以150 x 106 個細胞至450 x 106 個細胞之劑量投與，其中在該投與之前，該受試者已接受一線或多線先前療法，該等先前療法包括下列中之一或多者：蛋白酶體抑制劑、來那度胺、泊馬度胺、沙利度胺、硼替佐米、地塞米松、環磷醯胺、多柔比星、卡非佐米、伊沙佐米、順鉑、多柔比星、依託泊苷、抗CD38抗體、帕比司他及埃羅妥珠單抗。於一實施例中，該抗CD38抗體為達雷木單抗。於某些實施例中，該表現BCMA之癌症為多發性骨髓瘤、慢性淋巴球性白血病或非霍奇金氏淋巴瘤(例如，伯基特氏(Burkitt’s)淋巴瘤、慢性淋巴球性白血病/小淋巴球性淋巴瘤(CLL/SLL)、瀰漫性大B細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、免疫母細胞性大細胞淋巴瘤、前體B淋巴母細胞性淋巴瘤或套細胞淋巴瘤)。
於另一實施例中，本文中提供一種治療有需要受試者中之表現BCMA之癌症的方法，其包括對該受試者投與治療上有效量之表現針對B細胞成熟抗原(BCMA)之嵌合抗原受體(CAR)之免疫細胞，其中該等免疫細胞以150 x 106 個細胞至450 x 106 個細胞之劑量投與，其中在該投與之前，該受試者已接受一線或多線先前療法，該等先前療法包括下列中之一或多者：蛋白酶體抑制劑、來那度胺、泊馬度胺、沙利度胺、硼替佐米、地塞米松、環磷醯胺、多柔比星、卡非佐米、伊沙佐米、順鉑、多柔比星、依託泊苷、抗CD38抗體(諸如達雷木單抗)、帕比司他或埃羅妥珠單抗。於某些實施例中，該表現BCMA之癌症為多發性骨髓瘤、慢性淋巴球性白血病或非霍奇金氏淋巴瘤(例如，伯基特氏淋巴瘤、慢性淋巴球性白血病/小淋巴球性淋巴瘤(CLL/SLL)、瀰漫性大B細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、免疫母細胞性大細胞淋巴瘤、前體B淋巴母細胞性淋巴瘤或套細胞淋巴瘤)。
於另一實施例中，本文中提供一種治療有需要受試者中之表現BCMA之癌症的方法，其包括對該受試者投與治療上有效量之表現針對B細胞成熟抗原(BCMA)之嵌合抗原受體(CAR)之免疫細胞，其中該等免疫細胞以150 x 106 個細胞至450 x 106 個細胞之劑量投與，其中在該投與之前，該受試者已接受一線或多線先前療法，該等先前療法包括下列中之一或多者：蛋白酶體抑制劑、來那度胺、泊馬度胺、沙利度胺、硼替佐米、地塞米松、環磷醯胺、多柔比星、卡非佐米、伊沙佐米、順鉑、多柔比星、依託泊苷、抗CD38抗體(諸如達雷木單抗)、帕比司他或埃羅妥珠單抗；且其中該表現BCMA之癌症為多發性骨髓瘤、慢性淋巴球性白血病或非霍奇金氏淋巴瘤(例如，伯基特氏淋巴瘤、慢性淋巴球性白血病/小淋巴球性淋巴瘤(CLL/SLL)、瀰漫性大B細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、免疫母細胞性大細胞淋巴瘤、前體B淋巴母細胞性淋巴瘤及套細胞淋巴瘤)。
於一實施例中，本文中提供一種治療有需要受試者中之復發性、難治性高風險多發性骨髓瘤之方法，其包括對該受試者投與表現針對B細胞成熟抗原(BCMA)之嵌合抗原受體(CAR)之T細胞(例如，自體T細胞)，其中該等T細胞以約150 x 106 個細胞至約600 x 106 個細胞之範圍之劑量投與(例如，輸注)，其中在該投與之前，該受試者已接受一線或多線先前療法(例如，單一先前療法、2種先前療法、3種先前療法、或超過3種先前療法)，該等先前療法包括下列中之一或多者：蛋白酶體抑制劑、免疫調節劑(諸如IMiD化合物)、地塞米松及抗CD38抗體。於一實施例中，本文中提供一種治療有需要受試者中之復發性、難治性或高風險多發性骨髓瘤之方法，其包括對該受試者投與表現針對B細胞成熟抗原(BCMA)之嵌合抗原受體(CAR)之T細胞(例如，自體T細胞)，其中該等T細胞以約150 x 106 個細胞至約600 x 106 個細胞之範圍之劑量投與(例如，輸注)，其中在該投與之前，該受試者已接受一線或多線先前療法(例如，單一先前療法、2種先前療法、3種先前療法、或超過3種先前療法)，該等先前療法包括下列中之一或多者：蛋白酶體抑制劑、來那度胺、泊馬度胺、沙利度胺、硼替佐米、地塞米松、環磷醯胺、多柔比星、卡非佐米、伊沙佐米、順鉑、多柔比星、依託泊苷、及抗CD38抗體(諸如達雷木單抗)、帕比司他或埃羅妥珠單抗。於一些實施例中，該受試者已被診斷患有多發性骨髓瘤。於一實施例中，該受試者患有多發性骨髓瘤，該多發性骨髓瘤為高風險多發性骨髓瘤。於一實施例中，該受試者患有多發性骨髓瘤，該多發性骨髓瘤為復發性且難治性多發性骨髓瘤。於一些實施例中，根據本文中所述方法治療之受試者已接受僅一種先前療法。於一些實施例中，根據本文中所述方法治療之受試者已接受3至7種先前療法。於一些實施例中，根據本文中所述方法治療之受試者已接受超過3種先前療法。於一些實施例中，該受試者對至少一種、兩種或三種治療方案係難治(例如，對所接受之最後一種先前療法難治)，例如，在受試者於完成用治療方案治療之60天內展示疾病進展之情況下。於一實施例中，該方法係用於治療復發性且難治性多發性骨髓瘤。於一實施例中，該方法係用於治療復發性多發性骨髓瘤。於一實施例中，該方法係用於治療難治性多發性骨髓瘤。於一實施例中，該受試者對用蛋白酶體抑制劑、免疫調節劑(諸如IMiD化合物)、地塞米松及/或抗CD38抗體之治療係難治。於一實施例中，該方法係用於治療高風險多發性骨髓瘤。於一些實施例中，該高風險多發性骨髓瘤為R-ISS III期疾病及/或特徵為早期復發之疾病(例如，自最後一次治療方案(諸如用蛋白酶體抑制劑、免疫調節劑及/或地塞米松之最後一次治療方案)日起12個月內疾病進展)。於一實施例中，在投與表現針對B細胞成熟抗原(BCMA)之嵌合抗原受體(CAR)之T細胞之前，已對具有腫瘤之受試者評估BCMA藉由腫瘤之表現。於一實施例中，根據本文中所述方法治療表現BCMA之多發性骨髓瘤。於一些實施例中，該等T細胞藉由靜脈內輸注投與。於一些實施例中，該等T細胞以150 x 106 個細胞至450 x 106 個細胞、300 x 106 個細胞至600 x 106 個細胞、350 x 106 個細胞至600 x 106 個細胞、350 x 106 個細胞至550 x 106 個細胞、400 x 106 個細胞至600 x 106 個細胞、150 x 106 個細胞至300 x 106 個細胞、或400 x 106 個細胞至500 x 106 個細胞之範圍之劑量投與。於一些實施例中，該等T細胞以約150 x 106 個細胞、約200 x 106 個細胞、約250 x 106 個細胞、約300 x 106 個細胞、約350 x 106 個細胞、約400 x 106 個細胞、約450 x 106 個細胞、約500 x 106 個細胞、或約550 x 106 個細胞之劑量投與。於一實施例中，該等T細胞以約450 x 106 個細胞之劑量投與。於一些實施例中，對該受試者投與表現針對B細胞成熟抗原(BCMA)之嵌合抗原受體(CAR)之T細胞之一次輸注。於一些實施例中，重複投與表現針對B細胞成熟抗原(BCMA)之嵌合抗原受體(CAR)之T細胞(例如，可對該受試者投與T細胞之第二劑量)。
於本文中所述實施例中之任一者之特定實施例中，該等表現針對B細胞成熟抗原(BCMA)之嵌合抗原受體(CAR)之免疫細胞以約150 x 106 個細胞至約300 x 106 個細胞之劑量投與。於本文中所述實施例中之任一者之特定實施例中，該等表現針對B細胞成熟抗原(BCMA)之嵌合抗原受體(CAR)之免疫細胞以約350 x 106 個細胞至約550 x 106 個細胞之劑量投與。於本文中所述實施例中之任一者之特定實施例中，該等表現針對B細胞成熟抗原(BCMA)之嵌合抗原受體(CAR)之免疫細胞以約400 x 106 個細胞至約500 x 106 個細胞之劑量投與。於本文中所述實施例中之任一者之特定實施例中，該等表現針對B細胞成熟抗原(BCMA)之嵌合抗原受體(CAR)之免疫細胞以約150 x 106 個細胞至約250 x 106 個細胞之劑量投與。於本文中所述實施例中之任一者之特定實施例中，該等表現針對B細胞成熟抗原(BCMA)之嵌合抗原受體(CAR)之免疫細胞以約300 x 106 個細胞至約500 x 106 個細胞之劑量投與。於本文中所述實施例中之任一者之特定實施例中，該等表現針對B細胞成熟抗原(BCMA)之嵌合抗原受體(CAR)之免疫細胞以約350 x 106 個細胞至約450 x 106 個細胞之劑量投與。於本文中所述實施例中之任一者之特定實施例中，該等表現針對B細胞成熟抗原(BCMA)之嵌合抗原受體(CAR)之免疫細胞以約300 x 106 個細胞至約450 x 106 個細胞之劑量投與。於本文中所述實施例中之任一者之特定實施例中，該等表現針對B細胞成熟抗原(BCMA)之嵌合抗原受體(CAR)之免疫細胞以約250 x 106 個細胞至約450 x 106 個細胞之劑量投與。於本文中所述實施例中之任一者之特定實施例中，該等表現針對B細胞成熟抗原(BCMA)之嵌合抗原受體(CAR)之免疫細胞以約300 x 106 個細胞至約600 x 106 個細胞之劑量投與。於本文中所述實施例中之任一者之特定實施例中，該等表現針對B細胞成熟抗原(BCMA)之嵌合抗原受體(CAR)之免疫細胞以約250 x 106 個細胞至約500 x 106 個細胞之劑量投與。於本文中所述實施例中之任一者之特定實施例中，該等表現針對B細胞成熟抗原(BCMA)之嵌合抗原受體(CAR)之免疫細胞以約350 x 106 個細胞至約500 x 106 個細胞之劑量投與。於本文中所述實施例中之任一者之特定實施例中，該等表現針對B細胞成熟抗原(BCMA)之嵌合抗原受體(CAR)之免疫細胞以約400 x 106 個細胞至約600 x 106 個細胞之劑量投與。於本文中所述實施例中之任一者之特定實施例中，該等表現針對B細胞成熟抗原(BCMA)之嵌合抗原受體(CAR)之免疫細胞以約400 x 106 個細胞至約450 x 106 個細胞之劑量投與。於本文中所述實施例中之任一者之特定實施例中，該等表現針對B細胞成熟抗原(BCMA)之嵌合抗原受體(CAR)之免疫細胞以約200 x 106 個細胞至約400 x 106 個細胞之劑量投與。於本文中所述實施例中之任一者之特定實施例中，該等表現針對B細胞成熟抗原(BCMA)之嵌合抗原受體(CAR)之免疫細胞以約200 x 106 個細胞至約350 x 106 個細胞之劑量投與。於本文中所述實施例中之任一者之特定實施例中，該等表現針對B細胞成熟抗原(BCMA)之嵌合抗原受體(CAR)之免疫細胞以約200 x 106 個細胞至約300 x 106 個細胞之劑量投與。於本文中所述實施例中之任一者之特定實施例中，該等表現針對B細胞成熟抗原(BCMA)之嵌合抗原受體(CAR)之免疫細胞以約450 x 106 個細胞至約500 x 106 個細胞之劑量投與。於本文中所述實施例中之任一者之特定實施例中，該等表現針對B細胞成熟抗原(BCMA)之嵌合抗原受體(CAR)之免疫細胞以約250 x 106 個細胞至約400 x 106 個細胞之劑量投與。於本文中所述實施例中之任一者之特定實施例中，該等表現針對B細胞成熟抗原(BCMA)之嵌合抗原受體(CAR)之免疫細胞以約250 x 106 個細胞至約350 x 106 個細胞之劑量投與。於本文中所述實施例中之任一者之特定實施例中，該等表現針對B細胞成熟抗原(BCMA)之嵌合抗原受體(CAR)之免疫細胞以約450 x 106 個細胞之劑量投與。於本文中所述實施例中之任一者之特定實施例中，該等免疫細胞為T細胞(例如自體T細胞)。於本文中所述實施例中任一者之特定實施例中，正在治療之受試者經歷白血球分離術手術以收集自體免疫細胞用於製造該等表現針對B細胞成熟抗原(BCMA)之嵌合抗原受體(CAR)之免疫細胞，之後將其投與受試者。於本文中所述實施例中之任一者之特定實施例中，該等免疫細胞(例如T細胞)藉由靜脈內輸注投與。
於本文中所揭示實施例中之任一者之特定實施例中，在投與表現針對B細胞成熟抗原(BCMA)之嵌合抗原受體(CAR)之免疫細胞之前，對正在治療之受試者投與淋巴細胞清除(LD)化療。於特定實施例中，LD化療包括氟達拉濱(fludarabine)及/或環磷醯胺。於特定實施例中，LD化療包括氟達拉濱(例如，針對靜脈內投與，約30 mg/m2 )及環磷醯胺(例如，針對靜脈內投與，約300 mg/m2 )持續1、2、3、4、5、6或7天(例如，3天)。於其他特定實施例中，LD化療包括第5.9節中所述之化療劑中之任一者。於特定實施例中，於投與LD化療1、2、3、4、5、6或7天後(例如，於投與LD化療2或3天後)，對該受試者投與表現針對B細胞成熟抗原(BCMA)之嵌合抗原受體(CAR)之免疫細胞。於特定實施例中，在啟動LD化療之前至少或超過1週、至少或超過2週(至少或超過14天)、至少或超過3週、至少或超過4週、至少或超過5週、或至少或超過6週，該受試者尚未接受任何治療。於本文中所揭示實施例中之任一者之特定實施例中，在投與表現針對B細胞成熟抗原(BCMA)之嵌合抗原受體(CAR)之免疫細胞之前，正在治療之受試者已接受僅單一先前療法方案。
於上述實施例中任一者之特定實施例中，在該投與之前，該受試者已接受一線或多線先前療法，該等先前療法包括：達雷木單抗、泊馬度胺及地塞米松(DPd)；達雷木單抗、硼替佐米及地塞米松(DVd)；伊沙佐米、來那度胺及地塞米松(IRd)；達雷木單抗、來那度胺及地塞米松；硼替佐米、來那度胺及地塞米松(RVd)；硼替佐米、環磷醯胺及地塞米松(BCd)；硼替佐米、多柔比星及地塞米松；卡非佐米、來那度胺及地塞米松(CRd)；硼替佐米及地塞米松；硼替佐米、沙利度胺及地塞米松；來那度胺及地塞米松；地塞米松、沙利度胺、順鉑、多柔比星、環磷醯胺、依託泊苷及硼替佐米(VTD-PACE)；來那度胺及低劑量地塞米松；硼替佐米、環磷醯胺及地塞米松；卡非佐米及地塞米松；單獨來那度胺；單獨硼替佐米；單獨達雷木單抗；埃羅妥珠單抗、來那度胺及地塞米松；埃羅妥珠單抗、來那度胺及地塞米松；苯達莫司汀(bendamustine)、硼替佐米及地塞米松；苯達莫司汀、來那度胺及地塞米松；泊馬度胺及地塞米松；泊馬度胺、硼替佐米及地塞米松；泊馬度胺、卡非佐米及地塞米松；硼替佐米及脂質體多柔比星；環磷醯胺、來那度胺及地塞米松；埃羅妥珠單抗、硼替佐米及地塞米松；伊沙佐米及地塞米松；帕比司他、硼替佐米及地塞米松；帕比司他及卡非佐米；或泊馬度胺、環磷醯胺及地塞米松。
於上述實施例中任一者之特定實施例中，在該投與之前，該受試者已接受一線或多線先前療法，該等先前療法包括下列中之一或多者：蛋白酶體抑制劑、來那度胺、泊馬度胺、沙利度胺、硼替佐米、地塞米松(例如，低劑量之地塞米松)、環磷醯胺、多柔比星、卡非佐米、伊沙佐米、順鉑、多柔比星、依託泊苷、苯達莫司汀、脂質體多柔比星、抗CD38抗體、帕比司他及埃羅妥珠單抗。於特定實施例中，該抗CD38抗體為達雷木單抗。
於上述任一者之某些更特定實施例中，該受試者已接受該等線先前療法中之兩者或更多者、該等線先前療法中之三者或更多者、該等線先前療法中之四者或更多者、該等線先前療法中之五者或更多者、該等線先前療法中之六者或更多者、或該等線先前療法中之七者或更多者。於上述任一者之某些其他更特定實施例中，該受試者已接受該等線先前療法之不超過三者、該等線先前療法之不超過兩者、或該等線先前療法之不超過一者。
針對以上實施例中之任一者，在該投與之前，該受試者經歷淋巴細胞清除。針對以上實施例中之任一者，該受試者經歷血球分離術(apheresis)以收集且單離該等免疫細胞(例如，T細胞)。於以上實施例中任一者之特定實施例中，該受試者在該血球分離術時展示：M-蛋白(血清蛋白電泳[sPEP]或尿蛋白電泳[uPEP])：sPEP ≥ 0.5 g/dL或uPEP ≥ 200 mg/24小時；於血清或尿液中無可量測疾病之輕鏈多發性骨髓瘤，具有血清免疫球蛋白游離輕鏈≥ 10 mg/dL及異常血清免疫球蛋白κ λ游離輕鏈比率；及/或美國東岸癌症臨床研究合作組織(ECOG)表現狀態≤ 1。於更特定實施例中，該受試者在血球分離術時額外：已接受該等線先前療法中之至少三者，包括用蛋白酶體抑制劑、免疫調節劑(來那度胺或泊馬度胺)及抗CD38抗體先前療法；已經歷該等至少三種先前療法各者之至少2個連續週期之治療，除非疾病進展為對該線療法之最佳反應；在最近先前線療法之60天或60天內具有疾病進展之證據；及/或已達成對該等線先前療法中之至少一者之反應(最小反應或更佳)。於以上實施例中任一者之特定實施例中，該受試者在該投與時展示：M-蛋白(血清蛋白電泳[sPEP]或尿蛋白電泳[uPEP])：sPEP ≥ 0.5 g/dL或uPEP ≥ 200 mg/24小時；於血清或尿液中無可量測疾病之輕鏈多發性骨髓瘤，具有血清免疫球蛋白游離輕鏈≥ 10 mg/dL及異常血清免疫球蛋白κ λ游離輕鏈比率；及/或美國東岸癌症臨床研究合作組織(ECOG)表現狀態≤ 1。於更特定實施例中，該受試者在投與時額外：已接受該等線先前療法中之至少三者，包括用蛋白酶體抑制劑、免疫調節劑(例如，來那度胺或泊馬度胺)及抗CD38抗體先前療法；已經歷該等至少三種先前療法各者之至少2個連續週期之治療，除非疾病進展為對該線療法之最佳反應；在最近先前療法之60天或60天內具有疾病進展之證據；及/或已達成對該等線先前療法中之至少一者之反應(最小反應或更佳)。
於另一更特定實施例中，該受試者額外：已接受僅一種先前抗骨髓瘤治療方案；具有下列高風險因素：R-ISS III期及早期復發，將該早期復發定義為(i)若該受試者已經歷誘導加上幹細胞移植，則自首次移植日起少於12個月疾病進展；或(ii)若該受試者已僅接受誘導，則自最後治療方案日起＜ 12個月PD，該方案必須含有最低限度蛋白酶體抑制劑、免疫調節劑及地塞米松。
於以上實施例中任一者之特定實施例中，該受試者顯示於該投與後至少六個月之無進展生存期或於該投與後至少十二個月。
於以上實施例中任一者之特定實施例中，該嵌合抗原受體包括靶向BCMA之抗體或抗體片段，例如，單鏈Fv抗體片段(scFv)，例如，BCMA02 scFv。於一實施例中，該嵌合抗原受體包括靶向BCMA之鼠科單鏈Fv抗體片段。於一實施例中，該嵌合抗原受體包括結合BCMA多肽、包含CD8α多肽之鉸鏈域、CD8α跨膜域、CD137 (4-1BB)細胞內共刺激信號域、及CD3ζ主要信號域之鼠科抗BCMA scFv。於一實施例中，該嵌合抗原受體包括靶向BCMA之鼠科scFv，其中該scFV為SEQ ID NO: 9之抗BCMA02 CAR之scFV。於一實施例中，該嵌合抗原受體為或包括SEQ ID NO: 9。於本文中任何實施例之更特定實施例中，該等免疫細胞為bb2121細胞。於一實施例中，該等免疫細胞包含嵌合抗原受體，該嵌合抗原受體包括靶向BCMA之鼠科單鏈Fv抗體片段。於一實施例中，該等免疫細胞包含嵌合抗原受體，該嵌合抗原受體包括結合BCMA多肽、包含CD8α多肽之鉸鏈域、CD8α跨膜域、CD137 (4-1BB)細胞內共刺激信號域、及CD3ζ主要信號域之鼠科抗BCMA scFv。於一實施例中，該等免疫細胞包含嵌合抗原受體，該嵌合抗原受體為或包括SEQ ID NO: 9。
相關申請案之交互參照 本申請案主張2018年7月11日申請之美國臨時專利申請案62/696,802之權利，其揭示內容之全文以引用的方式併入本文中。序列表 本申請案併入參考序列表，該序列表隨本申請案提交，呈ASCII文本檔案，題名為14247-321-185_SEQ_LISTING.txt，在2019年7月3日創建，且具有27,379位元組之大小。4. 序列識別符之簡要描述
SEQ ID NO: 1 至 3 闡述本文中涵蓋之BCMA CAR之示例性輕鏈CDR序列之胺基酸序列。
SEQ ID NO: 4 至 6 闡述本文中涵蓋之BCMA CAR之示例性重鏈CDR序列之胺基酸序列。
SEQ ID NO: 7 闡述本文中涵蓋之BCMA CAR之示例性輕鏈序列之胺基酸序列。
SEQ ID NO: 8 闡述本文中涵蓋之BCMA CAR之示例性重鏈序列之胺基酸序列。
SEQ ID NO: 9 闡述本文中涵蓋之示例性BCMA CAR之胺基酸序列。
SEQ ID NO: 10 闡述編碼本文中涵蓋之示例性BCMA CAR之核苷酸序列。
SEQ ID NO: 11 闡述人類BCMA之胺基酸序列。
SEQ ID NO: 12 至 22 闡述各種連接子之胺基酸序列。
SEQ ID NO: 23 至 35 闡述蛋白酶裂解位點及自裂解多肽裂解位點之胺基酸序列。
SEQ ID NO: 36 闡述編碼BCMA CAR之載體之多核苷酸序列。5. 詳細描述 5.1. 概觀
本發明大體上係關於用於治療B細胞相關病狀之改良之組合物及方法。如本文中所用，術語「B細胞相關病狀」係指涉及不適當B細胞活性之病狀及B細胞惡性腫瘤。
於特定實施例中，本發明係關於使用經基因改造之免疫效應細胞之改良的B細胞相關病狀之授受性細胞療法。遺傳方法提供增強免疫識別及消除癌細胞之潛在方法。一種有前景策略為基因工程改造免疫效應細胞以表現嵌合抗原受體(CAR)，該等嵌合抗原受體重新定向對癌細胞之細胞毒性。然而，治療B細胞病症之現有授受性細胞免疫療法存在危及體液免疫之嚴重風險，因為該等細胞靶向在所有B細胞或大多數B細胞上表現之抗原。因此，此等療法非臨床上所需及因此，此項技術中仍需使避免體液免疫之B細胞相關病狀之更有效療法。
本文中所揭示之改良之授受性細胞療法之組合物及方法提供經基因改造之免疫效應細胞，該等細胞可容易擴增，展示活體內長期續存，且減少體液免疫藉由靶向表現B細胞成熟抗原(BCMA，亦稱作CD269或腫瘤壞死因子受體超家族，成員17；TNFRSF17)之B細胞之損害。
BCMA為腫瘤壞死因子受體超家族之成員(參見，例如，Thompson等人，J. Exp. Medicine , 192(1): 129-135, 2000，及Mackay等人，Annu. Rev. Immunol , 21: 231-264, 2003)。BCMA結合B-細胞活化因子(BAFF)及增殖誘導配位體(APRIL) (參見，例如，Mackay等人，2003及Kalled等人，Immunological Reviews , 204: 43-54, 2005)。在非惡性細胞中，已報導BCMA主要於漿細胞及成熟B細胞之子集中表現(參見，例如，Laabi等人，EMBO J ., 77(1 ): 3897-3904, 1992；Laabi等人，Nucleic Acids Res. , 22(7): 1147-1154, 1994；Kalled等人，2005；O'Connor等人，J. Exp. Medicine, 199(1): 91-97, 2004；及Ng等人，J. Immunol ., 73(2): 807-817, 2004)。BCMA缺乏之小鼠係健康的且具有正常數目之B細胞，但是長壽命漿細胞之存活受損(參見，例如，O'Connor等人，2004；Xu等人，Mol. Cell. Biol., 21(12): 4067-4074, 2001；及Schiemann等人，Science, 293(5537): 2 111-21 14, 2001)。已於多發性骨髓瘤細胞中及於其他淋巴瘤中普遍檢測到BCMA RNA，及已由若干研究者在來自多發性骨髓瘤患者之漿細胞表面上檢測到BCMA蛋白(參見，例如，Novak等人，Blood , 103(2): 689-694, 2004；Neri等人，Clinical Cancer Research , 73(19): 5903-5909, 2007；Bellucci等人，Blood , 105(10): 3945-3950, 2005；及Moreaux等人，Blood , 703(8): 3148-3157, 2004)。
於各種實施例中，包含鼠科抗BCMA抗體序列之CAR相較於包含特定人類抗體序列之BCMA CAR高度有效；經歷穩健活體內擴增；且識別表現BMCA之人類B細胞；顯示對表現BCMA之B細胞之細胞毒性活性；且不顯示誘導細胞激素風暴(一種潛在致命性病狀，其中由經活化之T細胞釋放之細胞激素於系統中建立突然發炎性反應，該反應加速非感染性發熱)之徵兆。
於一實施例中，提供包含鼠科抗BCMA抗體或抗原結合片段、跨膜域及一或多種細胞內信號域之CAR。
於一實施例中，提供經基因改造以表現本文中涵蓋之CAR之免疫效應細胞。本文中將表現CAR之T細胞稱作CAR T細胞或經CAR改造之T細胞。
於各種實施例中，對患有B細胞相關病狀(例如，與B細胞相關之自體免疫性疾病或B細胞惡性腫瘤)之患者投與本文中涵蓋之經基因改造之免疫效應細胞。
除非相反明確指明，否則本發明之實務採用化學、生物化學、有機化學、分子生物學、微生物學、重組DNA技術、遺傳學、免疫學及細胞生物學之習知方法，該等方法係於熟習此項技術者內，其中許多在以下出於說明目的描述。於文獻中充分解釋此等技術。參見，例如，Sambrook等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual (第3版，2001)；Sambrook等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual (第2版，1989)；Maniatis等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982)；Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons，2008年7月更新)；Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology , Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience；Glover,DNA Cloning: A Practical Approach ，第I及II卷(IRL Press, Oxford, 1985)；Anand, Techniques for the Analysis of Complex Genomes , (Academic Press, New York, 1992)；Transcription and Translation (B. Hames及S. Higgins編輯，1984)；Perbal,A Practical Guide to Molecular Cloning (1984)；Harlow及Lane,Antibodies , (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1998)；Current Protocols in Immunology Q. E. Coligan、A. M. Kruisbeek、D. H. Margulies、E. M. Shevach及W. Strober編輯，1991)；Annual Review of Immunology ；以及期刊專著，諸如Advances in Immunology 。5.2. 定義
除非另有指定，否則本文中所用之所有技術及科學術語具有與本發明所屬之一般技術者通常瞭解之含義相同之含義。雖然可於本發明之實務或測試中使用與本文中所述彼等相似或等效之任何方法及材料，但是本文中描述組合物、方法及材料之較佳實施例。出於本發明之目的，以下定義下列術語。
本文中使用冠詞「一(a/an)」及「該」係指該冠詞之語法賓語中之一者或超過一者(即，至少一者，或一或多者)。舉例而言，「一元素」意指一種元素或一或多種元素。
應瞭解，使用替代物(例如，「或」)意指替代物中之一者、兩者或其任何組合。
應瞭解，術語「及/或」意指替代物中之一者或兩者。
如本文中所用，術語「約(about)」、「大約(approximately)」係指變化多達參考數量、水平、值、數目、頻率、百分比、尺寸、大小、量、重量或長度之15%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或1%之數量、水平、值、數目、頻率、百分比、尺寸、大小、量、重量或長度。於一實施例中，術語「約」、「大約」係指約參考數量、水平、值、數目、頻率、百分比、尺寸、大小、量、重量或長度之± 15%、± 10%、± 9%、± 8%、± 7%、± 6%、± 5%、± 4%、± 3%、± 2%或± 1%之數量、水平、值、數目、頻率、百分比、尺寸、大小、量、重量或長度範圍。
整篇本說明書，除非上下文另有要求，否則單詞「包括(comprise/comprises/comprising)」應理解為暗含指定步驟或要素或步驟或要素之群組，但是排除任何其他步驟或要素或步驟或要素之群組。「由…組成」意指包含且限於跟隨短語「由…組成」之任何事物。因此，短語「由…組成」指示所列要素係必需或強制性，且不可存在其他要素。「基本上由…組成」意指包含該短語後所列之任何要素，且限於不干擾或有助於本發明針對所列要素指定之活性或活動之其他要素。因此，短語「基本上由…組成」指示所列要素係必需或強制性，但是不存在實質上影響所列要素之活性或活動之其他要素。
整篇本說明書提及「一個實施例」、「一實施例」、「特定實施例」、「相關實施例」、「某一實施例」、「額外實施例」或「另外實施例」或其組合意指結合該實施例描述之特定特徵、結構或特性包含於本發明之至少一個實施例中。因此，上述短語出現於整篇本說明書之各個地方中不一定全部係指相同實施例。此外，特定特徵、結構或特性可於一或多個實施例中以任何適宜方式組合。亦應瞭解，一個實施例中之特徵之正面詳述用作排除特定實施例中之特徵之基礎。5.3. 嵌合抗原受體
於各種實施例中，提供重新定向免疫效應細胞對B細胞之細胞毒性之經基因工程改造之受體。本文中此等經基因工程改造之受體係指嵌合抗原受體(CAR)。CAR為組合針對所需抗原(例如，BCMA)之基於抗體之特異性與T細胞受體活化細胞內域以產生展示特異性抗BCMA細胞免疫活性之嵌合蛋白的分子。如本文中所用，術語「嵌合」描述由來自不同來源之不同蛋白質或DNA之部分組成。
本文中涵蓋之CAR包含結合至BCMA之細胞外域(亦稱作結合域或抗原特異性結合域)、跨膜域及細胞內信號域。CAR之抗BCMA抗原結合域與靶細胞表面上之BCMA之接合導致CAR之群集且遞送對含CAR細胞之活化刺激。CAR之主要特性為其重新定向免疫效應細胞特異性之能力，從而觸發增生、細胞激素產生、吞噬作用或產生可以主要組織相容性(MHC)獨立方式介導表現靶抗原之細胞之細胞死亡之分子，開發單株抗體、可溶性配位體或細胞特異性共受體之細胞特異性靶向能力。
於各種實施例，CAR包含包含鼠科抗BCMA特異性結合域之細胞外結合域；跨膜域；一或多個細胞內共刺激信號域；及主要信號域。
於特定實施例中，CAR包含包含鼠科抗BCMA抗體或其抗原結合片段之細胞外結合域；一或多個鉸鏈域或間隔子域；包含之跨膜域；一或多個細胞內共刺激信號域；及主要信號域。5.3.1. 結合域
於特定實施例中，本文中涵蓋之CAR包含包含特異性結合至在B細胞上表現之人類BCMA多肽之鼠科抗BCMA抗體或其抗原結合片段之細胞外結合域。如本文中所用，術語「結合域」、「細胞外域」、「細胞外結合域」、「抗原特異性結合域」及「細胞外抗原特異性結合域」可交換使用且提供具有特異性結合至所關注靶抗原(例如，BCMA)之能力之CAR。結合域可源自天然、合成、半合成或重組來源。
如本文中所用，術語「特異性結合親和力」或「特異性結合(specifically binds/specifically bound/specific binding)」或「特異性靶向」描述抗BCMA抗體或其抗原結合片段(或包含其之CAR)在較背景結合更高結合親和力下與BCMA之結合。若結合域以例如大於或等於約105 M-1 之Ka 之親和力(即，具有1/M之單位之特定結合相互作用之平衡解離常數)結合至BCMA或與BCMA締合，則該結合域(或包含結合域之CAR或含有結合域之融合蛋白)「特異性結合」至BCMA。於某些實施例中，結合域(或其融合蛋白)以大於或等於約106 M-1 、107 M-1 、108 M-1 、109 M-1 、1010 M-1 、1011 M-1 、1012 M-1 、或1013 M-1 之Ka 結合至靶。「高親和力」結合域(或其單鏈融合蛋白)係指具有至少107 M‑ 1 、至少108 M-1 、至少109 M-1 、至少1010 M-1 、至少1011 M-1 、至少1012 M-1 、至少1013 M-1 、或更高之Ka 之彼等結合域。
或者，可將親和力定義為具有M之單位之特定結合相互作用之平衡解離常數(Kd ) (例如，10-5 M至10-13 M，或更低)。根據本發明之結合域多肽及CAR蛋白之親和力可使用習知技術，例如，藉由競爭ELISA (酶聯免疫吸附檢定)，或藉由結合締合，或使用標記配位體之置換檢定，或使用表面電漿子共振裝置(諸如Biacore T100，其可獲自Biacore, Inc., Piscataway, NJ)，或光學生物感測器技術，諸如可分別獲自Corning及Perkin Elmer之EPIC系統或EnSpire容易測定(亦參見，例如，Scatchard等人(1949) Ann. N.Y. Acad. Sci. 51:660；及美國專利案第5,283,173號、第5,468,614號或等效物)。
於一實施例中，特異性結合之親和力高於背景結合約2倍，高於背景結合約5倍，高於背景結合約10倍，高於背景結合約20倍，高於背景結合約50倍，高於背景結合約100倍，或高於背景結合約1000倍或更多。
於特定實施例中，CAR之細胞外結合域包含抗體或其抗原結合片段。「抗體」係指結合劑，該結合劑為包含至少一個輕鏈或重鏈免疫球蛋白可變區之多肽，該多肽特異性識別且結合抗原(諸如含有抗原決定子之肽、脂質、多醣或核酸)之抗原決定基，諸如由免疫細胞識別之彼等。
「抗原(Ag)」係指可刺激動物中產生抗體或T細胞反應之化合物、組合物或物質，包括注射或吸收至動物之組合物(諸如包含癌症特異性蛋白者)。抗原與特定體液或細胞免疫之產物反應，該等產物包括藉由異源抗原(諸如所揭示抗原)誘導之彼等。於特定實施例中，靶抗原為BCMA多肽之抗原決定基。
「抗原決定基(epitope)」或「抗原決定子(antigenic determinant)」係指結合劑結合之抗原之區域。抗原決定基可自鄰接胺基酸或藉由蛋白質之三級折疊並置之非鄰接胺基酸二者形成。自鄰接胺基酸形成之抗原決定基通常在暴露於變性溶劑時保留，然而藉由三級折疊形成之抗原決定基通常在用變性溶劑處理時丟失。抗原決定基通常包含以獨特空間構象的至少3個，及更通常，至少5個，約9個，或約8至10個胺基酸。
抗體包含其抗原結合片段，諸如Camel Ig、Ig NAR、Fab片段、Fab'片段、F(ab)'2片段、F(ab)'3片段、Fv、單鏈Fv蛋白(「scFv」)、雙-scFv、(scFv)2 、微抗體、雙抗體、三抗體、四抗體、經二硫醚穩定之Fv蛋白(「dsFv」)、及單域抗體(sdAb，奈米抗體)及負責抗原結合之全長抗體部分。該術語亦包括經基因工程改造之形式，諸如嵌合抗體(例如，人源化鼠科抗體)、異結合物抗體(諸如，雙特異性抗體)及其抗原結合片段。亦參見，Pierce Catalog及Handbook, 1994-1995 (Pierce Chemical Co., Rockford, IL)；Kuby, J., Immunology，第3版，W. H. Freeman & Co., New York, 1997。
如熟習者將瞭解及如本文中其他地方所述，完全抗體包含兩條重鏈及兩條輕鏈。各重鏈由可變區及第一、第二及第三恆定區組成，而各輕鏈由可變區及恆定區組成。將哺乳動物重鏈分類為α、δ、ε、γ及μ。將哺乳動物輕鏈分類為λ或κ。將包含α、δ、ε、γ及μ重鏈之免疫球蛋白分類為免疫球蛋白(Ig)A、IgD、IgE、IgG及IgM。完全抗體形成「Y」形狀。Y之莖由結合在一起之兩條重鏈之第二及第三恆定區(及針對IgE及IgM，第四恆定區)組成且於鉸鏈中形成二硫鍵(鏈間)。重鏈γ、α及δ具有由三個串聯(一行) Ig域組成之恆定區及用於增加可撓性之鉸鏈區；重鏈μ及ε具有由四個免疫球蛋白域組成之恆定區。將第二及第三恆定區各自稱作「CH2域」及「CH3域」。Y之各臂包含結合至單個輕鏈之可變區及恆定區之單個重鏈之可變區及第一恆定區。輕鏈及重鏈之可變區負責抗原結合。
輕鏈及重鏈可變區含有由三個超可變區中斷之「框架」區，亦稱作「互補決定區」或「CDR」。CDR可藉由習知方法，諸如藉由根據Kabat等人之序列(Wu, TT及Kabat, E. A.,J Exp Med . 132(2):211-50, (1970)；Borden, P.及Kabat E. A.,PNAS , 84: 2440-2443 (1987)；(參見，Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, 1991，其以引用的方式併入本文中)或藉由根據Chothia等人之結構(Chothia, C.及Lesk, A.M.,J Mol. Biol ., 196(4): 901-917 (1987)，Chothia, C.等人，Nature , 342: 877 - 883 (1989))定義或識別。
不同輕鏈或重鏈之框架區之序列於物種(諸如人類)中相對保守。抗體之框架區(為構成輕鏈及重鏈之組合框架區)用於於三維空間中定位及對準CDR。CDR主要負責結合至抗原之抗原決定基。通常將各鏈之CDR稱作CDR1、CDR2及CDR3 (自N端開始依序編號)，且通常亦藉由特定CDR所在之鏈識別。因此，將位於抗體之重鏈可變域中之CDR稱作CDRH1、CDRH2及CDRH3，然而將位於抗體之輕鏈可變域中之CDR稱作CDRL1、CDRL2及CDRL3。具有不同特異性(即，針對不同抗原之不同組合位點)之抗體具有不同CDR。雖然其為抗體間變化之CDR，但是CDR內之僅有限數目之胺基酸位置直接涉及抗原結合。將CDR內之此等位置稱作特異性決定殘基(SDR)。適用於構築本文中涵蓋之人源化BCMA CAR之輕鏈CDR之說明性實例包括(但不限於) SEQ ID NO: 1至3中所述之CDR序列。適用於構築本文中涵蓋之人源化BCMA CAR之重鏈CDR之說明性實例包括(但不限於) SEQ ID NO: 4至6中所述之CDR序列。
提及「VH」或「VH」係指免疫球蛋白重鏈可變區，包括抗體、Fv、scFv、dsFv、Fab或如本文中所揭示之其他抗體片段之重鏈可變區。提及「VL」或「VL」係指免疫球蛋白輕鏈可變區，包括抗體、Fv、scFv、dsFv、Fab或如本文中所揭示之其他抗體片段之輕鏈可變區。
「單株抗體」為藉由B淋巴細胞之單一純系或藉由轉染單一抗體之輕鏈及重鏈基因之細胞產生之抗體。單株抗體係藉由熟習此項技術者已知之方法，例如藉由自骨髓瘤細胞與免疫脾細胞之融合製備雜交抗體形成細胞產生。單株抗體包括人源化單株抗體。
「嵌合抗體」具有來自一個物種(諸如人類)之框架殘基及來自另一物種(諸如小鼠)之CDR (其一般賦予抗原結合)。於特定較佳實施例中，本文中涵蓋之CAR包含抗原特異性結合域，該抗原特異性結合域為嵌合抗體或其抗原結合片段。
「人源化」抗體為包含人類框架區及來自非人類(例如小鼠、大鼠或合成)免疫球蛋白之一或多個CDR之免疫球蛋白。將提供CDR之非人類免疫球蛋白稱作「供體」，且將提供框架之人類免疫球蛋白稱作「受體」。
於特定實施例中，鼠科抗BCMA抗體或其抗原結合片段包括(但不限於) Camel Ig (駱駝樣抗體(VHH))、Ig NAR、Fab片段、Fab'片段、F(ab)'2 片段、F(ab)'3 片段、Fv、單鏈Fv抗體(「scFv」)、bis-scFv、(scFv)2 、微抗體、雙抗體、三抗體、四抗體、經二硫醚穩定之Fv蛋白(「dsFv」)、及單域抗體(sdAb，奈米抗體)。
如本文中所用，「Camel Ig」或「駱駝樣VHH」係指重鏈抗體之最小已知抗原結合單元(Koch-Nolte等人，FASEB J., 21: 3490-3498 (2007))。「重鏈抗體」或「駱駝樣抗體」係指含有兩個VH域且無輕鏈之抗體(Riechmann L.等人，J. Immunol. Methods 231:25-38 (1999)；WO94/04678；WO94/25591；美國專利案第6,005,079號)。
「免疫球蛋白新抗原受體」之「IgNAR」係指來自鯊魚免疫庫之抗體類別，該庫由一個可變新抗原受體(VNAR)域及五個恆定新抗原受體(CNAR)域之同源二聚體組成。IgNAR表示最小已知免疫球蛋白基蛋白支架中之一些且高度穩定且具有有效結合特性。固有穩定性可歸因於以下二者：(i)下層Ig支架，其表示相較於鼠科抗體中發現之習知抗體VH及VL域之相當多帶電及親水性表面暴露殘基；及(ii)使包含環間二硫橋及環內氫鍵模式之互變決定區(CDR)環路中之結構特徵穩定。
抗體之木瓜蛋白酶消化產生兩個相同抗原結合片段，稱作「Fab」片段，各自具有單一抗原結合位點及殘餘「Fc」片段，其名稱反映其容易結晶之能力。木瓜蛋白酶處理產生F(ab′)2片段，該片段具有兩個抗原結合位點且仍能交聯抗原。
「Fv」為含有完全抗原結合位點之最小抗體片段。於一實施例中，雙鏈Fv物質由緊密非共價締合之一個重鏈及一個輕鏈可變域之二聚體組成。於單鏈Fv (scFv)物質中，一個重鏈及一個輕鏈可變域可藉由可撓性肽連接子共價連接使得輕鏈及重鏈可以類似於雙鏈Fv物質之「二聚體」結構締合。於此組態中各可變域之三個超可變區(HVR)相互作用以定義VH-VL二聚體表面上之抗原結合位點。共同地，該等六個HVR賦予對抗體之抗原結合特異性。然而，即使單個可變域(或僅包含對抗原特異性之三個HVR之Fv之一半)也具有識別且結合抗原之能力，但是以較整個結合位點更低的親和力。
Fab片段含有重鏈及輕鏈可變域且亦含有輕鏈之恆定域及重鏈之第一恆定域(CH1)。Fab′片段藉由在重鏈CH1域之羧基端處添加少量殘基不同於Fab片段，該重鏈CH1域包含來自抗體鉸鏈區之一或多個半胱胺酸。本文中Fab′-SH為針對Fab′之名稱，其中恆定域之半胱胺酸殘基含游離硫醇基。F(ab′)2抗體片段最初作為Fab′片段對產生，該等Fab′片段具有其間鉸鏈半胱胺酸。抗體片段之其他化學偶合亦係已知。
術語「雙抗體」係指具有兩個抗原結合位點之抗體片段，該等片段包含連接至相同多肽鏈(VH-VL)中之輕鏈可變域(VL)之重鏈可變域(VH)。藉由使用太短而不允許相同鏈上之兩個域之間配對之連接子，強迫該等域與另一條鏈之互補域配對並創建兩個抗原結合位點。雙抗體可係二價或雙特異性。雙抗體更充分述於例如EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等人，Nat.  Med. 9:129-134 (2003)；及Hollinger等人，PNAS USA 90: 6444-6448 (1993)中。三抗體及四抗體亦述於Hudson等人，Nat.  Med. 9:129-134 (2003)中。
「單域抗體」或「sdAb」或「奈米抗體」係指由抗體重鏈可變區(VH域)或抗體輕鏈可變區(VL域)組成之抗體片段(Holt, L.等人，2003, Trends in Biotechnology, 21(11): 484-490)。
「單鏈Fv」或「scFv」抗體片段包含抗體之VH及VL域，其中此等域存在於單個多肽鏈中且呈任一取向(例如，VL-VH或VH-VL)。一般而言，scFv多肽進一步包含VH與VL域之間之多肽連接子，該連接子使scFv能形成抗原結合之所需結構。針對scFv之評論，參見，例如，Pluckthün, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg及Moore編輯，(Springer-Verlag, New York, 1994)，第269至315頁。
於較佳實施例中，本文中涵蓋之CAR包含為鼠科scFv之抗原特異性結合域。單鏈抗體可自對所需靶具特異性之雜交瘤之V區基因選殖。此等雜交瘤之產生已變得常規。可用於選殖可變區重鏈(VH)及可變區輕鏈(VL)之技術已述於例如Orlandi等人，PNAS, 1989; 86: 3833-3837中。
於特定實施例中，為鼠科scFv之抗原特異性結合域結合人類BCMA多肽。適用於構築本文中涵蓋之BCMA CAR之可變重鏈之說明性實例包括(但不限於) SEQ ID NO: 8中所述之胺基酸序列。適用於構築本文中涵蓋之BCMA CAR之可變輕鏈之說明性實例包括(但不限於) SEQ ID NO: 7中所述之胺基酸序列。
本文中所提供之BCMA特異性結合域亦包含1、2、3、4、5或6個CDR。此等CDR可為選自輕鏈之CDRL1、CDRL2及CDRL3及重鏈之CDRH1、CDRH2及CDRH3之非人類CDR或改變之非人類CDR。於某些實施例中，BCMA特異性結合域包含(a)包含輕鏈CDRL1、輕鏈CDRL2及輕鏈CDRL3之輕鏈可變區，及(b)包含重鏈CDRH1、重鏈CDRH2及重鏈CDRH3之重鏈可變區。5.3.2. 連接子
於某些實施例中，本文中涵蓋之CAR可包含各種域之間之連接子殘基，例如，針對適宜間隔及分子構象添加。於特定實施例中，連接子為可變區連接序列。「可變區連接序列」為連接VH 及VL 域之胺基酸序列且提供與兩個亞結合域之相互作用相容之間隔子功能使得所得多肽保留對與包含相同輕鏈及重鏈可變區之抗體相同之靶分子之特異性結合親和力。本文中涵蓋之CAR可包含1、2、3、4或5或更多個連接子。於特定實施例中，連接子之長度為約1至約25個胺基酸、約5至約20個胺基酸、或約10至約20個胺基酸、或胺基酸之任何中間長度。於一些實施例中，連接子係1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多個胺基酸長。
連接子之說明性實例包括甘胺酸聚合物(G)n ；甘胺酸-絲胺酸聚合物(G1-5 S1-5 )n ，其中n為至少1、2、3、4或5之整數；甘胺酸-丙胺酸聚合物；丙胺酸-絲胺酸聚合物；及此項技術中已知之其他可撓性連接子。甘胺酸及甘胺酸-絲胺酸聚合物係相對非結構化，及因此可用作融合蛋白(諸如本文中所述之CAR)之域之間之中性繩。甘胺酸較甚至丙胺酸進入顯著更多phi-psi空間，且較具有更長側鏈之殘基受限少得多(參見Scheraga,Rev. Computational Chem . 11173-142 (1992))。一般熟習技工將知曉特定實施例中之CAR之設計可包含全部或部分可撓性之連接子，使得該連接子可包含可撓性連接子以及為提供所需CAR結構賦予較少可撓性結構之一或多個部分。
其他示例性連接子包括(但不限於)下列胺基酸序列：GGG；DGGGS (SEQ ID NO: 12)；TGEKP (SEQ ID NO: 13) (參見，例如，Liu等人，PNAS 5525-5530 (1997))；GGRR (SEQ ID NO: 14) (Pomerantz等人，1995，見上)；(GGGGS)n 其中n = 1、2、3、4或5，且其中將GGGGS識別為SEQ ID NO: 15 (Kim等人，PNAS 93, 1156-1160 (1996.)；EGKSSGSGSESKVD (SEQ ID NO: 16) (Chaudhary等人，1990, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:1066-1070)；KESGSVSSEQLAQFRSLD (SEQ ID NO: 17) (Bird等人，1988, Science 242:423-426)，GGRRGGGS (SEQ ID NO: 18)；LRQRDGERP (SEQ ID NO: 19)；LRQKDGGGSERP (SEQ ID NO: 20)；LRQKd(GGGS)2 ERP (SEQ ID NO: 21)。或者，可使用能建模DNA結合位點及肽自身二者之電腦程式(Desjarlais及Berg，PNAS 90:2256-2260 (1993),PNAS 91:11099-11103 (1994))或藉由噬菌體展示方法合理設計可撓性連接子。於一實施例中，連接子包含下列胺基酸序列：GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 22) (Cooper等人，Blood , 101(4): 1637-1644 (2003))。 5.3.3.間隔子域
於特定實施例中，CAR之結合域後面為一或多個「間隔子域」，該「間隔子域」係指自效應細胞表面移走抗原結合域以使能適當細胞/細胞接觸、抗原結合及活化之區(Patel等人，Gene Therapy , 1999; 6: 412-419)。間隔子域可源自天然、合成、半合成或重組來源。於某些實施例中，間隔子域為免疫球蛋白之部分，包括(但不限於)一或多個重鏈恆定區，例如，CH2及CH3。間隔子域可包含天然產生之免疫球蛋白鉸鏈區或改變之免疫球蛋白鉸鏈區之胺基酸序列。
於一實施例中，間隔子域包含IgG1或IgG4之CH2及CH3域。5.3.4. 鉸鏈域
CAR之結合域後面一般為一或多個「鉸鏈域」，該等「鉸鏈域」於定位遠離效應細胞表面之抗原結合域以使能適當細胞/細胞接觸、抗原結合及活化中起作用。CAR一般包含結合域與跨膜域(TM)之間之一或多個鉸鏈域。鉸鏈域可源自天然、合成、半合成或重組來源。鉸鏈域可包含天然產生之免疫球蛋白鉸鏈區或改變之免疫球蛋白鉸鏈區之胺基酸序列。
「改變之鉸鏈區」係指(a)具有多達30%胺基酸改變(例如，多達25%、20%、15%、10%或5%胺基酸置換或缺失)之天然產生之鉸鏈區，(b)具有多達30%胺基酸改變(例如，多達25%、20%、15%、10%或5%胺基酸置換或缺失)之至少10個胺基酸(例如，至少12、13、14或15個胺基酸)長之天然產生之鉸鏈區的一部分，或(c)包含核心鉸鏈區(其長度可為4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、或15，或至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15個胺基酸)之天然產生之鉸鏈區的一部分。於某些實施例中，天然產生之免疫球蛋白鉸鏈區中之一或多個半胱胺酸殘基可經一或多個其他胺基酸殘基(例如，一或多個絲胺酸殘基)置換。改變之免疫球蛋白鉸鏈區可替代或額外具有經另一胺基酸殘基(例如，絲胺酸殘基)置換之野生型免疫球蛋白鉸鏈區之脯胺酸殘基。
適用於本文中所述之CAR之其他說明性鉸鏈域包含源自1型膜蛋白之細胞外區(諸如CD8α、CD4、CD28及CD7)之鉸鏈區，其可為來自此等分子之野生型鉸鏈區或可經改變。於另一實施例中，鉸鏈域包含CD8α鉸鏈區。5.3.5. 跨膜域
跨膜(TM)域為CAR之部分，其融合細胞外結合部分及細胞內信號域且將CAR錨定至免疫效應細胞之血漿膜。TM域可源自天然、合成、半合成或重組來源。TM域可源自(即，包含以下之至少跨膜區)：T-細胞受體之α、β或ζ鏈、CD3ε、CD3ζ、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD27、CD28、CD33、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD152、CD154、及PD-1。於特定實施例中，TM域係合成且主要包含疏水性殘基，諸如白胺酸及纈胺酸。
於一實施例中，本文中涵蓋之CAR包含源自CD8α之TM域。於另一實施例中，本文中涵蓋之CAR包含源自CD8α之TM域及短寡肽或多肽連接子，較佳地長度1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸之間，該連接子連接CAR之TM域及細胞內信號域。基於甘胺酸-絲胺酸之連接子提供特別適宜連接子。5.3.6. 細胞內信號域
於特定實施例中，本文中涵蓋之CAR包含細胞內信號域。「細胞內信號域」係指CAR之部分，該部分參與將有效BCMA CAR結合至人類BCMA多肽之訊息轉導至免疫效應細胞內部以引起效應細胞功能，例如，活化、細胞激素產生、增生及細胞毒性活性，包括細胞毒性因子釋放至CAR-結合靶細胞，或利用抗原結合至細胞外CAR域引起之其他細胞反應。
術語「效應功能」係指免疫效應細胞之專有功能。T細胞之效應功能(例如)可為溶細胞性活性或輔助活性(包括分泌細胞激素)。因此，術語「細胞內信號域」係指轉導效應功能信號且指導細胞表現專有功能之蛋白質之部分。雖然通常可採用全細胞內信號域，但是於許多情況下不一定使用全域。就使用細胞內信號域之截短部分而言，可使用此截短部分代替全域，只要其轉導效應功能信號。術語細胞內信號域意指包括足以轉導效應功能信號之細胞內信號域之任何截短部分。
已知通過單獨TCR產生之信號不足以完全活化T細胞及亦需要二級或共刺激信號。因此，可稱T細胞活化藉由兩種不同類別之細胞內信號域介導：通過TCR (例如，TCR/CD3複合物)啟動抗原依賴性主要活化之主要信號域及以抗原獨立性方式作用以提供二級或共刺激信號之共刺激信號域。於較佳實施例中，本文中涵蓋之CAR包含細胞內信號域，該細胞內信號域包括一或多個「共刺激信號域」及「主要信號域」。
主要信號域以刺激方式或以抑制方式調節TCR複合物之主要活化。以刺激方式作用之主要信號域可含有信號基序，將該等信號基序稱作基於免疫受體酪胺酸之活化基序或ITAM。
於本發明中具特別用途之含ITAM之主要信號域之說明性實例包括源自TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b、及CD66d之彼等。於特別佳實施例中，CAR包含CD3ζ主要信號域及一或多個共刺激信號域。可將細胞內主要信號域及共刺激信號域以任何順序串聯連接至跨膜域之羧基端。
本文中涵蓋之CAR包含一或多個共刺激信號域以增強表現CAR受體之T細胞之功效及擴增。如本文中所用，術語「共刺激信號域」或「共刺激域」係指共刺激分子之細胞內信號域。共刺激分子為除了抗原受體或Fc受體外之細胞表面分子，該等分子提供在結合至抗原後T淋巴細胞之有效活化及功能所需之第二信號。此等共刺激分子之說明性實例包括CARD11、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54 (ICAM)、CD83、CD134 (OX40)、CD137 (4-1BB)、CD150 (SLAMF1)、CD152 (CTLA4)、CD223 (LAG3)、CD270 (HVEM)、CD273 (PD-L2)、CD274 (PD-L1)、CD278 (ICOS)、DAP10、LAT、NKD2C SLP76、TRIM、及ZAP70。於一實施例中，CAR包含選自由CD28、CD137及CD134組成之群之一或多個共刺激信號域及CD3ζ主要信號域。
於另一實施例中，CAR包含CD28及CD137共刺激信號域及CD3ζ主要信號域。
於又一實施例中，CAR包含CD28及CD134共刺激信號域及CD3ζ主要信號域。
於一實施例中，CAR包含CD137及CD134共刺激信號域及CD3ζ主要信號域。
於特定實施例中，本文中涵蓋之CAR包含特異性結合至在B細胞上表現之BCMA多肽之鼠科抗BCMA抗體或其抗原結合片段。
於一實施例中，CAR包含結合BCMA多肽之鼠科抗BCMA scFv；源自選自由以下組成之群之多肽之跨膜域：T-細胞受體之α、β或ζ鏈、CD3ε、CD3ζ、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD27、CD28、CD33、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD152、CD154、及PD1；及來自選自由以下組成之群之共刺激分子之一或多個細胞內共刺激信號域：CARD11、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54 (ICAM)、CD83、CD134 (OX40)、CD137 (4-1BB)、CD150 (SLAMF1)、CD152 (CTLA4)、CD223 (LAG3)、CD270 (HVEM)、CD273 (PD-L2)、CD274 (PD-L1)、CD278 (ICOS)、DAP10、LAT、NKD2C SLP76、TRIM、及ZAP70；及來自TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b、及CD66d之主要信號域。
於一實施例中，CAR包含結合BCMA多肽之鼠科抗BCMA scFv；源自選自由以下組成之群之多肽之跨膜域：T-細胞受體之α、β或ζ鏈、CD3ε、CD3ζ、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD27、CD28、CD33、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD152、CD154、及PD1；及來自選自由以下組成之群之共刺激分子之一或多個細胞內共刺激信號域：CARD11、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54 (ICAM)、CD83、CD134 (OX40)、CD137 (4-1BB)、CD150 (SLAMF1)、CD152 (CTLA4)、CD223 (LAG3)、CD270 (HVEM)、CD273 (PD-L2)、CD274 (PD-L1)、CD278 (ICOS)、DAP10、LAT、NKD2C SLP76、TRIM、及ZAP70；及來自選自由以下組成之群之多肽之一或多個主要信號域：TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b、及CD66d。
於一實施例中，CAR包含結合BCMA多肽之鼠科抗BCMA scFv；選自由以下組成之群之鉸鏈域：IgG1鉸鏈/CH2/CH3、IgG4鉸鏈/CH2/CH3及CD8α鉸鏈；源自選自由以下組成之群之多肽之跨膜域：T-細胞受體之α、β或ζ鏈、CD3ε、CD3ζ、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD27、CD28、CD33、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD152、CD154、及PD1；及來自選自由以下組成之群之共刺激分子之一或多個細胞內共刺激信號域：CARD11、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54 (ICAM)、CD83、CD134 (OX40)、CD137 (4-1BB)、CD150 (SLAMF1)、CD152 (CTLA4)、CD223 (LAG3)、CD270 (HVEM)、CD273 (PD-L2)、CD274 (PD-L1)、CD278 (ICOS)、DAP10、LAT、NKD2C SLP76、TRIM、及ZAP70；及來自TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b、及CD66d之主要信號域。
於一實施例中，CAR包含結合BCMA多肽之鼠科抗BCMA scFv；選自由以下組成之群之鉸鏈域：IgG1鉸鏈/CH2/CH3、IgG4鉸鏈/CH2/CH3及CD8α鉸鏈；源自選自由以下組成之群之多肽之跨膜域：T-細胞受體之α、β或ζ鏈、CD3ε、CD3ζ、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD27、CD28、CD33、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD152、CD154、及PD1；及來自選自由以下組成之群之共刺激分子之一或多個細胞內共刺激信號域：CARD11、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54 (ICAM)、CD83、CD134 (OX40)、CD137 (4-1BB)、CD150 (SLAMF1)、CD152 (CTLA4)、CD223 (LAG3)、CD270 (HVEM)、CD273 (PD-L2)、CD274 (PD-L1)、CD278 (ICOS)、DAP10、LAT、NKD2C SLP76、TRIM、及ZAP70；及來自選自由以下組成之群之多肽之一或多個主要信號域：TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b、及CD66d。
於一實施例中，CAR包含結合BCMA多肽之鼠科抗BCMA scFv；選自由以下組成之群之鉸鏈域：IgG1鉸鏈/CH2/CH3、IgG4鉸鏈/CH2/CH3及CD8α鉸鏈；源自選自由以下組成之群之多肽之跨膜域：T-細胞受體之α、β或ζ鏈、CD3ε、CD3ζ、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD27、CD28、CD33、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD152、CD154、及PD1；短寡肽或多肽連接子，較佳地長度在1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸之間，該連接子將TM域連接至CAR之細胞內信號域；及來自選自由以下組成之群之共刺激分子之一或多個細胞內共刺激信號域：CARD11、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54 (ICAM)、CD83、CD134 (OX40)、CD137 (4-1BB)、CD150 (SLAMF1)、CD152 (CTLA4)、CD223 (LAG3)、CD270 (HVEM)、CD273 (PD-L2)、CD274 (PD-L1)、CD278 (ICOS)、DAP10、LAT、NKD2C SLP76、TRIM、及ZAP70；及來自TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b、及CD66d之主要信號域。
於一實施例中，CAR包含結合BCMA多肽之鼠科抗BCMA scFv；選自由以下組成之群之鉸鏈域：IgG1鉸鏈/CH2/CH3、IgG4鉸鏈/CH2/CH3及CD8α鉸鏈；源自選自由以下組成之群之多肽之跨膜域：T-細胞受體之α、β或ζ鏈、CD3ε、CD3ζ、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD27、CD28、CD33、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD152、CD154、及PD1；短寡肽或多肽連接子，較佳地長度在1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸之間，該連接子將TM域連接至CAR之細胞內信號域；及來自選自由以下組成之群之共刺激分子之一或多個細胞內共刺激信號域：CARD11、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54 (ICAM)、CD83、CD134 (OX40)、CD137 (4-1BB)、CD150 (SLAMF1)、CD152 (CTLA4)、CD223 (LAG3)、CD270 (HVEM)、CD273 (PD-L2)、CD274 (PD-L1)、CD278 (ICOS)、DAP10、LAT、NKD2C SLP76、TRIM、及ZAP70；及來自選自由以下組成之群之多肽之一或多個主要信號域：TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b、及CD66d。
於一特定實施例中，CAR包含結合BCMA多肽之鼠科抗BCMA scFv；包含IgG1鉸鏈/CH2/CH3多肽及CD8α多肽之鉸鏈域；包含約3至約10個胺基酸之多肽連接子之CD8α跨膜域；CD137細胞內共刺激信號域；及CD3ζ主要信號域。
於一特定實施例中，CAR包含結合BCMA多肽之鼠科抗BCMA scFv；包含CD8α多肽之鉸鏈域；包含約3至約10個胺基酸之多肽連接子之CD8α跨膜域；CD134細胞內共刺激信號域；及CD3ζ主要信號域。
於一特定實施例中，CAR包含結合BCMA多肽之鼠科抗BCMA scFv；包含CD8α多肽之鉸鏈域；包含約3至約10個胺基酸之多肽連接子之CD8α跨膜域；CD28細胞內共刺激信號域；及CD3ζ主要信號域。
於一特定實施例中，CAR包含結合BCMA多肽之鼠科抗BCMA scFv；包含CD8α多肽之鉸鏈域；CD8α跨膜域；CD137 (4-1BB)細胞內共刺激信號域；及CD3ζ主要信號域。
此外，本文中涵蓋之CAR之設計使能於表現CAR之T細胞中相較於未經改造之T細胞或經改造以表現其他CAR之T細胞之改善的擴增、長期續存及可容許細胞毒性。5.4. 多肽
本發明涵蓋部分CAR多肽及其片段、細胞及包含其之組合物、及表現多肽之載體。於較佳實施例中，提供如SEQ ID NO: 9中所述之包含一或多個CAR之多肽。
除非相反指明，否則「多肽」、「多肽片段」、「肽」及「蛋白質」可交換使用，且根據習知含義，即，作為胺基酸序列。多肽不限於特定長度，例如，其可包含全長蛋白序列或全長蛋白之片段，且可包含多肽之轉譯後修飾，例如，糖基化、乙醯化、磷酸化及類似者，以及此項技術中已知之其他修飾，天然產生及非天然產生二者。於各種實施例中，本文中涵蓋之CAR多肽包含蛋白質之N末端處之信號(或前導)序列，其共同轉譯或轉譯後指導蛋白質之轉移。可用於本文中所揭示之CAR之適宜信號序列之說明性實例包括(但不限於) IgG1重鏈信號序列及CD8α信號序列。可使用各種熟知重組及/或合成技術中之任一者製備多肽。本文中涵蓋之多肽具體而言包含本發明之CAR或具有如本文中所揭示之CAR之一或多種胺基酸之缺失、新增及/或置換之序列。
如本文中所用，「經單離肽」或「經單離多肽」及類似者係指來自細胞環境及來自與細胞之其他組分締合之肽或多肽分子之活體外單離及/或純化，即，其不與活體內物質顯著締合。類似地，「經單離細胞」係指已獲自活體內組織或器官且實質上無細胞外基質之細胞。
多肽包括「多肽變異體」。多肽變異體可在一或多個置換、缺失、新增及/或插入方面不同於天然產生之多肽。此等變異體可係天然產生或可合成產生，例如，藉由修飾以上多肽序列中之一或多者。例如，於特定實施例中，可期望藉由引入一或多個置換、缺失、新增及/或插入至CAR多肽之結合域、鉸鏈、TM域、共刺激信號域或主要信號域來提高CAR之結合親和力及/或其他生物性質。較佳地，本發明之多肽包括具有與其至少約65%、70%、75%、85%、90%、95%、98%或99%胺基酸同一性之多肽。
多肽包含「多肽片段」。多肽片段係指可為單體或多聚體之多肽，其具有天然產生或重組產生之多肽之胺基端缺失、羧基端缺失、及/或內部缺失或置換。於某些實施例中，多肽片段可包含至少5至約500個胺基酸長之胺基酸鏈。應瞭解，於某些實施例中，片段係至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、150、200、250、300、350、400、或450個胺基酸長。特別有用多肽片段包括包含抗原結合域或抗體片段之功能域。於鼠科抗BCMA抗體之情況下，可用片段包括(但不限於) CDR區，重鏈或輕鏈之CDR3區；重鏈或輕鏈之可變區；抗體鏈或可變區(包括兩個CDR)之部分；及類似者。
多肽亦可於框架內融合或結合至連接子或其他序列以易於多肽(例如，聚His)之合成、純化或識別，或增強多肽與固體擔體之結合。
如上所指出，可以各種方式改變本發明之多肽，該等方式包括胺基酸置換、缺失、截短及插入。此等操作方法一般係此項技術中已知。例如，可藉由DNA突變製備參考多肽之胺基酸序列變異體。誘變及核苷酸序列改變之方法係此項技術中熟知。參見，例如，Kunkel (1985,Proc. Natl. Acad. Sci. USA . 82: 488-492)，Kunkel等人(1987,Methods in Enzymol , 154: 367-382)，美國專利案第4,873,192號，Watson, J. D.等人，(Molecular Biology of the Gene ，第4版，Benjamin/Cummings, Menlo Park, Calif., 1987)及其中引用之參考文獻。關於不影響所關注蛋白質之生物活性之適宜胺基酸置換的指導可見於Dayhoff等人，(1978)Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.)之模型中。
於某些實施例中，變異體將含有保守置換。「保守置換」為將一種胺基酸置換為具有相似性質之另一種胺基酸，使得熟習肽化學技術者將期望多肽之二級結構及親水性質實質上未改變。可於本發明之多核苷酸及多肽之結構中作出修飾且仍獲得編碼具有所需特性之變異體或衍生多肽之功能分子。當期望改變多肽之胺基酸序列以創建本發明之等效或甚至改良變異體多肽時，熟習此項技術者例如可例如根據表1改變編碼DNA序列之密碼子中之一或多者。表 1- 胺基酸密碼子
Figure 108124385-A0304-0001
可使用此項技術中熟知之電腦程式(諸如DNASTARTM 軟體)發現確定在不廢除生物活性下可置換、插入或缺失哪些胺基酸殘基之指導。較佳地，本文中揭示之蛋白質變異體中之胺基酸改變為保守胺基酸改變，即，相似帶電或不帶電胺基酸之置換。保守胺基酸改變涉及於其側鏈中相關之胺基酸家族中之一者之置換。一般將天然產生之胺基酸分成四個家族：酸性(天冬胺酸、麩胺酸)、鹼性(離胺酸、精胺酸、組胺酸)、非極性(丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸)及不帶電極性(甘胺酸、天冬醯胺、麩胺醯胺、半胱胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸)胺基酸。有時將苯丙胺酸、色胺酸及酪胺酸聯合歸類為芳族胺基酸。於肽或蛋白質中，胺基酸之適宜保守置換為熟習此項技術者已知且一般可在不改變所得分子之生物活性下製備。一般而言，熟習此項技術者知曉多肽之非必需區中之單胺基酸置換實質上不改變生物活性(參見，例如，Watson等人，Molecular Biology of the Gene ，第4版，1987, The Benjamin/Cummings Pub. Co.，第224頁)。示例性保守置換述於美國臨時專利申請案第61/241,647號，其揭示內容以引用的方式併入本文中。
於作出此等改變中，可考慮胺基酸之親水指數。一般於此項技術中瞭解親水胺基酸指數於賦予對蛋白質之交互生物功能中之重要性(Kyte及Doolittle，1982，以引用的方式併入本文中)。已根據各胺基酸之疏水性及電荷特性指定其親水指數(Kyte及Doolittle，1982)。此等值為：異白胺酸(+4.5)；纈胺酸(+4.2)；白胺酸(+3.8)；苯丙胺酸(+2.8)；半胱胺酸(+2.5)；甲硫胺酸(+1.9)；丙胺酸(+1.8)；甘胺酸(‑0.4)；蘇胺酸(‑0.7)；絲胺酸(‑0.8)；色胺酸(‑0.9)；酪胺酸(‑1.3)；脯胺酸(‑1.6)；組胺酸(‑3.2)；麩胺酸(‑3.5)；麩胺醯胺(‑3.5)；天冬胺酸(‑3.5)；天冬醯胺(‑3.5)；離胺酸(‑3.9)；及精胺酸(‑4.5)。
此項技術中已知，某些胺基酸可經具有相似親水指數或分數之其他胺基酸置換且仍導致具有相似生物活性之蛋白質，即，仍獲得生物功能等效蛋白質。於作出此等改變中，親水指數係於±2內之胺基酸之置換係較佳，±1內之彼等係特別佳，及±0.5內之彼等係甚至更特別佳。此項技術中亦應瞭解，可根據親水性有效作出類似胺基酸之置換。
如美國專利案第4,554,101號中所詳述，已對胺基酸殘基指定下列親水性值：精胺酸(+3.0)；離胺酸(+3.0)；天冬胺酸(+3.0 ± 1)；麩胺酸(+3.0 ± 1)；絲胺酸(+0.3)；天冬醯胺(+0.2)；麩胺醯胺(+0.2)；甘胺酸(0)；蘇胺酸(–0.4)；脯胺酸(–0.5 ± 1)；丙胺酸(–0.5)；組胺酸(–0.5)；半胱胺酸(–1.0)；甲硫胺酸(–1.3)；纈胺酸(–1.5)；白胺酸(–1.8)；異白胺酸(–1.8)；酪胺酸(–2.3)；苯丙胺酸(–2.5)；色胺酸(–3.4)。應瞭解，可將胺基酸置換為具有相似親水性值之另一者且仍獲得生物等效，及特定言之，免疫等效蛋白質。於此等改變中，親水性值係於±2內之胺基酸之置換係較佳，±1內之彼等係特別佳，及±0.5內之彼等係甚至更特別佳。
如上所概述，胺基酸置換可基於胺基酸側鏈取代基之相對相似性，例如，其疏水性、親水性、電荷、大小及類似者。
多肽變異體進一步包括糖基化形式、與其他分子聚集結合物、及與不相關化學部分(例如，聚二乙醇化分子)共價結合物。共價變異體可藉由連接功能性至胺基酸鏈中或在N端或C端殘基處發現之基團來製備，如此項技術中已知。變異體亦包括對偶基因變異體、物種變異體及突變蛋白。不影響蛋白質之功能活性之區之截短或缺失亦為變異體。
於一實施例中，在需要兩種或更多種多肽之表現之情況下，編碼其之多核苷酸序列可藉由及如本文中其他地方所討論之IRES序列分離。於另一實施例中，兩種或更多種多肽可表現為包含一或多種自裂解多肽序列之融合蛋白。
本發明之多肽包括融合多肽。於較佳實施例中，提供融合多肽及編碼融合多肽之多核苷酸，例如，CAR。融合多肽及融合蛋白係指具有至少2、3、4、5、6、7、8、9或10個或更多個多肽片段之多肽。通常將融合多肽C端至N端連接，雖然亦可將其C端至C端、N端至N端、或N端至C端連接。融合蛋白之多肽可係以指定順序之任何順序。融合多肽或融合蛋白亦可包含經保守修飾之變異體、多晶型變異體、對偶基因、突變體、子序列及種間同源物，只要保持該融合多肽之所需轉錄活性。融合多肽可藉由化學合成方法或藉由兩個部分之間之化學鍵聯產生或一般可使用其他標準技術製備。包含融合多肽之經連接DNA序列以可操作方式連接至如本文中其他地方所討論之適宜轉錄或轉譯控制元件。
於一實施例中，融合搭檔包含幫助表現較天然重組蛋白更高產率之蛋白質(表現增強子)之序列。可選擇其他融合搭檔以便增加蛋白質之溶解度或使能將蛋白質靶向所需細胞內室或促進融合蛋白通過細胞膜之轉運。
融合多肽可進一步包含本文中所述多肽域各者之間之多肽裂解信號。此外，可將多肽位點輸入任何連接肽序列。示例性多肽裂解信號包含多肽裂解識別位點，諸如蛋白酶裂解位點、核酸酶裂解位點(例如，罕見限制酶識別位點、自裂解核酶識別位點)及自裂解病毒寡肽(參見deFelipe及Ryan, 2004.Traffic , 5(8); 616-26)。
適宜蛋白酶裂解位點及自裂解肽為熟習者所知(參見，例如，於Ryan等人，1997.J. Gener. Virol. 78, 699-722；Scymczak等人(2004) Nature Biotech. 5, 589-594中)。示例性蛋白酶裂解位點包括(但不限於)以下之裂解位點：馬鈴薯Y病毒(potyvirus) NIa蛋白酶(例如，煙草蝕刻病毒蛋白酶)、馬鈴薯Y病毒HC蛋白酶、馬鈴薯Y病毒P1 (P35)蛋白酶、馬鈴薯Y病毒NIa蛋白酶、馬鈴薯Y病毒RNA-2編碼之蛋白酶、口蹄疫病毒(aphthovirus) L蛋白酶、腸道病毒(enterovirus) 2A蛋白酶、鼻病毒(rhinovirus) 2A蛋白酶、微小核糖核酸病毒(picorna) 3C蛋白酶、豇豆花葉病毒(comovirus) 24K蛋白酶、線蟲傳多面體病毒(nepovirus) 24K蛋白酶、類RTSV (水稻東格魯球形病毒(rice tungro spherical virus)) 3C蛋白酶、類PYVF (歐洲防風黃點病毒(parsnip yellow fleck virus)) 3C蛋白酶、肝素、凝血酶、因子Xa及腸激酶。由於其高裂解嚴格性，於一實施例中，TEV (煙草蝕刻病毒)蛋白酶裂解位點係較佳，例如，EXXYXQ(G/S) (SEQ ID NO: 23)，例如，ENLYFQG (SEQ ID NO: 24)及ENLYFQS (SEQ ID NO: 25)，其中X表示任何胺基酸(藉由TEV裂解在Q與G之間或Q與S之間產生)。
於特定實施例中，自裂解肽包含獲自馬鈴薯Y病毒及心病毒2A肽、FMDV (足口病病毒)、馬鼻炎A病毒、東亞細亞(Thosea asigna)病毒及豬捷申病毒(porcine teschovirus)之彼等多肽序列。
於某些實施例中，自裂解多肽位點包含2A或類2A位點、序列或域(Donnelly等人，2001.J. Gen. Virol . 82:1027-1041)。 表2：示例性2A位點包含下列序列：
Figure 108124385-A0304-0002
於較佳實施例中，本文中涵蓋之多肽包括CAR多肽。5.5. 多核苷酸
於較佳實施例中，提供編碼一或多個CAR多肽之多核苷酸，例如，SEQ ID NO: 10。如本文中所用，術語「多核苷酸」或「核酸」係指信使RNA (mRNA)、RNA、基因組RNA (gRNA)、加股RNA (RNA(+))、減股RNA (RNA(-))、基因組DNA (gDNA)、互補DNA (cDNA)或重組DNA。多核苷酸包括單股及雙股多核苷酸。較佳地，本發明之多核苷酸包括多核苷酸或具有與本文中所述參考序列(參見，例如，序列表)中之任一者至少約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性之變異體，通常其中該變異體維持該參考序列之至少一種生物活性。於各種說明性實施例中，本發明涵蓋包含表現載體、病毒載體及轉移質粒之部分多核苷酸，及組合物，及包含該組合物之細胞。
於特定實施例中，本發明提供多核苷酸，該等多核苷酸編碼本發明之多肽之至少約5、10、25、50、100、150、200、250、300、350、400、500、1000、1250、1500、1750、或2000個或更多個鄰接胺基酸殘基，以及所有中間長度。應容易瞭解於此上下文中「中間長度」意指所引用值之間之任何長度，諸如6、7、8、9等，101、102、103等；151、152、153等；201、202、203等。
如本文中所用，術語「多核苷酸變異體」及「變異體」及類似者係指顯示與參考多核苷酸序列實質序列同一性之多核苷酸或在下文中定義之嚴格條件下與參考序列雜交之多核苷酸。此等術語包括多核苷酸，其中相較於參考多核苷酸已新增或缺失一或多個核苷酸或經不同核苷酸置換。就此而言，此項技術中應充分瞭解可對參考多核苷酸作出包含突變、新增、缺失及置換之某些改變，藉此經改變之多核苷酸保留參考多核苷酸之生物功能或活性。
如本文中所用，敘述「序列同一性」或例如，包含「與…序列50%相同」之敘述係指在比較窗上序列基於核苷酸或基於胺基酸相同之程度。因此，可藉由以下計算「序列同一性百分比」：在比較窗上比較兩個最佳比對之序列，確定相同核酸鹼基(例如，A、T、C、G、I)或相同胺基酸殘基(例如，Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys及Met)於兩個序列中出現之位置的數目以得到匹配位置之數目，將匹配位置之數目除以比較窗中之位置之總數目(即，框口大小)，及將結果乘以100以得到序列同一性百分比。包含具有與本文中所述參考序列中之任一者至少約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性之核苷酸及多肽，通常其中該多肽變異體維持參考多肽之至少一種生物活性。
用於描述兩種或更多種多核苷酸或多肽之間之序列關係之術語包括「參考序列」、「比較窗」、「序列同一性」、「序列同一性百分比」及「實質同一性」。「參考序列」為長度至少12個但是頻繁15至18個及經常至少25個單體單元，包含核苷酸及胺基酸殘基。因為兩個多核苷酸可各包含(1)兩個多核苷酸之間相似之序列(即，僅完全多核苷酸序列之一部分)，及(2)兩個多核苷酸之間有分歧之序列，兩個(或更多個)多核苷酸之間之序列比較通常藉由在「比較窗」上比較兩個多核苷酸之序列進行以識別並比較序列相似性之局部區域。「比較窗」係指至少6個鄰接位置，通常約50至約100，更通常約100至約150之概念段，其中於將兩個序列最佳比對後將序列與相同數目之鄰接位置之參考序列比較。針對兩個序列之最佳比對，比較窗可包含相較於參考序列(其不包含新增或缺失)約20%或更少之新增或缺失(即，空隙)。用於比對比較窗之序列之最佳比對可藉由演算法之電腦化實施(Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0中之GAP、BESTFIT、FASTA及TFASTA，Genetics Computer Group, 575 Science Drive Madison, WI, USA)或藉由檢查及藉由所選各種方法中之任一者產生之最佳比對(即，在比較窗上產生最高百分比同源性)進行。亦可對如例如藉由Altschul等人，1997,Nucl. Acids Res . 25:3389所揭示之程序之BLAST家族作出參考。序列分析之詳細討論可見於Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc, 1994-1998，第15章之單元19.3。
如本文中所用，「經單離多核苷酸」係指已自以天然產生狀態位於其側面之序列純化之多核苷酸，例如，已自與片段正常相鄰之序列移除之DNA片段。「經單離多核苷酸」亦係指互補DNA (cDNA)、重組DNA、或不存在於自然中且已藉由人手製備之其他多核苷酸。
描述多核苷酸之方向之術語包括：5' (通常在具有游離磷酸鹽基團之多核苷酸之末端)及3' (通常在具有游離羥基(OH)之多核苷酸之末端)。可以5'至3'方向或3'至5'方向標注多核苷酸序列。針對DNA及mRNA，將5'至3'股指定為「意義」、「加」或「編碼」股，因為其序列與前信使(premRNA)之序列相同[除了RNA中之尿嘧啶(U)，代替DNA中之胸腺嘧啶(T)]。針對DNA及mRNA，將互補3'至5'股(其為藉由RNA聚合酶轉錄之股)指定為「模板」、「反義」、「減」或「非編碼」股。如本文中所用，術語「逆向」係指以3'至5'方向書寫之5'至3'序列或以5'至3'方向書寫之3'至5'序列。
術語「互補(complementary/complementarity)」係指由鹼基配對規則關聯之多核苷酸(即，核苷酸序列)。例如，DNA序列5' A G T C A T G 3'之互補股為3' T C A G T A C 5'。通常將後者序列寫作逆向互補，其中5'端在左側及3'端在右側，5' C A T G A C T 3'。將與其逆向互補相等之序列稱作回文序列。互補可係「部分」，其中將僅一些核酸之鹼基根據鹼基配對規則匹配。或者，在核酸之間可存在「完全」或「總體」互補。
此外，一般技術者應瞭解，由於遺傳密碼之簡併性，存在編碼多肽或其變異體片段之許多核苷酸序列，如本文中所述。此等多核苷酸中之一些具有與任何天然基因之核苷酸序列之最小同源性。然而，由於密碼子用法差異改變之多核苷酸明確涵蓋於本發明，例如，用於人類及/或靈長類動物密碼子選擇最佳化之多核苷酸。此外，亦可使用包含本文中所提供之多核苷酸序列之基因之對偶基因。對偶基因為內源基因，其由於一或多個突變(諸如核苷酸之缺失、新增及/或置換)而改變。
如本文中所用，術語「核酸盒」係指載體內之遺傳序列，該載體可表現RNA，及隨後表現蛋白質。核酸盒含有所關注基因，例如，CAR。核酸盒於載體內位置及順序定向使得該盒中之核酸可經轉錄至RNA，及當必要時，轉譯成蛋白質或多肽，經歷針對轉形細胞活性所需之適宜轉譯後修飾，且藉由靶向適宜細胞內室或分泌至細胞外室移位至針對生物活性之適宜室。較佳地，該盒具有適於隨時插入載體之其3'及5'端，例如，其在各端處具有限制性內切酶位點。於本發明之較佳實施例中，核酸盒含有用於治療B細胞惡性腫瘤之嵌合抗原受體序列。該盒可經移除並插入作為單一單元之質粒或病毒載體中。
於特定實施例中，多核苷酸包括至少一個所關注多核苷酸。如本文中所用，術語「所關注多核苷酸」係指編碼插入表現載體之多肽(即，所關注多肽)之多核苷酸，期望該表現載體表現。載體可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個所關注多核苷酸。於某些實施例中，所關注多核苷酸編碼多肽，該多肽提供治療或預防疾病或病症之治療效果。所關注多核苷酸及由此編碼之多肽包含編碼野生型多肽之多核苷酸以及功能變異體及其片段二者。於特定實施例中，功能變異體具有與對應野生型參考多核苷酸或多肽序列至少80%、至少90%、至少95%、或至少99%同一性。於某些實施例中，功能變異體或片段具有對應野生型多肽之生物活性之至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、或至少90%。
於一實施例中，所關注多核苷酸不編碼多肽但是用作轉錄miRNA、siRNA、或shRNA、核酶或其他抑制RNA之模板。於各種其他實施例中，多核苷酸包括編碼CAR之所關注多核苷酸及包含但不限於抑制核酸序列之一或多個額外所關注多核苷酸，該抑制核酸序列包括(但不限於)：siRNA、miRNA、shRNA及核酶。
如本文中所用，術語「siRNA」或「短干擾RNA」係指介導動物中序列特異性轉錄後基因沉默、轉譯抑制、轉錄抑制或表觀遺傳(epigenetic) RNAi過程之短多核苷酸序列(Zamore等人，2000,Cell , 101, 25-33；Fire等人，1998,Nature , 391, 806；Hamilton等人，1999,Science , 286, 950-951；Lin等人，1999,Nature , 402, 128-129；Sharp, 1999,Genes & Dev ., 13, 139-141；及Strauss, 1999,Science , 286, 886)。於某些實施例中，siRNA包含具有相同核苷數目之第一股及第二股；然而，該等第一及第二股抵銷使得該等第一股及第二股上之兩個末端核苷不與互補股上之一個殘基配對。於某些情況下，未配對之兩個核苷為胸苷殘基。siRNA應包含一個與靶基因足夠同源性之區域，且核苷酸足夠長，使得該siRNA或其片段可介導靶基因之下調。因此，siRNA包含一個與靶RNA至少部分互補之區域。siRNA與靶之間不一定存在完美互補性，但是對應性必須足以使siRNA或其裂解產物能引導序列特異性沉默，諸如藉由RNAi裂解靶RNA。與靶股之互補性或同源性程度於反義股中最關鍵。雖然完美互補性(特別於反義股中)通常需要，但是一些實施例包括一或多個，但是較佳地10、8、6、5、4、3、2個或更少錯配相對於靶RNA。錯配於末端區域中最能容忍，且若存在，則較佳地於末端區域中，例如於5'及/或3'端之6、5、4或3個核苷酸內。有意股僅需要與反義股足夠互補以維持分子之總體雙股特徵。
此外，siRNA可經修飾或包括核苷類似物。siRNA之單股區可經修飾或包含核苷類似物，例如髮夾結構之未配對區，例如連接兩個互補區之區，可具有修飾或核苷類似物。穩定siRNA之一或多個3'-或5'-端之修飾(例如針對核酸外切酶)，或利於反義siRNA劑進入RISC之修飾亦有用。修飾可包括C3 (或C6、C7、C12)胺基連接子、硫醇連接子、羧基連接子、非核苷酸間隔子(C3、C6、C9、C12、無鹼基(abasic)、三乙二醇、六乙二醇)、特定生物素或螢光素試劑，以亞磷醯胺(phosphorami-dites)出現且具有另一DMT保護之羥基，允許在RNA合成期間多個偶聯。siRNA之各股長度可等於或小於30、25、24、23、22、21、或20個核苷酸。股長度較佳至少19個核苷酸。例如，各股長度可在21與25個核苷酸之間。較佳siRNA具有一個17、18、19、29、21、22、23、24、或25個核苷酸對之雙螺旋區，及一或多個具有2至3個核苷酸之懸伸物，較佳地一或兩個具有2至3個核苷酸之3'懸伸物。
如本文中所用，術語「miRNA」或「microRNA」係指20至22個核苷酸之小非編碼RNA，通常自稱作前miRNA之約70個核苷酸折回RNA前驅體結構切除。miRNA以兩種方式中之一種負面調節其靶，取決於miRNA與靶之間之互補性程度。首先，具有與編碼蛋白質之mRNA序列完美或接近完美互補性結合之miRNA誘導RNA介導之干擾(RNAi)路徑。藉由結合至其mRNA靶之3'未轉譯區(UTR)內之不完美互補位點發揮其調節作用之miRNA通過RISC複合物抑制轉錄後靶基因表現，顯然在類似於用於RNAi路徑者或與之相同之轉譯水平。與轉譯控制一致，使用此機理之miRNA降低其靶基因之蛋白質水平，但是此等基因之mRNA水平僅受到最小影響。miRNA包括可特異性靶向任何mRNA序列之天然產生之miRNA以及人工設計之miRNA二者。例如，於一實施例中，熟習技工可設計表現為人類miRNA (例如，miR-30或miR-21)初級轉錄本之短髮夾RNA構築體。此設計添加Drosha處理位點至髮夾構築體及已顯示極大增加減弱功效(Pusch等人，2004)。髮夾莖由dsRNA之22-nt (例如，反義具有與所需靶之完美互補性)及來自人類miR之15至19-nt環組成。當與無microRNA之習知shRNA設計比較時，在髮夾之任一側或兩側添加miR環及miR30側接序列導致表現髮夾之Drosha及Dicer處理之大於10倍增加。增加之Drosha及Dicer處理轉譯成更大siRNA/miRNA產生及對表現髮夾之更大效能。
如本文中所用，術語「shRNA」或「短髮夾RNA」係指由單一自互補RNA股形成之雙股結構。含有與靶基因之編碼序列或非編碼序列之一部分相同之核苷酸序列之shRNA構築體較佳用於抑制。亦已發現具有相對於靶序列之插入、缺失及單點突變之RNA序列有效用於抑制。抑制RNA與靶基因之部分之間大於90%序列同一性或甚至100%序列同一性係較佳。於某些較佳實施例中，shRNA之雙螺旋形成部分之長度係至少20、21或22個核苷酸長，例如，大小對應於藉由Dicer依賴性裂解產生之RNA產物。於某些實施例中，shRNA構築體係至少25、50、100、200、300或400個鹼基長。於某些實施例中，shRNA構築體係400至800個鹼基長。shRNA構築體高度耐環序列及環大小之變化。
如本文中所用，術語「核酶」係指能位點特異性裂解靶mRNA之催化活性RNA分子。已描述若干亞型，例如，錘頭及髮夾核酶。核酶催化活性及穩定性可藉由在非催化鹼下將去氧核糖核苷酸置換為核糖核苷酸來提高。雖然可使用在位點特異性識別序列處裂解mRNA之核酶來破壞特定mRNA，但是使用錘頭核酶係較佳。錘頭核酶在藉由側接區指定之位置處裂解mRNA，該等側接區與靶mRNA形成互補鹼基對。唯一要求為該靶mRNA具有下列兩個鹼基之序列：5′-UG-3′。錘頭核酶之構築及產生係此項技術中熟知。
遞送所關注多核苷酸(包含siRNA、miRNA、shRNA或核酶)之較佳方法包括一或多個調節序列，諸如，例如，強構成性pol III，例如，人類U6 snRNA啟動子、小鼠U6 snRNA啟動子、人類及小鼠H1 RNA啟動子及人類tRNA-val啟動子，或強構成性pol II啟動子，如本文中其他地方所述。
不管編碼序列本身之長度，本發明之多核苷酸可與其他DNA序列組合，諸如啟動子及/或增強子、未轉譯之區(UTR)、信號序列、Kozak序列、多腺苷化信號、額外限制性酶位點、多個選殖位點、內部核糖體進入位點(IRES)、重組酶識別位點(例如，LoxP、FRT及Att位點)、終止密碼子、轉錄終止信號及編碼自裂解多肽、抗原決定基標籤之多核苷酸，如本文中其他地方所揭示或如此項技術中已知使得其總長可相當大的改變。因此期望可採用幾乎任何長度之多核苷酸片段，其中總長較佳地由易於製備限制且用於預期重組DNA方案中。
可使用此項技術中已知及可獲得之各種良好建立之技術中之任一者製備、操作及/或表現多核苷酸。為表現所需多肽，可將編碼多肽之核苷酸序列插入適宜載體中。載體之實例為質粒、自主複製序列及可置換元件。額外示例性載體包括(不限於)質粒、噬菌體、黏粒、人工染色體(諸如酵母人工染色體(YAC)、細菌人工染色體(BAC)或源自P1之人工染色體(PAC))、細菌噬菌體(諸如λ噬菌體或M13噬菌體)及動物病毒。可用作載體之動物病毒類別之實例包括(不限於)逆轉錄病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相關病毒、皰疹病毒(例如，單純皰疹病毒)、痘病毒、桿狀病毒、乳頭瘤病毒及乳多泡病毒(例如，SV40)。表現載體之實例為用於哺乳動物細胞中表現之pClneo載體(Promega)；用於哺乳動物細胞中慢病毒介導之基因轉移及表現之pLenti4/V5-DEST™、pLenti6/V5-DEST™及pLenti6.2/V5-GW/lacZ (Invitrogen)。於特定實施例中，可將本文中所揭示之嵌合蛋白之編碼序列接合至此等表現載體中用於哺乳動物細胞中表現該嵌合蛋白。
於一實施例中，編碼本文中涵蓋之CAR之載體包含SEQ ID NO: 36中所述之多核苷酸序列。
於特定實施例中，載體為附加體型載體或染色體外維持之載體。如本文中所用，術語「附加體型」係指能在不融入宿主之染色體DNA下且在無自分裂宿主細胞逐漸損失下複製之載體，亦意指該載體染色體外或表觀複製。該載體經工程改造以具有針對DNA複製源或來自淋巴營養型皰疹病毒或γ皰疹病毒、腺病毒、SV40、牛乳頭狀瘤病毒或酵母之「ori」，具體而言對應於EBV之oriP之淋巴營養型皰疹病毒或γ皰疹病毒之複製源編碼之序列。於特定態樣中，淋巴營養型皰疹病毒可為埃-巴二氏(Epstein Barr)病毒(EBV)、卡波西氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)皰疹病毒(KSHV)、薩米里(saimiri)皰疹病毒(HS)或馬立克氏病(Marek's disease)病毒(MDV)。埃-巴二氏病毒(EBV)及卡波西氏肉瘤皰疹病毒(KSHV)亦為γ皰疹病毒之實例。通常，宿主細胞包含激活複製之病毒複製轉錄活化子蛋白。
存在於表現載體中之「控制元件」或「調節序列」為載體之彼等非轉譯區-複製源、選擇盒、啟動子、增強子、轉譯啟動信號(Shine Dalgarno序列或Kozak序列)內含子、多腺苷酸化序列、5'及3'未轉譯區——其與宿主細胞蛋白相互作用以實施轉錄及轉譯。此等元件可於其長度及特異性中變化。取決於採用之載體系統及宿主，可使用任何數目之適宜轉錄及轉譯元件，包括泛在啟動子及可誘導啟動子。
於特定實施例中，用於實踐本發明之載體(包括但不限於表現載體及病毒載體)將包含外源、內源或異源控制序列，諸如啟動子及/或增強子。「內源」控制序列為與基因組中之給定基因天然連接者。「外源」控制序列為藉助基因操作(即，分子生物技術)與基因並置放置使得該基因之轉錄由連接之增強子/啟動子指導者。「異源」控制序列為來自較經基因操作之細胞不同物種之外源序列。
如本文中所用，術語「啟動子」係指多核苷酸(DNA或RNA)之識別位點，RNA聚合酶結合至該位點。RNA聚合酶啟動且轉錄以可操作方式連接至啟動子之多核苷酸。於特定實施例中，於哺乳動物細胞中操作之啟動子包含位於位點上游約25至30個鹼基之AT-濃化區，在該位點處啟動轉錄及/或發現自轉錄開始上游70至80個鹼基之另一序列，CNCAAT區，其中N可為任何核苷酸。
術語「增強子」係指含有能提供增強轉錄之序列及於一些情況下可相對於另一控制序列獨立於其定向起作用之DNA片段。增強子可與啟動子及/或其他增強子元件協同地或附加地起作用。術語「啟動子/增強子」係指含有能提供啟動子及增強子功能二者之序列之DNA片段。
術語「以可操作方式連接」係指並置，其中所述組分係於允許其以其預期方式起作用之關係中。於一實施例中，該術語係指核酸表現控制序列(諸如啟動子及/或增強子)與第二多核苷酸序列(例如，所關注之多核苷酸)之間之功能鍵聯，其中該表現控制序列指導對應於該第二序列之核酸之轉錄。
如本文中所用，術語「構成表現控制序列」係指持續或連續允許轉錄以可操作方式連接序列之啟動子、增強子或啟動子/增強子。構成表現控制序列可為允許於廣泛各種細胞及組織類型中表現之「泛」啟動子、增強子或啟動子/增強子或允許各自於受限各種細胞及組織類型中表現之「細胞特異性」、「細胞類型特異性」、「細胞譜系特異性」或「組織特異性」啟動子、增強子或啟動子/增強子。
適用於本發明之特定實施例之說明性泛在表現控制序列包括(但不限於)巨細胞病毒(CMV)即刻早期啟動子、病毒猿猴病毒40 (SV40) (例如，早期或晚期)、莫洛尼氏(Moloney)鼠科白血病病毒(MoMLV) LTR啟動子、勞氏(Rous)肉瘤病毒(RSV) LTR、單純皰疹病毒(HSV) (胸苷激酶)啟動子、來自疫苗病毒之H5、P7.5及P11啟動子、延伸因子1-α (EF1a)啟動子、早期生長反應1 (EGR1)、鐵蛋白H (FerH)、鐵蛋白L (FerL)、甘油醛3-磷酸脫氫酶(GAPDH)、真核轉譯啟動因子4A1 (EIF4A1)、熱激70kDa蛋白5 (HSPA5)、熱激蛋白90kDa β、成員1 (HSP90B1)、熱激蛋白70kDa (HSP70)、β-驅動蛋白(β-KIN)、人類ROSA 26基因座(Irions等人，Nature Biotechnology 25, 1477 - 1482 (2007))、泛素C啟動子(UBC)、磷酸甘油酸酯激酶-1 (PGK)啟動子、巨細胞病毒增強子/雞β-肌動蛋白(CAG)啟動子、β-肌動蛋白啟動子及骨髓增生性肉瘤病毒增強子、陰性對照區缺失之dl587rev引物結合位點置換之(MND)啟動子(Challita等人，J Virol . 69(2):748-55 (1995))。
於一實施例中，本發明之載體包含MND啟動子。
於一實施例中，本發明之載體包含包含人類EF1a基因之第一內含子之EF1a啟動子。
於一實施例中，本發明之載體包含缺少人類EF1a基因之第一內含子之EF1a啟動子。
於特定實施例中，可期望自T細胞特異性啟動子表現包含CAR之多核苷酸。
如本文中所用，「條件表現」可係指任何類型之條件表現，包括(但不限於)可誘導表現、可抑制表現、具有特定生理、生物或疾病狀態之細胞或組織中之表現等。此定義不意欲排除細胞類型或組織特異性表現。本發明之某些實施例提供所關注多核苷酸之條件表現，例如，表現藉由使細胞、組織、器官等經受引起多核苷酸表現或引起藉由所關注多核苷酸編碼之多核苷酸之表現增加或減少之治療或病狀來控制。
可誘導啟動子/系統之說明性實例包括(但不限於)類固醇可誘導啟動子(諸如編碼糖皮質激素或雌激素受體之基因之啟動子(藉由用對應激素處理可誘導))、金屬硫蛋白(metallothionine)啟動子(藉由用各種重金屬處理可誘導)、MX-1啟動子(藉由干擾素可誘導)、「GeneSwitch」米非司酮(mifepristone)-可調節系統(Sirin等人，2003,Gene , 323:67)、累積可誘導基因開關(WO 2002/088346)、四環素依賴性調節系統等。
條件表現亦可藉由使用位點特異性DNA重組酶達成。根據本發明之某些實施例，載體包含至少一個(通常兩個)位點用於藉由位點特異性重組酶介導之重組。如本文中所用，術語「重組酶」或「位點特異性重組酶」包括涉及涉及一或多個重組位點(例如，2、3、4、5、7、10、12、15、20、30、50個等)之重組反應之刺激性或整合性蛋白、酵素、共因子或相關蛋白，其可為野生型蛋白(參見Landy, Current Opinion in Biotechnology 3:699-707 (1993))或其突變體、衍生物(例如，含有重組蛋白序列或其片段之融合蛋白)、片段及變異體。適用於本發明之特定實施例之重組酶之說明性實例包括(但不限於)：Cre、Int、IHF、Xis、Flp、Fis、Hin、Gin、ΦC31、Cin、Tn3解離酶、TndX、XerC、XerD、TnpX、Hjc、Gin、SpCCE1及ParA。
載體可包含廣泛各種位點特異性重組酶中之任一者之一或多個重組位點。應瞭解，位點特異性重組酶之靶位點為除了整合載體(例如，逆轉錄病毒載體或慢病毒載體)所需之任何位點外。如本文中所用，術語「重組序列」、「重組位點」或「位點特異性重組位點」係指重組酶識別並結合之特定核酸序列。
例如，Cre重組酶之一重組位點為loxP，其為包含在8鹼基對核心序列側面之兩個13鹼基對反向重複序列(用作重組酶結合位點)之34鹼基對序列(參見圖1，Sauer, B.,Current Opinion in Biotechnology 5:521-527 (1994))。其他示例性loxP位點包括(但不限於)：lox511 (Hoess等人，1996；Bethke及Sauer，1997)、lox5171 (Lee及Saito，1998)、lox2272 (Lee及Saito，1998)、m2 (Langer等人，2002)、lox71 (Albert等人，1995)、及lox66 (Albert等人，1995)。
FLP重組酶之適宜識別位點包括(但不限於)：FRT (McLeod等人，1996)、F1, F2, F3 (Schlake及Bode，1994)、F4, F5 (Schlake及Bode，1994)、FRT(LE) (Senecoff等人，1988)、FRT(RE) (Senecoff等人， 1988)。
識別序列之其他實例為attB、attP、attL及attR序列，其藉由重組酶酵素λ整合酶(例如，phi-c31)識別。φ C31 SSR僅介導異型位點attB (長度34 bp)與attP (長度39 bp)之間之重組(Groth等人，2000)。各自針對細菌及噬菌體基因組上之噬菌體整合酶之附著位點命名之attB及attP均含有可藉由φ C31均二聚體結合之不完美反向重複序列(Groth等人，2000)。產物位點attL及attR對進一步φ C31介導之重組有效惰性(Belteki等人，2003)，使反應不可逆。針對催化插入，已發現含attB之DNA插入基因組attP位點較attP位點插入基因組attB位點更容易(Thyagarajan等人，2001；Belteki等人，2003)。因此，典型策略定位藉由將含attP之「停泊位點」同源重組至限定基因座，然後將該基因座與含attB之進來序列搭檔用於插入。
如本文中所用，「內部核糖體進入位點」或「IRES」係指促進直接內部核糖體進入起始密碼子，諸如順反子(編碼蛋白質之區)之ATG，從而導致基因之cap獨立性轉譯之元件。參見例如Jackson等人，1990.Trends Biochem Sci 15(12):477-83及Jackson及Kaminski. 1995.RNA 1(10):985-1000。於特定實施例中，藉由本發明涵蓋之載體包括編碼一或多個多肽之一或多個所關注多核苷酸。於特定實施例中，為達成複數個多肽各者之有效轉譯，多核苷酸序列可藉由一或多個IRES序列或編碼自裂解多肽之多核苷酸序列分離。
如本文中所用，術語「Kozak序列」係指極大促進mRNA初始結合至核糖體之小亞單元且增加轉譯之短核苷酸序列。共有Kozak序列為(GCC)RCCATGG，其中R為嘌呤(A或G) (Kozak, 1986.Cell . 44(2):283-92，及Kozak, 1987.Nucleic Acids Res . 15(20):8125-48)。於特定實施例中，藉由本發明涵蓋之載體包括具有共有Kozak序列且編碼所需多肽(例如，CAR)之多核苷酸。
於本發明之一些實施例中，多核苷酸或含有多核苷酸之細胞利用自殺基因(包括可誘導自殺基因)降低直接毒性及/或不受控制增生之風險。於特定態樣中，自殺基因對含有多核苷酸或細胞之宿主不具有免疫原性。可使用之自殺基因之某一實例為半胱天冬酶-9或半胱天冬酶-8或胞嘧啶脫胺酶。可使用二聚之特異性化學誘導劑(CID)激活半胱天冬酶-9。
於某些實施例中，載體包括引起本發明之免疫效應細胞(例如，T細胞)對活體內陰性選擇敏感之基因片段。「陰性選擇」意指由於個體之活體內條件之改變可消除融合細胞。陰性可選擇表現型可產生於插入賦予對所投與藥劑(例如，化合物)敏感性之基因。陰性可選擇基因係此項技術中已知，且包括尤其下列：賦予更昔洛韋(ganciclovir)敏感性之單純皰疹病毒I型胸苷激酶(HSV-I TK)基因(Wigler等人，Cell 11:223, 1977)、細胞次黃嘌呤磷酸核糖轉移酶(HPRT)基因、細胞腺嘌呤磷酸核糖轉移酶(APRT)基因及細菌胞嘧啶脫胺酶(Mullen等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:33 (1992))。
於一些實施例中，經基因改造之免疫效應細胞(諸如T細胞)包含多核苷酸，該多核苷酸進一步包含使能選擇活體外陰性可選擇表現型之細胞之陽性標記物。陽性可選擇標記物可為基因，其在引入宿主細胞後表現允許陽性選擇攜帶該基因之細胞之顯性表現型。此類型之基因係此項技術中已知，且包括尤其賦予對潮黴素(hygromycin) B抗性之潮黴素-B磷酸轉移酶基因(hph)、來自針對抗生素G418抗性編碼之Tn5之胺基糖苷磷酸轉移酶基因(neo或aph)、二氫葉酸還原酶(DHFR)基因、腺苷脫胺酶基因(ADA)及耐多藥物(MDR)基因。
較佳地，將陽性可選擇標記物及陰性可選擇元件連接使得陰性可選擇元件之丟失亦必然伴隨陽性可選擇標記物之丟失。甚至更較佳地，將陽性及陰性可選擇標記物融合使得一方丟失導致另一方丟失。產生賦予上述所需陽性及陰性選擇特徵二者之表現產物多肽之融合多核苷酸之實例為潮黴素磷酸轉移酶胸苷激酶融合基因(HyTK)。此基因之表現產生賦予對活體外陽性選擇潮黴素B抗性及對活體內陰性選擇更昔洛韋敏感性之多肽。參見Lupton S. D.等人，Mol. and Cell. Biology 1 1:3374- 3378, 1991。此外，於較佳實施例中，編碼嵌合受體之本發明之多核苷酸為含有融合基因之逆轉錄病毒載體，特定言之賦予對活體外陽性選擇潮黴素B抗性及對活體內陰性選擇更昔洛韋敏感性之彼等，例如，於Lupton, S. D.等人，(1991)，見上中所述之HyTK逆轉錄病毒載體。亦參見藉由S. D. Lupton之PCT US91/08442及PCT/US94/05601之公開案，其描述源自融合顯性陽性可選擇標記物與陰性可選擇標記物之雙功能可選擇融合基因之使用。
較佳陽性可選擇標記物係源自選自由hph、nco及gpt組成之群之基因，及較佳陰性可選擇標記物係源自選自由胞嘧啶脫胺酶、HSV-I TK、VZV TK、HPRT、APRT及gpt組成之群之基因。尤其佳標記物為雙功能可選擇融合基因，其中陽性可選擇標記物係源自hph或neo，及陰性可選擇標記物係源自胞嘧啶脫胺酶或TK基因或可選擇標記物。
病毒載體
於特定實施例中，將細胞(例如，免疫效應細胞)用逆轉錄病毒載體(例如，編碼CAR之慢病毒載體)轉導。例如，將免疫效應細胞用編碼CAR之載體轉導，該CAR包含結合BCMA多肽之鼠科抗BCMA抗體或其抗原結合片段，具有CD3ζ、CD28、4-1BB、Ox40或其任何組合之細胞內信號域。因此，此等經轉導細胞可引發CAR介導之細胞毒性反應。
逆轉錄病毒為基因遞送之常見工具(Miller, 2000,Nature . 357: 455-460)。於特定實施例中，使用逆轉錄病毒將編碼嵌合抗原受體(CAR)之多核苷酸遞送至細胞。如本文中所用，術語「逆轉錄病毒」係指將其基因組RNA逆轉錄至直鏈雙股DNA副本及隨後將其基因組DNA共價整合至宿主基因組之RNA病毒。一旦將病毒整合至宿主基因組，就將其稱作「前病毒」。前病毒用作RNA聚合酶II之模板且指導編碼產生新病毒粒子所需之結構蛋白及酵素之RNA分子的表現。
適用於特定實施例之說明性逆轉錄病毒包括(但不限於)：莫洛尼氏鼠科白血病病毒(MMuLV)、莫洛尼氏鼠科肉瘤病毒(MoMSV)、哈威(Harvey)鼠科肉瘤病毒(HaMuSV)、鼠科乳房腫瘤病毒(MuMTV)、長臂猿白血病病毒(GaLV)、貓科白血病病毒(FLV)、泡沫病毒(spumavirus)、弗裡德(Friend)鼠科白血病病毒、鼠科幹細胞病毒(MSCV)及勞氏肉瘤病毒(RSV)及慢病毒。
如本文中所用，術語「慢病毒」係指複合逆轉錄病毒之群(或屬)。說明性慢病毒包括(但不限於)：HIV (人類免疫缺陷病毒，包括HIV 1型及HIV 2型)、羊進行性間質肺炎(visna-maedi)病毒(VMV)病毒、山羊關節炎腦炎病毒(CAEV)、馬傳染性貧血病毒(EIAV)、貓免疫缺陷病毒(FIV)、牛免疫缺陷病毒(BIV)、及猿猴(simian)免疫缺陷病毒(SIV)。於一實施例中，基於HIV之載體主鏈(即，HIV順式作用序列元件)係較佳。於特定實施例中，使用慢病毒遞送包含CAR之多核苷酸至細胞。
逆轉錄病毒載體及更特定言之慢病毒載體可用於實踐本發明之特定實施例中。因此，如本文中所用，術語「逆轉錄病毒」或「逆轉錄病毒載體」意指各自包含「慢病毒」及「慢病毒載體」。
本文中使用術語「載體」係指能轉移或運送另一核酸分子之核酸分子。經轉移之核酸一般連接至(例如，插入)載體核酸分子。載體可包含指導細胞中之自主複製之序列，或可包含足以允許整合至宿主細胞DNA之序列。可用載體包括例如質粒(例如，DNA質粒或RNA質粒)、轉位子、黏粒、細菌人工染色體及病毒載體。可用病毒載體包括例如複製缺陷逆轉錄病毒及慢病毒。
對熟習此項技術者顯然，廣泛使用術語「病毒載體」係指包含通常促進核酸分子之轉移或整合至細胞基因組之病毒源核酸元件之核酸分子(例如，轉移質粒)或介導核酸轉移之病毒粒子。病毒粒子通常將包括各種病毒組分及有時亦包括除了核酸外之宿主細胞組分。
術語病毒載體可係指能轉移核酸至細胞或至自身轉移核酸之病毒或病毒粒子。病毒載體及轉移質粒含有主要源自病毒之結構及/或功能遺傳元件。術語「逆轉錄病毒載體」係指含有主要源自逆轉錄病毒之結構及功能遺傳元件或其部分之病毒載體或質粒。術語「慢病毒載體」係指含有結構及功能遺傳元件或其部分(包括主要源自慢病毒之LTR)之病毒載體或質粒。術語「混合載體」係指載體、LTR或含有逆轉錄病毒(例如，慢病毒)序列及非慢病毒病毒序列二者之其他核酸。於一實施例中，混合載體係指包含用於逆轉錄、複製、整合及/或包裝之逆轉錄病毒(例如，慢病毒)序列之載體或轉移質粒。
於特定實施例中，可使用術語「慢病毒載體」及「慢病毒表現載體」係指慢病毒轉移質粒及/或感染性慢病毒粒子。在本文中提及諸如選殖位點、啟動子、調節元件、異源核酸等之元件之情況下，應瞭解，存在於RNA中之此等元件之序列形成本發明之慢病毒粒子及存在於DNA中之此等元件之序列形成本發明之DNA質粒。
在前病毒之各端處為稱作「長末端重複序列」或「LTR」之結構。術語「長末端重複序列(LTR)」係指位於逆轉錄病毒DNA末端之鹼基對之域，於其天然序列背景下，其為直接重複序列且含有U3、R及U5區。LTR一般提供逆轉錄病毒基因之表現(例如，基因轉錄之促進、啟動及多腺苷酸化)及病毒複製之基本功能。LTR含有許多調節信號，包括轉錄控制元件、多腺苷酸信號及針對病毒基因組之複製及整合所需之序列。將病毒LTR分成三個區，稱作U3、R及U5。U3區含有增強子及啟動子元件。U5區為引物結合位點與R區之間之序列且含有多腺苷酸序列。R (重複)區位於U3及U5區之側面。LTR由U3、R及U5區組成且在病毒基因組之5'及3'端二者處出現。鄰近5' LTR為必要用於基因組之逆轉錄(tRNA引物結合位點)及用於將病毒RNA有效包裝至粒子(Psi位點)之序列。
如本文中所用，術語「包裝信號」或「包裝序列」係指位於逆轉錄病毒基因組內之序列，需要該等序列以將病毒RNA插入病毒衣殼或粒子，參見例如，Clever等人，1995. J. of Virology ，第69卷，第4期；第2101至2109頁。若干逆轉錄病毒載體使用針對病毒基因組之殼體化所需之最小包裝信號(亦稱作psi [Ψ]序列)。因此，如本文中所用，關於針對在病毒粒子形成期間逆轉錄病毒RNA股之殼體化所需之非編碼序列使用術語「包裝序列」、「包裝信號」、「psi」及符號「Ψ」。
於各種實施例中，載體包含經修飾之5' LTR及/或3' LTR。LTR中之任一者或二者可包含一或多個修飾，該等修飾包括(但不限於)一或多個缺失、插入或置換。經常作出3' LTR之修飾以藉由致使病毒複製缺陷來提高慢病毒或逆轉錄病毒系統之安全性。如本文中所用，術語「複製缺陷」係指不能完全有效複製使得不產生感染性病毒子之病毒(例如，複製缺陷慢病毒後代)。術語「複製勝任」係指能複製，使得病毒之病毒複製能產生感染性病毒子之野生型病毒或突變病毒(例如，複製勝任慢病毒後代)。
「自失活」 (SIN)載體係指複製缺陷載體，例如，逆轉錄病毒或慢病毒載體，其中被稱作U3區之右(3') LTR增強子-啟動子區已經修飾(例如，藉由缺失或置換)以防止病毒轉錄超過第一輪病毒複製。此係因為在病毒複製期間右(3') LTR U3區係用作左(5') LTR U3區之模板及因此，不可在無U3增強子-啟動子下進行病毒轉錄。於本發明之另外實施例中，修飾3' LTR使得U5區(例如)經理想poly(A)序列置換。應注意，對LTR之修飾(諸如對3' LTR、5' LTR、或3'及5' LTR二者之修飾)亦包含於本發明。
藉由在產生病毒粒子期間將5' LTR之U3區用異源啟動子置換以驅動病毒基因組之轉錄來提供額外安全性增強。可使用之異源啟動子之實例包括例如病毒猿猴病毒40 (SV40) (例如，早期或晚期)、巨細胞病毒(CMV) (例如，即刻早期)、莫洛尼氏鼠科白血病病毒(MoMLV)、勞氏肉瘤病毒(RSV)、及單純皰疹病毒(HSV) (胸苷激酶)啟動子。典型啟動子能以Tat獨立性方式驅動高水平轉錄。此置換降低重組以產生複製勝任病毒之可能性，因為於病毒產生系統中不存在完全U3序列。於某些實施例中，異源啟動子於控制轉錄病毒基因組之方式中具有額外優點。例如，異源啟動子可係可誘導，使得僅當誘導因子存在時，病毒基因組之所有或部分之轉錄將發生。誘導因子包括(但不限於)一或多種化學化合物或生理條件(諸如溫度或pH)，其中培養宿主細胞。
於一些實施例中，病毒載體包含TAR元件。術語「TAR」係指位於慢病毒(例如，HIV) LTR之R區之「轉錄活化子反應」遺傳元件。此元件與慢病毒轉綠活化子(tat)遺傳元件相互作用以增強病毒複製。然而，於5' LTR之U3區藉由異源啟動子置換之實施例中不需要此元件。
「R區」係指在封端基團開始(即，轉錄開始)處開始及在開始polyA道之前立即結束之逆轉錄病毒LTR內之區。亦可將R區定義為U3及U5區之側面。R區在逆轉錄期間於允許新生DNA自基因組之一端轉移至另一端中起作用。
如本文中所用，術語「FLAP元件」係指核酸，其序列包括逆轉錄病毒(例如，HIV-1或HIV-2)之中心多嘌呤道及中心終止序列(cPPT及CTS)。適宜FLAP元件述於美國專利案第6,682,907號及Zennou等人，2000,Cell , 101:173中。在HIV-1逆轉錄期間，在中心多嘌呤道(cPPT)處之正股DNA之中心啟動及在中心終止序列(CTS)處之中心終止導致三股DNA結構之形成：HIV-1中心DNA瓣。不希望受任何理論束縛，DNA瓣可充當慢病毒基因組核輸入之順式活化決定基及/或可增加病毒之效價。於特定實施例中，逆轉錄病毒或慢病毒載體主鏈包含載體中所關注之異源基因之一或多個上游或下游FLAP元件。例如，於特定實施例中，轉移質粒包含FLAP元件。於一實施例中，本發明之載體包含自HIV-1單離之FLAP元件。
於一實施例中，逆轉錄病毒或慢病毒轉移載體包含一或多個輸出元件。術語「輸出元件」係指順式作用轉錄後調節元件，其調節RNA轉錄自細胞核運送至細胞質。RNA輸出元件之實例包括(但不限於)人類免疫缺陷病毒(HIV) rev反應元件(RRE) (參見例如，Cullen等人，1991. J. Virol . 65: 1053；及Cullen等人，1991.Cell 58: 423)，及B型肝炎病毒轉錄後調節元件(HPRE)。一般而言，RNA輸出元件於基因之3' UTR內置換，且可作為一或多個副本插入。
於特定實施例中，病毒載體中之異源序列之表現藉由併入轉錄後調節元件、有效多腺苷酸化位點及視情況轉錄終止信號至該等載體中來增加。各種轉錄後調節元件可增加蛋白質處之異源核酸之表現，例如，土撥鼠肝炎病毒轉錄後調節元件(WPRE；Zufferey等人，1999,J. Virol ., 73:2886)；存在於B型肝炎病毒中之轉錄後調節元件(HPRE) (Huang等人，Mol. Cell. Biol ., 5:3864)；及類似者(Liu等人，1995,Genes Dev ., 9:1766)。於特定實施例中，本發明之載體包含轉錄後調節元件，諸如WPRE或HPRE。
於特定實施例中，本發明之載體缺少或不包含轉錄後調節元件(PTE) (諸如WPRE或HPRE)，因為於一些情況下此等元件增加細胞轉形之風險及/或實質上或顯著不增加mRNA轉錄之量或不增加mRNA穩定性。因此，於一些實施例中，本發明之載體缺少或不包含PTE。於其他實施例中，本發明之載體缺少或不包含作為額外安全措施之WPRE或HPRE。
指導異源核酸轉錄之有效終止及多腺苷酸化之元件增加異源基因表現。一般在多腺苷酸化信號之下游發現轉錄終止信號。於特定實施例中，載體包含編碼待表現之多肽之多核苷酸之多腺苷酸化序列3′。如本文中所用，術語「polyA位點」或「polyA序列」表示藉由RNA聚合酶II指導新生RNA轉錄之終止及多腺苷酸化二者之DNA序列。多腺苷酸化序列可藉由添加polyA尾至編碼序列之3′端促進mRNA穩定性及因此，有助於增加之轉譯效率。重組轉錄之有效多腺苷酸化係所需，因為缺少polyA尾之轉錄係不穩定且快速降解。可用於本發明之載體之polyA信號之說明性實例包括理想polyA序列(例如，AATAAA、ATTAAA、AGTAAA)、牛生長激素polyA序列(BGHpA)、兔β-球蛋白polyA序列(rβgpA)或此項技術中已知之另一種適宜異源或內源polyA序列。
於某些實施例中，逆轉錄病毒或慢病毒載體進一步包含一或多個絕緣子元件。絕緣子元件可有助於保護表現慢病毒之序列(例如，治療性多肽)免於受到整合位點效應，該等效應可藉由存在於基因組DNA中之順式作用元件介導且導致經轉移序列之去調控表現(即，位置效應；參見例如，Burgess-Beusse等人，2002,Proc. Natl. Acad. Sci., USA , 99:16433；及Zhan等人，2001,Hum. Genet ., 109:471)。於一些實施例中，轉移載體包含一或多個絕緣子元件3′ LTR及在將前病毒整合至宿主基因組後，由於複製該3′ LTR，該前病毒包含5′ LTR或3′ LTR二者處之一或多個絕緣子。用於本發明之適宜絕緣子包括(但不限於)雞β-球蛋白絕緣子(參見Chung等人，1993. Cell 74:505；Chung等人，1997. PNAS 94:575；及Bell等人，1999. Cell 98:387，其以引用的方式併入本文中)。絕緣子元件之實例包括(但不限於)來自β-球蛋白基因座之絕緣子，諸如雞HS4。
根據本發明之某些特定實施例，病毒載體主鏈序列之大多數或所有係源自慢病毒，例如，HIV-1。然而，應瞭解，可使用或組合逆轉錄病毒及/或慢病毒序列之許多不同來源及可適應某些慢病毒序列中之許多置換及改變而不損害轉移載體進行本文中所述功能之能力。此外，各種慢病毒載體係此項技術中已知，參見Naldini等人，(1996a、1996b及1998)；Zufferey等人，(1997)；Dull等人，1998，美國專利案第6,013,516號及第5,994,136號，可將其中許多改編以產生本發明之病毒載體或轉移質粒。
於各種實施例中，本發明之載體包含以可操作方式連接至編碼CAR多肽之多核苷酸之啟動子。該等載體可具有一或多個LTR，其中任一LTR包含一或多個修飾，諸如一或多個核苷酸置換、新增或缺失。該等載體可進一步包含一或多個附屬元件以增加轉導效率(例如cPPT/ FLAP)、病毒包裝(例如Psi (Ψ)包裝信號，RRE)，及/或增加治療基因表現之其他元件(例如聚(A)序列)，且可視情況包含WPRE或HPRE。
於特定實施例中，本發明之轉移載體包含左(5')逆轉錄病毒LTR、中心多嘌呤通道/DNA瓣(cPPT/FLAP)、逆轉錄病毒輸出元件、以可操作方式連接至編碼本文中涵蓋之CAR多肽之多核苷酸之T細胞中活性啟動子、及右(3')逆轉錄病毒LTR、及視情況可選的WPRE或HPRE。
於特定實施例中，本發明之轉移載體包含左(5')逆轉錄病毒LTR、逆轉錄病毒輸出元件、以可操作方式連接至編碼本文中涵蓋之CAR多肽之多核苷酸之T細胞中活性啟動子、右(3')逆轉錄病毒LTR、及poly(A)序列、及視情況可選的WPRE或HPRE。於另一特定實施例中，本發明提供包含以下之慢病毒載體：左(5') LTR、cPPT/FLAP、RRE、以可操作方式連接至編碼本文中涵蓋之CAR多肽之多核苷酸之T細胞中活性啟動子、右(3') LTR、及多腺苷酸化序列、及視情況可選的WPRE或HPRE。
於某一實施例中，本發明提供包含以下之慢病毒載體：左(5') HIV-1 LTR、Psi (Ψ)包裝信號、cPPT/FLAP、RRE、以可操作方式連接至編碼本文中涵蓋之CAR多肽之多核苷酸之T細胞中活性啟動子、右(3')自啟動(SIN) HIV-1 LTR、及兔β-球蛋白多腺苷酸化序列、及視情況可選的WPRE或HPRE。
於另一實施例中，本發明提供包含以下之載體：至少一個LTR、中心多嘌呤通道/DNA瓣(cPPT/FLAP)、逆轉錄病毒輸出元件、及以可操作方式連接至編碼本文中涵蓋之CAR多肽之多核苷酸之T細胞中活性啟動子、及視情況可選的WPRE或HPRE。
於特定實施例中，本發明提供包含以下之載體：至少一個LTR、cPPT/FLAP、RRE、以可操作方式連接至編碼本文中涵蓋之CAR多肽之多核苷酸之T細胞中活性啟動子、及多腺苷酸化序列、及視情況可選的WPRE或HPRE。
於某一實施例中，本發明提供至少一個SIN HIV-1 LTR、Psi (Ψ)包裝信號、cPPT/FLAP、RRE、T細胞中可操作地連接至編碼本文中涵蓋之CAR多肽之多核苷酸之活性啟動子、及兔β-球蛋白多腺苷酸化序列、及視情況可選的WPRE或HPRE。
於各種實施例中，該載體為整合病毒載體。
於各種其他實施例中，該載體為附加體或非整合病毒載體。
於各種實施例中，本文中涵蓋之載體包括非整合或整合缺陷逆轉錄病毒。於一實施例中，「整合缺陷」逆轉錄病毒或慢病毒係指具有缺少將病毒基因組整合至宿主細胞之基因組之能力之整合酶的逆轉錄病毒或慢病毒。於各種實施例中，將整合酶蛋白突變以特異性減少其整合酶活性。整合不勝任慢病毒載體藉由修飾編碼整合酶蛋白之pol基因，產生編碼整合缺陷整合酶之突變pol基因獲得。此等整合不勝任病毒載體已述於專利申請案WO 2006/010834中，其全文以引用的方式併入本文中。
適於降低整合酶活性之HIV-1 pol基因之說明性突變包括(但不限於)：H12N、H12C、H16C、H16V、S81R、D41A、K42A、H51A、Q53C、D55V、D64E、D64V、E69A、K71A、E85A、E87A、D116N、D1161、D116A、N120G、N1201、N120E、E152G、E152A、D35E、K156E、K156A、E157A、K159E、K159A、K160A、R166A、D167A、E170A、H171A、K173A、K186Q、K186T、K188T、E198A、R199c、R199T、R199A、D202A、K211A、Q214L、Q216L、Q221 L、W235F、W235E、K236S、K236A、K246A、G247W、D253A、R262A、R263A及K264H。
適於降低整合酶活性之HIV-1 pol基因之說明性突變包括(但不限於)：D64E、D64V、E92K、D116N、D1161、D116A、N120G、N1201、N120E、E152G、E152A、D35E、K156E、K156A、E157A、K159E、K159A、W235F、及W235E。
於特定實施例中，整合酶包含胺基酸中之一或多者之突變D64、D116或E152。於一實施例中，整合酶包含胺基酸中之突變D64、D116及E152。於特定實施例中，缺陷HIV-1整合酶包含D64V突變。
「宿主細胞」包括利用本發明之重組載體或多核苷酸活體內、離體或活體外電穿孔、轉染、感染或轉導之細胞。宿主細胞可包括包裝細胞、產生細胞及用病毒載體感染之細胞。於特定實施例中，對需要治療之受試者投與用本發明之病毒載體感染之宿主細胞。於某些實施例中，術語「靶細胞」可與宿主細胞交換使用且係指所需細胞類型之經轉染、感染或轉導細胞。於較佳實施例中，該靶細胞為T細胞。
為達成合理病毒效價，大規模病毒粒子產生經常係必要的。病毒粒子藉由將轉移載體轉染至包裝細胞系產生，該包裝細胞系包含病毒結構及/或附加基因，例如，gag、pol、env、tat、rev、vif、vpr、vpu、vpx、或nef基因或其他逆轉錄病毒基因。
如本文中所用，術語「包裝載體」係指缺少包裝信號且包含編碼1、2、3、4或更多個病毒結構及/或附件基因之多核苷酸之表現載體或病毒載體。通常，將包裝載體包含於包裝細胞中，且經由轉染、轉導或感染引入細胞。轉染、轉導或感染之方法由熟習此項技術者熟知。可經由轉染、轉導或感染將本發明之逆轉錄病毒/慢病毒轉移載體引入包裝細胞系以產生產生細胞或細胞系。可藉由標準方法將本發明之包裝載體引入人類細胞或細胞系，該等方法包括例如磷酸鈣轉染、脂質體轉染或電穿孔。於一些實施例中，將包裝載體與顯性可選擇標記物(諸如新黴素(neomycin)、潮黴素、嘌呤黴素(puromycin)、殺稻瘟菌素(blasticidin)、吉歐黴素(zeocin)、胸苷激酶、DHFR、Gln合成酶或ADA)一起引入細胞，接著在適宜藥物之存在下選擇及單離純系。可選擇標記物基因可經物理連接至藉由包裝載體(例如，藉由IRES或自裂解病毒肽)編碼之基因。
病毒包膜蛋白(env)決定可最終藉由自細胞系產生之重組逆轉錄病毒感染及轉形之宿主細胞之範圍。於慢病毒(諸如HIV-1、HIV-2、SIV、FIV及EIV)之情況下，env蛋白包含gp41及gp120。較佳地，藉由本發明之包裝細胞表現之病毒env蛋白在來自如上所述之病毒gag及pol基因之分開載體上編碼。
本發明可採用之源自逆轉錄病毒env基因之說明性實例包括(但不限於)：MLV包膜、10A1包膜、BAEV、FeLV-B、RD114、SSAV、Ebola、Sendai、FPV (雞瘟病毒)及流感病毒包膜。類似地，可利用編碼來自RNA病毒(例如，小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)、鈣化病毒科(Calciviridae)、星狀病毒科(Astroviridae)、披蓋病毒科(Togaviridae)、黃病毒科(Flaviviridae)、冠狀病毒科(Coronaviridae)、副黏病毒科(Paramyxoviridae)、彈狀病毒科(Rhabdoviridae)、纖絲病毒科(Filoviridae)、正黏病毒科(Orthomyxoviridae)、布尼亞病毒科(Bunyaviridae)、沙粒病毒科(Arenaviridae)、呼腸孤病毒科(Reoviridae)、雙核糖核酸病毒科(Birnaviridae)、逆轉錄病毒科(Retroviridae)之RNA病毒家族)以及來自DNA病毒(肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)、環病毒科(Circoviridae)、細小病毒科(Parvoviridae)、乳多泡病毒科(Papovaviridae)、腺病毒科(Adenoviridae)、皰疹病毒科(Herpesviridae)、痘病毒科(Poxviridae)及虹彩病毒科(Iridoviridae)之家族)之包膜之基因。代表性實例包括FeLV、VEE、HFVW、WDSV、SFV、Rabies、ALV、BIV、BLV、EBV、CAEV、SNV、ChTLV、STLV、MPMV、SMRV、RAV、FuSV、MH2、AEV、AMV、CT10、及EIAV。
於其他實施例中，假型化本發明病毒之包膜蛋白包括(但不限於)來自下列病毒之任何：A型流感(諸如H1N1、H1N2、H3N2及H5N1 (禽流感))、B型流感、C型流感病毒、A型肝炎病毒、B型肝炎病毒、C型肝炎病毒、D型肝炎病毒、E型肝炎病毒、輪狀病毒、諾瓦克(Norwalk)病毒組之任何病毒、腸腺病毒、細小病毒、登革(Dengue)熱病毒、猴痘、單股反鏈病毒目(Mononegavirales)、狂犬病病毒屬(諸如狂犬病病毒、拉哥斯(Lagos)蝙蝠病毒、莫柯拉(Mokola)病毒、杜文黑基(Duvenhage)病毒、歐洲蝙蝠病毒1及2及澳大利亞蝙蝠病毒)、短暫熱病毒屬(Ephemerovirus)、水泡性病毒屬(Vesiculovirus)、水皰性口炎病毒(VSV)、皰疹病毒(諸如單純皰疹病毒1型及2型、水痘帶狀皰疹)、巨細胞病毒、埃-巴二氏病毒(EBV)、人類皰疹病毒(HHV)、人類皰疹病毒6型及8型、人類免疫缺陷病毒(HIV)、乳頭狀瘤病毒、小鼠γ皰疹病毒、沙粒病毒(Arenavirus) (諸如阿根廷(Argentine)出血熱病毒、玻利維亞(Bolivian)出血熱病毒、沙比亞(Sabia)相關出血熱病毒、委內瑞拉(Venezuelan)出血熱病毒、拉沙(Lassa)熱病毒、馬丘坡(Machupo)病毒、淋巴球性脈絡叢腦膜炎病毒(LCMV))、本揚病毒科(Bunyaviridiae) (諸如克裡米亞-剛果(Crimean-Congo)出血熱病毒、漢坦病毒屬(Hantavirus)、引起出血熱與腎臟症候群之病毒、裂谷熱病毒)、纖絲病毒科(絲狀病毒) (包括埃博拉(Ebola)出血熱及瑪律堡(Marburg)出血熱)、黃病毒科(包括Kaysanur森林疾病病毒、鄂木斯克(Omsk)出血熱病毒、引起蜱媒腦炎之病毒)及副黏病毒科(諸如亨德拉(Hendra)病毒及尼帕(Nipah)病毒、大天花及小天花(天花))、甲病毒屬(諸如委內瑞拉馬腦炎病毒、東部馬腦炎病毒、西部馬腦炎病毒、SARS相關冠狀病毒(SARS-CoV)、西尼祿(West Nile)病毒及任何引起腦炎之病毒)。
於一實施例中，本發明提供產生用VSV-G醣蛋白假型之重組逆轉錄病毒(例如，慢病毒)之包裝細胞。
如本文中所用，術語「假型」或「假型化」係指其病毒包膜蛋白已經另一病毒處理較佳特徵之彼等置換之病毒。例如，可將HIV用水皰性口炎病毒G-蛋白(VSV-G)包膜蛋白假型，其允許HIV感染更寬範圍之細胞，因為HIV包膜蛋白(藉由env基因編碼)正常將該病毒靶向CD4+ 呈遞細胞。於本發明之較佳實施例中，將慢病毒包膜蛋白用VSV-G假型。於一實施例中，本發明提供產生用VSV-G包膜醣蛋白假型之重組逆轉錄病毒(例如，慢病毒)之包裝細胞。
如本文中所用，關於細胞系使用術語「包裝細胞系」，該等細胞系不含有包裝信號，但是不穩定或短暫表現必要用於正確包裝病毒粒子之病毒結構蛋白及複製酵素(例如，gag、pol及env)。可採用任何適宜細胞系製備本發明之包裝細胞。一般而言，該等細胞為哺乳動物細胞。於特定實施例中，用於產生包裝細胞系之細胞為人類細胞。可使用之適宜細胞系包括例如CHO細胞、BHK細胞、MDCK細胞、C3H 10T1/2細胞、FLY細胞、Psi-2細胞、BOSC 23細胞、PA317細胞、WEHI細胞、COS細胞、BSC 1細胞、BSC 40細胞、BMT 10細胞、VERO細胞、W138細胞、MRC5細胞、A549細胞、HT1080細胞、293細胞、293T細胞、B-50細胞、3T3細胞、NIH3T3細胞、HepG2細胞、Saos-2細胞、Huh7細胞、HeLa細胞、W163細胞、211細胞、及211A細胞。於較佳實施例中，該等包裝細胞為293細胞、293T細胞或A549細胞。於另一較佳實施例中，該等細胞為A549細胞。
如本文中所用，術語「生產細胞系」係指能產生重組逆轉錄病毒粒子之細胞系，包括包裝細胞系及包含包裝信號之轉移載體構築體。可使用習知技術進行感染性病毒粒子及病毒儲備溶液之產生。製備病毒儲備溶液之方法係此項技術中已知且藉由例如Y. Soneoka等人(1995)Nucl. Acids Res . 23:628-633，及N. R. Landau等人(1992)J. Virol . 66:5110-5113所說明。可使用習知技術自包裝細胞收集感染性病毒粒子。例如，可藉由細胞裂解或收集細胞培養物之上清液收集感染性粒子，如此項技術中已知。視情況，若所需，則可將收集之病毒粒子純化。適宜純化技術為熟習此項技術者熟知。
將使用逆轉錄病毒或慢病毒載體藉助病毒感染而非藉由轉染遞送基因或其他多核苷酸序列稱作「轉導」。於一實施例中，將逆轉錄病毒載體通過感染及前病毒整合轉導至細胞。於某些實施例中，若靶細胞(例如，T細胞)包含藉由使用病毒或逆轉錄病毒載體感染遞送至細胞之基因或其他多核苷酸序列，則其經「轉導」。於特定實施例中，經轉導細胞於其細胞基因組中包含藉由逆轉錄病毒或慢病毒載體遞送之一或多個基因或其他多核苷酸序列。
於特定實施例中，對受試者投與表現一或多種多肽之利用本發明之病毒載體轉導之宿主細胞以治療及/或預防B細胞惡性腫瘤。與於基因療法中使用病毒載體相關之其他方法(可根據本發明之某些實施例利用該等方法)可見於例如Kay, M. A. (1997)Chest 111(6 Supp.):138S-142S；Ferry, N.及Heard, J. M. (1998)Hum. Gene Ther . 9:1975-81；Shiratory, Y.等人(1999) Liver 19:265-74；Oka, K.等人(2000)Curr. Opin. Lipidol . 11:179-86；Thule, P. M.及Liu, J. M. (2000)Gene Ther . 7:1744-52；Yang, N. S. (1992)Crit. Rev. Biotechnol . 12:335-56；Alt, M. (1995)J. Hepatol . 23:746-58；Brody, S. L.及Crystal, R. G. (1994)Ann. N.Y. Acad. Sci . 716:90-101；Strayer, D. S. (1999)Expert Opin. Investig. Drugs 8:2159-2172；Smith-Arica, J. R.及Bartlett, J. S. (2001)Curr. Cardiol. Rep . 3:43-49；及Lee, H. C.等人(2000)Nature 408:483-8中。5.6. 經基因改造之細胞
於特定實施例中，本發明涵蓋經基因改造以表現本文中涵蓋之CAR之細胞以用於治療B細胞相關病狀。如本文中所用，術語「經基因工程改造」或「經基因改造」係指將呈DNA或RNA形式之額外遺傳物質添加至細胞中之總遺傳物質中。術語「經基因改造之細胞」、「經改造之細胞」及「重定向細胞」可交換使用。如本文中所用，術語「基因療法」係指將呈DNA或RNA形式之額外遺傳物質引入細胞中之總遺傳物質中，該細胞恢復、改正或改造基因表現或出於表現治療多肽(例如，CAR)之目的。
於特定實施例中，於免疫效應細胞中引入及表現本文中涵蓋之CAR以便將其特異性重定向至所關注靶抗原(例如，BCMA多肽)。「免疫效應細胞」為具有一或多種效應功能(例如，細胞毒性細胞殺死活性、分泌細胞激素、引入ADCC及/或CDC)之免疫系統之任何細胞。
本發明之免疫效應細胞可係自體(autologous/autogeneic) (「自身」)或非自體(「非自身」，例如，異基因、同基因或異種)。
如本文中所用，「自體」係指來自相同受試者之細胞。
如本文中所用，「異基因」係指與比較細胞遺傳不同之相同物種之細胞。
如本文中所用，「同基因」係指與比較細胞遺傳相同之不同受試者之細胞。
如本文中所用，「異種」係指與比較細胞不同物種之細胞。於較佳實施例中，本發明之細胞係異基因。
與本文中涵蓋之CAR一起使用之說明性免疫效應細胞包括T淋巴細胞。術語「T細胞」或「T淋巴細胞」係技術識別且意欲包括胸腺細胞、不成熟T淋巴細胞、成熟T淋巴細胞、休止T淋巴細胞或經活化T淋巴細胞。T細胞可為T輔助(Th)細胞，例如T輔助1 (Th1)或T輔助2 (Th2)細胞。T細胞可為輔助T細胞(HTL；CD4+ T細胞) CD4+ T細胞、細胞毒性T細胞(CTL；CD8+ T細胞)、CD4+ CD8+ T細胞、CD4- CD8- T細胞、或T細胞之任何其他子集。適用於特定實施例之T細胞之其他說明性群體包括初始T細胞及記憶T細胞。
如由熟習者所瞭解，其他細胞亦可作為免疫效應細胞與如本文中所述之CAR一起使用。特定言之，免疫效應細胞亦包括NK細胞、NKT細胞、嗜中性白血球及巨噬細胞。免疫效應細胞亦包括效應細胞之祖細胞，其中可於活體內或活體外誘導此等祖細胞分化成免疫效應細胞。因此，於特定實施例中，免疫效應細胞包括免疫效應細胞之祖細胞，諸如含於源自臍帶血、骨髓或動員外周血之細胞之CD34+群內之造血幹細胞(HSC)，其在投與後於受試者中分化成成熟免疫效應細胞或其可於活體外經誘導以分化成成熟免疫效應細胞。
如本文中所用，可將經基因工程改造以含有BCMA特異性CAR之免疫效應細胞稱作「BCMA特異性重定向免疫效應細胞」。
如本文中所用，術語「CD34+ 細胞」係指表現在其細胞表面上之CD34蛋白之細胞。如本文中所用，「CD34」係指經常充當細胞間黏附因子且涉及T細胞進入淋巴結之細胞表面醣蛋白(例如，唾液黏蛋白)。CD34+ 細胞群體含有造血幹細胞(HSC)，其在對患者投與後分化且有助於所有造血系，包括T細胞、NK細胞、NKT細胞、嗜中性白血球及單核細胞/巨噬細胞系之細胞。
本發明提供製備表現本文中涵蓋之CAR之免疫效應細胞之方法。於一實施例中，該方法包括轉染或轉導自個體單離之免疫效應細胞使得該等免疫效應細胞表現如本文中所述之一或多個CAR。於某些實施例中，免疫效應細胞自個體單離且經基因改造無需活體外進一步操作。然後可將此等細胞直接再投與至個體。於另外實施例中，首先將免疫效應細胞活化及刺激以於活體外增殖，之後經基因改造以表現CAR。就此而言，可在經基因改造(即，經轉導或經轉染以表現本文中涵蓋之CAR)之前及/或之後培養免疫效應細胞。
於特定實施例中，在活體外操作或基因改造本文中所述之免疫效應細胞之前，細胞來源係獲自受試者。於特定實施例中，經CAR改造之免疫效應細胞包括T細胞。T細胞可獲自許多來源，包括(但不限於)外周血單核細胞、骨髓、淋巴結組織、臍帶血、胸腺組織、來自感染部位之組織、腹水、胸腔積液、脾組織及腫瘤。於某些實施例中，T細胞可獲自使用熟習者已知之任何數目之技術(諸如沉降，例如，FICOLLTM 分離)自受試者收集之單位血。於一實施例中，來自個體之循環血之細胞藉由血球分離術獲得。血球分離術產物通常含有淋巴細胞(包括T細胞)、單核細胞、粒細胞、B細胞、其他成核白血球、紅血球及血小板。於一實施例中，可將藉由血球分離術收集之細胞洗滌以移除血漿部分及將細胞放置於適宜緩衝液或介質中用於隨後處理。可將細胞用PBS或用另一種適宜溶液洗滌，該溶液缺少鈣、鎂及若非所有其他，則大多數二價陽離子。一般技術者應瞭解，洗滌步驟可藉由此項技術者已知之方法，諸如藉由使用半自動流過離心機達成。例如，Cobe 2991細胞處理器、Baxter CytoMate或類似者。於洗滌後，可將細胞再懸浮於各種生物相容性緩衝液或含有或不含有緩衝液之其他鹽水溶液中。於某些實施例中，可於細胞直接再懸浮培養基中移除血球分離術樣品之非所需組分。
於某些實施例中，T細胞藉由裂解紅血球及清除單核細胞(例如，藉由通過PERCOLLTM 梯度離心)自外周血單核細胞(PBMC)單離。表現下列標記物中之一或多者之T細胞之特異性子群體：CD3、CD28、CD4、CD8、CD45RA及CD45RO可進一步藉由陽性或陰性選擇技術單離。於一實施例中，表現CD3、CD28、CD4、CD8、CD45RA及CD45RO之T細胞之特異性子群體進一步藉由陽性或陰性選擇技術單離。例如，藉由陰性選擇增濃T細胞群體可利用針對對陰性選擇之細胞獨特之表面標記物之抗體的組合達成。本文中使用之一種方法為經由負磁免疫黏附或流動式細胞測量術之細胞分選及/或選擇，該技術使用針對陰性選擇之細胞上呈遞之細胞表面標記物之單株抗體的混合物。例如，為藉由陰性選擇增濃CD4+ 細胞，單株抗體混合物通常包括CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR及CD8之抗體。亦可使用流動式細胞測量術及細胞分選單離用於本發明之所關注細胞群體。
可使用本文中涵蓋之方法將PBMC直接基因改造以表現CAR。於某些實施例中，於單離PBMC後，將T淋巴細胞進一步單離及某些實施例中，可在基因改造及/或擴增之前或之後將細胞毒性T淋巴細胞及輔助T淋巴細胞二者分選成初始、記憶及效應T細胞子群體。
可藉由使用標準方法獲得CD8+ 細胞。於一些實施例中，藉由識別與CD8+ 細胞之彼等類型各者相關之細胞表面抗原將CD8+ 細胞進一步分選成初始、中樞記憶及效應細胞。
於某些實施例中，初始CD8+ T淋巴細胞藉由初始T細胞之表現型標記物 (包括CD62L、CCR7、CD28、CD3、CD127及CD45RA) 之表現表徵。
於特定實施例中，記憶T細胞存在於CD8+ 外周血淋巴細胞之CD62L+ 及CD62L- 子集二者中。於用抗CD8及抗CD62L抗體染色後，將PBMC分選成CD62L- CD8+ 及CD62L+ CD8+ 部分。於一些實施例中，中樞記憶T細胞之表現型標記物之表現包括CD45RO、CD62L、CCR7、CD28、CD3及CD127且對顆粒酶B陰性。於一些實施例中，中樞記憶T細胞為CD45RO+ 、CD62L+ 、CD8+ T細胞。
於一些實施例中，效應T細胞對CD62L、CCR7、CD28及CD127陰性，且對顆粒酶B及穿孔蛋白(perforin)陽性。
於某些實施例中，將CD4+ T細胞進一步分選成子群體。例如，可藉由識別具有細胞表面抗原之細胞群體將CD4+ T輔助細胞分選成初始、中樞記憶及效應細胞。可藉由標準方法獲得CD4+ 淋巴細胞。於一些實施例中，初始CD4+ T淋巴細胞為CD45RO- 、CD45RA+ 、CD62L+ CD4+ T細胞。於一些實施例中，中樞記憶CD4+ 細胞係CD62L陽性及CD45RO陽性。於一些實施例中，效應CD4+ 細胞係CD62L及CD45RO陰性。
可於單離後使用已知方法將免疫效應細胞(諸如T細胞)基因改造，或可將免疫效應細胞活化及活體外擴增(或於祖細胞之情況下分化)，之後基因改造。於特定實施例中，將免疫效應細胞(諸如T細胞)用本文中涵蓋之嵌合抗原受體基因改造(例如，用包含編碼CAR之核酸之病毒載體轉導)及然後活化及於活體外擴增。於各種實施例中，可在基因改造以表現CAR之前或之後使用如下中所述之方法將T細胞活化及擴增：例如，美國專利案6,352,694、6,534,055、6,905,680、6,692,964、5,858,358、6,887,466、6,905,681、7,144,575、7,067,318、7,172,869、7,232,566、7,175,843、5,883,223、6,905,874、6,797,514、6,867,041；及美國專利申請公開案第20060121005號。
一般而言，藉由與其上附接有刺激CD3 TCR複合物相關信號之劑及刺激T細胞表面上之共刺激分子之配位體之表面接觸將T細胞擴增。可藉由與抗CD3抗體或其抗原結合片段，或表面上固定之抗CD2抗體接觸，或藉由與鈣離子載體結合之蛋白質激酶C活化子(例如，苔蘚蟲素(bryostatin))接觸刺激T細胞群體。亦涵蓋T細胞表面上之輔助分子之共刺激。
於特定實施例中，於含有適宜細胞激素(諸如IL-2、IL-7及/或IL-15)之培養基中，使PBMC或經單離T細胞與一般附接至珠或其他表面之刺激劑及共刺激劑(諸如抗CD3及抗CD28抗體)接觸。為刺激CD4+ T細胞或CD8+ T細胞之增殖，抗CD3抗體及抗CD28抗體。抗CD28抗體之實例包括9.3、B-T3、XR-CD28 (Diacione, Besancon, France)，其可如此項技術中通常已知之其他方法一樣使用(Berg等人，Transplant Proc . 30(8):3975-3977, 1998；Haanen等人，J. Exp. Med . 190(9): 13191328, 1999；Garland等人，J. Immunol Meth . 227(1 -2):53-63, 1999)。附接至相同珠之抗CD3及抗CD28抗體用作「替代」抗原呈遞細胞(APC)。於其他實施例中，可使用諸如述於US6040177、US5827642及WO2012129514中之彼等之方法用飼養細胞及適宜抗體及細胞激素活化及刺激T細胞增殖。
於其他實施例中，人工APC (aAPC)藉由將K562、U937、721.221、T2及C1R細胞工程化製備以指導各種共刺激分子及細胞激素之穩定表現及分泌。於特定實施例中，使用K32或U32 aAPC指導AAPC細胞表面上之一或多個基於抗體之刺激分子之展示。aAPC上之基因之各種組合之表現使能精確測定人類T細胞活化要求，使得可將aAPC裁制用於具有特異性生長要求及不同功能之T細胞子集之最佳繁殖。與使用天然APC相比，aAPC支援功能人類CD8 T細胞之離體生長及長期擴增而不需要添加外源細胞激素。T細胞群體可藉由表現各種共刺激分子之aAPC擴增，該等共刺激分子包括(但不限於) CD137L (4-1BBL)、CD134L (OX40L)、及/或CD80或CD86。最後，aAPC提供有效平臺以擴增經基因改造之T細胞及維持CD8 T細胞上之CD28表現。於WO 03/057171及US2003/0147869中提供之aAPC之全部以引用的方式併入本文中。
於一實施例中，根據本發明將CD34+ 細胞用核酸構築體轉導。於某些實施例中，經轉導之CD34+ 細胞於投與至受試者後於活體內分化成成熟免疫效應細胞，一般而言該等細胞自該受試者原始單離。於另一實施例中，可在暴露於如本文中所述之CAR之前或於經如本文中所述之CAR基因改造後用下列細胞激素中之一或多者活體外刺激CD34+ 細胞：根據前述方法之Flt-3配位體(FLT3)、幹細胞因子(SCF)、巨核細胞生長及分化因子(TPO)、IL-3及IL-6 (Asheuer等人，2004, PNAS 101(10):3557-3562；Imren等人，2004)。
本發明提供用於治療癌症之經改造之免疫效應細胞群體，該等經改造之免疫效應細胞包含如本文中所揭示之CAR。例如，經改造之免疫效應細胞群體自獲自診斷患有本文中所述之B細胞惡性腫瘤之患者(自體供體)之外周血單核細胞(PBMC)製備。PBMC形成可為CD4+ 、CD8+ 或CD4+ 及CD8+ 之T淋巴細胞之異源群體。
PBMC亦可包括其他細胞毒性淋巴細胞，諸如NK細胞或NKT細胞。可將攜帶本文中涵蓋之CAR之編碼序列之表現載體引入人類供體T細胞、NK細胞或NKT細胞群體。除了使用抗CD3抗體及/或抗CD28抗體及IL-2之細胞活化或如本文中其他地方所述之此項技術中已知之任何其他方法外，可使用流動式細胞測量術分選經成功轉導之攜帶表現載體之T細胞以單離CD3陽性T細胞及然後進一步增殖以增加此等表現CAR蛋白之T細胞之數目。使用標準程序冷凍保存表現CAR蛋白之T細胞，儲存及/或製備T細胞用於人類受試者。於一實施例中，在非人類動物源產物(諸如牛胎兒血清及胎牛血清)之不存在下進行T細胞之活體外轉導、培養及/或擴增。因為PBMC之異源群體經基因改造，所得經轉導細胞為包含靶向BCMA之如本文中涵蓋之CAR之經改造細胞的異源群體。
於另外實施例中，可將例如1、2、3、4、5或更多種不同表現載體之混合物用於基因改造免疫效應細胞之供體群體中，其中各載體編碼如本文中涵蓋之不同嵌合抗原受體蛋白。所得經改造免疫效應細胞形成經改造細胞之混合群體，其中該等經改造細胞之群體表現一種以上不同CAR蛋白。
於一實施例中，本發明提供一種儲存靶向BCMA蛋白之經基因改造之鼠科、人類或人源化之表現CAR蛋白之免疫效應細胞的方法，其包括冷凍保存免疫效應細胞使得該等細胞在解凍後保持活力。表現CAR蛋白之免疫效應細胞之部分可藉由此項技術中已知之方法冷凍保存以提供用於將來治療患有B細胞相關病狀之患者之此等細胞之永久來源。當需要時，可將經冷凍保存之經轉形免疫效應細胞解凍、生長及擴增用於更多此等細胞。
如本文中所用，「冷凍保存」係指藉由冷卻至零度以下溫度(諸如(通常) 77 K或-196℃ (液氮沸點))保存細胞。經常在零度以下溫度使用冷凍保護劑以防止被保存之細胞由於在低溫下凍結或升溫至室溫受損。冷凍保存劑及最佳冷卻速率可保護避免細胞損傷。可使用之冷凍保護劑包括(但不限於)二甲亞碸(DMSO) (Lovelock及Bishop，Nature, 1959; 183: 1394-1395；Ashwood-Smith,  Nature, 1961; 190: 1204-1205)、甘油、聚乙烯吡咯啶酮(Rinfret,  Ann. N.Y. Acad. Sci., 1960; 85: 576)及聚乙二醇(Sloviter及Ravdin，Nature, 1962; 196: 48)。較佳冷卻速率為1℃至3℃/分鐘。於至少兩小時後，T細胞已達到-80℃之溫度及可直接放入液氮(-196℃)中用於永久儲存，諸如於長期低溫儲存容器中。5.7. T 細胞製造方法
藉由本文中涵蓋之方法製造之T細胞提供改良之授受性免疫療法組合物。不希望受任何特定理論束縛，據信藉由本文中涵蓋之方法製造之T細胞組合物充滿優越性質，包括增加之生存、於相對缺乏分化下擴增及於活體內續存。於一實施例中，製造T細胞之方法包括使細胞與調節PI3K細胞信號傳導路徑之一或多種劑接觸。於一實施例中，製造T細胞之方法包括使細胞與調節PI3K/Akt/mTOR細胞信號傳導路徑之一或多種劑接觸。於各種實施例中，T細胞可獲自任何來源且在製造方法之活化及/或擴增階段與劑接觸。將所得T細胞組合物於發育強效T細胞中增濃，該等T細胞具有增殖能力且表現下列生物標記物中之一或多者：CD62L、CCR7、CD28、CD27、CD122、CD127、CD197、及CD38。於一實施例中，將包含已用一或多種PI3K抑制劑處理之T細胞之細胞群體增濃用於共同表現下列生物標記物中之一或多者或所有之CD8+ T細胞群體：CD62L、CD127、CD197、及CD38。
於一實施例中，製造包含維持之增殖水平及減少之分化之經改造之T細胞。於特定實施例中，藉由在一或多個刺激信號及為PI3K細胞信號傳導路徑之抑制劑之劑之存在下，刺激T細胞變成活化及增殖來製造T細胞。
然後可將T細胞改造以表現抗BCMA CAR。於一實施例中，藉由用包含本文中涵蓋之抗BCMA CAR之病毒載體轉導T細胞來改造T細胞。於某一實施例中，在刺激及活化之前在PI3K細胞信號傳導路徑之抑制劑之存在下改造T細胞。於另一實施例中，於刺激及活化後在PI3K細胞信號傳導路徑之抑制劑之存在下改造T細胞。於特定實施例中，於刺激及活化之12小時、24小時、36小時或48小時內在PI3K細胞信號傳導路徑之抑制劑之存在下改造T細胞。
於活化T細胞後，培養該等細胞以增殖。可將T細胞培養至少1、2、3、4、5、6、或7天，至少2週，至少1、2、3、4、5、或6個月或超過1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10或更多擴增輪。
於各種實施例中，在PI3K路徑之一或多種抑制劑之存在下製造T細胞組合物。該等抑制劑可靶向該路徑中之一或多種活性或單一活性。不希望受任何特定理論束縛，期望在製造方法之刺激、活化及/或擴增階段期間處理T細胞或使T細胞與PI3K路徑之一或多種抑制劑接觸優先增加年幼T細胞，從而產生優越治療性T細胞組合物。
於特定實施例中，提供一種增加表現經工程改造之T細胞受體之T細胞之增殖的方法。此等方法可包括例如收集來自受試者之T細胞源，在PI3K路徑之一或多種抑制劑之存在下刺激及活化該等T細胞，改造該等T細胞以表現抗BCMA CAR (例如，抗BCMA02 CAR)，及於培養物中擴增該等T細胞。
於某一實施例中，產生為表現下列生物標記物中之一或多者增濃之T細胞群體之方法：CD62L、CCR7、CD28、CD27、CD122、CD127、CD197、及CD38。於一實施例中，年幼T細胞包含下列生物標記物中之一或多者或所有：CD62L、CD127、CD197、及CD38。於一實施例中，提供缺乏表現CD57、CD244、CD160、PD-1、CTLA4、TIM3、及LAG3之年幼T細胞。如本文中其他地方所討論，年幼T細胞生物標記物之表現水平係相對於更分化T細胞或免疫效應細胞群體中之此等標記物之表現水平。
於一實施例中，使用外周血單核細胞(PBMC)作為本文中涵蓋之T細胞製造方法中之T細胞來源。PBMC形成T淋巴細胞(其可為CD4+ 、CD8+ 、或CD4+ 及CD8+ )之異源群體且可包含其他單核細胞，諸如單核細胞、B細胞、NK細胞及NKT細胞。可將包含編碼本文中涵蓋之經工程改造之TCR或CAR之多核苷酸之表現載體引入人類供體T細胞、NK細胞或NKT細胞中。除了使用抗CD3抗體及/或抗CD28抗體及IL-2、IL-7及/或IL-15之細胞活化或如本文中其他地方所述之此項技術中已知之任何其他方法外，可使用流動式細胞測量術分選經成功轉導之攜帶表現載體之T細胞以單離CD3陽性T細胞及然後進一步增殖以增加經改造之T細胞之數目。
本文中涵蓋之製造方法可進一步包括冷凍保存經改造之T細胞用於儲存及/或製備以用於人類受試者。將T細胞冷凍保存使得該等細胞在解凍後保持活力。當需要時，可將經冷凍保存之經轉形免疫效應細胞解凍、生長及擴增用於更多此等細胞。如本文中所用，「冷凍保存」係指藉由冷卻至零度以下溫度(諸如(通常) 77 K或-196℃ (液氮沸點))保存細胞。經常在零度以下溫度使用冷凍保護劑以防止被保存之細胞由於在低溫下凍結或升溫至室溫受損。冷凍保存劑及最佳冷卻速率可保護避免細胞損傷。可使用之冷凍保護劑包括(但不限於)二甲亞碸(DMSO) (Lovelock及Bishop，Nature , 1959; 183: 1394-1395；Ashwood-Smith,Nature , 1961; 190: 1204-1205)、甘油、聚乙烯吡咯啶酮(Rinfret,Ann. N.Y. Acad. Sci. , 1960; 85: 576)及聚乙二醇(Sloviter及Ravdin，Nature , 1962; 196: 48)。較佳冷卻速率為1℃至3℃/分鐘。於至少兩小時後，T細胞已達到-80℃之溫度及可直接放入液氮(-196℃)中用於永久儲存，諸如於長期低溫儲存容器中。5.8. T 細胞
本發明涵蓋製造經改良之CAR T細胞組合物。用於CAR T細胞產生之T細胞可係自體(autologous/autogeneic) (「自身」)或非自體(「非自身」，例如，異基因、同基因或異種)。於較佳實施例中，T細胞係獲自哺乳動物受試者。於更佳實施例中，T細胞係獲自靈長類動物受試者。於最佳實施例中，T細胞係獲自人類受試者。
T細胞可獲自許多來源，包括(但不限於)外周血單核細胞、骨髓、淋巴結組織、臍帶血、胸腺組織、來自感染部位之組織、腹水、胸腔積液、脾組織及腫瘤。於某些實施例中，T細胞可獲自使用熟習者已知之任何數目之技術(諸如沉降，例如，FICOLLTM 分離)自受試者收集之單位血。於一實施例中，來自個體之循環血之細胞藉由血球分離術獲得。血球分離術產物通常含有淋巴細胞(包括T細胞)、單核細胞、粒細胞、B細胞、其他成核白血球、紅血球及血小板。於一實施例中，可將藉由血球分離術收集之細胞洗滌以移除血漿部分及將細胞放置於適宜緩衝液或介質中用於隨後處理。可將細胞用PBS或用另一種適宜溶液洗滌，該溶液缺少鈣、鎂及若非所有其他，則大多數二價陽離子。一般技術者應瞭解，洗滌步驟可藉由此項技術者已知之方法，諸如藉由使用半自動流過離心機達成。例如，Cobe 2991細胞處理器、Baxter CytoMate或類似者。於洗滌後，可將細胞再懸浮於各種生物相容性緩衝液或含有或不含有緩衝液之其他鹽水溶液中。於某些實施例中，可於細胞直接再懸浮培養基中移除血球分離術樣品之非所需組分。
於特定實施例中，於本文中涵蓋之製造方法中使用包含T細胞(例如，PBMC)之細胞群體。於其他實施例中，於本文中涵蓋之製造方法中使用經單離或經純化之T細胞群體。可藉由裂解紅血球及清除單核細胞(例如，藉由通過PERCOLLTM梯度離心)將細胞自外周血單核細胞(PBMC)單離。於一些實施例中，於單離PBMC後，可在活化、擴增及/或基因改造之前或之後將細胞毒性及輔助T淋巴細胞分選成初始、記憶及效應T細胞子群體。
表現下列標記物中之一或多者之T細胞之特異性子群體：CD3、CD4、CD8、CD28、CD45RA、CD45RO、CD62、CD127、及HLA-DR可藉由陽性或陰性選擇技術進一步單離。於一實施例中，表現選自由(i) CD62L、CCR7、CD28、CD27、CD122、CD127、CD197；或(ii) CD38或CD62L、CD127、CD197及CD38組成之群之標記物中之一或多者之T細胞之特異性子群體藉由陽性或陰性選擇技術進一步單離。於各種實施例中，製造之T細胞組合物不表現或不實質上表現下列標記物中之一或多者：CD57、CD244、CD160、PD-1、CTLA4、TIM3、及LAG3。
於一實施例中，選自由CD62L、CD127、CD197及CD38組成之群之標記物中之一或多者之表現相較於不利用PI3K抑制劑活化及擴增之T細胞群體增加至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少25倍或更多。
於一實施例中，選自由CD57、CD244、CD160、PD-1、CTLA4、TIM3及LAG3組成之群之標記物中之一或多者之表現相較於利用PI3K抑制劑活化及擴增之T細胞群體減少至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少25倍或更多。
於一實施例中，本文中涵蓋之製造方法增加包含初始或發育強效T細胞之一或多種標記物之CAR T細胞之數目。不希望受任何特定理論束縛，本發明者相信用一或多種PI3K抑制劑處理包含T細胞之細胞群體導致發育強效T細胞之增加擴增且提供相較於現存CAR T細胞療法更穩健及有效授受性CAR T細胞免疫療法。
於使用本文中涵蓋之方法製造之T細胞中增加之初始或發育強效T細胞之標記物的說明性實例包括(但不限於) CD62L、CD127、CD197及CD38。於特定實施例中，初始T細胞不表現或不實質上表現下列標記物中之一或多者：CD57、CD244、CD160、PD-1、BTLA、CD45RA、CTLA4、TIM3、及LAG3。
關於T細胞，自本文中涵蓋之各種擴增方法產生之T細胞群體可具有各種特異性表現型性質，取決於採用之條件。於各種實施例中，經擴增之T細胞群體包含下列表現型標記物中之一或多者：CD62L、CD127、CD197、CD38及HLA-DR。
於一實施例中，此等表現型標記物包含CD62L、CD127、CD197及CD38中之一或多者或所有之增加之表現。於特定實施例中，將藉由包括CD62L、CD127、CD197及CD38之初始T細胞之表現型標記物之表現表徵的CD8+ T淋巴細胞擴增。
於特定實施例中，將藉由包括CD45RO、CD62L、CD127、CD197及CD38之中樞記憶T細胞之表現型標記物之表現且對顆粒酶B陰性表徵之T細胞擴增。於一些實施例中，該等中樞記憶T細胞為CD45RO+ 、CD62L+ 、CD8+ T細胞。
於某些實施例中，將藉由包括CD62L之初始CD4+ 細胞之表現型標記物之表現且對CD45RA及/或CD45RO之表現陰性表徵之CD4+ T淋巴細胞擴增。於一些實施例中，CD4+ 細胞藉由中樞記憶CD4+ 細胞之表現型標記物之表現(包括CD62L及CD45RO陽性)表徵。於一些實施例中，效應CD4+ 細胞係CD62L陽性及CD45RO陰性。
於某些實施例中，T細胞自個體單離及在經基因改造以表現抗BCMA CAR之前經活化及刺激以於活體外增殖。就此而言，可在經基因改造(即，經轉導或轉染以表現本文中涵蓋之抗BCMA CAR)之前及/或之後培養T細胞。.5.8.1. 活化及擴增
為達成T細胞組合物之足夠治療劑量，T細胞經常經受一或多輪刺激、活化及/或擴增。一般可使用如下所述之方法活化及擴增T細胞：例如，美國專利案6,352,694、6,534,055、6,905,680、6,692,964、5,858,358、6,887,466、6,905,681、7,144,575、7,067,318、7,172,869、7,232,566、7,175,843、5,883,223、6,905,874、6,797,514、及6,867,041，其全文各者以引用的方式併入本文中。可在改造T細胞之前及/或之後將經改造以表現抗BCMA CAR之T細胞活化及擴增。此外，可在活化及/或擴增之前、期間及/或之後使T細胞與調節PI3K細胞信號傳導路徑之一或多種劑接觸。於一實施例中，藉由本文中涵蓋之方法製造之T細胞經歷1、2、3、4或5或更多輪活化及擴增，其各者可包含調節PI3K細胞信號傳導路徑之一或多種劑。
於一實施例中，共刺激配位體在特異性結合T細胞上之同源共刺激分子之抗原呈遞細胞(例如，aAPC、樹突狀細胞、B細胞及類似者)上呈遞，從而提供信號，除了藉由例如結合TCR/CD3複合物提供之主要信號外，該信號介導所需T細胞反應。適宜共刺激配位體包括(但不限於) CD7、B7-1 (CD80)、B7-2 (CD86)、PD-L 1、PD-L2、4-1BBL、OX40L、可誘導共刺激配位體(ICOS-L)、細胞間黏附分子(ICAM)、CD30L、CD40、 CD70、CD83、HLA-G、MICA、MICB、HVEM、淋巴毒素β受體、ILT3、ILT4、結合Toll配位體受體之促效劑或抗體、及與B7-H3特異性結合之配位體。
於特定實施例中，共刺激配位體包括特異性結合至T細胞上呈遞之共刺激分子之抗體或其抗原結合片段，其包括(但不限於) CD27、CD28、4- IBB、OX40、CD30、CD40、PD-1、1COS、淋巴細胞功能相關抗原1 (LFA-1)、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3及與CD83特異性結合之配位體。
適宜共刺激配位體進一步包括靶抗原，其可以可溶形式提供或在結合在經改造之T細胞上表現之經工程改造之TCR或CAR的APC或aAPC上表現。
於各種實施例中，本文中涵蓋之製造T細胞之方法包括活化包含T細胞之細胞群體及擴增T細胞群體。T細胞活化可藉由通過T細胞TCR/CD3複合物或經由刺激CD2表面蛋白提供主要刺激信號及藉由通過輔助分子(例如，CD28)提供二級共刺激信號來達成。
可藉由使T細胞與適宜CD3結合劑(例如，CD3配位體或抗CD3單株抗體)接觸刺激TCR/CD3複合物。CD3抗體之說明性實例包括(但不限於) OKT3、G19-4、BC3及64.1。
於另一實施例中，可使用CD2結合劑對T細胞提供主要刺激信號。CD2結合劑之說明性實例包括(但不限於) CD2配位體及抗CD2抗體，例如，與T11.1或T11.2抗體組合之T11.3抗體(Meuer, S. C.等人(1984)Cell 36:897-906)及與9-1抗體組合之9.6抗體(其識別相同抗原決定基如TI 1.1) (Yang, S. Y.等人(1986)J. Immunol . 137:1097-1100)。亦可使用結合至與上述抗體中之任一者相同之抗原決定基之其他抗體。可藉由如本文中其他地方所揭示之標準技術製備及識別額外抗體或抗體之組合。
除了通過TCR/CD3複合物或經由CD2提供之主要刺激信號外，T細胞反應之誘導需要二級共刺激信號。於特定實施例中，可使用CD28結合劑提供共刺激信號。CD28結合劑之說明性實例包括(但不限於)：天然CD28配位體，例如CD28之天然配位體(例如蛋白質之B7家族之成員，諸如B7-1(CD80)及B7-2 (CD86))；及能交聯CD28分子之抗CD28單株抗體或其片段，例如單株抗體9.3、B-T3、XR-CD28、KOLT-2、15E8、248.23.2及EX5.3D10。
於一實施例中，將提供主要刺激信號之分子(例如通過TCR/CD3複合物或CD2提供刺激之分子)及共刺激分子偶聯至相同表面。
於某些實施例中，提供刺激及共刺激信號之結合劑在細胞表面定位。此可藉由將細胞用編碼結合劑之核酸以適於其在細胞表面表現之形式轉染或轉導或或者藉由將結合劑偶聯至細胞表面來達成。
於另一實施例中，提供主要刺激信號之分子(例如通過TCR/CD3複合物或CD2提供刺激之分子)及共刺激分子在抗原呈遞細胞上展示。
於一實施例中，提供主要刺激信號之分子(例如通過TCR/CD3複合物或CD2提供刺激之分子)及共刺激分子在分開表面上提供。
於某一實施例中，提供刺激及共刺激信號之結合劑中之一者係可溶(於溶液中提供)且其他劑在一或多個表面上提供。
於特定實施例中，提供刺激及共刺激信號之結合劑均以可溶形式提供(於溶液中提供)。
於各種實施例中，本文中涵蓋之製造T細胞之方法包括用抗CD3及抗CD28抗體活化T細胞。
藉由本文中涵蓋之方法製造之T細胞組合物包含在抑制PI3K細胞信號傳導路徑之一或多種劑之存在下活化及/或擴增之T細胞。可在改造T細胞之前及/或之後活化及擴增經改造以表現抗BCMA CAR之T細胞。於特定實施例中，將T細胞群體活化、改造以表現抗BCMA CAR，及然後培養用於擴增。
於一實施例中，藉由本文中涵蓋之方法製造之T細胞包含增加數目之T細胞表現標記物(指示高增殖潛力及自我更新能力)但是其不表現或實質上表現不可檢測之T細胞分化之標記物。此等T細胞可以穩健方式重複活化及擴增及從而提供改良之治療性T細胞組合物。
於一實施例中，在抑制PI3K細胞信號傳導路徑之一或多種劑之存在下活化及擴增之T細胞群體相較於不利用PI3K抑制劑活化及擴增之T細胞群體擴增至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少25倍、至少50倍、至少100倍、至少250倍、至少500倍、至少1000倍或更多。
於一實施例中，藉由在抑制PI3K細胞信號傳導路徑之一或多種劑之存在下活化及擴增之標記物年幼T細胞之表現表徵的T細胞群體相較於不利用PI3K抑制劑活化及擴增之T細胞群體擴增至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少25倍、至少50倍、至少100倍、至少250倍、至少500倍、至少1000倍或更多。
於一實施例中，擴增藉由本文中涵蓋之方法活化之T細胞進一步包括培養包含T細胞之細胞群體達若干小時(約3小時)至約7天至約28天或在中間之任何小時整數值。於另一實施例中，可將T細胞組合物培養14天。於特定實施例中，將T細胞培養約21天。於另一實施例中，將T細胞組合物培養約2至3天。亦可期望刺激/活化/擴增之若干週期使得T細胞之培養時間可為60天或更多。
於特定實施例中，適用於T細胞培養之條件包括適宜培養基(例如，最小基本培養基或RPMI培養基1640或X-vivo 15，(Lonza))及針對增殖及生存力必需之一或多種因子，包括(但不限於)血清(例如，胎牛血清或人類血清)、介白素-2 (IL-2)、胰島素、IFN-γ、IL-4、IL-7、IL-21、GM-CSF、IL- 10、IL- 12、IL-15、TGFβ及TNF-α或熟習技工已知之適用於細胞生長之任何其他添加劑。
細胞培養基之其他說明性實例包括(但不限於) RPMI 1640、Clicks、AIM-V、DMEM、MEM、a-MEM、F-12、X-Vivo 1 5、及X-Vivo 20、優化子，其中添加胺基酸、丙酮酸鈉及維生素，無血清或補充有適宜量之血清(或血漿)或限定組之激素、及/或足夠用於T細胞生長及擴增之量之細胞激素。
用於T細胞擴增之其他添加劑之說明性實例包括(但不限於)表面活性劑、piasmanate、pH緩衝劑(諸如HEPES)及還原劑(諸如N-乙醯基-半胱胺酸及2-巰基乙醇)。
抗生素(例如盤尼西林(penicillin)及鏈黴素(streptomycin))僅包含於實驗培養物中，不包含於待融合至受試者之細胞之培養物中。將靶細胞維持在支持生長必需之條件下，例如，適宜溫度(例如，37℃)及氛圍(例如，空氣+ 5% CO2 )。
於特定實施例中，於含有適宜細胞激素(諸如IL-2、IL-7及/或IL-15)之培養基中，使PBMC或經單離T細胞與一般附接至珠或其他表面之刺激劑及共刺激劑(諸如抗CD3及抗CD28抗體)接觸。
於其他實施例中，人工APC (aAPC)可藉由工程改造K562、U937、721.221、T2及C1R細胞以指導各種共刺激分子及細胞激素之穩定表現及分泌來製備。於特定實施例中，使用K32或U32 aAPC指導一或多種基於抗體之刺激分子在AAPC細胞表面之展示。T細胞群體可藉由表現各種共刺激分子之aAPC擴增，該等共刺激分子包括(但不限於) CD137L (4-1BBL)、CD134L (OX40L)及/或CD80或CD86。最後，aAPC提供有效平臺以擴增經基因改造之T細胞及維持CD8 T細胞上之CD28表現。於WO 03/057171及US2003/0147869中提供之aAPC之全部以引用的方式併入本文中。5.8.2. 劑
於各種實施例中，提供一種製造T細胞之方法，該方法擴增未分化或發育強效T細胞，其包括使T細胞與調節細胞中之PI3K路徑之劑接觸。於各種實施例中，提供一種製造T細胞之方法，該方法擴增未分化或發育強效T細胞，其包括使T細胞與調節細胞中之PI3K/AKT/mTOR路徑之劑接觸。可在活化及擴增之前、期間及/或之後接觸細胞。T細胞組合物保持足夠T細胞效能使得其可經歷多輪擴增而無分化之實質增加。
如本文中所用，術語「調節」、「調節劑(modulator/modulatory agent)」或可比較術語係指劑引起細胞信號傳導路徑改變之能力。調節劑可增加或減少路徑組分之量、活性或增加或減少細胞信號傳導路徑之所需效應或輸出。於一實施例中，該調節劑為抑制劑。於另一實施例中，該調節劑為活化劑。
「劑」係指用於調節PI3K/AKT/mTOR路徑之化合物、小分子(例如，小有機分子)、核酸、多肽或片段、其同工異型物、變異體、類似物或衍生物。
「小分子」係指具有小於約5 kD、小於約4 kD、小於約3 kD、小於約2 kD、小於約1 kD、或小於約.5kD之分子量之組合物。小分子可包括核酸、肽、多肽、肽擬似物、類肽、碳水化合物、脂質、其組分或其他有機或無機分子。化學及/或生物混合物(諸如真菌、細菌或藻類提取物)之庫係此項技術中已知且可利用本發明之檢定中之任一者篩選。合成分子庫之方法係此項技術中已知(參見，例如，Carell等人，1994a；Carell等人，1994b；Cho等人，1993；DeWitt等人，1993；Gallop等人，1994；Zuckermann等人，1994)。
「類似物」係指與具有本發明所需活性之化合物、核苷酸、蛋白質或多肽或化合物具有相似或相同活性或功能，但是不一定包含與較佳實施例之序列或結構相似或相同之序列或結構之小有機化合物、核苷酸、蛋白質或多肽。
「衍生物」係指包含已藉由引入胺基酸殘基置換、缺失或新增改變之親本蛋白質或多肽之胺基酸序列或已藉由引入核苷酸置換或缺失、新增或突變改造之核酸或核苷酸之化合物、蛋白質或多肽。衍生核酸、核苷酸、蛋白質或多肽具有與親本多肽相似或相同功能。
於各種實施例中，調節PI3K路徑之劑活化該路徑之組分。「活化劑」或「促效劑」係指促進、增加或誘導PI3K/AKT/mTOR路徑中之分子之一或多種活性之劑，其包括(不限於)抑制PI3K之一或多種活性之分子。
於各種實施例中，調節PI3K路徑之劑抑制該路徑之組分。「抑制劑」或「拮抗劑」係指抑制、減少或降低PI3K路徑中之分子之一或多種活性之劑，其包括(不限於) PI3K。於一實施例中，該抑制劑為雙分子抑制劑。於特定實施例中，該抑制劑可抑制具有相同或實質相似活性之一類分子(泛抑制劑)或可特異性抑制分子之活性(選擇性或特異性抑制劑)。抑制亦可係不可逆或可逆。
於一實施例中，抑制劑具有至少1 nM、至少2 nM、至少5 nM、至少10 nM、至少50 nM、至少100 nM、至少200 nM、至少500 nM、至少1 μM、至少10 μM、至少50 μM、或至少100 μM之IC50。IC50測定可使用此項技術中已知之任何習知技術達成。例如，IC50可藉由在研究下之抑制劑之濃度範圍存在下量測給定酵素之活性來測定。然後將酵素活性之實驗獲得之值對使用之抑制劑濃度作圖。採用顯示50%酵素活性(相較於在任何抑制劑不存在下之活性)之抑制劑之濃度作為「IC50」值。類似地，可通過活性之適宜測定定義其他抑制劑濃度。
於各種實施例中，使T細胞與PI3K路徑之一或多種調節劑在以下濃度下接觸或將T細胞用PI3K路徑之一或多種調節劑在以下濃度下處理或培養：至少1 nM、至少2 nM、至少5 nM、至少10 nM、至少50 nM、至少100 nM、至少200 nM、至少500 nM、至少1 μM、至少10 μM、至少50 μM、至少100 μM、或至少1 M。
於特定實施例中，可使T細胞與PI3K路徑之一或多種調節劑接觸或將T細胞用PI3K路徑之一或多種調節劑處理或培養達至少12小時，18小時，至少1、2、3、4、5、6或7天，至少2週，至少1、2、3、4、5或6個月或超過1、2、3、4、5、6、7、8、9或10或更多擴增輪。5.8.3. PI3K/Akt/mTOR 路徑
磷脂醯-肌醇-3激酶/Akt/雷帕黴素(rapamycin)之哺乳動物靶路徑用作整合生長因子信號傳導與細胞增殖、分化、代謝及生存之導管。PI3K為高度保守細胞內脂質激酶之家族。IA類PI3K藉由生長因子受體酪胺酸激酶(RTK)直接或通過與銜接子分子之胰島素受體受質家族相互作用活化。此活化導致產生磷脂醯-肌醇-3,4,5-三磷酸酯(PIP3) (絲胺酸/蘇胺酸激酶Akt之調節劑)。mTOR通過經典PI3K路徑經由2種不同複合物(各藉由賦予不同活性之不同結合搭檔表徵)作用。mTORC1 (與PRAS40、raptor及mLST8/GbL複合之mTOR)充當PI3K/Akt信號傳導之下游效應子，其連接生長因子信號與蛋白質轉譯、細胞生長、增殖及生存。mTORC2 (與rictor、mSIN1、protor及mLST8複合之mTOR)充當Akt之上游活化子。
在PI3K之生長因子受體介導之活化後，通過Akt之普列克底物蛋白(pleckstrin)同源域與PIP3之相互作用將Akt募集至膜，因此暴露其活化環及使能在蘇胺酸308 (Thr308)處藉由構成活化磷酸肌醇-依賴性蛋白激酶1 (PDK1)磷酸化。針對最大活化，亦將Akt藉由mTORC2在其C端疏水基序之絲胺酸473 (Ser473)處磷酸化。亦已顯示DNA-PK及HSP於調節Akt活性中係重要的。Akt通過TSC2之抑制磷酸化活化mTORC1，其伴隨TSC1藉由抑制Rheb GTP酶(mTORC1之正調節劑)負調節mTORC1。mTORC1具有2個良好定義之受質，p70S6K (下文中稱作S6K1)及4E-BP1，其二者關鍵調節蛋白質合成。因此，mTORC1為PI3K之重要下游效應子，其連接生長因子信號傳導與蛋白質轉譯及細胞增殖。5.8.4. PI3K 抑制劑
如本文中所用，術語「PI3K抑制劑」係指結合至PI3K且抑制PI3K之至少一種活性之核酸、肽、化合物或小有機分子。可將PI3K蛋白分成三種類別，1類PI3K、2類PI3K及3類PI3K。1類PI3K呈異二聚體存在，該等異二聚體由四個p110催化子單元(p110α、p110β、p110δ及p110γ)中之一者及調節子單元之兩個家族中之一者組成。本發明之PI3K抑制劑較佳地靶向1類PI3K抑制劑。於一實施例中，PI3K抑制劑將顯示對1類PI3K抑制劑之一或多種同功異型物之選擇性(即，對p110α、p110β、p110δ及p110γ或p110α、p110β、p110δ及p110γ中之一或多者之選擇性)。於另一態樣中，PI3K抑制劑將不顯示同功異型物選擇性且被認為「泛PI3K抑制劑」。於一實施例中，PI3K抑制劑將與PI3K催化域競爭結合ATP。
於某些實施例中，PI3K抑制劑可例如靶向PI3K以及PI3K-AKT-mTOR路徑中之額外蛋白質。於特定實施例中，可將靶向mTOR及PI3K二者之PI3K抑制劑稱作mTOR抑制劑或PI3K抑制劑。可將僅靶向PI3K之PI3K抑制劑稱作選擇性PI3K抑制劑。於一實施例中，可理解選擇性PI3K抑制劑係指展示關於PI3K 50%抑制濃度之劑，該濃度係低於關於mTOR及/或該路徑中之其他蛋白質之抑制劑之IC50至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少50倍、至少100倍、至少1000倍或更低。
於特定實施例中，示例性PI3K抑制劑以約200 nM或更低，較佳地約100 nm或更低，甚至更佳地約60 nM或更低，約25 nM、約10 nM、約5 nM、約1 nM、100 μM、50 μM、25 μM、10 μM、1 μM或更低之IC50 (抑制活性之50%之濃度) 抑制PI3K。於一實施例中，PI3K抑制劑以約2 nM至約100 nm，更佳地約2 nM至約50 nM，甚至更佳地約2 nM至約15 nM之IC50抑制PI3K。
適用於本文中涵蓋之T細胞製造方法之PI3K抑制劑之說明性實例包括(但不限於) BKM120 (1類PI3K抑制劑，Novartis)、XL147 (1類PI3K抑制劑，Exelixis)、(泛PI3K抑制劑，GlaxoSmithKline)及PX-866 (1類PI3K抑制劑；p110α、p110β及p110γ同功異型物，Oncothyreon)。
選擇性PI3K抑制劑之其他說明性實例包括(但不限於) BYL719、GSK2636771、TGX-221、AS25242、CAL-101、ZSTK474、及IPI-145。
泛PI3K抑制劑之其他說明性實例包括(但不限於) BEZ235、LY294002、GSK1059615、TG100713、及GDC-0941。5.8.5. AKT 抑制劑
如本文中所用，術語「AKT抑制劑」係指抑制AKT之至少一種活性之核酸、肽、化合物或小有機分子。可將AKT抑制劑分成若干類別，包括脂質基抑制劑(例如，靶向AKT之普列克底物蛋白同源域之抑制劑，其防止AKT定位至質膜)、ATP競爭性抑制劑及變構抑制劑。於一實施例中，AKT抑制劑藉由結合至AKT催化位點起作用。於特定實施例中，Akt抑制劑藉由抑制下游AKT靶(諸如mTOR)之磷酸化起作用。於另一實施例中，藉由抑制活化Akt之輸入信號藉由抑制例如AKT之DNA-PK活化、AKT之PDK-1活化及/或Akt之mTORC2活化來抑制AKT活性。
AKT抑制劑可靶向所有三種AKT同工異型物(AKT1、AKT2、AKT3)或可係同功異型物選擇性且僅靶向AKT同功異型物中之一者或二者。於一實施例中，AKT抑制劑可靶向AKT以及PI3K-AKT-mTOR路徑中之額外蛋白質。可將僅靶向AKT之AKT抑制劑稱作選擇性AKT抑制劑。於一實施例中，可理解選擇性AKT抑制劑係指展示關於AKT 50%抑制濃度之劑，該濃度係低於關於該路徑中之其他蛋白質之抑制劑之IC50至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少50倍、至少100倍、至少1000倍或更低。
於特定實施例中，示例性AKT抑制劑以約200 nM或更低，較佳地約100 nm或更低，甚至更佳地約60 nM或更低，約25 nM、約10 nM、約5 nM、約1 nM、100 μM、50 μM、25 μM、10 μM、1 μM或更低之IC50 (抑制活性之50%之濃度) 抑制AKT。於一實施例中，AKT以約2 nM至約100 nm，更佳地約2 nM至約50 nM，甚至更佳地約2 nM至約15 nM之IC50抑制AKT。
與基於奧利司他汀(auristatin)之抗體-藥物結合物組合使用之AKT抑制劑之說明性實例包括例如哌立福辛(perifosine) (Keryx)、MK2206 (Merck)、VQD-002 (VioQuest)、XL418 (Exelixis)、GSK690693、GDC-0068、及PX316 (PROLX Pharmaceuticals)。
選擇性Akt1抑制劑之說明性非限制性實例為A-674563。
選擇性Akt2抑制劑之說明性非限制性實例為CCT128930。
於特定實施例中，Akt抑制劑Akt之DNA-PK活化、Akt之PDK-1活化、Akt之mTORC2活化、或Akt之HSP活化。
DNA-PK抑制劑之說明性實例包括(但不限於) NU7441、PI-103、NU7026、PIK-75、及PP-121。5.8.6. mTOR 抑制劑
術語「mTOR抑制劑」或「抑制mTOR之劑」係指抑制mTOR蛋白之至少一種活性(諸如例如，對其受質(例如，p70S6激酶1、4E-BP1、AKT/PKB及eEF2)中之至少一者之絲胺酸/蘇胺酸蛋白質激酶活性)之核酸、肽、化合物或小有機分子。mTOR抑制劑能直接結合至且抑制mTORC1、mTORC2或mTORC1及mTORC2二者。
mTORC1及mTORC2活性之抑制可藉由PI3K/Akt/mTOR路徑之信號轉導之減少來測定。可利用廣泛各種讀出建立此信號傳導路徑之輸出之減少。一些非限制性示例性讀出包括(1)殘基(包括但不限於5473及T308)處之Akt之磷酸化減少；(2)如例如由Akt受質(包括但不限於Fox01/O3a T24/32、GSK3a/β、S21/9及TSC2 T1462)之磷酸化減少證明之Akt之活化減少；(3) mTOR之下游信號傳導分子(包括但不限於核糖體S6 S240/244、70S6K T389及4EBP1 T37/46)之磷酸化減少；及(4)癌細胞之增殖之抑制。
於一實施例中，mTOR抑制劑為活性位點抑制劑。此等為結合至mTOR之ATP結合位點(亦稱作ATP結合口袋)且抑制mTORC1及mTORC2二者之催化活性之mTOR抑制劑。適用於本文中涵蓋之T細胞製造方法之一類活性位點抑制劑為靶向且直接抑制PI3K及mTOR二者之雙重特異性抑制劑。雙重特異性抑制劑結合至mTOR及PI3K之ATP結合位點二者。此等抑制劑之說明性實例包括(但不限於)：咪唑并喹唑啉、渥曼青黴素(wortmannin)、LY294002、PI-103 (Cayman Chemical)、SF1126 (Semafore)、BGT226 (Novartis)、XL765 (Exelixis)及NVP-BEZ235 (Novartis)。
適用於本文中涵蓋之方法之另一類mTOR活性位點抑制劑相對於一或多種I型磷脂醯肌醇3-激酶(例如，PI3激酶α、β、γ或δ)選擇性抑制mTORC1及mTORC2活性。此等活性位點抑制劑結合至mTOR但是非PI3K之活性位點。此等抑制劑之說明性實例包括(但不限於)：吡唑并嘧啶、Torin1 (Guertin及Sabatini)、PP242 (2-(4-胺基-1-異丙基-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-基)-1H-吲哚-5-醇)、PP30、Ku-0063794、WAY-600 (Wyeth)、WAY-687 (Wyeth)、WAY-354 (Wyeth)、及AZD8055 (Liu等人，Nature Review, 8, 627-644, 2009)。
於一實施例中，選擇性mTOR抑制劑係指展示關於mTORC1及/或mTORC2 50%抑制濃度(IC50)之劑，該IC50係低於關於1、2、3或更多種I型PI3激酶或所有I型PI3激酶之抑制劑之IC50至少10倍、至少20倍、至少50倍、至少100倍、至少1000倍或更低。
本文中將用於本發明之另一類mTOR抑制劑稱作「雷帕類似物(rapalog)」。如本文中所用，術語「雷帕類似物」係指特異性結合至mTOR FRB域(FKBP雷帕黴素結合域)，與雷帕黴素結構上相關且保留mTOR抑制性質之化合物。該術語雷帕類似物排除雷帕黴素。雷帕類似物包括雷帕黴素之酯、醚、肟、腙及羥基胺，以及雷帕黴素核心結構上之官能基已例如藉由還原或氧化修飾之化合物。亦認為此等化合物之醫藥上可接受之鹽為雷帕黴素衍生物。適用於本文中涵蓋之方法之雷帕類似物之說明性實例包括(不限於)替西羅莫司(temsirolimus) (CC1779)、依維莫司(everolimus) (RAD001)、德福莫司(deforolimus) (AP23573)、AZD8055 (AstraZeneca)及OSI-027 (OSI)。
於一實施例中，該劑為mTOR抑制劑雷帕黴素(西羅莫司(sirolimus))。
於特定實施例中，用於本發明之示例性mTOR抑制劑以約200 nM或更低，較佳地約100 nm或更低，甚至更佳地約60 nM或更低，約25 nM、約10 nM、約5 nM、約1 nM、100 μM、50 μM、25 μM、10 μM、1 μM或更低之IC50 (抑制活性之50%之濃度) 抑制mTORC1、mTORC2或mTORC1及mTORC2二者。於一態樣中，用於本發明之mTOR抑制劑以約2 nM至約100 nm，更佳地約2 nM至約50 nM，甚至更佳地約2 nM至約15 nM之IC50抑制mTORC1、mTORC2或mTORC1及mTORC2二者。
於一實施例中，示例性mTOR抑制劑以約200 nM或更低，較佳地約100 nm或更低，甚至更佳地約60 nM或更低，約25 nM、約10 nM、約5 nM、約1 nM、100 μM、50 μM、25 μM、10 μM、1 μM或更低之IC50 (抑制活性之50%之濃度)抑制PI3K及mTORC1或mTORC2或mTORC1及mTORC2二者及PI3K。於一態樣中，用於本發明之mTOR抑制劑以約2 nM至約100 nm，更佳地約2 nM至約50 nM，甚至更佳地約2 nM至約15 nM之IC50抑制PI3K及mTORC1或mTORC2或mTORC1及mTORC2二者及PI3K。
適用於本文中涵蓋之特定實施例之mTOR抑制劑之其他說明性實例包括(但不限於) AZD8055、INK128、雷帕黴素、PF-04691502及依維莫司。
已顯示mTOR證實對生理受質蛋白、p70 S6核糖體蛋白激酶I (p70S6K1)及eIF4E結合蛋白1 (4EBP1)之穩健及特異性催化活性，如藉由西方墨點法(Western blotting)中之磷特異性抗體所量測。
於一實施例中，PI3K/AKT/mTOR路徑之抑制劑為選自由BI-D1870、H89、PF-4708671、FMK及AT7867組成之群之s6激酶抑制劑。5.9. 組合物及調配物
本文中涵蓋之組合物可包含一或多種多肽、多核苷酸、包含相同經基因改造之免疫效應細胞之載體等，如本文中所涵蓋。組合物包括(但不限於)醫藥組合物。「醫藥組合物」係指用於對細胞或動物投與之單獨或與一或多種其他治療形式組合之於醫藥上可接受或生理上可接受之溶液中調配的組合物。亦應瞭解，若所需，則本發明之組合物亦可與其他劑(諸如例如，細胞激素、生長因子、激素、小分子、化療、前體藥物、藥物、抗體或其他各種醫藥上活化劑)組合投與。實際上不限制亦可包含於組合物中之其他組分，只要額外劑不不利影響組合物遞送意欲療法之能力。
本文中採用短語「醫藥上可接受」係指於合理醫學判斷之範圍內，適用於與人類及動物之組織接觸而無過量毒性、刺激、過敏反應、或其他問題或併發症，與合理效益/風險比相當之該等化合物、物質、組合物及/或劑型。
如本文中所用，「醫藥上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑」包括(不限於)任何已由美國食品及藥品管理局(United States Food and Drug Administration)批准可接受用於人類或家畜之佐劑、載劑、賦形劑、助流劑、甜味劑、稀釋劑、防腐劑、染料/著色劑、增味劑、表面活性劑、潤濕劑、分散劑、懸浮液、穩定劑、等滲劑、溶劑、表面活性劑、或乳化劑。例示性醫藥上可接受之載劑包括(但不限於)糖，諸如乳糖、葡萄糖及蔗糖；澱粉，諸如玉米澱粉及馬鈴薯澱粉；纖維素及其衍生物，諸如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素及乙酸纖維素；黃蓍膠；麥芽；明膠；滑石；可可脂、蠟、動物及植物脂肪、石蠟、矽酮、膨潤土、矽酸、氧化鋅；油，諸如花生油、棉籽油、紅花油、芝麻油、橄欖油、玉米油及大豆油；二醇，諸如丙二醇；多元醇，諸如甘油、山梨醇、甘露醇及聚乙二醇；酯，諸如油酸乙酯及月桂酸乙酯；瓊脂；緩衝劑，諸如氫氧化鎂及氫氧化鋁；藻酸；無熱原水；等滲鹽水；林格氏溶液(Ringer's solution)；乙醇；磷酸鹽緩衝溶液；及用於調配物中之任何其他相容物質。
於特定實施例中，本發明之組合物包含一量之本文中涵蓋之表現CAR之免疫效應細胞。如本文中所用，術語「量」係指為達成有益或所需預防或治療結果(包括臨床結果)之「有效量(an amount effective/an effective amount)」之經基因改造之治療細胞(例如T細胞)。
「預防上有效量」係指有效達成所需預防結果之經基因改造之治療細胞之量。通常，但不一定，因為在疾病之前或較早期於個體中使用預防劑量，預防上有效量係小於治療上有效量。
經基因改造之治療細胞之「治療上有效量」可根據諸如以下之因素變化：個體之疾病狀態、年齡、性別及體重及幹細胞及祖細胞引起個體之所需反應之能力。治療上有效量亦為病毒或經轉導治療細胞之任何毒性或有害作用被治療有益效果超過者。術語「治療上有效量」包括有效「治療」受試者(例如，患者)之量。當指示治療量時，待投與之本發明之組合物之精確量可藉由醫生考慮年齡、體重、腫瘤大小、感染或轉移程度及患者(受試者)之病狀之個體差異來確定。一般可指定包含本文中所述之T細胞之醫藥組合物可在102 至1010 個細胞/kg體重，較佳地105 至106 個細胞/kg體重之劑量(包括彼得範圍內之整數值)下投與。細胞數目將取決於意欲組合物之最終用途，其中包含之細胞之類型亦將如此。針對本文中提供之用途，細胞一般係以公升或更少之體積，可為500 mL或更少，甚至250 mL或100 mL或更少。因此所需細胞之密度通常係大於106 個細胞/ml及一般係大於107 個細胞/ml，一般108 個細胞/ml或更大。可將免疫細胞之臨床相關數目分配至多次輸注，該等輸注累積等於或超過105 、106 、107 、108 、109 、1010 、1011 、或1012 個細胞。於本發明之一些態樣中，特定言之因為所有融合細胞將重定向至特定靶抗原(例如，κ或λ輕鏈)，可投與106 / kg (106 至1011 /患者)之範圍之較低數目之細胞。可在此等範圍內之劑量下多次投與表現CAR之細胞組合物。該等細胞可對經歷療法之患者係異基因、同基因、異種或自體。若所需，則治療亦可包括投與如本文中所述之分裂素(例如，PHA)或淋巴因子、細胞激素、及/或趨化因子(例如，IFN-γ、IL-2、IL-12、TNF-α、IL-18、及TNF-β、GM-CSF、IL-4、IL-13、Flt3-L、RANTES、MIP1α等)以增強誘導免疫反應。
一般而言，可於治療及預防免疫受損個體中產生之疾病中利用包含如本文中所述之經活化及擴增之細胞之組合物。特定言之，於治療B細胞惡性腫瘤中使用包含本文中涵蓋之經CAR改造之T細胞之組合物。本發明之經CAR改造之T細胞可單獨或作為醫藥組合物與載劑、稀釋劑、賦形劑及/或與諸如IL-2或其他細胞激素或細胞群體之其他組分組合投與。於特定實施例中，本文中涵蓋之醫藥組合物包含一定量之經基因改造之T細胞與一或多種醫藥上或生理上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑組合。
包含表現CAR之免疫效應細胞群體(諸如T細胞)之本發明之醫藥組合物可包含緩衝劑，諸如中性緩衝鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水及類似者；碳水化合物，諸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或右旋糖、甘露醇；蛋白質；多肽或胺基酸，諸如甘胺酸；抗氧化劑；螯合劑，諸如EDTA或麩胱甘肽；佐劑(例如，氫氧化鋁)；及防腐劑。較佳地調配本發明之組合物用於非經腸投與，例如，血管內(靜脈內及動脈內)、腹膜內或肌肉內投與。
液體醫藥組合物(無論其是否為溶液、懸浮液或其他類似形式)可包含下列中之一或多者：無菌稀釋劑，諸如用於注射之水、鹽水溶液(較佳地生理鹽水)、林格氏溶液、等滲氯化鈉、固定油(諸如可用作溶劑或懸浮介質之合成單或二甘油酯)、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他溶劑；抗菌劑，諸如苄基醇或對羥基苯甲酸甲酯；抗氧化劑，諸如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑，諸如乙二胺四乙酸；緩衝劑，諸如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽及用於調整張力之劑，諸如氯化鈉或右旋糖。可將非經腸製劑封裝於由玻璃或塑膠製備之安瓿、一次性注射器或多劑量小瓶中。可注射醫藥組合物較佳地係無菌。
於特定實施例中，本文中涵蓋之組合物包含有效量之表現CAR之免疫效應細胞，單獨或與一或多種治療劑組合。因此，表現CAR之免疫效應細胞組合物可單獨或與其他已知癌治療(諸如放射療法、化療、移植、免疫療法、激素療法、光動力學療法等)組合投與。該等組合物亦可與抗生素組合投與。此等治療劑可於此項技術中接受作為如本文中所述之特定疾病狀態(諸如特定癌症)之標準治療。涵蓋之示例性治療劑包括細胞激素、生長因子、類固醇、NSAID、DMARD、抗發炎劑、化療、放射治療、治療性抗體、或其他活性及輔助劑。
於某些實施例中，包含本文中揭示之表現CAR之免疫效應細胞之組合物可結合任何數目之化療劑投與。化療劑之說明性實例包括烷基化劑，諸如噻替哌(thiotepa)及環磷醯胺(cyclophosphamide) (CYTOXAN™)；烷基磺酸酯，諸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)及哌泊舒凡(piposulfan)；氮雜環丙烷，諸如苯并多巴(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、甲多巴(meturedopa)及尿多巴(uredopa)；伸乙基亞胺及甲基蜜胺，包括六甲蜜胺(altretamine)、三伸乙基蜜胺、三伸乙基磷醯胺、三伸乙基硫代磷醯胺及三羥甲蜜胺恢復；氮芥，諸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、環磷醯胺、雌氮芥(estramustine)、異環磷醯胺(ifosfamide)、二氯甲基二乙胺(mechlorethamine)、氧氮芥鹽酸鹽、美法侖(melphalan)、新恩比興(novembichin)、苯芥膽甾醇(phenesterine)、潑尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；硝基脲，諸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲黴素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)、雷莫司汀(ranimustine)；抗生素，諸如阿克拉黴素(aclacinomysin)、放線菌素(actinomycin)、安麯黴素(authramycin)、重氮絲胺酸(azaserine)、博來黴素(bleomycin)、放線菌素C (cactinomycin)、卡奇黴素(calicheamicin)、卡拉比辛(carabicin)、洋紅黴素(carminomycin)、嗜癌素(carzinophilin)、色黴素(chromomycin)、更生黴素(dactinomycin)、道諾黴素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮基-5-側氧基-L-正白胺酸、多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊達比星(idarubicin)、麻西羅黴素(marcellomycin)、絲裂黴素(mitomycin)、麥可酚酸(mycophenolic acid)、諾加黴素(nogalamycin)、橄欖黴素(olivomycin)、培洛黴素(peplomycin)、波菲黴素(potfiromycin)、嘌呤黴素(puromycin)、三鐵阿黴素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、鏈黑菌素(streptonigrin)、鏈佐星(streptozocin)、殺結核菌素(tubercidin)、烏苯美司(ubenimex)、淨司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代謝劑，諸如胺甲喋呤(methotrexate)及5-氟尿嘧啶(5-FU)；葉酸類似物，諸如二甲葉酸(denopterin)、胺甲喋呤、蝶羅呤(pteropterin)、曲麥克特(trimetrexate)；嘌呤類似物，諸如氟達拉濱(fludarabine)、6-巰基嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鳥嘌呤(thioguanine)；嘧啶類似物，諸如安西他濱(ancitabine)、阿紮胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、二去氧尿苷、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依諾他濱(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)、5-FU；雄激素，諸如卡魯睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone)、環硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾內脂(testolactone)；抗腎上腺劑，諸如胺魯米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；葉酸補充物，諸如亞葉酸(frolinic acid)；醋葡醛內酯(aceglatone)；醛磷醯胺配醣(aldophosphamide glycoside)；胺基乙醯丙酸；安吖啶(amsacrine)；百思布啶(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；依達曲沙(edatraxate)；地磷醯胺(defofamine)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；依氟鳥胺酸(elformithine)；依利醋銨(elliptinium acetate)；乙環氧啶(etoglucid)；硝酸鎵；羥基脲；蘑菇多醣(lentinan)；氯尼達明(lonidamine)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌達醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；噴司他丁(pentostatin)；蛋胺氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙醯肼；甲基苄肼(procarbazine)；PSK®；雷佐生(razoxane)；西佐喃(sizofiran)；螺旋鍺(spirogermanium)；細交鏈孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亞胺苯醌(triaziquone)；2, 2',2”-三氯三乙胺；尿烷(urethane)；長春地辛(vindesine)；達卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴衛矛醇(mitolactol)；哌血生(pipobroman)；加胞嘧啶(gacytosine)；阿拉伯糖苷(arabinoside) (「Ara-C」)；環磷醯胺；噻替哌；紫杉烷，例如，特素(paclitaxel) (TAXOL®，Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.)及多西他賽(doxetaxel) (TAXOTERE®，Rhone-Poulenc Rohrer, Antony, France)；苯丁酸氮芥；吉西他濱(gemcitabine)；6-硫鳥嘌呤；巰基嘌呤；胺甲喋呤；鉑類似物，諸如順鉑(cisplatin)及卡鉑(carboplatin)；長春鹼(vinblastine)；鉑；依託泊苷(VP-16)；異環磷醯胺；絲裂黴素C；米托蒽醌；長春新鹼(vincristine)；長春瑞濱(vinorelbine)；諾維本(navelbine)；諾消靈(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；道諾黴素(daunomycin)；胺喋呤(aminopterin)；希羅達(xeloda)；伊班膦酸鹽(ibandronate)；CPT-11；拓撲異構酶抑制劑RFS 2000；二氟甲基鳥胺酸(difluoromethylomithine) (DMFO)；視黃酸衍生物，諸如Targretin™ (貝沙羅汀(bexarotene))、Panretin™ (阿利維甲酸(alitretinoin))；ONTAK™ (地尼白介素(denileukin diftitox))；埃斯培拉黴素(esperamicin)；卡培他濱(capecitabine)及以上任一者之醫藥上可接受之鹽、酸或衍生物。亦包含於此定義為作用為調節或抑制激素對癌症作用之抗激素劑，諸如抗雌激素，包括例如他莫西芬(tamoxifen)、雷洛昔芬(raloxifene)、抑制4(5)-咪唑之芳香酶、4-羥基他莫西芬、曲沃昔芬(trioxifene)、雷洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奧那司酮(onapristone)及托瑞米芬(toremifene) (Fareston)；及抗雄激素，諸如氟他胺(flutamide)、尼魯米特(nilutamide)、比卡魯胺(bicalutamide)、亮脯利特(leuprolide)及戈舍瑞林(goserelin)；及以上任一者之醫藥上可接受之鹽、酸或衍生物。
各種其他治療劑可結合本文中所述之組合物使用。於一實施例中，投與包含表現CAR之免疫效應細胞之組合物與抗發炎劑。抗發炎劑或藥物包括(但不限於)類固醇及糖皮質激素(包括倍他米松(betamethasone)、布地奈德(budesonide)、地塞米松、乙酸氫化可的松(hydrocortisone acetate)、氫化可的松、甲基潑尼松龍(methylprednisolone)、潑尼松龍(prednisolone)、潑尼松(prednisone)、曲安西龍(triamcinolone))、非類固醇抗發炎藥物(NSAIDS) (包括阿司匹林(aspirin)、布洛芬(ibuprofen)、萘普生(naproxen)、胺甲喋呤、柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine)、來氟米特(leflunomide)、抗TNF藥劑、環磷醯胺及麥考酚酯(mycophenolate))。
其他示例性NSAID係選自由布洛芬、萘普生、甲氧萘丙酸鈉、Cox-2抑制劑(諸如VIOXX® (羅非考昔(rofecoxib))及CELEBREX® (塞來考昔(celecoxib)))及唾液酸鹽組成之群。示例性止痛劑係選自由醋胺酚、氧可酮、反胺苯環醇、及鹽酸丙氧芬組成之群。示例性糖皮質激素係選自由可的松(cortisone)、地塞米松、氫化可的松、甲基潑尼松龍、潑尼松龍及潑尼松組成之群。示例性生物反應調節劑包括針對細胞表面標記物(例如CD4、CD5等)之分子、細胞激素抑制劑，諸如TNF拮抗劑(例如依那西普(etanercept) (ENBREL®)、阿達木單抗(adalimumab) (HUMIRA®)及英夫利昔單抗(infliximab) (REMICADE®))、趨化因子抑制劑及黏附分子抑制劑。生物反應調節劑包括單株抗體以及分子之重組形式。示例性DMARD包括包括咪唑硫嘌呤(azathioprine)、環磷醯胺、環孢黴素(cyclosporine)、胺甲喋呤、青黴胺(penicillamine)、來氟米特、柳氮磺胺吡啶、羥基氯喹、Gold (口服(金諾芬(auranofin))及肌肉內)及二甲胺四環素(minocycline)。
適用於與本文中涵蓋之經CAR改造之T細胞組合之治療性抗體之說明性實例包括(但不限於)巴維昔單抗(bavituximab)、貝伐單抗(bevacizumab) (avastin)、比伐單抗(bivatuzumab)、博納吐單抗(blinatumomab)、考那木單抗(conatumumab)、達雷木單抗(daratumumab)、杜麗單抗(duligotumab)、達西珠單抗(dacetuzumab)、達洛珠單抗(dolotuzumab)、埃羅妥珠單抗(HuLuc63)、吉姆單抗(gemtuzumab)、替伊莫單抗(ibritumomab)、因達西單抗(indatuximab)、依託珠單抗(inotuzumab)、洛瓦土珠單抗(lorvotuzumab)、魯卡木單抗(lucatumumab)、米拉珠單抗(milatuzumab)、莫昔土莫單抗(moxetumomab)、奧卡拉珠單抗(ocaratuzumab)、奧法木單抗(ofatumumab)、利妥昔單抗(rituximab)、西妥昔單抗(siltuximab)、泰普洛單抗(teprotumumab)及尤必昔單抗(ublituximab)。
對PD-1或PD-L1及/或CTLA-4之抗體可與本文中揭示之CAR T細胞(例如，BCMA CAR T細胞，例如，表現包含BCMA-2單鏈Fv片段(例如，bb2121)之嵌合抗原受體之CAR T細胞)組合使用。於特定實施例中，PD-1抗體係選自由納武單抗(nivolumab)、派姆單抗(pembrolizumab)及帕地單抗(pidilizumab)組成之群。於特定實施例中，PD-L1抗體係選自由阿特珠單抗(atezolizumab)、阿伏魯單抗(avelumab)、德瓦魯單抗(durvalumab)及BMS-986559組成之群。於特定實施例中，CTLA-4抗體係選自由伊匹單抗(ipilimumab)及曲美木單抗(tremelimumab)組成之群。
於某些實施例中，本文中所述之組合物結合細胞激素投與。如本文中所用，「細胞激素」意指由作為細胞內調節劑對另一種細胞作用之一種細胞群體釋放之蛋白質的通用術語。此等細胞激素之實例為淋巴因子、單核因子及傳統多肽激素。包含於細胞激素中為生長激素，諸如人類生長激素、N-甲硫胺醯基人類生長激素及牛生長激素；副甲狀腺激素；甲狀腺素；胰島素；胰島素原；鬆弛素(relaxin)；前鬆弛素； 醣蛋白激素，諸如促卵泡激素(FSH)、促甲狀腺激素(TSH)及黃體化激素(LH)；肝生長因子；纖維母細胞生長因子；催乳素(prolactin)；胎盤催乳素；腫瘤壞死因子-α及-β；穆勒氏(mullerian)抑制物質；小鼠促性腺激素相關肽；抑制素(inhibin)；活化素(activin)；血管內皮生長因子；整聯蛋白(integrin)；促血小板生成素(thrombopoietin) (TPO)；神經生長因子，諸如NGF-β；血小板生長因子；轉形生長因子(TGF)，諸如TGF-α及TGF-β；類胰島素生長因子-I及-II；紅血球生成素(erythropoietin) (EPO)；骨誘導性因子；干擾素，諸如干擾素-α、β及γ；群落刺激因子(CSF)，諸如巨噬細胞-CSF (M-CSF)；粒細胞-巨噬細胞-CSF (GM-CSF)；及粒細胞-CSF (G-CSF)；介白素(IL)，諸如IL-1、IL-α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-15、IL-21；腫瘤壞死因子，諸如TNF-α或TNF-β；及其他多肽因子，包括LIF及套組配位體(KL)。如本文中所用，術語細胞激素包括來自天然來源或來自重組細胞培養物之蛋白質及初始序列細胞激素之生物活性等效物。
於特定實施例中，組合物包含本文中涵蓋之CAR T細胞，該等T細胞在如本文中所揭示之PI3K抑制劑之存在下培養且表現下列標記物中之一或多者：CD3、CD4、CD8、CD28、CD45RA、CD45RO、CD62、CD127及HLA-DR，可進一步藉由陽性或陰性選擇技術單離。於一實施例中，組合物包含表現選自由CD62L、CCR7、CD28、CD27、CD122、CD127、CD197；及CD38或CD62L、CD127、CD197及CD38組成之群之標記物中之一或多者之T細胞的特定子群體，進一步藉由陽性或陰性選擇技術單離。於各種實施例中，組合物不表現或不實質上表現下列標記物中之一或多者：CD57、CD244、CD160、PD-1、CTLA4、TIM3及LAG3。
於一實施例中，選自由CD62L、CD127、CD197及CD38組成之群之標記物中之一或多者之表現相較於不利用PI3K抑制劑活化及擴增之T細胞群體增加至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少25倍或更多。
於一實施例中，選自由CD57、CD244、CD160、PD-1、CTLA4、TIM3及LAG3組成之群之標記物中之一或多者之表現相較於利用PI3K抑制劑活化及擴增之T細胞群體減少至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少25倍或更多。5.10. 治療方法
本文中涵蓋之經基因改造之免疫效應細胞提供用於治療B細胞相關病狀之授受性免疫療法之改善方法，該等B細胞相關病狀包括(但不限於)免疫調節病狀及惡性血液病。5.10.1. 特定實施例
於一實施例中，本文中提供一種清除有需要受試者中之表現BCMA之細胞之方法，其包括對該受試者投與治療上有效量之表現針對B細胞成熟抗原(BCMA)之嵌合抗原受體(CAR)之免疫細胞，其中該等免疫細胞以150 x 106 個細胞至450 x 106 個細胞之劑量投與，且其中在該投與之前，該受試者已接受一線或多線先前療法，該一線或多線先前療法包括下列中之一或多者：蛋白酶體抑制劑、來那度胺、泊馬度胺、沙利度胺、硼替佐米、地塞米松、環磷醯胺、多柔比星、卡非佐米、伊沙佐米、順鉑、多柔比星、依託泊苷、抗CD38抗體(諸如達雷木單抗)、帕比司他或埃羅妥珠單抗。
於另一實施例中，本文中提供一種治療有需要受試者之由表現BCMA之細胞引起之疾病的方法，其包括對該受試者投與治療上有效量之表現針對B細胞成熟抗原(BCMA)之嵌合抗原受體(CAR)之免疫細胞，其中該等免疫細胞以150 x 106 個細胞至450 x 106 個細胞之劑量投與，且其中在該投與之前，該受試者已接受一線或多線先前療法，該一線或多線先前療法包括下列中之一或多者：蛋白酶體抑制劑、來那度胺、泊馬度胺、沙利度胺、硼替佐米、地塞米松、環磷醯胺、多柔比星、卡非佐米、伊沙佐米、順鉑、多柔比星、依託泊苷、抗CD38抗體(諸如達雷木單抗)、帕比司他或埃羅妥珠單抗。
於另一實施例中，本文中提供一種治療有需要受試者之表現BCMA之癌症之方法，其包括對該受試者投與治療上有效量之表現針對B細胞成熟抗原(BCMA)之嵌合抗原受體(CAR)之免疫細胞，其中該等免疫細胞以150 x 106 個細胞至450 x 106 個細胞之劑量投與，且其中在該投與之前，該受試者已接受一線或多線先前療法，該一線或多線先前療法包括下列中之一或多者：蛋白酶體抑制劑、來那度胺、泊馬度胺、沙利度胺、硼替佐米、地塞米松、環磷醯胺、多柔比星、卡非佐米、伊沙佐米、順鉑、多柔比星、依託泊苷、抗CD38抗體(諸如達雷木單抗)、帕比司他或埃羅妥珠單抗；其中該表現BCMA之癌症為多發性骨髓瘤、慢性淋巴球性白血病、或非霍奇金氏淋巴瘤(例如，伯基特氏淋巴瘤、慢性淋巴球性白血病/小淋巴球性淋巴瘤(CLL/SLL)、彌漫性大B細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、免疫母細胞性大細胞淋巴瘤、前體B淋巴母細胞性淋巴瘤、及套細胞淋巴瘤)。
於以上實施例中任一者之特定實施例中，在該投與之前，該受試者已接受包括以下之一線或多線先前療法：達雷木單抗、泊馬度胺、及地塞米松(DPd)；達雷木單抗、硼替佐米及地塞米松(DVd)；伊沙佐米、來那度胺及地塞米松 (IRd)；達雷木單抗、來那度胺及地塞米松；硼替佐米、來那度胺及地塞米松(RVd)；硼替佐米、環磷醯胺及地塞米松(BCd)；硼替佐米、多柔比星及地塞米松；卡非佐米、來那度胺及地塞米松(CRd)；硼替佐米及地塞米松；硼替佐米、沙利度胺及地塞米松； 來那度胺及地塞米松；地塞米松、沙利度胺、順鉑、多柔比星、環磷醯胺、依託泊苷及硼替佐米(VTD-PACE)；來那度胺及低劑量地塞米松；硼替佐米、環磷醯胺及地塞米松；卡非佐米及地塞米松；單獨來那度胺；單獨硼替佐米；單獨達雷木單抗；埃羅妥珠單抗、來那度胺及地塞米松；埃羅妥珠單抗、來那度胺及地塞米松；苯達莫司汀、硼替佐米及地塞米松；苯達莫司汀、來那度胺及地塞米松；泊馬度胺及地塞米松；泊馬度胺、硼替佐米及地塞米松；泊馬度胺、卡非佐米及地塞米松；硼替佐米及脂質體多柔比星；環磷醯胺、來那度胺及地塞米松；埃羅妥珠單抗、硼替佐米及地塞米松；伊沙佐米及地塞米松；帕比司他、硼替佐米及地塞米松；帕比司他及卡非佐米；或泊馬度胺、環磷醯胺及地塞米松。
於以上任一者之某些更特定實施例中，該受試者已接受該等線先前療法中之兩者或更多者、該等線先前療法中之三者或更多者、該等線先前療法中之四者或更多者、該等線先前療法中之五者或更多者、該等線先前療法中之六者或更多者、或該等線先前療法中之七者或更多者。於以上任一者之某些其他更特定實施例中，該受試者已接受不超過該等線先前療法中之三者、不超過該等線先前療法中之兩者、或不超過該等線先前療法中之一者。
針對以上實施例中之任一者，受試者在該投與之前經歷淋巴細胞清除。針對以上實施例中之任一者，受試者經歷血球分離術以收集且單離該等免疫細胞(例如，T細胞)。於以上實施例中之任一者之特定實施例中，該受試者在該血球分離術時展示：M-蛋白(血清蛋白電泳[sPEP]或尿蛋白電泳[uPEP])：sPEP ≥ 0.5 g/dL或uPEP ≥ 200 mg/24小時；輕鏈多發性骨髓瘤而於血清或尿液中無可量測疾病，具有血清免疫球蛋白游離輕鏈≥ 10 mg/dL及異常血清免疫球蛋白κ λ游離輕鏈比率；及/或美國東岸癌症臨床研究合作組織(ECOG)表現狀態≤ 1。於更特定實施例中，該受試者在血球分離術時額外：已接受該等線先前療法中之至少三者，包括用蛋白酶體抑制劑、免疫調節劑(來那度胺或泊馬度胺)及抗CD38抗體先前療法；已經歷該等至少三種先前療法各者之至少2個連續週期之治療，除非疾病進展為對療法之最佳反應；在最近先前療法之60天或60天內具有疾病進展之證據；及/或已達成對該等線先前療法中之至少一者之反應(最小反應或更佳)。
於另一更特定實施例中，該受試者額外：已接受僅一種先前抗骨髓瘤治療方案；具有下列高風險因素：R-ISS III期及定義為以下之早期復發：(i)若受試者已經歷誘導加幹細胞移植，則疾病進展小於自首次移植日起12個月；或 (ii)若受試者已僅接受誘導，則PD ＜自最後一次治療方案日起12個月，該方案最低限度必須含有蛋白酶體抑制劑、免疫調節劑及地塞米松。
於以上實施例中之任一者之特定實施例中，該受試者顯示於該投與後至少六個月或於該投與後至少十二個月之無進展生存期。
於以上實施例中之任一者之特定實施例中，該嵌合抗原受體包含靶向BCMA (例如，單鏈Fv抗體片段(scFv)，例如，BCMA02 scFv)之抗體或抗體片段。於本文中任何實施例之更特定實施例中，該等免疫細胞為bb2121細胞。5.10.2. 一般實施例
於特定實施例中，藉由用本文中涵蓋之CAR基因改造初始免疫效應細胞將初始免疫效應細胞之特異性重定向至B細胞。於各種實施例中，使用病毒載體基因改造具有編碼CAR之特定多核苷酸之免疫效應細胞，該CAR包含結合BCMA多肽之鼠科抗BCMA抗原結合域；鉸鏈域；跨膜 (TM)域，將TM域連接至CAR之細胞內信號域之短寡肽或多肽連接子；及一或多個細胞內共刺激信號域；及主要信號域。
於一實施例中，本發明包括一種細胞療法，其中T細胞經基因改造以表現靶向表現BCMA之B細胞之CAR。於另一實施例中，在IL-2及PI3K抑制劑之存在下培養抗BCMA CAR T細胞以增加治療性質及CAR T細胞之續存。然後將CAR T細胞融合至需要其之接受者。經融合細胞能殺死接受者中引起疾病之B細胞。不像抗體療法，CAR T細胞能於活體內複製，導致長期續存，該長期續存可導致持續癌症治療。
於一實施例中，本發明之CAR T細胞可經歷活體內穩健T細胞擴增且可續存延長量之時間。於另一實施例中，本發明之CAR T細胞進化成特異性記憶T細胞，該等記憶T細胞可經再活化以抑制任何額外腫瘤形成或生長。
於特定實施例中，包含包含本文中涵蓋之CAR之免疫效應細胞之組合物係用於治療與異常B細胞活性相關之病狀。
可使用包含本文中涵蓋之CAR之免疫效應細胞治療、預防或改善之病狀之說明性實例包括(但不限於)：全身性紅斑狼瘡、類風濕性關節炎、重症肌無力、自體免疫性溶血性貧血、特發性血小板減少性紫癜、抗磷脂症候群、恰加斯氏病、格雷夫氏病、韋格納氏肉芽腫病、結節性多動脈炎、斯耶葛籣氏症候群、尋常型天皰瘡、硬皮病、多發性硬化症、抗磷脂症候群、ANCA相關之血管炎、古德帕斯徹氏病、川崎氏病及急進性腎小球腎炎。
經改造之免疫效應細胞亦可於漿細胞病症(諸如重鏈疾病、初始或免疫細胞相關之澱粉樣變性及意義未定之單株丙種球蛋白病(MGUS))中具有應用。
如本文中所用，「B細胞惡性腫瘤」係指於如下文中所討論之B細胞(一種免疫系統細胞)中形成之一種癌症。
於特定實施例中，包含本文中涵蓋之經CAR改造之T細胞之組合物係用於治療血液惡性腫瘤，包括(但不限於) B細胞惡性腫瘤，諸如例如，多發性骨髓瘤(MM)及非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)。
多發性骨髓瘤為成熟漿細胞形態學之B細胞惡性腫瘤，該細胞形態學特徵在於此等類型細胞之單一純系之腫瘤轉形。此等漿細胞於骨髓(BM)中增殖且可侵入鄰近骨頭及有時血液。多發性骨髓瘤之變異體形式包括明顯多發性骨髓瘤、鬱積型多發性骨髓瘤、漿細胞白血病、非分泌性骨髓瘤、IgD骨髓瘤、骨硬化骨髓瘤、孤立性骨漿細胞瘤及髓外漿細胞瘤(參見，例如，Braunwald等人(編輯)，Harrison’s Principles of Internal Medicine ，第15版(McGraw-Hill 2001))。
可將多發性骨髓瘤如下分期： 表3：Durie-Salmon MM分期標準
Figure 108124385-A0304-0003
 表4：國際分期系統MM分期標準
Figure 108124385-A0304-0004
非霍奇金氏淋巴瘤包含一大群淋巴細胞(白血球)之癌症。非霍奇金氏淋巴瘤可在任何年齡發生且經常以較正常更大之淋巴結、發燒及體重損失為特徵。存在許多不同類型之非霍奇金氏淋巴瘤。例如，可將非霍奇金氏淋巴瘤分成侵略(快速生長)及懶惰(緩慢生長)型。雖然非霍奇金氏淋巴瘤可源自B細胞及T細胞，但是如本文中所用，術語「非霍奇金氏淋巴瘤」及「B細胞非霍奇金氏淋巴瘤」可交換使用。B細胞非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)包括伯基特氏淋巴瘤、慢性淋巴球性白血病/小淋巴球性淋巴瘤(CLL/SLL)、彌漫性大B細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、免疫母細胞性大細胞淋巴瘤、前體B-淋巴母細胞性淋巴瘤及套細胞淋巴瘤。於骨髓或幹細胞移植後出現之淋巴瘤通常為B細胞非霍奇金氏淋巴瘤。
慢性淋巴球性白血病(CLL)為懶惰(緩慢生長)癌症，其引起稱作B淋巴細胞或B細胞之不成熟白血球之緩慢增加。癌細胞通過血液及骨髓擴散，且亦可影響淋巴結或其他器官，諸如肝及脾。CLL最終造成骨髓衰竭。有時，於疾病後期，將該疾病稱作小淋巴球性淋巴瘤。
於特定實施例中，提供包括對有需要患者單獨或與一或多種治療劑組合投與治療上有效量之本文中涵蓋之表現CAR之免疫效應細胞或包含其之組合物的方法。於某些實施例中，本發明之細胞係用於治療有發展與異常B細胞活性相關之病狀或B細胞惡性腫瘤之風險的患者。因此，本發明提供治療或預防與異常B細胞活性相關之病狀或B細胞惡性腫瘤之方法，其包括對有需要受試者投與治療上有效量之本文中涵蓋之經CAR改造之細胞。
如本文中所用，術語「個體(individual)」及「受試者(subject)」經常可交換使用且係指展示可用基因療法載體、基於細胞之療法及本文中其他地方所揭示之方法治療之疾病、病症或病狀之症狀的任何動物。於較佳實施例中，受試者包括展示可用基因療法載體、基於細胞之療法及本文中其他地方所揭示之方法治療之造血系統之疾病、病症或病狀(例如，B細胞惡性腫瘤)之症狀的任何動物。適宜受試者(例如，患者)包括實驗動物(諸如小鼠、大鼠、兔或豚鼠)、農場動物及家畜或寵物(諸如貓或狗)。包括非人類靈長類動物及較佳地，人類患者。典型受試者包括患有B細胞惡性腫瘤、已經診斷患有B細胞惡性腫瘤或有B細胞惡性腫瘤風險或正在患有B細胞惡性腫瘤之人類患者。
如本文中所用，術語「患者」係指已經診斷患有可用基因療法載體、基於細胞之療法及本文中其他地方所揭示之方法治療之特定疾病、病症或病狀的受試者。
如本文中所用，「 治療(treatment/treating)」包括對疾病或病理狀態之症狀或病理學之任何有益或所需效果，且可包括正在治療之疾病或病狀之一或多種可量測標記物之甚至最小減少。治療可視情況涉及疾病或病狀之症狀之減少或改善，或延遲疾病或病狀之進展。「治療」不一定指示疾病或病狀或其相關症狀之完全根除。
如本文中所用，「預防(prevent)」及類似詞語(諸如「預防(prevented/preventing)」等)指示預防、抑制或降低疾病或病狀之發生或復發之可能性的方法。其亦係指延遲疾病或病狀之發作或復發或延遲疾病或病狀之症狀之發生或復發。如本文中所用，「預防」及類似詞語亦包括在疾病或病狀之發作或復發之前降低該疾病或病狀之強度、效果、症狀及/或負擔。
「增強」或「促進」或「增加」或「擴展」一般係指本文中涵蓋之組合物(例如，編碼CAR之經基因改造之T細胞或載體)產生、引起或造成相較於由載體或對照分子/組合物造成之反應更大生理反應(即，下游效應)之能力。可量測生理反應可包括T細胞擴增、活化、續存之增加及/或癌細胞殺死能力之增加，尤其自此項技術中理解及本文中描述顯而易見。「增加」或「增強」之量通常為「統計上顯著」量，且可包括由載體或對照組合物產生之反應之1.1、1.2、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30或更多倍(例如，500、1000倍) (包括所有整數及中間及1以上小數點，例如，1.5、1.6、1.7、1.8等)增加。
「減少(decrease)」或「降低(lower)」或「減少(lessen)」或「降低(reduce)」或「減少(abate)」一般係指本文中涵蓋之組合物產生、引起或造成相較於由載體或對照分子/組合物造成之反應更少生理反應(即，下游效應)之能力。「減少」或「降低」之量通常為「統計上顯著」量，且可包括由載體、對照組合物產生之反應(參考反應)或特定細胞系中之反應之1.1、1.2、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30或更多倍(例如，500、1000倍) (包括所有整數及中間及1以上小數點，例如，1.5、1.6、1.7、1.8等)減少。
「維持(maintain)」或「保持」或「維持(maintenance)」或「無變化」或「無實質變化」或「無實質減少」一般係指本文中涵蓋之組合物產生、引起或造成細胞中之更少生理反應(即，下游效應)之能力，如相較於由載體、對照分子/組合物造成之反應或特定細胞系中之反應。可比較反應為與參考反應無顯著不同或可量測不同者。
於一實施例中，治療有需要受試者之B細胞相關病狀之方法包括投與有效量(例如，治療上有效量)之包含本文中涵蓋之經基因改造之免疫效應細胞之組合物。投與數量及頻率將藉由如患者之病狀及患者之疾病之類型及嚴重度之此等因素確定，雖然可藉由臨床試驗確定適宜劑量。
於一實施例中，對受試者投與之組合物中之T細胞之量為至少0.1 x 105 個細胞、至少0.5 x 105 個細胞、至少1 x 105 個細胞、至少5 x 105 個細胞、至少1 x 106 個細胞、至少0.5 x 107 個細胞、至少1 x 107 個細胞、至少0.5 x 108 個細胞、至少1 x 108 個細胞、至少0.5 x 109 個細胞、至少1 x 109 個細胞、至少2 x 109 個細胞、至少3 x 109 個細胞、至少4 x 109 個細胞、至少5 x 109 個細胞或至少1 x 1010 個細胞。於特定實施例中，對受試者投與約1 x 107 個CAR T細胞至約1 x 109 個CAR T細胞、約2 x 107 個CAR T細胞至約0.9 x 109 個CAR T細胞、約3 x 107 個CAR T細胞至約0.8 x 109 個CAR T細胞、約4 x 107 個CAR T細胞至約0.7 x 109 個CAR T細胞、約5 x 107 個CAR T細胞至約0.6 x 109 個CAR T細胞、或約5 x 107 個CAR T細胞至約0.5 x 109 個CAR T細胞。
於一實施例中，對受試者投與之組合物中之T細胞之量為至少0.1 x 104 個細胞/kg體重、至少0.5 x 104 個細胞/kg體重、至少1 x 104 個細胞/kg體重、至少5 x 104 個細胞/kg體重、至少1 x 105 個細胞/kg體重、至少0.5 x 106 個細胞/kg體重、至少1 x 106 個細胞/kg體重、至少0.5 x 107 個細胞/kg體重、至少1 x 107 個細胞/kg體重、至少0.5 x 108 個細胞/kg體重、至少1 x 108 個細胞/kg體重、至少2 x 108 個細胞/kg體重、至少3 x 108 個細胞/kg體重、至少4 x 108 個細胞/kg體重、至少5 x 108 個細胞/kg體重、或至少1 x 109 個細胞/kg體重。於特定實施例中，對受試者投與約1 x 106 個CAR T細胞/kg體重至約1 x 108 個CAR T細胞/kg體重、約2 x 106 個CAR T細胞/kg體重至約0.9 x 108 個CAR T細胞/kg體重、約3 x 106 個CAR T細胞/kg體重至約0.8 x 108 個CAR T細胞/kg體重、約4 x 106 個CAR T細胞/kg體重至約0.7 x 108 個CAR T細胞/kg體重、約5 x 106 個CAR T細胞/kg體重至約0.6 x 108 個CAR T細胞/kg體重、或約5 x 106 個CAR T細胞/kg體重至約0.5 x 108 個CAR T細胞/kg體重。
一般技術者將知曉可需要本發明組合物之多次投與以產生所需治療。例如，可投與組合物1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10或更多次歷時1週、2週、3週、1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、1年、2年、5年、10年、或更多之跨度。
於某些實施例中，可期望對受試者投與經活化免疫效應細胞及然後隨後重新抽血(或進行血球分離術)，根據本發明由此活化免疫效應細胞及將患者用此等經活化及擴增之免疫效應細胞再輸注。此過程可每幾週進行多次。於某些實施例中，免疫效應細胞可自10cc至400cc之抽血活化。於某些實施例中，免疫效應細胞自20cc、30cc、40cc、50cc、60cc、70cc、80cc、90cc、100cc、150cc、200cc、250cc、300cc、350cc、或400cc或更多之抽血活化。不受理論束縛，使用此多個抽血/多個再輸注方案可用於選出免疫效應細胞之某些群體。
本文中涵蓋之組合物之投與可以任何習知方式，包括藉由氣溶膠吸入、注射、攝取、輸注、培植或移植進行。於較佳實施例中，非經腸投與組合物。如本文中所用，短語「非經腸投與(parenteral administration/administered parenterally)」係指除了腸及局部投與外通常藉由注射之投與模式，且包括(不限於)血管內、靜脈內、肌肉內、動脈內、鞘內、囊內、眶內、腫瘤內、心內、皮內、腹膜內、經氣管、皮下、表皮下、關節內、囊下、蛛網膜下、脊柱內及胸骨內注射及輸注。於一實施例中，本文中涵蓋之組合物藉由直接注射至腫瘤、淋巴結或感染部位對受試者投與。
於一實施例中，對有需要受試者投與有效量之組合物以增加對該受試者之B細胞相關病狀之細胞免疫反應。免疫反應可包括藉由能殺死感染細胞之細胞毒性T細胞介導之細胞免疫反應、調節T細胞及輔助T細胞反應。亦可誘導最初藉由輔助T細胞介導之激素免疫反應，該輔助T細胞能活化B細胞因此導致抗體產生。可使用各種技術分析藉由本發明組合物誘導之免疫反應之類型，該等技術良好述於此項技術中；例如，Current Protocols in Immunology ，由John E. Coligan、Ada M. Kruisbeek、David H. Margulies、Ethan M. Shevach、Warren Strober編輯(2001) John Wiley & Sons, NY, N.Y.
於T細胞介導之殺死之情況下，CAR-配位體結合啟動CAR信號傳導至T細胞，導致各種T細胞信號傳導路徑之活化，該等路徑藉由各種機理誘導T細胞產生或釋放能誘導靶細胞凋亡之蛋白質。此等T細胞介導之機理包括(但不限於)細胞內細胞毒性顆粒自T細胞至靶細胞之轉移，促發炎細胞激素之T細胞分泌(其可直接(或經由募集其他殺手效應細胞間接)誘導靶細胞殺死)，及T細胞表面上之死亡受體配位體(例如，FasL)之上調(其於結合至靶細胞上之其同源死亡受體(例如，Fas)後誘導靶細胞凋亡)。
於一實施例中，本發明提供一種治療經診斷患有B細胞相關病狀之受試者之方法，其包括自經診斷患有表現BCMA之B細胞相關病狀之受試者移除免疫效應細胞，利用包含編碼如本文中涵蓋之CAR之核酸之載體基因改造該等免疫效應細胞，從而產生經改造之免疫效應細胞之群體，及對相同受試者投與經改造之免疫效應細胞之群體。於較佳實施例中，該等免疫效應細胞包括T細胞。
於某些實施例中，本發明亦提供刺激對受試者之靶細胞群體之免疫效應細胞介導之免疫調節反應的方法，其包括對該受試者投與表現編碼CAR分子之核酸構築體之免疫效應細胞群體之步驟。
投與本文中所述之細胞組合物之方法包括任何方法，該方法有效導致於受試者中重新引入經離體基因改造之直接表現本發明之CAR之免疫效應細胞，或重新引入經基因改造之免疫效應細胞之祖細胞，該等細胞在引入受試者後分化成表現CAR之成熟免疫效應細胞。一種方法包括根據本發明利用核酸構築體離體轉導外周血T細胞及將經轉導之細胞返回至受試者。
本說明書中引用之所有公開案、專利申請案及發行之專利之全文以引用的方式併入本文中，如同明確且個別指示各個別公開案、專利申請案或發行之專利以引用的方式併入般。
雖然已出於清楚理解之目的於一些細節中經由說明及實例描述上述發明，根據本發明之教示對一般技術者顯而易見，可在不背離隨附申請專利範圍之精神或範圍下做出某些改變及修改。僅經由說明且不經由限制提供下列實例。熟習此項技術者將容易知曉可改變或修改各種非關鍵參數以產生基本類似結果。6. 實例 6.1. 實例 1 ： BCMA CAR 之構築
設計含有CAR之鼠科抗BCMA scFv抗體以含有以可操作方式連接至抗BMCA scFv之MND啟動子、來自CD8α及CD137共刺激域之鉸鏈及跨膜域、接著CD3ζ鏈之細胞內信號域。參見例如，圖1。圖1中所示之BCMA CAR包含用於在免疫效應細胞上表面表現之CD8α信號肽(SP)序列。示例性BCMA CAR之多核苷酸序列闡述於SEQ ID NO: 10 (抗BCMA02 CAR之多核苷酸序列)中；BCMA CAR之示例性多肽序列闡述於SEQ ID NO: 9 (抗BCMA02 CAR之多肽序列)中；及示例性CAR構築體之載體圖示於圖1中。表5顯示BCMA CAR慢病毒載體之各種核苷酸片段之身份、Genbank參考、來源名稱及引用。 表5.
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 6.2. 實例 2 ：鼠科 BCMA CAR 之評價 6.2.1. 引言
經嵌合抗原受體(CAR)基因工程改造之T細胞之授受性轉移已出現作為治療癌症之有前途方法。CAR為人工分子，其包含經由跨膜區融合至T細胞信號域之抗原反應單鏈可變片段(scFv)。於此實例中，評價特異性針對B細胞成熟抗原(BCMA)之CAR分子。BCMA在多發性骨髓瘤、漿細胞瘤及一些淋巴瘤上表現，但正常表現受限於漿細胞(Avery等人，2003；Carpenito等人，2009；Chiu等人，2007)。
使用來自小鼠抗BCMA抗體(C11D5.3)之序列來構築抗BCMA02 CAR。抗BCMA10 CAR使用經改性之序列來構築且為抗BCMA02 CAR之「人源化」形式。於一系列活體外檢定中，抗BCMA02 CAR T細胞及抗BCMA10 CAR T細胞均展示腫瘤特異性、高CAR表現且引起對抗原表現靶之強效反應性。顯示抗BCMA02 CAR T細胞及抗BCMA10 CAR T細胞具有可比較的對表現BCMA之腫瘤細胞系之反應性。雖然抗BCMA02 CAR T細胞及抗BCMA10 CAR T細胞均能於小鼠腫瘤模型中引起消退，抗BCMA10 CAR T細胞顯示抗原獨立性發炎性細胞激素分泌，及因此具有引起與高細胞激素水平相關聯之臨床毒性之潛力。6.2.2. 結果 6.2.2.1. 強直性發炎性細胞激素自與細胞凋亡相關聯之抗 BCMA10 T 細胞之釋放
BCMA蛋白於患有多發性骨髓瘤之患者之血清中係可檢測的(Sanchez等人，2012)。多發性骨髓瘤患者中之平均血清BCMA為10 ng/mL，但是峰值在達至100 ng/mL之水平。評價生理可溶性BCMA水平對候選抗BCMA CAR T細胞之影響。
於用可溶性BCMA培養24小時後，檢查自抗BCMA02 CAR T細胞、抗BCMA10 CAR T細胞及CAR19Δ T細胞之IFNγ釋放(圖2A)。於用多達1 μg/mL BCMA培養24小時後，抗BCMA02 CAR T細胞回應最小細胞激素釋放。相比之下，抗BCMA10 CAR T細胞回應增加水平之IFNγ，其與添加至培養物之可溶性BCMA之濃度成比例。在100 ng/mL BCMA下(於多發性骨髓瘤患者中報告之最大水平)，相較於由抗BCMA02 CAR T細胞分泌之28.8 ng/ml IFNγ，抗BCMA10 CAR T細胞分泌82.1 ng/ml IFNγ。甚至於利用抗BCMA10 CAR T細胞加上缺乏BCMA抗原之對照細胞系之若干共培養實驗中檢測到IFNγ (圖2B，K562共培養)。此等資料表明抗BCMA10 CAR T細胞具有對藉由可溶性BCMA刺激之增加之敏感性及T細胞中之抗原獨立性細胞激素反應之潛能。
檢查強直性細胞激素自抗BCMA02 CAR T細胞、抗BCMA10 CART細胞(距培養開始10天)及CAR19Δ T細胞之分泌之潛能。於製造CAR T細胞後，針對發炎性細胞激素之存在，分析來自抗BCMA02 CAR T細胞、抗BCMA10 CART細胞及CAR19Δ T細胞培養物之生長培養基。儘管不存在抗原刺激，相較於抗BCMA02 CAR T細胞培養物中之小於1 ng/mL之IFNγ，抗BCMA10 CAR T細胞培養物含有大於10 ng/mL IFNγ (圖3)。抗BCMA10 CAR T細胞培養物亦含有顯著(p＜0.001)更多的TNFα。為進一步定量在無抗原刺激下由抗BCMA10 CAR T細胞產生之細胞激素之量，在24小時培養期間量測自5 x 104 個CAR T細胞之細胞激素釋放。相較於抗BCMA02 CAR T細胞，抗BCMA10 CAR T細胞產生顯著更高量之發炎性細胞激素MIP1α、IFNγ、GMCSF、MIP1β、IL-8及TNFα (圖4，p＜0.0001)。MIP1α及IFNγ濃度在所檢查之所有細胞激素中為最高。抗BCMA10 CAR T細胞產生4.7 ng MIP1α/5 x 104 個細胞/24小時、3.0 ng IFNγ/5 x 104 個細胞/24小時及約1 ng/5 x 104 個細胞/24小時或更少之其他細胞激素。於抗發炎性細胞激素IL-10、IL-2及IL-4中未檢測到顯著差異。
在抗BCMA10 CAR T細胞製造結束時，量測T細胞活化之表現型標記物之表現以檢查強直性發炎性細胞激素分泌是否指示抗BCMA10 CAR T細胞之過度活躍狀態。HLA-DR及CD25為於T細胞活化後12至24小時正常展示峰值表現及然後隨時間減少之表面標記物。自三種正常供體製備之CAR T細胞顯示平均40±2%之抗BCMA02 CAR T細胞表現之HLA-DR。此等細胞中之HLA-DR之表現係與未經轉導之(43±2.3%) T細胞及CAR19Δ (32±2.2%)對照T細胞可比較。相比之下，88±1.2%抗BCMA10 CAR T細胞表現HLA-DR (圖5)。另一種活化標記物CD25之表現在抗BCMA10 CAR T細胞上相較於抗BCMA02 CAR T細胞亦較高(53±0.9%對35±2.4%)。因此，抗BCMA10 CAR T細胞展示在不存在添加之抗原下，經活化T細胞之表現型特徵。
T細胞之過度活躍經常與藉由細胞凋亡之活化誘導之細胞死亡(AICD)相關聯。量測經活化之半胱天冬酶-3之水平以檢查抗BCMA10 CAR T細胞之過度活躍是否可導致相較於抗BCMA02 CAR T細胞更高之細胞凋亡水平。48%之來自兩個供體之抗BCMA10 CAR T細胞相較於16%之抗BCMA02 CAR T細胞具有活躍半胱天冬酶-3 (圖6)。因此，在不存在添加之BCMA抗原下，相較於抗BCMA02 CAR T細胞，抗BCMA10 CAR T細胞含有更高之凋亡細胞頻率，其與增加之活化及發炎性細胞激素分泌相關聯。
針對CAR T細胞是否可選擇性回應於低BCMA水平或對用於T細胞生長之人類血清中之不相關抗原具交叉反應性，評價抗BCMA02 CAR T細胞及抗BCMA10 CAR T細胞。將抗BCMA02 CAR T細胞及抗BCMA10 CAR T細胞維持於缺少人類血清之培養基中兩天及然後轉換至存在或不存在100 ng/mL可溶性BCMA下含有胎牛血清(FBS)、人類血清(HABS)或HABS之培養基中(圖7)。24小時後藉由ELISA檢定IFNγ釋放。抗BCMA02 CAR T細胞及抗BCMA10 CAR T細胞均回應於可溶性BCMA。然而，抗BCMA10 CAR T細胞較抗BCMA02 CAR T細胞分泌10倍更多的IFNγ。於不存在BCMA下，僅抗BCMA10 CAR T細胞釋放IFNγ，而不管於胎牛血清(FBS) (p=0.0002)或人類AB血清(HABS) (p=0.0007)中培養。此等資料表明發炎性細胞激素分泌對抗BCMA10 CAR T細胞係固有的。6.2.2.2 . 多發性骨髓瘤之小鼠模型中之抗 BCMA10 CAR T 細胞之 劣 抗腫瘤功能
過度活躍及增加之細胞凋亡可負面影響患者中之CAR T細胞續存及最終臨床功效。於小鼠腫瘤模型中檢查抗BCMA02 CAR T細胞及抗BCMA10 CAR T細胞之抗腫瘤功能。將具有約100 mm3 實驗皮下人類多發性骨髓瘤(RPMI-8226)腫瘤之NOD-scid γ (NSG)小鼠用107 個抗BCMA02 CAR T細胞、107 個抗BCMA10 CAR T細胞或硼替佐米 (VELCADE®)處理。用測徑器監測RPMI-8226生長。於兩個獨立實驗(圖8A及8B)中，硼替佐米相較於媒劑對照動物控制腫瘤生長。用抗BCMA02 CAR T細胞授受性轉移之動物展示快速且持久之腫瘤清除(插圖放大早期腫瘤消退)。抗BCMA10 CAR T細胞之授受性轉移亦造成腫瘤消退，但是於兩個實驗中相較於抗BCMA02 CAR T細胞延遲。6.2.3. 結論
抗BCMA02 CAR T細胞及抗BCMA10 CAR T細胞於活體外檢定中展示可比較之抗腫瘤功能，但是抗BCMA10 CAR T細胞具有可負面影響患者治療之安全性及功效之特徵。抗BCMA10 CAR T細胞於暴露於生理水平之BCMA蛋白質後穩健回應為發炎性細胞激素分泌。細胞激素風暴或細胞激素分泌症候群為與CAR T細胞療法相關聯之已知臨床毒性。於觀察到抗BCMA10 CAR T細胞之強直性活性後，關於對BCMA之細胞激素釋放之問題加劇。甚至在不存在抗原刺激下，抗BCMA10 CAR T細胞釋放高水平之發炎性細胞激素。持續細胞激素分泌具有引起實質臨床毒性以及負面影響抗腫瘤功能之潛能。的確，吾人發現於多發性骨髓瘤之小鼠模型中，抗BCMA10 CAR T細胞相較於抗BCMA02 CAR T細胞培養物中之更高凋亡細胞組成及更劣抗腫瘤功能。 參考文獻 Avery等人，(2003).BAFF selectively enhances the survival of plasmablasts generated from human memory B cells. J Clin Invest, 112(2), 286-297。 Carpenito等人，(2009).Control of large, established tumor xenografts with genetically retargeted human T cells containing CD28 and CDI 37 domains. Proc Natl Acad Sci US A, 106(9), 3360-3365。 Chiu等人，(2007).Hodgkin lymphoma cells express TAC! and BCMA receptors and generate survival and proliferation signals in response to BAFF and APRIL. Blood, 109(2), 729-739。 Sanchez等人，(2012).Serum B-cell maturation antigen is elevated in multiple myeloma and correlates with disease status and survival. Br J Haematol, 158(6), 727-738。6.3. 實例 3 ：淋巴瘤上之最小 BCMA 表現活 化 抗 BCMA CAR T 細胞
量測淋巴瘤及白血病細胞系(Daudi及Raji)上之BCMA表現水平以確定該表現是否足夠活化抗BCMA02 CAR T細胞。
使用流動式細胞測量術定量淋巴瘤、白血病及多發性骨髓瘤細胞上之BCMA表現。於此檢定中，該等細胞上之相對BCMA表現藉由使BCMA表現之螢光強度與已知數目之結合抗體相關聯(抗體結合能力，ABC)來評估。將淋巴瘤細胞系中之BCMA表現水平與已知會活化抗BCMA02 CAR T細胞之多發性骨髓瘤細胞系(RPMI-8226)中之BCMA表現水平比較。12590±1275個BCMA02分子在RPMI-8226細胞之表面上表現。相比之下，Daudi細胞表現1173±234個BCMA02分子及JeKo-1細胞(套細胞淋巴瘤細胞系)僅表現222±138個BCMA02分子(圖9，圓圈)。
於另一組實驗中，測試抗BCMA02 CAR T細胞對在淋巴瘤及白血病細胞系上觀察到之BCMA之最小水平之活性(圖9，盒)。使用標準方法產生抗BCMA02 CAR T細胞及於與BCMA陽性及BCMA陰性腫瘤細胞系共培養後藉由IFNγ ELISA評估活性。於共培養後，抗BCMA02 CAR T細胞之反應性與BCMA mRNA表現之相對量(臨限值以上)及/或各種腫瘤細胞系表面上之BCMA受體之密度相關(圖9)。在BCMA CAR T細胞與以下BCMA陰性(BCMA-)腫瘤細胞系共培養後釋放零或極少IFNγ：骨髓性白血病(K562)、急性淋巴母細胞性白血病(NALM-6及NALM-16)；套細胞淋巴瘤(REC-1)；或霍奇金氏淋巴瘤(HDLM-2)。相比之下，在BCMA02 CAR T細胞與以下BCMA陽性(BCMA+)腫瘤細胞系共培養後釋放大量IFNγ：B細胞慢性淋巴母細胞性白血病(MEC-1)、套細胞淋巴瘤(JeKo-1)、霍奇金氏淋巴瘤(RPMI-6666)、伯基特氏淋巴瘤(Daudi細胞及Ramos細胞)及多發性骨髓瘤(RPMI-8226)。
抗BCMA02 CAR T細胞對表現BCMA之伯基特氏淋巴瘤細胞(Daudi細胞)之反應性擴展至活體內動物研究。Daudi細胞亦表現CD19。將抗BCMA02 CAR T細胞之活體內活性與抗CD19 CAR T細胞之活體內活性比較。將NOD scid γ (NSG)小鼠IV注射2 x 106 個Daudi細胞及允許累積大的全身性腫瘤負擔，之後用CAR T細胞處理。在腫瘤誘導8天及18天後投與CAR T細胞(各自為圖10A及10B)。媒劑及陰性對照(抗CD19Δ CAR T細胞)無法防止腫瘤生長，如由生物發光之對數期增加所示，其導致體重損失及死亡(圖10A，最左邊兩個小鼠調查組)。抗CD19及抗BCMA02 CAR T細胞防止腫瘤生長，導致體重維持及生存。當在第8天投與時，抗CD19及抗BCMA02 CAR T細胞係同等有效(圖10A，最右邊兩個小鼠調查組)。當在腫瘤誘導18天後投與時，抗BCMA02 CAR T細胞亦有效減少腫瘤負擔。圖10B，最右邊調查組。6.4. 實例 4 ： 抗 BCMA CAR T 細胞之強效活體外活性
利用抗BCMA02 CAR表現之50%減少達成抗BCMA02 CAR T細胞之強效活體外活性。將T細胞群體用4x108 與5x107 轉導單位之間之編碼抗BCM02A CAR分子之慢病毒轉導。所得T細胞群體顯示減少之抗BCMA02 CAR T細胞頻率(檢定為陽性%)及減少之抗BCMA02 CAR分子之表現(檢定為平均螢光強度：MFI)。
測定減少之CAR分子表現對抗BCMA02活性之影響。將抗BCMA CAR陽性T細胞之頻率用未經轉導之T細胞標準化以含有26 ± 4% BCMA反應性T細胞(圖11A)。經標準化之抗BCMA02 CAR T細胞之MFI範圍自885至1875 (圖11B)。K562為缺少BCMA表現之CML細胞系。將K562細胞工程改造以表現BCMA且用於活體外溶細胞檢定以評估具有變化之BCMA CAR表現之抗BCMA02 CAR T細胞之活性(圖11C)。將K562細胞用細胞跟蹤紫(cell trace violet)標記，而將穩定表現BCMA之K562細胞(K562-BCMA)用CFSE標記。收獲T細胞、K562細胞及K562-BCMA細胞，洗滌，及再懸浮於缺少外源細胞激素之培養基中。將細胞於37℃，5% CO2 培育箱中在20:1或10:1效應子(E；T細胞)對靶(T；K562及K562 BCMA細胞之1:1混合物)比率下培養4小時。然後將細胞用Live/Dead染色及藉由FACS分析。藉由標準化至缺少T細胞之條件之K562:K562-BCMA細胞之比率之差異測定細胞毒性。6.5. 實例 5 ：抗 BCMA CAR T 細胞製造方法
製造獨特抗BCMA02 CAR T細胞產品用於各患者治療。抗BCMA02 CAR T細胞產品之製造方法之可靠性藉由自11個個別正常供體PBMC產生抗BCMA02 CAR T細胞來評價。來自各供體之抗BCMA02 CAR T細胞擴增可與平行進行之匹配之未經轉導之培養物相比較(圖12A)。
在培養期結束時(第10天)，藉由用qPCR及慢病毒特異性引物集定量整合之慢病毒數目(載體副本數目，VCN)來評估T細胞轉導效率。來自11個供體之抗BCMA02 CAR T細胞培養物顯示可比較的慢病毒轉導效率(圖12B)。藉由流動式細胞測量術量測抗BCMA02 CAR陽性T細胞之頻率及發現BCMA表現跨所有供體係可比較的(圖12C)。
各抗BCMA02 CAR T細胞產品之活性藉由於與經工程改造以表現BCMA之K562細胞共培養後的IFNγ釋放來評估。當暴露於表現BCMA之K562細胞時，所有抗BCMA CAR02 T細胞產品展示治療上相關水平之IFNγ釋放(圖12D)。6.6. 實例 6 ：用 IL-2 或 IL-2 及 ZSTK474 處理之 CAR T 細胞上之 CD62L 、 CD127 、 CD197 及 CD38 表現
用IL-2及ZSTK474培養之CAR T細胞相較於單獨用IL-2培養之CAR T細胞顯示增加之CD62L表現。使用多參數質量細胞測量術(CyTOF)進行用IL-2及ZSTK474培養之抗BCMA02 CAR T細胞上之29種額外細胞表面標記物之表現分析及與單獨用IL-2培養之CAR T細胞比較。相較於單獨用IL-2處理之CAR T細胞，三種額外標記物(CD127、CD197及CD38)顯示於用IL-2 + ZSTK474處理之CAR T細胞中之增加之表現。因此，CD62L、CD127、CD197及CD38之共同表現進一步使經ZSTK474培養之CAR T細胞分層。於含有IL-2之培養基中培養後，相較於24.5%之用IL-2及ZSTK474培養之抗BCMA02 CAR T細胞，7.44%之抗BCMA02 CAR T共同表現CD127、CD197及CD38。圖13之文氏圖(Venn diagram)說明於CD62L陽性抗BCMA02 T細胞中共同表現CD127、CD197及CD38。6.7. 實例 7 ： ZSTK474 處理增加 CD8 T 細胞之頻率
將單獨用IL-2或IL-2及ZSTK474處理之抗BCMA02 CAR T細胞中之CD8表現定量。使用螢光標記之抗CD8抗體及流動式細胞測量術測定CD8表現。來自七個正常供體之用IL-2及ZSTK474培養之抗BCMA02 CAR T細胞相較於單獨用IL-2培養之抗BCMA02 CAR T細胞具有顯著更高的CD8表現。圖14。6.8. 實例 8 ：經 ZSTK474 處理之抗 BCMA CAR T 細胞中缺 乏 抗原獨立性活性
在不存在抗原下之CAR T細胞之強直性活性已與降低之生物活性相關聯。抗BCMA02 CAR T細胞之強直性活性藉由於在IL-2及ZSTK474之存在下培養後相較於單獨用IL-2之標準培養條件在不存在抗原下定量干擾素-γ (IFN-γ)釋放來評估。使用可直接擴大規模至大的臨床製造方法之系統製備抗BCMA CAR T細胞培養物。簡言之，將外周血單核細胞(PBMC)於靜態燒瓶中於含有IL-2 (CellGenix)及特異性針對CD3及CD28之抗體(Miltenyi Biotec)之培養基中培養。於培養開始一天後添加2 x 108 個轉導單位之編碼抗BCMA CAR之慢病毒。
藉由添加含有IL-2及最佳化劑量之ZSTK474之新鮮培養基將抗BCMA02 CAR T細胞維持在對數期持續總共10天培養。在製造結束時，將等效數目之抗BCMA02 CAR T細胞於單獨培養基中再培養24小時。24小時內釋放之IFN-γ之量藉由ELISA定量。於此檢定中，200 pg/mL以下之IFN-γ水平表示無強直性活性。圖15顯示由來自14個供體之抗BCMA02 CAR T細胞釋放之IFN-γ之量與缺少強直性活性一致，無論是否用ZSTK474培養CAR T細胞。6.9. 實例 9 ：經 ZSTK474 處理之抗 BCMA02 CAR T 細胞於淋巴瘤腫瘤模型中顯示治療活性
使用Daudi腫瘤來詢問用IL-2或IL-2及ZSTK474培養之抗BCMA02 CAR T細胞之抗腫瘤活性。Daudi細胞表現低水平之BCMA蛋白且提供侵襲性及難以治療淋巴瘤腫瘤模型。
將2 x 106 個Daudi腫瘤細胞用螢火蟲螢光素酶基因標記及藉由靜脈內注射注射至NOD scid IL-2受體γ鏈敲除小鼠(NSG)中。於允許腫瘤形成後，將1x107 個CAR T細胞注射至荷瘤小鼠中。將小鼠用以下注射：i)用IL-2或IL-2及ZSTK474處理10天之抗BCMA02 CAR T細胞；或ii)用IL-2及ZSTK474處理10天之經截短之信號傳導缺陷抗BCMA02 (tBCMA02) CAR T細胞。藉由生物發光使用Xenogen-IVIS造影系統監測腫瘤生長。
於投與用IL-2及ZSTK474處理之抗BCMA02 CAR T細胞之50%小鼠中觀察到完全腫瘤消退。圖16。6.10. 實例 10 ：經 ZSTK474 處理之 CAR T 細胞顯示於人類骨髓瘤之小鼠模型中之治療活性
將具有100 mm3 皮下多發性骨髓瘤腫瘤(RPMI-8226)之動物用等效CAR T細胞劑量(1 x 106 個抗BCMA02 CAR陽性T細胞)或來自匹配T細胞供體之未經改造之T細胞(未經轉導)輸注。如實例8中所述，將抗BCMA CAR T細胞用IL-2或IL-2及ZSTK474處理。
用經IL-2或IL-2及ZSTK474培養之抗BCMA02 CAR T細胞處理之動物完全防止腫瘤長出。圖17。相比之下，用未經轉導之細胞或媒劑處理之動物不能控制細胞生長。圖17。6.11. 實例 11 ：一項測定 BB2121 CAR T 細胞於在初始治療一年內進展之患有復發且難治性多發性骨髓瘤之受試者及患有高風險多發性骨髓瘤之受試者中之功效及安全性的 2 期，多群組，開放標示，多中心研究
該實例概述bb2121之2期臨床試驗，該bb2121為自體T淋巴細胞濃化之群體，該群體包含用抗B細胞成熟抗原(BCMA)嵌合抗原受體(CAR) (上述抗BCMA02 CAR)慢病毒載體轉導之細胞，該慢病毒載體編碼靶向人類BCMA之CAR，如第6.11.1節中進一步討論。
此研究為一項多群組，開放標示，多中心2期研究，其測定bb2121於在初始治療一年內進展之患有復發且難治性多發性骨髓瘤(RRMM)之受試者(群組1)及患有高風險(HR)多發性骨髓瘤(MM) (HRMM)之受試者(群組2)中之功效及安全性。於第6.11.2節中討論參與此研究之受試者及進一步針對群組1或2之特定納入及排除標準。該研究招募約122名受試者，將其隨機分成如下所列之兩個群組中之一者，其中約103名受試者經bb2121治療。估計自招募至輸注之流失率為15%。6.11.1. Bb2121
Bb2121包括自體T淋巴細胞濃化之群體，該群體包含用抗B細胞成熟抗原(BCMA)嵌合抗原受體(CAR)慢病毒載體轉導之細胞，該慢病毒載體編碼靶向人類BCMA之CAR (上述抗BCMA02 CAR)。使用抗BCMA02 CAR慢病毒載體轉導自體T細胞。此載體使用源自鼠科白血病病毒之骨髓增生性肉瘤病毒增強型啟動子來驅動嵌合受體之表現，該嵌合受體為一種多域蛋白，由細胞外抗原識別域(VL及VH)、CD8α鉸鏈域(一種跨膜域)(CD8 TM)及細胞內CD137共刺激(4-1BB)及CD3ζ鏈信號域組成。6.11.2. 研究群體
此研究之納入標準包括： (1)年齡≥ 18歲； (2)受試者具有如下所定義之可量測疾病： (i) M-蛋白(血清蛋白電泳[sPEP]或尿蛋白電泳[uPEP])：sPEP ≥ 0.5 g/dL或uPEP ≥ 200 mg/24小時，及/或 (ii)無血清或尿液中之可量測疾病之輕鏈MM：血清免疫球蛋白游離輕鏈≥ 10 mg/dL及異常血清免疫球蛋白κ λ游離輕鏈比率； (3)美國東岸癌症臨床研究合作組織(ECOG)表現狀態≤ 1；及 (4)由於先前療法，恢復至任何非血液學毒性之1級或基線，不包括禿頭症及2級神經病。 此外，特定群組內之受試者具有特定群組納入標準。群組1 RRMM (復發且難治性多發性骨髓瘤)受試者： (i)必須已接受至少3種先前抗骨髓瘤治療方案(利用或不利用造血幹細胞移植及利用或不利用維持療法之誘導視為單一方案)； (ii)必須已經歷各方案之至少2個連續週期之治療，除非疾病進展(PD)為對該方案之最佳反應； (iii)必須已接受用蛋白酶體抑制劑、免疫調節劑及抗CD38抗體之先前療法； (iv)必須在最近先前療法方案之60天時或60天內具有PD之證據；及 (v)必須已達成對至少1種先前療法方案之反應(最小反應[MR]或更好)。
此外，群組2 HRMM (高風險多發性骨髓瘤)受試者： (i)必須已接受僅1種先前抗骨髓瘤治療方案(利用或不利用造血幹細胞移植及利用或不利用維持療法之誘導視為單一方案)； (ii)必須具有下列HR因素：藉由經修訂之國際分期系統(R-ISS)定義為III期(R-ISS III期)之HR疾病及早期復發(定義為：針對已經歷移植之受試者，PD ＜自首次移植日起12個月，或針對已僅接受誘導之受試者，PD ＜自最後一次治療方案日起12個月，該治療方案最低限度必須含有蛋白酶體抑制劑、免疫調節劑及地塞米松)。
排除標準。下列中任一者之存在將排除來自招募之受試者： (1)受試者在白血球分離術之28天內使用任何研究中藥劑； (2)受試者在白血球分離術之最後14天內接受下列中之任一者： (a)血漿除去法； (b)大手術(如由研究者所定義)； (c)除了針對骨髓瘤相關聯之骨病變之局部治療外之放射治療；及 (d)使用任何全身性抗骨髓瘤藥物療法； (3)受試者具有已知中樞神經系統(CNS)骨髓瘤涉入； (4)受試者具有肺白血球滯留及彌散性血管內凝血之臨床證據； (5)臨床相關CNS病理(諸如癲癇、癲癇發作、局部麻痹、失語症、中風、蛛網膜下出血或其他CNS出血、嚴重腦損傷、癡呆、帕金森氏病(Parkinson's disease)、小腦疾病、器質性腦症候群或精神病)之歷史或存在。僅若受試者於bb2121治療後經歷4級神經毒性，則在用bb2121再治療之前適用此排除標準 (群組1)； (6)受試者具有漿細胞白血病、沃爾登斯氏(Waldenstrom's)巨球蛋白血症、POEMS症候群(多發性神經病、臟器腫大、內分泌病、單純系蛋白質及皮膚變化)或臨床顯著澱粉樣變性活性或歷史； (7)受試者患有非分泌性MM； (8)受試者具有下列實驗室異常中之任一者： (a)嗜中性白血球絕對計數(ANC) ＜ 1,000/μL； (b)在輸血擔體不存在下之血小板計數＜ 50,000 mm3 (於篩選7天內之血小板輸注)； (c)血紅素＜ 8 g/dL (＜ 4.9 mmol/L) (不允許對受試者輸血以達到此水平)； (d)血清肌胺酸酐清除率(CrCl) ＜ 45 mL/min； (e)經校正之血清鈣＞ 13.5 mg/dL (＞ 3.4 mmol/L)； (f)血清天冬胺酸轉胺酶(AST)或丙胺酸轉胺酶(ALT) ＞ 2.5 ×正常上限(ULN)； (g)針對患有登記在案之吉伯特氏(Gilbert’s)症候群之受試者，血清總膽紅素＞ 1.5 × ULN或＞ 3.0 mg/dL；及 (h)國際比率(INR)或部分促凝血酶原激酶時間(PTT) ＞ 1.5 × ULN，或30天內出血等級≥ 2之歷史，或受試者需要用慢性治療劑量之抗凝血劑(例如，華法林(warfarin)、低分子量肝素、因子Xa抑制劑)持續治療； (9)具有左心室射血分數＜ 45%之心回波圖(ECHO)或多門控捕獲(MUGA)； (10)受試者於開始研究治療之前的前6個月內具有III或IV級充血性心臟衰竭(CHF)或嚴重非缺血性心肌病、不穩定或控制不良心絞痛、心肌梗塞或室性心律失常之歷史； (11)定義為在室內空氣下氧飽和(Sa02) ＜ 92 %之不適當肺功能； (12)用慢性免疫抑制劑(例如，在任何劑量下之環孢黴素或全身性類固醇)持續治療。允許間歇性局部、吸入或鼻內皮質類固醇； (13)異基因造血幹細胞移植或用針對癌症之任何基於基因療法之治療劑或針對癌症之研究中細胞療法或靶向BCMA之療法治療的先前史； (14)受試者已於白血球分離術之前之12週內接受自體幹細胞移植(ASCT)； (15)受試者具有原發性免疫缺陷之歷史； (16)受試者對人類免疫缺陷病毒(HIV-1)、慢性或活性B型肝炎或活性A型或C型肝炎陽性； (17)受試者具有未經控制之全身性真菌、細菌、病毒或其他感染(包括結核病)，儘管適宜抗生素或其他治療； (18)受試者具有惡性腫瘤(除了MM外)之先前史，除非該受試者已無該疾病≥ 5年，除了下列非侵襲性惡性腫瘤外： (a)皮膚基底細胞癌； (b)皮膚鱗狀細胞癌； (c)子宮頸原位癌； (d)乳房原位癌；及 (e)前列腺癌之偶然組織學發現結果(使用TNM [腫瘤、結、轉移]臨床分期系統為T1a或T1b)或為治癒性的前列腺癌； (19)受試者為懷孕、護理或哺乳中女性或意欲在參與研究期間受孕之女性； (20)受試者具有對bb2121產品之任何組分、環磷醯胺、氟達拉濱及/或托珠單抗(tocilizumab)之已知過敏性； (21)受試者具有將阻止受試者參與該研究之任何顯著醫學病狀、實驗室異常或精神病； (22)受試者具有包括存在實驗室異常之任何病狀，若受試者參與該研究，則該病狀將該受試者置於不可接受之風險。此包括未控制(定義為展示與感染相關之持續徵兆/症狀且儘管適宜抗菌劑治療，仍無改良)或需要IV種抗菌劑管理之全身性真菌、細菌、病毒或其他感染；及 (23)受試者具有混淆解釋來自研究之資料之能力之任何病狀。6.11.3. 研究設計
該研究由4個週期組成： (1)預治療期(篩選、白血球分離術及視情況可選的橋接療法及基線評估)； (2)治療期(淋巴細胞清除(LD)化療(氟達拉濱及環磷醯胺)及bb2121輸注)； (3)治療後隨訪期(在bb2121輸注後最少24個月或直至登記在案之PD最多達於最後受試者已接受首次輸注後5年，以較長時間為準)；及 (4)生存隨訪。
在預治療期期間，經篩選之受試者經歷白血球分離術以使bb2121產品能產生。受試者可按照研究者之裁量接受橋接療法。於已成功製造bb2121藥物產品後，進行額外基線評價(包括針對接受橋接療法之彼等受試者之疾病分期評估)以在開始LD化療之前評估繼續的資格及安全性。
治療期以淋巴細胞清除化療開始，接著在治療第1天以150至450 x 106 個細胞之劑量之bb2121輸注。
群組 1 。招募具有≥3種先前抗骨髓瘤治療方案之約73名RRMM受試者以確保將此群組中約62名受試者用bb2121治療來評估安全性及功效。於群組1中，若滿足方案中定義之特定標準，則可考慮用bb2121之第二劑量再治療，包括第二過程之淋巴細胞清除(LD)化療(具有或不具有橋接療法)。經再治療之受試者繼續該研究最少於第二次輸注後6個月或直至登記在案之PD於最後受試者已接受首次輸注後最多長達5年，以較長者為準。若滿足下列特定標準，則受試者有資格接受bb2121之第二次輸注： •  自第一次bb2121輸注起已至少8週； •  受試者仍保留自原始白血球分離術材料製造之經單離之PBMC或bb2121產品； •  基於根據多發性骨髓瘤之國際骨髓瘤工作組(IMWG)統一反應標準之反應標準對初始bb2121之最佳反應係疾病穩定(SD)或更好； •  根據IMWG標準之疾病進展(PD)之證據； •  無利用先前bb2121治療之4級細胞激素釋放症候群(CRS)或神經毒性之歷史； •  繼續滿足招募之合格標準(除了排除具有已知中樞神經系統(CNS)骨髓瘤涉入之受試者，排除已接受用針對癌症之任何基於基因療法之療法或靶向BCMA之療法治療之受試者及嗜中性白血球及血小板相關排除標準外)； •  需滿足開始淋巴細胞清除(LD)化療之合格標準； •  距對具有CNS內之骨髓瘤之進展之受試者之放射療法至少8週之間隙，該進展需要全腦或定向腦放射療法(排除對頭皮或顱骨病變之姑息性病灶、最小滲透、放射療法)；及 •  自從首次bb2121輸注受試者尚未接受任何MM療法。
群組 2 。招募約49名MM受試者，其具有一種(1)先前抗骨髓瘤治療方案及藉由經修訂之國際分期系統(R-ISS)定義為III期及早期復發之HR疾病，以確保將約41名受試者用bb2121治療。將早期復發定義為針對有資格移植(TE)受試者自初始自體幹細胞移植(ASCT)之12個月內之疾病進展(PD)，及針對無資格移植 (TNE)於先前療法之12個月內之PD (先前方案最低限度必須含有蛋白酶體抑制劑、免疫調節劑及地塞米松)。
在受試者過早中止該研究或完成該研究後，在獨立的長期隨訪方案下監測長期bb2121相關毒性、病毒載體安全性、生存狀態及後續抗骨髓瘤療法。6.11.4. 終點
該研究之主要終點為評價bb2121於在初始治療之一年內進展之患有RRMM之受試者及患有HR MM之受試者中之功效。次要終點包括評價bb2121於在初始治療之一年內進展之患有RRMM之受試者及患有HR MM之受試者中之安全性；表徵嵌合抗原受體(CAR) + T細胞於外周血及骨髓中之擴增及續存(藉由載體副本數目[VCN])；評價抗CAR抗體反應之發展；評價達成最小殘留疾病(MRD)陰性狀態之受試者之百分比(藉由EuroFlow及下一代定序[NGS])；及評價健康相關生活品質(HRQoL)之變化。主要及次要終點列於下表中：
Figure 108124385-A0304-0006
群組1或群組2中之受試者可接受白血球分離術與bb2121之投與之間之橋接療法(若在開始淋巴細胞清除化療之前14天或超過14天投與)。橋接療法可包括基於研究者之裁量作為單一劑或組合之皮質類固醇、烷基化劑、免疫調節劑、蛋白酶體抑制劑及/或抗CD38抗體。受試者先前尚未暴露之實驗劑及骨髓瘤療法不應用作橋接療法。6.11.5. 治療方法
LD化療：各自在分配劑量30 mg/m2 及300 mg/m2 下每日靜脈內(IV)投與氟達拉濱及環磷醯胺持續3個連續日(在第-5天開始)接著休息2天。於完成LD化療後，以IV輸注在150至450 x 106 CAR+ T細胞之範圍之劑量下投與bb2121。6.12. 實例 12 ：一項比較 bb2121 相對於患有復發且難治性多發性骨髓瘤 (RRMM) 之受試者中之標準三重方案之功效及安全性的 3 期，多中心，隨機開放標示研究
此實例概述bb2121之3期臨床試驗。該研究為比較bb2121 (其為自體T淋巴細胞濃化之群體，該群體包含用抗B細胞成熟抗原(BCMA)嵌合抗原受體(CAR) (上述抗BCMA02 CAR)慢病毒載體轉導之細胞，該慢病毒載體編碼靶向人類BCMA之CAR，如上第6.11.1節中更詳細討論)相對於標準三重方案於患有復發且難治性多發性骨髓瘤(RRMM)之受試者中之功效及安全性的3期隨機開放標示研究。用作比較劑之特定三重方案包括：(1)達雷木單抗(D)、泊馬度胺(P)及地塞米松(d) (一起，DPd)；(2)達雷木單抗、硼替佐米(VELCADE®；V)及地塞米松(一起，DVd)；(3)伊沙佐米(I)、來那度胺(REVLIMID®；R)及地塞米松(一起，IRd)。6.12.1. 研究群體
該研究群體由患有MM之受試者組成，該等受試者已接受至少兩種先前方案(包括來那度胺(REVLIMID®)或泊馬度胺(POMALYST®)及蛋白酶體抑制劑(PI))且必須在最後治療期間或於最後治療後之60天內具有登記在案之疾病進展。先前接受達雷木單抗與泊馬度胺組合且具有或不具有地塞米松(DP±d)之受試者可不包括在內。允許先前暴露於達雷木單抗與硼替佐米組合且具有或不具有地塞米松(DV±d)或先前暴露於伊沙佐米與來那度胺組合且具有或不具有地塞米松(IR±d)，然而在進入此研究之前受試者可不接受DV±d或IR±d作為其最後先前方案。
此研究之納入標準 包括： (1)在簽署知情同意書(ICF)時，受試者係18歲或更老； (2)在進行任何研究相關評估/程序之前，受試者必須理解並自願簽署ICF。 (3)受試者願意且能遵從研究訪問時程表及此方案內之其他方案要求及針對隨機分成治療組A之受試者，受試者同意繼續隨訪多達15年，如由基因治療試驗之監管指導方針所規定。 (4)受試者已登記診斷患有多發性骨髓瘤(MM)及如下所定義之可量測疾病：(i) (a)血清M-蛋白含量(血清蛋白電泳[sPEP])大於或等於約0.5 g/dL，或(b)尿M-蛋白含量(尿蛋白電泳[uPEP])大於或等於約200 mg/24小時；及/或(ii)於血清或尿液中無可量測疾病之輕鏈MM：血清免疫球蛋白游離輕鏈大於或等於約10 mg/dL (100 mg/L)及異常血清免疫球蛋白κ λ游離輕鏈比率； (5)受試者已接受至少2種先前MM方案。利用或不利用造血幹細胞移植及利用或不利用維持療法誘導視為一種方案； (6)受試者已接受用含蛋白酶體抑制劑及免疫調節化合物之方案之先前療法持續至少2個連續週期。 (7)受試者必須對最後一種治療方案為難治。將難治定義為在進入研究之前在完成用最後一種抗骨髓瘤方案治療期間或於完成用最後一種抗骨髓瘤方案治療之60天內 (自該方案內之任何藥物之最後劑量量測) 登記在案之疾病進展； (8)受試者達成對至少1種先前治療方案之反應(最小反應[MR]或更好)； (9)受試者必須具有約1或更低之美國東岸癌症臨床研究合作組織(ECOG)表現狀態； (10)由於先前治療，受試者必須恢復至任何非血液學毒性之1級或基線，排除禿頭症及2級神經病； (11)受試者必須具有足夠血管可用於白血球分離術； (12)具生育潛能之女性受試者(FCBP)必須： (a)進行陰性妊娠測試，如由研究者所驗證。 (b)實踐與異性性接觸之真正節欲或同意使用且能遵守無中斷的有效避孕措施。 (c)同意在研究參與期間避免哺乳。 (d) 克制卵細胞捐贈。 (13)當參與該研究時，男性受試者必須實踐真正節欲或同意在與懷孕女性或具生育潛能之女性性接觸期間使用避孕套，及克制捐精。
排除標準 。下列中任一者之存在將排除來自招募之受試者： (1)受試者具有將阻止受試者參與該研究之任何顯著醫學病狀、實驗室異常或精神病； (2)受試者具有包括存在實驗室異常之任何病狀，若受試者參與該研究，則該病狀將該受試者置於不可接受之風險； (3)受試者具有混淆解釋來自該研究之資料之能力之任何病狀； (4)受試者患有非分泌性MM； (5)受試者具有下列實驗室異常中之任一者： (a)嗜中性白血球絕對計數(ANC) ＜ 1,000/Ml； (b)於＜ 50%之骨髓有核細胞為漿細胞之受試者中血小板計數：＜ 75,000/μL及於≥50%之骨髓有核細胞為漿細胞之受試者中血小板計數＜ 50,000/μL (不允許對受試者輸血以達到此水平)； (c)血紅素＜ 8 g/dL (＜ 4.9 mmol/L) (不允許對受試者輸血以達到此水平)； (d)血清肌胺酸酐清除率(CrCl) ＜ 45 mL/min； (e)經校正之血清鈣＞ 13.5 mg/dL (＞ 3.4 mmol/L)； (f)血清天冬胺酸轉胺酶(AST)或丙胺酸轉胺酶(ALT) ＞ 2.5 ×正常上限(ULN)； (g)針對患有登記在案之吉伯特氏症候群之受試者，血清總膽紅素＞ 1.5 × ULN或＞ 3.0 mg/dL；及 (h)國際標準化比率(INR)或經活化之部分促凝血酶原激酶時間(aPTT) ＞ 1.5 × ULN，或30天內出血等級≥ 2之歷史，或受試者需要用慢性治療性給藥之抗凝血劑(例如，華法林、低分子量肝素、因子Xa抑制劑)持續治療； (6)受試者具有定義為在室內空氣下氧飽和(SaO2 ) ＜ 92%之不適當肺功能； (7)受試者具有惡性腫瘤(除了MM外)之先前史，除非該受試者已無該疾病≥ 5年，除了下列非侵襲性惡性腫瘤外： (a)皮膚基底細胞癌； (b)皮膚鱗狀細胞癌； (c)子宮頸原位癌； (d)乳房原位癌；及 (e)前列腺癌之偶然組織學發現(使用腫瘤、結、轉移[TNM]臨床分期系統為T1a或T1b)或可以治療意圖治療之前列腺癌； (8)受試者具有漿細胞白血病、沃爾登斯氏巨球蛋白血症、POEMS症候群(多發性神經病、臟器腫大、內分泌病、單純系蛋白質及皮膚變化)或澱粉樣變性活性或歷史； (9)受試者具有已知中樞神經系統(CNS)骨髓瘤涉入。 (10)受試者具有肺白血球滯留及彌散性血管內凝血之臨床證據； (11)受試者患有已知慢性阻塞性肺病(COPD)，其中1秒內用力呼氣量(FEV1)為正常預測值之50%。對疑似患有COPD之受試者需要用力呼氣測試(FEV1)及若FEV1係＜50%之正常預測值，則必須排除受試者； (12)受試者具有臨床相關CNS病變(諸如癲癇、癲癇發作、局部麻痹、失語者、中風、蛛網膜下出血或其他CNS出血、嚴重腦損傷、癡呆、帕金森氏病、小腦病、器質性腦症候群或精神病)之歷史或存在； (13)受試者經達雷木單抗(DARA)與泊馬單抗(POM)組合且利用或不利用地塞米松(DP±d)作為其最近抗骨髓瘤治療方案之部分治療，若隨機分組成治療組A，則按照研究者之裁量，不可接受DPd (即，達雷木單抗、泊馬度胺及地塞米松)作為橋接療法但是可接受DVd (即，達雷木單抗、硼替佐米及地塞米松)或IRd (即，伊沙佐米、來那度胺及地塞米松)作為橋接； (14)受試者經DP±d作為其最近抗骨髓瘤治療方案之部分治療，若隨機分成治療組B，則按照研究者之裁量，不可接受DPd，但是可接受DVd或IRd； (15)受試者經DARA與硼替佐米(BTZ)組合且具有或不具有地塞米松(dex) (DV±d)作為其最近抗骨髓瘤治療方案之部分治療，若隨機分成治療組A，則按照研究者之裁量，不可接受DVd作為橋接療法但是可接受DPd或IRd作為橋接； (16)受試者經DV±d作為其最近抗骨髓瘤治療方案之部分治療，若隨機分成治療組B，則按照研究者之裁量，不可接受DVd但是可接受DPd或IRd； (17)受試者經伊沙佐米(IXA)與來那度胺(LEN)組合且具有或不具有地塞米松(IR±d)作為其最近抗骨髓瘤治療方案之部分治療，若隨機分成治療組A，則按照研究者之裁量，不可接受IRd作為橋接療法但是可接受DPd或DVd作為橋接； (18)受試者經IR±d作為其最近抗骨髓瘤治療方案治療，若隨機分成治療組B，則按照研究者之裁量，不可接受IRd但是可接受DPd或DVd； (19)異基因造血幹細胞移植，用針對癌症之任何基於基因療法之療法、針對癌症之研究中細胞療法或靶向BCMA之療法治療的先前史； (20)受試者於隨機分組之前之12週內已接受自體幹細胞移植(ASCT)； (21)受試者於隨機分組之前之28天內使用任何研究中藥劑。 (22)受試者於隨機分組之前之最後14天內已接受下列中之任一者： (a)血漿除去法； (b)大手術(如由研究者所定義)； (c)除了針對骨髓瘤相關之骨病變之局部療法外之放射療法；及 (d)使用任何全身性抗骨髓瘤藥物療法； (23)具有左心室射血分數(LVEF) ＜ 45%之心回波圖(ECHO)或多門控捕獲(MUGA)； (24)用慢性免疫抑制劑(例如，在任何劑量下之環孢黴素或全身性類固醇)持續治療。允許間歇局部、吸入或鼻內皮質類固醇； (25)受試者對人類免疫缺陷病毒(HIV-1)、慢性或活性B型肝炎或活性A型或C型肝炎陽性； (26)受試者具有不可控制之全身性真菌、細菌、病毒或其他感染(定義為展示與感染相關之持續徵兆/症狀及儘管適宜抗菌劑治療，仍無改良)或需要IV抗菌劑來管理； (27)受試者於隨機分組之前的前6個月內具有III或IV類充血性心臟衰竭(CHF)或嚴重非缺血性心肌病、不穩定或控制不良之心絞痛、心肌梗塞或室性心律失常之歷史； (28)對DARA、沙利度胺、來那度胺、POM、BTZ、IXA或地塞米松之過敏性。此包括在先前沙利度胺、POM或來那度胺療法期間，皮疹≥ 3 級； (29)受試者具有對bb2121產品之任何組分、環磷醯胺、氟達拉濱及/或托珠單抗之已知過敏性或對DARA、POM、LEN、IXA、BTZ或地塞米松之調配物中含有之賦形劑之過敏性； (30)受試者為懷孕、正在護理或哺乳之女性或意欲在參與該研究期間受孕之女性； (31)針對隨機分成治療組B且將處在含POM或LEN之方案之受試者；不能或不願經歷需要血栓栓塞預防之方案；及 (32)受試者對硼替佐米不耐受，若隨機分成治療組A，則受試者不可接受DVd作為橋接療法或若隨機分成治療組B，則不可接受DVd。6.12.2. 研究設計
將約390名受試者在治療組A或治療組B之間隨機分組2:1。將約260名受試者隨機分組以接受治療組A，及將約130名受試者隨機分組以接受治療組B。治療組A由bb2121組成，且治療組B由按照研究者之裁量之標準三重方案組成：DPd、DVd或IRd。使用藉由下列因素分層之互動式反應技術(Interactive Response Technology / IRT)將合格受試者隨機分組： •  先前達雷木單抗治療相對於先前無達雷木單抗治療 •  兩種或三種先前抗骨髓瘤方案相對於＞3種先前抗骨髓瘤方案；及 •  高風險細胞遺傳學異常(例如，t(4;14)或t(14;16)或del 17p) (自基線或歷史細胞遺傳學結果)，高風險細胞遺傳學異常之存在相對於此等高風險細胞遺傳學異常之不存在或未知存在
隨機分成治療組A之受試者經歷白血球分離術以使bb2121產品能產生。按照研究者之裁量，受試者可於白血球分離術後接受1個週期或更少之DPd作為橋接MM療法，只要在開始淋巴細胞清除(LD)化療之前≥ 14天投與最後劑量。於已成功製造bb2121藥物產品後，進行額外基線評價以在開始淋巴細胞清除(LD)化療之前至少3天評估繼續資格及安全性(包括針對接受橋接MM療法之彼等受試者之疾病分期評估)。有資格治療之受試者接受3個連續日之LD化療與氟達拉濱及環磷醯胺，接著休息2天及隨後在第1天輸注bb2121。針對安全性及功效，追蹤受試者直至登記在案之疾病進展(PD)或撤回同意。針對長期安全性，監測接受bb2121之所有受試者。
經隨機分成治療組B之受試者按照研究者之裁量接受下列研究治療中之任一者：靜脈內(IV)達雷木單抗、口服泊馬度胺及口服或IV地塞米松(DPd)；靜脈內達雷木單抗、皮下(SC)硼替佐米及口服或IV地塞米松 (DVd)；及口服伊沙佐米、口服來那度胺及口服地塞米松(IRd)。針對安全性及功效，追蹤受試者及可繼續研究治療直至PD、不可接受毒性或撤回同意。6.12.3. 終點
無進展生存期(PFS)：PFS計算為自隨機分組至首次登記在案之進展或由於研究中任何原因之死亡之時間，以最先發生者為準。當在研究期間無先前錯失評估下觀察到任何進展時，將進展日指定為最早時間。若由於不良事件或療法變化發生在登記在案之進展或死亡之前而退出研究，則在最後完全骨髓瘤反應評估確定缺少進展日時審查此等觀察結果。
關鍵次要終點：總生存期(OS)。OS計算為自隨機分組至任何原因之死亡之時間。
其他次要終點：
無事件生存期(EFS)： EFS計算為自隨機分組至首次登記在案之進展、當受試者接受另一種抗骨髓瘤治療之第一天或由於研究中任何原因之死亡之時間，以最先發生者為準。
總體反應速率(ORR)：反應者為顯示至少部分反應(PR)之任何受試者。將總體反應速率(ORR)定義為反應者之百分比。將受試者接受後續抗骨髓瘤治療後受試者之反應計數；然而，此等患者包含於分母中。
最小殘餘疾病(MRD)陰性：使用流動式細胞測量術(EuroFlow)及下一代定序(NGS)，為MRD陰性之MRD可評價受試者之百分比(在最少1 / 105 個有核細胞下定義)。
完全反應(CR)速率：將CR速率定義為具有至少CR之受試者之百分比。
針對以上反應及MRD終點，使用國際骨髓瘤工作組(International Myeloma Working Group，IMWG)標準將骨髓瘤反應分類。將ITT群體用作初步分析之分母及EE群體用於支持性分析。
反應時間(TTR)：TTR計算為自隨機分組至基於針對反應者之IMWG指導方針之初始登記在案之反應(PR或更好)的時間。
反應持續時間(DOR)：將DOR定義為初始登記在案之反應(PR或更好)至證實之疾病進展之時間。
下一次抗骨髓瘤治療之時間：下一次抗骨髓瘤治療之時間計算為自隨機分組至受試者接受另一種抗骨髓瘤治療之第一天之時間。在最後評估(若在治療期結束之前提供下一次抗骨髓瘤治療)或最後隨訪(若在長期隨訪期期間提供下一次抗骨髓瘤治療)日時審查在分析時尚未接受另一種抗骨髓瘤治療之受試者。
於下一次抗骨髓瘤治療後之無進展生存期(PFS2)：自隨機分組至第二次客觀疾病進展或任何原因之死亡之時間，以最先者為準。6.12.4. 治療方法
針對bb2121 CAR T療法，每日各自以30 mg/m2 及300 mg/m2 之劑量靜脈內(IV)投與氟達拉濱及環磷醯胺持續3個連續日(在第-5天開始)作為淋巴細胞清除(LD)療法，接著休息2天。於完成LD化療後，以150至450 x 106 個CAR+ T細胞範圍之劑量以IV輸注投與bb2121。
針對DPd療法，針對以下以16 mg/kg之起始劑量投與靜脈內達雷木單抗：第1及2個月在28天月之第1、8、15及22天；第3至6個月在28天月之第1、15天；及第≥7個月在28天月之第1天。口服泊馬度胺在28天月之第1至21天以4 mg/天給藥。地塞米松在28天月之第1、8、15及22天以40 mg (＞75歲，20 mg)給藥。在達雷木單抗給藥日：針對≤75歲之受試者，在達雷木單抗輸注之前將地塞米松以20 mg IV給藥及於達雷木單抗輸注後20 mg口服；針對＞75歲之受試者，在達雷木單抗輸注之前將地塞米松以20 mg IV給藥。
針對DVd療法，針對以下以16 mg/kg之起始劑量投與靜脈內達雷木單抗：第1至3個月在21天月之第1、8、15天；第4至8個月在21天月之第1天；及第≥9個月在28天之第1天。第1至8個月在21天月之第1、4、8及11天以1.3 mg/m2 之起始劑量皮下(SC)投與硼替佐米。於第8個月後必須中止硼替佐米給藥。第1至8個月在第1、2、4、5、8、9、11及12天以20 mg之起始劑量投與地塞米松；針對≤ 75歲之受試者，在達雷木單抗輸注之前將地塞米松以20 mg IV給藥及於輸注日後20 mg口服，及在非DARA給藥日，將地塞米松以20 mg口服給藥；針對＞75歲之重量不足(BMI ＜ 18.5)之患有控制不良糖尿病或對類固醇療法先前不耐受/AE之受試者，地塞米松劑量可以20 mg之劑量每週投與。於第8個月後必須中止地塞米松給藥。
針對IRd療法，在28天月之第1、8及15天以4 mg/天之起始劑量投與口服伊沙佐米。將口服來那度胺在28天月之第1至21天以25 mg/天給藥。將地塞米松在28天月之第1、8、15及22天以40 mg/天給藥。
一般而言，於下列申請專利範圍中，使用之術語不應解釋為限制該等申請專利範圍至本說明書及申請專利範圍中所揭示之特定實施例，但是應解釋為包括所有可能實施例連同使此等申請專利範圍有權利之等效物之全部範圍。因此，該等申請專利範圍不受限於揭示內容。
圖 1 顯示鼠科B細胞成熟抗原(muBCMA) CAR構築體之示意圖。
圖 2A 顯示於將細胞與表現BCMA之K562細胞共培養24小時後，自抗BCMA02 CAR T細胞、抗BCMA10 CAR T細胞及CAR19Δ T細胞釋放之IFNγ之量。
圖 2B 顯示於將細胞與缺少BCMA表現之K562細胞相較於表現BCMA之K562細胞共培養24小時後，自抗BCMA02 CAR T細胞、抗BCMA10 CAR T細胞及CAR19Δ T細胞釋放之IFNγ之量。
圖 3 顯示生長培養基中之來自未經轉導之對照T細胞、在檢定之前10天刺激之抗BCMA02 CAR T細胞、抗BCMA10 CAR T細胞及CAR19Δ T細胞之發炎性細胞激素的量。
圖 4 顯示在不存在抗原刺激下，由抗BCMA02 CAR T細胞、抗BCMA10 CAR T細胞及CAR19Δ T細胞產生之發炎性細胞激素之量。
圖 5 顯示在抗BCMA CAR T細胞製造結束時活化之表現型標誌物之表現。於抗BCMA02 CAR T細胞、抗BCMA10 CAR T細胞及CAR19Δ T細胞中量測HLA-DR及CD25表現。
圖 6 顯示經活化之半胱天冬酶-3之水平，該半胱天冬酶-3為細胞凋亡中之必要步驟且對於在不存在抗原刺激下抗BCMA10 CAR T細胞及抗BCMA02 CAR T細胞中之AICD而言係重要的。
圖 7 顯示於含有胎牛血清(FBS)、人類AB血清(HABS)或100 ng/ml可溶性BCMA之培養基中之抗BCMA02及抗BCMA10 CAR T細胞中之發炎性細胞激素釋放的量。
圖 8A 顯示具有約100 mm3 實驗皮下人類多發性骨髓瘤(RPMI-8226)腫瘤之NODscid γ (NSG)小鼠之腫瘤體積。將小鼠用媒劑、107 個抗BCMA02 CAR T細胞、107 個抗BCMA10 CAR T細胞、或硼替佐米(VELCADE®)處理。
圖 8B 顯示具有約100 mm3 實驗皮下人類多發性骨髓瘤(RPMI-8226)腫瘤之NODscid γ (NSG)小鼠之腫瘤體積。將小鼠用媒劑、107 個抗BCMA02 CAR T細胞、107 個抗BCMA10 CAR T細胞、或硼替佐米(VELCADE®)處理。
圖 9 顯示淋巴瘤及白血病細胞系上之BCMA表現水平(圓圈)及抗BCMA CAR T細胞對各細胞系之活性(IFNγ釋放，盒)。BCMA-陰性(BCMA-)腫瘤細胞系：骨髓性白血病(K562)、急性淋巴母細胞性白血病(NALM-6及NALM-16)、套細胞淋巴瘤(REC-1)、或霍奇金氏淋巴瘤(HDLM-2)顯示少或無IFNγ釋放。BCMA-陽性(BCMA+)腫瘤細胞系：B細胞慢性淋巴母細胞性白血病(MEC-1)、套細胞淋巴瘤(JeKo-1)、霍奇金氏淋巴瘤(RPMI-6666)、伯基特氏淋巴瘤(Daudi細胞及Ramos細胞)、及多發性骨髓瘤(RPMI-8226)顯示大量IFNγ釋放。
圖 10A 顯示當在腫瘤誘導8天後對小鼠投與CAR T細胞時，媒劑、抗CD19Δ CAR T細胞、抗CD19 CAR T細胞及抗BCMA CAR T細胞對NSG小鼠模型中之表現BCMA之伯基特氏淋巴瘤細胞(Daudi細胞)之活體內活性。
圖 10B 顯示當在腫瘤誘導18天後對小鼠投與CAR T細胞時，媒劑、抗CD19Δ CAR T細胞、抗CD19 CAR T細胞及抗BCMA CAR T細胞對NSG小鼠模型中之表現BCMA之伯基特氏淋巴瘤細胞(Daudi細胞)之活體內活性。
圖 11A 至 11C 顯示達成50%降低抗BCMA CAR表現之抗BCMA CAR T細胞之強效活體外活性。圖 11A ： 將T細胞群體用4 x 108 與5 x 107 之間個轉導單位之編碼抗BCMA CAR分子之慢病毒轉導(5至40之MOI)。將所得T細胞群體標準化以含有26 ± 4%抗BCMA CAR-陽性T細胞。圖 11B ： 標準化抗BCMA CAR T細胞之MFI範圍為885至1875，如由流動式細胞測量術所檢定。圖 11C ： 將K562細胞及K562-BCMA細胞與標準化抗BCMA CAR T細胞以20:1或10:1效應子(E；T細胞)與靶(T；K562及K562 BCMA細胞之1:1混合物)比率共培養，該比率顯示可比較之溶細胞性活性。
圖 12A 至 12D 顯示抗BCMA CAR T細胞之製造方法之可靠性。圖 12A ： 自11個個別供體之PBMC製造之抗BCMA CAR T細胞產品顯示相較於未經轉導之供體T細胞之匹配培養物可比較的擴增水平。圖 12B ： 自11個供體製造之抗BCMA CAR T細胞產品顯示可比較之慢病毒轉導效率(VCN)。圖 12C ： 藉由流動式細胞測量術量測抗BCMA CAR陽性T細胞之頻率及發現BCMA表現跨所有供體可比較。圖 12D ： 當暴露於表現BCMA之K562細胞時，自11個供體製造之抗BCMA CAR T細胞產品顯示IFNγ釋放之治療上相關水平。
圖 13 顯示CD62L陽性抗BCMA02 T細胞中之CD127、CD197及CD38之共同表現的文氏圖(Venn diagram)，該等T細胞已在IL-2或IL-2及ZSTK474之存在下培養10天。經ZSTK474處理之抗BCMA02 CAR T細胞相較於單獨用IL-2培養之抗BCMA CAR T細胞顯示共同表現CD127、CD197及CD38之細胞之百分比增加。
圖 14 顯示IL-2及ZSTK474 (n=7)處理之培養物相較於單獨用IL-2處理之培養物中之表現CD8之抗BCMA02 CAR T細胞之增加的百分比。使用螢光標記之抗CD8抗體及流動式細胞測量術測定CD8表現。
圖 15 顯示於單獨用IL-2或用IL-2及ZSTK474培養後，由來自14個供體之抗BCMA02 CAR T細胞釋放之IFN-γ的量。在培養期結束時，將等效數目之抗BCMA02 CAR T細胞於培養基中單獨再培養24小時。藉由ELISA定量24小時內釋放之IFN-γ之量。ZSTK474中之培養物相較於單獨用IL-2培養之抗BCMA02 CAR T細胞不顯著增加抗BCMA02 CAR T細胞強直性細胞激素釋放。
圖 16 顯示於侵襲性Daudi腫瘤模型中用IL-2或IL-2及ZSTK474處理之抗BCMA02 CAR T細胞，或用IL-2及ZSTK474處理之截短之信號缺陷抗BCMA02 (tBCMA02) CAR T細胞之抗腫瘤活性。於投與用IL-2及ZSTK474處理之抗BCMA02 CAR T細胞之50%小鼠中觀察到完全腫瘤消退。
圖 17 顯示於多發性骨髓瘤腫瘤(RPMI-8226)模型中用IL-2或IL-2及ZSTK474處理之抗BCMA02 CAR T細胞之抗腫瘤活性。用IL-2培養或IL-2及ZSTK474培養之抗BCMA02 CAR T細胞處理之動物完全防止腫瘤長出。
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Claims (25)

  1. 一種清除(depleting)有需要個體中表現BCMA之細胞的方法，其包括對該個體投與治療上有效量之表現針對B細胞成熟抗原(BCMA)之嵌合抗原受體(CAR)之免疫細胞，其中該等免疫細胞係以150 x 106 個細胞至450 x 106 個細胞之劑量投與，且其中在該投與之前，該個體已接受一線或多線先前療法，包括下列中之一或多者：蛋白酶體抑制劑、來那度胺(lenalidomide)、泊馬度胺(pomalidomide)、沙利度胺(thalidomide)、硼替佐米(bortezomib)、地塞米松(dexamethasone)、環磷醯胺(cyclophos-phamide)、多柔比星(doxorubicin)、卡非佐米(carfilzomib)、伊沙佐米(ixazomib)、順鉑(cisplatin)、多柔比星、依託泊苷(etoposide)、抗CD38抗體、帕比司他(panobinostat)及埃羅妥珠單抗(elotuzumab)。
  2. 一種治療有需要個體由表現BCMA之細胞引起之疾病的方法，其包括對該個體投與治療上有效量之表現針對B細胞成熟抗原(BCMA)之嵌合抗原受體(CAR)之免疫細胞，其中該等免疫細胞係以150 x 106 個細胞至450 x 106 個細胞之劑量投與，且其中在該投與之前，該個體已接受一線或多線先前療法，包括下列中之一或多者：蛋白酶體抑制劑、來那度胺、泊馬度胺、沙利度胺、硼替佐米、地塞米松、環磷醯胺、多柔比星、卡非佐米、伊沙佐米、順鉑、多柔比星、依託泊苷、抗CD38抗體、帕比司他及埃羅妥珠單抗。
  3. 一種治療有需要個體表現BCMA之癌症的方法，其包括對該個體投與治療上有效量之表現針對B細胞成熟抗原(BCMA)之嵌合抗原受體(CAR)之免疫細胞，其中該等免疫細胞係以150 x 106 個細胞至450 x 106 個細胞之劑量投與，且其中在該投與之前，該個體已接受一線或多線先前療法，包括下列中之一或多者：蛋白酶體抑制劑、來那度胺、泊馬度胺、沙利度胺、硼替佐米、地塞米松、環磷醯胺、多柔比星、卡非佐米、伊沙佐米、順鉑、多柔比星、依託泊苷、抗CD38抗體、帕比司他及埃羅妥珠單抗。
  4. 如請求項3之方法，其中該表現BCMA之癌症為多發性骨髓瘤、慢性淋巴球性白血病、或非霍奇金氏(non-Hodgkins)淋巴瘤(例如，伯基特氏(Burkitt’s)淋巴瘤、慢性淋巴球性白血病/小淋巴球性淋巴瘤(CLL/SLL)、瀰漫性大B細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、免疫母細胞性大細胞淋巴瘤、前體B淋巴母細胞性淋巴瘤及套細胞淋巴瘤)。
  5. 如請求項1至4中任一項之方法，其中該個體患有多發性骨髓瘤，該多發性骨髓瘤為高風險多發性骨髓瘤。
  6. 如請求項1至4中任一項之方法，其中該個體患有多發性骨髓瘤，該多發性骨髓瘤為復發且難治性多發性骨髓瘤。
  7. 如請求項1至6中任一項之方法，其中在該投與之前，該個體已接受一線或多線先前療法，該等先前療法包括： a.達雷木單抗(daratumumab)、泊馬度胺及地塞米松(DPd)； b.達雷木單抗、硼替佐米及地塞米松(DVd)； c.伊沙佐米、來那度胺及地塞米松(IRd)； d.達雷木單抗、來那度胺及地塞米松； e.硼替佐米、來那度胺及地塞米松(RVd)； f.硼替佐米、環磷醯胺及地塞米松(BCd)； g.硼替佐米、多柔比星及地塞米松； h.卡非佐米、來那度胺及地塞米松(CRd)； i.硼替佐米及地塞米松； j.硼替佐米、沙利度胺及地塞米松； k.來那度胺及地塞米松； l.地塞米松、沙利度胺、順鉑、多柔比星、環磷醯胺、依託泊苷及硼替佐米(VTD-PACE)； m.來那度胺及低劑量地塞米松； n.硼替佐米、環磷醯胺及地塞米松； o.卡非佐米及地塞米松； p.單獨來那度胺； q.單獨硼替佐米； r.單獨達雷木單抗； s.埃羅妥珠單抗、來那度胺及地塞米松； t.埃羅妥珠單抗、來那度胺及地塞米松； u.苯達莫司汀(bendamustine)、硼替佐米及地塞米松； v.苯達莫司汀、來那度胺及地塞米松； w.泊馬度胺及地塞米松； x.泊馬度胺、硼替佐米及地塞米松； y.泊馬度胺、卡非佐米及地塞米松； z.硼替佐米及脂質體多柔比星； aa.環磷醯胺、來那度胺及地塞米松； bb.埃羅妥珠單抗、硼替佐米及地塞米松； cc.伊沙佐米及地塞米松； dd.帕比司他、硼替佐米及地塞米松； ee.帕比司他及卡非佐米；或 ff.泊馬度胺、環磷醯胺及地塞米松。
  8. 如請求項7之方法，其中該個體已接受該等線先前療法中之兩者或更多者。
  9. 如請求項7之方法，其中該個體已接受該等線先前療法中之三者或更多者。
  10. 如請求項7之方法，其中該個體已接受該等線先前療法中之四者或更多者。
  11. 如請求項7之方法，其中該個體已接受該等線先前療法中之五者或更多者。
  12. 如請求項7之方法，其中該個體已接受該等線先前療法中之六者或更多者。
  13. 如請求項7之方法，其中該個體已接受該等線先前療法中之七者或更多者。
  14. 如請求項7之方法，其中該個體已接受該等線先前療法中不超過三者。
  15. 如請求項7之方法，其中該個體已接受該等線先前療法中不超過兩者。
  16. 如請求項7之方法，其中該個體已接受該等線先前療法中不超過一者。
  17. 如請求項1至16中任一項之方法，其中該個體在該投與時展示： a.大於或等於約0.5 g/dL之血清M-蛋白含量(血清蛋白電泳[sPEP])或大於或等於約200 mg/24小時之尿液M-蛋白含量(尿蛋白電泳[uPEP])，及/或 b.輕鏈多發性骨髓瘤(MM)，於血清或尿液中無可量測疾病，具有大於或等於約10 mg/dL之血清免疫球蛋白游離輕鏈，及異常血清免疫球蛋白κ λ游離輕鏈比率；及/或 c.約1或更低之美國東岸癌症臨床研究合作組織(Eastern Cooperative Oncology Group，ECOG)表現狀態。
  18. 如請求項17之方法，其中該個體另外： a.已接受該等線先前療法中之至少三者，包括用蛋白酶體抑制劑、免疫調節劑(來那度胺或泊馬度胺)及抗CD38抗體之先前療法； b.已經歷該等至少三線先前療法各至少2個連續治療週期，除非疾病進展(PD)為一線療法之最佳反應； c.在最近先前線療法之60天或60天內具有疾病進展(PD)之證據；及/或 d.已達成對該等先前線療法中至少一者之反應(最小反應或更好)。
  19. 如請求項17之方法，其中該個體另外： a.僅接受一種先前抗骨髓瘤治療方案；及/或 b.具有下列高風險因素：R-ISS III期及早期復發，其中該早期復發定義為：(i)若該個體已經歷誘發加上幹細胞移植，則自首次移植日起少於12個月疾病進展；或(ii)若該個體已僅接受誘發，則自最後治療方案日起少於12個月疾病進展(PD)，該方案最低限度必須含有蛋白酶體抑制劑、免疫調節劑及地塞米松。
  20. 如請求項1至19中任一項之方法，其中於該投與後該個體顯示至少6個月之無進展生存期。
  21. 如請求項1至19中任一項之方法，其中於該投與後該個體顯示至少12個月之無進展生存期。
  22. 如請求項1至21中任一項之方法，其中該嵌合抗原受體包括靶向BCMA之抗體或抗體片段。
  23. 如請求項1至22中任一項之方法，其中該嵌合抗原受體包括單鏈Fv抗體片段(scFv)。
  24. 如請求項1至22中任一項之方法，其中該嵌合抗原受體包括BCMA02 scFv。
  25. 如請求項1至22中任一項之方法，其中該等免疫細胞為bb2121細胞。
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