CN112689516A - 抗bcma嵌合抗原受体的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了抗B细胞成熟抗原(BCMA)嵌合抗原受体(CAR)用于治疗B细胞相关病状诸如表达BCMA的癌症的用途。

Description

抗BCMA嵌合抗原受体的用途
相关申请的交叉引用
本申请要求于2018年7月11日提交的美国临时专利申请62/696,802的权益，该临时专利申请的公开内容通过引用整体并入本文。
序列表
本申请以引用的方式并入序列表，该序列表作为ASCII文本文件与本申请一起提交，命名为14247-321-228_SEQ_LISTING.txt，创建于2019年7月3日且大小为27,379字节。
1.背景技术
1.1.技术领域
本发明涉及用于治疗B细胞相关病状的方法。更具体地，本发明涉及包含鼠抗BCMA抗体或其抗原结合片段的改良嵌合抗原受体(CAR)，被基因修饰为表达这些CAR的免疫效应细胞，以及这些组合物有效治疗B细胞相关病状的用途。
1.2.相关技术的描述
数种重要的疾病涉及B淋巴细胞，即B细胞。B细胞生理异常也可导致自身免疫性疾病的发展，所述自身免疫性疾病包括但不限于全身性红斑狼疮(SLE)。B细胞的恶性转化导致癌症，所述癌症包括但不限于淋巴瘤，例如多发性骨髓瘤和非霍奇金淋巴瘤。
患有包括非霍奇金淋巴瘤(NHL)和多发性骨髓瘤(MM)在内的B细胞恶性肿瘤的绝大多数患者都是导致癌症死亡率的重要贡献者。B细胞恶性肿瘤对各种形式的治疗的反应很混杂。由于毒副作用，包括化疗和放疗在内的治疗B细胞恶性肿瘤的传统方法的效用有限。用抗CD19、抗CD20、抗CD22、抗CD23、抗CD52、抗CD80和抗HLA-DR治疗性抗体进行的免疫疗法取得的成功有限，这部分是由于药代动力学特征较差、血清蛋白酶快速消除抗体和肾小球滤过，以及进入肿瘤部位的渗透和靶抗原在癌细胞上的表达水平有限。尝试使用表达嵌合抗原受体(CAR)的基因修饰细胞也取得了有限的成功。另外，CAR中使用的给定抗原结合结构域的治疗功效是无法预测的：如果抗原结合结构域结合太强，则CAR T细胞会诱导大量细胞因子释放，导致称为“细胞因子风暴”的潜在致命性免疫反应，而如果抗原结合结构域结合太弱，则CAR T细胞在清除癌细胞方面不会展示出足够的治疗功效。
2.发明内容
本发明总体上提供了治疗B细胞相关疾病(例如多发性骨髓瘤)的改进方法。
在一个实施方案中，本文提供了一种清除有需要的对象中的表达B细胞成熟抗原(BCMA)的细胞的方法，所述方法包括向所述对象施用表达针对BCMA的嵌合抗原受体(CAR)的免疫细胞，其中所述免疫细胞以150×106个细胞至450×106个细胞的剂量施用，并且其中在所述施用之前，所述对象已经接受了一个或多个系列的既往疗法。
在一个实施方案中，本文提供了一种清除有需要的对象中的表达BCMA的细胞的方法，所述方法包括向所述对象施用表达针对BCMA的嵌合抗原受体(CAR)的免疫细胞，其中所述免疫细胞以150×106个细胞至450×106个细胞的剂量施用，并且其中在所述施用之前，所述对象已经接受了一个或多个系列的既往疗法，所述一个或多个系列的既往疗法包含以下中的一种或多种：蛋白酶体抑制剂、来那度胺、泊马度胺、沙利度胺、硼替佐米、地塞米松、环磷酰胺、多柔比星、卡非佐米、伊沙佐米、顺铂、多柔比星、依托泊苷、抗CD38抗体、帕比司他和埃罗妥珠单抗。在一个实施方案中，抗CD38抗体是达雷木单抗。
在一个实施方案中，本文提供了一种清除有需要的对象中的表达BCMA的细胞的方法，所述方法包括向所述对象施用治疗有效量的表达针对B细胞成熟抗原(BCMA)的嵌合抗原受体(CAR)的免疫细胞，其中所述免疫细胞以150×106个细胞至450×106个细胞的剂量施用，并且其中在所述施用之前，所述对象已经接受了一个或多个系列的既往疗法，所述一个或多个系列的既往疗法包含以下中的一种或多种：蛋白酶体抑制剂、来那度胺、泊马度胺、沙利度胺、硼替佐米、地塞米松、环磷酰胺、多柔比星、卡非佐米、伊沙佐米、顺铂、多柔比星、依托泊苷、抗CD38抗体(诸如达雷木单抗)、帕比司他或埃罗妥珠单抗。
在另一个实施方案中，本文提供了一种治疗有需要的对象中由表达BCMA的细胞引起的疾病的方法，所述方法包括向所述对象施用表达针对BCMA的嵌合抗原受体(CAR)的免疫细胞，其中所述免疫细胞以150×106个细胞至450×106个细胞的剂量施用，并且其中在所述施用之前，所述对象已经接受了一个或多个系列的既往疗法。在某些实施方案中，根据本文所述的方法治疗的由表达BCMA的细胞引起的疾病包括但不限于：全身性红斑狼疮、类风湿性关节炎、重症肌无力、自身免疫性溶血性贫血、特发性血小板减少性紫癜、抗磷脂综合征、恰加斯氏病(Chagas’disease)、格雷夫氏病(Grave’s disease)、韦格纳肉芽肿(Wegener′s granulomatosis)、结节性多动脉炎、干燥综合征(Sjogren’s syndrome)、寻常性天疱疮、硬皮病、多发性硬化、抗磷脂综合症、ANCA相关性血管炎、古德帕斯病(Goodpasture′s disease)、川崎病(Kawasaki disease)和快速进行性肾小球肾炎。在某些实施方案中，根据本文所述的方法治疗的由表达BCMA的细胞引起的疾病还包括但不限于：重链疾病、原发性或免疫细胞相关的淀粉样变性和意义不明的单克隆丙种球蛋白病(MGUS)。
在另一个实施方案中，本文提供了一种治疗有需要的对象中由表达BCMA的细胞引起的疾病的方法，所述方法包括向所述对象施用表达针对BCMA的嵌合抗原受体(CAR)的免疫细胞，其中所述免疫细胞以150×106个细胞至450×106个细胞的剂量施用，并且其中在所述施用之前，所述对象已经接受了一个或多个系列的既往疗法，所述一个或多个系列的既往疗法包含以下中的一种或多种：蛋白酶体抑制剂、来那度胺、泊马度胺、沙利度胺、硼替佐米、地塞米松、环磷酰胺、多柔比星、卡非佐米、伊沙佐米、顺铂、多柔比星、依托泊苷、抗CD38抗体、帕比司他和埃罗妥珠单抗。在一个实施方案中，抗CD38抗体是达雷木单抗。
在另一个实施方案中，本文提供了一种治疗有需要的对象中由表达BCMA的细胞引起的疾病的方法，所述方法包括向所述对象施用治疗有效量的表达针对B细胞成熟抗原(BCMA)的嵌合抗原受体(CAR)的免疫细胞，其中所述免疫细胞以150×106个细胞至450×106个细胞的剂量施用，并且其中在所述施用之前，所述对象已经接受了一个或多个系列的既往疗法，所述一个或多个系列的既往疗法包含以下中的一种或多种：蛋白酶体抑制剂、来那度胺、泊马度胺、沙利度胺、硼替佐米、地塞米松、环磷酰胺、多柔比星、卡非佐米、伊沙佐米、顺铂、多柔比星、依托泊苷、抗CD38抗体(诸如达雷木单抗)、帕比司他或埃罗妥珠单抗。
在另一个实施方案中，本文提供了一种治疗有需要的对象中表达BCMA的癌症的方法，所述方法包括向所述对象施用表达针对BCMA的嵌合抗原受体(CAR)的免疫细胞，其中所述免疫细胞以150×106个细胞至450×106个细胞的剂量施用，其中在所述施用之前，所述对象已经接受了一个或多个系列的既往疗法。
在另一个实施方案中，本文提供了一种治疗有需要的对象中表达BCMA的癌症的方法，所述方法包括向所述对象施用表达针对BCMA的嵌合抗原受体(CAR)的免疫细胞，其中所述免疫细胞以150×106个细胞至450×106个细胞的剂量施用，其中在所述施用之前，所述对象已经接受了一个或多个系列的既往疗法，所述一个或多个系列的既往疗法包含以下中的一种或多种：蛋白酶体抑制剂、来那度胺、泊马度胺、沙利度胺、硼替佐米、地塞米松、环磷酰胺、多柔比星、卡非佐米、伊沙佐米、顺铂、多柔比星、依托泊苷、抗CD38抗体、帕比司他和埃罗妥珠单抗。在一个实施方案中，抗CD38抗体是达雷木单抗。在某些实施方案中，表达BCMA的癌症是多发性骨髓瘤、慢性淋巴细胞性白血病或非霍奇金淋巴瘤(例如伯基特氏淋巴瘤(Burkitt’s lymphoma)、慢性淋巴细胞性白血病/小淋巴细胞性淋巴瘤(CLL/SLL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、免疫母细胞性大细胞淋巴瘤、前体B淋巴母细胞性淋巴瘤或套细胞淋巴瘤)。
在另一个实施方案中，本文提供了一种治疗有需要的对象中表达BCMA的癌症的方法，所述方法包括向所述对象施用治疗有效量的表达针对B细胞成熟抗原(BCMA)的嵌合抗原受体(CAR)的免疫细胞，其中所述免疫细胞以150×106个细胞至450×106个细胞的剂量施用，其中在所述施用之前，所述对象已经接受了一个或多个系列的既往疗法，所述一个或多个系列的既往疗法包含以下中的一种或多种：蛋白酶体抑制剂、来那度胺、泊马度胺、沙利度胺、硼替佐米、地塞米松、环磷酰胺、多柔比星、卡非佐米、伊沙佐米、顺铂、多柔比星、依托泊苷、抗CD38抗体(诸如达雷木单抗)、帕比司他或埃罗妥珠单抗。在某些实施方案中，表达BCMA的癌症是多发性骨髓瘤、慢性淋巴细胞性白血病或非霍奇金淋巴瘤(例如伯基特氏淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病/小淋巴细胞性淋巴瘤(CLL/SLL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、免疫母细胞性大细胞淋巴瘤、前体B淋巴母细胞性淋巴瘤或套细胞淋巴瘤)。
在另一个实施方案中，本文提供了一种治疗有需要的对象中表达BCMA的癌症的方法，所述方法包括向所述对象施用治疗有效量的表达针对B细胞成熟抗原(BCMA)的嵌合抗原受体(CAR)的免疫细胞，其中所述免疫细胞以150×106个细胞至450×106个细胞的剂量施用，其中在所述施用之前，所述对象已经接受了一个或多个系列的既往疗法，所述一个或多个系列的既往疗法包含以下中的一种或多种：蛋白酶体抑制剂、来那度胺、泊马度胺、沙利度胺、硼替佐米、地塞米松、环磷酰胺、多柔比星、卡非佐米、伊沙佐米、顺铂、多柔比星、依托泊苷、抗CD38抗体(诸如达雷木单抗)、帕比司他或埃罗妥珠单抗；并且其中表达BCMA的癌症是多发性骨髓瘤、慢性淋巴细胞性白血病或非霍奇金淋巴瘤(例如伯基特氏淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病/小淋巴细胞性淋巴瘤(CLL/SLL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、免疫母细胞性大细胞淋巴瘤、前体B淋巴母细胞性淋巴瘤和套细胞淋巴瘤)。
在一个实施方案中，本文提供了一种治疗有需要的对象中的复发性、难治性或高危多发性骨髓瘤的方法，所述方法包括向对象施用表达针对B细胞成熟抗原(BCMA)的嵌合抗原受体(CAR)的T细胞(例如，自体T细胞)，其中所述T细胞以在约150×106个细胞至约600×106个细胞的范围内的剂量施用(例如，输注)，其中在所述施用之前，所述对象已经接受了一个或多个系列的既往疗法(例如，单一的既往疗法、2种既往疗法、3种既往疗法或多于3种既往疗法)，所述一个或多个系列的既往疗法包含以下中的一种或多种：蛋白酶体抑制剂、免疫调节剂(诸如IMiD化合物)、地塞米松和抗CD38抗体。在一个实施方案中，本文提供了一种治疗有需要的对象中的复发性、难治性或高危多发性骨髓瘤的方法，所述方法包括向对象施用表达针对B细胞成熟抗原(BCMA)的嵌合抗原受体(CAR)的T细胞(例如，自体T细胞)，其中所述T细胞以约150×106个细胞至约600×106个细胞的剂量施用(例如，输注)，其中在所述施用之前，所述对象已经接受了一个或多个系列的既往疗法(例如，单一的既往疗法、2种既往疗法、3种既往疗法或多于3种既往疗法)，所述一个或多个系列的既往疗法包含以下中的一种或多种：蛋白酶体抑制剂、来那度胺、泊马度胺、沙利度胺、硼替佐米、地塞米松、环磷酰胺、多柔比星、卡非佐米、伊沙佐米、顺铂、多柔比星、依托泊苷、抗CD38抗体(诸如达雷木单抗)、帕比司他或埃罗妥珠单抗。在一些实施方案中，对象已经被诊断患有多发性骨髓瘤。在一个实施方案中，对象患有多发性骨髓瘤，所述多发性骨髓瘤是高危多发性骨髓瘤。在一个实施方案中，对象患有多发性骨髓瘤，所述多发性骨髓瘤是复发难治性多发性骨髓瘤。在一些实施方案中，根据本文所述的方法治疗的对象仅接受过一种既往疗法。在一些实施方案中，根据本文所述的方法治疗的对象已经接受了3至7种既往疗法。在一些实施方案中，根据本文所述的方法治疗的对象已经接受了多于3种既往疗法。在一些实施方案中，对象对于至少一种、两种或三种治疗方案是难治性的(例如，对于最后一次接受的既往疗法是难治性的)，例如，其中该对象在完成用一种治疗方案进行的治疗的60天内表现出疾病进展。在一个实施方案中，所述方法用于治疗复发难治性多发性骨髓瘤。在一个实施方案中，所述方法用于治疗复发多发性骨髓瘤。在一个实施方案中，所述方法用于治疗难治性多发性骨髓瘤。在一个实施方案中，所述对象对于用蛋白酶体抑制剂、免疫调节剂(诸如IMiD化合物)、地塞米松和/或抗CD38抗体进行的治疗而言是难治性的。在一个实施方案中，所述方法用于治疗高危多发性骨髓瘤。在一些实施方案中，高危多发性骨髓瘤是R-ISS III期疾病和/或特征在于早期复发的疾病(例如，自最后一次治疗方案，诸如利用蛋白酶体抑制剂、免疫调节剂和/或地塞米松的最后一次治疗方案之日起12个月内出现的疾病进展)。在一个实施方案中，在施用表达针对B细胞成熟抗原(BCMA)的嵌合抗原受体(CAR)的T细胞之前，已经评估了患有肿瘤的对象的肿瘤的BCMA表达。在一个实施方案中，根据本文所述的方法治疗表达BCMA的多发性骨髓瘤。在一些实施方案中，通过静脉内输注施用T细胞。在一些实施方案中，以在以下范围内的剂量施用T细胞：150×106个细胞至450×106个细胞，300×106个细胞至600×106个细胞，350×106个细胞至600×106个细胞，350×106个细胞至550×106个细胞，400×106个细胞至600×106个细胞，150×106个细胞至300×106个细胞，或400×106个细胞至500×106个细胞。在一些实施方案中，以在以下范围内的剂量施用T细胞：约150×106个细胞，约200×106个细胞，约250×106个细胞，约300×106个细胞，约350×106个细胞，约400×106个细胞，约450×106个细胞，约500×106个细胞或约550×106个细胞。在一个实施方案中，以约450×106个细胞的剂量施用T细胞。在一些实施方案中，向对象输注一次表达针对B细胞成熟抗原(BCMA)的嵌合抗原受体(CAR)的T细胞。在一些实施方案中，重复施用表达针对B细胞成熟抗原(BCMA)的嵌合抗原受体(CAR)的T细胞(例如，可以向对象施用第二剂量的T细胞)。
在本文所述的任何实施方案的具体实施方案中，表达针对B细胞成熟抗原(BCMA)的嵌合抗原受体(CAR)的免疫细胞以约150×106个细胞至约300×106个细胞的剂量施用。在本文所述的任何实施方案的具体实施方案中，表达针对B细胞成熟抗原(BCMA)的嵌合抗原受体(CAR)的免疫细胞以约350×106个细胞至约550×106个细胞的剂量施用。在本文所述的任何实施方案的具体实施方案中，表达针对B细胞成熟抗原(BCMA)的嵌合抗原受体(CAR)的免疫细胞以约400×106个细胞至约500×106个细胞的剂量施用。在本文所述的任何实施方案的具体实施方案中，表达针对B细胞成熟抗原(BCMA)的嵌合抗原受体(CAR)的免疫细胞以约150×106个细胞至约250×106个细胞的剂量施用。在本文所述的任何实施方案的具体实施方案中，表达针对B细胞成熟抗原(BCMA)的嵌合抗原受体(CAR)的免疫细胞以约300×106个细胞至约500×106个细胞的剂量施用。在本文所述的任何实施方案的具体实施方案中，表达针对B细胞成熟抗原(BCMA)的嵌合抗原受体(CAR)的免疫细胞以约350×106个细胞至约450×106个细胞的剂量施用。在本文所述的任何实施方案的具体实施方案中，表达针对B细胞成熟抗原(BCMA)的嵌合抗原受体(CAR)的免疫细胞以约300×106个细胞至约450×106个细胞的剂量施用。在本文所述的任何实施方案的具体实施方案中，表达针对B细胞成熟抗原(BCMA)的嵌合抗原受体(CAR)的免疫细胞以约250×106个细胞至约450×106个细胞的剂量施用。在本文所述的任何实施方案的具体实施方案中，表达针对B细胞成熟抗原(BCMA)的嵌合抗原受体(CAR)的免疫细胞以约300×106个细胞至约600×106个细胞的剂量施用。在本文所述的任何实施方案的具体实施方案中，表达针对B细胞成熟抗原(BCMA)的嵌合抗原受体(CAR)的免疫细胞以约250×106个细胞至约500×106个细胞的剂量施用。在本文所述的任何实施方案的具体实施方案中，表达针对B细胞成熟抗原(BCMA)的嵌合抗原受体(CAR)的免疫细胞以约350×106个细胞至约500×106个细胞的剂量施用。在本文所述的任何实施方案的具体实施方案中，表达针对B细胞成熟抗原(BCMA)的嵌合抗原受体(CAR)的免疫细胞以约400×106个细胞至约600×106个细胞的剂量施用。在本文所述的任何实施方案的具体实施方案中，表达针对B细胞成熟抗原(BCMA)的嵌合抗原受体(CAR)的免疫细胞以约400×106个细胞至约450×106个细胞的剂量施用。在本文所述的任何实施方案的具体实施方案中，表达针对B细胞成熟抗原(BCMA)的嵌合抗原受体(CAR)的免疫细胞以约200×106个细胞至约400×106个细胞的剂量施用。在本文所述的任何实施方案的具体实施方案中，表达针对B细胞成熟抗原(BCMA)的嵌合抗原受体(CAR)的免疫细胞以约200×106个细胞至约350×106个细胞的剂量施用。在本文所述的任何实施方案的具体实施方案中，表达针对B细胞成熟抗原(BCMA)的嵌合抗原受体(CAR)的免疫细胞以约200×106个细胞至约300×106个细胞的剂量施用。在本文所述的任何实施方案的具体实施方案中，表达针对B细胞成熟抗原(BCMA)的嵌合抗原受体(CAR)的免疫细胞以约450×106个细胞至约500×106个细胞的剂量施用。在本文所述的任何实施方案的具体实施方案中，表达针对B细胞成熟抗原(BCMA)的嵌合抗原受体(CAR)的免疫细胞以约250×106个细胞至约400×106个细胞的剂量施用。在本文所述的任何实施方案的具体实施方案中，表达针对B细胞成熟抗原(BCMA)的嵌合抗原受体(CAR)的免疫细胞以约250×106个细胞至约350×106个细胞的剂量施用。在本文所述的任何实施方案的具体实施方案中，表达针对B细胞成熟抗原(BCMA)的嵌合抗原受体(CAR)的免疫细胞以约450×106个细胞的剂量施用。在本文所述的任何实施方案的具体实施方案中，免疫细胞是T细胞(例如，自体T细胞)。在本文所述的任何实施方案的具体实施方案中，使受治疗的对象经受白细胞去除程序以收集自体免疫细胞，以制造表达针对B细胞成熟抗原(BCMA)的嵌合抗原受体(CAR)的免疫细胞，然后将该免疫细胞施用于对象。在本文所述的任何实施方案的具体实施方案中，免疫细胞(例如，T细胞)是通过静脉内输注施用的。
在本文公开的任何实施方案的具体实施方案中，在施用表达针对B细胞成熟抗原(BCMA)的嵌合抗原受体(CAR)的免疫细胞之前，向受治疗的对象施用淋巴细胞清除(LD)化疗。在具体实施方案中，LD化疗包括氟达拉滨(fludarabine)和/或环磷酰胺。在具体实施方案中，LD化疗包括氟达拉滨(例如，静脉内施用约30mg/m2)和环磷酰胺(例如，静脉内施用约300mg/m2)，持续时间为1、2、3、4、5、6或7天(例如，3天)。在其它具体实施方案中，LD化疗包含第5.9节中描述的任何化学治疗剂。在具体实施方案中，在LD化疗施用后1、2、3、4、5、6或7天(例如，LD化疗施用后2或3天)，向对象施用表达针对B细胞成熟抗原(BCMA)的嵌合抗原受体(CAR)的免疫细胞。在具体实施方案中，对象在启动LD化疗之前至少1周或多于1周、至少2周或多于2周(至少14天或多于14天)、至少3周或多于3周、至少4周或多于4周、至少5周或多于5周，或至少6周或多于6周未接受过任何疗法。在本文公开的任何实施方案的具体实施方案中，在施用表达针对B细胞成熟抗原(BCMA)的嵌合抗原受体(CAR)的免疫细胞之前，受治疗的对象仅接受过单一的既往治疗方案。
在任何上述实施方案的具体实施方案中，在所述施用之前，所述对象已经接受了一个或多个系列的既往疗法，所述一个或多个系列的既往疗法包含以下：达雷木单抗、泊马度胺和地塞米松(DPd)；达雷木单抗、硼替佐米和地塞米松(DVd)；伊沙佐米、来那度胺和地塞米松(IRd)；达雷木单抗、来那度胺和地塞米松；硼替佐米、来那度胺和地塞米松(RVd)；硼替佐米、环磷酰胺和地塞米松(BCd)；硼替佐米、多柔比星和地塞米松；卡非佐米、来那度胺和地塞米松(CRd)；硼替佐米和地塞米松；硼替佐米、沙利度胺和地塞米松；来那度胺和地塞米松；地塞米松、沙利度胺、顺铂、多柔比星、环磷酰胺、依托泊苷和硼替佐米(VTD-PACE)；来那度胺和低剂量地塞米松；硼替佐米、环磷酰胺和地塞米松；卡非佐米和地塞米松；单独的来那度胺；单独的硼替佐米；单独的达雷木单抗；埃罗妥珠单抗、来那度胺和地塞米松；埃罗妥珠单抗、来那度胺和地塞米松；苯达莫司汀、硼替佐米和地塞米松；苯达莫司汀、来那度胺和地塞米松；泊马度胺和地塞米松；泊马度胺、硼替佐米和地塞米松；泊马度胺、卡非佐米和地塞米松；硼替佐米和多柔比星脂质体；环磷酰胺、来那度胺和地塞米松；埃罗妥珠单抗、硼替佐米和地塞米松；伊沙佐米和地塞米松；帕比司他、硼替佐米和地塞米松；帕比司他和卡非佐米；或泊马度胺、环磷酰胺和地塞米松。
在任何上述实施方案的具体实施方案中，在所述施用之前，所述对象已经接受了一个或多个系列的既往疗法，所述一个或多个系列的既往疗法包含以下中的一种或多种：蛋白酶体抑制剂、来那度胺、泊马度胺、沙利度胺、硼替佐米、地塞米松(例如，低剂量地塞米松)、环磷酰胺、多柔比星、卡非佐米、伊沙佐米、顺铂、多柔比星、依托泊苷、苯达莫司汀、多柔比星脂质体、抗CD38抗体、帕比司他和埃罗妥珠单抗。在具体实施方案中，抗CD38抗体是达雷木单抗。
在上述任一项的某些更具体的实施方案中，所述对象已经接受了所述系列的既往疗法中的两个或更多个系列、所述系列的既往疗法中的三个或更多个系列、所述系列的既往疗法中的四个或更多个系列、所述系列的既往疗法中的五个或更多个系列、所述系列的既往疗法中的六个或更多个系列，或所述系列的既往疗法中的七个或更多个系列。在上述任一项的某些其它更具体的实施方案中，所述对象已经接受了所述系列的既往疗法中的不超过三个系列、所述系列的既往疗法中的不超过两个系列，或所述系列的既往疗法中的不超过一个系列。
对于任何上述实施方案，所述对象在所述施用之前经受淋巴细胞清除。对于任何上述实施方案，对象经受单采术(apheresis)以收集和分离所述免疫细胞，例如T细胞。在任何上述实施方案的具体实施方案中，所述对象在所述单采术时表现出：M蛋白(血清蛋白电泳[sPEP]或尿蛋白电泳[uPEP])：sPEP≥0.5g/dL或uPEP≥200mg/24小时；在血清或尿中没有可测量到的疾病的情况下的轻链多发性骨髓瘤，其中血清免疫球蛋白游离轻链≥10mg/dL且血清免疫球蛋白游离轻链κ/λ比率异常；和/或东部肿瘤协作组(ECOG)体能状态≤1。在更具体的实施方案中，所述对象在单采术时另外：已经接受了所述系列的既往治疗中的至少三个系列，包括用蛋白酶体抑制剂、免疫调节剂(来那度胺或泊马度胺)和抗CD38抗体进行的既往治疗；已经经历了针对所述至少三个系列的既往治疗中的每一个系列的至少2个连续的治疗周期，除非疾病进展是对某一系列治疗的最佳反应；在最近的系列的既往治疗的过程中或60天内具有疾病进展的迹象；以及/或者已经对所述既往系列的治疗中的至少一个系列获得了反应(最低限度的反应或更佳)。在任何上述实施方案的一个具体实施方案中，所述对象在所述施用时表现出：M蛋白(血清蛋白电泳[sPEP]或尿蛋白电泳[uPEP])：sPEP≥0.5g/dL或uPEP≥200mg/24小时；在血清或尿中没有可测量到的疾病的情况下的轻链多发性骨髓瘤，其中血清免疫球蛋白游离轻链≥10mg/dL且血清免疫球蛋白游离轻链κ/λ比率异常；和/或东部肿瘤协作组(ECOG)体能状态≤1。在更具体的实施方案中，所述对象在施用时另外：已经接受了所述系列的既往治疗中的至少三个系列，包括用蛋白酶体抑制剂、免疫调节剂(例如，来那度胺或泊马度胺)和抗CD38抗体进行的既往治疗；已经经历了所述至少三个系列的既往治疗中的每一个系列的至少2个连续的治疗周期，除非疾病进展是对某一系列治疗的最佳反应；在最近的系列的既往治疗的过程中或60天内具有疾病进展的迹象；和/或已经对所述既往系列的治疗中的至少一个系列获得了反应(最低限度的反应或更佳的反应)。
在另一个更具体的实施方案中，所述对象另外：仅接受过一种既往抗骨髓瘤治疗方案；具有以下高危因素：R-ISS III期和早期复发，所述早期复发被定义为：(i)如果对象已经历诱导加干细胞移植，则自首次移植之日起少于12个月出现疾病进展(PD)；或(ii)如果对象仅接受过诱导，则自最后一次治疗方案之日起＜12个月出现PD，所述最后一次治疗方案必须最少含有蛋白酶体抑制剂、免疫调节剂和地塞米松。
在任何上述实施方案的具体实施方案中，所述对象在所述施用后表现出至少六个月的无进展生存期，或者在所述施用后表现出至少十二个月的无进展生存期。
在任何上述实施方案的具体实施方案中，所述嵌合抗原受体包含靶向BCMA的抗体或抗体片段，例如单链Fv抗体片段(scFv)，例如BCMA02 scFv。在一个实施方案中，嵌合抗原受体包含靶向BCMA的鼠单链Fv抗体片段。在一个实施方案中，嵌合抗原受体包含：结合BCMA多肽的鼠抗BCMA scFv、包含CD8α多肽的铰链结构域、CD8α跨膜结构域、CD137(4-1BB)细胞内共刺激信号传导结构域，和CD3ζ初级信号传导结构域。在一个实施方案中，嵌合抗原受体包含靶向BCMA的鼠scFv，其中scFV是SEQ ID NO：9的抗BCMA02CAR的scFv。在一个实施方案中，嵌合抗原受体是或包含SEQ ID NO：9。在本文任何实施方案的一个更具体的实施方案中，所述免疫细胞是bb2121细胞。在一个实施方案中，免疫细胞包含嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包含靶向BCMA的鼠单链Fv抗体片段。在一个实施方案中，免疫细胞包含嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包含结合BCMA多肽的鼠抗BCMAscFv、包含CD8α多肽的铰链结构域、CD8α跨膜结构域、CD137(4-1BB)细胞内共刺激信号传导结构域和CD3ζ初级信号传导结构域。在一个实施方案中，免疫细胞包含嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体是或包含SEQ IDNO：9。
3.附图简述
图1示出了鼠B细胞成熟抗原(muBCMA)CAR构建体的示意图。
图2A示出了在将抗BCMA02 CAR T细胞、抗BCMA10 CART细胞和CAR19ΔT细胞与表达BCMA的K562细胞一起共同培养24小时后，从该抗BCMA02 CAR T细胞、抗BCMA10 CART细胞和CAR19ΔT细胞中释放的IFNγ的量。
图2B示出了与表达BCMA的K562细胞相比较，在将抗BCMA02 CAR T细胞、抗BCMA10CART细胞和CAR19ΔT细胞与缺乏BCMA表达的K562细胞一起共同培养24小时后，从该抗BCMA02 CAR T细胞、抗BCMA10 CART细胞和CAR19ΔT细胞中释放的IFNγ的量。
图3示出了来自于在测定前10天受到刺激的未转导的对照T细胞、抗BCMA02 CAR T细胞、抗BCMA10 CART细胞和CAR19ΔT细胞的生长培养基中炎性细胞因子的量。
图4示出了在不存在抗原刺激的情况下，由抗BCMA02 CAR T细胞、抗BCMA10 CART细胞和CAR19ΔT细胞产生的炎性细胞因子的量。
图5示出了在抗BCMA CAR T细胞制造结束时活化的表型标志物的表达。在抗BCMA02 CAR T细胞、抗BCMA10 CAR T细胞和CAR19ΔT细胞中测量HLA-DR和CD25表达。
图6示出了在不存在抗原刺激的情况下，抗BCMA10 CAR T细胞和抗BCMA02 CAR T细胞中活化的半胱天冬酶3的水平，所述活化半胱天冬酶3是凋亡的必要步骤并且对AICD很重要。
图7示出了在含有胎牛血清(FBS)、人AB血清(HABS)或100ng/ml可溶性BCMA的培养基中，抗BCMA02和抗BCMA10 CAR T细胞中炎性细胞因子释放的量。
图8A示出了具有～100mm3实验皮下人多发性骨髓瘤(RPMI-8226)肿瘤的NOD scidγ(NSG)小鼠中的肿瘤体积。用媒介物、107个抗BCMA02 CAR T细胞、107个抗BCMA10 CAR T细胞或硼替佐米
Figure BDA0002971836970000081
来治疗小鼠。
图8B示出了具有～100mm3实验皮下人多发性骨髓瘤(RPMI-8226)肿瘤的NOD scidγ(NSG)小鼠中的肿瘤体积。用媒介物、107个抗BCMA02 CAR T细胞、107个抗BCMA10CAR T细胞或硼替佐米
Figure BDA0002971836970000082
来治疗小鼠。
图9示出了淋巴瘤和白血病细胞系上的BCMA表达水平(圆圈)以及抗BCMA CAR T细胞对每种细胞系的活性(IFNγ释放，方框)。BCMA阴性(BCMA-)肿瘤细胞系：骨髓性白血病(K562)、急性淋巴母细胞性白血病(NALM-6和NALM-16)；套细胞淋巴瘤(REC-1)；或霍奇金淋巴瘤(HDLM-2)显示出很少的IFNγ释放或没有显示出IFNγ释放。BCMA阳性(BCMA+)肿瘤细胞系：B细胞慢性淋巴母细胞性白血病(MEC-1)、套细胞淋巴瘤(JeKo-1)、霍奇金淋巴瘤(RPMI-6666)、伯基特淋巴瘤(Daudi细胞和Ramos细胞)和多发性骨髓瘤(RPMI-8226)显示出大量IFNγ释放。
图10A示出了在NSG小鼠模型中当在肿瘤诱导后第8天将CAR T细胞施用给小鼠时，媒介物、抗CD19ΔCAR T细胞、抗CD19 CAR T细胞和抗BCMA CAR T细胞对表达BCMA的伯基特淋巴瘤细胞(Daudi细胞)的体内活性。
图10B示出了在NSG小鼠模型中当在肿瘤诱导后第18天将CAR T细胞施用给小鼠时，媒介物、抗CD19ΔCAR T细胞、抗CD19 CAR T细胞和抗BCMA CAR T细胞对表达BCMA的伯基特淋巴瘤细胞(Daudi细胞)的体内活性。
图11A-11C示出了通过减少50％的抗BCMA CAR表达而获得的抗BCMA CAR T细胞的强效体外活性。图11A：用4×108至5×107个转导单位的编码抗BCMA CAR分子的慢病毒(MOI为5至40)转导T细胞群。将所得T细胞群归一化为含有26±4％的抗BCMA CAR阳性T细胞。图11B：如通过流式细胞术测定的在885至1875范围内的经归一化的抗BCMA CAR T细胞的MFI。图11C：将K562细胞和K562-BCMA细胞与归一化的抗BCMA CAR T细胞一起以20∶1或10∶1效应子(E；T细胞)：靶标(T；K562细胞和K562 BCMA细胞的1∶1混合物)比率共同培养，显示出有可比性的溶细胞活性。
图12A-12D示出了抗BCMA CAR T细胞的制造过程的可靠性。图12A：与未转导的供体T细胞的匹配培养物相比较，由11个个体供体的PBMC制造的抗BCMA CAR T细胞产物显示出有可比性的扩增水平。图12B：由11个供体制造的抗BCMA CAR T细胞产物显示出有可比性的慢病毒转导效率(VCN)。图12C：通过流式细胞术测量抗BCMA CAR阳性T细胞的频率，发现在所有供体中的BCMA表达都具有可比性。图12D：当暴露于表达BCMA的K562细胞中时，由11个供体制造的抗BCMA CAR T细胞产物显示出治疗上相关的水平的IFNγ释放。
图13示出了在存在IL-2或者IL-2和ZSTK474的情况下培养了十天的CD62L阳性抗BCMA02 T细胞中CD127、CD197和CD38的共表达的维恩图。同与单独IL-2一起培养的抗BCMACAR T细胞相比较，经ZSTK474处理的抗BCMA02 CAR T细胞显示出共表达CD127、CD197和CD38的细胞百分比增加。
图14显示通过同用单独IL-2处理的培养物相比较，在经IL-2和ZSTK474处理的培养物中(n＝7)表达CD8的抗BCMA02 CAR T细胞的百分比增加。使用荧光标记的抗CD8抗体和流式细胞术确定CD8的表达。
图15示出了在与单独IL-2一起培养或者与IL-2和ZSTK474一起培养后，由来自14个供体的抗BCMA02 CAR T细胞释放的IFN-γ的量。在培养期结束时，将相等数量的抗BCMA02 CAR T细胞在单独的培养基中再培养24小时。通过ELISA定量在24小时内释放的IFN-γ的量。同与单独IL-2一起培养的抗BCMA02 CAR T细胞相比较，在ZSTK474中的培养不会显著增加抗BCMA02 CAR T细胞补强细胞因子(cell tonic cytokine)的释放。
图16示出了在侵袭性Daudi肿瘤模型中用IL-2或者IL-2和ZSTK474处理的抗BCMA02 CAR T细胞，或用IL-2和ZSTK474处理的截短的信号传导缺陷型抗BCMA02(tBCMA02)CAR T细胞的抗肿瘤活性。在施用了用IL-2和ZSTK474处理的抗BCMA02 CAR T细胞的50％小鼠中观察到肿瘤完全消退。
图17示出了在多发性骨髓瘤肿瘤(RPMI-8226)模型中用IL-2或IL-2和ZSTK474处理的抗BCMA02 CAR T细胞的抗肿瘤活性。用与IL-2一起培养或者与IL-2和ZSTK474一起培养的抗BCMA02 CAR T细胞处理的动物完全阻止了肿瘤生长。
4.序列标识符简述
SEQ ID NO：1-3列出了本文考虑的BCMA CAR的示例性轻链CDR序列的氨基酸序列。
SEQ ID NO：4-6列出了本文考虑的BCMA CAR的示例性重链CDR序列的氨基酸序列。
SEQ ID NO：7列出了本文考虑的BCMA CAR的示例性轻链序列的氨基酸序列。
SEQ ID NO：8列出了本文考虑的BCMA CAR的示例性重链序列的氨基酸序列。
SEQ ID NO：9列出了本文考虑的示例性BCMA CAR的氨基酸序列。
SEQ ID NO：10列出了编码本文考虑的示例性BCMA CAR的多核苷酸序列。
SEQ ID NO：11列出了人BCMA的氨基酸序列。
SEQ ID NO：12-22列出了各种接头的氨基酸序列。
SEQ ID NO：23-35列出了蛋白酶切割位点和自我切割多肽切割位点的氨基酸序列。
SEQ ID NO：36列出了编码BCMA CAR的载体的多核苷酸序列。
5.具体实施方式
5.1.综述
本发明总体上涉及用于治疗B细胞相关病状的改进的组合物和方法。如本文所用，术语“B细胞相关病状”涉及牵涉不适当的B细胞活性和B细胞恶性肿瘤的病状。
在特定的实施方案中，本发明涉及使用经基因修饰的免疫效应细胞的改进的B细胞相关病状的过继细胞疗法。遗传方法提供了用于增强免疫识别和消除癌细胞的潜在手段。一种有前途的策略是对免疫效应细胞进行基因工程改造，以使其表达将细胞毒性重定向至癌细胞的嵌合抗原受体(CAR)。然而，现有的用于治疗B细胞病症的过继细胞免疫疗法存在严重的损害体液免疫力的风险，因为这些细胞靶向所有或大多数B细胞上表达的抗原。因此，此类疗法不是临床上可取的，因此，本领域仍然需要不伤害体液免疫力的针对B细胞相关病状的更有效的疗法。
本文公开的过继细胞疗法的改进组合物和方法提供了经基因修饰的免疫效应细胞，其可以容易地扩增，在体内表现出长期持久性，并且可以通过靶向表达B细胞成熟抗原(BCMA，也称为CD269或肿瘤坏死因子受体超家族，成员17；TNFRSF17)的B细胞而减少体液免疫力的损害。
BCMA是肿瘤坏死因子受体超家族的成员(参见，例如Thompson等人，J.Exp.Medicine，192(1)：129-135，2000，和Mackay等人，Annu.Rev.Immunol，21：231-264，2003。BCMA结合B细胞激活因子(BAFF)和增殖诱导配体(APRIL)(参见，例如Mackay等人，2003和Kalled等人，Immunological Reviews，204：43-54，2005)。在非恶性细胞中，BCMA已被报告主要在浆细胞和成熟B细胞亚群中表达(参见，例如Laabi等人，EMBOJ.，77(1)：3897-3904，1992；Laabi等人，Nucleic 4cids Res.，22(7)：1147-1154，，1994；Kalled等人，2005；O′Connor等人，J.Exp.Medicine，199(1)：91-97，2004；和Ng等人，J.Immunol.，73(2)：807-817，2004。缺乏BCMA的小鼠是健康的，具有正常数量的B细胞，但是长寿浆细胞的生存期受到损害(参见，例如O′Connor等人，2004；Xu等人，Mol.Cell.Biol.，21(12)：4067-4074，2001；和Schiemann等人，Science，293(5537)：2 111-21 14，2001)。已在多发性骨髓瘤细胞和其它淋巴瘤中普遍检测到BCMA RNA，并且几位研究人员已在多发性骨髓瘤患者的浆细胞表面上检测到BCMA蛋白(参见例如，Novak等人，Blood，103(2)：689-694，2004；Neri等人，Clinical Cancer Research，73(19)：5903-5909，2007；Bellucci等人，Blood，105(10)：3945-3950，2005；和Moreaux等人，Blood，703(8)：3148-3157，2004。
在各种实施方案中，包含鼠抗-BCMA抗体序列的CAR与包含特定人抗体序列的BCMACAR相比较是高效的；经历稳健的体内扩增；并识别表达BMCA的人B细胞；对表达BCMA的B细胞显示出细胞毒活性；而没有显示出诱导细胞因子风暴的迹象，细胞因子风暴是一种潜在致命性病状，活化的T细胞释放的细胞因子在系统中产生突然的炎症反应从而引发非感染性发烧。
在一个实施方案中，提供了一种CAR，其包含鼠抗BCMA抗体或抗原结合片段、跨膜结构域和一个或多个细胞内信号传导结构域。
在一个实施方案中，提供了一种被基因修饰为表达本文考虑的CAR的免疫效应细胞。表达CAR的T细胞在本文中称为CAR T细胞或CAR修饰的T细胞。
在各种实施方案中，将本文考虑的经基因修饰的免疫效应细胞施用给患有B细胞相关病状，例如与B细胞相关的自身免疫性疾病或B细胞恶性肿瘤的患者。
除非明确指出相反，否则本发明的实践采用了在本领域技术范围内的化学、生物化学、有机化学、分子生物学、微生物学、重组DNA技术、遗传学、免疫学和细胞生物学的常规方法，为了说明的目的，下面对许多所述常规方法进行了描述。文献中对此类技术进行了充分的解释。参见，例如Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(2001年第3版)；Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(1989年第2版)；Maniatis等人Molecular Cloning：A Laboratory Manual(1982)；Ausubel等人，Current Protocolsin Molecular Biology(John Wiley and Sons，2008年7月更新)；Short Protocols inMolecular Biology：A Compendium of Methods from Current Protocols in MolecularBiology，Greene Pub.Associates and Wiley-Interscience；Glover，DNA Cloning：APractical Approach，第I和II卷(IRL Press，Oxford，1985)；Anand，Techniques for theAnalysis of Complex Genomes，(Academic Press，New York，1992)；Transcription andTranslation(B.Hames和S.Higgins编著，1984)；Perbal，A Practical Guide toMolecular Cloning(1984)；Harlow和Lane，Antibodies，(Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1998)Current Protocols in ImmunologyQ.E.Coligan，A.M.Kruisbeek，D.H.Margulies，E.M.Shevach和W.Strober编著，1991)；Annual Review of Immunology；以及杂志诸如Advances in Immunology中的专题论文。
5.2.定义
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管在本发明的实践或测试中也可以使用与本文所述的那些方法和材料类似或等效的任何方法和材料，但本文描述的是组合物、方法和材料的优选实施方案。为了本发明的目的，下面定义了以下术语。
冠词“一”、“一种(个)”和“所述(该)”在本文中用于指代该冠词的语法对象中的一种(个)或多于一种(个)(即，至少一种(个)，或者一种(个)或多种(个))。举例来说，“要素”意指一个要素或者一个或多个要素。
替代方案(例如“或”)的使用应理解为意指替代方案中的任一者、两者，或其任何组合。
术语“和/或”应该理解为意指意指替代方案中的任一者或两者。
如本文所用，术语“约”或“大约”是指数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度相对于参考数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度变化至多15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％。在一个实施方案中，术语“约”或“大约”是指约为参考数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度的±15％、±10％、±9％、±8％、±7％、±6％、±5％、±4％、±3％、±2％或±1％的数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度的范围。
在本说明书全文中，除非上下文另有要求，否则词“包含”、“包括“应理解为意味着包含所陈述的步骤或要素或者步骤或要素的组，但不排除任何其它步骤或要素或者步骤或要素的组。“由......组成”意指包括且限于短语“由......组成”之后的内容。因此，短语“由......组成”表示所列要素是必需的或强制性的，并且不可以存在其它要素。“基本上由......组成”意指包括在该短语后面列出的任何要素，并且限于不干扰或不影响本公开中针对所列要素所指定的活性或作用的其它要素。因此，短语“基本上由......组成”表示所列要素是必需的或强制性的，但是不存在实质性地影响所列要素的活性或作用的其它要素。
贯穿本说明书对“一个实施方案”、“实施方案”、“特定实施方案”、“相关实施方案”、“某一实施方案”、“另外的实施方案”或“进一步的实施方案”或其组合的提及意指结合所述实施方案加以描述的特定特征、结构或特性包括在本发明的至少一个实施方案中。因此，前述短语在贯穿本说明书的各个地方的出现不一定全部指同一实施方案。此外，特定的特征、结构或特性可以以任何合适的方式组合在一个或多个实施方案中。还应理解，在一个实施方案中对特征的肯定陈述充当在一个特定实施方案中排除该特征的基础。
5.3.嵌合抗原受体
在各种实施方案中，提供了将免疫效应细胞的细胞毒性重定向至B细胞的经基因工程改造的受体。这些经基因工程改造的受体在本文中称为嵌合抗原受体(CAR)。CAR是将针对预期抗原(例如，BCMA)的基于抗体的特异性与活化T细胞受体的细胞内结构域组合以产生表现出特异性抗BCMA细胞免疫活性的嵌合蛋白的分子。如本文所用，术语“嵌合”描述由来自不同来源的不同蛋白质或DNA的部分组成。
本文考虑的CAR包含与BCMA结合的细胞外结构域(也称为结合结构域或抗原特异性结合结构域)、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。CAR的抗BCMA抗原结合结构域与靶细胞表面上的BCMA接合导致CAR的聚集，并且将活化刺激递送至含CAR的细胞。CAR的主要特性是其能够重定向免疫效应细胞特异性，从而触发增殖、细胞因子产生、吞噬作用或这样的分子的产生，所述分子可以以非主要组织相容性(MHC)依赖性的方式，利用单克隆抗体、可溶性配体或细胞特异性共受体的细胞特异性靶向能力来介导靶抗原表达细胞的细胞死亡。
在各种实施方案中，CAR包含细胞外结合结构域，其包含鼠抗BCMA特异性结合结构域；跨膜结构域；一个或多个细胞内共刺激信号传导结构域；以及初级信号传导结构域。
在特定实施方案中，CAR包含细胞外结合结构域，其包含鼠抗BCMA抗体或其抗原结合片段；一个或多个铰链结构域或间隔区结构域；跨膜结构域，其包括；一个或多个细胞内共刺激信号传导结构域；以及初级信号传导结构域。
5.3.1.结合结构域
在特定实施方案中，本文考虑的CAR包含细胞外结合结构域，其包含与B细胞上表达的人BCMA多肽特异性地结合的鼠抗BCMA抗体或其抗原结合片段。如本文所用，术语“结合结构域”、“细胞外结构域”、“细胞外结合结构域”、“抗原特异性结合结构域”和“细胞外抗原特异性结合结构域”可互换使用，并且提供具有与目标靶抗原(例如，BCMA)特异性地结合的能力的CAR。结合结构域可以源自天然、合成、半合成或重组来源。
如本文所用的术语“特异性结合亲和力”或“特异性地结合”或“被特异性地结合的”或“特异性结合”或“特异性地靶向”描述了抗BCMA抗体或其抗原结合片段(或者包含抗BCMA抗体或其抗原结合片段的CAR)与BCMA以高于背景结合的结合亲和力结合。如果结合结构域(或者包含结合结构域或含有结合结构域的融合蛋白的CAR)以例如大于或等于约105M-1的亲和力或Ka(即，特定结合相互作用的平衡缔合常数，单位为1/M)与BCMA结合或缔合，则该结合结构域与BCMA“特异性地结合”。在某些实施方案中，结合结构域(或其融合蛋白)以大于或等于约106M-1、107M-1、108M-1、109M-1、1010M-1、1011M-1、1012M-1或1013M-1的Ka与靶标结合。“高亲和力”结合结构域(或其单链融合蛋白)是指Ka为至少107M-1、至少108M-1、至少109M-1、至少1010M-1、至少1011M-1、至少1012M-1、至少1013M-1或更高的那些结合结构域。
可替代地，亲和力可以被定义为特定结合相互作用的平衡解离常数(Kd)，其单位为M(例如，10-5M至10-13M，或更低)。根据本公开的结合结构域多肽和CAR蛋白的亲和力可以使用常规技术容易地测定，例如通过竞争性ELISA(酶联免疫吸附测定)，或通过结合缔合，或置换测定法使用标记的配体，或使用表面等离子体共振装置，诸如可从Biacore，Inc.，Piscataway，NJ获得的Biacore T100，或使用光学生物传感器技术，诸如分别可从Corning和Perkin Elmer获得的EPIC系统或EnSpire(还请参见，例如Scatchard等人(1949)Ann.N.Y.Acad.Sci.51：660；和美国专利号5,283,173；5,468,614或等效案)来测定。
在一个实施方案中，特异性结合的亲和力是背景结合的约2倍、背景结合的约5倍、背景结合的约10倍、背景结合的约20倍、背景结合的约50倍、背景结合的约100倍，或背景结合的约1000倍或更多倍。
在特定实施方案中，CAR的细胞外结合结构域包含抗体或其抗原结合片段。“抗体”是指作为至少包含轻链或重链免疫球蛋白可变区的多肽的结合剂，其特异性地识别并结合抗原的表位，诸如肽、脂质、多糖或含有抗原决定簇的核酸，诸如被免疫细胞识别的那些。
“抗原(Ag)”是指可以刺激动物体内产生抗体或T细胞反应的化合物、组合物或物质，包括注射或吸收到动物体内的组合物(诸如包含癌症特异性蛋白质的组合物)。抗原与特定体液或细胞免疫力的产物(包括由异源抗原，诸如所公开的抗原诱导的那些)反应。在特定实施方案中，靶抗原是BCMA多肽的表位。
“表位”或“抗原决定簇”是指与结合剂结合的抗原区域。表位可以由连续氨基酸或通过蛋白质三级折叠而并置的非连续氨基酸形成。由连续氨基酸形成的表位通常在暴露于变性溶剂中时得以保留，而通过三级折叠形成的表位通常在用变性溶剂处理时丢失。表位通常包含至少3个，且更通常为至少5个、约9个或约8-10个处于独特的空间构象的氨基酸。
抗体包括其抗原结合片段，诸如骆驼Ig、IgNAR、Fab片段、Fab′片段、F(ab)′2片段、F(ab)′3片段、Fv、单链Fv蛋白(“scFv”)、双scFv、(scFv)2、小抗体、双抗体、三抗体、四抗体、二硫键稳定的Fv蛋白(“dsFv”)和单结构域抗体(sdAb，纳米抗体)以及全长抗体中负责抗原结合的部分。该术语还包括经基因工程改造的形式，诸如嵌合抗体(例如，人源化鼠抗体)、异源缀合物抗体(诸如，双特异性抗体)及其抗原结合片段。还请参见，Pierce Catalog andHandbook，1994-1995(Pierce Chemical Co.，Rockford，IL)；Kuby，J.，Immunology，第3版，W.H.Freeman&Co.，New York，1997。
如本领域技术人员将理解的并且如本文其它地方所描述的，完整的抗体包含两条重链和两条轻链。每条重链由可变区及第一、第二和第三恒定区组成，而每条轻链由可变区和恒定区组成。哺乳动物重链分类为α，δ，ε，γ和μ。哺乳动物轻链分类为λ或κ。包含α，δ，ε，γ和μ重链的免疫球蛋白分类为免疫球蛋白(Ig)A、IgD、IgE、IgG和IgM。完整的抗体形成“Y”形。Y的茎由结合在一起的两条重链的第二和第三恒定区(并且对于IgE和IgM，还有第四恒定区)组成，并且在铰链中形成了二硫键(链间)。重链γ、α和δ具有由三个串联(在一条线上)的Ig结构域组成的恒定区，和用于增加柔性的铰链区；重链μ和ε具有由四个免疫球蛋白结构域组成的恒定区。第二恒定区和第三恒定区分别称为“CH2结构域”和“CH3结构域”。Y的每条臂均包括与单条轻链的可变区和恒定区结合的单条重链的可变区和第一恒定区。轻链和重链的可变区负责抗原结合。
轻链和重链可变区含有被三个高变区中断的“框架”区，其也称为“互补决定区”或“CDR”。CDR可以通过常规方法，诸如通过根据Kabat等人(Wu，TT和Kabat，E.A.，JExpMed.132(2)：211-50，(1970)；Borden，P.和Kabat E.A.，PNAS，84：2440-2443(1987)；(参见，Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，U.S.Department ofHealth and Human Services，1991，其特此通过引用并入)的序列，或通过根据Chothia等人(Chothia，C.和Lesk，A.M.，JMol.Biol.，196(4)：901-917(1987)，Chothia，C.等人，Nature，342：877-883(1989))的结构来定义或鉴定。
不同的轻链或重链的框架区的序列在物种(诸如人)中是相对保守的。抗体的框架区，即组成轻链和重链的组合框架区，用于在三维空间中定位和对准CDR。CDR主要负责与抗原表位结合。每条链的CDR通常称为CDR1、CDR2和CDR3，从N端开始依次编号，并且通常也由特定CDR所在的链来进行标识。因此，位于抗体重链可变结构域中的CDR称为CDRH1、CDRH2和CDRH3，而位于抗体轻链可变结构域中的CDR称为CDRL1、CDRL2和CDRL3。具有不同特异性(即，针对不同抗原的不同结合位点)的抗体具有不同的CDR。尽管抗体之间CDR不同，但CDR内仅有限数量的氨基酸位置直接参与抗原结合。CDR内的这些位置称为特异性决定残基(SDR)。适于构建本文考虑的人源化BCMA CAR的轻链CDR的说明性实例包括但不限于SEQ IDNO：1-3中列出的CDR序列。适于构建本文考虑的人源化BCMA CAR的重链CDR的说明性实例包括但不限于SEQ ID NO：4-6中列出的CDR序列。
对“VH”或“VH”的提及是指免疫球蛋白重链的可变区，包括抗体、Fv、scFv、dsFv、Fab或如本文所公开的其它抗体片段的可变区。对“VL”或“VL”的提及是指免疫球蛋白轻链的可变区，包括抗体、Fv、scFv、dsFv、Fab或如本文所公开的其它抗体片段的可变区。
“单克隆抗体”是由B淋巴细胞的单个克隆或由单一抗体的轻链和重链基因已被转染到其中的细胞所产生的抗体。单克隆抗体通过本领域技术人员已知的方法，例如通过由骨髓瘤细胞与脾免疫细胞的融合制备杂交抗体形成细胞来产生。单克隆抗体包括人源化单克隆抗体。
“嵌合抗体”具有来自一个物种(诸如人)的框架残基和来自另一个物种(诸如小鼠)的CDR(其一般赋予抗原结合)。在特别优选的实施方案中，本文考虑的CAR包含作为嵌合抗体或其抗原结合片段的抗原特异性结合结构域。
“人源化”抗体是包括人框架区和来自非人(例如小鼠、大鼠或合成)免疫球蛋白的一个或多个CDR的免疫球蛋白。提供CDR的非人免疫球蛋白称为“供体”，而提供框架的人免疫球蛋白称为“受体”。
在特定实施方案中，鼠抗BCMA抗体或其抗原结合片段包括但不限于骆驼Ig(骆驼抗体(VHH))、Ig NAR、Fab片段、Fab′片段、F(ab)′2片段、F(ab)′3片段、Fv、单链Fv抗体(“scFv”)、双scFv、(scFv)2、微抗体、双抗体、三抗体、四抗体、二硫键稳定的Fv蛋白(“dsFv”)和单结构域抗体(sdAb，纳米抗体)。
如本文所用的“骆驼Ig”或“骆驼VHH”是指重链抗体的最小已知抗原结合单位(Koch-Nolte等人，FASEB J.，21：3490-3498(2007))。“重链抗体”或“骆驼抗体”是指含有两个VH结构域而不含轻链的抗体(Riechmann L.等人，J.Immunol.Methods 231：25-38(1999)；WO94/04678；WO94/25591；美国专利号6,005,079)。
“免疫球蛋白新抗原受体”的“IgNAR”是指鲨鱼免疫库中的一类抗体，该类抗体由一个可变新抗原受体(VNAR)结构域和五个恒定新抗原受体(CNAR)结构域的同型二聚体组成。IgNAR表示一些最小的已知的基于免疫球蛋白的蛋白质支架，并且高度稳定且具有有效的结合特性。固有的稳定性可以归因于以下两者：(i)基础的Ig支架，它与鼠抗体中发现的常规抗体VH和VL结构域相比较，具有大量带电的且亲水性表面暴露的残基；(ii)稳定包括环间二硫桥的互补决定区(CDR)环的结构特征，以及环内氢键的模式。
抗体的木瓜蛋白酶消化产生两个同一的抗原结合片段，称为″Fab″片段(各自具有单个抗原结合位点)和残留″Fc″片段(其名称反映了其易于结晶的能力)。胃蛋白酶处理得到F(ab′)2片段，其具有两个抗原结合位点并且仍然能够交联抗原。
″Fv″是含有完整的抗原结合位点的最小抗体片段。在一个实施例中，双链Fv种类由紧密非共价缔合的一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域的二聚体组成。在单链Fv(scFv)种类中，一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域可以通过柔性肽接头共价连接，使得轻链和重链可以缔合成与双链Fv种类中的结构类似的“二聚体”结构。在这种构型中每个可变结构域的三个高变区(HVR)相互作用以限定VH-VL二聚体表面上的抗原结合位点。六个HVR共同对抗体赋予抗原结合特异性。然而，即使单一可变结构域(或者仅包含对抗原具有特异性的三个HVR的Fv的一半)也具有识别并结合抗原的能力，但其亲合力低于整个结合位点。
Fab片段含有重链和轻链可变结构域并且还含有轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。Fab′片段与Fab片段的不同之处在于重链CH1结构域的羧基末端添加了几个残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab′-SH是本文对其中恒定结构域的一个或多个半胱氨酸残基带有游离硫醇基的Fab′的命名。F(ab′)2抗体片段起初以Fab′片段对的形式产生，所述Fab′片段对在Fab′片段之间具有铰链半胱氨酸。抗体片段的其它化学偶联物也是已知的。
术语“双抗体”是指具有两个抗原结合位点的抗体片段，所述片段包含与同一条多肽链(VH-VL)中的轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结构域(VH)。通过使用太短以至于不允许同一条链上的两个结构域之间配对的接头，迫使所述结构域与另一条链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点。双抗体可以是二价的或双特异性的。例如，EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等人，Nat.Med.9：129-134(2003)；以及Hollinger等人，PNAS USA90：6444-6448(1993)中更全面地描述了双抗体。三抗体和四抗体在Hudson等人，Nat.Med.9：129-134(2003)中也有描述。
“单结构域抗体”或“sdAb”或“纳米抗体”是指由抗体重链可变区(VH结构域)或抗体轻链可变区(VL结构域)组成的抗体片段(Holt，L.等人，2003，Trends inBiotechnology，21(11)：484-490)。
“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH结构域和VL结构域，其中这些结构域存在于单个多肽链中并且呈任一取向(例如，VL-VH或VH-VL)。一般来说，scFv多肽在VH结构域和VL结构域之间进一步包含多肽接头，该多肽接头使scFv能够形成所需结构以进行抗原结合。关于scFv片段的综述，参见，例如，Pluckthün，在The Pharmacology of MonoclonalAntibodies中，第113卷，Rosenburg和Moore编著，(Springer-Verlag，New York，1994)，第269-315页。
在优选的实施方案中，本文考虑的CAR包含作为鼠scFv的抗原特异性结合结构域。可以从对预期靶标具有特异性的杂交瘤的V区基因克隆单链抗体。此类杂交瘤的生产已成为常规。可用于克隆可变区重链(VH)和可变区轻链(VL)的技术已经例如在Orlandi等人，PNAS，1989；86：3833-3837中有描述。
在特定实施方案中，抗原特异性结合结构域是结合人BCMA多肽的鼠scFv。适于构建本文考虑的BCMA CAR的可变重链的说明性实例包括但不限于SEQ ID NO：8中列出的氨基酸序列。适于构建本文考虑的BCMACAR的可变轻链的说明性实例包括但不限于SEQ ID NO：7中列出的氨基酸序列。
本文提供的BCMA特异性结合结构域还包含一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR。此类CDR可以是选自轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3以及重链的CDRH1、CDRH2和CDRH3的非人CDR或改变的非人CDR。在某些实施方案中，BCMA特异性结合结构域包含(a)包含轻链CDRL1、轻链CDRL2和轻链CDRL3的轻链可变区，和(b)包含重链CDRH1、重链CDRH2和重链CDRH3的重链可变区。
5.3.2.接头
在某些实施方案中，本文考虑的CAR可以在各个结构域之间包含接头残基，例如，为该分子的适当间隔和构象而添加的接头残基。在特定实施方案中，接头是可变区连接序列。“可变区连接序列”是这样的氨基酸序列，其连接VH和VL结构域并提供与两个亚结合结构域的相互作用相容的间隔区功能，使得所得多肽保留了针对与包含相同轻链可变区和重链可变区的抗体相同的靶分子的特异性结合亲和力。本文考虑的CAR可以包含一个、两个、三个、四个或五个或更多个接头。在特定实施方案中，接头的长度为约1至约25个氨基酸，约5至约20个氨基酸或约10至约20个氨基酸，或介于中间的任何氨基酸长度。在一些实施方案中，接头长度为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22，23、24、25个或更多个氨基酸。
接头的说明性实例包括甘氨酸聚合物(G)n；甘氨酸-丝氨酸聚合物(G1-5S1-5)n，其中n是为至少1、2、3、4或5的整数；甘氨酸-丙氨酸聚合物；丙氨酸-丝氨酸聚合物；以及本领域已知的其它柔性接头。甘氨酸和甘氨酸-丝氨酸聚合物是相对非结构化的，并因此能够充当融合蛋白(诸如本文所述的CAR)的结构域之间的中性系链。甘氨酸接近甚至比丙氨酸显著更多的phi-psi空间，而且比具有较长侧链的残基所受的限制少得多(参见Scheraga，Rev.Computational Chem.11173-142(1992))。普通技术人员将认识到，在特定实施方案中，CAR的设计可以包括全部或部分柔性的接头，因此该接头可以包括柔性接头以及一个或多个赋予较低的柔性的结构以提供所需CAR结构的部分。
其它示例性接头包括但不限于以下氨基酸序列：GGG；DGGGS(SEQ ID NO：12)；TGEKP(SEQ ID NO：13)(参见，例如Liu等人，PNAS 5525-5530(1997))；GGRR(SEQ ID NO：14)(Pomerantz等人，1995，同上)；(GGGGS)n，其中n＝1、2、3、4或5，并且其中GGGGS标识为SEQID NO：15(Kim等人，PNAS 93，1156-1160(1996.)；EGKSSGSGSESKVD(SEQ ID NO：16)(Chaudhary等人，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87：1066-1070)；KESGSVSSEQLAQFRSLD(SEQ ID NO：17)(Bird等人，1988，Science 242：423-426)；GGRRGGGS(SEQ ID NO：18)；LRQRDGERP(SEQ ID NO：19)；LRQKDGGGSERP(SEQ ID NO：20)；LRQKd(GGGS)2ERP(SEQ ID NO：21)。可替代地，可以使用能够对DNA结合位点和肽本身建模的计算机程序(Desjarlais和Berg，PNAS 90：2256-2260(1993)，PNAS 91：11099-11103(1994)或通过噬菌体展示方法来合理地设计柔性接头。在一个实施方案中，接头包含以下氨基酸序列：GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO：22)(Cooper等人，Blood，101(4)：1637-1644(2003))。
5.3.3.间隔区结构域
在特定实施方案中，CAR的结合结构域后面是一个或多个“间隔区结构域”，其是指使抗原结合结构域移动远离效应细胞表面以实现适当的细胞/细胞接触、抗原结合和活化的区域(Patel等人，GeneTherapy，1999；6：412-419)。间隔区结构域可以源自天然、合成、半合成或重组来源。在某些实施方案中，间隔区结构域是免疫球蛋白的一部分，包括但不限于一个或多个重链恒定区，例如CH2和CH3。间隔区结构域可以包括天然存在的免疫球蛋白铰链区或改变的免疫球蛋白铰链区的氨基酸序列。
在一个实施方案中，间隔区结构域包含IgG1或IgG4的CH2和CH3结构域。
5.3.4.铰链结构域
CAR的结合结构域后面一般是一个或多个“铰链结构域”，其在使抗原结合结构域远离效应细胞表面定位以实现适当的细胞/细胞接触、抗原结合和活化中起作用。CAR一般在结合结构域和跨膜结构域(TM)之间包含一个或多个铰链结构域。铰链结构域可以源自天然、合成、半合成或重组来源。铰链结构域可以包括天然存在的免疫球蛋白铰链区或改变的免疫球蛋白铰链区的氨基酸序列。
“改变的铰链区”是指(a)具有多达30％的氨基酸变化(例如，多达25％、20％、15％、10％或5％的氨基酸取代或缺失)的天然存在的铰链区，(b)具有多达30％的氨基酸变化(例如多达25％、20％、15％、10％或5％的氨基酸取代或缺失)的长度为至少10个氨基酸(例如，至少12、13、14或15个氨基酸)的天然存在的铰链区的一部分，或(c)天然存在的铰链区中包含核心铰链区的部分(其长度可为4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸，或至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸)。在某些实施方案中，天然存在的免疫球蛋白铰链区中的一个或多个半胱氨酸残基可以被一个或多个其它氨基酸残基(例如，一个或多个丝氨酸残基)取代。改变的免疫球蛋白铰链区可替代地或另外地具有用另一个氨基酸残基(例如，丝氨酸残基)对野生型免疫球蛋白铰链区的脯氨酸残基的取代。
适合用于本文所述的CAR中的其它说明性铰链结构域包括源自1型膜蛋白(诸如CD8α、CD4、CD28和CD7)的胞外区的铰链区，这些铰链区可能是来自这些分子的野生型铰链区或者可以是改变的铰链区。在另一个实施方案中，铰链结构域包含CD8α铰链区。
5.3.5.跨膜结构域
跨膜(TM)结构域是CAR的一部分，其融合了细胞外结合部分和细胞内信号传导结构域，并将CAR锚定到免疫效应细胞的质膜上。TM结构域可以源自天然、合成、半合成或重组来源。TM结构域可以源自(即，至少包括以下的一个或多个跨膜区)：T细胞受体的α、β或ζ电链，CD3ε，CD3ζ，CD4，CD5，CD8α，CD9，CD16，CD22，CD27，CD28，CD33，CD37，CD45，CD64，CD80，CD86，CD134，CD137，CD152，CD154和PD-1。在特定实施方案中，TM结构域是合成的，并且主要包含疏水性残基，诸如亮氨酸和缬氨酸。
在一个实施方案中，本文考虑的CAR包含源自CD8α的TM结构域。在另一个实施方案中，本文考虑的CAR包含源自CD8α的TM结构域，以及连接CAR的TM结构域和细胞内信号传导结构域的优选长度为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸的短的寡肽或多肽接头。基于甘氨酸-丝氨酸的接头提供了特别合适的接头。
5.3.6.细胞内信号传导结构城
在特定实施方案中，本文考虑的CAR包含细胞内信号传导结构域。“细胞内信号传导结构域”是指CAR的一部分，其参与将有效BCMACAR与人BCMA多肽结合的信息转导至免疫效应细胞内部，以引发效应细胞功能，例如活化、细胞因子产生、增殖和细胞毒性活性(包括细胞毒性因子向被CAR结合的靶细胞的释放)，或随着抗原与细胞外CAR结构域结合而引发的其它细胞反应。
术语“效应子功能”是指免疫效应细胞的特化功能。T细胞的效应子功能，例如，可以是溶细胞活性或辅助活性，包括细胞因子的分泌。因此，术语“细胞内信号传导结构域”是指蛋白质的一部分，其转导效应子功能信号并指导细胞执行特化功能。虽然通常可以采用整个细胞内信号传导结构域，但是在许多情况下，不必使用整个结构域。就使用细胞内信号传导结构域的截短部分而言，只要截短部分转导效应子功能信号，就可以用它代替整个结构域。术语细胞内信号传导结构域意在包括细胞内信号传导结构域的足以转导效应子功能信号的任何截短部分。
已知仅通过TCR产生的信号不足以使T细胞完全活化，并且还需要次级或共刺激信号。因此，可以说T细胞活化是由两类不同的细胞内信号传导结构域介导的：通过TCR(例如，TCR/CD3复合物)启动抗原依赖性的初级活化作用的初级信号传导结构域和以非抗原依赖性的方式起作用以提供次级或共刺激信号的共刺激信号传导结构域。在优选的实施方案中，本文考虑的CAR包括细胞内信号传导结构域，其包含一个或多个“共刺激信号传导结构域”和“初级信号传导结构域”。
初级信号传导结构域以刺激性方式或以抑制性方式调控TCR复合物的初级活化。以刺激性方式起作用的初级信号传导结构域可以含有信号传导基序，其称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序或ITAM。
在本发明中特别有用的含ITAM的初级信号传导结构域的说明性实例包括源自TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的那些。在特别优选的实施方案中，CAR包含CD3ζ初级信号传导结构域和一个或多个共刺激信号传导结构域。细胞内的初级信号传导结构域和共刺激信号传导结构域可以按任何顺序串联连接至跨膜结构域的羧基端。
本文考虑的CAR包含一个或多个共刺激性信号传导结构域，以增强表达CAR受体的T细胞的功效和扩增。如本文所用，术语“共刺激信号传导结构域”或“共刺激结构域”是指共刺激分子的细胞内信号传导结构域。共刺激分子是除抗原受体或Fc受体以外的细胞表面分子，其在与抗原结合后提供T淋巴细胞的有效活化和功能所需的第二信号。此类共刺激分子的说明性实例包括CARD11、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54(ICAM)、CD83、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD150(SLAMF1)、CD152(CTLA4)、CD223(LAG3)、CD270(HVEM)、CD273(PD-L2)、CD274(PD-L1)、CD278(ICOS)、DAP10、LAT、NKD2C SLP76、TRIM和ZAP70。在一个实施方案中，CAR包含一个或多个选自由CD28、CD137和CD134组成的组的共刺激信号传导结构域以及CD3ζ初级信号传导结构域。
在另一个实施方案中，CAR包含CD28和CD137共刺激信号传导结构域和CD3ζ初级信号传导结构域。
在又一个实施方案中，CAR包含CD28和CD134共刺激信号传导结构域和CD3ζ初级信号传导结构域。
在一个实施方案中，CAR包含CD137和CD134共刺激信号传导结构域和CD3ζ初级信号传导结构域。
在特定实施方案中，本文考虑的CAR包含与B细胞上表达的BCMA多肽特异性地结合的鼠抗BCMA抗体或其抗原结合片段。
在一个实施方案中，CAR包含结合BCMA多肽的鼠抗BCMA scFv；源自选自由以下组成的组的多肽的跨膜结构域：T细胞受体的α、β或ζ链，CD3ε，CD3ζ，CD4，CD5，CD8α，CD9，CD16，CD22，CD27，CD28，CD33，CD37，CD45，CD64，CD80，CD86，CD 134，CD137，CD152，CD 154和PD1；以及来自选自由以下组成的组的共刺激分子的一个或多个细胞内共刺激信号传导结构域：CARD11、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54(ICAM)、CD83、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD150(SLAMF1)、CD152(CTLA4)、CD223(LAG3)、CD270(HVEM)、CD273(PD-L2)、CD274(PD-L1)、CD278(ICOS)、DAP10、LAT、NKD2C SLP76、TRIM和ZAP70；以及来自TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的初级信号传导结构域。
在一个实施方案中，CAR包含结合BCMA多肽的鼠抗BCMA scFv；源自选自由以下组成的组的多肽的跨膜结构域：T细胞受体的α、β或ζ链，CD3ε，CD3ζ，CD4，CD5，CD8α，CD9，CD16，CD22，CD27，CD28，CD33，CD37，CD45，CD64，CD80，CD86，CD 134，CD137，CD152，CD 154和PD1；以及来自选自由以下组成的组的共刺激分子的一个或多个细胞内共刺激信号传导结构域：CARD11、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54(ICAM)、CD83、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD150(SLAMF1)、CD152(CTLA4)、CD223(LAG3)、CD270(HVEM)、CD273(PD-L2)、CD274(PD-L1)、CD278(ICOS)、DAP10、LAT、NKD2C SLP76、TRIM和ZAP70；以及来自选自由以下组成的组的多肽的一个或多个初级信号传导结构域：TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b和CD66d。
在一个实施方案中，CAR包含结合BCMA多肽的鼠抗BCMA scFv；选自由以下组成的组的铰链结构域：IgG1铰链/CH2/CH3、IgG4铰链/CH2/CH3和CD8α铰链；源自选自由以下组成的组的多肽的跨膜结构域：T细胞受体的α、β或ζ链，CD3ε，CD3ζ，CD4，CD5，CD8α，CD9，CD 16，CD22，CD27、CD28，CD33，CD37，CD45，CD64，CD80，CD86，CD 134，CD137，CD152，CD 154和PD1；以及来自选自由以下组成的组的共刺激分子的一个或多个细胞内共刺激信号传导结构域：CARD11、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54(ICAM)、CD83、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD150(SLAMF1)、CD152(CTLA4)、CD223(LAG3)、CD270(HVEM)、CD273(PD-L2)、CD274(PD-L1)、CD278(ICOS)、DAP10、LAT、NKD2C SLP76、TRIM和ZAP70；以及来自TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的初级信号传导结构域。
在一个实施方案中，CAR包含结合BCMA多肽的鼠抗BCMA scFv；选自由以下组成的组的铰链结构域：IgG1铰链/CH2/CH3、IgG4铰链/CH2/CH3和CD8α铰链；源自选自由以下组成的组的多肽的跨膜结构域：T细胞受体的α、β或ζ链，CD3ε，CD3ζ，CD4，CD5，CD8α，CD9，CD 16，CD22，CD27、CD28，CD33，CD37，CD45，CD64，CD80，CD86，CD 134，CD137，CD152，CD 154和PD1；以及来自选自由以下组成的组的共刺激分子的一个或多个细胞内共刺激信号传导结构域：CARD11、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54(ICAM)、CD83、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD150(SLAMF1)、CD152(CTLA4)、CD223(LAG3)、CD270(HVEM)、CD273(PD-L2)、CD274(PD-L1)、CD278(ICOS)、DAP10、LAT、NKD2C SLP76、TRIM和ZAP70；以及来自选自由以下组成的组的多肽的一个或多个初级信号传导结构域：TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b和CD66d。
在一个实施方案中，CAR包含结合BCMA多肽的鼠抗BCMA scFv；选自由以下组成的组的铰链结构域：IgG1铰链/CH2/CH3、IgG4铰链/CH2/CH3和CD8α铰链；源自选自由以下组成的组的多肽的跨膜结构域：T细胞受体的α、β或ζ链，CD3ε，CD3ζ，CD4，CD5，CD8α，CD9，CD 16，CD22，CD27、CD28，CD33，CD37，CD45，CD64，CD80，CD86，CD 134，CD137，CD152，CD 154和PD1；将CAR的TM结构域连接至细胞内信号传导结构域的优选长度为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸的短的寡肽或多肽接头；以及来自选自由以下组成的组的共刺激分子的一个或多个细胞内共刺激信号传导结构域：CARD11、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54(ICAM)、CD83、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD150(SLAMF1)、CD152(CTLA4)、CD223(LAG3)、CD270(HVEM)、CD273(PD-L2)、CD274(PD-L1)、CD278(ICOS)、DAP10、LAT、NKD2C SLP76、TRIM和ZAP70；以及来自TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的初级信号传导结构域。
在一个实施方案中，CAR包含结合BCMA多肽的鼠抗BCMA scFv；选自由以下组成的组的铰链结构域：IgG1铰链/CH2/CH3、IgG4铰链/CH2/CH3和CD8α铰链；源自选自由以下组成的组的多肽的跨膜结构域：T细胞受体的α、β或ζ链，CD3ε，CD3ζ，CD4，CD5，CD8α，CD9，CD 16，CD22，CD27、CD28，CD33，CD37，CD45，CD64，CD80，CD86，CD 134，CD137，CD152，CD 154和PD1；将CAR的TM结构域连接至细胞内信号传导结构域的优选长度为1、2、3、4、5、6、7、8、9，或10个氨基酸的短的寡肽或多肽接头；以及来自选自由以下组成的组的共刺激分子的一个或多个细胞内共刺激信号传导结构域：CARD11、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54(ICAM)、CD83、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD150(SLAMF1)、CD152(CTLA4)、CD223(LAG3)、CD270(HVEM)、CD273(PD-L2)、CD274(PD-L1)、CD278(ICOS)、DAP10、LAT、NKD2C SLP76、TRIM和ZAP70；以及来自选自由以下组成的组的多肽的一个或多个初级信号传导结构域：TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b和CD66d。
在特定实施方案中，CAR包含结合BCMA多肽的鼠抗BCMA scFv；包含IgG1铰链/CH2/CH3多肽和CD8α多肽的铰链结构域；包含约3至约10个氨基酸的多肽接头的CD8α跨膜结构域；CD137细胞内共刺激信号传导结构域；以及CD3ζ初级信号传导结构域。
在特定实施方案中，CAR包含结合BCMA多肽的鼠抗BCMA scFv；包含CD8α多肽的铰链结构域；包含约3至约10个氨基酸的多肽接头的CD8α跨膜结构域；CD134细胞内共刺激信号传导结构域；以及CD3ζ初级信号传导结构域。
在特定实施方案中，CAR包含结合BCMA多肽的鼠抗BCMA scFv；包含CD8α多肽的铰链结构域；包含约3至约10个氨基酸的多肽接头的CD8α跨膜结构域；CD28细胞内共刺激信号传导结构域；以及CD3ζ初级信号传导结构域。
在特定实施方案中，CAR包含结合BCMA多肽的鼠抗BCMA scFv；包含CD8α多肽的铰链结构域；CD8α跨膜结构域；CD137(4-1BB)细胞内共刺激信号传导结构域；以及CD3ζ初级信号传导结构域。
而且，与未修饰的T细胞或经修饰为表达其它CAR的T细胞相比较，本文考虑的CAR的设计在表达CAR的T细胞中实现了改善的扩增、长期持久性和可耐受的细胞毒性。
5.4.多肽
本发明部分地考虑了CAR多肽及其片段、包含所述CAR多肽及其片段的细胞和组合物，以及表达多肽的载体。在优选的实施方案中，提供了包含一个或多个如SEQ ID NO：9中所列出的CAR的多肽。
除非指出相反，并且根据常规含义，即作为氨基酸序列，“多肽”、“多肽片段”、“肽”和“蛋白质”可以互换使用。多肽不限于具体长度，例如，它们可以包含全长蛋白质序列或全长蛋白质的片段，并且可以包括多肽的翻译后修饰，例如糖基化、乙酰化、磷酸化等，以及本领域中已知的天然存在的和非天然存在的其它修饰。在各种实施方案中，本文考虑的CAR多肽在蛋白质的N-末端包含信号(或前导)序列，其共翻译或翻译后指导蛋白质的转移。可用于本文公开的CAR中的合适信号序列的说明性实例包括但不限于IgG1重链信号序列和CD8α信号序列。可以使用多种众所周知的重组和/或合成技术中的任何一种来制备多肽。本文考虑的多肽具体地涵盖本公开的CAR，或具有如本文公开的CAR的一个或多个氨基酸的缺失、添加和/或取代的序列。
如本文中所用的“分离的肽”或“分离的多肽”等是指肽或多肽分子从细胞环境中，以及从与细胞其它组分的相关联中的体外分离和/或纯化，即它不与体内物质显著相关联。类似地，“分离的细胞”是指已经从体内组织或器官获得的并且基本上不含细胞外基质的细胞。
多肽包括“多肽变体”。多肽变体与天然存在的多肽的不同之处可在于一个或多个取代、缺失、添加和/或插入。此类变体可以是天然存在的，或者可以是合成产生的，例如，通过修饰一个或多个以上多肽序列而产生的。例如，在特定实施方案中，可能期望通过将一个或多个取代、缺失、添加和/或插入引入到CAR多肽的结合结构域、铰链、TM结构域、共刺激信号传导结构域或初级信号传导结构域中来改善CAR的结合亲和力和/或其它生物学性质。优选地，本发明的多肽包括与其具有至少约65％、70％、75％、85％、90％、95％、98％或99％氨基酸同一性的多肽。
多肽包括“多肽片段”。多肽片段是指具有氨基端缺失、羧基端缺失，和/或内部缺失或者天然存在或重组产生的多肽的取代的多肽，其可以是单体或多聚体。在某些实施方案中，多肽片段可以包含长度为至少5至约500个氨基酸的氨基酸链。应理解的是，在某些实施方案中，片段长度为至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、150、200、250、300、350、400或450个氨基酸。特别有用的多肽片段包括功能结构域，包括抗体的抗原结合结构域或片段。在鼠抗BCMA抗体的情况下，有用的片段包括但不限于：CDR区、重链或轻链的CDR3区；重链或轻链的可变区；抗体链或可变区的包含两个CDR的部分；等等。
也可以使多肽与接头或其它序列框内融合或缀合，以便于合成、纯化或鉴定该多肽(例如，多聚组氨酸)，或者以增强该多肽与固相支持物的结合。
如上所述，本发明的多肽可以以包括氨基酸取代、缺失、截短和插入在内的多种方式来加以改变。用于此类操纵的方法在本领域中一般是已知的。例如，可以通过DNA中的突变来制备参考多肽的氨基酸序列变体。用于诱变和核苷酸序列改变的方法是本领域众所周知的。参见，例如，Kunkel(1985，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.82：488-492)，Kunkel等人，(1987，Methods in Enzymol，154：367-382)，美国专利号4,873,192，Watson，J.D.等人，(Molecular Biology of the Gene，第四版，Benjamin/Cummings，Menlo Park，Calif.，1987)及其中引用的参考文献。在Dayhoff等人的模型，(1978)Atlas of Protein Sequenceand Structure(Natl.Biomed.Res.Found.，Washington，D.C.)中可以找到有关不影响目标蛋白质生物学活性的适当氨基酸取代的指南。
在某些实施方案中，变体将含有保守性取代。“保守性取代”是其中一种氨基酸被具有相似性质的另一种氨基酸取代，使得肽化学领域的技术人员可以预计多肽的二级结构和亲水性基本不变的保守性取代。可以对本发明的多核苷酸和多肽的结构进行修饰，并且仍然获得编码具有期望特性的变体或衍生多肽的功能分子。当期望改变多肽的氨基酸序列以产生本发明的等同或甚至改进的变体多肽时，本领域技术人员例如可以改变编码DNA序列的一个或多个密码子，例如根据表1的密码子。
表1-氨基酸密码子
Figure BDA0002971836970000221
使用本领域众所周知的计算机程序，诸如DNASTARTM软件，可以找到确定哪些氨基酸残基可以被取代、插入或缺失而不消除生物活性的指南。优选地，本文公开的蛋白质变体中的氨基酸变化是保守性的氨基酸变化，即，带类似电荷或不带电荷的氨基酸的取代。保守性的氨基酸变化涉及在其侧链上相关的氨基酸家族之一的取代。天然存在的氨基酸一般分为四个家族：酸性氨基酸(天冬氨酸盐、谷氨酸盐)、碱性氨基酸(赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、非极性氨基酸(丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)和不带电荷的极性氨基酸(甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸)。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时被共同分类为芳香族氨基酸。在肽或蛋白质中，氨基酸的合适的保守性取代是本领域技术人员已知的，并且一般可以在不改变所得分子的生物学活性的情况下制作出来。本领域技术人员认识到，一般而言，多肽非必需区域中的单个氨基酸取代基本上不会改变生物学活性(参见，例如，Watson等人Molecular Biology of the Gene，第4版，1987，The Benjamin/Cummings Pub.Co.，第224页)。示例性的保守性取代在美国临时专利申请号61/241,647中有描述，其公开内容通过引用并入本文。
在制作此类变化时，可以考虑氨基酸的亲水指数。亲水氨基酸指数在赋予蛋白质相互作用生物学功能中的重要性在本领域中是普遍理解的(Kyte和Doolittle，1982，通过引用并入本文)。已基于疏水性和电荷特性为每种氨基酸分配了亲水指数(Kyte和Doolittle，1982)。这些值为：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/半胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸盐(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸盐(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；以及精氨酸(-4.5)。
在本领域中已知某些氨基酸可以被其它具有相似亲水指数或得分的氨基酸取代，并且仍然产生具有相似生物学活性的蛋白质，即，仍然获得生物学功能等效的蛋白质。在制作此类变化时，优选亲水指数在±2以内的氨基酸的取代，特别优选亲水指数在±1以内的氨基酸的取代，且甚至更特别优选亲水指数在±0.5以内的氨基酸的取代。在本领域中还应理解，可以基于亲水性有效地制作相似氨基酸的取代。
如美国专利号4,554,101中所详述的，已为氨基酸残基分配了以下亲水性值：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸盐(+3.0±1)；谷氨酸盐(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。应理解的是，可以将一种氨基酸用具有相似亲水性值的另一种氨基酸来取代，并且仍然获得生物学上等效的，尤其是免疫学上等效的蛋白质。在制作此类变化时，优选亲水性值在±2以内的氨基酸的取代，特别优选亲水性值在±1以内的氨基酸的取代，且甚至更特别优选亲水性值在±0.5以内的氨基酸的取代。
如上所概述，氨基酸取代可以基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如它们的疏水性、亲水性、电荷、大小等。
多肽变体进一步包括糖基化形式、与其它分子的聚集缀合物以及与无关化学部分(例如，聚乙二醇化分子)的共价缀合物。如本领域已知的，可以通过将官能团连接到在氨基酸链中或在N端或C端残基上发现的基团来制备共价变体。变体还包括等位基因变体、物种变体和突变蛋白。不影响蛋白质功能活性的区域的截短或缺失也是变体。
在一个实施方案中，在期望表达两个或更多个多肽的情况下，可以将编码它们的多核苷酸序列用如本文别处所讨论的IRES序列隔开。在另一个实施方案中，两个或更多个多肽可以表达为包含一个或多个自我切割多肽序列的融合蛋白。
本发明的多肽包括融合多肽。在优选的实施方案中，提供了融合多肽和编码融合多肽的多核苷酸，例如CAR。融合多肽和融合蛋白是指具有至少两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个或更多个多肽区段的多肽。融合多肽通常将C端连接至N端，但是它们也可以将C端连接至C端、N端连接至N端，或N端连接至C端。融合蛋白的多肽可以呈任何顺序或指定顺序。融合多肽或融合蛋白还可以包括保守性修饰的变体、多态性变体、等位基因、突变体、子序列和种间同源物，只要保留了融合多肽的所需转录活性即可。融合多肽可以通过化学合成方法或通过两个部分之间的化学键联来产生，或者一般可以使用其它标准技术来制备。如本文别处所讨论的，构成融合多肽的结扎的DNA序列与合适的转录或翻译控制元件可操作地连接。
在一个实施方案中，融合伴侣包含有助于使蛋白以比天然重组蛋白更高的产率表达的序列(表达增强子)。可以选择其它融合伴侣，以增加蛋白质的溶解度或者使蛋白质能够靶向至预期的细胞内区室或者促进融合蛋白通过细胞膜的转运。
融合多肽可进一步包含在本文所述的每个多肽结构域之间的多肽切割信号。另外，可以将多肽位点置于任何接头肽序列中。示例性的多肽切割信号包括多肽切割识别位点，诸如蛋白酶切割位点、核酸酶切割位点(例如，罕见的限制酶识别位点、自我切割的核酶识别位点)和自我切割的病毒寡肽(参见deFelipe和Ryan，2004.Traffic，5(8)；616-26)。
合适的蛋白酶切割位点和自我切割肽是技术人员已知的(参见，例如，在Ryan等人，1997.J.Gener.Virol.78，699-722；Scymczak等人(2004)Nature Biotech.5，589-594中)。示例性的蛋白酶切割位点包括但不限于：马铃薯y病毒(potyvirus)NIa蛋白酶(例如，烟草蚀纹病毒蛋白酶)、马铃薯y病毒HC蛋白酶、马铃薯y病毒P1(P35)蛋白酶、大麦花叶病毒(byovirus)NIa蛋白酶、大麦花叶病毒RNA-2编码的蛋白酶、口蹄疫病毒L蛋白酶、肠病毒2A蛋白酶、鼻病毒2A蛋白酶、小核糖核酸病毒3C蛋白酶、豇豆花叶病毒24K蛋白酶、线虫传多面体病毒24K蛋白酶、RTSV(水稻东格鲁球形病毒)3C样蛋白酶、PYVF(欧防风黄点病毒)3C样蛋白酶、肝素、凝血酶、Xa因子和肠激酶的切割位点。由于它的切割严格性高，TEV(烟草蚀纹病毒)蛋白酶切割位点在一个实施方案中是优选的，例如EXXYXQ(G/S)(SEQ ID NO：23)，例如ENLYFQG(SEQ ID NO：24)和ENLYFQS(SEQ ID NO：25)，其中X表示任何氨基酸(TEV的切割发生在Q与G或者Q与S之间)。
在特定实施方案中，自我切割肽包括获自马铃薯y病毒和心病毒2A肽、FMDV(口蹄疫病毒)、马鼻炎A病毒、Thosea asigna病毒和猪捷申病毒的那些多肽序列。
在某些实施方案中，自我切割多肽位点包含2A或2A样位点、序列或结构域(Donnelly等人，2001.J.Gen.Virol.82：1027-1041)。
表2：示例性的2A位点包括以下序列：
Figure BDA0002971836970000241
在优选的实施方案中，本文考虑的多肽包含CAR多肽。
5.5.多核苷酸
在优选的实施方案中，提供了编码一种或多种CAR多肽的多核苷酸，例如SEQ IDNO：10。如本文所用，术语“多核苷酸”或“核酸”是指信使RNA(mRNA)、RNA、基因组RNA(gRNA)、RNA(RNA(+))、负链RNA(RNA(-))、基因组DNA(gDNA)、互补DNA(cDNA)或重组DNA。多核苷酸包括单链和双链多核苷酸。优选地，本发明的多核苷酸包括与本文所述的任何参考序列(参见，例如，序列表)具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的多核苷酸或变体，通常其中该变体保持参考序列的至少一种生物学活性。在各种说明性实施方案中，本发明部分地考虑了包含表达载体、病毒载体和转移质粒的多核苷酸，以及包含所述多核苷酸的组合物和细胞。
在特定实施方案中，本发明提供了编码本发明多肽的至少约5、10、25、50、100、150、200、250、300、350、400、500、1000、1250、1500、1750或2000个或更多个，以及所有中间长度的连续氨基酸残基的多核苷酸。容易理解的是在此上下文中，“中间长度”意指介于引用值之间的任何长度，诸如6、7、8、9等，101、102、103等；151、152、153等；201、202、203等。
如本文所用，术语“多核苷酸变体”和“变体”等是指与参考多核苷酸序列显示出实质序列同一性的多核苷酸或在下文定义的严格条件下与参考序列杂交的多核苷酸。这些术语包括与参考多核苷酸相比较，其中一个或多个核苷酸已添加或缺失，或被不同核苷酸置换的多核苷酸。在这方面，本领域众所周知，可以对参考多核苷酸制作出包括突变、添加、缺失和取代在内的某些改变，由此经改变的多核苷酸保留参考多核苷酸的生物学功能或活性。
如本文所用，叙述“序列同一性”或例如包含“与.....50％同一的序列”是指在核苷酸对核苷酸的基础上或者在氨基酸对氨基酸的基础上所述序列在比较窗口上同一的程度。因此，可通过下述方式计算“序列同一性百分比”：在比较窗口上对两个最佳比对序列进行比较，确定在这两个序列中出现同一的核酸碱基(例如，A、T、C、G、I)或同一的氨基酸残基(例如，Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)的位置的数目以得到匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗口中位置的总数(即，窗口大小)，并将结果乘以100以得到序列同一性百分比。包括与本文所述的任何参考序列具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的核苷酸和多肽，通常其中多肽变体保持参考多肽的至少一种生物学活性。
用于描述两个或更多个多核苷酸或多肽之间的序列关系的术语包括“参考序列”、“比较窗口”、“序列同一性”、“序列同一性百分比”和“实质同一性”。“参考序列”的长度为至少12个，但经常为15至18个，并且常常为至少25个单体单元(包括核苷酸和氨基酸残基)。由于两个多核苷酸可各自包含(1)在两个多核苷酸之间相似的序列(即，仅完整多核苷酸序列的一部分)，以及(2)在两个多核苷酸之间有差异的序列，因此在两个(或更多个)多核苷酸之间的序列比较通常通过在“比较窗口”上对两个多核苷酸的序列进行比较来鉴定和比较具有序列相似性的局部区域。“比较窗口”是指至少6个，通常约50至约100个，更通常约100至约150个连续位置的概念性区段，其中在将序列与具有相同数目的连续位置的参考序列最佳地比对之后，对这两个序列进行比较。与参考序列(其不包括添加或缺失)相比较，比较窗口可包含约20％或更少的添加或缺失(即，空位)，以便对这两个序列进行最佳地比对。可以通过计算机化算法实现方案(Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group，575Science Drive Madison，WI，USA)，或者通过由所选各种方法中的任一种所产生的检查和最佳比对(即，在比较窗口上产生最高的同源性百分比)来进行用于比对比较窗口的序列最佳比对。还可以参考例如Altschul等人，1997，Nucl.Acids Res.25：3389所公开的BLAST程序家族。序列分析的详细讨论可以在Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&SonsInc，1994-1998，第15章中的19.3单元中找到。
如本文所用，“分离的多核苷酸”是指已经从在天然存在的状态下侧接于其的序列中纯化出来的多核苷酸，例如已经从正常情况下与其相邻的序列中取出的DNA片段。“分离的多核苷酸”还指互补DNA(cDNA)、重组DNA或其它自然界中不存在而是由人工制成的多核苷酸。
描述多核苷酸的取向的术语包括：5′(正常情况下是具有游离磷酸酯基团的多核苷酸的末端)和3′(正常情况下是具有游离羟基(OH)基团的多核苷酸的末端)。多核苷酸序列可以5′至3′取向或3′至5′取向进行注解。对于DNA和mRNA，将5′至3′链称为“有义”、“正”或“编码”链，因为它的序列与前信使(premRNA)的序列是同一的[但是在RNA中为尿嘧啶(U)，在DNA中为胸腺嘧啶(T)以外]。对于DNA和mRNA，互补的3′至5′链(其是RNA聚合酶转录的链)被称为“模板”、“反义”、“负”或“非编码”链。如本文所用，术语“反向取向”是指以3′至5′取向书写的5′至3′序列或者以5′至3′取向写出的3′至5′序列。
术语“互补”和“互补性”是指通过碱基配对法则相关联的多核苷酸(即，核苷酸序列)。例如，DNA序列5′A G T C A T G 3′的互补链是3′T C A G T A C 5′。常常将后一序列书写为反向互补序列，其中5′末端在左侧，而3′末端在右侧，5′C A T G A CT 3′。将等同于其反向互补序列的序列称为回文序列。互补性可以是“部分的”，其中仅核酸的一些碱基根据碱基配对法则匹配。或者，核酸之间可以存在“完全”或“全部”互补性。
而且，本领域的普通技术人员将理解，由于遗传密码的简并性，存在许多编码如本文所述的多肽或其变体片段的核苷酸序列。这些多核苷酸中的一些与任何天然基因的核苷酸序列具有最小同源性。然而，本发明特别考虑了由于密码子使用的差异而变化的多核苷酸，例如针对人和/或灵长类密码子选择而优化的多核苷酸。进一步地，也可以使用包含本文提供的多核苷酸序列的基因的等位基因。等位基因是由于一种或多种突变(诸如，核苷酸的缺失、添加和/或取代)而改变的内源基因。
如本文所用的术语“核酸盒”是指载体内可以表达RNA并随后表达蛋白质的基因序列。核酸盒含目标基因，例如CAR。核酸盒在载体内按位置循序地定向，以使得盒中的核酸可被转录成RNA，并且在必要时可被翻译成蛋白质或多肽，经受在转化细胞中发挥活性所需的适当翻译后修饰，并可被易位到适当区室中以通过靶向适当的细胞内区室或分泌到细胞外区室中而发挥生物学活性。优选地，所述盒具有适于容易地插入到载体中的3′和5′末端，例如，它在每个末端都具有限制性核酸内切酶位点。在本发明的优选实施方案中，核酸盒含有用于治疗B细胞恶性肿瘤的嵌合抗原受体的序列。可以将所述盒取出并作为单个单元插入到质粒或病毒载体中。
在特定实施方案中，多核苷酸包括至少一种目标多核苷酸。如本文所用，术语“目标多核苷酸”是指插入到期望表达的表达载体中的编码多肽(即，目标多肽)的多核苷酸。载体可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个目标多核苷酸。在某些实施方案中，目标多核苷酸编码在疾病或病症的治疗或预防中提供治疗作用的多肽。目标多核苷酸和由其编码的多肽包括编码野生型多肽的多核苷酸及其功能变体和片段。在特定实施方案中，功能变体与相应的野生型参考多核苷酸或多肽序列具有至少80％、至少90％、至少95％或至少99％的同一性。在某些实施方案中，功能变体或片段具有相应野生型多肽的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的生物学活性。
在一个实施方案中，目标多核苷酸不编码多肽，而是充当转录miRNA、siRNA或shRNA、核酶或其它抑制性RNA的模板。在各种其它实施方案中，多核苷酸包含编码CAR的目标多核苷酸和一个或多个另外的目标多核苷酸，包括但不限于抑制性核酸序列，包括但不限于：siRNA、miRNA、shRNA和核酶。
如本文所用，术语“siRNA”或“短干扰RNA”是指动物中介导序列特异性的转录后基因沉默、翻译抑制、转录抑制或表观遗传RNAi的过程的短多核苷酸序列(Zamore等人，2000，Cell，101，25-33；Fire等人，1998，Nature，391，806；Hamilton等人，1999，Science，286，950-951；Lin等人，1999，Nature，402，128-129；Sharp，1999，Genes&Dev.，13，139-141；以及Strauss，1999，Science，286，886)。在某些实施方案中，siRNA包含具有相同数目的核苷的第一链和第二链；然而，第一链和第二链是偏移的，使得第一链和第二链上的两个末端核苷不与互补链上的残基配对。在某些情况下，未配对的两个核苷是胸苷残基。siRNA应包括与靶基因具有足够同源性的区域，并且就核苷酸而言应具有足够的长度，使得siRNA或其片段可以介导靶基因的下调。因此，siRNA包括与靶RNA至少部分互补的区域。siRNA与靶标之间不一定存在完美的互补性，但对应关系(correspondence)必须足以使siRNA或其切割产物能够指导序列特异性沉默，诸如通过靶标RNA的RNAi切割来指导序列特异性沉默。与靶链的互补性或同源性程度在反义链中最为关键。虽然常常期望完美的互补性，特别是在反义链中，但是一些实施方案包括相对于靶RNA的一个或多个，但优选10、8、6、5、4、3、2个或更少的错配。错配在末端区域中最为耐受，并且如果存在，则优选处于一个或多个末端区域中，例如在5′和/或3′端的6、5、4或3个核苷酸内。有义链仅需要与反义链充分互补就能维持分子的整体双链特征。
另外，siRNA可以被修饰或包括核苷类似物。siRNA的单链区域可以被修饰或包括核苷类似物，例如，发夹结构的一个或多个未配对区域，例如连接两个互补区域的区域，可以具有修饰或核苷类似物。为稳定siRNA的一个或多个3′或5′端(例如，抵抗核酸外切酶)，或为促进反义siRNA试剂进入RISC中的修饰也是有用的。修饰可以包括C3(或C6、C7、C12)氨基接头；硫醇接头；羧基接头；非核苷酸间隔区(C3、C6、C9、C12、无碱基(abasic)、三乙二醇、六乙二醇)；作为亚磷酰胺出现并且具有另一个DMT保护的羟基，从而允许在RNA合成过程中进行多次偶联的特殊的生物素或荧光素试剂。siRNA的每条链的长度可以等于或小于30、25、24、23、22、21或20个核苷酸。该链长度优选为至少19个核苷酸。例如，每条链的长度可以在21至25个核苷酸之间。优选的siRNA具有17、18、19、29、21、22、23、24或25个核苷酸对的双链体区域，以及一个或多个2-3个核苷酸的突出端，优选一个或两个2-3个核苷酸的3′突出端。
如本文所用，术语“miRNA”或“微RNA”是指通常从～70个核苷酸的折回RNA前体结构(称为pre-miRNA)中切除的20-22个核苷酸的小非编码RNA。miRNA根据miRNA与靶标之间的互补程度，以两种方式之一对其靶标进行负调控。首先，与编码蛋白质的mRNA序列完美或几乎完美互补结合的miRNA诱导RNA介导的干扰(RNAi)途径。通过结合其mRNA靶标的3′非翻译区(UTR)内的非完美互补位点而发挥其调控作用的miRNA，通过与用于RNAi途径的RISC复合物类似或可能同一的RISC复合物在转录后明显地在翻译水平上抑制靶基因的表达。与翻译控制一致，使用这种机制的miRNA降低了其靶基因的蛋白质水平，但这些基因的mRNA水平受到的影响很小。miRNA涵盖天然存在的miRNA以及可以特异性地靶向任何mRNA序列的人工设计的miRNA。例如，在一个实施方案中，技术人员可以设计表达为人miRNA(例如，miR-30或miR-21)初级转录物的短发夹RNA构建体。这种设计在发夹结构上增加了Drosha加工位点，并且已证实会大大提高敲低效率(Pusch等人，2004)。发夹茎由22-nt的dsRNA(例如，反义序列与所需靶标具有完美的互补性)和来自人miR的15-19-nt的环组成。与无微RNA的常规shRNA设计相比，在发夹的任一侧或两侧上添加miR环和miR30侧翼序列导致表达的发夹的Drosha和Dicer加工增加高于10倍。增加的Drosha和Dicer加工转化为更大的siRNA/miRNA产量和表达的发夹的更高效力。
如本文所用，术语“shRNA”或“短发夹RNA”是指由单条自我互补的RNA链形成的双链结构。对于抑制而言，优选含有与靶基因的编码序列或非编码序列的一部分同一的核苷酸序列的shRNA构建体。还已发现相对于靶序列具有插入、缺失和单点突变的RNA序列对于抑制有效。优选抑制性RNA与靶基因的部分之间高于90％的序列同一性，或甚至100％的序列同一性。在某些优选的实施方案中，shRNA的双链体形成部分的长度为至少20、21或22个核苷酸的长度，例如，其大小对应于通过Dicer依赖性切割产生的RNA产物。在某些实施方案中，shRNA构建体的长度为至少25、50、100、200、300或400个碱基。在某些实施方案中，shRNA构建体的长度为400-800个碱基。shRNA构建体高度耐受环序列和环大小的变异。
如本文所用，术语“核酶”是指能够对靶mRNA进行位点特异性切割的催化活性RNA分子。已经描述了几种亚型，例如锤头状核酶和发夹状核酶。核酶的催化活性和稳定性可以通过在非催化碱基处用脱氧核糖核苷酸取代核糖核苷酸而得以提高。虽然可以使用在位点特异性识别序列处切割mRNA的核酶来破坏特定的mRNA，但是优选使用锤头状核酶。锤头状核酶在由与靶mRNA形成互补碱基对的侧翼区所决定的位置处切割mRNA。唯一的要求是靶mRNA具有以下两个碱基的序列：5′-UG-3′。锤头状核酶的构建和产生在本领域中是众所周知的。
递送包含siRNA、miRNA、shRNA或核酶的目标多核苷酸的优选方法包括一个或多个调控序列，诸如强组成型pol III，例如人U6 snRNA启动子、小鼠U6 snRNA启动子、人和小鼠H1 RNA启动子以及人tRNA-val启动子或强组成型pol II启动子，如本文别处所述。
不管编码序列本身的长度如何，本发明的多核苷酸都可以与其它DNA序列，诸如启动子和/或增强子，非翻译区(UTR)，信号序列，Kozak序列，聚腺苷酸化信号，另外的限制酶位点、多个克隆位点，内部核糖体进入位点(IRES)，重组酶识别位点(例如，LoxP、FRT和Att位点)，终止密码子，转录终止信号，以及如本文别处所公开的或如本领域已知的编码自我切割多肽、表位标签的多核苷酸组合在一起，以使它们的总长度可以有很大变化。因此，考虑了可以采用几乎任何长度的多核苷酸片段，总长度优选地受限制于预期的重组DNA方案中的制备和使用的容易性。
可以使用本领域已知和可获得的多种完善的技术中的任何一种来制备、操纵和/或表达多核苷酸。为了表达预期多肽，可以将编码该多肽的核苷酸序列插入到适当的载体中。载体的实例是质粒、自主复制序列和转座元件。另外的示例性载体包括但不限于质粒、噬菌粒、粘粒、人工染色体(诸如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC))、噬菌体(诸如λ噬菌体或M13噬菌体)和动物病毒。可用作载体的动物病毒类别的实例包括但不限于逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(例如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒和乳多泡病毒(例如SV40)。表达载体的实例是用于在哺乳动物细胞中表达的pClneo载体(Promega)；用于在哺乳动物细胞中进行慢病毒介导的基因转移和表达的pLenti4/V5-DESTTM、pLenti6/V5-DESTTM和pLenti6.2/V5-GW/lacZ(Invitrogen)。在特定实施方案中，可以将本文公开的嵌合蛋白的编码序列结扎到此类表达载体中，以在哺乳动物细胞中表达嵌合蛋白。
在一个实施方案中，编码本文考虑的CAR的载体包含SEQ ID NO：36中列出的多核苷酸序列。
在特定实施方案中，载体是游离型载体或维持在染色体外的载体。如本文所用，术语“游离型”是指能够复制而不整合到宿主的染色体DNA中并且没有从分裂的宿主细胞中逐渐损失的载体，这也意味着所述载体在染色体外或游离地复制。将该载体工程改造为携带编码来自嗜淋巴细胞性疱疹病毒或γ疱疹病毒、腺病毒、SV40、牛乳头瘤病毒或酵母的DNA复制起点或“ori”，特别是对应于EBV的oriP的嗜淋巴细胞性疱疹病毒或γ疱疹病毒的复制起点的序列。在一个特定方面，所述嗜淋巴细胞性疱疹病毒可以是爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)、卡波西肉瘤疱疹病毒(KSHV)、松鼠猴疱疹病毒(HS)或马立克氏病病毒(MDV)。爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)和卡波西氏肉瘤疱疹病毒(KSHV)也是γ疱疹病毒的实例。通常，宿主细胞包含激活复制的病毒复制反式激活蛋白。
表达载体中存在的“控制元件”或“调控序列”是载体的那些非翻译区-复制起点、选择盒、启动子、增强子、翻译启动信号(Shine Dalgarno序列或Kozak序列)内含子、聚腺苷酸化序列、5′和3′非翻译区-它们与宿主细胞蛋白相互作用以进行转录和翻译。此类元件的强度和特异性可能有所不同。根据所利用的载体系统和宿主，可以使用许多合适的转录和翻译元件，包括遍在启动子和诱导型启动子。
在特定实施方案中，用于实践本发明的载体包括但不限于表达载体和病毒载体，将包括外源、内源或异源控制序列，诸如启动子和/或增强子。“内源”控制序列是与基因组中的给定基因天然连接的控制序列。“外源”控制序列是通过遗传操纵的手段(即，分子生物学技术)与基因并列放置，使得该基因的转录受所连接的增强子/启动子指导的控制序列。“异源”控制序列是来自与正被遗传操纵的细胞不同的物种的外源序列。
如本文所用的术语“启动子”是指与RNA聚合酶结合的多核苷酸(DNA或RNA)的识别位点。RNA聚合酶启动并转录与启动子可操作地连接的多核苷酸。在特定实施方案中，在哺乳动物细胞中起作用的启动子包括位于转录启动位点上游大约25至30个碱基处的富含AT的区域和/或在转录起点上游70至80个碱基处发现的另一个序列，即CNCAAT区，其中N可以是任何核苷酸。
术语“增强子”是指DNA区段，其含有能够提供增强的转录的序列，并且在一些情况下可以独立于它们相对于另一控制序列的取向而起作用。增强子可以与启动子和/或其它增强子元件协同或相加地起作用。术语“启动子/增强子”是指含有能够提供启动子和增强子功能的序列的DNA区段。
术语“可操作地连接”是指并置，其中所描述的组分处于容许其以预期的方式起作用的关系中。在一个实施方案中，该术语是指在核酸表达控制序列(诸如启动子和/或增强子)与第二多核苷酸序列(例如，目标多核苷酸)之间的功能性键联，其中表达控制序列指导对应于第二序列的核酸的转录。
如本文所用，术语“组成型表达控制序列”是指不断地或连续地允许可操作地连接的序列转录的启动子、增强子或启动子/增强子。组成型表达控制序列可以是允许在各种各样的细胞和组织类型中表达的“遍在”启动子、增强子或启动子/增强子，或分别允许在多种受限的细胞和组织类型中表达的“细胞特异性”、“细胞类型特异性”、“细胞谱系特异性”或“组织特异性”启动子、增强子或启动子/增强子。
适合用于本发明的特定实施方案中的示例性遍在表达控制序列包括但不限于巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子、病毒性猴病毒40(SV40)(例如，早期或晚期)、莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)LTR启动子、劳氏肉瘤病毒(RSV)LTR、单纯疱疹病毒(HSV)(胸苷激酶)启动子、来自牛痘病毒的H5、P7.5和P11启动子、延伸因子1-α(EF1a)启动子、早期生长反应1(EGR1)、铁蛋白H(FerH)、铁蛋白L(FerL)、甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、真核翻译启动因子4A1(EIF4A1)、热休克70kDa蛋白5(HSPA5)、热休克蛋白90kDa β成员1(HSP90B1)、热休克蛋白70kDa(HSP70)、β-驱动蛋白(β-KIN)、人ROSA 26基因座(Irions等人，NatureBiotechnology 25，1477-1482(2007))、泛素C启动子(UBC)、磷酸甘油酸激酶1(PGK)启动子、巨细胞病毒增强剂/鸡β-肌动蛋白(CAG)启动子、β-肌动蛋白启动子和骨髓增生性肉瘤病毒增强子、缺失的负控制区、dl587rev引物结合位点取代的(MND)启动子(Challita等人，J Virol.69(2)：748-55(1995))。
在一个实施方案中，本发明的载体包含MND启动子。
在一个实施方案中，本发明的载体包含含有人EF1a基因的第一内含子的EF1a启动子。
在一个实施方案中，本发明的载体包含缺少人EF1a基因的第一内含子的EF1a启动子。
在一个特定实施方案中，可能期望从T细胞特异性启动子表达包含CAR的多核苷酸。
如本文所用，“条件表达”可以指任何类型的条件表达，包括但不限于诱导型表达；可抑制的表达；在具有特定的生理、生物学或疾病状态的细胞或组织中的表达，等等。该定义并非旨在排除细胞类型或组织特异性表达。本发明的某些实施方案提供了目标多核苷酸的条件表达，例如，通过使细胞、组织、生物体等经受使多核苷酸得以表达或者引起由目标多核苷酸编码的多核苷酸的表达增加或减少的处理或条件来控制表达。
诱导型启动子/系统的说明性实例包括但不限于类固醇诱导型启动子，诸如编码糖皮质激素或雌激素受体的基因的启动子(可通过用相应激素处理而诱导)、金属硫蛋白启动子(可通过用各种重金属处理而诱导)、MX-1启动子(可被干扰素诱导)、“GeneSwitch”米非司酮可调系统(Sirin等人，2003，Gene，323：67)、cumate诱导型基因开关(WO 2002/088346)、四环素依赖性调控系统等。
条件表达也可以通过使用位点特异性DNA重组酶来实现。根据本发明的某些实施方案，载体包含至少一个(通常两个)用于位点特异性重组酶介导的重组的位点。如本文所用，术语“重组酶”或“位点特异性重组酶”包括参与涉及一个或多个重组位点(例如，两个、三个、四个、五个、七个、十个、十二个、十五个、二十个、三十个、五十个，等等)的重组反应的激发性或整合性蛋白、酶、辅因子或相关蛋白，它们可以是野生型蛋白(参见Landy，CurrentOpinion in Biotechnology 3：699-707(1993))，或其突变体、衍生物(例如，含重组蛋白序列或其片段的融合蛋白)、片段和变体。适合用于本发明的特定实施方案中的重组酶的说明性实例包括但不限于：Cre、Int、IHF、Xis、Flp、Fis、Hin、Gin、ΦC31、Cin、Tn3解离酶、TndX、XerC、XerD、TnpX、Hjc、Gin、SpCCE1和ParA。
载体可包含一个或多个用于各种各样的位点特异性重组酶中的任一种的重组位点。应当理解，位点特异性重组酶的靶位点是附加在整合载体(例如逆转录病毒载体或慢病毒载体)所需的任何一个或多个位点之上的。如本文所用，术语“重组序列”、“重组位点”或“位点特异性重组位点”是指重组酶识别并结合的特定核酸序列。
例如，Cre重组酶的一个重组位点是loxP，该loxP是34个碱基对的序列，其包含两个侧接8个碱基对的核心序列的13个碱基对的反向重复序列(用作重组酶结合位点)(参见Sauer，B.的图1，Current Opinion in Biotechnology 5：521-527(1994))。其它示例性loxP位点包括但不限于：lox511(Hoess等人，1996；Bethke和Sauer，1997)、lox5171(Lee和Saito，1998)、lox2272(Lee和Saito，1998)、m2(Langer等人，2002)、lox71(Albert等人，1995)和lox66(Albert等人，1995)。
FLP重组酶的合适识别位点包括但不限于：FRT(McLeod等人，1996)、F1、F2、F3(Schlake和Bode，1994)、F4、F5(Schlake和Bode，1994)、FRT(LE)(Senecoff等人，1988)、FRT(RE)(Senecoff等人，1988)。
识别序列的其它实例是被重组酶λ整合酶(例如phi-c31)识别的attB、attP、attL和attR序列。
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SSR仅介导异型位点attB(长度为34bp)和attP(长度为39bp)之间的重组(Groth等人，2000)。分别针对细菌和噬菌体基因组上噬菌体整合酶的附接位点命名的attB和attP都含有可能被
Figure BDA0002971836970000312
同型二聚体结合的非完美反向重复序列(Groth等人，2000)。产物位点attL和attR对于进一步
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介导的重组是有效惰性的(Belteki等人，2003)，使得反应不可逆。对于催化插入，已发现带有attB的DNA插入到基因组attP位点中比attP位点插入到基因组attB位点中更容易(Thyagarajan等人，2001；Belteki等人，2003)。因此，典型的策略是通过同源重组将带有attP的“对接位点”定位到限定的基因座中，然后将其与带有attB的进入序列配合以进行插入。
如本文所用，“内部核糖体进入位点”或“IRES”是指促进内部核糖体直接进入顺反子(蛋白质编码区)的启动密码子(例如ATG)中，从而导致非帽依赖性的基因翻译的元件。参见例如，Jackson等人，1990.Trends Biochem Sci 15(12)：477-83)以及Jackson和Kaminski.1995.RNA 1(10)：985-1000。在特定实施方案中，本发明考虑的载体包括一种或多种编码一种或多种多肽的目标多核苷酸。在特定实施方案中，为了实现多种多肽中的每一种的有效翻译，可以将多核苷酸序列用一个或多个IRES序列或编码自我切割多肽的多核苷酸序列隔开。
如本文所用，术语“Kozak序列”是指大大促进mRNA与核糖体小亚基的初始结合并增加翻译的短核苷酸序列。共有Kozak序列是(GCC)RCCATGG，其中R是嘌呤(A或G)(Kozak，1986.Cell.44(2)：283-92，和Kozak，1987.Nucleic Acids Res.15(20)：8125-48)。在特定实施方案中，本发明考虑的载体包含具有共有Kozak序列并且编码预期多肽(例如CAR)的多核苷酸。
在本发明的一些实施方案中，多核苷酸或携带该多核苷酸的细胞利用自杀基因(包括可诱导的自杀基因)来降低直接毒性和/或不受控制的增殖的风险。在特定方面，自杀基因对携带所述多核苷酸或细胞的宿主没有免疫原性。可以使用的自杀基因的某些实例是半胱天冬酶-9或半胱天冬酶-8或胞嘧啶脱氨酶。可以使用特定的二聚化化学诱导剂(CID)活化半胱天冬酶-9。
在某些实施方案中，载体包含使本发明的免疫效应细胞(例如T细胞)对体内阴性选择敏感的基因区段。“阴性选择”意指注入的细胞可由于个体体内条件的变化而被清除。阴性可选择性表型可以因插入赋予对所施用剂(例如化合物)的敏感性的基因而产生。阴性可选择性基因是本领域已知的，尤其包括以下：赋予更昔洛韦(ganciclovir)敏感性的单纯疱疹病毒I型胸苷激酶(HSV-ITK)基因(Wigler等人，Cell 11：223，1977)；细胞次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)基因、细胞腺嘌呤磷酸核糖基转移酶(APRT)基因和细菌胞嘧啶脱氨酶(Mullen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.89：33(1992))。
在一些实施方案中，经基因修饰的免疫效应细胞，诸如T细胞，包含进一步包含阳性标志物的多核苷酸，所述阳性标志物使得能够在体外选择具有阴性可选择性表型的细胞。阳性可选择性标志物可以是在被引入到宿主细胞中后表达显性表型，从而容许对带有该基因的细胞进行阳性选择的基因。这种类型的基因是本领域已知的，并且尤其包括赋予对潮霉素B的抗性的潮霉素-B磷酸转移酶基因(hph)，来自Tn5的编码对抗生素G418的抗性的氨基糖苷磷酸转移酶基因(neo或aph)，二氢叶酸还原酶(DHFR)基因，腺苷脱氨酶基因(ADA)和多药耐药(MDR)基因。
优选地，将阳性可选择性标志物和阴性可选择性元件连接，以使得阴性可选择性元件的损失也必定伴随着阳性可选择性标志物的损失。甚至更优选地，使阳性和阴性可选择性标志物融合，以使得一个的损失必然导致另一个的损失。产生赋予上述期望的阳性和阴性选择特征的多肽作为表达产物的融合多核苷酸的实例是潮霉素磷酸转移酶胸苷激酶融合基因(HyTK)。该基因的表达产生赋予潮霉素B抗性以进行体外阳性选择并赋予更昔洛韦敏感性以进行体内阴性选择的多肽。参见Lupton S.D.等人，Mol.and Cell.Biology 11：3374-3378，1991。另外，在优选的实施方案中，编码嵌合受体的本发明的多核苷酸处于含有融合基因，特别是那些赋予潮霉素B抗性以进行体外阳性选择并且赋予更昔洛韦敏感性以进行体内阴性选择的融合基因的逆转录病毒载体，例如Lupton，S.D.等人(1991)(同上)中描述的HyTK逆转录病毒载体中。还请参见S.D.Lupton的PCT US91/08442和PCT/US94/05601的公布，其描述了将显性阳性可选择性标志物与阴性可选择性标志物融合得到的双功能可选择性融合基因的用途。
优选的阳性可选择性标志物源自选自由hph、nco和gpt组成的组的基因，并且优选的阴性可选择性标志物源自选自由胞嘧啶脱氨酶、HSV-I TK、VZV TK、HPRT、APRT和gpt组成的组的基因。特别优选的标志物是双功能可选择性融合基因，其中阳性可选择性标志物源自hph或neo，而阴性可选择性标志物源自胞嘧啶脱氨酶或TK基因或可选择性标志物。
病毒载体
在特定实施方案中，用编码CAR的逆转录病毒载体(例如，慢病毒载体)转导细胞(例如，免疫效应细胞)。例如，用编码CAR的载体转导免疫效应细胞，所述CAR包含结合BCMA多肽的鼠抗BCMA抗体或其抗原结合片段，具有CD3ζ、CD28、4-1BB、Ox40或其任何组合的细胞内信号传导结构域。因此，这些转导的细胞可以引发CAR介导的细胞毒性反应。
逆转录病毒是用于基因递送的常用工具(Miller，2000，Nature.357：455-460)。在特定实施方案中，使用逆转录病毒将编码嵌合抗原受体(CAR)的多核苷酸递送至细胞。如本文所用，术语“逆转录病毒”是指RNA病毒，该RNA病毒将它的基因组RNA逆转录成线性双链DNA拷贝，随后将其基因组DNA共价整合到宿主基因组中。病毒一旦被整合到宿主基因组中，就被称为“前病毒”。前病毒充当RNA聚合酶II的模板，并指导编码产生新病毒颗粒所需的结构蛋白和酶的RNA分子的表达。
适合用于特定实施方案的说明性逆转录病毒包括但不限于：莫洛尼鼠白血病病毒(MMuLV)、莫洛尼鼠肉瘤病毒(MoMSV)、哈维鼠肉瘤病毒(HaMuSV)、鼠乳腺肿瘤病毒(MuMTV)、长臂猿白血病病毒(GaLV)、猫白血病病毒(FLV)、泡沫病毒(spumavirus)、弗云德鼠白血病病毒、鼠干细胞病毒(MSCV)和劳斯肉瘤病毒(RSV))和慢病毒。
如本文所用，术语“慢病毒”是指一类(或属)复杂逆转录病毒。说明性慢病毒包括但不限于：HIV(人免疫缺陷病毒；包括HIV 1型和HIV 2型)；维斯纳梅迪病毒(VMV)；山羊关节炎-脑炎病毒(CAEV)；马感染性贫血病毒(EIAV)；猫免疫缺陷病毒(FIV)；牛免疫缺陷病毒(BIV)；和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。在一个实施方案中，基于HIV的载体主链(即，HIV顺式作用序列元件)是优选的。在特定实施方案中，使用慢病毒将包含CAR的多核苷酸递送至细胞。
逆转录病毒载体，更尤其是慢病毒载体可用于实践本发明的特定实施方案。因此，如本文所用的术语“逆转录病毒”或“逆转录病毒载体”分别意在包括“慢病毒”和“慢病毒载体”。
术语“载体”在本文中用于指一种能够转移或转运另一种核酸分子的核酸分子。转移的核酸一般与载体核酸分子连接，例如插入到载体核酸分子中。载体可以包括指导细胞中的自主复制的序列，或者可以包括足以允许整合到宿主细胞DNA中的序列。有用的载体包括，例如，质粒(例如，DNA质粒或RNA质粒)、转座子、粘粒、细菌人工染色体和病毒载体。有用的病毒载体包括例如有复制缺陷的逆转录病毒和慢病毒。
如对于本领域技术人员是显而易见的，术语“病毒载体”被广泛地用于指代包括通常促进核酸分子转移或整合到细胞基因组中的病毒来源的核酸元件的核酸分子(例如，转移质粒)，或者指代介导核酸转移的病毒颗粒。病毒颗粒通常将包括各种病毒组分，并且有时还包括宿主细胞组分外加一种或多种核酸。
术语病毒载体可以指代能够将核酸转移到细胞中的病毒或病毒颗粒，或者指代转移的核酸本身。病毒载体和转移质粒含有主要源自病毒的结构和/或功能遗传元件。术语“逆转录病毒载体”是指含有主要源自逆转录病毒的结构和功能遗传元件或其部分的病毒载体或质粒。术语“慢病毒载体”是指含有主要源自慢病毒的结构和功能遗传元件或其部分(包括LTR)的病毒载体或质粒。术语“杂交载体”是指含有逆转录病毒(例如，慢病毒)序列和非慢病毒病毒序列的载体、LTR或其它核酸。在一个实施方案中，杂交载体是指含有逆转录病毒(例如，慢病毒)序列以进行逆转录、复制、整合和/或包装的载体或转移质粒。
在特定实施方案中，术语“慢病毒载体”和“慢病毒表达载体”可以用来指慢病毒转移质粒和/或感染性慢病毒颗粒。在本文中提及诸如克隆位点、启动子、调控元件、异源核酸等元件时，应理解这些元件的序列以RNA形式存在于本发明的慢病毒颗粒中，而以DNA形式存在存在于本发明的DNA质粒中。
前病毒的每个末端均有称为“长末端重复序列”或“LTR”的结构。术语“长末端重复序列(LTR)”是指位于逆转录病毒DNA末端的碱基对的结构域，其在其天然序列的背景下是直接重复序列并且含有U3、R和U5区域。LTR一般提供对逆转录病毒基因表达(例如，基因转录物的促进、启动和聚腺苷酸化)和病毒复制非常重要的功能。LTR含有包括转录控制元件、聚腺苷酸化信号以及病毒基因组复制和整合所需的序列在内的许多调控信号。病毒LTR分为称为U3、R和U5的三个区域。U3区含增强子和启动子元件。U5区是介于引物结合位点与R区之间的序列，并且含有聚腺苷酸化序列。R(重复)区两侧为U3和U5区。LTR由U3、R和U5区构成，并出现在病毒基因组的5′和3′末端。与5′LTR相邻的是基因组逆转录所必需的序列(tRNA引物结合位点)以及将病毒RNA有效包装到颗粒中所必需的序列(Psi位点)。
如本文所用，术语“包装信号”或“包装序列”是指位于逆转录病毒基因组内的将病毒RNA插入到病毒衣壳或颗粒中所需的序列，参见例如Clever等人，1995.J.of Virology，第69卷，第4号；第2101至2109页。几种逆转录病毒载体使用病毒基因组衣壳化所需的最小包装信号(也称为psi[Ψ]序列)。因此，如本文所用，术语“包装序列”、“包装信号”、“psi”和符号“Ψ”用于指在病毒颗粒形成期间逆转录病毒RNA链衣壳化所需的非编码序列。
在各种实施方案中，载体包含经修饰的5′LTR和/或3′LTR。该LTR中的一者或两者都可以包含一个或多个修饰，该修饰包括但不限于一个或多个缺失、插入或取代。往往对3′LTR进行修饰，以通过使病毒有复制缺陷来提高慢病毒或逆转录病毒系统的安全性。如本文所用，术语“有复制缺陷的”是指这样的病毒，其不能完全、有效地复制，以致不能产生感染性病毒体(例如，有复制缺陷的慢病毒后代)。术语“有复制能力的”是指这样的野生型病毒或突变病毒，其能够复制，使得该病毒的病毒复制能够产生感染性病毒体(例如，有复制能力的慢病毒后代)。
“自灭活”(SIN)载体是指有复制缺陷的载体，例如逆转录病毒或慢病毒载体，其中右侧的(3′)LTR增强子-启动子区(称为U3区)已被修饰(例如，通过缺失或取代来修饰)，以防止超出第一轮病毒复制的病毒转录。这是因为在病毒复制期间，右侧(3′)LTRU3区用作左侧(5′)LTRU3区的模板，因此，在不存在U3增强子-启动子的情况下，无法产生病毒转录物。在本发明的进一步实施方案中，3′LTR被修饰，使得U5区例如被理想的poly(A)序列置换。应当注意，对LTR的修饰，诸如对3′LTR、5′LTR，或3′和5′LTR两者的修饰也包括在本发明中。
通过用异源启动子置换5′LTR的U3区来提供额外的安全性增强，以在病毒颗粒产生期间驱动病毒基因组的转录。可以使用的异源启动子的实例包括，例如病毒性猿猴病毒40(SV40)(例如，早期或晚期)、巨细胞病毒(CMV)(例如，立即早期)、莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)、劳斯肉瘤病毒(RSV)和单纯疱疹病毒(HSV)(胸苷激酶)启动子。典型的启动子能够以非Tat依赖性的方式驱动高水平的转录。这种置换降低了重组产生有复制能力的病毒的可能性，因为在病毒生产系统中不存在完整的U3序列。在某些实施方案中，异源启动子在控制病毒基因组转录的方式方面具有另外的优势。例如，异源启动子可以是可诱导的，使得全部或部分病毒基因组的转录仅在存在诱导因子时才发生。诱导因子包括但不限于一种或多种化学化合物或培养宿主细胞的生理条件，诸如温度或pH。
在一些实施方案中，病毒载体包含TAR元件。术语“TAR”是指位于慢病毒(例如，HIV)LTR的R区中的“反式激活反应”遗传元件。该元件与慢病毒反式激活因子(tat)遗传元件相互作用，以增强病毒复制。然而，在其中5′LTR的U3区被异源启动子置换的实施方案中，该元件不是必需的。
“R区”是指逆转录病毒LTR内的从封端基团的起点(即，转录起点)开始且就在polyA束的起点之前终止的区域。R区也被定义为两侧是U3和U5区。R区在逆转录过程中起作用，容许新生DNA从基因组的一端转移到另一端。
如本文所用，术语“FLAP元件”是指这样的核酸，其序列包括逆转录病毒(例如HIV-1或HIV-2)的中央多嘌呤束和中央终止序列(cPPT和CTS)。合适的FLAP元件在美国专利号6,682,907和Zennou等人，2000，Cell，101：173中有描述。在HIV-1逆转录过程中，在中央多嘌呤束(cPPT)处的正链DNA的中央启动以及在中央终止序列(CTS)处的中央终止导致形成三链DNA结构：HIV-1中央DNA瓣。虽然不希望受到任何理论的束缚，但是DNA瓣可以充当慢病毒基因组核输入的顺式活性决定簇以及/或者可以增加病毒的滴度。在特定实施方案中，逆转录病毒或慢病毒载体主链包含在载体中目标异源基因上游或下游的一个或多个FLAP元件。例如，在特定实施方案中，转移质粒包括FLAP元件。在一个实施方案中，本发明的载体包含从HIV-1分离的FLAP元件。
在一个实施方案中，逆转录病毒或慢病毒转移载体包含一个或多个输出元件。术语“输出元件”是指顺式作用的转录后调控元件，其调控RNA转录物从细胞的细胞核到细胞质的转运。RNA输出元件的实例包括但不限于，人免疫缺陷病毒(HIV)rev反应元件(RRE)(参见例如，Cullen等人，1991.J.Virol.65：1053；和Cullen等人，1991.Cell58：423)，以及乙肝病毒转录后调控元件(HPRE)。一般而言，RNA输出元件被置于基因的3′UTR内，并且可以以一个或多个拷贝的形式插入。
在特定实施方案中，通过将转录后调控元件、有效的聚腺苷酸化位点和任选的转录终止信号并入到载体中来增加病毒载体中异源序列的表达。多种转录后调控元件可增加蛋白质处异源核酸的表达，例如土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE；Zufferey等人，1999，J.Virol.，73：2886)；乙型肝炎病毒中存在的转录后调控元件(HPRE)(Huang等人，Mol.Cell.Biol.，5：3864)；等等(Liu等人，1995，Genes Dev.，9：1766)。在特定实施方案中，本发明的载体包含转录后调控元件，诸如WPRE或HPRE。
在特定实施方案中，本发明的载体缺乏或不包含转录后调控元件(PTE)，诸如WPRE或HPRE，因为在一些情况下，这些元件增加了细胞转化的风险以及/或者不会大幅地或显著地增加mRNA转录物的量或增加mRNA稳定性。因此，在一些实施方案中，本发明的载体缺乏或不包含PTE。在其它实施方案中，本发明的载体缺乏或不包含作为附加安全措施的WPRE或HPRE。
指导异源核酸转录物的有效终止和聚腺苷酸化的元件增加异源基因表达。转录终止信号一般被发现在聚腺苷酸化信号的下游。在特定实施方案中，载体包含在编码待表达的多肽的多核苷酸3′的聚腺苷酸化序列。如本文所用的术语“polyA位点”或“polyA序列”表示指导RNA聚合酶II对新生RNA转录物的终止和聚腺苷酸化的DNA序列。聚腺苷酸化序列可通过在编码序列的3′末端添加polyA尾来促进mRNA的稳定性，从而有助于提高翻译效率。重组转录物的有效聚腺苷酸化是理想的，因为缺乏polyA尾的转录物是不稳定的并且迅速降解。可以在本发明的载体中使用的polyA信号的说明性实例包括理想的polyA序列(例如，AATAAA、ATTAAA、AGTAAA)、牛生长激素polyA序列(BGHpA)、兔β-珠蛋白polyA序列(rβgpA)，或本领域已知的另一种合适的异源或内源polyA序列。
在某些实施方案中，逆转录病毒或慢病毒载体进一步包含一个或多个绝缘子元件。绝缘子元件可有助于保护慢病毒表达的序列(例如，治疗性多肽)免受整合位点影响，所述整合位点影响可能受基因组DNA中存在的顺式作用元件介导并导致已转移序列的表达失调(即，位置效应；参见，例如，Burgess-Beusse等人，2002，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，99：16433；和Zhan等人，2001，Hum.Genet.，109：471)。在一些实施方案中，转移载体包含一个或多个绝缘子元件，3′LTR并且在前病毒整合到宿主基因组中后，前病毒通过复制3′LTR而在5′LTR或3′LTR处包含一个或多个绝缘子。用于本发明的合适的绝缘子包括但不限于鸡β-珠蛋白绝缘子(参见Chung等人，1993.Cell 74：505；Chung等人，1997.PNAS 94：575；和Bell等人，1999.Cell 98：387，通过引用并入本文)。绝缘子元件的实例包括但不限于来自β-珠蛋白基因座的绝缘子，诸如鸡HS4。
根据本发明的某些具体实施方案，大多数或全部病毒载体主链序列源自慢病毒，例如HIV-1。然而，应当理解，可以使用或组合许多不同来源的逆转录病毒和/或慢病毒序列，并且可以调节某些慢病毒序列中的许多取代和改变，而不损害转移载体执行本文所述功能的能力。而且，多种慢病毒载体是本领域已知的，参见Naldini等人，(1996a，1996b和1998)；Zufferey等人，(1997)；Dull等人，1998，美国专利号6,013,516和5,994,136，其中许多可以适于产生本发明的病毒载体或转移质粒。
在各种实施方案中，本发明的载体包含与编码CAR多肽的多核苷酸可操作地连接的启动子。载体可具有一个或多个LTR，其中任一LTR包含一个或多个修饰，诸如一个或多个核苷酸取代、添加或缺失。载体可进一步包含用于增加转导效率(例如，cPPT/FLAP)、病毒包装(例如，Psi(Ψ)包装信号、RRE)的一个或多个辅助元件，以及/或者增加治疗性基因表达的其它元件(例如，poly(A)序列)，并且可以任选地包含WPRE或HPRE。
在一个特定实施方案中，本发明的转移载体包含左侧(5′)逆转录病毒LTR；中央多嘌呤束/DNA瓣(cPPT/FLAP)；逆转录病毒输出元件；在T细胞中有活性的可操作地连接到编码本文考虑的CAR多肽的多核苷酸上的启动子；和右侧(3′)逆转录病毒LTR；以及任选的WPRE或HPRE。
在一个特定实施方案中，本发明的转移载体包含左侧(5′)逆转录病毒LTR；逆转录病毒输出元件；在T细胞中有活性的可操作地连接到编码本文考虑的CAR多肽的多核苷酸上的启动子；右侧(3′)逆转录病毒LTR；和poly(A)序列；以及任选的WPRE或HPRE。在另一个特定实施方案中，本发明提供了一种慢病毒载体，其包含：左侧(5′)LTR；cPPT/FLAP；RRE；在T细胞中有活性的可操作地连接到编码本文考虑的CAR多肽的多核苷酸上的启动子；右侧(3′)LTR；和聚腺苷酸化序列；以及任选的WPRE或HPRE。
在某些实施方案中，本发明提供了一种慢病毒载体，其包含：左侧(5′)HIV-1LTR；和Psi(Ψ)包装信号；cPPT/FLAP；RRE；在T细胞中有活性的可操作地连接到编码本文考虑的CAR多肽的多核苷酸上的启动子；右侧(3′)自灭活(SIN)HIV-1 LTR；和兔β-珠蛋白聚腺苷酸化序列；以及任选的WPRE或HPRE。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种载体，其包含：至少一个LTR；中央多嘌呤束/DNA瓣(cPPT/FLAP)；逆转录病毒输出元件；以及在T细胞中有活性的可操作地连接到编码本文考虑的CAR多肽的多核苷酸上的启动子；以及任选的WPRE或HPRE。
在特定实施方案中，本发明提供了一种载体，其包含：至少一个LTR；cPPT/FLAP；RRE；在T细胞中有活性的可操作地连接到编码本文考虑的CAR多肽的多核苷酸上的启动子；和聚腺苷酸化序列；以及任选的WPRE或HPRE。
在某些实施方案中，本发明提供了至少一种SIN HIV-1 LTR；Psi(Ψ)包装信号；cPPT/FLAP；RRE；在T细胞中有活性的可操作地连接到编码本文考虑的CAR多肽的多核苷酸上的启动子；和兔β-珠蛋白聚腺苷酸化序列；以及任选的WPRE或HPRE。
在各种实施方案中，载体是整合型病毒载体。
在各种其它实施方案中，载体是游离型或非整合型病毒载体。
在各种实施方案中，本文考虑的载体包含非整合型或整合缺陷型逆转录病毒。在一个实施方案中，“整合缺陷型”逆转录病毒或慢病毒是指具有缺乏将病毒基因组整合到宿主细胞的基因组中的能力的整合酶的逆转录病毒或慢病毒。在各种实施方案中，使整合酶蛋白突变以特异性地降低其整合酶活性。通过修饰编码整合酶蛋白的pol基因从而产生编码整合缺陷型整合酶的突变pol基因来获得无整合能力的慢病毒载体。此类无整合能力的病毒载体已经在专利申请WO 2006/010834(其通过引用整体并入本文)中有描述。
适于降低整合酶活性的HIV-1 pol基因中的说明性突变包括但不限于：H12N、H12C、H16C、H16V、S81R、D41A、K42A、H51A、Q53C、D55V、D64E、D64V、E69A、K71A、E85A、E87A、D116N、D1161、D116A、N120G、N1201、N120E、E152G、E152A、D35E、K156E、K156A、E157A、K159E、K159A、K160A、R166A、D167A、E170A、H171A、K173A、K186Q、K186T、K188T、E198A、R199c、R199T、R199A、D202A、K211A、Q214L、Q216L、Q221L、W235F、W235E、K236S、K236A、K246A、G247W、D253A、R262A、R263A和K264H。
适于降低整合酶活性的HIV-1 pol基因中的说明性突变包括但不限于：D64E、D64V、E92K、D116N、D1161、D116A、N120G、N1201、N120E、E152G、E152A、D35E、K156E、K156A、E157A、K159E、K159A、W235F和W235E。
在特定实施方案中，整合酶在氨基酸D64、D116或E152中的一者或多者中包含突变。在一个实施方案中，整合酶在氨基酸D64、D116和E152中包含突变。在特定实施方案中，缺陷型HIV-1整合酶包含D64V突变。
“宿主细胞”包括用本发明的重组载体或多核苷酸在体内、离体或在体外进行电穿孔、转染、感染或转导的细胞。宿主细胞可以包括包装细胞、生产细胞和被病毒载体感染的细胞。在特定实施方案中，将受本发明的病毒载体感染的宿主细胞施用于需要疗法的对象。在某些实施方案中，术语“靶细胞”可与宿主细胞互换使用并且是指经转染、感染或转导的预期细胞类型的细胞。在优选实施方案中，靶细胞是T细胞。
为了获得合理的病毒滴度，大规模的病毒颗粒生产往往是必须的。通过将转移载体转染到包装细胞系中来生产病毒颗粒，所述包装细胞系包含病毒结构基因和/或辅助基因，例如gag、pol、env、tat、rev、vif、vpr、vpu、vpx或nef基因或其它逆转录病毒基因。
如本文所用，术语“包装载体”是指缺乏包装信号并且包含编码一个、两个、三个、四个或更多个病毒结构基因和/或辅助基因的多核苷酸的表达载体或病毒载体。通常，包装载体包括在包装细胞中，并经由转染、转导或感染被引入到该细胞中。用于转染、转导或感染的方法是本领域技术人员众所周知的。可以经由转染、转导或感染将本发明的逆转录病毒/慢病毒转移载体引入到包装细胞系中，以产生生产细胞或生产细胞系。可以通过标准方法将本发明的包装载体引入到人细胞或细胞系中，所述标准方法包括例如磷酸钙转染、脂质转染或电穿孔。在一些实施方案中，将包装载体与显性可选择性标志物(诸如新霉素、潮霉素、嘌呤霉素、杀稻瘟菌素、博来霉素(zeocin)、胸苷激酶、DHFR、Gln合成酶或ADA)一起引入到细胞中，随后在适当药物的存在下进行选择并分离克隆物。可选择性标志物基因可物理地连接至包装载体编码的基因，例如通过IRES或自我切割病毒肽连接。
病毒包膜蛋白(env)决定了宿主细胞的范围，这些宿主细胞最终可以被从细胞系产生的重组逆转录病毒感染和转化。在慢病毒诸如HIV-1、HIV-2、SIV、FIV和EIV的情况下，env蛋白包括gp41和gp120。优选地，如先前所述，由本发明的包装细胞表达的病毒env蛋白是在与病毒gag和pol基因分离的载体上编码的。
可用于本发明的逆转录病毒来源的env基因的说明性实例包括但不限于：MLV包膜、10A1包膜、BAEV、FeLV-B、RD114、SSAV、埃博拉病毒、仙台病毒、FPV(鸡瘟病毒)和流感病毒包膜。类似地，可以利用编码来自RNA病毒(例如微小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)、杯状病毒科(Calciviridae)、星状病毒科(Astroviridae)、披膜病毒科(Togaviridae)、黄病毒科(Flaviviridae)、冠状病毒科(Coronaviridae)、副黏液病毒科(Paramyxoviridae)、弹状病毒科(Rhabdoviridae)、丝状病毒科(Filoviridae)、正粘病毒科(Orthomyxoviridae)、布尼亚病毒科(Bunyaviridae)、砂粒病毒科(Arenaviridae)、呼肠孤病毒科(Reoviridae)、双核糖核酸病毒科(Birnaviridae)、逆转录病毒科(Retroviridae)的RNA病毒家族)以及来自DNA病毒(肝脱氧核糖核酸病毒科(Hepadnaviridae)、圆环病毒科(Circoviridae)、细小病毒科(Parvoviridae)、乳多空病毒科(Papovaviridae)、腺病毒科(Adenoviridae)、疱疹病毒科(Herpesviridae)、痘病毒科(Poxyiridae)和虹彩病毒科(Iridoviridae)的家族)的包膜的基因。代表性实例包括FeLV、VEE、HFVW、WDSV、SFV、狂犬病病毒、ALV、BIV、BLV、EBV、CAEV、SNV、ChTLV、STLV、MPMV、SMRV、RAV、FuSV、MH2、AEV、AMV、CT10和EIAV。
在其它实施方案中，用于对本发明病毒假型化的包膜蛋白包括但不限于来自以下病毒中的任一种：甲型流感病毒(诸如H1N1、H1N2、H3N2和H5N1(禽流感))、乙型流感病毒、丙型流感病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、轮状病毒、诺沃克病毒群的任何病毒、肠腺病毒、细小病毒、登革热病毒、猴痘病毒、单股反链病毒(Mononegavirale)、狂犬病病毒属(诸如狂犬病病毒)、拉各斯蝙蝠病毒、莫科拉病毒(Mokola virus)、杜文黑基病毒(Duvenhage virus)、欧洲蝙蝠病毒1和2以及澳大利亚蝙蝠病毒、暂时热病毒、水疱病毒、水疱性口炎病毒(VSV)、疱疹病毒(诸如1型和2型单纯疱疹病毒)、水痘带状疱疹病毒、巨细胞病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)、人疱疹病毒(HHV)、人疱疹病毒6型和8型、人免疫缺陷病毒(HIV)、乳头瘤病毒、鼠γ疱疹病毒、沙粒病毒(诸如阿根廷出血热病毒、玻利维亚出血热病毒、萨比亚相关出血热病毒、委内瑞拉出血热病毒)、拉沙热病毒、马丘波病毒、淋巴细胞脉络丛膜脑膜炎病毒(LCMV)、布尼亚病毒科(诸如克里米亚-刚果出血热病毒(Crimean-Congo hemorrhagic fevervirus))、汉坦病毒、引起出血热伴肾综合征的病毒、裂谷热病毒、包括埃博拉出血热和马尔堡出血热在内的丝状病毒科(丝状病毒)、包括科萨努尔森林病(Kaysanur Forest disease)病毒在内的黄病毒科、鄂木斯克出血热病毒、引起蜱传脑炎(Tick-borne encephalitis)的病毒和副粘病毒科(诸如亨德拉病毒(Hendra virus)和尼帕病毒(Nipah virus))、重型痘症(variola maior)和轻型痘症(variola minor)(天花)病毒、甲病毒(诸如委内瑞拉马脑炎病毒、东部马脑炎病毒、西部马脑炎病毒、SARS相关冠状病毒(SARS-CoV)、西尼罗河病毒以及任何引起脑炎的病毒)。
在一个实施方案中，本发明提供了包装细胞，其产生用VSV-G糖蛋白假型化的重组逆转录病毒，例如慢病毒。
如本文所用的术语“假型”或“假型化”是指其病毒包膜蛋白已被具有优选特性的另一种病毒的包膜蛋白取代的病毒。例如，可以用水疱性口炎病毒G蛋白(VSV-G)包膜蛋白对HIV进行假型化，从而使HIV能够感染更广泛的细胞，因为(由env基因编码的)HIV包膜蛋白通常使该病毒靶向CD4+呈递细胞。在本发明的优选实施方案中，将慢病毒包膜蛋白用VSV-G假型化。在一个实施方案中，本发明提供了包装细胞，其产生用VSV-G包膜糖蛋白假型化的重组逆转录病毒，例如慢病毒。
如本文所用，术语“包装细胞系”用于指不含包装信号但确实稳定或瞬时地表达正确包装病毒颗粒所必需的病毒结构蛋白和复制酶(例如，gag、pol和env)的细胞系。任何合适的细胞系均可用于制备本发明的包装细胞。一般而言，所述细胞是哺乳动物细胞。在特定实施方案中，用于产生包装细胞系的细胞是人细胞。可以使用的合适的细胞系包括例如CHO细胞、BHK细胞、MDCK细胞、C3H 10T1/2细胞、FLY细胞、Psi-2细胞、BOSC 23细胞、PA317细胞、WEHI细胞、COS细胞、BSC 1细胞、BSC40细胞、BMT 10细胞、VERO细胞、W138细胞、MRC5细胞、A549细胞、HT1080细胞、293细胞、293T细胞、B-50细胞、3T3细胞、NIH3T3细胞、HepG2细胞、Saos-2细胞、Huh7细胞、HeLa细胞、W163细胞、211细胞和211A细胞。在优选的实施方案中，包装细胞是293细胞、293T细胞或A549细胞。在另一个优选的实施方案中，所述细胞是A549细胞。
如本文所用，术语“生产细胞系”是指能够产生重组逆转录病毒颗粒的细胞系，其包含包装细胞系和包含包装信号的转移载体构建体。感染性病毒颗粒和病毒原液的生产可以使用常规技术进行。制备病毒原液的方法是本领域已知的，并由例如Y.Soneoka等人(1995)Nucl.Acids Res.23：628-633和N.R.Landau等人(1992)J.Virol.66：5110-5113进行了说明。可以使用常规技术从包装细胞中收集感染性病毒颗粒。例如，如本领域已知的，可以通过细胞裂解或收集细胞培养物的上清液来收集感染性颗粒。任选地，如果需要，可以纯化收集的病毒颗粒。合适的纯化技术是本领域技术人员众所周知的。
使用逆转录病毒或慢病毒载体借助于病毒感染而不是通过转染来递送一个或多个基因或其它多核苷酸序列称为“转导”。在一个实施方案中，通过感染和前病毒整合将逆转录病毒载体转导到细胞中。在某些实施方案中，如果靶细胞，例如T细胞，包含使用病毒或逆转录病毒载体通过感染而递送至细胞中的基因或其它多核苷酸序列，则该靶细胞是经“转导的”。在特定实施方案中，经转导的细胞在其细胞基因组中包含通过逆转录病毒或慢病毒载体递送的一个或多个基因或其它多核苷酸序列。
在特定实施方案中，将用表达一种或多种多肽的本发明的病毒载体转导的宿主细胞施用于对象以治疗和/或预防B细胞恶性肿瘤。可以根据本发明的某些实施方案利用的与在基因疗法中使用病毒载体有关的其它方法可以在例如Kay，M.A.(1997)Chest 111(6Supp.)：138S-142S；Ferry，N.和Heard，J.M.(1998)Hum.Gene Ther.9：1975-81；Shiratory，Y.等人(1999)Liver 19：265-74；Oka，K.等人(2000)Curr.Opin.Lipidol.11：179-86；Thule，P.M.和Liu，J.M.(2000)Gene Ther.7：1744-52；Yang，N.S.(1992)Crit.Rev.Biotechnol.12：335-56；Alt，M.(1995)J.Hepatol.23：746-58；Brody，S.L.和Crystal，R.G.(1994)Ann.N.Y.Acad.Sci.716：90-101；Strayer，D.S.(1999)ExpertOpin.Investig.Drugs 8：2159-2172；Smith-Arica，J.R.和Bartlett，J.S.(2001)Curr.Cardiol.Rep.3：43-49；以及Lee，H.C.et al.(2000)Nature 408：483-8中找到。
5.6.经基因修饰的宿主细胞
在特定实施方案中，本发明考虑了经基因修饰成表达本文考虑的CAR以用于治疗B细胞相关病状的细胞。如本文所用，术语“经基因工程改造的”或“经基因修饰的”是指将DNA或RNA形式的额外遗传物质添加到细胞中的总遗传物质中。术语“经基因修饰的细胞”、“经修饰的细胞”和“重定向的细胞”可互换使用。如本文所用，术语“基因疗法”是指将DNA或RNA形式的额外遗传物质引入到细胞中的总遗传物质中以恢复、校正或修饰基因的表达，或者用于表达治疗性多肽(例如CAR)的目的。
在特定实施方案中，将本文考虑的CAR引入在免疫效应细胞中并使其在该免疫效应细胞中表达，以便将其特异性重定向至目标靶抗原，例如BCMA多肽。“免疫效应细胞”是具有一种或多种效应子功能(例如，细胞毒性细胞杀伤活性、细胞因子的分泌、ADCC和/或CDC的诱导)的免疫系统的任何细胞。
本发明的免疫效应细胞可以是自体的/自身的(“本身”)或非自体的(“非本身的”，例如同种异体的、同基因的或异种异体的)。
如本文所用的“自体的”是指来自同一对象的细胞。
如本文所用的“同种异体的”是指与所比较的细胞在基因上不同的相同物种的细胞。
如本文所用的“同基因的”是指与所比较的细胞在基因上同一的不同对象的细胞。
如本文所用的“异种异体的”是指与所比较的细胞的物种不同的物种的细胞。在优选实施方案中，本发明的细胞是同种异体的。
与本文考虑的CAR一起使用的说明性免疫效应细胞包括T淋巴细胞。术语“T细胞”或“T淋巴细胞”是本领域公认的，并且旨在包括胸腺细胞、未成熟的T淋巴细胞、成熟的T淋巴细胞、静止的T淋巴细胞或活化的T淋巴细胞。T细胞可以是T辅助(Th)细胞，例如T辅助1(Th1)或T辅助2(Th2)细胞。T细胞可以是辅助T细胞(HTL；CD4+ T细胞)CD4+ T细胞、细胞毒性T细胞(CTL；CD8+ T细胞)、CD4+CD8+ T细胞、CD4-CD8-T细胞，或T细胞的任何其它子集。适合用于特定实施方案中的T细胞的其它说明性群体包括原初T细胞和记忆T细胞。
如本领域技术人员将理解的，其它细胞也可以与如本文所述的CAR一起用作免疫效应细胞。具体而言，免疫效应细胞还包括NK细胞、NKT细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞。免疫效应细胞还包括效应细胞的祖细胞，其中可以诱导此类祖细胞在体内或体外分化为免疫效应细胞。因此，在特定实施方案中，免疫效应细胞包括免疫效应细胞的祖细胞，诸如包含在源自脐带血、骨髓或动员外周血的CD34+细胞群中的造血干细胞(HSC)，其在施用于对象中后分化为成熟的免疫效应细胞，或者其可以在体外被诱导分化为成熟的免疫效应细胞。
如本文所用，经基因工程改造为含有BCMA特异性CAR的免疫效应细胞可以称为“BCMA特异性重定向的免疫效应细胞”。
如本文所用的术语“CD34+细胞”是指在其细胞表面上表达CD34蛋白的细胞。如本文所用的“CD34”是指常常充当细胞-细胞粘附因子并参与T细胞进入淋巴结的细胞表面糖蛋白(例如，唾液粘蛋白(sialomucin))。CD34+细胞群含有造血干细胞(HSC)，其在施用于患者后分化并促成所有造血谱系，包括T细胞、NK细胞、NKT细胞、嗜中性粒细胞和单核细胞/巨噬细胞谱系的细胞。
本发明提供了制备表达本文考虑的CAR的免疫效应细胞的方法。在一个实施方案中，该方法包括转染或转导从个体分离的免疫效应细胞，以使得免疫效应细胞表达一种或多种如本文所述的CAR。在某些实施方案中，免疫效应细胞是从个体中分离出来的，并且无需进一步的体外操纵就可以进行基因修饰。然后可以将此类细胞直接重新施用于个体中。在进一步的实施方案中，在进行基因修饰以表达CAR之前，首先将免疫效应细胞活化并刺激其在体外增殖。在这方面，免疫效应细胞可以在进行基因修饰(即，转导或转染以表达本文考虑的CAR)之前和/或之后进行培养。
在特定实施方案中，在本文所述的免疫效应细胞的体外操纵或基因修饰之前，从对象中获得细胞来源。在特定实施方案中，经CAR修饰的免疫效应细胞包含T细胞。T细胞可从许多来源获得，所述来源包括但不限于外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾脏组织和肿瘤。在某些实施方案中，可以使用本领域技术人员已知的许多技术，诸如沉降，例如FICOLLTM分离，从收集自对象的一个单位的血液中获得T细胞。在一个实施方案中，来自个体循环血液的细胞通过单采术获得。单采术产品通常含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其它有核白血细胞、红血细胞和血小板。在一个实施方案中，可以洗涤通过单采术收集的细胞以除去血浆级分并将细胞置于适当的缓冲剂或培养基中以用于后续加工。可用PBS或用缺少钙、镁和大多数(即便不是全部)其它二价阳离子的另一种合适的溶液洗涤细胞。如本领域普通技术人员将理解的，洗涤步骤可以通过本领域人员已知的方法来完成，诸如通过使用半自动流通式离心机来完成。例如，Cobe 2991细胞处理器、Baxter CytoMate等。洗涤后，可将细胞重悬于各种生物相容性缓冲剂或其它含或不含缓冲剂的盐溶液中。在某些实施方案中，单采术样品中不合需要的组分可以在细胞直接重悬浮的培养基中去除。
在某些实施方案中，通过使红血细胞裂解并清除单核细胞，例如通过经过PERCOLLTM梯度离心，从外周血单核细胞(PBMC)中分离出T细胞。可以通过阳性或阴性选择技术进一步分离表达以下一种或多种标志物的特定T细胞亚群：CD3、CD28、CD4、CD8、CD45RA和CD45RO。在一个实施方案中，通过阳性或阴性选择技术进一步分离表达CD3、CD28、CD4、CD8、CD45RA和CD45RO的特定T细胞亚群。例如，通过阴性选择富集T细胞群可以用针对阴性选择的细胞特有的表面标志物的抗体的组合来完成。本文使用的一种方法是经由负磁性免疫粘附或流式细胞术进行细胞分选和/或选择，该方法使用针对阴性选择的细胞上存在的细胞表面标志物的单克隆抗体的混合液。例如，为了通过阴性选择来富集CD4+细胞，单克隆抗体混合液通常包括针对CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR和CD8的抗体。流式细胞术和细胞分选也可以用于分离目标细胞群以用于本发明中。
可以使用本文考虑的方法直接对PBMC进行基因修饰以使其表达CAR。在某些实施方案中，在PBMC分离之后，进一步分离T淋巴细胞，并且在某些实施方案中，可以在基因修饰和/或扩增之前或之后，将细胞毒性T淋巴细胞和辅助T淋巴细胞分选为原初、记忆和效应T细胞亚群。
可以通过使用标准方法获得CD8+细胞。在一些实施方案中，通过鉴定与那些类型的CD8+细胞中的每一种相关的细胞表面抗原，将CD8+细胞进一步分选为原初细胞、中央记忆细胞和效应细胞。
在某些实施方案中，原初CD8+T淋巴细胞的特征在于表达原初T细胞的表型标志物，所述表型标志物包括CD62L、CCR7、CD28、CD3、CD 127和CD45RA。
在特定实施方案中，记忆T细胞存在于CD8+外周血淋巴细胞的CD62L+和CD62L-子集中。在用抗CD8和抗CD62L抗体染色后，将PBMC分选为CD62L-CD8+和CD62L+CD8+级分。在一些实施方案中，中央记忆T细胞的表型标志物的表达包括CD45RO、CD62L、CCR7、CD28、CD3和CD127，并且对于颗粒酶B而言是呈阴性的。在一些实施方案中，中央记忆T细胞是CD45RO+、CD62L+、CD8+T细胞。
在一些实施方案中，效应T细胞对于CD62L、CCR7、CD28和CD127而言是呈阴性的，而对于颗粒酶B和穿孔素则是呈阳性的。
在某些实施方案中，将CD4+T细胞进一步分选为亚群。例如，通过鉴定具有细胞表面抗原的细胞群，可以将CD4+T辅助细胞分选为原初细胞、中央记忆细胞和效应细胞。CD4+淋巴细胞可以通过标准方法获得。在一些实施方案中，原初CD4+T淋巴细胞是CD45RO-、CD45RA+、CD62L+CD4+T细胞。在一些实施方案中，中央记忆CD4+细胞呈CD62L阳性和CD45RO阳性。在一些实施方案中，效应CD4+细胞呈CD62L和CD45RO阴性。
免疫效应细胞(诸如T细胞)可以在分离后使用已知方法来进行基因修饰，或者可以在对免疫效应细胞进行基因修饰之前在体外对它进行活化和扩增(或在祖细胞的情况下进行分化)。在特定实施方案中，对免疫效应细胞(诸如T细胞)用本文考虑的嵌合抗原受体进行基因修饰(例如，用包含编码CAR的核酸的病毒载体转导)，然后在体外进行活化和扩增。在各种实施方案中，T细胞可在基因修饰成表达CAR之前或之后使用如例如美国专利6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；6,867,041；以及美国专利申请公开号20060121005中所描述的方法来活化和扩增。
一般而言，通过使T细胞与上面附接有刺激CD3 TCR复合物相关信号的剂和刺激T细胞表面上的共刺激分子的配体的表面接触来使T细胞扩增。可以通过使T细胞群与固定在表面上的抗CD3抗体或其抗原结合片段或者抗CD2抗体接触，或者通过使T细胞群与蛋白激酶C活化剂(例如苔藓抑素)连同钙离子载体接触来刺激T细胞群。还考虑了T细胞表面上辅助分子的共刺激。
在特定实施方案中，使PBMC或分离的T细胞在具有适当的细胞因子(诸如IL-2、IL-7和/或IL-15)的培养基中与一般附着于珠粒或其它表面的刺激剂和共刺激剂(诸如抗CD3抗体和抗CD28抗体)接触。为了刺激CD4+ T细胞或CD8+ T细胞的增殖，使用抗CD3抗体和抗CD28抗体。抗CD28抗体的实例包括9.3、B-T3、XR-CD28(Diacione，Besancon，France)，其可以像本领域通常已知的其它方法一样使用(Berg等人，Transplant Proc.30(8)：3975-3977，1998；Haanen等人，J.Exp.Med.190(9)：13191328，1999；Garland等人，J.ImmunolMeth.227(1-2)：53-63，1999)。附着于同一珠粒上的抗CD3和抗CD28抗体充当“替代”抗原呈递细胞(APC)。在其它实施方案中，可以使用诸如US6040177、US5827642和WO2012129514中描述的方法的方法，用饲养细胞以及适当的抗体和细胞因子来活化和刺激T细胞增殖。
在其它实施方案中，通过工程改造K562、U937、721.221、T2和C1R细胞来制备人工APC(aAPC)以指导多种共刺激分子和细胞因子的稳定表达和分泌。在特定实施方案中，使用K32或U32 aAPC指导一种或多种基于抗体的刺激分子在AAPC细胞表面上的展示。各种基因组合在aAPC上的表达使得人T细胞活化的需求能够被精确地确定，以使得可以针对具有特定生长需求和独特功能的T细胞子集的最佳繁殖来定制aAPC。与使用天然APC不同，aAPC支持功能性人CD8 T细胞的离体生长和长期扩增，而无需添加外源细胞因子。T细胞群可以被表达多种共刺激分子的aAPC扩增，所述共刺激分子包括但不限于CD137L(4-1BBL)、CD134L(OX40L)和/或CD80或CD86。最后，aAPC提供了一个有效的平台来扩增经基因修饰的T细胞并维持CD8 T细胞上的CD28表达。WO 03/057171和US2003/0147869中提供的aAPC特此通过引用整体并入本文。
在一个实施方案中，用根据本发明的核酸构建体转导CD34+细胞。在某些实施方案中，经转导的CD34+细胞在施用于对象(一般是最初从其分离细胞的对象)中之后，在体内分化为成熟免疫效应细胞。在另一个实施方案中，CD34+细胞在暴露于如本文所述的CAR中之前或者在用如本文所述的CAR进行基因修饰之后，可以根据先前描述的方法(TPO)、IL-3和IL-6(Asheuer等人，2004，PNAS 101(10)：3557-3562；Imren等人，2004)在体外用一种或多种以下细胞因子刺激：Flt-3配体(FLT3)、干细胞因子(SCF))、巨核细胞生长和分化因子。
本发明提供了用于治疗癌症的经修饰的免疫效应细胞群，所述经修饰的免疫效应细胞包含如本文所公开的CAR。例如，由从被诊断为患有本文所述的B细胞恶性肿瘤的患者(自体供体)获得的外周血单核细胞(PBMC)制备经修饰的免疫效应细胞群。PBMC形成异质性T淋巴细胞群，其可以是CD4+、CD8+或CD4+和CD8+。
PBMC还可以包括其它细胞毒性淋巴细胞，诸如NK细胞或NKT细胞。可以将带有本文考虑的CAR的编码序列的表达载体引入到人供体T细胞、NK细胞或NKT细胞的群体中。可以使用流式细胞术分选带有表达载体的成功转导的T细胞，以分离CD3阳性T细胞，然后使该T细胞进一步繁殖以增加这些表达CAR蛋白的T细胞的数量，此外还使用抗CD3抗体和/或抗CD28抗体和IL-2或如本文其它地方所述的本领域已知的任何其它方法进行细胞活化。使用标准程序对表达CAR蛋白的T细胞进行冷冻保存，以用于储存和/或配制以供人对象使用。在一个实施方案中，在不存在非人动物来源的产物诸如胎牛血清和牛胎儿血清的情况下进行T细胞的体外转导、培养和/或扩增。由于异质性PBMC群体是经过基因修饰的，因此所得经转导细胞是包含如本文所考虑的靶向BCMA的CAR的经修饰细胞的异质性群体。
在进一步的实施方案中，例如，一种、两种、三种、四种、五种或更多种不同的表达载体的混合物可以用于对免疫效应细胞的供体群体进行基因修饰，其中每种载体编码如本文考虑的不同嵌合抗原受体蛋白。所得的经修饰的免疫效应细胞形成混合的经修饰细胞群体，其中一定比例的经修饰细胞表达多于一种不同的CAR蛋白。
在一个实施方案中，本发明提供了一种储存靶向BCMA蛋白的表达CAR蛋白的经基因修饰的鼠、人或人源化免疫效应细胞的方法，该方法包括冷冻保存免疫效应细胞，以使得该细胞在解冻后仍然能存活。可以通过本领域已知的方法冷冻保存表达CAR蛋白的免疫效应细胞的级分，以提供此类细胞的永久来源以用于将来治疗患有B细胞相关病状的患者。需要时，可以将冷冻保存的经转化的免疫效应细胞解冻，使其生长和扩增以获得更多此类细胞。
如本文所用，“冷冻保存”是指通过冷却至零下温度，诸如(通常)77K或-196℃(液氮的沸点)来保存细胞。常常在零下温度使用冷冻保护剂，以防止保存的细胞由于在低温下冷冻或升温到室温而受到损害。冷冻保护剂和最佳的冷却速率可以保护细胞免受损伤。可以使用的冷冻保护剂包括但不限于二甲基亚砜(DMSO)(Lovelock和Bishop，1959；183：1394-1395；Ashwood-Smith，Nature，1961；190：1204-1205)、甘油、聚乙烯吡咯烷酮(Rinfret，Ann.N.Y.Acad.Sci.，1960；85：576)和聚乙二醇(Sloviter和Ravdin，Nature，1962；196：48)。优选的冷却速率是1℃至3℃/分钟。在至少两小时之后，T细胞达到-80℃的温度，并且可以被直接放入到液氮(-196℃)中永久存储，诸如在长期低温存储容器中储存。
5.7.T细胞制造工艺
通过本文考虑的方法制造的T细胞提供了改进的过继免疫疗法组合物。不希望受任何特定理论的束缚，据信通过本文考虑的方法制造的T细胞组合物蕴藏着优良特性，包括增加的存活率、在相对缺乏分化的情况下的扩增，以及体内持久性。在一个实施方案中，制造T细胞的方法包括使该细胞与一种或多种调节PI3K细胞信号传导途径的剂接触。在一个实施方案中，制造T细胞的方法包括使该细胞与一种或多种调节PI3K/Akt/mTOR细胞信号传导途径的剂接触。在各种实施方案中，T细胞可以从任何来源获得并且在制造工艺的活化和/或扩展阶段期间与所述剂接触。所得的T细胞组合物富含有发育潜能的T细胞，所述T细胞能够增殖并表达以下一种或多种生物标志物：CD62L、CCR7、CD28、CD27、CD122、CD127、CD197和CD38。在一个实施方案中，已经用一种或多种PI3K抑制剂处理的包含T细胞的细胞群富含共表达以下的一种或多种或全部生物标志物的CD8+T细胞群：CD62L、CD127、CD197和CD38。
在一个实施方案中，制造了包含维持的水平的增殖和降低的分化的经修饰T细胞。在一个特定实施方案中，通过在一种或多种刺激信号和作为PI3K细胞信号传导途径的抑制剂的剂的存在下刺激T细胞变活化并增殖来制造T细胞。
然后可以修饰T细胞以使其表达抗BCMA CAR。在一个实施方案中，通过用包含本文考虑的抗BCMA CAR的病毒载体转导T细胞来修饰T细胞。在某一实施方案中，在PI3K细胞信号传导途径的抑制剂的存在下进行刺激和活化之前修饰T细胞。在另一个实施方案中，在PI3K细胞信号传导途径的抑制剂存在下进行刺激和活化之后修饰T细胞。在特定实施方案中，在PI3K细胞信号传导途径的抑制剂的存在下进行刺激和活化的12小时、24小时、36小时或48小时内修饰T细胞。
在T细胞活化后，培养该细胞以使其增殖。可将T细胞培养至少1、2、3、4、5、6或7天，至少2周，至少1、2、3、4、5或6个月或更长时间，其中扩增1、2，3、4、5、6、7、8、9或10轮或更多轮。
在各种实施方案中，在PI3K途径的一种或多种抑制剂的存在下制造T细胞组合物。所述抑制剂可以靶向所述途径中的一种或多种活性，或者单一活性。不希望受任何特定理论的束缚，考虑了在制造工艺的刺激、活化和/或扩增阶段期间，用PI3K途径的一种或多种抑制剂处理或接触T细胞会优先增加年轻T细胞，从而产生优良的治疗性T细胞组合物。
在特定实施方案中，提供了一种用于增加表达经工程改造的T细胞受体的T细胞的增殖的方法。此类方法可以包括，例如，从对象中收获T细胞的来源，在PI3K途径的一种或多种抑制剂的存在下刺激和活化T细胞，修饰T细胞以使其表达抗BCMA CAR，例如抗BCMA02CAR，以及使T细胞在培养中扩增。
在某一实施方案中，一种用于产生富含以下一种或多种生物标志物的表达的T细胞群的方法：CD62L、CCR7、CD28、CD27、CD122、CD127、CD197和CD38。在一个实施方案中，年轻T细胞包含以下的一种或多种或所有生物标志物：CD62L、CD127、CD197和CD38。在一个实施方案中，提供了缺乏CD57、CD244、CD160、PD-1、CTLA4、TIM3和LAG3的表达的年轻T细胞。如本文其它地方所讨论的，年轻T细胞生物标志物的表达水平是相对于此类标志物在分化程度更高的T细胞或免疫效应细胞群体中的表达水平而言。
在一个实施方案中，在本文考虑的T细胞制造方法中，使用外周血单核细胞(PBMC)作为T细胞的来源。PBMC形成异质性T淋巴细胞群，其可以是CD4+、CD8+，或者CD4+和CD8+，并且可以包括其它单核的细胞，诸如单核细胞、B细胞、NK细胞和NKT细胞。可将包含编码本文考虑的经工程改造的TCR或CAR的多核苷酸的表达载体引入到人供体T细胞、NK细胞或NKT细胞的群体中。可以使用流式细胞术分选带有表达载体的经成功转导的T细胞，以分离出CD3阳性T细胞，然后使该T细胞进一步繁殖以增加经修饰T细胞的数量，此外还使用抗CD3抗体和/或抗CD28抗体和IL-2、IL-7和/或IL-15或如本文其它地方所述的本领域已知的任何其它方法进行细胞活化。
本文考虑的制造方法可进一步包括冷冻保存经修饰T细胞，以用于储存和/或配制以供人对象中使用。将T细胞冷冻保存，以使得该细胞解冻后仍能存活。需要时，可以将冷冻保存的经转化的免疫效应细胞解冻，使其生长和扩增以获得更多此类细胞。如本文所用，“冷冻保存”是指通过冷却至零下温度，诸如(通常)77K或-196℃(液氮的沸点)来保存细胞。常常在零下温度使用冷冻保护剂，以防止保存的细胞由于在低温下冷冻或升温到室温而受到损害。冷冻保护剂和最佳的冷却速率可以保护细胞免受损伤。可以使用的冷冻保护剂包括但不限于二甲基亚砜(DMSO)(Lovelock和Bishop，1959；183：1394-1395；Ashwood-Smith，Nature，1961；190：1204-1205)、甘油、聚乙烯吡咯烷酮(Rinfret，Ann.N.Y.Acad.Sci.，1960；85：576)和聚乙二醇(Sloviter和Ravdin，Nature，1962；196：48)。优选的冷却速率是1℃至3℃/分钟。在至少两小时之后，T细胞达到-80℃的温度，并且可以被直接放入到液氮(-196℃)中永久存储，诸如在长期低温存储容器中储存。
5.8.T细胞
本发明考虑了改进的CAR T细胞组合物的制造。用于产生CAR T细胞的T细胞可以是自体的/自身的(“本身的”)或者非自体的(“非本身的”，例如同种异体的、同基因的或异种异体的)。在优选的实施方案中，T细胞获自哺乳动物对象。在更优选的实施方案中，T细胞获自灵长类动物对象。在最优选的实施方案中，T细胞获自人对象。
T细胞可从许多来源获得，所述来源包括但不限于外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾脏组织和肿瘤。在某些实施方案中，可以使用本领域技术人员已知的许多技术，诸如沉降，例如FICOLLTM分离，从收集自对象的一个单位的血液中获得T细胞。在一个实施方案中，来自个体循环血液的细胞通过单采术获得。单采术产品通常含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其它有核白血细胞、红血细胞和血小板。在一个实施方案中，可以洗涤通过单采术收集的细胞以除去血浆级分并将细胞置于适当的缓冲剂或培养基中以用于后续加工。可用PBS或用缺少钙、镁和大多数(即便不是全部)其它二价阳离子的另一种合适的溶液洗涤细胞。如本领域普通技术人员将理解的，洗涤步骤可以通过本领域人员已知的方法来完成，诸如通过使用半自动流通式离心机来完成。例如，Cobe2991细胞处理器、Baxter CytoMate等。洗涤后，可将细胞重悬于各种生物相容性缓冲剂或其它含或不含缓冲剂的盐溶液中。在某些实施方案中，单采术样品中不合需要的组分可以在细胞直接重悬浮的培养基中去除。
在特定实施方案中，在本文考虑的制造方法中使用包含T细胞的细胞群，例如PBMC。在其它实施方案中，在本文考虑的制造方法中使用分离的或纯化的T细胞群。通过使红细胞裂解并清除单核细胞，例如通过经过PERCOLLTM梯度离心，从外周血单核细胞(PBMC)中分离出细胞。在一些实施方案中，在PBMC分离之后，可以在活化、扩增和/或基因修饰之前或之后，将细胞毒性T淋巴细胞和辅助T淋巴细胞分选为原初、记忆和效应T细胞亚群。
可以通过阳性或阴性选择技术进一步分离表达以下一种或多种标志物的特定T细胞亚群：CD3、CD4、CD8、CD28、CD45RA、CD45RO、CD62、CD127和HLA-DR。在一个实施方案中，通过阳性或阴性选择技术进一步分离表达选自由以下组成的组的标志物中的一种或多种的特定T细胞亚群：(i)CD62L、CCR7、CD28、CD27、CD122、CD127、CD197；或(ii)CD38或CD62L、CD127、CD197和CD38。在各种实施方案中，制造的T细胞组合物不表达或基本上不表达以下的一种或多种标志物：CD57、CD244、CD160、PD-1、CTLA4、TIM3和LAG3。
在一个实施方案中，与在不存在PI3K抑制剂的情况下活化和扩增的T细胞群相比较，选自由CD62L、CD127、CD197和CD38组成的组的标志物中的一种或多种的表达增加至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少25倍或更多倍。
在一个实施方案中，与在存在PI3K抑制剂的情况下活化和扩增的T细胞群相比较，选自由CD57、CD244、CD160、PD-1、CTLA4、TIM3和LAG3组成的组的标志物中的一种或多种的表达降低至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少25倍或更多倍。
在一个实施方案中，本文考虑的制造方法增加了包含原初或有发育潜能的T细胞的一种或多种标志物的CAR T细胞的数目。不希望受任何特定理论的束缚，本发明人认为用一种或多种PI3K抑制剂处理包含T细胞的细胞群能导致有发育潜能的T细胞的扩增增加，并且提供了与现有CAR T细胞疗法相比较更稳健且有效的过继CAR T细胞免疫疗法。
在使用本文考虑的方法制造的T细胞中增加的原初或有发育潜能的T细胞的标志物的说明性实例包括但不限于CD62L、CD127、CD197和CD38。在特定实施方案中，原初T细胞不表达或基本上不表达以下的一种或多种标志物：CD57、CD244、CD160、PD-1、BTLA、CD45RA、CTLA4、TIM3和LAG3。
关于T细胞，根据所采用的条件，由本文考虑的各种扩增方法产生的T细胞群可具有多种特定的表型性质。在各种实施方案中，扩增的T细胞群包含以下的一种或多种表型标志物：CD62L、CD127、CD197、CD38和HLA-DR。
在一个实施方案中，此类表型标志物包括CD62L、CD127、CD197和CD38中的一种或多种或全部的增强表达。在特定实施方案中，扩增以包括CD62L、CD127、CD197和CD38在内的原初T细胞的表型标志物的表达为特征的CD8+ T淋巴细胞。
在特定实施方案中，扩增以包括CD45RO、CD62L、CD127、CD197和CD38在内的中央记忆T细胞的表型标志物的表达为特征并且对于颗粒酶B呈阴性的T细胞。在一些实施方案中，中央记忆T细胞是CD45RO+、CD62L+、CD8+T细胞。
在某些实施方案中，扩增以包括CD62L在内的原初CD4+细胞的表型标志物的表达为特征并且对于CD45RA和/或CD45RO表达呈阴性的CD4+T淋巴细胞。在一些实施方案中，CD4+细胞的特征在于包括CD62L在内的中央记忆CD4+细胞的表型标志物的表达并且呈CD45RO呈阳性。在一些实施方案中，效应CD4+细胞呈CD62L阳性和CD45RO阴性。
在某些实施方案中，从个体中分离出T细胞并且对该T细胞进行活化和刺激以使其在体外增殖，之后对其进行基因修饰以使其表达抗BCMA CAR。在这方面，可以在对T细胞进行基因修饰(即，转导或转染以表达本文考虑的抗BCMA CAR)之前和/或之后对T细胞加以培养。
5.8.1.活化和扩增
为了获得足够的治疗剂量的T细胞组合物，往往对T细胞进行一轮或多轮刺激、活化和/或扩增。T细胞一般可以使用如例如美国专利6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；和6,867,041中所描述的方法活化和扩增，所述每个专利均通过引用整体并入本文。被修饰为表达抗BCMA CAR的T细胞可以在修饰该T细胞之前和/或之后被活化和扩增。另外，可以在活化和/或扩增之前、期间和/或之后，使T细胞与一种或多种调节PI3K细胞信号传导途径的剂接触。在一个实施方案中，通过本文考虑的方法制造的T细胞经历一轮、两轮、三轮、四轮或五轮或更多轮的活化和扩增，其中的每一者均可包括一种或多种调节PI3K细胞信号传导途径的剂。
在一个实施方案中，共刺激配体存在于抗原呈递细胞(例如，aAPC、树突状细胞、B细胞等)上，该抗原呈递细胞特异性地结合T细胞上的同源共刺激分子，从而提供了与由例如TCR/CD3复合物的结合而提供的初级信号加在一起介导所需T细胞反应的信号。合适的共刺激配体包括但不限于CD7、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、PD-L 1、PD-L2、4-1BBL、OX40L、诱导型共刺激配体(ICOS-L)、细胞间粘附分子(ICAM)、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、MICB、HVEM、淋巴毒素β受体、ILT3、ILT4、结合Toll配体受体的激动剂或抗体，以及与B7-H3特异性地结合的配体。
在特定实施方案中，共刺激配体包含特异性地结合至T细胞上存在的共刺激分子的抗体或其抗原结合片段，所述T细胞上存在的共刺激分子包括但不限于CD27、CD28、4-IBB、OX40、CD30、CD40、PD-1、1COS、淋巴细胞功能相关抗原1(LFA-1)、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3以及与CD83特异性地结合的配体。
合适的共刺激配体进一步包括靶抗原，其可以以可溶形式提供或者在与经修饰的T细胞上表达的工程改造的TCR或CAR结合的APC或aAPC上表达。
在各种实施方案中，本文考虑的用于制造T细胞的方法包括活化包含T细胞的细胞群并扩增所述T细胞群。T细胞活化可通过经过T细胞TCR/CD3复合物或者经由CD2表面蛋白的刺激提供初级刺激信号，以及通过辅助分子(例如，CD28)提供次级共刺激信号来实现。
通过使T细胞与合适的CD3结合剂(例如，CD3配体或抗CD3单克隆抗体)接触，可以刺激TCR/CD3复合物。CD3抗体的说明性实例包括但不限于OKT3、G19-4、BC3和64.1。
在另一个实施方案中，CD2结合剂可用于向T细胞提供初级刺激信号。CD2结合剂的说明性实例包括但不限于CD2配体和抗CD2抗体，例如T11.3抗体与T11.1或T11.2抗体的组合(Meuer，S.C.等人(1984)Cell 36：897-906)，以及9.6抗体(其识别与TI 1.1相同的表位)与9-1抗体的组合(Yang，S.Y.等人(1986)J.Immunol.137：1097-1100)。也可以使用与上述任何抗体结合至相同的表位的其它抗体。可以通过如本文其它地方所公开的标准技术来制备和鉴定另外的抗体或抗体的组合。
除了通过TCR/CD3复合物或经由CD2提供的初级刺激信号外，T细胞反应的诱导还需要第二共刺激信号。在特定实施方案中，CD28结合剂可用于提供共刺激信号。CD28结合剂的说明性实例包括但不限于：天然CD 28配体，例如CD28的天然配体(例如，B7蛋白家族的成员，诸如B7-1(CD80)和B7-2(CD86)；以及能够与CD28分子交联的抗CD28单克隆抗体或其片段，例如单克隆抗体9.3、B-T3、XR-CD28、KOLT-2、15E8、248.23.2和EX5.3D10。
在一个实施方案中，提供初级刺激信号的分子(例如通过TCR/CD3复合物或CD2提供刺激的分子)和共刺激分子偶联至同一表面。
在某些实施方案中，提供刺激信号和共刺激信号的结合剂位于细胞表面上。这可以通过用编码结合剂的核酸以适合其在细胞表面上表达的形式转染或转导细胞，或者可替代地通过将结合剂偶联至细胞表面来实现。
在另一个实施方案中，提供初级刺激信号的分子(例如通过TCR/CD3复合物或CD2提供刺激的分子)和共刺激分子展示在抗原呈递细胞上。
在一个实施方案中，提供初级刺激信号的分子(例如通过TCR/CD3复合物或CD2提供刺激的分子)和共刺激分子提供在单独的表面上。
在某一实施方案中，提供刺激信号和共刺激信号的结合剂中的一种是可溶的(以溶液形式提供)，而另外的一种或多种结合剂提供在一个或多个表面上。
在特定实施方案中，提供刺激信号和共刺激信号的结合剂均以可溶形式提供(以溶液形式提供)。
在各种实施方案中，本文考虑的用于制造T细胞的方法包括用抗CD3和抗CD28抗体活化T细胞。
通过本文考虑的方法制造的T细胞组合物包含在一种或多种抑制PI3K细胞信号传导途径的剂的存在下活化和/或扩增的T细胞。被修饰为表达抗BCMACAR的T细胞可以在修饰该T细胞之前和/或之后被活化和扩增。在特定实施方案中，活化T细胞群、对其进行修饰以使其表达抗BCMA CAR，然后对其加以培养以进行扩增。
在一个实施方案中，通过本文考虑的方法制造的T细胞包含增加的数量的表达指示高增殖潜能和自我更新能力的标志物，但不表达或表达基本上检测不到的T细胞分化标志物的T细胞。这些T细胞可以以稳健的方式重复活化和扩增，从而提供了改善的治疗性T细胞组合物。
在一个实施方案中，在一种或多种抑制PI3K细胞信号传导途径的剂的存在下活化和扩增的T细胞群与在不存在PI3K抑制剂的情况下活化和扩增的T细胞群相比较，扩增至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少25倍、至少50倍、至少100倍、至少250倍、至少500倍、至少1000倍或更多倍。
在一个实施方案中，在一种或多种抑制PI3K细胞信号传导途径的剂的存在下活化和扩增的以标志物年轻T细胞的表达为特征的T细胞群与在不存在PI3K抑制剂的情况下活化和扩增的T细胞群相比，扩增至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少25倍、至少50倍、至少100倍、至少250倍、至少500倍、至少1000倍或更多。
在一个实施方案中，扩增通过本文考虑的方法活化的T细胞进一步包括将包含T细胞的细胞群体培养数小时(约3小时)至约7天至约28天或介于其间的任何每小时整数值。在另一个实施方案中，可以将T细胞组合物培养14天。在特定实施方案中，将T细胞培养约21天。在另一个实施方案中，将T细胞组合物培养约2-3天。还可能需要几个刺激/活化/扩增的周期，以使得T细胞的培养时间可以是60天或更长。
在特定实施方案中，适合于T细胞培养的条件包括适当的培养基(例如，最小基本培养基或RPMI培养基1640或X-vivo 15，(Lonza))以及增殖和存活力所必需的一种或多种因子，包括但不限于血清(例如胎牛或人血清)、白细胞介素-2(IL-2)、胰岛素、IFN-γ、IL-4、IL-7、IL-21、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、TGFβ和TNF-α或技术人员已知的任何其它适合于细胞生长的添加剂。
细胞培养基的进一步说明性实例包括但不限于其中添加有氨基酸、丙酮酸钠和维生素的RPMI 1640；Clicks；AIM-V；DMEM；MEM；a-MEM；F-12；X-Vivo 1 5和X-Vivo 20；以及优化剂(Optimizer)，它们不含血清或补充有适量的血清(或血浆)或一组确定的激素，以及/或者足够T细胞生长和扩增的量的一种或多种细胞因子。
用于T细胞扩增的其它添加剂的说明性实例包括但不限于表面活性剂、人血浆蛋白粉(piasmanate)、pH缓冲剂(诸如HEPES)和还原剂(诸如N-乙酰半胱氨酸和2-巯基乙醇)
抗生素，例如青霉素和链霉素，仅包括在实验培养物中，而不包括在要注入对象体内的细胞培养物中。将靶细胞维持在支持生长所必需的条件，例如适当的温度(例如，37℃)和大气(例如，空气加上5％CO2)下。
在特定实施方案中，使PBMC或分离的T细胞在具有适当的细胞因子(诸如IL-2、IL-7和/或IL-15)的培养基中与一般附着于珠粒或其它表面的刺激剂和共刺激剂(诸如抗CD3抗体和抗CD28抗体)接触。
在其它实施方案中，可以通过工程改造K562、U937、721.221、T2和C1R细胞来制备人工APC(aAPC)以指导多种共刺激分子和细胞因子的稳定表达和分泌。在特定实施方案中，使用K32或U32 aAPC指导一种或多种基于抗体的刺激分子在AAPC细胞表面上的展示。T细胞群可以被表达多种共刺激分子的aAPC扩增，所述共刺激分子包括但不限于CD137L(4-1BBL)、CD134L(OX40L)和/或CD80或CD86。最后，aAPC提供了一个有效的平台来扩增经基因修饰的T细胞并维持CD8 T细胞上的CD28表达。WO 03/057171和US2003/0147869中提供的aAPC特此通过引用整体并入本文。
5.8.2.剂
在各种实施方案中，提供了一种用于制造T细胞的方法，该方法扩增未分化或有发育潜能的T细胞，该方法包括使T细胞与调节细胞中的PI3K途径的剂接触。在各种实施方案中，提供了一种用于制造T细胞的方法，该方法扩增未分化或有发育潜能的T细胞，该方法包括使T细胞与调节细胞中的PI3K/AKT/mTOR途径的剂接触。可以使该细胞在活化和扩增之前、期间和/或之后接触。T细胞组合物保留了足够的T细胞潜能，使得它们可以经历多轮扩增而没有实质性的分化增加。
如本文所用，术语“调节”、“调节剂”或“调节性剂”或有可比性的术语是指剂引发细胞信号传导途径发生变化的能力。调节剂可以增加或减少途径组分的量、活性，或者增加或减少细胞信号传导途径的期望作用或输出。在一个实施方案中，调节剂是抑制剂。在另一个实施方案中，调节剂是活化剂。
“剂”是指用于调节PI3K/AKT/mTOR途径的化合物，小分子例如小的有机分子，核酸，多肽，或它们的片段、同种型、变体、类似物或衍生物。
“小分子”是指分子量小于约5kD、小于约4kD、小于约3kD、小于约2kD、小于约1kD或小于约.5kD的组合物。小分子可以包括核酸、肽、多肽、模拟肽、类肽、碳水化合物、脂质、其组分或其它有机分子或无机分子。化学和/或生物混合物(诸如真菌、细菌或藻类提取物)的文库在本领域中是已知的，并且可以用本发明的任何测定法进行筛选。分子文库的合成方法是本领域已知的(参见，例如，Carell等人，1994a；Carell等人，1994b；Cho等人，1993；DeWitt等人，1993；Gallop等人，1994；Zuckermann等人，1994)。
“类似物”是指具有与具有本发明所需活性的化合物、核苷酸、蛋白质或多肽或化合物相似或同一的活性或一种或多种功能，但不一定包含与优选实施方案的序列或结构相似或同一的序列或结构的小的有机化合物、核苷酸、蛋白质或多肽。
“衍生物”是指包含已经通过引入氨基酸残基的取代、缺失或添加而改变的亲本蛋白质或多肽的氨基酸序列，或已经通过引入核苷酸的取代或缺失、添加或突变而修饰的核酸或核苷酸的化合物、蛋白质或多肽。衍生核酸、核苷酸、蛋白质或多肽具有与亲本多肽相似或同一的功能。
在各种实施方案中，调节PI3K途径的剂活化该途径的组分。“活化剂”或“激动剂”是指促进、增加或诱导PI3K/AKT/mTOR途径中分子的一种或多种活性的剂，包括但不限于抑制PI3K的一种或多种活性的分子。
在各种实施方案中，调节PI3K途径的剂抑制该途径的组分。“抑制剂”或“拮抗剂”是指抑制、降低或减少PI3K途径中分子的一种或多种活性的剂，包括但不限于PI3K。在一个实施方案中，所述抑制剂是双分子抑制剂。在特定实施方案中，抑制剂可以抑制具有相同或基本上相似的活性的一类分子(泛抑制剂)，或者可以特异性地抑制分子的活性(选择性或特异性抑制剂)。抑制也可以是不可逆的或可逆的。
在一个实施方案中，抑制剂的IC50为至少1nM、至少2nM、至少5nM、至少10nM、至少50nM、至少100nM、至少200nM、至少500nM、至少1μM、至少10μM、至少50μM或至少100μM。可以使用本领域已知的任何常规技术来完成IC50测定。例如，可以通过在一系列浓度的所研究抑制剂的存在下测量给定酶的活性来测定IC50。然后根据所用抑制剂的浓度对实验获得的酶活性值作图。将表现出50％酶活性(与不存在任何抑制剂时的活性相比较)的抑制剂浓度作为“IC50”值。类似地，可以通过适当的活性测定来定义其它抑制浓度。
在各种实施方案中，将T细胞与以下浓度的一种或多种PI3K途径调节剂接触，或者用以下浓度的一种或多种PI3K途径调节剂进行处理，或者与以下浓度的一种或多种PI3K途径调节剂一起培养：至少1nM、至少2nM、至少5nM、至少10nM、至少50nM、至少100nM、至少200nM、至少500nM、至少1μM、至少10μM、至少50μM、至少100μM或至少1M。
在特定实施方案中，可以将T细胞与一种或多种PI3K途径调节剂接触，或者用一种或多种PI3K途径调节剂进行处理，或者与一种或多种PI3K途径调节剂一起培养，持续至少12小时、18小时、至少1、2、3、4、5、6或7天、至少2周、至少1、2、3、4、5或6个月或更长时间，其中扩增1、2，3、4、5、6、7、8、9或10轮或更多轮。
5.8.3.PI3K/Akt/mTOR途径
雷帕霉素途径的磷脂酰肌醇3激酶/Akt/哺乳动物靶标充当将生长因子信号传导与细胞增殖、分化、代谢和存活整合的通道。PI3K是高度保守的细胞内脂质激酶家族。IA类PI3K被生长因子受体酪氨酸激酶(RTK)直接活化或者通过与衔接子分子的胰岛素受体底物家族的相互作用而被活化。该活性导致产生磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸酯(PIP3)，其为丝氨酸/苏氨酸激酶Akt的调控因子。mTOR经由2种不同的复合物通过经典的PI3K途径起作用，每种复合物以赋予不同活性的不同结合伴侣为特征。mTORC1(与PRAS40、raptor和mLST8/GbL复合的mTOR)充当PI3K/Akt信号传导的下游效应子，将生长因子信号与蛋白质翻译、细胞生长、增殖和存活联系在一起。mTORC2(与rictor、mSIN1、protor和mLST8复合的mTOR)充当Akt的上游活化剂。
在生长因子受体介导的P13K活化后，Akt通过其pleckstrin同源结构域与PIP3相互作用而被募集到膜上，从而暴露其活化环并通过组成型活性磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1(PDK1)使苏氨酸308(Thr308)磷酸化。为了最大程度地活化，Akt在其C端疏水基序的丝氨酸473(Ser473)处也被mTORC2磷酸化。还已经证实DNA-PK和HSP在Akt活性的调控中也很重要。Akt通过抑制TSC2的磷酸化来活化mTORC1，TSC2与TSC1一起通过抑制Rheb GTP酶(mTORC1的正向调控因子)来负调控mTORC1。mTORC1具有2种定义明确的底物，p70S6K(以下称为S6K1)和4E-BP1，两者均对蛋白质的合成具有重要的调控作用。因此，mTORC1是PI3K的重要下游效应子，将生长因子信号传导与蛋白质翻译和细胞增殖联系在一起。
5.8.4.PI3K抑制剂
如本文所用，术语“PI3K抑制剂”是指结合至PI3K并且抑制PI3K的至少一种活性的核酸、肽、化合物或有机小分子。PI3K蛋白可分为三类：1类PI3K、2类PI3K和3类PI3K。1类PI3K作为异源二聚体存在，该异源二聚体由四个p110催化亚基(p110α、p110β、p110δ和p110γ)之一与两个调控亚基家族之一组成。本发明的PI3K抑制剂优选靶向1类PI3K抑制剂。在一个实施方案中，PI3K抑制剂将展示出对1类PI3K抑制剂的一种或多种同种型的选择性(即，对p110α、p110β、p110δ和p110γ，或者p110α、p110β、p110δ和p110γ中的一种或多种的选择性)。在另一方面，PI3K抑制剂将不展示出同种型选择性并且被认为是“泛PI3K抑制剂”。在一个实施方案中，PI3K抑制剂将与ATP竞争与PI3K催化结构域结合。
在某些实施方案中，PI3K抑制剂可以例如靶向PI3K以及PI3K-AKT-mTOR途径中的另外的蛋白质。在特定实施方案中，靶向mTOR和PI3K两者的P13K抑制剂可以称为mTOR抑制剂或PI3K抑制剂。仅靶向PI3K的PI3K抑制剂可以称为选择性PI3K抑制剂。在一个实施方案中，选择性PI3K抑制剂可以被理解为是指这样的剂，其相对于PI3K表现出的50％抑制浓度比该抑制剂相对于mTOR和/或该途径中的其它蛋白质表现出的IC50低至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少50倍、至少100倍、至少1000倍或更多倍。
在特定实施方案中，示例性的PI3K抑制剂以约200nM或更低，优选约100nm或更低，甚至更优选约60nM或更低，约25nM、约10nM、约5nM、约1nM、100μM、50μM、25μM、10μM、1μM或更低的IC50(抑制50％活性的浓度)抑制PI3K。在一个实施方案中，PI3K抑制剂以约2nM至约100nm，更优选约2nM至约50nM，甚至更优选约2nM至约15nM的IC50抑制PI3K。
适合于在本文考虑的T细胞制造方法中使用的PI3K抑制剂的说明性实例包括但不限于BKM120(1类PI3K抑制剂，Novartis)、XL147(1类PI3K抑制剂，Exe1ixis)、(泛PI3K抑制剂，GlaxoSmithKline)和PX-866(1类PI3K抑制剂；p110α、p110β和p110γ同种型，Oncothyreon)。
选择性PI3K抑制剂的其它说明性实例包括但不限于BYL719、GSK2636771、TGX-221、AS25242、CAL-101、ZSTK474和IPI-145。
泛P13K抑制剂的进一步说明性实例包括但不限于BEZ235、LY294002、GSK1059615、TG100713和GDC-0941。
5.8.5.AKT抑制剂
如本文所用，术语“AKT抑制剂”是指抑制AKT的至少一种活性的核酸、肽、化合物或有机小分子。AKT抑制剂可分为几类，包括基于脂质的抑制剂(例如，靶向阻止AKT定位于质膜的AKT的pleckstrin同源结构域的抑制剂)、ATP竞争性抑制剂和变构抑制剂。在一个实施方案中，AKT抑制剂通过与AKT催化位点结合而起作用。在特定实施方案中，Akt抑制剂通过抑制下游AKT靶标诸如mTOR的磷酸化起作用。在另一个实施方案中，通过抑制例如AKT的DNA-PK活化、AKT的PDK-1活化和/或Akt的mTORC2活化来抑制用于活化Akt的输入信号，如此来抑制AKT活性。
AKT抑制剂可以靶向所有三种AKT同种型AKT1、AKT2、AKT3，或者可以对同种型具有选择性并且仅靶向该AKT同种型中的一种或两种。在一个实施方案中，AKT抑制剂可以靶向AKT以及PI3K-AKT-mTOR途径中的另外的蛋白质。仅靶向AKT的AKT抑制剂可以称为选择性AKT抑制剂。在一个实施方案中，选择性AKT抑制剂可以被理解为是指这样的剂，其相对于AKT表现出的50％抑制浓度比该抑制剂相对于该途径中的其它蛋白质表现出的IC50低至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少50倍、至少100倍、至少1000倍或更多倍。
在特定实施方案中，示例性的AKT抑制剂以约200nM或更低，优选约100nm或更低，甚至更优选约60nM或更低，约25nM、约10nM、约5nM、约1nM、100μM、50μM、25μM、10μM、1μM或更低的IC50(抑制50％活性的浓度)抑制AKT。在一个实施方案中，AKT抑制剂以约2nM至约100nm，更优选约2nM至约50nM，甚至更优选约2nM至约15nM的IC50抑制AKT。
与基于澳瑞他汀(auristatin)的抗体-药物缀合物组合使用的AKT抑制剂的说明性实例包括，例如，哌福辛(Keryx)、MK2206(Merck)、VQD-002(VioQuest)、XL418(Exelixis)、GSK690693、GDC-0068和PX316(PROLX Pharmaceuticals)。
选择性Akt1抑制剂的说明性、非限制性实例是A-674563。
选择性Akt2抑制剂的说明性、非限制性实例是CCT128930。
在特定实施方案中，Akt抑制剂Akt的DNA-PK活化、Akt的PDK-l活化、Akt的mTORC2活化或Akt的HSP活化。
DNA-PK抑制剂的说明性实例包括但不限于NU7441、PI-103、NU7026、PIK-75和PP-121。
5.8.6.mTOR抑制剂
术语“mTOR抑制剂”或“抑制mTOR的剂”是指抑制mTOR蛋白的至少一种活性，例如丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(例如，p70S6激酶1、4E-BP1、AKT/PKB和eEF2)对其至少一种底物的活性的核酸、肽、化合物或有机小分子。mTOR抑制剂能够直接结合至并抑制mTORC1、mTORC2，或mTORC1和mTORC2两者。
mTORC1和/或mTORC2活性的抑制可通过PI3K/Akt/mTOR途径的信号转导的减少来确定。可以利用各种各样的读出信息(readout)来确定此类信号传导途径的输出的减少。一些非限制性的示例性读出信息包括：(1)残基(包括但不限于5473和T308)处Akt的磷酸化的降低；(2)例如通过Akt底物(包括但不限于Fox01/O3a T24/32、GSK3a/β、S21/9和TSC2T1462)的磷酸化的减少所证实的Akt活化的降低；(3)mTOR下游的信号传导分子(包括但不限于核糖体S6 S240/244、70S6K T389和4EBP1 T37/46)的磷酸化的降低；以及(4)癌细胞增殖的抑制。
在一个实施方案中，mTOR抑制剂是活性位点抑制剂。这些是与mTOR的ATP结合位点(也称为ATP结合口袋)结合并抑制mTORC1和mTORC2两者的催化活性的mTOR抑制剂。适合于在本文所考虑的T细胞制造方法中使用的一类活性位点抑制剂是靶向并直接抑制PI3K和mTOR的双重特异性抑制剂。双重特异性抑制剂结合至mTOR和PI3K两者的ATP结合位点。此类抑制剂的说明性实例包括但不限于：咪唑并喹唑啉、渥曼青霉素(wortmannin)、LY294002、PI-103(Cayman Chemical)、SF1126(Semafore)、BGT226(Novartis)、XL765(Exelixis)和NVP-BEZ235(Novartis)。
相对于一种或多种I型磷脂酰肌醇3-激酶，例如PI3激酶α、β、γ或δ，适合于在本文考虑的方法中使用的另一类mTOR活性位点抑制剂选择性地抑制mTORC1和mTORC2活性。这些活性位点抑制剂结合至mTOR的活性位点而不是PI3K的活性位点。此类抑制剂的说明性实例包括但不限于：吡唑并嘧啶、Torin1(Guertin和Sabatini)，PP242(2-(4-氨基-1-异丙基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3-基)-1H-吲哚-5-醇)、PP30、Ku-0063794、WAY-600(Wyeth)、WAY-687(Wyeth)、WAY-354(Wyeth)和AZD8055(Liu等人，Nature Review，8，627-644，2009)。
在一个实施方案中，选择性mTOR抑制剂是指这样的剂，其相对于mTORC1和/或mTORC2表现出的50％抑制浓度(IC50)比该抑制剂相对于一种、两种、三种或更多种I型PI3激酶或所有I型PI3激酶表现出的IC50低至少10倍、至少20倍、至少50倍、至少100倍、至少1000倍或更多倍。
用于本发明的另一类mTOR抑制剂在本文中称为“雷帕霉素类似物(rapalog)”。如本文所用，术语“雷帕霉素类似物”是指特异性地结合至mTOR FRB结构域(FKBP雷帕霉素结合结构域)，在结构上与雷帕霉素相关并且保留了mTOR抑制性质的化合物。术语雷帕霉素类似物不包括雷帕霉素。雷帕霉素类似物包括雷帕霉素的酯、醚、肟、腙和羟胺，以及其中雷帕霉素核心结构上的官能团已经例如通过还原或氧化进行修饰的化合物。此类化合物的药学上可接受的盐也被认为是雷帕霉素衍生物。适合于在本文考虑的方法中使用的雷帕霉素类似物的说明性实例包括但不限于替西罗莫司(temsirolimus)(CC1779)、依维莫司(everolimus)(RAD001)、地磷莫司(deforolimus)(AP23573)、AZD8055(AstraZeneca)和OSI-027(OSI)。
在一个实施方案中，所述剂是mTOR抑制剂雷帕霉素(西罗莫司(sirolimus))。
在特定实施方案中，用于本发明的示例性的mTOR抑制剂以约200nM或更低，优选约100nm或更低，甚至更优选约60nM或更低，约25nM、约10nM、约5nM、约1nM、100μM、50μM、25μM、10μM、1μM或更低的IC50(抑制50％活性的浓度)抑制mTORC1、mTORC2或mTORC1和mTORC2两者。在一方面，用于本发明的mTOR抑制剂以约2nM至约100nm，更优选约2nM至约50nM，甚至更优选约2nM至约15nM的IC50抑制mTORC1、mTORC2或mTORC1和mTORC2两者。
在一个实施方案中，示例性的mTOR抑制剂以约200nM或更低，优选约100nm或更低，甚至更优选约60nM或更低，约25nM、约10nM、约5nM、约1nM、100μM、50μM、25μM、10μM、1μM或更低的IC50(抑制50％活性的浓度)抑制PI3K和mTORC1或mTORC2，或者mTORC1和mTORC2两者和PI3K。在一方面，用于本发明的mTOR抑制剂以约2nM至约100nm，更优选约2nM至约50nM，甚至更优选约2nM至约15nM的IC50抑制PI3K和mTORC1或mTORC2，或者mTORC1和mTORC2两者和PI3K。
适合于在本文考虑的特定实施方案中使用的mTOR抑制剂的进一步说明性实例包括但不限于AZD8055、INK128、雷帕霉素、PF-04691502和依维莫司(everolimus)。
正如在Western印迹法中通过磷特异性抗体测量的，已证实mTOR对生理底物蛋白、p70 S6核糖体蛋白激酶I(p70S6K1)和eIF4E结合蛋白1(4EBP1)表现出稳健而特异性的催化活性。
在一个实施方案中，PI3K/AKT/mTOR途径的抑制剂是选自由以下组成的组的s6激酶抑制剂：BI-D1870、H89、PF-4708671、FMK和AT7867。
5.9.组合物和制剂
如本文所考虑的，本文考虑的组合物可以包含一种或多种多肽、多核苷酸、包含它们的载体、经基因修饰的免疫效应细胞等。组合物包括但不限于药物组合物。“药物组合物”是指在药学上可接受的或生理学上可接受的溶液中配制的、用于单独地或与一种或多种其它治疗方式组合施用给细胞或动物的组合物。还应理解，如果需要，本发明的组合物也可以与其它剂诸如细胞因子、生长因子、激素、小分子、化学治疗剂、前药、药物、抗体或其它各种药物活性剂组合施用。实际上对还可以包含在组合物中的其它组分没有限制，条件是另外的剂不会对组合物递送预期疗法的能力产生不利影响。
短语“药学上可接受的”在本文中用于指在合理的医学判断范围内，适合与人和动物的组织接触使用而没有过量毒性、刺激性、过敏反应或其它问题或并发症，与合理的利益/风险比相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。
如本文所用，“药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂”包括但不限于已被美国食品和药物管理局批准为可用于人或家畜的任何佐剂、载体、赋形剂、助流剂、甜味剂、稀释剂、防腐剂、染料/着色剂、增味剂、表面活性剂、润湿剂、分散剂、助悬剂、稳定剂、等渗剂、溶剂、表面活性剂或乳化剂。示例性的药学上可接受的载体包括但不限于糖，诸如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，诸如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，诸如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；黄蓍胶；麦芽；明教；滑石粉；可可油、蜡、动物和植物脂肪、石蜡、硅酮、膨润土、硅酸、氧化锌；油，诸如花生油、棉籽油、向日葵油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；二醇，诸如丙二醇；多元醇，诸如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；酯，诸如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，诸如氢氧化镁和氢氧化铝；海藻酸；无热原水；等渗盐水；林格氏溶液；乙醇；磷酸盐缓冲溶液；以及药物制剂中采用的任何其它相容性物质。
在特定实施方案中，本发明的组合物包含一定量的本文考虑的表达CAR的免疫效应细胞。如本文所用，术语“量”是指用于实现有益或期望的防治或治疗结果(包括临床结果)的经基因修饰的治疗细胞(例如T细胞)的“有效的量”或“有效量”。
“防治有效量”是指有效实现期望的防治结果的经基因修饰的治疗细胞的量。通常但不一定，因为防治剂量是在疾病之前或在疾病的早期阶段在对象中使用的，所以防治有效量小于治疗有效量。
经基因修饰的治疗细胞的“治疗有效量”可根据多种因素而变化，所述因素诸如个体的疾病状态、年龄、性别和重量，以及干细胞和祖细胞在个体中引发期望反应的能力。治疗有效量也是治疗有益作用超过病毒或经转导的治疗细胞的任何毒性或有害作用的量。术语“治疗有效量”包括有效地“治疗”对象(例如，患者)的量。当指示出治疗量时，医师可以考虑患者(对象)的年龄、重量、肿瘤大小、感染或转移程度以及状况的个体差异来确定要施用的本发明组合物的精确剂量。一般可以这么说，包含本文所述的T细胞的药物组合物可以以102至1010个细胞/kg体重，优选105至106个细胞/kg体重的剂量(包括在那些范围内的所有整数值)施用。细胞的数目将取决于组合物所预期的最终用途，以及其中所含细胞的类型。对于本文提供的用途，细胞的体积一般为1升或更小，可以为500mL或更小，甚至250mL或100mL或更小。因此，所需细胞的密度通常大于106个细胞/ml，并且一般大于107个细胞/ml，一般为108个细胞/ml或更高。可以将临床相关数目的免疫细胞分配成多次输注，累积等于或超过105、106、107、108、109、1010、1011或1012个细胞。在本发明的某些方面，特别是由于所有输注的细胞将被重定向至特定的靶抗原(例如，K或λ轻链)，因此可以施用在106个/千克(每位患者106-1011个)的范围内的较少数目的细胞。可以按这些范围内的剂量多次施用表达CAR的细胞组合物。所述细胞对于接受疗法的患者可以是同种异体的、同基因的、异种异体的或自体的。如果需要，所述治疗还可以包括施用如本文所述的有丝分裂原(例如，PHA)或淋巴因子、细胞因子和/或趋化因子(例如，IFN-γ、IL-2、IL-12、TNF-α、IL-18和TNF-β-、GM-CSF、IL-4、IL-13、Flt3-L、RANTES、MIP1α等)以增强免疫反应的诱导。
一般来说，包含如本文所述活化和扩增的细胞的组合物可用于治疗和预防免疫受损的个体中出现的疾病。具体而言，包含本文考虑的经CAR修饰的T细胞的组合物用于治疗B细胞恶性肿瘤。本发明的经CAR修饰的T细胞可以单独施用，或者与载体、稀释剂、赋形剂和/或与其它组分诸如IL-2或其它细胞因子或细胞群组合，作为药物组合物施用。在特定实施方案中，本文考虑的药物组合物包含一定量的经基因修饰的T细胞与一种或多种药学上或生理上可接受的载体、稀释剂或赋形剂的组合。
包含表达CAR的免疫效应细胞群(诸如T细胞)的本发明的药物组合物可以包含缓冲剂，诸如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸，诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，诸如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。本发明的组合物优选配制用于肠胃外施用，例如血管内(静脉内或动脉内)、腹膜内或肌内施用。
液体药物组合物，无论是溶液、悬浮液还是其它类似形式，都可以包括以下的一种或多种：无菌稀释剂，诸如注射用水、盐水溶液(优选生理盐水)、林格氏溶液、等渗氯化钠、不挥发性油(诸如可以用作溶剂或悬浮介质的合成甘油单酯或甘油二酯)、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它溶剂；抗菌剂，诸如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，诸如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，诸如乙二胺四乙酸；缓冲剂，诸如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐，以及用于调节张力的剂，诸如氯化钠或右旋糖。肠胃外制品可以封装在由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。可注射药物组合物优选是无菌的。
在特定实施方案中，本文考虑的组合物包含有效量的单独的或与一种或多种治疗剂组合在一起的表达CAR的免疫效应细胞。因此，表达CAR的免疫效应细胞组合物可以单独施用或与其它已知的癌症治疗组合施用，所述已知的癌症治疗诸如放疗、化疗、移植、免疫疗法、激素疗法、光动力疗法等。所述组合物也可以与抗生素组合施用。此类治疗剂可以在本领域中被接受作为用于如本文所述的特定疾病状态(诸如特定癌症)的标准治疗。考虑的示例性治疗剂包括细胞因子、生长因子、类固醇、NSAID、DMARD、抗炎药、化学治疗剂、放射治疗剂、治疗性抗体或其它活性剂和辅助剂。
在某些实施方案中，可以将本文公开的包含表达CAR的免疫效应细胞的组合物与许多化学治疗剂联合施用。化学治疗剂的说明性实例包括烷化剂，诸如噻替派(thiotepa)和环磷酰胺(CYTOXANTM)；烷基磺酸酯，诸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶类，诸如苯佐替派(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替哌(meturedopa)和乌瑞替派(uredopa)；乙烯亚胺类和甲基蜜胺类(methylamelamines)，包括六甲蜜胺、三亚乙基蜜胺、三亚乙基磷酰胺(triethylenethiophosphaoramide)、三亚乙基硫代磷酰胺和三羟甲基甲基三聚氰胺(trimethylolomelamine resume)；氮芥类，诸如苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、双氯乙基甲胺氧化物盐酸盐(mechlorethamineoxide hydrochloride)、美法仑、新恩比兴(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、乌拉莫司汀(uracilmustard)；亚硝基脲类，诸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)、雷莫司汀(ranimustine)；抗生素，诸如阿克拉霉素(aclacinomysin)、放线菌素(actinomycin)、安曲霉素(authramycin)、重氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素C(cactinomycin)、卡利奇霉素(calicheamicin)、卡柔比星(carabicin)、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)；丝裂霉素类、酶酚酸(mycophenolic acid)、诺加霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycins)、培来霉素(peplomycin)、potfiromycin、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodombicin)、链黑霉素(streptonigrin)、链脲酶素(streptozocin)、杀结核菌素(tubercindin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物类，诸如甲氨喋呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物诸如二甲叶酸(denopterin)、甲氨蝶呤、蝶罗呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘧啶、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，诸如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮杂尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)、5-FU；雄激素类，诸如卡普睾酮(calusterone)、屈他雄酮丙酸酯(dromostanolone propionate)、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酪(testolactone)；抗肾上腺类诸如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，诸如亚叶酸(frolinic acid)；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defofamine)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；依洛尼塞(elformithine)；依利醋铵(elliptinium acetate)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidamine)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基酰肼；丙卡巴肼(procarbazine)；
Figure BDA0002971836970000551
雷佐生(razoxane)；西佐喃(sizofiran)；锗螺胺(spirogermanium)；西交链孢菌酮酸(tenuazonicacid)；三亚胺醌(triaziquone)；2，2′，2″-三氯乙胺；乌拉坦(urethan)；长春地辛；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿糖胞苷(″Ara-C″)；环磷酰胺；噻替派；紫杉烷类，例如紫杉醇(
Figure BDA0002971836970000561
Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，N.J.)和多西他赛(doxetaxel)(
Figure BDA0002971836970000562
Rhone-Poulenc Rohrer，Antony，France)；苯丁酸氮芥(chlorambucil)；吉西他滨(gemcitabine)；6-硫代鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物诸如顺铂和卡铂；长春碱；铂；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺；丝裂霉素C；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱(vincristine)；长春瑞滨(vinorelbine)；诺维本(navelbine)；novantrone；替尼泊苷(teniposide)；道诺霉素(daunomycin)；氨基蝶呤；希罗达(xeloda)；伊班膦酸盐(ibandronate)；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(difluorometlhylomithine)(DMFO)；视黄酸衍生物，诸如TargretinTM(蓓萨罗丁(bexarotene))、PanretinTM(阿利维甲酸(alitretinoin))；ONTAKTM(地尼白介素(denileukin diftitox))；埃斯波霉素(esperamicin)；卡培他滨(capecitabine)；以及上述任一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。该定义中还包括调控或抑制激素对癌症的作用的抗激素剂，诸如抗雌激素类，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)、雷洛昔芬(raloxifene)、抑制芳香酶的4(5)-咪唑、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、雷洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮(onapristone)和托瑞米芬(toremifene)(Fareston)；以及抗雄激素类，诸如氟他胺(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、比卡鲁胺(bicalutamide)、亮丙瑞林(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin)；以及上述任一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
多种其它治疗剂可以与本文所述的组合物联合使用。在一个实施方案中，将包含表达CAR的免疫效应细胞的组合物与抗炎剂一起施用。抗炎剂或抗炎药包括但不限于类固醇和糖皮质激素(包括倍他米松(betamethasone)、布地奈德(budesonide)、地塞米松(dexamethasone)、醋酸氢化可的松(hydrocortisone acetate)、氢化可的松(hydrocortisone)、氢化可的松、甲基泼尼松龙(methylprednisolone)、泼尼松龙(prednisolone)、泼尼松(prednisone)、去炎松(triamcinolone))、非甾体抗炎药(NSAIDS)(包括阿司匹林(aspirin)、布洛芬(ibuprofen)、萘普生(naproxen)、甲氨蝶呤、柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine)、来氟米特(leflunomide)、抗TNF药物、环磷酰胺和霉酚酸酯)。
其它示例性NSAID选自由布洛芬、萘普生、萘普生钠、Cox-2抑制剂(诸如
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(罗非昔布(rofecoxib))和
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(塞来昔布(celecoxib)))和唾液酸盐(sialylate)组成的组。示例性的镇痛剂选自由对乙酰氨基酚(acetaminophen)、羟考酮(oxycodone)、曲马多(tramadol)和盐酸丙氧芬(propoxyphene hydrochloride)组成的组。示例性的糖皮质激素选自由可的松、地塞米松、氢化可的松、甲基泼尼松龙、泼尼松龙和泼尼松组成的组。示例性的生物反应调节剂包括针对细胞表面标志物(例如CD4、CD5等)的分子；细胞因子抑制剂，诸如TNF拮抗剂(例如依那西普(etanercept)
Figure BDA0002971836970000565
阿达木单抗(adalimumab)
Figure BDA0002971836970000566
和英夫利昔单抗(infliximab)
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趋化因子抑制剂和粘附分子抑制剂。生物反应调节剂包括单克隆抗体以及分子的重组形式。示例性的DMARD包括硫唑嘌呤(azathioprine)、环磷酰胺、环孢霉素、甲氨蝶呤、青霉素、来氟米特、柳氮磺胺吡啶、羟化氯喹、金(口服(金诺芬)和肌内)和米诺环素(minocycline)。
适合与本文考虑的经CAR修饰的T细胞组合的治疗性抗体的说明性实例包括但不限于巴维昔单抗(bavituximab)、贝伐单抗(bevacizumab)(阿瓦斯汀(avastin))、贝伐珠单抗(bivatuzumab)、博纳吐单抗(blinatumomab)、加尼妥单抗(conatumumab)、达雷木单抗(daratumumab)、度利戈妥单抗(duligotumab)、达西珠单抗(dacetuzumab)、达洛珠单抗(dalotuzumab)、埃罗妥珠单抗(elotuzumab)(HuLuc63)、吉妥珠单抗(gemtuzumab)、替伊莫单抗(ibritumomab)、英达妥昔单抗(indatuximab)、奥英妥珠单抗(inotuzumab)、洛妥珠单抗(lorvotuzumab)、鲁图莫单抗(lucatumumab)、米拉珠单抗(milatuzumab)、莫索妥玛单抗(moxetumomab)、奥卡妥珠单抗(ocaratuzumab)、奥法木单抗(ofatumumab)、利妥昔单抗(rituximab)、司妥昔单抗(siltuximab)、替普妥单抗(teprotumumab)和乌妥昔单抗(ublituximab)。
针对PD-1或PD-L1和/或CTLA-4的抗体可与本文公开的CAR T细胞(例如BCMA CART细胞，例如表达包含BCMA-2单链Fv片段(例如bb2121)的嵌合抗原受体的CART细胞)组合使用。在特定实施方案中，PD-1抗体选自由以下组成的组：纳武单抗(nivolumab)、派姆单抗(pembrolizumab)和匹地珠单抗(pidilizumab)。在特定实施方案中，PD-L1抗体选自由以下组成的组：阿特珠单抗(atezolizumab)、阿维单抗(avelumab)、度伐利尤单抗(durvalumab)和BMS-986559。在特定实施方案中，CTLA-4抗体选自由以下组成的组：伊匹木单抗(ipilimumab)和替西木单抗(tremelimumab)。
在某些实施方案中，本文所述的组合物与细胞因子联合施用。如本文所用的“细胞因子”意指由一个细胞群释放的、作为细胞间介体作用于另一细胞的蛋白质的通称。此类细胞因子的实例是淋巴因子、单核因子和传统的多肽激素。细胞因子中包括生长激素，诸如人生长激素、N-甲硫氨酰基人生长激素以及牛生长激素；甲状旁腺激素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素，诸如促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)以及黄体化激素(LH)；肝脏生长因子；成纤维细胞生长因子；促乳素；胎盘催乳素；肿瘤坏死因子-α和肿瘤坏死因子-β；苗勒抑制物质(mullerian-inhibiting substance)；小鼠促性腺激素相关肽；抑制素；活化素；血管内皮生长因子；整联蛋白；促血小板生成素(TPO)；神经生长因子，诸如NGF-β；血小板生长因子；转化生长因子(TGF)，诸如TGF-α和TGF-β；胰岛素样生长因子-I和胰岛素样生长因子-II；红细胞生长素(EPO)；骨诱导因子；干扰素，诸如干扰素-α、干扰素-β以及干扰素-γ；集落刺激因子(CSF)，诸如巨噬细胞-CSF(M-CSF)；粒细胞-巨噬细胞-CSF(GM-CSF)；和粒细胞-CSF(G-CSF)；白细胞介素(IL)，诸如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-15、IL-21；肿瘤坏死因子，诸如TNF-α和TNF-β；以及其它多肽因子，包括LIF和kit配体(KL)。如本文所用，术语细胞因子包括来自天然来源或来自重组细胞培养物的蛋白质，以及天然序列细胞因子的生物活性等效物。
在特定实施方案中，组合物包含本文考虑的CAR T细胞，所述CAR T细胞在如本文公开的PI3K抑制剂存在下培养，并表达以下标志物中的一种或多种：CD3、CD4、CD8、CD28、CD45RA、CD45RO、CD62、CD127和HLA-DR，并可以通过阳性或阴性选择技术进一步分离。在一个实施方案中，组合物包含特定的T细胞亚群，所述特定的T细胞亚群表达选自由CD62L、CCR7、CD28、CD27、CD122、CD127、CD197；以及CD38或CD62L、CD127、CD197和CD38组成的组的标志物中的一种或多种，并且通过阳性或阴性选择技术进一步分离。在各种实施方案中，组合物不表达或基本上不表达以下标志物中的一种或多种：CD57、CD244、CD160、PD-1、CTLA4、TIM3和LAG3。
在一个实施方案中，与在不存在PI3K抑制剂的情况下活化和扩增的T细胞群相比较，选自由CD62L、CD127、CD197和CD38组成的组的标志物中的一种或多种的表达增加至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少25倍或更多倍。
在一个实施方案中，与在存在PI3K抑制剂的情况下活化和扩增的T细胞群相比较，选自由CD57、CD244、CD160、PD-1、CTLA4、TIM3和LAG3组成的组的标志物中的一种或多种的表达降低至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少25倍或更多倍。
5.10.治疗方法
本文考虑的经基因修饰的免疫效应细胞提供了用于治疗B细胞相关病状的过继免疫疗法的改进方法，所述B细胞相关病状包括但不限于免疫调控病状和血液恶性肿瘤。
5.10.1.具体实施方案
在一个实施方案中，本文提供了一种清除有需要的对象中的表达BCMA的细胞的方法，所述方法包括向所述对象施用治疗有效量的表达针对B细胞成熟抗原(BCMA)的嵌合抗原受体(CAR)的免疫细胞，其中所述免疫细胞以150×106个细胞至450×106个细胞的剂量施用，并且其中在所述施用之前，所述对象已经接受了一个或多个系列的既往疗法，所述一个或多个系列的既往疗法包含以下中的一种或多种：蛋白酶体抑制剂、来那度胺、泊马度胺、沙利度胺、硼替佐米、地塞米松、环磷酰胺、多柔比星、卡非佐米、伊沙佐米、顺铂、多柔比星、依托泊苷、抗CD38抗体(诸如达雷木单抗)、帕比司他或埃罗妥珠单抗。
在另一个实施方案中，本文提供了一种治疗有需要的对象中由表达BCMA的细胞引起的疾病的方法，所述方法包括向所述对象施用治疗有效量的表达针对B细胞成熟抗原(BCMA)的嵌合抗原受体(CAR)的免疫细胞，其中所述免疫细胞以150×106个细胞至450×106个细胞的剂量施用，并且其中在所述施用之前，所述对象已经接受了一个或多个系列的既往疗法，所述一个或多个系列的既往疗法包含以下中的一种或多种：蛋白酶体抑制剂、来那度胺、泊马度胺、沙利度胺、硼替佐米、地塞米松、环磷酰胺、多柔比星、卡非佐米、伊沙佐米、顺铂、多柔比星、依托泊苷、抗CD38抗体(诸如达雷木单抗)、帕比司他或埃罗妥珠单抗。
在另一个实施方案中，本文提供了一种治疗有需要的对象中表达BCMA的癌症的方法，所述方法包括向所述对象施用治疗有效量的表达针对B细胞成熟抗原(BCMA)的嵌合抗原受体(CAR)的免疫细胞，其中所述免疫细胞以150×106个细胞至450×106个细胞的剂量施用，并且其中在所述施用之前，所述对象已经接受了一个或多个系列的既往疗法，所述一个或多个系列的既往疗法包含以下中的一种或多种：蛋白酶体抑制剂、来那度胺、泊马度胺、沙利度胺、硼替佐米、地塞米松、环磷酰胺、多柔比星、卡非佐米、伊沙佐米、顺铂、多柔比星、依托泊苷、抗CD38抗体(诸如达雷木单抗)、帕比司他或埃罗妥珠单抗；其中表达BCMA的癌症是多发性骨髓瘤、慢性淋巴细胞性白血病或非霍奇金淋巴瘤(例如伯基特氏淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病/小淋巴细胞性淋巴瘤(CLL/SLL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、免疫母细胞性大细胞淋巴瘤、前体B淋巴母细胞性淋巴瘤和套细胞淋巴瘤)。
在任何上述实施方案的具体实施方案中，在所述施用之前，所述对象已经接受了一个或多个系列的既往疗法，所述一个或多个系列的既往疗法包含以下：达雷木单抗、泊马度胺和地塞米松(DPd)；达雷木单抗、硼替佐米和地塞米松(DVd)；伊沙佐米、来那度胺和地塞米松(IRd)；达雷木单抗、来那度胺和地塞米松；硼替佐米、来那度胺和地塞米松(RVd)；硼替佐米、环磷酰胺和地塞米松(BCd)；硼替佐米、多柔比星和地塞米松；卡非佐米、来那度胺和地塞米松(CRd)；硼替佐米和地塞米松；硼替佐米、沙利度胺和地塞米松；来那度胺和地塞米松；地塞米松、沙利度胺、顺铂、多柔比星、环磷酰胺、依托泊苷和硼替佐米(VTD-PACE)；来那度胺和低剂量地塞米松；硼替佐米、环磷酰胺和地塞米松；卡非佐米和地塞米松；单独的来那度胺；单独的硼替佐米；单独的达雷木单抗；埃罗妥珠单抗、来那度胺和地塞米松；埃罗妥珠单抗、来那度胺和地塞米松；苯达莫司汀、硼替佐米和地塞米松；苯达莫司汀、来那度胺和地塞米松；泊马度胺和地塞米松；泊马度胺、硼替佐米和地塞米松；泊马度胺、卡非佐米和地塞米松；硼替佐米和多柔比星脂质体；环磷酰胺、来那度胺和地塞米松；埃罗妥珠单抗、硼替佐米和地塞米松；伊沙佐米和地塞米松；帕比司他、硼替佐米和地塞米松；帕比司他和卡非佐米；或泊马度胺、环磷酰胺和地塞米松。
在上述任一项的某些更具体的实施方案中，所述对象已经接受了所述系列的既往疗法中的两个或更多个系列、所述系列的既往疗法中的三个或更多个系列、所述系列的既往疗法中的四个或更多个系列、所述系列的既往疗法中的五个或更多个系列、所述系列的既往疗法中的六个或更多个系列，或所述系列的既往疗法中的七个或更多个系列。在上述任一项的某些其它更具体的实施方案中，所述对象已经接受了所述系列的既往疗法中的不超过三个系列、所述系列的既往疗法中的不超过两个系列，或所述系列的既往疗法中的不超过一个系列。
对于任何上述实施方案，所述对象在所述施用之前经受淋巴细胞清除。对于任何上述实施方案，对象经受单采术(apheresis)以收集和分离所述免疫细胞，例如T细胞。在任何上述实施方案的具体实施方案中，所述对象在所述单采术时表现出：M蛋白(血清蛋白电泳[sPEP]或尿蛋白电泳[uPEP])：sPEP≥0.5g/dL或uPEP≥200mg/24小时；在血清或尿中没有可测量到的疾病的情况下的轻链多发性骨髓瘤，其中血清免疫球蛋白游离轻链≥10mg/dL且血清免疫球蛋白游离轻链κ/λ比率异常；和/或东部肿瘤协作组(ECOG)体能状态≤1。在更具体的实施方案中，所述对象在单采术时另外：已经接受了所述系列的既往治疗中的至少三个系列，包括用蛋白酶体抑制剂、免疫调节剂(来那度胺或泊马度胺)和抗CD38抗体进行的既往治疗；已经经历了针对所述至少三个系列的既往治疗中的每一个系列的至少2个连续的治疗周期，除非疾病进展是对某一系列治疗的最佳反应；在最近的系列的既往治疗的过程中或60天内具有疾病进展的迹象；以及/或者已经对所述既往系列的治疗中的至少一个系列获得了反应(最低限度的反应或更佳)。
在另一个更具体的实施方案中，所述对象另外：仅接受过一种既往抗骨髓瘤治疗方案；具有以下高危因素：R-ISS III期和早期复发，所述早期复发被定义为：(i)如果对象已经历诱导加干细胞移植，则自首次移植之日起少于12个月出现疾病进展；或(ii)如果对象仅接受过诱导，则自最后一次治疗方案之日起＜12个月出现PD，所述最后一次治疗方案必须最少含有蛋白酶体抑制剂、免疫调节剂和地塞米松。
在任何上述实施方案的具体实施方案中，所述对象在所述施用后表现出至少六个月的无进展生存期，或者在所述施用后表现出至少十二个月的无进展生存期。
在任何上述实施方案的具体实施方案中，所述嵌合抗原受体包含靶向BCMA的抗体或抗体片段，例如单链Fv抗体片段(scFv)，例如BCMA02 scFv。在本文任何实施方案的更具体的实施方案中，所述免疫细胞是bb2121细胞。
5.10.2.一般实施方案
在特定实施方案中，通过用本文考虑的CAR对初级免疫效应细胞进行基因修饰，将初级免疫效应细胞的特异性重定向至B细胞。在各种实施方案中，病毒载体被用于用编码CAR的特定多核苷酸对免疫效应细胞进行基因修饰，所述CAR包含：结合BCMA多肽的鼠抗BCMA抗原结合结构域；铰链结构域；跨膜(TM)结构域，将TM结构域连接到CAR的细胞内信号传导结构域的短的寡肽或多肽接头；和一个或多个细胞内共刺激信号传导结构域；和初级信号传导结构域。
在一个实施方案中，本发明包括一种类型的细胞疗法，其中T细胞被基因修饰成表达靶向表达BCMA的B细胞的CAR。在另一个实施方案中，在IL-2和PI3K抑制剂的存在下培养抗BCMA CAR T细胞，以增加CAR T细胞的治疗特性和持久性。然后向有需要的受者输注CART细胞。输注的细胞能够杀伤受者中的致病B细胞。与抗体疗法不同，CAR T细胞能够在体内复制，导致长期持续存在，长期持续存在可导致持续的癌症疗法。
在一个实施方案中，本发明的CAR T细胞可以经历稳健的体内T细胞扩增并且可以长时间持续存在。在另一个实施方案中，本发明的CAR T细胞进化成特异性记忆T细胞，其可以被重新活化以抑制任何另外的肿瘤形成或生长。
在具体实施方案中，包含含有本文考虑的CAR的免疫效应细胞的组合物用于治疗与异常B细胞活性相关的病状。
可以使用包含本文考虑的CAR的免疫效应细胞治疗、预防或改善的病状的说明性实例包括但不限于：全身性红斑狼疮、类风湿性关节炎、重症肌无力、自身免疫性溶血性贫血、特发性血小板减少性紫癜、抗磷脂综合征、恰加斯氏病(Chagas’disease)、格雷夫氏病(Grave’s disease)、韦格纳肉芽肿(Wegener′s granulomatosis)、结节性多动脉炎、干燥综合征(Sjogren’s syndrome)、寻常性天疱疮、硬皮病、多发性硬化、抗磷脂综合症、ANCA相关性血管炎、古德帕斯病(Goodpasture′s disease)、川崎病(Kawasaki disease)和快速进行性肾小球肾炎。
经修饰的免疫效应细胞还可以应用于浆细胞病症，诸如重链疾病、原发性或与免疫细胞相关的淀粉样变性和意义不明的单克隆丙种球蛋白病(MGUS)。
如本文所用，“B细胞恶性肿瘤”是指如下文所论述的在B细胞(一种类型的免疫系统细胞)中形成的一种类型的癌症。
在特定实施方案中，包含本文考虑的经CAR修饰的T细胞的组合物用于治疗血液恶性肿瘤，包括但不限于B细胞恶性肿瘤，诸如多发性骨髓瘤(MM)和非霍奇金淋巴瘤(NHL)。
多发性骨髓瘤是成熟浆细胞形态的B细胞恶性肿瘤，其特征在于这些类型细胞的单个克隆的肿瘤转化。这些浆细胞在骨髓(BM)中增殖，并且可侵入邻近的骨骼，有时侵入血液。多发性骨髓瘤的变体形式包括明显的多发性骨髓瘤、冒烟型多发性骨髓瘤、浆细胞白血病、非分泌性骨髓瘤、IgD骨髓瘤、骨硬化性骨髓瘤、骨孤立性浆细胞瘤和髓外浆细胞瘤(参见，例如Braunwald等人(编著)，Harrison’s Principles of Internal Medicine，第15版(McGraw-Hill 2001))。
多发性骨髓瘤可分期如下：
表3：Durie-Salmon MM分期标准
Figure BDA0002971836970000611
表4：国际分期系统MM分期标准
Figure BDA0002971836970000612
非霍奇金淋巴瘤涵盖一大类淋巴细胞(白血细胞)癌症。非霍奇金淋巴瘤可发生于任何年龄，往往以大于正常的淋巴结、发烧和体重减轻为标志。非霍奇金淋巴瘤有许多不同类型。例如，非霍奇金淋巴瘤可分为侵袭性(快速生长)和惰性(缓慢生长)类型。尽管非霍奇金淋巴瘤可源自B细胞和T细胞，但如本文所用的术语“非霍奇金淋巴瘤”和“B细胞非霍奇金淋巴瘤”可互换使用。B细胞非霍奇金淋巴瘤(NHL)包括伯基特氏淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病/小淋巴细胞性淋巴瘤(CLL/SLL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、免疫母细胞性大细胞淋巴瘤、前体B淋巴母细胞性淋巴瘤和套细胞淋巴瘤。骨髓或干细胞移植后发生的淋巴瘤通常是B细胞非霍奇金淋巴瘤。
慢性淋巴细胞性白血病(CLL)是一种惰性(缓慢生长)的癌症，其会导致称为B淋巴细胞或B细胞的未成熟白细胞缓慢增加。癌细胞通过血液和骨髓扩散，并且还可影响淋巴结或其它器官，诸如肝脏和脾脏。CLL最终导致骨髓衰竭。有时，在疾病晚期，该疾病称为小淋巴细胞性淋巴瘤。
在特定实施方案中，提供了包括将治疗有效量的本文考虑的表达CAR的免疫效应细胞或包含所述免疫效应细胞的组合物单独地或与一种或多种治疗剂组合施用给有需要的患者的方法。在某些实施方案中，本发明的细胞用于治疗处于罹患与异常B细胞活性相关的病状或B细胞恶性肿瘤的风险中的患者。因此，本发明提供了用于治疗或预防与异常B细胞活性相关的病状或B细胞恶性肿瘤的方法，该方法包括向有需要的对象施用治疗有效量的本文考虑的经CAR修饰的细胞。
如本文所用，术语“个体”和“对象”往往可互换使用，并且是指表现出可以用基因治疗载体、基于细胞的治疗剂和本文其它地方公开的方法治疗的疾病、病症或病状的症状的任何动物。在优选实施方案中，对象包括表现出可以用基因治疗载体、基于细胞的治疗剂和本文其它地方公开的方法治疗的造血系统的疾病、病症或病状(例如B细胞恶性肿瘤)的症状的任何动物。合适的对象(例如，患者)包括实验动物(诸如小鼠、大鼠、兔或豚鼠)、农场动物和家畜或宠物(诸如猫或狗)。包括非人灵长类动物，优选人患者。典型的对象包括患有B细胞恶性肿瘤、已被诊断出患有B细胞恶性肿瘤，或者有患B细胞恶性肿瘤的风险的人患者。
如本文所用，术语“患者”是指已被诊断出患有可以用基因治疗载体、基于细胞的治疗剂和本文其它地方公开的方法治疗的特定疾病、病症或病状的对象。
如本文所用，“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”包括对疾病或病理病状的症状或病理的任何有益或期望的效果，并且可以包括对所治疗的疾病或病状的一种或多种可测量标志物的甚至最小的减少。治疗可以任选地涉及减轻或改善疾病或病状的症状，或延迟疾病或病状的进展。“治疗”不一定表示完全根除或治愈该疾病或病状或其相关症状。
如本文所用，“预防(prevent)”和类似的词诸如“预防(prevented)”、“预防(preventing)”等表示用于预防、抑制或减少疾病或病状发生或复发的可能性的途径。它还指延迟疾病或病状的发作或复发，或者延迟疾病或病症的症状的发生或复发。如本文所用，“预防”和类似词语还包括在疾病或病状发作或复发之前减轻该疾病或病状的强度、影响、症状和/或负担。
“增强”或“促进”或“增加”或“扩增”一般是指本文所考虑的组合物(例如，编码CAR的经基因修饰的T细胞或载体)产生、引发或引起与媒介物或对照分子/组合物所引起的反应相比较大的生理反应(即下游作用)的能力。从本领域的理解和本文的描述中显而易见的是，可测量的生理反应可以包括T细胞扩增、活化、持久性的增加以及/或者癌细胞杀伤能力的增加，等等。“增加”或“增强”的量通常是“统计学上显著”的量，并且可以包括比媒介物或对照组合物所产生的反应增加1.1、1.2、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30倍或更多倍(例如，500、1000倍)(包括介于其间且大于1的所有整数和小数点，例如1.5、1.6、1.7、1.8等)。
“减少”或“降低”或“减轻”或“减小”或“减弱”一般是指本文所考虑的组合物产生、引发或引起与媒介物或对照分子/组合物所引起的反应相比较小的生理反应(即下游作用)的能力。“减少”或“减小”的量通常是“统计学上显著”的量，并且可以包括比媒介物、对照组合物所产生的反应(参考反应)或者在特定细胞谱系中的反应减少1.1、1.2、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30倍或更多倍(例如，500、1000倍)(包括介于其间且大于1的所有整数和小数点，例如1.5、1.6、1.7、1.8等)。
“保持”或“保留”或“维持”或“无变化”或“无实质性变化”或“无实质性减少”一般是指本文所考虑的组合物在细胞中产生、引发或引起与媒介物、对照分子/组合物所产生的反应或者在特定细胞谱系中的反应相比较基本上相似的生理反应(即下游作用)的能力。有可比性的反应是与参考反应没有显著差异或可测量差异的反应。
在一个实施方案中，治疗有需要的对象中的B细胞相关病状的方法包括施用有效量(例如治疗有效量)的包含本文考虑的经基因修饰的免疫效应细胞的组合物。施用的数量和频率将由诸如患者的状况以及患者疾病的类型和严重程度等因素来确定，但可通过临床试验确定适当的剂量。
在一个实施方案中，施用给对象的组合物中T细胞的量为至少0.1×105个细胞、至少0.5×105个细胞、至少1×105个细胞、至少5×105个细胞、至少1×106个细胞、至少0.5×107个细胞、至少1×107个细胞、至少0.5×108个细胞、至少1×108个细胞、至少0.5×109个细胞、至少1×109个细胞、至少2×109个细胞、至少3×109个细胞、至少4×109个细胞、至少5×109个细胞或至少1×1010个细胞。在特定实施方案中，向对象施用约1×107个CAR T细胞至约1×109个CAR T细胞，约2×107个CAR T细胞至约0.9×109个CAR T细胞，约3×107个CAR T细胞至约0.8×109个CAR T细胞，约4×107个CAR T细胞至约0.7×109个CAR T细胞，约5×107个CAR T细胞至约0.6×109个CAR T细胞，或约5×107个CAR T细胞至约0.5×109个CAR T细胞。
在一个实施方案中，施用给对象的组合物中T细胞的量为至少0.1×104个细胞/kg体重，至少0.5×104个细胞/kg体重，至少1×104个细胞/kg体重，至少5×104个细胞/kg体重，至少1×105个细胞/kg体重，至少0.5×106个细胞/kg体重，至少1×106个细胞/kg体重，至少0.5×107个细胞/kg体重，至少1×107个细胞/kg体重，至少0.5×108个细胞/kg体重，至少1×108个细胞/kg体重，至少2×108个细胞/kg体重，至少3×108个细胞/kg体重，至少4×108个细胞/kg体重，至少5×108个细胞/kg体重，或至少1×109个细胞/kg体重。在特定实施方案中，向对象施用约1×106个CAR T细胞/kg体重至约1×108个CAR T细胞/kg体重，约2×106个CAR T细胞/kg体重至约0.9×108个CAR T细胞细胞/kg体重，约3×106个CAR T细胞/kg体重至约0.8×108个CAR T细胞/kg体重，约4×106个CAR T细胞/kg体重至约0.7×108个CART细胞/kg体重，约5×106个CAR T细胞/kg体重至约0.6×108个CAR T细胞/kg体重，或约5×106个CAR T细胞/kg体重至约0.5×108个CAR T细胞/kg体重。
本领域的普通技术人员将认识到，可能需要多次施用本发明的组合物以实现期望疗法。例如，组合物可以在1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、1年、2年、5年、10年或更长时间的跨度中施用1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次或更多次。
在某些实施方案中，可能期望向对象施用经活化的免疫效应细胞，然后随后抽血(或进行单采术)，根据本发明从抽取的血液中活化免疫效应细胞，并向患者重新输注这些经活化和扩增的免疫效应细胞。该过程可以每几周进行多次。在某些实施方案中，可以从10cc至400cc的抽取的血液中活化免疫效应细胞。在某些实施方案中，从20cc、30cc、40cc、50cc、60cc、70cc、80cc、90cc、100cc、150cc、200cc、250cc、300cc、350cc或400cc或更多的抽取的血液中活化免疫效应细胞。不受理论的束缚，使用这种多次抽血/多次重新输注方案可助于选出免疫效应细胞的某些群体。
本文考虑的组合物的施用可以以包括通过气雾剂吸入、注射、摄入、输血、植入或移植在内的任何方便的方式进行。在优选的实施方案中，组合物是经肠胃外施用的。如本文所用的短语“肠胃外施用”和“经肠胃外施用”是指除肠内和局部施用以外的施用模式，通常通过注射施用，并且包括但不限于血管内、静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、肿瘤内、心脏内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下、表角质层下(subcuticular)、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内和胸骨内注射和输注。在一个实施方案中，通过直接注射到肿瘤、淋巴结或感染部位中，将本文考虑的组合物施用于对象。
在一个实施方案中，向有需要的对象施用有效量的组合物，以增加对该对象中B细胞相关病状的细胞免疫反应。该免疫反应可以包括由能够杀伤受感染的细胞、调控性T细胞和辅助T细胞反应的细胞毒性T细胞介导的细胞免疫反应。也可以诱导主要由能够活化B细胞从而导致抗体产生的辅助T细胞介导的体液免疫反应。多种技术可以用于分析由本发明的组合物诱导的免疫反应的类型，这在本领域中有很好的描述；例如，Current Protocolsin Immunology，John E.Coligan，Ada M.Kruisbeek，David H.Margulies，EthanM.Shevach编著，Warren Strober(2001)John Wiley&Sons，NY，N.Y.。
在T细胞介导的杀伤的情况下，CAR-配体结合会启动向T细胞的CAR信号传导，导致多种T细胞信号传导途径的活化，从而诱导T细胞产生或释放能够通过各种机制诱导靶细胞凋亡的蛋白质。这些T细胞介导的机制包括(但不限于)细胞内细胞毒性颗粒从T细胞转移至靶细胞中，T细胞分泌可直接(或通过募集其它杀伤性效应细胞而间接)诱导靶细胞杀伤的促炎细胞因子，以及T细胞表面上的死亡受体配体(例如，FasL)上调，所述死亡受体配体在与它们的在靶细胞上的靶同源死亡受体(例如Fas)结合后诱导靶细胞凋亡。
在一个实施方案中，本发明提供了一种治疗被诊断出患有B细胞相关病状的对象的方法，该方法包括从被诊断出患有表达BCMA的B细胞相关病状的对象中取出免疫效应细胞，用包含编码如本文所考虑的CAR的核酸的载体对所述免疫效应细胞进行基因修饰，从而产生经修饰的免疫效应细胞群体，以及将经修饰的免疫效应细胞群体施用于同一对象。在优选的实施方案中，免疫效应细胞包含T细胞。
在某些实施方案中，本发明还提供了用于刺激免疫效应细胞介导的免疫调节剂对对象中靶细胞群体的反应的方法，其包括向对象施用表达编码CAR分子的核酸构建体的免疫效应细胞群体的步骤。
用于施用本文所述的细胞组合物的方法包括任何这样的方法，所述方法有效地导致直接表达本发明的CAR的离体基因修饰的免疫效应细胞被重新引入到对象中，或者导致在引入到对象中时分化为表达CAR的成熟免疫效应细胞的免疫效应细胞的经基因修饰的祖细胞被重新引入。一种方法包括用根据本发明的核酸构建体离体转导外周血T细胞，并将经转导的细胞送回至对象中。
在本说明书中引用的所有出版物、专利申请和已发布的专利均据此以引用的方式整体并入本文，如同每个单独的出版物、专利申请或授权专利被明确且单独地指出以引用的方式并入。
尽管为了清楚地理解，已经通过说明和实例的方式对前述发明进行了相当详细的描述，但是本领域普通技术人员鉴于本发明的教示显而易知可在不背离所附权利要求书的精神或范围的情况下作出某些变化和修改。以下实施例通过说明而非限制的方式来提供。本领域的技术人员将容易地识别多种非关键性参数，所述参数可以变化或修改以产生实质上类似的结果。
6.实施例
6.1.实施例1：BCMACAR的构建
将含有鼠抗BCMA scFv抗体的CAR设计为含有与抗BMCA scFv可操作地连接的MND启动子、来自CD8α的铰链和跨膜结构域以及CD137共刺激结构域，然后是CD3ζ链的细胞内信号传导结构域。参见，例如图1。图1所示的BCMA CAR包含用于在免疫效应细胞上表面表达的CD8α信号肽(SP)序列。示例性的BCMA CAR的多核苷酸序列示于SEQ ID NO：10(抗BCMA02CAR的多核苷酸序列)中；BCMA CAR的示例性多肽序列示于SEQ ID NO：9(抗BCMA02 CAR的多肽序列)中；图1示出了示例性CAR构建体的载体图。表5给出了BCMA CAR慢病毒载体的各个核苷酸区段的身份、基因库参考、来源名称和引文。
表5.
Figure BDA0002971836970000651
Figure BDA0002971836970000661
Figure BDA0002971836970000671
6.2.实施例2：对鼠BCMA CAR的评价
6.2.1.简介
经嵌合抗原受体(CAR)基因工程改造的T细胞的过继转移已成为有前景的治疗癌症的途径。CAR是一种人造分子，其由经由跨膜区与T细胞信号传导结构域融合的抗原反应性单链可变片段(scFv)构成。在该实施例中，评价了对B细胞成熟抗原(BCMA)具有特异性的CAR分子。BCMA在多发性骨髓瘤、浆细胞瘤和一些淋巴瘤上表达，但正常表达仅限于浆细胞(Avery等人，2003；Carpenito等人，2009；Chiu等人，2007)。
使用来自小鼠抗BCMA抗体(C11D5.3)的序列构建抗BCMA02 CAR。抗BCMA10 CAR是使用经修饰的序列构建的并且是抗-BCMA02 CAR的“人源化”型式。在一系列体外测定中，抗BCMA02 CAR T细胞和抗BCMA10 CAR T细胞均表现出肿瘤特异性、高CAR表达并引起对表达抗原的靶标的强有力的反应性。已证实抗BCMA02 CAR T细胞和抗BCMA10 CAR T细胞能与表达BCMA的肿瘤细胞系具有有可比性的反应性。尽管抗BCMA02 CAR T细胞和抗BCMA10 CAR T细胞均能够在小鼠肿瘤模型中引起消退，但是抗BCMA10 CAR T细胞展示出非抗原依赖性的炎性细胞因子分泌，因此有可能引起与高细胞因子水平相关的临床毒性。
6.2.2.结果
6.2.2.1.与凋亡相关的抗BCMA10 T细胞的滋补性炎性细胞因子释放
在多发性骨髓瘤患者的血清中可检测到BCMA蛋白(Sanchez等人，2012)。多发性骨髓瘤患者的平均血清BCMA为10ng/mL，但峰值达到100ng/mL的水平。评价了生理可溶性BCMA水平对抗BCMA CAR T细胞候选物的影响。
在与可溶性BCMA一起培养24小时后，检查了抗BCMA02 CAR T细胞、抗BCMA10 CART细胞和CAR19ΔT细胞的IFNγ释放(图2A)。在与多达1ug/mL BCMA一起培养24小时后，抗BCMA02 CAR T细胞以最低限度的细胞因子释放作出应答。相比之下，抗BCMA10 CAR T细胞以与添加到培养物中的可溶性BCMA浓度成比例的递增的IFNγ水平作出应答。在多发性骨髓瘤患者中报告的最高水平100ng/mL BCMA下，抗BCMA10 CAR T细胞分泌82.1ng/ml IFNγ，而相比之下，抗BCMA02 CAR T细胞分泌28.8ng/ml IFNγ。甚至在用抗BCMA10 CAR T细胞加上缺少BCMA抗原的对照细胞系进行的几个共同培养实验中也检测到IFNγ(图2B，K562共培养物)。这些数据表明，抗BCMA10 CAR T细胞对可溶性BCMA刺激具有增强的敏感性，并且在T细胞中具有非抗原依赖性的细胞因子反应的潜力。
检查了抗BCMA02 CAR T细胞、抗BCMA10 CART细胞(培养启动后10天)和CAR19ΔT细胞的滋补细胞因子分泌的潜力。在制造CAR T细胞之后，分析了来自抗BCMA02 CAR T细胞、抗BCMA10CART细胞和CAR19ΔT细胞培养物的生长培养基中是否存在炎性细胞因子。尽管不存在抗原刺激，但抗BCMA10 CAR T细胞培养物含有高于10ng/mL的IFNγ，而相比之下，抗BCMA02 CAR T细胞培养物含有低于1ng/mL的IFNγ(图3)。抗BCMA10 CAR T细胞培养物也含有显著更多(p＜0.001)的TNFα。为了进一步定量在不存在抗原刺激的情况下抗BCMA10CAR T细胞产生的细胞因子的量，在24小时的培养过程中测量了5×104个CAR T细胞的细胞因子释放。与抗BCMA02 CAR T细胞相比较，抗BCMA10 CAR T细胞产生显著更高的量的炎性细胞因子MIP1α、IFNγ、GMCSF、MIP1β、IL-8和TNFα(图4，p＜0.0001)。在检查的所有细胞因子中，MIP1α和IFNγ浓度最高。抗BCMA10 CAR T细胞产生4.7ng MIP1α/5×104个细胞/24小时、3.0ng IFNγ/5×104个细胞/24小时和～1ng/5×104个细胞/24小时或更少的其它细胞因子。未检测到抗炎细胞因子IL-10、IL-2和IL-4的显著差异。
测量抗BCMA10 CAR T细胞制造结束时T细胞活化的表型标志物的表达，以检查滋补炎性细胞因子的分泌是否指示抗BCMA10 CAR T细胞中的过度活跃状态。HLA-DR和CD25是表面标志物，其正常情况下在T细胞活化后12-24小时表现出峰值表达，然后随时间而减少。由三个正常供体制备的CAR T细胞显示，平均40±2％的抗BCMA02 CAR T细胞表达HLA-DR。在这些细胞中HLA-DR的表达与未转导的(43±2.3％)T细胞和CAR19Δ(32±2.2％)对照T细胞具有可比性。相比之下，88±1.2％的抗BCMA10 CAR T细胞表达HLA-DR(图5)。与抗BCMA02CAR T细胞相比较，在抗BCMA10 CAR T细胞上另一种活化标志物CD25的表达也较高(53±0.9％对比35±2.4％)。因此，在不存在添加的抗原的情况下，抗BCMA10 CAR T细胞表现出活化T细胞的表型特征。
T细胞中的过度活性往往与活化诱导的细胞凋亡所致的细胞死亡(AICD)相关。测量了活化的半胱天冬酶-3的水平，以检查抗BCMA10 CAR T细胞的过度活性是否可导致与抗BCMA02 CAR T细胞相比较更高的凋亡水平。来自两个供体的48％的抗BCMA10 CAR T细胞具有活性半胱天冬酶-3，而相比之下，16％的抗BCMA02 CAR T细胞具有活性半胱天冬酶-3(图6)。因此，在不存在添加的BCMA抗原的情况下，与抗BCMA02 CAR T细胞相比较，抗BCMA10CAR T细胞含有更高频率的与活化和炎性细胞因子分泌增加相关的凋亡细胞。
评价了抗BCMA02 CAR T细胞和抗BCMA10 CAR T细胞以确定该CAR T细胞是否可以对低BCMA水平选择性地反应或者与用于T细胞生长的人血清中的无关抗原交叉反应。将T抗BCMA02 CAR T细胞和抗BCMA10 CAR T细胞维持在缺乏人血清的培养基中两天，然后在存在或不存在100ng/mL可溶性BCMA的情况下转换到含有胎牛血清(FBS)、人血清(HABS)或HABS的培养基中(图7)。24小时后通过ELISA测定IFNγ释放。抗BCMA02 CAR T细胞和抗BCMA10CAR T细胞均对可溶性BCMA有反应。然而，抗BCMA10 CAR T细胞分泌的IFNγ是抗BCMA02CAR T细胞的10倍。在不存在BCMA的情况下，无论是在胎牛血清(FBS)(p＝0.0002)还是人AB血清(HABS)(p＝0.0007)中培养，仅抗BCMA10 CAR T细胞释放IFNγ。这些数据表明，炎性细胞因子分泌是抗BCMA10 CAR T细胞固有的。
6.2.2.2.抗BCMA10 CAR T细胞在多发性骨髓瘤小鼠模型中的抗肿瘤功能较弱
过度活化和凋亡增加可能对患者中的CAR T细胞持久性产生负面影响，并最终对临床功效产生负面影响。在小鼠肿瘤模型中检查了抗BCMA02 CAR T细胞和抗BCMA10 CAR T细胞的抗肿瘤功能。用107个抗BCMA02 CAR T细胞、107个抗BCMA10 CAR T细胞或硼替佐米
Figure BDA0002971836970000691
处理具有～100mm3的实验皮下人多发性骨髓瘤(RPMI-8226)的NOD-scidγ(NSG)小鼠。用卡尺监测RPMI-8226的生长。在两个独立的实验中(图8A和图8B)，与媒介物对照动物相比较，硼替佐米控制肿瘤生长。用抗BCMA02 CAR T细胞过继转移的动物表现出快速而持久的肿瘤清除(插图放大了早期的肿瘤消退)。抗BCMA10 CAR T细胞的过继转移也引起肿瘤消退，但是与抗BCMA02 CAR T细胞相比较，在这两个实验中均被延迟。
6.2.3.结论
抗BCMA02 CAR T细胞和抗BCMA10 CAR T细胞在体外测定中表现出有可比性的抗肿瘤功能，但抗BCMA10 CAR T细胞具有可能对患者治疗的安全性和功效产生负面影响的特征。暴露于生理水平的BCMA蛋白中后，抗BCMA10 CAR T细胞以炎性细胞因子的分泌作出强烈反应。细胞因子风暴或细胞因子释放综合征是与CAR T细胞疗法相关的已知临床毒性。在观察到抗BCMA10 CAR T细胞的滋补活性后，对细胞因子释放至BCMA的担忧加剧。即使在不存在抗原刺激的情况下，抗BCMA10 CAR T细胞也会释放出高水平的炎性细胞因子。持续的细胞因子分泌有可能引起大量的临床毒性并对抗肿瘤功能产生负面影响。实际上，在多发性骨髓瘤的小鼠模型中，与抗BCMA02 CAR T细胞培养物相比较，我们在抗BCMA10 CAR T细胞中发现具有更高的凋亡细胞组成和较弱的抗肿瘤功能。
参考文献
Avery et al.，(2003).BAFF selectively enhances the survival ofplasmablasts generated from human memory B cells.J Clin Invest，112(2)，286-297.
Carpenito et al.，(2009).Control of large，established tumor xenograftswith genetically retargeted human Tcells containing CD28 and CDI 37domains.Proc Natl Acad Sci USA，106(9)，3360-3365.
Chiu et al.，(2007).Hodgkin lymphoma cells express TAC！and BCMAreceptors and generate survival and proliferation signals in response to BAFFand APRIL.Blood，109(2)，729-739。
Sanchez et al.，(2012).Serum B-cellmaturation antigen is elevated inmultiple myeloma and correlates with disease status and survival.Br JHaematol，158(6)，727-738。
6.3.实施例3：淋巴瘤上最低限度的BCMA表达活化抗BCMA CAR T细胞
测量淋巴瘤和白血病细胞系(Daudi和Raji)上的BCMA表达水平，以确定该表达是否足以活化抗BCMA02 CAR T细胞。
使用流式细胞术对淋巴瘤、白血病和多发性骨髓瘤细胞上的BCMA表达进行定量。在该测定中，通过使BCMA表达的荧光强度与已知数量的被结合抗体(抗体结合能力，ABC)相关联来评估所述细胞上的相对BCMA表达。将淋巴瘤细胞系中的BCMA表达水平与已知会活化抗BCMA02 CAR T细胞的多发性骨髓瘤细胞系(RPMI-8226)的BCMA表达水平进行比较。12590±1275个BCMA02分子在RPMI-8226细胞的表面上表达。相比之下，Daudi细胞表达1173±234个BCMA02分子，而JeKo-1细胞(套细胞淋巴瘤细胞系)仅表达222±138个BCMA02分子(图9，圆圈)。
在另一组实验中，测试了在淋巴瘤和白血病细胞系上观察到的抗BCMA02 CAR T细胞对微量水平的BCMA的活性(图9，方框)。使用标准方法制取抗BCMA02 CAR T细胞，并且在用BCMA阳性和BCMA阴性肿瘤细胞系共同培养后通过IFNγELISA评估活性。共同培养后，抗BCMA02 CAR T细胞的反应性与各种肿瘤细胞系表面上BCMA mRNA表达的相对量(高于阈值)和/或BCMA受体密度相关(图9)。在BCMA CAR T细胞与BCMA阴性(BCMA-)肿瘤细胞系：骨髓性白血病(K562)、急性淋巴母细胞白血病(NALM-6和NALM-16)；套细胞淋巴瘤(REC-1)；或霍奇金淋巴瘤(HDLM-2)共同培养后，很少的(如果有的话)IFNγ被释放出来。相比之下，在BCMA02 CAR T细胞与BCMA阳性(BCMA+)肿瘤细胞系：B细胞慢性淋巴母细胞性白血病(MEC-1)、套细胞淋巴瘤(JeKo-1)、霍奇金淋巴瘤(RPMI-6666)、伯基特淋巴瘤(Daudi细胞和Ramos细胞)和多发性骨髓瘤(RPMI-8226)共同培养后，大量IFNγ被释放出来。
抗BCMA02 CAR T细胞对表达BCMA的伯基特淋巴瘤细胞(Daudi细胞)的反应性扩展到了体内动物研究。Daudi细胞也表达CD19。将抗BCMA02 CAR T细胞的体内活性与抗CD19CAR T细胞的体内活性进行比较。给NOD scidγ(NSG)小鼠静脉注射2×106个Daudi细胞，并让其积聚大量全身性肿瘤负荷，然后再用CAR T细胞治疗。在肿瘤诱导后第8天和第18天施用CAR T细胞(分别为图10A和图10B)。如生物发光的对数期增加所证明的，媒介物和阴性对照(抗CD19ΔCAR T细胞)未能阻止肿瘤生长，导致体重减轻和死亡(图10A，最左边的两个小鼠图)。抗CD19和抗BCMA02 CAR T细胞阻止肿瘤生长，使得体重和存活率得以维持。当在第8天施用时，抗CD19和抗BCMA02 CAR T细胞同样有效(图10A，最右边的两个小鼠图)。当在肿瘤诱导后18天施用时，抗BCMA02 CAR T细胞也有效地降低肿瘤负荷。图10B，最右边的图。
6.4.实施例4：抗BCMA CAR T细胞的强有力的体外活性
抗BCMA02 CAR T细胞的强有力的体外活性通过抗BCMA02 CAR表达降低50％来实现。用介于4×108个与5×107个之间的转导单位的编码抗BCM02A CAR分子的慢病毒转导T细胞群。所得的T细胞群体显示出降低的抗BCMA02 CAR T细胞频率(以阳性百分比测定)和降低的抗BCMA02 CAR分子的表达(以平均荧光强度：MFI测定)。
确定了CAR分子表达减少对抗BCMA02活性的影响。用未转导的T细胞将抗BCMA CAR阳性T细胞的频率归一化为含有26±4％的BCMA反应性T细胞(图11A)。归一化的抗BCMA02CAR T细胞的MFI范围为885至1875(图11B)。K562是一种缺乏BCMA表达的CML细胞系。K562细胞被工程改造为表达BCMA并用于体外溶细胞测定中以评估具有变化的BCMA CAR表达的抗BCMA02 CAR T细胞的活性(图11C)。将K562细胞用细胞追踪紫(cell trace violet)标记，而稳定表达BCMA的K562细胞(K562-BCMA)用CFSE标记。收获T细胞、K562细胞和K562-BCMA细胞，对其进行洗涤并将其重悬于缺乏外源细胞因子的培养基中。将细胞以20∶1或10∶1的效应子(E；T细胞)：靶标(T；K562和K562BCMA细胞的1∶1混合物)比率，在37℃、5％CO2培养箱中培养4小时。然后将细胞用Live/Dead染色并通过FACS进行分析。通过针对缺乏T细胞的条件归一化的K562：K562-BCMA细胞比率的差异来确定细胞毒性。
6.5.实施例5：抗BCMACAR T细胞的制造过程
针对每种患者治疗制造独特的抗BCMA02 CAR T细胞产品。通过从11种单独的正常供体PBMC制取抗BCMA02 CAR T细胞来评估抗BCMA02 CAR T细胞产品制造过程的可靠性。来自每个供体的抗BCMA02 CAR T细胞扩增与并行进行的匹配的未转导培养物具有可比性(图12A)。
在培养期结束时(第10天)，通过用qPCR和慢病毒特异性引物集(载体拷贝数，VCN)对整合的慢病毒的数目进行定量来评估T细胞转导效率。来自11个供体的抗BCMA02CAR T细胞培养物表现出有可比性的慢病毒转导效率(图12B)。通过流式细胞术测量抗BCMA02 CAR阳性T细胞的频率，发现BCMA表达在所有供体中都具有可比性(图12C)。
与被工程改造为表达BCMA的K562细胞共同培养后，通过IFNγ释放评估每种抗BCMA02 CAR T细胞产品的活性。当暴露于表达BCMA的K562细胞中时，所有抗BCMA CAR02 T细胞产品均表现出治疗相关的IFNγ释放水平(图12D)。
6.6.实施例6：用IL-2，或者IL-2和ZSTK474处理的CAR T细胞上的CD62L、CD127、CD197和CD38表达
同与单独的IL-2一起培养的CAR T细胞相比较，与IL-2和ZSTK474一起培养的CART细胞显示出增加的CD62L表达。使用多参数质谱流式细胞术(CyTOF)对29种另外的细胞表面标志物在与IL-2和ZSTK474一起培养的抗BCMA02 CAR T细胞上的表达进行分析，并同与单独的IL-2一起培养的CAR T细胞进行比较。同用单独的IL-2处理的CAR T细胞相比较，三种另外的标志物(CD127、CD197和CD38)在经IL-2+ZSTK474处理的CAR T细胞中显示出增加的表达。因此，CD62L、CD127、CD197和CD38的共表达进一步对ZSTK474培养的CAR T细胞进行了分层。在含有IL-2的培养基中培养后，7.44％的抗BCMA02 CAR T共表达CD127、CD197和CD38，而相比之下，与IL-2和ZSTK474一起培养的抗BCMA02 CAR T细胞共表达CD127、CD197和CD38的比例为24.5％。图13中的维恩图说明了CD127、CD197和CD38在CD62L阳性抗BCMA02T细胞中的共表达。
6.7.实施例7：ZSTK474处理增加了CD8 T细胞的频率
在用单独的IL-2处理或者用IL-2和ZSTK474处理的抗BCMA02 CAR T细胞中定量CD8表达。使用荧光标记的抗CD8抗体和流式细胞术确定CD8的表达。同与单独IL-2一起培养的抗BCMA02 CAR T细胞相比较，来自与IL-2和ZSTK474一起培养的七个正常供体的抗BCMA02 CAR T细胞具有显著更高的CD8表达。图14。
6.8.实施例8：在经ZSTK474处理的抗BCMACAR T细胞中缺乏非抗原依赖性活性
在不存在抗原的情况下，CAR T细胞的滋补活性与降低的生物学活性相关。同利用单独IL-2的标准培养条件相比较，通过定量在IL-2和ZSTK474的存在下培养后在不存在抗原的情况下干扰素-γ(IFN-γ)的释放来评估抗BCMA02 CAR T细胞的滋补活性。使用可直接扩大至大型临床制造过程的系统制备抗BCMA CAR T细胞培养物。简言之，将外周血单核细胞(PBMC)在静态烧瓶中的含有IL-2(CellGenix)以及对CD3和CD28有特异性的抗体(Miltenyi Biotec)的培养基中培养。培养启动后一天，添加2×108个转导单位的编码抗BCMA CAR的慢病毒。
通过添加含有IL-2和最适剂量的ZSTK474的新鲜培养基，将抗BCMA02 CAR T细胞维持在对数期，共培养10天。在制造结束时，将相等数量的抗BCMA02 CAR T细胞在单独的培养基中再培养24小时。通过ELISA定量在24小时内释放的IFN-γ的量。在该测定中，低于200pg/mL的IFN-γ水平表示没有滋补活性。图15显示来自14个供体的抗-BCMA02 CAR T细胞释放的IFN-γ的量与缺乏滋补活性一致，无论CAR T细胞是否与ZSTK474一起培养。
6.9.实施例9：经ZSTK474处理的抗BCMA02 CAR T细胞在淋巴瘤肿瘤模型中显示出治疗活性
使用Daudi肿瘤检查与IL-2，或者IL-2和ZSTK474一起培养的抗BCMA02 CAR T细胞的抗肿瘤活性。Daudi细胞表达低水平的BCMA蛋白，并提供侵袭性且难以治疗的淋巴瘤肿瘤模型。
将2×106个Daudi肿瘤细胞用萤火虫荧光素酶基因标记，并通过静脉注射将其注射到NOD scidIL-2受体γ链敲除小鼠(NSG)中。在使肿瘤形成之后，将1×107个CAR T细胞注射到荷瘤小鼠中。为小鼠注射i)用IL-2，或者IL-2和ZSTK474处理十天的抗BCMA02CAR T细胞；或ii)用IL-2和ZSTK474处理十天的截短的信号传导缺陷型抗BCMA02(tBCMA02)CAR T细胞。使用Xenogen-IVIS成像系统通过生物发光监测肿瘤的生长。
在施用了用IL-2和ZSTK474处理的抗BCMA02 CAR T细胞的50％小鼠中观察到肿瘤完全消退。图16。
6.10.实施例10：经ZSTK474处理的CAR T细胞在人骨髓瘤的小鼠模型中显示出治疗活性
向具有100mm3皮下多发性骨髓瘤肿瘤(RPMI-8226)的动物输注相等的CAR T细胞剂量(1×106个抗BCMA02 CAR阳性T细胞)或来自匹配的T细胞供体的未修饰T的细胞(未转导)。如实施例8所述的那样，用IL-2，或者IL-2和ZSTK474处理抗BCMA CAR T细胞。
用与IL-2一起培养或者与IL-2和ZSTK474一起培养的抗BCMA02 CAR T细胞处理的动物完全阻止了肿瘤生长。图17。相反，用未转导或媒介物处理的动物无法控制肿瘤生长。图17。
6.11.实施例11：用于确定BB2121 CAR T细胞在患有复发难治性多发性骨髓瘤的对象中以及在患有在初始治疗一年内进展的高危多发性骨髓瘤的对象中的功效和安全性的2期、多队列、开放标签、多中心研究
该实施例概述了bb2121的2期临床试验，bb2121是自体T淋巴细胞富集的群体，其包含用编码靶向人BCMA的CAR的抗B细胞成熟抗原(BCMA)嵌合抗原受体(CAR)(如上所述的抗BCMA02 CAR)慢病毒载体转导的细胞，如第6.11.1节中进一步讨论。
这项研究是用于确定bb2121在患有复发难治性多发性骨髓瘤(RRMM)的对象(队列1)中以及在患有在初始治疗一年内进展的高危(HR)多发性骨髓瘤(MM)(HRMM)的对象(队列2)中的功效和安全性的多队列、开放标签、多中心2期研究。第6.11.2节中讨论了针对参与本研究的对象并进一步针对队列1或2的特定纳入和排除标准。该研究招募大约122名对象，这些对象被随机分配到如下所列的两个队列之一中，其中大约103名对象用bb2121治疗。从招募到输注的退出率估计为15％。
6.11.1.Bb2121
Bb2121包含自体T淋巴细胞富集的群体，其包含用编码靶向人BCMA的CAR(如上所述的抗BCMA02 CAR)的抗B细胞成熟抗原(BCMA)嵌合抗原受体(CAR)慢病毒转导的细胞。使用抗BCMA02 CAR慢病毒载体转导自体T细胞。该载体使用鼠白血病病毒来源的骨髓增生性肉瘤病毒增强的启动子来驱动嵌合受体的表达，该嵌合受体是由细胞外抗原识别结构域(VL和VH)、CD8α铰链结构域、跨膜结构域(CD8 TM)以及细胞内CD137共刺激(4-1BB)和CD3ζ链信号传导结构域组成的多结构域蛋白。
6.11.2.研究群体
这项研究的纳入标准包括：
(1)年龄≥18岁；
(2)对象患有如下定义的可测量疾病：
(i)M蛋白(血清蛋白电泳[sPEP]或尿蛋白电泳[uPEP])：sPEP≥0.5g/dL或uPEP≥200mg/24小时，和/或
(ii)轻链多发性骨髓瘤，血清或尿中无可测量疾病：血清免疫球蛋白游离轻链≥10mg/dL且血清免疫球蛋白游离轻链κ/λ比率异常；
(3)东部肿瘤协作组(ECOG)体能状态≤1；以及
(4)由于既往治疗而导致的任何非血液学毒性(不包括脱发和2级神经病)恢复到1级或基线。
另外，特定队列内的对象具有特定的队列纳入标准。队列1 RRMM(复发难治性多发性骨髓瘤)对象：
(i)必须接受过至少3种既往抗骨髓瘤治疗方案(在存在或不存在造血干细胞移植的情况下以及在存在或不存在维持疗法的情况下的诱导被视为单一方案)；
(ii)必须接受过每个方案的至少接受2个连续治疗周期，除非疾病进展(PD)是对该方案的最佳反应；
(iii)必须接受过用蛋白酶体抑制剂、免疫调节剂和抗CD38抗体进行的既往治疗；
(iv)必须在最近的既往治疗方案的过程中或60天内具有PD的迹象；以及
(v)必须对至少1种既往治疗方案有反应(最小反应[MR]或更佳的反应)。
另外，队列2HRMM(高危多发性骨髓瘤)对象：
(i)必须仅接受过1种既往抗骨髓瘤治疗方案(在存在或不存在造血干细胞移植的情况下以及在存在或不存在维持疗法的情况下的诱导被视为单一方案)；
(ii)必须具有以下HR因素：由修订的国际分期系统(R-ISS)定义为III期(R-ISSIII期)的HR疾病和早期复发(所述早期复发被定义为对于经历了移植的对象而言，自首次移植之日起＜12个月出现PD，或者对于仅接受过诱导的对象而言，在自最后一次治疗方案之日起＜12个月出现PD，所述最后一次治疗方案必须最少含有蛋白酶体抑制剂、免疫调节剂和地塞米松)。
排除标准。存在以下任何一种情况都将对象从招募中排除：
(1)对象在白细胞单采术的28天内使用了任何研究药物；
(2)对象在白细胞单采术的最后14天内接受以下任何一项：
(a)血浆单采术；
(b)大手术(如由研究人员定义)；
(c)除骨髓瘤相关骨病变的局部疗法以外的放疗；和
(d)使用任何全身性抗骨髓瘤药物疗法；
(3)已知骨髓瘤累及中枢神经系统(CNS)的对象；
(4)对象具有肺白细胞瘀滞和弥散性血管内凝血的临床迹象；
(5)具有临床相关的中枢神经系统病理的病史或者存在临床相关的中枢神经系统病理，所述临床相关的中枢神经系统病理诸如癫痫、痫性发作、轻瘫、失语症、中风、蛛网膜下出血或其它中枢神经系统出血、严重脑损伤、痴呆、帕金森氏病、小脑疾病、器质性脑综合征或精神病。仅当对象在bb2121治疗后经历4级神经毒性时，用bb2121再治疗之前该排除标准才适用(队列1)；
(6)具有活动性的浆细胞性白血病、华氏巨球蛋白血症、POEMS综合征(多神经病、脏器肿大、内分泌病、单克隆蛋白和皮肤改变)或临床上显著的淀粉样变性，或者具有这些病的病史的对象；
(7)对象患有非分泌型多发性骨髓瘤；
(8)对象具有以下任何实验室异常：
(a)中性粒细胞绝对计数(ANC)＜1,000/μL；
(b)在没有输血支持的情况下血小板计数＜50,000mm3(筛选7天内进行血小板输注)；
(c)血红蛋白＜8g/dL(＜4.9mmol/L)(不容许向对象输血以达到该水平)；
(d)血清肌酐清除率(CrCl)＜45mL/分钟；
(e)经校正的血清钙＞13.5mg/dL(＞3.4mmol/L)；
(f)血清天冬氨酸转氨酶(AST)或丙氨酸转氨酶(ALT)＞2.5×正常上限(ULN)；
(g)记录有吉尔伯特综合征(documented Gilbert’s syndrome)的对象的血清总胆红素＞1.5×ULN或＞3.0mg/dL；以及
(h)国际比率(INR)或部分促凝血酶原激酶时间(PTT)＞1.5×ULN，或30天内有≥2级出血史，或对象需要用抗凝剂(例如，华法林(warfarin)、低分子重量肝素、Xa因子抑制剂)的长期、治疗性给药进行的持续治疗；
(9)超声心动图(ECHO)或多时闸心室造影(multi-gated acquisition，MUGA)，左心室射血分数＜45％；
(10)在开始研究治疗之前的6个月内有III类或IV类充血性心力衰竭(CHF)或严重的非缺血性心肌病、不稳定或控制不佳的心绞痛、心肌梗塞或室性心律失常的病史的对象；
(11)定义为室内空气中的氧饱和度(Sa02)＜92％的肺功能不足；
(12)用慢性免疫抑制剂(例如，任何剂量的环孢霉素或全身性类固醇)持续治疗。允许间断地局部、吸入或鼻内使用皮质类固醇；
(13)同种异体造血干细胞移植或用针对癌症的任何基于基因疗法的治疗剂或针对癌症的研究性细胞疗法或BCMA靶向疗法治疗的既往史；
(14)对象在白细胞单采术之前的12周内接受过自体干细胞移植(ASCT)；
(15)对象有原发性免疫缺陷病史；
(16)对象对人免疫缺陷病毒(HIV-1)、慢性或活动性乙型肝炎或者活动性甲型或丙型肝炎呈阳性；
(17)尽管进行了适当的抗生素治疗或其它治疗，但对象仍具有不受控制的全身性真菌、细菌、病毒或其它感染(包括结核病)；
(18)对象具有除多发性骨髓瘤以外的恶性肿瘤的既往病史，除非该对象已摆脱该疾病≥5年，但以下非侵入性恶性肿瘤除外：
(a)皮肤基底细胞癌；
(b)皮肤鳞状细胞癌；
(c)子宫颈原位癌；
(d)乳腺原位癌；和
(e)前列腺癌的偶然组织学发现(使用TNM[肿瘤、结节、转移]临床分期系统的T1a或T1b)或可治愈的前列腺癌；
(19)对象是怀孕、哺乳或母乳喂养或打算在参加研究期间怀孕的女性；
(20)已知对bb2121产品的任何组分、环磷酰胺、氟达拉滨和/或托珠单抗过敏的对象；
(21)对象具有会阻止该对象参与研究的任何重大的医学病状、实验室异常或精神疾病；
(22)对象具有包括存在实验室异常在内的任何状况，如果他/她要参与研究，所述状况使对象处于无法接受的风险中。这包括不受控制的全身性真菌、细菌、病毒或其它感染(其被定义为表现出与感染相关的持续体征/症状，尽管进行了适当的抗微生物治疗，但无改善)，或者需要静脉注射抗微生物剂进行管理；以及
(23)对象具有扰乱解释来自该研究的数据的能力的任何状况。
6.11.3.研究设计
该研究由4个时期组成：
(1)预处理期(筛查、白细胞单采术和任选的桥接疗法以及基线评估)；
(2)治疗期(淋巴细胞清除(LD)化疗(氟达拉滨和环磷酰胺)和bb2121输注)；
(3)治疗后的随访期(bb2121输注后随访最少24个月或一直随访到记录到PD为止，在最后一位对象接受第一次输注后最多随访5年，以较长者为准)；和
(4)生存随访。
在预处理期期间，使筛选出的对象经受白细胞单采术以使得bb2121产品能够产生。根据研究人员的判断，对象可接受桥接疗法。在成功制造了bb2121药物产品后，执行另外的基线评价(包括对接受桥接疗法的那些对象的疾病分期评估)，以在启动LD化疗之前评估持续的资格和安全性。
治疗期以淋巴细胞清除化疗开始，然后在治疗第1天以150至450×106个细胞的剂量输注bb2121。
队列1。招募大约73名接受了≥3种既往抗骨髓瘤治疗方案的RRMM对象，以确保该队列中大约62名对象用bb2121治疗，以评估安全性和功效。在队列1中，如果符合方案中定义的具体标准，则可以考虑在采用或不采用桥接疗法的情况下用第二剂bb2121(包括第二疗程的淋巴细胞清除(LD)化疗)再治疗。在这项研究中对再治疗的对象在第二次输注后随访至少6个月或者一直随访到记录到PD，在最后一位对象接受第一次输注后最多随访5年，以较长者为准。如果满足以下具体标准，则对象有资格接受bb2121的第二次输注：
·距离首次输注bb2121，已经过去了至少8周；
·对象仍然具有剩余的经分离的PBMC或bb2121产品，该产品是由原始白细胞单采术材料制造的；
·基于根据国际骨髓瘤工作组(IMWG)的多发性骨髓瘤统一反应标准的反应标准，对初始bb2121的最佳反应是病情稳定(SD)或更佳的反应。
·根据IMWG标准的疾病进展(PD)的迹象；
·没有4级细胞因子释放综合征(CRS)或既往用bb2121治疗的神经毒性的病史；
·继续满足入选的资格条件(除了排除已知骨髓瘤累及中枢神经系统(CNS)的对象、排除已经接受过用针对癌症的任何基于基因疗法的治疗剂或BCMA靶向疗法治疗的对象，以及中性粒细胞和血小板相关的排除标准)；
·必须满足开始淋巴细胞清除(LD)化疗的资格标准；
·对于中枢神经系统内骨髓瘤进展需要全脑或定向大脑放疗的对象，距放疗间隔至少8周(不包括对头皮或颅骨病变的姑息性局灶性的最小穿透性放疗)；以及
·自首次输注bb2121以来，对象未接受过任何多发性骨髓瘤疗法。
队列2。招募大约49名具有一(1)种既往抗骨髓瘤治疗方案和由修订的国际分期系统(R-ISS)定义为III期的HR疾病以及早期复发的多发性骨髓瘤对象，以确保大约41名对象用bb2121治疗。早期复发被定义为：对于符合移植资格的(TE)对象，自初始自体干细胞移植(ASCT)起12个月内出现疾病进展(PD)；对于不符合移植资格的(TNE)，在既往疗法12个月内出现PD(既往方案必须最少含有蛋白酶体抑制剂、免疫调节剂和地塞米松)。
在对象过早中止研究或完成研究后，在单独的长期随访方案下监测长期的bb2121相关毒性、病毒载体安全性、生存状态以及后续的抗骨髓瘤疗法。
6.11.4.终点
该研究的主要终点是评价bb2121在RRMM对象以及在初始治疗一年内进展的HR MM对象中的功效。次要终点包括评价bb2121在RRMM对象以及在初始治疗一年内进展的HRMM对象中的安全性；表征嵌合抗原受体(CAR)+T细胞在外周血和骨髓中的扩增和持久性(通过载体拷贝数[VCN]进行表征)；评价抗CAR抗体反应的发展；评价获得微小残留病(MRD)阴性状态的对象的百分比(通过EuroFlow和下一代测序[NGS]进行评价)；以及评价与健康有关的生活质量(HRQoL)的变化。下表列出了主要终点和次要终点：
Figure BDA0002971836970000761
队列1或队列2中的对象可以在白细胞单采术与bb2121施用(如果在启动淋巴细胞清除化疗前14天或超过14天施用)之间接受桥接疗法。基于研究人员的判断，桥接疗法可包括作为单一剂或组合的皮质类固醇、烷化剂、免疫调节剂、蛋白酶体抑制剂和/或抗CD38抗体。对象先前尚未接触过的实验性剂和骨髓瘤疗法不应用作桥接疗法。
6.11.5.治疗方法
LD化疗：每天分别以指定剂量30mg/m2和300mg/m2静脉(IV)施用氟达拉滨和环磷酰胺，连续3天(从第5天开始)，接着休息2天。LD化疗完成后，将bb2121以IV输注的形式以在150至450×106CAR+T个细胞范围内的剂量施用。
6.12.实施例12：用于比较BB2121与标准三联方案在患有复发难治性多发性骨髓瘤(RRMM)的对象中的功效和安全性的3期多中心、随机化、开放标签研究
该实施例概述了bb2121的3期临床试验。该研究是3期随机化、开放标签研究，其对bb2121(其是自体T淋巴细胞富集的群体，其包含用编码靶向人BCMA的CAR的抗B细胞成熟抗原(BCMA)嵌合抗原受体(CAR)(如上所述的抗BCMA02 CAR)慢病毒载体转导的细胞，如上面第6.11.1节中更详细地讨论的)与标准三联方案在患有复发难治性多发性骨髓瘤(RRMM)的对象中的功效和安全性进行了比较。用作比较者的特定三联方案包括：(1)达雷木单抗(D)、泊马度胺(P)和地塞米松(d)(一起称为DPd)；(2)达雷木单抗、硼替佐米(
Figure BDA0002971836970000771
V)和地塞米松(一起称为DVd)；(3)伊沙佐米(I)、来那度胺(
Figure BDA0002971836970000772
R)和地塞米松(一起称为IRd)。
6.12.1.研究群体
研究群体由接受过至少两种既往方案(包括来那度胺
Figure BDA0002971836970000773
或泊马度胺
Figure BDA0002971836970000774
和蛋白酶体抑制剂(PI))的多发性骨髓瘤患者，并且必须在最后一次疗法期间或60天内有记录到的疾病进展。既往接受过达雷木单抗与泊马度胺在存在或不存在地塞米松的情况下的组合(DP±d)的对象可能不包括在内。允许既往暴露于达雷木单抗与硼替佐米在存在或不存在地塞米松的情况下的组合(DV±d)，或者既往暴露于伊沙佐米与来那度胺在存在或不存在地塞米松的情况下的组合(IR±d)，但是对象在进入本研究之前不能接受DV±d或IR±d作为他们的最后一种既往方案。
这项研究的纳入标准包括：
(1)对象在签署知情同意书(ICF)年龄在时18岁或以上；
(2)在进行任何与研究有关的评估/程序之前，对象必须了解并自愿签署ICF。
(3)对象愿意且能够遵守该方案中的研究就诊时间表和其它方案要求，并且对于被随机分配到治疗组(Treatment Arm)A中的对象，对象同意如同监管指南对于基因治疗试验所要求的那样继续随访长达15年。
(4)对象已具有记录的多发性骨髓瘤(MM)和可测量疾病的诊断，可测量疾病被定义为(i)(a)血清M蛋白水平(血清蛋白电泳[sPEP])大于或等于约0.5g/dL，或(b)尿M蛋白水平(尿蛋白电泳[uPEP])大于或等于约200mg/24小时；和/或(ii)血清或尿中无可测量疾病的轻链多发性骨髓瘤：血清免疫球蛋白游离轻链大于或等于约10mg/dL(100mg/L)且血清免疫球蛋白游离轻链κ/λ比率异常；
(5)对象已经接受过至少2种既往MM方案。在存在或不存在造血干细胞移植的情况下以及在存在或不存在维持疗法的情况下的诱导被视为一种方案；
(6)对象已经接受过用蛋白酶体抑制剂和含免疫调节化合物的方案进行的既往治疗至少2个连续周期。
(7)对象必须对于最后一次治疗方案是难治性的。难治性被定义为在进入研究之前完成用最后一个抗骨髓瘤方案进行的治疗期间或60天内(从该方案内任何药物的最后一剂开始测量)有记录到的疾病进展；
(8)对象对至少1种既往治疗方案有反应(最小反应[MR]或更佳的反应)；
(9)对象必须具有约1或更低的东部肿瘤协作组(ECOG)体能状态；
(10)对象的由于既往治疗而导致的任何非血液学毒性(不包括脱发和2级神经病)必须恢复到1级或基线；
(11)对象必须有足够的血管通路以进行白细胞单采术；
(12)有生育潜能的女性对象(FCBP)必须：
(a)经研究人员核实妊娠试验呈阴性。
(b)在异性接触中实行真正的禁欲，或者同意使用并且能够遵照有效的避孕措施而不会中断。
(c)同意在参与研究期间放弃母乳喂养。
(d)避免捐赠卵细胞。
(13)男性对象在参加研究时必须实行真正的禁欲或同意在与妊娠女性或有生育潜能的女性性接触时使用避孕套，并避免捐赠精子。
排除标准。存在以下任何一种情况都将对象从招募中排除：
(1)对象具有会阻止该对象参与研究的任何重大的医学病状、实验室异常或精神疾病；
(2)对象具有包括存在实验室异常在内的任何状况，如果他/她要参与研究，所述状况使对象处于无法接受的风险中；
(3)对象具有扰乱解释来自研究的数据的能力的任何状况；
(4)对象患有非分泌型多发性骨髓瘤；
(5)对象具有以下任何实验室异常：
(a)中性粒细胞绝对计数(ANC)＜1,000/M1；
(b)血小板计数：在＜50％的骨髓有核细胞为浆细胞的对象中血小板计数＜75,000/μL，而在≥50％的骨髓有核细胞为浆细胞的对象中血小板计数＜50,000/μL(不容许向对象输血以达到该水平)；
(c)血红蛋白＜8g/dL(＜4.9mmol/L)(不容许向对象输血以达到该水平)；
(d)血清肌酐清除率(CrCl)＜45mL/分钟；
(e)经校正的血清钙＞13.5mg/dL(＞3.4mmol/L)；
(f)血清天冬氨酸转氨酶(AST)或丙氨酸转氨酶(ALT)＞2.5×正常上限(ULN)；
(g)记录有吉尔伯特综合征(documented Gilbert’s syndrome)的对象的血清总胆红素＞1.5×ULN或＞3.0mg/dL；以及
(h)国际归一化比率(INR)或活化部分促凝血酶原激酶时间(aPTT)＞1.5×ULN，或30天内有≥2级出血史，或对象需要用抗凝剂(例如，华法林(warfarin)、低分子重量肝素、Xa因子抑制剂)的长期、治疗性给药进行持续治疗；
(6)对象必须具有定义为室内空气中的氧饱和度(SaO2)＜92％的肺功能不足；
(7)对象具有除多发性骨髓瘤以外的恶性肿瘤的既往病史，除非该对象已摆脱疾病≥5年，但以下非侵入性恶性肿瘤除外：
(a)皮肤基底细胞癌；
(b)皮肤鳞状细胞癌；
(c)子宫颈原位癌；
(d)乳腺原位癌；和
(e)前列腺癌的偶然组织学发现(使用肿瘤、结节、转移[TNM]临床分期系统的T1a或T1b)或可以治愈目的治疗的前列腺癌；
(8)对象具有活动性的浆细胞性白血病、华氏巨球蛋白血症、POEMS综合征(多神经病、脏器肿大、内分泌病、单克隆蛋白和皮肤改变)或淀粉样变性，或者具有这些病的病史；
(9)已知骨髓瘤累及中枢神经系统(CNS)的对象；
(10)对象具有肺白细胞瘀滞和弥散性血管内凝血的临床迹象；
(11)对象患有已知的慢性阻塞性肺疾病(COPD)，其强力呼气容积在1秒钟内(FEV1)为正常预测值的50％。怀疑患有COPD的对象需要进行强力呼气试验(FEV1)，并且如果FEV1＜正常预测值的50％，则必须将对象排除；
(12)对象具有临床相关的中枢神经系统病理的病史或者存在临床相关的中枢神经系统病理，所述临床相关的中枢神经系统病理诸如癫痫、痫性发作、轻瘫、失语症、中风、蛛网膜下出血或其它中枢神经系统出血、严重脑损伤、痴呆、帕金森氏病、小脑疾病、器质性脑综合征或精神病；
(13)对象用作为其最近的抗骨髓瘤治疗方案的一部分的达雷木单抗(DARA)与泊马度胺(POM)在地塞米松存在或不存在的情况下的组合(DP±d)进行了治疗，如果被随机分配到治疗组A，则不能接受DPd(即，达雷木单抗、泊马度胺和地塞米松)作为桥接疗法，但是可以根据研究人员的判断接受DVd(即，达雷木单抗、硼替佐米和地塞米松)或IRd(即，伊沙佐米、来那度胺和地塞米松)作为桥接疗法；
(14)对象用作为其最近的抗骨髓瘤治疗方案的一部分的DP±d进行了治疗，如果被随机分配到治疗组B，则不能接受DPd，但根据研究人员的判断可以接受DVd或IRd；
(15)对象用作为其最近的抗骨髓瘤治疗方案的一部分的DARA与硼替佐米(BTZ)在地塞米松(dex)存在或不存在的情况下的组合(DV±d)进行了治疗，如果被随机分配到治疗组A，则不能接受DVd作为桥接疗法，但是根据研究人员的判断可以接受DPd或IRd作为桥接疗法；
(16)对象用作为其最近的抗骨髓瘤治疗方案的一部分的DV±d进行了治疗，如果被随机分配到治疗组B，则不能接受DVd，但根据研究人员的判断可以接受DPd或IRd；
(17)对象用作为其最近的抗骨髓瘤治疗方案的一部分的伊沙佐米(IXA)与来那度胺(LEN)在地塞米松存在或不存在的情况下的组合(IR±d)进行了治疗，如果被随机分配到治疗组A，则不能接受IRd作为桥接疗法，但是根据研究人员的判断可以接受DPd或DVd作为桥接疗法；
(18)对象用作为其最近的抗骨髓瘤治疗方案的一部分的IR±d进行了治疗，如果被随机分配到治疗组B，则不能接受IRd，但根据研究人员的判断可以接受DPd或DVd；
(19)异基因造血干细胞移植，用针对癌症的任何基于基因疗法的治疗剂，针对癌症的研究性细胞疗法或BCMA靶向疗法治疗的既往史；
(20)对象在随机分组之前的12周内接受过自体干细胞移植(ASCT)；
(21)对象在随机分组之前的28天内使用过任何研究药物。
(22)对象在随机分组之前的最后14天内已接受过以下任何一项：
(a)血浆单采术；
(b)大手术(如由研究人员定义)；
(c)除骨髓瘤相关骨病变的局部疗法以外的放疗；和
(d)使用任何全身性抗骨髓瘤药物疗法；
(23)超声心动图(ECHO)或多时闸心室造影(MUGA)，左心室射血分数(LVEF)＜45％；
(24)用慢性免疫抑制剂(例如，任何剂量的环孢霉素或全身性类固醇)持续治疗。允许间断地局部、吸入或鼻内使用皮质类固醇；
(25)对象对人免疫缺陷病毒(HIV-1)、慢性或活动性乙型肝炎或者活动性甲型或丙型肝炎呈阳性；
(26)对象已受到不受控制的全身性真菌、细菌、病毒或其它感染(被定义为表现出与感染相关的持续体征/症状，尽管进行了适当的抗微生物治疗，但无改善)，或者需要静脉注射抗微生物剂进行管理；
(27)对象在随机分组之前的6个月内有III类或IV类充血性心力衰竭(CHF)或严重的非缺血性心肌病、不稳定或控制不佳的心绞痛、心肌梗塞或室性心律失常的病史；
(28)对DARA、沙利度胺、来那度胺、POM、BTZ、IXA或地塞米松过敏。这包括在既往沙利度胺、POM或来那度胺治疗期间皮疹≥3级；
(29)已知对bb2121产品的任何组分、环磷酰胺、氟达拉滨和/或托珠单抗过敏的对象，或对DARA、POM、LEN、IXA、BTZ或dex制剂中所含的赋形剂过敏的对象；
(30)对象是怀孕、哺乳或母乳喂养或打算在参加研究期间怀孕的女性；
(31)被随机分配到治疗组B并且将采用含POM的治疗方案或含LEN的治疗方案的对象不能或不愿接受方案所要求的血栓防治；以及
(32)对象对硼替佐米不耐受，如果对象被随机分配到治疗组A，则不能接受DVd作为桥接疗法，或者如果对象被随机分配到治疗组B，则不能接受DVd。
6.12.2.研究设计
将大约390名对象在治疗组A或治疗组B之间按2∶1进行随机分配。大约260名对象被随机分配为接受治疗组A，大约130名对象被随机分配为接受治疗组B。治疗组A由bb2121组成，而治疗组B由根据研究人员判断的标准三联方案组成：DPd、DVd或IRd。使用交互式反应技术(IRT)对有资格的对象进行随机分配，按以下因素进行分层：
·既往达雷木单抗治疗与无既往达雷木单抗治疗
·两种或三种既往的抗骨髓瘤方案与＞3种既往的抗骨髓瘤方案；和
·存在高危细胞遗传学异常(例如，t(4；14)或t(14；16)或del17p)(根据基线或历史细胞遗传学结果)高危细胞遗传学异常与不存在这些高危细胞遗传学异常或不知道存在这些高危细胞遗传学异常。
使被随机分配到治疗组A的对象经受白细胞单采术以使得bb2121产品能够产生。根据研究人员的判断，只要最后一个剂量是在淋巴细胞清除(LD)化疗启动前≥14天施用的，则对象在白细胞单采术后可以接受1个周期或更短的DPd作为桥接多发性骨髓瘤疗法。在成功制造了bb2121药物产品后，执行另外的基线评价，以在启动淋巴细胞清除(LD)化疗之前至少3天评估持续的资格和安全性(包括对接受过桥接多发性骨髓瘤疗法的那些对象的疾病分期评估)。有资格进行治疗的对象接受连续3天用氟达拉滨和环磷酰胺进行LD化疗，然后休息2天，随后在第1天输注bb2121。跟踪对象的安全性和有效性，直到记录到疾病进展(PD)或撤回同意为止。监测所有接受bb2121的对象的长期安全性。
根据研究人员的判断，被随机分配到治疗B组的对象接受以下研究治疗之一：静脉(IV)注射达雷木单抗，口服泊马度胺和口服或静脉注射地塞米松(DPd)；静脉注射达雷木单抗，皮下(SC)注射硼替佐米和口服或静脉注射地塞米松(DVd)；以及口服伊沙佐米，口服来那度胺和口服地塞米松(IRd)。跟踪对象的安全性和有效性，并且可以继续进行研究治疗，直到出现PD、不可接受的毒性或撤回同意为止。
6.12.3.终点
无进展生存期(PFS)：PFS被计算为从随机分配到首次记录到由于有关研究的任何原因导致的进展或死亡的时间，以先到者为准。将进展日期指定为研究期间在没有缺少既往评估的情况下观察到任何进展的最早时间。如果在记录到进展或死亡之前发生由于不良事件或疗法的改变而退出研究，则在最后一次完整的骨髓瘤反应评估确定缺乏进展之日对这些观察结果进行检查。
关键次要终点：总生存期(OS)。OS被计算为从随机分配到因任何原因死亡的时间。
其它次要终点：
无事件生存期(EFS)：EFS被计算为从随机分配到首次记录到进展、对象接受另一种抗骨髓瘤治疗的第一天或因有关研究的任何原因而死亡的时间(以先到者为准)。
总反应率(ORR)：反应者是至少显示出部分反应(PR)的任何对象。总反应率(ORR)定义为反应者的百分比。在对象接受后续抗骨髓瘤治疗后对来自对象的反应进行计数；但是，这些患者包括在分母中。
微小残留病(MRD)阴性率：使用流式细胞术(EuroFlow)和下一代测序(NGS)测定呈MRD阴性(定义为至少1/105个有核细胞)的MRD可评价对象的百分比。
完全反应率(CR)：CR率被定义为至少具有CR的对象的百分比。
对于上述反应和MRD终点，使用国际骨髓瘤工作组(IMWG)标准对骨髓瘤反应进行分类。ITT群体用作主要分析的分母，而EE群体用作支持性分析的分母。
反应时间(TTR)：基于反应者的IMWG指南，TTR被计算为从随机分配到初始记录到反应(PR或更佳的反应)的时间。
反应持续时间(DOR)：DOR被定义为从初始记录到反应(PR或更佳的反应)到确认疾病进展的时间。
到下一次抗骨髓瘤治疗的时间：到下一次抗骨髓瘤治疗的时间被计算为从随机分配到对象接受另一种抗骨髓瘤治疗的第一天的时间。在分析时尚未接受另一种抗骨髓瘤治疗的对象将在最后一次评估之日(如果在治疗阶段结束之前给予下一抗骨髓瘤治疗)或最后一次随访就诊之日(如果在长期随访阶段期间给予下一次抗骨髓瘤治疗)进行检查。
下一次抗骨髓瘤疗法后的无进展生存期(PFS2)：从随机分配到第二次客观疾病进展或因任何原因死亡的时间，以先到者为准。
6.12.4.治疗方法
对于bb2121 CAR T疗法，每天分别以剂量30mg/m2和300mg/m2静脉(IV)施用氟达拉滨和环磷酰胺作为淋巴细胞清除(LD)化疗，连续3天(从第-5天开始)，然后休息2天。LD化疗完成后，将bb2121以IV输注的形式以在150至450×106CAR+T个细胞范围内的剂量施用。
对于DPd疗法，按以下时间表以16mg/kg的起始剂量静脉施用达雷木单抗：持续1和2个月在28天的月份第1、8、15和22天；持续3至6个月在28天的月份第1天、第15天；以及持续≥7个月在28天的月份第1天。在28天的月份第1至21天，以4mg/天口服泊马度胺。在28天的月份第1、8、15和22天，地塞米松以40mg(＞75岁，20mg)给药。在达雷木单抗给药日：对于≤75岁的对象，在输注达雷木单抗前地塞米松静脉给药20mg，在输注达雷木单抗后口服20mg；对于＞75岁的对象，在输注达雷木单抗前，地塞米松静脉给药20mR。
对于DVd疗法，按以下时间表以16mg/kg的起始剂量静脉施用达雷木单抗：持续1至3个月在21天的月份第1、8、15天；持续4至8个月在21天的月份第1天；以及持续≥9个月在28天的月份第1天。持续1至8个月在21天的月份第1天、第4天、第8天和第11天，以1.3mg/m2的起始剂量皮下(SC)施用硼替佐米。硼替佐米在第8个月后必须停止给药。持续1至8个月，在第1、2、4、5、8、9、11和12天，以20mg的起始剂量施用地塞米松；对于≤75岁的对象，在输注达雷木单抗前静脉给药地塞米松20mg并且在输注后第二天口服给药20mg，并且在非DARA给药日，口服给药地塞米松20mg；对于＞75岁、体重不足(BMI＜18.5)、糖尿病控制不佳或者既往对类固醇疗法不耐受/具有不良事件(AE)的对象，地塞米松剂量可以每周20mg的剂量施用。第8个月后必须停止地塞米松给药。
对于IRd疗法，在28天的月份第1天、第8天和第15天，以4mg/天的起始剂量施用口服伊沙佐米。在28天的月份第1至21天，以25mg/天给药口服来那度胺。在28天的月份第1、8、15和22天，以40mg/天给药地塞米松。
一般而言，在以下权利要求中，所用的术语不应解释为将权利要求限制为说明书和权利要求书中公开的具体实施方案，而应解释为包括所有可能的实施方案以及此类权利要求有权享有的等同方案的全部范围。因此，权利要求不受公开内容的限制。
序列表
<110> 细胞基因公司(CELGENE CORPORATION)
<120> 抗BCMA嵌合抗原受体的用途
<130> 14247-321-228
<140>
<141>
<150> US 62/696,802
<151> 2018-07-11
<160> 36
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 15
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 1
Arg Ala Ser Glu Ser Val Thr Ile Leu Gly Ser His Leu Ile His
1 5 10 15
<210> 2
<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 2
Leu Ala Ser Asn Val Gln Thr
1 5
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 3
Leu Gln Ser Arg Thr Ile Pro Arg Thr
1 5
<210> 4
<211> 5
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 4
Asp Tyr Ser Ile Asn
1 5
<210> 5
<211> 17
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 5
Trp Ile Asn Thr Glu Thr Arg Glu Pro Ala Tyr Ala Tyr Asp Phe Arg
1 5 10 15
Gly
<210> 6
<211> 8
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 6
Asp Tyr Ser Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5
<210> 7
<211> 111
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 7
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Pro Ser Leu Ala Met Ser Leu Gly
1 5 10 15
Lys Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Thr Ile Leu
20 25 30
Gly Ser His Leu Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Thr Leu Leu Ile Gln Leu Ala Ser Asn Val Gln Thr Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Asp Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Arg
85 90 95
Thr Ile Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 8
<211> 117
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 8
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Ser Ile Asn Trp Val Lys Arg Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Arg Glu Pro Ala Tyr Ala Tyr Asp Phe
50 55 60
Arg Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Tyr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Leu Asp Tyr Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 9
<211> 493
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗BCMA02 CAR
<400> 9
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Pro Ser Leu
20 25 30
Ala Met Ser Leu Gly Lys Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu
35 40 45
Ser Val Thr Ile Leu Gly Ser His Leu Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys
50 55 60
Pro Gly Gln Pro Pro Thr Leu Leu Ile Gln Leu Ala Ser Asn Val Gln
65 70 75 80
Thr Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe
85 90 95
Thr Leu Thr Ile Asp Pro Val Glu Glu Asp Asp Val Ala Val Tyr Tyr
100 105 110
Cys Leu Gln Ser Arg Thr Ile Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys
115 120 125
Leu Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly
130 135 140
Glu Gly Ser Thr Lys Gly Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu
145 150 155 160
Leu Lys Lys Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly
165 170 175
Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Ser Ile Asn Trp Val Lys Arg Ala Pro Gly
180 185 190
Lys Gly Leu Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Arg Glu Pro
195 200 205
Ala Tyr Ala Tyr Asp Phe Arg Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr
210 215 220
Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Tyr Glu Asp
225 230 235 240
Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Leu Asp Tyr Ser Tyr Ala Met Asp Tyr
245 250 255
Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Thr Thr
260 265 270
Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln
275 280 285
Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala
290 295 300
Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala
305 310 315 320
Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr
325 330 335
Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln
340 345 350
Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser
355 360 365
Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys
370 375 380
Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln
385 390 395 400
Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu
405 410 415
Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg
420 425 430
Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met
435 440 445
Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly
450 455 460
Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp
465 470 475 480
Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
485 490
<210> 10
<211> 1485
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗BCMA02 CAR
<400> 10
atggcactcc ccgtcaccgc ccttctcttg cccctcgccc tgctgctgca tgctgccagg 60
cccgacattg tgctcactca gtcacctccc agcctggcca tgagcctggg aaaaagggcc 120
accatctcct gtagagccag tgagtccgtc acaatcttgg ggagccatct tattcactgg 180
tatcagcaga agcccgggca gcctccaacc cttcttattc agctcgcgtc aaacgtccag 240
acgggtgtac ctgccagatt ttctggtagc gggtcccgca ctgattttac actgaccata 300
gatccagtgg aagaagacga tgtggccgtg tattattgtc tgcagagcag aacgattcct 360
cgcacatttg gtgggggtac taagctggag attaagggaa gcacgtccgg ctcagggaag 420
ccgggctccg gcgagggaag cacgaagggg caaattcagc tggtccagag cggacctgag 480
ctgaaaaaac ccggcgagac tgttaagatc agttgtaaag catctggcta taccttcacc 540
gactacagca taaattgggt gaaacgggcc cctggaaagg gcctcaaatg gatgggttgg 600
atcaataccg aaactaggga gcctgcttat gcatatgact tccgcgggag attcgccttt 660
tcactcgaga catctgcctc tactgcttac ctccaaataa acaacctcaa gtatgaagat 720
acagccactt acttttgcgc cctcgactat agttacgcca tggactactg gggacaggga 780
acctccgtta ccgtcagttc cgcggccgca accacaacac ctgctccaag gccccccaca 840
cccgctccaa ctatagccag ccaaccattg agcctcagac ctgaagcttg caggcccgca 900
gcaggaggcg ccgtccatac gcgaggcctg gacttcgcgt gtgatattta tatttgggcc 960
cctttggccg gaacatgtgg ggtgttgctt ctctcccttg tgatcactct gtattgtaag 1020
cgcgggagaa agaagctcct gtacatcttc aagcagcctt ttatgcgacc tgtgcaaacc 1080
actcaggaag aagatgggtg ttcatgccgc ttccccgagg aggaagaagg agggtgtgaa 1140
ctgagggtga aattttctag aagcgccgat gctcccgcat atcagcaggg tcagaatcag 1200
ctctacaatg aattgaatct cggcaggcga gaagagtacg atgttctgga caagagacgg 1260
ggcagggatc ccgagatggg gggaaagccc cggagaaaaa atcctcagga ggggttgtac 1320
aatgagctgc agaaggacaa gatggctgaa gcctatagcg agatcggaat gaaaggcgaa 1380
agacgcagag gcaaggggca tgacggtctg taccagggtc tctctacagc caccaaggac 1440
acttatgatg cgttgcatat gcaagccttg ccaccccgct aatga 1485
<210> 11
<211> 184
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 11
Met Leu Gln Met Ala Gly Gln Cys Ser Gln Asn Glu Tyr Phe Asp Ser
1 5 10 15
Leu Leu His Ala Cys Ile Pro Cys Gln Leu Arg Cys Ser Ser Asn Thr
20 25 30
Pro Pro Leu Thr Cys Gln Arg Tyr Cys Asn Ala Ser Val Thr Asn Ser
35 40 45
Val Lys Gly Thr Asn Ala Ile Leu Trp Thr Cys Leu Gly Leu Ser Leu
50 55 60
Ile Ile Ser Leu Ala Val Phe Val Leu Met Phe Leu Leu Arg Lys Ile
65 70 75 80
Asn Ser Glu Pro Leu Lys Asp Glu Phe Lys Asn Thr Gly Ser Gly Leu
85 90 95
Leu Gly Met Ala Asn Ile Asp Leu Glu Lys Ser Arg Thr Gly Asp Glu
100 105 110
Ile Ile Leu Pro Arg Gly Leu Glu Tyr Thr Val Glu Glu Cys Thr Cys
115 120 125
Glu Asp Cys Ile Lys Ser Lys Pro Lys Val Asp Ser Asp His Cys Phe
130 135 140
Pro Leu Pro Ala Met Glu Glu Gly Ala Thr Ile Leu Val Thr Thr Lys
145 150 155 160
Thr Asn Asp Tyr Cys Lys Ser Leu Pro Ala Ala Leu Ser Ala Thr Glu
165 170 175
Ile Glu Lys Ser Ile Ser Ala Arg
180
<210> 12
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 柔性肽接头
<400> 12
Asp Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 13
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 柔性肽接头
<400> 13
Thr Gly Glu Lys Pro
1 5
<210> 14
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 柔性肽接头
<400> 14
Gly Gly Arg Arg
1
<210> 15
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 柔性肽接头
<400> 15
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 16
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 柔性肽接头
<400> 16
Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Val Asp
1 5 10
<210> 17
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 柔性肽接头
<400> 17
Lys Glu Ser Gly Ser Val Ser Ser Glu Gln Leu Ala Gln Phe Arg Ser
1 5 10 15
Leu Asp
<210> 18
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 柔性肽接头
<400> 18
Gly Gly Arg Arg Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 19
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 柔性肽接头
<400> 19
Leu Arg Gln Arg Asp Gly Glu Arg Pro
1 5
<210> 20
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 柔性肽接头
<400> 20
Leu Arg Gln Lys Asp Gly Gly Gly Ser Glu Arg Pro
1 5 10
<210> 21
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 柔性肽接头
<400> 21
Leu Arg Gln Lys Asp Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Arg Pro
1 5 10 15
<210> 22
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 柔性肽接头
<400> 22
Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 23
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 蛋白酶切割位点
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(3)
<223> Xaa = 任何氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> Xaa = 任何氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> Xaa为Gly或Ser
<400> 23
Glu Xaa Xaa Tyr Xaa Gln Xaa
1 5
<210> 24
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 蛋白酶切割位点
<400> 24
Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly
1 5
<210> 25
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 蛋白酶切割位点
<400> 25
Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Ser
1 5
<210> 26
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 蛋白酶切割位点
<400> 26
Leu Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn
1 5 10 15
Pro Gly Pro
<210> 27
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 蛋白酶切割位点
<400> 27
Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn
1 5 10 15
Pro Gly Pro
<210> 28
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 蛋白酶切割位点
<400> 28
Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro
1 5 10
<210> 29
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 蛋白酶切割位点
<400> 29
Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly
1 5 10 15
Pro
<210> 30
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 蛋白酶切割位点
<400> 30
Gln Leu Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20
<210> 31
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 蛋白酶切割位点
<400> 31
Ala Pro Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly
1 5 10 15
Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20
<210> 32
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 蛋白酶切割位点
<400> 32
Val Thr Glu Leu Leu Tyr Arg Met Lys Arg Ala Glu Thr Tyr Cys Pro
1 5 10 15
Arg Pro Leu Leu Ala Ile His Pro Thr Glu Ala Arg His Lys Gln Lys
20 25 30
Ile Val Ala Pro Val Lys Gln Thr
35 40
<210> 33
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 蛋白酶切割位点
<400> 33
Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro
1 5 10 15
Gly Pro
<210> 34
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 蛋白酶切割位点
<400> 34
Leu Leu Ala Ile His Pro Thr Glu Ala Arg His Lys Gln Lys Ile Val
1 5 10 15
Ala Pro Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly
20 25 30
Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro
35 40
<210> 35
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 蛋白酶切割位点
<400> 35
Glu Ala Arg His Lys Gln Lys Ile Val Ala Pro Val Lys Gln Thr Leu
1 5 10 15
Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly
20 25 30
Pro
<210> 36
<211> 7350
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗BCMA02 CAR载体
<400> 36
tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60
cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120
ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180
accatcatat gccagcctat ggtgacattg attattgact agttattaat agtaatcaat 240
tacggggtca ttagttcata gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa 300
tggcccgcct ggctgaccgc ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt 360
tcccatagta acgccaatag ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta 420
aactgcccac ttggcagtac atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt 480
caatgacggt aaatggcccg cctggcatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc 540
tacttggcag tacatctacg tattagtcat cgctattacc atggtgatgc ggttttggca 600
gtacatcaat gggcgtggat agcggtttga ctcacgggga tttccaagtc tccaccccat 660
tgacgtcaat gggagtttgt tttggcacca aaatcaacgg gactttccaa aatgtcgtaa 720
caactccgcc ccattgacgc aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg tctatataag 780
cagagctcgt ttagtgaacc gggtctctct ggttagacca gatctgagcc tgggagctct 840
ctggctaact agggaaccca ctgcttaagc ctcaataaag cttgccttga gtgctcaaag 900
tagtgtgtgc ccgtctgttg tgtgactctg gtaactagag atccctcaga cccttttagt 960
cagtgtggaa aatctctagc agtggcgccc gaacagggac ttgaaagcga aagtaaagcc 1020
agaggagatc tctcgacgca ggactcggct tgctgaagcg cgcacggcaa gaggcgaggg 1080
gcggcgactg gtgagtacgc caaaaatttt gactagcgga ggctagaagg agagagtagg 1140
gtgcgagagc gtcggtatta agcgggggag aattagataa atgggaaaaa attcggttaa 1200
ggccaggggg aaagaaacaa tataaactaa aacatatagt tagggcaagc agggagctag 1260
aacgattcgc agttaatcct ggccttttag agacatcaga aggctgtaga caaatactgg 1320
gacagctaca accatccctt cagacaggat cagaagaact tagatcatta tataatacaa 1380
tagcagtcct ctattgtgtg catcaaagga tagatgtaaa agacaccaag gaagccttag 1440
ataagataga ggaagagcaa aacaaaagta agaaaaaggc acagcaagca gcagctgaca 1500
caggaaacaa cagccaggtc agccaaaatt accctatagt gcagaacctc caggggcaaa 1560
tggtacatca ggccatatca cctagaactt taaattaaga cagcagtaca aatggcagta 1620
ttcatccaca attttaaaag aaaagggggg attggggggt acagtgcagg ggaaagaata 1680
gtagacataa tagcaacaga catacaaact aaagaattac aaaaacaaat tacaaaaatt 1740
caaaattttc gggtttatta cagggacagc agagatccag tttggaaagg accagcaaag 1800
ctcctctgga aaggtgaagg ggcagtagta atacaagata atagtgacat aaaagtagtg 1860
ccaagaagaa aagcaaagat catcagggat tatggaaaac agatggcagg tgatgattgt 1920
gtggcaagta gacaggatga ggattaacac atggaaaaga ttagtaaaac accatagctc 1980
tagagcgatc ccgatcttca gacctggagg aggagatatg agggacaatt ggagaagtga 2040
attatataaa tataaagtag taaaaattga accattagga gtagcaccca ccaaggcaaa 2100
gagaagagtg gtgcagagag aaaaaagagc agtgggaata ggagctttgt tccttgggtt 2160
cttgggagca gcaggaagca ctatgggcgc agcgtcaatg acgctgacgg tacaggccag 2220
acaattattg tctggtatag tgcagcagca gaacaatttg ctgagggcta ttgaggcgca 2280
acagcatctg ttgcaactca cagtctgggg catcaagcag ctccaggcaa gaatcctggc 2340
tgtggaaaga tacctaaagg atcaacagct cctggggatt tggggttgct ctggaaaact 2400
catttgcacc actgctgtgc cttggaatgc tagttggagt aataaatctc tggaacagat 2460
ttggaatcac acgacctgga tggagtggga cagagaaatt aacaattaca caagcttggt 2520
aggtttaaga atagtttttg ctgtactttc tatagtgaat agagttaggc agggatattc 2580
accattatcg tttcagaccc acctcccaac cccgagggga cccgacaggc ccgaaggaat 2640
agaagaagaa ggtggagaga gagacagaga cagatccatt cgattagtga acggatccat 2700
ctcgacggaa tgaaagaccc cacctgtagg tttggcaagc taggatcaag gttaggaaca 2760
gagagacagc agaatatggg ccaaacagga tatctgtggt aagcagttcc tgccccggct 2820
cagggccaag aacagttgga acagcagaat atgggccaaa caggatatct gtggtaagca 2880
gttcctgccc cggctcaggg ccaagaacag atggtcccca gatgcggtcc cgccctcagc 2940
agtttctaga gaaccatcag atgtttccag ggtgccccaa ggacctgaaa tgaccctgtg 3000
ccttatttga actaaccaat cagttcgctt ctcgcttctg ttcgcgcgct tctgctcccc 3060
gagctcaata aaagagccca caacccctca ctcggcgcga ttcacctgac gcgtctacgc 3120
caccatggca ctccccgtca ccgcccttct cttgcccctc gccctgctgc tgcatgctgc 3180
caggcccgac attgtgctca ctcagtcacc tcccagcctg gccatgagcc tgggaaaaag 3240
ggccaccatc tcctgtagag ccagtgagtc cgtcacaatc ttggggagcc atcttattca 3300
ctggtatcag cagaagcccg ggcagcctcc aacccttctt attcagctcg cgtcaaacgt 3360
ccagacgggt gtacctgcca gattttctgg tagcgggtcc cgcactgatt ttacactgac 3420
catagatcca gtggaagaag acgatgtggc cgtgtattat tgtctgcaga gcagaacgat 3480
tcctcgcaca tttggtgggg gtactaagct ggagattaag ggaagcacgt ccggctcagg 3540
gaagccgggc tccggcgagg gaagcacgaa ggggcaaatt cagctggtcc agagcggacc 3600
tgagctgaaa aaacccggcg agactgttaa gatcagttgt aaagcatctg gctatacctt 3660
caccgactac agcataaatt gggtgaaacg ggcccctgga aagggcctca aatggatggg 3720
ttggatcaat accgaaacta gggagcctgc ttatgcatat gacttccgcg ggagattcgc 3780
cttttcactc gagacatctg cctctactgc ttacctccaa ataaacaacc tcaagtatga 3840
agatacagcc acttactttt gcgccctcga ctatagttac gccatggact actggggaca 3900
gggaacctcc gttaccgtca gttccgcggc cgcaaccaca acacctgctc caaggccccc 3960
cacacccgct ccaactatag ccagccaacc attgagcctc agacctgaag cttgcaggcc 4020
cgcagcagga ggcgccgtcc atacgcgagg cctggacttc gcgtgtgata tttatatttg 4080
ggcccctttg gccggaacat gtggggtgtt gcttctctcc cttgtgatca ctctgtattg 4140
taagcgcggg agaaagaagc tcctgtacat cttcaagcag ccttttatgc gacctgtgca 4200
aaccactcag gaagaagatg ggtgttcatg ccgcttcccc gaggaggaag aaggagggtg 4260
tgaactgagg gtgaaatttt ctagaagcgc cgatgctccc gcatatcagc agggtcagaa 4320
tcagctctac aatgaattga atctcggcag gcgagaagag tacgatgttc tggacaagag 4380
acggggcagg gatcccgaga tggggggaaa gccccggaga aaaaatcctc aggaggggtt 4440
gtacaatgag ctgcagaagg acaagatggc tgaagcctat agcgagatcg gaatgaaagg 4500
cgaaagacgc agaggcaagg ggcatgacgg tctgtaccag ggtctctcta cagccaccaa 4560
ggacacttat gatgcgttgc atatgcaagc cttgccaccc cgctaatgac aggtaccttt 4620
aagaccaatg acttacaagg cagctgtaga tcttagccac tttttaaaag aaaagggggg 4680
actggaaggg ctaattcact cccaaagaag acaagatctg ctttttgcct gtactgggtc 4740
tctctggtta gaccagatct gagcctggga gctctctggc taactaggga acccactgct 4800
taagcctcaa taaagcttgc cttgagtgct tcaatgtgtg tgttggtttt ttgtgtgtcg 4860
aaattctagc gattctagct tggcgtaatc atggtcatag ctgtttcctg tgtgaaattg 4920
ttatccgctc acaattccac acaacatacg agccggaagc ataaagtgta aagcctgggg 4980
tgcctaatga gtgagctaac tcacattaat tgcgttgcgc tcactgcccg ctttccagtc 5040
gggaaacctg tcgtgccagc tgcattaatg aatcggccaa cgcgcgggga gaggcggttt 5100
gcgtattggg cgctcttccg cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggct 5160
gcggcgagcg gtatcagctc actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag aatcagggga 5220
taacgcagga aagaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc 5280
cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg 5340
ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttccccctgg 5400
aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt 5460
tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt 5520
gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg 5580
cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta agacacgact tatcgccact 5640
ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt 5700
cttgaagtgg tggcctaact acggctacac tagaagaaca gtatttggta tctgcgctct 5760
gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca aacaaaccac 5820
cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc 5880
tcaagaagat cctttgatct tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg 5940
ttaagggatt ttggtcatga gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc ttttaaatta 6000
aaaatgaagt tttaaatcaa tctaaagtat atatgagtaa acttggtctg acagttacca 6060
atgcttaatc agtgaggcac ctatctcagc gatctgtcta tttcgttcat ccatagttgc 6120
ctgactcccc gtcgtgtaga taactacgat acgggagggc ttaccatctg gccccagtgc 6180
tgcaatgata ccgcgagacc cacgctcacc ggctccagat ttatcagcaa taaaccagcc 6240
agccggaagg gccgagcgca gaagtggtcc tgcaacttta tccgcctcca tccagtctat 6300
taattgttgc cgggaagcta gagtaagtag ttcgccagtt aatagtttgc gcaacgttgt 6360
tgccattgct acaggcatcg tggtgtcacg ctcgtcgttt ggtatggctt cattcagctc 6420
cggttcccaa cgatcaaggc gagttacatg atcccccatg ttgtgcaaaa aagcggttag 6480
ctccttcggt cctccgatcg ttgtcagaag taagttggcc gcagtgttat cactcatggt 6540
tatggcagca ctgcataatt ctcttactgt catgccatcc gtaagatgct tttctgtgac 6600
tggtgagtac tcaaccaagt cattctgaga atagtgtatg cggcgaccga gttgctcttg 6660
cccggcgtca atacgggata ataccgcgcc acatagcaga actttaaaag tgctcatcat 6720
tggaaaacgt tcttcggggc gaaaactctc aaggatctta ccgctgttga gatccagttc 6780
gatgtaaccc actcgtgcac ccaactgatc ttcagcatct tttactttca ccagcgtttc 6840
tgggtgagca aaaacaggaa ggcaaaatgc cgcaaaaaag ggaataaggg cgacacggaa 6900
atgttgaata ctcatactct tcctttttca atattattga agcatttatc agggttattg 6960
tctcatgagc ggatacatat ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg 7020
cacatttccc cgaaaagtgc cacctgggac tagctttttg caaaagccta ggcctccaaa 7080
aaagcctcct cactacttct ggaatagctc agaggccgag gcggcctcgg cctctgcata 7140
aataaaaaaa attagtcagc catggggcgg agaatgggcg gaactgggcg gagttagggg 7200
cgggatgggc ggagttaggg gcgggactat ggttgctgac taattgagat gagcttgcat 7260
gccgacattg attattgact agtccctaag aaaccattct tatcatgaca ttaacctata 7320
aaaataggcg tatcacgagg ccctttcgtc 7350

Claims (25)

1.一种清除有需要的对象中的表达BCMA的细胞的方法，所述方法包括向所述对象施用治疗有效量的表达针对B细胞成熟抗原(BCMA)的嵌合抗原受体(CAR)的免疫细胞，其中所述免疫细胞以150×106个细胞至450×106个细胞的剂量施用，并且其中在所述施用之前，所述对象已经接受了一个或多个系列的既往疗法，所述一个或多个系列的既往疗法包含以下中的一种或多种：蛋白酶体抑制剂、来那度胺、泊马度胺、沙利度胺、硼替佐米、地塞米松、环磷酰胺、多柔比星、卡非佐米、伊沙佐米、顺铂、多柔比星、依托泊苷、抗CD38抗体、帕比司他和埃罗妥珠单抗。
2.一种治疗有需要的对象中由表达BCMA的细胞引起的疾病的方法，所述方法包括向所述对象施用治疗有效量的表达针对B细胞成熟抗原(BCMA)的嵌合抗原受体(CAR)的免疫细胞，其中所述免疫细胞以150×106个细胞至450×106个细胞的剂量施用，并且其中在所述施用之前，所述对象已经接受了一个或多个系列的既往疗法，所述一个或多个系列的既往疗法包含以下中的一种或多种：蛋白酶体抑制剂、来那度胺、泊马度胺、沙利度胺、硼替佐米、地塞米松、环磷酰胺、多柔比星、卡非佐米、伊沙佐米、顺铂、多柔比星、依托泊苷、抗CD38抗体、帕比司他和埃罗妥珠单抗。
3.一种治疗有需要的对象中的表达BCMA的癌症的方法，所述方法包括向所述对象施用治疗有效量的表达针对B细胞成熟抗原(BCMA)的嵌合抗原受体(CAR)的免疫细胞，其中所述免疫细胞以150×106个细胞至450×106个细胞的剂量施用，并且其中在所述施用之前，所述对象已经接受了一个或多个系列的既往疗法，所述一个或多个系列的既往疗法包含以下中的一种或多种：蛋白酶体抑制剂、来那度胺、泊马度胺、沙利度胺、硼替佐米、地塞米松、环磷酰胺、多柔比星、卡非佐米、伊沙佐米、顺铂、多柔比星、依托泊苷、抗CD38抗体、帕比司他和埃罗妥珠单抗。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述表达BCMA的癌症是多发性骨髓瘤、慢性淋巴细胞性白血病或非霍奇金淋巴瘤(例如伯基特氏淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病/小淋巴细胞性淋巴瘤(CLL/SLL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、免疫母细胞性大细胞淋巴瘤、前体B淋巴母细胞性淋巴瘤和套细胞淋巴瘤)。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述对象患有多发性骨髓瘤，所述多发性骨髓瘤是高危多发性骨髓瘤。
6.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述对象患有多发性骨髓瘤，所述多发性骨髓瘤是复发难治性多发性骨髓瘤。
7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中在所述施用之前，所述对象已经接受了一个或多个系列的既往疗法，所述一个或多个系列的既往疗法包含：
a.达雷木单抗、泊马度胺和地塞米松(DPd)；
b.达雷木单抗、硼替佐米和地塞米松(DVd)；
c.伊沙佐米、来那度胺和地塞米松(IRd)；
d.达雷木单抗、来那度胺和地塞米松；
e.硼替佐米、来那度胺和地塞米松(RVd)；
f.硼替佐米、环磷酰胺和地塞米松(BCd)；
g.硼替佐米、多柔比星和地塞米松；
h.卡非佐米、来那度胺和地塞米松(CRd)；
i.硼替佐米和地塞米松；
j.硼替佐米、沙利度胺和地塞米松；
k.来那度胺和地塞米松；
l.地塞米松、沙利度胺、顺铂、多柔比星、环磷酰胺、依托泊苷和硼替佐米(VTD-PACE)；
m.来那度胺和低剂量地塞米松；
n.硼替佐米、环磷酰胺和地塞米松；
o.卡非佐米和地塞米松；
p.单独的来那度胺；
q.单独的硼替佐米；
r.单独的达雷木单抗；
s.埃罗妥珠单抗、来那度胺和地塞米松；
t.埃罗妥珠单抗、来那度胺和地塞米松；
u.苯达莫司汀、硼替佐米和地塞米松；
v.苯达莫司汀、来那度胺和地塞米松；
w.泊马度胺和地塞米松；
x.泊马度胺、硼替佐米和地塞米松；
y.泊马度胺、卡非佐米和地塞米松；
z.硼替佐米和多柔比星脂质体；
aa.环磷酰胺、来那度胺和地塞米松；
bb.埃罗妥珠单抗、硼替佐米和地塞米松；
cc.伊沙佐米和地塞米松；
dd.帕比司他、硼替佐米和地塞米松；
ee.帕比司他和卡非佐米；或
ff.泊马度胺、环磷酰胺和地塞米松。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述对象已经接受了所述系列的既往疗法中的两个或更多个系列。
9.如权利要求7所述的方法，其中所述对象已经接受了所述系列的既往疗法中的三个或更多个系列。
10.如权利要求7所述的方法，其中所述对象已经接受了所述系列的既往疗法中的四个或更多个系列。
11.如权利要求7所述的方法，其中所述对象已经接受了所述系列的既往疗法中的五个或更多个系列。
12.如权利要求7所述的方法，其中所述对象已经接受了所述系列的既往疗法中的六个或更多个系列。
13.如权利要求7所述的方法，其中所述对象已经接受了所述系列的既往疗法中的七个或更多个系列。
14.如权利要求7所述的方法，其中所述对象已经接受了所述系列的既往疗法中的不超过三个系列。
15.如权利要求7所述的方法，其中所述对象已经接受了所述系列的既往疗法中的不超过两个系列。
16.如权利要求7所述的方法，其中所述对象已经接受了所述系列的既往疗法中的不超过一个系列。
17.如权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述对象在所述施用时表现出：
a.血清M蛋白水平(血清蛋白电泳[sPEP])大于或等于约0.5g/dL或者尿M蛋白水平(尿蛋白电泳[uPEP])大于或等于约200mg/24小时，和/或
b.在血清或尿中没有可测量到的疾病的情况下的轻链多发性骨髓瘤(MM)，其中血清免疫球蛋白游离轻链大于或等于约10mg/dL且血清免疫球蛋白游离轻链κ/λ比率异常；和/或
c.东部肿瘤协作组(ECOG)体能状态约为1或更低。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述对象另外：
a.已经接受了所述系列的既往治疗中的至少三个系列，包括用蛋白酶体抑制剂、免疫调节剂(来那度胺或泊马度胺)和抗CD38抗体进行的既往治疗；
b.已经经历了针对所述至少三个系列的既往治疗中的每一个系列的至少2个连续的治疗周期，除非疾病进展(PD)是对某一系列治疗的最佳反应；
c.在最近的系列的既往治疗的过程中或60天内具有疾病进展(PD)的迹象；和/或
d.已经对所述既往系列的治疗中的至少一个系列获得了反应(最低限度的反应或更佳的反应)。
19.如权利要求17所述的方法，其中所述对象另外：
a.仅接受过一种既往抗骨髓瘤治疗方案；和/或
b.具有以下高危因素：R-ISSIII期和早期复发，其中所述早期复发被定义为：(i)如果所述对象已接受诱导加干细胞移植，则自首次移植之日起少于12个月出现疾病进展；或(ii)如果对象仅接受过诱导，则自最后一次治疗方案之日起少于12个月出现疾病进展(PD)，所述最后一次治疗方案必须最少含有蛋白酶体抑制剂、免疫调节剂和地塞米松。
20.如权利要求1-19中任一项所述的方法，其中所述对象在所述施用后表现出至少六个月的无进展生存期。
21.如权利要求1-19中任一项所述的方法，其中所述对象在所述施用后表现出至少十二个月的无进展生存期。
22.如权利要求1-21中任一项所述的方法，其中所述嵌合抗原受体包含靶向BCMA的抗体或抗体片段。
23.如权利要求1-22中任一项所述的方法，其中所述嵌合抗原受体包含单链Fv抗体片段(scFv)。
24.如权利要求1-22中任一项所述的方法，其中所述嵌合抗原受体包含BCMA02 scFv。
25.如权利要求1-22中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞是bb2121细胞。
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