KR20210045985A - 항-bcma 키메라 항원 수용체의 용도 - Google Patents

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크리스틴 해게
파얄 파텔
스티븐 노비크
라스 스터나스
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셀진 코포레이션
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Abstract

본 발명은 B-세포 관련 병태, 예컨대 BCMA-발현 암을 치료하기 위한 항-B 세포 성숙 항원(BCMA) 키메라 항원 수용체(CAR)의 용도를 제공한다.

Description

항-BCMA 키메라 항원 수용체의 용도
관련 출원에 대한 상호참조
본 출원은 2018년 7월 11일자로 출원된 미국 가출원 특허 제62/696,802호의 유익을 주장하며, 이의 개시내용은 본 명세서에 전문이 참조에 의해 원용된다.
서열목록
본 출원은 2019년 7월 3일자로 생성되고, 용량이 27,379 바이트인 파일명이 14247-321-228_SEQ_LISTING.txt인 ASCII 텍스트 파일로서 본 출원과 함께 제출된 서열목록을 참고로 포함한다.
기술분야
본 발명은 B 세포 관련 병태를 치료하는 방법에 관한 것이다. 더 구체적으로는, 본 발명은 뮤린 항-BCMA 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 개선된 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor: CAR), 이들 CAR을 발현시키도록 변형된 면역 효과기 세포, 및 B 세포 관련 병태를 효과적으로 치료하기 위한 이들 조성물의 용도에 관한 것이다.
몇몇 상당한 질환은 B 림프구, 즉, B 세포에 관련된다. 비정상적 B 세포 생리학은 또한 전신홍반루푸스(SLE)를 포함하지만, 이것으로 제한되지 않는, 자가면역질환의 발생을 야기할 수 있다. B 세포의 악성 형질전환은 림프종, 예를 들어, 다발성 골수종 및 비호지킨 림프종을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 암을 야기한다.
비호지킨 림프종(NHL) 및 다발성 골수종(MM)을 포함하는 B 세포 악성종양을 갖는 대다수의 환자는 암 사망률에 대한 상당한 기여자이다. 다양한 형태의 치료에 대한 B 세포 악성종양의 반응은 혼합된다. 화학요법 및 방사선요법을 포함하는 B 세포 악성종양을 치료하는 전통적인 방법은 독성 부작용으로 인한 제한된 효용을 가진다. 항-CD19, 항-CD20, 항-CD22, 항-CD23, 항-CD52, 항-CD80 및 항-HLA-DR 치료적 항체를 이용하는 면역요법은 불량한 약물동태학적 프로파일, 혈청 프로테아제에 의한 항체의 빠른 제거 및 사구체에서의 여과, 및 종양 부위 내로의 제한된 침투 및 암 세포 상에서 표적 항원의 발현 수준에 부분적으로 기인하여 제한된 성공을 제공하였다. 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현시키는 유전자 변형 세포를 사용하기 위한 시도는 또한 제한된 성공으로 충족되었다. 또한, CAR에서 사용되는 주어진 항원 결합 도메인의 치료 효능은 예측 불가능하며, 항원 결합 도메인이 너무 강하게 결합된다면, CAR T 세포는 "사이토카인 폭풍"으로 여겨지는 잠재적으로 치명적인 면역 반응을 초래하는 엄청난 사이토카인 방출을 유도하고, 항원 결합 도메인이 너무 약하게 결합한다면, CAR T 세포는 암 세포를 클리어런스함에 있어서 충분한 치료 효능을 나타내지 않는다.
본 발명은 일반적으로 B-세포-관련 질환, 예를 들어, 다발성 골수종을 치료하는 개선된 방법을 제공한다.
일 실시형태에서, B 세포 성숙 항원(B Cell Maturation Antigen: BCMA)와 관련된 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현시키는 면역 세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, BCMA-발현 세포의 고갈이 필요한 대상체에서 이를 고갈시키는 방법이 제공되되, 면역 세포는 150×106개의 세포 내지 450×106개의 세포의 투약량으로 투여되고, 상기 투여 전에 상기 대상체는 사전 요법의 한 가지 이상의 계통을 받은 적이 있다.
일 실시형태에서, BCMA와 관련된 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현시키는 면역 세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, BCMA-발현 세포의 고갈이 필요한 대상체에서 이를 고갈시키는 방법이 제공되되, 면역 세포는 150×106개의 세포 내지 450×106개의 세포의 투약량으로 투여되고, 상기 투여 전에 상기 대상체는 프로테아좀 저해제, 레날리도마이드, 포말리도마이드, 탈리도마이드, 보르테조밉, 덱사메타손, 사이클로포스파마이드, 독소루비신, 카필조밉, 익사조밉, 시스플라틴, 독소루비신, 에토포사이드, 항-CD38 항체, 파노비노스탯 및 엘로투주맙 중 하나 이상을 포함하는 사전 요법의 한 가지 이상의 계통을 받은 적이 있다. 일 실시형태에서, 항-CD38 항체는 다라투무맙이다.
일 실시형태에서, B 세포 성숙 항원(BCMA)과 관련된 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현시키는 치료적 유효량의 면역 세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, BCMA-발현 세포의 고갈이 필요한 대상체에서 이를 고갈시키는 방법이 제공되되, 면역 세포는 150×106개의 세포 내지 450×106개의 세포의 투약량으로 투여되고, 상기 투여 전에 상기 대상체는 프로테아좀 저해제, 레날리도마이드, 포말리도마이드, 탈리도마이드, 보르테조밉, 덱사메타손, 사이클로포스파마이드, 독소루비신, 카필조밉, 익사조밉, 시스플라틴, 독소루비신, 에토포사이드, 항-CD38 항체(예컨대 다라투무맙), 파노비노스탯 또는 엘로투주맙 중 하나 이상을 포함하는 사전 요법의 한 가지 이상의 계통을 받은 적이 있다.
다른 실시형태에서, 본 명세서에서 BCMA와 관련된 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현시키는 면역 세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, BCMA-발현 세포에 의해 야기되는 질환의 치료가 필요한 대상체에서 이런 질환을 치료하는 방법이 제공되되, 면역 세포는 150×106개의 세포 내지 450×106개의 세포의 투약량으로 투여되고, 상기 투여 전에 상기 대상체는 사전 요법의 한 가지 이상의 계통을 받은 적이 있다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법에 따라 치료되는 BCMA-발현 세포에 의해 야기되는 질환은 전신홍반루푸스, 류마티스 관절염, 중증 근무력증, 자가면역성 용혈성 빈혈, 특발성 혈소판 감소성 자반증, 항-인지질 증후군, 샤가스병, 그레이브스병, 베게너 육아종증, 결절성 다발성 동맥염, 쇼그렌 증후군, 심상성 천포창, 피부경화증, 다발성 경화증, 항-인지질 증후군, ANCA 연관 혈관염, 굿파스처병, 가와사키병 및 급속 진행성 사구체신염을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법에 따라 치료되는 BCMA-발현 세포에 의해 야기되는 질환은 또한 중쇄병, 원발성 또는 면역세포-연관 아밀로이드증 및 의미미결정 단클론성 감마글루불린병증(MGUS)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
다른 실시형태에서, BCMA와 관련된 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현시키는 면역 세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, BCMA-발현 세포에 의해 야기되는 질환의 치료가 필요한 대상체에서 이를 치료하는 방법이 제공되되, 면역 세포는 150×106개의 세포 내지 450×106개의 세포의 투약량으로 투여되고, 상기 투여 전에 상기 대상체는 프로테아좀 저해제, 레날리도마이드, 포말리도마이드, 탈리도마이드, 보르테조밉, 덱사메타손, 사이클로포스파마이드, 독소루비신, 카필조밉, 익사조밉, 시스플라틴, 독소루비신, 에토포사이드, 항-CD38 항체, 파노비노스탯 및 엘로투주맙 중 하나 이상을 포함하는 사전 요법의 한 가지 이상의 계통을 받은 적이 있다. 일 실시형태에서, 항-CD38 항체는 다라투무맙이다.
다른 실시형태에서, B 세포 성숙 항원(BCMA)과 관련된 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현시키는 치료적 유효량의 면역 세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, BCMA-발현 세포에 의해 야기되는 질환의 치료가 필요한 대상체에서 이를 치료하는 방법이 제공되되, 면역 세포는 150×106개의 세포 내지 450×106개의 세포의 투약량으로 투여되고, 상기 투여 전에 상기 대상체는 프로테아좀 저해제, 레날리도마이드, 포말리도마이드, 탈리도마이드, 보르테조밉, 덱사메타손, 사이클로포스파마이드, 독소루비신, 카필조밉, 익사조밉, 시스플라틴, 독소루비신, 에토포사이드, 항-CD38 항체(예컨대 다라투무맙), 파노비노스탯 또는 엘로투주맙 중 하나 이상을 포함하는 사전 요법의 한 가지 이상의 계통을 받은 적이 있다.
다른 실시형태에서, 본 명세서에서 BCMA와 관련된 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현시키는 면역 세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, BCMA를 발현시키는 암의 치료가 필요한 대상체에서 이런 암을 치료하는 방법이 제공되되, 면역 세포는 150×106개의 세포 내지 450×106개의 세포의 투약량으로 투여되고, 상기 투여 전에 상기 대상체는 사전 요법의 한 가지 이상의 계통을 받은 적이 있다.
다른 실시형태에서, BCMA와 관련된 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현시키는 면역 세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, BCMA를 발현시키는 암의 치료가 필요한 대상체에서 이런 암을 치료하는 방법이 제공되되, 면역 세포는 150×106개의 세포 내지 450×106개의 세포의 투약량으로 투여되고, 상기 투여 전에 상기 대상체는 프로테아좀 저해제, 레날리도마이드, 포말리도마이드, 탈리도마이드, 보르테조밉, 덱사메타손, 사이클로포스파마이드, 독소루비신, 카필조밉, 익사조밉, 시스플라틴, 독소루비신, 에토포사이드, 항-CD38 항체, 파노비노스탯 및 엘로투주맙 중 하나 이상을 포함하는 사전 요법의 한 가지 이상의 계통을 받은 적이 있다. 일 실시형태에서, 항-CD38 항체는 다라투무맙이다. 특정 실시형태에서, BCMA를 발현시키는 암은 다발성 골수종, 만성 림프구성 백혈병 또는 비호지킨 림프종(예를 들어, 버킷 림프종, 만성 림프구성 백혈병/소림프구 림프종(CLL/SLL), 미만성 거대 B 세포 림프종, 소포성 림프종, 면역아세포성 거대 세포 림프종, 전구체 B-림프아구성 림프종 또는 외투세포 림프종)이다.
다른 실시형태에서, B 세포 성숙 항원(BCMA)과 관련된 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현시키는 치료적 유효량의 면역 세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, BCMA를 발현시키는 암의 치료가 필요한 대상체에서 이런 암을 치료하는 방법이 제공되되, 면역 세포는 150×106개의 세포 내지 450×106개의 세포의 투약량으로 투여되고, 상기 투여 전에 상기 대상체는 프로테아좀 저해제, 레날리도마이드, 포말리도마이드, 탈리도마이드, 보르테조밉, 덱사메타손, 사이클로포스파마이드, 독소루비신, 카필조밉, 익사조밉, 시스플라틴, 독소루비신, 에토포사이드, 항-CD38 항체(예컨대 다라투무맙), 파노비노스탯 또는 엘로투주맙 중 하나 이상을 포함하는 사전 요법의 한 가지 이상의 계통을 받은 적이 있다. 특정 실시형태에서, BCMA를 발현시키는 암은 다발성 골수종, 만성 림프구성 백혈병 또는 비호지킨 림프종(예를 들어, 버킷 림프종, 만성 림프구성 백혈병/소림프구 림프종(CLL/SLL), 미만성 거대 B 세포 림프종, 소포성 림프종, 면역아세포성 거대 세포 림프종, 전구체 B-림프아구성 림프종 또는 외투세포 림프종)이다.
다른 실시형태에서, B 세포 성숙 항원(BCMA)과 관련된 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현시키는 치료적 유효량의 면역 세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, BCMA를 발현시키는 암의 치료가 필요한 대상체에서 이런 암을 치료하는 방법이 제공되되, 면역 세포는 150×106개의 세포 내지 450×106개의 세포의 투약량으로 투여되고, 상기 투여 전에 상기 대상체는 프로테아좀 저해제, 레날리도마이드, 포말리도마이드, 탈리도마이드, 보르테조밉, 덱사메타손, 사이클로포스파마이드, 독소루비신, 카필조밉, 익사조밉, 시스플라틴, 독소루비신, 에토포사이드, 항-CD38 항체(예컨대 다라투무맙), 파노비노스탯 또는 엘로투주맙 중 하나 이상을 포함하는 사전 요법의 한 가지 이상의 계통을 받은 적이 있고;; BCMA를 발현시키는 암은 다발성 골수종, 만성 림프구성 백혈병 또는 비호지킨 림프종(예를 들어, 버킷 림프종, 만성 림프구성 백혈병/소림프구 림프종(CLL/SLL), 미만성 거대 B 세포 림프종, 소포성 림프종, 면역아세포성 거대 세포 림프종, 전구체 B-림프아구성 림프종 및 외투세포 림프종)이다.
일 실시형태에서, 본 명세서에서 B 세포 성숙 항원(BCMA)과 관련된 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현시키는 T 세포(예를 들어, 자가 T 세포)를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 다발성 골수종의 치료가 필요한 대상체에서 재발, 난치성 또는 고위험의 다발성 골수종을 치료하는 방법이 제공되되, T 세포는 약 150×106개의 세포 내지 약 600×106개의 세포 범위의 용량으로 투여되고(예를 들어, 주입되고), 상기 투여 전에 상기 대상체는 프로테아좀 저해제, 면역조절제(예컨대 IMiD 화합물), 덱사메타손 및 항-CD38 항체 중 하나 이상을 포함하는 사전 요법(예를 들어, 단일 사전 요법, 2회의 사전 요법, 3회의 사전 요법 또는 3회 초과의 사전 요법)의 한 가지 이상의 계통을 받은 적이 있다. 일 실시형태에서, 본 명세서에서 B 세포 성숙 항원(BCMA)과 관련된 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현시키는 T 세포(예를 들어, 자가 T 세포)를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 다발성 골수종의 치료가 필요한 대상체에서 재발, 난치성 또는 고위험의 다발성 골수종을 치료하는 방법이 제공되되, T 세포는 약 150×106개의 세포 내지 약 600×106개의 세포 범위의 용량으로 투여되고(예를 들어, 주입되고), 상기 투여 전에 상기 대상체는 프로테아좀 저해제, 레날리도마이드, 포말리도마이드, 탈리도마이드, 보르테조밉, 덱사메타손, 사이클로포스파마이드, 독소루비신, 카필조밉, 익사조밉, 시스플라틴, 독소루비신, 에토포사이드 및 항-CD38 항체(예컨대 다라투무맙), 파노비노스탯 또는 엘로투주맙 중 하나 이상을 포함하는 사전 요법(예를 들어, 단일 사전 요법, 2회의 사전 요법, 3회의 사전 요법 또는 3회 초과의 사전 요법)의 한 가지 이상의 계통을 받은 적이 있다. 일부 실시형태에서, 대상체는 다발성 골수종으로 진단되었다. 일 실시형태에서, 대상체는 고위험 다발성 골수종인 다발성 골수종을 가진다. 일 실시형태에서, 대상체는 재발 및 난치성 다발성 골수종인 다발성 골수종을 가진다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법에 따라 치료 중인 대상체는 1가지의 사전 요법만을 받은 적이 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법에 따라 치료 중인 대상체는 3 내지 7가지의 사전 요법을 받은 적이 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법에 따라 치료 중인 대상체는 3가지 초과의 사전 요법을 받은 적이 있다. 일부 실시형태에서, 대상체는 적어도 1, 2 또는 3가지의 치료 요법에 대해 난치성(예를 들어, 투여받은 마지막 사전 요법에 대해 난치성)이고, 예를 들어, 대상체는 치료 요법에 의한 치료 완료 60일 이내에 진행성 질환을 나타내었다. 일 실시형태에서, 상기 방법은 재발 및 난치성 다발성 골수종을 치료하기 위한 것이다. 일 실시형태에서, 상기 방법은 재발 다발성 골수종을 치료하기 위한 것이다. 일 실시형태에서, 상기 방법은 난치성 다발성 골수종을 치료하기 위한 것이다. 일 실시형태에서, 대상체는 프로테아좀 저해제, 면역조절제(예컨대 IMiD 화합물), 덱사메타손 및/또는 항-CD38 항체에 의한 치료에 대해 난치성이다. 일 실시형태에서, 상기 방법은 고위험 다발성 골수종을 치료하기 위한 것이다. 일부 실시형태에서, 고위험 다발성 골수종은 R-ISS III기 질환 및/또는 조기 재발을 특징으로 하는 질환(예컨대, 마지막 치료 요법일, 프로테아좀 저해제, 면역조절제 및/또는 덱사메타손에 의한 마지막 치료 요법일 이후로 12개월 이내의 진행성 질환)이다. 일 실시형태에서, B 세포 성숙 항원(BCMA)과 관련된 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현시키는 T 세포의 투여 전에, 종양을 갖는 대상체는 종양에 의한 BCMA의 발현에 대해 평가되었다. 일 실시형태에서, BCMA-발현 다발성 골수종은 본 명세서에 기재된 방법에 따라 치료된다. 일부 실시형태에서, T 세포는 정맥내 주입에 의해 투여된다. 일부 실시형태에서, T 세포는 150×106개의 세포 내지 450×106개의 세포, 300×106개의 세포 내지 600×106개의 세포, 350×106개의 세포 내지 600×106개의 세포, 350×106개의 세포 내지 550×106개의 세포, 400×106개의 세포 내지 600×106개의 세포, 150×106개의 세포 내지 300×106개의 세포, 또는 400×106개의 세포 내지 500×106개의 세포 범위의 용량으로 투여된다. 일부 실시형태에서, T 세포는 약 150×106개의 세포, 약 200×106개의 세포, 약 250×106개의 세포, 약 300×106개의 세포, 약 350×106개의 세포, 약 400×106개의 세포, 약 450×106개의 세포, 약 500×106개의 세포, 또는 약 550×106개의 세포의 용량으로 투여된다. 일 실시형태에서, T 세포는 약 450×106개의 세포의 용량으로 투여된다. 일부 실시형태에서, 대상체는 B 세포 성숙 항원(BCMA)과 관련된 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현시키는 T 세포의 1회 주입이 투여된다. 일부 실시형태에서, B 세포 성숙 항원(BCMA)과 관련된 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현시키는 T 세포의 투여는 반복된다(예를 들어, T 세포의 제2 용량은 대상체에게 투여될 수 있다).
본 명세서에 기재된 임의의 실시형태의 구체적 실시형태에서, B 세포 성숙 항원(BCMA)과 관련된 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현시키는 면역 세포는 약 150×106개의 세포 내지 약 300×106개 세포의 투약량으로 투여된다. 본 명세서에 기재된 임의의 실시형태의 구체적 실시형태에서, B 세포 성숙 항원(BCMA)과 관련된 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현시키는 면역 세포는 약 350×106개의 세포 내지 약 550×106개 세포의 투약량으로 투여된다. 본 명세서에 기재된 임의의 실시형태의 구체적 실시형태에서, B 세포 성숙 항원(BCMA)과 관련된 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현시키는 면역 세포는 약 400×106개의 세포 내지 약 500×106개 세포의 투약량으로 투여된다. 본 명세서에 기재된 임의의 실시형태의 구체적 실시형태에서, B 세포 성숙 항원(BCMA)과 관련된 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현시키는 면역 세포는 약 150×106개의 세포 내지 약 250×106개 세포의 투약량으로 투여된다. 본 명세서에 기재된 임의의 실시형태의 구체적 실시형태에서, B 세포 성숙 항원(BCMA)과 관련된 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현시키는 면역 세포는 약 300×106개의 세포 내지 약 500×106개 세포의 투약량으로 투여된다. 본 명세서에 기재된 임의의 실시형태의 구체적 실시형태에서, B 세포 성숙 항원(BCMA)과 관련된 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현시키는 면역 세포는 약 350×106개의 세포 내지 약 450×106개 세포의 투약량으로 투여된다. 본 명세서에 기재된 임의의 실시형태의 구체적 실시형태에서, B 세포 성숙 항원(BCMA)과 관련된 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현시키는 면역 세포는 약 300×106개의 세포 내지 약 450×106개 세포의 투약량으로 투여된다. 본 명세서에 기재된 임의의 실시형태의 구체적 실시형태에서, B 세포 성숙 항원(BCMA)과 관련된 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현시키는 면역 세포는 약 250×106개의 세포 내지 약 450×106개 세포의 투약량으로 투여된다. 본 명세서에 기재된 임의의 실시형태의 구체적 실시형태에서, B 세포 성숙 항원(BCMA)과 관련된 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현시키는 면역 세포는 약 300×106개의 세포 내지 약 600×106개 세포의 투약량으로 투여된다. 본 명세서에 기재된 임의의 실시형태의 구체적 실시형태에서, B 세포 성숙 항원(BCMA)과 관련된 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현시키는 면역 세포는 약 250×106개의 세포 내지 약 500×106개 세포의 투약량으로 투여된다. 본 명세서에 기재된 임의의 실시형태의 구체적 실시형태에서, B 세포 성숙 항원(BCMA)과 관련된 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현시키는 면역 세포는 약 350×106개의 세포 내지 약 500×106개 세포의 투약량으로 투여된다. 본 명세서에 기재된 임의의 실시형태의 구체적 실시형태에서, B 세포 성숙 항원(BCMA)과 관련된 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현시키는 면역 세포는 약 400×106개의 세포 내지 약 600×106개 세포의 투약량으로 투여된다. 본 명세서에 기재된 임의의 실시형태의 구체적 실시형태에서, B 세포 성숙 항원(BCMA)과 관련된 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현시키는 면역 세포는 약 400×106개의 세포 내지 약 450×106개 세포의 투약량으로 투여된다. 본 명세서에 기재된 임의의 실시형태의 구체적 실시형태에서, B 세포 성숙 항원(BCMA)과 관련된 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현시키는 면역 세포는 약 200×106개의 세포 내지 약 400×106개 세포의 투약량으로 투여된다. 본 명세서에 기재된 임의의 실시형태의 구체적 실시형태에서, B 세포 성숙 항원(BCMA)과 관련된 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현시키는 면역 세포는 약 200×106개의 세포 내지 약 350×106개 세포의 투약량으로 투여된다. 본 명세서에 기재된 임의의 실시형태의 구체적 실시형태에서, B 세포 성숙 항원(BCMA)과 관련된 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현시키는 면역 세포는 약 200×106개의 세포 내지 약 300×106개 세포의 투약량으로 투여된다. 본 명세서에 기재된 임의의 실시형태의 구체적 실시형태에서, B 세포 성숙 항원(BCMA)과 관련된 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현시키는 면역 세포는 약 450×106개의 세포 내지 약 500×106개 세포의 투약량으로 투여된다. 본 명세서에 기재된 임의의 실시형태의 구체적 실시형태에서, B 세포 성숙 항원(BCMA)과 관련된 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현시키는 면역 세포는 약 250×106개의 세포 내지 약 400×106개 세포의 투약량으로 투여된다. 본 명세서에 기재된 임의의 실시형태의 구체적 실시형태에서, B 세포 성숙 항원(BCMA)과 관련된 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현시키는 면역 세포는 약 250×106개의 세포 내지 약 350×106개 세포의 투약량으로 투여된다. 본 명세서에 기재된 임의의 실시형태의 구체적 실시형태에서, B 세포 성숙 항원(BCMA)과 관련된 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현시키는 면역 세포는 약 450×106개의 세포의 투약량으로 투여된다. 본 명세서에 기재된 임의의 실시형태의 구체적 실시형태에서, 면역 세포는 T 세포(예를 들어, 자가 T 세포)이다. 본 명세서에 기재된 임의의 실시형태의 구체적 실시형태에서, 치료 중인 대상체는 대상체에 대한 투여 전에 B 세포 성숙 항원(BCMA)과 관련된 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현시키는 면역 세포의 제조를 위해 자가 면역 세포를 수집하는 백혈구성분채집술 절차를 겪는다. 본 명세서에 기재된 임의의 실시형태의 구체적 실시형태에서, 면역 세포(예를 들어, T 세포)는 정맥내 주입에 의해 투여된다.
본 명세서에 개시된 임의의 실시형태의 구체적 실시형태에서, B 세포 성숙 항원(BCMA)과 관련된 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현시키는 면역 세포의 투여 전에, 치료 중인 대상체는 림프구고갈(lymphodepleting: LD) 화학요법이 투여된다. 구체적 실시형태에서, LD 화학요법은 플루다라빈 및/또는 사이클로포스파마이드를 포함한다. 구체적 실시형태에서, LD 화학요법은 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일(예를 들어, 3일)의 지속기간 동안 플루다라빈(예를 들어, 정맥내 투여에 대해 약 30㎎/㎡) 및 사이클로포스파마이드(예를 들어, 정맥내 투여에 대해 약 300㎎/㎡)를 포함한다. 다른 구체적 실시형태에서, LD 화학요법은 부문 5.9에 기재된 임의의 화학치료제를 포함한다. 구체적 실시형태에서, 대상체는 LD 화학요법 투여 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일 후에(예를 들어, LD 화학요법 투여 2 또는 3일 후에) B 세포 성숙 항원(BCMA)과 관련된 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현시키는 면역 세포가 투여된다. 구체적 실시형태에서, 대상체는 적어도 1주 초과, 적어도 2주 초과(적어도 14일 초과), 적어도 3주 초과, 적어도 4주 초과, 적어도 5주 초과 또는 적어도 6주 초과 동안 LD 화학요법의 개시 전에 임의의 요법을 투여받지 않았다. 본 명세서에 개시된 임의의 실시형태의 구체적 실시형태에서, B 세포 성숙 항원(BCMA)과 관련된 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현시키는 면역 세포의 투여 전에, 치료 중인 대상체는 단일 사전 치료 요법만을 받은 적이 있다.
임의의 상기 실시형태의 구체적 실시형태에서, 상기 투여 전에 상기 대상체는 다라투무맙, 포말리도마이드 및 덱사메타손(DPd); 다라투무맙, 보르테조밉, 및 덱사메타손(DVd); 익사조밉, 레날리도마이드, 및 덱사메타손(IRd); 다라투무맙, 레날리도마이드 및 덱사메타손; 보르테조밉, 레날리도마이드 및 덱사메타손(RVd); 보르테조밉, 사이클로포스파마이드 및 덱사메타손(BCd); 보르테조밉, 독소루비신 및 덱사메타손; 카필조밉, 레날리도마이드 및 덱사메타손(CRd); 보르테조밉 및 덱사메타손; 보르테조밉, 탈리도마이드 및 덱사메타손; 레날리도마이드 및 덱사메타손; 덱사메타손, 탈리도마이드, 시스플라틴, 독소루비신, 사이클로포스파마이드, 에토포사이드 및 보르테조밉(VTD-PACE); 레날리도마이드 및 저용량 덱사메타손; 보르테조밉, 사이클로포스파마이드 및 덱사메타손; 카필조밉 및 덱사메타손; 레날리도마이드 단독; 보르테조밉 단독; 다라투무맙 단독; 엘로투주맙, 레날리도마이드, 및 덱사메타손; 엘로투주맙, 레날리도마이드 및 덱사메타손; 벤다무스틴, 보르테조밉 및 덱사메타손; 벤다무스틴, 레날리도마이드, 및 덱사메타손; 포말리도마이드 및 덱사메타손; 포말리도마이드, 보르테조밉 및 덱사메타손; 포말리도마이드, 카필조밉 및 덱사메타손; 보르테조밉 및 리포좀 독소루비신; 사이클로포스파마이드, 레날리도마이드, 및 덱사메타손; 엘로투주맙, 보르테조밉 및 덱사메타손; 익사조밉 및 덱사메타손; 파노비노스탯, 보르테조밉 및 덱사메타손; 파노비노스탯 및 카필조밉; 또는 포말리도마이드, 사이클로포스파마이드 및 덱사메타손을 포함하는 사전 요법의 한 가지 이상의 계통을 받은 적이 있다.
임의의 상기 실시형태의 구체적 실시형태에서, 상기 투여 전에 상기 대상체는 프로테아좀 저해제, 레날리도마이드, 포말리도마이드, 탈리도마이드, 보르테조밉, 덱사메타손(예를 들어, 저용량의 덱사메타손), 사이클로포스파마이드, 독소루비신, 카필조밉, 익사조밉, 시스플라틴, 독소루비신, 에토포사이드, 벤다무스틴, 리포좀 독소루비신, 항-CD38 항체, 파노비노스탯 및 엘로투주맙 중 하나 이상을 포함하는 사전 요법의 한 가지 이상의 계통을 받은 적이 있다. 구체적 실시형태에서, 항-CD38 항체는 다라투무맙이다.
임의의 상기의 특정의 더 구체적인 실시형태에서, 상기 대상체는 사전 요법의 상기 계통의 2가지 이상, 사전 요법의 상기 계통의 3가지 이상, 사전 요법의 상기 계통의 4가지 이상, 사전 요법의 상기 계통의 5가지 이상, 사전 요법의 상기 계통의 6가지 이상 또는 사전 요법의 상기 계통의 7가지 이상을 받은 적이 있다. 임의의 상기의 특정의 다른 더 구체적인 실시형태에서, 상기 대상체는 사전 요법의 상기 계통의 3가지 이하, 사전 요법의 상기 계통의 2가지 이하 또는 사전 요법의 상기 계통의 1가지 이하를 받은 적이 있다.
임의의 상기 실시형태에 대해, 대상체는 상기 투여 전에 림프구 제거술(lymphodepletion)을 받았다. 임의의 상기 실시형태에 대해, 대상체는 상기 면역 세포, 예를 들어, T 세포를 수집하고 단리시키기 위해 성분채집술을 받는다. 임의의 상기 실시형태의 구체적 실시형태에서, 상기 대상체는 상기 성분채집술 시 하기를 나타낸다: M-단백질(혈청 단백질 전기영동법[sPEP] 또는 소변 단백질 전기영동법[uPEP]): 0.5 g/㎗ 이상의 sPEP 또는 200㎎/24시간 이상의 uPEP; 혈청 또는 소변에서 측정 가능한 질환이 없고, 혈청 면역글로불린 유리 경쇄가 10㎎/㎗ 이상이고, 비정상적 혈청 면역글로불린 카파 람다 유리 경쇄 비를 갖는, 경쇄 다발성 골수종; 및/또는 동부 종양학 협력 그룹(ECOG) 수행도가 1 이하. 더 구체적인 실시형태에서, 성분채집술의 시작 시 상기 대상체는 추가적으로 프로테아좀 저해제, 면역조절제(레날리도마이드 또는 포말리도마이드) 및 항-CD38 항체에 의한 사전 치료를 포함하는 사전 치료의 상기 계통 중 적어도 3가지를 받은 적이 있고; 진행성 질환이 치료 계통에 대한 최고의 반응이 아니라면, 사전 치료의 상기 적어도 3가지 계통 각각에 대해 적어도 2회 연속 주기의 치료를 받은 적이 있고; 사전 치료의 대부분의 최신 계통의 60일에 또는 이내에 진행성 질환의 증거가 있으며; 그리고/또는 치료의 상기 사전 계통에 대한 반응(최소 반응 또는 더 양호한 반응)이 달성된 적이 있다. 임의의 상기 실시형태의 구체적 실시형태에서, 상기 대상체는 상기 투여 시 하기를 나타낸다: M-단백질(혈청 단백질 전기영동법[sPEP] 또는 소변 단백질 전기영동법[uPEP]): 0.5g/㎗ 이상의 sPEP 또는 200㎎/24시간 이상의 uPEP; 혈청 또는 소변에서 측정 가능한 질환이 없고, 혈청 면역글로불린 유리 경쇄가 10㎎/㎗ 이상이고, 비정상적 혈청 면역글로불린 카파 람다 유리 경쇄 비를 갖는, 경쇄 다발성 골수종; 및/또는 동부 종양학 협력 그룹(ECOG) 수행도가 1 이하. 더 구체적인 실시형태에서, 투여 시작 시 상기 대상체는 추가적으로 프로테아좀 저해제, 면역조절제(예를 들어, 레날리도마이드 또는 포말리도마이드) 및 항-CD38 항체에 의한 사전 치료를 포함하는 사전 치료의 상기 계통 중 적어도 3가지를 받은 적이 있고; 진행성 질환이 치료 계통에 대한 최고의 반응이 아니라면, 사전 치료의 상기 적어도 3가지 계통 각각에 대해 적어도 2회 연속 주기의 치료를 받은 적이 있고; 사전 치료의 대부분의 최신 계통의 60일에 또는 이내에 진행성 질환의 증거가 있으며; 그리고/또는 치료의 상기 사전 계통에 대한 반응(최소 반응 또는 더 양호한 반응)이 달성된 적이 있다.
다른 더 구체적인 실시형태에서, 상기 대상체는 추가적으로 단지 하나의 사전 항-골수종 치료 요법을 받고; 다음의 고위험 인자를 갖는다: (i) 대상체가 유도 + 줄기 세포 이식을 겪었다면, 제1 이식일 이후로 12개월 미만의 진행성 질환(PD)으로서; 또는 (ii) 대상체가 유도만을 받은 적이 있다면, 최소, 프로테아좀 저해제, 면역조절제 및 덱사메타손을 함유하여야 하는 마지막 치료 요법일 이후로 12개월 미만의 PD로서 정의되는, R-ISS III기, 및 조기 재발.
임의의 상기 실시형태의 구체적 실시형태에서, 상기 대상체는 상기 투여 후 적어도 6개월, 또는 상기 투여 후 적어도 12개월의 무진행 생존을 나타낸다.
임의의 상기 실시형태의 구체적 실시형태에서, 상기 키메라 항원 수용체는 BCMA를 표적화하는 항체 또는 항체 단편, 예를 들어, 단일 쇄 Fv 항체 단편(scFv), 예를 들어, BCMA02 scFv를 포함한다. 일 실시형태에서, 키메라 항원 수용체는 BCMA를 표적화하는 뮤린 단일 쇄 Fv 항체 단편을 포함한다. 일 실시형태에서, 키메라 항원 수용체는 BCMA 폴리펩타이드에 결합하는 뮤린 항-BCMA scFv, CD8α 폴리펩타이드를 포함하는 힌지 도메인, CD8α 막관통 도메인, CD137(4-1BB) 세포내 공자극 신호전달 도메인, 및 CD3ζ 1차 신호전달 도메인을 포함한다. 일 실시형태에서, 키메라 항원 수용체는 BCMA를 표적화하는 뮤린 scFv를 포함하되, scFV는 서열번호 9의 항-BCMA02 CAR의 scFv이다. 일 실시형태에서, 키메라 항원 수용체는 서열번호 9이거나 이를 포함한다. 본 명세서의 임의의 실시형태의 더 구체적인 실시형태에서, 상기 면역 세포는 bb2121 세포이다. 일 실시형태에서, 면역 세포는 BCMA를 표적화하는 뮤린 단일 쇄 Fv 항체 단편을 포함하는 키메라 항원 수용체를 포함한다. 일 실시형태에서, 면역 세포는 BCMA 폴리펩타이드에 결합하는 뮤린 항-BCMA scFv, CD8α 폴리펩타이드를 포함하는 힌지 도메인, CD8α 막관통 도메인, CD137(4-1BB) 세포내 공자극 신호전달 도메인, 및 CD3ζ 1차 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체를 포함한다. 일 실시형태에서, 면역 세포는 서열번호 9이거나 이를 포함하는 키메라 항원 수용체를 포함한다.
도 1은 뮤린 B 세포 성숙 항원(muBCMA) CAR 작제물의 개략도를 도시한 도면.
도 2A는 BCMA를 발현시키는 K562 세포와 함께 24시간 동안 공동배양시킨 후에, 항-BCMA02 CAR T 세포, 항-BCMA10 CART 세포 및 CAR19Δ T 세포로부터 방출된 IFNγ의 양을 도시한 도면.
도 2B는 BCMA를 발현시키는 K562 세포에 비해 BCMA 발현을 결여하는 K562 세포와 함께 24시간 동안 공동 배양시킨 후에, 항-BCMA02 CAR T 세포, 항-BCMA10 CART 세포 및 CAR19Δ T 세포로부터 방출된 IFNγ의 양을 도시한 도면.
도 3은 분석 10일 전에 자극한, 비형질도입 대조군 T 세포, 항-BCMA02 CAR T 세포, 항-BCMA10 CART 세포 및 CAR19Δ T 세포로부터의 성장 배지 내 염증 사이토카인의 양을 도시한 도면.
도 4는 항원 자극이 존재하지 않을 때 항-BCMA02 CAR T 세포, 항-BCMA10 CART 세포 및 CAR19Δ T 세포에 의해 생성되는 염증 사이토카인의 양을 도시한 도면.
도 5는 항-BCMA CAR T 세포 제조의 마지막에 활성화의 표현형 마커 발현을 도시한 도면. HLA-DR 및 CD25 발현은 항-BCMA02 CAR T 세포, 항-BCMA10 CAR T 세포, 및 CAR19Δ T 세포에서 측정되었다.
도 6은 세포자멸사에서 필수 단계이며, 항원 자극이 존재하지 않을 때 항-BCMA10 CAR T 세포 및 항-BCMA02 CAR T 세포에서 AICD에 대해 중요한, 활성화된 카스파제-3 수준을 도시한 도면.
도 7은 소 태아 혈청(FBS), 인간 AB 혈청(HABS) 또는 100ng/㎖ 가용성 BCMA를 함유하는 배지에서 항-BCMA02 및 항-BCMA10 CAR T 세포에서의 염증 사이토카인의 양을 도시한 도면.
도 8a는 ~100㎣의 실험적 피하 인간 다발성 골수종(RPMI-8226) 종양을 갖는 NOD scid 감마(NSG) 마우스에서의 종양 용적을 도시한 도면. 마우스를 비히클, 107개의 항-BCMA02 CAR T 세포, 107개의 항-BCMA10 CAR T 세포 또는 보르테조밉(VELCADE®)으로 치료하였다.
도 8b는 ~100㎣의 실험적 피하 인간 다발성 골수종(RPMI-8226) 종양을 갖는 NOD scid 감마(NSG) 마우스에서의 종양 용적을 도시한 도면. 마우스를 비히클, 107개의 항-BCMA02 CAR T 세포, 107개의 항-BCMA10 CAR T 세포 또는 보르테조밉(VELCADE®)로 치료하였다.
도 9는 림프종 및 백혈병 세포주 상의 BCMA 발현 수준(원) 및 각각의 세포주에 대한 항-BCMA CAR T 세포의 활성 수준(IFNγ 방출, 박스)을 도시한 도면. BCMA-음성(BCMA-) 종양 세포주: 골수성 백혈병(K562), 급성 림프아구성 백혈병(NALM-6 and NALM-16); 외투세포 림프종(REC-1); 또는 호지킨 림프종(HDLM-2)은 IFNγ 방출을 거의 또는 전혀 나타내지 않았다. BCMA-양성(BCMA+) 종양 세포주: B　세포 만성 림프아구성 백혈병(MEC-1), 외투세포 림프종(JeKo-1), 호지킨 림프종(RPMI-6666), 버킷 림프종(Daudi 세포 및 Ramos 세포) 및 다발성 골수종(RPMI-8226)은 실질적인 IFNγ 방출을 나타내었다.
도 10a는 CAR T 세포가 종양 유도 8일 후에 마우스에게 투여될 때, NSG 마우스 모델에서 BCMA 발현 버킷 림프종 세포(Daudi 세포)에 대한 비히클, 항-CD19Δ CAR T 세포, 항-CD19 CAR T 세포, 및 항-BCMA CAR T 세포의 생체내 활성을 도시한 도면.
도 10b는 CAR T 세포가 종양 유도 18일 후에 마우스에게 투여될 때, NSG 마우스 모델에서 BCMA 발현 버킷 림프종 세포(Daudi 세포)에 대한 비히클, 항-CD19Δ CAR T 세포, 항-CD19 CAR T 세포, 및 항-BCMA CAR T 세포의 생체내 활성을 도시한 도면.
도 11A 내지 도 11C는 50% 감소의 항-BCMA CAR 발현에 의해 달성된 항-BCMA CAR T 세포의 강한 시험관내 활성을 도시한 도면. 도 11A: 항-BCMA CAR 분자를 암호화하는 렌티바이러스의 4×108 내지 5×107개의 형질도입 단위(MOI 5 내지 40)로 T 세포 집단을 형질도입하였다. 26±4%의 항-BCMA CAR-양성 T 세포를 포함하도록 얻어진 T 세포 집단을 정규화하였다. 도 11B: 유세포분석으로 분석할 때 885 내지 1875의 범위에 있는 정규화된 항-BCMA CAR T 세포의 MFI. 도 11C: K562 세포 및 K562-BCMA 세포를 20:1 또는 10:1의 효과기(E; T 세포) 대 표적(T; K562 및 K562 BCMA 세포의 1:1 혼합) 비로 정규화된 항-BCMA CAR T 세포와 함께 공동배양시켰고, 비슷한 세포용해 활성을 나타내었다.
도 12a 내지 12D는 항-BCMA CAR T 세포에 대한 제조 공정의 신뢰도를 도시한 도면. 도 12a: 11명의 개개 공여자의 PBMC로부터 제조한 항-BCMA CAR T 세포 생성물은 비형질도입 공여자 T 세포의 매칭 배양물과 비교할 때 비슷한 수준의 확장을 나타낸다. 도 12b: 11명의 공여자로부터 제조된 항-BCMA CAR T 세포 생성물은 비슷한 렌티바이러스 형질도입 효율(VCN)을 나타내었다. 도 12c: 항-BCMA CAR 양성 T 세포의 빈도는 유세포분석에 의해 측정하였고 BCMA 발현은 모든 공여자에 걸쳐 비슷한 것이 발견되었다. 도 12d: 11명의 공여자로부터 제조된 항-BCMA CAR T 세포 생성물은 BCMA-발현 K562 세포에 노출될 때 IFNγ 방출의 치료적으로 적절한 수준을 나타내었다.
도 13은 10일 동안 IL-2 또는 IL-2 및 ZSTK474의 존재 하에 배양시킨 CD62L 양성 항-BCMA02 T 세포 내 CD127, CD197 및 CD38의 공동발현을 위한 벤 다이어그램을 도시한 도면. ZSTK474-처리된 항-BCMA02 CAR T 세포는 IL-2 단독과 함께 배양한 항-BCMA CAR T 세포에 비해 공동-발현 CD127, CD197 및 CD38 세포의 백분율 증가를 나타내었다.
도 14는 IL-2 단독으로 처리한 배양물에 비해 배양물 처리된 IL-2 및 ZSTK474(n=7)에서 항-BCMA02 CAR T 세포를 발현시키는 CD8의 증가된 백분율을 도시한 도면. 형광 표지된 항-CD8 항체 및 유세포분석을 이용하여 CD8 발현을 결정하였다.
도 15는 IL-2 단독과 함께 또는 IL-2 및 ZSTK474와 함께 배양 후에 14명의 공여자로부터의 항-BCMA02 CAR T 세포에 의해 방출된 IFN-γ의 양을 도시한 도면. 배양 기간의 마지막에, 동등한 수의 항-BCMA02 CAR T 세포를 배지 단독에서 24시간 동안 재배양하였다. 24시간에 방출된 IFN-γ의 양을 ELISA에 의해 정량화하였다. ZSTK474에서 배양물은 IL-2 단독과 함께 배양시킨 항-BCMA02 CAR T 세포에 비해 항-BCMA02 CAR T 세포 긴장성 사이토카인 방출을 유의하게 증가시키지 않았다.
도 16은 공격적 Daudi 종양 모델에서 IL-2 또는 IL-2 및 ZSTK474로 처리한 항-BCMA02 CAR T 세포, 또는 IL-2 및 ZSTK474로 처리한 절단된 신호전달 결핍 항-BCMA02 (tBCMA02) CAR T 세포의 항-종양 활성을 나타내는 도면. IL-2 및 ZSTK474로 처리한 항-BCMA02 CAR T 세포를 투여한 마우스의 50%에서 완전한 종양 퇴행이 관찰되었다.
도 17은 다발성 골수종 종양(RPMI-8226) 모델에서 IL-2 또는 IL-2 및 ZSTK474로 처리된 항-BCMA02 CAR T 세포의 항-종양 활성을 도시한 도면. IL-2- 또는 IL-2 및 ZSTK474-배양 항-BCMA02 CAR T 세포로 치료한 동물은 종양 파생물(outgrowth)이 완전히 방지되었다.
4. 서열 식별자의 간단한 설명
서열번호 1 내지 3은 본 명세서에 상정된 BCMA CAR에 대한 예시적인 경쇄 CDR 서열의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 4 내지 6은 본 명세서에 상정된 BCMA CAR에 대한 예시적인 중쇄 CDR 서열의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 7은 본 명세서에 상정된 BCMA CAR에 대한 예시적인 경쇄 서열의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 8은 본 명세서에 상정된 BCMA CAR에 대한 예시적인 중쇄 서열의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 9는 본 명세서에 상정된 예시적인 BCMA CAR의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 10은 본 명세서에 상정된 예시적인 BCMA CAR을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 제시한다.
서열번호 11은 인간 BCMA의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 12 내지 22는 다양한 링커의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 23 내지 35는 프로테아제 절단 부위 및 자기-절단성 폴리펩타이드 절단 부위의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 36은 BCMA CAR을 암호화하는 벡터의 폴리뉴클레오타이드 서열을 제시한다.
5. 상세한 설명
5.1. 개요
본 발명은 일반적으로 B 세포 관련 병태를 치료하기 위한 개선된 조성물 및 방법에 관한 것이다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "B 세포 관련 병태"는 부적절한 B 세포 활성 및 B 세포 악성종양을 수반하는 병태에 관한 것이다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 유전자 변형된 면역 효과기 세포를 이용하는 B 세포 관련 병태의 개선된 입양 세포 요법에 관한 것이다. 유전적 접근은 면역 인식 및 암 세포의 제거를 향상시키기 위한 잠재적 수단을 제공한다. 한 가지 유망한 전략은 세포독성을 암 세포 쪽으로 전용시키는(redirect) 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현시키기 위해 면역 효과기 세포를 유전자 조작하는 것이다. 그러나, B 세포 장애를 치료하기 위한 기존의 입양 세포 면역요법은 세포가 모든 또는 대다수의 B 세포 상에서 발현된 항원을 표적화하기 때문에 면역손상된 체액성 면역의 심각한 위험이 존재한다. 따라서, 이러한 요법은 임상적으로 바람직하지 않으며, 따라서 체액성 면역을 보존하는 B 세포 관련 병태에 대한 더 효율적인 요법에 대한 필요가 남아있다.
본 명세서에 개시된 입양 세포 요법의 개선된 조성물 및 방법은 용이하게 확장될 수 있고, 생체내 장기간 지속성을 나타내며, B 세포 성숙 항원을 발현시키는 B 세포를 표적화함으로써 체액성 면역의 손상을 감소시키는 유전자 변형된 면역 효과기 세포를 제공한다(CD269 또는 종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리, 구성원 17로도 알려진 BCMA; TNFRSF17).
BCMA는 종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리의 구성원이다(예를 들어, 문헌[Thompson et al., J. Exp. Medicine, 192(1): 129-135, 2000, 및 Mackay et al., Annu. Rev. Immunol, 21: 231-264, 2003). BCMA는 B-세포 활성체 인자(BAFF) 및 증식 유도 리간드(APRIL)에 결합한다(예를 들어, 문헌[Mackay et al., 2003 and Kalled et al., Immunological Reviews, 204: 43-54, 2005] 참조). 비악성종양 세포 중에서, BCMA는 혈장 세포 및 성숙 B-세포의 서브세트에서 대부분 발현되는 것으로 보고되었다(예를 들어, 문헌[Laabi et al., EMBO J., 77(1 ): 3897-3904, 1992; Laabi et al., Nucleic Acids Res., 22(7): 1147-1154,, 1994; Kalled et al., 2005; O'Connor et al., J. Exp. Medicine, 199(1): 91-97, 2004; 및 Ng et al., J. Immunol., 73(2): 807-817, 2004] 참조). BCMA에서 마우스 결핍은 건강체이며, 정상적인 수의 B 세포를 갖지만, 장수하는 혈장 세포의 생존을 손상시킨다(예를 들어, 문헌[O'Connor et al., 2004; Xu et al., Mol. Cell. Biol., 21(12): 4067-4074, 2001; 및 Schiemann et al., Science, 293(5537): 2 111-21 14, 2001] 참조). BCMA RNA는 다발성 골수종 세포에서 그리고 다른 림프종에서 보편적으로 검출되었고, BCMA 단백질은 몇몇 연구자에 의해 다발성 골수종 환자로부터의 혈장 세포 표면 상에서 검출되었다(예를 들어, 문헌[Novak et al., Blood, 103(2): 689-694, 2004; Neri et al., Clinical Cancer Research, 73(19): 5903-5909, 2007; Bellucci et al., Blood, 105(10): 3945-3950, 2005; 및 Moreaux et al., Blood, 703(8): 3148-3157, 2004] 참조).
다양한 실시형태에서, 뮤린 항-BCMA 항체 서열을 포함하는 CAR은 특정 인간 항체 서열을 포함하는 BCMA CAR에 비해 매우 효능이 있으며; 강한 생체내 확장을 겪고; BMCA를 발현시키는 인간 B 세포를 인식하며; BCMA 발현 B 세포에 대한 세포독성 활성을 나타내고; 잠재적으로 치명적인 병태인 사이토카인 폭풍을 유도하는 징후를 나타내지 않으며, 활성화된 T 세포에 의해 방출된 사이토카인은 비감염성 발열을 자극하는 시스템에서 갑작스러운 염증 반응을 생성한다.
일 실시형태에서, 뮤린 항-BCMA 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 막관통 도메인 및 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 CAR이 제공된다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 CAR을 발현시키도록 유전자 변형된 면역 효과기 세포가 제공된다. CAR을 발현시키는 T 세포는 본 명세서에서 CAR T 세포 또는 CAR 변형 T 세포로서 지칭된다.
다양한 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 유전자 변형된 면역 효과기 세포는 B 세포 관련 병태, 예를 들어, B 세포 또는 B 세포 악성종양과 연관된 자가면역 질환을 갖는 환자에게 투여된다.
본 발명의 실행은, 반대로 구체적으로 지시되지 않는 한, 당업계의 기술 이내의 화학, 생화학, 유기 화학, 분자 생물학, 미생물학, 재조합 DNA 기법, 유전학, 면역학 및 세포 생물학의 통상적인 방법을 사용하며, 이들 중 다수는 예시의 목적을 위해 이하에 기재된다. 이러한 기법은 문헌에서 완전하게 설명된다. 예를 들어, 문헌[Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd Edition, 2001); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989); Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, updated July 2008); Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience; Glover, DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & II (IRL Press, Oxford, 1985); Anand, Techniques for the Analysis of Complex Genomes, (Academic Press, New York, 1992); Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, Eds., 1984); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); Harlow and Lane, Antibodies, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1998) Current Protocols in Immunology Q. E. Coligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, E. M. Shevach and W. Strober, eds., 1991); Annual Review of Immunology]뿐만 아니라 문헌[Advances in Immunology]과 같은 저널의 논문을 참조한다.
5.2. 정의
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질은 본 발명의 실행 또는 시험의 실행에서 사용될 수 있으며, 조성물, 방법 및 물질의 바람직한 실시형태는 본 명세서에 기재되어 있다. 본 발명의 목적을 위해, 다음의 용어를 이하에 기재된다.
단수 항목은 본 명세서에서 물품의 문법적 대상의 하나 이상(즉, 적어도 하나 또는 하나 이상)을 지칭하는 데 사용된다. 예로서, "요소"는 하나의 요소 또는 하나 이상의 요소를 의미한다.
대안의 사용(예를 들어, "또는")은 대안 중 하나, 둘 다 또는 이들의 조합을 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
용어 "및/또는"은 대안 중 하나 또는 둘 다를 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "약" 또는 "대략"은 기준 양, 수준, 값, 수, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 대해 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1%만큼 다른 양, 수준, 값, 수, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 지칭한다. 일 실시형태에서, 용어 "약" 또는 "대략"은 기준 양, 수준, 값, 수, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 관해 양, 수준, 값, 수, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이 ±15%, ±10%, ±9%, ±8%, ±7%, ±6%, ±5%, ±4%, ±3%, ±2%, 또는 ±1%의 범위를 지칭한다.
본 명세서 전체적으로, 문맥에서 달리 요구되지 않는 한, 단어 "포함한다(comprise)", "포함한다(comprises)" 및 "포함하는(comprising)"은 언급된 단계 또는 요소 또는 단계 또는 요소의 그룹의 포함을 나타내는 것으로 이해될 것이지만, 임의의 다른 단계 또는 요소 또는 단계 또는 요소의 그룹을 제외하지는 않는다. "이루어진"은 어구 "이루어진" 다음의 어떤 것을 포함하며, 이것으로 제한된다는 의미이다" 따라서, 어구 "이루어진"은 열거된 요소가 필요하거나, 의무적이라는 것을 나타내고, 어떤 다른 요소도 존재하지 않을 수 있다는 것을 나타낸다. "본질적으로 이루어진"은 어구 다음에 열거된 임의의 요소를 포함하며, 열거된 요소에 대해 본 개시내용에 구체화된 활성 또는 작용을 방해하지 않는 또는 이에 기여하지 않는 다른 요소로 제한된다는 것을 의미한다. 따라서, 어구 "본질적으로 이루어진"은 열거된 요소가 필요하거나 의무적이지만, 열거된 요소의 활성 또는 작용에 실질적으로 영향을 미치는 어떤 다른 요소도 존재하지 않는다는 것을 나타낸다.
본 명세서 전체적으로 "일 실시형태", "실시형태", "특정 실시형태", "관련된 실시형태", "특정 실시형태", "추가적인 실시형태" 또는 "추가 실시형태" 또는 이들의 조합에 대한 언급은 실시형태와 관련하여 기재된 특성, 구조 또는 특징이 본 발명의 적어도 일 실시형태에 포함된다는 것을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체적으로 다양한 곳에서의 앞서 언급한 어구의 출현은 동일한 실시형태에 관해 모두 필수적인 것은 아니다. 더 나아가, 특정 특성, 구조 또는 특징은 하나 이상의 실시형태에서 임의의 적합한 방식으로 조합될 수 있다. 또한 일 실시형태에서 특징의 긍정적 열거는 특정 실시형태에서 특징을 제외하기 위한 기초로서 작용한다는 것이 이해된다.
5.3. 키메라 항원 수용체
다양한 실시형태에서, 면역 효과기 세포의 세포독성을 B 세포 쪽으로 전용시키는 유전자 조작된 수용체가 제공된다. 이들 유전자 조작된 수용체는 본 명세서에서 키메라 항원 수용체(CAR)로서 지칭된다. CAR은 특이적 항-BCMA 세포 면역 활성을 나타내는 키메라 단백질을 생성하기 위해 목적하는 항원(예를 들어, BCMA)에 대한 항체-기반 특이성을 T 세포 수용체-활성화 세포내 도메인과 조합하는 분자이다. 본 명세서에서 사용되는 용어, "키메라"는 상이한 단백질의 부분 또는 상이한 유래로부터의 DNA로 구성되는 것을 기재한다.
본 명세서에 상정된 CAR은 BCMA, 막관통 도메인 및 세포내 신호전달 도메인에 결합하는 세포외 도메인(또한 결합 도메인 또는 항원-특이적 결합 도메인으로서 지칭됨)을 포함한다. 표적 세포 표면 상의 BCMA와의 CAR의 항-BCMA 항원 결합 도메인의 생착은 CAR의 클러스터링을 초래하고, CAR-함유 세포에 대한 활성화 자극을 전달한다. CAR의 주된 특징은 면역 효과기 세포 특이성을 전용하여, 증식, 사이토카인 생성, 식세포작용 또는 주조직 적합(MHC) 독립적 방식으로 표적 항원 발현 세포의 세포사를 매개할 수 있는 분자의 생성을 촉발하고, 단클론성 항체, 가용성 리간드 또는 세포 적이적 공-수용체의 세포 특이적 표적화 능력을 이용한다.
다양한 실시형태에서, CAR은 뮤린 항-BCMA-특이적 결합 도메인; 막관통 도메인; 하나 이상의 세포내 공자극 신호전달 도메인; 및 1차 신호전달 도메인을 포함하는 세포외 결합 도메인을 포함한다.
특정 실시형태에서, CAR은 뮤린 항-BCMA 항체 또는 이의 항원 결합 단편; 하나 이상의 힌지 도메인 또는 스페이서 도메인; 막관통 도메인; 하나 이상의 세포내 공자극 신호전달 도메인; 및 1차 신호전달 도메인을 포함하는 세포외 결합 도메인을 포함한다.
5.3.1. 결합 도메인
특정 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 CAR은 B 세포 상에서 발현되는 인간 BCMA 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 뮤린 항-BCMA 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 세포외 결합 도메인을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어, "결합 도메인," "세포외 도메인", "세포외 결합 도메인," "항원-특이적 결합 도메인" 및 "세포외 항원 특이적 결합 도메인"은 상호 호환적으로 사용되며, 관심 대상의 표적 항원, 예를 들어, BCMA에 특이적으로 결합하는 능력을 갖는 CAR을 제공한다. 결합 도메인은 천연, 합성, 반합성 또는 재조합 공급원으로부터 유래될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "특이적 결합 친화도" 또는 "특이적으로 결합한다" 또는 "특이적으로 결합된" 또는 "특이적 결합" 또는 "특이적으로 표적화한다"는 배경 결합보다 더 큰 친화도로 BCMA에 대한 항-BCMA 항체 또는 이의 항원 결합 단편(또는 이를 포함하는 CAR)의 결합을 기재한다. 결합 도메인(또는 결합 도메인을 포함하는 CAR 또는 결합 도메인을 함유하는 융합 도메인)은, 예를 들어, 약 105 M-1 이상의 친화도 또는 Ka(즉, 1/M의 단위로 특정 결합 상호작용의 평형 결합 상수)로 BCMA에 결합하거나 회합한다면, BCMA에 "특이적으로 결합한다". 특정 실시형태에서, 결합 도메인(또는 이의 융합 단백질)은 약 106M-1, 107M-1, 108M-1, 109M-1, 1010M-1, 1011M-1, 1012M-1 또는 1013M-1 이상의 Ka로 표적에 결합한다. "고친화도" 결합 도메인(또는 이의 단일 쇄 융합 단백질)은 적어도 107M-1, 적어도 108M-1, 적어도 109M-1, 적어도 1010M-1, 적어도 1011M-1, 적어도 1012M-1, 적어도 1013M-1 이상의 Ka를 갖는 해당 결합 도메인을 지칭한다.
대안적으로, 친화도는 M 단위(예를 들어, 10-5 M 내지 10-13M 이하)를 갖는 특정 결합 상호작용의 평형 해리 상수(Kd)로서 정해질 수 있다. 본 개시내용에 따른 결합 도메인 폴리펩타이드 및 CAR 단백질의 친화도는 통상적인 기법을 이용하여, 예를 들어, 경쟁적 ELISA(효소-결합 면역흡착 분석)에 의해, 또는 결합 회합, 또는 표지 리간드를 이용하는 변위 분석에 의해, 또는 표면-플라즈몬 공명 장치, 예컨대 뉴저지주 피츠카타웨이에 소재한 비아코어 인코포레이티드(Biacore, Inc.)로부터 입수 가능한 비아코어(Biacore) T100 또는 광학 바이오센서 기술, 예컨대 각각 코닝(Corning) 및 퍼킨 엘머(Perkin Elmer)로부터 입수 가능한 EPIC 시스템 또는 EnSpire를 이용하여 용이하게 결정될 수 있다(예를 들어, 또한 문헌[Scatchard et al. (1949) Ann. N.Y. Acad. Sci. 51:660]; 및 미국 특허 제5,283,173호; 제5,468,614호 또는 등가물 참조).
일 실시형태에서, 특이적 결합의 친화도는 배경 결합보다 약 2배, 배경 결합보다 약 5배, 배경 결합보다 약 10배, 배경 결합보다 약 20배, 배경 결합보다 약 50배, 배경 결합보다 약 100배, 또는 배경 결합보다 약 1000배 이상이다.
특정 실시형태에서, CAR의 세포외 결합 도메인은 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다. "항체"는 항원 에피토프, 예컨대 항원 결정소, 예컨대 면역 세포에 의해 인식되는 것을 함유하는 펩타이드, 지질, 다당류 또는 핵산을 특이적으로 인식하고 결합하는 적어도 경쇄 또는 중쇄 면역글로불린 가변 영역을 포함하는 폴리펩타이드인 결합제를 지칭한다.
"항원(Ag)"은 동물에 주사되거나 흡수되는 조성물(예컨대 암-특이적 단백질을 포함하는 것)을 포함하는 항체 또는 T 세포 반응의 생성을 자극할 수 있는 화합물, 조성물 또는 기질을 지칭한다. 항원은 이종성 항원, 예컨대 개시된 항원에 의해 유도되는 것을 포함하는 특정 체액성 또는 세포성 면역 산물과 반응한다. 특정 실시형태에서, 표적 항원은 BCMA 폴리펩타이드의 에피토프이다.
"에피토프" 또는 "항원 결정소"는 결합제가 결합하는 항원 영역을 지칭한다. 에피토프는 단백질의 3차 폴딩에 의해 병치되는 인접한 아미노산 또는 비인접 아미노산 둘 다로부터 형성될 수 있다. 인접한 아미노산으로부터 형성된 에피토프는 전형적으로 변성 용매에 대한 노출 시 유지되는 반면, 3차 폴딩에 의해 형성되는 에피토프는 변성 용매로 처리 시 전형적으로 상실된다. 에피토프는 전형적으로 독특한 공간 입체구조에서 적어도 3, 더 보통으로는, 적어도 5, 약 9, 또는 약 8 내지 10개의 아미노산을 포함한다.
항체는 이의 항원 결합 단편, 예컨대 Camel Ig, Ig NAR, Fab 단편, Fab' 단편, F(ab)'2 단편, F(ab)'3 단편, Fv, 단일 쇄 Fv 단백질("scFv"), 비스-scFv, (scFv)2, 미니바디, 다이어바디, 트라이어바디, 테트라바디, 이황화 안정화된 Fv 단백질("dsFv") 및 단일-도메인 항체(sdAb, 나노바디(Nanobody)) 및 항원 결합을 초래하는 전장 항체의 부분을 포함한다. 상기 용어는 또한 유전자 조작된 형태, 예컨대 키메라 항체(예를 들어, 인간화된 뮤린 항체), 이형접합체 항체(예컨대, 이중특이성 항체) 및 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 또한 문헌[Pierce Catalog and Handbook, 1994-1995 (Pierce Chemical Co., Rockford, IL); Kuby, J., Immunology, 3rd Ed., W. H. Freeman & Co., New York, 1997] 참조.
당업자에 의해 이해될 바와 같이 그리고 본 명세서의 다른 곳에 기재된 바와 같이, 완전한 항체는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함한다. 각각의 중쇄는 가변 영역 및 제1, 제2 및 제3 불변 영역으로 이루어진 반면, 각각의 경쇄는 가변 영역 및 불변 영역으로 이루어진다. 포유류 중쇄는 α, δ, ε, γ 및 μ로서 분류된다. 포유류 경쇄는 λ 또는 κ로서 분류된다. α, δ, ε, γ 및 μ 중쇄를 포함하는 면역글로불린은 면역글로불린(Ig)A, IgD, IgE, IgG 및 IgM로서 분류된다. 완전한 항체는 "Y" 형상을 형성한다. Y 줄기는 함께 결합된 2개의 중쇄의 제2 및 제3 불변 영역(그리고 IgE 및 IgM에 대해, 제4 불변 영역)으로 이루어지고, 이황화 결합(사슬간)은 힌지에 형성된다. 중쇄 γ, α 및 δ는 3개의 일렬의(일직선 상의) Ig 도메인, 및 부가된 가요성을 위한 힌지 영역으로 구성된 불변 영역을 가지며; 중쇄 μ 및 ε은 4개의 면역글로불린 도메인으로 구성된 불변 영역을 가진다. 제2 및 제3 불변 영역은 각각 "CH2 도메인" 및 "CH3 도메인"으로서 지칭된다. Y의 각각의 아암은 단일 경쇄의 가변 및 불변 영역에 결합된 단일 중쇄의 가변 영역 및 제1 불변 영역을 포함한다. 경쇄 및 중쇄의 가변 영역은 항원 결합을 초래한다.
경쇄 및 중쇄 가변 영역은 "상보성-결정 영역" 또는 "CDR"으로도 불리는 3개의 초가변 영역을 가로막는 "프레임워크" 영역을 포함한다. CDR은 통상적인 방법에 의해, 예컨대 본 명세서에 참조에 의해 원용된 문헌[Kabat et al (Wu, TT and Kabat, E. A., J Exp Med. 132(2):211-50, (1970); Borden, P. and Kabat E. A., PNAS, 84: 2440-2443 (1987); (see, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, 1991])에 따른 서열에 의해, 또는 코티아(Chothia) 등에 따른 구조에 의해(Chothia, C. and Lesk, A.M., J Mol. Biol., 196(4): 901-917 (1987), Chothia, C. et al, Nature, 342: 877 - 883 (1989)) 정해지거나 식별될 수 있다.
상이한 경쇄 또는 중쇄의 프레임워크 영역 서열은 인간과 같은 종 내에서 상대적으로 보존된다. 요소 경쇄 및 중쇄의 조합된 프레임워크 영역인 항체의 프레임워크 영역은 3차원 공간에 CDR을 위치시키고 정렬하는 작용을 한다. CDR은 주로 항원 에피토프에 대한 결합을 초래한다. 각각의 쇄의 CDR은 전형적으로 N-말단으로부터 순차적으로 시작해서 넘버링되는 CDR1, CDR2 및 CDR3으로서 지칭되며, 또한 전형적으로 특정 CDR이 위치되는 쇄에 의해 식별된다. 따라서, 항체 중쇄의 가변 도메인에 위치된 CDR은 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3으로서 지칭되는 반면, 항체 경쇄의 가변 도메인에 위치된 CDR은 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3으로서 지칭된다. 상이한 특이성을 갖는 항체(즉, 상이한 항원에 대해 상이한 조합 부위)는 상이한 CDR을 가진다. 항체에 따라 다른 CDR이지만, CDR 내에서 제한된 수의 아미노산 위치만이 항원 결합에 직접적으로 관련된다. CDR 내의 이들 위치는 특이성 결정 잔기(specificity determining residue: SDR)로 불린다. 인간화된 본 명세서에 상정된 BCMA CAR을 작제하는 데 적합한 경쇄 CDR의 예시적인 예는 서열번호 1 내지 3에 제시된 CDR 서열을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 인간화된 본 명세서에 상정된 BCMA CAR을 작제하는 데 적합한 중쇄 CDR의 예시적인 예는 서열번호 4 내지 6에 제시된 CDR 서열을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
"VH" 또는 "VH"에 대한 언급은 항체, Fv, scFv, dsFv, Fab, 또는 본 명세서에 개시된 다른 항체 단편을 포함하는, 면역글로불린 중쇄의 가변 영역을 지칭한다. "VL" 또는 "VL"에 대한 언급은 항체, Fv, scFv, dsFv, Fab, 또는 본 명세서에 개시된 다른 항체 단편을 포함하는, 면역글로불린 경쇄의 가변 영역을 지칭한다.
"단클론성 항체"는 B 림프구의 단일 클론에 의해 또는 단일 항체의 경쇄 및 중쇄 유전자가 형질감염된 세포에 의해 생성된 항체이다. 단클론성 항체는, 예를 들어, 면역 비장 세포와 골수종 세포의 융합으로부터 혼성 항체-형성 세포를 제조함으로써, 당업자에게 공지된 방법에 의해 생성된다. 단클론성 항체는 인간화된 단클론성 항체를 포함한다.
"키메라 항체"는 하나의 종, 예컨대 인간으로부터의 프레임워크 및 (일반적으로 항원 결합을 부여하는) 다른 종, 예컨대 마우스로부터의 CDR을 가진다. 특정 바람직한 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 CAR은 키메라 항체 또는 이의 항원 결합 단편인 항원-특이적 결합 도메인을 포함한다.
"인간화된" 항체는 인간 프레임워크 영역 및 비-인간(예를 들어, 마우스, 랫트 또는 합성) 면역글로불린으로부터의 하나 이상의 CDR을 포함하는 면역글로불린이다. CDR을 제공하는 비인간 면역글로불린은 "공여자"로 칭해지며, 프레임워크를 제공하는 인간 면역글로불린은 "수용자"로 칭해진다.
특정 실시형태에서, 뮤린 항-BCMA 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 낙타(Camel) Ig(낙타과(camelid) 항체(VHH)), Ig NAR, Fab 단편, Fab' 단편, F(ab)'2 단편, F(ab)'3 단편, Fv, 단일 쇄 Fv 항체("scFv"), 비스-scFv, (scFv)2, 미니바디, 다이어바디, 트라이어바디, 테트라바디, 이황화 안정화된 Fv 단백질("dsFv") 및 단일-도메인 항체(sdAb, 나노바디)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "낙타 Ig" 또는 "낙타과 VHH"는 중쇄 항체의 가장 작은 공지된 항원-결합 단위를 지칭한다(Koch-Nolte, et al, FASEB J., 21: 3490-3498 (2007)). "중쇄 항체" 또는 "낙타과 항체"는 2개의 VH 도메인을 포함하고 경쇄는 없는 항체를 지칭한다(문헌[Riechmann L. et al, J. Immunol. Methods 231:25-38 (1999)]; WO94/04678; WO94/25591; 미국 특허 제6,005,079호).
"IgNAR" 또는 "면역글로불린 신규 항원 수용체"는 1개의 가변 신규 항원 수용체(VNAR) 도메인 및 5개의 불변 신규 항원 수용체(CNAR) 도메인의 동종이량체로 이루어진 상어 면역 레퍼토리로부터의 항체 부류를 지칭한다. IgNAR은 가장 작은 공지된 면역글로불린-기반 단백질 스캐폴드의 일부를 나타내고, 효율적인 결합 특징을 갖는다. 고유한 안정성은 (i) 뮤린 항체에서 발견되는 통상적인 항체 VH 및 VL 도메인에 비해 상당한 수의 하전된 그리고 친수성인 표면 노출 잔기가 존재하는, 기저 Ig 스캐폴드; 및 (ii) 루프간 이황화 브릿지 및 루프내 수소 결합 패턴을 포함하는 상보성 결정 영역(CDR) 루프에서의 구조적 특징의 안정화 둘 다에 기인할 수 있다.
항체의 파파인 분해는 "Fab" 단편으로 불리는 2개의 동일한 항원-결합 단편을 생성하며, 각각은 단일 항원-결합 부위 및 잔여 "Fc" 단편을 갖고, 이의 명칭은 이것이 용이하게 결정화하는 능력을 반영한다. 펩신 처리는 2개의 항원-조합 부위를 갖고 또한 항원을 가교연결할 수 있는 F(ab')2 단편을 수득한다.
"Fv"는 완전한 항원-결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 일 실시형태에서, 2개 쇄의 Fv 종은 타이트한, 비공유 회합에서 1개의 중쇄 및 1개의 경쇄 가변 도메인의 이량체로 이루어진다. 단일쇄 Fv(scFv) 종에서, 1개의 중쇄 및 1개의 경쇄 가변 도메인은, 경쇄 및 중쇄가 2개 쇄 Fv 종에서의 구조와 유사한 "이량체" 구조로 회합할 수 있도록 가요성 펩타이드 링커에 의해 공유결합될 수 있다. 이는 각각의 가변 도메인의 3개의 초가변 영역(HVR)이 VH-VL 이량체 표면 상에 항원-결합 부위를 정하도록 상호작용하는 입체배치이다. 종합적으로, 6개의 HVR은 항체에 항원-결합 특이성을 부여한다. 그러나, 단일 가변 도메인(또는 항원에 특이적인 3개의 HVR만을 포함하는 Fv의 절반)이 항원을 인식하고 이에 결합하는 능력을 가진다고 해도, 전체 결합 부위보다는 더 낮은 친화도를 가진다.
Fab 단편은 중쇄- 및 경쇄 가변 도메인을 함유하고, 또한 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인(CH1)을 함유한다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역으로부터의 하나 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카복시 말단에서 소수의 잔기의 첨가에 의해 Fab 단편과 다르게 된다. Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)가 유리 티올기를 보유하는 Fab'에 대한 본 명세서의 표기이다. F(ab')2 항체 단편은 사이에 시스테인을 갖는 Fab' 단편의 쌍으로서 본래 생성되었다. 항체 단편의 다른 화학적 결합이 또한 공지되어 있다.
용어 "다이어바디"는 2개의 항원-결합 부위를 갖는 항체 단편을 지칭하며, 이의 단편은 동일한 폴리펩타이드 쇄(VH-VL)에서 경쇄 가변 도메인(VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함한다. 동일한 쇄 상에서 2개의 도메인 사이에 짝짓기를 허용하기에는 너무 짧은 링커를 이용함으로써, 도메인은 다른 쇄의 상보성 도메인과 짝지어지도록 강제되고, 2개의 항원-결합 부위를 생성한다. 다이어바디는 2가 또는 이중특이성일 수 있다. 다이어바디는, 예를 들어, 유럽 특허 제404,097호; WO 1993/01161; 문헌[Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)]; 및 문헌[Hollinger et al., PNAS USA 90: 6444-6448 (1993)]에서 더 완전하게 기재된다. 트라이어바디 및 테트라바디는 또한 문헌[Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)]에 기재되어 있다.
"단일 도메인 항체" 또는 "sdAb" 또는 "나노바디"는 항체 중쇄의 가변 영역(VH 도메인) 또는 항체 경쇄의 가변 영역(VL 도메인)으로 이루어진 항체 단편을 지칭한다(Holt, L., et al, 2003, Trends in Biotechnology, 21(11): 484-490).
"단일쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하되, 이들 도메인은 단일 폴리펩타이드 쇄에 그리고 배향 중 하나에(예를 들어, VL-VH 또는 VH-VL) 존재한다. 일반적으로, scFv 폴리펩타이드는 scFv가 항원 결합을 위한 목적하는 구조를 형성하는 것을 가능하게 하는 VH 도메인과 VL 도메인 사이의 폴리펩타이드 링커를 추가로 포함한다. scFv의 검토를 위해, 예를 들어, 문헌[
Figure pct00001
, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York, 1994), pp. 269-315] 참조.
바람직한 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 CAR은 뮤린 scFv인 항원-특이적 결합 도메인을 포함한다. 단일쇄 항체는 목적하는 표적에 특이적인 하이브리도마의 V 영역 유전자를 형성하도록 클로닝될 수 있다. 이러한 하이브리도마의 생성은 일상적이 되었다. 가변 영역 중쇄(VH) 및 가변 영역 경쇄(VL)를 클로닝하기 위해 사용될 수 있는 기법은, 예를 들어, 문헌[Orlandi et al., PNAS, 1989; 86: 3833-3837]에 기재되어 있다.
특정 실시형태에서, 항원-특이적 결합 도메인은 인간 BCMA 폴리펩타이드에 결합하는 뮤린 scFv이다. 본 명세서에 상정된 BCMA CAR을 작제하는 데 적합한 가변 중쇄의 예시적인 예는 서열번호 8에 제시된 아미노산 서열을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 본 명세서에 상정된 BCMA CAR을 작제하는 데 적합한 가변 경쇄의 예시적인 예는 서열번호 7에 제시된 아미노산 서열을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 명세서에 제공된 BCMA-특이적 결합 도메인은 또한 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR을 포함한다. 이러한 CDR은 비인간 CDR 또는 경쇄의CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 및 중쇄의 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3으로부터 선택되는 변경된 비인간 CDR일 수 있다. 특정 실시형태에서, BCMA-특이적 결합 도메인은 (a) 경쇄 CDRL1, 경쇄 CDRL2, 및 경쇄 CDRL3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 (b) 중쇄 CDRH1, 중쇄 CDRH2 및 중쇄 CDRH3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
5.3.2. 링커
특정 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 CAR은, 예를 들어, 분자의 적절한 이격 및 입체구조를 위해 부가된 다양한 도메인 사이에 링커 잔기를 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 링커는 가변 영역 연결 서열이다. "가변 영역 연결 서열"은 얻어진 폴리펩타이드가 동일한 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 포함하는 항체와 동일한 표적 분자에 대한 특이적 결합 친화도를 보유하도록 VH와 VL 도메인을 연결하고, 2개의 서브-결합 도메인의 상호작용에 적합한 스페이서 기능을 제공하는 아미노산 서열이다. 본 명세서에 상정된 CAR은 1, 2, 3, 4 또는 5개 이상의 링커를 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 링커의 길이는 약 1 내지 약 25개의 아미노산, 약 5 내지 약 20개의 아미노산, 또는 약 10 내지 약 20개의 아미노산 또는 아미노산의 임의의 개재 길이이다. 일부 실시형태에서, 링커는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25개 이상의 아미노산 길이이다.
링커의 예시적인 예는 글리신 중합체(G)n; 글리신-세린 중합체(G1-5S1-5)n(여기서 n은 적어도 1, 2, 3, 4 또는 5의 정수임); 글리신-알라닌 중합체; 알라닌-세린 중합체; 및 당업계에 공지된 다른 가요성 링커를 포함한다. 글리신 및 글리신-세린 중합체는 상대적으로 비구조화되어 있고, 따라서 융합 단백질의 도메인, 예컨대 본 명세서에 기재된 CAR 사이의 중성 테더(tether)로서 작용할 수 있다. 글리신은 심지어 알라닌보다도 상당히 더 많은 파이-프사이 공간에 접근하며, 더 긴 측쇄를 갖는 잔기보다 훨씬 덜 제한되어 있다(문헌[Scheraga, Rev. Computational Chem. 11173-142 (1992)] 참조). 당업자는 링커가 목적하는 CAR 구조를 제공하는 덜 가요성인 구조를 부여하는 가요성 링커뿐만 아니라 하나 이상의 부분을 포함할 수 있도록, 특정 실시형태의 CAR의 설계가 모두 또는 부분적으로 가요성인 링커를 포함할 수 있다는 것을 인식할 것이다.
다른 예시적인 링커는 다음의 아미노산 서열을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다: GGG; DGGGS(서열번호 12); TGEKP(서열번호 13)(예를 들어, 문헌[Liu et al., PNAS 5525-5530 (1997)] 참조); GGRR(서열번호 14)(Pomerantz et al. 1995, 상기 참조); (GGGGS)n(여기서, n = 1, 2, 3, 4 또는 5이고, GGGGS는 서열번호 15로서 확인됨)(Kim et al., PNAS 93, 1156-1160 (1996.); EGKSSGSGSESKVD(서열번호 16)(Chaudhary et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:1066-1070); KESGSVSSEQLAQFRSLD(서열번호 17)(Bird et al., 1988, Science 242:423-426), GGRRGGGS(서열번호 18); LRQRDGERP(서열번호 19); LRQKDGGGSERP(서열번호 20); LRQKd(GGGS)2 ERP(서열번호 21). 대안적으로, 가요성 링커는 DNA-결합 부위와 펩타이드 그 자체를 둘 다 모델링할 수 있는 컴퓨터 프로그램을 이용하여(Desjarlais & Berg, PNAS 90:2256-2260 (1993), PNAS 91:11099-11103 (1994) 또는 파지 디스플레이 방법에 의해 합리적으로 설계될 수 있다. 일 실시형태에서, 링커는 다음의 아미노산 서열을 포함한다: GSTSGSGKPGSGEGSTKG(서열번호 22) (Cooper et al., Blood, 101(4): 1637-1644 (2003)).
5.3.3. 스페이서 도메인
특정 실시형태에서, CAR의 결합 도메인 다음에 하나 이상의 "스페이서 도메인"이 이어지며, 이는 항원 결합 도메인이 효과기 세포 표면으로부터 떨어져서 이동하여 적절한 세포/세포 접촉, 항원 결합 및 활성화를 가능하게 하는 영역을 지칭한다(Patel et al., Gene Therapy, 1999; 6: 412-419). 스페이서 도메인은 천연, 합성, 반합성 또는 재조합 공급원으로부터 유래될 수 있다. 특정 실시형태에서, 스페이서 도메인은 하나 이상의 중쇄 불변 영역, 예를 들어, CH2 및 CH3을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 면역글로불린의 일부이다. 스페이서 도메인은 천연 유래 면역글로불린 힌지 영역 또는 변경된 면역글로불린 힌지 영역의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 스페이서 도메인은 IgG1 또는 IgG4의 CH2 및 CH3 도메인을 포함한다.
5.3.4. 힌지 도메인
CAR의 결합 도메인은 일반적으로 하나 이상의 "힌지 도메인"이 이어지며, 이는 항원 결합 도메인이 효과기 세포 표면으로부터 떨어져서 위치화되어 적절한 세포/세포 접촉, 항원 결합 및 활성화를 가능하게 하는 역할을 한다. CAR은 일반적으로 결합 도메인과 막관통 도메인(TM) 사이에 하나 이상의 힌지 도메인을 포함한다. 힌지 도메인은 천연, 합성, 반합성 또는 재조합 공급원으로부터 유래될 수 있다. 힌지 도메인은 천연 유래 면역글로불린 힌지 영역 또는 변경된 면역글로불린 힌지 영역의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
"변경된 힌지 영역"은 (a) 최대 30%의 아미노산 변화(예를 들어, 최대 25%, 20%, 15%, 10% 또는 5% 아미노산 치환 또는 결실)를 갖는 천연 유래 힌지 영역, (b) 최대 30%의 아미노산 변화(예를 들어, 최대 25%, 20%, 15%, 10% 또는 5% 아미노산 치환 또는 결실)를 갖는 길이가 적어도 10개인 아미노산(예를 들어, 적어도 12, 13, 14 또는 15개의 아미노산)인 천연 유래 힌지 영역의 일부, 또는 (c) 코어 힌지 영역(길이가 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15, 또는 적어도 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 아미노산일 수 있음)을 포함하는 천연 유래 힌지 영역을 지칭한다. 특정 실시형태에서, 천연 유래 면역글로불린 힌지 영역 내 하나 이상의 시스테인 잔기는 하나 이상의 다른 아미노산 잔기(예를 들어, 하나 이상의 세린 잔기)에 의해 치환될 수 있다. 변경된 면역글로불린 힌지 영역은 대안적으로 또는 추가적으로 다른 아미노산 잔기(예를 들어, 세린 잔기)에 의해 치환되는 야생형 면역글로불린 힌지 영역의 프롤린 잔기를 가질 수 있다.
본 명세서에 기재된 CAR에서 사용하기에 적합한 다른 예시적인 힌지 도메인은 1형 막 단백질, 예컨대 CD8α, CD4, CD28 및 CD7의 세포외 영역으로부터 유래된 힌지 영역을 포함하며, 이는 이들 분자로부터의 야생형 힌지 영역일 수 있거나 변경될 수 있다. 다른 실시형태에서, 힌지 도메인은 CD8α 힌지 영역을 포함한다.
5.3.5. 막관통 도메인
막관통(TM) 도메인은 세포외 결합 부분 및 세포내 신호전달 도메인에 융합하고, 면역 효과기 세포의 혈장막에 CAR을 고정시키는 CAR의 부분이다. TM 도메인은 천연, 합성, 반합성 또는 재조합 공급원으로부터 유래될 수 있다. TM 도메인은 T-세포 수용체, CD3ε, CD3ζ, CD4, CD5, CD8α, CD9, CD16, CD22, CD27, CD28, CD33, CD37, CD45, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD152, CD154 및 PD-1의 알파, 베타 또는 제타 쇄로부터 유래될 수 있다(즉, 적어도 이들의 막관통 영역(들)을 포함할 수 있다). 특정 실시형태에서, TM 도메인은 합성이며, 대부분 소수성 잔기, 예컨대 류신 및 발린을 포함한다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 CAR은 CD8α로부터 유래된 TM 도메인을 포함한다. 다른 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 CAR은 CD8α 및 짧은 올리고- 또는 폴리펩타이드 링커로부터 유래된 TM 도메인, 바람직하게는 CAR의 TM 도메인과 세포내 신호전달 도메인을 연결하는 길이가 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개인 아미노산을 포함한다. 글리신-세린 기반 링커는 특히 적합한 링커를 제공한다.
5.3.6. 세포내 신호전달 도메인
특정 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 CAR은 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. "세포내 신호전달 도메인"은 CAR-결합 표적 세포에 대한 세포독성 인자의 방출, 또는 세포외 CAR 도메인에 대한 항원 결합에 의해 유발된 다른 세포 반응을 포함하는, 효과기 세포 기능, 예를 들어, 활성화, 사이토카인 생성, 증식 및 세포독성 활성을 유발하는 면역 효과기 세포 내부에 인간 BCMA 폴리펩타이드에 대한 효과적인 BCMA CAR 결합 메세지를 전달하는데 참여하는 CAR의 부분을 지칭한다.
용어 "효과기 기능"은 면역 효과기 세포의 전문화된 기능을 지칭한다. T 세포의 효과기 기능은, 예를 들어, 사이토카인의 분비를 포함하는 세포용해 활성 또는 헬퍼 활성일 수 있다. 따라서, 용어 "세포내 신호전달 도메인"은 효과기 기능 신호를 전달하고, 세포가 전문화된 기능을 수행하도록 지시하는 단백질의 일부를 지칭한다. 보통 전체 세포내 신호전달 도메인이 사용될 수 있지만, 다수의 경우에, 전체 도메인을 사용하는 것은 필요하지 않다. 세포내 신호전달 도메인의 절단 부분이 사용되는 정도로, 이러한 절단된 부분은 효과기 기능 신호를 전달하는 한 전체 도메인 대신에 사용될 수 있다. 용어 세포내 신호전달 도메인은 효과기 기능 신호를 전달하기에 충분한 세포내 신호전달 도메인의 임의의 절단 부분을 포함하는 것을 의미한다.
TCR 단독을 통해 생성된 신호는 T 세포의 완전한 활성화에 불충분하고, 2차 또는 공자극 신호가 또한 필요하다는 것은 공지되어 있다. 따라서, T 세포 활성화는 세포내 신호전달 도메인의 2개의 별개의 부류, 즉, TCR(예를 들어, TCR/CD3 복합체)을 통해 항원-의존적 1차 활성화를 개시하는 1차 신호전달 도메인 및 2차 또는 공자극 신호를 제공하도록 항원-독립적 방식으로 작용하는 공자극 신호전달 도메인에 의해 매개되는 것으로 언급될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 CAR은 하나 이상의 "공자극 신호전달 도메인" 및 "1차 신호전달 도메인"을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함한다.
1차 신호전달 도메인은 자극 방법에서, 또는 저해 방법에서 TCR 복합체의 1차 활성화를 조절한다. 자극 방식으로 작용하는 1차 신호전달 도메인은 면역수용체 타이로신-기반 활성화 모티프 또는 ITAM로서 공지된 신호전달 모티프를 함유할 수 있다.
본 발명에서 특정 용도를 갖는 1차 신호전달 도메인을 함유하는 ITAM의 예시적인 예는 TCRζ, FcRγ, FcRβ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD3ζ, CD22, CD79a, CD79b 및 CD66d로부터 유래된 것을 포함한다. 특정 바람직한 실시형태에서, CAR은 CD3ζ 1차 신호전달 도메인 및 하나 이상의 공자극 신호전달 도메인을 포함한다. 세포내 1차 신호전달 및 공자극 신호전달 도메인은 막관통 도메인의 카복실 말단에 대해 일렬로 임의의 순서로 연결될 수 있다.
본 명세서에 상정된 CAR은 T 세포 발현 CAR 수용체의 효능 및 확장을 향상시키기 위해 하나 이상의 공자극 신호전달 도메인을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어, "공자극 신호전달 도메인" 또는 "공자극 도메인"은 공자극 분자의 세포내 신호전달 도메인을 지칭한다. 공자극 분자는 항원에 대한 결합 시 T 림프구의 효율적인 활성화 및 기능에 필요한 제2 신호를 제공하는 항원 수용체 또는 Fc 수용체 이외의 세포 표면 분자이다. 이러한 공자극 분자의 예시적 예는 CARD11, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CD54 (ICAM), CD83, CD134 (OX40), CD137 (4-1BB), CD150 (SLAMF1), CD152 (CTLA4), CD223 (LAG3), CD270 (HVEM), CD273 (PD-L2), CD274 (PD-L1), CD278 (ICOS), DAP10, LAT, NKD2C SLP76, TRIM 및 ZAP70을 포함한다. 일 실시형태에서, CAR은 CD28, CD137, 및 CD134, 및 CD3ζ 1차 신호전달 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 공자극 신호전달 도메인을 포함한다.
다른 실시형태에서, CAR은 CD28 및 CD137 공자극 신호전달 도메인 및 CD3ζ 1차 신호전달 도메인을 포함한다.
또 다른 실시형태에서, CAR은 CD28 및 CD134 공자극 신호전달 도메인 및 CD3ζ 1차 신호전달 도메인을 포함한다.
일 실시형태에서, CAR은 CD137 및 CD134 공자극 신호전달 도메인 및 CD3ζ 1차 신호전달 도메인을 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 CAR은 B 세포 상에서 발현된 BCMA 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 뮤린 항-BCMA 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다.
일 실시형태에서, CAR은 BCMA 폴리펩타이드에 결합하는 뮤린 항-BCMA scFv; T-세포 수용체, CD3ε, CD3ζ, CD4, CD5, CD8α, CD9, CD 16, CD22, CD27, CD28, CD33, CD37, CD45, CD64, CD80, CD86, CD 134, CD137, CD152, CD 154 및 PD1의 알파, 베타 또는 제타쇄로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩타이드로부터 유래된 막관통 도메인; 및 CARD11, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CD54 (ICAM), CD83, CD134 (OX40), CD137 (4-1BB), CD150 (SLAMF1), CD152 (CTLA4), CD223 (LAG3), CD270 (HVEM), CD273 (PD-L2), CD274 (PD-L1), CD278 (ICOS), DAP10, LAT, NKD2C SLP76, TRIM 및 ZAP70으로 이루어진 군으로부터 선택된 공자극 분자로부터의 하나 이상의 세포내 공자극 신호전달 도메인; 및 TCRζ, FcRγ, FcRβ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD3ζ, CD22, CD79a, CD79b 및 CD66d로부터의 1차 신호전달 도메인을 포함한다.
일 실시형태에서, CAR은 BCMA 폴리펩타이드에 결합하는 뮤린 항-BCMA scFv; T-세포 수용체, CD3ε, CD3ζ, CD4, CD5, CD8α, CD9, CD 16, CD22, CD27, CD28, CD33, CD37, CD45, CD64, CD80, CD86, CD 134, CD137, CD152, CD 154 및 PD1의 알파, 베타 또는 제타 쇄로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩타이드로부터 유래된 막관통 도메인; 및 CARD11, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CD54 (ICAM), CD83, CD134 (OX40), CD137 (4-1BB), CD150 (SLAMF1), CD152 (CTLA4), CD223 (LAG3), CD270 (HVEM), CD273 (PD-L2), CD274 (PD-L1), CD278 (ICOS), DAP10, LAT, NKD2C SLP76, TRIM 및 ZAP70으로 이루어진 군으로부터 선택된 공자극 분자로부터의 하나 이상의 세포내 공자극 신호전달 도메인; 및 TCRζ, FcRγ, FcRβ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD3ζ, CD22, CD79a, CD79b 및 CD66d로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩타이드로부터의 하나 이상의 1차 신호전달 도메인을 포함한다.
일 실시형태에서, CAR은 BCMA 폴리펩타이드에 결합하는 뮤린 항-BCMA scFv; IgG1 힌지/CH2/CH3, IgG4 힌지/CH2/CH3 및 CD8α 힌지로 이루어진 군으로부터 선택된 힌지 도메인; T-세포 수용체, CD3ε, CD3ζ, CD4, CD5, CD8α, CD9, CD 16, CD22, CD27, CD28, CD33, CD37, CD45, CD64, CD80, CD86, CD 134, CD137, CD152, CD 154 및 PD1의 알파, 베타 또는 제타쇄로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩타이드로부터 유래된 막관통 도메인; 및 CARD11, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CD54 (ICAM), CD83, CD134 (OX40), CD137 (4-1BB), CD150 (SLAMF1), CD152 (CTLA4), CD223 (LAG3), CD270 (HVEM), CD273 (PD-L2), CD274 (PD-L1), CD278 (ICOS), DAP10, LAT, NKD2C SLP76, TRIM 및 ZAP70으로 이루어진 군으로부터 선택된 공자극 분자로부터의 하나 이상의 세포내 공자극 신호전달 도메인; 및 TCRζ, FcRγ, FcRβ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD3ζ, CD22, CD79a, CD79b 및 CD66d로부터의 1차 신호전달 도메인을 포함한다.
일 실시형태에서, CAR은 BCMA 폴리펩타이드에 결합하는 뮤린 항-BCMA scFv; IgG1 힌지/CH2/CH3, IgG4 힌지/CH2/CH3 및 CD8α 힌지로 이루어진 군으로부터 선택된 힌지 도메인; T-세포 수용체, CD3ε, CD3ζ, CD4, CD5, CD8α, CD9, CD 16, CD22, CD27, CD28, CD33, CD37, CD45, CD64, CD80, CD86, CD 134, CD137, CD152, CD 154 및 PD1의 알파, 베타 또는 제타쇄로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩타이드로부터 유래된 막관통 도메인; 및 CARD11, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CD54 (ICAM), CD83, CD134 (OX40), CD137 (4-1BB), CD150 (SLAMF1), CD152 (CTLA4), CD223 (LAG3), CD270 (HVEM), CD273 (PD-L2), CD274 (PD-L1), CD278 (ICOS), DAP10, LAT, NKD2C SLP76, TRIM 및 ZAP70으로 이루어진 군으로부터 선택된 공자극 분자로부터의 하나 이상의 세포내 공자극 신호전달 도메인; 및 TCRζ, FcRγ, FcRβ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD3ζ, CD22, CD79a, CD79b 및 CD66d로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩타이드로부터의 하나 이상의 1차 신호전달 도메인을 포함한다.
일 실시형태에서, CAR은 BCMA 폴리펩타이드에 결합하는 뮤린 항-BCMA scFv; IgG1 힌지/CH2/CH3, IgG4 힌지/CH2/CH3 및 CD8α 힌지로 이루어진 군으로부터 선택된 힌지 도메인; T-세포 수용체, CD3ε, CD3ζ, CD4, CD5, CD8α, CD9, CD 16, CD22, CD27, CD28, CD33, CD37, CD45, CD64, CD80, CD86, CD 134, CD137, CD152, CD 154 및 PD1의 알파, 베타 또는 제타쇄로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩타이드로부터 유래된 막관통 도메인; 짧은 올리고- 또는 폴리펩타이드 링커, 바람직하게는 CAR의 세포내 신호전달 도메인에 TM 도메인을 연결하는 길이가 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개인 아미노산; 및 CARD11, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CD54 (ICAM), CD83, CD134 (OX40), CD137 (4-1BB), CD150 (SLAMF1), CD152 (CTLA4), CD223 (LAG3), CD270 (HVEM), CD273 (PD-L2), CD274 (PD-L1), CD278 (ICOS), DAP10, LAT, NKD2C SLP76, TRIM 및 ZAP70으로 이루어진 군으로부터 선택된 공자극 분자로부터의 하나 이상의 세포내 공자극 신호전달 도메인; 및 TCRζ, FcRγ, FcRβ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD3ζ, CD22, CD79a, CD79b 및 CD66d로부터의 1차 신호전달 도메인을 포함한다.
일 실시형태에서, CAR은 BCMA 폴리펩타이드에 결합하는 뮤린 항-BCMA scFv; IgG1 힌지/CH2/CH3, IgG4 힌지/CH2/CH3 및 CD8α 힌지로 이루어진 군으로부터 선택된 힌지 도메인; T-세포 수용체, CD3ε, CD3ζ, CD4, CD5, CD8α, CD9, CD 16, CD22, CD27, CD28, CD33, CD37, CD45, CD64, CD80, CD86, CD 134, CD137, CD152, CD 154 및 PD1의 알파, 베타 또는 제타쇄로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩타이드로부터 유래된 막관통 도메인; 짧은 올리고- 또는 폴리펩타이드 링커, 바람직하게는 CAR의 세포내 신호전달 도메인에 TM 도메인을 연결하는 길이가 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개인 아미노산; 및 CARD11, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CD54 (ICAM), CD83, CD134 (OX40), CD137 (4-1BB), CD150 (SLAMF1), CD152 (CTLA4), CD223(LAG3), CD270 (HVEM), CD273 (PD-L2), CD274 (PD-L1), CD278 (ICOS), DAP10, LAT, NKD2C SLP76, TRIM 및 ZAP70으로 이루어진 군으로부터 선택된 공자극 분자로부터의 하나 이상의 세포내 공자극 신호전달 도메인; 및 TCRζ, FcRγ, FcRβ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD3ζ, CD22, CD79a, CD79b 및 CD66d로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩타이드로부터의 하나 이상의 1차 신호전달 도메인을 포함한다.
특정 실시형태에서, CAR은 BCMA 폴리펩타이드에 결합하는 뮤린 항-BCMA scFv; IgG1 힌지/CH2/CH3 폴리펩타이드 및 CD8α 폴리펩타이드를 포함하는 힌지 도메인; 약 3 내지 약 10개의 아미노산의 폴리펩타이드 링커를 포함하는 CD8α 막관통 도메인; CD137 세포내 공자극 신호전달 도메인; 및 CD3ζ 1차 신호전달 도메인을 포함한다.
특정 실시형태에서, CAR은 BCMA 폴리펩타이드에 결합하는 뮤린 항-BCMA scFv; CD8α 폴리펩타이드를 포함하는 힌지 도메인; 약 3 내지 약 10개의 아미노산의 폴리펩타이드 링커를 포함하는 CD8α 막관통 도메인; CD134 세포내 공자극 신호전달 도메인; 및 CD3ζ 1차 신호전달 도메인을 포함한다.
특정 실시형태에서, CAR은 BCMA 폴리펩타이드에 결합하는 뮤린 항-BCMA scFv; CD8α 폴리펩타이드를 포함하는 힌지 도메인; 약 3 내지 약 10개의 아미노산의 폴리펩타이드 링커를 포함하는 CD8α 막관통 도메인; CD28 세포내 공자극 신호전달 도메인; 및 CD3ζ 1차 신호전달 도메인을 포함한다.
특정 실시형태에서, CAR은 BCMA 폴리펩타이드에 결합하는 뮤린 항-BCMA; CD8α 폴리펩타이드를 포함하는 힌지 도메인; CD8α 막관통 도메인; CD137(4-1BB) 세포내 공자극 신호전달 도메인; 및 CD3ζ 1차 신호전달 도메인을 포함한다.
게다가, 본 명세서에 상정된 CAR의 설계는 비변형 T 세포 또는 다른 CAR을 발현시키도록 변형된 T 세포에 비해 CAR을 발현시키는 T 세포에서 개선된 확장, 장기간 지속, 및 용인 가능한 세포독성 특성을 가능하게 한다.
5.4. 폴리펩타이드
본 발명은 부분적으로, CAR 폴리펩타이드 및 이의 단편, 이를 포함하는 세포 및 조성물 및 폴리펩타이드를 발현시키는 벡터를 상정한다. 바람직한 실시형태에서, 서열번호 9에 제시된 하나 이상의 CAR을 포함하는 폴리펩타이드가 제공된다.
"폴리펩타이드", "폴리펩타이드 단편", "펩타이드" 및 "단백질"은 달리 대조적으로 구체화되지 않는 한, 통상적인 의미에 따라, 즉, 아미노산 서열로서 상호 호환적으로 사용된다. 폴리펩타이드는 구체적 길이로 제한되지 않으며, 예를 들어, 이들은 전장 단백질 서열 또는 전장 단백질의 단편을 포함할 수 있고, 폴리펩타이드의 번역 후 변형, 예를 들어, 천연 유래와 비천연 유래 둘 다 글리코실화, 아세틸화, 인산화뿐만 아니라 당업계에 공지된 다른 변형을 포함할 수 있다. 다양한 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 CAR 폴리펩타이드는 공동번역에 의해 또는 번역 후에 단백질의 전달을 지시하는 단백질 N-말단의 신호(또는 리더) 서열을 포함한다. 본 명세서에 개시된 CAR에서 유용한 적합한 신호 서열의 예시적인 예는 IgG1 중쇄 신호 서열 및 CD8α 신호 서열을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 폴리펩타이드는 임의의 다양한 잘 공지된 재조합 및/또는 합성 기법을 이용하여 제조될 수 있다. 본 명세서에 상정된 폴리펩타이드는 구체적으로는 본 개시내용의 CAR, 또는 본 명세서에 개시된 CAR의 하나 이상의 아미노산의 결실, 첨가 및/또는 치환을 갖는 서열을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "단리된 펩타이드" 또는 "단리된 폴리펩타이드" 등은 세포 환경으로부터의, 그리고 세포의 다른 성분과의 회합으로부터의 펩타이드 또는 폴리펩타이드 분자의 시험관내 단리 및/또는 정제를 지칭하며, 즉, 이는 생체내 물질과 유의하게 연관되지 않는다. 유사하게, "단리된 세포"는 생체내 조직 또는 기관으로부터 얻고 세포외 기질이 실질적으로 없는 세포를 지칭한다.
폴리펩타이드는 "폴리펩타이드 변이체"를 포함한다. 폴리펩타이드 변이체는 하나 이상의 치환, 결실, 첨가 및/또는 삽입이 천연 유래 폴리펩타이드와 다를 수 있다. 이러한 변이체는 천연 유래일 수 있거나 또는, 예를 들어, 상기 폴리펩타이드 서열 중 하나 이상을 변형함으로써, 합성에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 특정 실시형태에서, CAR 폴리펩타이드의 결합 도메인, 힌지, TM 도메인, 공자극 신호전달 도메인 또는 1차 신호전달 도메인 내로 하나 이상의 치환, 결실, 첨가 및/또는 삽입을 도입함으로써 CAR의 결합 친화도 및/또는 다른 생물학적 특성을 개선시키는 것이 바람직할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 폴리펩타이드는 이에 대해 적어도 약 65%, 70%, 75%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
폴리펩타이드는 "폴리펩타이드 단편"을 포함한다. 폴리펩타이드 단편은 천연 유래 또는 재조합적으로 생성된 폴리펩타이드의 아미노-말단의 결실, 카복실-말단의 결실 및/또는 내부 결실 또는 치환을 갖는, 단량체 또는 다량체일 수 있는 폴리펩타이드를 지칭한다. 특정 실시형태에서, 폴리펩타이드 단편은 적어도 5 내지 약 500개의 아미노산 길이의 아미노산 쇄를 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 단편은 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 150, 200, 250, 300, 350, 400 또는 450개의 아미노산 길이라는 것이 인식될 것이다. 특히 유용한 폴리펩타이드 단편은 항체의 항원-결합 도메인 또는 단편을 포함하는 기능성 도메인을 포함한다. 뮤린 항-BCMA 항체의 경우에, 유용한 단편은 CDR 영역, 중쇄 또는 경쇄의 CDR3 영역; 중쇄 또는 경쇄의 가변 영역; 항체쇄의 일부 또는 2개 CDR을 포함하는 가변 영역; 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
폴리펩타이드는 또한 폴리펩타이드(예를 들어, 폴리-His)의 합성, 정제 또는 식별의 용이함을 위해, 또는 고체 지지체에 대한 폴리펩타이드 결합을 향상시키기 위해 프레임내에서 융합되거나 링커 또는 다른 서열에 접합될 수 있다.
상기 언급한 바와 같이, 본 발명의 폴리펩타이드는 아미노산 치환, 결실, 절단 및 삽입을 포함하는 다양한 방법으로 변경될 수 있다. 이러한 조작에 대한 방법은 당업계에 일반적으로 공지되어 있다. 예를 들어, 기준 폴리펩타이드의 아미노산 서열 변이체는 DNA의 돌연변이에 의해 제조될 수 있다. 돌연변이유발 및 뉴클레오타이드 서열 변경을 위한 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Kunkel (1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82: 488-492), Kunkel et al., (1987, Methods in Enzymol, 154: 367-382), 미국 특허 제4,873,192호, Watson, J. D. et al., (Molecular Biology of the Gene, Fourth Edition, Benjamin/Cummings, Menlo Park, Calif., 1987)] 및 이에 열거된 참고문헌. 관심 대상의 단백질의 생물학적 활성에 영향을 미치지 않는 적절한 아미노산 치환에 대한 가이드는 문헌[Dayhoff et al., (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.)]의 모델에서 찾을 수 있다.
특정 실시형태에서, 변이체는 보존적 치환을 함유할 것이다. "보존적 치환"은 펩타이드 화학의 당업자가 실질적으로 변하지 않을 폴리펩타이드의 2차 구조 및 소수성 지표(hydropathy nature)를 예상하도록, 아미노산이 유사한 특성을 갖는 다른 아미노산을 치환하는 것이다. 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드 구조에서 변형이 만들어질 수 있으며, 또한 바람직한 특징을 갖는 변이체 또는 유도체 폴리펩타이드를 암호화하는 기능적 분자를 얻을 수 있다. 등가물 또는 심지어 본 발명의 개선된 변이체 폴리펩타이드를 생성하기 위해 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 변경시키는 것이 바람직할 때, 예를 들어, 당업자는, 예를 들어, 표 1에 따른 암호화 DNA 서열의 코돈 중 하나 이상을 변화시킬 수 있다.
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생물학적 활성을 없애는 일 없이 아미노산 잔기가 치환, 삽입 또는 결실되는 것을 결정하는 가이드는 DNASTARTM 소프트웨어와 같은 당업계에 잘 공지된 컴퓨터 프로그램을 이용하여 찾을 수 있다. 바람직하게는, 본 명세서에 개시된 단백질 변이체의 아미노산 변화는 보존적 아미노산 변화, 즉, 유사하게 하전된 또는 비하전 아미노산의 치환이다. 보존적 아미노산 변화는 이들의 측쇄와 관련된 아미노산의 패밀리 중 하나의 치환을 수반한다. 천연 유래 아미노산은 일반적으로 4개의 패밀리로 나눈다: 산성(아스파르테이트, 글루타메이트), 염기성(라이신, 알기닌, 히스티딘), 비극성(알라닌, 발린, 류신, 아이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판) 및 비하전 극성(글리신, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 세린, 트레오닌, 타이로신) 아미노산. 페닐알라닌, 트립토판 및 타이로신은 때때로 방향족 아미노산으로서 공동으로 분류된다. 펩타이드 또는 단백질에서, 아미노산의 적합한 보존적 치환은 당업계에 공지되어 있으며, 일반적으로 얻어진 분자의 생물학적 활성을 변경시키는 일 없이 이루어질 수 있다. 당업자는 일반적으로, 폴리펩타이드의 비필수 영역에서의 단일 아미노산 치환이 생물학적 활성을 실질적으로 변경시키지 않는다는 것을 인식한다(예를 들어, 문헌[Watson et al. Molecular Biology of the Gene, 4th Edition, 1987, The Benjamin/Cummings Pub. Co., p.224] 참조). 예시적인 보존적 치환은 미국 가출원 특허 제61/241,647호에 기재되어 있으며, 이의 개시내용은 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
이러한 변화를 만드는 데 있어서, 아미노산의 소수성 지표가 고려될 수 있다. 단백질 상에서 상호작용하는 생물학적 기능을 부여함에 있어서 소수성 아미노산 지표의 중요성은 일반적으로 당업계에서 이해된다(본 명세서에 참조에 의해 원용되는 문헌[Kyte and Doolittle, 1982] 참조). 각각의 아미노산은 이의 소수성 및 변화 특징에 기반하여 소수성 지표가 부여되었다(Kyte and Doolittle, 1982). 이들 값은 아이소류신(+4.5); 발린(+4.2); 류신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스테인(+2.5); 메티오닌(+1.9); 알라닌(+1.8); 글리신(-0.4); 트레오닌(-0.7); 세린(-0.8); 트립토판(-0.9); 타이로신(-1.3); 프롤린(-1.6); 히스티딘(-3.2); 글루타메이트(-3.5); 글루타민(-3.5); 아스파르테이트(-3.5); 아스파라긴(-3.5); 라이신(-3.9); 및 알기닌(-4.5)이다.
특정 아미노산은 유사한 소수성 지표 또는 스코어를 갖는 다른 아미노산으로 치환될 수 있고, 또한 유사한 생물학적 활성을 갖는 단백질을 생성하고, 즉, 또한 생물학적 기능적으로 동등한 단백질을 얻을 수 있다는 것이 당업계에 공지되어 있다. 이러한 변화를 생성함에 있어서, 소수성 지표가 ±2 이내인 아미노산의 치환이 바람직하며, ±1 이내인 것이 특히 바람직하고, ±0.5 이내인 것이 더욱 더 특히 바람직하다. 또한 유사한 아미노산의 치환은 친수성에 기반하여 효과적으로 이루어질 수 있다는 것이 이해된다.
미국 특허 제4,554,101호에서 상술되는 바와 같이, 아미노산 잔기에 다음의 친수성 값이 부여되었다: 알기닌(+3.0); 라이신(+3.0); 아스파르테이트(+3.0　± 1); 글루타메이트(+3.0 ± 1); 세린(+0.3); 아스파라긴 (+0.2); 글루타민(+0.2); 글리신(0); 트레오닌(-0.4); 프롤린(-0.5 ± 1); 알라닌(-0.5); 히스티딘(-0.5); 시스테인(-1.0); 메티오닌(-1.3); 발린(-1.5); 류신(-1.8); 아이소류신(-1.8); 타이로신(-2.3); 페닐알라닌(-2.5); 트립토판(-3.4). 아미노산은 유사한 친수성 값을 갖는 다른 아미노산을 치환할 수 있고, 또한 생물학적 등가물, 특히 면역학적으로 동등한 단백질을 얻는다는 것이 이해된다. 이러한 예에서, 친수성 값이 ±2 이내인 아미노산의 치환이 바람직하며, ±1 이내인 것이 특히 바람직하고, ±0.5 이내인 것이 더욱 더 특히 바람직하다.
상기 약술한 바와 같이, 아미노산 치환은 아미노산 측쇄 치환체의 상대적 유사성, 예를 들어, 이들의 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기반할 수 있다.
폴리펩타이드 변이체는 추가로 글리코실화된 형태, 다른 분자와의 응집 접합체 및 비관련 화학적 모이어티와의 공유 접합체(예를 들어, 페길화된 분자)를 포함한다. 공유 변이체는 당업계에 공지된 바와 같이 아미노산 쇄에서 또는 N- 또는 C-말단 잔기에서 발견되는 기에 작용기를 연결함으로써 제조될 수 있다. 변이체는 또한 대립유전자 변이체, 종 변이체 및 뮤테인을 포함한다. 단백질의 기능적 활성에 영향을 미치지 않는 영역의 절단 또는 결실은 또한 변이체이다.
일 실시형태에서, 둘 이상의 폴리펩타이드의 발현이 요망되는 경우에, 이들을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 본 명세서의 다른 곳에 논의되는 바와 같은 IRES 서열에 의해 분리될 수 있다. 다른 실시형태에서, 둘 이상의 폴리펩타이드는 하나 이상의 자기-절단성 폴리펩타이드 서열을 포함하는 융합 단백질로서 발현될 수 있다.
본 발명의 폴리펩타이드는 융합 폴리펩타이드를 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 융합 폴리펩타이드 및 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 예를 들어, CAR이 제공된다. 융합 폴리펩타이드 및 융합 단백질은 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 이상의 폴리펩타이드 세그먼트를 갖는 폴리펩타이드를 지칭한다. 융합 폴리펩타이드는 전형적으로 C-말단이 N-말단에 연결되지만, 이들은 또한 C-말단이 C-말단에, N-말단이 N-말단에 또는 N-말단이 C-말단에 연결될 수 있다. 융합 단백질의 폴리펩타이드는 임의의 순서 또는 구체화된 순서일 수 있다. 융합 폴리펩타이드 또는 융합 단백질은 또한 융합 폴리펩타이드의 목적하는 전사 활성이 보존된다면, 보존적으로 변형된 변이체, 다형성 변이체, 대립유전자, 돌연변이체, 하위서열 및 종간 상동체를 포함할 수 있다. 융합 폴리펩타이드는 화학적 합성 방법에 의해 또는 두 모이어티 간의 화학적 결합에 의해 생성될 수 있거나, 일반적으로 다른 표준 기법을 이용하여 제조될 수 있다. 융합 폴리펩타이드를 포함하는 결찰된 DNA 서열은 본 명세서의 다른 곳에서 논의되는 적합한 전사 또는 번역 제어 요소에 작동 가능하게 연결된다.
일 실시형태에서, 융합 상대는 천연 재조합 단백질보다 고수율로 단백질(발현 인핸서)을 발현시키는 것을 보조하는 서열을 포함한다. 다른 융합 상대는 단백질의 용해도를 증가시키거나 또는 단백질이 목적하는 세포내 구획에 표적화되는 것을 가능하게 하거나 또는 세포막을 통해 융합 단백질의 수송을 용이하게 하기 위해 선택될 수 있다.
융합 폴리펩타이드는 각각의 본 명세서에 기재된 폴리펩타이드 도메인 사이에 폴리펩타이드 절단 신호를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 폴리펩타이드 부위는 임의의 링커 펩타이드 서열에 위치될 수 있다. 예시적인 폴리펩타이드 절단 신호는 폴리펩타이드 절단 인식 부위, 예컨대 프로테아제 절단 부위, 뉴클레아제 절단 부위(예를 들어, 희귀 제한 효소 인식 부위, 자기-절단성 리보자임 인식 부위) 및 자기-절단성 바이러스 올리고펩타이드를 포함한다(문헌[deFelipe and Ryan, 2004. Traffic, 5(8); 616-26] 참조).
적합한 프로테아제 절단 부위 및 자기-절단성 펩타이드는 당업자에게 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Ryan et al., 1997. J. Gener. Virol. 78, 699-722; Scymczak et al. (2004) Nature Biotech. 5, 589-594] 참조). 예시적인 프로테아제 절단 부위는 포티바이러스 NIa 프로테아제(예를 들어, 담배 식각 바이러스 프로테아제), 포티바이러스 HC 프로테아제, 포티바이러스 P1(P35) 프로테아제, 비오바이러스(byovirus) NIa 프로테아제, 비오바이러스 RNA-2-암호화된 프로테아제, 아프토바이러스 L 프로테아제, 엔테로바이러스 2A 프로테아제, 리노바이러스 2A 프로테아제, 피코르나 3C 프로테아제, 코모바이러스 24K 프로테아제, 네포바이러스 24K 프로테아제, RTSV(벼 퉁그로 구형 바이러스) 3C-유사 프로테아제, PYVF(파스닙 황색 반점 바이러스) 3C-유사 프로테아제, 헤파린, 트롬빈, 인자 Xa 및 엔테로키나제의 절단부위를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 이의 고절단 엄중함으로 인해, TEV(담배 식각 바이러스) 프로테아제 절단 부위는 일 실시형태에서, 예를 들어, EXXYXQ(G/S)(서열번호 23), 예를 들어, ENLYFQG(서열번호 24) 및 ENLYFQS(서열번호 25)이 바람직하되, X는 임의의 아미노산을 나타낸다(TEV에 의한 절단은 Q 내지 G 또는 Q 내지 S 사이에서 일어난다).
특정 실시형태에서, 자기-절단성 펩타이드는 포티바이러스 및 카디오바이러스 2A 펩타이드, FMDV(구제역 바이러스), 마 비염 A 바이러스, 토레사 아시그나 바이러스 및 돼지 테스코바이러스로부터 얻은 해당 폴리펩타이드 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 자기-절단성 폴리펩타이드 부위는 2A 또는 2A-유사 부위, 서열 또는 도메인을 포함한다(Donnelly et al., 2001. J. Gen. Virol. 82:1027-1041).
Figure pct00003
바람직한 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 폴리펩타이드는 CAR 폴리펩타이드를 포함한다.
5.5. 폴리뉴클레오타이드
바람직한 실시형태에서, 하나 이상의 CAR 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 서열번호 10이 제공된다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "폴리뉴클레오타이드" 또는 "핵산"은 전령 RNA(mRNA), RNA, 게놈 RNA(gRNA), 플러스 가닥 RNA(RNA(+)), 마이너스 가닥 RNA(RNA(-)), 게놈 DNA(gDNA), 상보성 DNA(cDNA) 또는 재조합 DNA를 지칭한다. 폴리뉴클레오타이드는 단일 및 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 본 명세서에 기재된 임의의 기준 서열(예를 들어, 서열목록)에 대해 적어도 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오타이드 또는 변이체를 포함하고, 전형적으로 변이체는 기준 서열의 적어도 하나의 생물학적 활성을 유지한다. 다양한 예시적 실시형태에서, 본 발명은 부분적으로 발현 벡터, 바이러스 벡터 및 전달 플라스미드를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 및 이를 포함하는 조성물, 및 세포를 상정한다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 폴리펩타이드의 적어도 약 5, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 500, 1000, 1250, 1500, 1750 또는 2000개 이상의 인접한 아미노산 잔기뿐만 아니라 중간 길이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 본 발명에 의해 제공된다. 이와 관련하여 "중간 길이"는 6, 7, 8, 9 등, 101, 102, 103 등; 151, 152, 153 등; 201, 202, 203 등과 같은 제시된 값 사이의 임의의 길이를 의미한다는 것이 용이하게 이해될 것이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "폴리뉴클레오타이드 변이체" 및 "변이체" 등은 기준 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 본 명세서에서 이후에 정해지는 엄격 조건 하에 기준 서열과 혼성화하는 폴리뉴클레오타이드에 대해 실질적인 서열 동일성을 나타내는 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다. 이들 용어는 하나 이상의 뉴클레오타이드가 기준 폴리뉴클레오타이드에 비해 첨가 또는 결실되거나, 상이한 뉴클레오타이드로 대체된 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 이와 관련하여, 돌연변이, 첨가, 결실 및 치환을 포함하는 특정 변경이 기준 폴리뉴클레오에 대해 이루어지고, 이에 의해 변경된 폴리뉴클레오타이드가 기준 폴리뉴클레오타이드의 생물학적 기능 또는 활성을 유지할 수 있다는 것은 당업계에서 잘 이해된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 설명 "서열 동일성" 또는, 예를 들어, "~에 대해 50% 동일한 서열"을 포함하는 것은 서열이 비교창에 걸쳐 뉴클레오타이드에 따른 기준 또는 아미노산에 따른 기준에 대해 동일한 정도를 지칭한다. 따라서, "서열 동일성의 백분율"은 비교창에 걸쳐 2개의 최적으로 정렬된 서열을 비교하고, 서열 둘 다에서 동일한 핵산 염기(예를 들어, A, T, C, G, I) 또는 동일한 아미노산 잔기(예를 들어, Ala, Pro, Ser, Thr, Gly, Val, Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, Lys, Arg, His, Asp, Glu, Asn, Gln, Cys 및 Met)가 생겨서 매칭된 위치의 수를 수득한 위치의 수를 결정하고, 매칭된 위치의 수를 비교창 내 위치의 총 수(즉, 창 크기)로 나누고, 결과에 100을 곱하여서 서열 동일성 백분율을 수득함으로써 계산될 수 있다. 본 명세서에 기재된 임의의 기준 서열에 대해 적어도 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드가 포함되며, 전형적으로 폴리펩타이드 변이체는 기준 폴리펩타이드의 적어도 하나의 생물학적 활성을 유지한다.
둘 이상의 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 사이의 서열 관계를 기재하기 위해 사용되는 용어는 "기준 서열", "비교창", "서열 동일성", "서열 동일성 백분율" 및 "실질적인 동일성"을 포함한다. "기준 서열"은 뉴클레오타이드 및 아미노산 잔기를 포함하는, 길이로 적어도 12개이지만, 빈번하게는 15 내지 18개, 및 종종은 적어도 25개의 단량체 단위이다. 2개의 폴리뉴클레오타이드는 각각 (1) 2개의 폴리뉴클레오타이드 간에 유사한 서열(즉, 완전한 폴리뉴클레오타이드 서열의 일부만), 및 (2) 2개의 폴리뉴클레오타이드 사이에서 분기되는 서열을 포함할 수 있기 때문에, 둘(이상의) 폴리뉴클레오타이드 간의 서열 비교는 전형적으로 서열 유사성의 국소 영역을 확인하고 비교하기 위해 "비교창"에 걸쳐 2개의 폴리뉴클레오타이드의 서열을 비교함으로써 수행된다. "비교창"은 적어도 6개의 인접한 위치, 보통 약 50 내지 약 100, 더 보통으로는 약 100 내지 약 150의 개념 세그먼트를 지칭하며, 이때 서열은 두 서열이 최적으로 정렬된 후 동일한 수의 인접한 위치의 기준 서열과 비교된다. 비교창은 두 서열의 최적의 정렬을 위해 기준 서열(첨가 또는 결실을 포함하지 않음)에 비해 약 20% 이하의 첨가 또는 결실(즉, 갭)을 포함할 수 있다. 비교창을 정렬하기 위한 서열의 최적의 정렬은 알고리즘의 컴퓨터화된 실행(위스콘신 제네틱스 소프트웨어 패키지 릴리즈 7.0(Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0)의 GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA, 미국 위스콘신주 메디슨에 소재한 575 사이언스 드라이브 메디슨에 소재한 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group))에 의해 또는 선택된 임의의 다양한 방법에 의해 생성된 검사 및 최고의 정렬(즉, 비교창에 걸쳐 가장 높은 백분율 상동성을 초래함)에 의해 수행될 수 있다. 또한, 예를 들어, 문헌[Altschul et al., 1997, Nucl. Acids Res. 25:3389]에 개시된 바와 같은 프로그램의 BLAST 패밀리를 참고할 수 있다. 서열 분석의 상세한 논의는 문헌[Unit 19.3 of Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc, 1994-1998, Chapter 15]에서 찾을 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "단리된 폴리뉴클레오타이드"는 천연 유래 상태에서 측접하는 서열로부터 정제된 폴리뉴클레오타이드, 예를 들어, 정상적으로는 단편에 인접한 서열로부터 제거되는 DNA 단편을 지칭한다. "단리된 폴리뉴클레오타이드"는 또한 상보성 DNA(cDNA), 재조합 DNA 또는 천연 상태에서 존재하지 않지만 사람의 손으로 만들어진 다른 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다.
폴리뉴클레오타이드의 배향을 기재하는 용어는 하기를 포함한다: 5'(정상적으로는 유리 인산염기를 갖는 폴리뉴클레오타이드의 말단) 및 3'(정상적으로는 유리 하이드록실(OH) 기를 갖는 폴리뉴클레오타이드 말단). 폴리뉴클레오타이드 서열은 5'에서 3' 배형으로 또는 3'에서 5' 배향으로 주석이 달릴 수 있다. DNA 및 mRNA에 대해, 5'에서 3' 가닥은 "센스", "플러스" 또는 "암호화" 가닥으로 표기되되는데, 이의 서열은 전전령(premessenger: premRNA)의 서열과 동일하기 때문이다[DNA에서의 티민(T) 대신 RNA에서의 유라실(U)을 제외]. DNA 및 mRNA에 대해, RNA 중합효소에 의해 전사되는 가닥인 상보성 3' 내지 5' 가닥은 "주형", "안티센스", "마이너스" 또는 "비암호" 가닥으로서 표기된다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "역방향 배향"은 3'에서 5' 배향으로 기재된 5'에서 3' 서열 또는 5'에서 3' 배향으로 기재된 3'에서 5' 서열을 지칭한다.
용어 "상보성" 및 "상보적"은 염기쌍 규칙에 의해 관련된 폴리뉴클레오타이드(즉, 뉴클레오타이드 서열)을 지칭한다. 예를 들어, DNA 서열 5' A G T C A T G 3'의 상보성 가닥은 3' T C A G T A C 5'이다. 후자의 서열은 종종 좌측에서 5' 말단 및 우측에서 3' 말단으로 역방향 보체로서 기재된다, 5' C A T G A C T 3'. 역방향 보체와 동일한 서열은 회문구조 서열인 것으로 언급된다. 상보성은 "부분적"일 수 있으며, 이때 핵산 염기의 일부만이 염기쌍 규칙에 따라 매칭될 수 있다. 또는, 핵산 사이에 "완전한" 또는 "전체" 상보성이 있을 수 있다.
게다가, 유전자 암호 축퇴(degeneracy)의 결과로서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 폴리펩타이드, 또는 이의 변이체의 단편을 암호화하는 다수의 뉴클레오타이드 서열이 있다는 것은 당업자에 의해 인식될 것이다. 이들 폴리뉴클레오타이드 중 일부는 임의의 천연 유전자의 뉴클레오타이드 서열에 대해 최소 상동성을 보유한다. 그럼에도 불구하고, 코돈출현빈도의 차이로 인해 다른 폴리뉴클레오타이드, 예를 들어 인간 및/또는 영장류 코돈 선택에 대해 최적화된 폴리뉴클레오타이드가 구체적으로 상정된다. 추가로, 본 명세서에 제공된 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전자의 대립유전자가 또한 사용될 수 있다. 대립유전자는 하나 이상의 돌연변이, 예컨대 뉴클레오타이드의 결실, 첨가 및/또는 치환의 결과로서 변경된 내인성 유전자이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "핵산 카세트"는 RNA, 및 후속적으로 단백질을 발현시킬 수 있는 벡터 내의 유전자 서열을 지칭한다. 핵산 카세트는 관심 대상의 유전자, 예를 들어, CAR을 함유한다. 카세트 내 핵산이 RNA로 전사될 수 있고, 필요하다면, 단백질 또는 폴리펩타이드로 번역되며, 형질전환 세포에서 활성이 필요한 적절한 번역 후 변형을 겪고, 적절한 세포내 구획에 대한 표적화 또는 세포외 구획 내로의 분비에 의해 생물학적 활성을 위한 적절한 구획으로 전위될 수 있도록, 핵산 카세트는 벡터 내에 위치적으로 그리고 순차적으로 배향된다. 바람직하게는, 카세트는 벡터 내로의 준비된 삽입에 적합한 3' 및 5' 말단을 갖고, 예를 들어, 이는 각각의 말단에서 제한 엔도뉴클레아제 부위를 갖는다. 본 발명의 바람직한 실시형태에서, 핵산 카세트는 B 세포 악성종양을 치료하기 위해 사용되는 키메라 항원 수용체의 서열을 함유한다. 카세트는 제거될 수 있고, 단일 단위로서 플라스미드 또는 바이러스 벡터 내에 삽입될 수 있다.
특정 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 적어도 하나의 관심 대상의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "관심 대상의 폴리뉴클레오타이드"는 발현될 것이 요망되는 발현 벡터 내로 삽입된 폴리펩타이드(즉, 관심 대상의 폴리펩타이드)를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다. 벡터는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 관심 대상의 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 관심 대상의 폴리뉴클레오타이드는 질환 또는 장애의 치료 또는 장애에서 치료 효과를 제공하는 폴리펩타이드를 암호화한다. 관심 대상의 폴리뉴클레오타이드 및 이로부터 암호화된 폴리펩타이드는 야생형 폴리펩타이드뿐만 아니라 이의 기능성 변이체 및 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 둘 다 포함한다. 특정 실시형태에서, 기능성 변이체는 대응하는 야생형 기준 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열에 대해 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 동일성을 갖는다. 특정 실시형태에서, 기능성 변이체 또는 단편은 대응하는 야생형 폴리펩타이드의 생물학적 활성의 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 90%를 가진다.
일 실시형태에서, 관심 대상의 폴리뉴클레오타이드는 폴리펩타이드를 암호화하지 않지만, miRNA, siRNA, 또는 shRNA, 리보자임, 또는 다른 저해 RNA를 전사하기 위한 주형으로서 작용한다. 다양한 다른 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 CAR을 암호화하는 관심 대상의 폴리뉴클레오타이드 및 siRNA, miRNA, shRNA 및 리보자임을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 저해 핵산 서열을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 하나 이상의 추가적인 관심 대상의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "siRNA" 또는 "짧은 간섭 RNA"는 동물에서 서열-특이적 전사 후 유전자 침묵, 번역 저해, 전사 저해 또는 후성적 RNAi의 과정을 매개하는 짧은 폴리뉴클레오타이드 서열을 지칭한다(Zamore et al., 2000, Cell, 101, 25-33; Fire et al., 1998, Nature, 391, 806; Hamilton et al., 1999, Science, 286, 950-951; Lin et al., 1999, Nature, 402, 128-129; Sharp, 1999, Genes & Dev., 13, 139-141; 및 Strauss, 1999, Science, 286, 886). 특정 실시형태에서, siRNA는 동일한 수의 뉴클레오사이드를 갖는 제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하지만; 그러나, 제1 가닥 및 제2 가닥 상의 2개의 말단 뉴클레오사이드가 상보성 가닥 상의 잔기와 짝지어지지 않도록, 제1 가닥 및 제2 가닥은 오프셋이 된다. 특정 예에서, 짝지어지지 않은 두 뉴클레오사이드는 티미딘 잔기이다. siRNA는 표적 유전자에 대해 충분한 상동성 영역을 포함하여야 하고, siRNA 또는 이의 단편이 표적 유전자의 하향 조절을 매개할 수 있도록, 뉴클레오타이드에 관해 충분한 길이를 가져야 한다. 따라서, siRNA는 표적 RNA에 대해 적어도 부분적으로 상보성인 영역을 포함한다. siRNA와 표적 사이에 완전한 상보성이 존재할 필요는 없지만, 대응도는 예컨대 표적 RNA의 RNAi 절단에 의해 siRNA, 또는 이의 절단 산물이 서열 특이적 침묵을 지시하는 것을 가능하게 하는 데 충분하여야 한다. 상보성 또는 표적 가닥과의 상보성 정도는 안티센스 가닥에서 가장 중요하다. 특히 안티센스 가닥에서 완전한 상보성이 종종 요망되지만, 일부 실시형태는 하나 이상의, 그러나 표적 RNA에 대해 바람직하게는 10, 8, 6, 5, 4, 3, 2 또는 더 소수의 미스매치를 포함한다. 미스매치는 말단 영역에서 가장 용인되며, 존재한다면, 예를 들어, 5' 및/또는 3' 말단의 6, 5, 4 또는 3개의 뉴클레오타이드 내의 바람직하게는 말단 영역 또는 영역들이다. 분자의 전반적인 이중 가닥 특징을 유지하기 위해 센스 가닥은 안티센스 가닥과만 충분히 상보성이 있을 필요가 있다.
추가로, siRNA는 변형될 수 있거나 뉴클레오사이드 유사체를 포함할 수 있다. siRNA의 단일 가닥 영역은 변형되거나 뉴클레오사이드 유사체를 포함할 수 있고, 예를 들어, 헤어핀 구조의 짝지어지지 않은 영역 또는 영역들, 예를 들어, 2개의 상보성 영역을 연결하는 영역은 변형 또는 뉴클레오사이드 유사체를 가진다. 예를 들어, 엑소뉴클레아제에 대해 siRNA의 하나 이상의 3'- 또는 5'-말단을 안정화시키는 변형 또는 안티센스 siRNA 제제가 RISC 내로 유입되는 것을 선호하는 변형이 또한 유용한다. 변형은 C3(또는 C6, C7, C12) 아미노 링커, 티올 링커, 카복실 링커, 비뉴클레오타이드 스페이서(C3, C6, C9, C12, 비염기성, 트라이에틸렌 글리콜, 헥사에틸렌 글리콜), 특별한 바이오틴, 또는 포스포르아미다이트로서 생기고 다른 DMT-보호 하이드록실기를 갖는 플루오레세인 시약을 포함하여, RNA 합성 동안 다중 결합을 가능하게 할 수 있다. siRNA의 각각의 가닥은 길이가 30개 이하, 25, 24, 23, 22, 21 또는 20개의 뉴클레오타이드일 수 있다. 가닥은 바람직하게는 길이가 적어도 19개의 뉴클레오타이드이다. 예를 들어, 각각의 가닥은 길이가 21 내지 25개의 뉴클레오타이드일 수 있다. 바람직한 siRNA는 17, 18, 19, 29, 21, 22, 23, 24 또는 25개의 뉴클레오타이드 쌍의 이중가닥 영역, 및 2 내지 3개 뉴클레오타이드의 하나 이상의 돌출부, 바람직하게는 2 내지 3개의 뉴클레오타이드의 1 또는 2개의 3' 돌출부를 가진다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "miRNA" 또는 "microRNA"는 전형적으로 전-miRNA로서 알려진 대략 70개 뉴클레오타이드 폴드-백(fold-back) RNA 전구체 구조로부터 절단된 20 내지 22개의 뉴클레오타이드의 소형 비암호화 RNA를 지칭한다. miRNA는 miRNA와 표적 사이의 상보성 정도에 따라서 두 방법 중 하나에서 이들의 표적을 음성으로 조절한다. 첫째로, 단백질-암호화 mRNA 서열에 대해 완전한 또는 거의 완전한 상보성으로 결합하는 miRNA는 RNA-매개 간섭(RNAi) 경로를 유도한다. 이들의 mRNA 표적의 3' 비번역 영역(UTR) 내에서 불완전한 상보성 부위에 대한 결합에 의해 조절 효과를 발휘하는 miRNA는 RNAi 경로에 대해 사용된 것과 유사하거나 가능하게는 동일한 RISC 복합체를 통해 전사 후에, 분명하게는 번역 수준에서 표적-유전자 발현을 억제한다. 번역 후 조절과 일치되게, 이 메커니즘을 사용하는 miRNA는 이들의 표적 유전자의 단백질 수준을 감소시키지만, 이들 유전자의 mRNA 수준은 최소로만 영향받는다. miRNA는 천연 유래 miRNA뿐만 아니라 임의의 mRNA 서열을 특이적으로 표적화할 수 있는 인공 설계된 miRNA를 둘 다 포괄한다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 당업자는 인간 miRNA(예를 들어, miR-30 또는 miR-21) 1차 전사체로서 발현되는 짧은 헤어핀 RNA 작제물을 설계할 수 있다. 이 설계는 헤어핀 작제물에 Drosha 가공 부위를 첨가하며, 넉다운 효율을 크게 증가시키는 것으로 나타났다(Pusch et al., 2004). 헤어핀 줄기는 dsRNA의 22개의 nt(예를 들어, 안티센스는 목적하는 표적에 대해 완전한 상보성을 가짐) 및 인간 miR로부터의 15 내지 19개의 nt 루프로 이루어진다. 헤어핀 측면 중 하나 또는 둘 다에 miR 루프 및 miR30 측접 서열을 첨가하는 것은 마이크로RNA가 없는 통상적인 shRNA 설계와 비교할 때 발현된 헤어핀의 Drosha 및 Dicer 가공에서 10배 초과의 증가를 초래한다. 증가된 Drosha 및 Dicer 가공은 발현된 헤어핀에 대해 더 큰 siRNA/miRNA 생성 및 더 큰 효능으로 번역한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "shRNA" 또는 "짧은 헤어핀 RNA"는 단일 자기-상보성 RNA에 의해 형성된 이중-가닥 구조를 지칭한다. 암호화 또는 비암호화 서열의, 표적 유전자의 일부와 동일한 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 shRNA 작제물은 저해에 바람직하다. 표적 서열에 대해 삽입, 결실 및 단일 점 돌연변이를 갖는 RNA 서열은 또한 저해에 효과적인 것으로 발견되었다. 저해 RNA와 표적 유전자의 일부 사이의 90% 초과의 서열 동일성, 또는 심지어 100% 서열 동일성이 바람직하다. 특정 바람직한 실시형태에서, shRNA의 이중가닥-형성 부분의 길이는, 예를 들어, Dicer-의존적 절단에 의해 생성된 RNA 산물에 대한 크기에 대응하는 길이가 적어도 20, 21 또는 22개인 뉴클레오타이드이다. 특정 실시형태에서, shRNA 작제물은 길이가 적어도 25, 50, 100, 200, 300 또는 400개인 염기이다. 특정 실시형태에서, shRNA 작제물은 길이가 400 내지 800개인 염기이다. shRNA 작제물은 루프 서열 및 루프 사이즈에서의 변형이 크게 용인된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "리보자임"은 표적 mRNA의 부위-특이적 절단을 가능하게 하는 촉매적으로 활성인 RNA 분자를 지칭한다. 몇몇 하위유형, 예를 들어, 해머헤드(hammerhead) 및 헤어핀 리보자임이 기재되었다. 리보자임 촉매 활성 및 안정성은 비촉매 염기에서 리보뉴클레오타이드를 데옥시리보뉴클레오타이드로 치환함으로써 개선될 수 있다. 특정 mRNA를 파괴하기 위해 부위-특이적 인식 서열에서 mRNA를 절단하는 리보자임이 사용될 수 있지만, 해머헤드 리보자임의 사용이 바람직하다. 해머헤드 리보자임은 표적 mRNA와 상보성 염기쌍을 형성하는 측접 영역에 의해 지시되는 위치에서 mRNA를 절단한다. 유일한 요건은 표적 mRNA가 2개 염기의 다음의 서열을 갖는다는 것이다: 5'-UG-3'. 해머헤드 리보자임의 작제 및 생성은 당업계에 잘 공지되어 있다.
siRNA, miRNA, shRNA 또는 리보자임을 포함하는 관심 대상의 폴리뉴클레오타이드의 바람직한 전달 방법은 본 명세서의 다른 곳에 기재된 바와 같은 하나 이상의 조절 서열, 예를 들어, 강한 구성적 pol III, 예를 들어, 인간 U6 snRNA 프로모터, 마우스 U6 snRNA 프로모터, 인간 및 마우스 H1 RNA 프로모터 및 인간 tRNA-val 프로모터, 또는 강한 구성적 pol II 프로모터를 포함한다.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드는, 암호화 서열 그 자체의 길이와 상관없이, 이들의 전체 길이가 상당히 달라질 수 있도록, 본 명세서의 다른 곳에 개시된 바와 같이 또는 당업계에 공지된 바와 같이 다른 DNA 서열, 예컨대 프로모터 및/또는 인핸서, 비번역 영역(UTR), 신호 서열, 코작(Kozak) 서열, 폴리아데닐화 신호, 추가적인 제한 효소 부위, 다중 클로닝 부위, 내부 리보솜 유입 부위(IRES), 재조합효소 인식 부위(예를 들어, LoxP, FRT 및 Att 부위), 말단 코돈, 전사 종결 신호, 및 자기-절단성 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 에피토프 태그와 조합될 수 있다. 따라서 대부분의 임의의 길이의 폴리뉴클레오타이드 단편이 사용될 수 있으며, 총 길이가 바람직하게는 의도된 재조합 DNA 프로토콜에서 제조 및 사용의 용이함에 의해 제한된다는 것이 상정된다.
폴리뉴클레오타이드는 당업계에서 공지되고 이용 가능한 임의의 다양한 잘 확립된 기법을 이용하여 제조되고/되거나, 조작되고/되거나 발현될 수 있다. 목적하는 폴리펩타이드를 발현시키기 위해, 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 적절한 벡터 내로 삽입될 수 있다. 벡터의 예는 플라스미드, 자율 복제 서열 및 전위 요소이다. 추가적인 예시적 벡터는 플라스미드, 파지미드, 코스미드, 인공 염색체, 예컨대 효모 인공 염색체(YAC), 박테리아 인공 염색체(BAC) 또는 P1-유래 인공 염색체(PAC), 박테리오파지, 예컨대 람다 파지 또는 M13 파지 및 동물 바이러스를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 벡터로서 유용한 동물 바이러스 범주의 예는 레트로바이러스(렌티바이러스를 포함), 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 헤르페스바이러스(예를 들어, 단순포진 바이러스), 폭스바이러스, 바큘로바이러스, 파필로마바이러스, 및 파포바바이러스(예를 들어, SV40)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 발현 벡터의 예는 포유류 세포에서 발현을 위한 pClneo 벡터(프로메가(Promega)); 포유류 세포에서 렌티바이러스-매개 유전자 전달 및 발현을 위한 pLenti4/V5-DEST™, pLenti6/V5-DEST™ 및 pLenti6.2/V5-GW/lacZ(인비트로젠(Invitrogen))이다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 키메라 단백질의 암호화 서열은 포유류 세포에서 키메라 단백질의 발현을 위해 이러한 발현 벡터 내로 결찰될 수 있다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 CAR을 암호화하는 벡터는 서열번호 36에 제시된 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 벡터는 에피솜 벡터 또는 염색체외에 유지된 벡터이다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "에피솜"은 숙주의 염색체 DNA 내로의 통합 없이 그리고 분화 숙주 세포로부터의 점진적 상실 없이 복제할 수 있는 벡터를 지칭하며, 또한 상기 벡터가 염색체외로 또는 에피솜으로 복제한다는 것을 의미한다. 벡터는 림프친화성 헤르페스 바이러스 또는 감마 헤르페스바이러스, 아데노바이러스, SV40, 소 유두종 바이러스, 또는 효모로부터의 DNA 복제 기점 또는 "ori", 구체적으로는 EBV의 oriP에 대응하는 림프친화성 헤르페스 바이러스 또는 감마 헤르페스바이러스의 복제 기점에 대한 서열 암호화를 보유하도록 조작된다. 특정 양상에서, 림프친화성 헤르페스 바이러스는 엡스타임 바르 바이러스(EBV), 카포시 육종 헤르페스 바이러스(KSHV), 헤르페스 바이러스 사이미리(HS) 또는 마렉병 바이러스(MDV)일 수 있다. 엡스타인 바르 바이러스(EBV) 및 카포시 육종 헤르페스 바이러스(KSHV)는 또한 감마 헤르페스 바이러스의 예이다. 전형적으로, 숙주 세포는 복제를 활성화하는 바이러스 복제 전사활성체 단백질을 포함한다.
발현 벡터에 존재하는 "제어 요소" 또는 "조절 서열"은 벡터-복제기점의 비번역 영역, 선택 카세트, 프로모터, 인핸서, 번역 개시 신호(샤인 달가노(Shine Dalgarno) 서열 또는 코작(Kozak sequence) 인트론, 폴리아데닐화 서열, 5' 및 3' 비번역 영역이며-이들은 전사 및 번역을 수행하기 위해 숙주 세포의 단백질과 상호작용한다. 이러한 요소는 이들의 강도 및 특이성이 다를 수 있다. 이용되는 벡터 시스템 및 숙주에 따라서, 편재하는 프로모터 및 유도성 프로모터를 포함하는 다수의 적합한 전사 및 번역 요소가 사용될 수 있다.
특정 실시형태에서, 발현 벡터 및 바이러스 벡터를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 발명을 실행하는 데 사용하기 위한 벡터는 외인성, 내인성 또는 이종성 제어 서열, 예컨대 프로모터 및/또는 인핸서를 포함할 수 있다. "내인성" 제어 서열은 게놈 내 주어진 유전자와 자연적으로 연결되는 것이다. "외인성" 제어 서열은 해당 유전자의 전사가 연결된 인핸서/프로모터에 의해 지시되도록, 유전자 조직(즉, 분자 생물학 기법)에 의해 유전자에 병치되어 위치되는 것이다. "이종성" 제어 서열은 유전자 조작 중인 세포와 상이한 종으로부터의 외인성 서열이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "프로모터"는 RNA 중합효소가 결합하는 폴리뉴클레오타이드(DNA 또는 RNA)의 인식 부위를 지칭한다. RNA 중합효소는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오타이드를 개시하고 전사한다. 특정 실시형태에서, 포유류 세포에서 작동성인 프로모터는 전사가 개시된 부위로부터 상류의 대략 25 내지 30개 염기에 위치된 AT-풍부 영역 및/또는 전사 시작으로부터 상류의 70 내지 80개 염기에서 발견되는 다른 서열, 즉, CNCAAT 영역을 포함하며, 여기서 N은 임의의 뉴클레오타이드일 수 있다.
용어 "인핸서"는 향상된 전사를 제공할 수 있는 서열을 함유하는 DNA 세그먼트를 지칭하며, 일부 예에서, 다른 제어 서열에 대한 이들의 배향과 독립적으로 작용할 수 있다. 인핸서는 프로모터 및/또는 다른 인핸서 요소와 협응적으로 또는 상가적으로 작용할 수 있다. 용어 "프로모터/인핸서"는 프로모터와 인핸서 기능을 둘 다 제공할 수 있는 서열을 함유하는 DNA의 세그먼트를 지칭한다.
용어 "작동 가능하게 연결된"은 기재된 성분이 이들의 의도된 방식으로 작용하는 것을 가능하게 하는 병치를 지칭한다. 일 실시형태에서, 상기 용어는 핵산 발현 제어 서열(예컨대 프로모터, 및/또는 인핸서), 및 제2 폴리뉴클레오타이드 서열, 예를 들어, 관심 대상의 폴리뉴클레오타이드 사이의 기능적 연결을 지칭하며, 발현 제어 서열은 제2 서열에 대응하는 핵산의 전사를 지시한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "구성적 발현 제어 서열"은 작동 가능하게 연결된 서열의 전사를 지속적으로 또는 계속해서 가능하게 하는 프로모터, 인핸서 또는 프로모터/인핸서를 지칭한다. 구성적 발현 제어 서열은 매우 다양한 세포 및 조직 유형에서 발현을 가능하게 하는 "편재하는" 프로모터, 인핸서 또는 프로모터/인핸서 또는 각각, 제한된 다양성의 세포 및 조직 유형에서 발현을 가능하게 하는 "세포 특이적", "세포 유형 특이적", "세포 계통 특이적" 또는 "조직 특이적" 프로모터, 인핸서, 또는 프로모터/인핸서일 수 있다.
본 발명의 특정 실시형태에서 사용하기에 적합한 예시적인 편재하는 발현 제어 서열은 거대세포바이러스(CMV) 급초기 프로모터, 바이러스 유인원 바이러스 40(SV40)(예를 들어, 초기 또는 후기), 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(MoMLV) LTR 프로모터, 라우스 육종 바이러스(RSV) LTR, 단순 포진 바이러스(HSV)(티미딘 키나제) 프로모터, 백시니아 바이러스로부터의 H5, P7.5 및 P11 프로모터, 연장 인자 1-알파(EF1a) 프로모터, 초기 성장 반응 1(EGR1), 페리틴 H(FerH), 페리틴 L(FerL), 글리세르알데하이드 3-인산염 탈수소효소(GAPDH), 진핵생물 번역 개시 인자 4A1(EIF4A1), 열 충격 70kDa 단백질 5(HSPA5), 열 충격 단백질 90kDa 베타, 구성원 1(HSP90B1), 열 충격 단백질 70kDa(HSP70), β-키네신(β-KIN), 인간 ROSA 26 좌위(Irions et al., Nature Biotechnology 25, 1477 - 1482 (2007)), 유비퀴틴 C 프로모터(UBC), 포스포글리세레이트 키나제-1(PGK) 프로모터, 거대세포바이러스 인핸서/닭 β-액틴(CAG) 프로모터, β-액틴 프로모터 및 골수증식성 육종 바이러스 인핸서, 결실된 음성 제어 영역, dl587rev 프라이머-결합 부위 치환된(MND) 프로모터를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다(Challita et al., J Virol. 69(2):748-55 (1995)).
일 실시형태에서, 본 발명의 벡터는 MND 프로모터를 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 벡터는 인간 EF1a 유전자의 제1 인트론을 포함하는 EF1a 프로모터를 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 벡터는 인간 EF1a 유전자의 제1 인트론을 결여하는 EF1a 프로모터를 포함한다.
특정 실시형태에서, T 세포 특이적 프로모터로부터의 CAR을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 발현시키는 것이 바람직할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은, "조건적 발현"은 유도성 발현; 억제 가능한 발현; 특정 생리학적, 생물학적 또는 질환 상태를 갖는 세포 또는 조직 내 발현 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 조건적 발현의 임의의 유형을 지칭할 수 있다. 본 정의는 세포 유형 또는 조직 특이적 발현을 제외하는 것으로 의도되지 않는다. 본 발명의 특정 실시형태는 관심 대상의 폴리뉴클레오타이드의 조건적 발현을 제공하며, 예를 들어, 발현은 세포, 조직, 유기체 등에 폴리펩타이드가 발현되게 하거나 또는 관심 대상의 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되는 폴리뉴클레오타이드 발현의 증가 또는 감소를 야기하는 처리 또는 조건을 실시함으로써 제어된다.
유도성 프로모터/시스템의 예시적인 예는 스테로이드-유도성 프로모터, 예컨대 글루코코르티코이드 또는 에스트로겐 수용체를 암호화하는 유전자에 대한 프로모터(대응하는 호르몬에 의한 처리에 의해 유도성), 메탈로티오닌 프로모터(다양한 중금속에 의한 처리에 의해 유도성), MX-1 프로모터(인터페론에 의해 유도성), 문헌["GeneSwitch" mifepristone-regulatable system (Sirin et al., 2003, Gene, 323:67)], 큐메이트 유도성 유전자 스위치(WO 2002/088346), 테트라사이클린-의존적 조절 시스템 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
조건적 발현은 또한 부위 특이적 DNA 재조합효소를 이용함으로써 달성될 수 있다. 본 발명의 특정 실시형태에 따르면, 벡터는 부위 특이적 재조합효소에 의해 매개되는 재조합을 위해 적어도 1개의(전형적으로 2개의) 부위(들)를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "재조합효소" 또는 "부위 특이적 재조합효소"는 삭제 또는 통합 단백질, 효소, 보인자 또는 하나 이상의 재조합 부위(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 7, 10, 12, 15, 20, 30, 50개 등)를 수반하는 재조합 반응에 관련된 연관 단백질을 포함하며, 이는 야생형 단백질(예를 들어, 문헌[Landy, Current Opinion in Biotechnology 3:699-707 (1993)]), 또는 돌연변이체, 유도체(예를 들어, 재조합 단백질 서열 또는 이의 단편을 함유하는 융합 단백질), 이의 단편, 및 변이체일 수 있다. 본 발명의 특정 실시형태에서 사용하기에 적합한 재조합효소의 예시적 예는 Cre, Int, IHF, Xis, Flp, Fis, Hin, Gin, ΦC31, Cin, Tn3 resolvase, TndX, XerC, XerD, TnpX, Hjc, Gin, SpCCE1 및 ParA를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
벡터는 임의의 다양한 부위 특이적 재조합효소에 대한 하나 이상의 재조합 부위를 포함할 수 있다. 부위 특이적 재조합효소에 대한 표적 부위는 벡터, 예를 들어, 레트로바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터의 통합에 필요한 임의의 부위(들)에 추가된다는 것이 이해되어야 한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "재조합 서열", "재조합 부위" 또는 "부위 특이적 재조합 부위"는 재조합효소가 인식하고 결합하는 특정 핵산 서열을 지칭한다.
예를 들어, Cre 재조합효소에 대한 하나의 재조합 부위는 8개의 염기쌍 코어 서열에 측접하는 2개의 13개 염기쌍 역 반복부(재조합효소 결합 부위로서 작용)를 포함하는 34개 염기쌍인 loxP이다(문헌[Sauer, B., Current Opinion in Biotechnology 5:521-527 (1994)]의 도 1 참조). 다른 예시적인 loxP 부위는 lox511 (Hoess et al., 1996; Bethke and Sauer, 1997), lox5171(Lee and Saito, 1998), lox2272(Lee and Saito, 1998), m2(Langer et al., 2002), lox71(Albert et al., 1995) 및 lox66(Albert et al., 1995)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
FLP 재조합효소에 대한 적합한 인식 부위는 FRT(McLeod, et al., 1996), F1, F2, F3(Schlake and Bode, 1994), F4, F5(Schlake and Bode, 1994), FRT(LE) (Senecoff et al., 1988), FRT(RE)(Senecoff et al., 1988)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
인식 서열의 다른 예는 재조합효소 λ 인테그라제, 예를 들어, 파이-c31에 의해 인식되는 attB, attP, attL 및 attR 서열이다. φC31 SSR은 이형 부위 attB(길이가 34개의 bp) 내지 attP(길이가 39 bp) 사이에서만 재조합을 매개한다(Groth et al., 2000). 박테리아 및 파지 게놈 각각에 대한 파지 인테그라제에 대한 부착 부위에 대해 명명되는 attB 및 attP는 둘 다 φC31 동종이량체에 의해 결합될 가능성이 있는 불완전 역 반복부를 함유한다(Groth et al., 2000). 산물 부위인 attL 및 attR은 추가적인 φC31-매개 재조합(Belteki et al., 2003)에 대해 효과적으로 비활성이 되어, 반응을 비가역적으로 만든다. 삽입을 촉매하기 위해, attB-보유 DNA는 게놈 attB 부위보다 게놈 attP 부위에 더 용이하게 삽입된다는 것이 발견되었다(Thyagarajan et al., 2001; Belteki et al., 2003). 따라서, 전형적인 전략은 상동성 재조합에 의해 attP-보유 "도킹 부위"를 정해진 좌위에 위치시키고, 이어서, 삽입을 위한 attB-보유 유입 서열과 짝을 이룬다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은, "내부 리보솜 유입 부위" 또는 "IRES"는 시스트론(단백질 암호화 영역)의 개시 코돈, 예컨대 ATG에 대한 직접적인 내부 리보솜 유입을 촉진시킴으로써, 유전자의 캡-의존적 번역을 야기하는 요소를 지칭한다. 예를 들어, 문헌[Jackson et al., 1990. Trends Biochem Sci 15(12):477-83) 및 Jackson and Kaminski. 1995. RNA 1(10):985-1000] 참조. 특정 실시형태에서, 본 발명에 의해 상정된 벡터는 하나 이상의 폴리펩타이드를 암호화하는 하나 이상의 관심 대상의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 특정 실시형태에서, 각각의 복수의 폴리펩타이드의 효율적인 번역을 달성하기 위해, 폴리뉴클레오타이드 서열은 하나 이상의 IRES 서열 또는 자기-절단성 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 분리될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "코작 서열"은 리보솜의 작은 서브유닛에 대한 mRNA의 초기 결합을 크게 용이하게 하고, 번역을 증가시키는 짧은 뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. 공통 코작 서열은 (GCC)RCCATGG이며, R은 퓨린(A 또는 G)이다(문헌[Kozak, 1986. Cell. 44(2):283-92, 및 Kozak, 1987. Nucleic Acids Res. 15(20):8125-48]). 특정 실시형태에서, 본 발명에 의해 상정된 벡터는 공통 코작 서열을 갖고, 목적하는 폴리펩타이드, 예를 들어, CAR을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
본 발명의 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드를 보유하는 세포는 직접적인 독성 및/또는 비제어 증식의 위험을 감소시키기 위한 유도성 자살 유전자를 포함하는, 자살 유전자를 이용한다. 구체적 양상에서, 자살 유전자는 폴리뉴클레오타이드 또는 세포를 보유하는 숙주에 대해 면역원성이 아니다. 사용될 수 있는 자살 유전자의 특정 예는 카스파제-9 또는 카스파제-8 또는 사이토신 데아미나제이다. 카스파제-9는 이량체의 구체적 화학적 유도제(CID)를 이용하여 활성화될 수 있다.
특정 실시형태에서, 벡터는 본 발명의 면역 효과기 세포, 예를 들어, 생체내에서 음성 선택의 영향을 받기 쉬운 T 세포를 야기하는 유전자 세그먼트를 포함한다. "음성 선택"은 주입된 세포가 개체의 생체내 병태에서 변화 결과로서 제거될 수 있다는 것을 의미한다. 음성 선택 가능한 표현형은 투여되는 제제, 예를 들어, 화합물에 민감성을 부여하는 유전자의 삽입으로부터 초래될 수 있다. 음성 선택 가능 유전자는 당업계에 공지되어 있으며, 특히 다음을 포함한다: 간시클로비어 민감성을 부여하는 단순 포진 바이러스 I형 티미딘 키나제(HSV-I TK) 유전자(Wigler et al., Cell 11:223, 1977); 세포의 하이포잔틴 포스포리보실트랜스퍼라제(HPRT) 유전자, 세포의 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제(APRT) 유전자 및 박테리아 사이토신 데아미나제(Mullen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:33 (1992)).
일부 실시형태에서, 유전자 변형된 면역 효과기 세포, 예컨대 T 세포는 생체내에서 음성 선택 가능 표현형 세포의 선택을 가능하게 하는 양성 마커를 추가로 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 양성 선택 가능 마커는 숙주 세포 내로 도입 시 유전자를 운반하는 세포의 양성 선택을 허용하는 우성 표현형을 발현시키는 유전자일 수 있다. 이 유형의 유전자는 당업계에 공지되어 있고, 특히, 하이그로마이신 B에 대한 내성을 부여하는 하이그로마이신-B 포스포트랜스퍼라제 유전자(hph), 항생제 G418에 대한 내성을 암호화하는 Tn5로부터의 아미노 글리코사이드 포스포트랜스퍼라제 유전자(neo 또는 aph), 다이하이드로폴레이트 환원효소(DHFR) 유전자, 아데노신 데아미나제 유전자(ADA), 및 다재약물 내성(MDR) 유전자를 포함한다.
바람직하게는, 양성 선택 가능 마커 및 음성 선택 가능 요소는 음성 선택 가능 요소의 상실이 필수적으로 또한 양성 선택 가능 마커의 상실을 수반하도록 연결된다. 훨씬 더 바람직하게는, 양성 및 음성 선택 가능 마커는 하나의 상실이 다른 것의 상실을 필수적으로 야기하도록 융합된다. 상기 기재한 목적하는 양성 및 음성 선택 특징을 둘 다 부여하는 폴리펩타이드를 발현 산물로서 수득하는 융합된 폴리뉴클레오타이드의 예는 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제 티미딘 키나제 융합 유전자(HyTK)이다. 이 유전자의 발현은 시험관내 양성 선택을 위해 하이그로마이신 B 내성 및 생체내 음성 선택을 위해 간사이클로비어 민감성을 부여하는 폴리펩타이드를 수득한다. 문헌[Lupton S. D., et al, Mol. 및 Cell. Biology 1 1:3374- 3378, 1991] 참조. 추가로, 바람직한 실시형태에서, 키메라 수용체를 암호화하는 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 융합 유전자, 특히 시험관내 양성 선택을 위해 하이그로마이신 B 내성 및 생체내 음성 선택을 위해 간시클로비어 민감성을 부여하는 것을 함유하는 레트로바이러스 벡터, 예를 들어 문헌[Lupton, S. D. et al. (1991), 상기 참조]에 기재된 HyTK 레트로바이러스 벡터에 있다. 또한 음성 선택 가능 마커와 우성 양성 선택 가능 마커를 융합하는 것으로부터 유래된 2작용성 선택 가능 융합 유전자의 용도를 기재하는 S. D. Lupton에 의한 PCT US91/08442 및 PCT/US94/05601의 공보를 참조한다.
바람직한 양성 선택 가능 마커는 hph, nco 및 gpt로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자로부터 유래되고, 바람직한 음성 선택 가능 마커는 사이토신 데아미나제, HSV-I TK, VZV TK, HPRT, APRT 및 gpt로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자로부터 유래된다. 특히 바람직한 마커는 2작용성의 선택 가능한 융합 유전자이되, 양성 선택 가능 마커는 hph 또는 neo로부터 유래되고, 음성 선택 가능 마커는 사이토신 데아미나제 또는 TK 유전자 또는 선택 가능 마커로부터 유래된다.
바이러스 벡터
특정 실시형태에서, 세포(예를 들어, 면역 효과기 세포)는 CAR을 암호화하는 레트로바이러스 벡터, 예를 들어, 렌티바이러스 벡터에 의해 형질도입된다. 예를 들어, 면역 효과기 세포는 BCMA 폴리펩타이드에 결합하는 뮤린 항-BCMA 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 CD3ζ, CD28, 4-1BB, Ox40, 또는 이들의 임의의 조합물의 세포내 신호전달 도메인과 함께 포함하는 CAR을 암호화하는 벡터에 의해 형질도입된다. 따라서, 이들 형질도입 세포는 CAR-매개 세포독성 반응을 유발할 수 있다.
레트로바이러스는 유전자 전달을 위한 통상적인 도구이다(Miller, 2000, Nature. 357: 455-460). 특정 실시형태에서, 레트로바이러스는 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 세포에 전달하는 데 사용된다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "레트로바이러스"는 게놈 RNA를 선형 이중 가닥 DNA 복제물로 역전사하고, 후속적으로 게놈 DNA를 숙주 게놈에 공유적으로 통합하는 RNA 바이러스를 지칭한다. 일단 바이러스가 숙주 게놈에 통합되면, 이는 "프로바이러스"로서 지칭된다. 프로바이러스는 RNA 중합효소 II에 대한 주형으로서 작용하고, 새로운 바이러스 입자를 생성하는 데 필요한 구조적 단백질 및 효소를 암호화하는 RNA 분자의 발현을 지시한다.
특정 실시형태에서 사용하기에 적합한 예시적인 레트로바이러스는 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(MMuLV), 몰로니 뮤린 육종 바이러스(MoMSV), Harvey 뮤린 육종 바이러스(HaMuSV), 뮤린 유선 종양 바이러스(MuMTV), 깁본 유인원 백혈병 바이러스(GaLV), 고양이 백혈병 바이러스(FLV), 스푸마바이러스, 프렌드 뮤린 백혈병 바이러스, 뮤린 줄기 세포 바이러스(MSCV) 및 라우스 육종 바이러스(RSV)) 및 렌티바이러스를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "렌티바이러스"는 복합 레트로바이러스의 그룹(또는 속)을 지칭한다. 예시적인 렌티바이러스는 HIV(인간 면역결핍 바이러스; HIV 1형, 및 HIV 2형을 포함); 비스나-메디 바이러스(VMV) 바이러스; 염소-관절염-뇌염 바이러스(CAEV); 말 전염성 빈혈 바이러스(EIAV); 고양이 면역결핍 바이러스(FIV); 소 면역결핍 바이러스(BIV); 및 유인원 면역결핍 바이러스(SIV)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 일 실시형태에서, HIV 기반 벡터 골격(즉, HIV 시스-작용성 서열 요소)이 바람직하다. 특정 실시형태에서, 렌티바이러스는 CAR을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 세포에 전달하는 데 사용된다.
레트로바이러스 벡터 및 더 구체적으로는 렌티바이러스 벡터가 본 발명의 특정 실시형태를 실행하는 데 사용될 수 있다. 따라서, 본 명세서에서 사용되는 용어 "레트로바이러스" 또는 "레트로바이러스 벡터"는 각각 "렌티바이러스" 및 "렌티바이러스 벡터"를 포함하는 것을 의미한다.
용어 "벡터"는 다른 핵산 분자를 전달하거나 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭하기 위해 본 명세서에서 사용된다. 전달된 핵산은 일반적으로, 벡터 핵산 분자에 연결되고, 예를 들어, 벡터 핵산 분자 내에 삽입된다. 벡터는 세포에서 자율 복제를 지시하는 서열을 포함할 수 있거나, 숙주 세포 DNA 내로의 통합을 가능하게 하는 데 충분한 서열을 포함할 수 있다. 유용한 벡터는, 예를 들어, 플라스미드(예를 들어, DNA 플라스미드 또는 RNA 플라스미드), 트랜스포존, 코스미드, 박테리아 인공 염색체 및 바이러스 벡터를 포함한다. 유용한 바이러스 벡터는, 예를 들어, 복제 결함 레트로바이러스 및 렌티바이러스를 포함한다.
당업자에게 분명한 바와 같이, 용어 "바이러스 벡터"는 세포의 게놈 내로 또는 핵산 전달을 매개하는 바이러스 입자에 핵산 분자의 전달 또는 통합을 용이하게 하는 바이러스-유래 핵산을 포함하는 핵산 분자(예를 들어, 전달 플라스미드) 중 하나를 지칭하기 위해 널리 사용된다. 바이러스 입자는 전형적으로 핵산(들)에 추가로 다양한 바이러스 성분 및 때때로 또한 숙주 세포 성분을 포함할 것이다.
용어 바이러스 벡터는 세포 내로 또는 전달된 핵산 그 자체에 핵산을 전달할 수 있는 바이러스 또는 바이러스 입자를 지칭할 수 있다. 바이러스 벡터 및 전달 플라스미드는 주로 바이러스로부터 유래된 구조적 및/또는 기능적 유전자 요소를 함유한다. 용어 "레트로바이러스 벡터"는 주로 레트로바이러스로부터 유래된 구조적 및 기능적 유전자 요소 또는 이의 일부를 함유하는 바이러스 벡터 또는 플라스미드를 지칭한다. 용어 "렌티바이러스 벡터"는 주로 렌티바이러스로부터 유래된 LTR을 포함하는 구조적 및 기능적 유전자 요소 또는 이의 일부를 함유하는 바이러스 벡터 또는 플라스미드를 지칭한다. 용어 "혼성체 벡터"는 레트로바이러스, 예를 들어, 렌티바이러스 서열 및 비-렌티바이러스 서열을 둘 다 함유하는 벡터, LTR 또는 다른 핵산을 지칭한다. 일 실시형태에서, 혼성체 벡터는 역전사, 복제, 통합 및/또는 패키징을 위한 레트로바이러스, 예를 들어, 렌티바이러스 서열을 포함하는 벡터 또는 전달 플라스미드를 지칭한다.
특정 실시형태에서, 용어 "렌티바이러스 벡터" 및 "렌티바이러스 발현 벡터"는 렌티바이러스 전달 플라스미드 및/또는 전염성 렌티바이러스 입자를 지칭하기 위해 사용될 수 있다. 본 명세서에서 클로닝 부위, 프로모터, 조절 요소, 이종성 핵산 등과 같은 요소를 참조로 하는 경우, 이들 요소의 서열은 본 발명의 렌티바이러스 입자에서 RNA 형태에 존재하고, 본 발명의 DNA 플라스미드에서 DNA 형태로 존재한다는 것이 이해되어야 한다.
프로바이러스의 각각의 말단에 "긴 말단 반복부" 또는 "LTR"로 불리는 구조가 있다. 용어 "긴 말단 반복부(LTR)"는 이들의 천연 서열 맥락에서, 직접 반복부이며 U3, R 및 U5 영역을 함유하는 레트로바이러스 DNA의 말단에 위치된 염기쌍의 도메인을 지칭한다. LTR은 일반적으로 레트로바이러스 유전자의 발현에 필수적인 기능(예를 들어, 유전자 전사체의 촉진, 개시 및 폴리아데닐화) 및 바이러스 복제에 필수적인 기능을 제공한다. LTR은 전사 제어 요소, 폴리아데닐화 신호 및 바이러스 게놈의 복제 및 통합에 필요한 서열을 포함하는 수많은 조절 신호를 함유한다. 바이러스 LTR은 U3, R 및 U5로 불리는 3개의 영역으로 나누어진다. U3 영역은 인핸서 및 프로모터 요소를 포함한다. U5 영역은 프라이머 결합 부위 와 R 영역 사이의 서열이며, 폴리아데닐화 서열을 포함한다. R(반복부) 영역은 U3 및 U5 영역에 측접한다. LTR은 U3, R 및 U5 영역으로 구성되고, 바이러스 게놈의 5' 및 3' 말단 둘 다에서 나타난다. 게놈(tRNA 프라이머 결합 부위)의 역전사에 필요한 서열 및 입자(Psi 부위) 내로의 바이러스 RNA의 효율적인 패키징에 필요한 서열이 5' LTR에 인접해 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "패키징 신호" 또는 "패키징 서열"은 바이러스 캡시드 또는 입자 내로의 바이러스 RNA의 삽입에 필요한 레트로바이러스 게놈 내에 위치된 서열을 지칭한다, 예를 들어, 문헌[Clever et al., 1995. J. of Virology, Vol. 69, No. 4; pp. 2101-2109] 참조. 몇몇 레트로바이러스 벡터는 바이러스 게놈의 캡시드화에 필요한 최소 패키징 신호(또한 프사이[Ψ] 서열로도 지칭됨)를 사용한다. 따라서, 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "패키징 서열", "패키징 신호," "프사이" 및 기호 "Ψ"는 바이러스 입자 형성 동안 레트로바이러스 RNA 가닥의 캡시드화에 필요한 비암호화 서열에 대해 사용된다.
다양한 실시형태에서, 벡터는 변형된 5' LTR 및/또는 3' LTR을 포함한다. LTR 중 하나 또는 둘 다는 하나 이상의 결실, 삽입 또는 치환을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 하나 이상의 변형을 포함할 수 있다. 바이러스 복제 결함을 제공함으로써 렌티바이러스 또는 레트로바이러스 시스템의 안전성을 개선시키기 위해 종종 3' LTR의 변형이 이루어진다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "복제-결함"은 전염성 비리온이 생성되지 않도록 완전하고, 효과적인 복제를 할 수 없는 바이러스(예를 들어, 복제-결함 렌티바이러스 자손)를 지칭한다. 용어 "복제-적격"은 바이러스의 바이러스 복제가 전염성 비리온(예를 들어, 복제-적격 렌티바이러스 자손)을 생성할 수 있도록 복제할 수 있는 돌연변이체 바이러스 또는 야생형 바이러스를 지칭한다.
"자기-비활성화"(SIN) 벡터는 복제-결함 벡터, 예를 들어, 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터를 지칭하며, U3 영역으로서 알려진 우측(3') LTR 인핸서-프로모터 영역은 바이러스 복제의 제1 라운드 이후에 (예를 들어, 결실 또는 치환에 의해) 바이러스 전사를 방지하도록 변형되었다. 이는 우측(3') LTR U3 영역은 바이러스 복제 동안 좌측(5') LTR U3 영역에 대한 주형으로서 사용되고, 따라서, 바이러스 전사체는 U3 인핸서-프로모터 없이 생성될 수 없기 때문이다. 본 발명의 추가 실시형태에서, U5 영역이, 예를 들어, 이상적인 폴리(A) 서열로 대체되도록, 3' LTR이 변형된다. LTR에 대한 변형, 예컨대 3' LTR, 5' LTR, 또는 3'과 5' LTR 둘 다에 대한 변형이 또한 본 발명에 포함된다는 것을 주목하여야 한다.
추가적인 안전성 향상은 바이러스 입자의 생성 동안 5' LTR의 U3 영역을 이종성 프로모터로 대체하여 바이러스 게놈의 전사를 유도함으로써 제공된다. 사용될 수 있는 이종성 프로모터의 예는, 예를 들어, 바이러스 유인원 바이러스 40 (SV40)(예를 들어, 초기 또는 후기), 거대세포바이러스(CMV)(예를 들어, 급초기), 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(MoMLV), 라우스 육종 바이러스(RSV), 및 단순 포진 바이러스(HSV)(티미딘 키나제) 프로모터를 포함한다. 전형적인 프로모터는 Tat-독립적 방식으로 고수준의 전사를 유도할 수 있다. 이 대체는 복제-적격 바이러스를 생성하는 재조합 확률을 감소시키는데, 바이러스 생성 시스템에 완전한 U3 서열이 없기 때문이다. 특정 실시형태에서, 이종성 프로모터는 바이러스 게놈이 전사되는 방식을 제어하는 것의 추가적인 이점이 있다. 예를 들어, 바이러스 게놈의 모두 또는 일부의 전사가 존재하도록, 이종성 프로모터는 유도성일 수 있다. 유도 인자는 하나 이상의 화학적 화합물 또는 생리적 조건, 예컨대 숙주 세포가 배양되는 온도 또는 pH를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, 바이러스 벡터는 TAR 요소를 포함한다. 용어 "TAR"은 렌티바이러스(예를 들어, HIV) LTR의 R 영역에 위치된 "전사 활성화 반응" 유전자 요소를 지칭한다. 이 요소는 바이러스 복제를 향상시키기 위해 렌티바이러스 전사 활성체(tat) 유전자 요소와 상호작용한다. 그러나, 이 요소는 5' LTR의 U3 영역이 이종성 프로모터에 의해 대체되는 실시형태에서 필요하지 않다.
"R 영역"은 캡핑기의 개시(즉, 전사 개시) 시 시작하고, 폴리 A 관의 개시 직전에 종료되는 레트로바이러스 LTR 내의 영역을 지칭한다. R 영역은 또한 U3 및 U5 영역에 측접되는 것으로 정의된다. R 영역은 게놈의 한쪽 말단으로부터 다른 쪽 말단까지 발생기 DNA의 전달을 가능하게 함에 있어서 역전사 동안에 어떤 역할을 한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "FLAP 요소"는 서열이 레트로바이러스, 예를 들어, HIV-1 또는 HIV-2의 중심 폴리퓨린관 및 중심 종료 서열(cPPT 및 CTS)을 포함하는 핵산을 지칭한다. 적합한 FLAP 요소는 미국 특허 제6,682,907호 및 문헌[Zennou, et al., 2000, Cell, 101:173]에 기재되어 있다. HIV-1 역전사 동안, 중심 폴리퓨린 관(cPPT)에서 플러스-가닥 DNA의 중심 개시 및 중심 종료 서열(CTS)에서의 중심 종료는 3-가닥 DNA 구조: HIV-1 중심 DNA 플랩의 형성을 야기한다. 임의의 이론으로 구속되는 것을 바라지는 않지만, DNA 플랩은 렌티바이러스 게놈 핵 유입(import)의 시스-활성 결정소로서 작용할 수 있고/있거나 바이러스 역가를 증가시킬 수 있다. 특정 실시형태에서, 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터 골격은 벡터에서 관심 대상의 이종성 유전자의 상류 또는 하류에 하나 이상의 FLAP 요소를 포함한다. 예를 들어, 특정 실시형태에서 전달 플라스미드는 FLAP 요소를 포함한다. 일 실시형태에서, 본 발명의 벡터는 HIV-1로부터 단리된 FLAP 요소를 포함한다.
일 실시형태에서, 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 전달 벡터는 하나 이상의 유출(export) 요소를 포함한다. 용어 "유출 요소"는 세포의 핵으로부터 세포질까지 RNA 전사체 수송을 조절하는 시스 작용성 전사 후 조절 요소를 지칭한다. RNA 유출 요소의 예는 인간 면역결핍 바이러스(HIV) rev 반응 요소(RRE)(예를 들어, 문헌[Cullen et al., 1991. J. Virol. 65: 1053; 및 Cullen et al., 1991. Cell 58: 423] 참조), 및 B형 간염 전사후 조절 요소(HPRE)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 일반적으로, RNA 유축 요소는 유전자의 3' UTR에 위치되고, 하나 또는 다중 복제물로서 삽입될 수 있다.
특정 실시형태에서, 바이러스 벡터 내 이종성 서열의 발현은 전사후 조절 요소, 효율적인 폴리아데닐화 부위 및 선택적으로, 전사 종료 신호를 벡터 내로 혼입함으로써 증가된다. 다양한 전사후 조절 요소는 단백질에서 이종성 핵산, 예를 들어, 마멋 간염 바이러스 전사 후 조절 요소(WPRE; Zufferey et al., 1999, J. Virol., 73:2886); B형 간염 바이러스(HPRE)에 존재하는 전사후 조절 요소(Huang et al., Mol. Cell. Biol., 5:3864); 등(Liu et al., 1995, Genes Dev., 9:1766)의 발현을 증가시킨다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 벡터는 전사후 조절 요소, 예컨대 WPRE 또는 HPRE를 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 벡터는 전사후 조절 요소(PTE), 예컨대 WPRE 또는 HPRE를 결여하거나, 포함하지 않는데, 일부 예에서 이들 요소가 세포 형질전환 위험을 증가시키고/시키거나 mRNA 전사체의 양을 실질적으로 또는 유의하게 증가시키지 않거나 mRNA 안정성을 증가시키기 때문이다. 따라서, 일부 실시형태에서, 본 발명의 벡터는 PTE를 결여하거나 포함하지 않는다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 벡터는 부가된 안전성 척도로서의 WPRE 또는 HPRE를 결여하거나 포함하지 않는다.
이종성 핵산 전사체의 효율적인 종결 및 폴리아데닐화를 지시하는 요소는 이종성 유전자 발현을 증가시킨다. 전사 종결 신호는 일반적으로 폴리아데닐화 신호 하루에서 발견된다. 특정 실시형태에서, 벡터는 발현될 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 폴리아데닐화 서열 3'을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "폴리A 부위" 또는 "폴리A 서열"은 RNA 중합효소 II에 의한 발생기 RNA 전사체의 종결과 폴리아데닐화를 둘 다 지시하는 DNA 서열을 나타낸다. 폴리아데닐화 서열은 암호화 서열의 3' 말단에 대한 폴리A 꼬리의 첨가에 의해 mRNA 안정성을 촉진시킬 수 있고, 따라서, 증가된 번역 효율에 기여한다. 폴리 A 꼬리가 없는 전사체는 불안정하고 빠르게 분해되기 때문에 재조합 전사체의 효율적인 폴리아데닐화는 바람직하다. 본 발명의 벡터에서 사용될 수 있는 폴리A 신호의 예시적인 예는 이상적인 폴리A 서열(예를 들어, AATAAA, ATTAAA, AGTAAA), 소 성장 호르몬 폴리A 서열(BGHpA), 토끼 β-글로빈 폴리A 서열(rβgpA), 또는 당업계에 공지된 다른 적합한 이종성 또는 내인성 폴리A 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터는 하나 이상의 절연체 요소를 추가로 포함한다. 절연체 요소는 통합 부위 효과로부터, 게놈 DNA에 존재하는 시스 작용성 요소에 의해 매개될 수 있고 전달된 서열의 통제된 발현을 야기하는 렌티바이러스-발현 서열, 예를 들어, 치료 폴리펩타이드 보호에 기여할 수 있다(즉, 위치 효과; 예를 들어, 문헌[Burgess-Beusse et al., 2002, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 99:16433; 및 Zhan et al., 2001, Hum. Genet., 109:471] 참조). 일부 실시형태에서, 전달 벡터는 프로바이러스의 통합 시 숙주 게놈 내로 하나 이상의 절연체 요소 3' LTR을 포함하고, 프로바이러스는 5' LTR 또는 3' LTR 둘 다에서, 중복되는 3' LTR에 의해 하나 이상의 절연체를 포함한다. 본 발명에서 사용하기 위한 적합한 절연체는 닭 β-글로빈 절연체를 포함하지만, 이것으로 제한되지 않는다(본 명세서에 참조에 의해 원용되는 문헌[Chung et al., 1993. Cell 74:505; Chung et al., 1997. PNAS 94:575]; 및 문헌[Bell et al., 1999. Cell 98:387] 참조). 절연체 요소의 예는 β-글로빈 좌위, 예컨대 닭 HS4로부터의 절연체를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 발명의 특정 구체적 실시형태에 따르면, 대부분 또는 모든 바이러스 벡터 골격 서열은 렌티바이러스, 예를 들어, HIV-1로부터 유래된다. 그러나, 레트로바이러스 및/또는 렌티바이러스 서열의 다수의 상이한 공급원이 사용되거나, 조합될 수 있고, 특정 렌티바이러스 서열에서 수많은 치환 및 변경은 본 명세서에 기재된 기능을 수행하는 전달 벡터의 능력을 손상시키는 일 없이 수용될 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 게다가, 다양한 렌티바이러스 벡터는 당업계에 공지되어 있으며(문헌[Naldini et al., (1996a, 1996b, and 1998); Zufferey et al., (1997); Dull et al., 1998, 미국 특허 제6,013,516호; 및 제5,994,136호 참조]), 이들 중 다수는 본 발명의 바이러스 벡터 또는 전달 플라스미드를 생성하는 데 적합할 수 있다.
다양한 실시형태에서, 본 발명의 벡터는 CAR 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함한다. 벡터는 하나 이상의 LTR을 가질 수 있되, LTR은 하나 이상의 변형, 예컨대 하나 이상의 뉴클레오타이드 치환, 첨가 또는 결실을 포함한다. 벡터는 형질도입 효율을 증가시키기 위한 하나 이상의 부속 요소(예를 들어, cPPT/FLAP), 바이러스 패키징(예를 들어, 프사이(Ψ) 패키징 신호, RRE) 및/또는 치료적 유전자 발현(예를 들어, 폴리(A) 서열)을 증가시키고, WPRE 또는 HPRE를 선택적으로 포함할 수 있는 다른 요소를 추가로 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 전달 벡터는 좌측(5') 레트로바이러스 LTR; 중심 폴리퓨린관/DNA 플랩(cPPT/FLAP); 레트로바이러스 유출 요소; 본 명세서에 상정된 CAR 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 T 세포에서 활성인 프로모터; 및 우측(3') 레트로바이러스 LTR; 및 선택적으로 WPRE 또는 HPRE를 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 전달 벡터는 좌측 (5') 레트로바이러스 LTR; 레트로바이러스 유출 요소; 본 명세서에 상정된 CAR 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 T 세포에서 활성인 프로모터; 우측(3') 레트로바이러스 LTR; 및 폴리(A) 서열; 및 선택적으로 WPRE 또는 HPRE를 포함한다. 다른 특정 실시형태에서, 본 발명은 좌측 (5') LTR; cPPT/FLAP; RRE; 본 명세서에 상정된 CAR 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 T 세포에서 활성인 프로모터; 우측 (3') LTR; 및 폴리아데닐화 서열; 및 선택적으로 WPRE 또는 HPRE를 포함하는 렌티바이러스 벡터를 제공한다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 좌측(5') HIV-1 LTR; 프사이(Ψ) 패키징 신호; cPPT/FLAP; RRE; 본 명세서에 상정된 CAR 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 T 세포에서 활성인 프로모터; 우측(3') 자기-비활성화(SIN) HIV-1 LTR; 및 토끼 β-글로빈 폴리아데닐화 서열; 및 선택적으로 WPRE 또는 HPRE를 포함하는 렌티바이러스 벡터를 제공한다.
다른 실시형태에서, 본 발명은 적어도 하나의 LTR; 중심 폴리퓨린관/DNA 플랩(cPPT/FLAP); 레트로바이러스 유출 요소; 및 본 명세서에 상정된 CAR 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 T 세포에서 활성인 프로모터; 및 선택적으로 WPRE 또는 HPRE를 포함하는 벡터를 제공한다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 적어도 하나의 LTR; cPPT/FLAP; RRE; 본 명세서에 상정된 CAR 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 T 세포에서 활성인 프로모터; 및 폴리아데닐화 서열; 및 선택적으로 WPRE 또는 HPRE를 포함하는 벡터를 제공한다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 적어도 하나의 SIN HIV-1 LTR; 프사이(Ψ) 패키징 신호; cPPT/FLAP; RRE; 본 명세서에 상정된 CAR 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 T 세포에서 활성인 프로모터; 및 토끼 β-글로빈 폴리아데닐화 서열; 및 선택적으로 WPRE 또는 HPRE를 제공한다.
다양한 실시형태에서, 벡터는 통합 바이러스 벡터이다.
다양한 다른 실시형태에서, 벡터는 에피솜 또는 비통합 바이러스 벡터이다.
다양한 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 벡터는 비통합 또는 통합 결함 레트로바이러스를 포함한다. 일 실시형태에서, "통합 결함" 레트로바이러스 또는 렌티바이러스는 숙주 세포의 게놈 내로 바이러스 게놈을 통합하는 능력이 결여된 인테그라제를 갖는 레트로바이러스 또는 렌티바이러스를 지칭한다. 다양한 실시형태에서, 인테그라제 단백질은 이의 인테그라제 활성을 특이적으로 감소시키도록 돌연변이된다. 통합-부적격 렌티바이러스 벡터는 인테그라제 단백질을 암호화하는 pol 유전자를 변형시켜, 통합 결핍 인테그라제를 암호화하는 돌연변이된 pol 유전자를 생성함으로써 얻어진다. 이러한 통합-부적격 바이러스 벡터는 본 명세서에 전문이 참조에 의해 원용되는 특허 출원 WO 2006/010834에 기재되어 있다.
인테그라제 활성을 감소시키는 데 적합한 HIV-1 pol 유전자에서의 예시적인 돌연변이는 하기를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다: H12N, H12C, H16C, H16V, S81 R, D41A, K42A, H51A, Q53C, D55V, D64E, D64V, E69A, K71A, E85A, E87A, D116N, D1161, D116A, N120G, N1201, N120E, E152G, E152A, D35E, K156E, K156A, E157A, K159E, K159A, K160A, R166A, D167A, E170A, H171A, K173A, K186Q, K186T, K188T, E198A, R199c, R199T, R199A, D202A, K211A, Q214L, Q216L, Q221 L, W235F, W235E, K236S, K236A, K246A, G247W, D253A, R262A, R263A 및 K264H.
인테그라제 활성을 감소시키는 데 적합한 HIV-1 pol 유전자에서의 예시적인 돌연변이는 하기를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다: D64E, D64V, E92K, D116N, D1161, D116A, N120G, N1201, N120E, E152G, E152A, D35E, K156E, K156A, E157A, K159E, K159A, W235F 및 W235E.
특정 실시형태에서, 인테그라제는 아미노산, D64, D116 또는 E152 중 하나 이상에서 돌연변이를 포함한다. 일 실시형태에서, 인테그라제는 아미노산, D64, D116 및 E152에서 돌연변이를 포함한다. 특정 실시형태에서, 결함 HIV-1 인테그라제는 D64V 돌연변이를 포함한다.
"숙주 세포"는 본 발명의 재조합 벡터 또는 폴리뉴클레오타이드에 의해 생체내, 생체외 또는 시험관내에서 전기천공되거나, 형질감염되거나 또는 형질도입된 세포를 포함한다. 숙주 세포는 패키징 세포, 생산자 세포, 및 바이러스 벡터로 감염된 세포를 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 바이러스 벡터로 감염된 숙주 세포는 요법이 필요한 대상체에게 투여된다. 특정 실시형태에서, 용어 "표적 세포"는 숙주 세포와 상호 호환적으로 사용되고, 목적하는 세포 유형의 형질감염, 감염 또는 형질도입된 세포를 지칭한다. 바람직한 실시형태에서, 표적 세포는 T 세포이다.
합리적인 바이러스 역가를 달성하기 위해 대규모 바이러스 입자 생성이 필요하다. 바이러스 입자는 바이러스 구조 및/또는 부속 유전자, 예를 들어, gag, pol, env, tat, rev, vif, vpr, vpu, vpx 또는 nef 유전자 또는 다른 레트로바이러스 유전자를 포함하는 패키징 세포주 내로 전달 벡터를 형질감염시킴으로써 생성된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "패키징 벡터"는 패키징 신호가 없고, 1, 2, 3, 4개 이상의 바이러스 구조 및/또는 부속 유전자를 포함하는 발현 벡터 또는 바이러스 벡터를 지칭한다. 전형적으로, 패키징 벡터는 패키징 세포에 포함되고, 형질감염, 형질도입 또는 감염을 통해 세포 내로 도입된다. 형질감염, 형질도입 또는 감염을 위한 방법은 당업자에게 잘 공지되어 있다. 본 발명의 레트로바이러스/렌티바이러스 전달 벡터는 생산자 세포 또는 세포주를 생성하기 위해 형질감염, 형질도입 또는 감염을 통해 패키징 세포주 내로 도입될 수 있다. 본 발명의 패키징 벡터는, 예를 들어, 인산칼슘 형질감염, 리포펙션 또는 전기천공법을 포함하는 표준 방법에 의해 인간 세포 또는 세포주 내로 도입될 수 있다. 일부 실시형태에서, 패키징 벡터는 우성 선택 가능 마커, 예컨대 네오마이신, 하이그로마이신, 퓨로마이신, 블라스토시딘, 제오신, 티미딘 키나제, DHFR, Gln 합성효소 또는 ADA와 함께 세포 내로 도입된 후에, 적절한 약물의 존재 하에 선택되고, 클론이 단리된다. 선택 가능 마커 유전자는 패키징 벡터에 의해, 예를 들어, IRES 또는 자기-절단성 바이러스 펩타이드에 의해 암호화하는 유전자에 생리적으로 연결될 수 있다.
바이러스 외피 단백질(env)은 궁극적으로는 세포주로부터 생성된 재조합 레트로바이러스에 의해 감염되고 형질전환될 수 있는 숙주 세포 범위를 결정한다. 렌티바이러스, 예컨대 HIV-1, HIV-2, SIV, FIV 및 EIV의 경우에, env 단백질은 gp41 및 gp120을 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 패키징 세포에 의해 발현되는 바이러스 env 단백질은 앞서 기재한 바와 같이 바이러스 gag 및 pol 유전자와 별개의 벡터 사에서 암호화된다.
본 발명에서 사용될 수 있는 레트로바이러스-유래 env 유전자의 예시적인 예는 하기를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다: MLV 외피, 10A1 외피, BAEV, FeLV-B, RD114, SSAV, 에볼라, 센다이, FPV(조류 흑사병 바이러스), 및 인플루엔자 바이러스 외피. 유사하게, RNA 바이러스(예를 들어, 피코르나바이러스과, 칼시바이러스과, 아스트로바이러스과, 토가바이러스과, 플라비바이러스과, 코로나바이러스과, 파라믹소바이러스과, 랍도바이러스과, 필로바이러스과, 오쏘믹소바이러스과, 분야바이러스과, 아레나바이러스과, 레오바이러스과, 비르나바이러스과, 레트로바이러스과의 RNA 바이러스과)로부터의 외피뿐만 아니라 DNA 바이러스(헤파드나바이러스과, 써코바이러스과, 파보바이러스과, 파포바바이러스과, 아데노바이러스과, 헤르페스바이러스과, 폭시바이러스과 및 이리도바이러스과)로부터의 외피를 암호화하는 유전자가 이용될 수 있다. 대표적인 예는 FeLV, VEE, HFVW, WDSV, SFV, Rabies, ALV, BIV, BLV, EBV, CAEV, SNV, ChTLV, STLV, MPMV, SMRV, RAV, FuSV, MH2, AEV, AMV, CT10 및 EIAV를 포함한다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 바이러스 위형에 대한 외피 단백질은 다음의 바이러스로부터의 어느 것을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다: A형 인플루엔자, 예컨대 H1N1, H1N2, H3N2 및 H5N1(조류 독감), B형 인플루엔자, C형 인플루엔자 바이러스, A형 간염 바이러스, B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, D형 간염 바이러스, E형 감염 바이러스, 로타바이러스, 노워크 바이러스 그룹의 임의의 바이러스, 장 아데노바이러스, 파보바이러스, 뎅기열 바이러스, 원두, 모노네가바이러스, 리사바이러스, 예컨대 광견병 바이러스, 라르고 박쥐 바이러스, 모콜라 바이러스, 듀벤헤이즈 바이러스, 유럽 박쥐 바이러스 1 및 2 및 호주 박쥐 바이러스, 에페메로바이러스, 베시쿨로바이러스, 수포성 구내염 바이러스(VSV), 헤르페스바이러스, 예컨대 1형 및 2형 단순 포진 바이러스, 수두 대상 포진, 거대세포바이러스, 엡스타인-바르 바이러스(EBV), 인간 헤르페스바이러스(HHV), 6형 및 8형 인간 헤르페스바이러스, 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 유두종 바이러스, 뮤린 감마헤르페스바이러스, 아레나바이러스, 예컨대 아르헨티나 출혈열 바이러스, 볼리비아 출혈열 바이러스, 사비아-연관 출혈열 바이러스, 베네수엘라 출혈열 바이러스, 라싸열 바이러스, 마추포 바이러스, 림프구성 맥락수막염 바이러스(LCMV), 분야바이러스과, 예컨대 크리미안-콩고 출혈열 바이러스, 한타바이러스, 신증후군 원인 바이러스에 의한 출혈열, 리프트 계곡열 바이러스, 에볼라 출혈열 및 마르부르크 출혈열을 포함하는 필로바이러스과(필로바이러스), 케이사누르(Kaysanur) 산림병 바이러스를 포함하는 플라비바이러스과, Omsk 출혈열 바이러스, 진드기 매개 뇌염 원인 바이러스 및 파라믹소바이러스과, 예컨대 헨드라(Hendra) 바이러스 및 니파(Nipah) 바이러스, 대두창 및 소두창(두창), 알파바이러스, 예컨대 베네수엘라 말 뇌염 바이러스, 동부 말 뇌염 바이러스, 서부 말 뇌염 바이러스, SARS-연관 코로나바이러스(SARS-CoV), 웨스트 나일바이러스, 및 임의의 뇌염 원인 바이러스.
일 실시형태에서, 본 발명은 재조합 레트로바이러스, 예를 들어, VSV-G 당단백질을 갖는 위형의 렌티바이러스를 생성하는 패키징 세포를 제공한다.
용어 "위형" 또는 "위형화"은 바이러스 외피 단백질이 바람직한 특징을 갖는 다른 바이러스로 대체된 바이러스를 지칭한다. 예를 들어, HIV는 HIV 외피 단백질(env 유전자에 의해 암호화됨)이 CD4+ 제시 세포에 바이러스를 정상적으로 표적화하기 때문에 HIV가 보다 다양한 세포를 감염시키는 것을 가능하게 하는 수포성 구내염 바이러스 G-단백질(VSV-G) 외피 단백질에 의해 위형화될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시형태에서, 렌티바이러스 외피 단백질은 VSV-G에 의해 위형화된다. 일 실시형태에서, 본 발명은 재조합 레트로바이러스, 예를 들어, VSV-G 외피 당단백질을 갖는 위형의 렌티바이러스를 생성하는 패키징 세포를 제공한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "패키징 세포주"는 패키징 신호를 함유하지 않지만, 바이러스 입자의 정확한 패키징에 필요한 바이러스 구조 단백질 및 복제 효소(예를 들어, gag, pol 및 env)를 안정하게 또는 일시적으로 발현시키는 세포주와 관련하여 사용된다. 본 발명의 패키징 세포를 준비하는 데 임의의 적합한 세포주가 사용될 수 있다. 일반적으로, 세포는 포유류 세포이다. 특정 실시형태에서, 패키징 세포주를 생성하는 데 사용되는 세포는 인간 세포이다. 사용될 수 있는 적합한 세포주는, 예를 들어, CHO 세포, BHK 세포, MDCK 세포, C3H 10T1/2 세포, FLY 세포, Psi-2 세포, BOSC 23 세포, PA317 세포, WEHI 세포, COS 세포, BSC 1 세포, BSC 40 세포, BMT 10 세포, VERO 세포, W138 세포, MRC5 세포, A549 세포, HT1080 세포, 293 세포, 293T 세포, B-50 세포, 3T3 세포, NIH3T3 세포, HepG2 세포, Saos-2 세포, Huh7 세포, HeLa 세포, W163 세포, 211 세포 및 211A 세포를 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 패키징 세포는 293 세포, 293T 세포 또는 A549 세포이다. 다른 바람직한 실시형태에서, 세포는 A549 세포이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "생성자 세포주"는 패키징 세포주 및 패키징 신호를 포함하는 전달 벡터 작제물을 포함하는 재조합 레트로바이러스 입자를 생성할 수 있는 세포주를 지칭한다. 전염성 바이러스 입자 및 바이러스 저장 용액의 생성은 통상적인 기법을 이용하여 수행될 수 있다. 바이러스 저장 용액의 제조 방법은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌[Y. Soneoka et al. (1995) Nucl. Acids Res. 23:628-633, 및 N. R. Landau et al. (1992) J. Virol. 66:5110-5113]에 의해 예시된다. 전염성 바이러스 입자는 통상적인 기법을 이용하여 패키징 세포로부터 수집될 수 있다. 예를 들어, 전염성 입자는 당업계에 공지된 바와 같은 세포용해, 세포 배양물 상청액의 수집에 의해 수집될 수 있다. 선택적으로, 수집된 바이러스 입자는 원한다면 정제될 수 있다. 적합한 정제 기법은 당업자에게 잘 공지되어 있다.
형질감염에 의하기 보다는 바이러스 감염에 의해 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터를 이용하는 유전자(들) 또는 다른 폴리뉴클레오타이드 서열의 전달은 "형질도입"으로서 지칭된다. 일 실시형태에서, 레트로바이러스 벡터는 감염 및 프로바이러스 통합을 통해 세포 내로 형질도입된다. 특정 실시형태에서, 표적 세포, 예를 들어, T 세포는, 바이러스 또는 레트로바이러스 벡터를 이용하는 감염에 의해 세포에 전달되는 유전자 또는 다른 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한다면, "형질도입"된다. 특정 실시형태에서, 형질도입 세포는 세포 게놈에서 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터에 의해 전달되는 하나 이상의 유전자 또는 다른 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 하나 이상의 폴리펩타이드를 발현시키는 본 발명의 바이러스 벡터에 의해 형질도입된 숙주 세포는 B 세포 악성종양을 치료하고/하거나 예방하기 위해 대상체에게 투여된다. 본 발명의 특정 실시형태에 따라 이용될 수 있는 유전자 요법에서 바이러스 벡터의 사용에 관한 다른 방법은, 예를 들어 문헌[Kay, M. A. (1997) Chest 111(6 Supp.):138S-142S; Ferry, N. and Heard, J. M. (1998) Hum. Gene Ther. 9:1975-81; Shiratory, Y. et al. (1999) Liver 19:265-74; Oka, K. et al. (2000) Curr. Opin. Lipidol. 11:179-86; Thule, P. M. and Liu, J. M. (2000) Gene Ther. 7:1744-52; Yang, N. S. (1992) Crit. Rev. Biotechnol. 12:335-56; Alt, M. (1995) J. Hepatol. 23:746-58; Brody, S. L. and Crystal, R. G. (1994) Ann. N.Y. Acad. Sci. 716:90-101; Strayer, D. S. (1999) Expert Opin. Investig. Drugs 8:2159-2172; Smith-Arica, J. R. and Bartlett, J. S. (2001) Curr. Cardiol. Rep. 3:43-49; 및 Lee, H. C. et al. (2000) Nature 408:483-8]에서 찾을 수 있다.
5.6. 유전자 변형된 세포
본 발명은, 특정 실시형태에서, B 세포 관련 병태의 치료에서 사용하기 위한 본 명세서에 상정된 CAR을 발현시키도록 유전자 변형된 세포를 상정한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "유전자 조작된" 또는 "유전자 변형된"은 세포 내 총 유전자 물질 내로 DNA 또는 RNA 형태의 추가적인 유전자 물질의 첨가를 지칭한다. 용어, "유전자 변형된 세포", "변형된 세포" 및 "전용된 세포"는 상호 호환적으로 사용된다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "유전자 요법"은 유전자의 발현을 회복시키거나, 수정하거나, 변형시키는, 또는 치료적 폴리펩타이드, 예를 들어, CAR을 발현시킬 목적을 위해, 세포 내 총 유전자 물질에 DNA 또는 RNA 형태의 추가 유전자 물질 도입을 지칭한다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 CAR은 이들의 특이성을 관심 대상의 표적 항원, 예를 들어, BCMA 폴리펩타이드로 전용시키기 위해 면역 효과기 세포에서 도입되고 발현된다. "면역 효과기 세포"는 하나 이상의 효과기 기능(예를 들어, 세포독성 세포 사멸 활성, 사이토카인의 분비, ADCC 및/또는 CDC의 유도)을 갖는 면역계의 임의의 세포이다.
본 발명의 면역 효과기 세포는 자가/자율("자기") 또는 비-자가("비-자기", 예를 들어, 동종이계, 동질유전자 또는 이종성)일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "자가"는 동일한 대상체로부터의 세포를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "동종이계"는 비교 중인 세포와 유전적으로 상이한, 동일한 종의 세포를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "동질유전자"는 비교 중인 세포와 유전적으로 동일한, 상이한 대상체의 세포를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "이종성"은 비교 중인 세포와 상이한 종의 세포를 지칭한다. 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 세포는 동종이계이다.
본 명세서에 상정된 CAR에 의해 사용되는 예시적인 면역 효과기 세포는 T 림프구를 포함한다. 용어 "T 세포" 또는 "T 림프구"는 당업계에서 인식되며, 흉선세포, 미숙 T 림프구, 성숙 T 림프구, 휴지 T 림프구 또는 활성화된 T 림프구를 포함하는 것으로 의도된다. T 세포는 T 헬퍼(Th) 세포, 예를 들어 T 헬퍼 1(Th1) 또는 T 헬퍼 2 (Th2) 세포일 수 있다. T 세포는 헬퍼 T 세포(HTL; CD4+ T 세포) CD4+ T 세포, 세포독성 T 세포(CTL; CD8+ T 세포), CD4+CD8+ T 세포, CD4-CD8- T 세포, 또는 T 세포의 다른 서브세트일 수 있다.　 특정 실시형태에서 사용하기에 적합한 T 세포의 다른 예시적 집단은 미경험(
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) T 세포 및 기억 T 세포를 포함한다.
당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 다른 세포는 또한 본 명세서에 기재되는 바와 같은 CAR을 갖는 면역 효과기 세포로서 사용될 수 있다. 특히, 면역 효과기 세포는 또한 NK 세포, NKT 세포, 호중구 및 대식세포를 포함한다. 면역 효과기 세포는 또한 효과기 세포의 조상세포를 포함하되, 조상 세포는 생체내 또는 시험관내 면역 효과기 세포로 분화하도록 유도될 수 있다. 따라서, 특정 실시형태에서, 면역 효과기 세포는 투여 시 대상체에서 성숙 면역 효과기 세포로 분화하거나, 또는 성숙 면역 효과기 세포로 분화하도록 시험관내에서 유도될 수 있는 제대혈, 골수 또는 동원된(mobilized) 말초 혈액으로부터 유래된 세포의 CD34+ 집단에 포함된 조혈 줄기 세포(hematopoietic stem cell: HSC)와 같은 면역 효과기 세포의 조상 세포를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은, BCMA-특이적 CAR을 포함하도록 유전자 조작된 면역 효과기 세포는 "BCMA-특이적 전용 면역 효과기 세포"로서 지칭될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "CD34+ 세포"는 이의 세포 표면 상에서 CD34 단백질을 발현시키는 세포를 지칭한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "CD34"는 종종 세포-세포 접착 인자로서 작용하고, 림프절 내로의 T 세포 유입에 연루된 세포 표면 당단백질(예를 들어, 시알로뮤신 단백질)을 지칭한다. CD34+ 세포 집단은 환자에 대한 투여 시 T 세포, NK 세포, NKT 세포, 호중구 및 단핵구/대식세포 계통의 세포를 포함하는 조혈 계통으로 분화하고 이에 기여하는 조혈 줄기 세포(HSC)를 포함한다.
본 발명은 본 명세서에 상정된 CAR을 발현시키고 면역 효과기 세포를 제조하는 방법을 제공한다. 일 실시형태에서, 상기 방법은 면역 효과기 세포가 본 명세서에 기재된 바와 같은 하나 이상의 CAR을 발현시키도록 개체로부터 단리된 면역 효과기 세포를 형질감염 또는 형질도입하는 단계를 포함한다. 특정 실시형태에서, 면역 효과기 세포는 개체로부터 단리되고 시험관내에서 추가적인 조작 없이 유전자 변형된다. 이어서, 이러한 세포는 개체에 직접적으로 재투여될 수 있다. 추가 실시형태에서, 면역 효과기 세포는 처음에 활성화되고, CAR을 발현시키도록 유전자 변형되기 전에 시험관내에서 증식하도록 자극된다. 이와 관련하여, 면역 효과기 세포는 유전자 변형되기(즉, 본 명세서에 상정된 CAR을 발현시키기 위해 형질도입되거나 형질감염되기) 전에 그리고/후에 배양될 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 면역 효과기 세포의 시험관내 조작 또는 유전적 변형 전에, 세포의 공급원은 대상체로부터 얻는다. 특정 실시형태에서, CAR-변형된 면역 효과기 세포는 T 세포를 포함한다. T 세포는 말초 혈액 단핵구 세포, 골수, 림프절 조직, 제대혈, 흉선 조직, 감염 부위로부터의 조직, 복수, 흉막 삼출, 비장 조직 및 종양을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 다수의 공급원으로부터 얻을 수 있다. 특정 실시형태에서, T 세포는 당업자에게 공지된 다수의 기법, 예컨대 침강, 예를 들어, FICOLLTM 분리를 이용하여 대상체로부터 수집된 혈액 단위로부터 얻을 수 있다. 일 실시형태에서, 개체의 순환 혈액으로부터의 세포는 성분채집술에 의해 얻는다. 성분채집술 생성물은 전형적으로 T 세포, 단핵구, 과립구, B 세포, 다른 유핵 백혈구, 적혈구 및 혈소판을 포함하는 림프구를 함유한다. 일 실시형태에서, 성분채집술에 의해 수집된 세포는 혈장 분획을 제거하기 위해 그리고 후속 가공을 위한 적절한 완충제 또는 배지에 세포를 위치시키기 위해 세척될 수 있다. 세포는 PBS로 또는 칼슘, 마그네슘, 나머지 모두는 아니지만 대부분의 2가 양이온을 결여하는 다른 적합한 용액으로 세척될 수 있다. 당업자에 의해 인식될 바와 같이, 세척 단계는 당업계에 공지된 방법에 의해, 예컨대 반자동화된 통과액 원심분리를 이용함으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, Cobe 2991 세포 처리기, Baxter CytoMate 등. 세척 후에, 세포는 다양한 생체 적합 완충제에서 또는 완충제와 함께 또는 완충제 없이 다른 식염수 용액에서 재현탁될 수 있다. 특정 실시형태에서, 성분채집술 샘플의 바람직한 성분은 세포가 직접적으로 재현탁된 배양 배지에서 제거될 수 있다.
특정 실시형태에서, T 세포는, 예를 들어, PERCOLLTM 구배를 통해 원심분리에 의해 적혈구를 용해시키고 단핵구를 고갈시킴으로써 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)로부터 단리된다. 다음의 마커: CD3, CD28, CD4, CD8, CD45RA 및 CD45RO 중 하나 이상을 발현시키는 T 세포의 특정 하위 집단은 양성 또는 음성 선택 기법에 의해 추가로 단리될 수 있다. 일 실시형태에서, CD3, CD28, CD4, CD8, CD45RA 및 CD45RO를 발현시키는 T 세포의 특정 하위집단은 양성 또는 음성 선택 기법에 의해 추가로 단리된다. 예를 들어, 음성 선택에 의한 T 세포 집단의 풍부도는 음성 선택된 세포에 독특한 표면 마커와 관련된 항체의 조합에 의해 달성될 수 있다. 본 명세서에서 사용하기 위한 일 방법은 음성 선택된 세포 상에서 제시되는 세포 표면 마커와 관련된 단클론성 항체의 칵테일을 사용하는 음성 자기 면역부착 또는 유세포분석을 통한 세포 분류 및/또는 선택이다. 예를 들어, 음성 선택에 의해 CD4+ 세포를 풍부하게 하기 위해, 단클론성 항체 칵테일은 전형적으로 CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR 및 CD8에 대한 항체를 포함한다. 유세포분석 및 세포분류는 또한 본 발명에서 사용하기 위한 관심대상의 세포집단을 단리시키는 데 사용될 수 있다.
PBMC는 본 명세서에 상정된 방법을 이용하여 CAR을 발현시키기 위해 직접적으로 유전자 변형될 수 있다. 특정 실시형태에서, PBMC의 단리 후에, T 림프구는 추가로 단리되고, 특정 실시형태에서, 세포독성과 헬퍼 T 림프구는 둘 다 유전자 변형 및/또는 확장 전에 또는 후에 미경험, 기억 및 효과기 T 세포 하위집단으로 분류될 수 있다.
CD8+ 세포는 표준 방법을 이용함으로써 얻을 수 있다. 일부 실시형태에서, CD8+ 세포는 CD8+ 세포의 각 해당 유형과 연관된 세포 표면 항원을 확인함으로써 미경험, 중심 기억 및 효과기 세포로 추가로 분류된다.
특정 실시형태에서, 미경험 CD8+ T 림프구는 CD62L, CCR7, CD28, CD3, CD 127 및 CD45RA를 포함하는 미경험 T 세포의 표현형 마커 발현을 특징으로 한다.
특정 실시형태에서, 기억 T 세포는 CD8+ 말초 혈액 림프구의 CD62L+와 CD62L- 서브세트 둘 다에 존재한다. PBMC는 항-CD8 및 항-CD62L 항체로 염색 후에 CD62L-CD8+ 및 CD62L+CD8+ 분획으로 분류된다. 일부 실시형태에서, 중심 기억 T 세포의 표현형 마커 발현은 CD45RO, CD62L, CCR7, CD28, CD3 및 CD127을 포함하고, 그랜자임 B에 대해 음성이다. 일부 실시형태에서, 중심 기억 T 세포는 CD45RO+, CD62L+, CD8+ T 세포이다.
일부 실시형태에서, 효과기 T 세포는 CD62L, CCR7, CD28 및 CD127에 대해 음성이고, 그랜자임 B 및 퍼포린에 대해 양성이다.
특정 실시형태에서, CD4+ T 세포는 하위 집단으로 추가로 분류된다. 예를 들어, CD4+ T 헬퍼 세포는 세포 표면 항원을 갖는 세포 집단을 확인함으로써 천연, 중심 기억 및 효과기 세포로 분류될 수 있다. CD4+ 림프구는 표준 방법에 의해 얻을 수 있다. 일부 실시형태에서, 미경험 CD4+ T 림프구는 CD45RO-, CD45RA+, CD62L+ CD4+ T 세포이다. 일부 실시형태에서, 중심 기억 CD4+ 세포는 CD62L 양성 및 CD45RO 양성이다. 일부 실시형태에서, 효과기 CD4+ 세포는 CD62L 및 CD45RO 음성이다.
면역 효과기 세포, 예컨대 T 세포는 공지된 방법을 이용하여 단리 후에 유전자 변형되거나, 또는 면역 효과기 세포는 유전자 변형되기 전에 시험관 내에서 활성화되고 확장된다(또는 조상세포의 경우에 분화된다). 특정 실시형태에서, 면역 효과기 세포, 예컨대 T 세포는 본 명세서에 상정된 키메라 항원 수용체(예를 들어, CAR을 암호화하는 핵산을 포함하는 바이러스 벡터에 의해 형질도입됨)로 유전자 변형되고, 이어서, 활성화되고, 시험관내에서 확장된다. 다양한 실시형태에서, T 세포는, 예를 들어, 미국 특허 제6,352,694호; 제6,534,055호; 제6,905,680호; 제6,692,964호; 제5,858,358호; 제6,887,466호; 제6,905,681호; 제7,144,575호; 제7,067,318호; 제7,172,869호; 제7,232,566호; 제7,175,843호; 제5,883,223호; 제6,905,874호; 제6,797,514호; 제6,867,041호; 및 미국 특허 출원 공개 제20060121005호에 기재된 바와 같은 방법을 이용하여 CAR을 발현시키기 위한 변형 전에 또는 후에 활성화되고 확장될 수 있다.
일반적으로, T 세포는 이에 대해 CD3 TCR 복합체 연관 신호를 자극하는 제제 및 T 세포 표면 상에서 공자극 분자를 자극하는 리간드가 부착된 표면과의 접촉에 의해 확장된다. T 세포 집단은 표면 상에 고정된 항-CD3 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 항-CD2 항체와의 접촉에 의해, 또는 칼슘 이오노포어와 함께 단백질 키나제 C 활성체(예를 들어, 브리오스타틴)와의 접촉에 의해 자극될 수 있다. T 세포 표면 상에서 부속 분자의 공자극이 또한 상정된다.
특정 실시형태에서, PBMC 또는 단리된 T 세포는 적절한 사이토카인, 예컨대 IL-2, IL-7 및/또는 IL-15가 있는 배양 배지에서 비드 또는 다른 표면에 일반적으로 부착되는 자극제 및 공자극제, 예컨대 항-CD3 및 항-CD28 항체와 접촉된다. CD4+　T 세포 또는 CD8+　T 세포 중 하나의 증식을 자극하기 위해, 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체. 항-CD28 항체의 예는 9.3, B-T3을 포함하며, XR-CD28(Diacione, 프랑스 베산콘에 소재)은 당업계에 통상적으로 공지된 다른 방법과 같이 사용될 수 있다(Berg et al., Transplant Proc. 30(8):3975-3977, 1998; Haanen et al., J. Exp. Med. 190(9): 13191328, 1999; Garland et al., J. Immunol Meth. 227(1 -2):53-63, 1999). 동일한 비드에 부착된 항-CD3 및 항-CD28 항체는 "대리" 항원 제시 세포(APC)로서 작용한다. 다른 실시형태에서, T 세포는 미국 특허 제6040177호; 미국 특허 제5827642호; 및 WO2012129514에 기재된 것과 같은 방법을 이용하여 피더 세포 및 적절한 항체 및 사이토카인에 의해 활성화되고 자극될 수 있다.
다른 실시형태에서, 다양한 공자극 분자 및 사이토카인의 안정한 발현 및 분비를 지시하기 위해 K562, U937, 721.221, T2, 및 C1R 세포를 조작함으로써 인공 APC(aAPC)가 생성된다. 특정 실시형태에서, AAPC 세포 표면 상에서 하나 이상의 항체-기반 자극 분자의 디스플레이를 지시하기 위해 K32 또는 U32 aAPC가 사용된다. aAPC가 특정 성장 요건 및 구별되는 기능을 갖는 T-세포 서브세트의 최적의 증식을 위해 맞춤될 수 있도록, aAPC 상에서 유전자의 다양한 조합물의 발현은 인간 T-세포 활성화 요건의 정확한 결정을 가능하게 한다. aAPC는 천연 APC의 용도와 대조적으로 외인성 사이토카인의 첨가를 필요로 하는 일 없이 기능성 인간 CD8 T 세포의 생체외 및 장기간 확장을 뒷받침한다. T 세포의 집단은 CD137L(4-1BBL), CD134L(OX40L) 및/또는 CD80 또는 CD86을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 다양한 공자극 분자를 발현시키는 aAPC에 의해 확장될 수 있다. 최종적으로, aAPC는 유전자 변형된 T 세포를 확장시키기 위해 그리고 CD8 T 세포 상에서 CD28 발현을 유지하기 위해 효율적인 플랫폼을 제공한다. WO 03/057171 및 미국 특허 제2003/0147869호에 제공된 aAPC는 본 명세서에 전문이 참조에 의해 원용된다.
일 실시형태에서, CD34+ 세포는 본 발명에 따른 핵산 작제물로 형질도입된다. 특정 실시형태에서, 형질도입된 CD34+ 세포는 대상체, 즉, 일반적으로 세포가 본래 단리된 대상체 내로 투여 후 생체내에서 성숙 면역 효과기 세포로 분화한다. 다른 실시형태에서, CD34+ 세포는 본 명세서에 기재된 바와 같은 CAR로, 다음의 사이토카인 중 하나 이상에 대한 노출 전에 또는 이에 의해 유전자 변형된 후에 시험관내에서 자극될 수 있다: 앞서 기재된 방법에 따른 Flt-3 리간드(FLT3), 줄기 세포 인자(SCF), 거핵구성장인자 및 분화 인자(TPO), IL-3 및 IL-6(Asheuer et al., 2004, PNAS 101(10):3557-3562; Imren, et al., 2004).
본 발명은 암 치료를 위해 변형된 면역 효과기 세포, 즉, 본 명세서에 개시된 바와 같은 CAR을 포함하는 변형된 면역 효과기 세포의 집단을 제공한다. 예를 들어, 변형된 면역 효과기 세포의 집단은 본 명세서에 기재된 B 세포 악성종양으로 진단된 환자(자가 공여자)로부터 얻은 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)로부터 제조된다. PBMC는 CD4+, CD8+ 또는 CD4+ 및 CD8+일 수 있는 T 림프구의 이종성 집단을 형성한다.
PBMC는 또한 다른 세포독성 림프구, 예컨대 NK 세포 또는 NKT 세포를 포함할 수 있다. 본 명세서에 상정된 CAR의 암호화 서열을 운반하는 발현 벡터는 인간 공여자 T 세포, NK 세포 또는 NKT 세포의 집단에 도입될 수 있다. 발현 벡터를 운반하는 성공적으로 형질도입된 T 세포는 CD3 양성 T 세포를 단리시키기 위해 유세포분석을 이용하여 분류될 수 있고, 항-CD3 항체 및 또는 항-CD28 항체 및 IL-2 또는 본 명세서의 다른 곳에 기재된 바와 같은 당업계에 공지된 임의의 다른 방법을 이용하여 세포 활성화에 추가로 이들 CAR 단백질 발현 T 세포 수를 증가시키도록 추가로 증식된다. 인간 대상체에서 사용하기 위한 저장 및/또는 제조를 위한 T 세포 CAR 단백질을 발현시키는 T 세포의 동결보존을 위해 표준 절차가 사용된다. 일 실시형태에서, T 세포의 시험관내 형질도입, 시험관내 형질도입, 배양 및/또는 확장은 소 태아 혈청 및 소 태아 혈청과 같은 비-인간 동물 유래 산물 없이 수행된다. PBMC의 이종 집단은 유전자 변형되기 때문에, 얻어진 형질도입 세포는 본 명세서에 상정된 CAR을 표적화하는 BCMA를 포함하는 변형 세포의 이종성 집단이다.
추가 실시형태에서, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 상이한 발현 벡터의 혼합물이 면역 효과기 세포의 공여자 집단을 유전자 변형시키는 데 사용될 수 있되, 각각의 벡터는 본 명세서에 상정된 바와 상이한 키메라 항원 수용체 단백질을 암호화한다. 얻어진 변형된 면역 효과기 세포는 하나 초과의 상이한 CAR 단백질을 발현시키는 변형된 세포 집단과 함께 변형된 세포의 혼합 집단을 형성한다.
일 실시형태에서, 본 발명은 세포가 해동 시 생존한 채로 남아있도록, 면역 효과기 세포를 동결보존시키는 단계를 포함하는, BCMA 단백질을 표적화하는 면역 효과기 세포를 발현시키는 유전자 변형된 뮤린, 인간 또는 인간화된 CAR 단백질을 저장하는 방법을 제공한다. CAR 단백질을 발현시키는 면역 효과기 세포의 분획은 B 세포 관련 병태에 걸린 환자의 장래의 치료를 위해 이러한 세포의 영구한 공급원을 제공하도록 당업계에 공지된 방법에 의해 동결보존될 수 있다. 필요하다면, 동결보존된 형질전환 면역 효과기 세포는 해동되며, 성장되고, 더 많은 이러한 세포에 대해 확장될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은, "동결보존"은 0도 미만, 예컨대 (전형적으로) 77 K 또는 -196℃(액체 질소의 비등점)로의 냉각에 의한 세포 보존을 지칭한다. 동결보호제는 종종 저온에서의 냉각 또는 실온으로의 가온으로 인해 보존 중인 세포가 손상되는 것을 방지하기 위해 0도 미만의 온도에서 사용된다. 동결보존제 및 최적의 냉각속도는 세포 손상에 대해 보호할 수 있다. 사용될 수 있는 동결보호제는 다이메틸설폭사이드(DMSO)(Lovelock and Bishop, Nature, 1959; 183: 1394-1395; Ashwood-Smith, Nature, 1961; 190: 1204-1205), 글리세롤, 폴리비닐피롤리돈 (Rinfret, Ann. N.Y. Acad. Sci., 1960; 85: 576), 및 폴리에틸렌 글리콜(Sloviter and Ravdin, Nature, 1962; 196: 48)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 바람직한 냉각 속도는 1° 내지 3℃/분이다. 적어도 2시간 후에, T 세포는 -80℃의 온도에 도달되고, 장기간 극저온 저장 용기에서와 같은 영구 저장을 위해 액체 질소(-196℃)에 직접 넣어질 수 있다.
5.7. T 세포 제작 공정
본 명세서에 상정된 방법에 의해 제조된 T 세포는 개선된 입양 면역요법 조성물을 제공한다. 임의의 특정 이론으로 구속되기를 바라지는 않지만, 본 명세서에 상정된 방법에 의해 제조된 T 세포 조성물은 증가된 생존, 분화의 상대적 부재의 확장 및 생체내 지속성을 포함하는 우수한 특성을 지니는 것으로 여겨진다. 일 실시형태에서, T 세포의 제조 방법은 PI3K 세포 신호전달 경로를 조절하는 하나 이상의 제제와 세포를 접촉하는 단계를 포함한다. 일 실시형태에서, T 세포의 제조 방법은 PI3K/Akt/mTOR 세포 신호전달 경로를 조절하는 하나 이상의 제제와 세포를 접촉하는 단계를 포함한다. 다양한 실시형태에서, T 세포는 임의의 공급원으로부터 얻을 수 있고, 제조 공정의 활성화 및/또는 확장기 동안 제제와 접촉된다. 얻어진 T 세포 조성물은 다음의 바이오마커 중 하나 이상을 증식하고 발현시키는 능력을 갖는 발생적으로 강력한 T 세포에서 풍부화된다: CD62L, CCR7, CD28, CD27, CD122, CD127, CD197 및 CD38. 일 실시형태에서, 하나 이상의 PI3K 저해제로 처리된 T 세포를 포함하는 세포 집단은 다음의 바이오마커 중 하나 이상 또는 모두를 공동 발현시키는 CD8+ T 세포 집단에 대해 풍부화된다: CD62L, CD127, CD197 및 CD38.
일 실시형태에서, 증식의 유지된 수준 및 감소된 분화를 포함하는 변형된 T 세포가 제조된다. 특정 실시형태에서, 하나 이상의 자극 신호 및 PI3K 세포 신호전달 경로의 저해제인 제제의 존재 하에 활성화되고 증식되는 T 세포를 자극함으로써, T 세포가 제조된다.
이어서, T 세포는 항-BCMA CAR을 발현시키도록 변형될 수 있다. 일 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 항-BCMA CAR을 포함하는 바이러스 벡터를 이용하여 T 세포를 형질도입함으로써 T 세포가 변형된다. 특정 실시형태에서, T 세포는 PI3K 세포 신호전달 경로 저해제의 존재 하에서 자극 및 활성화 전에 변형된다. 다른 실시형태에서, T 세포는 PI3K 세포 신호전달 경로 저해제의 존재 하에서 자극 및 활성화 후에 변형된다. 특정 실시형태에서, T 세포는 PI3K 세포 신호전달 경로 저해제의 존재 하에서 자극 및 활성화의 12시간, 24시간, 36시간 또는 48시간 이내에 변형된다.
T 세포가 활성화된 후에, 세포는 증식하도록 배양된다. T 세포는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일, 적어도 2주, 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개월 이상 동안 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10회 이상의 확장 라운드로 배양될 수 있다.
다양한 실시형태에서, T 세포 조성물은 PI3K 경로의 하나 이상의 저해제의 존재 하에 제조된다. 저해제는 경로 또는 신호 활성에서 하나 이상의 활성을 표적화할 수 있다. 임의의 특정 이론으로 구속되는 것을 바라지는 않지만, 제조 과정의 자극, 활성화, 및/또는 확장기 동안 PI3K의 하나 이상의 저해제로 T 세포를 처리하거나 이와 접촉시켜 어린 T 세포를 우선적으로 증가시킴으로써, 우수한 치료적 T 세포 조성물을 생성한다는 것이 상정된다.
특정 실시형태에서, 조작된 T 세포 수용체를 발현시키는 T 세포의 증식을 증가시키는 방법이 제공된다. 이러한 방법은, 예를 들어, 대상체로부터 T 세포의 공급원을 채취하는 단계, PI3K 경로의 하나 이상의 존재 하에 T 세포를 자극하고 활성화시키는 단계, 항-BCMA CAR, 예를 들어, 항-BCMA02 CAR을 발현시키기 위한 T 세포의 변형 단계, 및 배양물에서 T 세포를 확장시키는 단계를 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, T 세포의 집단을 생성하기 위한 방법은 다음의 바이오마커 중 하나 이상의 발현을 위해 풍부화된다: CD62L, CCR7, CD28, CD27, CD122, CD127, CD197 및 CD38. 일 실시형태에서, 어린 T 세포는 다음의 생물학적 바이오마커 중 하나 이상 또는 모두를 포함한다: CD62L, CD127, CD197 및 CD38. 일 실시형태에서, CD57, CD244, CD160, PD-1, CTLA4, TIM3 및 LAG3의 어린 T 세포 결여 발현이 제공된다. 본 명세서의 다른 곳에서 논의되는 바와 같이, 어린 T 세포 바이오마커의 발현 수준은 더 분화된 T 세포 또는 면역 효과기 세포 집단에서의 이러한 마커의 발현 수준에 비례한다.
일 실시형태에서, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)는 본 명세서에 상정된 T 세포 제조 방법에서 T 세포의 공급원으로서 사용된다. PBMC는 CD4+, CD8+ 또는 CD4+ 및 CD8+일 수 있고, 단핵구, B 세포, NK 세포 및 NKT 세포와 같은 다른 단핵 세포를 포함할 수 있는 T 림프구의 이종성 집단을 형성한다. 본 명세서에 상정된 조작된 TCR 또는 CAR을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터는 인간 공여자 T 세포, NK 세포 또는 NKT 세포 집단으로 도입될 수 있다. 발현 벡터를 운반하는 성공적으로 형질도입된 T 세포는 CD3 양성 T 세포를 단리시키기 위해 유세포분석을 이용하여 분류될 수 있고, 항-CD3 항체 및 또는 항-CD28 항체 및 IL-2, IL-7, 및/또는 IL-15 또는 본 명세서의 다른 곳에 기재된 바와 같은 당업계에 공지된 임의의 다른 방법을 이용하여 세포 활성화에 추가로 변형된 T 세포 수를 증가시키도록 추가로 증식된다.
본 명세서에 상정된 제조 방법은 인간 대상체에서 사용하기 위한 저장 및/또는 제조를 위한 변형된 T 세포의 동결보존을 추가로 포함할 수 있다. 세포가 해동 시에 생존하도록 T 세포는 동결보존된다. 필요하다면, 동결보존된 형질전환 면역 효과기 세포는 해동되며, 성장되고, 더 많은 이러한 세포에 대해 확장될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은, "동결보존"은 0도 미만, 예컨대 (전형적으로) 77 K 또는 -196℃(액체 질소의 비등점)로의 냉각에 의한 세포 보존을 지칭한다. 동결보호제는 종종 저온에서의 냉각 또는 실온으로의 가온으로 인해 보존 중인 세포가 손상되는 것을 방지하기 위해 0도 미만의 온도에서 사용된다. 동결보존제 및 최적의 냉각 속도는 세포 손상에 대해 보호할 수 있다. 사용될 수 있는 동결보호제는 다이메틸설폭사이드(DMSO)(Lovelock and Bishop, Nature, 1959; 183: 1394-1395; Ashwood-Smith, Nature, 1961; 190: 1204-1205), 글리세롤, 폴리비닐피롤리돈 (Rinfret, Ann. N.Y. Acad. Sci., 1960; 85: 576), 및 폴리에틸렌 글리콜(Sloviter and Ravdin, Nature, 1962; 196: 48)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 바람직한 냉각 속도는 1° 내지 3℃/분이다. 적어도 2시간 후에, T 세포는 -80℃의 온도에 도달되고, 장기간 극저온 저장 용기에서와 같은 영구 저장을 위해 액체 질소(-196℃)에 직접 넣어질 수 있다.
5.8. T 세포
본 발명은 개선된 CAR T 세포 조성물의 제조를 상정한다. CAR T 세포 생성을 위해 사용되는 T 세포는 자가/자율("자기") 또는 비-자가("비-자기", 예를 들어, 동종이계, 동질유전자 또는 이종성)일 수 있다. 바람직한 실시형태에서, T 세포는 포유류 대상체로부터 얻는다. 더 바람직한 실시형태에서, T 세포는 영장류 대상체로부터 얻는다. 가장 바람직한 실시형태에서, T 세포는 인간 대상체로부터 얻는다.
T 세포는 말초 혈액 단핵구 세포, 골수, 림프절 조직, 제대혈, 흉선 조직, 감염 부위로부터의 조직, 복수, 흉막 삼출, 비장 조직 및 종양을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 다수의 공급원으로부터 얻을 수 있다. 특정 실시형태에서, T 세포는 당업자에게 공지된 다수의 기법, 예컨대 침강, 예를 들어, FICOLLTM 분리를 이용하여 대상체로부터 수집된 혈액 단위로부터 얻을 수 있다. 일 실시형태에서, 개체의 순환 혈액으로부터의 세포는 성분채집술에 의해 얻는다. 성분채집술 생성물은 전형적으로 T 세포, 단핵구, 과립구, B 세포, 다른 유핵 백혈구, 적혈구 및 혈소판을 포함하는 림프구를 함유한다. 일 실시형태에서, 성분채집술에 의해 수집된 세포는 혈장 분획을 제거하기 위해 그리고 후속 가공을 위한 적절한 완충제 또는 배지에 세포를 위치시키기 위해 세척될 수 있다. 세포는 PBS로 또는 칼슘, 마그네슘, 나머지 모두는 아니지만 대부분의 2가 양이온을 결여하는 다른 적합한 용액으로 세척될 수 있다. 당업자에 의해 인식될 바와 같이, 세척 단계는 당업계에 공지된 방법에 의해, 예컨대 반자동화된 통과액 원심분리를 이용함으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, Cobe 2991 세포 처리기, Baxter CytoMate 등. 세척 후에, 세포는 다양한 생체 적합 완충제에서 또는 완충제와 함께 또는 완충제 없이 다른 식염수 용액에서 재현탁될 수 있다. 특정 실시형태에서, 성분채집술 샘플의 바람직한 성분은 세포가 직접적으로 재현탁된 배양 배지에서 제거될 수 있다.
특정 실시형태에서, T 세포를 포함하는 세포 집단, 예를 들어, PBMC는 본 명세서에 상정된 제조 방법에서 사용된다. 다른 실시형태에서, T 세포의 단리 또는 정제된 집단은 본 명세서에 상정된 제조 방법에서 사용된다. 세포는, 예를 들어, PERCOLLTM 구배를 통해 원심분리에 의해 적혈구를 용해시키고 단핵구를 고갈시킴으로써 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)로부터 단리될 수 있다. 일부 실시형태에서, PBMC의 단리 후에, 세포독성 및 헬퍼 T 림프구는 활성화, 확장, 및/또는 유전자 변형 전에 또는 후에 미경험, 기억 및 효과기 T 세포 하위집단으로 분류될 수 있다.
다음의 마커: CD3, CD4, CD8, CD28, CD45RA, CD45RO, CD62, CD127 및 HLA-DR 중 하나 이상을 발현시키는 T 세포의 특정 하위 집단은 양성 또는 음성 선택 기법에 의해 추가로 단리될 수 있다. 일 실시형태에서, (i) CD62L, CCR7, CD28, CD27, CD122, CD127, CD197; 또는 (ii) CD38 또는 CD62L, CD127, CD197 및 CD38로 이루어진 군으로부터 선택되는 마커 중 하나 이상을 발현시키는 T 세포의 특정 하위집단은 양성 또는 음성 선택 기법에 의해 추가로 단리된다. 다양한 실시형태에서, 제조된 T 세포 조성물은 다음의 마커 중 하나 이상을 발현시키지 않거나 실질적으로 발현시키지 않는다: CD57, CD244, CD160, PD-1, CTLA4, TIM3 및 LAG3.
일 실시형태에서, CD62L, CD127, CD197 및 CD38로 이루어진 군으로부터 선택된 마커 중 하나 이상의 발현은 PI3K 저해제 없이 활성화되고 확장된 T 세포 집단에 비해 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 9배, 적어도 10배, 적어도 25배 이상만큼 증가된다.
일 실시형태에서, CD57, CD244, CD160, PD-1, CTLA4, TIM3 및 LAG3으로 이루어진 군으로부터 선택된 마커 중 하나 이상의 발현은 PI3K 저해제와 함께 활성화되고 확장된 T 세포 집단에 비해 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 9배, 적어도 10배, 적어도 25배 이상만큼 감소된다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 제조 방법은 미경험 또는 발생적으로 강한 T 세포의 하나 이상의 마커를 포함하는 CAR T 세포의 수를 증가시킨다. 임의의 특정 이론으로 구속되는 것을 바라지는 않지만, 본 발명자들은, T 세포를 포함하는 세포 집단을 하나 이상의 PI3K 저해제로 처리하는 것은 발생적으로 강력한 T 세포의 증가 또는 확장을 초래하고 기존의 CAR T 세포 요법에 비해 더 강하고 효능있는 입양 CAR T 세포 면역요법을 제공하는 것으로 여긴다.
본 명세서에 상정된 방법을 이용하여 제조된 T 세포에서 증가된 미경험 또는 발생적으로 강한 T 세포 마커의 예시적인 예는 CD62L, CD127, CD197 및 CD38을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 특정 실시형태에서, 미경험 T 세포는 다음의 마커 중 하나 이상을 발현시키지 않거나 실질적으로 발현시키지 않는다: CD57, CD244, CD160, PD-1, BTLA, CD45RA, CTLA4, TIM3 및 LAG3.
T 세포에 관해, 본 명세서에 상정된 다양한 확장 방법으로부터 초래되는 T 세포 집단은 사용되는 조건에 따라서 다양한 구체적 표현형 특성을 가질 수 있다. 다양한 실시형태에서, 확장된 T 세포 집단은 다음의 표현형 마커 중 하나 이상을 포함한다: CD62L, CD127, CD197, CD38 및 HLA-DR.
일 실시형태에서, 이러한 표현형 마커는 CD62L, CD127, CD197 및 CD38 중 하나 이상 또는 모두의 향상된 발현을 포함한다. 특정 실시형태에서, CD62L, CD127, CD197 및 CD38을 포함하는 미경험 T 세포의 표현형 마커 발현을 특징으로 하는 CD8+ T 림프구는 확장된다.
특정 실시형태에서, CD45RO, CD62L, CD127, CD197 및 CD38을 포함하는 중심 기억 T 세포의 표현형 마커의 발현 및 그랜자임 B에 대해 음성을 특징으로 하는 T 세포가 확장된다. 일부 실시형태에서, 중심 기억 T 세포는 CD45RO+, CD62L+, CD8+ T 세포이다.
특정 실시형태에서, CD62L을 포함하는 미경험 CD4+ 세포의 표현형 마커 및 CD45RA 및/또는 CD45RO의 발현에 대해 음성을 특징으로 하는 CD4+ T 림프구가 확장된다. 일부 실시형태에서, CD62L 및 CD45RO 양성을 포함하는 중심 기억 CD4+ 세포의 표현형 마커의 발현을 특징으로 하는 CD4+ 세포. 일부 실시형태에서, 효과기 CD4+ 세포는 CD62L 양성 및 CD45RO 음성이다.
특정 실시형태에서, T 세포는 개체로부터 단리되고, 항-BCMA CAR을 발현시키기 위해 유전자 변형되기 전에 증폭을 위해 활성화 및 자극된다. 이와 관련하여, T 세포는 유전자 변형되기(즉, 본 명세서에 상정된 항-BCMA CAR을 발현시키기 위해 형질도입되거나 형질감염되기) 전에 그리고/후에 배양될 수 있다.
5.8.1. 활성화 및 확장
충분한 치료적 용량의 T 세포 조성물을 달성하기 위해, T 세포는 종종 자극, 활성화 및/또는 확장의 1회 이상의 라운드가 실시된다. T 세포는, 예를 들어, 미국 특허 제6,352,694호; 제6,534,055호; 제6,905,680호; 제6,692,964호; 제5,858,358호; 제6,887,466호; 제6,905,681호; 제7,144,575호; 제7,067,318호; 제7,172,869호; 제7,232,566호; 제7,175,843호; 제5,883,223호; 제6,905,874호; 제6,797,514호; 및 제6,867,041호에 기재된 바와 같은 방법을 이용하여 일반적으로 활성화 및 확장될 수 있으며, 이들 각각은 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용된다. 항-BCMA CAR을 발현시키도록 변형된 T 세포는 T 세포가 변형되기 전에 그리고/또는 후에 활성화되고 확장될 수 있다. 또한, T 세포는 활성화 및/또는 확장 전에, 동안에 그리고/또는 후에 PI3K 세포 신호전달 경로를 조절하는 하나 이상의 제제와 접촉될 수 있다. 일 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 방법에 의해 제조되는 T 세포는 활성화 및 확장의 1, 2, 3, 4 또는 5회 이상의 라운드를 겪고, 이들 각각은 PI3K 세포 신호전달 경로를 조절하는 하나 이상의 제제를 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 공자극 리간드는 T 세포 상의 동종 공자극 분자에 특이적으로 결합함으로써, 예를 들어, TCR/CD3 복합체의 결합에 의해 제공되는 1차 신호에 추가로, 목적하는 T 세포 반응을 매개하는 신호를 제공하는, 항원 제시 세포(예를 들어, aAPC, 수지상 세포, B 세포 등) 상에서 제시된다. 적합한 공자극 리간드는 CD7, B7-1(CD80), B7-2(CD86), PD-L 1, PD-L2, 4-1BBL, OX40L, 유도성 공자극 리간드(ICOS-L), 세포내 접착 분자(ICAM), CD30L, CD40, CD70, CD83, HLA-G, MICA, MICB, HVEM, 림포톡신 베타 수용체, ILT3, ILT4, Toll 리간드 수용체에 결합하는 작용제 또는 항체, 및 B7-H3에 특이적으로 결합하는 리간드를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
특정 실시형태에서, 공자극 리간드는 CD27, CD28, 4- IBB, OX40, CD30, CD40, PD-1, 1COS, 림프구 기능-연관 항원 1(LFA-1), CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, 및 CD83에 특이적으로 결합하는 리간드를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는, T 세포 상에 존재하는 공자극 분자에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다.
적합한 공자극 리간드는 변형 T 세포 상에서 발현되는 조작된 TCR 또는 CAR에 결합하는 APC 또는 aAPC 상에서 발현되거나 가용성 형태로 제공될 수 있는 표적 항원을 추가로 포함한다.
다양한 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 T 세포의 제조 방법은 T 세포를 포함하는 세포 집단을 활성화하는 단계 및 T 세포 집단을 확장시키는 단계를 포함한다. T 세포 활성화는 T 세포 TCR/CD3 복합체를 통해 1차 자극 신호를 제공함으로써 또는 CD2 표면 단백질의 자극을 통해 또는 부속 분자, 예를 들어, CD28을 통해 2차 공자극 신호를 제공함으로써 달성될 수 있다.
TCR/CD3 복합체는 T 세포를 적합한 CD3 결합제, 예를 들어, CD3 리간드 또는 항-CD3 단클론성 항체와 접촉시킴으로써 자극될 수 있다. CD3 항체의 예시적인 예는 OKT3, G19-4, BC3 및 64.1을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
다른 실시형태에서, CD2 결합제는 T 세포에 1차 자극 신호를 제공하는 데 사용될 수 있다. CD2 결합제의 예시적 예는 T11.1 또는 T11.2 항체(Meuer, S. C. et al. (1984) Cell 36:897-906) 및 9.6 항체(TI 1.1과 동일한 에피토프를 인식)와 조합하고, 9-1 항체와 조합한 T11.3 항체와 같은, CD2 리간드 및 항-CD2 항체를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다(Yang, S. Y. et al. (1986) J. Immunol. 137:1097-1100). 임의의 상기 기재한 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 다른 항체가 또한 사용될 수 있다. 추가적인 항체 또는 항체의 조합물은 본 명세서의 다른 곳에 개시된 바와 같은 표준 기법에 의해 제조되고 확인될 수 있다.
TCR/CD3 복합체를 통해 또는 CD2를 통해 제공되는 1차 자극 신호에 추가로, T 세포 반응의 유도는 제2 공자극 신호를 필요로 한다. 특정 실시형태에서, CD28 결합제는 공자극 신호를 제공하는 데 사용될 수 있다. CD28 결합제의 예시적인 예는 천연 CD 28 리간드, 예를 들어, CD28에 대한 천연 리간드(예를 들어, 단백질의 B7 패밀리의 구성원, 예컨대 B7-1(CD80) 및 B7-2(CD86)); 및 CD28 분자, 예를 들어, 단클론성 항체 9.3, B-T3, XR-CD28, KOLT-2, 15E8, 248.23.2 및 EX5.3D10을 가교할 수 있는 항-CD28 단클론성 항체 또는 이의 단편을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
일 실시형태에서, 1차 자극 신호를 제공하는 분자, 예를 들어 TCR/CD3 복합체 또는 CD2를 통해 자극을 제공하는 분자, 및 공자극 분자는 동일한 표면 상에 결합된다.
특정 실시형태에서, 자극 및 공자극 신호를 제공하는 결합제는 세포 표면 상에서 국소화된다. 이는 세포 표면 상에서의 발현에 적합한 형태로 결합제를 암호화하는 핵산에 의해 세포를 형질감염 또는 형질도입함으로써 또는 대안적으로는 세포 표면에 결합제를 결합함으로써 달성될 수 있다.
다른 실시형태에서, 1차 자극 신호를 제공하는 분자, 예를 들어 TCR/CD3 복합체 또는 CD2를 통해 자극을 제공하는 분자, 및 공자극 분자는 항원 제시 세포 상에 나타난다.
일 실시형태에서, 1차 자극 신호를 제공하는 분자, 예를 들어 TCR/CD3 복합체 또는 CD2를 통해 자극을 제공하는 분자, 및 공자극 분자는 별개의 표면 상에 제공된다.
특정 실시형태에서, 자극 및 공자극 신호를 제공하는 결합제 중 하나는 가용성이고(용액 중에 제공되고), 다른 제제(들)는 하나 이상의 표면 상에 제공된다.
특정 실시형태에서, 자극 및 공자극 신호를 제공하는 결합제는 가용성 형태로 제공된다(용액 중에 제공된다).
다양한 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 T 세포를 제조하기 위한 방법은 항-CD3 및 항-CD28 항체를 이용하여 T 세포를 활성화시키는 단계를 포함한다.
본 명세서에 상정된 방법에 의해 제조된 T 세포 조성물은 PI3K 세포 신호전달 경로를 저해하는 하나 이상의 제제의 존재 하에 활성화되고/되거나 확장되는 T 세포를 포함한다. 항-BCMA CAR을 발현시키도록 변형된 T 세포는 T 세포가 변형되기 전에 그리고/또는 후에 활성화되고 확장될 수 있다. 특정 실시형태에서, T 세포 집단은 항-BCMA CAR을 발현시키도록 활성화되고, 변형되고, 이어서, 확장을 위해 배양된다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 방법에 의해 제조된 T 세포는 높은 증식 가능성 및 자기 재생 능력을 나타내는 마커를 발현시키지만, T 세포 분화의 실질적으로 검출 가능한 마커를 발현시키지 않거나 또는 발현시키는 증가된 수의 T 세포를 포함한다. 이들 T 세포는 강한 방식으로 반복적으로 활성화되고 확장될 수 있으며, 이에 의해 개선된 치료적 T 세포 조성물을 제공한다.
일 실시형태에서, PI3K 세포 신호전달 경로를 저해하는 하나 이상의 제제의 존재 하에 활성화되고 확장되는 T 세포 집단은 PI3K 저해제 없이 활성화되고 확장된 T 세포 집단에 비해 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 9배, 적어도 10배, 적어도 25배, 적어도 50배, 적어도 100배, 적어도 250배, 적어도 500배, 적어도 1000배 이상 확장된다.
일 실시형태에서, 어린 T 세포의 발현을 특징으로 하는 T 세포 집단은 PI3K 세포 신호전달 경로를 저해하는 하나 이상의 제제의 존재 하에 활성화되고 확장되며, PI3K 저해제 없이 활성화되고 확장된 T 세포 집단에 비해 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 9배, 적어도 10배, 적어도 25배, 적어도 50배, 적어도 100배, 적어도 250배, 적어도 500배, 적어도 1000배 이상 확장된다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 방법에 의해 활성화된 T 세포를 확장시키는 것은 몇 시간(약 3시간) 내지 약 7일, 내지 약 28일 또는 그 사이의 임의의 시간의 정수 값 동안 T 세포를 포함하는 세포 집단을 배양시키는 단계를 추가로 포함한다. 다른 실시형태에서, T 세포 조성물은 14일 동안 배양될 수 있다. 특정 실시형태에서, T 세포는 약 21일 동안 배양된다. 다른 실시형태에서, T 세포 조성물은 약 2 내지 3일 동안 배양된다. T 세포의 배양 시간이 60일 이상일 수 있도록 자극/활성화/확장의 몇 회의 순환이 또한 요망될 수 있다.
특정 실시형태에서, T 세포 배양물에 적절한 조건은 적절한 배지(예를 들어, 최소 필수 배지 또는 RPMI 배지 1640 또는 X-vivo 15(론자(Lonza))), 및 혈청(예를 들어, 소 태아 또는 인간 혈청), 인터류킨-2(IL-2), 인슐린, IFN-γ, IL-4, IL-7, IL-21, GM-CSF, IL- 10, IL- 12, IL-15, TGFβ 및 TNF-α 또는 당업자에게 공지된 세포의 성장에 적합한 임의의 다른 첨가제를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 증식 및 생존도에 필수적인 하나 이상의 인자를 포함한다.
세포 배양 배지의 추가적인 예시적 예는 아미노산, 피루브산나트, 및 비타민이 첨가되고, 적절한 양의 혈청(또는 혈장) 또는 정해진 세트의 호르몬 및/또는 T 세포의 성장 및 확장에 충분한 양의 사이토카인(들)로 보충되거나 무혈청인 RPMI 1640, Clicks, AIM-V, DMEM, MEM, a-MEM, F-12, X-Vivo 1 5, 및 X-Vivo 20, 옵티마이저(Optimizer)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
T 세포 확장을 위한 다른 첨가제의 예시적인 예는 계면활성제, 플라스마네이트, pH 완충제, 예컨대 HEPES, 및 환원제, 예컨대 N-아세틸-시스테인 및 2-머캅토에탄올을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
항생제, 예를 들어, 페니실린 및 스트렙토마이신은 실험 배양물에만 포함되고, 대상체에 주입되지 않는 세포 배양물에는 포함되지 않는다. 표적 세포는 성장을 뒷받침하는 데 필요한 조건, 예를 들어, 적절한 온도(예를 들어, 37℃) 및 대기(예를 들어, 공기 + 5% CO2) 하에 유지된다.
특정 실시형태에서, PBMC 또는 단리된 T 세포는 적절한 사이토카인, 예컨대 IL-2, IL-7 및/또는 IL-15가 있는 배양 배지에서 비드 또는 다른 표면에 일반적으로 부착되는 자극제 및 공자극제, 예컨대 항-CD3 및 항-CD28 항체와 접촉된다.
다른 실시형태에서, 다양한 공자극 분자 및 사이토카인의 안정한 발현 및 분비를 지시하기 위해 K562, U937, 721.221, T2, 및 C1R 세포를 조작함으로써 인공 APT(aAPC)가 생성될 수 있다. 특정 실시형태에서, AAPC 세포 표면 상에서 하나 이상의 항체-기반 자극 분자의 디스플레이를 지시하기 위해 K32 또는 U32 aAPC가 사용된다. T 세포의 집단은 CD137L(4-1BBL), CD134L(OX40L) 및/또는 CD80 또는 CD86을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 다양한 공자극 분자를 발현시키는 aAPC에 의해 확장될 수 있다. 최종적으로, aAPC는 유전자 변형된 T 세포를 확장시키기 위해 그리고 CD8 T 세포 상에서 CD28 발현을 유지하기 위해 효율적인 플랫폼을 제공한다. WO 03/057171 및 미국 특허 제2003/0147869호에 제공된 aAPC는 본 명세서에 전문이 참조에 의해 원용된다.
5.8.2. 제제
다양한 실시형태에서, T 세포를 세포에서 PI3K 경로를 조절하는 제제와 접촉시키는 단계를 포함하는 비분화 또는 발생적으로 강한 T 세포를 확장시키는 T 세포의 제조 방법이 제공된다. 다양한 실시형태에서, T 세포를 세포에서 PI3K/AKT/mTOR 경로를 조절하는 제제와 접촉시키는 단계를 포함하는 비분화 또는 발생적으로 강한 T 세포를 확장시키는 T 세포의 제조 방법이 제공된다. 세포는 활성화 및 확장 전에, 동안에 그리고/또는 후에 접촉될 수 있다. T 세포 조성물은 분화에서의 실질적인 증가 없이 다회 라운드의 확장을 겪을 수 있도록 충분한 T 세포 효능을 보유한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "조절한다", "조절제" 또는 "조절 제제" 또는 비슷한 용어는 세포 신호전달 경로에서 변화를 유발하는 제제의 능력을 지칭한다. 조절제는 경로 성분의 양, 활성을 증가시키거나, 감소시키거나, 세포 신호전달 경로의 목적하는 효과 또는 결과를 증가시키거나 감소시킬 수 있다. 일 실시형태에서, 조절제는 저해제이다. 다른 실시형태에서, 조절제는 활성체이다.
"제제"는 화합물, 소분자, 예를 들어, PI3K/AKT/mTOR 경로의 조절에서 사용되는 소 유기 분자, 핵산, 폴리펩타이드, 또는 이들의 단편, 아이소폼, 변이체, 유기체 또는 유도체를 지칭한다.
"소분자"는 분자량이 약 5kD 미만, 약 4kD 미만, 약 3kD 미만, 약 2kD 미만, 약 1kD 미만 또는 약 0.5kD 미만인 조성물을 지칭한다. 소분자는 핵산, 펩타이드, 폴리펩타이드, 펩타이드모방체, 펩토이드, 탄수화물, 지질, 이들의 구성성분 또는 기타 유기 또는 무기 분자를 포함할 수 있다. 화학적 및/또는 생물학적 혼합물, 예컨대 진균, 박테리아, 또는 조류 추출물의 라이브러리는 당업계에 공지되어 있으며, 본 발명의 임의의 분석에서 선별될 수 있다. 분자 라이브러리의 합성을 위한 방법은 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Carell et al., 1994a; Carell et al., 1994b; Cho et al., 1993; DeWitt et al., 1993; Gallop et al., 1994; Zuckermann et al., 1994] 참조).
"유사체"는 본 발명의 목적하는 활성을 갖는 화합물, 뉴클레오타이드, 단백질 또는 폴리펩타이드 또는 화합물과 유사하거나 동일한 활성을 갖지만, 바람직한 실시형태의 서열 또는 구조와 유사하거나 동일한 서열 또는 구조를 반드시 포함할 필요는 없는 소 유기 화합물, 뉴클레오타이드, 단백질 또는 폴리펩타이드를 지칭한다.
"유도체"는 아미노산 잔기 치환, 결실 또는 첨가, 또는 뉴클레오타이드 치환 또는 결실, 첨가 또는 돌연변이의 도입에 의해 변형된 핵산 또는 뉴클레오타이드의 도입에 의해 변형된 모 단백질 또는 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 포함하는 화합물, 단백질 또는 폴리펩타이드를 지칭한다. 유도체 핵산, 뉴클레오타이드, 단백질 또는 폴리펩타이드는 모 폴리펩타이드와 유사하거나 동일한 기능을 갖는다.
다양한 실시형태에서, PI3K 경로를 조절하는 제제는 경로 성분을 활성화한다. "활성체" 또는 "작용제"는 PI3K의 하나 이상의 활성을 저해하는 분자를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는, PI3K/AKT/mTOR 경로 내 분자의 하나 이상의 활성을 촉진시키거나, 증가시키거나, 유도하는 제제를 지칭한다.
다양한 실시형태에서, PI3K 경로를 조절하는 제제는 경로 성분을 저해한다. "저해제" 또는 "길항제"는 PI3K를 포함하지만, 이것으로 제한되지 않는, PI3K 경로 내 분자의 하나 이상의 활성을 저해하거나, 줄이거나, 감소시키는 제제를 지칭한다. 일 실시형태에서, 저해제는 이중 분자 저해제이다. 특정 실시형태에서, 저해제는 동일하거나 실질적으로 유사한 활성을 갖는 분자 부류(pan-저해제)를 저해할 수 있지만, 분자의 활성을 특이적으로 저해할 수도 있다(선택적 또는 특이적 저해제). 저해는 또한 비가역적 또는 가역적일 수 있다.
일 실시형태에서, 저해제는 IC50이 적어도 1nM, 적어도 2nM, 적어도 5nM, 적어도 10nM, 적어도 50nM, 적어도 100nM, 적어도 200nM, 적어도 500nM, 적어도 1μM, 적어도 10μM, 적어도 50μM 또는 적어도 100μM이다. IC50 결정은 당업계에 공지된 임의의 통상적인 기법을 이용하여 달성될 수 있다. 예를 들어, IC50은 연구 하에서 다양한 농도의 저해제의 존재 하에 주어진 효소의 활성을 측정함으로써 결정될 수 있다. 이어서, 효소 활성의 실험적으로 얻은 값은 사용되는 저해제 농도에 대해 플롯팅된다. (임의의 저해제가 없는 활성에 비해) 50%의 효소 활성을 나타내는 저해제의 농도는 "IC50" 값으로서 취해진다. 유사하게는, 다른 저해 농도는 활성의 적절한 결정을 통해 정해질 수 있다.
다양한 실시형태에서, T 세포는 PI3K 경로의 하나 이상의 조절제와 적어도1nM, 적어도 2nM, 적어도 5nM, 적어도 10nM, 적어도 50nM, 적어도 100nM, 적어도 200nM, 적어도 500nM, 적어도 1μM, 적어도 10μM, 적어도 50μM, 적어도 100μM, 또는 적어도 1 M 농도로 접촉되거나, 처리되거나 또는 배양된다.
특정 실시형태에서, T 세포는 적어도 12시간, 18시간, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일, 적어도 2주, 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개월 이상 동안 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10회 이상의 확장 라운드로 PI3K 경로의 하나 이상의 조절제와 접촉되거나, 처리되거나, 배양될 수 있다.
5.8.3. PI3K/Akt/mTOR 경로
라파마이신 경로의 포스파티딜-이노시톨-3 키나제/Akt/포유류 표적은 세포의 증식, 분화, 대사 및 생존에 의한 성장 인자 신호전달을 통합하기 위한 도관으로서 작용한다. PI3K는 고도로 보존된 세포내 지질 키나제의 패밀리이다. 클래스 IA PI3K는 직접적으로 또는 어댑터 분자의 인슐린 수용체 기질 패밀리와의 상호작용을 통해 성장 인자 수용체 타이로신 키나제(RTK)에 의해 활성화된다. 이런 활성은 세린/트레오닌 키나제 Akt의 조절제인 포스파티딜-이노시톨-3,4,5-트리스포스페이트(PIP3)의 생산을 초래한다. mTOR은 별개의 활성을 부여하는 상이한 결합 상대를 각각 특징으로 하는 2개의 별개의 복합체를 통한 정규 PI3K 경로를 통해 작용한다. mTORC1(PRAS40, 랩터(raptor) 및㎖ST8/GbL과의 복합체에서의 mTOR)은 성장 인자 신호를 단백질 번역, 세포 성장, 증식 및 생존과 연결하는 PI3K/Akt 신호전달의 하류의 효과기로서 작용한다. mTORC2(릭터(rictor), mSIN1, 프로터(protor) 및㎖ST8과의 복합체에서의 mTOR)은 Akt의 상류 활성체로서 작용한다.
PI3K의 성장 인자 수용체-매개 활성화 시, Akt는 이의 플레크스트린 상동체 도메인과 PIP3의 상호작용을 통해 막에 보충되고, 따라서 이의 활성화 루프를 노출시키고, 구성적으로 활성인 포스포이노시타이드-의존적 단백질 키나제 1(PDK1)에 의해 트레오닌 308(Thr308)에서의 인산화를 가능하게 한다. 최대 활성화를 위해, Akt는 또한 이의 C-말단 소수성 모티프의 세린 473(Ser473)에서 mTORC2에 의해 인산화된다. DNA-PK 및 HSP는 또한 Akt 활성의 조절에서 중요한 것으로 나타났다. Akt는 TSC1과 함께, mTORC1의 양성 조절자인 Rheb GTPase를 저해함으로써 mTORC1을 음성 조절하는 TSC2의 저해 인산화를 통해 mTORC1을 활성화한다. mTORC1은 has 2가지의 잘 한정된 기질인, p70S6K(본 명세서에서 이후에 S6K1로도 지칭됨) 및 4E-BP1을 가지며, 이들 둘 다 단백질 합성을 결정적으로 조절한다. 따라서, mTORC1은 성장 인자 신호 전달을 단백질 번역 및 세포 증식과 연결하는 PI3K의 중요한 하류 효과기이다.
5.8.4. PI3K 저해제
본 명세서에서 사용되는 용어 "PI3K 저해제"는 PI3K에 결합하거나 이의 적어도 하나의 활성을 저해하는 핵산, 펩타이드, 화합물 또는 소분자 유기 분자를 지칭한다. PI3K 단백질은 3가지 부류, 즉, 클래스 1 PI3K, 클래스 2 PI3K 및 클래스 3 PI3K로 나누어질 수 있다. 클래스 1 PI3K는 4가지 p110 촉매적 서브유닛(p110α, p110β, p110δ 및 p110γ) 중 하나 및 조절 서브유닛의 2가지 패밀리 중 하나로 이루어진 이형이량체로서 존재한다. 본 발명의 PI3K 저해제는 바람직하게는 클래스 1 PI3K 저해제를 표적화한다. 일 실시형태에서, PI3K 저해제는 클래스 1 PI3K 저해제의 하나 이상의 아이소폼에 대해 선택성(즉, p110α, p110β, p110δ 및 p110γ 또는 p110α, p110β, p110δ 및 p110γ 중 하나 이상에 대해 선택성)을 나타낼 것이다. 다른 양상에서, PI3K 저해제는 아이소폼 선택성을 나타내지 않을 것이며, "pan-PI3K 저해제"로서 간주된다. 일 실시형태에서, PI3K 저해제는 PI3K 촉매적 도메인에 대한 결합에 대해 ATP와 경쟁할 것이다.
특정 실시형태에서, PI3K 저해제는, 예를 들어, 표적 PI3K뿐만 아니라 PI3K-AKT-mTOR 경로에서의 추가적인 단백질을 표적화할 수 있다. 특정 실시형태에서, mTOR과 PI3K를 둘 다 표적화하는 PI3K 저해제는 mTOR 저해제 또는 PI3K 저해제 중 하나로서 지칭될 수 있다. PI3K만을 표적화하는 PI3K 저해제는 선택적 PI3K 저해제로서 지칭될 수 있다. 일 실시형태에서, 선택적 PI3K 저해제는 경로에서mTOR 및/또는 다른 단백질에 대한 저해제의 IC50보다 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 30배, 적어도 50배, 적어도 100배, 적어도 1000배 이상인 PI3K에 대한 50% 저해 농도를 나타내는 제제를 지칭하는 것으로 이해될 수 있다.
특정 실시형태에서, 예시적인 PI3K 저해제는 약 200nM 이하, 바람직하게는 약 100 nm 이하, 훨씬 더 바람직하게는 약 60nM 이하, 약 25nM, 약 10nM, 약 5nM, 약 1nM, 100μM, 50μM, 25μM, 10μM, 1μM 이하의 IC50(활성의 50%를 저해하는 농도)으로 PI3K를 저해한다. 일 실시형태에서, PI3K 저해제는 약 2nM 내지 약 100 nm, 더 바람직하게는 약 2nM 내지 약 50nM, 훨씬 더 바람직하게는 약 2nM 내지 약 15nM의 IC50으로 PI3K를 저해한다.
T 세포 제조 본 명세서에 상정된 방법에서 사용하는 데 적합한 PI3K 저해제의 예시적 예는 BKM120(클래스 1 PI3K 저해제, 노바티스(Novartis)), XL147 (클래스 1 PI3K 저해제, 엑셀리시스(Exelixis)), (pan-PI3K 저해제, 글락소스미스클라인(GlaxoSmithKline)) 및 PX-866(클래스 1 PI3K 저해제; p110α, p110β 및 p110γ 아이소폼, 온코티레온(Oncothyreon))을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
선택적 PI3K 저해제의 다른 예시적 예는 BYL719, GSK2636771, TGX-221, AS25242, CAL-101, ZSTK474 및 IPI-145를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
pan-PI3K 저해제의 추가적인 예시적 예는 BEZ235, LY294002, GSK1059615, TG100713 및 GDC-0941을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
5.8.5. AKT 저해제
본 명세서에서 사용되는 용어 "AKT 저해제"는 AKT의 적어도 하나의 활성을 저해하는 핵산, 펩타이드, 화합물 또는 소분자 유기 분자를 지칭한다. AKT 저해제는 지질계 저해제(예를 들어, AKT가 혈장막에 국소화되는 것을 방지하는 AKT의 플렉스트린 상동체 도메인을 표적화하는 저해제), ATP-경쟁적 저해제 및 다른자리 입체성 저해제를 포함하는 몇몇 부류로 그룹화될 수 있다. 일 실시형태에서, AKT 저해제는 AKT 촉매 부위에 대한 결합에 의해 작용한다. 특정 실시형태에서, Akt 저해제는 하류의 AKT 표적, 예컨대 mTOR의 인산화를 저해함으로써 작용한다. 다른 실시형태에서, 예를 들어, AKT의 DNA-PK 활성화, AKT의 PDK-1 활성화, 및/또는 Akt의 mTORC2 활성화를 저해함으로써 입력 신호가 활성화되는 것을 저해함으로써, AKT 활성이 저해된다.
AKT 저해제는 모두 3가지의 AKT 아이소폼, 즉, AKT1, AKT2, AKT3을 표적화할 수 있거나, 선택적 아이오폼일 수 있거나, AKT 아이소폼 중 단지 하나 또는 둘만을 표적화할 수 있다. 일 실시형태에서, AKT 저해제는 PI3K-AKT-mTOR 경로에서 AKT뿐만 아니라 추가적인 단백질을 표적화할 수 있다. AKT만을 표적화하는 AKT 저해제는 선택적 AKT 저해제로서 지칭될 수 있다. 일 실시형태에서, 선택적 AKT 저해제는 경로에서 다른 단백질에 대한 저해제의 IC50보다 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 30배, 적어도 50배, 적어도 100배, 적어도 1000배 이상인 AKT에 대한 50% 저해 농도를 나타내는 제제를 지칭하는 것으로 이해될 수 있다.
특정 실시형태에서, 예시적인 AKT 저해제는 약 200nM 이하, 바람직하게는 약 100nm 이하, 훨씬 더 바람직하게는 약 60nM 이하, 약 25nM, 약 10nM, 약 5nM, 약 1nM, 100μM, 50μM, 25μM, 10μM, 1μM 이하의 IC50(활성의 50%를 저해하는 농도)으로 AKT를 저해한다. 일 실시형태에서, AKT는 약 2nM 내지 약 100nm, 더 바람직하게는 약 2nM 내지 약 50nM, 훨씬 더 바람직하게는 약 2nM 내지 약 15nM의 IC50으로 AKT를 저해한다.
아우리스타틴계 항체-약물 접합체와 병용하여 사용하기 위한 AKT 저해제의 예시적 예는, 예를 들어, 페리포신(케릭스(Keryx)), MK2206(머크(Merck)), VQD-002(바이오퀘스트(VioQuest)), XL418(엑셀리시스), GSK690693, GDC-0068 및 PX316(프롤엑스 파마슈티컬스(PROLX Pharmaceuticals))를 포함한다.
선택적 Akt1 저해제의 예시적인, 비제한적 예는 A-674563이다.
선택적 Akt2 저해제의 예시적인, 비제한적 예는 CCT128930이다.
특정 실시형태에서, Akt의 Akt 저해제 DNA-PK 활성화, Akt의 PDK-1 활성화, Akt의 mTORC2 활성화 또는 Akt의 HSP 활성화.
DNA-PK 저해제의 예시적 예는 NU7441, PI-103, NU7026, PIK-75 및 PP-121을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
5.8.6. mTOR 저해제
용어 "mTOR 저해제" 또는 "mTOR을 저해하는 제제"는 mTOR 단백질의 적어도 하나의 활성, 예를 들어, 기질 중 적어도 하나(예를 들어, p70S6 키나제 1, 4E-BP1, AKT/PKB 및 eEF2)에 대해 세린/트레오닌 단백질 키나제 활성을 저해하는 핵산, 펩타이드, 화합물 또는 소 유기 분자를 지칭한다. mTOR 저해제는 mTORC1, mTORC2 또는 mTORC1과 mTORC2 둘 다에 직접 결합하고, 이를 저해할 수 있다.
mTORC1 및/또는 mTORC2 활성의 저해는 PI3K/Akt/mTOR 경로의 신호 전달 감소에 의해 결정될 수 있다. 이러한 신호전달 경로의 결과 감소를 확립하기 위해 매우 다양한 판독이 이용될 수 있다. 일부 비제한적인 예시적인 판독은 (1) 5473 및 T308을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 잔기에서 Akt의 인산화 감소; (2) 예를 들어, Fox01/O3a T24/32, GSK3a/β; S21/9 및 TSC2 T1462를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 Akt 기질의 인산화 감소에 의해 입증되는 바와 같은 Akt의 활성화 감소; (3) 리보솜 S6 S240/244, 70S6K T389 및 4EBP1 T37/46을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 mTOR 하류의 신호전달 분자의 임산화 감소; 및 (4) 암성 세포 증식의 저해를 포함한다.
일 실시형태에서, mTOR 저해제는 활성 부위 저해제이다. 이들은 mTOR의 ATP 결합 부위(또한 ATP 결합 포켓으로도 지칭됨)에 결합하고, mTORC1과 mTORC2 둘 다의 촉매 활성을 저해하는 mTOR 저해제이다. T 세포 제조 본 명세서에 상정된 방법에서 사용하는 데 적합한 활성 부위 저해제의 한 가지 부류는 PI3K와 mTOR 둘 다를 표적화하고 직접 저해하는 이중 특이성 저해제이다. 이중 특이성 저해제는 mTOR 및 PI3K의 ATP 결합 부위 둘 다에 결합한다. 이러한 저해제의 예시적 예는 이미다조퀴나졸린, 워트만닌, LY294002, PI-103(카이만 케미컬), SF1126(세마포레(Semafore)), BGT226(노바티스), XL765(엑셀리시스) 및 NVP-BEZ235(노바티스)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 명세서에 상정된 방법에서 사용하기에 적합한 mTOR 활성 부위 저해제의 다른 부류는 하나 이상의 I형 포스파티딜이노시톨 3-키나제, 예를 들어, PI3 키나제 α, β, γ 또는 δ에 비해 mTORC1 및 mTORC2 활성을 선택적으로 저해한다. 이들 활성 부위 저해제는 mTOR의 활성 부위에 결합하지만, PI3K에는 결합하지 않는다. 이러한 저해제의 예시적 예는 피라졸로피리미딘, Torin1(구에르틴(Guertin)과 사바티니(Sabatini)), PP242(2-(4-아미노-1-아이소프로필-1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-3-일)-1H-인돌-5-올), PP30, Ku-0063794, WAY-600(와이어스(Wyeth)), WAY-687(와이어스), WAY-354(와이어스) 및 AZD8055(Liu et al., Nature Review, 8, 627-644, 2009)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
일 실시형태에서, 선택적 mTOR 저해제는 1, 2, 3가지 이상의 I형 PI3-키나제에 대한 또는 I형 PI3-키나제 모두에 대한 저해제의 IC50보다 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 50배, 적어도 100배, 적어도 1000배 이상인 mTORC1 및/또는 mTORC2에 대한 50% 저해 농도(IC50)를 나타내는 제제를 지칭한다.
본 발명에서 사용하기 위한 mTOR 저해제의 다른 부류는 본 명세서에서 "라팔로그"로서 지칭된다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "라팔로그"는 mTOR FRB 도메인(FKBP 라파마이신 결합 도메인)에 특이적으로 결합하고, 라파마이신과 구조적으로 관련되며, mTOR 저해 특성을 보유하는 화합물을 지칭한다. 용어 라팔로그는 라파마이신을 제외한다. 라팔로그는 라파마이신의 에스터, 에터, 옥심, 하이드라존 및 하이드록실아민뿐만 아니라 라파마이신 코어 구조 상의 작용기가, 예를 들어, 환원 또는 산화에 의해 변형된 화합물을 포함한다. 이러한 화합물의 약제학적으로 허용 가능한 염은 또한 라파마이신 유도체인 것으로 간주된다. 본 명세서에 상정된 방법에서 사용하기에 적합한 라팔로그의 예시적 예는 템시롤리무스(CC1779), 에베롤리무스(RAD001), 데포롤리무스(AP23573), AZD8055(아스트라제네카(AstraZeneca)) 및 OSI-027(OSI)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
일 실시형태에서, 제제는 mTOR 저해제 라파마이신(시롤리무스)이다.
특정 실시형태에서, 본 발명에서 사용하기 위한 예시적인 mTOR 저해제는 약 200nM 이하, 바람직하게는 약 100 nm 이하, 훨씬 더 바람직하게는 약 60nM 이하, 약 25nM, 약 10nM, 약 5nM, 약 1nM, 100μM, 50μM, 25μM, 10μM, 1μM 이하의 IC50(활성의 50%를 저해하는 농도)으로 mTORC1, mTORC2 또는 mTORC1과 mTORC2 둘 다를 저해한다. 일 양상에서, 본 발명에서 사용하기 위한 mTOR 저해제는 약 2nM 내지 약 100 nm, 더 바람직하게는 약 2nM 내지 약 50nM, 훨씬 더 바람직하게는 약 2nM 내지 약 15nM의 IC50으로 mTORC1, mTORC2 또는 mTORC1과 mTORC2 둘 다를 저해한다.
일 실시형태에서, 예시적인 mTOR 저해제는 약 200nM 이하, 바람직하게는 약 100 nm 이하, 훨씬 더 바람직하게는 약 60nM 이하, 약 25nM, 약 10nM, 약 5nM, 약 1nM, 100μM, 50μM, 25μM, 10μM, 1μM 이하의 IC50(활성의 50%를 저해하는 농도)으로 PI3K와 mTORC1 또는 mTORC2, 또는 mTORC1과 mTORC2 둘 다와 PI3K를 저해한다. 일 양상에서, 본 발명에서 사용하기 위한 mTOR 저해제는 약 2nM 내지 약 100 nm, 더 바람직하게는 약 2nM 내지 약 50nM, 훨씬 더 바람직하게는 약 2nM 내지 약 15nM의 IC50으로 PI3K와 mTORC1 또는 mTORC2 또는 mTORC1과 mTORC2 둘 다와 PI3K를 저해한다.
본 명세서에 상정된 특정 실시형태에서 사용하기에 적합한 mTOR 저해제의 추가적인 예시적 예는 AZD8055, INK128, 라파마이신, PF-04691502, 및 에베롤리무스를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
mTOR은 웨스턴 블롯팅에서 인-특이적 항체에 의해 측정할 때, 생리적 기질 단백질, p70 S6 리보솜 단백질 키나제 I(p70S6K1) 및 eIF4E 결합 단백질 1(4EBP1)에 대해 강하고 특이적인 촉매 활성을 입증하는 것으로 나타났다.
일 실시형태에서, PI3K/AKT/mTOR 경로의 저해제는 BI-D1870, H89, PF-4708671, FMK 및 AT7867로 이루어진 군으로부터 선택되는 s6 키나제 저해제이다.
5.9. 조성물 및 제형
본 명세서에 상정된 조성물은 본 명세서에 상정된 바와 같은 하나 이상의 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 이를 포함하는 벡터, 유전자 변형된 면역 효과기 세포 등을 포함할 수 있다. 조성물은 약제학적 조성물을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. "약제학적 조성물"은 단독으로 또는 한 가지 이상의 다른 요법 양상과 병용하여 세포 또는 다른 동물에 대한 투여를 위해 약제학적으로-허용 가능한 또는 생리적으로-허용 가능한 용액에서 제형화된 조성물을 지칭한다. 또한 원한다면, 본 발명의 조성물은 마찬가지로 다른 제제, 예컨대, 사이토카인, 성장 인자, 호르몬, 소분자, 화학치료제, 프로드러그, 약물, 항체 또는 다른 다양한 약제학적으로-활성제와 병용하여 투여될 수 있다는 것이 이해될 것이다. 또한 조성물에 포함될 수 있는 다른 성분에 대한 제한은 사실상 없으며, 단, 추가적인 제제는 의도된 요법을 전달하기 위한 조성물의 능력에 유해하게 영향을 미치지 않는다.
어구 "약제학적으로 허용 가능한"은 타당한 의학적 판단의 범주 내에서, 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 또는 다른 문제 또는 합병증 없이, 합리적인 유해/유익비에 비례하여 인간 및 동물 조직과 접촉하여 사용하기에 적합한 화합물, 물질, 조성물 및/또는 투약 형태를 지칭하기 위해 본 명세서에서 사용된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "약제학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제"는 인간 또는 가축 동물에서 사용에 대해 허용 가능한 것으로 미국식품의약관리국에 의해 승인된 임의의 보조제, 담체, 부형제, 활택제, 감미제, 희석제, 보존제, 염료/착색제, 향미 증진제, 계면활성제, 습윤제, 분산제, 현탁제, 안정제, 등장제, 용매, 계면활성제 또는 유화제를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 예시적인 약제학적으로 허용 가능한 담체는 당, 예컨대 락토스, 글루코스 및 수크로스; 전분, 예컨대 옥수수 전분 및 감자 전분; 셀룰로스, 및 이의 유도체, 예컨대 카복시메틸셀룰로스나트륨, 에틸 셀룰로스 및 셀룰로스 아세테이트; 트래거캔스; 맥아; 젤라틴; 활석; 코코아버터, 왁스, 동물 및 식물성 지방, 파라핀, 실리콘, 벤토나이트, 규산, 산화아연; 오일, 예컨대 땅콩유, 면실유, 홍화유, 참깨유, 올리브유, 옥수수유 및 대두유; 글리콜, 예컨대 프로필렌 글리콜; 폴리올, 예컨대 글리세린, 솔비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜; 에스터, 예컨대 에틸 올리에이트 및 에틸 라우레이트; 한천; 완충제, 예컨대 수산화마그네슘 및 수산화알루미늄; 알긴산; 무발열원수; 등장 식염수; 링거액; 에틸 알코올; 인산염 완충제 용액; 및 약제학적 제형에서 사용되는 임의의 다른 적합한 물질을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 본 명세서에 상정된 CAR-발현 면역 효과기 세포의 양을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "양"은 임상 결과를 포함하는 유리한 또는 목적하는 예방적 또는 치료적 결과를 달성하기 위한 유전자 변형된 치료 세포, 예를 들어, T 세포의 "효과적인 양" 또는 "유효량"을 지칭한다.
"예방적 유효량"은 목적하는 예방 결과를 달성하는 데 효과적인 유전자 변형된 치료 세포의 양을 지칭한다. 반드시는 아니지만 전형적으로, 예방적 용량은 대상체에서 질환의 전에 또는 초기에 사용되기 때문에, 예방적 유효량은 치료적 유효량 미만이다.
"치료적 유효량"의 유전자 변형된 치료 세포는 개체의 질환 상태, 연령, 성별 및 체중, 및 개체에서 목적하는 반응을 유발하기 위한 줄기 세포 및 조상 세포의 능력과 같은 인자에 따라 다를 수 있다. 치료적 유효량은 또한 치료적으로 유리한 효과가 바이러스 또는 형질도입된 치료 세포의 임의의 독성 또는 유해 효과보다 큰 양이다. 용어 "치료적 유효량"은 대상체(예를 들어, 환자)를 "치료하는" 데 효과적인 양을 포함한다. 치료적 양이 표시될 때, 투여될 본 발명의 조성물의 정확한 양은 환자(대상체)의 연령, 중량, 종양 크기, 감염 또는 전이 정도, 및 병태에서의 개개 차이를 고려하여 의사에 의해 결정될 수 있다. 일반적으로 본 명세서에 기재된 T 세포를 포함하는 약제학적 조성물은 102　내지 1010개의 세포/㎏ 체중, 바람직하게는 105　내지 106개의 세포/㎏ 체중(이들 범위 내의 모든 정수 값을 포함함)의 투약량으로 투여될 수 있다는 것이 언급될 수 있다. 세포 수는 조성물에 대해 이에 포함된 세포 유형에 따라 의도되는 궁극적인 용도에 따를 것이다. 본 명세서에 제공되는 용도에 대해, 세포는 일반적으로 1리터 이하의 용적일 수 있으며, 500㎖ 이하, 심지어 250㎖ 또는 100㎖ 이하일 수 있다. 따라서 목적하는 세포 밀도는 전형적으로 106개 초과의 세포/㎖이고, 일반적으로 107개 초과의 세포/㎖, 일반적으로 108개의 세포/㎖ 이상이다. 임상적으로 적절한 수의 면역 세포는 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011 또는 1012개의 세포와 누적적으로 동일하거나 이를 초과하는 다회 주입으로 나누어질 수 있다. 본 발명의 일부 양상에서, 특히 모든 주입 세포가 특정 표적 항원(예를 들어, κ 또는 λ 경쇄)으로 전용되기 때문에, 106개/킬로그램(환자 당 106 내지 1011개)의 범위로 더 적은 수의 세포가 투여될 수 있다. CAR 발현 세포 조성물은 이들 범위 내의 투약량에서 다회로 투여될 수 있다. 세포는 요법을 받고 있는 동종이계, 동질유전자, 이종성 또는 자가일 수 있다. 원한다면, 치료는 면역 반응의 유도를 향상시키기 위해 본 명세서에 기재된 바와 같은 미토겐(예를 들어, PHA) 또는 림포카인, 사이토카인 및/또는 케모카인(예를 들어, IFN-γ, IL-2, IL-12, TNF-알파, IL-18 및 TNF-베타, GM-CSF, IL-4, IL-13, Flt3-L, RANTES, MIP1α 등)의 투여를 포함할 수 있다.
일반적으로, 본 명세서에 기재된 바와 같이 활성화되고 확장된 세포를 포함하는 조성물은 면역손상된 개체에서 일어나는 질환의 치료 및 예방에서 이용될 수 있다. 특히, 본 명세서에 상정된 CAR-변형 T 세포를 포함하는 조성물은 B 세포 악성종양의 치료에서 사용된다. 본 발명의 CAR-변형 T 세포는 단독으로, 또는 담체, 희석제, 부형제와 조합하여 그리고/또는 다른 성분, 예컨대 IL-2 또는 다른 사이토카인 또는 세포 집단과 함께 약제학적 조성물로서 투여될 수 있다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 약제학적 조성물은 하나 이상의 약제학적으로 또는 생리적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제와 조합하여 유전자 변형된 T 세포의 양을 포함한다.
CAR-발현 면역 효과기 세포 집단, 예컨대 T 세포를 포함하는 본 발명의 약제학적 조성물은 완충제, 예컨대 중성 완충 식염수, 인산염 완충 식염수 등; 탄수화물, 예컨대 글루코스, 만노스, 수크로스 또는 덱스트란, 만니톨; 단백질; 폴리펩타이드 또는 아미노산, 예컨대 글리신; 항산화제; 킬레이트제, 예컨대 EDTA 또는 글루타티온; 보조제(예를 들어, 수산화알루미늄); 및 보존제를 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 바람직하게는 비경구 투여, 예를 들어, 혈관내(정맥내 또는 동맥내), 복강내 또는 근육내 투여를 위해 제형화된다.
액체 약제학적 조성물은, 이들이 용액, 현탁액이든 또는 기타 유사한 형태이든, 다음 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 멸균 희석제, 예컨대 주사용수, 식염수 용액, 바람직하게는 생리 식염수, 링거액, 등장성 염화나트륨, 고정유, 예컨대 용매 또는 현탁 매질로서 작용할 수 있는 합성 모노 또는 다이글리세라이드, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 용매; 항박테리아제, 예컨대 벤질 알코올 또는 메틸 파라벤; 항산화제, 예컨대 아스코브산 또는 아황산수소나트륨; 킬레이트제, 예컨대 에틸렌다이아민테트라아세트산; 완충제, 예컨대 아세트산염, 시트르산염 또는 인산염 및 등장성 조절을 위한 제제, 예컨대 염화나트륨 또는 덱스트로스. 비경구 제제는 유리 또는 플라스틱으로 만들어진 앰플, 1회용 주사기 또는 다회 용량 바이알에 밀봉될 수 있다. 주사용 약제학적 조성물은 바람직하게는 멸균이다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 조성물은 유효량의 CAR-발현 면역 효과기 세포를 단독으로 또는 하나 이상의 치료제와 병용하여 포함한다. 따라서, CAR-발현 면역 효과기 세포 조성물은 단독으로 또는 다른 공지된 다른 치료, 예컨대 방사선 요법, 화학요법, 이식, 면역요법, 호르몬 요법, 광역학 요법 등과 병용하여 투여될 수 있다. 조성물은 또한 항생제와 병용하여 투여될 수 있다. 이러한 치료제는 본 명세서에 기재된 바와 같은 특정 질환 상태, 예컨대 특정 암에 대한 표준 치료로서 당업계에서 허용될 수 있다. 상정된 예시적인 치료제는 사이토카인, 성장 인자, 스테로이드, NSAID, DMARD, 항-염증제, 화학치료제, 방사선치료, 치료적 항체, 또는 기타 활성 및 보조제를 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 CAR-발현 면역 효과기 세포를 포함하는 조성물은 다수의 화학치료제와 함께 투여될 수 있다. 화학치료제의 예시적 예는 알킬화제, 예컨대 티오테파 및 사이클로포스파마이드(CYTOXAN™); 알킬 설포네이트, 예컨대 부설판, 임프로설판 및 피포설판; 아지리딘, 예컨대 벤조도파, 카보쿠온, 메투레도파 및 유레도파; 에틸렌이민 및 알트레타민을 포함하는 메틸아멜아민, 트라이에틸렌멜라민, 트라이에틸렌포스포르아마이드, 트라이에틸렌티오포스파오르아마이드 및 트라이메틸올로멜라민 레주메; 질소 머스터드, 예컨대 클로람부실, 클로르나파진, 클로로포스파마이드, 에스트라무스틴, 이포스파마이드, 메클로르에타민, 메클로르에타민 옥사이드 하이드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비신, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파마이드, 유라실 머스터드; 나이트로소유레아, 예컨대 카무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 라니무스틴; 항상제, 예컨대 아클라시노마이신, 악티노마이신, 오트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 칼리케아마이신, 카라비신, 카미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-다이아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신, 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 마이코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 퓨로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트레토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항-대사물질, 예컨대 메토트렉세이트 및 5-플루오로유라실(5-FU); 엽산 유사체, 예컨대 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트라이메트렉세이트; 퓨린 유사체, 예컨대 플루다라빈, 6-머캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예컨대 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자유리딘, 카모푸르, 사이타라빈, 다이데옥시유리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록수리딘, 5-FU; 안드로겐, 예컨대 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스탄올, 메피티오스탄, 테스토락톤; 항-부신제, 예컨대 아미노글루테티마이드, 미토탄, 트라이로스탄; 엽산 보충제, 예컨대 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파마이드 글리코사이드; 아미노레불린산; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 다이아지쿠온; 엘포미틴; 엘립티늄 아세테이트; 에토글루시드; 질산갈륨; 하이드록시유레아; 렌티난; 로니다민; 미토구아존; 미톡산트론; 모피다몰; 니트라크린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 포도필린산; 2-에틸하이드라자이드; 프로카바진; PSK®; 라족산; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트라이아지쿠온; 2, 2',2"-트라이클로로트라이에틸아민; 유레탄; 빈데신; 다카바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가사이토신; 아라비노사이드("Ara-C"); 사이클로포스파마이드; 티오테파; 탁소이드, 예를 들어, 파클리탁셀(TAXOL®, 뉴저지주 프린스턴에 소재한 브리스톨-마이어스 스큅 온콜로지(Bristol-Myers Squibb Oncology)) 및 도세탁셀(TAXOTERE®, 프랑스 안토니에 소재한 롱프랑 로리(Rhone-Poulenc Rohrer)); 클로람부실; 겜시타빈; 6-티오구아닌; 머캅토퓨린; 메토트렉세이트; 백금 유사체, 예컨대 시스플라틴 및 카보플라틴; 빈블라스틴; 백금; 에토포사이드(VP-16); 이포스파마이드; 미토마이신 C; 미톡산트론; 빈크리스틴; 비노렐빈; 나벨빈; 노반트론; 테니포사이드; 다우노마이신; 아미노프테린; 젤로다; 이반드로네이트; CPT-11; 토포아이소머라제 저해제 RFS 2000; 다이플루오로메틸로미틴(DMFO); 레티노산 유도체, 예컨대 Targretin™(벡사로텐), Panretin™(알리트레티노인); ONTAK™(데니류킨 디프티톡스); 에스페라마이신; 카페시타빈; 및 임의의 앞서 언급한 것의 약제학적으로 허용 가능한 염, 산 또는 유도체를 포함한다. 또한 본 정의에 암에 대해 호르몬을 조절하거나 저해하는 작용을 하는 항-호르몬제, 예를 들어 타목시펜, 랄록시펜, 아로마타제 저해 4(5)-이미다졸, 4-하이드록시타목시펜, 트라이옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤 및 토레미펜(파레스톤(Fareston))을 포함하는, 항-에스트로겐; 및 항-안드로겐, 예컨대 플루타마이드, 닐루타마이드, 비칼루타마이드, 류플롤라이드 및 고세렐린; 및 임의의 상기의 약제학적으로 허용 가능한 염, 산 또는 유도체가 포함된다.
본 명세서에 기재된 조성물과 함께 다양한 다른 치료제가 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, CAR-발현 면역 효과기 세포를 포함하는 조성물은 항염증제와 함께 투여된다. 항염증제 또는 약물은 스테로이드, 및 글루코코르티코이드(베타메타손, 부데소나이드, 덱사메타손, 하이드로코티손 아세테이트, 하이드로코티손, 하이드로코티손, 메틸프레드니솔론, 프레드니솔론, 프레드니손, 트라이암시놀론), 아스피린, 이부프로펜, 나프록센, 메토트렉세이트, 설파살라진, 레플루노마이드를 포함하는 비스테로이드성 항염증 약물(NSAIDS), 항-TNF 의약, 사이클로포스파마이드 및 마이코페놀레이트를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
다른 예시적인 NSAID는 이부프로펜, 나프록센, 나프록센 나트륨, Cox-2 저해제, 예컨대 VIOXX®(로페콕십) 및 CELEBREX®(셀레콕십) 및 시알릴레이트로 이루어진 군으로부터 선택된다. 예시적인 진통제는 아세트아미노펜, 옥시코돈, 트라마돌 및 프로폭시펜 하이드로클로라이드로 이루어진 군으로부터 선택된다. 예시적인 글루코코르티코이드는 코티손, 덱사메타손, 하이드로코티손, 메틸프레드니솔론, 프레드니솔론 및 프레드니손으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 예시적인 생물학적 반응 변형제는 세포 표면 마커(예를 들어, CD4, CD5 등), 사이토카인 저해제, 예컨대 TNF 길항제(예를 들어, 에타너셉트(ENBREL®), 아달리무맙(HUMIRA®) 및 인플릭시맙(REMICADE®), 케모카인 저해제 및 접착 분자 저해제로 향하는 분자를 포함한다. 생물학적 반응 변형제는 단클론성 항체뿐만 아니라 분자의 재조합 형태를 포함한다. 예시적인 DMARD는 아자티오프린, 사이클로포스파마이드, 사이클로스포린, 메토트렉세이트, 페니실아민, 레플루노마이드, 설파살라진, 하이드록시클로로퀸, 골드(Gold)(경구(아우라노핀) 및 근육내) 및 미노사이클린을 포함한다.
본 명세서에 상정된 CAR 변형된 T 세포와 조합하기에 적합한 치료적 항체의 예시적 예는 바비툭시맙, 베바시주맙(아바스틴), 비바투주맙, 블리나투모맙, 코나투무맙, 다라투무맙, 둘리고투맙, 다세투주맙, 달로투주맙, 엘로투주맙(HuLuc63), 겜투주맙, 이브리투모맙, 인다툭시맙, 이노투주맙, 로르보투주맙, 루카투무맙, 밀라투주맙, 목세투모맙, 오카라투주맙, 오파투무맙, 리툭시맙, 실툭시맙, 테프로투무맙 및 유블리툭시맙을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
PD-1 또는 PD-L1 및/또는 CTLA-4에 대한 항체는 본 명세서에 개시된 CAR T 세포, 예를 들어, BCMA CAR T 세포, 예를 들어, BCMA-2 단일 쇄 Fv 단편, 예를 들어, bb2121을 포함하는 키메라 항원 수용체를 발현시키는 CAR T 세포와 조합하여 사용될 수 있다. 특정 실시형태에서, PD-1 항체는 니볼루맙, 펨브롤리주맙 및 피딜리주맙으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 실시형태에서, PD-L1 항체는 아테졸리주맙, 아벨루맙, 두발루맙 및 BMS-986559로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 실시형태에서, CTLA-4 항체는 이필리무맙 및 트레멜리무맙으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 조성물은 사이토카인과 함께 투여된다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 "사이토카인"은 세포내 매개체로서 다른 세포 상에서 작용하는 하나의 세포 집단에 의해 방출되는 단백질에 대한 일반적 용어를 의미한다. 이러한 사이토카인의 예는 림포카인, 모노카인 및 전통적인 폴리펩타이드 호르몬이다. 사이토카인 중에 성장 호르몬, 예컨대 인간 성장 호르몬, N-메티오닐 인간 성장 호르몬, 및 소 성장 호르몬; 부갑상선 호르몬; 티록신; 인슐린; 프로인슐린; 릴랙신; 프로릴랙신; 당단백질 호르몬, 예컨대 여포자극호르몬(FSH), 갑상선 자극 호르몬(TSH), 및 황체형성호르몬(LH); 간 성장 인자; 섬유아세포 성장 인자; 프롤락틴; 태반 락토겐; 종양 괴사 인자-알파 및 -베타; 뮬러관-저해 물질; 마우스 성선자극호르몬-연관 펩타이드; 인히빈; 액티빈; 혈관내피 성장 인자; 인테그린; 트롬보포이에틴(TPO); 신경 성장 인자, 예컨대 NGF-베타; 혈소판-성장 인자; 형질전환 성장 인자(TGF), 예컨대 TGF-알파 및 TGF-베타; 인슐린-유사 성장 인자-I 및 -II; 에리트로포이에틴(EPO); 골유도성 인자; 인터페론, 예컨대 인터페론-알파, 베타 및 -감마; 집락 자극 인자(CSF), 예컨대 대식세포-CSF(M-CSF); 과립구-대식세포-CSF(GM-CSF); 및 과립구-CSF(G-CSF); 인터류킨(IL), 예컨대 IL-1, IL-1알파, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12; IL-15, IL-21, 종양 괴사 인자, 예컨대 TNF-알파 또는 TNF-베타; 및 LIF 및 키트 리간드(kit ligand: KL)를 포함하는 기타 폴리펩타이드 인자가 포함된다. 본 명세서에서 사용되는 용어 사이토카인은 천연 공급원으로부터의 단백질 또는 재조합 세포 배양물, 및 천연 서열 사이토카인의 생물학적으로 활성인 등가물의 단백질을 포함한다.
특정 실시형태에서, 조성물은 본 명세서에 개시된 바와 같은 PI3K 저해제의 존재 하에 배양되는 본 명세서에 상정된 CAR T 세포를 포함하고, 다음의 마커: CD3, CD4, CD8, CD28, CD45RA, CD45RO, CD62, CD127 및 HLA-DR 중 하나 이상을 발현시키고, 이는 양성 또는 음성 선택 기법에 의해 추가로 단리될 수 있다. 일 실시형태에서, 조성물은 CD62L, CCR7, CD28, CD27, CD122, CD127, CD197; 및 CD38 또는 CD62L, CD127, CD197 및 CD38로 이루어진 군으로부터 선택되는 마커 중 하나 이상을 발현시키는 T 세포의 특정 하위집단을 포함하고, 양성 또는 음성 선택 기법에 의해 추가로 단리된다. 다양한 실시형태에서, 조성물은 다음의 마커: CD57, CD244, CD160, PD-1, CTLA4, TIM3 및 LAG3 중 하나 이상을 발현시키지 않거나, 실질적으로 발현시키지 않는다.
일 실시형태에서, CD62L, CD127, CD197 및 CD38로 이루어진 군으로부터 선택된 마커 중 하나 이상의 발현은 PI3K 저해제 없이 활성화되고 확장된 T 세포 집단에 비해 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 9배, 적어도 10배, 적어도 25배 이상만큼 증가된다.
일 실시형태에서, CD57, CD244, CD160, PD-1, CTLA4, TIM3 및 LAG3으로 이루어진 군으로부터 선택된 마커 중 하나 이상의 발현은 PI3K 저해제와 함께 활성화되고 확장된 T 세포 집단에 비해 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 9배, 적어도 10배, 적어도 25배 이상만큼 감소된다.
5.10. 치료 방법
본 명세서에 상정된 유전자 변형된 면역 효과기 세포는 면역조절 병태 및 혈액학적 악성종양을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는, B 세포 관련 병태의 치료에서 사용하기 위한 입양 면역요법의 개선된 방법을 제공한다.
5.10.1. 구체적 실시형태
일 실시형태에서, B 세포 성숙 항원(BCMA)과 관련된 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현시키는 치료적 유효량의 면역 세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, BCMA-발현 세포의 고갈이 필요한 대상체에서 이를 고갈시키는 방법이 제공되되, 면역 세포는 150×106개의 세포 내지 450×106개의 세포의 투약량으로 투여되고, 상기 투여 전에 상기 대상체는 프로테아좀 저해제, 레날리도마이드, 포말리도마이드, 탈리도마이드, 보르테조밉, 덱사메타손, 사이클로포스파마이드, 독소루비신, 카필조밉, 익사조밉, 시스플라틴, 독소루비신, 에토포사이드, 항-CD38 항체(예컨대 다라투무맙), 파노비노스탯 또는 엘로투주맙 중 하나 이상을 포함하는 사전 요법의 한 가지 이상의 계통을 받은 적이 있다.
다른 실시형태에서, B 세포 성숙 항원(BCMA)과 관련된 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현시키는 치료적 유효량의 면역 세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, BCMA-발현 세포에 의해 야기되는 질환의 치료가 필요한 대상체에서 이를 치료하는 방법이 제공되되, 면역 세포는 150×106개의 세포 내지 450×106개의 세포의 투약량으로 투여되고, 상기 투여 전에 상기 대상체는 프로테아좀 저해제, 레날리도마이드, 포말리도마이드, 탈리도마이드, 보르테조밉, 덱사메타손, 사이클로포스파마이드, 독소루비신, 카필조밉, 익사조밉, 시스플라틴, 독소루비신, 에토포사이드, 항-CD38 항체(예컨대 다라투무맙), 파노비노스탯 또는 엘로투주맙 중 하나 이상을 포함하는 사전 요법의 한 가지 이상의 계통을 받은 적이 있다.
다른 실시형태에서, B 세포 성숙 항원(BCMA)과 관련된 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현시키는 치료적 유효량의 면역 세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, BCMA를 발현시키는 암의 치료가 필요한 대상체에서 이런 암을 치료하는 방법이 제공되되, 면역 세포는 150×106개의 세포 내지 450×106개의 세포의 투약량으로 투여되고, 상기 투여 전에 상기 대상체는 프로테아좀 저해제, 레날리도마이드, 포말리도마이드, 탈리도마이드, 보르테조밉, 덱사메타손, 사이클로포스파마이드, 독소루비신, 카필조밉, 익사조밉, 시스플라틴, 독소루비신, 에토포사이드, 항-CD38 항체(예컨대 다라투무맙), 파노비노스탯 또는 엘로투주맙 중 하나 이상을 포함하는 사전 요법의 한 가지 이상의 계통을 받은 적이 있고;; BCMA를 발현시키는 암은 다발성 골수종, 만성 림프구성 백혈병 또는 비호지킨 림프종(예를 들어, 버킷 림프종, 만성 림프구성 백혈병/소림프구 림프종(CLL/SLL), 미만성 거대 B 세포 림프종, 소포성 림프종, 면역아세포성 거대 세포 림프종, 전구체 B-림프아구성 림프종 및 외투세포 림프종)이다.
임의의 상기 실시형태의 구체적 실시형태에서, 상기 투여 전에 상기 대상체는 다라투무맙, 포말리도마이드 및 덱사메타손(DPd); 다라투무맙, 보르테조밉, 및 덱사메타손(DVd); 익사조밉, 레날리도마이드, 및 덱사메타손(IRd); 다라투무맙, 레날리도마이드 및 덱사메타손; 보르테조밉, 레날리도마이드 및 덱사메타손(RVd); 보르테조밉, 사이클로포스파마이드 및 덱사메타손(BCd); 보르테조밉, 독소루비신 및 덱사메타손; 카필조밉, 레날리도마이드 및 덱사메타손(CRd); 보르테조밉 및 덱사메타손; 보르테조밉, 탈리도마이드 및 덱사메타손; 레날리도마이드 및 덱사메타손; 덱사메타손, 탈리도마이드, 시스플라틴, 독소루비신, 사이클로포스파마이드, 에토포사이드 및 보르테조밉(VTD-PACE); 레날리도마이드 및 저용량 덱사메타손; 보르테조밉, 사이클로포스파마이드 및 덱사메타손; 카필조밉 및 덱사메타손; 레날리도마이드 단독; 보르테조밉 단독; 다라투무맙 단독; 엘로투주맙, 레날리도마이드, 및 덱사메타손; 엘로투주맙, 레날리도마이드 및 덱사메타손; 벤다무스틴, 보르테조밉 및 덱사메타손; 벤다무스틴, 레날리도마이드, 및 덱사메타손; 포말리도마이드 및 덱사메타손; 포말리도마이드, 보르테조밉 및 덱사메타손; 포말리도마이드, 카필조밉 및 덱사메타손; 보르테조밉 및 리포좀 독소루비신; 사이클로포스파마이드, 레날리도마이드, 및 덱사메타손; 엘로투주맙, 보르테조밉 및 덱사메타손; 익사조밉 및 덱사메타손; 파노비노스탯, 보르테조밉 및 덱사메타손; 파노비노스탯 및 카필조밉; 또는 포말리도마이드, 사이클로포스파마이드 및 덱사메타손을 포함하는 사전 요법의 한 가지 이상의 계통을 받은 적이 있다.
임의의 상기의 특정의 더 구체적인 실시형태에서, 상기 대상체는 사전 요법의 상기 계통의 2가지 이상, 사전 요법의 상기 계통의 3가지 이상, 사전 요법의 상기 계통의 4가지 이상, 사전 요법의 상기 계통의 5가지 이상, 사전 요법의 상기 계통의 6가지 이상 또는 사전 요법의 상기 계통의 7가지 이상을 받은 적이 있다. 임의의 상기의 특정의 다른 더 구체적인 실시형태에서, 상기 대상체는 사전 요법의 상기 계통의 3가지 이하, 사전 요법의 상기 계통의 2가지 이하 또는 사전 요법의 상기 계통의 1가지 이하를 받은 적이 있다.
임의의 상기 실시형태에 대해, 대상체는 상기 투여 전에 림프구 제거술(lymphodepletion)을 받았다. 임의의 상기 실시형태에 대해, 대상체는 상기 면역 세포, 예를 들어, T 세포를 수집하고 단리시키기 위해 성분채집술을 받는다. 임의의 상기 실시형태의 구체적 실시형태에서, 상기 대상체는 상기 성분채집술 시 하기를 나타낸다: M-단백질(혈청 단백질 전기영동법[sPEP] 또는 소변 단백질 전기영동법[uPEP]): 0.5g/㎗ 이상의 sPEP 또는 200㎎/24시간 이상의 uPEP; 혈청 또는 소변에서 측정 가능한 질환이 없고, 혈청 면역글로불린 유리 경쇄가 10㎎/㎗ 이상이고, 비정상적 혈청 면역글로불린 카파 람다 유리 경쇄 비를 갖는, 경쇄 다발성 골수종; 및/또는 동부 종양학 협력 그룹(ECOG) 수행도가 1 이하. 더 구체적인 실시형태에서, 성분채집술의 시작 시 상기 대상체는 추가적으로 프로테아좀 저해제, 면역조절제(레날리도마이드 또는 포말리도마이드) 및 항-CD38 항체에 의한 사전 치료를 포함하는 사전 치료의 상기 계통 중 적어도 3가지를 받은 적이 있으며; 진행성 질환이 치료 계통에 대한 최고의 반응이 아니라면, 사전 치료의 상기 적어도 3가지 계통 각각에 대해 적어도 2회 연속 주기의 치료를 받은 적이 있고; 사전 치료의 대부분의 최신 계통의 60일에 또는 이내에 진행성 질환의 증거가 있으며; 그리고/또는 치료의 상기 사전 계통에 대한 반응(최소 반응 또는 더 양호한 반응)이 달성된 적이 있다.
다른 더 구체적인 실시형태에서, 상기 대상체는 추가적으로 단지 하나의 사전 항-골수종 치료 요법을 받고; 다음의 고위험 인자를 갖는다: (i) 대상체가 유도 + 줄기 세포 이식을 겪었다면, 제1 이식일 이후로 12개월 미만의 진행성 질환으로서; 또는 (ii) 대상체가 유도만을 받은 적이 있다면, 최소, 프로테아좀 저해제, 면역조절제 및 덱사메타손을 함유하여야 하는 마지막 치료 요법일 이후로 12개월 미만의 PD로서 정의되는, R-ISS III기, 및 조기 재발.
임의의 상기 실시형태의 구체적 실시형태에서, 상기 대상체는 상기 투여 후 적어도 6개월, 또는 상기 투여 후 적어도 12개월의 무진행 생존을 나타낸다.
임의의 상기 실시형태의 구체적 실시형태에서, 상기 키메라 항원 수용체는 BCMA를 표적화하는 항체 또는 항체 단편, 예를 들어, 단일 쇄 Fv 항체 단편(scFv), 예를 들어, BCMA02 scFv를 포함한다. 본 명세서의 임의의 실시형태의 더 구체적인 실시형태에서, 상기 면역 세포는 bb2121 세포이다.
5.10.2. 일반적 실시형태
특정 실시형태에서, 1차 면역 효과기 세포의 특이성은 본 명세서에 상정된 CAR을 이용하여 1차 면역 효과기 세포를 유전자 변형시킴으로써 B 세포로 전용된다. 다양한 실시형태에서, 바이러스 벡터는 BCMA 폴리펩타이드에 결합하는 뮤린 항-BCMA 항원 결합 도메인; 힌지 도메인; TM 도메인을 CAR의 세포내 신호전달 도메인에 연결하는 짧은 올리고- 또는 폴리펩타이드 링커인 막관통(TM) 도메인; 및 하나 이상의 세포내 공자극 신호전달 도메인; 및 1차 신호전달 도메인을 포함하는, CAR을 암호화하는 특정 폴리뉴클레오타이드를 이용하여 면역 효과기 세포를 유전자 변형시키는 데 사용된다.
일 실시형태에서, 본 발명은 T 세포가 BCMA 발현 B 세포를 표적화하는 CAR을 발현시키도록 유전자 변형된 세포 요법 유형을 포함한다. 다른 실시형태에서, 항-BCMA CAR T 세포는 CAR T 세포의 치료적 특성 및 지속성을 증가시키기 위해 IL-2 및 PI3K 저해제의 존재 하에 배양된다. 이어서, CAR T 세포는 이러한 요법이 필요한 수용자에게 주입된다. 주입된 세포는 수용자에서 B 세포를 야기하는 질환을 사멸시킬 수 있다. 항체 요법과 달리, CAR T 세포는 생체내에서 복제되어, 지속적인 암 요법을 야기할 수 있는 장기간 지속성을 초래할 수 있다.
일 실시형태에서, 본 발명의 CAR T 세포는 강한 생체내 T 세포 확장을 겪을 수 있고, 장기간의 시간 동안 지속될 수 있다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 CAR T 세포는 임의의 추가적인 종양 형성 또는 성장을 저해하도록 재활성화될 수 있는 특이적 기억 T 세포로 진화된다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 CAR을 포함하는 면역 효과기 세포를 포함하는 조성물은 비정상 B 세포 활성과 연관된 병태의 치료에서 사용된다.
본 명세서에 상정된 CAR을 포함하는 면역 효과기 세포를 이용하여 치료되거나, 예방되거나, 개선될 수 있는 병태의 예시적 예는 전신홍반루푸스, 류마티스 관절염, 중증 근무력증, 자가면역성 용혈성 빈혈, 특발성 혈소판 감소성 자반증, 항-인지질 증후군, 샤가스병, 그레이브스병, 베게너 육아종증, 결절성 다발성 동맥염, 쇼그렌 증후군, 심상성 천포창, 피부경화증, 다발성 경화증, 항-인지질 증후군, ANCA 연관 혈관염, 굿파스처병, 가와사키병 및 급속 진행성 사구체신염을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
변형된 면역 효과기 세포는 또한 혈장 세포 장애, 예컨대 중쇄병, 1차 또는 면역세포-연관 아밀로이드증, 및 의미미결정 단클론성 감마글루불린병증(MGUS)에서의 용도를 가질 수 있다.　
본 명세서에 사용된 바와 같은, "B 세포 악성종양"은 이하에 논의되는 바와 같은 B 세포(면역계 세포의 유형)에서 형성되는 암 유형을 지칭한다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 CAR-변형 T 세포를 포함하는 조성물은 B 세포 악성종양, 예를 들어, 다발성 골수종(MM) 및 비-호지킨 림프종(NHL)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 혈액 악성종양의 치료에서 사용된다.
다발성 골수종은 이들 세포 유형의 신생물 형질전환을 특징으로 하는 성숙 혈장 세포의 B 세포 악성종양이다. 이들 혈장 세포는 골수(BM)에서 증식하며, 인접한 뼈, 때때로 혈액에 침윤할 수 있다. 다양한 형태의 다발성 골수종은 현성 다발성 골수종, 무증상 다발성 골수종, 혈장 세포 백혈병, 비분비 골수종, IgD 골수종, 골경화증 골수종, 뼈의 고립성 형질세포종, 및 골수외 형질세포종을 포함한다(예를 들어, 문헌[Braunwald, et al. (eds), Harrison's Principles of Internal Medicine, 15th Edition (McGraw-Hill 2001)] 참조).
다발성 골수종은 다음과 같이 병기화될 수 있다
Figure pct00005
Figure pct00006
비호지킨 림프종은 림프구(백혈구) 암의 거대 그룹을 포함한다. 비호지킨 림프종은 임의의 연령에서 발생될 수 있으며, 종종 정상보다 큰 림프절, 발열 및 체중 감소로 나타난다. 많은 유형의 비호지킨 림프종이 있다. 예를 들어, 비-호지킨 림프종은 공격적(빠르게 진행) 유형 및 무통성(느리게 진행) 유형. 비호지킨 림프종은 B 세포 및 T-세포로부터 유래될 수 있지만, 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "비-호지킨 림프종" 및 "B 세포 비호지킨 림프종"은 상호 호환적으로 사용된다. B 세포 비호지킨 림프종(NHL)은 버킷 림프종, 만성 림프구성 백혈병/소림프구 림프종(CLL/SLL), 미만성 거대 B 세포 림프종, 소포성 림프종, 면역아세포성 거대 세포 림프종, 전구체 B-림프아구성 림프종 및 외투세포 림프종을 포함한다. 골수 또는 줄기 세포 이식 후 생기는 림프종은 보통 B 세포 비호지킨 림프종이다.
만성 림프구성 백혈병(CLL)은 B 림프구, 또는 B 세포로 불리는 미숙 백혈구의 느린 증가를 야기하는 무통성(느리게 진행) 암이다. 암 세포는 혈액 및 골수를 통해 확산되며, 또한 림프절 또는 다른 기관, 예컨대 간 및 비장에 영향을 미칠 수 있다. CLL은 종국적으로는 골수에 대한 부전을 야기한다. 때때로, 질환의 이후의 병기에서, 질환은 소림프구 림프종으로 불린다.
특정 실시형태에서, 치료적 유효량의 본 명세서에 상정된 CAR-발현 면역 효과기 세포 또는 이를 포함하는 조성물을 단독으로 또는 하나 이상의 치료제와 병용하여 치료가 필요한 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 세포는 비정상 B 세포 활성과 연관된 병태 또는 B 세포 악성종양이 발생할 위험에 있는 환자의 치료에서 사용된다. 따라서, 본 발명은 치료적 유효량의 본 명세서에 상정된 CAR-변형 세포를 비정상 B 세포 활성과 연관된 병태 또는 B 세포 악성종양의 치료 또는 예방이 필요한 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 이의 치료 또는 예방을 위한 방법을 제공한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "개체" 및 "대상체"는 종종 상호 호환적으로 사용되고, 유전자 요법 벡터, 세포-기반 치료제 및 본 명세서의 다른 곳에 개시된 방법으로 치료될 수 있는 질환, 장애 또는 병태의 증상을 나타내는 임의의 동물을 지칭한다. 바람직한 실시형태에서, 대상체는 유전자 요법 벡터, 세포-기반 치료제 및 본 명세서의 다른 곳에 개시된 방법으로 치료될 수 있는 조혈 시스템의 질환, 장애 또는 병태, 예를 들어, B 세포 악성종양의 증상을 나타내는 임의의 동물을 포함한다. 적합한 대상체(예를 들어, 환자)는 실험 동물(예컨대 마우스, 랫트, 토끼 또는 기니피크), 농장 동물, 및 가축 동물 또는 반려동물(예컨대 고양이 또는 개)을 포함한다. 비인간 영장류 및 바람직하게는, 인간 환자가 포함된다. 전형적인 대상체는 B 세포 악성종양을 갖고, B 세포 악성종양으로 진단되거나, B 세포 악성종양의 위험에 있거나 갖는, 인간 환자를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "환자"는 유전자 요법 벡터, 세포 기반 치료제 및 본 명세서의 다른 곳에 개시된 방법으로 치료될 수 있는 특정 질환, 장애 또는 병태로 진단된 대상체를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "치료" 또는 "치료하는"은 질환 또는 병리학적 병태의 증상 또는 병리에 대해 임의의 유리한 또는 바람직한 효과를 포함하고, 치료 중인 질환 또는 병태의 하나 이상의 측정 가능한 마커의 최소 감소를 포함할 수 있다. 치료는 선택적으로 질환 또는 병태 증상의 감소 또는 개선, 또는 질환 또는 병태 진행의 지연을 수반할 수 있다. "치료"는 반드시 질환 또는 병태 또는 이의 연관된 증상의 완전한 근절 또는 치유를 나타내지는 않는다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은, "예방한다" 및 유사한 단어, 예컨대 "예방되는", "예방하는" 등은 질환 또는 병태의 발생 또는 재발 가능성을 예방하거나, 저해하거나, 감소시키기 위한 접근을 나타낸다. 이는 또한 질환 또는 병태의 개시 또는 재발을 지연시키거나, 질환 또는 병태 증상의 발생 또는 재발을 지연시키는 것을 지칭한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은, "예방" 및 유사한 단어는 또한 질환 또는 병태의 개시 또는 재발 전에 질환 또는 병태의 강도, 효과, 증상 및/또는 부담을 감소시키는 것을 포함한다.
"향상시킨다" 또는 "촉진시킨다" 또는 "증가시킨다" 또는 "확장시킨다"는 일반적으로 비히클 또는 대조군 분자/조성물 중 하나에 의해 야기되는 반응에 비해 생물학적 반응(즉, 하류 효과)을 생성하거나, 유발하거나, 야기하기 위한 본 명세서에 상정된 조성물, 예를 들어, CAR을 암호화하는 유전자 변형된 T 세포 또는 벡터의 능력을 지칭한다. 측정 가능한 생리적 반응은 당업계 및 본 명세서의 설명에서 이해하는 것으로부터 분명한 다른 것 중에서도 T 세포 확장, 활성화, 지속성의 증가, 및/또는 암 세포 사멸 능력의 증가를 포함할 수 있다. "증가된" 또는 "향상된" 양은 전형적으로 "통계학적으로 유의한" 양이며, 비히클 또는 대조군 조성물에 의해 생성된 반응의 1.1, 1.2, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30배 이상(예를 들어, 500, 1000배)(1 사이의 그리고 초과하는 모든 정수 및 소수점을 포함, 예를 들어, 1.5, 1.6, 1.7. 1.8 등)인 증가를 포함할 수 있다.
"줄인다" 또는 "낮춘다" 또는 "적어진다" 또는 "감소시킨다" 또는 "없앤다"는 일반적으로 비히클 또는 대조군 분자/조성물 중 하나 의해 야기된 반응에 비해 더 적은 생리적 반응(즉, 하류 효과)을 생성하거나, 유발하거나, 야기하는 본 명세서에 상정된 조성물의 능력을 지칭한다. "줄어든" 또는 "감소된" 양은 전형적으로 "통계학적으로 유의한" 양이며, 비히클 또는 대조군 조성물에 의해 생성된 반응(기준 반응), 또는 특정 세포 계통의 반응의 1.1, 1.2, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30배 이상(예를 들어, 500, 1000배)(1 사이의 그리고 초과하는 모든 정수 및 소수점을 포함, 예를 들어, 1.5, 1.6, 1.7. 1.8 등)인 감소를 포함할 수 있다.
"유지하다" 또는 "보존한다" 또는 "유지" 또는 "변화 없음" 또는 "실질적인 변화 없음" 또는 "실질적인 감소 없음"은 비히클, 대조군 분자/조성물에 의해 야기되는 반응, 또는 특정 세포 계통에서의 반응에 비해, 세포에서 실질적으로 유사한 생리적 반응(즉, 하류 효과)를 생성하거나, 유발하거나, 야기하는 본 명세서에 상정된 조성물의 능력을 지칭한다. 비슷한 반응은 기준 반응과 유의하게 다르지 않거나 또는 측정 가능하게 다르지 않은 것이다.
일 실시형태에서, B 세포 관련 병태의 치료가 필요한 대상체에서 이를 치료하는 방법은 유효량, 예를 들어, 치료적 유효량의 본 명세서에 상정된 유전자 변형된 면역 효과기 세포를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 투여량 및 빈도는 환자의 병태, 및 환자 질환의 유형 및 중증도와 같은 인자에 의해 결정될 것이지만, 임상 시험에 의해 적절한 투약량이 결정될 수 있다.
일 실시형태에서, 대상체에게 투여되는 조성물 중의 T 세포의 양은 적어도 0.1×105개의 세포, 적어도 0.5×105개의 세포, 적어도 1×105개의 세포, 적어도 5×105개의 세포, 적어도 1×106개의 세포, 적어도 0.5×107개의 세포, 적어도 1×107개의 세포, 적어도 0.5×108개의 세포, 적어도 1×108개의 세포, 적어도 0.5×109개의 세포, 적어도 1×109개의 세포, 적어도 2×109개의 세포, 적어도 3×109개의 세포, 적어도 4×109개의 세포, 적어도 5×109개의 세포, 또는 적어도 1×1010개의 세포이다. 특정 실시형태에서, 약 1×107개의 CAR T 세포 내지 약 1×109개의 CAR T 세포, 약 2×107개의 CAR T 세포 내지 약 0.9×109개의 CAR T 세포, 약 3×107개의 CAR T 세포 내지 약 0.8×109개의 CAR T 세포, 약 4×107개의 CAR T 세포 내지 약 0.7×109개의 CAR T 세포, 약 5×107개의 CAR T 세포 내지 약 0.6×109개의 CAR T 세포, 또는 약 5×107개의 CAR T 세포 내지 약 0.5×109개의 CAR T 세포는 대상체에게 투여된다.
일 실시형태에서, 대상체에게 투여되는 조성물 중의 T 세포의 양은 적어도 0.1×104개의 세포/㎏의 체중, 적어도 0.5×104개의 세포/㎏의 체중, 적어도 1×104개의 세포/㎏의 체중, 적어도 5×104개의 세포/㎏의 체중, 적어도 1×105개의 세포/㎏의 체중, 적어도 0.5×106개의 세포/㎏의 체중, 적어도 1×106개의 세포/㎏의 체중, 적어도 0.5×107개의 세포/㎏의 체중, 적어도 1×107개의 세포/㎏의 체중, 적어도 0.5×108개의 세포/㎏의 체중, 적어도 1×108개의 세포/㎏의 체중, 적어도 2×108개의 세포/㎏의 체중, 적어도 3×108개의 세포/㎏의 체중, 적어도 4×108개의 세포/㎏의 체중, 적어도 5×108개의 세포/㎏의 체중, 또는 적어도 1×109개의 세포/㎏의 체중이다. 특정 실시형태에서, 약 1×106개의 CAR T 세포/㎏의 체중 내지 약 1×108개의 CAR T 세포/㎏의 체중, 약 2×106개의 CAR T 세포/㎏의 체중 내지 약 0.9×108개의 CAR T 세포/㎏의 체중, 약 3×106개의 CAR T 세포/㎏의 체중 내지 약 0.8×108개의 CAR T 세포/㎏의 체중, 약 4×106개의 CAR T 세포/㎏의 체중 내지 약 0.7×108개의 CAR T 세포/㎏의 체중, 약 5×106개의 CAR T 세포/㎏의 체중 내지 약 0.6×108개의 CAR T 세포/㎏의 체중, 또는 약 5×106개의 CAR T 세포/㎏의 체중 내지 약 0.5×108개의 CAR T 세포/㎏의 체중이 대상체에게 투여된다.
당업자는 본 발명의 조성물의 다회 투여가 목적하는 요법을 달성하는 데 필요할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 예를 들어, 조성물은 1주, 2주, 3주, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 1년, 2년, 5년, 10년 이상의 기간에 걸쳐 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10회 이상 투여될 수 있다.
특정 실시형태에서, 활성화된 면역 효과기 세포를 대상체에게 투여하고, 이어서, 후속적으로 재채혈하고(또는 성분채집술이 수행됨), 본 발명에 따라 이로부터 면역 효과기 세포를 활성화하고, 이들 활성화 및 확장된 면역 효과기 세포를 환자에게 재주입하는 것이 바람직할 수 있다. 이 과정은 몇 주마다 다회 수행될 수 있다. 특정 실시형태에서, 면역 효과기 세포는 10cc 내지 400cc의 채혈로부터 활성화될 수 있다. 특정 실시형태에서, 면역 효과기 세포는 20cc, 30cc, 40cc, 50cc, 60cc, 70cc, 80cc, 90cc, 100cc, 150cc, 200cc, 250cc, 300cc, 350cc 또는 400cc 이상의 채혈로부터 활성화된다. 이론에 의해 구속되지 않고, 다회 채혈/다회 재주입 프로토콜을 이용하여 면역 효과기 세포의 특정 집단을 선택하는 작용을 할 수 있다.
본 명세서에 상정된 조성물의 투여는 에어로졸 흡입, 주사, 섭취, 수혈, 체내이식 또는 이식을 포함하는 임의의 편리한 방식으로 수행될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 조성물은 비경구로 투여된다. 본 명세서에서 사용되는 어구 "비경구 투여" 및 "비경구로 투여되는"은 보통 주사에 의하는, 장 이외의 투여 및 국소 투여 방식을 지칭하고, 혈관내, 정맥내, 근육내, 동맥내, 척수내, 피막내, 안와내, 종양내, 심장내, 진피내, 복강내, 경기관, 피하, 피부밑, 관절내, 피막하, 지주막, 척주내 및 흉골내 주사 및 주입을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 일 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 조성물은 종양, 림프절 또는 감염 부위 내로의 직접 주사에 의해 대상체에게 투여된다.
일 실시형태에서, 대상체에서 B 세포 관련 병태에 대한 세포 면역 반응을 증가시키기 위해 이러한 세포 면역 반응 증가가 필요한 대상체에게 유효량의 조성물이 투여된다. 면역 반응은 감염된 세포, 조절 T 세포, 및 헬퍼 T 세포 반응을 사멸시킬 수 있는 세포독성 T 세포에 의해 매개되는 세포의 면역 반응을 포함할 수 있다. B 세포를 활성화하고, 그에 따라 항체 생성을 야기할 수 있는 헬퍼 T 세포에 의해 주로 매개되는 체액성 면역 반응이 또한 유도될 수 있다. 당업계에 잘 기재된 본 발명의 조성물에 의해 유도되는 면역 반응 유형을 분석하기 위해 다양한 기법이 사용될 수 있다; 예를 들어, 문헌[Current Protocols in Immunology, Edited by: John E. Coligan, Ada M. Kruisbeek, David H. Margulies, Ethan M. Shevach, Warren Strober (2001) John Wiley & Sons, NY, N.Y].
T 세포-매개 사멸의 경우에, CAR-리간드 결합은 T 세포에 대한 CAR 신호전달을 개시하여, 다양한 메커니즘에 의해 표적 세포 세포자멸사를 유도할 수 있는 단백질을 생성하거나 방출하도록 T 세포를 유도하는 다양한 T 세포 신호전달 경로의 활성화를 야기한다. 이들 T 세포-매개 메커니즘은 T 세포로부터 세포내 세포독성 과립의 표적 세포 내로의 전달, 표적 세포 사멸을 직접적으로(또는 다른 킬러 효과기 세포의 보충을 통해 간접적으로) 유도할 수 있는 전염증 사이토카인의 T 세포 분비, 및 표적 세포 상에서 이들의 동족 사멸 수용체(예를 들어, Fas)에 대한 결합 후 표적 세포의 세포자멸사를 유도하는 T 세포 표면 상의 사멸 수용체 리간드(예를 들어, FasL)의 상향 조절을 포함한다(그러나 이들로 제한되지 않는다).
일 실시형태에서, 본 발명은 BCMA-발현 B 세포 관련 병태로 진단된 대상체로부터 면역 효과기 세포를 제거하는 단계, 본 명세서에 상정된 CAR을 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터로 상기 면역 효과기 세포를 유전자 변형시켜, 변형된 면역 효과기 세포의 집단을 생성하는 단계, 및 변형된 면역 효과기 세포 집단을 동일한 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, B 세포 관련 병태로 진단된 대상체를 치료하는 방법을 제공한다. 바람직한 실시형태에서, 면역 효과기 세포는 T 세포를 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 또한 CAR 분자를 암호화하는 핵산 작제물을 발현시키는 면역 효과기 세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 대상체에서 표적 세포 집단에 대한 면역 효과기 세포 매개 면역 조절제 반응을 자극하는 방법을 제공한다.
본 명세서에 기재된 세포 조성물을 투여하는 방법은 대상체에서 본 발명의 CAR을 직접적으로 발현시키는 생체외 유전자 변형된 면역 효과기 세포의 재도입 또는 대상체에 도입 시 CAR을 발현시키는 성숙 면역 효과기 세포로 분화되는 면역 효과기 세포의 유전자 변형된 조상세포의 재도입을 초래하는 데 효과적인 임의의 방법을 포함한다. 한 가지 방법은 본 발명에 따른 핵산 작제물을 이용하여 생체외 말초 혈액 T 세포를 형질도입하는 단계 및 형질도입 세포를 대상체 내로 복귀시키는 단계를 포함한다.
본 명세서에 인용된 모든 간행물, 특허 출원 및 발행된 특허는 각각의 개개 간행물, 특허 출원 또는 발행된 특허가 참고로 포함되는 것으로 나타난 구체적이고 개별적으로 나타나는 것과 같이 이들의 전문이 본 명세서에 참조에 의해 본 명세서에 포함된다.
앞서 언급한 발명은 이해의 명확함의 목적을 위해 예시에 의해 그리고 실시예에 의해 일부 상세하게 기재되었지만, 본 발명의 교시에 비추어 첨부하는 청구범위의 정신 또는 범주로부터 벗어나는 일 없이 특정 변화 및 변형이 이루어질 수 있다는 것은 당업자에게 용이하게 분명할 것이다. 다음의 실시예는 단지 예시의 방법으로 제공되며, 제한하는 것이 아니다. 당업자는 본질적으로 유사한 결과를 얻기 위해 변화 또는 변형될 수 있는 다양한 중요하지 않는 파라미터를 용이하게 인식할 것이다.
6. 실시예
6.1. 실시예 1: BCMA CAR의 작제
항-BMCA scFv에 작동 가능하게 연결된 MND 프로모터, 힌지 및 CD8α로부터의 막관통 도메인 및 CD137 공자극 도메인 다음에 CD3ζ 쇄의 세포내 신호전달 도메인을 포함하도록 뮤린 항-BCMA scFv 항체를 포함하는 CAR을 설계하였다. 예를 들어, 도 1 참조. 도 1에 나타낸 BCMA CAR은 면역 효과기 세포 상에서 표면 발현을 위해 CD8α 신호 펩타이드(SP) 서열을 포함한다. 예시적인 BCMA CAR의 폴리뉴클레오타이드 서열은 서열번호 10(항-BCMA02 CAR의 폴리뉴클레오타이드 서열)에 제시하며; BCMA CAR의 예시적인 폴리펩타이드 서열은 서열번호 9(항-BCMA02 CAR의 폴리펩타이드 서열)에 제시하고; 예시적인 CAR 작제물의 벡터 맵은 도 1에 나타낸다. 표 5는 BCMA CAR 렌티바이러스 벡터의 다양한 뉴클레오타이드 세그먼트에 대한 식별, 젠뱅크 참조번호, 공급원 명칭 및 인용문헌을 나타낸다.
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
6.2. 실시예 2: 뮤린 BCMA CAR의 평가
6.2.1. 도입
키메라 항원 수용체(CAR)에 의해 유전자 조작된 T 세포의 입양 전달은 암을 치료하기 위한 유망한 접근으로서 나타났다. CAR은 막관통 영역을 통해 T 세포 신호전달 도메인에 융합된 항원 반응성 단일 쇄 가변 단편(scFv)을 포함하는 인공 분자이다. 본 실시예에서, B 세포 성숙 항원(BCMA)에 특이적인 CAR 분자를 평가하였다. BCMA는 다발성 골수종, 형질세포종, 및 일부 림프종 상에서 발현되며, 아직 정상인 발현은 혈장 세포로 제한된다(Avery et al., 2003; Carpenito et al., 2009; Chiu et al., 2007).
마우스 항-BCMA 항체(C11D5.3)로부터의 서열을 이용하여 항-BCMA02 CAR을 작제하였다. 항-BCMA10 CAR은 변형된 서열을 이용하여 작제하였고, 항-BCMA02 CAR의 "인간화된" 형태이다. 일련의 시험관내 분석에서, 항-BCMA02 CAR T 세포와 항-BCMA10 CAR T 세포는 둘 다 종양 특이성, 높은 CAR 발현을 나타내었고, 항원 발현 표적에 대한 강한 반응성을 야기하였다. 항-BCMA02 CAR T 세포 및 항-BCMA10 CAR T 세포는 BCMA-발현 종양 세포주에 대해 비슷한 반응성을 갖는 것으로 나타났다. 항-BCMA02 CAR T 세포와 항-BCMA10 CAR T 세포는 둘 다 마우스 종양 모델에서의 퇴행을 야기할 수 있지만, 항-BCMA10 CAR T 세포는 항원-독립적 염증 사이토카인 분비를 나타내었고, 따라서, 높은 사이토카인 수준과 연관된 임상 독성을 야기할 가능성을 가진다.
6.2.2. 결과
6.2.2.1. 세포자멸사와 연관된 항-BCMA10 T 세포로부터의 긴장성 염증 사이토카인 방출
BCMA 단백질은 다발성 골수종을 갖는 환자의 혈청에서 검출 가능하다(Sanchez et al., 2012). 다발성 골수종 환자에서의 평균 혈청 BCMA는 10ng/㎖이지만, 최대 100ng/㎖의 수준에서 최고치가 되었다. 항-BCMA CAR T 세포 후보에 대한 생물학적 가용성 BCMA 수준의 영향을 평가하였다.
가용성 BCMA와 함께 24시간 배양 후에 항-BCMA02 CAR T 세포, 항-BCMA10 CART 세포 및 CAR19Δ T 세포로부터의 IFNγ 방출을 시험하였다(도 2A). 항-BCMA02 CAR T 세포는 최대 1㎍/㎖ BCMA와 함께 24시간 배양 후에 최소 사이토카인 방출로 반응하였다. 대조적으로, 항-BCMA10 CAR T 세포는 배양물에 첨가한 가용성 BCMA의 농도에 비례하는 IFNγ의 수준이 증가로 반응하였다. 다발성 골수종 환자에서 보고된 최대 수준인 100ng/㎖ BCMA에서, 항-BCMA10 CAR T 세포 분비 82.1ng/㎖ IFNγ를 항-BCMA02 CAR T 세포에 의해 분비되는 28.8ng/㎖ IFNγ와 비교하였다. 항-BCMA10 CAR T 세포와 함께 BCMA 항원이 없는 대조군 세포주를 더한 몇몇 공동 배양 실험에서 IFNγ도 검출되었다(도 2B, K562 공동 배양물). 이들 데이터는 항-BCMA10 CAR T 세포가 가용성 BCMA에 의한 자극에 대해 증가된 민감성 및 T 세포에서 항원-독립적 사이토카인 반응에 대한 가능성을 가진다는 것을 시사하였다.
항-BCMA02 CAR T 세포, 항-BCMA10 CART 세포(배양 개지로부터 10일) 및 CAR19Δ T 세포로부터의 긴장성 사이토카인 분비 가능성을 시험하였다. CAR T 세포의 제조 후에, 항-BCMA02 CAR T 세포, 항-BCMA10 CART 세포 및 CAR19Δ T 세포 배양물로부터의 성장 배지를 염증 사이토카인의 존재에 대해 분석하였다. 항원 자극의 부재에도 불구하고, 항-BCMA10 CAR T 세포 배양물은 항-BCMA02 CAR T 세포 배양물에서의 1ng/㎖ 미만의 IFNγ에 비해 10ng/㎖ 초과의 IFNγ를 포함하였다(도 3). 항-BCMA10 CAR T 세포 배양물은 또한 유의하게(p<0.001) 더 많은 TNFα를 함유하였다. 항원 자극 없이 항-BCMA10 CAR T 세포에 의해 생성된 사이토카인의 양을 추가로 정량화하기 위해, 24시간 배양 동안 5×104개의 CAR T 세포로부터 사이토카인 방출이 측정되었다. 항-BCMA10 CAR T 세포는 항-BCMA02 CAR T 세포에 비해 유의하게 더 다량의 염증 사이토카인 MIP1α, IFNγ, GMCSF, MIP1β, IL-8 및 TNFα를 생성하였다(도 4, p<0.0001). MIP1α 및 IFNγ 농도는 시험한 모든 사이토카인 중에서 가장 높았다. 항-BCMA10 CAR T 세포는 4.7ng MIP1α/5×104개의 세포/24시간, 3.0ng IFNγ/5×104개의 세포/24시간 및 ~1ng/5×104개의 세포/24시간 또는 더 적은 다른 사이토카인을 생성하였다. 항-염증 사이토카인 IL-10, IL-2 및 IL-4에서 유의한 차이가 검출되지 않았다.
항-BCMA10 CAR T 세포 제조의 종료 시 T 세포 활성화의 표현형 마커 발현을 측정하여 긴장성 염증 사이토카인 분비가 항-BCMA10 CAR T 세포에서 과민성 상태를 나타내는지의 여부를 시험하였다. HLA-DR 및 CD25는 T 세포 활성화 후 12 내지 24시간에 정상적으로 피크 표현을 나타내고, 이어서 시간에 따라 감소되는 표면 마커이다. 3명의 정상 공여자로부터 제조한 CAR T 세포는 항-BCMA02 CAR T 세포의 평균 40±2%가 HLA-DR을 발현시켰다는 것을 나타내었다. 이들 세포에서 HLA-DR의 발현은 비형질도입(43±2.3%) T 세포 및 CAR19Δ(32±2.2%) 대조군 T 세포와 비슷하였다. 대조적으로, 88±1.2% 항-BCMA10 CAR T 세포는 HLA-DR을 발현시켰다(도 5). 다른 활성화 마커 CD25의 발현은 또한 항-BCMA02 CAR T 세포에 비해 항-BCMA10 CAR T 세포에 대해 더 높았다(53±0.9% 대 35±2.4%). 따라서, 항-BCMA10 CAR T 세포는 첨가된 항원이 존재하지 않을 때 활성화된 T 세포의 표현형 특징을 나타내었다.
T 세포에서의 과활성은 종종 세포자멸사에 의해 활성화-유도 세포사(AICD)와 연관된다. 항-BCMA10 CAR T 세포의 과활성이 항-BCMA02 CAR T 세포에 비해 더 높은 세포자멸사 수준을 초래할 수 있는지의 여부를 시험하기 위해 활성화된 카스파제-3의 수준을 측정하였다. 2명의 공여자로부터의 항-BCMA10 CAR T 세포의 48%는 항-BCMA02 CAR T 세포의 16%에 비해 활성인 카스파제-3을 가진다(도 6). 따라서, 첨가된 BCMA 항원이 존재하지 않을 때, 항-BCMA10 CAR T 세포는 항-BCMA02 CAR T 세포에 비해 증가된 활성화 및 염증 사이토카인 분비와 연관된 보다 고빈도의 세포자멸사 세포를 함유한다.
CAR T 세포가 낮은 BCMA 수준에 선택적으로 반응할 수 있는지, 또는 T 세포 성장을 위해 사용한 인간 혈청에서 관련없는 항원에 대해 교차반응성인지의 여부에 대해 항-BCMA02 CAR T 세포 및 항-BCMA10 CAR T 세포를 평가하였다. T 항-BCMA02 CAR T 세포 및 항-BCMA10 CAR T 세포를 인간 혈청이 없는 배지에서 2일 동안 유지하고, 이어서, 100ng/㎖ 가용성 BCMA의 존재 또는 부재 하에 소 태아 혈청(FBS), 인간 혈청(HABS) 또는 HABS를 함유하는 배지로 교환하였다(도 7). 24시간 이후에 ELISA에 의해 IFNγ 방출을 분석하였다. 항-BCMA02 CAR T 세포와 항-BCMA10 CAR T 세포는 둘 다 가용성 BCMA에 반응하였다. 그러나, 항-BCMA10 CAR T 세포는 항-BCMA02 CAR T 세포보다 IFNγ를 10배 더 많이 분비하였다. BCMA의 부재 하에, 소 태아 혈청(FBS)(p=0.0002) 또는 인간 AB 혈청(HABS)(p=0.0007)에서의 배양물과 상관없이 항-BCMA10 CAR T 세포만이 IFNγ를 방출하였다. 이들 데이터는 염증 사이토카인 분비가 항-BCMA10 CAR T 세포에 고유하였다는 것을 시사하였다.
6.2.2.2. 다발성 골수종의 마우스 모델에서 항-BCMA10 CAR T 세포의 불량한 항-종양 기능
과활성화 및 증가된 세포자멸사는 환자에서 CAR T 세포 지속성, 궁극적으로는 임상 효능에 부정적으로 영향을 미칠 수 있다. 마우스 종양 모델에서 항-BCMA02 CAR T 세포 및 항-BCMA10 CAR T 세포의 항-종양 기능을 시험하였다. ~100㎣ 실험적 피하 인간 다발성 골수종(RPMI-8226) 종양을 갖는 NOD-scid 감마(NSG) 마우스를 107개의 항-BCMA02 CAR T 세포, 107개의 항-BCMA10 CAR T 세포, 또는 보르테조밉(VELCADE®)으로 처리하였다. 캘리퍼스를 이용하여 RPMI-8226 성장을 모니터링하였다. 2회의 독립적 실험(도 8a 및 도 8b)에서, 보르테조밉은 비히클 대조군 동물에 비해 종양 성장이 제어되었다. 항-BCMA02 CAR T 세포가 입양 전달된 동물은 빠르고 지속 가능한 종양 클리어런스(조기 종양 퇴행을 확대한 삽도 그래프)를 나타내었다. 항-BCMA10 CAR T 세포의 입양 전달은 또한 종양 퇴행을 야기하였지만, 항-BCMA02 CAR T 세포에 비해 실험 둘 다에서 지연되었다.
6.2.3. 결론
항-BCMA02 CAR T 세포 및 항-BCMA10 CAR T 세포는 시험관내 분석에서 비슷한 항종양 기능을 나타내었지만, 항-BCMA10 CAR T 세포는 환자 치료에서 안전성 및 효능에 부정적으로 영향을 미친 특징을 가졌다. 항-BCMA10 CAR T 세포는 생리적 수준의 BCMA 단백질에 대한 노출 후 염증 사이토카인 분비에 강하게 반응하였다. 사이토카인 폭풍 또는 사이토카인 방출 증후군은 CAR T 세포 요법과 연관된 공지된 임상 독성이다. BCMA에 대한 사이토카인 방출에 관한 문제는 항-BCMA10 CAR T 세포의 긴장성 활성의 관찰 후에 악화되었다. 항원-자극이 존재하지 않을 때 조차, 항-BCMA10 CAR T 세포는 고수준의 염증 사이토카인을 방출하였다. 지속적 사이토카인 분비는 실질적인 임상 독성을 야기할 가능성이 있을 뿐만 아니라 항-종양 기능에 부정적인 영향을 미친다. 또한, 본 발명자들은 다발성 골수종의 마우스 모델에서 항-BCMA02 CAR T 세포 배양물에 비해 세포자멸사 세포의 보다 높은 조성 및 항-BCMA10 CAR T 세포에서의 불량한 항-종양 기능을 발견하였다.
Figure pct00010
Figure pct00011
6.3. 실시예 3: 림프종 상의 최소 BCMA 발현은 항-BCMA CAR T 세포를 활성화한다
발현이 항-BCMA02 CAR T 세포를 활성화시키는 데 충분한지를 결정하기 위해 림프종 및 백혈병 세포주(Daudi 및 Raji) 상의 BCMA 발현 수준을 측정하였다.
유세포분석을 이용하여 림프종, 백혈병 및 다발성 골수종 세포 상의 BCMA 발현을 정량화하였다. 이 분석에서, 알려진 수의 결합된 항체(항체 결합 능력, ABC)에 BCMA 발현의 형광 강도를 상호 연관시킴으로써 세포 상의 상대적 BCMA 발현을 평가하였다. 림프종 세포주에서의 BCMA 발현 수준을 항-BCMA02 CAR T 세포를 활성화하는 것으로 알려진 다발성 골수종 세포주(RPMI-8226)의 BCMA 발현 수준과 비교하였다. 12590±1275 BCMA02 분자를 RPMI-8226 세포 표면 상에서 발현시켰다. 대조적으로, Daudi 세포는 1173±234 BCMA02 분자를 발현시켰고, JeKo-1 세포(외투세포 림프종 세포주)는 222±138 BCMA02 분자만을 발현시켰다(도 9, 원).
다른 세트의 실험에서, 림프종 및 백혈병 세포주에 대해 관찰된 극히 적은 수준의 BCMA에 대한 항-BCMA02 CAR T 세포의 활성을 시험하였다(도 9, 박스). 표준 방법을 이용하여 항-BCMA02 CAR T 세포를 생성하고, BCMA-양성 및 BCMA-음성 종양 세포주와 함께 공동 배양 후에 IFNγ ELISA에 의해 활성을 평가하였다. 항-BCMA02 CAR T 세포의 반응성은 상대적 양의 BCMA mRNA 발현(역치 초과) 및/또는 공동 배양 후 다양한 종양 세포주의 표면 상의 BCMA 수용체 밀도와 상관관계가 있었다(도 9). 만약에 있다면 거의 없는 IFNγ는 BCMA-음성(BCMA-) 종양 세포주: 골수성 백혈병(K562), 급성 림프아구성 백혈병(NALM-6 및 NALM-16); 외투세포 림프종(REC-1); 또는 호지킨 림프종(HDLM-2)과 함께 BCMA CAR T 세포의 공동 배양 시 방출된다. 대조적으로, BCMA02 CAR T 세포와 BCMA-양성(BCMA+) 종양 세포주: B　세포 만성 림프아구성 백혈병(MEC-1), 외투세포 림프종(JeKo-1), 호지킨 림프종(RPMI-6666), 버킷 림프종(Daudi 세포 및 Ramos 세포) 및 다발성 골수종(RPMI-8226)과의 공동배양 시 실질적인 양의 IFNγ가 방출되었다.
BCMA 발현 버킷 림프종 세포(Daudi 세포)에 대한 항-BCMA02 CAR T 세포의 반응성은 생체내 동물 연구로 연장되었다. Daudi 세포는 또한 CD19를 발현시킨다. 항-BCMA02 CAR T 세포의 생체내 활성을 항-CD19 CAR T 세포의 생체내 활성과 비교하였다. NOD scid 감마(NSG) 마우스에 2×106개의 Daudi 세포를 IV 주사하고, CAR T 세포로 치료하기 전에 큰 전신 종양 부담이 축적되는 것을 가능하게 하였다. CAR T 세포를 종양 유도 후 제8일 및 제18일에 투여하였다(각각 도 10a 및 도 10b). 비히클 및 음성 대조군(항-CD19Δ CAR T　세포)은 생물발광에서의 log-기 증가에 의해 나타내는 바와 같이 종양 성장을 방지하지 못하였고, 체중 감소 및 사망을 초래하였다(도 10a, 가장 좌측의 2개의 마우스 패널). 항-CD19 및 항-BCMA02 CAR T 세포는 종양 성장을 방지하여, 체중 및 생존의 유지를 초래하였다. 항-CD19 및 항-BCMA02 CAR T　세포는 제8일에 투여될 때 동등하게 효과적이었다(도 10a, 가장 우측의 2개의 마우스 패널). 항-BCMA02 CAR T　세포는 또한 종양 유도 후 18일에 투여할 때 종양 부담 감소에 효과적이었다. 도 10b, 가장 우측의 패널.
6.4. 실시예 4: 항-BCMA CAR T 세포의 강한 시험관내 활성
항-BCMA02 CAR 발현의 50% 감소와 함께 항-BCMA02 CAR T 세포의 강한 시험관내 활성이 달성되었다. 항-BCM02A CAR 분자를 암호화하는 렌티바이러스의 4x108 내지 5x107 형질도입 단위로 T 세포 집단을 형질도입하였다. 얻어진 T 세포 집단은 감소된 항-BCMA02 CAR T 세포 빈도(양성 백분율로서 분석) 및 항-BCMA02 CAR 분자의 감소된 발현(평균 형광 강도:MFI로서 분석)을 나타내었다.
항-BCMA02 활성에 대한 감소된 CAR 발현 영향을 결정하였다. 항-BCMA CAR-양성 T 세포 빈도는 26±4%의 BCMA-반응성 T 세포를 함유하도록 비형질도입 T 세포로 정규화하였다(도 11A). 정규화된 항-BCMA02 CAR T 세포의 MFI는 885 내지 1875의 범위였다(도 11B). K562는 BCMA 발현이 결여된 CML 세포주이다. K562 세포는 BCMA를 발현시키도록 조작하고, 시험관내 세포용해 분석에서 사용하여 BCMA CAR 발현을 달리함에 따른 항-BCMA02 CAR T 세포의 활성을 평가하였다(도 11C). K562 세포를 세포 추적 바이올렛(cell trace violet)으로 표지한 한편, BCMA를 안정하게 발현시키는 K562 세포(K562-BCMA)를 CFSE로 표지하였다. T 세포, K562 세포 및 K562-BCMA 세포를 채취하고, 세척하고 나서, 외인성 사이토카인을 결여하는 배지에서 재현탁시켰다. 세포를 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 4시간 동안 20:1 또는 10:1의 효과기(E; T 세포) 대 표적(T; K562 및 K562 BCMA 세포의 1:1 혼합물) 비로 배양시켰다. 이어서, 세포를 생/사멸로 염색하고, FACS로 분석하였다. T 세포가 없는 조건으로 정규화시킨 K562:K562-BCMA 세포 비의 차이에 의해 세포독성을 결정하였다.
6.5. 실시예 5: 항-BCMA CAR T 세포 제조 과정
각각의 환자 치료를 위해 독특한 항-BCMA02 CAR T 세포 생성물을 제조한다. 11명의 개개 정상 공여자 PBMC로부터 항-BCMA02 CAR T 세포를 생성함으로써 항-BCMA02 CAR T 세포 생성물에 대한 제조 과정의 신뢰도를 평가하였다. 각각의 공여자로부터의 항-BCMA02 CAR T 세포 확장은 병행하여 수행한 매칭된 비형질도입 배양과 비슷하였다(도 12a).
배양 기간의 종료 시(제10일), qPCR 및 렌티바이러스-특이적 프라이머 세트(벡터 복제수, VCN)를 이용하여 통합된 렌티바이러스 수를 정량화함으로써 T 세포 형질도입 효율을 평가하였다. 11명의 공여자로부터의 항-BCMA02 CAR T 세포 배양물은 비슷한 렌티바이러스 형질도입 효율을 나타내었다(도 12b). 항-BCMA02 CAR 양성 T 세포의 빈도는 유세포분석에 의해 측정하였고 BCMA 발현은 모든 공여자에 걸쳐 비슷한 것이 발견되었다(도 12c).
BCMA를 발현시키도록 조작한 K562 세포와 함께 공동 배양 후에 IFNγ-방출에 의해 각각의 항-BCMA02 CAR T 세포 산물의 활성을 평가하였다. 모든 항-BCMA CAR02 T 세포 생성물은 BCMA-발현 K562 세포에 노출될 때 치료적으로 적절한 수준의 IFNγ 방출을 나타내었다(도 12d).
6.6. 실시예 6: IL-2 또는 IL-2 및 ZSTK474로 처리한 CAR T 세포에 대한 CD62L, CD127, CD197 및 CD38 발현
IL-2 및 ZSTK474와 함께 배양시킨 CAR T 세포는 IL-2 단독과 배양시킨 CAR T 세포에 비해 증가된 CD62L 발현을 나타낸다. 다중파라미터 질량 세포분석(CyTOF)을 이용하여 IL-2 및 ZSTK474와 함께 배양시킨 항-BCMA02 CAR T 세포 상의 29개의 추가적인 세포 표면 마커의 발현 분석을 수행하고, IL-2 단독에서 배양시킨 CAR T 세포와 비교하였다. 3가지 추가적인 마커(CD127, CD197 및 CD38)는 IL-2 단독으로 처리한 CAR T 세포에 비해 IL-2 + ZSTK474 처리 CAR T 세포에서 증가된 발현을 나타내었다. 따라서, CD62L, CD127, CD197 및 CD38의 공동 발현은 ZSTK474-배양 CAR T 세포를 추가로 층화하였다. IL-2를 함유하는 배지에서 배양 후에, 7.44%의 항-BCMA02 CAR T는 IL-2 및 ZSTK474와 함께 배양시킨 24.5%의 항-BCMA02 CAR T 세포에 비해 CD127, CD197 및 CD38을 공동 발현시켰다. 도 13의 벤 다이어그램은 CD62L 양성 항-BCMA02 T 세포에서 CD127, CD197 및 CD38의 공동 발현을 도시한다.
6.7. 실시예 7: ZSTK474 처리는 CD8 T 세포의 빈도를 증가시킨다
CD8 발현을 IL-2 단독 또는 IL-2 및 ZSTK474로 처리한 항-BCMA02 CAR T 세포에서 정량화하였다. 형광 표지된 항-CD8 항체 및 유세포분석을 이용하여 CD8 발현을 결정하였다. IL-2 및 ZSTK474와 함께 배양시킨 7명의 정상 공여자로부터의 항-BCMA02 CAR T 세포는 IL-2 단독과 배양시킨 항-BCMA02 CAR T 세포에 비해 유의하게 더 높은 CD8 발현을 가졌다. 도 14.
6.8. 실시예 8: ZSTK474 처리 항-BCMA CAR T 세포에서 항원-독립적 활성의 결여
항원의 부재 하에 CAR T 세포의 긴장성 활성은 감소된 생물학적 활성과 연관되었다. IL-2 단독에 의하는 표준 조건에 비해 IL-2 및 ZSTK474의 존재 하에 배양 후에 항원의 부재 하에 인터페론-γ(IFN-γ) 방출을 정량화함으로써 항-BCMA02 CAR T 세포의 긴장성 활성은 평가하였다. 대규모 임상 제조 과정에 대해 직접 측정 가능한 시스템을 이용하여 항-BCMA CAR T 세포 배양물을 제조하였다. 간략하게, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 IL-2(셀제닉스(CellGenix)) 및 CD3 및 CD28에 특이적인 항체(밀테니 바이오텍(Miltenyi Biotec))를 함유하는 배지 내 고정 플라스크에서 배양시켰다. 항-BCMA CAR을 암호화하는 렌티바이러스의 2×108개의 형질도입 단위를 배양 개시 1일 후에 첨가하였다.
항-BCMA02 CAR T 세포를 총 10일의 배양 동안 IL-2 및 최적화된 용량의 ZSTK474를 함유하는 신선한 배지를 첨가함으로써 대수 증식기에 유지시켰다. 제조의 마지막에, 동등한 수의 항-BCMA02 CAR T 세포를 배지 단독에서 24시간 동안 재배양하였다. 24시간에 방출된 IFN-γ의 양을 ELISA에 의해 정량화하였다. 이 분석에서 200pg/㎖ 미만의 IFN-γ 수준은 긴장성 활성을 나타내지 않았다. 도 15는, 14명의 공여자로부터의 항-BCMA02 CAR T 세포에 의해 방출된 IFN-γ의 양이 CAR T 세포를 ZSTK474와 함께 배양하든 아니든 긴장성 활성을 결여하는 것과 일치된다는 것을 나타낸다.
6.9. 실시예 9: ZSTK474 처리 항-BCMA02 CAR T 세포는 림프종 종양 모델에서 치료 활성을 나타낸다
IL-2 또는 IL-2 및 ZSTK474와 함께 배양시킨 항-BCMA02 CAR T 세포의 항 종양 활성의 정보를 얻기 위해 Daudi 종양을 사용하였다. Daudi 세포는 저수준의 BCMA 단백질을 발현시키고, 공격성을 제공하며, 림프종 종양 모델을 치료하기에 어렵게 한다.
2×106개의 Daudi 종양 세포를 반딧불이 루시퍼라제 유전자로 표지하였고, 정맥내 주사에 의해 NOD scid IL-2 수용체 감마 쇄 넉아웃 마우스(NSG)에 주사하였다. 종양이 형성되게 한 후에, 1×107개의 CAR T 세포를 종양 보유 마우스에 주사하였다. 마우스에 i) IL-2 또는 IL-2 및 ZSTK474로 10일 동안 처리한 항-BCMA02 CAR T 세포; 또는 ii) IL-2 및 ZSTK474로 10일 동안 처리한 절단된 신호전달 결핍 항-BCMA02 (tBCMA02) CAR T 세포를 주사하였다. 제노겐(Xenogen)-IVIS 영상화 시스템을 이용하여 생물발광에 의해 종양 성장을 모니터링하였다.
IL-2 및 ZSTK474로 처리한 항-BCMA02 CAR T 세포를 투여한 마우스의 50%에서 완전한 종양 퇴행이 관찰되었다. 도 16.
6.10. 실시예 10: ZSTK474 처리된 CAR T 세포는 인간 골수종의 마우스 모델에서 치료 활성을 나타낸다
100㎣ 피하 다발성 골수종 종양(RPMI-8226)을 갖는 동물에 동등한 CAR T 세포 용량(1×106개의 항-BCMA02 CAR-양성 T 세포) 또는 매칭된 T 세포 공여자(비형질도입)로부터의 비변형 T 세포를 주입하였다. 항-BCMA CAR T 세포를 실시예 8에 기재한 바와 같이 IL-2 또는 IL-2 및 ZSTK474로 처리하였다.
IL-2- 또는 IL-2 및 ZSTK474-배양 항-BCMA02 CAR T 세포로 치료한 동물은 종양 파생물(outgrowth)이 완전히 방지되었다. 도 17. 대조적으로 비형질도입 또는 비히클로 처리한 동물은 종양 성장을 제어할 수 없었다. 도 17.
6.11. 실시예 11: 재발 및 난치성 다발성 골수종을 갖는 대상체에서 그리고 초기 치료의 1년 이내에 진행된 고위험의 다발성 골수종을 갖는 대상체에서 BB2121 CAR T 세포의 효능 및 안전성을 결정하기 위한 2상, 다중-코호트, 개방 표지, 다기관 연구
본 실시예는 부문 6.11.1에 추가로 논의하는 바와 같이 CAR 표적화 인간 BCMA를 암호화하는 항-B 세포 성숙 항원(BCMA) 키메라 항원 수용체(CAR)(항-BCMA02 CAR, 상기 기재함) 렌티바이러스 벡터로 형질도입된 세포를 포함하는 자가 T 림프구-풍부 집단인 bb2121의 2상 임상 시험을 약술한다.
본 연구는 재발 및 난치성 다발성 골수종(RRMM)을 갖는 대상체(코호트 1)에서, 초기 치료의 1년 이내에 진행된 고위험(HR) 다발성 골수종(MM)(HRMM)을 갖는 대상체(코호트 2)에서 bb2121의 효능 및 안전성을 결정하기 위한 2상, 다중-코호트, 개방 표지, 다기관 연구이다. 본 연구에 참여하는 대상체에 대한 그리고 추가로 코호트 1 또는 2에 대한 구체적인 포함 및 제외 기준을 부문 6.11.2에서 논의한다. 연구에 대략 122명의 대상체를 등록하고, 이하에 열거하는 바와 같이 2개의 코호트 중 하나로 무작위하고, 대략 103명의 대상체를 bb2121로 처리하였다. 등록으로부터 주입까지의 거부율은 15%인 것으로 추정된다.
6.11.1. Bb2121
Bb2121은 CAR 표적화 인간 BCMA를 암호화하는 항-B 세포 성숙 항원(BCMA) 키메라 항원 수용체(CAR) 렌티바이러스 벡터(항-BCMA02 CAR, 상기 기재)으로 형질도입한 세포를 포함하는 자가 T 림프구-풍부 집단을 포함한다. 항-BCMA02 CAR 렌티바이러스 벡터를 사용하여 자가 T 세포를 형질도입한다. 이 벡터는 뮤린 백혈병 바이러스-유래 골수증식성 육종 바이러스 향상 프로모터를 사용하여 세포외 항원 인식 도메인(VL 및 VH), CD8α 힌지 도메인, 막관통 도메인(CD8 TM), 및 세포내 CD137 공자극(4-1BB) 및 CD3제타 쇄 신호전달 도메인으로 이루어진 다중-도메인 단백질인 키메라 수용체의 발현을 유도한다.
6.11.2. 연구 집단
이 연구를 위한 포함 기준은 하기를 포함한다:
(1) 연령 ≥18세;
(2) 대상체는 다음과 같이 정의되는 측정 가능한 질환을 갖는다:
(i) M-단백질(혈청 단백질 전기영동법 [sPEP] 또는 소변 단백질 전기영동법 [uPEP]): 0.5 g/㎗ 이상의 sPEP 또는 200㎎/24시간 이상의 uPEP, 및/또는
(ii) 혈청 또는 소변에서 측정 가능한 질환이 없는 경쇄 MM: 혈청 면역글로불린 유리 경쇄가 10㎎/㎗ 이상이고, 비정상적 혈청 면역글로불린 카파 람다 유리 경쇄 비;
(3) 동부 종양학 협력 그룹(ECOG) 수행도가 1 이하; 및
(4) 탈모 및 2등급 신경병증을 제외하고, 등급 1로의 회복 또는 사전 치료로 인한 임의의 비 혈액학적 독성의 기준.
추가적으로, 특정 코호트 내의 대상체는 특정 코호트 포함 기준을 가진다. 코호트 1 RRMM (재발 및 난치성 다발성 골수종) 대상체는:
(i) 적어도 3회의 사전 항-골수종 치료 요법을 받아야 함(혈 줄기 세포 이식과 함께 또는 이식이 없는 유도 및 유지 요법이 있는 또는 없는 유도는 단일 요법으로 간주됨);
(ii) 진행성 질환(PD)이 요법에 대해 최고의 반응이 아니라면, 각각의 요법에 대해 적어도 2회 연속적인 치료 주기를 받아야 함;
(iii) 프로테아좀 저해제, 면역조절제 및 항-CD38 항체에 의한 사전 치료를 받아야 함;
(iv) 가장 최근의 사전 치료 요법의 60일에 또는 60일 이내에 PD의 증거가 있어야 함; 그리고
(v) 치료 요법 전 적어도 1가지의 반응(최소 반응[MR] 또는 더 양호)이 달성되어야 함.
추가적으로, 코호트 2 HRMM(고위험 다발성 골수종) 대상체는:
(i) 적어도 1회의 사전 항-골수종 치료 요법을 받아야 함(조혈 줄기 세포 이식과 함께 또는 이식이 없는 포함 및 유지 요법이 있는 또는 없는 포함은 단일 요법으로 간주됨);
(ii) 다음의 HR 인자를 가져야 함: 개정된 국제 병기 체계에 의해 III기로 정의된 HR 질환(Revised International Staging System: R-ISS)(R-ISS III기) 및 조기 재발(정의된 바와 같이, 이식을 받은 대상체에 대해, 제1 이식일 이후로 PD < 12개월, 또는 유도만을 받은 대상체에 대해, 최소로, 프로테아좀 저해제, 면역조절제 및 덱사메타손을 함유하여야 하는 마지막 치료 요법일 이후로 PD < 12개월).
제외 기준. 다음 중 어느 것의 존재는 등록으로부터 대상체를 제외할 것이다:
(1) 백혈구성분채집술 28일 이내에 임의의 연구 제제를 사용한 대상체;
(2) 백혈구성분채집술의 마지막 14일 이내에 다음 중 어느 것을 받은 대상체:
(a) 혈장성분채집술;
(b) 큰 수술(연구자에 의해 정함);
(c) 골수종 연관 골 병변에 대한 국소 요법 이외의 방사선 요법; 및
(d) 임의의 전신 항-골수종 약물 요법의 사용;
(3) 골수종과 함께 알려진 중추 신경계(CNS) 관여를 갖는 대상체;
(4) 대상체는 폐 백혈구 울혈 및 파종성 혈관내 응집의 임상 증거가 있음;
(5) 임상적으로 적절한 CNS 병리, 예컨대 뇌전증, 발작, 부전마비, 실어증, 뇌졸중, 지주막 출혈 또는 다른 CNS 출혈, 중증의 뇌 손상, 치매, 파킨슨병, 소뇌 질환, 기질성 뇌 증후군 또는 정신증의 병력 또는 존재. 대상체가 bb2121 치료 후 4 등급 신경독성을 경험한 경우에만 이 제외 기준은 bb2121로 재치료 전에 적용 가능함(코호트 1);
(6) 혈장 세포 백혈병, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, POEMS 증후군(말초신경병증, 장기종대, 내분비병증, 단클론성 단백질 및 피부 변화), 또는 임상적으로 유의한 아밀로이드증의 활성 또는 이력을 갖는 대상체;
(7) 대상체는 비분비성 MM을 가짐;
(8) 대상체는 임의의 다음의 실험 이상을 가짐:
(a) 1,000/㎕ 미만의 절대 호중구 계수(ANC);
(b) 50,000 ㎣미만의 수혈 지원 없는 혈소판 계수(선별 7일 이내에 혈소판 수혈);
(c) 헤모글로빈 < 8 g/㎗(< 4.9m㏖/ℓ)(이 수준에 도달될 때까지 대상체에게 수혈이 허용되지 않음);
(d) 45 ㎖/분 미만의혈청 크레아티닌 클리어런스(CrCl);
(e) 13.5㎎/㎗ 초과(3.4m㏖/ℓ 초과)의 보정된 혈청 칼슘;
(f) 2.5×정상의 상한(ULN) 초과의 혈청 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제(AST) 또는 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT);
(g) 1.5×ULN 초과의 혈청 총 빌리루빈 또는 기록된 길버트 증후군을 갖는 대상체에 대해 3.0㎎/㎗ 초과; 및
(h) 30일 이내에 국제비(International ratio: INR) 또는 1.5×ULN 초과의 부분적 트롬보플라스틴 시간(PTT), 또는 2 등급 이상의 출혈 병력, 또는 만성의, 항응고제(예를 들어, 와파린, 저분자량 헤파린, 인자 Xa 저해제) 치료적 투약에 의하는 진행 중인 치료를 받고 있는 대상체;
(9) 심초음파검사(ECHO) 또는 45% 미만의 좌심실 박출률을 갖는 다중-개폐 획득(multi-gated acquisition: MUGA);
(10) 연구 치료 시작 전에 이전의 6개월 이내에 클래스 III 또는 IV 울혈성심부전(CHF) 또는 중증의 비허혈 심근증, 불안정한 또는 불량하게 제어되는 협심증, 심근 경색증 또는 심실부정맥 병력을 갖는 대상체;
(11) 실내 공기 상에서 산소 포화도(Sa02) < 92%로서 정의되는 부적절한 폐 기능;
(12) 만성 면역억제제(예를 들어, 임의의 용량에서 사이클로스포린 또는 전신성 스테로이드)에 의한 진행 중인 치료. 간헐적 국소, 흡입 또는 비강내 코르티코스테로이드가 허용된다;
(13) 암에 대한 임의의 유전자 요법 기반 치료 또는 암 또는 BCMA 표적화 요법에 대한 연구 세포 요법을 이용하는 동종이계 조혈 줄기 세포 이식 또는 치료의 이전의 병력;
(14) 대상체는 백혈구성분채집술 전 12주 이내에 자가 줄기 세포 이식(ASCT)을 받은 적이 있음;
(15) 대상체는 원발성 면역결핍증의 병력을 가짐;
(16) 대상체는 인간 면역결핍 바이러스(HIV-1), 만성 또는 활성 B형 간염 또는 활성 A 또는 C형 간염 바이러스에 대해 양성임;
(17) 대상체는 적절한 항생제 또는 다른 치료에도 불구하고 통제되지 않는 전신 진균, 박테리아, 바이러스 또는 다른 감염(결핵을 포함)을 가짐;
(18) 다음의 비침습성 악성종양을 제외하고, 대상체가 5년 이상 동안 질환이 없다면, MM 이외의 악성종양의 사전 병력을 갖는 대상체:
(a) 피부의 기저세포 암종;
(b) 피부의 편평세포 암종;
(c) 자궁경부의 상피내암;
(d) 유방의 상피내암; 및
(e) 전립선암(TNM[종양, 결절, 전이] 임상 병기 시스템을 이용하여 T1a 또는 T1b) 또는 치유성의 전립선 암의 부수적인 조직학적 발견;
(19) 대상체가 연구에 참여하는 동안 임신 중이거나, 치료중이거나, 수유중이거나, 임신 계획 중인 여성임;
(20) bb2121 산물의 임의의 성분, 사이클로포스파마이드, 플루다라빈 및/또는 토실리주맙에 대해 알려진 과민증을 갖는 대상체;
(21) 대상체는 대상체가 연구에 참여하는 것을 막는 임의의 유의한 의학적 병태, 실험 이상 또는 정신의학 질환을 가짐;
(22) 대상체는 그/그녀가 연구에 참여한다면 대상체를 허용되지 않는 위험에 두는 실험 이상의 존재를 포함하는 임의의 병태를 가짐. 이는 제어되지 않는(적절한 항미생물제 치료에도 불구하고, 개선 없이, 감염과 관련된 진행 중인 징후/증상을 나타내는 것으로 정의됨) 또는 관리를 위해 IV 미생물제를 필요로 하는, 전신 진균, 박테리아, 바이러스 또는 기타 감염을 포함함; 그리고
(23) 대상체는 연구로부터 데이터를 해석하는 능력을 혼란시키는 임의의 병태를 가짐.
6.11.3. 연구 설계
연구는 4가지 기간으로 이루어진다:
(1) 전처리 기간(선별, 백혈구성분채집술 및 선택적 브리징 요법 및 기준 평가);
(2) 치료 기간(림프구고갈(LD) 화학요법(플루다라빈 및 사이클로포스파마이드) 및 bb2121 주입);
(3) 치료 후 후속 기간(bb2121 주입 후 최소 24-개월 동안 또는 마지막 대상체가 제1 주입을 받은 후 최대 5년까지 동안 PD를 보고할 때까지, 어느 쪽이든 더 긴 것); 및
(4) 후속 생존 기간.
전처리 기간 동안, 선별된 대상체는 bb2121 산물 생성을 가능하게 하는 백혈구성분채집술을 받는다. 대상체는 연구자의 재량에 따라 브리징 요법을 받을 수 있다. bb2121 약물 제품이 성공적으로 제조된 후에, 브리징 요법을 받은 해당 대상체에 대한 병기 평가를 포함하는 추가적인 기준 평가를 수행하여 LD 화학요법의 개시 전에 계속된 적격 및 안전성 평가를 수행한다.
150 내지 450×106개의 세포 용량으로 치료 제1일에, 치료 기간을 림프구고갈 화학요법으로 시작한 후에 bb2121 주입이 이어진다.
코호트 1 . 3회 이상의 사전 항-골수종 치료 요법을 받은 대략 73명의 RRMM 대상체를 등록하여, 안전성 및 효능 평가를 위해 이 코호트에서 대략 62명의 대상체가 bb2121로 처리되는 것을 보장한다. 코호트 1에서, 프로토콜에서 정해지는 구체적 기준이 충족된다면, 브리징 요법과 함께 또는 브리징 요법 없이 림프구고갈(LD) 화학요법의 제2 과정을 포함하는 bb2121의 제2 용량에 의한 재치료가 고려될 수 있다. 재치료된 대상체는 제2 주입 후 최소 6개월 동안 또는 마지막 대상체가 제1 주입을 받은 후 최대 5년 동안 기록된 PD까지, 어느 쪽이든 더 긴 것으로 본 연구가 이어진다. 대상체는 다음의 구체적 기준이 충족된다면 bb2121의 제2 주입을 받을 자격이 있다:
Figure pct00012
이는 제1 bb2121 주입 이후로 적어도 8주임;
Figure pct00013
대상체는 또한 본래의 백혈구성분채집술 물질로부터 제조된 단리된 PBMC 또는 bb2121 산물이 남아있음;
Figure pct00014
초기 bb2121에 대한 최고의 반응은 다발성 골수종에 대한 국제 골수종 실행 그룹(IMWG) 균일 반응 기준에 따른 반응 기준에 기반하여 안정한 질환(SD)이거나 더 양호함;
Figure pct00015
IMWG 기준에 따른 진행성 질환(PD)의 증거;
Figure pct00016
사전 bb2121 치료를 받은 4등급 사이토카인 방출 증후군(CRS) 또는 신경독성의 병력 없음;
Figure pct00017
등록을 위한 적격 기준은 계속해서 충족되어야 함(골수종과 함께 알려진 중추 신경계(CNS) 관여를 갖는 대상체의 제외, 암에 대한 임의의 유전자 요법-기반 치료제 또는 BCMA 표적화 요법 및 호중구에 의하는 치료를 받은 대상체의 제외 및 혈소판 관련 제외 기준을 제외함);
Figure pct00018
림프구고갈 (LD) 화학요법을 시작하기 위한 적격 기준은 충족될 필요가 있음;
Figure pct00019
전뇌 또는 관련된 뇌 방사선요법(두피 또는 두개골 병변에 대한 완화적 병소, 최소 침투성, 방사선요법을 제외)이 필요한 CNS 내의 골수종 진행을 갖는 대상체에 대한 방사선 요법으로부터 적어도 8주의 갭; 및
Figure pct00020
대상체는 제1 bb2121 주입 이후로 임의의 MM 요법을 받은 적이 없음.
코호트 2 . 한(1) 번의 항-골수종 치료 요법 및 개정된 국제 병기 체계(R-ISS)에 따라 III기로 정해진 HR 질환 및 조기 재발을 갖는 대략 49명의 MM 대상체를 등록하여 대략 41명의 대상체가 bb2121로 치료되는 것을 보장한다. 초기 재발은 이식 적격(TE) 대상체에 대해 초기 자가 줄기 세포 이식(ASCT)으로부터 12개월 이내의 진행성 질환(PD) 및 및 이식 부적격(TNE)에 대한 사전 요법(사전 요법은 최소 프로테아좀 저해제, 면역조절제 및 덱사메타손을 함유하여야 함)의 12개월 이내의 PD로서 정의한다.
연구를 조기에 중단하거나 완료한 대상체에 대해, 장기간 bb2121-관련 독성, 바이러스 벡터 안전성, 생존 상태 및 후속적 항-골수종 요법을 별개의 장기간 후속 프로토콜 하에 모니터링한다.
6.11.4. 종점
연구의 1차 종점은 RRMM을 갖는 대상체에서 그리고 초회 치료의 1년 이내에 진행된 HR MM을 갖는 대상체에서 bb2121의 효능 평가이다. 2차 종점은 RRMM을 갖는 대상체에서 그리고 초회 치료의 1년 이내에 진행된 HR MM을 갖는 대상체에서 bb2121의 효능 평가; (벡터 복제수[VCN]에 의한) 말초 혈액 및 골수에서 키메라 항원 수용체(CAR) + T 세포의 확장 및 지속성의 특성규명; 항-CAR 항체 반응 발생의 평가; (EuroFlow 및 차세대 서열분석[NGS]에 의해) 최소 잔여 질환(MRD) 음성 상태를 달성하는 대상체 백분율의 평가; 및 건강 관련 삶의 질(health-related quality of life: HRQoL) 변화의 평가를 포함한다. 1차 및 2차 종점을 다음의 표에 열거한다:
Figure pct00021
코호트 1 또는 코호트 2의 대상체는 (림프구고갈 화학요법 개시 전 14일 또는 14일 초과에 투여 받는다면) 백혈구성분채집술과 bb2121의 투여 사이에 브리징 요법을 받을 수 있다. 브리징 요법은 코르티코스테로이드, 알킬화제, 면역조절제, 프로테아좀 저해제 및/또는 항-CD38 항체를 단일 제제로서 또는 연구자의 재량에 기반하여 조합물로 포함할 수 있다. 대상체가 이전에 노출되지 않은 실험 제제 및 골수종 요법은 브리징 요법으로서 사용해야 한다.
6.11.5. 치료 방법
LD 화학요법: 3연속일(-제5일에 시작) 다음에 나머지 2일 동안 각각 매일 할당된 용량 30㎎/㎡ 및 300㎎/㎡로 투여한 정맥내(IV) 플루다라빈 및 사이클로포스파마이드. LD 화학요법의 완료 후, bb2121은 150 내지 450×106개의 CAR+ T 세포 범위의 용량으로 IV 주입으로서 투여한다.
6.12. 실시예 12: 재발성 및 난치성 다발성 골수종(RRMM)을 갖는 표준 삼중 요법에 대한 BB2121의 효능 및 안전성을 비교하기 위한 3상, 다기관, 무작위, 개방 표지 연구
본 실시예는 bb2121의 3상 임상 연구를 약술한다. 연구는 재발 및 난치성 다발성 골수종(RRMM)을 갖는 대상체에서의 표준 삼중 요법에 대해 bb2121(상기 부문 6.11.1에서 더 상세하게 논의하는 바와 같은 인간 BCMA를 표적화하는 CAR을 암호화하는 항-B 세포 성숙 항원(BCMA) 키메라 항원 수용체(CAR)(상기 기재한 항-BCMA02 CAR) 렌티바이러스 벡터로 형질도입된 세포를 포함하는 자가 T 림프구-풍부 집단임)의 효능 및 안전성을 비교하는 3상, 무작위, 개방 표지 연구이다. 비교기로서 사용한 특정 삼중 요법은 하기를 포함한다: (1) 다라투무맙(D), 포말리도마이드(P) 및 덱사메타손(d)(함께, DPd); (2) 다라투무맙, 보르테조밉(VELCADE®; V) 및 덱사메타손(함께 DVd); (3) 익사조밉(I), 레날리도마이드(REVLIMID®; R) 및 덱사메타손(함께, IRd).
6.12.1. 연구 집단
연구 집단은 레날리도마이드(REVLIMID®) 또는 포말리도마이드(POMALYST®) 및 프로테아좀 저해제(PI)를 포함하는 적어도 2회의 사전 요법을 받은 MM을 갖는 대상체로 이루어지며, 마지막 요법 후 60일 동안 또는 이내에 질환 진행이 기록되어야 한다. 덱사메타손(DP±d)과 함께 또는 이것 없이 포말리도마이드와 병용하여 사전에 다라투무맙을 받은 대상체는 포함시키지 않을 수도 있다. 덱사메타손(DV±d)과 함께 또는 없이 보르테조밉과 병용한 다라투무맙에 대한 사전 노출 또는 덱사메타손(IR±d)과 함께 또는 없이 레날리도마이드와 병용한 익사조밉에 대한 사전 노출이 허용되지만, 그러나 대상체는 이 연구에 등록되기 전 마지막 사전 요법으로서 DV±d 또는 IR±d를 받지 않을 수도 있다.
이 연구를 위한 포함 기준은 하기를 포함한다:
(1) 대상체는 사전 동의서(ICF)에 서명 시 18세 이상임;
(2) 대상체는 임의의 연구-관련 평가/절차를 수행하기 전에 ICF를 이해하고 자발적으로 서명하여야 함.
(3) 대상체는 치료 아암 A에 대해 기꺼이 연구 방문 스케줄 및 이 프로토콜 내의 다른 프로토콜 요건을 준수하고, 대상체는 유전자 요법 시험에 대한 규제 가이드라인에 의해 지시되는 바와 같이 최대 15년 동안 후속 조치를 계속하는 것에 동의함.
(4) 대상체는 (i) (a) 약 0.5 g/㎗ 이상의 혈청 M-단백질 수준(혈청 단백질 전기영동법 [sPEP]), 또는 (b) 약 200㎎/24시간 이상의 소변 M-단백질 수준(소변 단백질 전기영동법 [uPEP]); 및/또는 (ii) 약 10㎎/㎗(100㎎/ℓ) 이상의 혈청 또는 소변: 혈청 면역글로불린 유리 경쇄 및 비정상적 혈청 면역글로불린 카파 람다 유리 경쇄 비에서 측정 가능한 질환 없이 경쇄 MM으로서 정의되는 다발성 골수종(MM) 및 측정 가능한 질환의 진단을 기록함;
(5) 대상체는 적어도 2회의 사전 MM 요법을 받음. 조혈 줄기 세포 이식과 함께 또는 이식이 없는 그리고 유지 요법과 함께 또는 유지 요법이 없는 유도는 하나의 요법으로 간주됨;
(6) 대상체는 적어도 2 연속 주기 동안 프로테아좀 저해제- 및 면역 조절 화합물-함유 요법에 의한 사전 치료를 받음.
(7) 대상체는 마지막 치료 요법에 대해 난치성이어야 함. 난치성은 연구 등록 전 마지막 항-골수종 요법에 의한 치료를 완료하고 60일 동안 또는 이내에(요법 이내의 임의의 약물의 마지막 투약으로부터 측정함) 기록된 진행성 질환으로서 정의함;
(8) 대상체는 치료 요법 전 적어도 1가지의 반응(최소 반응[MR] 또는 더 양호)이 달성됨;
(9) 대상체는 약 1 이하의 동부 종양학 협력 그룹(ECOG) 수행도를 가져야 함;
(10) 대상체는 탈모 및 2등급 신경병증을 제외하고, 등급 1로의 회복 또는 사전 치료로 인한 임의의 비 혈액학적 독성의 기준을 가져야 함;
(11) 대상체는 백혈구성분채집술에 대한 적절한 혈관 접근을 가져야 함;
(12) 임신 가능성이 있는 여성 대상체(FCBP)는 하기를 만족해야 함:
(a) 연구자에 의해 검증하여, 임신 검사에서 음성이어야 함.
(b) 사실상 이성 접촉에 대해 실제로 금욕하거나 또는 중단 없이 피임의 효과적인 측정의 사용에 동의하고, 준수할 수 있어야 함.
(c) 연구 참여 동안 수유를 중단하는 것에 동의해야 함.
(d) 난자 세포 공여를 자제해야 함.
(13) 남성 대상체는 사실상 금욕을 실행하거나 임신 중인 여성 또는 임신 가능성이 있는 여성과의 성적 접촉 동안 콘돔을 사용하는 것에 동의하는 한편, 연구에 참여하는 동안, 정자 공여를 자제하여야 함.
제외 기준. 다음 중 어느 것의 존재는 등록으로부터 대상체를 제외할 것이다:
(1) 대상체는 대상체가 연구에 참여하는 것을 막는 임의의 유의한 의학적 병태, 실험 이상 또는 정신의학 질환을 가짐;
(2) 대상체는 그/그녀가 연구에 참여한다면 대상체를 허용되지 않는 위험에 두는 실험 이상의 존재를 포함하는 임의의 병태를 가짐;
(3) 대상체는 연구로부터 데이터를 해석하는 능력을 혼란시키는 임의의 병태를 가짐;
(4) 대상체는 비분비성 MM을 가짐;
(5) 대상체는 임의의 다음의 실험 이상을 가짐:
(a) 1,000/Ml 미만의 절대 호중구 계수(ANC);
(b) 혈소판 계수: 골수 유핵 세포의 50% 미만이 혈장 세포인 대상체에서 75,000/㎕ 미만 및 골수 유핵 세포의 50% 이상이 혈장 세포인 대상체에서 50,000/㎕ 미만인 혈소판 계수(대상체가 이 수준에 도달하도록 수혈하는 것은 허용되지 않음);
(c) 8 g/㎗ 미만(4.9m㏖/ℓ 미만)의 헤모글로빈(이 수준에 도달될 때까지 대상체에게 수혈이 허용되지 않음);
(d) 45 ㎖/분 미만의 혈청 크레아티닌 클리어런스(CrCl);
(e) 13.5㎎/㎗ 초과(3.4m㏖/ℓ 초과)의 보정된 혈청 칼슘;
(f) 혈청 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제(AST) 또는 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT) > 2.5×정상의 상한(ULN);
(g) 기록된 길버트 증후군을 갖는 대상체에 대해 1.5×ULN 초과 또는 3.0㎎/㎗ 초과의 혈청 총 빌리루빈; 및
(h) 30일 이내에 국제 정규화 비(INR) 또는 1.5×ULN 초과의 활성화된 부분적 트롬보플라스틴 시간(aPTT), 또는 2 등급 이상의 출혈 병력, 또는 만성의, 항응고제(예를 들어, 와파린, 저분자량 헤파린, 인자 Xa 저해제) 치료적 투약에 의하는 진행 중인 치료를 받고 있는 대상체;
(6) 대상체는 실내 공기에서 92% 미만의 산소 포화도(SaO2)로서 정의되는 부적절한 폐 기능을 가짐;
(7) 대상체는 다음의 비침습성 악성종양을 제외하고, 대상체가 5년 이상 동안 질환이 없다면, MM 이외의 악성종양의 사전 병력을 가짐:
(a) 피부의 기저세포 암종;
(b) 피부의 편평세포 암종;
(c) 자궁경부의 상피내암;
(d) 유방의 상피내암; 및
(e) 전립선암(종양, 결절, 전이[TNM] 임상 병기 시스템을 이용하여 T1a 또는 T1b) 또는 치유 의도로 치료될 수 있는 전립선 암의 부수적인 조직학적 발견;
(8) 대상체는 혈장 세포 백혈병, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, POEMS 증후군(말초신경병증, 장기종대, 내분비병증, 단클론성 단백질 및 피부 변화), 또는 아밀로이드증의 활성 또는 이력을 가짐;
(9) 골수종과 함께 알려진 중추 신경계(CNS) 관여를 갖는 대상체.
(10) 대상체는 폐 백혈구 울혈 및 파종성 혈관내 응집의 임상 증거가 있음;
(11) 대상체는 예측되는 정상치의 50% 미만인 1초간 강제 호기량(FEV1)을 갖는 공지된 만성 폐쇄성 폐 질환(COPD)을 가짐. 강제 호기 시험(FEV1)은 COPD를 가질 것으로 의심되는 대상체에 필요하며, FEV1이 예측된 정상체의 50% 미만인 경우에 대상체는 제외되어야 함;
(12) 대상체는 임상적으로 적절한 CNS 병리, 예컨대 뇌전증, 발작, 부전마비, 실어증, 뇌졸중, 지주막 출혈 또는 다른 CNS 출혈, 중증의 뇌 손상, 치매, 파킨슨병, 소뇌 질환, 기질성 뇌 증후군 또는 정신증의 병력 또는 존재를 가짐;
(13) 대상체는 이들의 가장 최근의 항-골수종 치료 요법의 일부로서 dex(DP±d)와 함께 또는 이것 없이 포말리도마이드(POM)와 병용하여 다라투무맙(DARA)으로 치료하였고, 브리징 요법으로서 DPd(즉, 다라투무맙, 포말리도마이드 및 덱사메타손)를 가질 수 있지만, 치료 아암 A에 대해 무작위화한 경우 연구자의 재량에 따라 브리징으로서 DVd(즉, 다라투무맙, 보르테조밉 및 덱사메타손) 또는 IRd(즉, 익사조밉, 레날리도마이드 및 덱사메타손)를 받을 수 있음;
(14) 대상체는 이들의 가장 최근의 항-골수종 치료 요법의 일부로서 DP±d로 치료하였고, 치료 아암 B에 대해 무작위화한 경우 DPd를 받을 수 없지만, 연구자의 재량에 따라 DVd 또는 IRd를 받을 수 있음;
(15) 대상체를 이들의 가장 최근의 항-골수종 치료 요법의 일부로서 덱사메타손(dex)(DV±d)과 함께 또는 이것 없이 보르테조밉(BTZ)과 병용하여 DARA로 처리하였고, 브리징 요법으로서 DVd를 받을 수 있지만, 치료 아암 A에 대해 무작위화한 경우 연구자의 재량에 따라 브리징으로서 DPd 또는 IRd를 받을 수 있음;
(16) 대상체는 이들의 가장 최근의 항-골수종 치료 요법의 일부로서 DV±d로 치료하였고, 치료 아암 B에 대해 무작위화한 경우 DVd를 받을 수 없지만, 연구자의 재량에 따라 DPd 또는 IRd를 받을 수 있음;
(17) 대상체는 이들의 가장 최근의 항-골수종 치료 요법의 일부로서 dex (IR±d)와 함께 또는 이것 없이 레날리도마이드(LEN)와 병용하여 익사조밉(IXA)으로 처리하였고, 브리징 요법으로서 IRd를 받을 수 있지만, 치료 아암 A에 대해 무작위화한 경우 연구자의 재량에 따라 브리징으로서 DPd 또는 DVd를 받을 수 있음;
(18) 대상체는 이들의 가장 최근의 항-골수종 치료 요법의 일부로서 IR±d로 치료하였고, 치료 아암 B에 대해 무작위화한 경우 IRd를 받을 수 없지만, 연구자의 재량에 따라 DPd 또는 DVd를 받을 수 있음;
(19) 암에 대한 임의의 유전자 요법 기반 치료, 암 또는 BCMA 표적화 요법에 대한 연구 세포 요법을 이용하는 동종이계 조혈 줄기 세포 이식, 치료의 이전의 병력;
(20) 대상체는 무작위화 전 12주 이내에 자가 줄기 세포 이식(ASCT)을 받음;
(21) 대상체는 무작위화 전 28일 이내에 임의의 연구 제제를 사용함.
(22) 대상체는 무작위화 전 마지막 14일 이내에 다음 중 어느 것을 받음:
(a) 혈장성분채집술;
(b) 큰 수술(연구자에 의해 정함);
(c) 골수종 연관 골 병변에 대한 국소 요법 이외의 방사선 요법; 및
(d) 임의의 전신 항-골수종 약물 요법의 사용;
(23) 좌심실 박출률(LVEF)이 45% 미만인 심초음파검사(ECHO) 또는 다중개폐 획득(MUGA);
(24) 만성 면역억제제(예를 들어, 임의의 용량에서 사이클로스포린 또는 전신성 스테로이드)에 의한 진행 중인 치료. 간헐적 국소, 흡입 또는 비강내 코르티코스테로이드가 허용된다;
(25) 대상체는 인간 면역결핍 바이러스(HIV-1), 만성 또는 활성 B형 간염 또는 활성 A 또는 C형 간염 바이러스에 대해 양성임;
(26) 대상체는 제어되지 않는(적절한 항미생물제 치료에도 불구하고, 개선 없이, 감염과 관련된 진행 중인 징후/증상을 나타내는 것으로 정의됨) 또는 관리를 위해 IV 미생물제를 필요로 하는, 전신 진균, 박테리아, 바이러스 또는 기타 감염을 가짐;
(27) 대상체는 무작위화 전에 이전의 6개월 이내에 클래스 III 또는 IV 울혈성심부전(CHF) 또는 중증의 비허혈 심근증, 불안정한 또는 불량하게 제어되는 협심증, 심근 경색증 또는 심실부정맥 병력을 가짐;
(28) DARA, 탈리도마이드, 레날리도마이드, POM, BTZ, IXA 또는 dex에 대한 과민증. 이는 사전 탈리도마이드, POM 또는 레날리도마이드 요법 동안 3등급 이상의 발진을 포함함;
(29) bb2121 산물의 임의의 성분, 사이클로포스파마이드, 플루다라빈, 및/또는 토실리주맙에 대한 알려진 과민증 또는 DARA, POM, LEN, IXA, BTZ 또는 dex의 제형에 함유된 부형제에 대한 과민증을 갖는 대상체;
(30) 대상체가 연구에 참여하는 동안 임신 중이거나, 치료중이거나, 수유중이거나, 임신 계획 중인 여성임;
(31) 치료 아암 B에 대해 무작위화하고, POM- 또는 LEN-함유 요법을 할 대상체에 대해; 혈전증 예방이 필요한 프로토콜을 받을 수 없거나 할 의사가 없음; 및
(32) 대상체는 보르테조밉에 대해 불내성이며, 대상체는 치료 아암 A에 대해 무작위화하는 경우 브리징 요법으로서 DVd를 받을 수 없거나 또는 치료 아암 B에 대해 무작위화하지 않은 경우에 DVd를 받을 수 없음.
6.12.2. 연구 설계
대략 390명의 대상체를 치료 아암 A 또는 치료 아암 B 사이에 2:1로 무작위화한다. 대략 260명의 대상체는 치료 아암 A를 받도록 무작위화하고, 대략 130명의 대상체는 치료 아암 B를 받도록 무작위화한다. 치료 아암 A는 bb2121로 이루어지고, 치료 아암 B는 연구자의 재량에 따라 표준 삼중 요법: DPd, DVd 또는 IRd로 이루어진다. 다음의 인자에 의해 적격인 대상체를 다음의 인자에 의해 층상화되는 상호작용 반응 기술(Interactive Response Technology: IRT)을 이용하여 무작위화한다:
Figure pct00022
사전 다라투무맙 치료 없음에 대한 사전 다라투무맙 치료
Figure pct00023
3가지 초과의 사전 항i-골수종 요법에 대한 2 또는 3회의 사전 항-골수종 요법; 및
Figure pct00024
이들 고위험 세포유전학적 이상의 부재 또는 알려지지 않은 존재에 대한 고위험 세포유전 이상(예를 들어, t(4;14) 또는 t(14;16) 또는 del 17p)(기준 또는 역사적 세포유전학적 결과) 고위험 세포유전학적 이상의 존재.
치료 아암 A에 대해 무작위화한 대상체는 bb2121 산물 생성을 가능하게 하는 백혈구성분채집술을 받는다. 연구자의 재량에 따라, 대상체는 마지막 용량이 림프구고갈 (LD) 화학요법의 개시 전 14일 이상 투여된다면, 백혈구성분채집술 후 브리징 MM으로서 1주기 이하의 DPd를 받을 수 있다. bb2121 약물 제품을 성공적으로 제조한 후에, 림프구고갈(LD) 화학요법 개시의 적어도 3일 전에 적격 및 안전성을 평가하기 위해 추가적인 기준 평가(브리징 MM 요법을 받은 대상체에 대한 질환 병기 평가를 포함)를 수행한다. 치료에 적격인 대상체는 플루다라빈 및 사이클로포스파마이드를 이용하는 연속 3일의 LD 화학요법, 다음에 나머지 2일 및 후속적으로 제1일에 bb2121 주입을 받는다. 대상체는 기록된 진행성 질환(PD) 또는 동의의 철회까지 안전성 및 효능에 따랐다. bb2121을 받은 모든 대상체를 장기간 안전성에 대해 모니터링한다.
치료 아암 B에 대해 무작위화한 대상체는 연구자의 재량에 따라 다음의 연구 치료 중 하나를 받는다: 정맥내(IV) 다라투무맙, 경구 포말리도마이드, 및 경구 또는 IV 덱사메타손(DPd); 정맥내 다라투무맙, 피하(SC) 보르테조밉, 및 경구 또는 IV 덱사메타손(DVd); 및 경구 익사조밉, 경구 레날리도마이드, 및 경구 덱사메타손(IRd). 대상체는 안전성 및 효능을 따르고, PD, 허용 가능하지 않은 독성 또는 동의의 철회까지 연구 치료를 계속할 수 있다.
6.12.3. 종점
무진행 생존(PFS): PFS는 무작위화로부터 제1 기록 진행 또는 연구 상의 임의의 원인으로 인한 사망까지의 시간으로서, 어느 쪽이든 먼저 일어나는 것으로 계산한다. 연구 동안 사전 실수 평가 없이 임의의 진행이 관찰될 때 진행일을 가장 이른 시간에 배정한다. 요법의 유해 사건 또는 변화로 인해 기록된 진행 또는 사망 전에 연구 철회가 일어난다면, 이들 관찰은 마지막 완전한 골수종 반응 평가가 진행의 결여를 결정할 때의 일자로 검열한다.
중요한 2차 종점: 전반적 생존(OS). OS는 무작위화로부터 임의의 원인에 의한 사망까지의 시간으로서 계산한다.
다른 2차 종점:
무사건 생존(EFS): EFS는 무작위화로부터 제1 기록 진행, 즉, 대상체가 다른 항-골수종 치료를 받는 첫 번째 날 또는 연구 중 임의의 원인으로 인한 사망 중 어느 것이든 먼저 일어나는 것까지의 시간으로서 계산한다.
전반적 반응률(ORR) 반응자는 적어도 부분적인 반응(PR)을 나타내는 임의의 대상체이다. 전반적 반응률(ORR)은 반응자의 백분율로서 정의한다. 이들이 후속적인 항-골수종 치료를 받은 후에 대상체로부터의 반응을 계수하지만; 이들 환자는 공통 특징에 포함시킨다.
최소 잔여 질환(MRD) 성향: 유세포분석(유로플로우(EuroFlow)) 및 차세대 서열분석(NGS)을 이용하는 MRD 음성(105개의 유핵 세포 중 최소 1개로 정의)인 MRD 평가 가능 대상체의 백분율.
완전한 반응률(CR): CR률은 적어도 CR을 갖는 대상체의 백분율로서 정의한다.
상기 반응 및 MRD 종점에 대해, 국제 골수종 실행 그룹(IMWG) 기준을 사용하여 골수종 반응을 범주화한다. 주요 분석을 위한 공통 특징으로서 ITT 집단을 사용하고, 지지 분석을 위해 EE 집단을 사용한다.
반응에 대한 시간(TTR): TTR은 반응자에 대한 IMWG 가이드라인에 기반하여 무작위화로부터 초기 기록 반응(PR 또는 더 양호)까지의 시간으로서 계산한다.
반응의 지속시간(DOR) DOR은 초기 기록 반응(PR 또는 더 양호)으로부터 확인된 질환 진행까지의 시간으로서 정의한다.
다음 항-골수종 치료까지의 시간: 다음 항-골수종 치료까지의 시간은 무작위화로부터 대상체가 다른 항-골수종 치료를 받을 때의 첫 번째 날까지의 시간으로서 계산한다. 분석 시 다른 항-골수종 치료를 받지 않은 대상체는 마지막 평가일(다음 항-골수종 치료가 치료기의 종료 전에 제공되는 경우) 또는 마지막 후속 방문일(장기간 후속기 동안 다음 항-골수종 치료가 제공되는 경우)에 검열한다.
다음의 항-골수종 요법 후 무진행 생존(PFS2): 무작위화로부터 제2의 객관적 질환 진행 또는 임의의 원인으로 인한 사망, 어느 것이든 먼저 일어나는 것.
6.12.4. 치료 방법
bb2121 CAR T 요법에 대해, 정맥내(IV) 플루다라빈 및 사이클로포스파마이드를 림프구고갈 (LD) 요법으로서 3연속일(-제5일에 시작), 이어서, 나머지 2일 동안 각각 매일 30㎎/㎡ 및 300㎎/㎡의 용량으로 투여한다. LD 화학요법의 완료 후, bb2121은 150 내지 450×106개의 CAR+ T 세포 범위의 용량으로 IV 주입으로서 투여한다.
DPd 요법에 대해, 정맥내 다라투무맙을 1 및 2개월 동안 28-일 개월 중 제1일, 제8일, 제15일 및 제22일; 3 내지 6개월 동안 28일 개월의 제1일, 제15일; 및 28일 개월의 제1일에 7개월 이상 동안 16㎎/㎏의 시작 용량으로 투여하였다. 경구 포말리도마이드를 28일 개월 중 제1일 내지 제21일에 4㎎/일로 투약하였다. 덱사메타손을 28일 개월 중 제1일, 제8일, 제15일 및 제22일에 40㎎(75세 초과, 20㎎)으로 투약하였다. 다라투무맙 투약일에: 75세 이하의 대상체에 대해, 다라투무맙 주입 전에 덱사메타손을 20㎎ IV로서, 그리고 다라투무맙 주입 후 20㎎을 경구로 투약하고; 75세 초과의 대상체에 대해, 덱사메타손을 다라투무맙 주입 전에 20㎎ IV로서 투약한다.
DVd 요법을 위해, 정맥내 다라투무맙을 21-일 개월 중 제1일, 제8일, 제15일에 1 내지 3개월; 21-일 개월의 제1일에 4 내지 8개월; 및 28일 개월의 제1일에 9개월 이상 동안 16㎎/㎏의 개시 용량으로 투여한다. 보르테조밉을 1 내지 8개월 동안 21-일 개월의 제1일, 제4일, 제8일 및 제11일에 1.3㎎/㎡의 시작 용량으로 피하로(SC) 투여한다. 보르테조밉 투약은 8개월 후 중단되어야 한다. 덱사메타손은 1 내지 8개월 동안 제1일, 제2일, 제4일, 제5일, 제8일, 제9일, 제11일 및 제12일에 20㎎의 개시 용량으로 투여하고; 75세 이상의 대상체에 대해, 다라투무맙 주입 전에 덱사메타손을 20㎎ IV로서 투약하고, 주입 다음 날에 20㎎을 경구로 투약하고, 비-DARA 투약일에, 덱사메타손을 20㎎으로서 경구로 투약하고; 75세 초과의 대상체에 대해, 저체중(BMI < 18.5)은 불량하게 제어된 진성 당뇨병 또는 스테로이드 요법에 대해 사전 불내성/AE를 갖고, 덱사메타손 용량은 매주 20㎎의 용량으로 투여될 수 있다. 덱사메타손 투약은 8개월 후 중단되어야 한다.
IRd 요법에 대해, 경구 익사조밉은 28-일 개월의 제1일, 제8일 및 제15일에 4㎎/일의 시작 용량으로 투여된다. 경구 레날리도마이드를 28일 개월 중 제1일 내지 제21일에 25㎎/일로 투약하였다. 덱사메타손을 28일 개월 중 제1일, 제8일, 제15일 및 제22일에 40㎎/일로 투약하였다.
일반적으로, 다음의 청구범위에서, 사용하는 용어는 본 명세서 및 청구범위에 개시된 구체적 실시형태로 청구범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 되지만, 이러한 청구범위에 부여된 균등물의 완전한 범주와 함께 모든 가능한 실시형태를 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 따라서, 청구범위는 본 개시내용으로 제한되지 않는다.
SEQUENCE LISTING <110> CELGENE CORPORATION <120> USES OF ANTI-BCMA CHIMERIC ANTIGEN RECEPTORS <130> 14247-321-228 <140> <141> <150> US 62/696,802 <151> 2018-07-11 <160> 36 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 15 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1 Arg Ala Ser Glu Ser Val Thr Ile Leu Gly Ser His Leu Ile His 1 5 10 15 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> mus musculus <400> 2 Leu Ala Ser Asn Val Gln Thr 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> mus musculus <400> 3 Leu Gln Ser Arg Thr Ile Pro Arg Thr 1 5 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 4 Asp Tyr Ser Ile Asn 1 5 <210> 5 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 5 Trp Ile Asn Thr Glu Thr Arg Glu Pro Ala Tyr Ala Tyr Asp Phe Arg 1 5 10 15 Gly <210> 6 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 6 Asp Tyr Ser Tyr Ala Met Asp Tyr 1 5 <210> 7 <211> 111 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 7 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Pro Ser Leu Ala Met Ser Leu Gly 1 5 10 15 Lys Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Thr Ile Leu 20 25 30 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ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta 420 aactgcccac ttggcagtac atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt 480 caatgacggt aaatggcccg cctggcatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc 540 tacttggcag tacatctacg tattagtcat cgctattacc atggtgatgc ggttttggca 600 gtacatcaat gggcgtggat agcggtttga ctcacgggga tttccaagtc tccaccccat 660 tgacgtcaat gggagtttgt tttggcacca aaatcaacgg gactttccaa aatgtcgtaa 720 caactccgcc ccattgacgc aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg tctatataag 780 cagagctcgt ttagtgaacc gggtctctct ggttagacca gatctgagcc tgggagctct 840 ctggctaact agggaaccca ctgcttaagc ctcaataaag cttgccttga gtgctcaaag 900 tagtgtgtgc ccgtctgttg tgtgactctg gtaactagag atccctcaga cccttttagt 960 cagtgtggaa aatctctagc agtggcgccc gaacagggac ttgaaagcga aagtaaagcc 1020 agaggagatc tctcgacgca ggactcggct tgctgaagcg cgcacggcaa gaggcgaggg 1080 gcggcgactg gtgagtacgc caaaaatttt gactagcgga ggctagaagg agagagtagg 1140 gtgcgagagc gtcggtatta agcgggggag aattagataa atgggaaaaa attcggttaa 1200 ggccaggggg aaagaaacaa tataaactaa aacatatagt tagggcaagc agggagctag 1260 aacgattcgc agttaatcct ggccttttag agacatcaga aggctgtaga caaatactgg 1320 gacagctaca accatccctt cagacaggat cagaagaact tagatcatta tataatacaa 1380 tagcagtcct ctattgtgtg catcaaagga tagatgtaaa agacaccaag gaagccttag 1440 ataagataga ggaagagcaa aacaaaagta agaaaaaggc acagcaagca gcagctgaca 1500 caggaaacaa cagccaggtc agccaaaatt accctatagt gcagaacctc caggggcaaa 1560 tggtacatca ggccatatca cctagaactt taaattaaga cagcagtaca aatggcagta 1620 ttcatccaca attttaaaag aaaagggggg attggggggt acagtgcagg ggaaagaata 1680 gtagacataa tagcaacaga catacaaact aaagaattac aaaaacaaat tacaaaaatt 1740 caaaattttc gggtttatta cagggacagc agagatccag tttggaaagg accagcaaag 1800 ctcctctgga aaggtgaagg ggcagtagta atacaagata atagtgacat aaaagtagtg 1860 ccaagaagaa aagcaaagat catcagggat tatggaaaac agatggcagg tgatgattgt 1920 gtggcaagta gacaggatga ggattaacac atggaaaaga ttagtaaaac accatagctc 1980 tagagcgatc ccgatcttca gacctggagg aggagatatg agggacaatt ggagaagtga 2040 attatataaa tataaagtag taaaaattga accattagga gtagcaccca ccaaggcaaa 2100 gagaagagtg gtgcagagag aaaaaagagc agtgggaata ggagctttgt tccttgggtt 2160 cttgggagca gcaggaagca ctatgggcgc agcgtcaatg acgctgacgg tacaggccag 2220 acaattattg tctggtatag tgcagcagca gaacaatttg ctgagggcta ttgaggcgca 2280 acagcatctg ttgcaactca cagtctgggg catcaagcag ctccaggcaa gaatcctggc 2340 tgtggaaaga tacctaaagg atcaacagct cctggggatt tggggttgct ctggaaaact 2400 catttgcacc actgctgtgc cttggaatgc tagttggagt aataaatctc tggaacagat 2460 ttggaatcac acgacctgga tggagtggga cagagaaatt aacaattaca caagcttggt 2520 aggtttaaga atagtttttg ctgtactttc tatagtgaat agagttaggc agggatattc 2580 accattatcg tttcagaccc acctcccaac cccgagggga cccgacaggc ccgaaggaat 2640 agaagaagaa ggtggagaga gagacagaga cagatccatt cgattagtga acggatccat 2700 ctcgacggaa tgaaagaccc cacctgtagg tttggcaagc taggatcaag gttaggaaca 2760 gagagacagc agaatatggg ccaaacagga tatctgtggt aagcagttcc tgccccggct 2820 cagggccaag aacagttgga acagcagaat atgggccaaa caggatatct gtggtaagca 2880 gttcctgccc cggctcaggg ccaagaacag 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cttgccaccc cgctaatgac aggtaccttt 4620 aagaccaatg acttacaagg cagctgtaga tcttagccac tttttaaaag aaaagggggg 4680 actggaaggg ctaattcact cccaaagaag acaagatctg ctttttgcct gtactgggtc 4740 tctctggtta gaccagatct gagcctggga gctctctggc taactaggga acccactgct 4800 taagcctcaa taaagcttgc cttgagtgct tcaatgtgtg tgttggtttt ttgtgtgtcg 4860 aaattctagc gattctagct tggcgtaatc atggtcatag ctgtttcctg tgtgaaattg 4920 ttatccgctc acaattccac acaacatacg agccggaagc ataaagtgta aagcctgggg 4980 tgcctaatga gtgagctaac tcacattaat tgcgttgcgc tcactgcccg ctttccagtc 5040 gggaaacctg tcgtgccagc tgcattaatg aatcggccaa cgcgcgggga gaggcggttt 5100 gcgtattggg cgctcttccg cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggct 5160 gcggcgagcg gtatcagctc actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag aatcagggga 5220 taacgcagga aagaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc 5280 cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg 5340 ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttccccctgg 5400 aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac 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tgcaacttta tccgcctcca tccagtctat 6300 taattgttgc cgggaagcta gagtaagtag ttcgccagtt aatagtttgc gcaacgttgt 6360 tgccattgct acaggcatcg tggtgtcacg ctcgtcgttt ggtatggctt cattcagctc 6420 cggttcccaa cgatcaaggc gagttacatg atcccccatg ttgtgcaaaa aagcggttag 6480 ctccttcggt cctccgatcg ttgtcagaag taagttggcc gcagtgttat cactcatggt 6540 tatggcagca ctgcataatt ctcttactgt catgccatcc gtaagatgct tttctgtgac 6600 tggtgagtac tcaaccaagt cattctgaga atagtgtatg cggcgaccga gttgctcttg 6660 cccggcgtca atacgggata ataccgcgcc acatagcaga actttaaaag tgctcatcat 6720 tggaaaacgt tcttcggggc gaaaactctc aaggatctta ccgctgttga gatccagttc 6780 gatgtaaccc actcgtgcac ccaactgatc ttcagcatct tttactttca ccagcgtttc 6840 tgggtgagca aaaacaggaa ggcaaaatgc cgcaaaaaag ggaataaggg cgacacggaa 6900 atgttgaata ctcatactct tcctttttca atattattga agcatttatc agggttattg 6960 tctcatgagc ggatacatat ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg 7020 cacatttccc cgaaaagtgc cacctgggac tagctttttg caaaagccta ggcctccaaa 7080 aaagcctcct cactacttct ggaatagctc agaggccgag gcggcctcgg cctctgcata 7140 aataaaaaaa attagtcagc catggggcgg agaatgggcg gaactgggcg gagttagggg 7200 cgggatgggc ggagttaggg gcgggactat ggttgctgac taattgagat gagcttgcat 7260 gccgacattg attattgact agtccctaag aaaccattct tatcatgaca ttaacctata 7320 aaaataggcg tatcacgagg ccctttcgtc 7350

Claims (25)

  1. B 세포 성숙 항원(B Cell Maturation Antigen: BCMA)-발현 세포의 고갈이 필요한 대상체에서 이를 고갈시키는 방법으로서, BCMA와 관련된 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor: CAR)를 발현시키는 치료적 유효량의 면역 세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하되, 상기 면역 세포는 150×106개의 세포 내지 450×106개의 세포의 투약량으로 투여되고, 상기 투여 전에 상기 대상체는 프로테아좀 저해제, 레날리도마이드, 포말리도마이드, 탈리도마이드, 보르테조밉, 덱사메타손, 사이클로포스파마이드, 독소루비신, 카필조밉, 익사조밉, 시스플라틴, 독소루비신, 에토포사이드, 항-CD38 항체, 파노비노스탯 및 엘로투주맙 중 하나 이상을 포함하는 사전 요법의 한 가지 이상의 계통을 받은 적이 있는, 방법.
  2. B 세포 성숙 항원(BCMA)-발현 세포에 의해 야기되는 질환의 치료가 필요한 대상체에서 이를 치료하는 방법으로서, BCMA와 관련된 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현시키는 치료적 유효량의 면역 세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하되, 상기 면역 세포는 150×106개의 세포 내지 450×106개의 세포의 투약량으로 투여되고, 상기 투여 전에 상기 대상체는 프로테아좀 저해제, 레날리도마이드, 포말리도마이드, 탈리도마이드, 보르테조밉, 덱사메타손, 사이클로포스파마이드, 독소루비신, 카필조밉, 익사조밉, 시스플라틴, 독소루비신, 에토포사이드, 항-CD38 항체, 파노비노스탯 및 엘로투주맙 중 하나 이상을 포함하는 사전 요법의 한 가지 이상의 계통을 받은 적이 있는, 방법.
  3. B 세포 성숙 항원(BCMA)을 발현시키는 암의 치료가 필요한 대상체에서 이를 치료하는 방법으로서, BCMA와 관련된 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현시키는 치료적 유효량의 면역 세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하되, 상기 면역 세포는 150×106개의 세포 내지 450×106개의 세포의 투약량으로 투여되고, 상기 투여 전에 상기 대상체는 프로테아좀 저해제, 레날리도마이드, 포말리도마이드, 탈리도마이드, 보르테조밉, 덱사메타손, 사이클로포스파마이드, 독소루비신, 카필조밉, 익사조밉, 시스플라틴, 독소루비신, 에토포사이드, 항-CD38 항체, 파노비노스탯 및 엘로투주맙 중 하나 이상을 포함하는 사전 요법의 한 가지 이상의 계통을 받은 적이 있는, 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 BCMA를 발현시키는 암은 다발성 골수종, 만성 림프구성 백혈병 또는 비호지킨 림프종(예를 들어, 버킷 림프종, 만성 림프구성 백혈병/소림프구 림프종(CLL/SLL), 미만성 거대 B 세포 림프종, 소포성 림프종, 면역아세포성 거대 세포 림프종, 전구체 B-림프아구성 림프종 및 외투세포 림프종)인, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 고위험 다발성 골수종인 다발성 골수종을 갖는, 방법.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 재발 및 난치성 다발성 골수종인 다발성 골수종을 갖는, 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여 전에 상기 대상체는 하기를 포함하는 사전 요법의 한 가지 이상의 계통을 받은 적이 있는, 방법:
    a. 다라투무맙, 포말리도마이드, 및 덱사메타손(DPd);
    b. 다라투무맙, 보르테조밉, 및 덱사메타손(DVd);
    c. 익사조밉, 레날리도마이드, 및 덱사메타손(IRd);
    d. 다라투무맙, 레날리도마이드 및 덱사메타손;
    e. 보르테조밉, 레날리도마이드 및 덱사메타손(RVd);
    f. 보르테조밉, 사이클로포스파마이드 및 덱사메타손(BCd);
    g. 보르테조밉, 독소루비신 및 덱사메타손;
    h. 카필조밉, 레날리도마이드 및 덱사메타손(CRd);
    i. 보르테조밉 및 덱사메타손;
    j. 보르테조밉, 탈리도마이드 및 덱사메타손;
    k. 레날리도마이드 및 덱사메타손;
    l. 덱사메타손, 탈리도마이드, 시스플라틴, 독소루비신, 사이클로포스파마이드, 에토포사이드 및 보르테조밉(VTD-PACE);
    m. 레날리도마이드 및 저용량 덱사메타손;
    n. 보르테조밉, 사이클로포스파마이드 및 덱사메타손;
    o. 카필조밉 및 덱사메타손;
    p. 레날리도마이드 단독;
    q. 보르테조밉 단독;
    r. 다라투무맙 단독;
    s. 엘로투주맙, 레날리도마이드, 및 덱사메타손;
    t. 엘로투주맙, 레날리도마이드 및 덱사메타손;
    u. 벤다무스틴, 보르테조밉 및 덱사메타손;
    v. 벤다무스틴, 레날리도마이드, 및 덱사메타손;
    w. 포말리도마이드 및 덱사메타손;
    x. 포말리도마이드, 보르테조밉 및 덱사메타손;
    y. 포말리도마이드, 카필조밉 및 덱사메타손;
    z. 보르테조밉 및 리포좀 독소루비신;
    aa. 사이클로포스파마이드, 레날리도마이드, 및 덱사메타손;
    bb. 엘로투주맙, 보르테조밉 및 덱사메타손;
    cc. 익사조밉 및 덱사메타손;
    dd. 파노비노스탯, 보르테조밉 및 덱사메타손;
    ee. 파노비노스탯 및 카필조밉; 또는
    ff. 포말리도마이드, 사이클로포스파마이드 및 덱사메타손.
  8. 제7항에 있어서, 상기 대상체는 사전 요법의 상기 계통 중 2가지 이상을 받은 적이 있는, 방법.
  9. 제7항에 있어서, 상기 대상체는 사전 요법의 상기 계통 중 3가지 이상을 받은 적이 있는, 방법.
  10. 제7항에 있어서, 상기 대상체는 사전 요법의 상기 계통 중 4가지 이상을 받은 적이 있는, 방법.
  11. 제7항에 있어서, 상기 대상체는 사전 요법의 상기 계통 중 5가지 이상을 받은 적이 있는, 방법.
  12. 제7항에 있어서, 상기 대상체는 사전 요법의 상기 계통 중 6가지 이상을 받는, 방법.
  13. 제7항에 있어서, 상기 대상체는 사전 요법의 상기 계통 중 7가지 이상을 받은 적이 있는, 방법.
  14. 제7항에 있어서, 상기 대상체는 사전 요법의 상기 계통 중 3가지 이하를 받은 적이 있는, 방법.
  15. 제7항에 있어서, 상기 대상체는 사전 요법의 상기 계통 중 2가지 이하를 받은 적이 있는, 방법.
  16. 제7항에 있어서, 상기 대상체는 사전 요법의 상기 계통 중 1가지 이하를 받는, 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 상기 투여 시 하기를 나타내는, 방법:
    a. 약 0.5 g/㎗ 이상의 혈청 M-단백질 수준(혈청 단백질 전기영동법 [sPEP]) 또는 약 200㎎/24시간 이상의 소변 M-단백질 수준(소변 단백질 전기영동법 [uPEP]), 및/또는
    b. 혈청 면역글로불린 유리 경쇄가 약 10㎎/㎗ 이상이고 비정상적 혈청 면역글로불린 카파 람다 유리 경쇄 비를 갖는, 혈청 또는 소변에서 측정 가능한 질환 없이 경쇄 다발성 골수종(MM); 및/또는
    c. 약 1 이하의 동부 종양학 협력 그룹(Eastern Cooperative Oncology Group: ECOG) 수행도.
  18. 제17항에 있어서, 상기 대상체는 추가적으로,
    a. 프로테아좀 저해제, 면역조절제(레날리도마이드 또는 포말리도마이드) 및 항-CD38 항체에 의한 사전 치료를 포함하는 사전 치료의 상기 계통 중 적어도 3가지를 받은 적이 있고;
    b. 진행성 질환(PD)이 치료 계통에 대해 최고의 반응이 아니라면, 사전 치료의 상기 적어도 3가지 계통 각각에 대해 적어도 2연속 주기를 받은 적이 있고;
    c. 사전 치료의 가장 최근의 계통의 60일에 또는 60일 이내에 진행성 질환(PD)의 증거를 갖고; 그리고/또는
    d. 치료의 상기 사전 계통 중 적어도 하나에 대한 반응(최소 반응 또는 더 양호)을 달성한 적이 있는, 방법.
  19. 제17항에 있어서, 상기 대상체는 추가적으로,
    a. 1회의 사전 항-골수종 치료 요법만을 받았고; 그리고/또는
    b. 다음의 고위험 인자: R-ISS III기 및 조기 재발을 갖되, 상기 조기 재발은 (i) 상기 대상체가 유도 + 줄기 세포 이식을 받은 적이 있다면, 제1 이식일 이후로 12개월 미만의 진행성 질환; 또는 (ii) 상기 대상체가 유도만을 받은 적이 있다면, 최소로, 프로테아좀 저해제, 면역조절제 및 덱사메타손을 함유하여야 하는 마지막 치료 요법일 이후로 12개월 미만의 진행성 질환(PD)으로서 정의되는, 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 상기 투여 후 적어도 6개월의 무진행 생존을 나타내는, 방법.
  21. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 상기 투여 후 적어도 12개월의 무진행 생존을 나타내는, 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키메라 항원 수용체는 BCMA를 표적화하는 항체 또는 항체 단편을 포함하는, 방법.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키메라 항원 수용체는 단일 쇄 Fv 항체 단편(scFv)을 포함하는, 방법.
  24. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키메라 항원 수용체는 BCMA02 scFv를 포함하는, 방법.
  25. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 세포는 bb2121 세포인, 방법.
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