ES2837628T3

ES2837628T3 - Linfocitos T modificados

Info

Publication number: ES2837628T3
Application number: ES14770151T
Authority: ES
Inventors: Stewart Abbot; Tianjian Li; Bitao Liang
Original assignee: Celgene Corp
Current assignee: Celgene Corp
Priority date: 2013-03-15
Filing date: 2014-03-14
Publication date: 2021-07-01
Anticipated expiration: 2034-03-14
Also published as: CN105518018B; CA2907397C; NZ751539A; HK1220205A1; AU2019202089A1; CN111643663A; CN105518018A; US10967005B2; JP2021176314A; US20190175652A1; NZ712373A; US20210299175A1; AU2014240083B2; AU2014240083A1; JP2019088324A; WO2014152177A1; EP2970372A4; EP2970372A1; AU2014240083C1; US20160030479A1

Abstract

Un linfocito T que comprende un polipéptido de muerte celular artificial que comprende un dominio inductor de la apoptosis, en donde dicho polipéptido es dimerizable usando un anticuerpo, y en donde cuando dicho anticuerpo dimeriza dicho polipéptido, se genera en dicho linfocito T una señal inductora de la apoptosis, en donde dicho polipéptido de muerte celular artificial es una proteína transmembrana que comprende un dominio extracelular que comprende un epítopo o mimotopo, un dominio transmembrana, y un dominio intracelular que comprende dicho dominio inductor de la apoptosis, en donde dicho dominio inductor de la apoptosis es o comprende caspasa 3, caspasa 8 o caspasa 9, y en donde dicho anticuerpo es rituximab y dicho epítopo o mimotopo es un epítopo o mimotopo de CD20 que se une a dicho rituximab; dicho anticuerpo es tositumumab y dicho epítopo o mimotopo es un epítopo o mimotopo de CD20 que se une a dicho tositumumab; dicho anticuerpo es ibritumomab y dicho epítopo o mimotopo es un epítopo o mimotopo de CD20 que se une a dicho ibritumomab; dicho anticuerpo es ofatumumab y dicho epítopo o mimotopo es un epítopo o mimotopo de CD20 que se une a dicho ofatumumab; dicho anticuerpo es alemtuzumab y dicho epítopo o mimotopo es un epítopo o mimotopo de CD52 que se une a dicho alemtuzumab; dicho anticuerpo es basiliximab y dicho epítopo o mimotopo es un epítopo o mimotopo de CD25 que se une a dicho basiliximab; dicho anticuerpo es daclizumab y dicho epítopo o mimotopo es un epítopo o mimotopo de CD25 que se une a dicho daclizumab; dicho anticuerpo es brentuximab y dicho epítopo o mimotopo es un epítopo o mimotopo de CD30 que se une a dicho brentuximab; dicho anticuerpo es belimumab y dicho epítopo o mimotopo es un epítopo o mimotopo del factor de activación de células B (BAFF) que se une a dicho belimumab; dicho anticuerpo es cetuximab y dicho epítopo o mimotopo es un epítopo o mimotopo del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) que se une a dicho cetuximab; dicho anticuerpo es panitumumab y dicho epítopo o mimotopo es un epítopo o mimotopo del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) que se une a dicho panitumumab; dicho anticuerpo es efalizumab y dicho epítopo o mimotopo es un epítopo o mimotopo de CD11a que se une a dicho efalizumab; dicho anticuerpo es ipilimumab y dicho epítopo o mimotopo es un epítopo o mimotopo de CD152 que se une a dicho ipilimumab; o dicho anticuerpo es natalizumab y dicho epítopo o mimotopo es un epítopo o mimotopo de la integrina alfa-4 que se une a dicho natalizumab.

Description

DESCRIPCIÓN

Linfocitos T modificados

1. Campo

La descripción de la presente memoria se refiere al campo de la inmunología y, más específicamente, a la modificación de linfocitos T u otras células inmunes.

2. Antecedentes

Los linfocitos T reconocen e interaccionan con antígenos específicos, incluyendo antígenos asociados a tumores o específicos de tumores. Como los linfocitos T son capaces de matar a las células tumorales, en los últimos 25 años se ha observado un gran interés en tomar como diana las células tumorales con linfocitos T, bien linfocitos T específicos de antígeno, o linfocitos T modificados genéticamente para expresar uno o más receptores de antígeno quiméricos (CAR; véase, p. ej., Eshhar, Patente de EE. UU. No. 7.741.465; Eshhar, Publicación de Solicitud de Patente de EE. u U. No.

2012/0093842). Sin embargo, dada la capacidad de los linfocitos T para matar no solo a las células tumorales que presentan un determinado antígeno, sino también a las células normales que presentan el mismo antígeno, es deseable incorporar en los linfocitos T un mecanismo de seguridad que permita la muerte rápida de las células después de la administración a un paciente si los efectos fuera de la diana resultan perjudiciales para el paciente.

Aunque se ha descrito un sistema para matar a las células T (Straathof et al. (2005) Blood 105(11):4247-4254), este sistema dependía de modificaciones específicas de proteínas y difíciles de realizar, lo que hacía que el sistema no fuera deseable para un uso práctico. Como tal, existe la necesidad en la técnica de un sistema de seguridad para matar rápidamente linfocitos T terapéuticos que sea relativamente simple y sencillo de construir. Los linfocitos T que comprenden dicho sistema de seguridad se describen en la presente memoria.

3. Resumen

Hoyos et al., Haematologica, 2012, 97 (11), p 1622-1631 revisa los regímenes de quimioterapia y el cuidado paliativo para el tratamiento de pacientes con neoplasias hematológicas. Se discuten, entre otras, las terapias con linfocitos T que expresan CAR específicos de CD 19 y CD 20.

WO 2011/035018 se refiere a una terapia basada en células que comprende: administrar al individuo una pluralidad de células modificadas genéticamente y uno o más agentes citotóxicos, en donde las células son resistentes al agente citotóxico; permitir que las células permanezcan en el sitio en condiciones y durante un tiempo suficiente como para proporcionar una cantidad de terapia al individuo; e inducir apoptosis en las células, proporcionando así una terapia basada en células.

US 2012/034245 se refiere a proteínas monocatenarias multiespecíficas que comprenden al menos dos dominios de unión específicos de la diana, en donde esos dos dominios están unidos por una subregión constante de inmunoglobulina y dos péptidos conectores, así como a los ácidos nucleicos que codifican dichas proteínas, y a los usos de diagnóstico y terapéuticos de dichas proteínas y ácidos nucleicos.

La presente invención proporciona un linfocito T que comprende un polipéptido de muerte celular artificial que comprende un dominio inductor de la apoptosis, en donde dicho polipéptido es dimerizable usando un anticuerpo, y en donde cuando dicho anticuerpo dimeriza dicho polipéptido, se genera una señal inductora de la apoptosis en dicho linfocito T, en donde dicho polipéptido de muerte celular artificial es una proteína transmembrana que comprende un dominio extracelular que comprende un epítopo o mimotopo, un dominio transmembrana, y un dominio intracelular que comprende dicho dominio inductor de la apoptosis, en donde dicho dominio inductor de la apoptosis es o comprende caspasa 3, caspasa 8 o caspasa 9, y en donde

dicho anticuerpo es rituximab y dicho epítopo o mimotopo es un epítopo o mimotopo de CD20 que se une a dicho rituximab;

dicho anticuerpo es tositumumab y dicho epítopo o mimotopo es un epítopo o mimotopo de CD20 que se une a dicho tositumumab;

dicho anticuerpo es ibritumomab y dicho epítopo o mimotopo es un epítopo o mimotopo de CD20 que se une a dicho ibritumomab;

dicho anticuerpo es ofatumumab y dicho epítopo o mimotopo es un epítopo o mimotopo de CD20 que se une a dicho ofatumumab;

dicho anticuerpo es alemtuzumab y dicho epítopo o mimotopo es un epítopo o mimotopo de CD52 que se une a dicho alemtuzumab;

dicho anticuerpo es basiliximab y dicho epítopo o mimotopo es un epítopo o mimotopo de CD25 que se une a dicho basiliximab;

dicho anticuerpo es daclizumab y dicho epítopo o mimotopo es un epítopo o mimotopo de CD25 que se une a dicho daclizumab;

dicho anticuerpo es brentuximab y dicho epítopo o mimotopo es un epítopo o mimotopo de CD30 que se une a dicho brentuximab;

dicho anticuerpo es belimumab y dicho epítopo o mimotopo es un epítopo o mimotopo del factor de activación de células B (BAFF) que se une a dicho belimumab;

dicho anticuerpo es cetuximab y dicho epítopo o mimotopo es un epítopo o mimotopo del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) que se une a dicho cetuximab;

dicho anticuerpo es panitumumab y dicho epítopo o mimotopo es un epítopo o mimotopo del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) que se une a dicho panitumumab;

dicho anticuerpo es efalizumab y dicho epítopo o mimotopo es un epítopo o mimotopo de CD11a que se une a dicho efalizumab;

dicho anticuerpo es ipilimumab y dicho epítopo o mimotopo es un epítopo o mimotopo de CD152 que se une a dicho ipilimumab; o

dicho anticuerpo es natalizumab y dicho epítopo o mimotopo es un epítopo o mimotopo de la integrina alfa-4 que se une a dicho natalizumab.

La invención es como se define en las presentes reivindicaciones.

En una realización, cuando dicho anticuerpo se une a dicho epítopo o mimotopo en al menos dos de dichos polipéptidos de muerte celular artificiales, los dominios intracelulares de dichos polipéptidos se dimerizan y generan una señal inductora de la apoptosis añadida suficiente como para matar a dicho linfocito T.

En un aspecto, dicho linfocito T comprende adicionalmente un receptor de antígeno quimérico (CAR) que reconoce un antígeno en una célula tumoral.

En una realización, dicha célula tumoral es una célula de un tumor sólido o una célula de un cáncer sanguíneo.

En una realización, dicho antígeno en una célula tumoral es Her2, antígeno de células madre de próstata (PSCA), alfafetoproteína (AFP), antígeno carcinoembrionario (CEA), antígeno de cáncer-125 (CA-125), CA19-9, calretinina, MUC-1, proteína de membrana epitelial (EMA), antígeno tumoral epitelial (ETA), tirosinasa, antígeno asociado al melanoma (MAGE), CD34, CD45, CD99, CD117, cromogranina, citoqueratina, desmina, proteína ácida fibrilar glial (GFAP), proteína líquida de la enfermedad quística macroscópica (GCDFP-15), antígeno HMB-45, proteína melan-A (antígeno de melanoma reconocido por los linfocitos T; MART-1), mio-D1, actina específica de músculo (MSA), neurofilamento, enolasa específica de neuronas (NSE), fosfatasa alcalina placentaria, sinaptofisis, tiroglobulina, factor de transcripción tiroideo 1, la forma dimérica de la isoenzima de la piruvato quinasa tipo M2 (M2-PK tumoral), una proteína ras anormal o una proteína p53 anormal.

En un aspecto, también se proporciona en la presente memoria dicho linfocito T que comprende dicho CAR para su uso en un método de tratamiento de un tumor.

En una realización, el tumor es un tumor sólido o un cáncer sanguíneo.

En una realización, el tumor es un linfoma, un cáncer de pulmón, un cáncer de mama, un cáncer de próstata, un carcinoma adrenocortical, un carcinoma de tiroides, un carcinoma nasofaríngeo, un melanoma, un melanoma maligno, un carcinoma de piel, un carcinoma colorrectal, un tumor desmoides, un tumor desmoplásico de células redondas pequeñas, un tumor endocrino, un sarcoma de Ewing, un tumor neuroectodérmico primitivo periférico, un tumor de células germinales sólido, un hepatoblastoma, un neuroblastoma, un sarcoma de tejido blando no rabdomiosarcoma, un osteosarcoma, un retinoblastoma, un rabdomiosarcoma, un tumor de Wilms, un glioblastoma, un mixoma, un fibroma o un lipoma.

En una realización, dicho tumor es un linfoma, y dicho linfoma es leucemia linfocítica crónica (linfoma linfocítico pequeño), leucemia prolinfocítica de células B, linfoma linfoplasmocítico, macroglobulinemia de Waldenstróm, linfoma de zona marginal esplénica, mieloma de células plasmáticas, plasmacitoma, linfoma de células B de la zona marginal extraganglionar, linfoma MALT, linfoma de células B de la zona marginal ganglionar, linfoma folicular, linfoma de células del manto, linfoma difuso de células B grandes, linfoma mediastínico (tímico) de células B grandes, linfoma intravascular de células B grandes, linfoma de derrame primario, linfoma de Burkitt, leucemia prolinfocítica de linfocitos T, leucemia linfocítica granular grande de linfocitos T, leucemia agresiva de células NK, leucemia/linfoma de linfocitos T del adulto, linfoma de linfocitos NK/T extraganglionar de tipo nasal, linfoma de linfocitos T de tipo enteropatía, linfoma de linfocitos T hepatoesplénico, linfoma de células NK blásticas, micosis fungoide, síndrome de Sezary, linfoma de células grandes anaplásico cutáneo primario, papulosis linfomatoide, linfoma de linfocitos T angioinmunoblástico, linfoma de linfocitos T periférico (no especificado), linfoma anaplásico de células grandes, linfoma de Hodgkin o linfoma no Hodgkin.

La presente invención también proporciona un anticuerpo según la presente invención para su uso en un método para el tratamiento de un paciente, en donde el método comprende la muerte terapéutica del linfocito T según la presente invención mediante la administración del anticuerpo al paciente, y en donde el método es para su uso en el caso en el que la administración del linfocito T cause efectos no deseados o perjudiciales en el paciente que recibe el linfocito T o en el caso en el que la presencia del linfocito T en el paciente ya no sea necesaria.

En la presente memoria se describen células modificadas genéticamente, por ejemplo, células inmunes, tales como linfocitos T, p. ej., linfocitos T humanos, que comprenden un polipéptido artificial multimerizable, p. ej., dimerizable (denominado en la presente memoria un "polipéptido de muerte celular") que, cuando se multimeriza, p. ej., dimeriza, por un agente multimerizante, p. ej., agente dimerizante, genera una señal inductora de la apoptosis en una célula, p. ej., un linfocito T, que expresa el polipéptido, dando como resultado la muerte celular, p. ej., a través de apoptosis. Sin pretender la vinculación a ningún mecanismo o teoría particular, se cree que cuando un número suficiente de una pluralidad de polipéptidos de muerte celular de la célula se multimerizan, p. ej., se dimerizan, la señal inductora de la apoptosis añadida generada de ese modo es suficiente como para matar a la célula, p. ej., causar que la célula experimente apoptosis.

Los polipéptidos de muerte celular descritos en la presente memoria pueden usarse junto con cualquier célula, en particular, cualquier célula de mamífero, por ejemplo, cualquier célula humana. Por ejemplo, dichos polipéptidos de muerte celular proporcionan, por ejemplo, una característica de seguridad útil para los agentes terapéuticos celulares. Como tales, los polipéptidos de muerte celular pueden, por ejemplo, ser importantes para un producto farmacológico que comprende un agente terapéutico celular, p. ej., linfocitos T que expresan un receptor de antígeno quimérico c Ar , porque los polipéptidos de muerte celular permiten la muerte rápida del agente terapéutico celular, p. ej., los linfocitos T, si dicha muerte rápida se vuelve deseable, p. ej., en el caso en el que la administración de las células cause efectos no deseados o perjudiciales en un paciente que los recibe, o si la presencia del agente terapéutico celular, p. ej., los linfocitos T, en un sujeto ya no es necesaria. Por tanto, en determinados ejemplos, los polipéptidos de muerte celular descritos en la presente memoria se pueden usar junto con cualquier célula administrable, por ejemplo, agentes terapéuticos celulares, tal como agentes terapéuticos celulares de mamífero, p. ej., agentes terapéuticos celulares humanos. Los ejemplos no limitativos de células en las que pueden usarse los polipéptidos de muerte celular y agentes multimerizantes o dimerizantes incluyen, pero no están limitadas a, células asesinas naturales (NK), células dendríticas (DC), células madre placentarias (p. ej., las células madre placentarias descritas en las Patentes de EE. UU. Nos. 7.468.276; 8.057.788 y 8.202.703), células madre similares a mesenquimales de la sangre del cordón umbilical, sangre placentaria, sangre periférica, médula ósea, pulpa dental, tejido adiposo, tejido osteocondral, y similares; células madre embrionarias, células germinales embrionarias, células madre de la cresta neural, células madre neurales, y células diferenciadas (p. ej., fibroblastos, etc.). Los polipéptidos de muerte celular y los agentes multimerizantes o dimerizantes también pueden usarse en líneas de células tumorales, p. ej., para fines experimentales en modelos animales.

Típicamente, el polipéptido de muerte celular es multimerizable o dimerizable usando un agente multimerizante o dimerizante administrable, p. ej., una molécula pequeña, polipéptido (distinto del polipéptido de muerte celular) tal como un anticuerpo, un oligonucleótido o un polisacárido. Los polipéptidos de muerte celular no comprenden una proteína de unión a FK506 (FKBP), una porción funcional de la misma, o una forma modificada de la misma, y el agente multimerizante o agente dimerizante no es un ligando de FKBP.

En la presente memoria, se describe un linfocito T, que comprende un polipéptido de muerte celular que comprende un dominio inductor de la apoptosis, en donde dicho polipéptido de muerte celular es multimerizable usando un agente multimerizante, en donde cuando dicho agente multimerizante multimeriza dicho polipéptido, se genera en dicha célula una señal inductora de la apoptosis. En un ejemplo específico, dicho agente multimerizante es un agente dimerizante; es decir, el agente multimerizante hace que el polipéptido de muerte celular se dimerice. En otro ejemplo específico, cuando dicho agente dimerizante dimeriza dicho polipéptido, se genera en dicha célula una señal inductora de la apoptosis.

En determinados ejemplos, dicho polipéptido de muerte celular es un polipéptido transmembrana que comprende un dominio extracelular, un dominio transmembrana y un dominio intracelular que comprende dicho dominio inductor de la apoptosis. Según la presente invención, el dominio inductor de la apoptosis del polipéptido de muerte celular es o comprende caspasa 9, caspasa 8 o caspasa 3, por ejemplo, una caspasa 9, caspasa 8 o caspasa 3 humana.

En determinados ejemplos, el agente dimerizante es un polipéptido que comprende al menos dos sitios que se unen específicamente a un polipéptido de muerte celular, p. ej., un dominio extracelular de un polipéptido de muerte celular. En ejemplos particulares, el polipéptido es un anticuerpo, p. ej., un anticuerpo que comprende al menos dos sitios de unión a epítopo o mimotopo. En determinadas realizaciones, solo se usa el dominio de unión a antígeno del anticuerpo como el agente dimerizante. En determinadas realizaciones, el dominio extracelular del polipéptido de muerte celular comprende al menos un epítopo o mimotopo al que se une específicamente el anticuerpo. En ejemplos particulares, el anticuerpo es un anticuerpo biespecífico que comprende dos sitios de unión a epítopo o mimotopo diferentes que se unen a dos epítopos o mimotopos diferentes presentes en un dominio extracelular de un polipéptido de muerte celular. En determinados ejemplos, el anticuerpo es un anticuerpo IgG o IgM. En un ejemplo particular, un anticuerpo útil como agente multimerizante o dimerizante es uno que ha sido aprobado por la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos para cualquier uso.

En un ejemplo, un anticuerpo útil como agente multimerizante o dimerizante es uno que se une específicamente a un epítopo o mimotopo de CD20, p. ej., un epítopo o mimotopo de CD20 humano, y un dominio extracelular de un polipéptido de muerte celular comprende un epítopo o mimotopo de CD20 al que se une específicamente el anticuerpo. En determinadas realizaciones específicas, el anticuerpo es rituximab y el epítopo o mimotopo es un epítopo de CD20 o un mimotopo de CD20 que se une específicamente a dicho rituximab. En otra realización específica, el anticuerpo es tositumumab y el epítopo o mimotopo es un epítopo de CD20 o un mimotopo de CD20 que se une específicamente a dicho tositumumab. En otra realización más, el anticuerpo es ibritumomab y el epítopo o mimotopo es un epítopo de CD20 o un mimotopo de CD20 que se une específicamente a dicho ibritumomab. En otra realización más, el anticuerpo es ofatumumab y el epítopo o mimotopo es un epítopo de CD20 o un mimotopo de CD20 que se une específicamente a dicho ofatumumab.

En otra realización específica, el anticuerpo es alemtuzumab y el epítopo o mimotopo es un epítopo de CD52 o un mimotopo de CD52 que se une específicamente a dicho alemtuzumab. En otra realización más, el anticuerpo es basiliximab y el epítopo o mimotopo es un epítopo de CD25 o un mimotopo de CD25 que se une específicamente a dicho basiliximab. En otra realización, el anticuerpo es daclizumab y el epítopo o mimotopo es un epítopo de CD25 o un mimotopo de CD25 que se une específicamente a dicho daclizumab. En otra realización más, el anticuerpo es brentuximab y el epítopo o mimotopo es un epítopo de CD30 o un mimotopo de CD30 que se une específicamente a dicho brentuximab. En otra realización, el anticuerpo es belimumab y el epítopo o mimotopo es un epítopo del factor de activación de células B (BAFF) o un mimotopo de BAFF que se une específicamente a dicho belimumab. En otra realización, el anticuerpo es cetuximab y el epítopo o mimotopo es un epítopo del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) o un mimotopo de EGFR que se une específicamente a dicho cetuximab. En otra realización más, el anticuerpo es panitumumab y el epítopo o mimotopo es un epítopo del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) o un mimotopo de EGFR que se une específicamente a dicho panitumumab. En otra realización, el anticuerpo es efalizumab y el epítopo o mimotopo es un epítopo de CD11a o un mimotopo de CD11a que se une específicamente a dicho efalizumab. En otra realización más, el anticuerpo es ipilimumab y el epítopo o mimotopo es un epítopo de CD152 o mimotopo de CD152 que se une específicamente a dicho ipilimumab. En otra realización más, el anticuerpo es natalizumab y el epítopo o mimotopo es un epítopo de la integrina alfa-4 o un mimotopo de la integrina alfa 4 que se une específicamente a dicho natalizumab.

En determinados ejemplos, cuando un agente multimerizante o un agente dimerizante se une al menos a dos polipéptidos de muerte celular, se produce la dimerización o multimerización de los polipéptidos de muerte celular, p. ej., se produce la dimerización o multimerización de los polipéptidos de muerte celular. En determinados ejemplos, un dominio extracelular de un polipéptido de muerte celular es o comprende un receptor o una porción de unión a ligando del mismo. En un ejemplo específico, un agente multimerizante o agente dimerizante es o comprende al menos dos ligandos para dicho receptor o porción de unión a ligando del mismo. En otro ejemplo específico, dicho agente multimerizante o agente dimerizante se une a dicho receptor o dicha porción de unión a ligando del mismo en dos de los polipéptidos de muerte celular, y dichos polipéptidos se multimerizan o dimerizan, p. ej., los dominios intracelulares de dichos polipéptidos se multimerizan o dimerizan. En ejemplos particulares, los polipéptidos de muerte celular comprenden dominios intracelulares que comprenden un dominio de caspasa, y se produce la multimerización o dimerización de los dominios de caspasa. En ejemplos específicos, dicha multimerización o dimerización, por ejemplo, multimerización o dimerización de dominios intracelulares, p. ej., multimerización o dimerización de dominios de caspasa, inicia una señal inductora de la apoptosis en dicha célula, p. ej., linfocito T.

Según la presente invención, cuando el anticuerpo se une específicamente al epítopo o mimotopo de al menos dos polipéptidos de muerte celular, se produce la dimerización de los polipéptidos de muerte celular, p. ej., se produce la dimerización de los dominios intracelulares de los polipéptidos de muerte celular. En realizaciones particulares, los polipéptidos de muerte celular comprenden dominios intracelulares que comprenden el dominio de caspasa y se produce la dimerización de los dominios de caspasa. En realizaciones específicas, dicha dimerización, por ejemplo, dimerización de dominios intracelulares, p. ej., dimerización de dominios de caspasa, inicia una señal inductora de la apoptosis en el linfocito T.

En determinados otros ejemplos de la célula, p. ej., linfocito T, dicho dominio extracelular del polipéptido de muerte celular comprende un ligando para un receptor. En un ejemplo específico, dicho agente multimerizante o agente dimerizante comprende al menos dos receptores o porciones de unión a ligando del mismo que se unen a dicho ligando. En un ejemplo específico, cuando dicho agente multimerizante o agente dimerizante se une a dicho receptor o dicha porción de unión a ligando del mismo en al menos dos de los polipéptidos de muerte celular, dichos polipéptidos se multimerizan o dimerizan. En un ejemplo específico, cuando los polipéptidos de muerte celular se multimerizan o dimerizan, se genera en dicha célula una señal inductora de la apoptosis.

En determinados otros ejemplos, un dominio extracelular de un polipéptido de muerte celular comprende una secuencia de oligonucleótidos artificial. Por ejemplo, en ejemplos particulares, una célula modificada, p. ej., un linfocito T, comprende un polipéptido de muerte celular que comprende un dominio extracelular que comprende una secuencia de oligonucleótidos artificial. En un ejemplo específico, un agente multimerizante o dimerizante es o comprende al menos un oligonucleótido multimerizante o dimerizante que comprende un primer oligonucleótido y un segundo oligonucleótido, opcionalmente unidos por un conector, en donde dicho primer oligonucleótido y dicho segundo oligonucleótido son complementarios a dicha secuencia de oligonucleótidos artificial. En determinados ejemplos específicos, dicho primer oligonucleótido y dicho segundo oligonucleótido tienen la misma secuencia. En ejemplos específicos, dicho primer oligonucleótido y dicho segundo oligonucleótido se unen en una conformación de cabeza a cabeza o de cola a cola. En ejemplos específicos, cuando dicho oligonucleótido multimerizante o dimerizante de dicho agente multimerizante o agente dimerizante hibrida con la secuencia de oligonucleótidos artificial de dos de dichos polipéptidos de muerte celular, los polipéptidos de muerte celular se multimerizan o dimerizan. En otro ejemplo específico, cuando los polipéptidos de muerte celular se multimerizan o dimerizan, se genera en dicha célula una señal inductora de la apoptosis. En ejemplos particulares, los polipéptidos de muerte celular comprenden dominios de caspasa intracelulares, y cuando los dominios de caspasa intracelulares se multimerizan o dimerizan, se genera en dicha célula una señal inductora de la apoptosis.

En determinados otros ejemplos de la célula, p. ej., linfocito T, dicho agente multimerizante o dimerizante es un polipéptido artificial que comprende dos o más dominios de unión unidos por uno o más conectores.

En una realización específica, el linfocito T comprende el polipéptido de muerte celular que comprende el dominio extracelular que comprende el epítopo, un dominio transmembrana y un dominio intracelular que comprende una caspasa 9, p. ej., una caspasa 9 humana, o una porción funcional de la misma. En otro ejemplo específico, en la presente memoria se describe una célula, p. ej., un linfocito T, que comprende un polipéptido artificial que comprende un dominio extracelular que comprende un receptor o una porción de unión a ligando del mismo, y un dominio intracelular que comprende una caspasa 9, p. ej., una caspasa 9 humana, o una porción funcional de la misma. En otro ejemplo específico, en la presente memoria se describe una célula, p. ej., un linfocito T, que comprende un polipéptido artificial que comprende un dominio extracelular que comprende un ligando o una porción de unión a receptor del mismo, en donde dicho ligando se une a un receptor o porción de unión a ligando del mismo, y un dominio intracelular que comprende una caspasa 9, p. ej., una caspasa 9 humana, o una porción funcional de la misma. En un ejemplo específico, dicha célula es un linfocito T.

En otro aspecto, en la presente memoria se proporciona un sistema de seguridad para linfocitos T que comprende el linfocito T según la invención que comprende (a) el polipéptido de muerte celular que comprende el dominio extracelular que comprende el epítopo, un dominio transmembrana y un dominio intracelular que comprende una caspasa o una porción funcional de la misma; y (b) el anticuerpo que comprende dos dominios de unión a epítopo o de unión a mimotopo que cuando se ponen en contacto con dos de dichos polipéptidos de muerte celular dimerizan dichos polipéptidos, en donde dicha caspasa es caspasa 3, caspasa 8 o caspasa 9, p. ej., caspasa 3, caspasa 8, o caspasa 9 humana, y en donde dicha dimerización genera en dicho linfocito una señal inductora de la apoptosis.

También se describe en la presente memoria un sistema de seguridad para una célula, p. ej., un linfocito T, que comprende (a) una célula que comprende un polipéptido artificial que comprende un dominio extracelular que comprende un receptor o una porción de unión a ligando del mismo, y un dominio intracelular que comprende una caspasa o una porción funcional de la misma; y (b) un agente dimerizante que comprende dos ligandos que se unen a dicho receptor o porción de unión a ligando del mismo, en donde cuando dicho agente dimerizante se pone en contacto con dos de dichos polipéptidos, dicho agente dimerizante dimeriza dichos polipéptidos, en donde dicha caspasa es caspasa 3, caspasa 8 o caspasa 9, p. ej., caspasa 3, caspasa 8 o caspasa 9 humana, y en donde dicha dimerización genera en dicha célula una señal inductora de la apoptosis. En un ejemplo específico, dicha célula es un linfocito T.

También se describe en la presente memoria un sistema de seguridad para una célula, p. ej., un linfocito T, que comprende (a) una célula que comprende un polipéptido de muerte celular artificial que comprende un dominio extracelular que comprende un ligando o una porción de unión a receptor del mismo, y un dominio intracelular que comprende una caspasa o una porción funcional de la misma; y (b) un agente dimerizante que comprende dos receptores o porciones de unión a ligando del mismo que se unen a dicho ligando o porción de unión a receptor del mismo, en donde cuando dicho agente dimerizante se pone en contacto con dos de dichos polipéptidos, dicho agente dimerizante dimeriza dichos polipéptidos, en donde dicha caspasa es caspasa 3, caspasa 8 o caspasa 9, p. ej., caspasa 3, caspasa 8 o caspasa 9 humana, y en donde dicha dimerización genera en dicha célula una señal inductora de la apoptosis. En un ejemplo específico, dicha célula es un linfocito T.

En una realización específica de cualquiera de las realizaciones de la presente memoria, cuando se generan en el linfocito T una pluralidad de señales inductoras de la apoptosis, dicha señal es suficiente como para matar a dicha célula.

También se describe en la presente memoria un método para matar una célula, p. ej., un linfocito T, en donde dicha célula comprende una pluralidad de polipéptidos de muerte celular artificiales, cada uno de los cuales comprende un dominio inductor de la apoptosis, en donde los polipéptidos de muerte celular son multimerizables o dimerizables usando un agente multimerizante o agente dimerizante que no es un ligando de la proteína de unión a FK506 (FKBP), y en donde cuando dicho agente multimerizante o agente dimerizante multimeriza o dimeriza dicho polipéptido, se genera en dicho linfocito T una señal inductora de la apoptosis, que comprende poner en contacto dicha célula con una cantidad de dicho agente multimerizante o agente dimerizante suficiente como para que dicha pluralidad de polipéptidos de muerte celular multimerice o dimerice y genere una señal inductora de apoptosis añadida suficiente como para matar a dicha célula. En determinados ejemplos, el polipéptido de muerte celular es un polipéptido transmembrana que comprende un dominio extracelular, un dominio transmembrana y un dominio intracelular que comprende dicho dominio inductor de la apoptosis. Según la presente invención, el dominio inductor de la apoptosis es o comprende caspasa 3, caspasa 8 o caspasa 9, por ejemplo, una caspasa 9, caspasa 8 o caspasa 3 humana. En ejemplos específicos, el agente multimerizante o agente dimerizante es una proteína, un oligonucleótido o un polisacárido. En un ejemplo específico, dicha célula es un linfocito T.

En determinados ejemplos, el agente multimerizante o agente dimerizante es una proteína, un oligonucleótido o un polisacárido. En ejemplos específicos, el agente multimerizante o agente dimerizante es un polipéptido que comprende al menos dos sitios que se unen específicamente a un polipéptido de muerte celular, p. ej., un dominio extracelular de un polipéptido de muerte celular. En ejemplos particulares, el polipéptido es un anticuerpo, p. ej., un anticuerpo que comprende al menos dos sitios de unión a epítopo o al menos dos sitios de unión a mimotopo. En determinadas realizaciones, el dominio extracelular del polipéptido de muerte celular comprende al menos un epítopo o mimotopo al que se une específicamente el anticuerpo. En ejemplos particulares, el anticuerpo es un anticuerpo biespecífico que comprende dos sitios de unión a epítopo o mimotopo diferentes que se unen a dos epítopos o mimotopos diferentes presentes en un dominio extracelular de un polipéptido de muerte celular. En determinados ejemplos, el anticuerpo es un anticuerpo IgG o IgM. En un ejemplo específico, un anticuerpo útil como un agente multimerizante o dimerizante es uno que ha sido aprobado por la Administración de Alimentos y Fármacos de los Estados Unidos para cualquier uso.

En un ejemplo específico, cuando el agente multimerizante o agente dimerizante es un anticuerpo, dicho anticuerpo es uno que se une específicamente a un epítopo o mimotopo de CD20, p. ej., un epítopo o mimotopo de CD20 humano, y dicho dominio extracelular de un polipéptido de muerte celular comprende un epítopo o mimotopo de CD20 al que se une específicamente dicho anticuerpo. En determinadas realizaciones específicas, el anticuerpo es rituximab y el epítopo o mimotopo es un epítopo de CD20 o un mimotopo de CD20 que se une a dicho rituximab; el anticuerpo es tositumumab y el epítopo o mimotopo es un epítopo de CD20 o un mimotopo de CD20 que se une a dicho tositumumab; el anticuerpo es ibritumomab y el epítopo o mimotopo es un epítopo de CD20 o un mimotopo de CD20 que se une a dicho ibritumomab; el anticuerpo es ofatumumab y el epítopo o mimotopo es un epítopo de CD20 o un mimotopo de CD20 que se une a dicho ofatumumab; el anticuerpo es alemtuzumab y el epítopo o mimotopo es un epítopo de CD52 o un mimotopo de CD52 que se une a dicho alemtuzumab; el anticuerpo es basiliximab y el epítopo o mimotopo es un epítopo de CD25 o un mimotopo de CD25 que se une a dicho basiliximab; el anticuerpo es daclizumab y el epítopo o mimotopo es un epítopo de CD25 o un mimotopo de CD25 que se une a dicho daclizumab; el anticuerpo es brentuximab y el epítopo o mimotopo es un epítopo de CD30 o un mimotopo de CD30 que se une a dicho brentuximab; el anticuerpo es belimumab y el epítopo o mimotopo es un epítopo del factor de activación de células B (BAFF) o un mimotopo de BAFF que se une a dicho belimumab; el anticuerpo es cetuximab y el epítopo o mimotopo es un epítopo del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) o un mimotopo de EGFR que se une a dicho cetuximab; el anticuerpo es panitumumab y el epítopo o mimotopo es un epítopo del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) o un mimotopo de EGFR que se une a dicho panitumumab; el anticuerpo es efalizumab y el epítopo o mimotopo es un epítopo de CD11a o un mimotopo de CD11a que se une a dicho efalizumab; el anticuerpo es ipilimumab y el epítopo o mimotopo es un epítopo de CD152 o mimotopo CD152 que se une a dicho ipilimumab; o el anticuerpo es natalizumab y el epítopo o mimotopo es un epítopo de la integrina alfa-4 o un mimotopo de la integrina alfa 4 que se une a dicho natalizumab. En una realización específica de cualquiera de las realizaciones anteriores, cuando dicho anticuerpo se une a dicho epítopo o mimotopo en al menos dos de dichos polipéptidos de muerte celular, los dominios intracelulares de dichos polipéptidos, y/o las caspasas respectivas en dichos dominios intracelulares multimerizan o dimerizan. En realizaciones específicas, cuando dicho anticuerpo se une específicamente al epítopo o mimotopo de al menos dos polipéptidos de muerte celular, se produce la dimerización de los polipéptidos de muerte celular, p. ej., se produce la dimerización de los dominios intracelulares de los polipéptidos de muerte celular. En realizaciones particulares, los polipéptidos de muerte celular comprenden dominios intracelulares que comprenden el dominio de caspasa y se produce la dimerización de los dominios de caspasa. En realizaciones específicas, dicha dimerización, por ejemplo, dimerización de dominios intracelulares, p. ej., dimerización de dominios de caspasa, inicia una señal inductora de la apoptosis en el linfocito T.

En determinados ejemplos específicos, dicho dominio extracelular del polipéptido de muerte celular es o comprende un receptor o una porción de unión a ligando del mismo. En dichos ejemplos, dicho agente multimerizante o agente dimerizante comprende al menos dos ligandos para dicho receptor o porción de unión a ligando del mismo. En ejemplos específicos, cuando dicho agente multimerizante o agente dimerizante se une a dicho receptor o dicha porción de unión a ligando del mismo en al menos dos de dichos polipéptidos de muerte celular, dichos polipéptidos se multimerizan o dimerizan. En ejemplos específicos, dicha multimerización o dimerización de dichos polipéptidos inicia una señal inductora de la apoptosis en dicha célula, p. ej., linfocito T.

En determinados ejemplos específicos, dicho dominio extracelular del polipéptido de muerte celular comprende un ligando para un receptor. En dichos ejemplos, dicho agente multimerizante o agente dimerizante comprende al menos dos receptores o porciones de unión a ligando del mismo que se unen a dicho ligando. En ejemplos específicos, cuando dicho agente multimerizante o agente dimerizante se une a dicho receptor o dicha porción de unión a ligando del mismo en dos o más de dichos polipéptidos, los dominios intracelulares en dichos polipéptidos y/o los dominios de caspasa de dichos polipéptidos se multimerizan o dimerizan. En ejemplos específicos, dicha multimerización o dimerización de dichos dominios intracelulares y/o dominios de caspasa inician una señal inductora de la apoptosis que se genera en dicha célula, p. ej., linfocito T.

En determinados ejemplos, dicho dominio extracelular de dicho polipéptido de muerte celular comprende una secuencia de oligonucleótidos artificial. Por ejemplo, en ejemplos particulares, dicho polipéptido de muerte celular comprende un dominio extracelular que comprende una secuencia de oligonucleótidos artificial. En un ejemplo específico, un agente multimerizante o dimerizante es o comprende al menos un oligonucleótido multimerizante o dimerizante que comprende un primer oligonucleótido y un segundo oligonucleótido, opcionalmente unidos por un conector, en donde dicho primer oligonucleótido y dicho segundo oligonucleótido son complementarios a dicha secuencia de oligonucleótidos artificial. En determinados ejemplos específicos, dicho primer oligonucleótido y dicho segundo oligonucleótido tienen la misma secuencia. En ejemplos específicos, dicho primer oligonucleótido y dicho segundo oligonucleótido se unen en una conformación de cabeza a cabeza o de cola a cola. En ejemplos específicos, cuando dicho oligonucleótido multimerizante o dimerizante de dicho agente multimerizante o agente dimerizante hibrida con la secuencia de oligonucleótidos artificial de dos de dichos polipéptidos de muerte celular, los polipéptidos de muerte celular se multimerizan o dimerizan. En otro ejemplo específico, cuando los polipéptidos de muerte celular se multimerizan o dimerizan, se genera en dicha célula una señal inductora de la apoptosis. En ejemplos particulares, los polipéptidos de muerte celular comprenden dominios de caspasa intracelulares, y cuando los dominios de caspasa intracelulares se multimerizan o dimerizan, se genera en dicha célula una señal inductora de la apoptosis. En un ejemplo específico, dicha célula es un linfocito T.

En una realización específica de cualquiera de las realizaciones de la presente memoria, cuando se genera en el linfocito T una pluralidad de las señales inductoras de la apoptosis, dicha señal es suficiente como para matar a dicho linfocito T.

En otros ejemplos, dicho agente multimerizante o agente dimerizante es un polipéptido artificial que comprende dos o más dominios de unión unidos por uno o más conectores.

También se proporciona en la presente memoria un anticuerpo según la presente invención para su uso en un método para el tratamiento de un paciente, en donde el método comprende la muerte terapéutica de un linfocito T según la presente invención, en donde dicho linfocito T comprende una pluralidad de los polipéptidos de muerte celular artificiales, cada uno de los cuales comprende una caspasa o una porción funcional de la misma, en donde dicha caspasa es caspasa 3, caspasa 8 o caspasa 9 (p. ej., caspasa 3, caspasa 8 o caspasa 9 humana), y en donde dicho polipéptido de muerte celular es dimerizable usando dicho anticuerpo, y en donde cuando dicho anticuerpo dimeriza dicho polipéptido, se genera en dicho linfocito T una señal inductora de la apoptosis, en donde el método comprende poner en contacto dicho linfocito T con una cantidad de dicho anticuerpo suficiente como para dimerizar un número suficiente de dicha pluralidad de polipéptidos artificiales para dimerizar y generar una señal de inducción de la apoptosis añadida suficiente como para matar a dicho linfocito T.

También se describe en la presente memoria un método para matar una célula, p. ej., un linfocito T, en donde dicha célula comprende una pluralidad de polipéptidos de muerte celular artificiales, cada uno de los cuales comprende una caspasa o una porción funcional de la misma, en donde dicha caspasa es caspasa 3, caspasa 8 o caspasa 9 (p. ej., caspasa 3, caspasa 8 o caspasa 9 humana), y, en donde dicha pluralidad de polipéptidos artificiales comprende cada uno un dominio extracelular que comprende un receptor o una porción de unión a ligando del mismo que se une a un ligando, en donde dicho polipéptido es dimerizable usando un agente dimerizante que comprende dos de dichos ligandos, y en donde cuando dicho agente dimerizante dimeriza dos de dichos polipéptidos, se genera en la célula una señal inductora de la apoptosis, que comprende poner en contacto dicha célula con una cantidad de dicho agente dimerizante suficiente como para dimerizar un número suficiente de dicha pluralidad de polipéptidos de muerte celular artificiales para dimerizar y generar una señal inductora de la apoptosis añadida suficiente como para matar a dicha célula. En un ejemplo específico, dicha célula es un linfocito T.

También se describe en la presente memoria un método para matar una célula, p. ej., un linfocito T, en donde dicha célula comprende una pluralidad de polipéptidos de muerte celular artificiales, cada uno de los cuales comprende una caspasa o porción funcional de la misma, en donde dicha caspasa es caspasa 3, caspasa 8 o caspasa 9 (p. ej., caspasa 3, caspasa 8 o caspasa 9 humana), y, en donde dicha pluralidad de polipéptidos artificiales comprende cada uno un dominio extracelular que comprende un ligando o porción de unión a receptor del mismo que se une a un receptor o porción de unión a ligando del mismo, en donde dichos polipéptidos son dimerizables usando un agente dimerizante que comprende dos de dichos receptores o porción de unión a ligando del mismo, y en donde cuando dicho agente dimerizante dimeriza dos de dichos polipéptidos, se genera en dicha célula una señal inductora de la apoptosis, que comprende poner en contacto dicha célula con una cantidad de dicho agente dimerizante suficiente como para dimerizar un número suficiente de dicha pluralidad de polipéptidos artificiales para dimerizar y generar una señal inductora de la apoptosis añadida suficiente como para matar a dicha célula. En un ejemplo específico, dicha célula es un linfocito T.

También se describe en la presente memoria un método para matar una célula, p. ej., un linfocito T, en donde dicha célula comprende una pluralidad de polipéptidos de muerte celular artificiales, cada uno de los cuales comprende una caspasa o porción funcional de la misma, en donde dicha caspasa es caspasa 3, caspasa 8 o caspasa 9 (p. ej., caspasa 3, caspasa 8 o caspasa 9 humana), y, en donde dicha pluralidad de polipéptidos artificiales comprende cada uno un dominio extracelular que comprende un oligonucleótido artificial, en donde dicha pluralidad de polipéptidos son dimerizables usando un agente dimerizante que comprende un oligonucleótido que comprende un primer oligonucleótido y un segundo oligonucleótido, en donde dicho primer oligonucleótido y dicho segundo oligonucleótido tienen la misma secuencia de nucleótidos, y en donde dicho primer oligonucleótido y segundo oligonucleótido están unidos opcionalmente por un conector, y en donde dicho primer oligonucleótido y dicho segundo oligonucleótido son complementarios a dicho oligonucleótido artificial en dicho dominio extracelular de dicho polipéptido, y en donde cuando dicho agente dimerizante dimeriza dos de dichos polipéptidos de muerte celular, se genera en dicha célula una señal inductora de la apoptosis, que comprende poner en contacto dicha célula con una cantidad de dicho agente dimerizante suficiente como para dimerizar un número suficiente de dicha pluralidad de polipéptidos artificiales para dimerizar y generar una señal inductora de la apoptosis añadida suficiente como para matar a dicha célula. En un ejemplo específico, dicha célula es un linfocito T.

En determinadas realizaciones, los linfocitos T matados comprenden un polipéptido que actúa para dirigir los linfocitos T a un antígeno particular, p. ej., un antígeno asociado a tumor o un antígeno específico de tumor, en donde dicho polipéptido, cuando se une a dicho antígeno, hace que la célula mate a una célula que presenta dicho antígeno, por ejemplo, un receptor de antígeno quimérico (CAR). Los linfocitos T que comprenden CAR se denominan en la presente memoria linfocitos CAR-T. Los receptores de antígenos quiméricos comprenden típicamente (i) un dominio intracelular (p. ej., dominio citoplásmico) de una proteína endógena expresada en la superficie de los linfocitos y que desencadena la activación y/o proliferación de dichos linfocitos, (ii) un dominio transmembrana y (iii) un dominio extracelular que se une a un antígeno de interés, p. ej., un antígeno asociado a tumor o un antígeno específico de tumor. Los linfocitos CAR-T también comprenden típicamente uno o más dominios coestimuladores. En determinadas realizaciones, un linfocito CAR-T comprende al menos dos polipéptidos CAR, al menos uno de los cuales proporciona una señal estimuladora primaria al linfocito CAR-T, y al menos uno que proporciona una señal coestimuladora al linfocito CAR-T. Los linfocitos CAR-T según la presente invención y que comprenden realizaciones específicas de CAR se proporcionan a continuación.

En otro aspecto, en la presente memoria se proporcionan linfocitos T de la presente invención para su uso en métodos de tratamiento de un individuo que tiene una enfermedad o trastorno, en donde la enfermedad o trastorno se caracteriza, o se puede caracterizar, por células que expresan un antígeno, en donde el método comprende administrar al individuo dichos linfocitos T. En determinadas realizaciones, cuando los linfocitos T modificados se administran a un sujeto que los necesita, la combinación de agente dimerizante y polipéptido de muerte celular seleccionada se elige de manera que sea compatible con la población de pacientes (o subpoblación) a la que se han administrado los linfocitos T. Solo a modo de ejemplo, si el agente dimerizante seleccionado es el anticuerpo rituximab, entonces, en determinadas realizaciones, la población de pacientes son individuos que tienen un cáncer de células B, p. ej., linfoma de células B.

4. Descripción detallada

4.1. Células que comprenden polipéptidos de muerte celular

La presente invención proporciona un linfocito T que comprende un polipéptido de muerte celular artificial que comprende un dominio inductor de la apoptosis, en donde dicho polipéptido es dimerizable usando un anticuerpo, y en donde cuando dicho anticuerpo dimeriza dicho polipéptido, se genera en dicho linfocito T una señal inductora de la apoptosis, en donde dicho polipéptido de muerte celular artificial es una proteína transmembrana que comprende un dominio extracelular que comprende un epítopo o mimotopo, un dominio transmembrana, y un dominio intracelular que comprende dicho dominio inductor de la apoptosis, en donde dicho dominio inductor de la apoptosis es o comprende caspasa 3, caspasa 8 o caspasa 9, y en donde

En la presente memoria se describen células modificadas genéticamente, por ejemplo, células inmunes, tales como linfocitos T, p. ej., linfocitos T humanos, que comprenden un polipéptido artificial multimerizable, p. ej., dimerizable (denominado en la presente memoria un "polipéptido de muerte celular") que, cuando se multimeriza, p. ej., dimeriza, por un agente multimerizante, p. ej., agente dimerizante, genera una señal inductora de la apoptosis en una célula, p. ej., un linfocito T, que expresa el polipéptido, dando como resultado la muerte celular, p. ej., a través de apoptosis. Sin pretender la vinculación a ningún mecanismo o teoría particular, se cree que cuando un número suficiente de una pluralidad de polipéptidos de muerte celular de la célula se multimerizan, p. ej., se dimerizan, la señal inductora de la apoptosis añadida generada de ese modo es suficiente como para matar a la célula, p. ej., causar que la célula experimente apoptosis. En un ejemplo específico, las células modificadas genéticamente proporcionadas en la presente memoria son linfocitos T. En determinados ejemplos, el polipéptido de muerte celular puede ser multimerizado o dimerizado por un agente multimerizante o agente dimerizante administrable, p. ej., una proteína (p. ej., anticuerpo, receptor o porción de unión a ligando del mismo, un ligando o porción de unión a receptor del mismo), oligonucleótido, o similar. En determinados ejemplos, el agente multimerizante no es una molécula pequeña. El agente multimerizante o dimerizante puede usarse para matar linfocitos T que comprenden el polipéptido de muerte celular bien in vitro o in vivo.

Por tanto, en la presente memoria se describe un linfocito T que comprende un polipéptido artificial (polipéptido de muerte celular) que comprende un dominio inductor de la apoptosis, en donde dicho polipéptido de muerte celular es multimerizable usando un agente multimerizante, en donde dicho agente multimerizante no es un ligando de la proteína de unión a FK506 (FKBP), y en donde cuando dicho agente multimerizante multimeriza dicho polipéptido, se genera en dicho linfocito T una señal inductora de la apoptosis. En un ejemplo específico, dicho agente multimerizante es un agente dimerizante; es decir, el agente multimerizante hace que el polipéptido de muerte celular se dimerice. En otro ejemplo específico, cuando dicho agente dimerizante dimeriza dicho polipéptido de muerte celular, se genera en dicho linfocito T una señal inductora de la apoptosis. El polipéptido de muerte celular no comprende una proteína de unión a FK506, una porción funcional de la misma o una forma modificada de la misma.

En determinados ejemplos, dicho polipéptido de muerte celular es un polipéptido transmembrana que comprende un dominio extracelular, un dominio transmembrana y un dominio intracelular que comprende dicho dominio inductor de la apoptosis. En determinados ejemplos, el dominio inductor de la apoptosis del polipéptido de muerte celular puede ser, por ejemplo, cualquier proteína o porción de la misma que cuando se dimeriza inicia una señal inductora de la apoptosis en la célula. Según la presente invención, el dominio inductor de la apoptosis es o comprende caspasa 9, caspasa 8 o caspasa 3 (p. ej., caspasa 9, caspasa 8 o caspasa 3 humana). Las secuencias de aminoácidos de las caspasas humanas, incluyendo la caspasa 9 humana, la caspasa 8 humana y la caspasa 3 humana, son bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, a la caspasa 3 humana se le ha asignado la ID de Gen de NCBI: 836; a la caspasa 8 humana se le ha asignado la ID de Gen de NCBI: 841; y a la caspasa humana 9 se le ha asignado la ID de Gen de NCBI: 842. En determinadas realizaciones, el dominio intracelular que es, o comprende, el dominio de caspasa, y el dominio extracelular, que comprende el epítopo o mimotopo, están unidos por un tallo de CD8a o tallo de CD8|3, al menos parte del cual puede funcionar como un dominio transmembrana.

En determinados ejemplos, el agente dimerizante es un polipéptido que comprende al menos dos sitios que se unen específicamente a un polipéptido de muerte celular, p. ej., un dominio extracelular de un polipéptido de muerte celular. En ejemplos particulares, el polipéptido es un anticuerpo, p. ej., un anticuerpo que comprende al menos dos sitios de unión a epítopo o mimotopo. En determinadas realizaciones, solo se usa el dominio de unión a antígeno del anticuerpo como un agente multimerizante o dimerizante. En determinadas realizaciones, el dominio extracelular del polipéptido de muerte celular comprende al menos un epítopo o mimotopo al que se une específicamente el anticuerpo. En ejemplos particulares, el anticuerpo es un anticuerpo biespecífico que comprende dos sitios de unión a epítopo o mimotopo diferentes que se unen a dos epítopos o mimotopos diferentes presentes en un dominio extracelular de un polipéptido de muerte celular. En determinados ejemplos, el anticuerpo es un anticuerpo IgG o IgM. También se pueden usar construcciones de anticuerpos artificiales que comprenden dominios de unión a epítopo o de unión a mimotopo de anticuerpos, opcionalmente unidos por uno o más conectores.

En un ejemplo específico, dicho anticuerpo, útil como agente multimerizante o dimerizante, ha sido aprobado por una autoridad reguladora gubernamental, p. ej., la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos para cualquier uso. Esto asegura, p. ej., que el anticuerpo, cuando se usa como un agente dimerizante o multimerizante, tiene una toxicidad y un perfil de seguridad para el paciente conocidos. Puede usarse cualquier combinación de anticuerpo y diana asociada en los linfocitos T descrita en la presente memoria. En un ejemplo, un anticuerpo útil como un agente multimerizante o dimerizante es uno que se une específicamente a un epítopo o mimotopo de c D20, p. ej., un epítopo o mimotopo de CD20 humano, y un dominio extracelular de un polipéptido de muerte celular comprende un epítopo o mimotopo de CD20 al que se une específicamente el anticuerpo. En determinadas realizaciones específicas, el anticuerpo es rituximab y el epítopo o mimotopo es un epítopo de CD20 o un mimotopo de CD20 que se une específicamente a dicho rituximab. En otra realización específica, el anticuerpo es tositumumab y el epítopo o mimotopo es un epítopo de CD20 o un mimotopo de CD20 que se une específicamente a dicho tositumumab. En otra realización más, el anticuerpo es ibritumomab y el epítopo o mimotopo es un epítopo de CD20 o un mimotopo de CD20 que se une específicamente a dicho ibritumomab. En otra realización más, el anticuerpo es ofatumumab y el epítopo o mimotopo es un epítopo de CD20 o un mimotopo de CD20 que se une específicamente a dicho atumumab.

Pueden utilizarse ligandos y receptores en la construcción de los polipéptidos de muerte celular descritos en la presente memoria, y pueden usarse agentes multimerizantes o agentes dimerizantes que comprenden los ligandos respectivos de los receptores para multimerizar o dimerizar los polipéptidos. En determinados ejemplos, cuando un agente multimerizante o un agente dimerizante se une al menos a dos polipéptidos de muerte celular, se produce la dimerización o multimerización de los polipéptidos de muerte celular, p. ej., se produce la dimerización o multimerización de los polipéptidos de muerte celular. En determinados ejemplos, un dominio extracelular de un polipéptido de muerte celular es o comprende un receptor o una porción de unión a ligando del mismo. En un ejemplo específico, un agente multimerizante o agente dimerizante es o comprende al menos dos ligandos para dicho receptor o porción de unión a ligando del mismo. En otro ejemplo específico, dicho agente multimerizante o agente dimerizante se une a dicho receptor o dicha porción de unión a ligando del mismo en dos de los polipéptidos de muerte celular, y dichos polipéptidos se multimerizan o dimerizan, p. ej., los dominios intracelulares de dichos polipéptidos se multimerizan o dimerizan. En realizaciones particulares, los polipéptidos de muerte celular comprenden dominios intracelulares que comprenden el dominio de caspasa y se produce la dimerización de los dominios de caspasa. En realizaciones específicas, dicha dimerización, por ejemplo, dimerización de dominios intracelulares, p. ej., dimerización de dominios de caspasa, inicia una señal inductora de la apoptosis en el linfocito T.

En determinados otros ejemplos de la célula, p. ej., linfocito T, dicho dominio extracelular del polipéptido de muerte celular comprende un ligando para un receptor. En un ejemplo específico, dicho agente multimerizante o agente dimerizante comprende al menos dos receptores o porciones de unión a ligando del mismo que se unen a dicho ligando. En un ejemplo específico cuando dicho agente multimerizante o agente dimerizante se une a dicho receptor o dicha porción de unión a ligando del mismo en al menos dos de los polipéptidos de muerte celular, dichos polipéptidos se multimerizan o dimerizan. En un ejemplo específico, cuando los polipéptidos de muerte celular se multimerizan o dimerizan, se genera en dicha célula una señal inductora de la apoptosis. En un ejemplo específico, dicha célula es un linfocito T.

En determinados otros ejemplos, un dominio extracelular de un polipéptido de muerte celular comprende una secuencia de oligonucleótidos artificial. Por ejemplo, en ejemplos particulares, una célula modificada, p. ej., un linfocito T, comprende un polipéptido de muerte celular que comprende un dominio extracelular que comprende una secuencia de oligonucleótidos artificial. En un ejemplo específico, un agente multimerizante o dimerizante es o comprende al menos un oligonucleótido multimerizante o dimerizante que comprende un primer oligonucleótido y un segundo oligonucleótido, opcionalmente unidos por un conector, en donde dicho primer oligonucleótido y dicho segundo oligonucleótido son complementarios a dicha secuencia de oligonucleótidos artificial. En determinados ejemplos específicos, dicho primer oligonucleótido y dicho segundo oligonucleótido tienen la misma secuencia. En ejemplos específicos, dicho primer oligonucleótido y dicho segundo oligonucleótido se unen en una conformación de cabeza a cabeza o de cola a cola. En ejemplos específicos, cuando dicho oligonucleótido multimerizante o dimerizante de dicho agente multimerizante o agente dimerizante hibrida con la secuencia de oligonucleótidos artificial de dos de dichos polipéptidos de muerte celular, los polipéptidos de muerte celular se multimerizan o dimerizan. En otro ejemplo específico, cuando los polipéptidos de muerte celular se multimerizan o dimerizan, se genera en dicha célula una señal inductora de la apoptosis. En ejemplos particulares, los polipéptidos de muerte celular comprenden dominios de caspasa intracelulares, y cuando los dominios de caspasa intracelulares se multimerizan o dimerizan, se genera en dicha célula una señal inductora de la apoptosis. En un ejemplo específico, dicha célula es un linfocito T.

En determinados otros ejemplos del linfocito T, el agente multimerizante o dimerizante es un polipéptido artificial que comprende dos o más dominios de unión unidos por uno o más conectores.

En una realización específica, el linfocito T de la presente invención comprende el polipéptido de muerte celular que comprende el dominio extracelular que comprende el epítopo, un dominio transmembrana y un dominio intracelular que comprende una caspasa 9, p. ej., una caspasa 9 humana, o una parte funcional de la misma. En otro ejemplo específico, en la presente memoria se describe una célula, p. ej., un linfocito T, que comprende un polipéptido artificial que comprende un dominio extracelular que comprende un receptor o una porción de unión a ligando del mismo, y un dominio intracelular que comprende una caspasa 9, p. ej., una caspasa 9 humana, o una porción funcional de la misma. En otro ejemplo específico, en la presente memoria se describe una célula, p. ej., un linfocito T, que comprende un polipéptido artificial que comprende un dominio extracelular que comprende un ligando o una porción de unión a receptor del mismo, en donde dicho ligando se une a un receptor o porción de unión a ligando del mismo, y un dominio intracelular que comprende una caspasa 9, p. ej., una caspasa 9 humana, o una porción funcional de la misma. En un ejemplo específico, dicha célula es un linfocito T.

En cualquiera de las realizaciones de la presente memoria, los linfocitos T pueden ser linfocitos T CD4+ o linfocitos T CD8+. Los linfocitos T pueden ser, sin modificación genética, específicos para un antígeno particular (p. ej., un antígeno asociado a tumor, un antígeno específico de tumor, antígeno viral o similar). Los linfocitos T pueden modificarse genéticamente para expresar uno o más polipéptidos, p. ej., receptores de antígenos quiméricos, que dirigen al linfocito T a un antígeno específico.

4.2. Métodos para matar células que comprenden polipéptidos de muerte celular

Los polipéptidos de muerte celular descritos en la presente memoria se pueden usar en métodos para matar células, p. ej., linfocitos T, que comprenden los polipéptidos de muerte celular. Los polipéptidos de muerte celular descritos en la presente memoria pueden usarse junto con cualquier célula, en particular, cualquier célula de mamífero, por ejemplo, cualquier célula humana. Dichos polipéptidos de muerte celular proporcionan, por ejemplo, una característica de seguridad útil para los agentes terapéuticos celulares. Como tales, los polipéptidos de muerte celular pueden, por ejemplo, ser importantes para un producto farmacológico que comprende un agente terapéutico celular, p. ej., linfocitos T que expresan un receptor de antígeno quimérico CAR, porque los polipéptidos de muerte celular permiten la muerte rápida del agente terapéutico celular, p. ej., los linfocitos T, si dicha muerte rápida se vuelve deseable, p. ej., en el caso en el que la administración de las células cause efectos no deseados o perjudiciales en un paciente que los recibe, o si la presencia del agente terapéutico celular, p. ej., los linfocitos T, en un sujeto ya no es necesaria. Por tanto, en determinados ejemplos, los polipéptidos de muerte celular descritos en la presente memoria se pueden usar junto con cualquier célula administrable, por ejemplo, agentes terapéuticos celulares, tales como agentes terapéuticos celulares de mamífero, p. ej., agentes terapéuticos celulares humanos. Los ejemplos no limitativos de células en las que pueden usarse los polipéptidos de muerte celular y los agentes multimerizantes o dimerizantes incluyen, pero no están limitadas a, células asesinas naturales (NK), células dendríticas (DC), células madre placentarias (p. ej., las células madre placentarias descritas en las Patentes de EE. UU. Nos. 7.468.276; 8.057.788 y 8.202.703), células madre similares a mesenquimales de la sangre del cordón umbilical, sangre placentaria, sangre periférica, médula ósea, pulpa dental, tejido adiposo, tejido osteocondral, y similares; células madre embrionarias, células germinales embrionarias, células madre de la cresta neural, células madre neurales, y células diferenciadas (p. ej., fibroblastos, etc.). Los polipéptidos de muerte celular y los agentes multimerizantes o dimerizantes también pueden usarse en líneas de células tumorales, p. ej., para fines experimentales en modelos animales.

La muerte celular por los polipéptidos de muerte celular descritos en la presente memoria puede tener lugar bien ¡n vivo, p. ej., en un individuo al que se han administrado las células, p. ej., linfocitos T, o ¡n vitrn, p. ej., en un laboratorio, p. ej., como parte de experimentos de control de calidad. En un ejemplo, en la presente memoria se describe un método para matar una célula, p. ej., un linfocito T, en donde dicha célula comprende una pluralidad de polipéptidos de muerte celular artificiales, cada uno de los cuales comprende un dominio inductor de la apoptosis, en donde dichos polipéptidos son multimerizables o dimerizables usando un agente multimerizante o agente dimerizante que no es un ligando de la proteína de unión a FK506 (FKBP), y en donde cuando dicho agente multimerizante o agente dimerizante multimeriza o dimeriza dicho polipéptido, se genera en dicha célula una señal inductora de la apoptosis, que comprende poner en contacto dicha célula con una cantidad de dicho agente multimerizante o agente dimerizante suficiente como para que dicha pluralidad de polipéptidos artificiales se dimerice y genere una señal inductora de la apoptosis añadida suficiente como para matar a dicha célula. En determinados ejemplos, el polipéptido de muerte celular es un polipéptido transmembrana que comprende un dominio extracelular, un dominio transmembrana y un dominio intracelular que comprende dicho dominio inductor de la apoptosis. En determinadas realizaciones, el dominio intracelular que es, o comprende, el dominio de caspasa, y el dominio extracelular, que comprende el epítopo o mimotopo, están unidos por un tallo de CD8a o tallo de CD8|3, al menos parte del cual puede funcionar como un dominio transmembrana. Según la presente invención, el dominio inductor de la apoptosis es o comprende caspasa 3, caspasa 8 o caspasa 9 (p. ej., caspasa 9, caspasa 8 o caspasa 3 humana).

El agente multimerizante o agente dimerizante usado en el método puede ser cualquier compuesto, distinto de una molécula pequeña, que pueda dimerizar o multimerizar un polipéptido de muerte celular, p. ej., una proteína, un oligonucleótido o un polisacárido. En determinados ejemplos, el agente multimerizante o agente dimerizante es un anticuerpo, p. ej., un anticuerpo que comprende al menos dos sitios de unión a epítopo o al menos dos sitios de unión a mimotopo. En determinadas realizaciones, solo se usa el dominio de unión a antígeno del anticuerpo como un agente multimerizante o dimerizante. El dominio extracelular del polipéptido de muerte celular comprende un epítopo o mimotopo al que se une el anticuerpo. El anticuerpo puede ser un anticuerpo de cualquier valencia, pero preferiblemente es un anticuerpo IgG o IgM.

En un ejemplo específico, dicho anticuerpo, útil como un agente multimerizante o dimerizante, ha sido aprobado por una autoridad reguladora gubernamental, p. ej., la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos para cualquier uso. Se puede usar cualquier combinación de anticuerpo y diana asociada en los métodos de matar linfocitos T descritos en la presente memoria.

En un ejemplo específico, cuando el agente multimerizante o agente dimerizante es un anticuerpo, dicho anticuerpo es uno que se une específicamente a un epítopo o mimotopo de CD20, p. ej., un epítopo o mimotopo de CD20 humano, y dicho dominio extracelular de un polipéptido de muerte celular comprende un epítopo o mimotopo de CD20 al que se une específicamente dicho anticuerpo. En determinadas realizaciones específicas, el anticuerpo es rituximab y el epítopo o mimotopo es un epítopo de CD20 o un mimotopo de CD20 que se une a dicho rituximab; el anticuerpo es tositumumab y el epítopo o mimotopo es un epítopo de CD20 o un mimotopo de CD20 que se une a dicho tositumumab; el anticuerpo es ibritumomab y el epítopo o mimotopo es un epítopo de CD20 o un mimotopo de CD20 que se une a dicho ibritumomab; el anticuerpo es ofatumumab y el epítopo o mimotopo es un epítopo de CD20 o un mimotopo de CD20 que se une a dicho ofatumumab; o el anticuerpo es alemtuzumab y el epítopo o mimotopo es un epítopo de CD52 o un mimotopo de CD52 que se une a dicho alemtuzumab.

En determinadas realizaciones específicas, el anticuerpo es basiliximab y el epítopo o mimotopo es un epítopo de CD25 o un mimotopo de CD25 que se une a dicho basiliximab; el anticuerpo es daclizumab y el epítopo o mimotopo es un epítopo de CD25 o un mimotopo de CD25 que se une a dicho daclizumab; el anticuerpo es brentuximab y el epítopo o mimotopo es un epítopo de CD30 o un mimotopo de CD30 que se une a dicho brentuximab; el anticuerpo es belimumab y el epítopo o mimotopo es un epítopo del factor de activación de células B (BAFF) o un mimotopo de BAFF que se une a dicho belimumab; el anticuerpo es cetuximab y el epítopo o mimotopo es un epítopo del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) o un mimotopo de EGFR que se une a dicho cetuximab; el anticuerpo es panitumumab y el epítopo o mimotopo es un epítopo del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) o un mimotopo de EGFR que se une a dicho panitumumab; el anticuerpo es efalizumab y el epítopo o mimotopo es un epítopo de CD11a o un mimotopo de CD11a que se une a dicho efalizumab; el anticuerpo es ipilimumab y el epítopo o mimotopo es un epítopo de CD152 o mimotopo de CD152 que se une a dicho ipilimumab; o el anticuerpo es natalizumab y el epítopo o mimotopo es un epítopo de la integrina alfa-4 o un mimotopo de la integrina alfa 4 que se une a dicho natalizumab.

En una realización específica de cualquiera de las realizaciones anteriores, cuando dicho anticuerpo se une a dicho epítopo o mimotopo en al menos dos de dichos polipéptidos de muerte celular, los dominios intracelulares de dichos polipéptidos, y/o las caspasas respectivas en dichos dominios intracelulares se multimerizan o dimerizan. En realizaciones específicas, cuando dicho anticuerpo se une específicamente al epítopo o mimotopo de al menos dos polipéptidos de muerte celular, se produce la dimerización de los polipéptidos de muerte celular, p. ej., se produce la dimerización de los dominios intracelulares de los polipéptidos de muerte celular. En realizaciones particulares, los polipéptidos de muerte celular comprenden dominios intracelulares que comprenden un dominio de caspasa, y se produce la dimerización de los dominios de caspasa. En realizaciones específicas, dicha dimerización, por ejemplo, dimerización de dominios intracelulares, p. ej., dimerización de dominios de caspasa, inicia una señal inductora de la apoptosis en el linfocito T.

Sin pretender la vinculación a ninguna teoría, cuando el anticuerpo se une a los respectivos epítopos o mimotopos en al menos dos de dichos polipéptidos, los dominios intracelulares de dichos polipéptidos se multimerizan, p. ej., dimerizan, momento en el que las caspasas respectivas en dichos dominios intracelulares se dimerizan. La dimerización de dichos polipéptidos inicia una señal inductora de la apoptosis en dicho linfocito T.

Como anteriormente, los receptores y sus respectivos ligandos se pueden usar para multimerizar o dimerizar polipéptidos de muerte celular y, por lo tanto, efectuar la muerte de una célula, p. ej., un linfocito T, que comprende el polipéptido. Por ejemplo, el dominio extracelular de dicho polipéptido de muerte celular es o comprende un receptor o una porción de unión a ligando del mismo. En dichos ejemplos, el agente multimerizante o agente dimerizante comprende al menos dos ligandos para dicho receptor o porción de unión a ligando del mismo, lo que permite la multimerización o dimerización del polipéptido de muerte celular cuando el agente multimerizante o agente dimerizante se une a dicho receptor o dicha porción de unión a ligando del mismo, en al menos dos de dichos polipéptidos, dichos polipéptidos se dimerizan. En ejemplos preferidos, la dimerización de dichos polipéptidos inicia una señal inductora de la apoptosis en dicha célula.

En otros ejemplos del método para matar células, p. ej., linfocitos T, el dominio extracelular del polipéptido de muerte celular comprende un ligando para un receptor. En dichos ejemplos del método, el agente multimerizante o agente dimerizante comprende al menos dos receptores o porciones de unión a ligando del mismo que se unen a dicho ligando. Cuando el agente multimerizante dimerizante se une a dicho receptor o dicha porción de unión a ligando del mismo en dos de dichos polipéptidos de muerte celular, los dominios intracelulares, y por tanto preferiblemente los dominios de caspasa, en dichos polipéptidos se dimerizan. La dimerización de dichos dominios intracelulares, y los dominios de caspasa, preferiblemente inicia una señal inductora de la apoptosis que se genera en dicha célula.

En determinados otros ejemplos del método para matar células, p. ej., linfocitos T, dicho dominio extracelular de dicho polipéptido de muerte celular comprende una secuencia de oligonucleótidos artificial. Por ejemplo, en ejemplos particulares, dicho polipéptido de muerte celular comprende un dominio extracelular que comprende una secuencia de oligonucleótidos artificial. En un ejemplo específico, un agente multimerizante o dimerizante es o comprende al menos un oligonucleótido multimerizante o dimerizante que comprende un primer oligonucleótido y un segundo oligonucleótido, opcionalmente unidos por un conector, en donde dicho primer oligonucleótido y dicho segundo oligonucleótido son complementarios a dicha secuencia de oligonucleótidos artificial. En determinados ejemplos específicos, dicho primer oligonucleótido y dicho segundo oligonucleótido tienen la misma secuencia. En ejemplos específicos, dicho primer oligonucleótido y dicho segundo oligonucleótido se unen en una conformación de cabeza a cabeza o de cola a cola. En ejemplos específicos, cuando dicho oligonucleótido multimerizante o dimerizante de dicho agente multimerizante o agente dimerizante hibrida con la secuencia de oligonucleótidos artificial de dos de dichos polipéptidos de muerte celular, los polipéptidos de muerte celular se multimerizan o dimerizan. En otro ejemplo específico, cuando los polipéptidos de muerte celular se multimerizan o dimerizan, se genera en dicha célula una señal inductora de la apoptosis. En ejemplos particulares, los polipéptidos de muerte celular comprenden dominios de caspasa intracelulares, y cuando los dominios de caspasa intracelulares se multimerizan o dimerizan, se genera en dicha célula una señal inductora de la apoptosis. En un ejemplo específico, dicha célula es un linfocito T.

En determinados otros ejemplos del método para matar linfocitos T, el agente multimerizante o dimerizante es un polipéptido artificial que comprende dos o más dominios de unión unidos por uno o más conectores.

También se proporciona en la presente memoria un anticuerpo según la presente invención para su uso en un método para el tratamiento de un paciente, en donde el método comprende la muerte terapéutica de un linfocito T según la presente invención, en donde dicho linfocito T comprende una pluralidad de los polipéptidos de muerte celular artificiales cada uno de los cuales comprende una caspasa o una porción funcional de la misma, en donde dicha caspasa es caspasa 3, caspasa 8 o caspasa 9 (p. ej., caspasa 3, caspasa 8 o caspasa 9 humana), y en donde dicho polipéptido de muerte celular es dimerizable usando dicho anticuerpo, y en donde cuando dicho anticuerpo dimeriza dicho polipéptido, se genera en dicha célula una señal inductora de la apoptosis, comprendiendo el método poner en contacto dicha célula con una cantidad de dicho anticuerpo suficiente como para dimerizar un número suficiente de dicha pluralidad de polipéptidos artificiales para dimerizar y generar una señal inductora de la apoptosis añadida suficiente como para matar a dicho linfocito T.

En otro ejemplo específico, en la presente memoria se describe un método para matar una célula, p. ej., un linfocito T, en donde dicha célula comprende una pluralidad de polipéptidos de muerte celular artificiales, cada uno de los cuales comprende una caspasa o una porción funcional de la misma, en donde dicha caspasa es caspasa 3, caspasa 8 o caspasa 9 (p. ej., caspasa 3, caspasa 8 o caspasa 9 humana), y, en donde dicha pluralidad de polipéptidos artificiales comprende cada uno un dominio extracelular que comprende un receptor o porción de unión a ligando del mismo que se une a un ligando, en donde dicho polipéptido es dimerizable usando un agente dimerizante que comprende dos de dichos ligandos, y en donde cuando dicho agente dimerizante dimeriza dos de dichos polipéptidos, se genera en la célula una señal inductora de la apoptosis, que comprende poner en contacto dicha célula con una cantidad de dicho agente dimerizante suficiente como para dimerizar un número suficiente de dicha pluralidad de polipéptidos de muerte celular artificiales para dimerizar y generar una señal inductora de la apoptosis añadida suficiente como para matar a dicha célula . En un ejemplo específico, dicha célula es un linfocito T.

En otro ejemplo específico, en la presente memoria se describe un método para matar una célula, p. ej., un linfocito T, en donde dicha célula comprende una pluralidad de polipéptidos de muerte celular artificiales, cada uno de los cuales comprende una caspasa o una porción funcional de la misma, en donde dicha caspasa es caspasa 3, caspasa 8 o caspasa 9 (p. ej., caspasa 3, caspasa 8 o caspasa 9 humana), y, en donde dicha pluralidad de polipéptidos artificiales comprende cada uno un dominio extracelular que comprende un ligando o porción de unión al receptor del mismo que se une a un receptor o porción de unión a ligando del mismo, donde dichos polipéptidos son dimerizables usando un agente dimerizante que comprende dos de dichos receptores o porción de unión a ligando del mismo, y en donde cuando dicho agente dimerizante dimeriza dos de dichos polipéptidos, se genera en dicha célula una señal inductora de la apoptosis, que comprende poner en contacto dicha célula con una cantidad de dicho agente dimerizante suficiente como para dimerizar un número suficiente de dicha pluralidad de polipéptidos artificiales para dimerizar y generar una señal inductora de la apoptosis añadida suficiente como para matar a dicha célula. En un ejemplo específico, dicha célula es un linfocito T.

En otro ejemplo específico, en la presente memoria se describe un método para matar una célula, p. ej., un linfocito T, en donde dicha célula comprende una pluralidad de polipéptidos de muerte celular artificiales, cada uno de los cuales comprende una caspasa o porción funcional de la misma, en donde dicha caspasa es caspasa 3, caspasa 8 o caspasa 9 (p. ej., caspasa 3, caspasa 8 o caspasa 9 humana), y, en donde dicha pluralidad de polipéptidos artificiales comprende cada uno un dominio extracelular que comprende un oligonucleótido artificial, en donde dicha pluralidad de polipéptidos son dimerizables usando un agente dimerizante que comprende un oligonucleótido que comprende un primer oligonucleótido y un segundo oligonucleótido, en donde dicho primer oligonucleótido y dicho segundo oligonucleótido tienen la misma secuencia de nucleótidos, y en donde dicho primer oligonucleótido y segundo oligonucleótido están unidos opcionalmente por un conector, y en donde dicho primer oligonucleótido y dicho segundo oligonucleótido son complementarios a dicho oligonucleótido artificial en dicho dominio extracelular de dicho polipéptido, y en donde cuando dicho agente dimerizante dimeriza dos de dichos polipéptidos de muerte celular, se genera en dicha célula una señal inductora de la apoptosis, que comprende poner en contacto dicha célula con una cantidad de dicho agente dimerizante suficiente como para dimerizar un número suficiente de dicha pluralidad de polipéptidos artificiales para dimerizar y generar una señal inductora de la apoptosis añadida suficiente como para matar a dicha célula. En un ejemplo específico, dicha célula es un linfocito T.

En una realización específica, los linfocitos T muertos son linfocitos CAR-T.

4.3. Receptores de antígenos quiméricos

El linfocito T según la presente invención puede comprender adicionalmente un receptor de antígeno quimérico (CAR) que reconoce un antígeno en un tumor. En un aspecto, en la presente memoria se proporciona dicho linfocito T que comprende dicho CAR para su uso en un método de tratamiento de un tumor. Los linfocitos T según la presente invención pueden, en determinadas realizaciones, comprender receptores de antígenos quiméricos (CAR), que son proteínas unidas a la membrana artificiales que dirigen un linfocito T a un antígeno y estimulan al linfocito T para que mate una célula que presenta el antígeno. Véase, p. ej., Eshhar, Patente de EE. u U. No. 7.741.465. Como mínimo, el CAR comprende un dominio extracelular que se une a un antígeno, p. ej., un antígeno en una célula, un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular (citoplásmico) que transmite una señal de activación primaria a una célula inmune. Si se cumplen todas las demás condiciones, cuando el CAR se expresa en la superficie de, p. ej., un linfocito T, y el dominio extracelular del CAR se une a un antígeno, el dominio de señalización intracelular transmite una señal al linfocito T para su activación y/o proliferación y, si el antígeno está presente en la superficie de una célula, para matar la célula que expresa el antígeno. Debido a que los linfocitos T requieren dos señales, una señal de activación primaria y una señal coestimuladora, con el fin de activarse, típicamente los CAR también comprenden un dominio coestimulador de manera que la unión del antígeno al dominio extracelular da como resultado la transmisión tanto de una señal de activación primaria como de una señal coestimuladora.

4.3.1. Estructura general del dominio intracelular de CAR

En determinadas realizaciones, el dominio intracelular del CAR es o comprende un dominio o resto intracelular de una proteína que se expresa en la superficie de los linfocitos T y desencadena la activación y/o proliferación de dichos linfocitos T. Dicho dominio o resto es capaz de transmitir una señal primaria de unión al antígeno que es necesaria para la activación de un linfocito T en respuesta a la unión del antígeno a la porción extracelular del CAR. Típicamente, este dominio o resto comprende, o es, un ITAM (resto de activación de inmunorreceptor basado en tirosina). Los polipéptidos que contienen ITAM adecuados para los CAR incluyen, por ejemplo, la cadena zeta de CD3 (CD3Z) o porciones de la misma que contienen ITAM. En una realización específica, el dominio intracelular es un dominio de señalización intracelular de CD3Z. En otras realizaciones específicas, el dominio intracelular es de una cadena de receptor de linfocitos, una proteína de complejo TCR/CD3, una subunidad del receptor de Fc o una subunidad del receptor de IL-2.

En determinadas realizaciones, el CAR comprende además uno o más dominios o restos coestimuladores, p. ej., como parte del dominio intracelular del polipéptido. El uno o más dominios o restos coestimuladores pueden ser, o comprender, uno o más de una secuencia de polipéptido de CD27 coestimuladora, una secuencia de polipéptido de CD28 coestimuladora, una secuencia de polipéptido de OX40 (CD134) coestimuladora, una secuencia de polipéptido de 4-1BB (CD137) coestimuladora, o una secuencia de polipéptido coestimulador de células T inducible (ICOS) coestimuladora, u otro dominio o resto coestimulador.

La región transmembrana puede ser cualquier región transmembrana que se pueda incorporar en un CAR funcional, típicamente una región transmembrana de una molécula CD4 o CD8.

4.3.2. Dominios transmembrana de CAR de CTLA4 o PD-1

En determinadas realizaciones, el dominio transmembrana del CAR es de una proteína del sistema inmune que normalmente transmite una señal inhibidora a dichas células del sistema inmune, p. ej., un dominio transmembrana de CTLA4 (antígeno 4 de linfocito T citotóxico o proteína 4 asociada a linfocito T citotóxico) o PD-1 (Muerte programada-1).

En determinadas realizaciones, cualquiera de los linfocitos T proporcionados en la presente memoria, que comprende una pluralidad de polipéptidos de muerte celular, comprende un dominio transmembrana de CTLA4 o PD-1 (Muerte celular programada 1). En una realización específica, un linfocito T que expresa dicho polipéptido, o cualquiera de dichos polipéptidos descritos en la presente memoria, se activa o estimula para que prolifere cuando dicho polipéptido se une a dicho antígeno. En una realización específica, el polipéptido, cuando se expresa en la superficie de un linfocito T, dirige al linfocito T para matar a una célula que expresa dicho antígeno.

En realizaciones específicas, en las que el dominio transmembrana del polipéptido es de CTLA4, el dominio transmembrana de CTLA4 es de un CTLA4 de mamífero, p. ej., CTLA4 humano, de primate o roedor, p. ej., murino. Preferiblemente, el dominio transmembrana no comprende aminoácidos del dominio intracelular, dominio extracelular o dominio intracelular o extracelular de CTLA4 o PD-1. A continuación, se proporcionan ejemplos específicos no limitativos de secuencias de dominio transmembrana de CTLA4 o PD-1.

En una realización específica, el dominio transmembrana de CTLA4 es la secuencia polipeptídica codificada por el exón 3 de un gen CTLA4 humano. En otra realización específica, el dominio transmembrana de CTLA4 es o comprende la secuencia de aminoácidos PEPCPDSDFLLWILAAVSSGLFFYSFLLTAVSLSKM (en código de tres letras, Pro-Glu-Pro-Cys-Pro-Asp-Ser-Asp-Phe-Leu-Leu-Trp-Ile-Leu-Ala-Ala-Val-Ser-Ser-Gly-Leu-Phe-Phe-Tyr-Ser-Phe-Leu-Leu-Thr-Ala-Val-Ser-Leu-Ser-Lys-Met) (SEQ ID NO:1). En otra realización específica, el dominio transmembrana de CTLA4 es o comprende la secuencia polipeptídica codificada por los nucleótidos 610-722 del No. de Acceso de GenBank NM_005214.4. En otra realización específica, el dominio transmembrana de CTLA4 es o comprende la secuencia de aminoácidos PDSDFLLWILAAVSSGLFFYSFLLTAVSL (en código de tres letras, Pro-Asp-Ser-Asp-Phe-Leu-Leu-Trp-Ile-Leu-Ala-Ala-Val-Ser-Ser-Gly-Leu-Phe-Phe-Tyr-Ser-Phe-Leu-Leu-Thr-Ala-Val-Ser-Leu) (SEQ ID n O:2). En otra realización específica, el dominio transmembrana de CTLA4 es o comprende la secuencia polipeptídica codificada por los nucleótidos 636-699 del No. de Acceso de GenBank NM_005214.4. En otra realización específica, el dominio transmembrana de CTLA4 es o comprende la secuencia de aminoácidos FLLWILAAVSSGLFFYSFLLTAV (en código de tres letras, Phe-Leu-Leu-Trp-Ile-Leu-Ala-Ala-Val-Ser-Ser-Gly-Leu-Phe-Phe-Tyr-Ser-Phe-Leu-Leu-Thr-Ala-Val) (SEQ ID NO:3). Véase, p. ej., la referencia de proteína Ensembl no. ENSP00000303939.3. En otra realización específica, el dominio transmembrana de CTLA4 es o comprende la secuencia polipeptídica FLLWILAAVSSGLFFYSFLLT (en código de tres letras, Phe-Leu-Leu-Trp-Ile-Leu-Ala-Ala-Val-Ser-Ser-Gly-Leu-Phe-Phe-Tyr-Ser-Phe-Leu-Leu-Thr) (SEQ ID NO:4), véase, p. ej., el No. de Acceso de UNIPROT P16410. En otra realización específica, el dominio transmembrana de CTLA4 es o comprende la secuencia polipeptídica FLLWILVAVSLGLFFYSFLVSAVSLS (en código de tres letras, Phe-Leu-Leu-Trp-Ile-Leu-Val-Ala-Val-Ser-Leu-Gly-Leu-Phe-Phe-Tyr-Ser-Phe-Leu-Val-Ser-Ala-Val-Ser-Leu-Ser) (SEQ ID NO:5). Véase, por ejemplo, Shin et al., Blood 119:5678-5687 (2012). En otra realización específica, el dominio transmembrana de PD-1 es o comprende la secuencia de aminoácidos TLVVGVVGGLLGSLVLLVWVLAVICSRAA (en código de tres letras, Thr-Leu-Val-Val-Gly-Val-Val-Gly-Gly-Leu-Leu-Gly-Ser-Leu-Val-Leu-Leu-Val-Trp-Val-Leu-Ala-Val-Ile-Cys-Ser-Arg-Ala-Ala) (SEQ ID NO:6). Véase, Finger et al., Gene 197(1 -2):177-187 (1997). En otra realización específica, el dominio transmembrana de PD-1 es o comprende la secuencia de aminoácidos VGVVGGLLGSLVLLVWVLAVI (en código de tres letras, Val-Gly-Val-Val-Gly-Gly-Leu-Leu-Gly-Ser-Leu-Val-Leu-Leu-Val-Trp-Val-Leu-Ala-Val-Ile) (SEQ ID NO:7). Véase, p. ej., el No. de Acceso de UNIPROT Q15116. En otra realización específica, el dominio transmembrana de PD-1 es o comprende la secuencia de aminoácidos FQTLVVGVVGGLLGSLVLlVw VLa V i (en código de tres letras, Phe-Glu-Thr-Leu-Val-Val-Gly-Val-Val-Gly-Gly-Leu-Leu-Gly-Ser-Leu-Val-Leu-Leu-Val-Trp-Val-Leu-Ala-Val-Ile) (SEQ ID NO:8). Véase, p. ej., el No. de Acceso de GenBank NM_005018.2. En determinadas realizaciones, una secuencia de nucleótidos que codifica uno de los polipéptidos transmembrana descritos en la presente memoria comprende una secuencia de nucleótidos que codifica cualquiera de las secuencias de aminoácidos descritas en SEQ ID. NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 o SEQ ID NO:8. En otra realización específica, el dominio transmembrana de PD-1 es o comprende al menos 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o 21 aminoácidos consecutivos descritos en SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 o SEQ ID NO:8. En determinadas realizaciones, una secuencia de nucleótidos que codifica uno de los polipéptidos descritos en la presente memoria comprende una secuencia de nucleótidos que codifica al menos 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o 21 aminoácidos consecutivos descritos en SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 o SEQ ID NO:8. Al construir el polipéptido, p. ej., CAR, en determinadas realizaciones, las secuencias humanas pueden combinarse con secuencias no humanas. Por ejemplo, un polipéptido, p. ej., CAR que comprende secuencias de aminoácidos de dominio extracelular e intracelular humano puede comprender un dominio transmembrana de una especie no humana; p. ej., puede comprender un dominio transmembrana de CTLA4 murino o un dominio transmembrana de PD-1 murino. En una realización más específica, el polipéptido, p. ej., CAR, comprende secuencias de aminoácidos humanas para los dominios extracelular e intracelular, y comprende un dominio transmembrana que tiene, o consiste en, la secuencia de aminoácidos de SEQ ID. NO:5.

4.3.3. Dominio intracelular de CAR

El dominio extracelular del polipéptido se une a un antígeno de interés. En determinadas realizaciones, el dominio extracelular comprende un receptor, o una porción de un receptor, que se une a dicho antígeno. El dominio extracelular puede ser, p. ej., un receptor, o una porción de un receptor, que se une a dicho antígeno. En determinadas realizaciones, el dominio extracelular comprende, o es, un anticuerpo o una porción de unión a antígeno del mismo. En realizaciones específicas, el dominio extracelular comprende, o es, un dominio Fv monocatenario. El dominio Fv monocatenario puede comprender, por ejemplo, un V^lunido a V^hmediante un conector flexible, en donde dichos V^ly V^hson de un anticuerpo que se une a dicho antígeno.

El antígeno al que se une el dominio extracelular del polipéptido puede ser cualquier antígeno de interés, p. ej., puede ser un antígeno en una célula tumoral. La célula tumoral puede ser, p. ej., una célula de un tumor sólido o una célula de un cáncer sanguíneo. El antígeno puede ser cualquier antígeno que se exprese en una célula de cualquier tumor o tipo de cáncer, p. ej., células de un linfoma, un cáncer de pulmón, un cáncer de mama, un cáncer de próstata, un carcinoma adrenocortical, un carcinoma de tiroides, un carcinoma nasofaríngeo, un melanoma, p. ej., un melanoma maligno, un carcinoma de piel, un carcinoma colorrectal, un tumor desmoide, un tumor desmoplásico de células redondas pequeñas, un tumor endocrino, un sarcoma de Ewing, un tumor neuroectodérmico primitivo periférico, un tumor de células germinales sólido, un hepatoblastoma, un neuroblastoma, un sarcoma de tejido blando no rabdomiosarcoma, un osteosarcoma, un retinoblastoma, un rabdomiosarcoma, un tumor de Wilms, un glioblastoma, un mixoma, un fibroma, un lipoma o similares. En realizaciones más específicas, dicho linfoma puede ser leucemia linfocítica crónica (linfoma linfocítico pequeño), leucemia prolinfocítica de células B, linfoma linfoplasmocítico, macroglobulinemia de Waldenstróm, linfoma de zona marginal esplénica, mieloma de células plasmáticas, plasmacitoma, linfoma de células B de la zona marginal extraganglionar, linfoma MALT, linfoma de células B de la zona marginal ganglionar, linfoma folicular, linfoma de células del manto, linfoma difuso de células B grandes, linfoma mediastínico (tímico) de células B grandes, linfoma intravascular de células B grandes, linfoma de derrame primario, linfoma de Burkitt, leucemia prolinfocítica de linfocitos T, leucemia linfocítica granular grande de linfocitos T, leucemia agresiva de células NK, leucemia/linfoma de linfocitos T del adulto, linfoma de linfocitos NK/T extraganglionar de tipo nasal, linfoma de linfocitos T de tipo enteropatía, linfoma de linfocitos T hepatoesplénico, linfoma de células NK blásticas, micosis fungoide, síndrome de Sezary, linfoma de células grandes anaplásico cutáneo primario, papulosis linfomatoide, linfoma de linfocitos T angioinmunoblástica, linfoma de linfocitos T periférico (no especificado), linfoma anaplásico de células grandes, linfoma de Hodgkin o linfoma no de Hodgkin.

En una realización específica, en la que el cáncer es leucemia linfocítica crónica (CLL), las células B de la CLL tienen un cariotipo normal. En otras realizaciones específicas, en las que el cáncer es leucemia linfocítica crónica (CLL), las células B de la CLL portan una deleción de 17p, una deleción de 11q, una trisomía de 12q, una deleción de 13q o una deleción de p53.

En determinadas realizaciones, el antígeno es un antígeno asociado a tumor o un antígeno específico de tumor. En diversas realizaciones específicas, sin limitación, el antígeno asociado a tumor o el antígeno específico de tumor es Her2, antígeno de células madre de próstata (PSCA), alfa-fetoproteína (AFP), antígeno carcinoembrionario (CEA), antígeno de cáncer 125 (CA-125), CA19-9, calretinina, MUC-1, proteína de la membrana epitelial (EMA), antígeno tumoral epitelial (ETA), tirosinasa, antígeno asociado al melanoma (MAGE), CD19, CD34, CD45, CD99, CD117, cromogranina, citoqueratina, desmina, proteína ácida fibrilar glial (GFAP), proteína del líquido de la enfermedad quística macroscópica (GCDFP-15), antígeno HMB-45, proteína melan-A (antígeno del melanoma reconocido por los linfocitos T; MART-1), mio-D1, actina específica del músculo (MSA), neurofilamento, enolasa específica de neuronas (NSE), fosfatasa alcalina placentaria, sinaptofisis, tiroglobulina, factor de transcripción tiroideo 1, la forma dimérica de la isoenzima de la piruvato quinasa tipo M2 (M2-PK tumoral), una proteína ras anormal, o una proteína p53 anormal.

En determinadas realizaciones, el TAA o TSA es un antígeno de cáncer/testículos (CT), p. ej., BAGE, CAGE, CTAGE, FATE, GAGE, HCA661, HOM-TES-85, MAGEA, MAGEB, MAGEC, NA88, NY-ESO-1, NY-SAR-35, OY-TES-1, SPANXB1, SPA17, SSX, SYCP1, o TPTE.

En determinadas otras realizaciones, el TAA o TSA es un carbohidrato o gangliósido, p. ej., fuc-GM1, GM2 (antígeno oncofetal-inmunogénico-1; OFA-I-1); GD2 (OFA-I-2), GM3, GD3 y similares.

En determinadas otras realizaciones, el TAA o TSA es alfa-actinina-4, Bage-1, BCR-ABL, proteína de fusión Bcr-Abl, betacatenina, CA 125, CA 15-3 (CA 27,29\BCAA), CA 195, CA 242, CA-50, CAM43, Casp-8, cdc27, cdk4, cdkn2a, CEA, coa-1, proteína de fusión dek-can, EBNA, EF2, antígenos del virus de Epstein Barr, proteína de fusión ETV6-AML1, HLA-A2, HLA-A11, hsp70-2, KIAAO205, Mart2, Mum-1, 2, y 3, neo-PAP, miosina clase I, OS-9, proteína de fusión pml-RARa, PTPRK, K-ras, N-ras, triosafosfato isomerasa, Gage 3,4,5,6,7, GnTV, Herv-K-mel, Lage-1, NA-88, NY-Eso-1/Lage-2, SP17, SSX-2, TRP2-Int2, , gp100 (Pmel 17), tirosinasa, TRP-1, TRP-2, MAGE-1, MAGE-3, RAGE, GAGE-1, GAGE-2, p15(58), RAGE, SCP-1, Hom/Mel-40, PRAME, p53, H-Ras, HER-2/neu, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, MYL-RAR, antígenos del papilomavirus humano (HPV) E6 y E7, TSP-180, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6, p185erbB2, p180erbB-3, cmet, nm-23H1, PSA, TAG-72-4, CA 19-9, CA 72-4, CAM 17.1, NuMa, K-ras, 13-Catenina, Mum-1, p16, TAGE, PSMA, CT7, telomerasa, 43-9F, 5T4, 791Tgp72, 13HCG, BCA225, BTAA, CD68\KP1, CO-029, FGF-5, G250, Ga733 (EpCAM), HTgp-175, M344, MA-50, MG7-Ag, MOV18, NB\70K, NY-CO-1, RCAS1, SDCCAG16, TA-90, TAAL6, TAG72, TLP, TPS, CD19, CD22, CD27, CD30, CD70, GD2 (gangliósido G2), EGFRvIII (variante III del factor de crecimiento epidérmico), proteína espermática 17 (Sp17), mesotelina, PAP (ácido prostático fosfatasa), prosteína, TARP (proteína de marco de lectura alternativo del receptor de células T gamma), Trp-p8, STEAP1 (antígeno epitelial de seis dominios transmembrana de la próstata 1), una proteína ras anormal, o una proteína p53 anormal. En otra realización específica, dicho antígeno asociado a tumor o antígeno específico de tumor es integrina avp3 (CD61), galactina, K-Ras (oncogén viral de sarcoma de rata de Kirsten V-Ki-ras2) o Ral-B. Los expertos en la técnica conocen otros antígenos asociados a tumores y específicos de tumores.

Los anticuerpos, y scFv, que se unen a TSA y TAA se conocen en la técnica, al igual que las secuencias de nucleótidos que los codifican.

En determinadas realizaciones específicas, el antígeno es un antígeno que no se considera un TSA o un TAA, pero que, no obstante, está asociado con células tumorales o daño causado por un tumor. En determinadas realizaciones, por ejemplo, el antígeno es, p. ej., un factor de crecimiento, citoquina o interleuquina, p. ej., un factor de crecimiento, citoquina o interleuquina asociada con angiogénesis o vasculogénesis. Dichos factores de crecimiento, citoquinas o interleuquinas pueden incluir, p. ej., factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF), factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), factor de crecimiento similar a la insulina. (IGF) o interleuquina-8 (IL-8). Los tumores también pueden crear un ambiente hipóxico local al tumor. Como tal, en otras realizaciones específicas, el antígeno es un factor asociado a hipoxia, p. ej., HIF-1a, HIF-1p, HIF-2a, HIF-2P, HIF-3a o HIF-3p. Los tumores también pueden causar daño localizado al tejido normal, provocando la liberación de moléculas conocidas como moléculas de patrón molecular asociado al daño (DAMP, también conocidas como alarminas). En determinadas otras realizaciones específicas, por lo tanto, el antígeno es una DAMP, p. ej., una proteína de choque térmico, una proteína asociada a la cromatina de alta movilidad del grupo 1 (HMGB1), S100A8 (MRP8, calgranulina A), S100A9 (MRP14, calgranulina B) amiloide A sérico (SAA), o puede ser un ácido desoxirribonucleico, trifosfato de adenosina, ácido úrico o sulfato de heparina.

En determinadas realizaciones, el dominio extracelular está unido a dicho dominio transmembrana mediante una secuencia polipeptídica conectora, espaciadora o bisagra, p. ej., una secuencia de CD28 o una secuencia de CTLA4.

4.3.4. CAR biespecíficos

En determinadas realizaciones, los linfocitos T, además de comprender el polipéptido de muerte celular, comprenden dos o más CAR en los que el mecanismo de señalización primario y el mecanismo coestimulador se dividen en dos o más polipéptidos.

En determinadas realizaciones, por ejemplo, los linfocitos T comprenden el polipéptido de muerte celular y al menos otros dos polipéptidos diferentes, p. ej., receptores quiméricos, en los que la señal inmune deriva de la unión de un polipéptido de señalización primaria, p. ej., receptor quimérico, a un primer antígeno se separa de una señal coestimuladora producida por un polipéptido coestimulador, p. ej., receptor quimérico, en donde la señal coestimuladora depende de la unión al antígeno de un segundo antígeno por el segundo receptor quimérico.

En una realización, el linfocito T comprende un polipéptido de señalización primaria que comprende un primer dominio de unión a antígeno extracelular que se une a un primer antígeno, y un primer dominio de señalización intracelular, en donde dicho polipéptido de señalización primaria no comprende un dominio coestimulador; y un coestimulador que comprende un segundo dominio de unión a antígeno extracelular que se une a un segundo antígeno, o un receptor que se une a dicho segundo antígeno; y un segundo dominio de señalización intracelular; en donde dicho linfocito T se vuelve máximamente citotóxico solo cuando dicho primer dominio de señalización y dicho segundo dominio de señalización son ambos activados por dicho primer antígeno y dicho segundo antígeno, respectivamente. En una realización específica, la unión de dicho primer antígeno a dicho primer dominio de unión a antígeno sin la unión de dicho segundo antígeno a dicho segundo dominio de unión, o la unión de dicho segundo antígeno a dicho segundo dominio de unión a antígeno sin la unión del primer segundo antígeno a dicho primer dominio de unión, induce anergia de dicho linfocito T, o falta de respuesta de dicho linfocito T a dicho primer antígeno o dicho segundo antígeno.

En otra realización específica, dicho primer dominio de unión a antígeno y dicho segundo dominio de unión a antígeno son independientemente una porción de unión a antígeno de un receptor, una porción de unión a antígeno de un anticuerpo u otro agente de unión a antígeno macromolecular basado en péptido. En determinadas realizaciones específicas, cualquiera o ambos de dicho primer dominio de unión a antígeno o dicho segundo dominio de unión a antígeno son fragmentos de anticuerpo scFv. En realizaciones específicas, cualquiera o ambos de dicho polipéptido de señalización primaria o dicho polipéptido coestimulador comprenden adicionalmente un dominio transmembrana. En otras realizaciones específicas, dicho polipéptido de señalización primaria o dicho polipéptido coestimulador comprende un resto de supervivencia de linfocitos T. En una realización específica, el resto de supervivencia de linfocitos T es un resto de supervivencia de linfocitos T CD28. En otras realizaciones específicas, dicho resto de supervivencia de linfocitos T es un dominio de señalización intracelular del receptor de IL-7 (IL-7R), un dominio de señalización intracelular del receptor de IL-12, un dominio de señalización intracelular del receptor de IL-15, un dominio de señalización intracelular del receptor de IL-21, o un dominio de señalización intracelular del receptor del factor de crecimiento transformante p (TGFP). En otra realización más específica, dicho polipéptido de señalización primaria o dicho polipéptido coestimulador comprende una porción de una molécula de CD28 que comprende un resto de supervivencia de linfocitos T. En una realización más específica, dicho polipéptido de señalización primaria o dicho polipéptido coestimulador comprende una molécula de CD28 que comprende un resto de supervivencia de linfocitos T. En determinadas realizaciones específicas, dicho primer dominio de señalización intracelular comprende una secuencia polipeptídica que comprende un resto de activación de inmunorreceptor basado en tirosina (ITAM). En una realización más específica, dicha secuencia polipeptídica es un dominio de señalización de CD3Z.

En determinadas realizaciones específicas, dicho primer antígeno es un antígeno en una célula tumoral. En una realización más específica, dicha célula tumoral es una célula en un tumor sólido. En otra realización más específica, dicha célula tumoral es una célula de cáncer sanguíneo. En otra realización específica, dicho antígeno es un antígeno asociado a tumor o un antígeno específico de tumor. En realizaciones más específicas, dicho antígeno asociado a tumor o antígeno específico de tumor es Her2, antígeno de células madre de próstata (PSCA), alfa-fetoproteína (AFP), antígeno carcinoembrionario (CEA), antígeno de cáncer 125 (CA-125), CA19-9, calretinina, MUC-1, proteína de la membrana epitelial (EMA), antígeno tumoral epitelial (ETA), tirosinasa, antígeno asociado al melanoma (MAGE), CD34, CD45, CD99, CD117, cromogranina, citoqueratina, desmina, proteína ácida fibrilar glial (GFAP), proteína del líquido de la enfermedad quística macroscópica (GCDFP-15), antígeno HMB-45, proteína melan-A (antígeno del melanoma reconocido por los linfocitos T; MART-1), mio-D1, actina específica del músculo (MSA), neurofilamento, enolasa específica de neuronas (NSE), fosfatasa alcalina placentaria, sinaptofisina, tiroglobulina, factor de transcripción tiroideo 1, la forma dimérica de la isoenzima de la piruvato quinasa tipo M2 (M2-PK tumoral), una proteína ras anormal, o una proteína p53 anormal.

En otra realización específica, dicho segundo antígeno es un factor de crecimiento, citoquina o interleuquina. El segundo antígeno es un factor de crecimiento, citoquina o interleuquina asociado con angiogénesis o vasculogénesis. En realizaciones más específicas, dicho segundo antígeno es el factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF), factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), factor de crecimiento similar a la insulina (IGF), o interleuquina-8 (IL-8).

En otra realización específica, la activación de la transducción de señales proporcionada por dicho segundo antígeno no es antigénica, pero está asociada con hipoxia. En realizaciones más específicas, dicho estímulo se induce por la activación del factor inducible por hipoxia 1a (HIF-1a), HIF-1 p, HIF-2a, HIF-2P, HF-3a o HIF-3p.

En otra realización específica, dicho segundo antígeno es una interleuquina.

En otra realización específica, dicho segundo antígeno es una molécula de patrón molecular asociada al daño (DAMP; también conocida como alarmina). En realizaciones más específicas, dicha DAMP es una proteína de choque térmico, una proteína asociada a la cromatina de alta movilidad del grupo 1 (HMGB1), S100A8 (también conocida como MRP8 o calgranulina A), S100A9 (también conocida como MRP14 o calgranulina B), amiloide A sérico (SAA), ácido desoxirribonucleico, trifosfato de adenosina, ácido úrico o sulfato de heparina.

En determinadas realizaciones específicas, dicho segundo antígeno es un antígeno en un anticuerpo que se une a un antígeno presentado por una célula tumoral.

En una realización específica de cualquiera de las realizaciones de la presente memoria, dicho polipéptido coestimulador comprende uno o más dominios coestimuladores. En realizaciones específicas, dichos uno o más dominios coestimuladores comprenden uno o más de una secuencia de polipéptido de CD27 coestimuladora, una secuencia de polipéptido de CD28 coestimuladora, una secuencia de polipéptido de OX40 (CD134) coestimuladora, una secuencia de polipéptido de 4-1BB (CD137) coestimuladora, o una secuencia de polipéptido coestimuladora de células T inducible coestimuladora (ICOS).

En una realización específica, dicho polipéptido de señalización primaria comprende un dominio de unión a antígeno tumoral extracelular y un dominio de señalización de CD3Z, y en donde dicho polipéptido coestimulador comprende un dominio de unión a antígeno en donde dicho antígeno es un factor angiogénico o vasculogénico, y uno o más dominios de señalización de moléculas coestimuladoras. Dicho factor angiogénico puede ser, p. ej., VEGF. Dichos uno o más restos de señalización de moléculas coestimuladoras pueden comprender, p. ej., dominios de señalización coestimuladores de cada uno de CD28, OX40 y 4-1BB. En una realización más específica, dicho polipéptido de señalización primaria comprende un dominio de unión a antígeno tumoral extracelular y un dominio de señalización de CD3Z, y en donde dicho polipéptido coestimulador comprende un dominio de unión a antígeno en donde dicho antígeno es VEGF, y dominios de señalización coestimuladores de cada uno de CD28, OX40 y 4-1BB.

En una realización más específica, dicho polipéptido de señalización primaria o dicho polipéptido coestimulador comprende un resto de supervivencia de linfocitos T. En realizaciones más específicas, dicho resto de supervivencia de linfocitos T es, o se deriva de, un dominio de señalización intracelular del receptor de IL-7 (IL-7R), un dominio de señalización intracelular del receptor de IL-12, un dominio de señalización intracelular del receptor de IL-15, un dominio de señalización intracelular del receptor de IL-21, o un dominio de señalización intracelular del receptor del factor de crecimiento transformante p (TGFP). En una realización más específica de dicho linfocito T, por lo tanto, dicho polipéptido de señalización primaria comprende un dominio de unión a antígeno tumoral extracelular y un dominio de señalización de CD3Z, y en donde dicho polipéptido coestimulador comprende un dominio de unión a antígeno en donde dicho antígeno es VEGF, un resto de supervivencia de linfocitos T intracelulares del receptor de IL-7 y dominios de señalización coestimuladores de cada uno de CD28, OX40 y 4-1BB.

En otra realización específica del linfocito T, dicho primer antígeno es un antígeno específico de tumor o un antígeno asociado a tumor, y dicho primer dominio de señalización intracelular comprende un dominio de señalización de CD3Z; y en donde dicho polipéptido coestimulador comprende un dominio de unión a antígeno que se une a dicho segundo antígeno y dominios de señalización coestimuladores de cada uno de CD28, OX40 y 4-1BB. En una realización más específica, dicho polipéptido coestimulador comprende además un resto de supervivencia de linfocitos T intracelular, p. ej., un resto de supervivencia de linfocitos T que es, o se deriva de, un dominio de señalización intracelular del receptor de IL-7 (IL-7R), un dominio de señalización intracelular del receptor de IL-12, un dominio de señalización intracelular del receptor de IL-15, un dominio de señalización intracelular del receptor de IL-21 o un dominio de señalización intracelular del receptor del factor de crecimiento transformante p (TGFP).

En una realización específica de cualquiera de los linfocitos T proporcionados en la presente memoria, dicho segundo antígeno es VEGF o IL-4.

En otra realización, el linfocito T comprende el polipéptido de muerte celular, un polipéptido coestimulador que comprende un primer dominio de unión a antígeno extracelular que se une a un primer antígeno y un primer dominio de señalización intracelular; y un polipéptido de señalización primaria que comprende un segundo dominio de unión a antígeno extracelular que se une a un segundo antígeno, o un receptor que se une a dicho segundo antígeno; y un segundo dominio de señalización intracelular, en donde dicho polipéptido de señalización primaria no comprende un dominio coestimulador; en donde dicho linfocito modificado se vuelve máximamente citotóxico solo cuando dicho primer dominio de señalización y dicho segundo dominio de señalización son ambos activados por dicho primer antígeno y dicho segundo antígeno, respectivamente. En una realización específica, la unión de dicho primer antígeno a dicho primer dominio de unión a antígeno sin la unión de dicho segundo antígeno a dicho segundo dominio de unión, o la unión de dicho segundo antígeno a dicho segundo dominio de unión a antígeno sin la unión del primer segundo antígeno a dicho primer dominio de unión induce anergia de dicho linfocito T, o falta de respuesta de dicho linfocito T a dicho primer antígeno. En una realización específica, dicho primer dominio de unión a antígeno y dicho dominio de unión a antígeno son independientemente una porción de unión a antígeno de un receptor o una porción de unión a antígeno de un anticuerpo. En otra realización específica, cualquiera o ambos de dicho primer dominio de unión a antígeno o dicho segundo dominio de unión a antígeno son fragmentos de anticuerpo scFv. En realizaciones específicas, dicho polipéptido coestimulador y/o dicho polipéptido de señalización primaria comprende además un dominio transmembrana. En una realización más específica, dicho polipéptido coestimulador o dicho polipéptido de señalización primaria comprende un resto de supervivencia de linfocitos T, p. ej., cualquiera de los restos de supervivencia de linfocitos T descritos en la presente memoria. En otra realización específica, dicho primer antígeno es un antígeno en una célula tumoral, p. ej., una célula en un tumor sólido o una célula de cáncer sanguíneo. En una realización específica, dicho primer antígeno es un antígeno asociado a tumor o un antígeno específico de tumor, p. ej., Her2, antígeno de células madre de próstata (PSCA), alfa-fetoproteína (AFP), antígeno carcinoembrionario (CEA), antígeno de cáncer 125 (CA-125), CA19-9, calretinina, MUC-1, proteína de la membrana epitelial (EMA), antígeno tumoral epitelial (ETA), tirosinasa, antígeno asociado al melanoma (MAGE), CD34, CD45, CD99, CD117, cromogranina, citoqueratina, desmina, proteína ácida fibrilar glial (GFAP), proteína del líquido de la enfermedad quística macroscópica (GCDFP-15), antígeno HMB-45, proteína melan-A (antígeno del melanoma reconocido por los linfocitos T; MART-1), mio-D1, actina específica del músculo (MSA), neurofilamento, enolasa específica de neuronas (NSE), fosfatasa alcalina placentaria, sinaptofisina, tiroglobulina, factor de transcripción tiroideo 1, la forma dimérica de la isoenzima de la piruvato quinasa tipo M2 (M2-PK tumoral), una proteína ras anormal, una proteína p53 anormal, CD19, CD22, CD27, c D30, CD70, GD2 (gangliósido G2), EGFRvIII (variante III del factor de crecimiento epidérmico), proteína de esperma 17 (Sp17), mesotelina, PAP (fosfatasa ácida prostática), prosteína, TARP (proteína del marco de lectura alternativo del receptor de células T gamma), Trp-p8 o STEAP1 (antígeno epitelial de seis dominios transmembrana de la próstata 1). En otra realización específica, dicho antígeno asociado a tumor o antígeno específico de tumor es integrina avp3 (CD61), galactina, K-Ras (oncogén viral de sarcoma de rata de Kirsten V-Ki-ras2) o Ral-B.

En determinadas realizaciones específicas, dicho segundo dominio de señalización intracelular comprende una secuencia polipeptídica que comprende un resto de activación de inmunorreceptor basado en tirosina (ITAM), p. ej., un dominio de señalización de CD3Z. En una realización específica, dicho segundo antígeno es un factor de crecimiento, citoquina o interleuquina. En otra realización específica, dicho segundo antígeno es un factor de crecimiento, citoquina o interleuquina asociada con angiogénesis o vasculogénesis, p. ej., VEGF, bFGF, PDGF, HGF, IGF o IL-8. En otras realizaciones más específicas, la transducción de señales por dicho segundo receptor quimérico es inducida por la activación de un factor asociado a hipoxia, p. ej., HIF-1a, HIF-1 p, HIF-2a, HIF-2P, HIF-3a o HIF-3p. En otras realizaciones específicas, dicho segundo antígeno es una interleuquina. En otras realizaciones específicas, dicho segundo antígeno es una DAMP, p. ej., una proteína de choque térmico, HMGB1, S100A8, S100A9, SAA, ADN, ATP, ácido úrico o sulfato de heparina. En otras realizaciones específicas, dicho segundo antígeno es un péptido administrado, p. ej., un anticuerpo o un polipéptido sintético. En otras realizaciones específicas, dicho segundo antígeno es un antígeno en un anticuerpo que se une a un antígeno presentado por una célula tumoral. En determinadas realizaciones específicas, dicho polipéptido coestimulador comprende uno o más dominios coestimuladores, p. ej., uno o más de una secuencia de polipéptido de CD27 coestimuladora, una secuencia de polipéptido de CD28 coestimuladora, una secuencia de polipéptido de OX40 (CD134) coestimuladora, una secuencia de polipéptido de 4-1BB (CD137) coestimuladora, o una secuencia de polipéptido coestimuladora de células T inducible coestimuladora (ICOS). En cualquiera de las realizaciones anteriores, en una realización específica, dicho polipéptido coestimulador o dicho polipéptido de señalización primaria comprende un resto de supervivencia de linfocitos T, p. ej., dicho resto de supervivencia de linfocitos T es, o se deriva de, un dominio de señalización intracelular del receptor de IL-7 (IL-7R), un dominio de señalización intracelular del receptor de IL-12, un dominio de señalización intracelular del receptor de IL-15, un dominio de señalización intracelular del receptor de IL-21 o un dominio de señalización intracelular del receptor del factor de crecimiento transformante p (TGFP).

4.4. Polipéptidos aislados

Cualquiera de los polipéptidos, que comprenden un dominio transmembrana de CTLA4 o PD-1, puede modificarse mediante, p. ej., acilación, amidación, glicosilación, metilación, fosforilación, sulfatación, sumoilación, ubiquitilación o similares. Los polipéptidos se pueden marcar con un marcador capaz de proporcionar una señal detectable, p. ej., con radioisótopos y compuestos fluorescentes. Una o más cadenas laterales del primer o segundo polipéptidos pueden derivatizarse, p. ej., derivatización de residuos lisinilo y amino terminales con succínico u otros anhídridos de ácido carboxílico, o derivatización con, p. ej., imidoésteres tales como picolinimidato de metilo; fosfato de piridoxal; piridoxal; cloroborohidruro; ácido trinitrobencenosulfónico; O-metilisourea; 2,4 pentanodiona; y reacción catalizada por transaminasas con glioxilato. Los grupos laterales carboxilo, aspartilo o glutamilo, pueden modificarse selectivamente mediante reacción con carbodiimidas (R-N=C=N-R') tales como 1-ciclohexil-3-(2-morfolinil-(4-etil)carbodiimida o 1 -etil-3-(4-azonia-4,4-dimetilpentil)carbodiimida.

4.5. Ácidos nucleicos aislados

Los polipéptidos (p. ej., receptores quiméricos) pueden estar codificados por secuencias de polinucleótidos de acuerdo con métodos bien conocidos en la técnica. Los polinucleótidos pueden estar contenidos en cualquier vector polinucleotídico adecuado para la transformación de células inmunes, p. ej., linfocitos T. Por ejemplo, los linfocitos T se pueden transformar usando vectores sintéticos, vectores lentivirales o retrovirales, plásmidos de replicación autónoma, un virus (p. ej., un retrovirus, lentivirus, adenovirus o virus del herpes), o similares, que contienen polinucleótidos que codifican el primer y segundo polipéptidos (p. ej., receptores quiméricos). Los vectores lentivirales adecuados para la transformación de linfocitos T incluyen, pero no están limitados a, p. ej., los vectores lentivirales descritos en las Patentes de EE. UU. Nos.

5.994.136; 6.165.782; 6.428.953; 7.083.981; y 7.250.299. Los vectores de VIH adecuados para la transformación de linfocitos T incluyen, pero no están limitados a, p. ej., los vectores descritos en la Patente de e E. UU. 5.665.577.

Los ácidos nucleicos útiles en la producción del primer y segundo polipéptidos, p. ej., dentro de un linfocito T, incluyen ADN, ARN o análogos de ácidos nucleicos. Los análogos de ácidos nucleicos se pueden modificar en el resto de base, resto de azúcar o esqueleto de fosfato, y pueden incluir la sustitución de desoxiuridina por desoxitimidina, la sustitución de 5-metil-2'-desoxicitidina o 5-bromo-2'-desoxicitidina por desoxicitidina. Las modificaciones del resto de azúcar pueden incluir la modificación del hidroxilo 2' del azúcar ribosa para formar azúcares 2'-O-metilo o 2'-O-alilo. El esqueleto de desoxirribosa fosfato se puede modificar para producir ácidos morfolino nucleicos, en los que cada resto de base está unido a un anillo morfolino de seis miembros, o ácidos nucleicos peptídicos, en los que el esqueleto de desoxifosfato se reemplaza por un esqueleto de pseudopéptido y las cuatro bases se retienen. Véase, por ejemplo, Summerton y Weller (1997) Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 7:187-195; y Hyrup et al. (1996) Bioorgan. Med. Chain. 4:5-23. Además, el esqueleto de desoxifosfato se puede reemplazar con, por ejemplo, un esqueleto de fósforotioato o fósforoditioato, una fósforamidita o un esqueleto de fosfotriésterde alquilo.

4.6. Células

Los ejemplos no limitativos de células en las que pueden usarse los polipéptidos de muerte celular y agentes multimerizantes o dimerizantes incluyen, pero no están limitadas a, células asesinas naturales (NK), células dendríticas (DC), células madre placentarias (p. ej., las células madre placentarias descritas en las Patentes de EE. UU. Nos.

7.468.276; 8.057.788 y 8.202.703), células madre similares a mesenquimales de la sangre del cordón umbilical, sangre placentaria, sangre periférica, médula ósea, pulpa dental, tejido adiposo, tejido osteocondral, y similares; células madre embrionarias, células germinales embrionarias, células madre de la cresta neural, células madre neurales, y células diferenciadas (p. ej., fibroblastos, etc.). Los polipéptidos de muerte celular y los agentes multimerizantes o dimerizantes también pueden usarse en líneas de células tumorales, p. ej., para fines experimentales en modelos animales.

Los linfocitos T proporcionados en la presente memoria pueden ser linfocitos T naíf o linfocitos T restringidos por MHC. En determinadas realizaciones, los linfocitos T son linfocitos infiltrantes de tumores (TIL). En determinadas realizaciones, los linfocitos T se han aislado de una biopsia de tumor o se han expandido a partir de linfocitos T aislados de una biopsia de tumor. En determinadas otras realizaciones, los linfocitos T se han aislado de, o se han expandido a partir de linfocitos T expandidos a partir de, sangre periférica, sangre de cordón o linfa.

Las células inmunes, p. ej., linfocitos T, usadas en los presentes métodos son preferiblemente autólogas para un individuo al que se van a administrar los linfocitos T. En determinadas otras realizaciones, los linfocitos T son alogénicos para un individuo al que se van a administrar los linfocitos T. Cuando se usan linfocitos T alogénicos para preparar linfocitos T, es preferible seleccionar linfocitos T que reduzcan la posibilidad de la enfermedad de injerto frente a huésped (GVHD) en el individuo. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, se seleccionan linfocitos T específicos de virus para la preparación de linfocitos T; se esperará que dichos linfocitos tengan una capacidad nativa muy reducida para unirse a, y, por tanto, ser activados por, cualquier antígeno del receptor. En determinadas realizaciones, el rechazo mediado por el receptor de linfocitos T alogénicos puede reducirse mediante la coadministración al huésped de uno o más agentes inmunosupresores, p. ej., ciclosporina, tacrolimus, sirolimus, ciclofosfamida o similares.

En una realización, los linfocitos T se obtienen de un individuo, opcionalmente luego se expanden, y luego se transforman con un polinucleótido que codifica un polipéptido de muerte celular y, opcionalmente, uno o más polinucleótidos que codifican uno o más CAR, y, opcionalmente, luego se expanden. En otra realización, los linfocitos T se obtienen de un individuo, luego opcionalmente se expanden y luego se transforman con un polinucleótido que codifica un polipéptido de muerte celular y, opcionalmente, uno o más polinucleótidos que codifican uno o más CAR, y, opcionalmente, luego se expanden. Las células que contienen cualquiera de los polinucleótidos pueden seleccionarse usando uno o más marcadores seleccionables.

En determinadas realizaciones, cualquiera de los linfocitos T proporcionados en la presente memoria expresa o comprende proteínas TCR nativas, p. ej., TCR-a y TCR-p que son capaces de formar complejos TCR nativos, además del polipéptido que contiene el dominio transmembrana de CTLA4 o PD-1. En determinadas otras realizaciones, cualquiera o ambos de los genes nativos que codifican TCR-a y TCR-p en los linfocitos T se modifican para que no sean funcionales, p. ej., se deleciona una porción o todo, se inserta una mutación, etc.

En determinadas realizaciones, cualquiera de los linfocitos T proporcionados en la presente se aísla de una lesión tumoral, p. ej., son linfocitos infiltrantes de tumores; se espera que dichos linfocitos T sean específicos para un TSA o TAA.

Los linfocitos T, y los linfocitos T que comprenden un polipéptido que comprende un dominio de señalización de CD3Z y un dominio coestimulador de CD28, pueden expandirse usando anticuerpos frente a CD3 y CD28, p. ej., anticuerpos unidos a perlas, o a la superficie de una placa de cultivo celular; véanse, p. ej., las Patentes de EE. UU. Nos. 5.948.893; 6.534.055; 6.352.694; 6.692.964; 6.887.466; y 6.905.681.

En cualquiera de las realizaciones anteriores, el antígeno y/o el anticuerpo puede existir libre en el medio en el que se cultivan los linfocitos T, o cualquiera o ambos pueden unirse a un soporte sólido, p. ej., superficie plástica de cultivo de tejidos, perlas o similares.

Los linfocitos T proporcionados en la presente memoria pueden comprender opcionalmente un segundo tipo de "gen suicida" o "interruptor de seguridad", además del polipéptido de muerte celular. Por ejemplo, los linfocitos T, en determinadas realizaciones, pueden comprender un gen de timidina quinasa de HSV (HSV-t K), que provoca la muerte de los linfocitos T al entrar en contacto con ganciclovir. En otra realización, los linfocitos T expresan o comprenden una caspasa inducible, p. ej., una caspasa 9 inducible (icaspasa9), p. ej., una proteína de fusión entre la caspasa 9 y la proteína de unión a FK506 humana que permite la dimerización usando un fármaco que es una molécula pequeña específica. Véase, Straathof et al., Blood 105(11):4247-4254 (2005).

4.7. Métodos para el uso de células que comprenden polipéptidos de muerte celular

Los linfocitos T, proporcionados en la presente memoria que comprenden polipéptidos de muerte celular y, opcionalmente, uno o más CAR, se pueden usar en un método para tratar a un individuo que tiene uno o más tipos de células que se desea tomar como diana por las células descritas en la presente memoria, p. ej., uno o más tipos de células que se desea matar. En determinadas realizaciones, las células que se van a matar son células cancerosas, p. ej., células tumorales. En realizaciones específicas, las células cancerosas son células de un tumor sólido. En realizaciones específicas, las células son células de un linfoma, un cáncer de pulmón, un cáncer de mama, un cáncer de próstata, un carcinoma adrenocortical, un carcinoma de tiroides, un carcinoma nasofaríngeo, un melanoma, p. ej., un melanoma maligno, un carcinoma de piel, un carcinoma colorrectal, un tumor desmoide, un tumor desmoplásico de células redondas pequeñas, un tumor endocrino, un sarcoma de Ewing, un tumor neuroectodérmico primitivo periférico, un tumor de células germinales sólido, un hepatoblastoma, un neuroblastoma, un sarcoma de tejido blando no rabdomiosarcoma, un osteosarcoma, un retinoblastoma, un rabdomiosarcoma, un tumor de Wilms, un glioblastoma, un mixoma, un fibroma, un lipoma o similares. En realizaciones más específicas, dicho linfoma puede ser leucemia linfocítica crónica (linfoma linfocítico pequeño), leucemia prolinfocítica de células B, linfoma linfoplasmocítico, macroglobulinemia de Waldenstróm, linfoma de zona marginal esplénica, mieloma de células plasmáticas, plasmacitoma, linfoma de células B de la zona marginal extraganglionar, linfoma MALT, linfoma de células B de la zona marginal ganglionar, linfoma folicular, linfoma de células del manto, linfoma difuso de células B grandes, linfoma mediastínico (tímico) de células B grandes, linfoma intravascular de células B grandes, linfoma de derrame primario, linfoma de Burkitt, leucemia prolinfocítica de linfocitos T, leucemia linfocítica granular grande de linfocitos T, leucemia agresiva de células NK, leucemia/linfoma de linfocitos T del adulto, linfoma de linfocitos NK/T extraganglionar de tipo nasal, linfoma de linfocitos T de tipo enteropatía, linfoma de linfocitos T hepatoesplénico, linfoma de células NK blásticas, micosis fungoide, síndrome de Sezary, linfoma de células grandes anaplásico cutáneo primario, papulosis linfomatoide, linfoma de linfocitos T angioinmunoblástica, linfoma de linfocitos T periférico (no especificado), linfoma anaplásico de células grandes, linfoma de Hodgkin o linfoma no de Hodgkin.

En determinadas realizaciones, cuando los linfocitos T modificados se administran a un sujeto que los necesita, la combinación del agente dimerizante y el polipéptido de muerte celular seleccionados se elige de manera que sean compatibles con la población de pacientes (o subpoblación ) a la que se han administrado dichos linfocitos T. Solo a modo de ejemplo, si el agente dimerizante seleccionado es el anticuerpo rituximab, entonces, en determinadas realizaciones, la población de pacientes son individuos que tienen un cáncer de células B, p. ej., linfoma de células B.

La eficacia de las células, p. ej., linfocitos T, después de la administración a un individuo que tiene una enfermedad o trastorno remediable por dichas células, p. ej., linfocitos T, p. ej., un individuo que tiene cáncer, puede evaluarse mediante uno o más criterios, específicos para la enfermedad o trastorno particular, conocidos por los expertos en la técnica, como indicativos del progreso de la enfermedad o trastorno. Generalmente, la administración de las células a dicho individuo es efectiva cuando uno o más de dichos criterios se mueven de forma detectable, p. ej., significativa, desde un valor o rango de estado de enfermedad a, o hacia, un valor o rango normal.

Las células, p. ej., linfocitos T, pueden formularse en cualquier disolución farmacéuticamente aceptable, preferiblemente una disolución adecuada para la administración de células vivas, p. ej., disolución salina (tal como disolución de Ringer), gelatinas, carbohidratos (p. ej., lactosa, amilosa, almidón, o similares), ésteres de ácidos grasos, hidroximetilcelulosa, polivinilpirrolidina, etc. Dichas preparaciones se esterilizan preferiblemente antes de la adición de las células y se pueden mezclar con agentes auxiliares tales como lubricantes, conservantes, estabilizadores, emulsionantes, sales para influir en la presión osmótica, tampones y colorantes. Los vehículos farmacéuticos adecuados para su uso en la formulación de las células son conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en WO 96/05309.

En determinadas realizaciones, los linfocitos T, se formulan en dosis individuales, en donde dichas dosis individuales comprenden al menos, como máximo, o aproximadamente 1x104, 5x104, 1x105, 5x105, 1x106, 5x106, 1x107, 5x107, 1x108, 5x108, 1x109, 5x109, 1x1010, 5x1010, o 1x10" linfocitos T. En determinadas realizaciones, los linfocitos T se formulan para administración intravenosa, intraarterial, parenteral, intramuscular, subcutánea, intratecal o intraocular, o administración en un órgano o tejido particular.

5. Ejemplos

5.1. Ejemplo 1: tratamiento del linfoma de células B

Un individuo se presenta con leucemia linfocítica crónica de células B, un linfoma de células B. El ensayo de las células B del individuo determina que las células B portan una deleción de 17p. Los linfocitos T se obtienen del individuo, se transfectan con un vector lentiviral que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un receptor de antígeno quimérico (CAR) y se transfectan con un segundo vector lentiviral que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de muerte celular dimerizable que comprende un dominio extracelular que comprende un mimotopo que puede unirse al anticuerpo rituximab y un dominio intracelular que comprende un dominio de caspasa 9. Los linfocitos T se expanden usando perlas recubiertas con CD3+CD28 en cantidades suficientes para la administración. El receptor quimérico comprende una región de unión a antígeno extracelular que se une a CD19; un dominio transmembrana de CTLA4; dominio coestimulador intracelular de CD28; y un dominio de CD3Z intracelular. Al individuo se le administran entre 109 y 1010 de los linfocitos T en 200 mL de disolución salina mediante infusión intravenosa durante 30 minutos. El individuo se monitoriza durante dos semanas posteriormente para establecer una reducción de al menos el 90 % de las células B CD19+ en la sangre del individuo. Cuando el paciente, después de la administración de los linfocitos T, muestra signos de malestar debido a los linfocitos T (p. ej., dificultad para respirar, fiebre, niveles anormales de citoquinas en suero, erupción cutánea o similares), se administra rituximab a una dosificación de 200-500 mg/m2 o hasta que los síntomas desaparezcan.

5.2. Ejemplo 2: tratamiento de un linfoma de células B

Un individuo se presenta con leucemia linfocítica crónica de células B, un linfoma de células B. El ensayo de las células B del individuo determina que las células B portan una deleción de 17p. Se obtienen aproximadamente 106 linfocitos T del individuo, se transfectan con un vector lentiviral que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de muerte celular que comprende un dominio extracelular que comprende un mimotopo que puede unirse al anticuerpo rituximab y un dominio intracelular que comprende un dominio de caspasa 8 y se transfectan con un vector lentiviral que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un CAR. El CAR comprende una región de unión a antígeno extracelular que se une a CD19; un dominio transmembrana de PD-1; dominio coestimulador intracelular de CD28; y un dominio de CD3Z intracelular. Los linfocitos T que expresan CAR se administran al individuo sin expansión previa de los linfocitos T. Al individuo se le administran entre 105 y 106 de los linfocitos T en 200 mL de disolución salina mediante infusión intravenosa durante 30 minutos. El individuo se monitoriza durante dos semanas posteriormente para establecer una reducción de al menos el 90 % de las células B CD19+ en la sangre del individuo. Cuando el paciente, después de la administración de los linfocitos T, muestra signos de malestar debido a los linfocitos T (p. ej., dificultad para respirar, fiebre, niveles anormales de citoquinas en suero, erupción cutánea o similares), se administra rituximab a una dosificación de 200-500 mg/m2 o hasta que los síntomas desaparezcan.

5.3. Ejemplo 3: tratamiento del linfoma de células B

Un individuo se presenta con leucemia linfocítica crónica de células B, un linfoma de células B. El ensayo de las células B del individuo determina que las células B portan una deleción de p53. Los linfocitos T se obtienen del individuo, se transfectan con un vector lentiviral que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de muerte celular que comprende un dominio extracelular que comprende un epítopo que puede unirse al anticuerpo rituximab y un dominio intracelular que comprende un dominio de caspasa 3, y se transfectan con un vector lentiviral que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un CAR. Los linfocitos T se expanden usando perlas recubiertas con CD3+CD28 en cantidades suficientes para la administración. El CAR comprende una región de unión a antígeno extracelular que se une a CD19; un dominio transmembrana de CTLA4; dominios coestimuladores intracelulares de cada uno de CD28, 4-1BB y OX40; y un dominio intracelular de CD3Z. Al individuo se le administran entre 109 y 1010 de los linfocitos T en 200 mL de disolución salina mediante infusión intravenosa durante 30 minutos. El individuo se monitoriza durante dos semanas posteriormente para establecer una reducción de al menos el 90 % de las células B CD19+ en la sangre del individuo. Cuando el paciente, después de la administración de los linfocitos T, muestra signos de malestar debido a los linfocitos T (p. ej., dificultad para respirar, fiebre, niveles anormales de citoquinas en suero, erupción cutánea o similares), se administra rituximab a una dosificación de 200-500 mg/m2 o hasta que los síntomas desaparezcan.

5.4. Ejemplo 4: tratamiento de un linfoma de células B

Un individuo se presenta con leucemia linfocítica crónica de células B, un linfoma de células B. El ensayo de las células B del individuo determina que las células B portan una deleción de p53. Se obtienen aproximadamente 106 linfocitos T del individuo, se transfectan con un vector lentiviral que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de muerte celular que comprende un dominio extracelular que comprende un epítopo que puede unirse al anticuerpo rituximab y un dominio intracelular que comprende un dominio de caspasa 9 y se transfectan con un vector lentiviral que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un CAR. El CAR comprende una región de unión a antígeno extracelular que se une a CD19; un dominio transmembrana de PD-1; dominios coestimuladores intracelulares de cada uno de CD28, 4-1BB y OX40; y un dominio intracelular de CD3Z. Los linfocitos T que expresan CAR se administran al individuo sin expansión previa de los linfocitos T. Al individuo se le administran entre 105 y 106 de los linfocitos T en 200 mL de disolución salina mediante infusión intravenosa durante 30 minutos. El individuo se monitoriza durante dos semanas posteriormente para establecer una reducción de al menos el 90 % de las células B CD19+ en la sangre del individuo. Cuando el paciente, después de la administración de los linfocitos T, muestra signos de malestar debido a los linfocitos T (p. ej., dificultad para respirar, fiebre, niveles anormales de citoquinas en suero, erupción cutánea o similares), se administra rituximab a una dosificación de 200-500 mg/m2 o hasta que los síntomas desaparezcan.

5.5. Ejemplo 5: tratamiento de cáncer de próstata

Un individuo se presenta con cáncer de próstata en estadio T2, sin diseminación a los ganglios linfáticos regionales u otros (N0, M0). Se determina que el grado histológico es G2. Globalmente, se determina que el individuo tiene cáncer de próstata en estadio II. Al individuo se le administran entre 109 y 1010 linfocitos T que comprenden un CAR, en 200 mL de disolución salina mediante infusión intravenosa durante 30 minutos. El CAR comprende una región de unión a antígeno extracelular que se une a PSCA, un dominio transmembrana de CTLA4, dominio coestimulador intracelular de CD28 y un dominio intracelular de CD3Z. Los linfocitos T también comprenden un polipéptido de muerte celular que comprende un dominio extracelular que comprende un epítopo que puede unirse al anticuerpo rituximab, y un dominio intracelular que comprende un dominio de caspasa 3, caspasa 8 o caspasa 9. El individuo se vuelve a evaluar para determinar el estadio del cáncer de próstata y la diseminación a los ganglios linfáticos, y se realiza la histología del tejido prostático biopsiado, a los 30, 60 y 90 días después de la administración. Cuando el paciente, después de la administración de los linfocitos T, muestra signos de malestar debido a los linfocitos T (p. ej., dificultad para respirar, fiebre, niveles anormales de citoquinas en suero, erupción cutánea o similares), se administra rituximab a una dosificación de 200-500 mg/m2 o hasta que los síntomas desaparezcan.

5.6. Ejemplo 6: tratamiento de cáncer de próstata

Un individuo se presenta con cáncer de próstata en estadio T2, sin diseminación a los ganglios linfáticos regionales u otros (N0, M0). Se determina que el grado histológico es G2. Globalmente, se determina que el individuo tiene cáncer de próstata en estadio II. Al individuo se le administran entre 109 y 1010 linfocitos T que comprenden un CAR, en 200 mL de disolución salina mediante infusión intravenosa durante 30 minutos. El CAR comprende una región de unión a antígeno extracelular que se une a PSCA, un dominio transmembrana de PD-1, dominio coestimulador intracelular de CD28 y un dominio intracelular de CD3Z. Los linfocitos T también comprenden un polipéptido de muerte celular que comprende un dominio extracelular que comprende un epítopo que puede unirse al anticuerpo rituximab, y un dominio intracelular que comprende un dominio de caspasa 3, caspasa 8 o caspasa 9. El individuo se vuelve a evaluar para determinar el estadio del cáncer de próstata y la diseminación a los ganglios linfáticos, y se realiza la histología del tejido prostático biopsiado, a los 30, 60 y 90 días después de la administración. Cuando el paciente, después de la administración de los linfocitos T, muestra signos de malestar debido a los linfocitos T (p. ej., dificultad para respirar, fiebre, niveles anormales de citoquinas en suero, erupción cutánea o similares), se administra rituximab a una dosificación de 200-500 mg/m2 o hasta que los síntomas desaparezcan.

5.7. Ejemplo 7: tratamiento de cáncer de próstata

Un individuo se presenta con cáncer de próstata en estadio T2, sin diseminación a los ganglios linfáticos regionales u otros (N0, M0). Se determina que el grado histológico es G2. Globalmente, se determina que el individuo tiene cáncer de próstata en estadio II. Al individuo se le administran entre 109 y 1010 linfocitos T que comprenden un CAR, en 200 mL de disolución salina mediante infusión intravenosa durante 30 minutos. El CAR comprende una región de unión a antígeno extracelular que se une a PSCA, un dominio transmembrana de CTLA-4, dominios coestimuladores intracelulares de cada uno de CD28, 4-1BB y OX40, y un dominio intracelular de CD3Z. Los linfocitos T también comprenden un polipéptido de muerte celular que comprende un dominio extracelular que comprende un epítopo que puede unirse al anticuerpo rituximab, y un dominio intracelular que comprende un dominio de caspasa 3, caspasa 8 o caspasa 9. El individuo se vuelve a evaluar para determinar el estadio del cáncer de próstata y la diseminación a los ganglios linfáticos, y se realiza la histología del tejido prostático biopsiado, a los 30, 60 y 90 días después de la administración. Cuando el paciente, después de la administración de los linfocitos T, muestra signos de malestar debido a los linfocitos T (p. ej., dificultad para respirar, fiebre, niveles anormales de citoquinas en suero, erupción cutánea o similares), se administra rituximab a una dosificación de 200-500 mg/m2 o hasta que los síntomas desaparezcan.

5.8. Ejemplo 8: tratamiento de cáncer de próstata

Un individuo se presenta con cáncer de próstata en estadio T2, sin diseminación a los ganglios linfáticos regionales u otros (N0, M0). Se determina que el grado histológico es G2. Globalmente, se determina que el individuo tiene cáncer de próstata en estadio II. Al individuo se le administran entre 109 y 1010 linfocitos T que comprenden un CAR, en 200 mL de disolución salina mediante infusión intravenosa durante 30 minutos. El CAR comprende una región de unión a antígeno extracelular que se une a PSCA, un dominio transmembrana de PD-1, dominios coestimuladores intracelulares de cada uno de CD28, 4-1BB y OX40, y un dominio intracelular de CD3Z. Los linfocitos T también comprenden un polipéptido de muerte celular que comprende un dominio extracelular que comprende un epítopo que puede unirse al anticuerpo rituximab, y un dominio intracelular que comprende un dominio de caspasa 3, caspasa 8 o caspasa 9. El individuo se vuelve a evaluar para determinar el estadio del cáncer de próstata y la diseminación a los ganglios linfáticos, y se realiza la histología del tejido prostático biopsiado, a los 30, 60 y 90 días después de la administración. Cuando el paciente, después de la administración de los linfocitos T, muestra signos de malestar debido a los linfocitos T (p. ej., dificultad para respirar, fiebre, niveles anormales de citoquinas en suero, erupción cutánea o similares), se administra rituximab a una dosificación de 200-500 mg/m2 o hasta que los síntomas desaparezcan.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un linfocito T que comprende un polipéptido de muerte celular artificial que comprende un dominio inductor de la apoptosis, en donde dicho polipéptido es dimerizable usando un anticuerpo, y en donde cuando dicho anticuerpo dimeriza dicho polipéptido, se genera en dicho linfocito T una señal inductora de la apoptosis, en donde dicho polipéptido de muerte celular artificial es una proteína transmembrana que comprende un dominio extracelular que comprende un epítopo o mimotopo, un dominio transmembrana, y un dominio intracelular que comprende dicho dominio inductor de la apoptosis, en donde dicho dominio inductor de la apoptosis es o comprende caspasa 3, caspasa 8 o caspasa 9, y en donde

2. El linfocito T de la reivindicación 1, en donde cuando dicho anticuerpo se une a dicho epítopo o mimotopo en al menos dos de dichos polipéptidos de muerte celular artificiales, los dominios intracelulares de dichos polipéptidos se dimerizan y generan una señal inductora de la apoptosis añadida suficiente como para matar a dicho linfocito T.

3. El linfocito T de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en donde dicho linfocito T comprende adicionalmente un receptor de antígeno quimérico (CAR) que reconoce un antígeno en una célula tumoral.

4. El linfocito T de la reivindicación 3, en donde dicha célula tumoral es una célula de un tumor sólido o una célula de un cáncer sanguíneo.

5. El linfocito T de la reivindicación 3 o 4, en donde dicho antígeno en una célula tumoral es Her2, antígeno de células madre de próstata (PSCA), alfa-fetoproteína (AFP), antígeno carcinoembrionario (CEA), antígeno de cáncer 125 (CA-125), CA19-9, calretinina, MUC-1, proteína de la membrana epitelial (EMA), antígeno tumoral epitelial (ETA), tirosinasa, antígeno asociado al melanoma (MAGE), CD34, CD45, CD99, CD117, cromogranina, citoqueratina, desmina, proteína ácida fibrilar glial (GFAP), proteína del líquido de la enfermedad quística macroscópica (GCDFP-15), antígeno HMB-45, proteína melan-A (antígeno de melanoma reconocido por los linfocitos T; MART-1), mio-D1, actina específica de músculo (MSA), neurofilamento, enolasa específica de neuronas (NSE), fosfatasa alcalina placentaria, sinaptofisis, tiroglobulina, factor de transcripción tiroideo 1, la forma dimérica de la isoenzima de la piruvato quinasa tipo M2 (M2-PK tumoral), una proteína ras anormal o una proteína p53 anormal.

6. Un linfocito T como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5 para su uso en un método de tratamiento de un tumor.

7. El linfocito T para su uso de la reivindicación 6, en donde el tumor es un tumor sólido o un cáncer sanguíneo.

8. El linfocito T para su uso de la reivindicación 7, en donde el tumor es un linfoma, un cáncer de pulmón, un cáncer de mama, un cáncer de próstata, un carcinoma adrenocortical, un carcinoma de tiroides, un carcinoma nasofaríngeo, un melanoma, un melanoma maligno, un carcinoma de piel, un carcinoma colorrectal, un tumor desmoide, un tumor desmoplásico de células redondas pequeñas, un tumor endocrino, un sarcoma de Ewing, un tumor neuroectodérmico periférico primitivo, un tumor de células germinales sólido, un hepatoblastoma, un neuroblastoma, un sarcoma de tejido blando no rabdomiosarcoma, un osteosarcoma, un retinoblastoma, un rabdomiosarcoma, un tumor de Wilms, un glioblastoma, un mixoma, un fibroma o un lipoma.

9. El linfocito T para su uso de la reivindicación 8, en donde dicho tumor es un linfoma, y dicho linfoma es leucemia linfocítica crónica (linfoma linfocítico pequeño), leucemia prolinfocítica de células B, linfoma linfoplasmocítico, macroglobulinemia de Waldenstróm, linfoma de zona marginal esplénica, mieloma de células plasmáticas, plasmacitoma, linfoma de células B de la zona marginal extraganglionar, linfoma MALT, linfoma de células B de la zona marginal ganglionar, linfoma folicular, linfoma de células del manto, linfoma difuso de células B grandes, linfoma mediastínico (tímico) de células B grandes, linfoma intravascular de células B grandes, linfoma de derrame primario, linfoma de Burkitt, leucemia prolinfocítica de linfocitos T, leucemia linfocítica granular grande de linfocitos T, leucemia agresiva de células NK, leucemia/linfoma de linfocitos T del adulto, linfoma de linfocitos NK/T extraganglionar de tipo nasal, linfoma de linfocitos T de tipo enteropatía, linfoma de linfocitos T hepatoesplénico, linfoma de células NK blásticas, micosis fungoide, síndrome de Sezary, linfoma de células grandes anaplásico cutáneo primario, papulosis linfomatoide, linfoma de linfocitos T angioinmunoblástica, linfoma de linfocitos T periférico (no especificado), linfoma anaplásico de células grandes, linfoma de Hodgkin o linfoma no de Hodgkin.

10. Un anticuerpo como se define en la reivindicación 1 para su uso en un método para el tratamiento de un paciente, en donde el método comprende la muerte terapéutica del linfocito T de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 mediante la administración del anticuerpo al paciente, y en donde el método es para su uso en el caso en el que la administración del linfocito T cause efectos no deseados o perjudiciales en el paciente que recibe el linfocito T o en el caso en el que la presencia del linfocito T en el paciente ya no sea necesaria.