CN102031267B - 一种caspase-ERLBD融合基因 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种caspase-ERLBD融合基因，由caspase8基因与ERα的配体结合区基因连接而成，caspase-ERLBD融合基因表达的融合蛋白caspase-ERLBD能够识别雌激素并特异性的与其结合。触发融合蛋白caspase-ERLBD的二聚化，使融合蛋白中的caspase通过分子间交互切割而活化，使其中的caspase发生分子间切割而活化，促进细胞凋亡。与现有的肿瘤细胞“自杀基因”相比，本发明利用细胞内的天然小分子物质雌激素诱导死亡分子caspase的活化和细胞死亡，因此无需再像其他“自杀基因”系统一样，在导入并表达“自杀基因”的同时，还要其他的外源药物诱导，从而避免了药物潜在的毒副作用，或者caspase的聚集活化不受调控的缺陷。
Description
技术领域
本发明属于细胞凋亡调控技术领域，涉及一种caspase-ERLBD融合基因。
背景技术
1、Caspase与细胞凋亡信号传递
细胞凋亡作为一种自发的程序化的死亡过程，在多细胞生物的组织分化、器官发育、机体稳态的维持中有着重要意义，并参与多种疾病的病理过程。半胱天冬酶(caspase)是不同凋亡途径中共同的末端蛋白酶，目前该家族已发现了14个成员，它们都具有相似的结构和功能，如活性位点含有半胱氨酸，识别蛋白质中特定的四肽序列，并在天冬氨酸羧基侧切割底物等。caspase在细胞中以酶原形式存在，包含1个N端原结构域(prodomain)、大亚基和小亚基。在上游凋亡信号作用下，caspases被切割活化，游离的大、小亚基结合成活性caspase分子，引发细胞凋亡。
根据caspases的结构及作用底物不同，分为两类：①起始caspase(上游caspase)，如caspase-2，-8，-10等，具有长的原结构域，在上游信号的作用下，分子间借助该结构域发生同源聚集并活化，活化后作用于下游caspase；②效应caspase(下游caspase)，如caspase-3，-6，-7等，原结构域较短，可被上游caspases活化，在稳定聚集时也可相互切割活化，活化后广泛作用于细胞结构和功能蛋白，诱发细胞凋亡。
细胞发生凋亡时，caspase可以通过多种信号途径被激活。细胞表面存在着一类以Fas为代表的“死亡受体”，属表皮生长因子受体超家族。细胞外的凋亡信号，如细胞毒性淋巴细胞(CTL)等分泌的Fas配体(FasL)与Fas结合，引起Fas分子三价聚集，Fas通过接头分子FADD(Fas-associated deathdomain)募集具有较长原结构域的caspase8，使后者也发生同源聚集，并通过分子间的相互切割而活化，进一步激活下游效应caspase(caspase-3，-6，-7等)，形成一种级联反应，将凋亡的信号扩大。
近年来的研究表明，在上游信号的诱导下，起始caspase分子相互接近，并形成同源二聚体是caspase活化的关键步骤，同时在适当条件下，同源聚集的效应caspase(如caspase-3)也可以发生活化。活化的效应caspase作用于细胞内多种底物蛋白，导致细胞骨架和核纤层解体，中断DNA复制和修复并降解染色体DNA，阻止mRNA拼接，促进凋亡小体的形成。另外，射线照射和细胞毒物质等也可以诱发细胞凋亡，这类凋亡信号途径通常需要线粒体参与。线粒体释放的细胞色素C与接头分子Apaf-1一起激活caspase-9，进而活化效应caspase，引起细胞凋亡。
2、Caspase聚集活化的诱导模型
随着细胞中caspase分子活化的内在机制的阐明，人们试图通过人为的诱导caspase分子之间的聚集而活化这些分子，诱导细胞凋亡，从而有效地杀伤肿瘤细胞。有研究者将大环内脂类药物FK506的结合结构域与caspase融合，然后应用FK506的二聚体FK1012，可以有效地促进caspase的二聚化和切割活化(Yang X，Chang HY，Baltimore D.Autoproteolytic activation ofpro-caspases by oligomerization，Mol Cell 1998；1：319-325)，而利用抗体的Fc片段和caspase融合诱导后者聚集的研究也有报道(Shi Y.Caspase activation：revisiting the induced proximity model.Cell，2004；117：855-858)。但上述这些方法或者需要依赖外源药物诱导，从而增加了药物潜在的毒副作用，或者caspase的聚集活化不受调控，因此限制了它们在肿瘤治疗中的成功应用。
3、雌激素-雌激素受体信号途径与肿瘤的发生
雌激素是由卵巢等组织分泌的类固醇激素，它通过与机体多种靶组织细胞中的受体结合，对生殖系统、乳腺、骨骼、神经及心血管系统的发育和功能发挥调节作用。雌激素在临床上被用于预防和治疗更年期综合症、骨质疏松、心血管疾病等，但体内长期高水平雌激素的刺激可导致许多组织的癌变。
研究表明，雌二醇(estradiol，E2)及其几种代谢产物是诱发乳腺癌、子宫内膜癌的重要因素。另外，人们很早就发现，雌激素受体(ER)的过表达与乳腺癌和一些妇科肿瘤的发生相关，雌激素与其受体结合成为具有活性的转录因子，启动多种基因的转录，促进细胞增殖并抑制细胞凋亡信号通路。同时，它也是化疗时肿瘤产生耐药性的重要原因(Hall JM，Couse JF，KorachKS.The multifaceted mechanisms of estradiol and estrogen receptor signaling.J Biol Chem，2001；276：36869-36872)。近年来出现了一类选择性激素调节剂(SERMs)，如三苯氧胺(tamoxifen)、TAT-59等，它们多通过与雌激素竞争结合受体而消除雌激素的致癌效应，但有实验表明，三苯氧胺长期应用也有类似雌激素的副作用(Norris JD，Paige LA，Christensen DJ，et al.Peptideantagonists of the human estrogen receptor.Science，1999；285：744-6)。
ER是甾醇类激素受体的一种，定位于细胞核以及细胞质中，现已发现了ER-α、ER-β两种结构类型。ER两种亚型表达的组织特异性，以及不同细胞表达的辅激活因子的差异，是雌激素-雌激素受体信号途径具有多种生物学效应的重要原因。
成熟ER-α蛋白包含4个功能结构域：N端的主要转录功能区；DNA结合区，并与蛋白质的细胞核定位有关；激素结合区；C端的激素依赖性二聚化及转录功能区。另外，肿瘤和正常人体细胞中均有ER的变异体存在。ER在细胞中通常与热休克蛋白HSP90结合而不具有转录激活活性，当与激素等配体结合后，构象发生变化，与HSP90解离，形成稳定的二聚体，并与DNA中具有回文结构的特定元件(ERE)结合，随后ER可以通过不同的辅激活因子与靶基因的转录元件相互作用，启动基因转录。
除了依赖配体的经典途径外，一些多肽类激素经过细胞内信号传递，也可以通过磷酸化而激活ER，促进下游靶基因的表达。另外，ER还可以与Fos、Jun等蛋白作用，并与DNA上的AP-1位点结合影响转录，在这方面，ER-α和ER-β的作用相反，前者启动转录，后者则抑制转录。雌激素-雌激素受体复合物还通过与MAPK和磷脂酰肌醇3-激酶/Akt途径相互作用，以一种非转录依赖的方式调节骨骼、心血管系统的发育和功能。
发明内容
本发明解决的技术问题在于提供一种caspase-ERLBD融合基因，该融合基因作为一种自杀性基因，所表达的蛋白能够识别雌激素并特异性的与其结合，在雌激素的诱导下能够发生聚集活化。
本发明是通过以下技术方案来实现：
一种caspase-ERLBD融合基因，由caspase8基因与ERα的配体结合区基因连接而成，caspase-ERLBD融合基因表达的融合蛋白caspase-ERLBD能够识别雌激素并特异性的与其结合。
所述的融合蛋白caspase-ERLBD与雌激素结合后，触发融合蛋白caspase-ERLBD的二聚化，使融合蛋白中的caspase通过分子间交互切割而活化。
所述的caspase-ERLBD融合基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。
所述的雌激素能够特异性的结合于转染caspase-ERLBD融合基因并表达caspase-ERLBD融合蛋白的细胞。
所述的雌激素与表达caspase-ERLBD融合蛋白的细胞结合后，触发融合蛋白caspase-ERLBD的二聚化，使融合蛋白中的caspase通过分子间交互切割而活化，诱导细胞凋亡。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
1、本发明所构建的caspase8-ERLBD融合基因，通过将caspase8基因与ERα的配体结合区基因连接，caspase-ERLBD融合基因表达的融合蛋白caspase-ERLBD能够识别雌激素并特异性的与其结合，触发融合蛋白caspase-ERLBD的二聚化，使融合蛋白中的caspase通过分子间交互切割而活化，使其中的caspase发生分子间切割而活化，促进细胞凋亡。
Western blot检测道路了融合基因表达后的融合蛋白在收到E2诱导之后的二聚化，并且非变性蛋白质凝胶电泳实验检测到二聚化后的融合蛋白发生了切割活化，caspase8被切割成大亚基和小亚基两部分。进一步，证实了在E2诱导下，转染了caspase-ERLBD融合基因的肿瘤细胞的增殖在体内、体外受到了明显的抑制，caspase-ERLBD融合基因能够促进细胞凋亡。
2、与现有的肿瘤细胞“自杀基因”相比，本发明利用细胞内的天然小分子物质雌激素诱导死亡分子caspase的活化和细胞死亡，因此无需再像其他“自杀基因”系统一样，在导入并表达“自杀基因”的同时，还要其他的外源药物诱导。从而避免了药物潜在的毒副作用，或者caspase的聚集活化不受调控的缺陷。
3、与现有的诱导caspase活化的模型相比，本发明利用雌激素诱导caspase的聚集、切割和活化，由于雌激素已经被证实与乳腺癌等多种肿瘤的发生呈现正相关，因此本发明构建的融合基因在转入细胞后可望逆转雌激素促进细胞增殖和癌变的效应。
4、与现有的雌激素受体靶向的肿瘤治疗药物(如tamoxifen)相比，本发明构建的caspase-ERLBD融合蛋白，不仅仅是简单地封闭雌激素受体的功能和雌激素信号途径，而是利用雌激素诱导表达融合蛋白的肿瘤细胞发生凋亡，因而能够有效地杀伤肿瘤细胞。
附图说明
图1为caspase-ERLBD融合基因构成示意图。
图2为Western blot(caspase8抗体)检测融合基因转染的细胞中融合蛋白的表达。
图3为非变性聚丙烯酰胺电泳证实融合蛋白二聚体的形成。
图4为免疫共沉淀证实100nmol/L E2诱导下融合蛋白的聚集，其中融合蛋白分别带有Flag和His标签。
图5为Western blot检测100nmol/L雌二醇(E2)诱导前后转染细胞中caspase8的加工剪切。
图6为MTT法检测100nmol/L E2诱导前后转染细胞的增殖。
图7为Annexin V和PI染色后流式细胞术检测细胞凋亡(Annexin V+和PI-细胞为早期凋亡细胞)。
图8为caspase8-ERLBD融合基因转染细胞和未经转染细胞皮下接种裸鼠形成的肿瘤。
图9为两周一次100nmol/L雌二醇(E2)或生理盐水(ctrl)瘤内注射对肿瘤生长的影响。
图10为肿瘤组织HE、免疫荧光和TUNEL染色结果图。
具体实施方式
下面结合融合基因及其表达载体的构建、融合基因表达后的融合蛋白及其收到诱导后的二聚化、分子间切割活化的检测、转染了caspase-ERLBD融合基因的肿瘤细胞的促细胞凋亡的检测和验证，对本发明做进一步详细描述，所述是对本发明的解释而不是限定。
1、Caspase8-ERLBD融合基因的制备和表达载体的构建
1.1Caspase8-ERLBD融合基因的制备
通过KpnI/XhoI酶切位点将人工克隆的人ERα基因亚克隆入pcDNA3表达载体，获得pcDNA3-ERα表达载体。
人caspase8基因(GenBank登录号：NM_033356)分为C8-1和C8-2两个片段分别从人淋巴瘤Jurkat细胞中克隆：在提取Jurkat细胞的总RNA之后，反转录成cDNA；以cDNA为模板，分别用C8-1F、C8-1R作为引物对以及C8-2F、C8-2R作为引物对(引物序列如表1所示)，PCR扩增C8-1和C8-2片段。
将扩增的C8-1和C8-2片段分别用HindIII/NcoI和NcoI/KpnI进行双酶切，酶切之后连接得到带黏性末端的C8(Caspase8)基因片段，并将其通过HindIII/KpnI酶切位点克隆入pcDNA3-ERα表达载体，得到pcDNA3-C8/ER表达载体，并测序证实其序列插入正确。
为了获得caspase8和ERαLBD融合基因，首先用CE-1F和CER作为引物对(引物序列如表1所示)，以pcDNA3-C8/ER载体为模板，PCR扩增获得长度为417bp的第一片段；其次，以所获的第一片段为模板，用CE-2F和CER作为引物对，PCR扩增获得长度为443bp的第二片段；然后将被NcoI/KpnI酶切后的第二片段，与pcDNA3-C8/ER载体用NcoI/XbaI酶切后获得的长度为610bp的第三片段连接，获得带KpnI/XbaI黏性末端的第四片段；再将第四片段通过KpnI/XbaI酶切位点克隆入pcDNA3-C8/ER载体，获得pcDNA3-C8/ERL载体，并测序证实插入序列正确；与pcDNA3序列比对，获得caspase8基因与ERα的配体结合区基因连接而成的caspase8-ERLBD融合基因(C8/ERL)，融合基因的结构示意图如图1所示，其具体的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。
1.2含有标签的融合基因表达载体的构建
为了构建含有标签的融合蛋白表达载体，以pcDNA3-C8/ERL载体为模板，以用C8-3F和ERR为引物对进行PCR扩增，获得融合基因C8/ERL片段，并通过BamHI/SalI酶切位点将扩增的C8/ERL片段连接入pBabe-puro载体，获得含有Flag标签的pBP-Flag-C8/ERL载体；
以pcDNA3-C8/ERL载体为模板，分别用MCE-1F和MCE-1R作为引物对、MCE-2F和FCER作为引物对进行PCR扩增，所获得的长度为680bp的第五片段和长度为600bp的第六片段；用EcoRI/ApaI酶切pcDNA3-C8/ERL载体，并将所获的1.8kb片段通过EcoRI/ApaI位点克隆入pcDNA3/Myc-His A载体，然后再通过XbaI/ApaI位点和BamHI/EcoRI位点，分别将酶切后的第五片段和第六片段克隆入载体，终获得含Myc、His标签的pHis-C8/ERL载体。
上述1.1和1.2在融合基因和其表达载体过程所用引物序列如表1所示：
表1引物序列表
*表1中，名称以“F”结尾的引物为上游引物，以“R”结尾的为下游引物。
2、caspase8-ERLBD融合蛋白的体外转染和表达
在体外用不含雌激素的血清培养人乳腺癌MDA-MB-231细胞(已知ER阴性)，通过脂质体转染法，将表达载体pcDNA3-C8/ERL用脂质体法(lipofectamine2000，Invitrogen公司)转染进入人乳腺癌细胞MDA-MB-231，并用400μg/mL G418筛选，建立表达载体阳性转染的细胞系。
以购自Cell Signaling Technology公司的caspase8抗体作为一抗，通过Western blot检测构建的阳性转染的细胞中融合基因的表达。结果如图2所示，其中C8/ER、C8/ERL融合基因通过载体转染宿主细胞之后，融合蛋白C8/ER、C8-ERL(caspase-ERLBD)均得到了表达，如泳道左2、左3所示。
3、雌激素等配体诱导的caspase8-ERLBD融合蛋白的加工、聚集和切割活化
在表达载体pcDNA3-C8/ERL阳性转染的MDA-MB-231细胞系中加入100nmol/L的雌激素(雌二醇，E2)进行诱导，当细胞表达的融合蛋白C8/ERL受到雌激素的诱导之后，融合蛋白C8/ERL发生二聚化而发生聚集。
应用非变性蛋白质凝胶电泳和Western blot实验，检测融合蛋白C8/ERL的二聚化，检测结果如图3所示，其中转染空载体组(mock和mock+E2)未检测到ER或融合蛋白的表达，而转染C8/ERL融合基因的细胞中检测到了融合蛋白单体(monomer)的表达(C8/ERL)，加入E2后，融合蛋白形成了二聚体的表达(dimer，C8/ERL+E2)。融合蛋白C8/ERL单体的分子量为90KD左右，而二聚体的分子量为约180KD，从而证实了融合蛋白在雌二醇的诱导下发生了二聚化的聚集。
进一步分别用C8/ERL融合基因与Flag和His标签连接的表达载体pBP-Flag-C8/ERL和pHis-C8/ERL共转染人乳腺癌MCF-7细胞，应用针对His和Flag标签的抗体(购自Sigma公司)，对添加或不添加E2诱导转染细胞分别进行免疫共沉淀实验，检测与标签连接的融合蛋白C8/ERL是否在E2的诱导下发生二聚化的聚集。检测结果如图4所示，其中“+”表示转染并表达相应融合基因(Flag-C8/ERL或His-C8/ERL)或加入相应试剂(E2)，“-”则相反。“IP”为用来做免疫沉淀的抗体，“IB”则为用来做免疫印迹杂交的抗体。
结果显示，只有在共转染两种融合基因并加入E2的情况下，用抗His的抗体进行免疫沉淀，沉淀物用抗Flag的抗体进行免疫印迹检测，得到预期的条带(IP：His，IB：Flag)，从而表明带有两种标记的融合蛋白在细胞中共表达后可以在E2的诱导下发生结合，即融合蛋白在雌激素诱导下发生了聚集。而将免疫沉淀和免疫印迹的抗体交换，也获得了预期条带(IP：Flag，IB：His)，证实了上述结论。
更进一步，应用识别位于大亚基的特定抗原表位的caspase-8抗体进行Western blot实验，检测表达融合蛋白C8/ERL的细胞与雌激素结合触发而聚化活化后caspase8的切割活化。检测结果如图5所示，以不添加E2诱导的C8/ERL、C8/ER融合基因阳性转染细胞，以及添加E2诱导的C8/ER阳性转染细胞作为对比；不添加E2诱导时，90KD的C8/ERL融合蛋白得到了表达，在添加E2进行诱导后，90KD的C8/ERL发生二聚化活化切割，caspase8被切割成大亚基和小亚基两部分，在图中可以看到18KD的大亚基，而小亚基与ERL连接(约43KD)。同时，活化的融合蛋白还可以进一步切割细胞中内源表达的caspase8(55KD)。
4、在E2诱导下的caspase-ERLBD融合基因的促细胞凋亡
4.1caspase-ERLBD融合基因体外促体外细胞凋亡
在转染pcDNA3-C8/ERL表达载体的MCF-7、T47D、SKBr-3细胞系中分别加入100nmol/L的E2诱导24小时，同时以转染空载体的细胞(Ctrl)和不加E2的细胞(E2-)作为对照细胞。
通过MTT法检测细胞的增殖情况，检测结果具体如图6所示，其中，横坐标为检测时间(h)，纵坐标为490nm光吸收值，它与存活细胞的数目成正比。可以看出在不同的细胞系检测当中，作为对照的细胞在不添加或添加E2的情况下细胞增殖情况一致，而阳性转染细胞在添加E2之后细胞增殖受到抑制，尤其是结束诱导48h之后MCF-7、T47D、SKBr-3细胞增殖均明显受到抑制。
用AnnexinV和PI对细胞进行染色，用流式细胞术分析细胞凋亡的情况，其中AnnexinV和PI阴性细胞为正常细胞，AnnexinV阳性PI阴性细胞为早期凋亡细胞，AnnexinV和PI阳性细胞为晚期凋亡或坏死细胞。检测结果如图7所示，其中横座标显示AnnexinV着色情况，纵座标显示PI着色情况，因此，落在第三象限的细胞为正常细胞，落在第四象限的细胞为早期凋亡细胞，落在第一象限的细胞为晚期凋亡和坏死的细胞。可以看出对照细胞在添加E2诱导前后凋亡细胞的数量未发生明显变化，而转染C8/ERL融合基因的MCF-7、T47D、SKBr-3细胞在添加E2细胞进行诱导之后，与未诱导相比较，凋亡细胞的比率明显增加。
上述结果证实，在雌激素诱导之后，可以有效地促进MCF-7、T47D、SKBr-3细胞中通过转染表达的caspase8-ERLBD融合蛋白发生聚集，并通过分子间的交互切割而使其中的caspase8活化，诱发细胞凋亡，从而可以逆转雌激素依赖的肿瘤细胞中雌激素-受体信号促进细胞增殖的作用。
4.2caspase-ERLBD融合基因体内促体外细胞凋亡
应用人乳腺癌SKBr-3和MCF-7细胞系进行体内成瘤和肿瘤抑制实验。在裸鼠右后肢皮下分别注射对照细胞(经空载体转染的细胞，ctrl)和稳定转染caspase-ERLBD融合基因的细胞，建立移植瘤动物模型。通过瘤内或静脉注射100nmol/L的E2(每次100μl，每周2次，持续注射)，以注射相同体积的生理盐水做为对照。
每隔3天测量肿瘤的最大径(a)和最小径(b)，并按照公式V＝a×b2/2计算肿瘤体积，待第一次注射33天后剥瘤称重，具体结果如图8、图9所示。图8为不同处理组肿瘤的大小比较，图9为肿瘤在体内的生长情况，其中曲线图横坐标为第一次E2注射后的天数，纵坐标为肿瘤的体积，直方图横坐标为第一次E2注射后的天数，纵坐标为剥瘤测得的肿瘤重量与小鼠体重的比值。
可以看出，随着时间的延长，肿瘤的体积逐渐增大；对照组细胞以及未注射E2的C8/ERL转染细胞在不同的时间检测，其形成肿瘤的大小基本保持一致，而C8/ERL转染细胞E2诱导之后，在各个检测时间点的肿瘤体积和均有减小，生长33天时肿瘤重量与体重的比值也显著小于上述对照组，表明肿瘤在体内的生长得到了抑制。这说明在雌激素诱导下，caspase-ERLBD融合蛋白对体内肿瘤生长具有明显的抑制作用。
对取出的肿瘤组织切片，进行HE、免疫荧光染色，并通过TUNEL染色检测细胞的凋亡，具体结果如图10所示(其中左图为PI衬染的细胞核)。其中，所有细胞caspase-8染色均为阳性，显示内源caspase-8的组成性表达；MCF-7细胞ER染色阳性，同时转染融合基因的SKBr-3细胞也呈现ER染色阳性，显示融合蛋白得到了表达。同时，与对照组相比，表达融合蛋白的细胞在E2诱导下，TUNEL染色阳性的细胞明显增加，细胞核结构遭到破坏，这表明在受到E2诱导之后，caspase-ERLBD融合基因可以显著促进在体肿瘤细胞发生凋亡。
Claims (4)
1.一种caspase-ERLBD融合基因，其特征在于，由caspase8基因与ERα的配体结合区基因连接而成，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示；caspase-ERLBD融合基因表达的融合蛋白caspase-ERLBD能够识别雌激素并特异性的与其结合。
2.如权利要求1所述的caspase-ERLBD融合基因，其特征在于，所述的融合蛋白caspase-ERLBD与雌激素结合后，触发融合蛋白caspase-ERLBD的二聚化，使融合蛋白中的caspase通过分子间交互切割而活化。
3.如权利要求1所述的caspase-ERLBD融合基因，其特征在于，雌激素能够特异性的结合于转染caspase-ERLBD融合基因并表达caspase-ERLBD融合蛋白的细胞。
4.如权利要求3所述的caspase-ERLBD融合基因，其特征在于，雌激素与表达caspase-ERLBD融合蛋白的细胞结合后，触发融合蛋白caspase-ERLBD的二聚化，使融合蛋白中的caspase通过分子间交互切割而活化，诱导细胞凋亡。
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