CN101384614A - Vegf活化的fas配体 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了VEGF受体的胞外结构域和死亡配体构成的融合蛋白。该融合蛋白结合于VEGF和肿瘤细胞上的死亡受体,从而抑制VEGF激活VEGF受体并诱导肿瘤细胞凋亡。本发明融合蛋白可用于诱导细胞凋亡和细胞毒作用、治疗癌症和血管新生和/或血管生成失控相关性疾病或失调。因此,本发明还提供了用该融合蛋白、编码该融合蛋白的多核苷酸,含有该多核苷酸的载体,含有该融合蛋白或编码该融合蛋白的多核苷酸的药物组合物和药盒治疗血管新生相关性疾病的方法。
Description
相关申请的交叉参考
本申请要求08/15/2005提交的临时申请序列号60/708,723的优先权,将其公开内容全文纳入本文作参考。
发明领域
本发明涉及用于治疗包括癌症在内的血管新生和/或血管生成失控相关性疾病和失调的组合物和方法。更具体说,本发明提供了用于治疗癌症和诸如类风湿性关节炎、黄斑变性和牛皮癣等疾病的含有VEGF受体胞外域和死亡配体的融合蛋白。
对联邦资助下的研究和开发获得的本发明的权利声明
国防部前列腺癌研究计划(DAMD17-02-1-0029)和乳腺癌研究计划(W81XWH-04-1-0745 BC032859)资助了本发明的工作。
发明背景
血管新生是发生新血管的过程,包括原先已存在血管的毛细内皮细胞的增殖、迁移和组织浸润。血管新生在包括胚胎发育、卵泡生长和伤口愈合等正常生理过程中,以及包括肿瘤生长和非肿瘤疾病等病理状况中至关重要,所述非肿瘤疾病包括异常新血管形成,包括新生血管性青光眼(Folkman和Klagsbrun,Science(1987),235:442-447)。
已经确定血管新生和癌症之间相关联。新血管形成是从超常增生转变为肿瘤过程中的一个重要步骤,当肿瘤直径长到2-3以上和肿瘤转移时必然发生新生血管形成(Folkman,Nat Med(1995),1:27-30;综述参见Bouck等,Adv in Cancer Res(1996),69:135-174)。在许多不同肿瘤类型(包括恶性胶质瘤(Plate和Risau,GLIA(1995),15:339-347)以及乳腺癌(Horak等,Lancet(1992),340:1120-124)、膀胱癌(Dickinson等,Br J Urol(1994),74:762-766)、结肠癌(Takahashi等,Cancer Res(1995),55:3964-3968)和子宫内膜癌(Kirschner等,Am J Obstet Gynecol(1996),174:1879-1882))中观察到微血管密度与疾病严重程度之间相关联。
除癌症以外,还有许多严重疾病与持续性血管新生失控有关。这些疾病受异常的新血管形成控制。存在血管新生失控的疾病包括子宫内膜异位,眼病(如黄斑变性)、腰肌炎(psoiaris)和类风湿性关节炎。关节炎是严重的卫生保健问题。人类进行性关节炎可引起严重疼痛、关节活动性受限和畸形以及总体生活质量降低。在类风湿性关节炎中,滑膜过度增殖(新血管辅助)并侵入而破坏软骨。
抑制血管新生则能抑制新血管的形成,因此影响肿瘤生长和转移的产生。实际上,估计消除一个内皮细胞可以抑制100个肿瘤细胞的生长(Thorpe等,Breast CancerResearch and Treatment(1995),36:237-251)。抑制新毛细血管形成可减轻类风湿性关节炎中发生的关节破坏并中止疾病进展。
迄今为止,已经鉴定到数种血管新生因子(综述参见Folkman,Nat Med(1995),1:27-30;Hanahan等,Cell(1996),86:353-364),包括特别有效的血管内皮生长因子(VEGF),也称为VPF或血管营养素(vasculotropin)(综述参见Ferrara,Trends CardiovascMed(1993),3:244-250;Ferrara和Davis-Smyth,Endocrine Rev(1997),18:4-25)。不像其它血管新生因子,在血管新生过程中VEGF的作用是内皮细胞-特异性促分裂原(Terman等,Biochem Biophys Res Commun(1992),187:1579-1586和Ferrara,TrendsCardiovasc Med(1993),3:244-250)。证明产生的抗VEGF抗体能抑制体内肿瘤生长(Kim等,Nature(1993),362:841-844),这表明VEGF拮抗剂可能具有作为肿瘤诱导血管新生的抑制剂的治疗应用。
许多人肿瘤细胞系在培养时都分泌VEGF,包括胶质瘤(Tsai等,J Neurosurg(1995),82:864-867)、黑色素瘤(Claffey等,Cancer Res(1996),56:172-181)、胃癌细胞(Zhang等,World J Gastroenterol(2002),8(6):994-8)、卡波西肉瘤和表皮状癌细胞(Myoken等,Proc Natl Acad Sci USA(1991),88:5819-5823)。更重要的是,对原代胶质瘤(Plate等,Lab Invest(1992),67:529-534;Plate等Int J Cancer(1994),59:520-529)、成血管细胞瘤(Hatva等,Amer J Pathol(1996),148:763-775)以及乳腺癌(Toi等,Jpn.J Cancer Res(1994),85:1045-1049;Anan等,Surgery(1996),119:333-339;Yoshiji等,Cancer Res(1996),56:2013-2016)、结肠癌(Brown等,Cancer Res(1993),53:4727-4735;Takahashi等,Cancer Res(1995),55:3964-3968)和肾细胞瘤(Takahashi等,CancerRes(1994),54:4233-4237)的原位杂交或免疫组化已鉴定到VEGF的转录物或蛋白质。在成胶质细胞瘤中,在邻近坏死区域的细胞中检测到VEGF信使,这与缺氧时其上调相一致(Shweiki等,Nature(1992),359,843-845;Plate等,Lab Invest(1992),67:529-534)。有报道称,垂体瘤(McCabe等,J Clin Endocrinol Metab(2002),87(9):4238-44)和黑色素瘤异种移植物(Graells等,J Invest Dermatol(2004),123(6):1151-61)的VEGF mRNA和蛋白质水平显著升高。而且,癌症患者的血清VEGF水平显著高于正常志愿者。在未经治疗的转移性癌症患者中观察到VEGF浓度最高。
最初从滤泡星形细胞和各种肿瘤细胞系的条件培养基中纯化得到VEGF(Ferrara等,Biochem Biophys Res Commun(1989),161:851-858;Plouet等,EMBO J(1989),8:3801-3806)。VEGF是一种同源二聚体糖蛋白,由两个23kD亚基组成,一般以二聚多肽的形式结合其受体。编码VEGF的人基因结构由7个内含子隔开的8个外显子组成。VEGF基因的mRNA交替剪接产生了五种不同的分子,其成熟单体含有121、145、165、189或206个氨基酸残基(Tisher等,J Biol Chem(1991),266:11947-11954;Houck等,Mol Endocrinol(1991),5:1806-1814。只有缺少外显子6编码的残基的VEGF 165是VEGF的成熟和活性形式。它结合于肝素和细胞表面肝素硫酸蛋白聚糖,并可以表达成游离形式或细胞膜结合形式(Houck等,1992)。VEGF206和VEGF189是膜结合形式。同时,近年来,已鉴定到许多VEGF结构同源物:VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D和胎盘生长因子(P1GF)(Klagsbrun和D′Amore,Cytokine Growth Factor Rev(1996),7:259-270;综述参见Ferrara,J Mol Med(1999),77:527-543)。
已鉴定到VEGF用作高亲和力配体的两种酪氨酸激酶受体:fims-样酪氨酸激酶-1(Flt-1或VEGFR-1)和激酶域受体(KDR/Flk-1或VEGFR-2)(Matthews等,Proc NatlAcad Sci USA(1991),88:9026-9030;Terman等,Biochem Biophys Res Commun(1992),187:1579-1586;De Vries等,Science(1992),255:989-991;Millauer等,Cell(1993),72:835-846)。
虽然Flt-1结合VEGF的亲和力比KDR高50倍(De Vries等,Science(1992),255:989-991),但大多数VEGF的血管新生特性(促分裂性、趋化性和诱导形态改变)是由与KDR相互作用所介导的(Waltenberger等,J Biol Chem(1994),269:26988-26995)。因此,最适合的是破坏VEGF与KDR之间的相互作用,以抑制血管新生。
VEGF受体一般是III类受体型酪氨酸激酶,特征是其氨基末端胞外受体配体结合域中含有数个,一般是5个或7个,免疫球蛋白样环(Kaipainen等,J Exp Med(1993),178:2077-2088)。另外两个区域包括跨膜区和羧基末端胞内催化域,它们之间插入了不同长度的亲水性激酶间序列,称为激酶插入结构域(Terman等,Oncogene(1991),6:1677-1683)。
此外,VEGF能结合于第三种受体—神经毡蛋白-1。最初,神经毡蛋白-1(NRP-1)最初被描述为参与神经元导向的协同受体,它能结合脑信号蛋白/脑衰蛋白家族成员的神经元。NRP-1也在内皮细胞中表达,相信它作为VEGFR-2的协同受体而促进血管新生(Gray等,Cancer Res.(2005),65(9):3664-70)。NRP-1和VEGFR-2不直接相互作用,而是通过一种VEGF同种型—VEGF165桥接而相互作用(Mac Gabhann和Popel,Am J Physiol Heart Circ Physiol,(2005),288(6):H2851-60)。
因此,VEGF可能在多种癌症,包括结肠癌、直肠癌、肾细胞(肾)癌、乳腺癌、非小细胞肺癌和卵巢癌中具有广泛作用。目前,阿瓦斯汀(AvastatinTM,贝伐单抗)已被批准用于治疗转移性结肠或直肠癌患者,它是基因技术公司(Genetech)开发的一种治疗性抗体,设计用于抑制VEGF功能,从而干扰肿瘤的血供。其它阻断血管新生的方法采用VEGF受体的特异性单克隆抗体(如美国专利号5,955,331)、化合物如吲哚啉酮(美国专利号6,846,839)或干扰VEGF而阻断它与其相关受体相互作用的肽(如美国专利号6,559,126)。
然而,目前的临床试验治疗方案以及本领域所知的通过防止VEGF结合肿瘤细胞上其相关受体而阻断肿瘤相关性新血管形成的治疗方案都没有尝试杀伤肿瘤细胞。这可能不是一项容易的任务,因为除了在血管新生中的主要作用外,VEGF还通过干扰凋亡影响细胞存活(Bairey等,Leuk Res(2004),28(3):243-8)。
凋亡,或程序性细胞死亡,是多细胞生物体在发育和维持内稳态过程中的重要生理过程。凋亡至少部分由细胞表面受体蛋白Fas介导,该蛋白在免疫系统的发育和功能中起到重要作用。已证明,Fas系统功能障碍会引起淋巴增殖性疾病并加速自身免疫病(Takahashi等,Cell(1994),76:969-976)。
Fas是分子量约为45kD的I型膜蛋白,属于肿瘤坏死因子(TNF)受体家族(Nagata等,Science,1995),267:1449)。Fas作为细胞表面抗原将凋亡信号传导给细胞。凋亡性细胞死亡的特征是特征性的核和胞质皱缩、膜出泡和染色体DNA降解,可区别于因急性细胞损伤所致的坏死性细胞死亡。
许多组织和细胞系的Fas表达很弱,但发现心脏、肺、肝脏、卵巢和甲状腺中高水平表达(Watanabe-Fukunaga等,J Immunol(1992),148:1274)。Fas与某些抗体如APO-1(Trauth等,Science(1989),245:301)和抗-Fas(Yonehara等,J Exp Med(1989),169:1747)或Fas的天然配体—Fas配体(FasL)结合而被触发时,能传导凋亡或程序性细胞死亡的信号(Thompson,Science(1995),267:1456)。Fas也在肿瘤细胞表面表达。例如,用植入小鼠的实体瘤已在体内证明抗-Fas抗体、FasL表达细胞或重组FasL可有效诱导Fas-介导的肿瘤凋亡(Timmer等,J Pathol(2002),196(2):125-34)。
已克隆了人、大鼠和小鼠的FasL(Takahashi等,Internat Immunol(1994),6:1567;Suda等,Cell(1993),75:1169;Lynch等,Immunity(1994),1:131;Takahashi等,Ce//(1994),76:969)。人FasL与大鼠FasL和小鼠FasL的胞外结构域高度同源,人FasL不仅能够识别人Fas,而且能够识别小鼠Fas和诱导凋亡。相似地,大鼠和小鼠FasL能够识别人Fas并诱导凋亡。FasL是II型膜蛋白,即具有胞外羧基末端结构域和胞内氨基末端结构域,属于TNF蛋白家族,分子量约为40kD。(Suda等,Cell(1993),75:1169)。Fas配体在活化的淋巴细胞上、睾丸(Suda等,Cell(1993),75:1169)和眼中(GrifFlth等,Science(1995),270:1189),以及一些细胞毒性T-淋巴细胞(CTL)细胞系上(Rouvier等,J Exp Med(1993),177:195)强烈表达。
表达FasL的细胞以及纯化的FasL蛋白(Suda和Nagata,J Exp Med(1994),179:873)对表达Fas的细胞有细胞毒性。因此,FasL通过结合Fas传导凋亡信号。另外,由于与TNF相似,相信FasL可以用作三聚体,推测在各FasL单元的界面上结合1-3个Fas分子。两个或多个Fas分子与FasL三聚体结合应引起Fas寡聚化,从而将凋亡信号传导给表达Fas的细胞。
总之,需要能够产生具有以下联合特性的可溶性化合物:(i)VEGFR多肽的功能,即结合VEGF多肽,(ii)中和VEGF介导的VEGFR活化的功能,从而防止肿瘤相关性新血管形成和(iii)Fas配体与Fas受体相互作用的功能,即受体结合和/或激活受体介导的途径。这类化合物可用于杀伤分泌VEGF和表达Fas的癌细胞。然而,重组蛋白技术的重大挑战常常是以可溶性蛋白形式表达有生物活性的跨膜蛋白。本发明克服了这些障碍,满足了这些和其它需求。
发明概述
本发明提供了结合死亡受体的新型融合蛋白。本发明融合蛋白包含(i)结合血管内皮生长因子(VEGF)多肽的血管内皮生长因子受体(VEGFR)多肽和(ii)包含寡聚结构域和死亡受体识别部分的死亡配体,其中VEGFR多肽的C末端连接于死亡配体的N末端。
VEGFR-死亡配体融合蛋白可用于中和VEGF受体被VEGF活化的方法。这些方法特别可用于诱导凋亡、在细胞中诱导细胞毒效应、治疗癌症和与血管新生和/或血管生成失控相关性疾病或失调。
在本发明的优选实施方式中,死亡受体是Fas,死亡配体是Fas配体。Fas配体优选为人Fas配体。
在本发明的另一优选实施方式中,该融合蛋白的VEGFR多肽包含VEGF受体-1(VEGFR-1)的VEGF结合域或VEGF受体-2(VEGFR-2)的VEGF结合域。VEGFR-1和VEGFR-2优选为人VEGFR-1和人VEGFR-2。VEGFR-1和VEGFR-2还可来自小鼠或大鼠。
本发明的优选融合蛋白包含鼠VEGFR-2多肽和人Fas配体。优选地,此融合蛋白包含与SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:23所示氨基酸序列至少80%同源的氨基酸序列。在本发明的一个实施方式中,该融合蛋白包含SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中,本发明融合蛋白还包含表位标签。优选的表位标签是FLAG样标签或HA标签。优选地,可切掉该表位标签。
可将几种Fas配体多肽连接于VEGFR多肽。在优选实施方式中,Fas配体选自(i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:11的多肽;(ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:12的多肽;(iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:13的多肽;和(iv)包含在(i)-(iii)中任一项氨基酸序列中缺失、取代或添加一个至数个氨基酸残基的氨基酸序列的具有Fas结合活性的多肽。
可将几种VEGFR-1多肽连接于Fas配体。在优选实施方式中,VEGFR-1多肽选自(i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:20的多肽;(ii)包含SEQ ID NO:19的氨基酸残基1-747的多肽;(iii)包含SEQ ID NO:19的氨基酸残基32-747的多肽;(iv)包含SEQID NO:19的氨基酸残基151-214的多肽;(v)包含SEQ ID NO:19的氨基酸残基230-327的多肽;(vi)包含VEGFR1的氨基酸129-230(如图10所示的SDTG...NTII;结构域2(D2))的多肽和(vii)包含在(i)-(iv)中任一项氨基酸序列中缺失、取代或添加一个至数个氨基酸残基的氨基酸序列的具有VEGF结合活性的多肽。
可将几种VEGFR-2多肽连接于Fas配体。在优选实施方式中,VEGFR-2多肽选自(i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:1的多肽;(ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:2的多肽;(iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:3的多肽;(iv)包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的多肽;(v)包含氨基酸序列SEQ ID NO:5的多肽;(vi)包含氨基酸序列SEQ ID NO:6的多肽;(vii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:1的氨基酸141-207的多肽;(iix)包含氨基酸序列SEQ ID NO:1的氨基酸224-320的多肽;和(ix)包含在(i)-(iix)中任一项氨基酸序列中缺失、取代或添加一个至数个氨基酸残基的氨基酸序列的具有VEGF结合活性的多肽。
在本发明的另一方面,提供了编码本发明融合蛋白的核酸。SEQ ID NO:14显示了优选的核酸。另外,本发明提供了包含编码本发明融合蛋白的核酸的载体。优选载体包含含有核苷酸序列SEQ ID NO:14的核酸。
本发明还提供了调节死亡受体介导途径的方法。该方法包括使表达死亡受体的细胞与含有以下组分的融合蛋白相接触的步骤:(i)结合VEGF蛋白的VEGFR多肽;和(ii)包含寡聚化结构域和死亡受体识别部分的死亡配体;其中所述VEGFR多肽已结合VEGF蛋白,所述融合蛋白的含量能有效调节死亡受体介导途径。
在本发明的优选实施方式中,Fas-介导途径是凋亡。在这种方法中,融合蛋白的含量能有效诱导凋亡。
可以在体外和体内实施本发明方法。
在本发明的优选实施方式中,表达死亡受体的细胞是癌细胞,优选过度表达VEGF的癌细胞。所述癌细胞选自乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、肺癌、成胶质细胞瘤或卵巢癌。
在本发明另一优选实施方式中,调节除癌症外疾病中的Fas-介导途径。优选疾病选自类风湿性关节炎、牛皮癣或黄斑变性。
在本发明的优选实施方式中,调节死亡受体-介导途径的方法包括使表达死亡受体的细胞与化疗药接触的步骤。优选的化疗药选自:喜树碱、依托泊甙、双吲哚基马来酰亚胺VIII、顺铂、紫杉醇、多柔比星、替莫唑胺、硼替佐米、LY294002或丙戊酸。
本发明还提供了含有本发明融合蛋白和药学上可接受的赋形剂、运载体和/或稀释剂的药物组合物。
在另一方面,本发明提供了一种包含载体和药学上可接受的赋形剂、运载体和/或稀释剂的组合物,其中所述载体包含具有SEQ ID NO:14所示核苷酸序列的核酸。
附图简要说明
图1显示了本发明融合蛋白的示意图,如VEGFR-FasL。该图显示,(i)单体融合蛋白,(ii)在没有VEGF的情况下三聚体融合蛋白产生无功能的FasL,不能诱导显著的凋亡和(iii)VEGF-诱导融合蛋白寡聚化而产生有功能的FasL,它能够诱导凋亡。V:V表示两个VEGF分子的结合。
图2显示了人(H)(GenBank登录号P48023)、小鼠(M)(GenBank登录号A53062)和大鼠(R)(GenBank登录号A49266)的FasL蛋白序列的比对结果。星号表示小鼠和大鼠FasL与人FasL的相同氨基酸残基。指出了胞内结构域、跨膜结构域、切割位置、三聚体结构域和受体结合域。FasL-Fas结合域的N末端边界尚未阐明。
图3显示了人(GenBank登录号NP-002244)、小鼠(GenBank登录号P35918)和大鼠(GenBank登录号NP_037914)的VEGFR-2蛋白序列与人VEGFR-1(GenBank登录号NM_002019)的胞外和跨膜区的比对结果。星号表示小鼠和大鼠VEGFR-2与人VEGFR-2的相同氨基酸残基。指出了VEGFR-2序列的信号序列、IgG-样结构域1-7和跨膜结构域。
图4显示了注释的人神经毡蛋白-1胞外结构域的序列(Genbank AAC12921的一部分)。指出了鉴定的各结构域。B结构域参与结合VEGF。
图5描述了VEGFR/FasL融合蛋白编码核酸Flk(D1-D3)+FasL(139-281)的构建。详见实施例2。
图6描述了VEGFR/FasL融合蛋白编码核酸FLAG/FlkhFasL(D1-D3/139-281)的构建。详见实施例3。
图7显示了FlkFasL的cDNA序列。下划线表示Flk-1信号序列和胞外结构域序列的核苷酸序列;正常字体显示接头的核苷酸序列;粗体表示FasL的核苷酸序列。
图8显示了FlkFasL的氨基酸序列。斜体字表示Flk-1信号肽的氨基酸序列;下划线表示Flk-1胞外结构域的氨基酸序列;正常字体显示接头的氨基酸序列;粗体表示FasL的核苷酸序列。
图9显示了FLAG-标记的R1[D2]FasL的核酸序列。斜体为前胰蛋白酶原的先导序列;下划线为FLAG表位标签序列;下划线和粗体为VEGFR1结构域2;标准字体为编码ARGTS的接头序列;粗体为FasL三聚化和Fas受体结合域。详见实施例3。
图10显示了R1[D2]FasL的氨基酸序列,用单字母编码表示氨基酸残基。详见实施例3。
图11A显示了Cos-7细胞中FlkFasL三聚体的表达。用DEAE-右旋糖苷法以对照质粒pSV/Neo(泳道A)或质粒pBJ/FlkFasL(泳道B-D)转染Cos-7细胞。在泳道B中,用1μg质粒DNA转染细胞30分钟;在泳道C中,用3μg质粒DNA转染30分钟;泳道D,用3μg质粒DNA转染3小时。裂解转染细胞44小时后,用PAGE电泳分析裂解物,并用VEGFR-2胞外结构域抗体进行免疫印迹。图11B显示了稳定转染的CHO细胞表达的R2FasL。Western印迹法检测了条件培养基中经抗VEGFR2抗体借助FLAG-标签纯化后的R2FasL。详见实施例4。
图12显示FlkFasL以VEGF-依赖性方式杀伤Jurkat细胞。将含有FlkFasL的不同量的条件培养基加入Jurkat细胞中。数据表示为每个血球计视野中的平均细胞数±SEM。就一些数据点而言,SEM小于所用的图标。详见实施例5。
图13显示FlkFasL杀伤Jurkat细胞取决于VEGF用量。将不同量的VEGF-165加入Jurkat细胞中。数据表示为每个血球计视野中的平均细胞数±SEM。就一些数据点而言,SEM小于所用的图标。详见实施例6。
图14显示FlkFasL以VEGF-依赖性方式诱导凋亡。用对照条件培养基(C)或含有FlkFasL的条件培养基(F)以所示的1μL或5μL体积培育Jurkat细胞。再用2nMVEGF-165处理细胞(V)或不处理(-)60分钟。用FACS分析膜联蛋白V-阳性/碘化丙锭阴性细胞,从而评估对凋亡的诱导。详见实施例7。
图15显示在人乳腺癌细胞系中诱导凋亡。用25μL对照质粒pSV/Neo(对照CM)或质粒FlkFasL(FlkFasL CM)转染的Cos-7细胞的条件培养基处理T-47D人乳腺癌细胞。在右图中,再用2nM VEGF-165处理细胞。处理后24小时,对细胞拍照。中图中显示FlkFasL诱导很少的细胞死亡。右图中细胞死亡显著增加证明,FlkFasL凋亡活性受VEGF的调控。详见实施例8。
图16显示在人乳腺癌细胞系中用FlkFasL刺激的细胞毒性。用25μL对照质粒pSV/Neo(B)或质粒FlkFasL(C和D)转染的Cos-7细胞的条件培养基处理T-47D人乳腺癌细胞。还用2nM VEGF-165处理D中的细胞。泳道A中没有加入条件培养基。处理后24小时,对细胞拍照。48小时后,通过定量释放到细胞培养物上清液中的乳酸脱氢酶(LDH)测定细胞毒应答反应。详见实施例9。
图17显示,R2FasL在U87MG人成胶质细胞瘤细胞和DU145人前列腺癌细胞中诱导的细胞毒性或凋亡,但在U373人成胶质细胞瘤细胞中没有这种作用。A.R2FasL在U87MG细胞中诱导细胞毒性,VEGF(抗-VEGF Ab)或FasL(抗-FasL Ab)的中和抗体能抑制这种作用。B.R2FasL在U87MG成胶质细胞瘤细胞中诱导细胞死亡,VEGF(抗-VEGF Ab)或FasL(抗-FasLAb)的中和抗体能抑制这种作用。C.R2FasL在DU145人前列腺癌细胞中诱导细胞毒性。CM,条件培养基。D.R2FasL在U373成胶质细胞瘤细胞中不诱导细胞毒性。详见实施例10。
图18描述了R1[D2]FasL的凋亡活性。A.R1[D2]FasL以VEGF-依赖性方式诱导凋亡。加入重组人VEGF(rhV 165),浓度为2nM。对照中不加VEGF(无V)。B.人和小鼠VEGF-165;人VEGF-121、人VEGF:P1GF异源二聚体和人P1GF能激活R1[D2]FasL。C.hVEGF-165对R1[D2]FasL的ED50约为100pM。详见实施例11。
图19描述了化疗药能增强R2FasL活性。A.Bis VIII、喜树碱和依托泊甙增强R2FasL对U87MG成胶质细胞瘤细胞的凋亡活性。B.Bis VIII、喜树碱和依托泊甙能增强R2FasL对U87MG成胶质细胞瘤细胞的细胞毒活性。详见实施例12。
图20A描述了在人脐静脉内皮细胞中R2FasL+VEGF不诱导细胞毒性。图20B描述了在牛肾上腺皮质内皮细胞(微血管内皮细胞)中R2FasL+VEGF诱导细胞毒性。详见实施例13。
图21A描述了人和小鼠VEGF-165(分别是hVEGF和mVEGF)均能激活R2FasL。图21B显示,VEGF-165的ED50为20-200pM。详见实施例14。
发明详述
I.定义
除非另有说明,本文所用的所有科技术语具有本发明所属领域技术人员共同理解的含义。以下参考文献为本领域技术人员提供了许多本发明所用术语的通用定义:Singleton等,Dictionary of Microbiology and Molecular Biology(微生物和分子生物学字典,第二版,1994);The Cambridge Dictionary of Science and Technology(剑桥科技字典,Walker等,1988);The Glossary ofGenetics(遗传学术语表),第5版,R.Rieger等(编),Springer Verlag(施普林格出版社)(1991);以及Hale和Marham,The HarperCollins Dictionary of Biology(哈珀柯林斯生物学字典,1991)。本文所用的以下术语具有其固有含义,除非另有说明。
术语"氨基酸"指天然产生和合成的氨基酸,以及功能类似于天然产生的氨基酸的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然产生的氨基酸是遗传密码编码的氨基酸,以及随后作了修饰的氨基酸,如羟基脯氨酸,γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。"氨基酸类似物"指与天然产生的氨基酸基本化学结构相同,如α碳结合于氢、羧基、氨基和R基团的化合物,如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。这些类似物可能含有修饰的R基团(如正亮氨酸)或修饰的肽主链,但保留了与天然产生的氨基酸相同的基本化学结构。"氨基酸模拟物"指其结构与氨基酸的一般化学结构不同,但功能类似于天然产生的氨基酸的化合物。
本文中采用共知的三字母符或IUPAC-IUB生化命名委员会推荐的单字母符表示氨基酸。同样,采用共同接受的单字母编码表示核苷酸。
本文所用的"生物学样品"是含有核酸或多肽的生物组织或液体的样品。这类样品一般来自人,但包括分离自非人灵长动物或啮齿动物,如小鼠和大鼠的组织。生物学样品还包括组织切片,如活检样品或尸检样品,为组织学目的取得的冰冻切片,血液、血浆、血清、痰液、粪便、眼泪、粘膜、毛发、皮肤等。生物学样品也包括衍生自患者组织的外植体和原代和/或转化的细胞培养物。"生物学样品"也指动物的细胞或细胞群或者一定量的组织或液体。最常见的是,从动物取得生物学样品,但术语"生物学样品"也可指体内分析的细胞或组织,即不从动物(体内)取得的细胞或组织。一般地,"生物学样品"含有动物的细胞,但该术语也可指可用于测定癌症相关性多核苷酸或多肽水平的非细胞生物物质,如血液、唾液或尿液的非细胞组分。本发明可采用许多类型的生物学样品,包括但不限于:组织活检样品、血液样品、血清样品或唾液样品。本文所用的"组织活检样品"指从动物(优选人)取得、用于诊断分析的一定量的组织。在癌症患者中,可切取肿瘤组织,以分析肿瘤内的细胞。"组织活检样品"可指任何类型的活检样品,如穿刺活检样品、细针穿刺活检样品、手术活检样品等。
"提供生物学样品"指获得用于本文所述方法的生物学样品。最常见的是,从患者取得细胞样品完成这一过程,但也可采用以前分离(如由其他人分离、在其它时间分离和/或因另一目的分离)的细胞来完成这一过程,或在体内进行本发明方法完成这一过程。也可采用具有治疗或疗效历史的保藏组织。
术语"细胞生长的改变"指细胞在体外或体内的生长和增殖特性的任何改变,如形成细胞灶、贴壁依赖性、半固体或软琼脂生长、接触抑制和生长密度限度的改变、丢失对生长因子或血清的需求、细胞形态的改变、获得或失去永生化、获得或失去肿瘤特异性标记、注射到合适的动物宿主中时能够形成或抑制肿瘤,和/或细胞的永生化。参见例如,Freshney,Culture of Animal Cell a Manual of Basic Technique(动物细胞培养:基本技术手册),第231-241页(第3版,1994)。
"保守性修饰变体"适用于氨基酸和核酸序列。提到具体核酸序列时,保守性修饰变体指编码相同或基本相同的氨基酸序列的核酸,或者该核酸不编码氨基酸序列时,指基本相同或相关(如天然毗连)的序列。由于遗传密码的简并性,大量功能相同的核酸编码大多数蛋白质。例如,密码子GCA、GCC、GCG和GCU均编码丙氨酸。因此,对某密码子所确定的每个位置丙氨酸,可将该密码子改变成所述相应密码子中的另一个,而不改变编码的多肽。这类核酸变异是“沉默变异”,是保守性修饰变异的一种形式。本文中编码多肽的每个核酸序列也含有所述核酸的沉默变异。本领域技术人员知道,在某些情况下,可修饰核酸中各密码子(除AUG和TGG以外,AUG是甲硫氨酸的唯一密码子,TGG是色氨酸的唯一密码子),而产生功能相同的分子。因此,就表达产物而言,编码多肽的核酸的沉默变异常常是暗含于所述序列中,但对实际探针序列而言则并非如此。
至于氨基酸序列,本领域技术人员应认识到,改变、加入或缺失编码序列中的一个氨基酸或一小部分氨基酸的核酸,肽,多肽或蛋白质序列中的单个取代、缺失或添加是"保守性修饰的突变体",其中所述改变导致用化学上相似的氨基酸取代另一氨基酸。本领域熟知可提供功能相似的氨基酸保守取代表。这类保守性修饰变体是额外的,不排除多态性突变体、种间同源物和本发明等位基因,它们一般互为保守取代:1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G);2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E);3)天冬酰胺(N)、谷胺酰胺(Q);4)精氨酸(R)、赖氨酸(K);5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V);6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W);7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T);和8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)(参见例如,Creighton,Proteins(1984))。
"癌细胞"、"转化"细胞或在组织培养物中"转化"指自发性或诱导性表型的改变,不一定包括摄入新的遗传物质。虽然可通过转化病毒的感染和新基因组DNA的掺入,或摄入外源性DNA进行转化,但也可自发产生或接触致癌物后内源性基因发生突变而产生。转化伴有表型改变,例如细胞永生化、异常生长控制、非形态改变和/或变成恶性(参见Freshney,Culture of Animal Cell a Manual of Basic Technique(动物细胞培养:基本技术手册,第3版,1994))。
术语"死亡配体"指可结合死亡受体和结合后诱导细胞杀伤作用的哺乳动物蛋白家族。示范性死亡配体包括但不限于:FasL、肿瘤坏死因子(TKF)、淋巴毒素(LT)和肿瘤坏死因子-相关性凋亡诱导配体(TRAIL)。死亡配体多肽通常包含寡聚化结构域和死亡受体识别部分。
术语"死亡受体"指哺乳动物细胞表面上表达的、可结合死亡配体并且在结合死亡配体后寡聚化而诱导细胞杀伤作用的哺乳动物蛋白家族。死亡受体多肽通常包含寡聚化结构域和死亡配体识别部分。8种死亡受体和死亡受体信号转导的综述参见Lavrik等,J Cell Sci,(2005),118(Pt2):265-7,全文纳入本文作参考。示范性死亡受体包括但不限于:肿瘤坏死因子受体1(TNFR1;也称为DR1、CD120a、p55和p60)、CD95(也称为DR2、APO-I和Fas)、DR3(也称为APO-3、LARD、TRAMP和WSL1)、TNF-相关性凋亡诱导配体受体1(TRAILR1;也称为DR4和APO-2)、TRAILR2(也称为DR5、KILLER和TRICK2)、DR6、外异蛋白(ectodysplasin)A受体(EDAR)和神经生长因子受体(NGFR)。它们的区别是称为死亡结构域(DD)的~80个残基的胞质区。当这些受体被相应配体激发时,将许多分子征集到DD附近,随后激活信号转导级联反应。死亡配体还与不含有DD因此无法形成信号转导复合物的引诱受体(DcR)相互作用。迄今为止,已经鉴定到四种引诱受体:TRAILR3(也称为DcR1)、TRAILR4(也称为DcR2)、DcR3和护骨蛋白(OPG)。
术语"死亡受体识别部分"指死亡配体中作为与死亡受体结合充分所必需的亚域。
术语"测定功能作用"指测定化合物提高或降低间接或直接受本发明融合蛋白如VEGFR-FasL影响的参数,如功能、酶学、物理和化学作用。可通过本领域技术人员已知的任何方式测定这类功能作用,如光谱特征(如荧光、吸光度、折射率改变,蛋白质的水动力学(如形状)、色谱学或溶解性能的改变,测定诱导型标记物或本发明融合蛋白如VEGFR-FasL的转录激活;测定结合活性,如与死亡受体的结合,测定细胞增殖,测定凋亡等等。也可采用本领域技术人员已知试验,如体外试验测定化合物对癌症的功能作用,所述试验包括(例如)细胞在软琼脂上生长;贴壁依赖性;接触抑制和生长密度限度;细胞增殖;细胞转化;生长因子或血清依赖性;肿瘤特异性标记物水平;侵入基质胶;体内肿瘤生长和转移;发生转移的细胞中的mRNA和蛋白质表达以及癌细胞的其它特征。可以采用本领域技术人员熟知的许多方法评估这些功能作用,例如,定量或定性地测定形态特征改变的显微镜观察法,测定RNA或蛋白质水平改变,测定RNA稳定性,鉴定下游或报告基因的表达(CAT、荧光素酶、β-gal、GFP等),例如通过化学发光、荧光、比色反应、抗体结合、诱导型标记物和配体结合试验进行测定。"功能作用"包括体外、体内和离体活性。
治疗疾病的化合物的"有效量"是足以改善、或以某种方式减轻症状,或者中止或逆转疾病进程的用量。通过给予具体药物组合物改善具体疾病的症状,指可能相关的任何减轻,无论是永久或暂时性、持续性或瞬时性减轻。
"表达载体"是重组或合成产生的含有一系列特殊核酸元件的核酸构建物,这些特殊元件能够使该具体核酸在宿主细胞中转录。表达载体可以是质粒、病毒或核酸片段部分。表达载体通常包含要转录的操作性连接于启动子的核酸。
术语"FasL"或"Fas配体"指分离核酸,多肽和多态性变体、等位基因、突变体和其种间同源物,进一步描述如下:(1)优选在至少约50、75、100、150、200、250或281个氨基酸的区域上,其氨基酸序列与下述人FasL序列的氨基酸序列相同性大于约60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%,优选91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或更高;(2)它能结合于用含有下述氨基酸序列的免疫原产生的抗体(如多克隆抗体)或其保守性修饰变体;(3)它能结合FasL结合蛋白;(4)它能与天然产生的Fas配体竞争结合Fas配体结合蛋白;(5)它能在含有膜结合性FasL结合蛋白的细胞中诱导凋亡;(6)它能在严谨杂交条件下特异性杂交于下述核酸序列,或其保守修饰变体;(7)优选在至少约100、200、300、400或更多个核苷酸的区域上,其核酸序列与SEQ ID NO:16(人FasL)的核苷酸序列相同性约为90%,优选大于约96%、97%、98%、99%或更高;和/或(8)它含有SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:11(人FasL)的至少25个,常常是50、75、100、125或143个毗连氨基酸残基。FasL多肽可具有本文所述的寡聚结构域和死亡受体识别结构域。
FasL多核苷酸或多肽序列一般来自人,但也可来自其它哺乳动物,例如但不限于非人灵长动物,啮齿动物如大鼠、小鼠或仓鼠;牛、猪、马、绵羊或其它哺乳动物。因此,在一些实施方式中,本文所述的FasL多肽和FasL亚域多肽可包含对应于人FasL序列的序列。因此,本文提供了示范性FasL,它们是本领域已知的。例如,人FasL多肽的GenBank登录号是P48023。小鼠FasL多肽的GenBank登录号是(例如)A53062;大鼠FasL的GenBank登录号是A49266。
术语"FasL结合蛋白"指能与FasL结合的多肽。
FasL"同源物"或VEGFR"同源物"指包含类似于FasL或VEGFR的氨基酸序列、但不一定具有与FasL或VEGFR相似或相同功能的多肽。
FasL"同种型"或VEGFR"同种型"分别指由同一基因编码,但pi或MW或二者皆不同的FasL或VEGFR的变体。这类同种型的氨基酸组成可能不同(例如,由于交替剪接或有限水解所致),此外或或者,可能由不同的翻译后修饰(如糖基化、酰基化或磷酸化)产生。
本文所用的FasL"直向同源物"或VEGFR"直向同源物"指(i)包含类似于人FasL或VEGFR的氨基酸序列和(ii)具有与人FasL或VEGFR相似或相同功能的非人多肽。
本文所用的FasL"相关"多肽指FasL同源物、FasL同种型或FasL直向同源物。本文所用的VEGFR"相关"多肽指VEGFR同源物、VEGFR同种型或VEGFR直向同源物。
"宿主细胞"是含有表达载体并能支持该表达载体复制或表达的天然产生的细胞或转化细胞。宿主细胞可以是培养的细胞、外植体、体内的细胞等。宿主细胞可以是原核细胞如大肠杆菌(E.coli)或真核细胞如酵母、昆虫细胞、两栖动物细胞或哺乳动物细胞,如Cos细胞(如Cos-7)、CHO、293、3T3、HeLa等细胞(参见例如,AmericanType Culture Collection(美国典型培养物保藏中心))。
提到两种或多种核酸或多肽序列时,术语"相同"或"相同性"百分数指采用BLAST或BLAST 2.0序列比较算法(默认参数如下)或通过手工比对和目测测定,两种或多种序列或子序列的特定区域相同,或区域中一定百分数的氨基酸残基或核苷酸相同(即,对比较窗口或指定区域作比较和比对的最大对应性,约60%相同,优选70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多相同)(参见例如,NCBI网站http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/等)。称这类序列"基本相同"。此定义还指,或可应用于测试序列的互补性。该定义还包括含有缺失和/或添加的序列,以及含有取代的序列,以及天然产生的(如)多态性或等位基因变体和人造变体。下述的优选算法可计算缺口等。优选地,在长度为至少约25个氨基酸或核苷酸的区域上,或更优选在长度为50-100个氨基酸或核苷酸的区域上存在相同性。
在序列比较中,一般将一种序列用作参比序列,将测试序列与其作比较。采用序列比较算法时,将测试和参比序列输入计算机,如果需要,指定子序列的坐标,并指定序列算法程序参数。优选采用默认的程序参数,或者可指定其它参数。然后,用该序列比较算法根据程序参数计算测试序列相对于参比序列的序列相同性百分数。
本文所用的"比较窗口"包括一般选自约20-600、通常约50-200、更通常约100-150个毗连位置中的一段序列,其中在两种序列最优比对后将测试序列与毗连位置数相同的参比序列作比较。本领域熟知用于比较的序列比对方法。可通过(例如)Smith和Waterman,AdvApplMath 2:482(1981)的局部同源性算法;Needleman和Wunsch,J MolBio.48:443(1970)的同源比对算法;Pearson和Lipman,Proc Nat′l Acad Sci.USA85:2444(1988)的相似性搜索法;这些算法的计算机执行(威斯康星遗传学软件包(Wisconsin Genetics Software Package)中的GAP、BESTFLT、FASTA和TFASTA,遗传学计算组(Genetics Computer Group),575 Science Dr.,威斯康星州麦迪逊)或手动比对和目测(参见例如,Current Protocols in Molecular Biology(新编分子生物学方法)(Ausubel等编,1995增刊))进行最优序列比对,以便进行比较。
适合测定序列相同性和序列相似性百分数的算法的优选例子包括BLAST和BLAST 2.0算法,参见Altschul等,Nucl Acids Res 25:3389-3402(1977)和Altschul等,J Mol Biol 215:403-410(1990)。采用BLAST和BLAST 2.0和本文所述参数来测定本发明核酸和蛋白质的序列相同性百分数。公众可以通过国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)(http://www.ncbi.nhn.nih.gov/)获得进行BLAST分析的软件。这种算法包括:首先通过鉴定查询序列中长W的短字来鉴定用同样长度的字在数据库序列中比对时能匹配或满足某些阳性评价阈值评分T的高评分序列对(HSP)。T称为相邻字评分阈值(Altschul等,同上)。这些初始相邻的字命中可用作种子来启动搜索找到含有它们的较长HSP。字命中沿各序列在两个方向上延伸,直至提高累积的比对评分。就核苷酸序列而言,可采用(例如)参数M(一对匹配残基的奖分;总是>0)和N(错配残基的罚分;总是<0)来计算累积评分。就氨基酸序列而言,用评分矩阵计算累积评分。当累积比对评分由最大获得值下降至X;由于累积了一个或多个阴性比对残基的评分,或达到任一序列的末端时,累积评分接近零或零以下;中止字命中在二方向上的延伸。BLAST算法参数W、T和X决定了比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)所用的默认参数为:字长(W)11,预计值(E)10,M=5,N=-4和比较两条链。就氨基酸序列而言,BLASTP程序所用的默认参数为:字长3,预计值(E)10,BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff和Henikoff,Proc Natl Acad Sci USA 89:10915(1989))比对(B)50,预计值(E)10,M=5,N=-4和比较两条链。
BLAST算法也对二序列之间的相似性进行了统计学分析(参见例如,Karlin和Altschul,Proc Natl Acad Sci USA 90:5873-5787(1993))。BLAST算法提供的一种相似性测定方法是最小总和概率(P(N)),它说明两种核苷酸或氨基酸序列之间偶然发生匹配的概率。例如,如果将某测试核酸与参比核酸作比较时最小的总和概率小于约0.2,更优选小于约0.01,最优选小于约0.001,则认为该核酸类似于参比序列。对数值可以是大负数,如5、10、20、30、40、40、70、90、110、150、170等。
如果第一种核酸编码的多肽能够与第二种核酸编码的多肽的抗体发生免疫交叉反应,则表明这两种核酸序列或多肽基本相同,如下所述。因此,例如,当两种肽的区别仅仅在于保守取代时,该多肽与第二种多肽基本相同。当两种分子或其互补物能在严谨条件下互相杂交,则说明这两种核酸序列基本相同,如下所述。另外,如果可采用相同引物扩增二种核酸序列,则说明这两种核酸序列基本相同。
术语"抑制"包括VEGF和VEGF受体的相互作用;血管新生;血管新生相关性疾病的症状,或VEGF可能介导的任何其它活性的任何可测定、可重现的降低。
术语"分离"、"纯化"或"生物纯"指某物质基本不含在天然状态下通常与其相伴的组分。一般用分析化学技术如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱测定纯度和均一性。作为制剂中存在的主要物质的蛋白质或核酸是基本纯化的。具体说,分离核酸不含有天然侧接于该基因的编码该基因编码蛋白以外的蛋白质的一些开放阅读框。在一些实施方式中,术语"纯化"指核酸或蛋白质在电泳凝胶中主要产生一条条带。优选地,这意味着该核酸或蛋白质的纯度为至少85%,更优选至少95%,最优选至少99%。在其它实施方式中,"纯度"或"纯化"指去除该组合物中的至少一种污染物。从这个意义上说,纯化过程不需要使纯化化合物均一,如100%纯。
提到死亡受体信号转导时,本文所用术语"调节"指化合物在体外和/或体内改变死亡受体功能的能力。化合物优选激活死亡受体的活性,这取决于该化合物的浓度。
本文所用的"核酸"或"寡核苷酸"或"多核苷酸"或其语法等同形式指共价连接在一起的至少两个核苷酸。寡核苷酸的长度一般为约5、6、7、8、9、10、12、15、25、30、40、50或更多个核苷酸,长度至多约100个核苷酸。核酸和多核苷酸是任何长度的聚合物,包括较长的聚合物,如200、300、500、1000、2000、3000、5000、7000、10,000个核苷酸等。本发明核酸通常包含磷酸二酯键,但在一些情况下,所包含的核酸类似物可以含有交替主链,包括例如:氨基磷酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或O-甲基亚磷酰胺连接(参见Eckstein,Oligonucleotides and Analogues:A PracticalApproach(寡核苷酸和类似物:实用方法),牛津大学出版社);以及肽核酸主链和连接。其它类似核酸包括含有正电主链;非离子主链和非核糖主链的核酸,包括美国专利5,235,033和5,034,506,以及ASC研讨会丛书580的第6和7章,CarbohydrateModifications in Antisense Research(反义研究中的糖修饰)(Sanghui和Cook编)所述的核酸。核酸定义中还包括含有一个或多个碳环糖的核酸。可能因各种原因而修饰核糖-磷酸主链,例如提高这类分子在生理环境中或作为探针在生物芯片上的稳定性和半衰期。可制备天然产生的核酸和类似物的混合物;或者,可制备不同的核酸类似物的混合物,以及天然产生的核酸和类似物的混合物。
各种参考文献公开了这些核酸类似物,包括例如,氨基磷酸酯(Beaucage等,Tetrahedron 49(10):1925(1993)和其中的参考文献;Letsinger,J Org Chem 35:3800(1970);Sprinzl等,Eur J Biochem 81:579(1977);Letsinger等,Nucl Acids Res 14:3487(1986);Sawai等,Chem Lett 805(1984),Letsinger等,J Am Chem Soc 110:4470(1988);和Pauwels等,Chemica Scripta 26:141 91986)),硫代磷酸酯(Mag等,Nucl Acids Res19:1437(1991);和美国专利号5,644,048),二硫代磷酸酯(Briu等,J.Am.Chem.Soc.111:2321(1989),O甲基亚磷酰胺连接(参见Eckstein,Oligonucleotides and Analogues:A Practical Approach(寡核苷酸和类似物:实用方法),牛津大学出版社)和肽核酸主链和连接(参见Egholm,J Am Chem Soc 114:1895(1992);Meier等,Chem Int Ed Engl31:1008(1992);Nielsen,Nature 365:566(1993);Carlsson等,Nature 380:207(1996),将其纳入本文作参考)。其它类似核酸包括含有正电主链(Denpcy等,Proc Natl AcadSci USA 92:6097(1995);非离子主链(美国专利5,386,023、5,637,684、5,602,240、5,216,141和4,469,863;Kiedrowshi等,Angew.Chem Intl英文版30:423(1991);Letsinger等,J Am Chem Soc 110:4470(1988);Letsinger等,Nucleoside & Nucleotide(核苷和核苷酸)13:1597(1994);ASC研讨会丛书580的第2和3章,CarbohydrateModifications in Antisense Research(反义研究中的糖修饰),Y.S.Sanghui和P.Dan Cook编;Mesmaeker等,Bioorganic and Medicinal Chem.Lett 4:395(1994);Jeffs等,JBiomolecular NMR 34:17(1994);Tetrahedron Lett 31:743(1996))和非核糖主链的核酸,包括美国专利5,235,033和5,034,506以及ASC研讨会丛书580的第6和7章,Carbohydrate Modifications in Antisense Research(反义研究中的糖修饰),Y.S.Sanghui和P.Dan Cook(编)所述的核酸。核酸定义中还包括含有一个或多个碳环糖的核酸(参见Jenkins等,Chem Soc Rev第169 176页(1995))。Rawls,C和E News,1997年6月2日,第35页描述了几种核酸类似物。特别将所有这些参考文献纳入本文作参考。
其它类似物包括肽核酸(PNA),它是肽核酸类似物。与天然产生核酸的磷酸二酯主链带有大量电荷不同,在中性条件下这些主链基本上是非离子性的。这产生了两个优点。首先,PNA主链具有改进的杂交动力学特性。与完美匹配的碱基对相比,错配时PNA的解链温度(Tm)改变较大。一个内部错配会使DNA和RNA的Tm降低2-4℃。用非离子型PNA主链时,Tm降低接近7-9℃。相似地,由于它们的非离子性属性,连接于这些主链的碱基杂交时对盐浓度相对不敏感。此外,PNA无法被细胞酶降解,因此可能更稳定。
如上所述,核酸可能是单链或双链,或含有双链或单链序列部分。本领域技术人员应理解,对单链的描述也确定了互补链的序列;因此本文所述序列也提供了该序列的互补物。核酸可以是DNA(基因组DNA和cDNA)、RNA或杂交体,其中核酸可含有脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的组合,以及碱基组合,所述碱基包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、异胞嘧啶、异鸟嘌呤等。"转录物"一般指天然产生的RNA,如前-mRNA、hnRNA或mRNA。本文所用术语"核苷"包括核苷酸以及核苷和核苷酸类似物,修饰核苷如氨基修饰的核苷。此外,"核苷"包括非天然产生的类似结构。因此,例如,各自含有一个碱基的单个肽核酸单元在本文中称为核苷。
"标记"或"可检测部分"是可通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、化学或其它物理方法检测的组合物。例如,有用的标记包括32P、荧光染料、电子致密试剂、酶(如通常用于ELISA)、生物素、地高辛或半抗原和可通过(例如)将放射性标记掺入肽使其可检测或用于检测与该肽发生特异性反应的抗体的任何物质。可将该标签掺入乳腺癌核酸、蛋白质和抗体的任何位置。可采用本领域已知将所述抗体与此种标签偶联的任何方法,包括Hunter等,Nature 144:945(1962);David等,Biochemistry13:1014(1974);Pain等,J Immunol Meth 40:219(1981);和Nygren,J Histochem.和Cytochem 30:407(1982)所述的方法。
"标记的核酸探针或寡核苷酸"是通过接头或化学键共价结合,或通过离子键、范德华力、静电力或氢键非共价结合于标记的探针,以便通过检测结合于探针的标签来检测该探针是否存在。或者,采用高亲和力相互作用的方法可获得相同结果,结合对中的一种物质结合于另一种物质,如生物素与链霉亲和素。
本文所用术语"核酸探针或寡核苷酸"定义为核酸能够通过一种或多种类型的化学键,通常通过互补碱基配对,通常通过氢键形成而结合于互补序列的靶核酸。本文所用的探针可包括天然(即A、G、C或T)或修饰的碱基(7-脱氮鸟苷、肌苷等)。此外,探针中的碱基例如通过除磷酸二酯键以外的连接键相连接,只要不会功能上干扰杂交。因此,例如,探针可以是组成的碱基通过肽键而非磷酸二酯键连接的肽核酸。本领域技术人员应理解,探针可结合与探针序列不完全互补的靶序列,这取决于杂交条件的严谨性。探针优选直接用同位素、生色团、发光团、色原直接标记,或用(例如)生物素间接标记,随后与链霉亲和素结合形成复合物。通过检测是否存在探针,便可检测是否存在选择的序列或子序列。诊断或预后可根据基因组水平,或RNA或蛋白质表达水平。
用于(例如)细胞或者核酸、蛋白质或载体的术语"重组"指,通过引入异源核酸或蛋白质或改变天然核酸或蛋白质修饰细胞、核酸、蛋白质或载体,或者由如此修饰的细胞产生的细胞。因此,例如,重组细胞表达在天然(非重组)形式的细胞中没有发现的基因或表达在其它情况下异常表达、低水平表达或根本不表达的天然基因。本文所用术语"重组核酸"指最初(如)利用聚合酶和核酸内切酶在体外操作核酸而形成的天然情况下没有发现的核酸。以此形式,获得不同序列的操作性连接。因此,出于本发明目的,线性形式的分离核酸或通过连接通常并不连接在一起的DNA分子在体外形成的表达载体都被认为是重组形式。应理解,一旦制备了重组核酸并将其重新引入宿主细胞或生物体后,它能以非重组方式复制,即利用宿主细胞的体内细胞机器而非体外操作复制;然而,出于本发明目的,一旦用重组方法产生这类核酸后,虽然随后以非重组方式复制,但仍应认为其是重组核酸。相似地,"重组蛋白"是用重组技术,即通过表达上述重组核酸产生的蛋白质。
用于核酸部分时,术语"异源"指某核酸包含在天然情况下通常没有相互关系的两种或多种子序列。例如,核酸一般是重组产生的,含有两种或多种序列,(例如)来自无关基因用于制备新功能的核酸,如某一来源的启动子和另一来源的编码区。相似地,异源蛋白常指在天然情况下通常没有相互关系的两种或多种子序列(如融合蛋白)。
本文所用术语"多肽"、"肽"和"蛋白质"指氨基酸残基的聚合物。该术语还应用于其中一个或多个氨基酸残基是相应天然产生氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物,含有修饰残基的天然产生的氨基酸聚合物和非天然产生的氨基酸聚合物。本发明的多肽和肽包括含有单个氨基酸残基D-和L-同种型的氨基酸聚合物,以及其它氨基酸变体。可通过组成肽分子一级结构的氨基酸残基数目区分肽。出于本发明目的,肽一般是由至多50个氨基酸残基组成的氨基酸聚合物,多肽则包含50个以上的氨基酸残基。
"启动子"定义为指导核酸转录的一种核酸控制序列的阵列。本文所用的启动子包括在转录起始位点附近的必须核酸序列,例如在聚合酶II型启动子、TATA元件的情况下。启动子还任选包含远端增强子或阻抑元件,它们可距转录起始位点数千个碱基对。
"组成型"启动子是在大多数环境和发育条件下有活性的启动子。"诱导型"启动子是在环境或发育调控下有活性的启动子。术语"操作性连接"指核酸表达控制序列(如启动子,或转录因子结合位点阵列)与第二种核酸序列之间的功能连接,其中所述表达控制序列指导对应于第二种序列的核酸的转录。
本文所用术语"牛皮癣"指具有多基因遗传性和波动病程的常见的慢性鳞片状皮炎。本领域熟知其诊断方法。它是特征是表皮过度增殖、炎症和血管新生的慢性皮肤病。
本文所用术语"类风湿性关节炎"指慢性系统性疾病,主要涉及关节,通常是多关节性疾病,其特征是滑膜和关节结构的炎性改变,以及肌肉萎缩和骨稀薄化。类风湿性关节炎的形式包括但不限于:青少年关节炎、慢性绒毛状关节炎、环杓性关节炎、变形性关节炎、退化性关节炎、毁形性关节炎和增殖性关节炎。
术语"选择性(或特异性)杂交于"指当某特定核苷酸序列存在于复杂混合物(如全部细胞或者文库DNA或RNA)中时,某分子只与该序列在严谨杂交条件下结合、形成双链体或杂交。
术语"严谨杂交条件"指探针与其靶子序列杂交(一般是在复杂的核酸混合物中的靶子序列),但不与其它序列杂交的条件。严谨条件是序列依赖性的,在不同环境下不同。较长序列在较高温度下特异性杂交。核酸杂交的广泛指南参见Tijssen,Techniques in Biochemistry and Molecular Biology—Hybridization with NucleicProbes(生化和分子生物学—与核酸杂交),"Overview of principles of hybridization和the strategy of核酸assays(核酸实验的杂交原理和方案的概览)"(1993)。通常选择的严谨条件在确定离子强度pH下,比具体序列的热解链温度(Tm)低约5-10℃。Tm是50%互补探针与靶序列杂交达到平衡的温度(在确定的离子强度、pH和核酸浓度下)(因为靶序列在Tm下过量存在,所以平衡时50%探针被占据)。严谨条件是:在pH为7.0-8.3时盐浓度低于约1.0M钠离子,一般约为0.01-1.0M钠离子浓度(或其它盐),短探针(如10-50个核苷酸)温度为至少约30℃和长探针(如50个核苷酸以上)温度为至少约60℃。也可通过加入去稳定剂如甲酰胺获得严谨条件。
在选择性或特异性杂交中,阳性信号至少是背景的两倍,优选为背景杂交的10倍。示范性严谨杂交条件可以是:50%甲酰胺、5x SSC和1% SDS,42℃培育,或者,5x SSC,1% SDS,65℃培育,用0.2x SSC洗涤,以及0.1% SDS 65℃培育。在PCR中,低严谨性扩增的温度一般为约36℃,但退火温度可在约32℃-48℃之间变动,这取决于引物长度。在高严谨性PCR扩增中,温度一般为约62℃,但高严谨性退火温度可能约为50℃-65℃,这取决于引物长度和特异性。高和低严谨性扩增的典型循环条件包括90℃-95℃ 30秒至2分钟的变性阶段,退火阶段持续30秒至2分钟,延伸阶段约为72℃ 1-2分钟。低和高严谨性扩增反应的方案和指南参见(例如)Innis等(1990)PCR Protocols,A Guide to Methods and Applications(PCR方案,方法和应用指南),纽约的学术出版社公司(Academic Press,Inc.))。
如果二核酸编码的多肽基本相同,即使在严谨条件下不相互杂交仍然认为基本相同。例如,用遗传密码允许的最大密码子简并性产生的核酸拷贝就是这样。在这种情况下,核酸一般在中等严谨条件下即能杂交。示范性的"中等严谨条件"包括在40%甲酰胺、1M NaC、1% SDS的缓冲液中37℃杂交,用1x SSC于45℃洗涤。阳性杂交至少是背景的两倍。本领域普通技术人员不难认识到,替代的杂交和洗涤条件可用于提供严谨性相似的条件。许多参考文献中提供了测定杂交参数的其它指南,例如Current Protocols in Molecular Biology(新编分子生物学方案),Ausubel等编。
本文所用术语"治疗"包括:(1)预防疾病,如癌症,即使易患疾病但尚未出现任何疾病症状的对象不发生疾病的临床症状;(2)抑制疾病,即阻滞或减缓疾病或其临床症状的发展;或(3)缓解疾病,即引起疾病或其临床症状消退。治疗指减轻或有益地改变症状或病症、失调或疾病的病理状况的任何方式。治疗也包括本发明组合物的药物应用。需要治疗的对象优选是哺乳动物,更优选人。
"肿瘤细胞"指肿瘤中的癌前、癌症和正常细胞。
"VEGF"指血管内皮生长因子家族的任何成员,以及剪接变体和同种型。VEGF可以是四种不同的剪接变体,称为VEGF121(或VEGF-121)、VEGF165(或VEGF-165)、VEGF189(或VEGF-189)和VEGF206(或VEGF-206;数字指多肽中的氨基酸数量)。所有四种同种型均为二硫键连接的同源二聚体。不同细胞类型的同种型分泌模式不同,但VEGF165是观察到的最常见同种型。近年来,在来自女性生殖道的三种人癌细胞系中发现了第五种变体VEGF145(Poltorak等,J Biol Chem(1997)272:7157-7158)。这五种同种型以高亲和力与两种受体Flt-I和Flk-1/KDR结合,但它们对肝素和胞外基质的结合亲和力不同。近年来,已鉴定到VEGF家族的三个新成员—VEGF-B、VEGF-C和VEGF-D(Achen等,Proc Natl Acad Sci USA(1998),95(2):548-53)。已发现了能刺激内皮细胞生长的VEGF-B的两种剪接变体(Olofsson等,J Biol Chem(1996),271:19310-19317;Olofsson等,Proc Natl Acad Sci USA(1996),93:2576-2581)。
术语"VEGF结合活性"指VEGFR多肽与VEGF多肽结合的活性。用本文所述和本领域已知的结合实验测定结合。
生物学样品中的"VEGF mRNA水平"指细胞或生物学样品中存在的由VEGF基因转录的mRNA量。mRNA通常编码有功能的VEGF多肽,但可能存在改变或消除该编码多肽的功能的突变。一般地,定量测定"VEGF mRNA水平",并与对照样品的水平或对照样品的预计水平作比较。然而,可简单地检测"VEGF mRNA水平",例如由人进行主观目测,进行或不进行比较。
生物学样品中的"VEGF多肽水平"指细胞或生物学样品中存在的由VEGFmRNA翻译的VEGF多肽量。该多肽可以或可以不具有VEGF多肽活性。一般地,定量测定"VEGF多肽水平",并与对照样品的水平或对照样品的预计水平作比较。然而,也可简单地检测"VEGF多肽水平",例如由人进行主观的目测,进行或不进行比较。
本文所用术语"VEGF表达上调"或"VEGF过度表达"和其语法等同形式指VEGF多肽或VEGF多核苷酸高于预定的参比水平。因此,例如,按照本发明,正常或健康对象中VEGF多肽或VEGF多核苷酸的参比水平被确定为截止值,高于该值时,VEGF多肽或VEGF多核苷酸的水平与癌症显著相关。一般地,与正常或健康人的VEGF水平相比,癌症患者血清中的VEGF水平高出至少约为2倍,在某些癌症如卵巢癌中,通常高出至少约为5倍,更通常至少约10倍(参见例如,Manenti等,EurJ Cancer(2003),39:1948-1956)。在本文中,术语"上调"和"过度表达"可互换使用。本领域已知测定VEGF水平的方法,包括但不限于RT-PCR和使用抗-VEGF抗体。
"使含量相互关联"指将一种样品中测定的物质、分子或标记物(如VEGF)的含量与另一样品中测定的物质、分子或标记物的含量作比较。另一样品中测定的同一物质、分子或标记物的含量可能对某给定疾病或癌症具有特异性。
本发明范围内考虑了术语"测定含量"的同义词,包括但不限于:检测、测定、检验或确定分子如VEGF的存在、不存在、含量或浓度。
术语"VEGFR"或"VEGF受体"指结合VEGF或VEGF家族成员、剪接变体和同种型的受体。酪氨酸激酶VEGF受体家族的特征是胞外结构域和分离的酪氨酸激酶结构域中含有7个免疫球蛋白样序列。VEGFR包括:(i)Flt-1(fms样酪氨酸激酶),也称为VEGFR-1(Shibuya等,Oncogene(1990),5:519-524;De Vries等,Science(1992),255:989-991);(ii)Flk-1(胎肝激酶)、小鼠RTK(Quinn等,Proc Natl Acad Sci USA(1993),90:7533-7537;Millauer等,Cell(1993),72:835-846)和其人同源物,KDR(含有激酶插入结构域的受体;Terman等,Biochem Biophys Res Comm(1992),187:1579-1586);和(iii)Flt-4,淋巴内皮上表达,但血管内皮上不表达(Pajusola等,CancerRes(1992),52:5738-43)。
术语"VEGFR-FasL"指包含以下部分的融合蛋白:(i)VEGFR、VEGFR片段、VEGFR结构域、VEGFR相关多肽或VEGFR相关多肽片段的氨基酸序列和(ii)FasL、FasL片段、FasL相关多肽或FasL相关多肽片段的氨基酸序列。一般用标准的分子克隆技术将VEGFR、VEGFR片段、VEGFR结构域、VEGFR相关多肽或VEGFR相关多肽片段的氨基酸序列融合于FasL、FasL片段、FasL相关多肽或FasL相关多肽片段的氨基酸序列的N末端。
术语"VEGFR多肽"或VEGFR核酸"指分离的核酸、多肽和它们的多态性变体、等位基因、突变体和种间同源物,如本文以下的进一步详述:(1)优选在至少约50、75、100、150、200、250、300个或更多个氨基酸的区域上,其氨基酸序列与下述序列的氨基酸序列相同性大于约60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%,优选91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或更高,(i)以下所示血管内皮生长因子(VEGF)受体-1的胞外区序列;(ii)以下所示血管内皮生长因子(VEGF)受体-2的胞外区序列;或(iii)以下所示血管内皮生长因子(VEGF)受体-3的胞外区序列;(2)能结合用含有下述氨基酸序列的免疫原或其保守修饰变体产生的抗体(如多克隆抗体);(3)能结合VEGF多肽;(4)能与天然产生的VEGF受体-1、VEGF受体-2或VEGF受体-3蛋白竞争结合VEGF多肽;(5)能抑制VEGF与VEGF受体结合;(6)能在严谨杂交条件下特异性杂交于以下所示核酸序列,或其保守修饰变体;(7)优选在至少约100、200、300、400、500、600、700、800、900、1,000个或更多个核苷酸的区域上,其核酸序列与SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18(人VEGFR-2);SEQ ID NO.21(人VEGFR-1)的核苷酸序列相同性大于约90%,优选大于约96%、97%、98%、99%或更高;和/或(8)含有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:4(人VEGFR-2)或SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20(人VEGFR-1)或SEQ ID NO:24(人神经毡蛋白-1)或SEQ ID NO:25(人VEGFR-3)的至少50个,常常是75、100、115、150、175、200、250或300个毗连氨基酸残基。
VEGFR多核苷酸或多肽序列一般来自人,但可能来自其它哺乳动物,例如但不限于:非人灵长动物,啮齿动物如大鼠、小鼠或仓鼠;牛、猪、马、绵羊或其它哺乳动物。因此,在一些实施方式中,本文所述的VEGFR多肽和VEGFR亚域多肽可包含对应于人VEGFR序列的序列。因此,本文提供了示范性VEGFR,它是本领域已知的。例如,人VEGFR-2多肽的GenBank登录号是NP_002244和P35968。小鼠VEGFR-2多肽的GenBank登录号是(例如)P35918;大鼠VEGFR-2是008775。人VEGFR-2cDNA序列可参见GenBank NM_002253。人VEGFR-1多肽的GenBank登录号是NP_002010、P17948、AAC16449、CAI17096和CAI14846。小鼠VEGFR-1多肽的GenBank登录号是(例如)NP_034358;大鼠VEGFR-1是NP_062179和P53767。人VEGFR-1 cDNA序列可参见GenBank NM_002019。
II.VEGFR-死亡配体融合蛋白
本发明提供了结合死亡受体的新型融合蛋白。本发明融合蛋白包含(i)结合血管内皮因子(VEGF)多肽的血管内皮生长因子受体(VEGFR)多肽和(ii)含有寡聚化结构域和死亡受体识别部分的死亡配体,其中VEGFR多肽的C末端连接于死亡配体的N末端。
A.VEGF受体多肽
用于制备本发明融合蛋白的VEGFR多肽可获自数种VEGFR,如Flt-1(fms-样酪氨酸激酶;VEGFR-1)、Flk-1(胎肝激酶;KDR;VEGFR-2)和Flt-4。出于本发明目的,结合VEGF的VEGFR多肽一般包含VEGFR的胞外结构域或其一部分。
优选的VEGFR多肽包含VEGFR-1的胞外结构域或其一部分。优选的VEGFR-1是人VEGFR-1。人VEGFR-1的氨基酸序列见SEQ ID NO:19。
可将几种VEGFR-1多肽或VEGFR-1亚域多肽连接于Fas配体,以产生本发明融合蛋白。在优选实施方式中,VEGFR-1多肽或VEGFR-1亚域多肽选自(i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:20的多肽;(ii)包含SEQ ID NO:19的氨基酸残基1-747的多肽;(iii)包含SEQ ID NO:19的氨基酸残基32-747的多肽;(iv)包含氨基酸序列SEQ IDNO:19的氨基酸151-214的多肽;(v)包含氨基酸序列SEQ ID NO:19的氨基酸230-327的多肽;(vi)包含VEGFR1的氨基酸129-230(如图10所示的SDTG...NTII;结构域2(D2))的多肽,和(vii)包含在(i)-(vi)中任一项氨基酸序列中缺失、取代或添加一个至数个氨基酸残基的氨基酸序列的具有VEGF结合活性的多肽。
术语"在氨基酸序列中缺失、取代或添加一个至数个氨基酸残基"指在氨基酸序列中缺失、取代或添加一般少于25个,更一般少于20个,更一般少于15个,最一般少于10个氨基酸残基。
每个VEGFR-1亚域多肽包含至少一个IgG-样结构域。人VEGFR-1的IgG样结构域包含SEQ ID NO:19的氨基酸残基1-747;SEQ ID NO:19的氨基酸残基32-747;SEQ ID NO:19的氨基酸残基32-123;SEQ ID NO:19的氨基酸残基151-214;SEQ IDNO:19的氨基酸残基230-327;SEQ ID NO:19的氨基酸残基335-4221;SEQ ID NO:19的氨基酸残基428-553;SEQ ID NO:19的氨基酸残基556-654;或SEQ ID NO:19的氨基酸残基661-747。
还优选其它哺乳动物VEGFR-1多肽,包括但不限于:小鼠和大鼠VEGFR-1多肽。可通过比对哺乳动物VEGFR-1序列与人VEGFR-1氨基酸序列来鉴定其它哺乳动物的VEGFR-1亚域多肽。
另一种优选的VEGFR多肽包含VEGFR-2的胞外结构域或其一部分。VEGFR-2优选为人VGEFR-2。在本发明的优选实施方式中,融合蛋白包含含有氨基酸序列SEQID NO:1的VEGFR-2多肽。这种VEGFR-2多肽包含人VEGFR-2的信号肽。在本发明的另一优选实施方式中,融合蛋白包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:4的VEGFR-2多肽。这种VEGFR-2多肽不包含信号肽。
可将几种VEGFR-2多肽或VEGFR-2亚域多肽连接于Fas配体,以产生本发明融合蛋白。在优选实施方式中,VEGFR-2多肽或VEGFR-2亚域多肽选自(i)含有氨基酸序列SEQ ID NO:1的多肽;(ii)含有氨基酸序列SEQ ID NO:2的多肽;(iii)含有氨基酸序列SEQ ID NO:3的多肽;(iv)含有氨基酸序列SEQ ID NO:4的多肽;(v)含有氨基酸序列SEQ ID NO:5的多肽;(vi)含有氨基酸序列SEQ ID NO:6的多肽;(iiv)含有氨基酸序列SEQ ID NO:1的氨基酸141-207的多肽;(iix)含有氨基酸序列SEQID NO:1的氨基酸224-320的多肽;和(ix)包含在(i)-(iix)中任一项氨基酸序列中缺失、取代或添加一个至数个氨基酸残基的氨基酸序列的具有VEGF结合活性的多肽。
每个VEGFR-2亚域多肽包含至少一个IgG样结构域。在本发明的一个优选实施方式中,VEGFR-死亡配体融合蛋白包含人VEGFR-2的IgG样结构域,其含有氨基酸序列SEQ ID NO:1的氨基酸残基141-207。在另一实施方式中,人VEGFR-2的IgG样结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:1的氨基酸残基224-320。
本文所述的VEGFR亚域多肽可互相交换。因此,可设计一种VEGFR多肽,其包含一个或多个VEGFR-1(优选人VEGFR-1)的IgG样结构域和一个或多个人VEGFR-2(优选人VEGFR-2)的IgG样结构域。
在本发明的某些实施方式中,VEGFR是VEGFR同源物、VEGFR同种型、VEGFR直向同源物或VEGFR相关多肽。
B.死亡配体
本发明提供了包含上述VEGFR多肽和可结合死亡受体的死亡配体的新型融合蛋白。连接于VEGFR多肽的死亡配体包含寡聚化结构域和死亡受体识别部分。
用于制备本发明融合蛋白的死亡配体的综述参见Lavrik等,J Cell Sci(2005),118:265-267(全文纳入本文作参考),氨基酸序列和核苷酸序列可由GenBank获得。用于制备本发明融合蛋白的含有寡聚化结构域和死亡受体识别部分的死亡配体可获自数种死亡配体,如Fas配体(FasL)、肿瘤坏死因子(TNF)或淋巴毒素(LT)。出于本发明目的,结合死亡受体的含有寡聚化结构域和死亡受体识别部分的死亡配体一般包含死亡配体的胞外结构域或其一部分。
C.FasL
在本发明的优选实施方式中,该融合蛋白能结合Fas,该死亡配体是Fas配体(FasL)。因此,本发明的优选融合蛋白VEGFR-FasL包含含有寡聚化结构域和死亡受体识别部分的Fas配体。本发明VEGFR-FasL融合蛋白中的FasL含有至少一个对结合Fas蛋白和传递凋亡信号所必需而有效的功能域或决定簇。这类FasL决定簇通常仅含一部分胞外结构域,然而,它们保持了完整FasL的结合特异性,并且可溶。
用于本发明的优选FasL多肽包含FasL胞外结构域或其一部分。该FasL优选为人FasL。含有三聚化结构域和其受体(Fas)结合域的人FasL多肽的氨基酸序列参见SEQ ID NO:11。因此,在优选实施方式中,本发明融合蛋白包含含有SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的FasL。
在其它优选实施方式中,FasL是哺乳动物FasL,包括但不限于小鼠或大鼠的FasL。因此,在一个实施方式中,本发明融合蛋白包含SEQ ID NO:12所示的鼠FasL多肽。在另一实施方式中,本发明融合蛋白包含SEQ ID NO:13所示的大鼠FasL多肽。
用于本发明的另一种FasL是包含在氨基酸序列SEQ ID NO:11、SEQ ED NO:12或SEQ ID NO:13中缺失、取代或添加一个至数个氨基酸残基的氨基酸序列的具有Fas结合活性的多肽。
死亡配体包含两个亚域,即寡聚化结构域和死亡受体识别部分。图1是FasL的三聚化结构域(即寡聚化结构域)和FasL的Fas-结合域(即死亡受体识别部分)的示意图。如本文进一步所述,TNF显示具有相似结构。
在本发明的一个方面,本文所述的死亡配体亚域可相互交换。因此,例如,可设计一种FasL多肽,其包含FasL的Fas结合域和TNF三聚化结构域,反之亦然。本领域已知TNF结构域和相应氨基酸序列,本领域普通技术人员无需进行过多实验即可鉴定相应结构域(见下)。
在另一方面,可设计嵌合FasL多肽,其包含(例如)人FasL的Fas识别部分和另一种哺乳动物如小鼠或大鼠的FasL三聚化结构域。
用于人类患者时,优选采用人Fas配体。可采用其它动物的FasL在(例如)小鼠和大鼠中进行体外或体内检测。
FasL融合蛋白或FasL变体参见例如,美国专利6,451,759;6,544,523;6,348,334;6,235,878;6,046,310;6,001,962;美国专利申请2004/0126859;2004/0053249;和2005/0013816中的描述,特别将所有参考文献纳入本文作参考。在本发明的某些实施方式中,FasL是FasL同源物、FasL同种型、FasL直向同源物或FasL相关多肽。
D.VEGFR-死亡配体融合蛋白
如本文详述,本发明的VEGFR-死亡配体融合蛋白与已经开发或正在开发的靶向VEGF或其受体的许多药物不同。设计的所有这些药物(包括中和抗体、可溶性VEGF受体、RNA适体、RNAi、核酶、反义序列、小分子激酶抑制剂)均能抑制VEGF或其受体的表达或活性。这些药物都没有引起VEGF过度表达而产生凋亡活性。本发明提供的组合物,如VEGFR-死亡配体融合蛋白,可使(例如)肿瘤过度表达VEGF,将肿瘤自身产生的武器用作死亡因子,即诱导表达死亡受体的肿瘤凋亡。
本发明提供了新型VEGFR-死亡配体融合蛋白。图1图解说明了本发明的优选实施方式。VEGFR多肽连接于FasL的这一实施方式称为VEGFR-FasL。在此实施方式中,VEGFR多肽的羧基末端连接于FasL的氨基末端。FasL优选连接于VEGFR多肽的羧基末端,但也可连接于其它地方。
VEGFR-死亡配体融合蛋白,具体是VEGFR-FasL融合蛋白(如本文中SEQ IDNO:22和SEQ ID NO:23所示的VEGFR-2-FasL),是可溶性蛋白质。这种可溶性蛋白质组合了VEGFR胞外结构域的VEGF结合域与死亡配体的三聚化结构域和死亡受体识别部分。
设计的本发明VEGFR-死亡配体融合蛋白,具体是VEGFR-FasL融合蛋白,使得VEGF二聚体将VEGFR-死亡配体三聚体聚集成簇,该簇可结合、簇集而激活死亡受体,具体是Fas。图1是这类实施方式的示意图。
优选的VEGFR-死亡配体融合蛋白见图5-8。这些优选的VEGFR-死亡配体融合蛋白包含Flk的D1、D2和D3结构域。
本发明另一种优选的VEGFR-死亡配体融合蛋白见图9和10。这种优选的VEGFR-死亡配体融合蛋白包含VEGFR1的结构域2(D2)。
1.信号肽
本发明提供了含有VEGFR多肽和死亡配体的新型融合蛋白。含有信号肽序列的全长融合蛋白(例如参见SEQ ID NO:22)和不含信号肽的成熟全长融合蛋白(如SEQID NO:23)可用于实施本发明方法,并用作本发明药物组合物和药盒中的组合物。
因此,本发明融合蛋白可以或可以不包含信号肽序列,取决于其所需用途和生产方式(具体见本文)。信号肽序列可以是同源信号肽序列,即通常见于分泌蛋白N末端的信号肽(例如参见图3)。或者,例如,鼠VEGFR信号序列可取代人VEGFR信号序列,反之亦然,这取决于用于产生本发明融合蛋白的表达系统。
2.接头序列
任选地,VEGFR-FasL含有接头。优选制备连接C末端VEGFR与N末端FasL的这类多肽接头,以使VEGF多肽结合于VEGFR多肽和FasL的二聚化或三聚化以及VEGFR-FasL结合于Fas。该接头可含有1-约100个氨基酸残基,优选5-50个。在优选实施方式中,接头序列包含5个氨基酸残基,如SEQ ID NO:7所示。可插入VEGFR多肽和死亡配体多肽之间的接头序列不重要。其它优选的接头序列包括Gly接头或Gly/Ser接头。
E.其它生长因子/死亡配体蛋白
本发明的基本原理是将生长因子(如VEGF)的生长活性转变为死亡因子,也可将该原理应用于其它生长因子。在这些实施方式中,VEGFR多肽可被另一种生长因子,如血小板衍生生长因子(PDGF)的结合域取代。因此,无需过多实验并且可以合理地预料获得成功,本领域普通技术人员按照本发明和从公共数据库如GenBank获得涉及生长因子序列或生长因子受体的相关信息,或者由美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得编码这类生长因子或生长因子受体的克隆DNA。
F.其它死亡受体/死亡配体蛋白
本发明融合蛋白能够结合死亡受体,优选结合表达死亡受体的细胞表面上的死亡受体。用作本发明方法靶点的死亡受体一般属于TNF受体超家族,包括p55和p75肿瘤坏死因子受体(TNFR)和Fas(也称为FAS/APO1)。肿瘤坏死因子(TNF-α)和淋巴毒素(TNF-β)能结合p55和p75,从而启动导致(例如)表达p55或p75的肿瘤细胞死亡的反应。
因此,在本发明另一方面,VEGFR-死亡配体融合蛋白包含本文所述的VEGFR多肽和结合TNFR的含有寡聚化结构域和死亡受体识别部分的TNF多肽。在另一实施方式中,VEGFR-死亡配体融合蛋白包含VEGFR多肽和含有寡聚化结构域和结合于TNFR的死亡受体识别部分的LT多肽。
G.编码VEGFR-FasL融合蛋白的核酸
在另一方面,本发明涉及编码全部或一部分VEGFR-FasL融合蛋白的重组核酸。在本发明的一个优选实施方式中,编码全部或一部分VEGFR-FasL融合蛋白的核酸包含图7所示核苷酸序列。编码全部或一部分VEGFR-FasL融合蛋白的另一种优选核酸包含图9所示核苷酸序列。编码全部或一部分VEGFR-FasL融合蛋白的其它优选核酸是图7和9所示核酸,但不包含编码接头序列或FLAG-标签的序列。本领域技术人员可通过PCR和适当设计的PCR引物产生这类核酸。
通常,通过探针杂交由cDNA和基因组DNA文库克隆编码VEGFR-死亡配体融合蛋白的核酸序列和相关的核酸序列类似物,或采用寡核苷酸引物的扩增技术分离这些核酸序列或类似物。例如,一般通过核酸探针杂交由哺乳动物核酸(基因组或cDNA)文库分离这些序列。
也可采用引物扩增技术扩增和分离DNA或RNA核酸。可用本领域熟知的原理设计适合扩增具体序列的引物(参见例如,Dieffenfach和Dveksler,PCR Primer:ALaboratory Manual(PCR引物:实验室手册)(1995))。可采用这些引物(例如)扩增VEGFR多肽或死亡配体的全长序列或片段。
也可采用合成寡核苷酸构建VEGFR-死亡配体编码基因,用作探针或用于表达蛋白。用长度通常为40-120bp的一系列重叠寡核苷酸(代表该基因的有义和无义链)进行该方法。然后退火、连接和克隆这些DNA片段。或者,可采用精确引物的扩增技术扩增该核酸的特定子序列。然后将特定子序列连接到表达载体中。
一般将编码VEGFR-死亡配体融合蛋白的核酸克隆到中间载体中,然后转化到原核或真核细胞中进行复制和/或表达。这些中间载体一般是原核载体,如质粒或穿梭载体。
任选地,可按照标准技术制备含有VEGFR、死亡配体或其结构域的嵌合蛋白的编码核酸。
H.表达VEGFR-死亡配体融合蛋白
为了获得高水平表达VEGFR-死亡配体的核酸,一般将VEGFR-死亡配体核酸亚克隆到含有指导转录的强启动子、转录/翻译终止子和(如果用于编码蛋白的核酸)启动翻译的核糖体结合位点的表达载体中。合适的细菌启动子是本领域熟知的,参见例如Sambrook和Russell,Molecular Cloning,A Laboratory Manual(《分子克隆,实验室手册》,第3版,2001),Ausubel等(编),Current Protocols in Molecular Biology(新编分子生物学实验指南),约翰韦利和森思公司(John Wiley & Sons),纽约(1993);和Kriegler,Gene Transfer and Expression,A Laboratory Manual(基因转移和表达,实验室手册),Stockton Press(斯托克顿出版社),纽约(1990)。用于表达VEGFR-死亡配体蛋白的细菌表达系统可获自(如)大肠杆菌(E.coli)、芽孢杆菌(Bacillus sp.)和沙门菌(Salmonella)(Palva等,Gene 22:229-235(1983);Mosbach等,Nature 302:543-545(1983)。可购得用于这类表达系统的试剂盒。用于哺乳动物细胞、酵母和昆虫细胞的真核表达系统是本领域众所周知的,也可购得。在一个实施方式中,真核表达载体是腺病毒载体、腺伴随病毒载体或逆转录病毒载体。
用于指导异源核酸表达的启动子取决于具体应用。任选地,启动子与异源转录起始位点的距离与其在天然状态下与转录起始位点的距离大约相同。然而,正如本领域所了解的那样,此距离可允许有一些改变而不会丢失启动子功能。
除启动子外,表达载体一般还包含转录单元或表达盒,它们含有在宿主细胞中表达VEGFR-死亡配体编码核酸所需的所有其它元件。因此,表达盒一般含有操作性连接于编码VEGFR-死亡配体的核酸序列和有效聚腺苷酸化该转录物所需的信号的启动子、核糖体结合位点和翻译中止位点。编码VEGFR-死亡配体的核酸序列一般连接于可切割的信号肽序列,以促进转化细胞分泌该编码蛋白。这类信号肽包括组织血纤维蛋白溶酶原激活物、胰岛素和神经元生长因子以及绿棉铃虫(Heliothisvirescens)的保幼激素酯酶等的信号肽。表达盒的其它元件可包括增强子和(如果基因组DNA用作结构基因)含有功能性剪接供体和受体位点的内含子。
除启动子序列外,此表达盒在结构基因的下游还应含有转录终止区而可有效终止。此终止区可与启动子序列获自同一基因,或可获自不同基因。
用于将遗传信息转运到细胞中的具体表达载体(类型)并不特别重要。可采用在真核或原核细胞中表达所用的任何常规载体。标准的细菌表达载体包括质粒如基于pBR322的质粒、pSKF、pET23D和融合表达系统如GST和LacZ。也可将表位标签加入重组蛋白如c-myc中,以提供方便的分离方法。
真核表达载体一般采用含有真核病毒调控元件的表达载体,如SV40载体、乳头瘤病毒载体和衍生自EB病毒的载体。其它示范性真核载体包括能在SV40早期启动子、SV40晚期启动子、金属硫蛋白启动子、鼠乳房肿瘤病毒启动子、劳氏肉瘤病毒启动子、多角体蛋白启动子或能在真核细胞中有效表达的其它启动子的指导下表达蛋白质的pMSG、pAV009/A+、pMTO10/A+、pMAMneo-5、杆状病毒pDSVE和任何其它载体。
一些表达系统含有可显示基因扩增的标记物,例如胸苷激酶、潮霉素B磷酸转移酶和二氢叶酸还原酶。或者,不包括基因扩增的高产率表达系统也适用,例如在昆虫细胞中采用杆状病毒载体,其中VEGFR-死亡配体编码序列在多角体蛋白启动子或其它强效杆状病毒启动子的指导下。
表达载体中通常包含的元件也包括:在大肠杆菌中具有功能的复制子、能够选择携带重组质粒的细菌的抗生素抗性编码基因和能插入真核序列的质粒非必需区中的独特限制性位点。所选择的具体抗生素抗性基因并不重要,许多本领域已知的抗性基因都适用。任选选择原核序列,使它们不干扰DNA在真核细胞中的复制(如果必要)。
用标准的转染方法产生表达大量VEGFR-死亡配体蛋白的细菌、哺乳动物、酵母或昆虫细胞系,然后用标准技术纯化这些蛋白(参见例如,Colley等,J.Biol.Chem.264:17619-17622(1989);蛋白质纯化指南(Guide to Protein Purification),《酶学方法》(Methods in Enzymology),第182卷(Deutscher编,1990))。按照标准技术转化真核和原核细胞(参见例如,Morrison,J.Bact.132:349-351(1977);Clark-Curtiss和Curtiss,《酶学方法》(Methods in Enzymology)101:347-362(Wu等编,1983)。
可采用将外来核苷酸序列引入宿主细胞的任何熟知方法。这些方法包括采用磷酸钙转染、聚凝胺(polybrene)、原生质体融合、电穿孔、脂质体、显微注射、血浆载体(plasma vector)、病毒载体和将克隆的基因组DNA、cDNA、合成DNA或其它外来遗传物质引入宿主细胞的其它熟知方法(参见例如,Sambrook和Russell,同上)。只要需要,采用具体的遗传工程改造方法能够成功地将至少一种基因引入能够表达VEGFR-死亡配体的宿主细胞中。可通过瞬时转染或稳定转染将VEGFR-FasL核酸引入细胞中(实施例4和图11a和11B)。
将表达载体引入细胞后,在有利于VEGFR-死亡配体表达的条件下培养转染的细胞,然后用标准技术回收培养物中的VEGFR-死亡配体(参见例如,Scopes,蛋白质纯化:原理和实践(Protein Purification:Principles and Practice)(1982);美国专利号4,673,641;Ausubel等,同上;和Sambrook等,同上)。产生有用的VEGFR-FasL融合蛋白参见实施例4和图11和11B的描述。
I.纯化VEGFR-FasL融合蛋白
可采用本领域熟知的方法纯化本发明的VEGFR-死亡配体融合蛋白,如,Sambrook和Russell,Molecular Cloning,A Laboratory Manual(分子克隆,实验室手册;第3版,2001);Kriegler,Gene Transfer and Expression:A Laboratory Manual(基因转移和表达:实验室手册)(1990);和Current Protocols in Molecular Biology(新编分子生物学实验指南)(Ausubel等编,1994-1999)。
因此,可通过常规的蛋白质纯化方法纯化本发明VEGFR-死亡配体融合蛋白。或者,利用连接于VEGFR-死亡配体融合蛋白的标签进行蛋白质纯化。本领域已知各种标签,包括但不限于FLAG-和HA-标签。一般将这些标签的编码序列连接于VEGFR-死亡配体编码序列,当转录RNA翻译时即可表达。优选标签是FLAG标签。含有FLAG标记的VEGFR-死亡配体融合蛋白的本发明优选实施方式见图6和11,详见实施例3和4。
在一个优选实施方式中,将可切割的肽序列插入标签与VEGFR-死亡配体融合蛋白之间。这特别有利于在纯化蛋白后切割掉此标签。
J.VEGF结合于VEGFR-FasL
本发明VEGFR融合蛋白能结合血管内皮生长因子(VEGF)。本领域已知用于监测VEGF与VEGF受体胞外结构域结合的生物试验,参见本文的描述。例如,Achen等(纳入本文作参考)描述了用于监测VEGF配体与VEGFR-2胞外结构域相结合的生物试验和采用可溶性VEGFR胞外结构域的结合试验。可利用Achen等(Proc Natl AcadSci USA(1998),95:548-553)的试验检测VEGF与本发明VEGFR融合蛋白的结合。
VEGF与本发明VEGFR-FasL融合蛋白的结合激活了VEGFR-FasL融合蛋白。本发明VEGFR-FasL融合蛋白可由人VEGF、小鼠VEGF(实施例11)或任何其它哺乳动物VEGF激活。此外,本发明VEGFR-FasL融合蛋白可由VEGF/P1GF异源二聚体或P1GF激活(实施例11)。
K.VEGFR-FasL与Fas结合
本发明VEGFR-FasL融合蛋白能结合Fas。本领域已知用于监测FasL-Fas结合的生物试验,参见本文的描述。例如,Schneider等(纳入本文作参考)描述了细胞毒试验和用于监测FasL与Fas胞外结构域结合的体外Fas-FasL结合试验。可采用Schneider等(J Biol Chem(1997),272(30):18827-18833)的试验测定本发明VEGFR-FasL与Fas的结合。
在优选实施方式中,与可溶性FasL或其胞外结构域相比,VEGFR-FasL融合蛋白诱导表达Fas的癌细胞凋亡或死亡的效率更高。
III.用VEGFR-死亡配体融合蛋白中和VEGF激活VEGF受体的方法
可以各种方式使用本发明VEGFR-死亡配体融合蛋白。例如,VEGFR-死亡配体融合蛋白,具体是VEGFR-FasL融合蛋白,可用作过度表达VEGF的肿瘤的抗癌剂。本发明VEGFR-死亡配体融合蛋白还可用作特征是病理性血管新生的疾病,如癌症、类风湿性关节炎或增殖性视网膜病所用的抗血管新生剂。
在本发明的优选实施方式中,提供了利用VEGFR-死亡配体融合蛋白中和VEGF激活VEGF受体的方法。该方法包括使VEGF与VEGFR-死亡配体融合蛋白相接触的步骤。
可在体外或体内中和VEGF激活细胞如肿瘤细胞上的VEGF受体。中和VEGF激活VEGF受体包括使含有表面表达VEGF受体的细胞的生物学样品与本发明融合蛋白相接触。可以在加入VEGF之前、同时或之后,在体外使生物学样品与该融合蛋白如VEGFR-FasL相接触。
通过给予哺乳动物,使本发明融合蛋白与生物液体如血液或肿瘤在体内相接触。这种体内中和法可用于患有疾病如肿瘤生长的哺乳动物,以抑制或阻止血管新生。因此,本发明融合蛋白,如VEGFR-FasL是抗血管新生性和抗肿瘤治疗药物。
该方法能有效治疗患有肿瘤,包括恶性肿瘤和瘤,如胚细胞瘤、癌症或肉瘤,特别是高度血管化肿瘤的对象。可用本发明抗体或片段治疗的肿瘤的一些例子包括表皮样瘤、鳞状细胞瘤如头颈肿瘤、结直肠肿瘤、前列腺肿瘤、乳腺肿瘤、肺肿瘤(包括小细胞和非小细胞肺肿瘤)、胰腺肿瘤、甲状腺肿瘤、卵巢肿瘤和肝肿瘤。
IV.用VEGFR-死亡配体融合蛋白诱导凋亡的方法
可以各种方式使用本发明VEGFR-死亡配体融合蛋白。在本发明的优选实施方式中,提供了将血管新生因子的VEGF活性逆转为细胞死亡因子的方法。该方法根据VEGF在许多癌症,尤其是人癌中过度表达的观察结果。过度表达VEGF的癌症包括但不限于:胶质瘤、黑色素瘤、胃癌、卡波西肉瘤、表皮样癌、成血管细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、肾细胞瘤、垂体瘤、肺癌和前列腺癌。优选的癌症是成胶质细胞瘤。另一种优选的癌症是前列腺癌。
该方法的构思是利用肿瘤中过度表达的VEGF作为对抗肿瘤本身或其血管的死亡因子。实际上,使肿瘤的武器,即过度表达的VEGF(肿瘤需要它来维持生长和转移)转向对抗肿瘤本身。因此,本发明组合物可用于在癌细胞中诱导凋亡或细胞毒作用。
该方法包括使VEGF与本发明VEGFR-死亡配体融合蛋白相接触的步骤。该方法还包括使细胞表面上的死亡受体与VEGF多肽结合的本发明VEGFR-死亡配体融合蛋白相接触的步骤。因此,在此实施方式中,如果不结合VEGF多肽,VEGFR-死亡配体融合蛋白将不结合死亡受体。
本发明组合物也可用于在除癌细胞外的细胞中诱导凋亡或细胞毒作用。例如,本发明VEGFR-FasL融合蛋白可用于在微血管内皮细胞,如肾上腺皮质内皮细胞中诱导凋亡和细胞毒作用。
VEGFR-死亡配体融合蛋白(含有结合的VEGF多肽)结合于细胞上的死亡受体后,则诱导凋亡,即细胞死亡。如本文所述,VEGFR-死亡配体融合蛋白通过死亡受体识别部分结合于死亡受体。例如,作为三聚体产生的FasL能通过结合Fas、与Fas成簇从而激活Fas来诱导凋亡。含有FasL多肽的本发明VEGFR-FasL融合蛋白能以相同方式诱导凋亡,所述FasL多肽含有寡聚化结构域和死亡受体识别部分。因此,一个重要特征是Fas活化需要Fas与FasL,或Fas与VEGFR-FasL融合蛋白聚集成簇。
优选在没有VEGF的情况下本发明VEGFR-配体融合蛋白没有凋亡活性或活性很小。在几次体外实验中证明了这一现象,参见图11、13、14和15。
优选在没有VEGF的情况下本发明VEGFR-配体融合蛋白的凋亡活性提高。在几次体外实验中证明了这一现象,参见图11、13、14和15。在这里,"凋亡活性提高"指与不用VEGF相比,至少激活提高两倍,优选激活提高三倍、更优选5倍。
在优选实施方式中,在VEGF表达上调和表达死亡受体的细胞中诱导凋亡的方法包括使细胞接触组合物或使细胞与含有本文所述的VEGFR-死亡配体融合蛋白或编码VEGFR-死亡配体融合蛋白的多核苷酸的组合物相接触的步骤。在优选实施方式中,该多核苷酸编码SEQ ID NO.22或SEQ ID NO:23的VEGFR-死亡配体融合蛋白。
在本发明另一优选实施方式中,该多核苷酸包含SEQ ID NO:14。
在本发明一方面,利用VEGFR-死亡配体融合蛋白或多核苷酸在体外诱导培养的细胞系凋亡。在另一优选方面,利用VEGFR-死亡配体融合蛋白或多核苷酸在体内即在动物体内,优选哺乳动物,包括人,优选在癌细胞中诱导凋亡。
V.过度表达VEGF和表达FAS受体的癌症的治疗方法
A.测定正常个体和癌症患者中的VEGF
现有技术已经描述了用于测定或确定正常个体和癌症患者中VEGF的生物试验,可用于在给予本发明VEGFR-死亡配体融合蛋白之前测定个体中内源性VEGF的水平。例如,Cooper等评估了在区分卵巢癌患者与良性附件区包块患者的血清VEGF水平的临床相关性,结论是手术前VEGF水平可用于区分良性附件区包块与恶性肿瘤(Clin Cancer Res,(2002)8(10):3193-7)。
B.测定癌细胞表达的Fas受体
现有技术已经描述了用于测定或确定癌细胞表达的Fas受体的生物试验,可用于确定要靶向的癌细胞是否表达FasR或任何其它死亡受体,因此,是否易受本发明VEGFR-死亡配体融合蛋白的凋亡诱导作用的影响。在给予本发明VEGFR-死亡配体融合蛋白之前需要确定患者的癌症是否表达Fas或任何其它死亡受体。例如,可采用Algeciras-Schimnich等,Proc Natl Acad Sci USA,(2003)100:11445)所述的生物试验。
C.治疗癌症的方法
本发明方法包括治疗VEGF上调和表达死亡受体的癌细胞。该方法一般包括用本发明VEGFR-死亡配体融合蛋白诱导凋亡。优选的癌细胞选自乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、肺癌、成胶质细胞瘤或卵巢癌。
该方法能有效治疗患有肿瘤,包括恶性肿瘤和瘤,例如胚细胞瘤、癌症或肉瘤,特别是高度血管化肿瘤的对象。可用本发明抗体或片段治疗的肿瘤的一些例子包括表皮样瘤、鳞状细胞瘤如头颈肿瘤、结直肠肿瘤、前列腺肿瘤、乳腺肿瘤、肺肿瘤(包括小细胞和非小细胞肺肿瘤)、胰腺肿瘤、甲状腺肿瘤、卵巢肿瘤和肝肿瘤。
本发明提供了治疗VEGF表达上调癌症的方法。该方法包括给予患者药物组合物的步骤。这类药物组合物包括例如,VEGFR-死亡配体融合蛋白、VEGFR-死亡配体融合蛋白类似物、VEGFR-死亡配体融合蛋白模拟物、VEGFR-死亡配体融合蛋白相关多肽;或者编码VEGFR-死亡配体融合蛋白、VEGFR-死亡配体融合蛋白类似物、VEGFR-死亡配体融合蛋白模拟物、VEGFR-死亡配体融合蛋白相关多肽的多核苷酸。本发明药物组合物可单独给药或与一种或多种其它治疗性化合物或疗法联合给药。这类治疗性化合物或疗法的例子包括但不限于:紫杉醇、环磷酰胺、他莫昔芬、氟尿嘧啶和多柔比星。
D.抑制细胞增殖
可以各种方式使用本发明VEGFR-死亡配体融合蛋白。在本发明的优选实施方式中,提供了抑制过度表达VEGF的细胞增殖的方法。"增殖"指细胞生长、细胞繁殖或倍增或形成病理囊肿。过度表达的VEGF可以是VEGF多肽或VEGF mRNA。这种方法包括使细胞接触能有效抑制细胞增殖用量的VEGFR-死亡配体融合蛋白的步骤。
在本发明的优选实施方式中,在体外实施该方法。如本文进一步所述,也可在体内实施本发明方法。
VI.用VEGFR-FASL融合蛋白治疗与血管新生和/或血管生成失控相关性疾病或失调的方法
也可利用防止或抑制血管新生治疗与血管新生和/或血管生成失控相关性疾病、失调或非肿瘤疾病,如类风湿性关节炎、新生血管性青光眼、增殖性视网膜病,包括增殖性糖尿病视网膜病、黄斑变性、血管瘤、血管纤维瘤和牛皮癣。本发明组合物可用于治疗这种疾病。
可以各种方式使用本发明VEGFR-死亡配体融合蛋白。在本发明的另一优选实施方式中,提供了治疗与VEGF过度表达或病理性血管新生有关的疾病的方法。该方法包括以下步骤:将有效治疗该疾病用量的具有VEGFR-死亡配体融合蛋白活性的多肽给予对象,优选需要治疗的对象。所述对象优选是人。
A.类风湿性关节炎
在本发明的优选实施方式中,用本发明VEGFR-死亡配体融合蛋白或编码VEGFR-死亡配体融合蛋白的多核苷酸治疗的疾病是类风湿性关节炎。类风湿性关节炎(RA)是以中性粒细胞浸入滑膜液、T淋巴细胞和巨噬细胞浸润滑膜、滑膜细胞过度增殖(导致形成关节肿大(apannus))以及软骨和骨被破坏为特征的炎性关节疾病(Feldman等,Ann Rev Immunol(1996),14:397-440;Paleolog,Br J Rheumatol(1996),35:917-920)。认为血管新生在RA发病过程中有重要作用(Colville-Nash和Scott,Annals Rheumatic Diseases(1992),51:919-925和其中的参考文献)。
在RA中存在VEGF起着直接血管新生因子作用的最强证据。RA患者的滑膜液和组织中VEGF表达显著高于其它类型关节炎的患者(Fava等,J.Exp.Med.(1994)180:341-346;Koch等,J Immunol(1994)152:4149-4156)。此种VEGF的来源似乎是由于滑膜内皮细胞、滑膜下巨噬细胞、微血管周围的成纤维细胞和血管平滑肌细胞中表达升高所致(Fava等,J.Exp.Med.(1994),180:341-346;Koch等,J Immunol(1994),152:4149-4156;Nagashima等,J Rheumatol(1995),22:1624-1630)。也可采用其它因子间接诱导VEGF。
B.牛皮癣
在本发明的另一优选实施方式中,用本发明VEGFR-死亡配体融合蛋白或编码VEGFR-死亡配体融合蛋白的多核苷酸治疗的疾病是牛皮癣。牛皮癣是特征是表皮过度增殖、炎症和血管新生的慢性皮肤病。血管新生似乎是牛皮癣发病的主要原因,微血管改变是发生牛皮癣损伤中最早可检测到的变化之一(综述参见Creamer和Barker,Clin Exp Dermatol(1995),20:6-9)。几项报道表明表皮是血管新生因子的来源(Nishioka和Ryan,J Invest Dermatol(1972),58:33-45;Wolf和Harrison,J InvestDermatol(1973),59:40-43;Barnhill等,Br J Dermatol(1984),110:273-281;Malhotra等,Lab Invest(1989),61:162-165)。
在皮肤中鉴定到的许多血管新生因子中(Arbiser,Am Acad Derm(1996),34:486-497),VEGF是最具特征的血管新生直接诱导物。VEGF在牛皮癣皮肤角质形成细胞中过度表达,但在正常表皮中表达量很少(Detmar等,J Exp Med(1994),180:1141-1146)。VEGF也在其它皮肤病如大疱型类天疱疮、疱疹样皮炎和多形性红斑中(Brown等,Invest Dermatol 1995,104,744-749)、迟发型皮肤过敏性反应(Brown等,J Immunol 1995,154,2801-2807)、也可能在皮肤暴晒后过度表达,例如使培养的角质形成细胞接触紫外线后诱导了VEGF表达(Brauchle等,J Biol Chem(1996),271:21793-21797)。
C.黄斑变性
在本发明的优选实施方式中,用本发明VEGFR-死亡配体融合蛋白或编码VEGFR-死亡配体融合蛋白的多核苷酸治疗的疾病是黄斑变性。假定视网膜缺血引起的血管新生因子释放是视网膜新血管形成的核心刺激物。在几种眼病如早熟性视网膜病、衰老相关性黄斑变性和糖尿病视网膜病中,继发于眼内新血管形成的青光眼、玻璃体出血和视网膜剥离会导致失明。视网膜缺血引起的血管新生因子释放能诱导新血管生长并提高该区域的氧供给,其结果是有害的,因为新血管不以正常结构生长。水肿、出血、血管曲张和病理性新血管形成结果导致视网膜剥离,继而导致失明。
正常眼睛的血管网组织中组成型表达VEGF(Adamis等,Arch Ophthalmol(1996),114:66-71),然而,在诸如糖尿病视网膜病等疾病中眼内VEGF基因表达提高(Adamis等,Amer J Ophthalmology(1994),118:445-450;Malecaze等,ArchOphthalmology(1994),112:1476-1482)。
VII.联合治疗
如本文所详述,本发明提供了采用VEGFR-死亡配体融合蛋白中和VEGF受体被VEGF活化的方法。这些方法尤其可用于诱导凋亡、诱导细胞毒作用、治疗癌症和与血管新生和/或血管生成失控相关性疾病或失调。在本发明的优选实施方式中,这些方法各自还可包括给予患者第二种治疗剂,如化疗药或放疗。
化疗药的例子包括但不限于:道诺霉素、道诺霉素、放线菌素d、多柔比星、表柔比星、伊达比星、依索比星、博来霉素、麦黄磷芥、异环磷酰胺、胞嘧啶阿糖胞苷、双氯乙基亚硝基脲、白消安、丝裂霉素C、放线菌素D、光神霉素、氯泼尼松、羟基孕酮、睾酮、他莫昔芬、达卡巴嗪、丙卡巴肼、六甲蜜胺、五甲蜜胺、米托蒽醌、安吖啶、苯丁酸氮芥、甲基环己基亚硝基脲、氮芥、美法仑、环磷酰胺、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷(CA)、5-氮杂胞苷、羟基脲、脱氧助间型霉素、4-羟基过氧环磷酰胺、5-氟尿嘧啶(5-FU)、5-氟脱氧尿苷(5-FUdR)、甲氨蝶呤(MTX)、秋水仙素、紫杉醇、长春新碱、长春碱、依托泊甙、三甲曲沙、替尼泊苷、顺铂和二乙基已烯雌酚(DES)。通常参见,The Merck Manual of Diagnosis and Therapy(默克诊疗手册),第15版,1987,第1206-1228页,Berkow等,编,Rahway,NJ。
在本发明的优选实施方式中,化疗药选自喜树碱、依托泊甙、双吲哚基马来酰亚胺VIII、顺铂、紫杉醇、多柔比星、替莫唑胺、硼替佐米、LY294002或丙戊酸。
VIII.给予VEGFR-死亡配体融合蛋白
在本发明的一方面,可采用表达VEGFR-死亡配体融合蛋白如VEGFR-FasL的核酸分子(如本文详述)将该核酸引入哺乳动物细胞或靶组织中。可采用常规的病毒和非病毒基因转移方法将编码VEGFR-死亡配体融合蛋白的核酸引入哺乳动物细胞或靶组织中。非病毒载体递送系统包括DNA质粒、裸露核酸和与递送运载体如脂质体复合的核酸。病毒载体递送系统包括DNA和RNA病毒,递送给细胞后成为附加体或整合到基因组中。基因治疗方法的综述参见,Anderson,Science 256:808-813(1992);Nabel和Feigner,TIBTECH 11:211-217(1993);Mitani和Caskey,TIBTECH 11:162-166(1993);Dillon,TIBTECH 11:167-175(1993);Miller,Nature 357:455-460(1992);Van Brunt,Biotechnology 6(10):1149-U54(1988);Vigne,Restorative Neurology andNeuroscience 8:35-36(1995);Kremer和Perricaudet,British Medical Bulletin 51(1):31-44(1995);Haddada等,Current Topics in Microbiology and Immunology(微生物学和免疫学的当前热点)Doerfler和Bhm(编)(1995);和Yu等,Gene Therapy 1:13-26(1994)。
A.非病毒递送方法
编码本发明工程改造多肽的核酸的非病毒递送方法包括脂质转染(lipofection)、显微注射、生物射弹、病毒体、脂质体、免疫脂质体、聚阳离子或脂质:核酸缀合物、裸露DNA、人工病毒体和药物增强的DNA摄取。脂质转染参见例如:US 5,049,386、US 4,946,787和US 4,897,355,脂质转染试剂可购得(如川司菲坦(TransfectamTM)和力波菲汀(LipofectinTM))。适合对多核苷酸进行有效的受体识别脂质转染的阳离子性和中性脂质包括Feigner、WO 91/17424、WO 91/16024所述的脂质。可以递送给细胞(离体给药)或靶组织(体内给药)。
本领域技术人员熟知脂质:核酸复合物,包括靶向脂质体如免疫脂质复合物的制备(参见例如,Crystal,Science 270:404-410(1995);Blaese等,Cancer Gene Ther.2:291-297(1995);Behr等,Bioconjugate Chem.5:382-389(1994);Remy等,Bioconjugate Chem.5:647-654(1994);Gao等,Gene Therapy 2:710-722(1995);Ahmad等,Cancer Res.52:4817-4820(1992);美国专利号4,186,183、4,217,344、4,235,871、4,261,975、4,485,054、4,501,728、4,774,085、4,837,028和4,946,787)。
B.病毒递送方法
本领域知道利用RNA或DNA病毒系统来递送VEGFR-死亡配体融合蛋白编码核酸。用于基因转移的常规病毒系统包括逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺伴随病毒和单纯疱疹病毒载体。
在许多基因治疗应用中,需要用对特定组织类型,如肺组织或乳房组织高度特异的基因治疗载体递送。可修饰病毒载体,使其表达配体与病毒外表面的病毒包被蛋白构成的融合蛋白而对给定的细胞类型具有特异性。选择的配体应对感兴趣细胞类型上存在的已知受体具有亲和力。例如,Han等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92:91A1-9151(1995)报道,可修饰莫洛尼鼠白血病病毒,使其表达融合于gp70的人调蛋白,该重组病毒感染表达人表皮生长因子受体的某些人乳腺癌细胞。这一原理可延伸至其它成对的表达配体融合蛋白的病毒和表达受体的靶细胞。例如,可工程改造丝状噬菌体,使之展示对基本上任何所选细胞受体具有特异性结合亲和力的抗体片段(如Fab或Fv)。虽然上述说明主要应用于病毒载体,但相同的原理也可应用于非病毒载体。可工程改造这类载体,使其含有认为能促进特定靶细胞摄入的特定摄入序列。
一般通过全身给药(如静脉内、腹膜内、肌肉内、皮下或颅内输注)或局部应用给予患者个体,向体内递送基因治疗载体,如下所述。或者,可将载体离体递送给细胞,如取自患者个体的细胞。
本领域技术人员熟知用于诊断、研究或基因治疗的离体细胞转染方法(如将转染细胞再输回到宿主生物体中)。在一些实施方式中,分离对象生物体的细胞,用VEGFR-死亡配体编码核酸转染,在输注回对象生物体(如患者)中。本领域技术人员熟知适合离体转染的各种细胞类型(参见例如,Freshney等,Culture of Animal Cells,A Manual of Basic Technique(动物细胞培养,基本技术手册)(第3版,1994))和其中引用的参考文献,有关如何分离和培养患者细胞的讨论)。
还可将含有治疗性核酸的载体(如逆转录病毒、腺病毒、脂质体等)直接给予生物体,以在体内转导细胞。或者,可给予裸露的DNA。通过常用的使分子与血液或组织细胞最终相接触的任何途径给药。本领域技术人员可以获得和熟知给予这类核酸的合适方法,虽然可采用一种以上途径给予某具体组合物,但与其它途径相比,某一具体途径常可提供比另一途径更快捷更有效的反应。
部分根据给予的具体组合物以及给予该组合物所用的具体方法确定药学上可接受的运载体。因此,本发明药物组合物可采用各种合适剂型,如下所述(参见例如,Remington′s Pharmaceutical Sciences(雷明顿药物科学),第17版,1989)。
IX.药物组合物
本发明提供了含有本发明VEGFR-死亡配体融合蛋白的药物组合物。
在本发明的优选实施方式中,药物组合物含有(i)含以下组分的融合蛋白:(1)能结合VEGF蛋白的VEGFR多肽;和(2)含寡聚化结构域和Fas配体蛋白胞外结构域的Fas受体识别部分的Fas配体;和(ii)药学上可接受的赋形剂、运载体和/或稀释剂。
在本发明另一实施方式中,提供了含有编码VEGFR-死亡配体融合蛋白的核酸的载体和药学上可接受的赋形剂、运载体和/或稀释剂的组合物。在一个实施方式中,编码VEGFR-死亡配体融合蛋白的核酸含有SEQ ID NO:14所示的核苷酸序列。
该药物组合物可用于治疗过度表达VEGF和表达死亡受体如Fas的癌症。该药物组合物也可用于治疗特征是本文所述病理性血管新生的疾病。
A.给予药物组合物
可将含有VEGFR-死亡配体融合蛋白或编码VEGFR-死亡配体融合蛋白的多核苷酸激活物的药物组合物给予患者,以治疗癌症,如肺癌或乳腺癌。如本文以下所详述,任选地将该化合物与药学上可接受的运载体一起给药。
可将治疗有效量的VEGFR-死亡配体融合蛋白或编码VEGFR-死亡配体融合蛋白的多核苷酸给予患者,以预防、治疗或控制癌症。给予某患者足以在该患者中引发有效治疗反应的用量的化合物。有效治疗反应是至少部分阻滞或减缓该疾病的症状或并发症的反应。将足以实现这一目的的用量定义为"治疗有效量"。该剂量取决于所用具体VEGFR-死亡配体的功效和对象的病情、以及体重或待治疗区域的表面积。剂量大小也取决于与具体化合物或载体给予具体对象时是否存在伴随的副作用、特性或程度。
可通过标准药学方法在细胞培养物或实验动物中测定这类化合物的毒性和疗效,例如,测定LD50(对50%群体致死的剂量)和ED50(在50%群体中有效治疗的剂量)。毒性和疗效的剂量比是治疗指数,可表示为LD50/ED50之比。优选治疗指数较大的化合物。虽然可采用具有毒副作用的化合物,但应小心设计使这类化合物靶向患病组织的递送系统,以最大程度降低对正常细胞的可能伤害,从而降低副作用。
可采用获自(例如)细胞培养实验和动物研究的数据计算用于人的剂量范围。这类化合物的剂量优选在无毒性或毒性较小的包含ED50的循环浓度范围内。剂量可以在此范围内变化,取决于所用剂型和给药途径。对于本发明方法所用的任何化合物,可先通过细胞培养实验评估其治疗有效剂量。可配制成动物模型中所用的剂量,以获得包括在细胞培养中测定的IC50(对症状实现半数最大抑制的受试化合物浓度)的循环血浆浓度范围。可利用这类信息更精确地确定用于人体的剂量。可用(例如)高效液相色谱(HPLC)测定血浆水平。通常,对典型对象而言,调节物的剂量当量约为1ng/kg-10mg/kg。
可采用一种或多种生理上可接受的运载体或赋形剂以标准技术配制本发明所用的药物组合物。可配制该化合物及其生理上可接受的盐和溶剂合物,用于通过任何合适途径,包括吸入、局部、经鼻、口服、胃肠道外(如静脉内、腹膜内、膀胱内或鞘内)或直肠途径给药。
就口服给药而言,该药物组合物可以取(例如)用常规方法制备的含有药学上可接受赋形剂的片剂或胶囊剂型,所述赋形剂包括粘合剂,如预明胶化的玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素;填料,如乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙;润滑剂,如硬脂酸镁、滑石粉或二氧化硅;崩解剂,如马铃薯淀粉或淀粉乙醇酸钠;或者湿润剂,如十二烷基硫酸钠。可以用本领域熟知方法给片剂包衣。用于口服给药的液体制剂可以取(例如)溶液、糖浆或悬液剂型,或者可以将它们制备成干燥产品,临用前用水或其它合适载体构建。可通过常规方法制备含有药学上可接受添加剂的这类液体制剂,所述添加剂包括(例如):悬浮剂,如山梨糖醇糖浆、纤维素衍生物或氢化食用脂肪;乳化剂,如卵磷脂或阿拉伯胶;非水性载体,如杏仁油、油性酯、乙醇或分馏的植物油;和防腐剂,如甲基或丙基-对-羟基苯甲酸或山梨酸。该制剂也可适当地含有缓冲盐、调味剂、着色剂和/或甜味剂。如果需要,可适当地配制口服给药制剂,以控释该活性化合物。
在吸入给药中,通常可用加压包装或喷雾器以气溶胶喷雾形式递送该化合物,其中采用了合适的推进剂,如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它合适气体。在加压气溶胶的情况下,可提供一个阀门以确定的单位剂量递送计量药物。可配制用于吸入器或吹药器的胶囊和药筒(例如明胶胶囊和药筒),使其含有所述化合物和合适的粉末基料如乳糖或淀粉的粉末混合物。
可配制胃肠道外注射给药,例如推注或连续输注给药的化合物。注射制剂可以是单位剂型,例如,装在安瓿或多剂量容器中添加有防腐剂的单位剂型。这类形式的该组合物可以是用油性或水性载体配制的悬浮液、溶液或乳剂,可含有配制物质,如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。或者,活性成分可以是粉末形式,在临用前用合适载体如无菌无热原水构建。
可以将该化合物配制成直肠给药组合物,如栓剂或保留灌肠剂,例如,含有常规栓剂基料如可可油或其它甘油酯的制剂。
而且,可将该化合物配制成长效制剂。这类长效制剂可通过植入(例如皮下或肌肉内植入)或肌肉内注射给药。因此,例如,可将该化合物与合适的聚合物或疏水材料(例如用可接受的油配制成乳剂)或离子交换树脂配制在一起,或者将其配制成微溶衍生物如微溶盐。
如果需要,可将该组合物保存在含有一个或多个单位剂型的包装或分配装置中,所述单位剂型中含有活性成分。所述包装(例如)包括金属箔或塑料薄膜,如起泡包装。包装或分配装置中可装有给药说明书。
B.治疗有效量和给药
在本发明的一个实施方式中,如本文所述,将治疗有效量的药物组合物或药剂给予对象,优选人或非人动物,以预防、治疗或控制病情或疾病。将足以在对象中引起有效治疗反应的量的此药物组合物或药剂给予对象。有效治疗反应是至少部分阻滞或减缓病情、失调或疾病的症状或并发症的反应。将足以实现这一目的的用量定义为"治疗有效剂量",也称为"治疗有效量"。
给药的活性药物剂量取决于温血动物的种类(哺乳动物)、体重、年龄、个体情况、待治疗区域的表面积或体积和给药方式。剂量大小也取决于与具体小分子化合物给予具体对象时是否存在伴随的副作用、特性或程度。口服给予约50-70kg的哺乳动物的单位剂量可含有约5-500mg活性药物。一般地,本发明活性化合物的剂量是足以实现所需效果的剂量。可通过对象体内药物累积的测定结果计算最优给药方案。通常,可以每天、每周或每月给药一次或多次。本领域普通技术人员不难确定最优剂量、给药方法和重复速率。
所给活性药物的剂量也取决于该药物的特性。例如,本发明蛋白质或多肽的治疗有效量(即有效剂量)范围是约0.001-30mg/kg体重,优选约0.01-25mg/kg体重,更优选约0.1-20mg/kg体重,更优选约1-10mg/kg、2-9mg/kg、3-8mg/kg、4-7mg/kg或5-6mg/kg体重。在约1-10周,优选2-8周,更优选约3-7周,更优选约4、5或6周中,可以每周给予一次该蛋白质或多肽。
此外应理解,任何具体动物对象的特定剂量水平将取决于各种因素,包括所用具体VEGFR-FasL融合蛋白的活性,对象的年龄、体重、总体健康状况、性别和饮食,给药时间,给药途径,排泄速率,联用药物以及所要调节的表达程度或活性水平。
在本发明的一个实施方式中,含有本发明VEGFR-死亡配体融合蛋白的药物组合物或药剂的每天给药剂量范围是每kg对象体重约1mg各化合物(1mg/kg)至约1g/kg数天。在另一实施方式中,每日剂量的范围是约5mg/kg-500mg/kg。在又一实施方式中,每日剂量约为10mg/kg-250mg/kg。在另一实施方式中,每日剂量约为25mg/kg-150mg/kg。优选剂量约为10mg/kg。可每天给予一次每日剂量,或者分成亚剂量给药多次,如每天给药两次、三次或四次。然而,本领域技术人员应理解,可以不同量、在不同时间给予这些多肽和蛋白质,如本发明VEGFR-死亡配体融合蛋白。本领域技术人员也理解,某些因素可能影响有效治疗对象所需的剂量和时间,这些因素包括但不限于:疾病或失调的严重程度、曾用治疗、对象的总体健康状况和/或年龄以及存在的其它疾病。而且,用治疗有效量的化合物治疗对象可包括单次治疗,或者优选可包括一系列治疗。
为了实现所需疗效,可以治疗有效的每日剂量给药数天VEGFR-死亡配体融合蛋白或其编码核酸。因此,治疗有效地给予VEGFR-死亡配体融合蛋白或其编码核酸,以治疗对象的本文所述的病情或疾病,需要在3天至两周或更长时间的一段时间内定期(如每日)给药。一般地,至少连续三天,常常至少连续5天,更常见至少10天,有时连续20、30、40或更多天给予VEGFR-死亡配体融合蛋白或其编码核酸。虽然连续每日给药是实现治疗有效剂量的优选途径,但即使VEGFR-死亡配体融合蛋白或其编码核酸不是每日给药,也能获得有益的治疗效果,只要重复给药,重复的频率足以在对象体内维持VEGFR-死亡配体融合蛋白或其编码核酸的治疗有效浓度。例如,可以每隔一天、每隔两天给予VEGFR-死亡配体融合蛋白或其编码核酸,或者,如果采用较高剂量范围并且对象能耐受,则每周给药一次。
VEGFR-死亡配体融合蛋白或其编码核酸的最优剂量、毒性和疗效可能取决于单个VEGFR-死亡配体融合蛋白或其编码核酸的相对强度,可通过细胞培养或实验动物的标准药学方法测定,例如,测定LD50(对50%群体致死的剂量)和ED50(在50%群体中有效治疗的剂量)。毒性与疗效的剂量比是治疗指数,表示为LD50/ED50之比。优选治疗指数较大的VEGFR-死亡配体融合蛋白或其编码核酸。虽然可采用具有毒副作用的VEGFR-死亡配体融合蛋白或其编码核酸,但应小心设计使这类药物靶向患病组织的递送系统,以最大程度降低对正常细胞的可能损伤,从而降低副作用。
可采用获自(例如)细胞培养实验和动物研究的数据确定用于人的剂量范围。这类VEGFR-死亡配体融合蛋白或其编码核酸的剂量优选在无毒性或毒性很小的包含ED50的循环浓度范围内。剂量可以在此范围内变化,取决于所用剂型和给药途径。对本发明方法所用的任何VEGFR-死亡配体融合蛋白或其编码核酸,可先通过细胞培养实验评估其治疗有效剂量。可配成动物模型中所用的剂量,以获得包括在细胞培养中测定的IC50(对症状实现半数最大抑制的药物浓度)的循环血浆浓度范围。可利用这类信息更精确地确定用于人体的剂量。可通过(例如)高效液相色谱(HPLC)测定血浆水平。通常,对典型对象而言,此药物的剂量当量约为1ng/kg-100mg/kg。
成功治疗后,可能需要让对象进行维持治疗,以防止所治疗的病情或疾病复发。
X.用于诊断、研究和治疗应用的试剂盒(药盒)
用于诊断、研究和上述治疗应用时,本发明也提供了试剂盒。在诊断和研究应用中,这种试剂盒可包括以下任何或所有物质:测定试剂、缓冲液、VEGFR-死亡配体多肽、VEGFR-死亡配体特异性核酸或抗体、杂交探针和/或引物、VEGFR-死亡配体表达构建物、VEGFR-死亡配体的小分子激活物等。治疗产品可包括无菌盐水和另一种药学上可接受的乳剂和悬液基料。
此外,该试剂盒可包括含有实施本发明方法的指南(即方案)的说明书。该说明书可以是装在本发明试剂盒中的各种形式,其中一种或多种可装在该试剂盒中。虽然说明书一般包括手写或打印材料,但它们不限于此。本发明考虑了能够存储这类说明书并将它们输送给终端用户的任何媒介。这类介质包括但不限于电子储存介质(如磁盘、磁带、磁带盒、芯片)、光学介质(如CD ROM)等。这类介质可包括提供说明材料的因特网址。
在本发明的优选实施方式中,该试剂盒是药盒,装有含以下组分的药物组合物:(i)编码VEGFR-死亡配体多肽的多核苷酸和(ii)药学上可接受的运载体。在本发明另一优选实施方式中,该试剂盒是药盒,装有含以下组分的药物组合物:(i)VEGFR-死亡配体多肽和(ii)药学上可接受的运载体。药盒任选装有陈述药物组合物可以或应该用于治疗VEGF表达上调癌症的说明书。
本发明试剂盒还可装有进行质谱分析的试剂。这类试剂是本领域技术人员熟知的,包括例如探针或芯片。
本发明其它实施方式的试剂盒装有使本领域普通技术人员能够进行本文所述的方法变型的任选功能组分。
虽然为了阐述和理解,通过说明和举例的方式详细描述了上述发明,但本领域普通技术人员不难理解,根据本发明的内容,可以在不背离本发明构思和范围的情况下作出某些修改、改变、修饰和等同物取代。因此,对本文所述实施方式进行的各种修饰、改变等也属于本发明范围,本发明范围仅参考所附权利要求书确定。本领域技术人员容易了解,可改变、修改或修饰各种不重要的参数,仍能产生基本相似的结果。
虽然本文描述了本发明各元素的多种实施方式,但应理解,除非另有说明,本发明给定元素的各个实施方式能够与本发明其它元素的各个实施方式一起使用,这种使用意味着形成本发明的独特实施方式。
通过上述说明可了解,本发明具有广泛应用价值。现通过以下实施例进一步说明本发明,这些实施例只是说明,而不以任何方式限制本发明的边界和范围。
XI.实施例
实施例1:材料和方法
1.通常的重组DNA方法
除非另有说明,为了阐述编码本发明融合蛋白的核酸和表达融合蛋白,可采用重组基因组学领域的常规技术。介绍本发明所用普通方法的基本教科书包括Sambrook和Russell,Molecular Cloning,A Laboratory Manual(分子克隆,实验室手册)(第3版,2001);Kriegler,Gene Transfer and Expression:A Laboratory Manual(基因转移和表达:实验室手册)(1990);和Current Protocols in Molecular Biology(新编分子生物学实验指南)(Ausubel等编,1994-1999)。
核酸的大小以千碱基(kb)或碱基对(bp)计算。它们是衍生自琼脂糖或丙烯酰胺凝胶电泳、测序核酸或公开的DNA序列的估计值。蛋白质的大小以千道尔顿(kDa)或氨基酸残基数计算。由凝胶电泳、测序蛋白、衍生的氨基酸序列或公开的蛋白质序列估计蛋白质大小。
按照首先由Beaucage和Caruthers,Tetrahedron Letts.22:1859-1862(1981)描述的固相亚磷酰胺三酯法,用自动化合成仪化学合成市场上不能获得的寡核苷酸,参见Van Devanter等,Nucleic Acids Res.12:6159-6168(1984)所述。通过天然丙烯酰胺凝胶电泳或阴离子-交换HPLC纯化寡核苷酸,见Pearson和Reanier,J.Chrom.255:137-149(1983)所述。
克隆后,可采用(如)Wallace等,Gene 16:21-26(1981)所述的测序双链模板的链终止法验证所克隆基因和所合成寡核苷酸的序列。
2.细胞系和组织培养
Cos-7细胞获自UCSF细胞培养机构。在37℃、5% CO2的组织培养箱中,用补充有10%胎牛血清和青霉素/链霉素的DME-H21培养基培养此细胞。
T-47D人乳腺癌细胞获自UCSF细胞培养机构。在37℃、5% CO2的组织培养箱中,用补充有胰岛素(0.2U/mL)、10%胎牛血清和青霉素/链霉素的RPMI-1640培养基培养此细胞。
Jurkat E6.1细胞获自UCSF细胞培养机构。在37℃、5% CO2的组织培养箱中,用补充有10%胎牛血清和青霉素/链霉素的RPMI-1640培养基培养此细胞。
U87MG和U373是获自美国典型培养物保藏中心(ATCC;美国弗吉尼亚州马纳萨斯,20108)的人成胶质细胞瘤细胞系。这两种细胞都用补充有10%胎牛血清和抗生素的MEM Eagle培养基和Earl′s BSS培养基培养。U373细胞能对抗Fas受体介导的凋亡,而U87MG细胞敏感(Rieger等,1998,FEBS Lett 427:124-128;Yount等,1999,Cancer Res 59:1362-1365)。
DU145是人前列腺癌细胞系。DU145获自ATCC,用补充有10%胎牛血清和抗生素的MEM Eagle培养基和Earl′s BSS培养基培养。
人脐静脉内皮细胞(HUVEC)获自克隆泰克公司(Clonetics),用补充有胎牛血清、氢化可的松、hFGF、IGF和抗坏血酸的生产商提供的EGM-2培养基培养。由加州大学旧金山分校的Richard博士获得牛肾上腺皮质内皮细胞(微血管细胞)。用补充有10%胎牛血清和抗生素的含有1g/L葡萄糖的DME H-16培养这些细胞(Ferrara等,1991,Endocrinology 129:896-900)。
3.Western印迹
VEGFR-2胞外结构域的抗体购自贝克顿-迪金森/法鸣公司(Becton-Dickinson/Pharmingen)(#555307)。将大鼠单克隆抗体用于Western印迹,其终浓度为0.5微克/mL。第二抗体是购自圣克鲁斯生物技术公司(Santa CruzBiotechnology)的山羊抗大鼠IgG HRP偶联抗体(#SC-2065),所用的终浓度为0.4微克/mL。利用化学发光(安玛西亚的ECL试剂)观察条带。
4.PCR方法
用PCR扩增编码氨基酸139-281的人FasL片段。正义引物(购自UCSF生物医学中心)是:
5′-GGGCTCGAGGGACTAGTGAAAAAAAGGAGCTGAGGAAAGTGGCCCAT-3′,它的5′端包含XhoI和SpeI位点。反义引物(购自UCSF生物医学中心)是:
5′-GGGTCTAGATCTTAGAGCTTATATAAGCCGAAAAACGTCTG-3′,它的3′端包含BgIII位点和XbaI位点。模板是pOTB7/hFasL(购自ATCC);DNA聚合酶是Pfu(司查塔基公司(Stratagene));dNTP来自罗氏公司(Roche)。
PCR条件:模板pOTB7/hFasL:2.0微克;引物:100pMol;dNTP:20nMol;Pfu:2.5单位;第一轮循环:95℃ 5′;95℃-35℃ 10′以上;72℃ 5′;第2-11轮循环:95℃ 45";60℃ 45";72℃ 60"。用琼脂糖凝胶层析纯化440bp PCR片段,用凝胶提取试剂盒(凯杰公司(Qiagen))纯化,亚克隆到pBJ载体的XhoI/XbaI限制性位点中。
5.凋亡分析
用三种试验测定凋亡和细胞毒性:细胞计数、膜联蛋白V阳性细胞的FACS分析和LDH(乳糖脱氢酶)释放。在Jurkat细胞的细胞计数中,将100μL细胞悬液与等体积的台盼蓝染料(0.4%)混合,室温静置2分钟。用血球计数板计数活细胞,一式三份。用InStat统计学软件计算细胞平均数/视野和SEM。在FACS分析中,按照生产商方案使用购自罗氏公司的膜联蛋白-V-Fluos试剂盒。简言之,用FlkFasL或对照条件培养基±VEGF-165(2nM,来自派普泰科公司(Peprotech))处理后,离心沉淀Jurkat细胞,重悬于100μL膜联蛋白-V-Fluos标记溶液(FITC-膜联蛋白V加碘化丙锭),室温静置15分钟。用CellQuest软件在贝克顿迪金森FACSCaliburTM上进行FACS分析,进行门控分选以区分膜联蛋白V-阳性(凋亡)与阴性细胞,和碘化丙锭阳性(即坏死)与阴性细胞。测定凋亡细胞群(膜联蛋白-V-阳性和碘化丙锭-阴性)的百分数。在LDH释放试验中,按照生产商方案使用罗氏公司的LDH细胞毒检测试剂盒。简要说,用FlkFasL或对照条件培养基±VEGF-165(2nM)处理48小时后,将细胞培养物上清液500g离心3分钟,使细胞碎片沉淀。取25μL上清液与LDH检测试剂混合,一式三份,测定492nm的吸光度定量LDH活性。用InStat统计学软件计算平均值和SEM。
实施例2:构建编码嵌合型小鼠/人VEGFR/FasL融合蛋白的核酸
以逐步方式构建编码FlkFasL的pBJ质粒pBJ/Flk(D1-D3)+FasL(139-281)。首先进行PCR,以扩增编码侧接有5′Xho I/Spe I和3′Bgl II/Xba I位点的氨基酸139-281的人FasL序列。用Xho I和Xba I消化PCR片段,亚克隆到pBJ哺乳动物表达载体的Xho I和Xba I位点中,以产生pBJ/hFasL(139-281)(图6)。然后用Xho I切割此质粒,将含有Flk-I信号序列和免疫球蛋白样结构域1-3的质粒LNCX/Flk(1-3)Ha的XhoI/Xho I片段克隆到此质粒中。得到的质粒pBJ/Flk(D1-D3)+FasL(139-281)(图5)含有图7所示的FlkFasL核苷酸序列。
质粒pBJ/Flk(D1-D3)+FasL(139-281)编码含有图8所示氨基酸序列的VEGFR-2-FasL融合蛋白。
实施例3:构建编码嵌合型小鼠/人FLAG-VEGFR/FasL融合蛋白的核酸
为了产生表达FlkFasL和FLAG表位标签的质粒pFLAG/FlkhFasL(D1-D3/139-281;图6),由西格玛公司(SIGMA)购得pFLAG-CMV-3载体。如图6所示,用NotI切割pFLAG-CMV-3载体,用克列诺(Klenow)酶补齐末端。用AvaI切割质粒pBJ/FlkFasL(D1-D3/139-281),用绿豆核酸酶形成钝端。得到的片段编码Flk-I胞外结构域,从信号序列末端的氨基酸Ala-19至结构域3末端的Ser-336。将AvaI/绿豆片段连接到NotI/克列诺-处理的pFLAG-CMV-3中产生pFLAG-Flk(D1-D3),其中Flk-I序列位于编码FLAG表位标签的核苷酸框内下游。为了完成将FlkFasL cDNA组装到pFLAG载体中,亚克隆pBJ/FlkFasL的BspEI/Bgl II片段(D1-D3/139-281)。最终质粒pFLAG-FlkFasL编码含有N-末端FLAG表位标签的FlkFasL。
R1[D2]FasL蛋白由融合于三聚体的人VEGFR1第二结构域(氨基酸129-230:SDTG...NTH;图10)和hFasL的Fas受体结合域(氨基酸139-281;图10)组成。VEGFR1与FasL结构域之间存在5个氨基酸的接头序列(ARGTS)(图10)。该接头序列和FasL结构域与最初描述的R2FasL蛋白相同。此外,其3′端有框内前胰蛋白酶原前导序列和FLAG表位标签,它们也存在于pFLAG3载体中(图10)。
简要说,按如下方法构建含有R1[D2]FasL核酸序列的质粒。采用5′引物(5′-CCCGCGGCCGCCAGTGATACAGGTAGACCTTTCG-3′)和3′引物(5′-GGCCTCGAGCTATGATTGTATTGGTTTGTCG-3′)扩增含有VEGFR1的质粒中的VEGFR1结构域2的cDNA(deVries等,1992,Science 255:989-991)。将得到的PCR片段亚克隆到NotI和XhoI限制性位点中,产生pFLAG3/R1[D2]FasL质粒。FLAG-标记的r1[D2]FasL的核酸序列见图9。
实施例4:产生含有VEGFR/FasL融合蛋白的条件培养基
用Cos-7细胞产生含有FlkFasL蛋白的条件培养基。采用由Sambrook和Russell,Molecular Cloning,A Laboratory Manual(分子克隆,实验室手册)(第3版,2001)改良的DEAE-右旋糖苷方案转染Cos-7细胞。简要说,用不含血清或抗生素的培养基将10厘米平板中培养的Cos-7细胞洗涤两次。各平板中加入3mL不含血清或抗生素的培养基,加入3mL DEAE-右旋糖苷溶液使DEAE/右旋糖苷的终浓度=0.4mg/mL。将质粒DNA(pBJ/FlkFasL或仅编码新霉素抗性基因的对照质粒pBJ/Neo各1-3μg)加入各平板,将平板放回培养箱中。30分钟或3小时后,吸出DEAE-右旋糖苷-DNA溶液,用含有血清的完全培养基洗涤各平板。24小时后,将培养基换成无血清培养基(杂交瘤-SFM,吉布科公司(GIBCO))。72小时后,收集平板中的条件培养基,通过0.2μM滤器过滤,储存于4℃,准备用于实验。为了验证FlkFasL蛋白的表达,DEAE-右旋糖苷转染48小时后,用甘油/Triton X-100裂解缓冲液裂解Cos-7细胞。用PAGE分离裂解物,用VEGFR-2胞外结构域的抗体(法鸣公司(Pharmingen))进行免疫印迹在证实了与单体、二聚体和三聚体相符的分子量大小的FlkFasL的表达(图11A)。
也产生了分泌FLAG标记R2FasL的稳定转染的CHO细胞。简要说,用10:1的pFLAG/R2FasL和新霉素抗性-表达载体pBSR-α的混合物电穿孔CHO细胞。48小时后,将细胞分瓶,在含有新霉素(1mg/mL)的完全培养基中培养。选择在新霉素中生长的集落进行亚培养,用VEGFR2胞外结构域的抗体(法鸣公司)通过Western印迹筛选分泌有R2FasL的条件培养基。通过细胞有限稀释法再次选择阳性克隆,并用Western印迹再次验证R2FasL已分泌到条件培养基中。采用抗-FLAG抗体(西格玛公司(Sigma))对条件培养基进行亲和色谱证明,表达了FLAG标记的R2FasL蛋白(图11B)。
为了产生R1[D2]FasL蛋白,通过DEAE-右旋糖苷介导的转染将pFLAG3/R1[D2]FasL质粒转染到Cos7细胞中。96小时时收集条件培养基。用抗-FLAG抗体亲和层析(来自西格玛公司的M2凝胶)和用FLAG表位肽洗脱纯化得到条件培养基中的R1[D2]FasL。
实施例5:VEGFR/FasL融合蛋白的剂量依赖性细胞杀伤作用
将Jurkat细胞接种到24孔板中(500,000个细胞,500μl/孔),用体积递增的获自对照质粒pSV/Neo或质粒pBJ/FlkFasL转染的Cos-7细胞的条件培养基处理。再用VEGF-165(2nM,来自派普泰科公司)或不用VEGF处理Jurkat细胞。32小时后,经台盼蓝染色计数活细胞。代表性结果见图12。
实施例6:VEGFR/FasL融合蛋白的细胞杀伤作用取决于VEGF用量
将Jurkat细胞接种到24孔板中(500,000个细胞,500μl/孔),用25μL/孔的获自对照质粒pSV/Neo或质粒pBJ/FlkFasL转染的Cos-7细胞的条件培养基处理。再用不同量的VEGF-165处理Jurkat细胞。24小时后,经台盼蓝染色计数活细胞。代表性结果见图13。
实施例7;FlkFasL以VEGF依赖性方式诱导凋亡
将Jurkat细胞接种到24孔板中(500,000个细胞,500μl/孔),用1μL/孔或5μL/孔获自对照质粒pSV/Neo或质粒pB J/FlkFasL转染的Cos-7细胞的条件培养基处理。再用VEGF-165(2nM)处理一些孔60分钟。通过FACS分析FLTC-膜联蛋白V-阳性/碘化丙锭阴性细胞,评估所诱导的凋亡。代表性结果见图14。
实施例8:VEGFR/FasL融合蛋白诱导乳腺癌细胞凋亡
将T-47D人乳腺癌细胞接种到24孔板中(500,000个细胞,500μl/孔),生长至汇合。用25μL/孔获自对照质粒pSV/Neo或质粒pBJ/FlkFasL转染的Cos-7细胞的条件培养基处理细胞。还用2nM VEGF-165或不用VEGF-165处理细胞。处理24小时后,对细胞拍照。在T-47D细胞产生的内源性VEGF的存在下,FlkFasL诱导凋亡(图13,中心)。加入内源性VEGF后,观察到细胞死亡显著增加,这表明FlkFasL凋亡活性受VEGF调控。代表性结果见图15。
实施例9:VEGFR/FasL融合蛋白以VEGF依赖性方式在乳腺癌细胞中诱导细
胞毒性
将T-47D人乳腺癌细胞接种于24-孔板中(500,000个细胞,500μl/孔),生长至汇合。用25μL/孔获自对照质粒pSV/Neo或质粒FlkFasL转染的Cos-7细胞的条件培养基处理细胞。还用2nM VEGF-165或不用VEGF-165处理细胞。48小时后,用LDH细胞毒检测试剂盒(罗氏公司(Roche))检测细胞毒性。在T-47D细胞产生的内源性VEGF的存在下,FlkFasL诱导细胞毒性(图14,泳道B)。加入内源性VEGF后,观察到细胞毒性显著提高,这表明FlkFasL凋亡活性受VEGF调控(图16,泳道D)。
将图14所示结果(诱导Jurkat细胞凋亡)与图16所示结果(在乳腺癌细胞中刺激细胞毒性)作比较后,注意到添加或不添加VEGF的对照条件培养基,凋亡诱导/细胞毒性刺激的基础水平同样低下(将图16的泳道A和B与图16作比较)。虽然在没有VEGF的情况下加入条件培养基不提高对Jurkat细胞凋亡的诱导水平(图14),但分析在相似条件下的乳腺癌细胞时观察到凋亡诱导显著提高(图16,泳道C)。已知乳腺癌细胞表达和分泌内源性VEGF。因此,在乳腺癌细胞中诱导或刺激细胞毒作用可解释为内源性VEGF结合于FlkFasL,随后FlkFasL融合蛋白(已结合VEGF多肽)结合于乳腺癌细胞表面上的Fas所致。因此,图16的泳道C描述了对癌细胞分泌的内源性VEGF的凋亡反应,说明体内给予本发明融合蛋白的可观前景。值得注意的是,加入内源性VEGF后,甚至增强了细胞毒作用。
实施例10:R2FasL在U87MG人成胶质细胞瘤细胞和DU145人前列腺癌细胞
中,但不在U373人成胶质细胞瘤细胞中诱导细胞毒性或凋亡
为了研究R2FasL能否在人成胶质细胞瘤中诱导细胞毒性,进行了以下实验。以25,000个细胞/孔将U87MG人成胶质细胞瘤细胞接种于含有100μL完全培养基的96-孔板中,所述培养基含有10%胎牛血清,使细胞生长84小时而不更换培养基。然后将经FLAG表位标签亲和层析纯化的R2FasL溶液(0、0.01、0.1、1或10μL)加入各孔(图17A)。此外,各孔接受300ng中和性抗VEGF抗体、中和性抗FasL抗体或对照山羊Ig(均来自R&S系统公司)。24小时后,用LDH释放试验(罗氏公司)测定细胞毒性,其中将10μL细胞悬液与100μL LDH反应混合物混合,总反应体积为200μL。测定492nm吸光度,用分光光度法测定细胞毒性。VEGF或FasL的中和性抗体能抑制细胞毒性说明,它们都是R2FasL介导细胞毒性所必需(图17A)。
为了研究R2FasL能否诱导人成胶质细胞瘤凋亡,进行了以下试验。以约287,500个细胞/孔将U87MG人成胶质细胞瘤细胞接种于含有500μL完全培养基的12孔板中,所述培养基中含有10%胎牛血清。24小时后,加入用pFLAG/R2FasL或空pFLAG载体转染的Cos7细胞的条件培养基(图17B)。用市售rhsFasL作为标准品(R&S系统公司)进行定量免疫印迹,从而分别测定R2FasL浓度。再经过36小时后,用胰蛋白酶处理细胞,用台盼蓝染色,用血球计数板计数。图17B的数据表示为平均值±SEM。
为了研究R2FasL能否在人前列腺癌细胞中诱导细胞毒性,进行以下实验。将DU145人前列腺癌细胞接种于含有500μL完全培养基的24孔板中,所述完全培养基含有10%胎牛血清,使其生长54小时而不更换培养基。加入所示体积的用pFLAG/R2FasL或空pFLAG载体转染的Cos7细胞的条件培养基。再经过34小时后,用上述LDH释放试验测定细胞毒性。代表性数据组见图17C。
为了研究R2FasL活性对U87MG成胶质细胞瘤细胞的特异性,分析了R2FasL对U373成胶质细胞瘤细胞系的细胞毒作用。已知U373细胞对Fas受体介导的杀伤作用有抗性,即U373细胞基本上是阴性对照,以显示R2FasL没有组成型毒性。以25,000个细胞/孔将U87MG和U373人成胶质细胞瘤细胞接种于含有100μL完全培养基的96孔板中,所述培养基含有10%胎牛血清,使其生长96小时而不更换培养基。加入所示体积的用pFLAG/R2FasL载体转染的Cos7细胞的条件培养基。再经过36小时后,用本文所述的LDH释放试验检测细胞毒性(图17D)。
实施例11:R1[D2]FasL以VEGF依赖性方式诱导凋亡
为了研究R1[D2]FasL能否以VEGF依赖性方式诱导凋亡,进行了以下实验。将Jurkat E6.1人T细胞接种于包含100μL含有10%胎牛血清的完全培养基的96孔板中。在不存在或存在rhVEGF-165(终浓度2nM)的情况下,加入用pFLAG/R1[D2]FasL载体转染的Cos7细胞的条件培养基(0.001、0.01、0.1、1或10μL)。22小时后,用刃天青试验(来自生物资源公司(BioSource)的阿尔玛蓝试剂)检测细胞活力。将20μL阿尔玛蓝加入各孔和检测540nm和620nM的吸光度,测定活细胞将多少阿尔玛蓝底物转变为产物。按照生产商方案计算底物转变成产物的%。显示R1[D2]FasL以VEGF依赖性方式诱导凋亡的代表性数据组见图18A。
为了研究哪种生长因子能激活R1[D2]FasL,进行了以下实验。将Jurkat E6.1人T细胞接种于包含100μL含有10%胎牛血清的完全培养基的96孔板中。在不存在或存在rhVEGF-165(重组人VEGF-165)、rmVEGF-164(重组小鼠VEGF-164)、rhVEGF-121(重组人VEGF-121)、rhVEGF-165/rhP1GF-129异源二聚体或rhP1GF-129的情况下,加入用pFLAG/R1[D2]FasL载体转染的Cos7细胞的条件培养基(2μL/孔)。所用的所有生长因子的终浓度为10nM,来自派普泰科公司或R&D系统公司。19小时后,用上述刃天青试验检测细胞活力。代表性数据见图18B。结果表明,在这些实验中,所检测的所有生长因子都能激活R1[D2]FasL。
在类似实验中,所检测的生长因子浓度不同。简要说,将Jurkat E6.1人T细胞接种于包含100μL含有10%胎牛血清的完全培养基的96孔板中。在不存在或存在终浓度为0.001、0.01、0.1、1和10nM的rhVEGF-165或rmVEGF-165的情况下,加入用pFLAG/R2FasL载体或空pFLAG载体转染的Cos7细胞的条件培养基(1μL/孔)。18小时后,用本文所述的刃天青试验测定细胞活力。图21A所示数据表明,人和小鼠VEGF-165能相似地激活R2FasL。
为了测定hVEGF-165对R1[D2]FasL的ED50,进行以下实验。将Jurkat E6.1人T细胞接种于包含100μL含有10%胎牛血清的完全培养基的96孔板中。在不存在或存在0、0.01、0.1、1、10、100、1,000或10,000nM rhVEGF-165的情况下,加入用pFLAG/R1[D2]FasL载体转染的Cos7细胞的条件培养基(2μL/孔)。19小时后,用上述刃天青试验检测细胞活力。发现hVEGF-165对R1[D2]FasL的ED50约为100pM(图18C)。
在类似实验中,测定了hVEGF-165对R2FasL的ED50。简要说,将Jurkat E6.1人T细胞接种于包含100μL含有10%胎牛血清的完全培养基的96孔板中。在不存在或存在终浓度为0、0.02、0.02、0.2和2nM的rhVEGF-165的情况下,加入所示体积的用pFLAG/R2FasL载体转染的Cos7细胞的条件培养基。18小时后,用刃天青试验测定细胞活力。rhVEGF-165的ED50为20pM-200pM(图21B)。
实施例12:用化疗药加强R2FasL活性
为了测定化疗药可否加强R2FasL活性,进行以下实验。以25,000个细胞/孔将U87MG人成胶质细胞瘤细胞接种于包含100μL含有10%胎牛血清的96孔板中。48小时后,用双吲哚基马来酰亚胺VIII(Bis VIII,终浓度1μM)、喜树碱(终浓度20nM)、依托泊甙(终浓度5μM)或DMSO载体(1μL/孔)处理细胞。将Bis VIII、喜树碱和依托泊甙(均来自拜尔默公司(Biomol))溶解于DMSO,每孔加入1μL。接触药物72小时后,用FLAG抗体亲和纯化的R2FasL溶液(10μL/孔)处理细胞,再培育40小时。分别用上述刃天青试验和LDG释放试验测定细胞活力和细胞毒性。图19A和19B所示结果证明,在这些实验中检测的化疗药均能增强R2FasL的活性。
实施例13:R2FasL在大血管内皮细胞中不诱导细胞毒性,但在微血管内皮细
胞中具有活性
为了测定R2FasL能否在大血管内皮细胞中诱导细胞毒性,微血管和大血管可表达不同的死亡因子受体和生长因子受体群。R2FasL在肿瘤内皮细胞(微血管)中的活性有差异,对正常大血管(如动脉和静脉)内皮细胞的毒性较小。为了测定R2FasL能否在大血管内皮细胞中诱导细胞毒性,进行了以下实验。将人脐静脉内皮细胞(大血管内皮细胞;HUVEC,第4代,来自克隆泰克公司(Clonetics))接种于含有100μL培养基的96孔板中,所述培养基含有10%胎牛血清但不含VEGF。24小时后,撤消血清开始血清饥饿(以使细胞对死亡信号敏感)。血清饥饿15小时后,在不存在或存在rhVEGF-165(终浓度2nM)的情况下,用含有R2FasL(10μL/孔)的Cos7细胞条件培养基处理细胞。用R2FasL±rhVEGF处理22小时后,用本文所述的刃天青试验测定细胞活力。表明R2FasL+VEGF对这些大血管内皮细胞没有作用(图20A)。
为了测定R2FasL能否在微血管内皮细胞中诱导细胞毒性,进行了以下实验。将牛肾上腺皮质内皮细胞(微血管内皮细胞)接种于包含100μL含有1%胎牛血清的完全培养基的96孔板中。22小时后,在不存在或存在rhVEGF-165(终浓度2nM)的情况下,加入用pFLAG/R2FasL或空pFLAG载体转染的Cos7细胞的条件培养基(2μL/孔)。24小时后,用上述LDH释放试验检测细胞毒性。图20B显示,R2FasL和VEGF能在肾上腺皮质内皮细胞中诱导细胞毒性。因此,R2FasL对大血管内皮细胞(如HUVEC)无活性,但对微血管内皮细胞有活性。
实施例14:检测VEGFR-FasL的体内(作用)
也可在体内,(例如)在佐剂关节炎模型中检测本发明融合蛋白的活性。本文所用术语"佐剂关节炎模型"指大鼠,优选Wistar-Lewis或本领域技术人员已知的其它大鼠品系,将0.1mL弗氏佐剂注射到尾根部诱导此疾病。这种佐剂关节炎模型只是一个可用于检测本发明化合物的动物模型例子。三种最常见的动物模型的综述参见Oliver和Brahn(1996)J.Rheumatol.23:56-60,将其全文,包括附图、数据或表格纳入本文作参考。
已经开发了许多动物模型来研究VEGF在肿瘤血管新生中的功能。例如,大鼠C6胶质瘤和人U87MG成胶质细胞瘤细胞能分泌VEGF,在无胸腺小鼠皮下生长(Saleh等,Cancer Res(1996)56:393-401;Cheng等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1996),93:8502-8507)。将VEGF mRNA的反义构建物引入这些细胞系能减缓其体内生长,并降低新血管形成的程度。VEGF的单克隆抗体能抑制人横纹肌肉瘤、成胶质细胞瘤、平滑肌肉瘤(Kim等,Nature(1993),362:841-844)和纤维肉瘤(Asano等,Cancer Res(1995),55:5296-5301)在无胸腺小鼠皮下生长。抗VEGF抗体也能阻断纤维肉瘤(Asano等,Cancer Res(1995),55:5296-5301)和结肠癌肿瘤(Warren等,J Clin Invest(1995),95:1789-1797)的转移。因此,这些动物模型可用于检测本发明融合蛋白的体内活性。
虽然为了阐述和理解,通过说明和举例的方式详细描述了上述发明,但本领域普通技术人员不难理解,根据本发明的内容,可以在不背离所附权利要求书的构思和范围的情况下作出某些改变和修饰。
将本说明书引用的所有发表物和专利申请纳入本文作参考,就像将单个发表物或专利申请专门或单独纳入本文作参考的那样。
序列表
SEQ ID NO:1包含信号肽的人VEGF受体-2蛋白序列的胞外结构域(GenBank NP_002244的一部分)
SEQ ID NO:2包含信号肽的小鼠VEGF受体-2蛋白序列的胞外结构域(GenBank P35918的一部分)
SEQ ID NO:3包含信号肽的大鼠VEGF受体-2蛋白序列的胞外结构域(GenBank 008775的一部分)
SEQ ID NO:4人VEGF受体-2蛋白序列的胞外结构域(GenBank NP_002244的一部分)
SEQ ID NO:5小鼠VEGF受体-2蛋白序列的胞外结构域(GenBank P35918的一部分)
SEQ ID NO:6大鼠VEGF受体-2蛋白序列的胞外结构域(GenBank 008775的一部分)
SEQ ID NO:7氨基酸接头序列
SEQ ID NO:8人FasL蛋白序列(GenBank P48023)
SEQ ID NO:9小鼠FasL蛋白序列(GenBank A53062)
SEQ ID NO:10大鼠FasL蛋白序列(GenBank A49266)
SEQ ID NO:11VEGFR-FasL融合蛋白中的人FasL蛋白序列(GenBank P48023的一部分)
SEQ ID NO:12VEGFR-FasL融合蛋白中的小鼠FasL蛋白序列(GenBank A53062的一部分)
SEQ ID NO:13VEGFR-FasL融合蛋白中的大鼠FasL蛋白序列(GenBank A49266的一部分)
SEQ ID NO:14编码包含信号肽和接头序列的VEGFR-FasL融合蛋白Flk(D1-D3)FasL(139-281)的cDNA序列
SEQ ID NO:15编码小鼠VEGF受体-2胞外结构域(19-336)的cDNA序列
SEQ ID NO:16编码人FasL(139-281)的cDNA序列
SEQ ID NO:17编码包含信号肽的人VEGF受体-2胞外结构域(1-334)的cDNA序列(GenBank NM_002253的一部分)
SEQ ID NO:18编码人VEGF受体-2胞外结构域(19-334)的cDNA序列(GenBank NM_002253的一部分)
SEQ ID NO:19包含信号肽(下划线)和Ig样C2型结构域(32-123、151-214、230-327、335-421、428-553、556-654和661-747,以粗体表示)的人VEGF受体-1的蛋白序列(1-1338)(GenBank P17948)
SEQ ID NO:20人VEGF受体-1胞外结构域的蛋白序列(27-758,不含信号肽)(GenBank P17948的一部分)
SEQ ID NO:21编码人VEGF受体-1胞外结构域(27-758)的cDNA序列(GenBank NM_002019的一部分)
SEQ ID NO:22包含信号肽的Flk(D1-D3)+FasL(139-281)的氨基酸序列
SEQ ID NO:23不含信号肽的Flk(D1-D3)+FasL(139-281)的氨基酸序列
SEQ ID NO:24包含信号肽序列的人神经毡蛋白-1胞外结构域的氨基酸序列(GenBank AAC12921的一部分)
SEQ ID NO:25人VEGFR-3的氨基酸序列(GenBank NP_891555)
Claims (34)
1.一种结合于死亡受体的融合蛋白,所述融合蛋白包含:
(i)结合血管内皮生长因子(VEGF)多肽的血管内皮生长因子受体(VEGFR)多肽;和
(ii)含有寡聚化结构域和死亡受体识别部分的死亡配体;
其中所述VEGFR多肽的C末端连接于所述死亡配体的N末端。
2.如权利要求1所述的融合蛋白,其特征在于,所述死亡受体是Fas,所述死亡配体是Fas配体。
3.如权利要求1所述的融合蛋白,其特征在于,所述VEGFR多肽包含VEGF受体-1(VEGFR-1)的VEGF结合域。
4.如权利要求1所述的融合蛋白,其特征在于,所述VEGFR多肽包含VEGF受体-2(VEGFR-2)的VEGF结合域。
5.如权利要求3所述的融合蛋白,其特征在于,所述VEGF受体-1是人VEGF受体-1。
6.如权利要求4所述的融合蛋白,其特征在于,所述VEGF受体-2是人VEGF受体-2。
7.如权利要求2所述的融合蛋白,其特征在于,所述Fas配体是人Fas配体。
8.如权利要求4所述的融合蛋白,其特征在于,所述VEGFR-2是鼠VEGFR-2,所述死亡配体包括人Fas配体。
9.如权利要求8所述的融合蛋白,其特征在于,所述融合蛋白包含与SEQ IDNO:22或SEQ ID NO:23所示氨基酸序列至少80%同源的氨基酸序列。
10.如权利要求8所述的融合蛋白,其特征在于,所述融合蛋白包含SEQ IDNO:22或SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列。
11.如权利要求1所述的融合蛋白,还包含:(iii)表位标签。
12.如权利要求11所述的融合蛋白,其特征在于,所述表位标签包括FLAG样标签或HA标签。
13.如权利要求12所述的融合蛋白,其特征在于,可切掉所述表位标签。
14.如权利要求2所述的融合蛋白,其特征在于,所述Fas配体选自:
(i)含有氨基酸序列SEQ ID NO:11的多肽;
(ii)含有氨基酸序列SEQ ID NO:12的多肽;
(iii)含有氨基酸序列SEQ ID NO:13的多肽;和
(iv)包含在(i)-(iii)中任一项氨基酸序列中缺失、取代或添加一个至数个氨基酸残基的氨基酸序列的具有Fas结合活性的多肽。
15.如权利要求3所述的融合蛋白,其特征在于,所述VEGFR-1选自:
(i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:20的多肽;
(ii)包含SEQ ID NO:19的氨基酸残基1-747的多肽;
(iii)包含SEQ ID NO:19的氨基酸残基32-747的多肽;
(iv)包含SEQ ID NO:19的氨基酸残基151-214的多肽;
(v)包含SEQ ID NO:19的氨基酸残基230-327的多肽;和
(vi)包含在(i)-(v)中任一项氨基酸序列中缺失、取代或添加一个至数个氨基酸残基的氨基酸序列的具有VEGF结合活性的多肽。
16.如权利要求4所述的融合蛋白,其特征在于,所述VEGFR-2多肽选自:
(i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:1的多肽;
(ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:2的多肽;
(iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:3的多肽;
(iv)包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的多肽;
(v)包含氨基酸序列SEQ ID NO:5的多肽;
(vi)包含氨基酸序列SEQ ID NO:6的多肽;
(iiv)包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基141-207的多肽;
(iix)包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基224-320的多肽;和
(ix)包含在(i)-(iix)中任一项氨基酸序列中缺失、取代或添加一个至数个氨基酸残基的氨基酸序列的具有VEGF结合活性的多肽。
17.一种核酸,其包含SEQ ID NO:14所示的核苷酸序列。
18.一种载体,其包含权利要求17所述的核酸。
19.一种调节死亡受体介导的途径的方法,所述方法包括以下步骤:
使表达死亡受体的细胞与含有以下组分的融合蛋白相接触:
(i)结合VEGF蛋白的VEGFR多肽;
(ii)含有寡聚化结构域和死亡受体识别部分的死亡配体;
其中所述VEGFR多肽已结合VEGF蛋白,所述融合蛋白的含量能有效调节死亡受体介导的途径。
20.如权利要求19所述的方法,其特征在于,所述死亡受体是Fas,所述死亡配体是Fas配体。
21.如权利要求20所述的方法,其特征在于,所述Fas-介导途径是凋亡。
22.如权利要求21所述的方法,其特征在于,所述融合蛋白的量能有效诱导凋亡。
23.如权利要求19所述的方法,可在体外实施。
24.如权利要求19所述的方法,可在体内实施。
25.如权利要求19所述的方法,其特征在于,所述细胞是癌细胞。
26.如权利要求25所述的方法,其特征在于,所述癌细胞过度表达VEGF。
27.如权利要求25所述的方法,其特征在于,所述癌细胞选自乳腺癌细胞、前列腺癌细胞、结肠癌细胞、肺癌细胞、成胶质细胞瘤细胞或卵巢癌细胞。
28.如权利要求19所述的方法,其特征在于,该方法在选自下组的疾病中调节Fas介导的途径:类风湿性关节炎、牛皮癣和黄斑变性。
29.如权利要求19所述的方法,还包括使表达所述死亡受体的细胞与化疗药相接触的步骤。
30.如权利要求29所述的方法,其特征在于,所述化疗药选自喜树碱、依托泊甙、双吲哚基马来酰亚胺VIII、顺铂、紫杉醇、多柔比星、替莫唑胺、硼替佐米、LY294002或丙戊酸。
31.一种药物组合物,其包含:
(i)含有以下组分的融合蛋白:(1)结合VEGF蛋白的VEGFR多肽;(2)含有寡聚化结构域和Fas配体蛋白胞外结构域的Fas受体识别部分的Fas配体;和
(ii)药学上可接受的赋形剂、运载体和/或稀释剂。
32.如权利要求31所述的药物组合物,其特征在于,所述Fas配体是人Fas配体。
33.如权利要求31所述的药物组合物,其特征在于,所述VEGFR多肽包含VEGF受体的VEGF结合域。
34.一种组合物,其包含:
(i)含有SEQ ID NO:14所示核苷酸序列的核酸的载体;和
(ii)药学上可接受的赋形剂、运载体和/或稀释剂。
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