CN114703229A - 一种基于人源细胞的表面展示技术及靶向hbv受体的多肽及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于人源细胞的表面展示技术，包括：S1、将受体蛋白与荧光蛋白融合，获得含有受体‑荧光蛋白融合蛋白的膜碎片备用；S2、将待筛选的多肽与FasL的跨膜序列以及荧光蛋白融合，构建荧光蛋白‑FasL跨膜区‑多肽融合蛋白质粒，得到的稳定表达细胞系为细胞表面展示多肽库；S3、将受体‑荧光蛋白融合蛋白膜碎片与步骤S2得到的稳定表达细胞系混合孵育，然后用流式细胞仪分选与受体亲和力高的展示细胞，筛选富集得到与受体具有高亲和力的目标多肽；本发明还公开了靶向HBV受体的多肽217‑3或217‑4，经实验证实，Myr‑217‑3抑制HBV感染的IC50较Myr‑21改进了约8倍。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学和生物医药技术领域，具体涉及一种基于人源细胞的表面展示技术及靶向HBV受体的多肽及其应用。
背景技术
包膜病毒感染细胞的过程，依赖于病毒包膜蛋白与细胞表面受体的结合。因此，干扰病毒包膜蛋白与受体的结合，可成为有效的抗病毒策略。要实现这种策略，可以封闭相应的病毒包膜蛋白，或者封闭细胞表面的相应受体，从而阻止二者的结合。能与受体相互作用，从而阻止其与病毒蛋白结合的分子，可以是化合物分子或者多肽分子。与化合物分子相比，多肽分子由氨基酸模块组成，通过改变序列和长度可以获得巨大的分子多样性。同时，多肽可以由DNA编码和表达，相对容易实现低成本筛选。因此，多肽已成为一类重要的候选药物来源。
筛选与特定蛋白分子结合的多肽，通常可利用一些表面展示技术，比如噬菌体展示技术、酵母细胞表面展示技术，核糖体展示技术等。这些展示技术系统通常包含两种主要成分。一种是用于展示随机多肽的平台，如噬菌体，酵母细胞等；另一种是目标蛋白分子。大体筛选原理，是将目标蛋白分子固定于某种载体，然后去结合展示于噬菌体或酵母细胞表面的多肽分子。不能被结合的噬菌体或酵母细胞，将被淘筛去除。而能被结合的噬菌体或酵母细胞，则被收集下来，做进一步反复淘筛。最终获得的噬菌体或酵母细胞所表达的多肽，就可能是与目标蛋白有相当亲和力的分子。
然而，在筛选与病毒受体相互作用的多肽时，常用的表面展示技术可能存在困难。首先，这些多肽往往要经过某种修饰，才能发挥作用。这些修饰虽然在人体细胞中可以自动进行，但在低等生物细胞中却不能完成。例如，与HBV受体NTCP结合的多肽，需要在其N端具有豆蔻酰化修饰。其次，受体蛋白通常是膜蛋白。一方面，膜蛋白很难从原核细胞表达与纯化；另一方面，在脱离膜结构时，膜蛋白很可能不形成具有功能的正常结构，因而无法作为实际筛选靶标。
发明内容
本发明的发明人在进行抑制乙肝病毒的多肽的研究中，发现现有的表面展示技术难以应用在所研究的课题中，针对现有表面展示技术的上述问题，开发了一种基于人源细胞的表面展示技术系统，在该表面展示技术基础上筛选到了能够抑制乙肝病毒感染的多肽。因此，本发明要求保护如下技术方案：
一种基于人源细胞的表面展示技术，包括如下步骤：
S1、将受体蛋白与荧光蛋白融合，利用sleeping beauty转座子转染HEK293细胞使其稳定表达于人源细胞膜，筛选后得到该受体蛋白融合荧光蛋白的稳定表达细胞系，然后裂解细胞膜，获得含有受体-荧光蛋白融合蛋白的膜碎片备用；
S2、将待筛选的多肽与FasL的跨膜序列以及荧光蛋白融合，构建荧光蛋白-FasL跨膜区-多肽融合蛋白质粒，然后利用sleeping beauty转座子转染HEK293细胞，经筛选后，得到的稳定表达细胞系即为细胞表面展示多肽库；
S3、将步骤S1得到的受体-荧光蛋白融合蛋白膜碎片与步骤S2得到的稳定表达细胞系混合孵育，然后用流式细胞仪分选与受体亲和力高的展示细胞，经过进一步的筛选富集得到与受体具有高亲和力的目标多肽；
所述荧光蛋白为绿色荧光蛋白或者红色荧光蛋白，且受体蛋白和多肽分别融合的是不同的荧光蛋白。
所述表面展示技术用于筛选与HBV受体NTCP结合的多肽；
步骤S1中，所述受体蛋白为NTCP，所述荧光蛋白为绿色荧光蛋白；所述裂解细胞采用的方法是反复冻融裂解破碎细胞膜，高速离心去上清后，用1ml注射器反复吹吸混匀细胞膜碎片使其基本呈现出均质状态；所述NTCP与绿色荧光蛋白由接头1连接，所述接头1的氨基酸序列为：WSGSGGGGSG GGGSGGGGSG GGGSGGGGSG GGGSGGGGSG GGGSGGGGSV(SEQ IDNO.47)；
步骤S2中，所述荧光蛋白为红色荧光蛋白，红色荧光蛋白Cherry与FasL跨膜区之间由柔性接头2连接，所述柔性接头2的氨基酸序列为GGGGS(SEQ ID NO.48)；FasL跨膜区与多肽之间由柔性接头3连接，所述柔性接头3的氨基酸序列为SSGSGGGGSG GGGSGGGGSGGGGSGGGGSG GGGSGGGGSG GGGSGGGGS(SEQ ID NO.49)；FasL跨膜区的氨基酸序列是KKRGNHSTGL CLLVMFFMVL VALVGLGLGM FQLFHLQKE(SEQ ID NO.50)。
所述待筛选的多肽为将preS1 aa2-21的C端延伸7个随机氨基酸得到的随机多肽库。
本发明还保护由上述表面展示技术筛选得到的靶向HBV受体的多肽，所述多肽为217-3或217-4，217-3的氨基酸序列为(SEQ ID NO.51)：GTNLSVPNPLGFFPDHQLDPLWTSNKK，217-4的氨基酸序列为(SEQ ID NO.52)：GTNLSVPNPLGFFPDHQLDPLRRVAEF。
所述多肽的N端有豆蔻酰化修饰。
蛋白质豆蔻酰化修饰(N-myristoylation)是由豆蔻酰化转移酶(N-myristoyltransferase,NMT)介导的，在蛋白质N端甘氨酸上共价连接上14-碳饱和脂肪酸。
本发明还保护上述的多肽在制备治疗乙型肝炎病毒的药物中的应用。
在上述应用技术方案中，所述多肽与HBV受体NTCP结合。
本发明还保护一种用于治疗乙型肝炎病毒的药物，所述药物包含上述的多肽。
所述药物还包含药学上可接受的载体和赋形剂，药物剂型为片剂、胶囊剂、颗粒剂、混悬剂、丸剂中的任意一种。
本发明的有益效果是：
为了解决现有技术中的展示技术系统不适合于与HBV受体NTCP(硫磺胆酸钠共转运蛋白)结合的多肽的筛选的技术问题，本发明建立了一种基于人源细胞的表面展示技术系统，以多肽PreS12-21为优化起点，在其羧基末端延伸7个随机氨基酸，构建了细胞表面展示多肽库，然后利用HEK293表达的NTCP-GFP融合蛋白，结合流式细胞分选以筛选对NTCP亲和力更高的多肽，通过7轮流式分选富集，二代测序结果显示，部分多肽富集程度超过1000倍。对富集程度较高的多肽逐一做流式分析，最终得到多肽217-3。与起始多肽Myr21相比，多肽Myr217-3在HepG2-NTCP细胞模型上的抗HBV感染作用提升约9倍，证明了这一筛选系统的有效性。
本发明将受体蛋白与荧光蛋白融合，利用转座子系统稳定表达于人源细胞膜，经筛选构成稳定细胞系后，根据需要收集细胞并裂解细胞膜，用带有受体-荧光蛋白的膜碎片作为靶蛋白进行筛选，解决膜蛋白的表达和标记问题；利用转座子，将多肽库构建成稳定表达的展示细胞库以用于后续的靶向筛选；通过靶蛋白与荧光蛋白融合、多肽与荧光蛋白结合，采用流式细胞仪分选即可分选出与靶蛋白具有高亲和力的多肽。本发明的筛选技术为靶向其他病毒受体的多肽开发提供了有益借鉴，有望应用在更多病毒受体的靶向多肽开发上面，为多肽开发提供了一种新的工具。
附图说明
图1是用于NTCP亲和多肽筛选优化的细胞表面展示系统与筛选流程示意图。
图2是用FKBP12-FRB系统验证流式细胞分选的可行性测试。
图3是膜上表达NTCP-Cherry与胞浆表达GFP-preS1相互作用流式分析。
图4是膜上表达Cherry-preS1与膜上表达NTCP-GFP相互作用流式分析。
图5是不同浓度NTCP-GFP与膜上Cherry-preS1的结合分析。
图6是随机延伸多肽库的一代测序结果。
图7是分选富集后多肽库多样性的变化。
图8是经7轮分选富集后筛选出的多肽序列。
图9是初筛多肽的验证结果。
图10是Myr-217-3抑制HBV感染实验结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明，但并不因此而限制本发明。
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法；所用生物、化学试剂如无特殊说明，均为本领域常规试剂，均可通过商购获得。
1、主要试剂来源：
Golden Gate无缝克隆用到的BsmBⅠ酶，Tango，DTT(Termo Scientific公司，美国)；T7 Ligase连接酶(New England Biolabs)。
PCR用到的2×PrimeSTAR Premix(Takara，日本)。胶回收试剂盒，质粒小量抽提试剂盒(Magen，中国)，质粒中量抽题试剂盒(Macherey-Nagel)，基因组DNA提取试剂盒(Qiagen，德国)。细胞用到的试剂有：Lipo8000转染试剂(碧云天,中国)，慢病毒浓缩试剂PEG-it Virus Precipitation Solution(SBI，美国),Doxycycline(MCE)，Blastinatin(NEB，美国)，OptiMEM(Gibco)，胶原(Corning)。胎牛血清(Lonsera公司，乌拉圭)，胰酶，DMEM培养基，PBS，青链霉素(Gibco，美国)。Platinum SYBR Green qPCR(Invitrogen公司，美国)；病毒s抗原和e抗原酶免法检测试剂盒(科华生物工程股份有限公司，上海)；逆转录试剂盒(天根生化科技有限公司，北京)；Trizol Reagent试剂(Termo Scientific，美国)；酚氯仿(Amresco，美国)，微管酶(NEB，美国)，Southern blotting试剂、地高辛抗体、探针(Roche Diagnostics)；Anti-GFP鼠抗、Actin内参(碧云天，中国)；荧光标记二抗(LicorBiosciences)；6×蛋白Loading、蛋白Marker(Bio-rad)；SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(ATGene)，Tris、SDS、NaCl、CaCl2(生工，上海)，EDTA、DMSO、Rapamycin(Solarbio，北京)。
2、主要材料来源
质粒模板来源：质粒RlucN-HBC，与中国专利申请CN 201610564291.6中的质粒RlucN-HBC相同，pCH9/3091质粒由德国弗莱堡大学Nassal实验室构建，pEGFP-N1购自美国的Clontech公司，LentiCRISPRv2、psPAX2、Pmd2.0G为麻省理工张峰实验室构建。
菌株：大肠杆菌DH5α购自索莱宝公司。
细胞：HEK293购自ATCC(美国模式培养物集存所)，HepG2-NTCP在重庆医科大学感染性疾病分子生物学重点实验室长期保存。
3、本发明实施例中使用引物序列如下：
注：引物序列中的N代表A,G,C或T；引物序列中的K代表G或T。
4、本发明技术方案的总体技术方案设计
我们以HBV preS1蛋白(乙型肝炎病毒前S1蛋白)的第2-21位氨基酸(preS1 aa2-21)序列为筛选和优化起点，因为preS1 aa2-21是参与preS1与HBV受体NTCP结合的重要序列。技术方案需要满足以下几项条件：(1)多肽序列的N端需要被豆蔻酰化，才具有与NTCP的结合能力；为此，我们利用人源细胞HEK293表达这些多肽，以获得豆蔻酰化修饰；(2)待筛选的多肽具有序列多样性，为此，我们将preS1 aa2-21的C端延长7个随机氨基酸，以获得这种多样性(图1A)；(3)这些多肽需要被展示在细胞膜表面，为此，我们将多肽与FasL(FasL长278aa，为II型跨膜糖蛋白，由胞膜外区、跨膜区和胞浆区组成)的跨膜序列融合，以实现其在细胞膜表面的展示(图1A)；(4)这些多肽需要被带上荧光标记以便分选，为此，我们将多肽融合红色荧光蛋白Cherry(图1A)；(5)这些多肽还需要从HEK293细胞中稳定表达，以获得亲和表型与基因型的偶联；为此，我们利用sleeping beauty转座子，来构建随机多肽的稳定表达混合细胞系；(6)需要表达结构和功能正常的靶蛋白NTCP，同时NTCP也需要被荧光标记以便筛选；为此，我们利用HEK293细胞表达融合蛋白NTCP-GFP，该融合蛋白将被表达于细胞膜上，我们将用反复冻融方式破碎细胞膜，然后，以位于细胞膜碎片上的NTCP-GFP作为筛选靶分子。
整体筛选流程如下：首先，利用转座子构建稳定表达多样性多肽的融合蛋白，将多肽展示在HEK293细胞表面(图1B)；然后，将带有NTCP-GFP的细胞膜碎片与展示了多肽的HEK293细胞孵育(图1C)；孵育的结果，是那些与NTCP亲和力较高的展示细胞，吸附更多的NTCP-GFP分子。将这些细胞悬混液用流式细胞仪分选(图1D)，选择那些表达Cherry并且GFP信号较高的细胞，做进一步培养扩增(图1E)；再用经过扩增的细胞，与NTCP-GFP孵育后做下一轮筛选富集。如此反复分选富集数轮以后，提取细胞的基因组DNA并用PCR扩增含有多样性多肽的区段，做二代测序，以鉴定其序列。选择那些丰度较高且富集程度较高的序列做进一步鉴定(图1F)，其中部分序列可能与NTCP有较高亲和力，因而具有进一步研究开发价值。
实施例1质粒构建
质粒GFP-FRB，FRB-GFP,Cherry-FasL-FKBP，NTCP-GFP为前期构建，在此基础上构建其它质粒。
质粒GFP-FRB是以RlucN-HBC为骨架，将绿色荧光蛋白GFP基因插入在CMV启动子和SV40终止子之间的表达框内得到的质粒，其中GFP位于N端，FRB位于C端。
质粒FRB-GFP是以RlucN-HBC为骨架，将绿色荧光蛋白GFP基因插入在CMV启动子和SV40终止子之间的表达框内得到的质粒，其中FRB位于N端，GFP位于C端。
质粒Cherry-FasL-FKBP是以RlucN-HBC为骨架，将红色荧光蛋白-FasL-FKBP融合基因插入在CMV启动子和SV40终止子之间的表达框内之间得到的质粒。
质粒NTCP-GFP以RlucN-HBC为骨架，将NTCP-GFB融合基因插入在CMV启动子和SV40终止子之间的表达框内得到的质粒。
一、构建中间质粒Lenti-NTCP-GFP-2A-blast，NTCP d157-165-GFP，NTCP-Cherry，Lenti-NTCP-Cherry-2A-blast，NTCP 267S/F-Cherry，NTCP d157-165-Cherry，PreS-d11-15-GFP
其中，Lenti-NTCP-GFP-2A-blast和Lenti-NTCP-Cherry-2A-blast用于构建稳定系，分别为NTCP-GFP和NTCP-Cherry的稳定系，方便随取随用。
PreS-d11-15-GFP的构建，是以PreS1 48为模板，用引物F d11-15+R d11-15扩出片段，该片段自连即可得到该质粒。
以NTCP-GFP为模板，用引物Fen-cmv+REGFP扩增得到片段1。再以Lenti-Cas9-Blast质粒(商购)为模板，用引物F lentiv2 P2A+R lenti preEF-1α得到片段2。利用Golden Gate克隆法将片段1、2酶切连接得到质粒Lenti-NTCP-GFP-blast。
以NTCP-GFP为模板，用引物R de157-165+Famp494 ggtt，F de157-165+Ramp494aacc扩增得到片段3、4，利用Golden Gate克隆法将片段3、4酶切连接得到质粒NTCP d157-165-GFP。
以NTCP-GFP为模板，用引物F SV40 GG2+R GSNTCP扩得片段5。以带有红色荧光蛋白基因Cherry基因的质粒为模板，用FAGCA Cherry+R GTTA Cherry扩出片段6。片段5、6酶切连接得到质粒NTCP-Cherry。
质粒NTCP-Cherry构建完成后，以之为模板，F TTAC267+Ramp494 aacc，R GTAA267+Famp494 ggtt扩增得到片段7、8，用引物R de157-165+Famp494 ggtt，F de157-165+Ramp494 aacc扩增得到片段9、10，利用Golden Gate克隆法将片段7、8酶切连接得到质粒NTCP 267S/F-Cherry，片段9、10酶切连接得到质粒NTCP d157-165-Cherry。
PCR扩增反应体系为：作为模板的质粒10ng，正向引物F(10μM)/反向引物R(10μM)各0.4μl，2×PrimeSTAR Max Premix(Takara)10μl，灭菌超纯水补齐体积至20μl。反应条件：95℃预变性3min；98℃10s，55℃5s，72℃30s，36个循环。用胶回收试剂盒回收扩增片段。
Golden gate连接反应的反应体系为：BsmB Iv2酶(NEB)0.75μl、Tango buffer 1μl、DTT 1μl、T7 DNA ligase(NEB)0.25μl、ATP 1μl、待连接的各片段。各片段按照Kb*20/Gel回收的浓度(ng/μl)来计算加入的量，ddH2O补齐至10μl。反应条件：42℃5min，16℃5min，循环25次后，60℃5min。Golden gate产物转化DH5α感受态细菌，涂板，克隆初筛，测序鉴定成功后提小抽，即可得到目标质粒。
二、构建质粒PT4-Cherry-FasL-PreS1 48-2A-blast(PT4-48)，PT4-Cherry-FasL-PreS1 21-2A-blast(PT4-21)
以Cherry-FasL-FKBP为模板，用引物R GSFasL+F SV40 GG2扩增得到片段11，以Pch9/3091为模板，F PreS1+R GTTA PreS48扩增得到片段12，片段11、12酶切连接得到质粒Cherry-FasL-PreS1 48。
PT4-48和PT4-21的构建分为以下两步：
第一步，在Cherry-FasL-PreS1 48的基础上构建Lenti-Cherry-FasL-PreS1 48-2A-Blast，Lenti-Cherry-FasL-PreS1 21-2A-Blast。
以Lenti-Cas9-Blast为模板，用引物F lentiv2 P2A+Famp494 ggtt，RlentipreEF-1α+Ramp494 aacc分别扩出片段13、14，以Cherry-FasL-PreS1 48为模板，用引物Fen-cmv+R ATCC PreS48，Fen-cmv+R ATCC PreS21，分别扩出片段15、16。片段13、14、15酶切连接得到质粒Lenti-Cherry-FasL-PreS1 48-2A-Blast，片段13、14、16酶切连接得到质粒Lenti-Cherry-FasL-PreS1 21-2A-Blast。
第二步，在Lenti-Cherry-FasL-PreS1 48-2A-Blast，Lenti-Cherry-FasL-PreS121-2A-Blast的基础上构建PT4-Cherry-FasL-PreS1 48-2A-Blast(简称PT4-48)，PT4-Cherry-FasL-PreS1 21-2A-Blast(简称PT4-21)。
以Lenti-Cherry-FasL-PreS1 48-2A-Blast为模板，用引物F ATGG Cherry-2+Rblast-2扩出片段17；以Lenti-Cherry-FasL-PreS1 21-2A-Blast为模板，用引物F ATGGCherry-2+R blast-2扩出片段18；以PT4/HB(商购)为模板，用引物F PT4 RIR-2+R CMVccat扩出片段19。片段17、19连接得到质粒PT4-48，片段18、19连接得到质粒PT4-21。
PCR反应体系和GoldenGate连接反应的体系同上。
至此，PT4-48及PT4-21构建完成，PT4-48用于后续NTCP-PreS1系统验证流式分选富集的可行性实验中比较PT4-21与PT4-48对于NTCP-GFP结合力的强弱，表明该系统理论上能够筛选出结合力更强的突变体。
三、构建PT4-21+7随机多肽库
之前的研究显示，N-肉豆蔻酰化修饰的preS1 aa2-21是preS1与其受体结合的高度保守区域。因此，我们在PreS1 aa2-21的基础上，向C端延伸7个随机氨基酸构建随机多肽库。
采用传统NNK法，构建21+7随机多肽库，即在PT4-Cherry-FasL-PreS1 21-2A-blast(PT4-21)的基础上构建了PT4-Cherry-FasL-PreS1 21+7随机多肽库(用PT4-21+7简写表示)，过程如下：
以PT4-21为模板，用引物F1-NNK7tcca’21+R1-PreS21tgga扩得一个大约5kb的片段，取100ng做GoldenGate单一片段自连。GoldenGate连接重复15管，共获取150μl的连接产物体系。转化后不涂板，直接将转化产物加入LB培养基中，37℃,220rpm摇1h以复苏，加入氨苄青霉素至100μg/ml,继续摇12h，提中抽，即得到质粒PT4-21+7随机多肽库。PCR反应体系同上。
Golden gate连接反应的反应体系为：BsmB Iv2酶0.75μl、Tango buffer 1μl、DTT1μl、T7 DNA ligase 0.25μl、ATP 1μl、自连片段100ng，ddH2O补齐至10μl。反应条件：42℃5min，16℃5min，循环30次后，60℃5min。Golden gate产物转化DH5α感受态细菌，涂板，克隆初筛，测序鉴定成功后提小抽，即可得到目标质粒，即为多肽库。多肽库构建完成后，用PT4/SB100X转座子系统转染HEK293细胞，转染步骤按试剂操作说明书进行。经Blasticidin筛选两周后，得到的稳定表达细胞系即为细胞表面展示多肽库。
图6是随机延伸多肽库的一代测序结果。
四、FRB-GFP的基础上构建质粒PreS1 48-GFP，PreS1 21-GFP，以及筛选得到的10个突变体217-1～10-GFP
以质粒FRB-GFP为模板，用引物R BsmBI vect+F GSGFP扩出片段20；以Cherry-FasL-PreS1 48为模板，用F CATG PreS1+RPreS 48扩出片段21。片段20、21连接得到质粒PreS1 48-GFP。
以PreS1 48-GFP为模板，用引物R PreS 20+Famp494 ggtt，F PreS 20+Ramp494aacc，分别扩出片段22、23，连接片段22、23得到质粒PreS1 21-GFP。
根据实施例2中筛选得到的10条候选序列(217-1——217-10)构建质粒突变体217-1～10-GFP用于后续实验：
以PreS1 21-GFP为模板，用引物RACGA217-1-GFP+Famp494 ggtt，RACGA217-2-GFP+Famp494 ggtt，RACGA217-3-GFP+Famp494 ggtt，RACGA217-4-GFP+Famp494 ggtt，RACGA217-5-GFP+Famp494 ggtt，RACGA217-6-GFP+Famp494 ggtt，RACGA217-7-GFP+Famp494 ggtt，RACGA217-8-GFP+Famp494 ggtt，RACGA217-9-GFP+Famp494 ggtt，RACGA217-10-GFP+Famp494 ggtt，FTCGT-GFP+Ramp494 aacc分别扩出1个片段，依次命名为片段24--34，其中，片段24-33分别与片段34连接可得到以下10个质粒突变体，依次为：1-KRRIDQY，2-YILMDIM，3-LWTSNKK，4-LRRVAEF，5-RNKDCHL，6-MGDVRSG，7-YVPLMKA，8-LYLPIQM，9-HRDLRAL，10-PTLCFPG。
PCR反应体系及GoldenGate连接反应同前面步骤一。
实施例2流式分选富集可行性验证
一、利用FKBP12-FRB系统验证流式分选富集的可行性
建立本发明技术方案中的筛选系统的关键之一，在于能够用流式细胞仪进行分选与富集，将那些能够结合NTCP的多肽展示细胞分离出来。为了验证这种流式分选方式的可行性，我们首先用雷帕霉素调控FKBP12-FRB相互作用系统来进行模拟测试。
将质粒GFP-FRB转染HEK293细胞，转染48小时后，用胰酶消化收集细胞并用PBS重悬，然后将细胞用液氮及37℃水浴反复冻融裂解细胞。离心去除裂解后的细胞碎片，获得含有融合蛋白GFP-FRB的上清备用。将质粒Cherry-FasL-FKBP转染HEK293细胞，转染48小时后，消化收集细胞，并用PBS重悬。取细胞悬液2份，分别与前述含有GFP-FRB的裂解液37℃孵育1小时。其中1份在孵育前加入雷帕霉素(Rapamycin)，另一份不做处理作为对照。随后，用流式细胞仪分析两份样品。分析结果如图2所示，在未加入雷帕霉素时，那些能表达Cherry的细胞呈现红色荧光(红色线条)，但所有细胞均不呈现明显的绿色荧光。加入雷帕霉素的样品中，可见部分表达Cherry的细胞同时也呈现明显较高水平的绿色荧光，表示这些细胞表面的FKBP在雷帕霉素辅助下，的确结合了GFP-FRB。由于这群细胞与未结合GFP-FRB的细胞有明显差异，因此可以由流式细胞分选出来。
二、利用NTCP-PreS1系统验证流式分选富集的可行性
我们进一步验证了本发明的细胞表面展示技术能否用于PreS1/NTCP相互作用检测。验证实验分为两个方面：
(1)验证表达于膜上的NTCP-Cherry蛋白能否与表达于胞浆的GFP-preS1蛋白(裂解细胞后)相互作用：采用反复冻融裂解高速离心取上清获得表达于胞浆的GFP-preS1蛋白。采用质粒NTCP-Cherry转染HEK293细胞，转染48小时后，消化收集细胞，并用PBS重悬。取细胞悬液与前述含有GFP-preS1的裂解液37℃孵育1小时。随后，用流式细胞仪分析样品。实验时同时采用NTCP、preS1进行缺失突变或点突变的融合蛋白质粒(前面构建的NTCP d157-165-cherry、NTCP 267S/F-Cherry)作为对照转染HEK293细胞获得缺失突变或点突变的NTCP-Cherry、GFP-preS1。
实验结果如图3所示，野生型NTCP-Cherry与野生型GFP-preS1之间可检测到明显的相互作用，而将NTCP或者preS1进行缺失突变或点突变时，这种相互作用消失，与预期的结果一致。图3中，NTCP 267S/F-Cherry是指NTCP第267位氨基酸点突变后与红色荧光蛋白的融合蛋白，NTCP d157-165-Cherry是指NTCP第157-165位氨基酸缺失突变后与红色荧光蛋白的融合蛋白，preS1-d11-15-GFP是指preS1的第11-15位氨基酸缺失突变后与绿色荧光蛋白的融合蛋白。
(2)参照(1)的方法，我们还验证了表达于膜上的Cherry-FasL-preS1蛋白能否与表达于膜上的NTCP-GFP蛋白(反复冻融裂解成细胞膜碎片)相互作用。实验结果如图4所示，流式分析可检测到野生型NTCP-GFP与Cherry-FasL-preS1之间的相互作用。当NTCP突变后(NTCP d157-165-GFP)，两分子间亲和力基本丧失。同时，preS1 48对NTCP-GFP的结合量明显高于preS1 21。这些结果均与预期一致。图4中，NTCP d157-165-GFP表示NTCP第157-165位氨基酸缺失突变后与绿色荧光蛋白的融合蛋白。
三、利用NTCP-PreS1系统进行浓度梯度结合试验
为了证明该系统能反映蛋白结合量的多寡，我们又进行了浓度梯度结合试验。如图5所示，随着NTCP-GFP量的增加，细胞表面会结合更多NTCP-GFP膜蛋白。在此基础上，用竞争抑制试验来测试这种结合是否具有特异性，即在NTCP-GFP与细胞表面展示了PreS1的细胞共孵育之前，用Myr21(即豆蔻酰化修饰的preS1 21)多肽预处理NTCP-GFP，以封闭一部分NTCP。与此同时，用一个无关多肽处理NTCP-GFP及一个不作任何处理的NTCP-GFP样本作为对照。结果表明，无关多肽处理和不作处理结果相当，而Myr21处理组的结合率下降。说明这种结合具有特异性，同时表明该系统可以分辨结合了不同量NTCP-GFP的情况，可以用于后续筛选。
四、多肽库的筛选与验证
将实施例1中得到的展示了随机多肽PT4-21+7的稳定表达细胞与NTCP-GFP膜蛋白(含有该融合蛋白的细胞膜碎片)以4:1的细胞数量比例共孵育2小时后，采用NTCP-PreS1系统，用流式细胞术分选出膜蛋白结合量最高5％的细胞，分选出来的细胞经过扩大培养以后，再次分选，如此反复分选富集7轮。对第5轮和第7轮富集扩增的细胞，提取基因组DNA，并用PCR扩增(扩增引物对为F-21/R-21)包含多肽序列的片段，PCR反应程序是：95℃预变性3min；98℃10s，55℃5s，72℃10s，28个循环。胶回收纯化片段后做二代测序，并将该测序结果与初始多肽库的二代测序结果进行比较。测序结果显示，初始多肽库的多样性大于30万种，而经过5轮和7轮富集后，多样性明显减少到7万种左右(图7)。我们选择同时满足以下两种条件的第7轮富集序列：(1)二代测序中序列占比位列前10；(2)与初始多肽库相比，富集倍数(某序列在富集库的占比/在初始库中的占比)位列前10。
依上述标准，总共得到10条候选序列，分别命名为217-1——217-10，如图8所示。这些序列的占比最高接近10％，富集倍数均大于1万倍。我们对这10条序列进行了进一步验证。验证方式与初筛方式有所不同，我们将NTCP-Cherry直接展示于细胞表面，而将融合了GFP的PreS1多肽从胞浆表达，因为这种方式更接近病毒感染时的状况。为确定此种方式的有效性，我们用融合蛋白GFP-FRB(阴性对照)及PreS1 21-GFP、PreS1 48-GFP进行验证，结果如图9所示，与阴性对照相比，流式分析显示PreS1 48和PreS1 21均与NTCP-Cherry存在明显结合，且PreS1 48的结合强于PreS1 21。这一结果表明，这种方式能很好地反映不同多肽与NTCP的亲和力差异。
217-1——217-10、PreS1 21、PreS1 48、的氨基酸序列分别如下：
PreS1 21(即多肽PreS1的第2-21位氨基酸)的氨基酸序列为(SEQ ID NO.53)：GTNLSVPNPLGFFPDHQLDP。
PreS1 48(即多肽PreS1的第2-48位氨基酸)的氨基酸序列为(SEQ ID NO.54)：GTNLSVPNPLGFFPDHQLDPAFRANTANPDWDFNPNKDTWPDANKVG。
217-1——217-10的氨基酸序列为在PreS2-21的基础上分别添加以下七个氨基酸：
1-KRRIDQY，2-YILMDIM，3-LWTSNKK，4-LRRVAEF，5-RNKDCHL，6-MGDVRSG，7-YVPLMKA，8-LYLPIQM、9-HRDLRAL，10-PTLCFPG。
217-1——217-10的氨基酸序列依次如序列表中SEQ ID NO.55、56、51、52、57～62所示。
我们将前述10条序列分别构建到PreS1 21-GFP质粒框架中(在preS1-21的C端分别加上这些多肽序列，即实施例1中构建得到的质粒突变体217-1～10-GFP)，然后将10种质粒分别转染HEK293细胞。48小时后收集细胞，反复冻融裂解后离心取上清。Western Blot检测显示，各上清样本中目标蛋白表达量相似(图9)。将这些上清分别与表达NTCP-Cherry的稳定细胞共孵育2小时，然后进行流式细胞仪检测分析。结果显示，发现序列217-3、217-4在原PreS1 21的基础上对NTCP膜蛋白的亲和力有显著提高，接近preS 148的结合水平(图9)。
实施例3、在HepG2-NTCP细胞模型中验证Myr-217-3的抗HBV感染作用
体外合成实施例2筛选出的多肽217-3(N端豆蔻酰化修饰)，以及作为对照的多肽Myr21。用不同浓度梯度的多肽预处理HepG2-NTCP 2小时，再感染乙肝病毒。每2天换液，到第七天时同时检测细胞培养上清中的HBeAg和HBsAg。结果显示(图10)，Myr-217-3(N端豆蔻酰化修饰的多肽217-3)抑制HBV感染的IC50较Myr-21改进了约8倍。
序列表
<110> 重庆医科大学
<120> 一种基于人源细胞的表面展示技术及靶向HBV受体的多肽及其应用
<160> 62
<210> 1
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> Fen-cmv
<400> 1
acgtctctca gtgacattga ttattgacta gttattaata g 41
<210> 2
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> REGFP
<400> 2
acgtctctat cccttgtaca gctcgtccat gccg 34
<210> 3
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> F lentiv2 P2A
<400> 3
acgtctctgg atccggcgca acaacttctc tc 32
<210> 4
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> R lenti preEF-1α
<400> 4
acgtctctac tgacgggcac cggagccaat tcccactcct 40
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> Famp494 ggtt
<400> 5
tcgtctcagg ttcccaacga tcaaggcgag 30
<210> 6
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> Ramp494 aacc
<400> 6
tcgtctcaaa ccggagctga atgaagcca 29
<210> 7
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> R de157-165
<400> 7
tcgtctctga acatagggca ccttgtcctt caggtc 36
<210> 8
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> F de157-165
<400> 8
tcgtctctgt tctcattcct tgcaccatag 30
<210> 9
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> F TTAC267
<400> 9
tcgtctcttt accatcctca atgtggcctt tcca 34
<210> 10
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> R GTAA267
<400> 10
tcgtctctgt aaaacagagt tggacatttt ggcatc 36
<210> 11
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> F d11-15
<400> 11
tcgtctctga ccaccagttg gatccag 27
<210> 12
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> R d11-15
<400> 12
tcgtctctag gattgctggt ggaaagat 28
<210> 13
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> F SV40 GG2
<400> 13
tcgtctctta actggccgcg actctagatc at 32
<210> 14
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> F AGCA Cherry
<400> 14
tcgtctctag caagggcgag gaggataaca tg 32
<210> 15
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> R GTTA Cherry
<400> 15
tcgtctctct tgtacagctc gtccat 26
<210> 16
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> R GSFasL
<400> 16
tcgtctctag atccacttcc tccagatcca 30
<210> 17
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> F PreS1
<400> 17
tcgtctctat ctgggcagaa tctttccacc 30
<210> 18
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> R GTTA PreS48
<400> 18
tcgtctctgt tatcctacct tgttggcgtc tg 32
<210> 19
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> R ATCC PreS48
<400> 19
tcgtctctat cctcctacct tgttggcgtc tg 32
<210> 20
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> R ATCC PreS21
<400> 20
tcgtctctat cctggatcca actggtggtc gg 32
<210> 21
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> R CMV ccat
<400> 21
acgtctctcc atggtggctg gatccgagct cg 32
<210> 22
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> F ATGG Cherry-2
<400> 22
acgtctctat ggtgagcaag ggcgaggagg ata 33
<210> 23
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> F PT4 RIR-2
<400> 23
tcgtctctca gcagctcgct gatcagcctc gactgtgc 38
<210> 24
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> R blast-2
<400> 24
tcgtctctgc tgttagccct cccacacata acc 33
<210> 25
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> F1-NNK7tcca’21
<400> 25
tcgtctcttc cannknnknn knnknnknnk nnktccggcg caacaaactt ctctctgctg 60
aaac 64
<210> 26
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> R1-PreS21tgga
<400> 26
tcgtctcttg gatccaactg gtggtcggga aagaa 35
<210> 27
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> FTCGT-GFP
<400> 27
acgtctcttc gtctggatca ggcggtggcg 30
<210> 28
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> RACGA217-1-GFP
<400> 28
acgtctctac gaatactgat caatccgacg ctttggatcc aactggtggt cggg 54
<210> 29
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> RACGA217-2-GFP
<400> 29
acgtctctac gacataatat ccatcaaaat atatggatcc aactggtggt cggg 54
<210> 30
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> RACGA217-3-GFP
<400> 30
acgtctctac gacttcttat tactcgtcca caatggatcc aactggtggt cggg 54
<210> 31
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> RACGA217-4-GFP
<400> 31
acgtctctac gaaaactccg ccacccgccg caatggatcc aactggtggt cggg 54
<210> 32
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> RACGA217-5-GFP
<400> 32
acgtctctac gacaaatgac aatccttatt acgtggatcc aactggtggt cggg 54
<210> 33
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> RACGA217-6-GFP
<400> 33
acgtctctac gacccagacc tcacatcacc cattggatcc aactggtggt cggg 54
<210> 34
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> RACGA217-7-GFP
<400> 34
acgtctctac gaagccttca tcagcggcac atatggatcc aactggtggt cggg 54
<210> 35
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> RACGA217-8-GFP
<400> 35
acgtctctac gacatctgaa tcggcagata caatggatcc aactggtggt cggg 54
<210> 36
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> RACGA217-9-GFP
<400> 36
acgtctctac gacagagccc taagatcacg atgtggatcc aactggtggt cggg 54
<210> 37
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> RACGA217-10-GFP
<400> 37
acgtctctac gacccaggaa aacacagcgt aggtggatcc aactggtggt cggg 54
<210> 38
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> R BsmBI vect
<400> 38
tcgtctctca tgccccaaag ccacccaa 28
<210> 39
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> F CATG PreS1
<400> 39
tcgtctctca tgatggggca gaatctttcc ac 32
<210> 40
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> R PreS 48
<400> 40
acgtctcttc ctaccttgtt ggcgtctg 28
<210> 41
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> F GSGFP
<400> 41
acgtctctag gatcgtctgg atcaggcggt g 31
<210> 42
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> R PreS 20
<400> 42
acgtctcttg gatccaactg gtggtcggga a 31
<210> 43
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> F PreS 20
<400> 43
acgtctcttc catcgtctgg atcaggc 27
<210> 44
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> R GSNTCP
<400> 44
tcgtctcttg ctcacagatc cacctcctcc a 31
<210> 45
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> F-21
<400> 45
tctggtggtg gaggctctgg 20
<210> 46
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> R-21
<400> 46
gttgctcttt caatgagggt 20
<210> 47
<211> 50
<212> PRT
<213> 人工序列
<223> 接头1
<400> 47
Trp Ser Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
1 5 10 15
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
20 25 30
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
35 40 45
Ser Val
50
<210> 48
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<223> 接头2
<400> 48
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 49
<211> 49
<212> PRT
<213> 人工序列
<223> 接头3
<400> 49
Ser Ser Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
1 5 10 15
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
20 25 30
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
35 40 45
Ser
<210> 50
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<223> FasL跨膜区
<400> 50
Lys Lys Arg Gly Asn His Ser Thr Gly Leu Cys Leu Leu Val Met Phe
1 5 10 15
Phe Met Val Leu Val Ala Leu Val Gly Leu Gly Leu Gly Met Phe Gln
20 25 30
Leu Phe His Leu Gln Lys Glu
35
<210> 51
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<223> 217-3
<400> 51
Gly Thr Asn Leu Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His
1 5 10 15
Gln Leu Asp Pro Leu Trp Thr Ser Asn Lys Lys
20 25
<210> 52
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<223> 217-4
<400> 52
Gly Thr Asn Leu Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His
1 5 10 15
Gln Leu Asp Pro Leu Arg Arg Val Ala Glu Phe
20 25
<210> 53
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<223> PreS1 21
<400> 53
Gly Thr Asn Leu Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His
1 5 10 15
Gln Leu Asp Pro
20
<210> 54
<211> 47
<212> PRT
<213> 人工序列
<223> PreS1 48
<400> 54
Gly Thr Asn Leu Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His
1 5 10 15
Gln Leu Asp Pro Ala Phe Arg Ala Asn Thr Ala Asn Pro Asp Trp Asp
20 25 30
Phe Asn Pro Asn Lys Asp Thr Trp Pro Asp Ala Asn Lys Val Gly
35 40 45
<210> 55
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<223> 217-1
<400> 55
Gly Thr Asn Leu Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His
1 5 10 15
Gln Leu Asp Pro Lys Arg Arg Ile Asp Gln Tyr
20 25
<210> 56
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<223> 217-2
<400> 56
Gly Thr Asn Leu Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His
1 5 10 15
Gln Leu Asp Pro Tyr Ile Leu Met Asp Ile Met
20 25
<210> 57
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<223> 217-5
<400> 57
Gly Thr Asn Leu Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His
1 5 10 15
Gln Leu Asp Pro Arg Asn Lys Asp Cys His Leu
20 25
<210> 58
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<223> 217-6
<400> 58
Gly Thr Asn Leu Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His
1 5 10 15
Gln Leu Asp Pro Met Gly Asp Val Arg Ser Gly
20 25
<210> 59
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<223> 217-7
<400> 59
Gly Thr Asn Leu Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His
1 5 10 15
Gln Leu Asp Pro Tyr Val Pro Leu Met Lys Ala
20 25
<210> 60
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<223> 217-8
<400> 60
Gly Thr Asn Leu Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His
1 5 10 15
Gln Leu Asp Pro Leu Tyr Leu Pro Ile Gln Met
20 25
<210> 61
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<223> 217-9
<400> 61
Gly Thr Asn Leu Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His
1 5 10 15
Gln Leu Asp Pro His Arg Asp Leu Arg Ala Leu
20 25
<210> 62
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<223> 217-10
<400> 62
Gly Thr Asn Leu Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His
1 5 10 15
Gln Leu Asp Pro Pro Thr Leu Cys Phe Pro Gly
20 25
Claims (9)
1.一种基于人源细胞的表面展示技术，其特征在于，包括如下步骤：
S1、将受体蛋白与荧光蛋白融合，利用sleepingbeauty转座子转染HEK293细胞使其稳定表达于人源细胞膜，筛选后得到该受体蛋白融合荧光蛋白的稳定表达细胞系，然后裂解细胞膜，获得含有受体-荧光蛋白融合蛋白的膜碎片备用；
S2、将待筛选的多肽与FasL的跨膜序列以及荧光蛋白融合，构建荧光蛋白-FasL跨膜区-多肽融合蛋白质粒，然后利用sleepingbeauty转座子转染HEK293细胞，经筛选后，得到的稳定表达细胞系即为细胞表面展示多肽库；
S3、将步骤S1得到的受体-荧光蛋白融合蛋白膜碎片与步骤S2得到的稳定表达细胞系混合孵育，然后用流式细胞仪分选与受体亲和力高的展示细胞，经过进一步的筛选富集得到与受体具有高亲和力的目标多肽；
所述荧光蛋白为绿色荧光蛋白或者红色荧光蛋白，且受体蛋白和多肽分别融合的是不同的荧光蛋白。
2.如权利要求1所述的表面展示技术，其特征在于：所述表面展示技术用于筛选与HBV受体NTCP结合的多肽；
步骤S1中，所述受体蛋白为NTCP，所述荧光蛋白为绿色荧光蛋白；所述裂解细胞采用的方法是反复冻融裂解破碎细胞膜；所述NTCP与绿色荧光蛋白由接头1连接，所述接头1的氨基酸序列为：WSGSGGGGSG GGGSGGGGSG GGGSGGGGSG GGGSGGGGSG GGGSGGGGSV；
步骤S2中，所述荧光蛋白为红色荧光蛋白，红色荧光蛋白Cherry与FasL跨膜区之间由柔性接头2连接，所述柔性接头2的氨基酸序列为GGGGS；FasL跨膜区与多肽之间由柔性接头3连接，所述柔性接头3的氨基酸序列为SSGSGGGGSG GGGSGGGGSG GGGSGGGGSG GGGSGGGGSGGGGSGGGGS；FasL跨膜区的氨基酸序列是KKRGNHSTGL CLLVMFFMVL VALVGLGLGM FQLFHLQKE。
3.如权利要求2所述的表面展示技术，其特征在于：所述待筛选的多肽为将preS1 aa2-21的C端延伸7个随机氨基酸得到的随机多肽库。
4.一种靶向HBV受体的多肽，其特征在于：所述多肽为217-3或217-4，217-3的氨基酸序列为：GTNLSVPNPLGFFPDHQLDPLWTSNKK，217-4的氨基酸序列为：
GTNLSVPNPLGFFPDHQLDPLRRVAEF。
5.如权利要求4所述的多肽，其特征在于：所述多肽的N端有豆蔻酰化修饰。
6.权利要求4或5所述的多肽在制备治疗乙型肝炎病毒的药物中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于：所述多肽与HBV受体NTCP结合。
8.一种用于治疗乙型肝炎病毒的药物，其特征在于：所述药物包含权利要求4或5所述的多肽。
9.如权利要求8所述的药物，其特征在于：所述药物还包含药学上可接受的载体和赋形剂，药物剂型为片剂、胶囊剂、颗粒剂、混悬剂、丸剂中的任意一种。
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