CN112940081B

CN112940081B - 可特异性结合新型冠状病毒核衣壳蛋白的多肽分子及制备方法

Info

Publication number: CN112940081B
Application number: CN202110390701.0A
Authority: CN
Inventors: 万蒙; 何庆华
Original assignee: Jiangxi Lecheng Biological Medical Co ltd
Current assignee: Jiangxi Lecheng Biological Medical Co ltd
Priority date: 2021-04-12
Filing date: 2021-04-12
Publication date: 2022-10-18
Anticipated expiration: 2041-04-12
Also published as: CN112940081A

Abstract

本发明提供了一种可特异性结合新型冠状病毒(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2,SARS‑CoV‑2)核衣壳蛋白(Nucleocapsid protein,N蛋白)的多肽分子及制备方法，涉及生物技术领域，该多肽分子的氨基酸序列为MQPMNALGGGAY。本发明采用优化的液相亲和淘选方式，快速淘选获得可特异性结合新型冠状病毒核衣壳蛋白的多肽分子，所述的多肽分子与具传统的抗体相比，具有优良的特异性，更好的酸碱耐受及热稳定性，该多肽分子的获得无需免疫过程、制备简单、成本低、周期短，该多肽分子既可通过生物培养的方式大量扩增，也可以通过化学合成或者基因工程的方法进行大量制备，为新型冠状病毒核衣壳蛋白特异性识别元件的制备提供了新的路径，具有较好的应用价值。

Description

可特异性结合新型冠状病毒核衣壳蛋白的多肽分子及制备方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及可特异性结合新型冠状病毒(SevereAcute Respiratory Syndrome Coronavirus 2,SARS-CoV-2)核衣壳蛋白(Nucleocapsidprotein,N蛋白)的多肽分子及制备方法。

背景技术

现有研究已证实，新型冠状病毒肺炎(Coronavirus disease 2019,COVID-19)是由新型冠状病毒(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2,SARS-CoV-2)所导致。研究表明，新型冠状病毒为正链单链RNA病毒，基因组长约30Kb，两端为非编码区，中间为非结构蛋白编码区和结构蛋白编码区。非结构蛋白编码区主要包括开放读码框ORF1a和ORF1b基因，编码16个非结构蛋白。结构蛋白编码区主要编码刺突蛋白、包膜蛋白、膜蛋白和核衣壳蛋白。核衣壳蛋白(Nucleocapsid protein,N蛋白)序列保守程度高，在病毒复制过程中发挥重要作用。N蛋白与病毒RNA结合形成复合体，随后在膜蛋白和包膜蛋白的共同作用下，包裹后进入病毒衣壳中。N蛋白是SARS-CoV-2含量最丰富的蛋白，能刺激机体产生高亲和力的抗体。N蛋白可作为检测抗原，用于COVID-19患者的血清抗体检测。同理，检测SARS-CoV-2病毒裂解后释放出的N蛋白，也可作为判断SARS-CoV-2病毒是否存在的一个依据。

现有技术未发现有关于可特异性结合新型冠状病毒(Severe Acute RespiratorySyndrome Coronavirus 2,SARS-CoV-2)核衣壳蛋白(Nucleocapsid protein,N蛋白)的多肽分子的报导。

发明内容

本发明以新型冠状病毒核衣壳蛋白为靶分子，将靶分子结合到酶标板载体上，投入噬菌体随机展示十二肽库，通过优化的亲和淘选条件，获得了一种可特异性结合新型冠状病毒核衣壳蛋白的多肽分子，其氨基酸序列为：M-Q-P-M-N-A-L-G-G-G-A-Y。

上述多肽分子结构中，大写英文字母分别代表已知天然L-型氨基酸残基或其D-型异构体的一种，即M代表甲硫氨酸(蛋氨酸)残基，Q代表谷氨酰胺残基，P代表脯氨酸残基，N代表天冬酰胺残基，A代表丙氨酸残基，L代表亮氨酸残基，G代表甘氨酸残基，Y代表酪氨酸残基。

本发明还涉及编码上述多肽分子氨基酸序列(MQPMNALGGGAY)的核苷酸，其序列为:ATG CAG CCT ATG AAT GCT TTG GGT GGT GGT GCT TAT。

本发明提及多肽分子可通过噬菌体扩增、化学合成或基因工程重组表达的方式进行大量制备。噬菌体扩增是指将展示有多肽分子的噬菌体，通过生物扩增的方式，大量繁殖生产展示有多肽分子的噬菌体粒子。化学合成是指依据公布的多肽氨基酸序列，通过化学合成多肽的方式进行多肽合成。基因工程重组表达的方式是指将编码多肽分子的基因，通过克隆至表达载体，以多肽-融合蛋白的形式进行多肽分子的大量制备。

本发明的有益效果是：本发明所提及的多肽分子可替代传统的新型冠状病毒核衣壳蛋白抗体分子，该多肽分子具有特异性强、结构稳定性好、耐酸碱、耐高温，制备简单、快速等特点。

此外，本发明通过噬菌体展示多肽库技术，采用亲和淘选的方式，从噬菌体展示多肽库中快速筛选到能与新型冠状病毒核衣壳蛋白特异性结合的多肽分子，其可作为核衣壳蛋白的多克隆抗体、单克隆抗体等传统抗体的替代物。该方法避免了制备传统单克隆抗体所需要的动物免疫、细胞融合、单克隆筛选等流程，具有无需免疫过程、筛选方便、周期短、制备成本低等特点。

附图说明

图1为ELISA鉴定多肽分子与SARS-CoV-2核衣壳蛋白的结合特性图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的若干实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容更加透彻全面。

实施例1与新型冠状病毒核衣壳蛋白特异性结合多肽分子的亲和淘选及其鉴定

1)亲和淘选与SARS-Cov-2核衣壳蛋白特异性结合多肽分子的具体方法为：取0.1mg SARS-Cov-2核衣壳蛋白(氨基酸序列见genebank：MN908947.3)，包被于酶标板孔(150μL/孔)，4℃孵育12小时。取出酶标板，用PBST(10mM PBS pH 7.4包含0.5％Tween-20(v/v))洗涤10次后，加入350μl封闭液(5％明胶溶液)37℃孵育2小时，用PBST洗涤10次后加入100μl噬菌体肽库(噬菌体展示随机十二肽库，购自NEB公司，用PBS 10倍稀释噬菌体原液，约2.0×10¹¹pfu)，37℃振荡反应60min。

2)用PBST洗涤15次，去除未结合的噬菌体，随后加入洗脱液(Gly-HCL，pH2.2)100μL，16-22℃下轻摇震荡10min以洗脱与核衣壳蛋白结合的噬菌体。吸出洗脱液，加入15μL、1MTris-HCl(pH 9.1)中和缓冲液。取10μl中和液进行噬菌体滴度测定，其余的用于感染20mL生长至对数前期的E.coli ER2738菌株进行扩增。第二天用PEG/NaCl沉淀纯化噬菌体，并测定扩增后噬菌体的滴度。然后依次进行第2轮和第3轮淘选，淘选步骤与第一轮大体相同，每次加入的噬菌体量均为2×10¹¹pfu，不同之处在于：第2、3轮筛选的噬菌体展示多肽与包被了SARS-Cov-2核衣壳蛋白的板条孵育时间分别为60min、30min；SARS-Cov-2核衣壳蛋白的包被浓度分别为50、25μg，竞争洗脱液的洗脱时间分别为5min、3min。

3)阳性噬菌体克隆的鉴定：从第3轮淘选后测定噬菌体滴度的平板中随机挑取100个噬菌体斑，进行噬菌体的扩增，采用酶联免疫吸附检测方法进行阳性噬菌体克隆的鉴定，具体方法为：首先，用10mM PBS(pH 7.4)稀释新型冠状病毒核衣壳蛋白，1μg/mL包被96孔酶标板，4℃孵育过夜。第二天用PBST(10mM PBS,0.05％Tween-20(v/v))洗涤3次后，用含有3％脱脂奶粉的PBS进行封闭，37℃孵育1小时；投入100μl噬菌体斑扩增液(1.0×10¹²pfu)，以原始噬菌体肽库作为阴性对照，37℃孵育1小时；加入1：5000倍稀释的HRP标记抗M13噬菌体二抗100μl，37℃孵育1小时；加入100μl TMB底物液，避光显色5min，酶标仪读取450nm处的吸收值。选取OD₄₅₀大于阴性对照2倍的噬菌体克隆为阳性克隆。

4)特异性结合SARS-CoV-2核衣壳蛋白多肽分子的鉴定：采用ELISA的方法进行多肽分子与SARS-Cov-2核衣壳蛋白结合能力及特异性的鉴定，具体方法为：用10mM PBS(pH7.4)分别包被SARS-Cov-2核衣壳蛋白、SARS核衣壳蛋白(氨基酸序列见genebank：AY274119.3)(100μL/孔，1μg/ml)、健康人血清(100μL/孔)、牛血清白蛋白(100μL/孔，1μg/ml)、COVID-19阳性咽拭子灭活病毒裂解液(100μL/孔)于酶标板，4℃孵育过夜；第二天用PBST(10mM PBS,0.05％Tween-20(v/v))洗涤3次后，用含有3％脱脂奶粉的PBS进行封闭，37℃孵育1小时；投入100μl经ELISA鉴定为阳性的噬菌体克隆(1.0×10¹¹pfu)，37℃孵育1小时；加入1：5000稀释HRP标记的抗M13噬菌体二抗100μl，37℃孵育1小时；加入100μl TMB底物液，避光显色5min，读取OD₄₅₀。实验结果显示：加入阳性克隆噬菌体后，包被有SARS-Cov-2核衣壳蛋白、SARS核衣壳蛋白、健康人血清、牛血清白蛋白、COVID-19阳性咽拭子灭活病毒裂解液的酶标板孔OD₄₅₀数值分别为1.8、0.35、0.05、0.02、1.06，表明获得的多肽分子与SARS-Cov-2核衣壳蛋白具有良好的结合特性(图1)。

实施例2多肽分子编码基因的测序及其氨基酸序列的确定

将经ELISA鉴定展示有特异性结合新型冠状病毒核衣壳蛋白多肽分子的噬菌体进行扩增，提取噬菌体的DNA测序模板。简要过程如下：进行噬菌体扩增，在第一步离心后，将800μl含噬菌体上清转入一新离心管。加入200μl PEG/NaCl沉淀噬菌体。离心后将沉淀重悬于100μl碘化物缓冲液(10mM Tris-HCl(pH 8.0),1mM EDTA,4M NaI)，加入250μl无水乙醇沉淀DNA，离心后再用70％乙醇洗涤沉淀(DNA测序模板)。沉淀最终重悬于20μl灭菌水，取2μl进行琼脂糖凝胶电泳分析；取5μL噬菌体模板进行DNA测序，其-96gIII测序引物为：5’-^HOCCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3’。依据DNA测序结果及密码子表可获得多肽分子的氨基酸序列：M-Q-P-M-N-A-L-G-G-G-A-Y。

实施例3与新型冠状病毒核衣壳蛋白特异性结合多肽分子的的大量制备

1)以噬菌体扩增的方式

将与新型冠状病毒核衣壳蛋白特异性结合的噬菌体加入至20ml接种有大肠杆菌ER 2738的培养物中，37度220rpm振荡培养4.5h。将培养物转入另一离心管中，4℃10000rpm离心10min，将上清的上部80％转入一新鲜管中，加入1/6体积的PEG/NaCl，4℃下静置120min。4℃10000rpm离心PEG/NaCL静置溶液15min。弃上清，短暂离心后吸去残留上清液。加入1mL TBS进行重悬，即为噬菌体扩增液。

2)以多肽-融合蛋白的方式进行制备

A.PCR扩增多肽分子的外源编码基因

PCR反应体系：(50μL)

10×PCR Buffer5μL

dNTP Mixture(each for 2.5mM)4μL

M13KE insert extension primer(10mM)1μL

-96gIII sequencing primer(10mM)1μL

噬菌体DNA模板1μL

Pyrobest DNA Polymerase 0.5μL

灭菌ddH₂O37.5μL

PCR反应条件：

采用PCR产物回收试剂盒纯化PCR产物，微量核酸定量仪定量。

B.外源编码基因及表达载体的双酶切

分别采用ACC65I和Eag I酶对外源编码基因和表达载体(pMAl-pIII,NEB公司，可表达MBP融合蛋白)进行双酶切。

C.酶切后产物的连接及转化

将质粒pMal-PIII和目的片段以1∶15(摩尔比)混匀，于20℃水浴连接12h,取15μL连接产物加至100μL感受态细胞DH5α中，充分混匀。冰浴35min后，42℃水浴热激60s，立即冰浴3min后补加800μL LB液体培养液，37℃，200rpm培养1h，8000rpm离心5min，吸去上清留取约300μL，涂布于LB-A固体(Amp)培养基中，37℃过夜培养，得到亚克隆阳性克隆。

D.克隆转化

将上述步骤得到的亚克隆用质粒试剂盒提取目的质粒，取10μL至100μL感受态细胞TB1中，充分混匀。冰浴20min后，45℃水浴热激60s，立即冰浴5min后补加800μL LB液体培养液，37℃，200rpm培养45min，7000rpm离心6min，吸去上清留取约300μL，涂布于LB-A固体(Amp)培养基中，37℃过夜培养，得到阳性克隆。

E.多肽-MBP融合蛋白的表达

将上述获得的阳性克隆子，从平板上挑一单菌落接种于5mL LB-A，0.5％蔗糖中，37℃，220r/min，振荡培养过夜，将过夜培养物按1％接种量(v/v)接种于50mL的LB-A，0.2％蔗糖培养基中，分别接种3瓶，37℃，220r/min振荡培养，当培养物细菌浓度OD600达到0.6时，向三瓶培养物中加入IPTG至终浓度为0.3mmol/L，120r/min振荡培养，将诱导物(IPEG溶液)于4℃，5000g，离心15min收集菌体沉淀，弃上清。重悬细胞于400mL 30mM Tris-HCl，25％蔗糖，pH 8.0(80mL/g细胞湿重)，加入EDTA至1mM，室温下震荡5-10min，8000g，4℃离心15min，弃上清，沉淀重悬于400ml预冷的5mM MgSO₄，冰上震荡15min，8000g，4℃，离心20min，保留上清，向上清液中加入8mL 1M Tris-HCl,pH 7.4，获得多肽-MBP融合蛋白。

实施例4与新型冠状病毒核衣壳蛋白特异性结合多肽分子的免疫学检测稳定性实验

1)耐酸碱性实验

将可与新型冠状病毒核衣壳蛋白特异性结合的多肽分子、鼠抗新型冠状病毒核衣壳蛋白单克隆抗体分别用pH＝4.0，5.0，6.0，7.4，8.0的缓冲液稀释成工作液，分别进行ELISA测定，具体方法为：用10mM PBS(pH 7.4)稀释的核衣壳蛋白(1μg/ml)，包被酶标板，4℃孵育过夜。第二天用PBST(10mM PBS,0.05％Tween-20(v/v))洗涤3次后，用含有3％脱脂奶粉的PBS进行封闭，37℃孵育1小时后，用PBST洗板6次待用。取出处理好的板条，每孔分别投入100μl多肽分子/鼠抗核衣壳蛋白单克隆抗体，37℃孵育20min。加入1:5000稀释HRP标记的抗M13噬菌体二抗/HRP标记的羊抗鼠IgG二抗，37℃孵育1小时。然后用TMB底物显色，读取OD₄₅₀。

实验结果显示：在pH＝4.0，5.0，6.0，7.4，8.0时，对应的多肽分子、单克隆抗体分子的OD₄₅₀分别为1.75、1.82、1.77、1.83、1.80以及0.8、1.0、1.2、1.9、1.8，表明多肽分子与传统的单克隆抗体分子相比，具有更好的酸碱耐性。

2)高温耐受性实验

将可与新型冠状病毒核衣壳蛋白特异性结合的多肽分子、鼠抗新型冠状病毒核衣壳蛋白单克隆抗体分别置于温度为37℃，45℃，50℃，60℃，70℃的水浴中孵育30min，取出后分别进行ELISA实验，具体方法为：用10mM PBS(pH 7.4)稀释的核衣壳蛋白(1μg/ml)，包被酶标板，4℃孵育过夜。第二天用PBST(10mM PBS,0.05％Tween-20(v/v))洗涤3次后，用含有3％脱脂奶粉的PBS进行封闭，37℃孵育1小时后，用PBST洗板6次待用。取出处理好的板条，每孔分别投入100μl多肽分子/鼠抗核衣壳蛋白单克隆抗体，37℃孵育20min。加入1:5000稀释HRP标记的抗M13噬菌体二抗/HRP标记的羊抗鼠IgG二抗，37℃孵育1小时。然后用TMB底物显色，读取OD₄₅₀。以37℃时的OD值为100％，计算不同温度下OD₄₅₀值的稳定度％。

实验结果显示:以多肽分子作为识别元件的ELISA，在温度为37℃，45℃，50℃，60℃，70℃时，其稳定度分别为100％，95％，86％，82％，74％；以单克隆抗体作为识别元件的ELISA，在温度为37℃，45℃，50℃，60℃，70℃时，其温度度分别为100％，75％，43％，32％,12％，表明相比于传统的单克隆抗体，抗体替代物的多肽分子具有更好的高温耐受性。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江西乐成生物医疗有限公司

<120> 可特异性结合新型冠状病毒（SARS-Cov-2）核衣壳蛋白的多肽分子

<130> 1

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Gln Pro Met Asn Ala Leu Gly Gly Gly Ala Tyr

1 5 9

Claims

1.一种可特异性结合新型冠状病毒核衣壳蛋白的多肽分子，其特征在于，该多肽分子的氨基酸序列为:M-Q-P-M-N-A-L-G-G-G-A-Y。

2.编码权利要求1所述的氨基酸序列的核苷酸。

3.如权利要求2所述的核苷酸的序列对应为:

ATG CAG CCT ATG AAT GCT TTG GGT GGT GGT GCT TAT。

4.权利要求1所述的可特异性结合新型冠状病毒核衣壳蛋白的多肽分子的制备方法，其特征在于，通过噬菌体扩增、化学合成或基因工程重组表达的方式进行大量制备；所述噬菌体扩增是指将展示多肽分子的噬菌体，通过生物扩增的方式，大量繁殖生产展示有可特异性结合新型冠状病毒核衣壳蛋白的多肽分子的噬菌体粒子；所述化学合成指依据多肽分子的氨基酸序列，通过化学合成多肽的方式进行多肽合成；所述基因工程重组表达的方式是指将编码多肽分子的基因，通过克隆至表达载体，以多肽-融合蛋白的形式进行大量制备。