CN111499739B

CN111499739B - 一种抗体及其制备方法和应用

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Publication number: CN111499739B
Application number: CN201910091153.4A
Authority: CN
Inventors: 李尹雄; 王宁; 庄苑琦; 袁方
Original assignee: Guangzhou Institute of Biomedicine and Health of CAS
Current assignee: Guangzhou Institute of Biomedicine and Health of CAS
Priority date: 2019-01-30
Filing date: 2019-01-30
Publication date: 2022-03-25
Anticipated expiration: 2039-01-30
Also published as: CN111499739A

Abstract

本发明提供了一种抗体及其制备方法和应用，所述方法使用AFB1‑BSA作为淘选抗原包被免疫管，利用噬菌体展示技术，从用AFB1‑HEL作为免疫原免疫七鳃鳗所构建的抗体文库中淘选出高亲和力的噬菌体，得到两株抗AFB1的七鳃鳗来源的新型抗体分子，为AFB1的检测与研究提供了坚实的基础，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。

Description

一种抗体及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，涉及一种抗体及其制备方法和应用。

背景技术

黄曲霉毒素(Aflatoxins，AFT)是主要由真菌黄曲霉或寄生曲霉产生的一组强毒性的次生代谢产物，广泛存在于花生、玉米及其它常见农作物和饲料中。在霉菌毒素中，黄曲霉毒素B1(AFB1)是已知致癌毒性最强，与人的肝癌等多种癌症有密切关系。AFB1的毒性为氰化钾的10倍，砒霜的68倍，能引起人急性中毒死亡。1993年，AFB1被国际癌症研究机构划定为Ⅰ类致癌物。

黄曲霉毒素的检测方法很多，由最初的薄层层析法(TLC)，到高效液相色谱法(HPLC)、液质联用法(LC-MS)、酶联免疫吸附法(ELISA)和胶体金免疫层析法(GICA)。由于ELISA具有操作简单、特异性强、分析时间短、对待测样品的需求量少、可以进行定性和定量测定的特点，所以ELISA已经成为食品和饲料中最常用的AFT检测方法。我国现行的食品中AFB1的测定国家标准之一就是用ELISA方法进行检测的，其检出限是0.01μg/kg。ELISA检测方法的关键在于获得高特异性的抗体分子。由于AFB1是小分子化合物，制备传统抗体IgG时，其免疫原性弱，不易产生高效价高亲和力抗体。因此制备针对AFB1的高特异性、强稳定性的抗体是检测AFB1的关键。

可变淋巴细胞受体(VLR)是2004年Pancer等人在《Nature》首次报道在无颌类脊椎动物(七鳃鳗和盲鳗)中发现一类新型“抗体”分子——可变淋巴细胞受体(VariableLymphocyte Receptor，VLR)。无颌类脊椎动物可通过多聚亮氨酸富集序列(LRR)识别各种抗原性物质，实现适应性免疫反应。VLR分为膜型和分泌型，分泌型VLR由4-5个二聚体通过二硫键连接形成，其在电子显微镜下形态学与高等哺乳动物的IgM具有相似性。与免疫球蛋白相比，VLR的优势主要表现在：VLR对特异性抗原的亲和力比IgG高1000倍，显现出更高的灵敏性及亲和力；在56℃放置36小时、4℃放置12个月或室温放置一个月仍保持较高活性；VLR与抗原结合后，只有在强碱条件下(PH>11)才能被洗脱；VLR由结构单一的单体组成，有利于人们对VLR抗原结合位点进行改构；七鳃鳗与其他哺乳动物的亲缘关系较远，所以VLR能够克服哺乳动物因免疫耐受而不能产生抗体的限制，从而识别更广泛的抗原表位。

因此，研发一种可变淋巴细胞受体文库并筛选制备抗AFB1的抗体，为AFB1的检测与研究提供了坚实的基础。

发明内容

针对现有技术的不足及实际的需求，本发明提供一种抗体及其制备方法和应用，所述方法使用AFB1-BSA作为淘选抗原包被免疫管，利用噬菌体展示技术，从用AFB1-HEL作为免疫原免疫七鳃鳗所构建的抗体文库中淘选出高亲和力的噬菌体，得到抗AFB1的七鳃鳗来源的新型抗体分子，为AFB1的检测与研究提供了坚实的基础。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种抗体，所述抗体包括C9抗体和/或E1抗体，其中，所述C9抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述E1抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

C9抗体的氨基酸序列为SEQ ID NO.1：

MGWIKWIATLVAFGALVQSAVACPAQCSCSGTDIQCDRRSLTSVPAGIPTSTRELYLHSNQITKLEPGVFDHLVNLQWLVLHTNQLKSIPRGAFDNLKSLTHIYLYNNPWDCACSDILYLKNWIVQHASIVNPAGYGGVDNVKCSGTNTPVRAVTEASTSPSKCPGYVATTTTPTTTTPEIIPETTTLPVITTQKPRSLMNFNCSSIQERKNDGGDCGKPACTTLLNCANFLSCLCSTCALCKKRHHHHHH.

E1抗体的氨基酸序列为SEQ ID NO.2：

MGWIKWIATLVAFGALVQSAVACPAQCSCSGTTVNCGGKSLASVPAGIPSTTRELYLHSNQITKLEPGVFDSLTQLTHLDLGGNQLKALAEGMFDRLGNLQSLGLHVNQLKSIPRGAFDNLKSLTHIWLFNNPWDCACSDILYLSRWISQHPGVVRRGESGYAVDPDHARCSGTNTPVRAVTEASTSPSKCPGYVATTTTPTTTTPEIIPETTTLPVITTQKPRSLMNFNCSSIQERKNDGGDCGKPACTTLLNCANFLSCLCSTCALCKKRHHHHHH.

优选地，所述C9抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

优选地，所述E1抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

C9抗体的核苷酸序列为SEQ ID NO.3:

ATGGGTTGGATCAAGTGGATCGCCACGCTGGTCGCCTTTGGCGCCCTGGTGCAAAGTGCAGTAGCATGTCCCGCGCAGTGTTCGTGCTCAGGGACAGATATTCAATGTGACAGGAGAAGCCTCACATCTGTGCCTGCGGGAATCCCCACTTCAACGCGAGAGCTGTATTTGCATAGCAATCAGATCACGAAGCTCGAGCCCGGGGTGTTTGACCACCTGGTGAATCTGCAATGGTTGGTTTTGCACACCAACCAGCTGAAGAGCATTCCCAGGGGCGCCTTTGACAACCTCAAGAGCCTCACTCACATCTATCTGTACAACAACCCCTGGGACTGCGCCTGTTCAGACATCCTTTATCTGAAGAACTGGATTGTGCAGCACGCAAGCATCGTGAATCCAGCGGGCTATGGGGGAGTTGATAACGTGAAGTGCTCTGGTACCAATACCCCCGTCCGTGCAGTCACCGAGGCCAGCACTAGCCCCTCAAAATGCCCAGGCTACGTTGCTACGACCACGACGCCGACGACGACCACGCCCGAAATCATCCCCGAGACCACAACCTTGCCCGTGATCACAACCCAGAAACCCAGGTCTCTGATGAATTTCAACTGCAGCTCAATTCAGGAGAGGAAGAACGACGGCGGCGACTGCGGAAAGCCCGCCTGCACAACTCTCCTGAATTGCGCCAACTTCCTCAGCTGCCTCTGTTCGACCTGCGCCCTCTGCAAGAAACGTCACCACCACCACCACCACTGA.

E1抗体的核苷酸序列为SEQ ID NO.4:

ATGGGTTGGATCAAGTGGATCGCCACGCTGGTCGCCTTTGGCGCCCTGGTGCAAAGTGCAGTAGCATGTCCCGCGCAGTGTTCGTGCTCGGGGACAACTGTGAACTGTGGAGGGAAAAGCCTCGCGTCTGTGCCTGCGGGAATCCCCAGCACCACGCGAGAGCTGTATTTGCATAGCAATCAGATCACGAAGCTCGAGCCCGGGGTGTTTGACAGTCTGACCCAACTGACTCATCTGGATCTTGGTGGCAACCAACTGAAGGCCCTTGCCGAGGGAATGTTTGACCGACTGGGGAATCTGCAGTCGTTGGGTCTGCACGTCAACCAGCTGAAGAGCATTCCCAGGGGCGCCTTCGACAACCTCAAGAGCCTCACTCATATCTGGTTGTTCAACAACCCCTGGGACTGTGCCTGCTCAGACATCCTGTATCTCAGCCGCTGGATCTCTCAGCACCCAGGAGTCGTGAGGAGGGGTGAATCAGGCTACGCTGTGGACCCTGACCATGCGCGCTGCTCTGGTACCAATACCCCCGTCCGTGCAGTCACCGAGGCCAGCACTAGCCCCTCAAAATGCCCAGGCTACGTTGCTACGACCACGACGCCGACGACGACCACGCCCGAAATCATCCCCGAGACCACAACCTTGCCCGTGATCACAACCCAGAAACCCAGGTCTCTGATGAATTTCAACTGCAGCTCAATTCAGGAGAGGAAGAACGACGGCGGCGACTGCGGAAAGCCCGCCTGCACAACTCTCCTGAATTGCGCCAACTTCCTCAGCTGCCTCTGTTCGACCTGCGCCCTCTGCAAGAAACGTCACCACCACCACCACCACTGA.

发明人在长期科研实践中，通过复杂实验筛选验证了所述方法的可行性和稳定性，用AFB1-BSA作为淘选抗原包被免疫管，利用噬菌体展示技术，从用AFB1-HEL作为免疫原免疫七鳃鳗所构建的抗体文库中淘选出高亲和力的噬菌体，免疫和淘选过程中采用一对全抗原淘选，得到抗AFB1的七鳃鳗来源的新型抗体分子，本发明经过五轮噬菌体展示技术的淘选，以AFB1-BSA为筛选抗原获得两个新型的能够特异性识别AFB1的可变淋巴细胞受体序列，并构建了pCDNA-3.1-VLR重组蛋白进行真核表达，得到的抗体具有亲和活性，为AFB1的检测与研究提供了坚实的基础。

第二方面，本发明提供一种制备如第一方面所述抗体的方法，包括如下步骤：

a)构建抗AFB1七鳃鳗噬菌体展示初级抗体文库；

b)对步骤a)的初级抗体文库进行筛选和鉴定。

优选地，步骤a)所述文库的构建方法包括如下步骤：

(1)将抗原免疫无颌类脊椎动物，分离淋巴细胞，提取总RNA并合成cDNA；

(2)将步骤(1)合成的cDNA扩增VLR基因重组至噬菌体展示载体上，得到重组质粒；

(3)将步骤(2)得到的重组质粒转化至感受态细胞中，建库得到所述文库。

优选地，步骤(1)所述抗原包括AFB1-BSA、AFB1-HEL、AFB1-OVA、AFB1-KLH或AFB1-HAS中的任意一种或至少两种的组合，优选为AFB1-HEL。

优选地，所述无颌类脊椎动物包括七鳃鳗和/或盲鳗。

优选地，步骤(2)所述重组的方法包括酶切连接。

优选地，步骤(2)所述酶切的酶包括Nco I和Not I；

优选地，步骤(2)所述噬菌体展示载体包括pComb3、pCANTAB 5E、pHEN1或pMESy4中的任意一种或至少两种的组合，优选为pCANTAB 5E；

优选地，步骤(3)所述感受态细胞包括TG1。

优选地，步骤b)所述筛选的抗原包括AFB1-BSA、AFB1-OVA、AFB1-KLH或AFB1-HAS中的任意一种或至少两种的组合，优选为AFB1-BSA。

优选地，步骤b)所述筛选的方法为固相筛选。

作为优选技术方案，一种制备如第一方面所述抗体的方法，具体包括如下步骤：

(1)将抗原AFB1-HEL免疫七鳃鳗，分离淋巴细胞，提取总RNA并合成cDNA；

(2)将步骤(1)合成的cDNA扩增VLR基因用Nco I和Not I酶切，连接至噬菌体展示载体pCANTAB 5E上，得到重组质粒；

(3)将步骤(2)得到的重组质粒转化至感受态细胞TG1中，建库得到所述文库；

(4)对步骤3)的文库采用AFB1-BSA进行固相筛选和鉴定，得到所述抗体。

本发明采用免疫七鳃鳗的制备AFB1抗体的方法，之前没有报道过半抗原免疫七鳃鳗的方法，发明人采取腹腔注射法用完全抗原AFB1-HEL免疫东北七鳃鳗，获得抗AFB1的七鳃鳗抗血清；与免疫球蛋白相比，VLR的优势主要表现在：VLR对特异性抗原的亲和力更高、稳定性更强、单体易于改构、强碱条件才能被洗脱后仍具有亲和力等优点。同时，本发明采用噬菌体展示技术，更好的筛选出亲和力最强的AFB1抗体株。

本发明采取腹腔注射法用完全抗原AFB1-HEL免疫东北七鳃鳗，获得抗AFB1的七鳃鳗抗血清，分离获取淋巴细胞，提取总RNA，逆转录成cDNA，扩增出VLR完整开放阅读框基因序列；用高保真限制性内切酶Not I和Nco I的对VLR文库和噬菌粒载体pCANTAB 5E进行双酶切，然后将双酶切产物连接，采用电转化法将连接混合物转化到大肠杆菌TG1中，从而建立抗AFB1的可变淋巴细胞受体抗体文库，所构建的抗AFB1的VLR抗体文库多样性强，库容量大。

第三方面，本发明提供一种如第一方面所述抗体或第二方面所述方法用于制备检测黄曲霉毒素B1的试剂盒的应用。

由于黄曲霉毒素B1广泛存在于我们日常生活的环境及饮食中，对人类健康产生了极大的影响，因此发展检测黄曲霉毒素B1的渐变、快速、灵敏的方法是非常必要的，本发明制备的抗黄曲霉毒素B1的新型抗体可以部分取代测定食品和环境样品中黄曲霉毒素B1测定所需试剂。

本发明提供了一种抗AFB1的七鳃鳗来源的新型抗体分子、所述抗AFB1的七鳃鳗来源的新型抗体分子在体外抗AFB1中的应用。

本发明还提高了一种筛选抗AFB1的方法，所述方法是用AFB1-BSA作为淘选抗原包被免疫管，利用噬菌体展示技术，从用AFB1-HEL作为免疫原免疫七鳃鳗所构建的抗体文库中淘选出高亲和力的噬菌体，得到所述的抗AFB1的七鳃鳗来源的新型抗体分子，所述的免疫和淘选过程中采用一对全抗原淘选得到具有特异性结合的序列。

具体地，本发明提供了一种AFB1免疫七鳃鳗噬菌体展示初级抗体文库的构建方法，提供抗AFB1的新型抗体库的筛选与鉴定方法，提供抗AFB1的新型抗体的表达，提供抗AFB1的新型抗体的纯化与鉴定。

技术方案概述如下：

本发明提供的抗AFB1新型抗体是从T7噬菌体展示七鳃鳗源免疫抗体库中筛选获得的并在293T细胞中进行了可溶性表达。

本发明提供的抗AFB1新型抗体的制备方法为：

1.抗AFB1七鳃鳗噬菌体展示初级抗体文库的构建

将免疫原AFB1-HEL免疫6次的七鳃鳗(血清效价1:16000)断尾取血，分离获取淋巴细胞，提取总RNA，反转录cDNA，特异性扩增VLR基因，大小为750bp左右；使用限制性的内切酶Nco I和Not I酶切pCANTAB 5E噬菌体展示载体及VLR片段，用T4连接酶连接两个片段；将重组质粒pCANTAB 5E-VLR的电转化至感受态细胞TG1中，建库得到容量为6.825×10⁸的pCANTAB 5E-VLR初级抗体文库。

2.抗AFB1的新型抗体库的筛选与鉴定方法

本发明采用淘选抗原AFB1-BSA对初级抗体文库进行固相筛选，筛选过程如下：

1)加入滴度为10⁹-10¹⁰的噬菌体初级库，先在旋转器上旋转1h，然后在室温条件下静止孵育1h；

2)用0.1％Tween/PBS洗涤10(第1轮)-20遍(第2-5轮)，并用PBS洗涤10遍；

3)加入1mL 100mM TEA(三乙胺，pH 11.0)溶液，放到旋转台上，室温条件下缓慢转动10min，加入1mL 1M Tris-HCl(pH 6.8)中和，洗脱后的噬菌体一部分用于下一轮的筛选，一部分做好梯度稀释，用于计算淘选后噬菌体库的容量。

这样反复进行“孵育-洗脱-扩增”4-5个循环，用未进行展示的辅助噬菌体作为阴性对照，用洗脱下来的噬菌体作为一抗，抗噬菌体M13蛋白作为二抗，采用噬菌体ELISA对其亲和力进行测定。

3.抗AFB1的新型抗体的表达。

本发明先将测序正确且具有较高亲和力的抗AFB1的菌株对应的噬菌粒转化HB2151，用1mM的IPTG培养16h进行诱导表达，同时做好对照(不加IPTG)，然后采用超声处理样品，分别对上清和沉淀进行Western Blot鉴定，在35KDa处有目的蛋白，并以包涵体的形式存在于菌体破碎后的沉淀中。

本发明采用将测序正确且具有较高亲和力的抗AFB1的VLR序列克隆到真核表达载体pcDNA3.1上，在293T细胞中进行表达，分别鉴定转染的细胞和上清，发现目标蛋白VLR可以在293T细胞的上清中分泌表达，收集上清并进行纯化和鉴定。

4.抗AFB1的新型抗体的纯化与鉴定

提取去内毒素的pcDNA3.1-VLR，用lipofectamine 3000将真核表达重组载体转染293T细胞，72h后收集细胞分泌液，经滤膜过滤后进行Ni²⁺柱亲和纯化，用SDS-PAGE和VLR抗体或HIS抗体进行western blot鉴定。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明提供的方法简洁高效，易于推广应用，利用对免疫抗体库进行淘选，免疫和淘选过程中采用一对全抗原淘选得到具有特异性结合的序列，获得的抗黄曲霉毒素B1抗体特异性高，稳定性较强，亲和力高，序列清楚，可以用于基因工程操作，易于获得大量的抗体。

附图说明

图1为ELISA法检测七鳃鳗抗AFB1-HEL血清效价图；

图2为VLR基因的扩增图；

图3为初级抗体库的菌液PCR鉴定图；

图4为初级抗体库的VLR的氨基酸序列比对

图5为噬菌体ELISA淘选重组噬菌体图；

图6为噬菌体经滴度均一化后ELISA检测图；

图7为两个序列蛋白纯化后的western鉴定图。

具体实施方式

为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。下述实施例所用到的试剂和材料均可从常规试剂公司进行购买，下述实施例中未标明具体条件的实验方法均按照常规条件进行。

实施例1噬菌体展示七鳃鳗来源的抗AFB1的抗体初级库的构建

一.RNA提取与cDNA的合成

将完全抗原AFB1-HEL免疫的七鳃鳗(血清效价1:16000)断尾取血，ELISA法检测七鳃鳗抗AFB1-HEL血清效价结果见图1，分离获取淋巴细胞，用Trizol裂解提取淋巴细胞的总RNA，采用反转录试剂盒合成cDNA第一条链。

二.VLR基因的扩增

1.引物设计：

Primer F(包含Nco I酶切位点)SEQ ID NO.5：CATGCCATGGGTTGGATCAAGTGGATCGCCACG

Primer R(包含Not I酶切位点)SEQ ID NO.6：ATAAGAATGCGGCCGCACGTTTCTTGCAGAGGGCG

2.VLR基因片段的PCR扩增体系：

以七鳃鳗白细胞cDNA为模板，用Pyrobest DNA聚合酶进行扩增，PCR扩增体系如下表1：

表1

试剂	体积
		ddH<sub>2</sub>O	32.75μL
dNTPs(2.5mM each)	4μL
		cDNA	4μL
Primer F正向引物	2μL
		Primer R反向引物	2μL
10×Pyrobest Buffer II	5μL
		Pyrobest DNA Polymerase(5units/μL)	0.25μL
总体积	50μL

扩增条件：95℃预变性3min，95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min；25个循环；72℃延伸10min；4℃保存；

用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果(见图2)，QIAquick胶回收试剂盒收目的片段并保存于-20℃。

实施例2噬菌体抗体库的构建和淘筛

一.VLR与pCANTAB-5E连接

按照如下表2操作进行：

表2

16℃连接12-16小时，70℃、10min灭火T4连接酶。

二.VLR文库的构建-重组质粒pCANTAB 5E-VLR的电转化

1)将重组质粒pCANTAB 5E-VLR和电转化感受态TG1放在冰上融化，同时把电转化杯放在冰上预冷；

2)取4μL的重组质粒pCANTAB 5E-VLR加入到融化的感受态TG1中，轻轻吹打，使其混匀；

3)将混有重组质粒的感受态加入到预冷的0.1cm的电转杯中，盖上盖子后，在桌子上轻轻敲杯底，使感受态细胞均匀的分布在杯底，同时排除了气泡，迅速将电转杯转移到冰上使其处于低温状态，静置2-3min；

4)将电转杯擦干，放入到电穿孔仪，将仪器设定为200Ω，25μF(电容)和1.8kV，如果电转化正常，则电击时间在4.5-5.5ms之间；

5)电击完成后，取1mL预热的37℃的SOC复苏培养基加入到电转杯中，轻轻的重悬菌体，将其全部转移到1.5mL的EP管内，在37℃条件下，振荡培养1h；

6)将所有的电转化培养液混合到一起，将混合液系列梯度稀释后在100mm TYE/Amp/glu平板上涂板，以确定所建文库的容量；

7)将剩余的所有的菌液涂布在145mm的TYE/Amp/glu平板上，将这些平板放在30℃的培养箱中，倒置过夜培养；

8)第二天，加入含有15％甘油(0.2μm滤膜过滤除菌)的TYE/Amp/glu培养基于平板，用一次性涂布棒将平板上的细菌全部刮取下来，加入在-80℃下保存，即完成初级抗体文库的构建；

随机挑选20个菌落，加入到4-5mL含100μg/mL氨苄青霉素的2×TY液体培养基，第二天采用20μL体系进行菌液PCR和测序，以确定所建初级抗体库的质量，即阳性率；

三.噬菌体VLR抗体库的构建

1)取50μL的文库菌液接种到50mL预热的含2％葡糖糖和100μg/mL氨苄青霉素的2×TY液体培养基，在37℃的条件下振荡(250r/min)培养，直至A600值为0.4(3-3.5h)(要保证实际用菌量为实际库容的20倍，以确保抗体库内的所有菌都被淘选，此时50mL的菌液含有50×0.4×5×10⁸＝1×10¹⁰的细菌)；

2)取2×10¹¹辅助噬菌体加入到上述菌液中，在37℃条件下静置孵育30min，然后，在37℃条件下振荡(250r/min)培养30min；

3)在室温条件下，3000r/min离心10min，用50mL的含有50μg/mL卡那霉素和100μg/mL氨苄青霉素的50mL 2×TY液体培养基重悬沉淀，在30℃条件下，振荡(250r/min)培养过夜；

4)第二天，将细菌培养液转移到2支50mL的离心管内，以5000r/min，离心30min，将上清部分转移至50mL新的离心管内；

5)向上清中加入1/4体积的PEG/NaCl溶液，混合均匀后放置在冰上1h，使噬菌体沉淀，这时上清中会呈现云雾状；

6)在4℃条件下，4000r/min，离心30min，此时噬菌体以白色沉淀的形式吸附在管底，弃去上清，再短暂离心数秒以吸弃最后的几滴残留的上清；

7)用5mL PBS将沉淀重悬，在4℃条件下，10，000r/min，离心15min，以沉淀细菌碎片，然后弃沉淀；

8)将上清转移到含1mL PEG/NaCl溶液的新离心管内，混合均匀后放置在冰上至少20min，使噬菌体沉淀；

9)在4℃条件下，4000r/min，离心30min，此时噬菌体以白色沉淀的形式吸附在管底，弃去上清，再短暂离心数秒以吸弃最后的几滴残留的上清；

10)加入1mL的PBS，重悬噬菌体沉淀，在4℃条件下，10000r/min，离心15min，以彻底沉淀细菌碎片，弃沉淀；

11)将上清转移到新的1.5mL EP管，获得纯化的噬菌体，保存于4℃以备用；

从初级抗体库中挑选20个克隆，过夜培养后进行PCR，鉴定结果其阳性率大于90％(见图3)，所挑取的20个单菌落的插入片段大小与VLR基因大小一致，均在800bp左右，并且电泳结果显示条带的大小具有一定的差异，初步证明通过电转化重组噬菌粒pCANTAB 5E-VLR所建立的初级抗体库正确，且具有多样性；

为了进一步地验证所建立的初级抗体库的多样性，对以上20个阳性克隆提取质粒，送到华大基因进行测序，从20条序列中任取10条序列进行分析，利用软件VECTOR NTI对10条基因序列对应的蛋白序列进行同源性序列比对，结果显示序列具有多样性(结果见图4)；

氨基酸序列比对结果表明，10条VLR基因所对应的蛋白序列具有较高的同源性，LRRNT端和LRRCT端的保守性最高，LRRV区具有较高的多样性，并且亮氨酸主要存在于LRRV区4251，在LRRCT端有丰富的半胱氨酸，半胱氨酸与低聚体的形成有密切关系，这也是存在于分泌型的VLR的LRRCT端的结构特点之一；同时，结果显示，在序列的LRR区，10条蛋白质序列均不相同，存在差异，即所建立的初级抗体库的具有较高的多样性。

四.抗AFB1的新型抗体库的筛选

本发明采用淘选抗原AFB1-BSA对初级抗体文库进行固相筛选；

1)取400μg的抗原(第一轮取400μg抗原，第二轮取200μg抗原，第三轮到第五轮取100μg抗原)AFB1-BSA于2mL的PBS包被免疫管，置于4℃冰箱过夜。可使用碳酸盐缓冲液；

2)第二天，用PBS洗涤免疫管3次(每次都是迅速地倒入和倒出)；

3)用2％MPBS封闭非特异性的结合位点，在室温条件下静置孵育2h；

4)用PBS洗涤免疫管3次；

5)将10⁹-10¹⁰的噬菌体抗体分子加入到2mL的2％MPBS，先在旋转器上旋转1h，然后在室温条件下静止孵育1h；

6)弃上清，然后用0.1％Tween/PBS洗涤10(第1轮)-20遍(第2-5轮)，并用PBS洗涤10遍；

7)甩干残余的PBS，加入1mL 100mM TEA(三乙胺，pH 11.0)溶液，放到旋转台上，室温条件下缓慢转动10min，加入1mL 1M Tris-HCl(pH6.8)中和，中和后的pH为7.0-7.4(实际7.1)；

8)取10mL OD600＝0.4的TG1，加入1.5mL洗脱后的噬菌体，并混匀，在37℃的条件下静置孵育30min，放置在摇床振荡(250r/min)30min；剩下0.5mL储存在4℃；

9)将感染后的培养液3000r/min离心5-10min，弃上清，用1mL新鲜的2×TY培养基重新悬浮菌体(动作轻柔)，涂布于含100μg/mL氨苄青霉素和2％葡萄糖的TYE平板上；同时做好梯度稀释，用于计算淘选后噬菌体库的容量；

10)置于细菌培养箱，倒置，37℃过夜培养；

本实施例用抗原AFB1-BSA包被免疫管，采用固相筛选法，通过不同的包被浓度及不同严密程度进行了五轮淘选，利用抗体可以识别特异性抗原的原理去除非特异性吸附的噬菌体，对淘选后噬菌体进行梯度稀释以确定每轮洗脱下来噬菌体的滴度，如下表所示，随着筛选的进行，噬菌体的回收率增加，表明特异性的噬菌体得到了富集；

各轮淘选的噬菌体回收率见表3：

表3

筛选轮数	抗原包被浓度	噬菌体投入量	噬菌体洗脱量	淘选回收率
					1	200μg/mL	8.5×10<sup>11</sup>pfu	7.3×10<sup>6</sup>pfu	8.56×10<sup>-5</sup>
2	200μg/mL	4.87×10<sup>10</sup>pfu	2.3×10<sup>5</sup>pfu	4.72×10<sup>-5</sup>
					3	100μg/mL	3.20×10<sup>10</sup>pfu	7.65×10<sup>8</sup>pfu	2.39×10<sup>-2</sup>
4	100μg/mL	1.78×10<sup>10</sup>pfu	1.96×10<sup>8</sup>pfu	1.10×10<sup>-2</sup>
					5	100μg/mL	2.327×10<sup>9</sup>pfu	9.1×10<sup>7</sup>pfu	3.91×10<sup>-2</sup>

实施例3阳性噬菌体单链抗体功能的检测

一.阳性克隆的噬菌体ELISA检测

本发明从第五轮筛选后测定滴度的10cm平板上随机挑取94个单克隆，用辅助噬菌体进行感染，将VLR展示在噬菌体的衣壳蛋白上，然后用AFB1-BSA包被酶标板，进行噬菌体ELISA以筛选抗AFB1重组噬菌体；最后两个孔(95，96)用辅助噬菌体作为阴性对照孔，OD450分别为0.046和0.047，由ELISA结果可知，94个克隆里面有很多亲和力较高的克隆(结果见图5)；

1)取40μg的蛋白抗原AFB1-BSA于20mL的PBS混匀包被94孔酶标板，每

孔100μL，置于4℃冰箱过夜，也可以使用碳酸盐缓冲液；

2)弃去抗原包被液，用洗涤缓冲液PBS洗涤3遍(枪头不要与酶标板底部接触，以免破坏包被好的抗原蛋白，影响实验结果)；

3)每孔加入200μL的2％MPBS，在室温条件下，封闭2h；

4)用洗涤缓冲液PBS洗涤3遍；

5)每孔加入50μL的4％MPBS和50μL含噬菌体抗体的培养基上清，用多道移液器反复吹打混匀，在室温条件下孵育1h；

6)弃去含噬菌体的上清液，用0.1％Tween 20PBS洗涤三遍，然后再用PBS洗涤3遍；

二.阳性克隆亲和力的进一步验证

由于丝状噬菌体在用ELISA进行检测时会产生较高的背景，为了尽量地减少背景的干扰，得到较为准确的蛋白信号，我们将获得的亲和力较高的阳性克隆挑选出来，在50mL离心管内重新进行展示，用PEG/NaCl对上清进行沉淀浓缩，将含有展示了VLR的噬菌体悬液稀释至同一浓度(滴度为10¹⁰)，然后分别用等浓度的AFB1-BSA和BSA包被96孔酶标板，进行ELISA检测，用来比较不同克隆间的差异；

为了排除重组噬菌体对BSA的吸附作用，我们同时包被了相同浓度的BSA，将噬菌体滴度进行均一化处理后进行ELISA检测，若包被AFB1-BSA孔的OD450大于包被BSA孔的2倍，则认为是阳性孔，结果见图6；实验结果表明，这些噬菌体均具有较高的结合活性。

将上述的阳性克隆进行测序，测序结果显示SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4，只有2种VLR序列，分别命名为C9和E1，且将序列进行翻译和结构预测，发现均能进行蛋白的表达和纯化，这进一步地证明了淘选结果的可靠性，具有较高的吸附力的阳性克隆被富集。

三.抗AFB1的新型抗体的表达与鉴定。

本发明先将测序正确且具有较高亲和力的抗AFB1的菌株对应的噬菌粒转化HB2151，用1mM的IPTG培养16h进行诱导表达，同时做好对照(不加IPTG)，然后采用超声处理样品，分别对上清和沉淀进行Western Blot鉴定；

本发明考虑到包涵体的变复性对其功能的影响，所以后来采用将测序正确且具有较高亲和力的抗AFB1的VLR序列克隆到真核表达载体上，在293T细胞中进行表达；

1)样品准备：用lipofectamine 3000将真核表达重组载体转染293T细胞，分别鉴定转染的细胞和上清，发现VLR可以在293T细胞的上清中分泌表达，收集上清并纯化进行鉴定(结果见图7)；

2)SDS-PAGE凝胶电泳：按照要求配置SDS-PAGE胶，上层为浓度5％的浓缩胶，下层为浓度10％的分离胶；将配置好的凝胶转移到电泳槽内，按实验要求吸取定量处理好的样品上清，依次加入到各样品槽内；样品在浓缩胶时使用电压为80V，当样品进入到分离胶时，将电压调至120V，电泳时间为1.5h；电泳结束后，准备转膜；

3)转膜：电泳结束后，用电泳装置上取下玻璃板撬开玻璃板，切除浓缩胶，按照上样情况和蛋白大小，适当去除多余分离胶，取出剩余分离胶，浸泡在转膜缓冲液中；准备与凝胶大小相当的PVDF膜和6层滤纸，PVDF膜用甲醇处理30s后浸泡在转膜缓冲液中，滤纸同样浸泡在转膜缓冲液中；按照电源负极面、海绵、3层滤纸、分离胶、PVDF膜、三层滤纸、海绵、电源正极面的顺序安置转膜系统，注意禁止各层之间有气泡；将转移槽胶板转移到转移槽中，加入转膜缓冲液，恒流200mA，90min，整个电泳过程都是在冰上进行；

4)封闭：转膜结束后，打开转移槽胶板，取出PVDF膜，浸泡在封闭液(5％脱脂奶粉)中，室温摇床上孵育2h；

5)一抗孵育：倒去封闭液，将用封闭液稀释好的VLR抗体(1:5000稀释)加到PVDF膜上，室温摇床孵育2h，孵育结束后，用TBST漂洗5次，每次5min；

6)二抗孵育：将孵育完一抗的PVDF膜放入用封闭液稀释好羊抗鼠的带有HRP的二抗(1:5000稀释)中，室温摇床孵育1h，孵育结束后，用TBST漂洗5次，每次5min；

7)显色：PVDF膜标记二抗之后，配制新鲜发光工作液，将试剂盒中的Solution I和Solution II等体积混和，用镊子将PVDF膜放于保鲜膜上，膜与发光液充分接触，室温孵育2min，然后用镊子夹起PVDF膜，沥干发光液，用保鲜膜包起，用化学发光成像系统进行拍照。

综上所述，本发明提供了一种可抗体及其制备方法和应用，所述方法使用AFB1-BSA作为淘选抗原包被免疫管，利用噬菌体展示技术，从用AFB1-HEL作为免疫原免疫七鳃鳗所构建的抗体文库中淘选出高亲和力的噬菌体，得到两株抗AFB1的七鳃鳗来源的新型抗体分子，为AFB1的检测与研究提供了坚实的基础，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院广州生物医药与健康研究院

<120> 一种抗体及其制备方法和应用

<130> 2019年1月

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 251

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 1

Met Gly Trp Ile Lys Trp Ile Ala Thr Leu Val Ala Phe Gly Ala Leu

1 5 10 15

Val Gln Ser Ala Val Ala Cys Pro Ala Gln Cys Ser Cys Ser Gly Thr

20 25 30

Asp Ile Gln Cys Asp Arg Arg Ser Leu Thr Ser Val Pro Ala Gly Ile

35 40 45

Pro Thr Ser Thr Arg Glu Leu Tyr Leu His Ser Asn Gln Ile Thr Lys

50 55 60

Leu Glu Pro Gly Val Phe Asp His Leu Val Asn Leu Gln Trp Leu Val

65 70 75 80

Leu His Thr Asn Gln Leu Lys Ser Ile Pro Arg Gly Ala Phe Asp Asn

85 90 95

Leu Lys Ser Leu Thr His Ile Tyr Leu Tyr Asn Asn Pro Trp Asp Cys

100 105 110

Ala Cys Ser Asp Ile Leu Tyr Leu Lys Asn Trp Ile Val Gln His Ala

115 120 125

Ser Ile Val Asn Pro Ala Gly Tyr Gly Gly Val Asp Asn Val Lys Cys

130 135 140

Ser Gly Thr Asn Thr Pro Val Arg Ala Val Thr Glu Ala Ser Thr Ser

145 150 155 160

Pro Ser Lys Cys Pro Gly Tyr Val Ala Thr Thr Thr Thr Pro Thr Thr

165 170 175

Thr Thr Pro Glu Ile Ile Pro Glu Thr Thr Thr Leu Pro Val Ile Thr

180 185 190

Thr Gln Lys Pro Arg Ser Leu Met Asn Phe Asn Cys Ser Ser Ile Gln

195 200 205

Glu Arg Lys Asn Asp Gly Gly Asp Cys Gly Lys Pro Ala Cys Thr Thr

210 215 220

Leu Leu Asn Cys Ala Asn Phe Leu Ser Cys Leu Cys Ser Thr Cys Ala

225 230 235 240

Leu Cys Lys Lys Arg His His His His His His

245 250

<210> 2

<211> 278

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 2

Met Gly Trp Ile Lys Trp Ile Ala Thr Leu Val Ala Phe Gly Ala Leu

1 5 10 15

Val Gln Ser Ala Val Ala Cys Pro Ala Gln Cys Ser Cys Ser Gly Thr

20 25 30

Thr Val Asn Cys Gly Gly Lys Ser Leu Ala Ser Val Pro Ala Gly Ile

35 40 45

Pro Ser Thr Thr Arg Glu Leu Tyr Leu His Ser Asn Gln Ile Thr Lys

50 55 60

Leu Glu Pro Gly Val Phe Asp Ser Leu Thr Gln Leu Thr His Leu Asp

65 70 75 80

Leu Gly Gly Asn Gln Leu Lys Ala Leu Ala Glu Gly Met Phe Asp Arg

85 90 95

Leu Gly Asn Leu Gln Ser Leu Gly Leu His Val Asn Gln Leu Lys Ser

100 105 110

Ile Pro Arg Gly Ala Phe Asp Asn Leu Lys Ser Leu Thr His Ile Trp

115 120 125

Leu Phe Asn Asn Pro Trp Asp Cys Ala Cys Ser Asp Ile Leu Tyr Leu

130 135 140

Ser Arg Trp Ile Ser Gln His Pro Gly Val Val Arg Arg Gly Glu Ser

145 150 155 160

Gly Tyr Ala Val Asp Pro Asp His Ala Arg Cys Ser Gly Thr Asn Thr

165 170 175

Pro Val Arg Ala Val Thr Glu Ala Ser Thr Ser Pro Ser Lys Cys Pro

180 185 190

Gly Tyr Val Ala Thr Thr Thr Thr Pro Thr Thr Thr Thr Pro Glu Ile

195 200 205

Ile Pro Glu Thr Thr Thr Leu Pro Val Ile Thr Thr Gln Lys Pro Arg

210 215 220

Ser Leu Met Asn Phe Asn Cys Ser Ser Ile Gln Glu Arg Lys Asn Asp

225 230 235 240

Gly Gly Asp Cys Gly Lys Pro Ala Cys Thr Thr Leu Leu Asn Cys Ala

245 250 255

Asn Phe Leu Ser Cys Leu Cys Ser Thr Cys Ala Leu Cys Lys Lys Arg

260 265 270

His His His His His His

275

<210> 3

<211> 756

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

atgggttgga tcaagtggat cgccacgctg gtcgcctttg gcgccctggt gcaaagtgca 60

gtagcatgtc ccgcgcagtg ttcgtgctca gggacagata ttcaatgtga caggagaagc 120

ctcacatctg tgcctgcggg aatccccact tcaacgcgag agctgtattt gcatagcaat 180

cagatcacga agctcgagcc cggggtgttt gaccacctgg tgaatctgca atggttggtt 240

ttgcacacca accagctgaa gagcattccc aggggcgcct ttgacaacct caagagcctc 300

actcacatct atctgtacaa caacccctgg gactgcgcct gttcagacat cctttatctg 360

aagaactgga ttgtgcagca cgcaagcatc gtgaatccag cgggctatgg gggagttgat 420

aacgtgaagt gctctggtac caataccccc gtccgtgcag tcaccgaggc cagcactagc 480

ccctcaaaat gcccaggcta cgttgctacg accacgacgc cgacgacgac cacgcccgaa 540

atcatccccg agaccacaac cttgcccgtg atcacaaccc agaaacccag gtctctgatg 600

aatttcaact gcagctcaat tcaggagagg aagaacgacg gcggcgactg cggaaagccc 660

gcctgcacaa ctctcctgaa ttgcgccaac ttcctcagct gcctctgttc gacctgcgcc 720

ctctgcaaga aacgtcacca ccaccaccac cactga 756

<210> 4

<211> 837

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

atgggttgga tcaagtggat cgccacgctg gtcgcctttg gcgccctggt gcaaagtgca 60

gtagcatgtc ccgcgcagtg ttcgtgctcg gggacaactg tgaactgtgg agggaaaagc 120

ctcgcgtctg tgcctgcggg aatccccagc accacgcgag agctgtattt gcatagcaat 180

cagatcacga agctcgagcc cggggtgttt gacagtctga cccaactgac tcatctggat 240

cttggtggca accaactgaa ggcccttgcc gagggaatgt ttgaccgact ggggaatctg 300

cagtcgttgg gtctgcacgt caaccagctg aagagcattc ccaggggcgc cttcgacaac 360

ctcaagagcc tcactcatat ctggttgttc aacaacccct gggactgtgc ctgctcagac 420

atcctgtatc tcagccgctg gatctctcag cacccaggag tcgtgaggag gggtgaatca 480

ggctacgctg tggaccctga ccatgcgcgc tgctctggta ccaatacccc cgtccgtgca 540

gtcaccgagg ccagcactag cccctcaaaa tgcccaggct acgttgctac gaccacgacg 600

ccgacgacga ccacgcccga aatcatcccc gagaccacaa ccttgcccgt gatcacaacc 660

cagaaaccca ggtctctgat gaatttcaac tgcagctcaa ttcaggagag gaagaacgac 720

ggcggcgact gcggaaagcc cgcctgcaca actctcctga attgcgccaa cttcctcagc 780

tgcctctgtt cgacctgcgc cctctgcaag aaacgtcacc accaccacca ccactga 837

<210> 5

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

catgccatgg gttggatcaa gtggatcgcc acg 33

<210> 6

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

ataagaatgc ggccgcacgt ttcttgcaga gggcg 35

Claims

1.一种抗体，其特征在于，所述抗体包括C9抗体和/或E1抗体，其中，所述C9抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述E1抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述C9抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

3.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述E1抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

4.一种如权利要求1～3任一项所述抗体用于制备检测黄曲霉毒素B1的试剂盒。