CN108017712B - 一种鲨鱼抗体来源的蛋白骨架及其应用 - Google Patents
一种鲨鱼抗体来源的蛋白骨架及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种蛋白骨架，其特征在于以下结构：A‑B‑C，其中结构单元A表示序列RVEQTPTTTTKEAGESLTINCVLKGSSCALGSTYWYFTKKGATKKASLSTGGRYSDTKNTASKSFSLRISDLRVEDSGTYHCEAY(SEQ ID NO：1)；结构单元B表示抗体可变区；结构单元C表示EGGGTILTVK(SEQ ID NO：2)，其中结构单元A，B和C以肽键连接。
Description
技术领域
本发明涉及鲨鱼抗体来源的蛋白骨架及其应用。
背景技术
所谓蛋白骨架包括典型的大分子抗体【比如IgG，IgM等】，骆驼抗体、羊驼抗体和鲨鱼抗体等小分子抗体，以及Affibody和DARPin等非抗体小分子蛋白骨架。这些蛋白骨架可以是一种完整的天然蛋白，一种天然蛋白的部分结构域，两种或两种以上天然蛋白的部分结构域的融合蛋白。这些蛋白骨架的共同特征是，在其个别区域允许突变，适合构建大容量合成蛋白骨架突变文库。可以采用噬菌体展示等筛选技术，从这些突变文库中筛选与靶分子结合的蛋白骨架分子。在众多的蛋白骨架中，小分子蛋白骨架尤其重要。小分子蛋白骨架的体积小，可以在与靶分子相互作用时，作用于大分子抗体无法接触的沟回表位；小分子蛋白骨架可以构建多价分子，提高中和靶分子的能力，提高潜在药效；也可以构建双特异或多特异融合蛋白，产生新的功能和临床治疗效果；还具有穿透细胞膜进入细胞内，穿过血脑屏障，发挥大分子抗体不具有的功能。根据筛选靶点的不同，这些蛋白骨架分子，具有不同的功能，被用于开发治疗性药物或诊断检测试剂。(1，2)
美国Morphosys公司利用全人源合成抗体库筛选抗体(3)，进行广泛的药物开发，其中治疗牛皮癣的抗体药物Guselkumab已经进入了临床试验III期(4)。Ablynx公司基于羊驼抗体蛋白骨架开发的Caplacizumab，已进入III期临床，用于治疗血小板减少性紫癜(5)。另一个基于羊驼抗体蛋白骨架的抗体药物ALX-0061也进入了III期临床，用于治疗类风湿性关节炎(6)。Affibody公司开发的Affibody肿瘤显象剂ABY-025((her2))已经进入临床试验II期(7)。Molecular Partners公司开发的基因DARPin蛋白骨架开发的Abicipar进入临床试验III期，用于治疗年龄相关性黄斑变性(8)。
因此，寻找新的小分子蛋白骨架，并证明可以通过构建和筛选合成小分子蛋白骨架文库，获得特定功能分子，在药物开发过程中具有实用性。如果这种新型蛋白骨架具有全新的序列特征，就具有新颖性。
发明内容
本发明在于寻找一种新的鲨鱼抗体来源的蛋白骨架，构建通用蛋白骨架文库。
首先，获得中国南海产鲨鱼(点纹斑竹鲨，chiloscyllium punctatum)的脾脏，进行转录组测序，获得点纹斑竹鲨抗体序列库。通过序列分析，确定点纹斑竹鲨抗体的可变区。然后，将点纹斑竹鲨抗体可变区序列进行序列检索发现，有两种鲨鱼抗体序列与点纹斑竹鲨抗体序列的同源性在50％以上，分别为护士鲨(62％，The Nurse Shark，Ginglymostoma cirratum)和斑纹虎须鲨(61％，The Spotted Wobbegong，Orectolobusmaculatus)。点纹斑竹鲨抗体序列与这两种鲨鱼抗体序列之间存在显著差异。至此，我们发现了一种具有全新序列的抗体(QRVEQTPTTTTKEAGESLTINCVLKGSSCALGSTYWYFTKKGATKKASLSTGGRYSDTKNTASKSFSLRISDLRVEDSGTYHCEAYMRATAGCTVWNSYIEGGGTILTVK，SEQ ID NO：3)，点纹斑竹鲨抗体。
分析点纹斑竹鲨抗体的可变区，发现包括两部份：内部不变区域【C区】和内部可变区域【M区】。点纹斑竹鲨抗体整个可变区一共有4个半胱氨酸，其中C区内存在3个半胱氨酸。M区中存在一个位置不固定的半胱氨酸。四个半胱氨酸形成两个二硫键，由于位置不固定的半胱氨酸位于内部可变区(M区)内，具有可变性，即通过可变的二硫键将M区锚定在固定C区骨架上，推测M区的序列多样性和二硫键位置的可变性平衡了M区结构的弹性和刚性，是一种更为合理的结构多样性。
点纹斑竹鲨抗体可变区的M区长度在7-15个氨基酸之间，具有序列多样性和长度多样性；M区内的半胱氨酸的位置不固定，具有二硫键位置多样性。采用点纹斑竹鲨抗体的可变区作为骨架，C区保持不变，按照M区上述序列特征构建的骨架文库既是点纹斑竹鲨抗体蛋白骨架文库。
根据点纹斑竹鲨抗体可变区的M区的这些特征，我们设计了噬菌体展示点纹斑竹鲨抗体蛋白骨架文库的构建方案。首先，合成一条F基因。F基因包含必要的噬菌体展示载体必要元件，完整的C区和M区预置区。M区预置区含有必要的适合无缝连接的酶切位点和相关序列，允许采用无缝连接方式，连入M区。同时，设计合成多种随机突变基因片段R。R包含无缝连接必要元件和M区基因。基于M区的特征(序列多样性，长度多样性和二硫键位置多样性)，M区的多样性为99，需要对应合成99个R片段。然后，采用的无缝连接技术，可以一次性将99个R片段连入到F基因中，构建噬菌体展示点纹斑竹鲨抗体蛋白骨架文库。最后，采用亲和淘选的方法，筛选与模式靶分子例如人血清白蛋白【HSA：Human Serum Albumin】结合的蛋白骨架分子，并采用噬菌体ELISA的方法充分证了与人血清白蛋白【HSA：Human SerumAlbumin】的结合能力。
通过这些试验，我们构建了点纹斑竹鲨抗体蛋白骨架文库，并筛选到具有靶向结合能力的蛋白骨架分子。至此，本发明提供了一种新的通用蛋白骨架文库，点纹斑竹鲨抗体蛋白骨架文库。同时，本发明还提供了一种点纹斑竹鲨抗体蛋白骨架文库的无缝连接构建方法。
具体地，一方面，本发明提供了点纹斑竹鲨抗体，其序列如SEQ ID NO：3所示。
另一方面，本发明提供了蛋白骨架，其特征在于以下结构：A-B-C，其中结构单元A表示序列RVEQTPTTTTKEAGESLTINCVLKGSSCALGSTYWYFTKKGATKKASLSTGGRYSDTKNTASKSFSLRISDLRVEDSGTYHCEAY(SEQ ID NO：1)；结构单元B表示抗体可变区；结构单元C表示EGGGTILTVK(SEQ ID NO：2)，其中结构单元A，B和C以肽键连接。
在具体的实施方案中，所述抗体可变区为任意序列，抗体可变区的长度为1-50个氨基酸，优选为3-45个氨基酸，5-40个氨基酸，7-35个氨基酸，9-30个氨基酸，11-25个氨基酸，或13-20个氨基酸，更优选为7-15个氨基酸，优选地，所述抗体可变区中存在一个半胱氨酸。
在本发明的一个方面，提供了所述蛋白骨架在构建蛋白骨架文库中的应用。
在本发明的一个方面，提供了蛋白骨架文库，其特征在于包含所述的蛋白骨架。
在具体的实施方案中，所述蛋白骨架文库为噬菌体展示蛋白骨架文库，细菌表面展示文库，酵母表面展示文库，核糖体展示文库，病毒表面展示文库，哺乳动物细胞表面展示文库，真菌表面展示文库；优选地，所述噬菌体展示蛋白骨架文库是与选自以下蛋白融合的噬菌体展示蛋白骨架文库：P3蛋白，P8蛋白或P9蛋白。
在本发明的一个方面，提供了筛选蛋白骨架的方法，其特征在于将所述的蛋白骨架文库与靶蛋白、多糖、核酸或脂类相接触，其中优选地，所述靶蛋白为人血清白蛋白。
在本发明的一个方面，提供了利用所述蛋白骨架文库筛选获得的蛋白。
在具体的实施方案中，所获得的蛋白，优选其为SEQ ID NO：33-38任一个所述的序列。
在具体的实施方案中，所获得的蛋白进一步修饰为糖基化衍生物，融合蛋白，共价或非共价结合复合物，偶联物或螯合物。
在本发明的一个方面，提供了所述的蛋白骨架文库在筛选药物或检测试剂中的应用。
在本发明的一个方面，提供了构建所述蛋白骨架文库的方法，其特征在于包含：
(1)构建质粒载体，其包含上述骨架蛋白序列，其中在结构单元B的两侧添加IIs类限制性内切酶的位点；
(2)根据结构单元B的长度和结构单元B中半胱氨酸的有无进行排列组合，设计作为抗体可变区的随机片段，所述随机片段两端添加IIs类限制性内切酶的位点；
(3)将步骤(1)的质粒载体与步骤(2)的随机片段通过IIs类限制性内切酶进行酶切后连接，然后转化宿主细胞。
在一个实施方案中，所述IIs类限制性内切酶为BsaI，SapI，ESP3I，BsmBI，BBsI，BtgZI或BspQI。
在一个实施方案中，步骤(2)根据结构单元B的长度和结构单元B中半胱氨酸的位置进行排列组合，设计作为抗体可变区的随机片段。
附图说明
图1.点纹斑竹鲨抗体序列比对，其中XXXXXXXXXXXXXXXX表示克隆1-11比对后的可变区，各序列可变碱基以下划线黑体表示。
图2.点纹斑竹鲨抗体与斑纹虎须鲨/护士鲨抗体序列比对。
图3.点纹斑竹鲨抗体来源蛋白骨架序列。其中底部划线区域为不变区，即C区；框内区域为可变区，即M区；X代表任意氨基酸组成的序列，长度为1-50个氨基酸，X表示抗体可变区。
图4.无缝连接原理。
图5.无缝连接构建点纹斑竹鲨抗体蛋白骨架文库示意图。
图6.构建噬菌体展示点纹斑竹鲨抗体蛋白骨架文库的F基因，基因F包含了信号肽序列、点纹斑竹鲨抗体C区基因序列、用于无缝连接的酶切位点【两个BsaI】和间隔酶切位点的冗余序列。
图7.构建噬菌体展示点纹斑竹鲨抗体蛋白骨架文库的R片段，框内区域为BsaI酶切位点，用于无缝连接基因克隆；n＝a，g，c，t；k＝g，t。
图8.引物片段R电泳鉴定图，其中泳道1-10分别为引物片段R10-1，R10-2，R10-3，R10-4，R10-5，R10-6，R10-7，R10-8，R10-9，R10-10；泳道M：分子量标准，DL2000，大连宝生物。
图9.退火延伸产物电泳图，其中泳道1-10：dsDNA片段R10-1，R10-2，R10-3，R10-4，R10-5，R10-6，R10-7，R10-8，R10-9，R10-10，泳道M：分子量标准，DL2000，大连宝生物。
图10.噬菌体展示载体电泳结果，其中泳道1，2：pCANTab-5E/SPS-1质粒DNA，泳道M：分子量标准，DL2000，大连宝生物。
图11.菌落PCR鉴定合成文库，其中泳道1-20：菌落PCR产物，泳道M：分子量标准，DL2000，大连宝生物。
图12.6个阳性克隆的序列比对。
具体实施方式
实施例：
本发明的实施例部分包括点纹斑竹鲨脾脏转录组基因测序，抗体序列收集与分析，点纹斑竹鲨合成抗体蛋白骨架文库的设计、构建和筛选、以及点纹斑竹鲨抗体的活性检测。但是以下的实施例对本发明的保护范围不构成任何限制。
实施例(1)点纹斑竹鲨脾脏转录组测序
溶液配制：
PBS：pH7.4：0.24g KH2PO4，1.44g Na2HPO4，8.0g NaCl，0.2g KCl，加水至1000mL
方法：
将点纹斑竹鲨脾脏组织浸泡在PBS溶液中。在一个90mm直径细胞培养皿中，加入适量的PBS溶液，放一个200目细胞筛。取出脾脏放于细胞筛中。用无菌玻璃注射器内芯末端碾压脾脏组织，膜内细胞会慢慢游离出来。细胞经过细胞筛之后，悬浮在PBS溶液中，经过400g离心15分钟后，除去上清，加2毫升红细胞裂解液(称取3.735g氯化铵、三羟甲基氨基甲烷(Tris)1.3g，加水溶解并稀释至500ml)重悬细胞沉淀，然后37度放置2分钟，裂解红细胞。再400g离心15分钟，除去上清。重新使用5毫升PBS重悬细胞沉淀，400g离心15分钟，除去上清，洗细胞沉淀一遍。最后，使用5毫升PBS溶液重悬细胞沉淀，除去其中不可溶的组织纤维后，取100μL细胞悬液进行细胞计数。
采用Qiagen公司的Oligotex Direct mRNA Midi kit试剂盒提取mRNA，并送华大基因做mRNA转录组测序。测序样品纯度要求：OD260/280值在1.9-2.2之间，RNA28S：18S≥1.5，RIN≥7，样品浓度不低于100ng/μL，样品总量不少于7μg。用冻存管保存mRNA样品，并用干冰运输。
实施例(2)点纹斑竹鲨抗体序列分析
根据转录组测序结果，整理出11条点纹斑竹鲨抗体可变区序列(SEQ ID NO：4-14)。如图1所示，经过序列比对，得到一条高度保守共有序列(Consensus)。对点纹斑竹鲨抗体序列进行在线序列比对[https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi]，结果发现点纹斑竹鲨抗体序列与两种抗体序列同源性在50％以上，分别为护士鲨：The Nurse Shark，(Ginglymostoma cirratum，SEQ ID NO：15))和斑纹虎须鲨：The Spotted Wobbegong(Orectolobus maculatus，SEQ ID NO：16)。选取这两个鲨鱼品种的抗体序列中同源性最高的两个序列，与点纹斑竹鲨抗体蛋白骨架进行细致比对。如图2所示.这两个鲨鱼品种的抗体序列与点纹斑竹鲨抗体序列的同源性分别为62％和61％，具有显著差异。至此，我们发现了一种具有全新序列的抗体(QRVEQTPTTTTKEAGESLTINCVLKGSSCALGSTYWYFTKKGATKKASLSTGGRYSDTKNTASKSFSLRISDLRVEDSGTYHCEAYMRATAGCTVWNSYIEGGGTILTVK，SEQ ID NO：3)，点纹斑竹鲨抗体。
如图1所示，分析点纹斑竹鲨抗体的可变区包括两部份：不变区域【C区】和内部可变区域【M区】。点纹斑竹鲨抗体可变区M区的长度在7-15个氨基酸之间，具有序列多样性和长度多样性。整个可变区一共有4个半胱氨酸，其中C区内存在3个半胱氨酸，M区中存在一个位置不固定的半胱氨酸。四个半胱氨酸形成两个二硫键，由于位置不固定的半胱氨酸位于M内，具有可变性，即通过可变的二硫键将M可变区锚定在固定C区骨架上，推测M可变区域的序列多样性和二硫键位置的可变性平衡了M区结构的弹性和刚性，是一种更为合理的结构多样性。
总之，点纹斑竹鲨抗体可变区具有序列多样性、长度多样性和二硫键位置多样性。
基于此，如图3所示，我们得到点纹斑竹鲨抗体来源蛋白骨架序列，其为点纹斑竹鲨抗体的可变区，其中包括两部分，底部划线区域为不变区，即C区；框内区域为可变区，即M区；X表示抗体可变区，X代表任意氨基酸组成的序列，根据文献(11)，本领域的普通技术人员可以理解抗体可变区X的长度可以为1-50个氨基酸。
实施例(3)噬菌体展示点纹斑竹鲨合成抗体库的构建方案设计
以点纹斑竹鲨抗体可变区为蛋白骨架，设计噬菌体展示点纹斑竹鲨合成抗体库的关键是如何涵盖M区长度多样性、序列多样性和二硫键位置多样性，并采用合理的技术方法，将M区基因克隆到C区基因骨架上。
根据图1，M区的长度在7-15个氨基酸之间，如果涵盖所有的序列长度多样性，这需要有9个不同长度的M区。而由于M区内的半胱氨酸的位置不固定，每个长度的M区根据氨基酸的数量需要再分出亚类M区。在M区内，半胱氨酸可以选择TGC固定密码子，在其他氨基酸位置上，可以根据需要，在基因合成时，或者随机合成，或者定制氨基酸的种类和比例进行合成。
根据点纹斑竹鲨抗体可变区的特征和M区的特征，我们设计了噬菌体展示点纹斑竹鲨合成抗体库构建方案。
首先，合成一条F基因。F基因包含必要的噬菌体展示载体必要元件，完整的C区和M区预置区。M区预置区含有必要的适合无缝连接的酶切位点和相关序列，允许采用无缝连接方式，连入M区。将F基因预先连接到噬菌体展示载体中。
同时，设计合成多种随机突变基因片段R。R包含无缝连接必要元件和用于替换M区基因的序列。基于M区的特征(序列多样性，长度多样性和二硫键位置多样性)，如表1所示，M区的多样性为99，需要对应合成99个R片段。
然后，需要将99个R片段连入到预置了F基因的噬菌体载体中，构建噬菌体展示点纹斑竹鲨合成抗体库。
表1.M区的设计策略和R片段数量
点纹斑竹鲨合成抗体的M区位于C区内部，在构建噬菌体展示点纹斑竹鲨合成抗体库时，不能在M区和C区的连接处产生冗余氨基酸，要保证无缝连接。
如果在M区基因的两侧设计典型的II型限制性内切酶，将M区基因连入，必将产生冗余氨基酸。冗余氨基酸的存在一定会影响点纹斑竹鲨合成抗体库的应用。
如果采用重叠PCR方法构建噬菌体展示点纹斑竹鲨合成抗体库，需要将C区基因分为两段，M区基因独立合成，三段基因通过重叠PCR反应拼接成完整的点纹斑竹鲨合成抗体基因。然后，经过琼脂糖电泳纯化和回收点纹斑竹鲨合成抗体基因，再采用酶切反应和连接反应，将其连入噬菌体展示载体中，构建噬菌体展示点纹斑竹鲨合成抗体库。重叠PCR方法的缺点是：(1)需要优化重叠PCR、酶切反应和连接反应的条件；(2)包括重叠PCR，电泳纯化和回收PCR产物，酶切反应，脱盐，连接反应和电击转化等步骤，步骤多，耗时长。(3)构建噬菌体展示点纹斑竹鲨抗体库，需要连入99个不同的M区基因，更加重了重叠PCR方法的工作量，费时费力。
为了完成如此庞大的构建工作，我们专门设计了一个无缝连接的方案。与II型限制性内切酶不同，IIs类限制性内切酶识别连续的非对称位点，在识别位点之外切割DNA，并且对切割位点的序列没有要求。如图4所示，所谓IIs类限制性内切酶无缝连接克隆法就是在同一反应体系中，利用IIs型限制性内切酶在识别位点之外切开DNA，产生含粘性末端的片段，再用连接酶将几个片段按顺序连接，拼成不含酶识别位点的DNA。酶切和连接在一个反应体系里完成，由于连接产物不会被再次切开，未被切开的片段或载体，以及自身回复连接产生的片段会被再次切开。经过多个酶切和连接的循化后，目标连接产物被不断积累。最后做一次彻底的酶切反应，将亲本质粒全部切开，完全克服非连接空载体背景(9)。IIs类限制性内切酶包括BsaI，SapI，ESP3I，BsmBI，BBsI，BtgZI，BspQI。在本实施方案中，我们选择IIs类限制性内切酶BsaI，完成点纹斑竹鲨抗体库的构建。
根据图5的构建示意图，在一个反应体系内，可以同时将99个R片段和噬菌粒载体进行无缝连接反应，一次完成完整的点纹斑竹鲨蛋白骨架文库的构建。
实施例(4)噬菌体展示点纹斑竹鲨合成抗体库的构建
溶液配制：
2YT培养基：用800mL超纯水溶解10g胰化蛋白胨，10g酵母提取物，5gNaCl，用5MNaOH调节pH至7.4，定容至1L。
方法：
(1)合成基因F：SEQ ID NO：17
如图6所示，基因F包含了信号肽序列、点纹斑竹鲨抗体C区基因序列、用于无缝连接的酶切位点【两个BsaI】和间隔酶切位点的冗余序列。利用基因F两侧的HindIII和NotI位点，将基因F连入噬菌粒载体pCANTab-5E(GE Health Care)得到pCANTab-5E/SPS-1。
(2)合成不同的引物片段R
在此，我们以构建噬菌体展示点纹斑竹鲨抗体库的M10亚库为例，详述R引物片段的设计。如图7所示，构建M10亚库需要合成10条R引物。M区内除固定位置采用半胱氨酸的密码子”TGC”外，其余氨基酸均采用NNK方式合成。其他亚库(M7，M8，M9，M11，M12，M13，M14和M15)的R引物设计与M10亚库的R引物设计原理相同(参考M10亚库以及表1)。具体参见图7续。其它亚库R引物的鉴定同M10亚库。
(3)退火延伸片段R制备dsDNA片段(以M10的R引物为例，其它亚库R引物片段的dsDNA片段制备与M10的R引物dsDNA片段制备相同)
(4)退火延伸之前，M10亚库的R引物片段的鉴定结果见图8。
退火延伸反应体系：5μLPCR溶液(10×，TaKaRa)，5μLdNTP溶液(2.5mM，TaKaRa)，5μL引物R-RC(10pm/μL，5’-acgcaagcaggttatgagta-3’，SEQ ID NO：28)，1.5μL单链寡核苷酸R10-n(10pm/μL即图7中的R10-1，SEQ ID NO：18；R10-2，SEQ ID NO：19；R10-3，SEQ ID NO：20；R10-4，SEQ ID NO：21；R10-5，SEQ ID NO：22；R10-6，SEQ ID NO：23；R10-7，SEQ ID NO：24；R10-8，SEQ ID NO：25；R10-9，SEQ ID NO：26；R10-10，SEQ ID NO：27)，0.5μLDNA聚合酶rTaq(TaKaRa)，补双蒸水至50μL。
退火延伸反应程序：94℃预变性4分钟，然后94℃/30秒、53℃/30秒、72℃/30秒反应25个循化，最后72℃延伸10分钟和4℃冷却2分钟。0.8％琼脂糖电泳纯化退火延伸产物，M10亚库的R引物片段退火延伸后的电泳结果见图9。
(5)无缝连接反应
纯化的退火延伸产物(即如上获得的M1-M10亚库99条R引物dsDNA片段)分别与噬菌体展示载体pCANTab-5ESPS-1混合，进行无缝连接反应。pCANTab-5E/SPS-1的鉴定结果见图10。
无缝连接反应体系：30μL【60ng】pCANTab-5E/SPS-1质粒，63μL【4ng】双链DNA片段，50μLT4缓冲液【10×，NEB】，25μLBsaI-HF【NEB】，50μLT4 DNA连接酶【NEB】，补双蒸水至500μL。
无缝连接反应程序为：37℃/10分钟、16℃/10分钟反应15个酶切和连接循环，然后37℃30分钟充分酶切，50℃5分钟充分酶切，80℃5分钟变性灭活酶，4℃2分钟冷却反应体系。无缝连接产物-80℃保存，备用。
(6)电击转化
在电击转化之前，无缝连接产物需要脱盐。在无缝连接产物中依次加入50μLNaAC溶液【3M】和1.5毫升无水乙醇，混匀后，置于-20℃1个小时。10,000rpm 4℃离心10分钟，弃上清。使用冷75％乙醇洗涤沉淀2次，每次10,000rpm 4℃离心10分钟，弃上清。最后一次弃上清后，将离心管置于超净台内自然风干。然后悬浮在200μL双蒸水中，-80℃保存，备用。
采用分子克隆手册的方法，制备细菌TG1电击感受态细胞(10)。
采用BTX630电击仪进行电击转化。将5μL脱盐后连接产物，加入到200μLTG1电击感受态中，电击参数是2500V、125Ω、50μF。电击后，合并电击后感受态细胞，加入到200毫升2YT培养基中，37℃100rpm恒温摇床培养1小时，进行复苏。复苏后，补加氨苄青霉素至100微克/毫升，补加葡萄糖至2％【质量/体积】。再在30℃，220rpm恒温摇床培养约10小时，至OD600值约4.3-4.5，补加甘油至终浓度20％，-80℃冻存。得到点纹斑竹鲨合成抗体库的细菌文库。
(7)菌落PCR鉴定库阳性率
PCR反应体系：2μLPCR溶液(10×，TaKaRa)，2μLdNTP溶液(2.5mM，TaKaRa)，1μL引物L1(10pm/μL，5’-acgcaagcaggttatgagta-3’，SEQ ID NO：29)，1μL引物S6(10pm/μL，5’-acgcaagcaggttatgagta-3’，SEQ ID NO：30)，单菌落，0.4μLDNA聚合酶rTaq(TaKaRa)，补双蒸水至20μL。
退火延伸反应程序：94℃预变性4分钟，然后94℃/30秒、53℃/30秒、72℃/30秒反应30个循化，最后72℃延伸2分钟和4℃冷却2分钟。0.8％琼脂糖电泳鉴定PCR产物，电泳结果见图11。
实施例(5)噬菌体展示点纹斑竹鲨合成抗体库之噬菌体库的包装
溶液配制：
2YT-A-G培养基：2YT培养基中含有终浓度100μg/mL氨苄青霉素、1％(w/v)葡萄糖)
2YT-A-K培养基：2YT培养基中含有终浓度100μg/mL氨苄青霉素、50μg/mL卡那霉素)
PEG6000/NaCl：称取40g PEG6000和29.22g NaCl，加入165mL去离子水，开水浴至颗粒完全溶解，冷水降温到溶液澄清，低磅灭菌。
LB-A平板：10g胰化蛋白胨(Tryptone)，5g酵母提取物(Yeast extract)，5g NaCl，15g琼脂或者琼脂糖，1mL 1mol/LNaOH调pH至7.4，用去离子水定容至1L。
方法：
(1)扩增：取冻存的点纹斑竹鲨合成抗体库的细菌文库，加到300mL2YT-A-G培养基中，至初始OD600≈0.1-0.2，37℃恒温220rpm摇床培养。
(2)侵染：约2.5小时左右，至OD600≈0.8-1.0之间，加入M13KO7辅助噬菌体(GEHealth Care)进行侵染，MOI＝10。加入M13KO7后，摇晃混匀，放入37℃培养箱静置30分钟。静置后，37℃，180rpm缓摇30分钟。
(3)离心换液：将侵染的菌液倒入500mL离心筒中，于4℃，5000rpm离心10分钟，弃尽上清。每瓶用300mL 2YT-A-K培养基重悬沉淀，于30℃，220rpm培养过夜。
(4)一次沉淀：将每瓶300mL过夜菌倒入500mL离心筒，9000rpm离心20分钟。将上清全部倒入新的500mL离心筒中，9,000rpm离心20分钟。将上清倒入噬菌体专用量筒中，量取250mL上清，倒入新的500mL离心筒中。离心筒底部剩余的上清和沉淀一起丢弃。于250mL上清中加入1/4体积的PEG6000/NaCl，边加边摇晃混匀，冰水浴沉淀4小时。然后冰浴后，于4℃，9,000rpm离心20分钟，倒掉上清。9,000rpm再次离心1分钟，用枪头吸出底部残液。
(5)二次沉淀：加入20mL 1×PBS缓冲液，将每瓶沉淀悬液倒入50mL离心管中，再加入1/5体积的PEG6000/NaCl，用枪头吹吸混匀。于冰水浴中进行二次沉淀1小时。于4℃，12,000rpm离心20分钟，并小心倒掉上清。再12,000rpm离心1分钟，用枪头吸出残液。
(6)分装：根据沉淀的量，用3-6mL 1×PBS缓冲液重悬沉淀。预先用1×PBS缓冲液润洗0.45um一次性滤器，再过滤噬菌体，以减少噬菌体损失；将噬菌体过滤到一个新的50mL三角瓶中，加入1/2体积的50％甘油(w/v)至终浓度约为17％。混匀后分装到1.5mL EP管中，每支500μL，做好标记TG1，取10μL测滴度，其余-80℃冻存。
(7)测滴度：早上接种TG1单克隆菌落，于20mL 2YT培养基中，37℃，220rpm培养至OD600≈1.0。取10μL噬菌体库加入到990μL 2YT培养基中，轻弹混匀，此管标记为10-2。再从此管吸出10μL加入到990μL 2YT培养基中，轻弹混匀，此管标记为10-4。依次类推，稀释到10-10管。从10-10管取出100μL，加入到200μL培养好的TG1中，37℃培养箱静置30分钟，300μL全部涂布至LB-A半板上，37℃过夜培养。
(8)滴度计算：滴度(pfu/mL)＝10-10板上的克隆数*1010
至此，如表2.所示，完成噬菌体展示点纹斑竹鲨蛋白抗体库的构建。
表2.噬菌体展示点纹斑竹鲨蛋白抗体库的建库数据
| 库容 | 鉴定阳性率 | 噬菌体滴度 |
| 9.1×10<sup>9</sup> | 17/20 | 1.1*10<sup>13</sup> |
实施例(6)噬菌体展示点纹斑竹鲨合成抗体库的筛选
溶液配制：
包被液：1.59g NaHCO3，2.93g NaHCO3，加去离子水至1000mL
2％M-PBS：2％(w/v)脱脂奶粉，1×PBS
4％M-PBS：4％(w/v)脱脂奶粉，1×PBS
2YT-A培养基：2YT培养基中含有终浓度100μg/mL氨苄青霉素
0.1％-0.5％PBST：0.1％-0.5％(v/v)，1×PBS
方法：
第一天：准备
(1)包被靶分子：用包被液稀释靶人血清白蛋白(美国SIGMA产品)至2ug/mL，每孔100μL，在湿盒中4℃静置过夜。
(2)封闭空白孔：用2％M-PBS封闭，300μL/孔，在湿盒中4℃静置过夜。(2％M-PBS需9,000rpm 2分钟，取上清)。
(3)划TG1单克隆平板：取冻存TG1菌于10mL 2YT培养基中，于37℃，250rpm培养至对数期，然后划LB平板。
第二天早晨：筛选
(1)接TG1菌：挑取TG1单克隆菌于10mL 2YT培养基中，于37℃，250rpm培养至对数期(OD≈0.5)，用于测滴度。
(2)封闭靶分子包被孔：倒掉包被靶分子孔中的包被液，PBS洗板3次，每孔加入300μL封阻液(2％M-PBS)，于37℃静置1小时。
(3)扣除前背景：将封闭好的空白孔PBS洗3次。将噬菌体库与1％M-PBS混合后，加入到空白孔中，100μL/孔，室温静置1小时。
(4)结合：将封闭好的靶分子包被孔PBS洗3次。将步骤3已经扣除前背景的噬菌体抗体库加入到靶分子包被孔中，100μL/孔，进行结合反应，室温结合1小时。
(5)洗涤：0.1％-0.5％PBST洗板9次。每次摇1分钟，PBS洗板1次。
(6)洗脱：将1mg/mL胰酶(Trypsin)加入到洗涤后的靶分子孔里，100μL/孔，再室温缓摇8分钟。然后吸出后与等体积4％M-PBS混合，以终止胰酶活性。得到的洗脱产物于4℃保存。
(7)测定滴度：测定洗脱产物噬菌体滴度的方法同实施例(5)
第二天下午：扩增
(1)接TG1单克隆菌：将TG1单克隆菌接种于20mL 2YT培养基，于37℃，250rpm震荡培养至对数期(OD＝0.5)。
(2)洗脱产物侵染：洗脱产物加入到对数期TG1培养物中混匀，于37℃静置30分钟。
(3)补加抗性：补加氨苄青霉素至终浓度20μg/mL，于37℃，180rpm缓摇60分钟。
(4)M13K07侵染：向瓶中加入相应量的M13KO7(GE Health Care)，MOI≥10，于37℃静置20分钟。
(5)补加培养基：补加30mL 2YT培养基，补加氨苄青霉素至终浓度20μg/mL，于37℃180rpm缓摇60分钟。
(6)收菌重悬：5,000rpm离心10分钟弃上清收菌，菌体重悬在50mL 2YT-A培养基(氨苄青霉素终浓度50μg/mL)中，于30℃，220rpm过夜培养。
第三天：继续扩增
(1)沉淀：将过夜培养物转入50mL离心管中，4℃，12,000rpm离心10分钟。上清转入另一50mL离心管同样条件再离心。将上清转入新离心管，并加入1/4体积的PEG6000/NaCl，4℃沉淀4小时。再4℃12,000rpm离心20分钟，倒掉上清液，再短暂离心，吸去残留上清。重悬沉淀于0.5mL PBS中。再4℃ 12,000rpm离心10分钟，将上清转入另一新鲜1.5mL离心管中，此为扩增产物。
(2)测扩增产物滴度：测定洗脱产物噬菌体滴度的方法同实施例(5)
(3)菌落PCR鉴定洗脱产物克隆阳性率：
配制PCR反应体系：2μLPCR溶液(10×，TaKaRa)，2μLdNTP溶液(2.5mM，TaKaRa)，1μL引物L1(10pm/μL，5′-tggaattgtgagcggataacaatt-3′，SEQ ID NO：31)，1μL引物S6(10pm/μL，5′-gtaaatgaattttctgtatgagg-3′，SEQ ID NO：32)，单菌落菌苔作为PCR模板，0.5μLDNA聚合酶rTaq(TaKaRa)，补双蒸水至20μL。
PCR反应程序为：94℃预变性4分钟，然后94℃/30秒、53℃/30秒、72℃/30秒反应30个循化，最后72℃延伸2分钟和4℃冷却2分钟。
至此，第一轮筛选结束。重复筛选3次。
结果分析：如表3所示，经过3轮筛选，富集因子提高了100倍，靶分子筛选与对照筛选相差1000倍，亲和淘选成功。
表3.亲和淘选数据
富集因子＝投入/产出
实施例(7)噬菌体ELISA
制备单克隆噬菌体：
第一天：
(1)扩增：在50mL摇瓶中加入10mL 2YT-A-G(A，氨苄青霉素，100μg/mL；G，葡萄糖，0.1％，w/v)，挑取洗脱产物测滴度平板上的单克隆菌落，37℃，250rpm培养至OD≈0.5。
(2)M13K07侵染：加入3.5～5.0μL M13KO7，37℃静置30分钟，再37℃180rpm缓摇30分钟。
(3)补加培养基：加入10mL 2YT-A-K(A，氨苄青霉素，50μg/mL；K，卡那霉素，25μg/mL)，摇匀后，30℃，220rpm培养过夜。
第二天：
将过夜培养物转入50mL离心管中，4℃12,000rpm离心10分钟。将上清转入新离心管，加入1/4体积的PEG6000/NaCl，4℃沉淀4小时。4℃12,000rpm离心20分钟，倒掉上清液，再短暂离心，吸去残留上清。重悬沉淀于0.5mL PBS中。4℃ 12,000rpm离心10分钟，上清转入另一新的1.5mL离心管中。
噬菌体ELISA：
溶液配制：
0.1％-PBST：0.1％(v/v)Tween-20，1×PBS
1％M-PBS：1％(w/v)脱脂奶粉，1×PBS
底物缓冲液：pH5.0，5mL 0.2M Na2HPO4，5mL 0.1M柠檬酸，加入4mg OPD，1μL 30％(w/v)
方法：
第一天：
包被：用pH9.6包被液稀释人血清白蛋白，50μL/孔，在湿盒中，4℃静置过夜。
第二天：
(1)封闭：弃包被液，0.1％-PBST洗板3次。加入封阻液，300μL/孔，37℃在湿盒中静置1小时。
(2)结合：弃出封闭液，0.1％-PBST洗板3次。用1％M-PBS 10倍稀释噬菌体，50μL/孔，37℃在湿盒中静置1小时。
(3)加一抗：弃噬菌体溶液，0.1％-PBST洗板3次。用1％M-PBS 1∶1000稀释兔抗M13多抗(GE Healthcare)，加入50μL/孔，37℃在湿盒中静置1小时。
(4)加二抗：弃一抗溶液，0.1％-PBST洗板3次。用1％M-PBS 1∶3000稀释HRP羊抗兔IgG多抗(SIGMA)，加入50μL/孔，37℃在湿盒中静置1小时。
(5)显色：弃二抗溶液，0.1％-PBST洗板4次。取10mL底物缓冲液，混匀，50μL/孔，室温避光显色30分钟，2M H2SO4终止，490nm检测。
结果分析：
从第三轮靶分子筛选产物中，挑取20个单克隆菌落，经过单克隆噬菌体扩增之后，采用噬菌体ELISA的方法进行鉴定。噬菌体ELISA的结果如表4所示，20个克隆里一共有19个阳性克隆，1个阴性克隆。至此，噬菌体ELISA鉴定成功。将19个克隆送当地的公司测序后，一共得到6个独特的序列，测序结果见表5。6个独特的抗体序列的比对结果见图12。
最后，我们成功构建了噬菌体展示点纹斑竹鲨合成抗体库，并采用亲和淘选的方法成功筛选到6个与HSA特异结合的新的点纹斑竹鲨抗体。
表4.噬菌体ELISA结果
表5.测序结果统计
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Claims (15)
1.点纹斑竹鲨抗体，其序列如SEQ ID NO:3所示。
2.多肽，其特征在于以下结构：A-B-C，其中结构单元A表示序列RVEQTPTTTTKEAGESLTINCVLKGSSCALGSTYWYFTKKGATKKASLSTGGRYSDTKNTASKSFSLRISDLRVEDSGTYHCEAY(SEQ ID NO:1)；结构单元B表示抗体可变区；结构单元C表示EGGGTILTVK(SEQ ID NO:2)，其中结构单元A，B和C以肽键连接，其中所述抗体可变区为任意序列，长度为7-15个氨基酸，其中所述抗体可变区中存在一个半胱氨酸。
3.权利要求2所述的多肽在构建多肽文库中的应用。
4.多肽文库，其特征在于包含权利要求2所述的多肽。
5.权利要求4所述的多肽文库，其特征在于所述多肽文库为噬菌体展示多肽文库，细菌表面展示文库，酵母表面展示文库，核糖体展示文库，病毒表面展示文库，哺乳动物细胞表面展示文库，真菌表面展示文库。
6.权利要求5所述的多肽文库，其特征在于所述噬菌体展示多肽文库是与选自以下蛋白融合的噬菌体展示多肽文库：P3蛋白，P8蛋白或P9蛋白。
7.筛选多肽的方法，其特征在于将权利要求4或5所述的多肽文库与靶蛋白、多糖、核酸或脂类相接触。
8.权利要求7的方法，其中所述靶蛋白为人血清白蛋白。
9.蛋白，其特征在于利用权利要求4或5所述的多肽文库筛选获得。
10.权利要求9所述的蛋白，所述蛋白为SEQ ID NO：33-38任一个所述的序列。
11.权利要求9所述的蛋白，其中所述蛋白进一步修饰为糖基化衍生物，融合蛋白，共价或非共价结合复合物，偶联物或螯合物。
12.权利要求4或5所述的多肽文库在筛选药物或检测试剂中的应用。
13.构建权利要求4所述多肽文库的方法，其特征在于包含：
(1)构建质粒载体，其包含权利要求2所述的多肽序列，其中在结构单元B的两侧添加IIs类限制性内切酶的位点；
(2)根据结构单元B的长度和结构单元B中半胱氨酸的有无进行排列组合，设计作为抗体可变区的随机片段，所述随机片段两端添加IIs类限制性内切酶的位点；
(3)将步骤(1)的质粒载体与步骤(2)的随机片段通过IIs类限制性内切酶进行酶切后连接，然后转化宿主细胞。
14.权利要求13所述的方法，其中，所述IIs类限制性内切酶为BsaI,SapI,ESP3I,BsmBI,BBsI,BtgZI或BspQI。
15.权利要求13所述的方法，步骤(2)根据结构单元B的长度和结构单元B中半胱氨酸的位置进行排列组合，设计作为抗体可变区的随机片段。
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