CN112940120B - 降钙素原单域抗体及其应用和试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物抗体技术领域，具体提供一种降钙素原单域抗体及其应用和试剂盒。其中，所述降钙素原单域抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明提供的降钙素原单域抗体在常温至45℃之间均具有良好的稳定性，能在常温至45℃下长期保存，使PCT抗体储存的难度大幅度降低，可有效地降低储存及运输的成本。

Description

降钙素原单域抗体及其应用和试剂盒

技术领域

本发明属于生物抗体技术领域，尤其涉及一种降钙素原单域抗体及其应用和试剂盒。

背景技术

传统的诊断标记如血液培养物和炎症标记物（即C-反应蛋白，英文简称为：CRP），可用于临床怀疑感染患者的检测，但是这些传统的诊断标记存在敏感性和特异性欠佳的问题。这些问题的存在会使得医生对使用抗生素治疗的必要性感到模糊，而不必要和长期暴露于抗菌药物中会对患者的预后产生不利影响，如艰难梭菌感染；而不适当的抗生素治疗则会增加患者的抗生素耐药性问题，从而造成公共卫生威胁。目前已经有越来越多的证据表明，感染标志物降钙素原（procalcitonin，英文简称为：PCT）可以用于改善细菌感染的诊断和提示感染的解决，从而帮助检测患者和指导抗生素治疗。

随着技术的发展，PCT已经应用于：（1）细菌和非细菌感染的诊断标准；（2）检测手术和严重创伤患者细菌感染并发症；（3）帮助严重脓毒症的诊断及预后；（4）对严重多发伤并发症的预测与辅助诊断；（5）指导抗生素使用；（6）鉴别诊断肿瘤是否有继发感染；（7）败血症诊断等。表1所示为目前市面上已经使用的某两款抗人降钙素原抗体的基本概况。

表1

从表1可知，现有的PCT抗体需要低温保存，如2℃-8℃或-20℃及以下或冻干保存，储存条件比较苛刻，这会使得PCT抗体在运输过程中需要冷链，运输条件和运输成本都比较高。

发明内容

本发明实施例的主要目的在于提供一种降钙素原单域抗体及其应用和试剂盒，旨在解决现有降钙素原抗体需低温保存以及由此使得保存和运输的条件及成本都比较高的问题。

第一方面，本发明实施例提供一种降钙素原单域抗体，所述降钙素原单域抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步地，所述降钙素原单域抗体的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。

第二方面，本发明实施例提供上述所述的降钙素原单域抗体作为试剂盒成分的应用。

第三方面，本发明实施例提供一种试剂盒，所述试剂盒中包含上述所述的降钙素原单域抗体。

可选地，所述试剂盒包括细菌和非细菌感染诊断标准的试剂盒、脓毒症诊断及预后的试剂盒、多发伤并发症预测与辅助诊断的试剂盒、指导抗生素使用的试剂盒、抗生素治疗效果监测的试剂盒、鉴别诊断肿瘤是否有继发感染的试剂盒、败血症诊断的试剂盒、不明原因发烧鉴别诊断的试剂盒、胆源性与细菌感染性胰腺炎鉴别诊断的试剂盒、新生儿及儿童的细菌性与病毒性脑膜炎鉴别诊断的试剂盒、急性器官排斥反应与移植后感染鉴别诊断的试剂盒、伴有急性炎症性自身免疫疾病是否合并细菌感染鉴别诊断的试剂盒、泌尿系统感染检测的试剂盒中的任一种。

可选地，所述试剂盒还包括：

（1）校准品；（2）固相载体；（3）酶标记抗体；（4）底物液；（5）洗涤液；（6）封板膜。

本发明实施例的有益效果如下：

相对于现有技术而言，本发明实施例提供的降钙素原单域抗体，在常温至45℃之间均具有良好的稳定性，在常温至45℃之间的任一温度下均可长期保存，使得PCT抗体储存的难度大幅度降低，可有效地降低储存、运输的成本，此外，本发明的降钙素原单域抗体在高温下也具有良好的活性，因此将本发明的降钙素原单域抗体作为试剂盒时可以有效降低试剂盒的储存、运输成本。

附图说明

为了更清楚地说明本发明施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例提供的降钙素原单域抗体和传统PCT抗体（鼠抗）在37℃下储存7天的稳定性比较柱状图；

图2是本发明实施例提供的降钙素原单域抗体及鼠抗在45 ℃下储存14天的考马斯亮蓝染色结果图；

图3是本发明实施例提供的降钙素原单域抗体及鼠抗在45 ℃下储存14天的稳定性柱状图；

图4是本发明实施例提供的降钙素原单域抗体的诱导表达结果图；

图5是本发明实施例提供的降钙素原单域抗体在100 ℃条件下稳定性的检测结果图；

图6是鼠抗在100 ℃条件下稳定性的检测结果图；

图7是兔抗在100 ℃条件下稳定性的检测结果图。

具体实施方式

为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明做进一步的详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

一、降钙素原单域抗体的获取过程

首次获得本发明实施例提供的降钙素原单域抗体的方法如下：

1、单域抗体库的获取：

（1）以健康的成年（0.5~1.5年龄）条纹斑竹鲨作为免疫对象，采用降钙素原（PCT）为抗原进行免疫，共免疫4-8次，且相邻两次免疫的时间间隔为10-20天；在一些实施方式中，共免疫5次，并且每隔14天免疫一次。

（2）完成免疫后，采集鲨鱼外周血淋巴细胞或者脾脏细胞，提取RNA，并采用逆转录试剂盒反转录为cDNA，随后经PCR法扩增获得vNAR区编码基因。

（3）采用SfiI限制性内切酶进行酶切后克隆进噬菌粒（phagemid）中，进行质粒构建；在一些实施方式中，噬菌粒包括pComb3xss载体、pCANTAB5E载体、pCANTAB5L载体及pCANTAB5X载体等中的任一种。

（4）将构建好的质粒转化入大肠杆菌，将PCT抗体蛋白片段展示在噬菌体M13的表面，得到初级文库菌，即由此获得单域抗体库。

2、单域抗体库的扩增：

具体包括以下步骤：

（1）取1支初级文库菌接种到50mL无抗性的2×YTG（G为2wt%的葡萄糖）中，在37℃、250rpm的条件下振荡培养至OD600达0.5左右。

（2）加入感染复数（moi）为20：1的VCSM13噬菌体，在37℃的条件下静置15min，随后在37℃、250rpm的条件下振荡培养45min，再取100μL的菌液分别涂布在2×YTG+AMP+TET和2×YTG+KAN的平板上，于37℃的条件下过夜培养。

（3）按照4000rpm的转速离心10min，弃去上清。

（4）用200mL新鲜的2×YT+AMP+TET+KAN培养液重悬菌体，在30℃、150rpm的条件下振荡培养过夜。

（5）将上清转移到无菌管里，在4 ℃、14000 rpm的条件下离心10分钟，随后将上清液转移到新管中，并按照每400 μL上清液中加入100 μL 40%的PEG 4000和2.5M的NaCl溶液，冰浴条件下剧烈震动15分钟。

（6）在4 ℃、14000 rpm的条件下离心15分钟，随后去掉上清，得到PCT抗体库，用4mL 1×TE缓冲液溶解。

3、抗体的筛选和富集：

对PCT抗体库进行三轮筛选和富集，其中，第一轮筛选和富集过程如下：

（1）吸取30 μg的PCT抗原，溶于2 mL的PBS溶液(pH＝7.2)中，转移至容量为5 mL的免疫试管中，在4 ℃的条件下过夜。

（2）先用Tris-HCl液清洗免疫试管3次，尽量去除上清，加入4 mL 0.1M的Tris-HCl缓冲液(pH=8.0)，室温静置2小时。

（3）将4 mL 3%的BSA放入免疫试管中，室温缓慢摇动2小时，以封闭潜在蛋白结合位点，随后以PBS清洗3次。

（4）将1 mL的噬菌体抗体库溶液加入免疫试管中，室温下，混合器缓慢摇晃30分钟，然后室温静置90分钟，以PBST清洗免疫试管10次，PBS清洗免疫试管10次，甩干。

（5）向免疫试管中加入600 μL的Glycine-HCl，缓慢摇晃，室温30分钟，然后加入100 μL 0.1M的Tris-HCl将pH调至7.5，加入2 mL的新鲜XL1-Blue菌液（OD＝0.7），在37 ℃的条件下静置50分钟，随后转移至50 mL的离心管中，并加入5 mL的 2×YT，在37 ℃的条件下摇荡30分钟。

（6）加入1 μL的VCSM13辅助噬菌体，在37 ℃的条件下静置50分钟，随后在3000 g的离心力下离心5分钟，去掉上清，沉淀溶于50 mL的2×YT+AMP+KAN培养基，在30 ℃的条件下过夜。

（7）采用PEG4000沉淀培养基上清液中的噬菌体，在14000 rpm的条件下离心，随后以2 mL的1×TE溶解噬菌体。

第二轮、第三轮的筛选和富集步骤同第一轮，在此不再展开赘述。

4、抗体的富集度检测：

采用ELISA检测抗体的富集度，具体包括以下步骤：

（1）抗原包被：用PCT抗原分别包被ELISA板，包被浓度为1 μg/mL。

（2）BSA封闭。

（3）每个ELISA孔加入不同富集度的PCT抗体，稀释到PBST中，100 μL/孔，静置1小时。

（4）抗M13噬菌体抗体（兔源)，稀释度为1：5000，100 μL/孔，在37 ℃的条件下静置1小时。

（5）羊抗兔IgG抗体(HRP)，稀释度为1：10000，100 μL/孔，在37 ℃的条件下静置1小时。

（6）显色：PBST洗涤5次，轻轻拍干每孔加入100 μL的显色剂，室温反应5-10 min。

（7）每孔中加入100 μL的终止液并混匀，终止显色反应。

（8）用酶标仪在450 nm处测定吸光值；从吸光值看出，随着三轮筛选的进行，能够特异性识别结合PCT的抗体逐渐被富集，获得PCT抗体库。

5、单克隆抗体菌落的选取：

Phage-ELISA初步检测抗原阳性重组抗体，具体步骤如下：

（1）取1.5 mL EP管，加入2×YTG+AMP+TET培养基，400 μL/管。

（2）在三级抗体库（即第三轮筛选得到的PCT抗体库）中随机挑取抗体单菌落，接种至上面各EP管中，在37℃、250 rpm的条件下振荡培养过夜。

（3）次日，另取新EP管，每管加入400μL含有2.5×10¹⁰ pfu/mL VCSM13的2×YTG+AMP+TET+KAN培养基，再加入40μL过夜培养的菌液，在37℃、150rpm的条件下振荡培养2小时。

（4）1500×g离心20 min，小心去上清，向EP管中加入400μL2×YT+AMP+TET+KAN培养基，在37℃、250 rpm的条件下振荡培养过夜。

（5）次日，1500×g离心20min，小心取上清，待用。

（6）上清液直接作为抗体溶液做ELISA，选取每次实验中吸光度值最高的单菌落作为单克隆抗体阳性菌落，共做30次实验，选取30个吸光度值最高的单菌落。

根据单克隆抗体噬菌粒（Phage-VNAR）ELISA的结果，选取这些阳性菌落进行测序，其中，SEQ IDNO.2所示的氨基酸序列是吸光度值最高的单克隆抗体阳性克隆的氨基酸序列，即为降钙素原单域抗体，由此也可以进一步得到如SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列。

二、性能验证

1、37℃的储存稳定性检测：

将上述获得的降钙素原单域抗体和传统PCT抗体（即鼠抗）置于恒温箱中，37℃的条件下保存，并检测降钙素原单域抗体、鼠抗的降解情况，结果如图1所示。

从图1可以看到，同样是在37 ℃的条件下储存7天，相对于鼠抗，本发明实施例提供的降钙素原单域抗体的余量保持在100%，而鼠抗的余量在第7天时，仅剩不到30%，说明本发明实施例提供的降钙素原单域抗体在37℃下具有良好的储存稳定性。

2、45 ℃的储存稳定性检测；

采用考马斯亮蓝染色法对本发明实施例制备得到的降钙素原单域抗体、鼠抗重链HC、鼠抗轻链LC分别进行染色，然后置于恒温箱中，在45 ℃的条件下保存，检测考染的情况以及降解情况，结果如图2和图3所示。

从图2可以看到，本发明提供的降钙素原单域抗体染色后，从第0天至第14天，颜色清晰而且稳定，仅有轻微变淡的迹象，而鼠抗重链HC和鼠抗轻链LC在染色的第0天，条带颜色清晰，并且鼠抗重链HC的颜色比鼠抗轻链LC的颜色更为清晰，但是，随着时间的推移，两者的条带均逐渐暗淡，变淡的迹象十分明显，且鼠抗重链HC比鼠抗轻链LC变得更为暗淡。

从图3可以看到，本发明实施例提供的降钙素原单域抗体至14天的余量仍然高达90%以上，而鼠抗重链HC的余量仅为25%左右，鼠抗轻链LC的余量仅为43%左右。

综合图2和图3可以看出，本发明实施例提供的降钙素原单域抗体在45℃下具有良好的储存稳定性，能够长时间储存。

3、诱导表达

（1）挑菌接入5 mL的液体LB培养基中，在37 ℃、200 rpm的条件下振荡培养约过夜。

（2）取上述菌液按1：100接入100 mL的液体LB培养基的发酵摇瓶，在37 ℃、200rpm的条件下振荡培养至OD600=0.6-1.0之间时（对数生长中后期），添加终浓度为0.5 mM的异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）溶液，在25 ℃、200 rpm的条件下振荡诱导9 h。

（3）诱导后的菌液放入4 ℃冰箱冷却，用离心机离心收集菌体，控制离心的温度为4℃、离心转速为4000 rpm、离心20 min，对所得菌体称重。

（4）取离心收集的菌体，加入菌体洗涤溶液：20 mM的Tris-HCl pH=8.0，震荡洗涤菌体两次，每次用量为50 mL，均在4 ℃、4000 rpm、20 min的条件离心，弃去上清，称量菌体。

（5）加入裂解菌体的裂解缓冲液：50 mM Tris-HCl pH=8.0、2 mM EDTA、100 mMNaCl、1 mM DTT、1 mM蛋白酶抑制剂PMSF，在100 mL的烧杯中配60 mL的裂解缓冲液，超声破碎。

（6）冰浴中用连续超声波破碎仪充分破碎菌体，使用1/2英寸标准探头，输出总功率70%，工作时间30 min，破5 s/停10 s，总时间1.5小时。时间可随超声菌体的量调整，超声会大量放热，期间需要注意换冰。

（7）在4 ℃、8000 rpm的条件下，离心30 min，收集包涵体和上清，以待检测。

（8）取未诱导、诱导、上清和包涵体分别煮沸上样，120 V、1.5 h，考马斯亮蓝染色，结果如图4所示。

从图4可以看到，在25℃的条件下，0.5 mM的IPTG成功的诱导降钙素原单域抗体的表达，并且降钙素原单域抗体大部分以包涵体的形式存在，少部分表达在上清中。

4、100 ℃条件下抗体的稳定性

（1）将本发明实施例得到的降钙素原单域抗体（共7个样品，每个样品上样量为2.5μg）加入上样缓冲液在100 ℃下分别加热，具体加热方式为金属浴，7个样品的加热时间分别为10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min、70 min，随后室温冷却2 min，加入上样缓冲液。

（2）按照上述加热时间进行加热后，各取10 μL（2.5 μg）的上样，SDS-PAGE后考马斯亮蓝染色，结果如图5所示。

（3）以鼠抗（IgG）、兔抗（IgG）为对照，并按照（1）-（2）进行操作，结果如图6和图7所示。

从图5可以看出，杂蛋白随着加热时间的延长，越来越少；而降钙素原单域抗体并没有减少，说明降钙素原单域抗体在100 ℃下具有良好的稳定性。

从图6可以看出，在100 ℃的条件下加热10 min后鼠抗内轻链和重链之间的二硫键完全打开，出现分子量约为27 KDa的轻链和55 KDa的重链，此时重链间的铰链区也开始断裂，分为约25 KDa和32 KDa的片段，随着加热时间的延长重链的铰链区断裂比例逐步增加；鼠抗的轻链含量有先增加，在加热40 min时达到最大值，随后逐渐减少；重链断裂后较小片段也有同样的趋势。

从图7可以看出，兔抗和鼠抗基本一致，但相对于鼠抗而言，兔抗的轻重链比较稳定。

综上可以看到，本发明实施例提供的降钙素原单域抗体在37 ℃和45 ℃下都具有良好的稳定性，可以稳定存在，因此，本发明实施例提供的降钙素原单域抗体在常温至较高温度（40 ℃左右）下可以长期保存，使得PCT抗体储存的难度大幅度降低，可有效地降低储存、运输的成本。

由于本发明的降钙素原单域抗体在常温至45 ℃之间均具有良好的储存稳定性，可以长期保存，因此，以本发明实施例提供的降钙素原单域抗体作为试剂盒的成分不仅可以帮助进行检测和诊断，还可以使得试剂盒可以在常温至45 ℃之间具有良好的储存稳定性，可以长期保存，且可以有效地降低试剂盒储存和运输的难度及成本。本发明实施例提供的降钙素原单域抗体，可以做成如下的试剂盒：作为细菌和非细菌感染诊断标准的试剂盒（如包括作为监测大手术和严重创伤患者细菌感染并发症的试剂盒、作为对白细胞减少症患者细菌感染诊断的试剂盒等）、作为严重脓毒症诊断及预后的试剂盒（如包括作为系统性细菌感染及脓毒症早期“预警”诊断的试剂盒、作为对系统性细菌感染及脓毒症治疗过程的监测及判断预后的试剂盒等）、作为严重多发伤并发症预测与辅助诊断的试剂盒（如包括作为监测多发性损伤病人感染的试剂盒等）、作为指导抗生素使用的试剂盒、作为对抗生素治疗效果监测的试剂盒、作为鉴别诊断肿瘤是否有继发感染的试剂盒、作为败血症诊断的试剂盒；作为不明原因发烧鉴别诊断的试剂盒、作为胆源性与细菌感染性胰腺炎鉴别诊断的试剂盒、作为对新生儿及儿童的细菌性与病毒性脑膜炎鉴别诊断的试剂盒、作为对急性器官排斥反应与移植后感染鉴别诊断的试剂盒、作为对伴有急性炎症性自身免疫疾病是否合并细菌感染鉴别诊断的试剂盒、作为对泌尿系统感染检测的试剂盒等。

具体地，本发明实施例提供的试剂盒中包含以下成分：本发明实施例提供的降钙素原单域抗体、校准品、固相载体、酶标记抗体（辣根过氧化物酶HRP酶标）、底物液、洗涤液及封板膜等。

三、降钙素原单域抗体的大规模获取

在上述第一点和第二点的基础上，需要再次获取本发明实施例的降钙素原单域抗体时，只需要将含有如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的降钙素原单域抗体在原核或真核细胞中进行表达和纯化，即可获得大规模的降钙素原单域抗体，具体在原核或真核细胞中的表达和纯化为基因工程领域的常规方法，为节约篇幅，在此不再展开赘述。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 深圳海创生物技术有限公司

<120> 降钙素原单域抗体及其应用和试剂盒

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 408

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aatattttct tgctttcgtg ccttttagcc tggttaccaa atgtctttac tcaacgggtt 60

gaacaaacac cgacaacgac aacaaaggag gcaggcgaat cactgaccat caattgcgtc 120

ctaaaaggtt ccagctatgc attgtgtaac acgtactggt ttgtcacaaa aaagggcgca 180

acaaagaagg agagcttaac aaatggcgga cgatactcag tcacaatgaa caaggcatca 240

aagtcctttt ctttgcgaat tagtgaccta agagttgaag acagtggtac atatcactgt 300

aaagcgtata tcagagctgg gggtccgtac tgtgggattt cggatgaagg aggcggcacc 360

attctgactg tgaaacctgg caaacaacct tctccaccag tcatcagt 408

<210> 2

<211> 136

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Asn Ile Phe Leu Leu Ser Cys Leu Leu Ala Trp Leu Pro Asn Val Phe

1 5 10 15

Thr Gln Arg Val Glu Gln Thr Pro Thr Thr Thr Thr Lys Glu Ala Gly

20 25 30

Glu Ser Leu Thr Ile Asn Cys Val Leu Lys Gly Ser Ser Tyr Ala Leu

35 40 45

Cys Asn Thr Tyr Trp Phe Val Thr Lys Lys Gly Ala Thr Lys Lys Glu

50 55 60

Ser Leu Thr Asn Gly Gly Arg Tyr Ser Val Thr Met Asn Lys Ala Ser

65 70 75 80

Lys Ser Phe Ser Leu Arg Ile Ser Asp Leu Arg Val Glu Asp Ser Gly

85 90 95

Thr Tyr His Cys Lys Ala Tyr Ile Arg Ala Gly Gly Pro Tyr Cys Gly

100 105 110

Ile Ser Asp Glu Gly Gly Gly Thr Ile Leu Thr Val Lys Pro Gly Lys

115 120 125

Gln Pro Ser Pro Pro Val Ile Ser

130 135

Claims (5)

1.一种降钙素原单域抗体，其特征在于，所述降钙素原单域抗体的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.如权利要求1所述的降钙素原单域抗体，其特征在于，所述降钙素原单域抗体的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。

3.如权利要求1或2任一项所述的降钙素原单域抗体在制备检测降钙素原的试剂盒中的应用。

4.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包含权利要求1或2中的降钙素原单域抗体。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：

（1）校准品；（2）固相载体；（3）酶标记抗体；（4）底物液；（5）洗涤液；（6）封板膜。

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