CN111909272B

CN111909272B - 抗pd-l1纳米抗体及其应用

Info

Publication number: CN111909272B
Application number: CN202010808068.8A
Authority: CN
Inventors: 郑文云; 刘秋丽; 马兴元
Original assignee: East China University of Science and Technology
Current assignee: East China University of Science and Technology
Priority date: 2020-08-12
Filing date: 2020-08-12
Publication date: 2022-09-23
Anticipated expiration: 2040-08-12
Also published as: CN111909272A

Abstract

本发明提供一种抗PD‑L1纳米抗体及其应用，所述抗体的序列包括FR区、CDR区以及HV区；所述FR区包括氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的FR1区、SEQ ID NO.2所示的FR2区、SEQ ID NO.3所示的FR3区和SEQ ID NO.4所示的FR4区；所述CDR区包括氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示的CDR1区和SEQ ID NO.8——SEQ ID NO.12任一所示的CDR3区；所述HV区包括氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示的HV2区和SEQ ID NO.7所示的HV4区。本发明基于新型鲨鱼V‑NAR框架序列所筛选的抗PD‑L1纳米抗体，具有优良的稳定性，可为新型抗肿瘤药物研发与获得提供新品种。

Description

抗PD-L1纳米抗体及其应用

技术领域

本发明涉及生物医学与分子生物学领域，尤其涉及基于构建的鲨鱼抗体可变区(V-NAR)噬菌体合成肽库筛选获得的抗PD-L1纳米抗体和应用。

背景技术

鲨鱼体内存在一类只含重链的抗体IgNAR，其可变区V-NAR是目前已知分子量最小的抗体片段，被称为纳米抗体。V-NAR具有亲和力高、稳定性强、可溶性好、易偶联改造和良好的组织渗透能力等优势，因而在生物医药行业具有广阔的应用前景。

噬菌体展示库是目前构建文库广泛应用的方法。虽然免疫文库的抗体靶特异性较高，但是其存在局限性。例如，不仅免疫时间过长，只针对单一的免疫抗原，而且对抗原的要求也苛刻。天然文库的多样性较为丰富，但其文库的抗体结合力较弱。然而，合成抗体库具有库容大、多样性丰富、可用于筛选多种抗原以及生产成本低等优势，是目前高亲和力抗体获得的主要来源，对于V-NAR类药物的研发有重要意义。

目前，免疫疗法已成为治疗癌症的有效手段之一，最常用的治疗方式为阻断程序性死亡配体-1(programmed cell death 1ligand,PD-L1)免疫检查点。已发现多种肿瘤细胞均过表达PD-L1，PD-L1可与T细胞表面的PD-1结合，从而抑制T细胞的活化增殖，最终导致肿瘤细胞免疫逃逸。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种抗PD-L1纳米抗体，基于鲨鱼抗体可变区(V-NAR)噬菌体的合成肽库筛选而得，与PD-L1特异性结合，可阻断PD-1与PD-L1的结合，并具有优良的稳定性。

为了实现上述目的，本发明提供了一种抗PD-L1纳米抗体，所述抗体的序列包括FR区、CDR区以及HV区；

所述FR区包括氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的FR1区、SEQ ID NO.2所示的FR2区、SEQ ID NO.3所示的FR3区和SEQ ID NO.4所示的FR4区；

所述CDR区包括氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示的CDR1区和SEQ ID NO.8——SEQID NO.12任一所示的CDR3区；

所述HV区包括氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示的HV2区和SEQ ID NO.7所示的HV4区。

作为一个优选方案，抗PD-L1纳米抗体，所述抗体的序列包括FR区、CDR区以及HV区；所述FR区包括氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的FR1区、SEQ ID NO.2所示的FR2区、SEQID NO.3所示的FR3区和SEQ ID NO.4所示的FR4区；所述CDR区包括氨基酸序列如SEQ IDNO.5所示的CDR1区和SEQ ID NO.8所示的CDR3区；所述HV区包括氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示的HV2区和SEQ ID NO.7所示的HV4区。

作为一个优选方案，抗PD-L1纳米抗体，所述抗体的序列包括FR区、CDR区以及HV区；所述FR区包括氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的FR1区、SEQ ID NO.2所示的FR2区、SEQID NO.3所示的FR3区和SEQ ID NO.4所示的FR4区；所述CDR区包括氨基酸序列如SEQ IDNO.5所示的CDR1区和SEQ ID NO.9所示的CDR3区；所述HV区包括氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示的HV2区和SEQ ID NO.7所示的HV4区。

作为一个优选方案，抗PD-L1纳米抗体，所述抗体的序列包括FR区、CDR区以及HV区；所述FR区包括氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的FR1区、SEQ ID NO.2所示的FR2区、SEQID NO.3所示的FR3区和SEQ ID NO.4所示的FR4区；所述CDR区包括氨基酸序列如SEQ IDNO.5所示的CDR1区和SEQ ID NO.10所示的CDR3区；所述HV区包括氨基酸序列如SEQ IDNO.6所示的HV2区和SEQ ID NO.7所示的HV4区。

作为一个优选方案，抗PD-L1纳米抗体，所述抗体的序列包括FR区、CDR区以及HV区；所述FR区包括氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的FR1区、SEQ ID NO.2所示的FR2区、SEQID NO.3所示的FR3区和SEQ ID NO.4所示的FR4区；所述CDR区包括氨基酸序列如SEQ IDNO.5所示的CDR1区和SEQ ID NO.11所示的CDR3区；所述HV区包括氨基酸序列如SEQ IDNO.6所示的HV2区和SEQ ID NO.7所示的HV4区。

作为一个优选方案，抗PD-L1纳米抗体，所述抗体的序列包括FR区、CDR区以及HV区；所述FR区包括氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的FR1区、SEQ ID NO.2所示的FR2区、SEQID NO.3所示的FR3区和SEQ ID NO.4所示的FR4区；所述CDR区包括氨基酸序列如SEQ IDNO.5所示的CDR1区和SEQ ID NO.12所示的CDR3区；所述HV区包括氨基酸序列如SEQ IDNO.6所示的HV2区和SEQ ID NO.7所示的HV4区。

本发明所述抗体包含一个或多个氨基酸置换、添加和/或缺失，或在非CDR区域内的残基中有一个或多个保守氨基酸置换。

在本发明的另一方面，提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸编码上述抗体。

在本发明的另一方面，提供了一种表达载体，所述表达载体含上述多核苷酸。

在本发明的另一方面，提供了一种抗体药物偶联物，所述抗体药物偶联物含有上述抗体。

在本发明的另一方面，提供了所述抗PD-L1纳米抗体的应用，用于制备检测PD-L1分子的试剂或者用于制备治疗肿瘤的药物。

为了构建多样性丰富、通用性好以及无抗原偏向性的高容量合成鲨鱼V-NAR噬菌体库，本发明通过设计一种新型鲨鱼V-NAR框架，以此框架为基础，并使用NNK的方法在CDR3区中引入突变，构建获得了库容为1.9×10⁹cfu的基于鲨鱼抗体IgNAR可变区(V-NAR)的合成噬菌体库，并且基因插入率100％，多样性丰富。此外，从噬菌体库中筛选获得PD-L1特异性纳米抗体，其均与PD-L1特异性结合，可阻断PD-1与PD-L1的结合，并具有优良的稳定性。所以，可证实所构建的V-NAR噬菌体库具有生物学活性，可作为其它抗原的通用筛选平台。

本发明的优点在于，本发明基于新型鲨鱼V-NAR框架序列所筛选的抗PD-L1纳米抗体，具有优良的稳定性，可为新型抗肿瘤药物研发与获得提供新品种。

附图说明

图1为新型V-NAR框架序列。

图2为PCR扩增V-NAR片段的DNA电泳图。

图3为ELISA初步鉴定PD-L1特异性纳米抗体。

图4为Anti-PD-L1纳米抗体经镍柱纯化后的SDS-PAGE图，其中泳道1为Nb-P1；泳道2为Nb-P2；泳道3为Nb-P3；泳道4为Nb-P4；泳道5为Nb-P5。

图5为Anti-PD-L1纳米抗体的体外热稳定性评价。

图6为Anti-PD-L1纳米抗体的体外亲和力评价。

图7为Anti-PD-L1纳米抗体的体外细胞荧光亲和力评价。

图8为Anti-PD-L1纳米抗体的体外流式亲和力评价。

图9为Circular dichroism检测Anti-PD-L1尿素稳定性。

图10为流式细胞术检测Anti-PD-L1-NbP3和P4阻断功能，A:Anti-PD-L1-NbP3阻断功能；B:Anti-PD-L1-NbP4阻断功能。

具体实施方式

以下，结合具体实施方式对本发明的技术进行详细描述。应当知道的是，以下具体实施方式仅用于帮助本领域技术人员理解本发明，而非对本发明的限制。

下面的实施例中所示实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1：新型V-NAR框架的设计

通过PDB(https://www.rcsb.org)和NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)数据库获取2YWZ_A、AAP86762、4HGK_C、AAN75852、AAM33845、Lep-12E1、ABY64741和Tom70等V-NAR纳米抗体氨基酸序列，并使用clustalw(https://www.ebi.ac.uk)和WebLogo(http://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi)分析V-NAR氨基酸序列。根据序列比对结果上骨架区相对应位置的氨基酸出现频率的高低，确定V-NAR框架4个FR区的氨基酸序列。对于V-NAR框架的CDR1、HV2和HV4区氨基酸序列，不仅要根据序列比对结果，还需参考已报道的V-NAR中有利于抗体稳定的特定位点氨基酸，最终确定V-NAR框架CDR1、HV2和HV4区的氨基酸序列。V-NAR的CDR3区是与抗原结合的关键部位，所以我们选择使用三种不同长度的CDR3(13、18和22个氨基酸)，并在每个位置引入“NNK”(N代表4种碱基，A、T、C和G，K代表2种碱基，T和G)随机化，增加文库多样性，从而提高合成文库的质量。利用ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)和CPHmodels 3.2Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/CPHmodels/)对这8种纳米抗体序列及设计的V-NAR框架序列进行一级以及高级结构预测，从而确定V-NAR框架序列(图1)。

实施例2：V-NAR噬菌体库的构建及评价

利用重叠延伸PCR扩增得到V-NAR全长基因片段，总共3轮PCR。第1轮PCR扩增获得FRl-FR3区DNA片段。第2轮PCR扩增获得CDR3-FR4区DNA片段，第3轮PCR扩增获得完整的V-NAR全抗体基因片段(图2)。随后将其和pCANTAB5E噬菌粒载体分别进行Sfi I和Not I内切酶酶切，以及连接且电转入大肠杆菌TG1。随后对利用2×TY培养基稀释V-NAR合成文库，按照10^-1、10^-2、10^-3到10^-8(10倍)梯度稀释，取100μL各个浓度的菌液涂布于含Amp的2×TY平板上，根据稀释倍数和相应平板上的单菌落数目，从而检测V-NAR的库容。随机挑取20个单克隆，进行菌液PCR以及测序，从而确定V-NAR目的基因插入率和多样性。V-NAR文库质量评价见表1，包括库容量、基因插入率以及基因多样性等。

表1.评价噬菌体文库的质量

实施例3：PD-L1特异性纳米抗体的筛选及初步鉴定

将PD-L1蛋白和BSA用NaHCO₃缓冲液稀释，浓度为100μg/mL，PD-L1蛋白为实验组，BSA为对照组。每孔加入150μL，设置3个复孔，4℃下过夜孵育。随后对反应孔用TBST(0.1％)缓冲液洗涤，并用3％脱脂牛奶在4℃下封闭2h。洗涤后加入100μL噬菌体库溶液，并在室温下孵育60min。接着用TBST缓冲液洗涤10遍后，将200μL洗脱液加至孔内，并在室温下孵育10min。孵育结束后，每孔再加入15μL中和缓冲液，即为第1轮筛选获得的阳性噬菌体，并进行滴度测定。利用2×TY培养基将其进行稀释，并侵染对数期TG1甘油菌，孵育30min。孵育后，分别取100μL菌液均匀涂布于含Kan的2×TY平板上，根据稀释倍数和单菌落数目计算文库的滴度。随后将其在大肠杆菌TG1中扩增，并用M13K07辅助噬菌体进行救援，进行下一轮筛选，共计4轮。

从第4轮筛选后洗脱噬菌体的平板上随机挑取60个单菌落，分别进行噬菌体扩增。使用NaHCO₃溶液将PD-L1蛋白和BSA稀释为100μg/mL，每孔加入150μL溶液，PD-L1蛋白为实验组，BSA为对照组，4℃，60rpm，过夜孵育。

TBST(0.1％)缓冲液洗涤后并加入5％脱脂奶粉封闭1h。将扩增后的噬菌体用TBST(0.1％)缓冲液稀释10倍。封闭结束后洗涤，并将100μL噬菌体库溶液加至孔内，37℃，孵育1h。孵育后用TBST(0.1％)缓冲液洗涤，并每孔加入200μL用5％的脱脂奶粉以1:5000的比例稀释的HRP标记的Anti-M13抗体，25℃，60rpm孵育60min。注意此过程需在避光下完成。将30％H₂O₂与ABTS溶液混合以配制成底物溶液。TBST(0.1％)缓冲液洗涤96孔板后，将100μLABTS底物溶液加入孔内进行显色，室温避光孵育10min。将100μL浓H₂SO₄加至每孔以终止反应，并检测在405nm处的吸光度。根据实验组和阴性对照组的吸光度比值确定阳性克隆(图3)，并将其于2×TY培养基中培养后测序。结果显示有5个CDR3区不同序列的Anti-PD-L1纳米抗体。FR1区序列如SEQ ID NO.1所示；FR2区序列如SEQ ID NO.2所示；FR3区序列如SEQID NO.3所示；FR4区序列如SEQ ID NO.4所示；CDR1区序列如SEQ ID NO.5所示；HV2区序列如SEQ ID NO.6所示；HV4区序列如SEQ ID NO.7所示；CDR3区DNA序列如SEQ ID NO.8或SEQID NO.9或SEQ ID NO.10或SEQ ID NO.11或SEQ ID NO.12所示。

SEQ ID NO.1：ARVDQTPRSVTKETGESLTINCVLR

SEQ ID NO.2：TCWYRKKSGSGGRYVETV

SEQ ID NO.3：FSLRINDLTVEDGGTYRCGV

SEQ ID NO.4：CGDGTAVTVNP

SEQ ID NO.5：DASYGLGS

SEQ ID NO.6：TNEESISK

SEQ ID NO.7：NSGSKS

SEQ ID NO.8：PVSFWGRVCAWWSLHCLRFLFG

SEQ ID NO.9：LGGPFGVRCAMYRWWCGLRRRT

SEQ ID NO.10：GTELRWFSCMWKMLLCVRGWLV

SEQ ID NO.11：GFWGCLVYLCRLF

SEQ ID NO.12：VVPLCMFVFCMLV。

实施例4：Anti-PD-L1纳米抗体的构建表达及纯化

利用PCR技术扩增获得Anti-PD-L1纳米抗体基因序列，并对其进行Nde I和Xho I双酶切，克隆至pET-24a(+)载体。随后将重组质粒转化如将表达质粒转化入表达菌株E.coli BL21(DE3)中；从转化的平板上挑选单菌落接种到含卡那抗性的5mL LB液体培养基中培养过夜，然后取1mL过夜培养的菌液转接到含卡那抗性的100mL LB液体培养基中，37℃，180rpm培养到菌液OD₆₀₀值在0.6左右；接着添加诱导剂IPTG至终浓度0.5mM,30℃诱导10小时；诱导表达结束后，9000rpm离心5分钟收集菌体；将菌体再次重悬于PBS缓冲液中，并利用低温高压细胞破碎仪破碎菌体，将破碎后的菌体4℃，9000rpm，20min，分别收集其上清以及沉淀；将沉淀重悬于PBS缓冲液中，并取适量上清和溶解后的沉淀跑SDS-PAGE用于验证PD-L1纳米抗体的表达形式；用包涵体洗涤液重悬沉淀并离心，重复3次；利用包涵体溶解液重悬沉淀，并进行镍柱纯化，每个纯化后的蛋白(图4)分装后-80℃保存。

实施例5：Anti-PD-L1纳米抗体的体外活性评价

(1)将PD-L1蛋白稀释为5μg/mL和10μg/mL，每孔加入量为150μL，包被于96孔板中，PD-L1蛋白为实验组，BSA为阴性对照组，同样进行稀释并包被，4℃，60rpm，过夜孵育。用TBST(0.1％)缓冲液洗涤3遍后，将200μL 3％脱脂奶粉加入每孔中进行封闭，并在4℃下孵育1h。将5株Anti-PD-L1纳米抗体用TBST(0.1％)缓冲液稀释为0.625μg/mL、1.25μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL和20μg/mL。封闭后用TBST(0.1％)缓冲液洗涤，并加入200μL各梯度浓度的纳米抗体，37℃，孵育1h。TBST(0.1％)缓冲液洗涤后，并添加200μL以1:5000的比例在3％脱脂奶粉中稀释的HRP标记的Anti-HA抗体。25℃，60rpm，孵育60min，注意此过程需在避光下完成。TBST(0.1％)缓冲液洗涤后，将100μL ABTS底物溶液加至孔内，25℃，60rpm，避光孵育10min进行显色。每孔加入100μL浓H₂SO₄终止显色，孵育5min后用酶标仪检测在405nm处的吸光度。通过通过抗原、抗体浓度以及405nm处的吸光度计算Anti-PD-L1纳米抗体的亲和力。

(2)将NbP1、NbP2、NbP3、NbP4、NbP5 5株Anti-PD-L1纳米抗体使用NaHCO3溶液稀释为100μg/mL。分别将每种纳米抗体于20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃和80℃下孵育10min，各温度下设置3个平行。结束后于4℃保存。经各温度处理后的纳米抗体与抗原的结合力同样利用上述间接ELISA检测(图5)。

表2：Anti-PD-L1纳米抗体的CDR3区基因和氨基酸序列

(3)利用PD-L1和PD-L2蛋白的同源性检测Anti-PD-L1纳米抗体的与PD-L1结合的特异性，方法同ELISA(图6)。

(4)将HepG2细胞以1×10⁵cell/mL的密度铺在共聚焦培养皿中，培养18h。设置空白组和实验组，空白组只加入1mL DMEM培养基；使用DMEM培养基将FITC标记的5株Anti-PD-L1纳米抗体稀释为50μg/mL，实验组加入1mL已配制的FITC标记的Anti-PD-L1纳米抗体溶液。置于培养箱共孵育6h。共孵育结束后，PBS溶液洗涤细胞并用4％多聚甲醛固定HepG2细胞，于培养箱中放置15min。弃去4％多聚甲醛并用PBS缓冲液清洗。将DiI染料加至培养皿，于培养箱中放置1h，进行细胞膜染色。弃去细胞膜染料并用PBS洗涤。再加入Hoechst33342染料，37℃下静置15min，对细胞核进行染色。弃去细胞核染料并洗涤，再加入1mL PBS缓冲液，于尼康共聚焦显微镜下观察Anti-PD-L1纳米抗体与细胞结合情况(图7)。

(5)将HepG2细胞以2×10⁵cell/mL的密度铺在六孔板中，培养18h。弃去培养基并清洗HepG2细胞。设置空白组和实验组，空白组只加入2mL DMEM培养基，实验组加入2mL含有FITC标记纳米抗体(50μg/mL)的DMEM培养基。于细胞培养箱中共孵育6h。共孵育结束后，用PBS缓冲液洗涤细胞并消化孔内细胞。随后再加入1mL DMEM培养基终止消化，吹打孔内细胞并转移至EP管，离心收集细胞。将细胞沉淀重悬于PBS中，并用流式细胞仪检测HepG2细胞荧光强度(图8)。Anti-PD-L1纳米抗体的体外活性评价见表3，包括亲和力、热稳定性以及特异性。

表3纳米抗体的体外亲和力活性评价

实施例6：Anti-PD-L1纳米抗体的尿素稳定性

将透析复性后的Anti-PD-L1纳米抗体使用鲨鱼血中的尿素溶液(21.6mg/mL)稀释为0.5mg/mL，设置4个时间梯度，0h、2h、4h和8h。在室温下，分别将纳米抗体放置不同的时间段后，利用圆二色谱仪检测纳米抗体结构变化(图9)。

实施例7：Anti-PD-L1纳米抗体的对PD-L1与PD-1相互作用的阻断作用

将HepG2细胞消化，以2×105cell/mL的密度铺在六孔板中，置于细胞培养箱中过夜培养。弃去培养基，并用PBS缓冲液洗涤细胞。空白组只加入2mL DMEM培养基，共计5个实验组，第一组只加入FITC标记的纳米抗体；第二组预先加入PD-1蛋白，孵育1h后再加入FITC标记的纳米抗体，PD-1与纳米抗体的摩尔比为5:1；第三组同时加入PD-1蛋白和FITC标记的纳米抗体，两者的摩尔比为5:1；第四组也是预先与PD-1孵育1h，随后再加入纳米抗体，两者的摩尔比为2:1；第五组同时加入PD-1与纳米抗体，摩尔比为2:1。最后置于培养箱共孵育6h。细胞孵育结束后，用PBS洗涤细胞，并用胰酶消化孔内细胞，1000rpm离心收集细胞。弃上清并用PBS缓冲液重悬细胞，再次离心收集细胞。将细胞沉淀重悬于0.5mL PBS中，并用流式细胞仪检测其荧光强度，以计算抗体的阻断作用(图10)。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 华东理工大学

<120> 抗PD-L1纳米抗体及其应用

<130> /

<160> 17

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Ala Arg Val Asp Gln Thr Pro Arg Ser Val Thr Lys Glu Thr Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Thr Ile Asn Cys Val Leu Arg

20 25

<210> 2

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Thr Cys Trp Tyr Arg Lys Lys Ser Gly Ser Gly Gly Arg Tyr Val Glu

1 5 10 15

Thr Val

<210> 3

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Phe Ser Leu Arg Ile Asn Asp Leu Thr Val Glu Asp Gly Gly Thr Tyr

1 5 10 15

Arg Cys Gly Val

20

<210> 4

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Cys Gly Asp Gly Thr Ala Val Thr Val Asn Pro

1 5 10

<210> 5

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Asp Ala Ser Tyr Gly Leu Gly Ser

1 5

<210> 6

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Thr Asn Glu Glu Ser Ile Ser Lys

1 5

<210> 7

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Asn Ser Gly Ser Lys Ser

1 5

<210> 8

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Pro Val Ser Phe Trp Gly Arg Val Cys Ala Trp Trp Ser Leu His Cys

1 5 10 15

Leu Arg Phe Leu Phe Gly

20

<210> 9

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Leu Gly Gly Pro Phe Gly Val Arg Cys Ala Met Tyr Arg Trp Trp Cys

1 5 10 15

Gly Leu Arg Arg Arg Thr

20

<210> 10

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Gly Thr Glu Leu Arg Trp Phe Ser Cys Met Trp Lys Met Leu Leu Cys

1 5 10 15

Val Arg Gly Trp Leu Val

20

<210> 11

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Gly Phe Trp Gly Cys Leu Val Tyr Leu Cys Arg Leu Phe

1 5 10

<210> 12

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

Val Val Pro Leu Cys Met Phe Val Phe Cys Met Leu Val

1 5 10

<210> 13

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

cctgttagtt tttggggtag ggtttgtgcg tggtggtctt tgcattgttt gaggtttttg 60

tttggg 66

<210> 14

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

cttggggggc cttttggggt gaggtgtgcg atgtataggt ggtggtgtgg gttgaggcgg 60

cgtact 66

<210> 15

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ggtacggagc ttcgttggtt ttcgtgtatg tggaagatgt tgttgtgtgt taggggttgg 60

ttggtg 66

<210> 16

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

ggtttttggg gttgtttggt ttatttgtgt aggcttttt 39

<210> 17

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

gttgtgccgt tgtgtatgtt tgttttttgt atgttggtt 39

Claims

1.抗PD-L1纳米抗体，其特征在于，所述抗体的序列如Anti-PD-L1-NbP1、Anti-PD-L1-NbP2、Anti-PD-L1-NbP3、Anti-PD-L1-NbP4和Anti-PD-L1-NbP5 任一所示，其中

Anti-PD-L1-NbP1：ARVDQTPRSVTKETGESLTINCVLRDASYGLGS TCWYRKKSGSTNEESISKGGRYVETVNSGSKSFSLRINDLTVEDGGTYRCGVPVSFWGRVCAWWSLHCLRFLFGCGDGTAVTVNP；

Anti-PD-L1-NbP2：ARVDQTPRSVTKETGESLTINCVLRDASYGLGS TCWYRKKSGSTNEESISKGGRYVETVNSGSKSFSLRINDLTVEDGGTYRCGV LGGPFGVRCAMYRWWCGLRRRTCGDGTAVTVNP；

Anti-PD-L1-NbP3：ARVDQTPRSVTKETGESLTINCVLRDASYGLGS TCWYRKKSGSTNEESISKGGRYVETVNSGSKSFSLRINDLTVEDGGTYRCGVGTELRWFSCMWKMLLCVRGWLVCGDGTAVTVNP；

Anti-PD-L1-NbP4：ARVDQTPRSVTKETGESLTINCVLRDASYGLGS TCWYRKKSGSTNEESISKGGRYVETVNSGSKSFSLRINDLTVEDGGTYRCGVGFWGCLVYLCRLFCGDGTAVTVNP；

Anti-PD-L1-NbP5：ARVDQTPRSVTKETGESLTINCVLRDASYGLGS TCWYRKKSGSTNEESISKGGRYVETVNSGSKSFSLRINDLTVEDGGTYRCGVVVPLCMFVFCMLVCGDGTAVTVNP。

2.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码权利要求1所述抗体。

3.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有权利要求2所述多核苷酸。

4.一种抗体药物偶联物，其特征在于，所述抗体药物偶联物含有权利要求1所述抗体。

5.权利要求1所述抗PD-L1纳米抗体的应用，其特征在于，用于制备检测PD-L1分子的试剂或者用于制备治疗肿瘤的药物。