CN116023482A

CN116023482A - 靶向冠状病毒的中和抗体、其抗原结合片段及其用途

Info

Publication number: CN116023482A
Application number: CN202211530475.2A
Authority: CN
Inventors: 王立燕; 刘婵娟; 郎国竣
Original assignee: Sanyou Biopharmaceuticals Co Ltd
Current assignee: Sanyou Biopharmaceuticals Co Ltd
Priority date: 2022-11-30
Filing date: 2022-11-30
Publication date: 2023-04-28

Abstract

本发明公开了一种靶向冠状病毒的中和抗体、其抗原结合片段及其用途。所述中和抗体或其抗原结合片段包含重链可变区。本发明的中和抗体或其抗原结合片段靶向冠状病毒抗原表位的保守氨基酸序列，对冠状病毒各变种均具有良好的结合活性，对病毒与ACE2的结合具有良好的阻断活性，同时具有显著的完全抑制率，为防治病毒感染提供了更多选择，具有重要的临床价值。

Description

靶向冠状病毒的中和抗体、其抗原结合片段及其用途

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种靶向冠状病毒的中和抗体、其抗原结合片段及其用途。

背景技术

研究显示新型冠状病毒(2019novel CoV(2019-nCoV))通过刺突蛋白(S蛋白)与宿主细胞上的受体血管紧张素转换酶Ⅱ(angiotensin converting enzymeⅡ，也称为ACE2)结合，介导病毒进入宿主细胞(Ashour HM等人，Insights into the Recent 2019NovelCoronavirus(SARS-CoV-2)in Light of Past Human Coronavirus Outbreaks，Pathogens，2020年3月4日；9(3).pii:E186.doi:10.3390/pathogens9030186；Roujian Lu等人，Genomic characterisation and epidemiology of 2019novel coronavirus:implications for virus origins and receptor binding，www.thelancet.com，2020年1月29日网上公开，https://doi.org/10.1016/S0140-6736(20)30251-8)，因此，本领域需要开发出针对冠状病毒S蛋白并且阻断其与宿主细胞上的ACE2受体结合的高亲和力中和抗体，来有效预防和治疗此类冠状病毒(例如，2019-n CoV、SARS-CoV)感染。

而现阶段面临的新问题是SARS-CoV-2(即2019-nCoV)在不断突变，因病毒突变带来的疫苗保护力下降或失效，以及单克隆抗体结合的病毒表位有限而导致突变体逃逸，失去中和效果。曾出现过的主流变异株包括Alpha、Belta、Delta，以及现在流行的Omicron，使得已获批紧急使用的大部分中和抗体已失效。因此，开发结合表位的氨基酸序列相对保守、且具有较好中和效果的抗体极为重要，此类抗体具有广泛的治疗及诊断价值。

发明内容

为了克服现有技术中缺少对冠状病毒及其变异株均具有良好中和效果的中和抗体，提供了一种靶向冠状病毒的中和抗体、其抗原结合片段及其用途。本发明的中和抗体或其抗原结合片段对冠状病毒各变种均具有良好的结合活性，同时具有显著的完全抑制率，为防治病毒感染提供了更多选择，具有重要的临床价值。

本发明通过以下技术方案解决上述技术问题。

本发明的第一方面提供一种靶向冠状病毒的中和抗体或其抗原结合片段，所述中和抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO:12、SEQ IDNO:13和SEQ ID NO:14所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或者，

所述重链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或者，

所述重链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10和SEQ IDNO:11所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或者，

所述重链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3。

本发明中，HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列采用AbM定义。

在本发明一些实施方案中，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示或与SEQ ID NO:19具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列相同性的氨基酸序列。

在本发明一些实施方案中，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示或与SEQ ID NO:17具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列相同性的氨基酸序列。

在本发明一些实施方案中，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示或与SEQ ID NO:18具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列相同性的氨基酸序列。

在本发明一些实施方案中，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示或与SEQ ID NO:16具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列相同性的氨基酸序列。

本发明中，所述抗体为纳米抗体、SdAb或HcAb。

在本发明一些实施方案中，当所述抗体为纳米抗体时，所述纳米抗体的重链恒定区源自人源抗体的重链或其变体。

在本发明一些具体实施方案中，所述重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示。

本发明的第二方面提供一种分离的核酸，所述核酸编码如第一方面所述的中和抗体或其抗原结合片段。

本发明的第三方面提供一种重组表达载体，所述重组表达载体包含如第二方面所述的核酸。

在本发明一些实施方案中，所述重组表达载体为质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体。

在本发明一些具体实施方案中，所述病毒载体为逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体或腺相关病毒载体。

本发明的第四方面提供一种转化体，所述转化体在宿主细胞中包含如第三方面所述的重组表达载体。

本发明中，所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞。

本文所使用的术语“宿主细胞”是指，可用于导入载体的细胞，其包括但不限于，如大肠杆菌等原核细胞，如酵母细胞等的真菌细胞，如S2果蝇细胞或Sf9等的昆虫细胞，或者如纤维原细胞、CHO细胞、COS细胞、NSO细胞、HeLa细胞、BHK细胞、HEK293细胞或人细胞等的动物细胞。

在本发明一些实施方案中，所述宿主细胞选自酵母细胞、哺乳动物细胞或适用于制备抗体或其抗原结合片段的其它细胞。

在本发明一些具体实施方案中，所述哺乳动物细胞例如为HEK293细胞。

本发明的第五方面提供一种制备靶向冠状病毒的中和抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括培养如第四方面所述的转化体，从培养物中获得靶向冠状病毒的中和抗体或其抗原结合片段。

本发明的第六方面提供一种药物组合物，所述药物组合物包含如第一方面所述的中和抗体或其抗原结合片段，以及药学上可接受的载体。

本发明的第七方面提供一种试剂盒，所述试剂盒包括如第一方面所述的中和抗体或其抗原结合片段、或者如第六方面所述的药物组合物。

在本发明一些实施方案中，所述试剂盒还包括检测所述中和抗体或其抗原结合片段与抗原结合的试剂。

本发明的第八方面提供一种如第一方面所述的中和抗体或其抗原结合片段、或者如第六方面所述的药物组合物在制备诊断、预防和/或治疗病毒感染的药物中的应用。

在本发明一些实施方案中，所述病毒感染为冠状病毒感染。

在本发明一些具体实施方案中，所述冠状病毒为SARS-CoV-2感染。

本发明的第九方面提供一种如第一方面所述的中和抗体或其抗原结合片段、或者如第六方面所述的药物组合物在诊断、预防和/或治疗病毒感染的应用。

在本发明一些实施方案中，所述病毒感染为冠状病毒感染。

定义

本文使用的术语“互补决定区”或“CDR区”或“CDR”是抗体可变结构域中在序列上高变并且形成在结构上确定的环(“超变环”)和/或含有抗原接触残基(“抗原接触点”)的区域。CDR主要负责与抗原表位结合，从N-端开始顺序编号依次包括CDR1、CDR2和CDR3。在一个给定的重链可变区氨基酸序列中，各CDR的精确氨基酸序列边界可以使用许多公知的抗体CDR指派系统的任一种或其组合确定。本领域人员公知，在本领域中可以通过多种方法来定义抗体的CDR，例如基于抗体的三维结构和CDR环的拓扑学的Chothia(Chothia等人.(1989)Nature 342:877-883，Al-Lazikani等人,Journal of Molecular Biology,273,927-948(1997))、基于抗体序列可变性的Kabat(Kabat等人,U.S.Department of Health andHuman Services,National Institutes of Health(1987))、AbM(University of Bath)，Contact(University College London)、国际ImMunoGeneTics database(IMGT)(万维网imgt.cines.fr/)，以及基于利用大量晶体结构的近邻传播聚类(affinity propagationclustering)的North CDR定义。本领域技术人员应当理解的是，除非另有规定，否则术语给定抗体或其区(例如可变区)的“CDR”及“互补决定区”应理解为涵盖如通过本发明描述的上述已知方案中的任何一种界定的互补决定区。

具有不同特异性(即，针对不同抗原的不同结合位点)的抗体具有不同的CDR。然而，尽管CDR在抗体与抗体之间是不同的，但是CDR内只有有限数量的氨基酸位置直接参与抗原结合。使用Kabat、Chothia、IMGT、AbM和Contact方法中的至少两种，可以确定最小重叠区域，从而提供用于抗原结合的“最小结合单位”。最小结合单位可以是CDR的一个子部分。正如本领域技术人员明了，通过抗体的结构和蛋白折叠，可以确定CDR序列其余部分的残基。因此，本发明也考虑本文所给出的任何CDR的变体。例如，在一个CDR的变体中，最小结合单位的氨基酸残基可以保持不变，而根据Kabat或Chothia或AbM定义的其余CDR残基可以被保守氨基酸残基替代。

如本文所用，氨基酸序列的“百分比(％)序列同一性”、“序列同一性”具有本领域公认的定义，其指通过序列比对(例如通过人工检视或可公知的算法)确定的两个多肽序列之间相同的百分比。可以使用本领域技术人员已知的方法确定，例如使用可公开获得的计算机软件如BLAST、BLAST-2、Clustal Omega和FASTA软件。

本发明中，除非上下文明确指出，否则当提及术语“抗体”时，其不仅包括完整抗体，而且包括抗体的抗原结合片段。

术语“单结构域抗体”简称单域抗体(single domain antibody，SdAb)，是含单个抗体重链可变区结构域的抗体。类似IgG抗体，它能够选择性结合特定的抗原，但单域抗体的分子量却远小于IgG抗体。

如本文所用，术语“重链抗体(heavy-chain antibody，HcAb)”是指不具有轻链的抗体，从N端到C端可以包含VH-CH2-CH3，或包含VH-CH1-CH2-CH3；可以构成同型二聚体，例如不具有轻链的重链二聚体抗体。

本文所使用的术语“分离的”指的是从天然状态下经人工手段获得的。如果自然界中出现某一种“分离的”物质或成分，那么可能是其所处的天然环境发生了改变，或从天然环境下分离出该物质，或二者情况均有发生。例如，某一活体动物体内天然存在某种未被分离的多聚核苷酸或多肽，而从这种天然状态下分离出来的高纯度的相同的多聚核苷酸或多肽即称之为“分离的”。术语“分离的”不排除混有人工或合成的物质，也不排除存在不影响物质活性的其它不纯物质。

如本发明所用，“载体”表示构建体，其能够将一种或多种所关注的基因或序列递送入宿主细胞并且优选在宿主细胞中表达所述基因或序列。载体的实例包括但不限于病毒载体、裸DNA或RNA表达载体、质粒、粘粒或噬菌体载体、与阳离子凝聚剂相关的DNA或RNA表达载体、包囊化于脂质体中的DNA或RNA表达载体以及某些真核细胞，例如生产细胞。

本文所使用的术语“宿主细胞”是指，可用于导入载体的细胞，其包括但不限于，如大肠杆菌等原核细胞，如酵母细胞等的真菌细胞，如S2果蝇细胞或Sf9等的昆虫细胞，或者如纤维原细胞，CHO细胞，COS细胞，NSO细胞，HeLa细胞，BHK细胞，HEK293细胞或人细胞等的动物细胞。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：

本发明的中和抗体或其抗原结合片段靶向冠状病毒抗原表位的保守氨基酸序列，对冠状病毒各变种均具有良好的结合活性，对病毒与ACE2的结合具有良好的阻断活性，同时具有显著的完全抑制率，为防治病毒感染提供了更多选择，具有重要的临床价值。

附图说明

图1显示了基于ELISA法检测得到的候选抗体与Omicron-RBD-His的结合活性。

图2显示了候选抗体阻断Omicron-S1D-mFc和ACE2结合的活性。

图3A-图3E显示了候选抗体与SARS-CoV-2及其突变株的S蛋白的结合活性；图3A显示了dAb-708与SARS-S1D-His的结合活性；图3B显示了dAb-708与Alpha-S1D-His的结合活性；图3C显示了dAb-708与Beta-S1D-His的结合活性；图3D显示了dAb-708与Delta-S1D-His的结合活性；图3E显示了dAb-708与Omicron-S1D-His的结合活性。

图4A-图4E显示了候选抗体阻断SARS-CoV-2及其突变株的S蛋白与ACE2结合的活性；图4A显示了dAb-708阻断SARS-S1D-His与人ACE2-huFc结合的活性；图4B显示了dAb-708阻断Alpha-S1D-His与人ACE2-huFc结合的活性；图4C显示了dAb-708阻断Beta-S1D-His与人ACE2-huFc结合的活性；图4D显示了dAb-708阻断Delta-S1D-His与人ACE2-huFc结合的活性；图4E显示了dAb-708阻断Omicron-S1D-His与人ACE2-huFc结合的活性。

图5显示了候选抗体对SARS-CoV-2突变株假病毒的中和活性。

图6显示了候选抗体的SDS-PAGE结果。

图7显示了候选抗体的SEC-HPLC结果。

具体实施方式

通过参考以下实施例将更容易地理解本文一般地描述的本发明，这些实施例是以举例说明的方式提供的，并且不旨在限制本发明的范围。这些实施例并不旨在表示下面的实验是全部或仅进行的实验。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

实施例1冠状病毒S蛋白抗原的制备和检测用ACE2的制备

实施例中共用到如下抗原和ACE2蛋白：S蛋白RBD-His(Arg319-Asn532)、S蛋白S1-huFc或S1-His(Gln14-Arg685)、Alpha突变株S1-His(Gln14-Arg685，含如下突变：HV69-70缺失、Y144缺失、N501Y、A570D、D614G)(以下简称Alpha-S1D-His)、Beta突变株S1-His(Gln14-Arg685，含如下突变：L18F、D80A、D215G、242-244缺失、R246I、K417N、E484K、N501Y、D614G)(以下简称Beta-S1D-His)、Delta突变株S1-His(Gln14-Arg685，含如下突变：T19R、G142D、EF156-157缺失、R158G、L452R、T478K、D614G)(以下简称Delta-S1D-His)、Omicron突变株S1-His(Gln14-Arg685，含如下突变：A67V、HV69-70缺失、T95I、G142D、VYY143-145缺失、N211缺失、L212I、插入214EPE、G339D、S371L、S373P、S375F、K417N、N440K、G446S、S477N、T478K、E484A、Q493R、G496S、Q498R、N501Y、Y505H、T547K、D614G、H655Y、N679K、P681H)(以下简称Omicron-S1D-His)、人ACE2-huFc(Gln18-Ser740)、Omicron突变株RBD-His或RBD-huFc(Arg319-Asn532，含如下突变：G339D、S371L、S373P、S375F、K417N、N440K、G446S、S477N、T478K、E484A、Q493R、G496S、Q498R、N501Y、Y505H)(以下简称Omicron-RBD-His或Omicron-RBD-huFc)、人ACE2-His(Gln18-Ser740)，S蛋白RBD-mFc(购自Sinobio，40592-V05H)，SARS-CoV病毒的S1-mFc(购自Sinobio，40150-V05H)(以下简称SARS-S1D-mFc)和RBD-mFc(购自Sinobio，40150-V05H1)(以下简称SARS-RBD-mFc)，其自制蛋白的具体制备方法如下。

1.1质粒构建

从NCBI获取各蛋白序列，其中人ACE2序列获自NCBI Gene ID:59272，S蛋白序列获自NCBI Gene ID:43740568，分别按照上述氨基酸片段位置获得各蛋白序列，转化成基因序列后由金斯瑞生物科技股份有限公司进行目的片段基因合成，对于突变株则基于已合成的S蛋白序列进行相应的点突变PCR扩增。PCR扩增各目的片段，然后通过同源重组的方法构建至真核表达载体pcDNA3.4(Invitrogen)，用于后续重组蛋白的表达。

1.2质粒制备

将构建好的各重组蛋白表达载体分别转化到大肠杆菌SS320中，37℃过夜培养，利用无内毒素质粒提取试剂盒(OMEGA，D6950-01)进行质粒提取，得到无内毒素的各质粒以供真核表达使用。

1.3蛋白的表达纯化

所有抗原蛋白均通过Expi293瞬转表达系统(ThermoFisher，A14635)表达，具体方法如下：

转染当天，确认细胞密度为4.5×10⁶-5.5×10⁶个活细胞/mL，细胞存活率>95％，此时用37℃预温的新鲜Expi293表达培养基将细胞调整到终浓度为3×10⁶个细胞/mL。用4℃预冷的Opti-MEMTM稀释目的质粒(1mL Opti-MEMTM中加入1μg质粒)，同时用Opti-MEMTM稀释ExpiFectamineTM293试剂，再将两者等体积混合并轻轻吹打混匀制备成ExpiFectamine^TM293试剂/质粒DNA混合液，室温孵育10-20min，缓慢加入到准备好的细胞悬液中，并同时轻轻摇晃，最后置于细胞培养摇床中，在37℃，8％ CO₂条件下培养。

在转染后18-22h内添加ExpiFectamineTM293 Transfection Enhancer 1和ExpiFectamineTM293Transfection Enhancer 2，摇瓶放置于32℃摇床和5％ CO₂条件下继续培养，在转染5-7天后，将细胞表达上清于15000g高速离心10min，所得Fc标签蛋白表达上清用MabSelect SuRe LX(GE，17547403)进行亲和纯化，然后用100mM乙酸钠(pH3.0)洗脱目的蛋白，接着用1M Tris-HCl中和；所得His标签蛋白表达上清用Ni Smart Beads 6FF(常州天地人和生物科技有限公司，SA036050)进行亲和纯化，然后用梯度浓度的咪唑洗脱目的蛋白。洗脱下来的各蛋白分别通过超滤浓缩管(Millipore，UFC901096)置换至PBS缓冲液中。经SDS-PAGE鉴定和活性鉴定合格后于-80℃冻存待用。

实施例2对照抗体制备

在本实施例中，使用的对照抗体为抗S蛋白Sotrovimab(VIR-7831/GSK4182136)单抗，由葛兰素史克(GSK)公司开发，是目前为数不多针对Omicron依然有中和活性的抗体，已被FDA获批为紧急使用(EUA)中和抗体，序列来自专利申请US20210371504A1(SEQ ID NO:1-2)。

抗体重链和轻链的DNA序列委托金唯智生物科技有限公司合成。PCR扩增各目的片段，然后通过同源重组的方法构建至真核表达载体pcDNA3.4(Invitrogen)。将构建好的重组蛋白表达载体转化到大肠杆菌DH5α中，37℃过夜培养，然后利用无内毒素质粒提取试剂盒(OMEGA，D6950-01)进行质粒提取，得到无内毒素的质粒以供真核表达使用。采用ExpiCHO瞬转表达系统(Thermo Fisher，A29133)表达(方法参见WO2020238730A1)。将细胞混悬液进行高速离心并收集上清，所得上清经0.22μm滤膜过滤后，采用Protein A/G柱进行亲和层析纯化。目的蛋白使用100mM甘氨酸盐酸(pH 3.0)进行洗脱，经浓缩，缓冲液置换，分装，SDS-PAGE鉴定和活性检测后入库冻存。

实施例3噬菌体展示文库的构建和筛选

在本实施例中，采用本司已构建及预制好的噬菌体展示文库进行抗体筛选，所使用文库dAb-15为人源化骨架纳米抗体库，库容为2.52×10¹¹。所使用的筛选路径包括：用SARS-CoV病毒的S1-mFc和Omicron-S1D-His筛选该文库。获得了特异性结合2019-nCoV冠状病毒S蛋白的抗体分子。

3.1噬菌体展示文库构建

dAb-15为人源化骨架纳米抗体库，基于全人源化的纳米抗体骨架，设计不同长度的随机化引物，分别扩增不同CDR区的基因片段，进行重组，构建人源化骨架纳米抗体库(文库构建方法参考专利CN112625136A中的实施例8.1)对3个CDR进行重组所获得全合成噬菌体展示抗体文库。通过梯度稀释铺板，测得此文库库容量为2.52×10¹¹，即2.52×10¹¹个抗体基因的抗体基因库(库容计算方法参考专利CN112250763B中的实施例2.2)。采用VSCM13辅助噬菌体(购自Stratagene)对其进行包装，获得了抗体基因噬菌体展示文库(抗体基因噬菌体展示文库的制备参考专利CN112250763B中的实施例2.3)。

3.2噬菌体展示文库的筛选

基于磁珠法和免疫管法，对上述文库进行筛选，采用S蛋白S1-huFc、S蛋白S1-his、SARS-S1D-mFc、Omicron-S1D-his、Omicron-RBD-huFc和Omicron-RBD-his筛选，筛选目的为获得结合序列较为保守且同时具有较好中和活性的抗体。

3.2.1磁珠法筛选抗体基因噬菌体展示文库

免疫管法筛选的原理是将S蛋白S1-his、SARS-S1D-mFc、Omicron-S1D-his和Omicron-RBD-his包被在具有高吸附力的免疫管表面，通过将噬菌体展示抗体文库加入免疫管中并和吸附于免疫管表面的抗原蛋白进行孵育、洗涤和洗脱的淘选过程，经历3轮淘选，最终将针对抗原的特异性单克隆抗体富集下来。

具体实施方法如下：

首先第一轮海选用生物素标记的S蛋白S1-huFc与链霉亲和素偶联的磁珠孵育，使得生物素标记的S蛋白S1-huFc蛋白结合到磁珠上。将结合S蛋白S1-huFc蛋白的磁珠和构建的噬菌体库室温下孵育2h。经PBST洗涤6-8次后，去除非特异性吸附的噬菌体，加入Trypsin(Gibco，25200072)轻轻混匀并反应20min，以洗脱特异性结合的抗体展示噬菌体。随后，用洗脱下来的噬菌体侵染对数期的SS320菌体(Lucigen，MC1061 F)并静置30min，然后在220rpm条件下培养1h，再加入VSCM13辅助噬菌体并静置30min，继续在220rpm条件下培养1h，离心并置换至C+/K+2-YT培养基中，最终得到的噬菌体继续用于下一轮的淘选。第二轮和第三轮海选分别用SARS-S1D-mFc、Omicron-S1D-his、Omicron-RBD-huFc和Omicron-RBD-his与链霉亲和素偶联的磁珠孵育，使得生物素标记的蛋白结合到磁珠上，参照第一轮海选的方案进行抗体库的富集。

3.2.2免疫管法筛选抗体基因噬菌体展示文库

具体实施方法如下：

第一轮筛选时，在免疫管中加入1mL 100μg/mL的S蛋白S1-his，4℃包被过夜，第二天弃去包被液，加入5％牛奶的PBS封闭2h，PBS润洗两次后加入构建的总量为200只羊驼的纳米抗体基因的噬菌体库，孵育2h，用PBST润洗8遍，然后用PBS润洗2遍，以去除非特异性结合的噬菌体，然后向免疫管中加入0.8mL 0.05％EDTA胰酶消化液，用于洗脱特异性结合目标抗原的噬菌体，接着将其侵染对数期的SS320菌体(Lucigen，60512-1)，37℃静置30min，然后220rpm条件下培养1h，再加入VSCM13辅助噬菌体，静置30min，继续在220rpm条件下培养1h，离心并置换至C+/K+2-YT培养基中，并于30℃，220rpm环境下继续培养过夜。第二天沉淀噬菌体，用于后续2-4轮的筛选。第二轮、第三轮噬菌体筛选包被的抗原为：S蛋白S1-his、SARS-S1D-mFc、Omicron-S1D-his和Omicron-RBD-his，抗原包被浓度依次递减，分别为20μg/mL、4μg/mL；除此之外，PBST润洗强度也逐渐加大，PBST洗脱次数依次为10次和14次。

采用酶联免疫吸附试验，包被S蛋白S1-his、SARS-S1D-mFc、Omicron-S1D-his、S蛋白RBD-his、SARS-RBD-mFc、Omicron-RBD-his对每轮洗脱下来的噬菌体池进行ELISA检测来评价富集的效果，并从每轮筛选的噬菌体池中随机挑选10个克隆进行序列分析。结果表明，第三轮筛选后抗体序列富集明显，每一轮都有更好的富集。因此，选择第二轮和第三轮所得的克隆进行ELISA的阳性克隆筛选。

3.3单克隆的挑选

在共三轮筛选后，选择第二轮和第三轮所得的克隆进行ELISA的阳性克隆ELISA筛选。经测序分析、ELISA结合检测后，选取了多个克隆的序列构建全长抗体(VHH-Fc)以进行进一步的实验。

根据筛选所得抗体和SARS-CoV病毒的S1-mFc及SARS-CoV-2S1-His的结合活性及序列的多样性，选择了4个抗体，所得抗体的CDR氨基酸序列见表1，采用AbM定义CDR的方式，确定CDR序列。

根据筛选所得抗体和SARS-S1D-mFc及S蛋白S1-His的结合活性及序列的多样性，选择了4个抗体，所得抗体的CDR氨基酸序列见表1，采用AbM定义CDR的方式，确定CDR序列。

表1

实施例4抗体的构建、表达和纯化

将实施例3中获得的抗体构建为人IgG1_LALA亚型(LALA为人IgG1 Fc的L234和L235位分别突变为A)，形成VHH-Fc_LALA，构建所得VHH-Fc_LALA抗体名称对应为dAb-552、dAb-84、dAb-267和dAb-708。

4.1质粒构建

从筛选获得的含有候选单克隆菌株中，PCR扩增获取抗体重链可变区片段。通过同源重组方法，构建至经过改造的含有人IgG1 Fc_LALA片段(SEQ ID NO:15)的真核表达载体质粒pcDNA3.4(Invitrogen)上，将构建好的抗体载体转化到大肠杆菌SS320中，37℃过夜培养。利用无内毒素质粒提取试剂盒(OMEGA，D6950-01)进行质粒提取，得到无内毒素的抗体质粒以供真核表达使用。

4.2抗体的表达和纯化

候选抗体通过ExpiCHO瞬转表达系统(Thermo Fisher，A29133)表达，具体方法如下：转染当天，确认细胞密度为7×10⁶至1×10⁷个活细胞/mL，细胞存活率>98％，此时，用37℃预温的新鲜ExpiCHO表达培养基将细胞调整到终浓度为6×10⁶个细胞/mL。用4℃预冷的OptiPRO^TM SFM稀释目的质粒(向1mL所述培养基中加入1μg质粒)，同时，用OptiPRO^TMSFM稀释ExpiFectamine^TMCHO，再将两者等体积混合并轻轻吹打混匀制备成ExpiFectamine^TMCHO/质粒DNA混合液，室温孵育1-5min，缓慢加入到准备好的细胞悬液中，并同时轻轻摇晃，最后置于细胞培养摇床中，在37℃、8％ CO₂条件下培养。

在转染后18-22h，向培养液中添加ExpiCHO^TMEnhancer和ExpiCHO^TMFeed，摇瓶放置于32℃摇床和5％ CO₂条件下继续培养。在转染后的第5天，添加相同体积的ExpiCHO^TMFeed，缓慢加入的同时轻轻混匀细胞混悬液。在转染7-15天后，将表达有目的蛋白的细胞培养上清于15000g高速离心10min，所得上清用MabSelect SuRe LX(GE，17547403)进行亲和纯化，然后用100mM乙酸钠(pH 3.0)洗脱目的蛋白，接着用1M Tris-HCl中和，最后通过超滤浓缩管(Millipore，UFC901096)将所得蛋白置换至PBS缓冲液中。

实施例5基于ELISA方法检测候选抗体的亲和活性

本实施例基于ELISA方法检测了候选抗体对Omicron突变株的S蛋白的结合活性，具体方法如下：

在96孔ELISA板上，包被Omicron-RBD-His(2μg/mL、30μL/孔)，4℃过夜。次日，将孔板用PBST洗3次后用5％脱脂牛奶封闭2h，用PBST洗板3次后，加入梯度稀释的待测抗体，并孵育1h。之后，用PBST清洗3次后加入二抗(Anti-human-IgG-Fc-HRP，abcam，ab97225)并孵育1h。孵育完成后，PBST洗板六次，加TMB(SurModics，TMBS-1000-01)显色。根据显色结果，加入2M HCl终止反应，通过酶标仪(Molecular Devices，SpecterMax 190)在OD₄₅₀下读板。

结果显示在图1中，所有抗体均与Omicron-RBD-His蛋白有不同程度的亲和活性，其中dAb-267和dAb-552显示了良好的对Omicron-RBD-His蛋白的结合活性，dAb-708的结合活性较弱。

实施例6基于ELISA方法检测候选抗体的阻断活性

本实施例基于ELISA方法检测了候选抗体阻断Omicron-S1D-mFc和ACE2结合的活性。

具体试验方法如下：用人ACE2-huFc蛋白，4μg/mL，30μL/孔，4℃过夜包被96孔板。次日，将96孔板用PBST洗3次后用5％脱脂牛奶封闭2h。然后将候选抗体梯度稀释，并与生物素标记的Omicron-S1D-mFc提前预混1.0h，在封闭完成并洗板结束后转移至96孔ELISA板中，孵育1h。用PBST清洗3次后加入100μL/孔1:5000稀释的第二抗体NeutrAvidin-HRP(Thermofisher，31001)并孵育1h。孵育完成后，PBST洗板六次，加入TMB(SurModics，TMBS-1000-01)显色，根据显色结果，加入2M HCl终止反应，通过酶标仪(Molecular Devices，SpecterMax 190)在OD₄₅₀下读板。

结果如图2所示，dAb-708、dAb-84和dAb-267显示了完全阻断ACE2-Omicron-S1D-mFc结合活性。

实施例7候选抗体对SARS-CoV-2突变株S蛋白的结合活性检测

本实施例中选择了dAb-708分子，检测了其对SARS-CoV-2S蛋白、Alpha、Beta、Delta、Omicorn突变株S1蛋白的结合及阻断活性，以Sotrovimab作为对照抗体。该方法基于包被一定浓度抗体，用梯度稀释的抗原(S蛋白S1-His、Alpha-S1D-His、Beta-S1D-His、Delta-S1D-His或Omicro-S1D-His)与抗体进行结合并检测相应的信号值，详细的ELISA方法如下。

在96孔ELISA板上，包被各抗体蛋白(4μg/mL、30μL/孔)，4℃过夜，其中包被对照抗体Sotrovimab作为阳性对照。次日，将孔板用PBST洗3次后用5％脱脂牛奶封闭2h，用PBST洗板3次后，分别加入梯度稀释的各蛋白并孵育1h。然后用PBST清洗3次后加入二抗(Anti-6*his-HRP，Proteintech，HRP-66005)并孵育1h。孵育完成后，PBST洗板六次，加TMB(SurModics，TMBS-1000-01)显色。根据显色结果，加入2M HCl终止反应，通过酶标仪(Molecular Devices，SpecterMax 190)在OD₄₅₀下读板。

结果显示在图3A-3E中，结果显示，dAb-708和对照抗体Sotrovimab与各种突变株蛋白均具有结合活性，并且dAb-708与S蛋白S1-His和Beta-S1D-His的结合活性与阳性对照抗体相当，与Omicro-S1D-His的结合活性优于阳性对照抗体。

实施例8候选抗体对SARS-CoV-2突变株S蛋白的阻断活性检测

因SARS-CoV-2及其突变株、SARS-CoV的主要受体均为ACE2，因此阻断活性检测方法参考实施例6，检测了候选分子dAb-708和对照抗体Sotrovimab阻断不同突变株S蛋白和ACE2的结合活性。

结果如图4A-图4E所示，由结果可知，对照抗体Sotrovimab对SARS-CoV-2及其突变株的阻断活性均很弱，预示其结合表位非受配体结合的关键表位。其中，候选分子dAb-708显示了极好的阻断活性，包括对SARS-CoV-2及其突变株Omicron、Delta、Alpha、Beta的S蛋白-ACE2结合。

实施例9候选抗体对SARS-CoV-2突变株假病毒中和活性检测

本实施例中检测了抗体dAb-708和对照抗体Sotrovimab中和Omicron突变株假病毒的活性。假病毒为病毒衣壳上融合有SARS-CoV-2S蛋白的慢病毒，当病毒通过S蛋白与细胞膜表面的受体ACE2结合后进行膜融合并进入细胞，在细胞内启动病毒带有的荧光素酶报告基因表达，在加入荧光素酶底物后可产生荧光，荧光素酶的表达量越高，催化底物产生的荧光越强。因此，当梯度稀释的抗体结合S蛋白，且抗体可以阻断S蛋白和ACE2结合时，可不同程度阻断病毒侵染细胞，具体实施操作如下：

收集指数生长期的AEC2-HEK293细胞，离心去上清，用工作培养基(DMEM+10％FBS)重悬后计数，将细胞密度调整为2×10⁵个/mL，吸取50μL细胞加入到96孔白边底透明细胞培养板中，置于37度培养箱中培养过夜(16～20h)。其中ACE2-HEK293细胞是在HEK293细胞通过将含有ACE2的质粒进行电转，而最终获得的在细胞膜上可表达ACE2蛋白的稳转细胞株，可用于细胞水平的结合阻断以及功能测定。使用工作培养基(DMEM+10％ FBS)为稀释液，将所有测试抗体在96孔板进行梯度稀释，并将稀释后的抗体与一定量Omicron假病毒(Genomeditech，GM-47297LV-R20)孵育15min，将孵育后的抗体和假病毒混合物加入细胞中，50μL/孔。轻轻拍打混匀，将细胞培养板放入37℃细胞培养箱孵育72h。将细胞板置于室温平衡20min，将bright-lite(Vazyme，DD1204-03)提前置于室温融化，每孔加50μLbright-lite，混匀并使用酶标仪震荡5min使其充分反应。使用SpectraMax i3X酶标仪检测信号，并进行结果记录。

结果如图5所示，dAb-708的中和活性优于阳性对照抗体Sotrovimab，IC₅₀分别为0.0085μg/mL和0.9895μg/mL。

实施例10候选抗体结合SARS-CoV-2突变株S蛋白的亲和力常数检测

在本实施例中，通过Fortebio方法检测了候选抗体dAb-708和对照抗体Sotrovimab与SARS-CoV-2S蛋白及其突变株S蛋白的亲和力常数。

材料准备：称取10g的BSA，量取5mL的Tween 20，加入到1000mL的10×PBS，混匀，制成10×KB缓冲液。过滤后分装保存。吸取0.1mL 0.1M且pH＝2.0的甘氨酸溶液加入至0.9mL的超纯水中，混匀，制成传感器再生缓冲液。作为抗原的S蛋白RBD-His以10×KB稀释成10μg/mL，抗体以10×KB稀释成系列浓度梯度，依次为200、66.6、22.2、7.41、0nM。

实验流程：避光条件下，采用10×KB缓冲液预湿传感器(Anti-Penta-HIS，HIS1K，Fortebio，CA)，至少10min后开始测试样品板(GreinierBio，PN655209)，测试无误后按预设程序进行。首先采用Protein A传感器抓取抗体，抗体浓度为30nM，孵育120s，在10×KB缓冲液中平衡60s后，将结合有抗体的传感器转移至不同浓度抗原稀释液中结合120s，抗原包括SARS-S1D-His蛋白、Omicorn-S1D-His蛋白、Delta-S1D-His蛋白和Beta-S1D-His蛋白(浓度设置为300nM起始，2倍梯度稀释，最低浓度为18.8nM)，待结合信号稳定后，再转移到10×KB缓冲液中，解离时间为180s，最后通过不同浓度抗原的结合解离数据，取其中3个数据稳定的点，拟合得到KD、Kon和Koff。

结果分析：结果显示在表2中，抗体dAb-708对各种突变株的S1蛋白均显示结合活性(“N/A”数据不可获得，“WB”弱结合)。对照抗体Sotrovimab与各种突变株的S1蛋白的结合亲和力均与抗体dAb-708相当。

表2.BLI测定抗体对SARS-CoV-2S蛋白及其突变株S蛋白的亲和力

实施例11候选抗体的理化性质检测

在本实施例中，用SDS-PAGE、SEC-HPLC检测候选抗体的纯度。

11.1候选抗体SDS-PAGE鉴定

非还原溶液制备：候选抗体以及质控品IPI(所述IPI是伊匹木单抗(Ipilimumab)的缩写，通过实施例4的方法制备获得)1μg加入5×SDS上样缓冲液和40mM碘代乙酰胺，75℃干浴加热10min，冷却到室温后，12000rpm离心5min，取上清。还原溶液制备：候选纳米抗体以及质控品IPI 2μg加入5×SDS上样缓冲液和5mM DTT，100℃干浴加热10min，冷却到室温后，12000rpm离心5min，取上清。将上清加入Bis-tris 4-15％梯度胶(购于金斯瑞)，恒压110V电泳，当考马斯亮蓝迁移到凝胶底部，停止运行，取出凝胶片置考马斯亮蓝染色液中1-2h，弃去染色液，加入脱色液，根据需要更换2-3次脱色液，脱色至凝胶背景透明后保存在去离子水中。脱色后用EPSON V550彩色扫描仪扫描，通过Image J按照峰面积归一法计算还原和非还原条带纯度。

结果如图6所示，抗体dAb-708和质控品IPI非还原胶的条带分别在80KD和150kD左右，dAb-708和还原胶的条带在40KD左右，质控品IPI还原交代分别是55kD左右和25kD左右，符合预期大小，且纯度均大于95％。

11.2候选抗体的SEC-HPLC单体纯度鉴定

材料准备：1、流动相：150mmol/L磷酸缓冲液，pH 7.4；2、样品制备：候选纳米抗体以及质控品IPI均用流动相溶液稀释到0.5mg/mL。Agilent HPLC 1100色谱柱(XBridge BEHSEC 3.5μm，7.8mm I.D.×30cm，Waters)流速设为0.8mL/min，进样体积20μL，VWD检测器波长为280nm和214nm。依次进样空白溶液、IPI质控品溶液和样品溶液。

按照面积归一法计算样品中高分子聚合物、抗体单体和低分子物质百分比，结果如图7所示，dAb-708单体纯度为98％。

序列表

Claims

1.一种靶向冠状病毒的中和抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述中和抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13和SEQID NO:14所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或者，

所述重链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或者，

所述重链可变区包含氨基酸序列分别如EQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3。

2.如权利要求1所述的中和抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示或与SEQ ID NO:19具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列相同性；或者，

所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示或与SEQ ID NO:17具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列相同性；或者，

所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示或与SEQ ID NO:18具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列相同性；或者，

所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示或与SEQ ID NO:16具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列相同性。

3.如权利要求1或2所述的中和抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体为纳米抗体、SdAb或HcAb；

较佳地，所述抗体还包括恒定区；所述恒定区优选地为人源抗体的Fc区或其变体；

更佳地，所述恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示或与SEQ ID NO:15具有至少80％序列相同性。

4.一种分离的核酸，其特征在于，所述核酸编码如权利要求1～3任一项所述的中和抗体或其抗原结合片段。

5.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含如权利要求4所述的核酸；

较佳地，所述重组表达载体为质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体；

更佳地，所述病毒载体为逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体或腺相关病毒载体。

6.一种转化体，其特征在于，所述转化体在宿主细胞中包含如权利要求5所述的重组表达载体；

较佳地，所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞；

更佳地，所述宿主细胞选自酵母细胞、哺乳动物细胞或适用于制备抗体或其抗原结合片段的其它细胞；所述哺乳动物细胞例如为HEK293细胞。

7.一种制备靶向冠状病毒的中和抗体或其抗原结合片段的方法，其特征在于，所述方法包括培养如权利要求6所述的转化体，从培养物中获得靶向冠状病毒的中和抗体或其抗原结合片段。

8.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含如权利要求1～3任一项所述的中和抗体或其抗原结合片段，以及药学上可接受的载体。

9.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1～3任一项所述的中和抗体或其抗原结合片段、或者如权利要求8所述的药物组合物；

较佳地，所述试剂盒还包括检测所述中和抗体或其抗原结合片段与抗原结合的试剂。

10.一种如权利要求1～3任一项所述的中和抗体或其抗原结合片段、或者如权利要求8所述的药物组合物在制备诊断、预防和/或治疗病毒感染的药物中的应用；

较佳地，所述病毒感染为冠状病毒感染；

更佳地，所述冠状病毒为SARS-CoV-2感染。