CN116253796A - 靶向冠状病毒的中和抗体、其抗原结合片段及其用途 - Google Patents
靶向冠状病毒的中和抗体、其抗原结合片段及其用途 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116253796A CN116253796A CN202211153812.0A CN202211153812A CN116253796A CN 116253796 A CN116253796 A CN 116253796A CN 202211153812 A CN202211153812 A CN 202211153812A CN 116253796 A CN116253796 A CN 116253796A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- seq
- variable region
- chain variable
- amino acid
- acid sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 230000027455 binding Effects 0.000 title claims abstract description 94
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims abstract description 49
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims abstract description 49
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title claims abstract description 48
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 title claims abstract description 41
- 239000012634 fragment Substances 0.000 title claims abstract description 36
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 title claims abstract description 24
- 230000008685 targeting Effects 0.000 title claims description 9
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 137
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 claims abstract description 8
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 66
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 46
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 42
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 22
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 14
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 14
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 11
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 claims description 7
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 6
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 6
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 6
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 claims description 6
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 claims description 5
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 3
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 3
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 208000025721 COVID-19 Diseases 0.000 claims description 2
- 208000001528 Coronaviridae Infections Diseases 0.000 claims description 2
- 208000037847 SARS-CoV-2-infection Diseases 0.000 claims description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 2
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 abstract description 17
- 102000053723 Angiotensin-converting enzyme 2 Human genes 0.000 abstract description 11
- 108090000975 Angiotensin-converting enzyme 2 Proteins 0.000 abstract description 11
- 241000700605 Viruses Species 0.000 abstract description 9
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 abstract description 4
- 102100031673 Corneodesmosin Human genes 0.000 description 40
- 101710139375 Corneodesmosin Proteins 0.000 description 40
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 39
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 27
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 24
- 102100035360 Cerebellar degeneration-related antigen 1 Human genes 0.000 description 20
- 102100030988 Angiotensin-converting enzyme Human genes 0.000 description 16
- 241001678559 COVID-19 virus Species 0.000 description 16
- 101710185050 Angiotensin-converting enzyme Proteins 0.000 description 14
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 14
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 12
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 11
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 11
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 10
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 8
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 7
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 7
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 6
- 241001112090 Pseudovirus Species 0.000 description 6
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 6
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 6
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 6
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 6
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 6
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 6
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- 101000773743 Homo sapiens Angiotensin-converting enzyme Proteins 0.000 description 5
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 5
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 5
- 102000056252 human ACE Human genes 0.000 description 5
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 5
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- 101000629318 Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 Spike glycoprotein Proteins 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 3
- 241000315672 SARS coronavirus Species 0.000 description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 3
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 3
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 3
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 238000003998 size exclusion chromatography high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 3
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- UUUHXMGGBIUAPW-UHFFFAOYSA-N 1-[1-[2-[[5-amino-2-[[1-[5-(diaminomethylideneamino)-2-[[1-[3-(1h-indol-3-yl)-2-[(5-oxopyrrolidine-2-carbonyl)amino]propanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]pentanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-methylpentanoyl]pyrrolidine-2-carbon Chemical compound C1CCC(C(=O)N2C(CCC2)C(O)=O)N1C(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C1CCCN1C(=O)C(CCCN=C(N)N)NC(=O)C1CCCN1C(=O)C(CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)C1CCC(=O)N1 UUUHXMGGBIUAPW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 2
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 2
- 239000012515 MabSelect SuRe Substances 0.000 description 2
- 101001028244 Onchocerca volvulus Fatty-acid and retinol-binding protein 1 Proteins 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 108090000882 Peptidyl-Dipeptidase A Proteins 0.000 description 2
- 201000003176 Severe Acute Respiratory Syndrome Diseases 0.000 description 2
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 2
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 229960005386 ipilimumab Drugs 0.000 description 2
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 2
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 2
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 2
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 2
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 2
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 2
- 239000012192 staining solution Substances 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- HBZBAMXERPYTFS-SECBINFHSA-N (4S)-2-(6,7-dihydro-5H-pyrrolo[3,2-f][1,3]benzothiazol-2-yl)-4,5-dihydro-1,3-thiazole-4-carboxylic acid Chemical compound OC(=O)[C@H]1CSC(=N1)c1nc2cc3CCNc3cc2s1 HBZBAMXERPYTFS-SECBINFHSA-N 0.000 description 1
- IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetic acid;hydron;chloride Chemical compound Cl.NCC(O)=O IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 description 1
- 102220570672 E3 ubiquitin-protein ligase MYLIP_T19D_mutation Human genes 0.000 description 1
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 description 1
- 108091006020 Fc-tagged proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101000929928 Homo sapiens Angiotensin-converting enzyme 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000878605 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin epsilon Fc receptor Proteins 0.000 description 1
- 244000309467 Human Coronavirus Species 0.000 description 1
- 102100038007 Low affinity immunoglobulin epsilon Fc receptor Human genes 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091061960 Naked DNA Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 101710198474 Spike protein Proteins 0.000 description 1
- 239000002390 adhesive tape Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N bis-tris Chemical compound OCCN(CCO)C(CO)(CO)CO OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012490 blank solution Substances 0.000 description 1
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000701 coagulant Substances 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000004042 decolorization Methods 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 229960002449 glycine Drugs 0.000 description 1
- 229960001269 glycine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011544 gradient gel Substances 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 102000048657 human ACE2 Human genes 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002998 immunogenetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N iodoacetamide Chemical compound NC(=O)CI PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 230000012846 protein folding Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 239000012557 regeneration buffer Substances 0.000 description 1
- 102220061025 rs786202340 Human genes 0.000 description 1
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000008478 viral entry into host cell Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0681—Cells of the genital tract; Non-germinal cells from gonads
- C12N5/0682—Cells of the female genital tract, e.g. endometrium; Non-germinal cells from ovaries, e.g. ovarian follicle cells
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56983—Viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/10—Plasmid DNA
- C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
- C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
- G01N2333/08—RNA viruses
- G01N2333/165—Coronaviridae, e.g. avian infectious bronchitis virus
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Hematology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Oncology (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
Abstract
本发明公开了一种靶向冠状病毒的中和抗体、其抗原结合片段及其用途。所述中和抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区。本发明的中和抗体或其抗原结合片段靶向冠状病毒抗原表位的保守氨基酸序列,对冠状病毒各变种均具有良好的结合活性,对病毒与ACE2的结合具有良好的阻断活性,同时具有显著的完全抑制率,为防治病毒感染提供了更多选择,具有重要的临床价值。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域,具体涉及一种靶向冠状病毒的中和抗体、其抗原结合片段及其用途。
背景技术
研究显示,新型冠状病毒通过刺突蛋白(S蛋白)与宿主细胞上的受体血管紧张素转换酶Ⅱ(angiotensin converting enzymeⅡ,也称为ACE2)结合,介导病毒进入宿主细胞(Ashour HM等人,Insights into the Recent 2019 Novel Coronavirus(SARS-CoV-2)inLight of Past Human Coronavirus Outbreaks,Pathogens,2020年3月4日;9(3).pii:E186.;Roujian Lu等人,Genomic characterisation and epidemiology of 2019 novelcoronavirus:implications for virus origins and receptor binding,www.thelancet.com,2020年1月29日网上公开,https://doi.org/10.1016/S0140-6736(20)30251-8),因此,本领域需要开发出针对冠状病毒S蛋白并且阻断其与宿主细胞上的ACE2受体结合的高亲和力中和抗体,来有效预防和治疗此类冠状病毒(例如,2019-n CoV、SARS-CoV)感染。
而现阶段面临的新问题是SARS-CoV-2(即2019-nCoV)在不断突变,因病毒突变带来的疫苗保护力下降或失效,以及单克隆抗体结合的病毒表位有限而导致突变体逃逸,失去中和效果。曾出现过的主流变异株包括Alpha、Belta、Delta,以及现在流行的Omicron,使得已获批紧急使用的大部分中和抗体已失效。因此,开发结合表位的氨基酸序列相对保守、且具有较好中和效果的抗体极为重要,此类抗体具有广泛的治疗及诊断价值。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是为了克服现有技术中缺少对冠状病毒及其变异株均具有良好中和效果的中和抗体,提供了一种靶向冠状病毒的中和抗体、其抗原结合片段及其用途。本发明的中和抗体或其抗原结合片段对冠状病毒各变种均具有良好的结合活性,同时具有显著的完全抑制率,为防治病毒感染提供了更多选择,具有重要的临床价值。
本发明通过以下技术方案解决上述技术问题。
本发明的第一方面提供一种靶向冠状病毒的中和抗体或其抗原结合片段,所述中和抗体包含重链可变区和轻链可变区,所述重链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3;所述轻链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3;或者,
所述重链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10和SEQ IDNO:11所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3;所述轻链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:13所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3;或者,
所述重链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15和SEQ IDNO:16所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3;所述轻链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3;或者,
所述重链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:15和SEQ IDNO:21所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3;所述轻链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3;或者,
所述重链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:15和SEQ IDNO:25所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3;所述轻链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3;或者,
所述重链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:15和SEQ IDNO:29所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3;所述轻链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3;或者,
所述重链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:33所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3;所述轻链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO:34、SEQID NO:7和SEQ ID NO:35所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3;或者,
所述重链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:15和SEQ IDNO:36所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3;所述轻链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:39所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3;或者,
所述重链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:40和SEQ IDNO:41所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3;所述轻链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3;或者,
所述重链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43和SEQ IDNO:44所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3;所述轻链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:45所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3;或者,
所述重链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:46所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3;所述轻链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO:47、SEQID NO:48和SEQ ID NO:49所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3;或者,
所述重链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:50所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3;所述轻链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO:51、SEQID NO:52和SEQ ID NO:53所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3;或者,
所述重链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:15和SEQ IDNO:54所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3;所述轻链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:57所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3;或者,
所述重链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:58和SEQ IDNO:59所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3;所述轻链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61和SEQ ID NO:62所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3;或者,
所述重链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:58和SEQ IDNO:59所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3;所述轻链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64和SEQ ID NO:65所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
本发明中,HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列采用AbM定义。
在本发明一些实施方案中,所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:68所示或与SEQ ID NO:68具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列相同性的氨基酸序列,所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:69所示或与SEQ ID NO:69具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列相同性的氨基酸序列。
在本发明一些实施方案中,所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:70所示或与SEQ ID NO:70具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列相同性的氨基酸序列,所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:71所示;或者或与SEQ ID NO:71具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列相同性的氨基酸序列。
在本发明一些实施方案中,所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:72所示或与SEQ ID NO:72具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列相同性的氨基酸序列,所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:73所示或与SEQ ID NO:73具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列相同性的氨基酸序列。
在本发明一些实施方案中,所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:74所示或与SEQ ID NO:74具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列相同性的氨基酸序列,所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:75所示或与SEQ ID NO:75具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列相同性的氨基酸序列。
在本发明一些实施方案中,所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:76所示或与SEQ ID NO:76具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列相同性的氨基酸序列,所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:77所示或与SEQ ID NO:77具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列相同性的氨基酸序列。
在本发明一些实施方案中,所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:78所示或与SEQ ID NO:78具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列相同性的氨基酸序列,所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:79所示或与SEQ ID NO:79具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列相同性的氨基酸序列。
在本发明一些实施方案中,所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:80所示或与SEQ ID NO:80具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列相同性的氨基酸序列,所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:81所示或与SEQ ID NO:81具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列相同性的氨基酸序列。
在本发明一些实施方案中,所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:82所示或与SEQ ID NO:82具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列相同性的氨基酸序列,所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:83所示或与SEQ ID NO:83具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列相同性的氨基酸序列。
在本发明一些实施方案中,所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:84所示或与SEQ ID NO:84具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列相同性的氨基酸序列,所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:85所示或与SEQ ID NO:85具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列相同性的氨基酸序列。
在本发明一些实施方案中,所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:86所示或与SEQ ID NO:86具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列相同性的氨基酸序列,所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:87所示或与SEQ ID NO:87具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列相同性的氨基酸序列。
在本发明一些实施方案中,所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:88所示或与SEQ ID NO:88具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列相同性的氨基酸序列,所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:89所示或与SEQ ID NO:89具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列相同性的氨基酸序列。
在本发明一些实施方案中,所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:90所示或与SEQ ID NO:90具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列相同性的氨基酸序列,所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:91所示或与SEQ ID NO:91具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列相同性的氨基酸序列。
在本发明一些实施方案中,所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:92所示或与SEQ ID NO:92具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列相同性的氨基酸序列,所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:93所示或与SEQ ID NO:93具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列相同性的氨基酸序列。
在本发明一些实施方案中,所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:94所示或与SEQ ID NO:94具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列相同性的氨基酸序列,所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:95所示或与SEQ ID NO:95具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列相同性的氨基酸序列。
在本发明一些实施方案中,所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:94所示或与SEQ ID NO:94具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列相同性的氨基酸序列,所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:96所示或与SEQ ID NO:96具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列相同性的氨基酸序列。
本发明中,所述序列相同性可限于所述重链可变区和轻链可变区的框架区。本发明的中和抗体或其抗原结合片段靶向抗原保守氨基酸序列,与各CDR对应的重链可变区和轻链可变区的参考序列的框架区具有至少80%序列相同性的重链可变区和轻链可变区保留与抗原的结合活性。
本发明中,所述抗体为全长抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv或多特异性抗体。
在本发明一些实施方案中,当所述抗体为全长抗体时,所述全长抗体的重链恒定区源自人源抗体的重链或其变体,所述全长抗体的轻链恒定区源自人源抗体的κ链或者λ链或其变体。
在本发明一些具体实施方案中,所述重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO:66所示,所述轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO:67所示。
本发明的第二方面提供一种分离的核酸,所述核酸编码如第一方面所述的中和抗体或其抗原结合片段。
本发明的第三方面提供一种重组表达载体,所述重组表达载体包含如第二方面所述的核酸。
在本发明一些实施方案中,所述重组表达载体可为本领域常规,例如质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体。
在本发明一些具体实施方案中,所述病毒载体为逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体或腺相关病毒载体。
本发明的第四方面提供一种转化体,所述转化体在宿主细胞中包含如第三方面所述的重组表达载体。
本发明中,所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞。
在本发明一些实施方案中,所述宿主细胞选自酵母细胞、哺乳动物细胞或适用于制备抗体或其抗原结合片段的其它细胞。
在本发明一些具体实施方案中,所述哺乳动物细胞为HEK293细胞。
本发明的第五方面提供一种制备靶向冠状病毒的中和抗体或其抗原结合片段的方法,所述方法包括培养如第四方面所述的转化体,从培养物中获得靶向冠状病毒的中和抗体或其抗原结合片段。
本发明的第六方面提供一种药物组合物,所述药物组合物包含如第一方面所述的中和抗体或其抗原结合片段,以及药学上可接受的载体。
本发明的第七方面提供一种试剂盒,所述试剂盒包括如第一方面所述的中和抗体或其抗原结合片段、或者如第六方面所述的药物组合物;
在本发明一些实施方案中,所述试剂盒还包括检测所述中和抗体或其抗原结合片段与抗原结合的试剂。
本发明的第八方面提供一种如第一方面所述的中和抗体或其抗原结合片段、或者如第六方面所述的药物组合物在制备诊断、预防和/或治疗病毒感染的药物中的应用。
在本发明一些实施方案中,所述病毒感染为冠状病毒感染。
在本发明一些具体实施方案中,所述冠状病毒为SARS-CoV-2感染。
定义
本文使用的术语“互补决定区”或“CDR区”或“CDR”是抗体可变结构域中在序列上高变并且形成在结构上确定的环(“超变环”)和/或含有抗原接触残基(“抗原接触点”)的区域。CDR主要负责与抗原表位结合,从N-端开始顺序编号依次包括CDR1、CDR2和CDR3。在一个给定的重链可变区氨基酸序列中,各CDR的精确氨基酸序列边界可以使用许多公知的抗体CDR指派系统的任一种或其组合确定。本领域人员公知,在本领域中可以通过多种方法来定义抗体的CDR,例如基于抗体的三维结构和CDR环的拓扑学的Chothia(Chothia等人.(1989)Nature 342:877-883,Al-Lazikani等人,Journal of Molecular Biology,273,927-948(1997))、基于抗体序列可变性的Kabat(Kabat等人,U.S.Department of Health andHuman Services,National Institutes of Health(1987))、AbM(University of Bath),Contact(University College London)、国际ImMunoGeneTics database(IMGT)(万维网imgt.cines.fr/),以及基于利用大量晶体结构的近邻传播聚类(affinity propagationclustering)的North CDR定义。本领域技术人员应当理解的是,除非另有规定,否则术语给定抗体或其区(例如可变区)的“CDR”及“互补决定区”应理解为涵盖如通过本发明描述的上述已知方案中的任何一种界定的互补决定区。
具有不同特异性(即,针对不同抗原的不同结合位点)的抗体具有不同的CDR。然而,尽管CDR在抗体与抗体之间是不同的,但是CDR内只有有限数量的氨基酸位置直接参与抗原结合。使用Kabat、Chothia、IMGT、AbM和Contact方法中的至少两种,可以确定最小重叠区域,从而提供用于抗原结合的“最小结合单位”。最小结合单位可以是CDR的一个子部分。正如本领域技术人员明了,通过抗体的结构和蛋白折叠,可以确定CDR序列其余部分的残基。因此,本发明也考虑本文所给出的任何CDR的变体。例如,在一个CDR的变体中,最小结合单位的氨基酸残基可以保持不变,而根据Kabat或Chothia或AbM定义的其余CDR残基可以被保守氨基酸残基替代。
如本文所用,氨基酸序列的“百分比(%)序列同一性”、“序列同一性”具有本领域公认的定义,其指通过序列比对(例如通过人工检视或可公知的算法)确定的两个多肽序列之间相同的百分比。可以使用本领域技术人员已知的方法确定,例如使用可公开获得的计算机软件如BLAST、BLAST-2、Clustal Omega和FASTA软件。
本发明中,除非上下文明确指出,否则当提及术语“抗体”时,其不仅包括完整抗体,而且包括抗体的抗原结合片段。
如本文所用,术语“多特异性抗体”是指能够特异性结合两种或更多种(例如2、3、4、5或6种)不同抗原表位的抗体。多特异性抗体可以例如是双特异性、三特异性或四特异性抗体,其分别能够特异性结合2、3或4种抗原表位。如本文所用,术语“抗原表位”或“抗原决定簇”表示抗原中与抗体的抗原结合位点特异性结合的区域。
本文所使用的术语“分离的”指的是从天然状态下经人工手段获得的。如果自然界中出现某一种“分离的”物质或成分,那么可能是其所处的天然环境发生了改变,或从天然环境下分离出该物质,或二者情况均有发生。例如,某一活体动物体内天然存在某种未被分离的多聚核苷酸或多肽,而从这种天然状态下分离出来的高纯度的相同的多聚核苷酸或多肽即称之为“分离的”。术语“分离的”不排除混有人工或合成的物质,也不排除存在不影响物质活性的其它不纯物质。
如本发明所用,“载体”表示构建体,其能够将一种或多种所关注的基因或序列递送入宿主细胞并且优选在宿主细胞中表达所述基因或序列。载体的实例包括但不限于病毒载体、裸DNA或RNA表达载体、质粒、粘粒或噬菌体载体、与阳离子凝聚剂相关的DNA或RNA表达载体、包囊化于脂质体中的DNA或RNA表达载体以及某些真核细胞,例如生产细胞。
本文所使用的术语“宿主细胞”是指,可用于导入载体的细胞,其包括但不限于,如大肠杆菌等原核细胞,如酵母细胞等的真菌细胞,如S2果蝇细胞或Sf9等的昆虫细胞,或者如纤维原细胞,CHO细胞,COS细胞,NSO细胞,HeLa细胞,BHK细胞,HEK293细胞或人细胞等的动物细胞。
在符合本领域常识的基础上,上述各优选条件,可任意组合,即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于:
本发明的中和抗体或其抗原结合片段靶向冠状病毒抗原表位的保守氨基酸序列,对冠状病毒各变种均具有良好的结合活性,对病毒与ACE2的结合具有良好的阻断活性,同时具有显著的完全抑制率,为防治病毒感染提供了更多选择,具有重要的临床价值。
附图说明
图1A-1E显示了基于抗原包被法检测得到的候选抗体与Omicron-RBD-His的结合活性;其中:
图1A显示了E-R-3G-163和S1D-Ab-003与Omicron-RBD-His的结合活性;
图1B显示了S1D-Ab-079和S1D-Ab-092与Omicron-RBD-His的结合活性;
图1C显示了S1D-Ab-101、S1D-Ab-102和S1D-Ab-106与Omicron-RBD-His的结合活性;
图1D显示了S1D-Ab-009、S1D-Ab-029、S1D-Ab-034、S1D-Ab-054和S1D-Ab-076与Omicron-RBD-His的结合活性;
图1E显示了A-R-3G-38、A-R-3Y-6和C-R-2G-5与Omicron-RBD-His的结合活性。
图2A-2B显示了基于抗体包被法检测的候选抗体与Omicron-RBD-His的结合活性;其中:
图2A显示了C-R-2G-5、A-R-3G-38、S1D-Ab-003、S1D-Ab-009、S1D-Ab-092、S1D-Ab-101、S1D-Ab-029和S1D-Ab-054与Omicron-RBD-His的结合活性;
图2B显示了E-R-3G-163、A-R-3Y-6、S1D-Ab-034、S1D-Ab-106、S1D-Ab-076、S1D-Ab-079和S1D-Ab-102与Omicron-RBD-His的结合活性。
图3A-3J显示了候选抗体阻断S蛋白S1-huFc和ACE2结合的活性;其中:
图3A显示了C-R-2G-5阻断S蛋白S1-huFc和ACE2结合的活性;
图3B显示了A-R-3G-38阻断S蛋白S1-huFcFc和ACE2结合的活性;
图3C显示了A-R-3Y-6阻断S蛋白S1-huFc和ACE2结合的活性;
图3D显示了E-R-3G-163阻断S蛋白S1-huFc和ACE2结合的活性;
图3E显示了S1D-Ab-003和S1D-Ab-009阻断S蛋白S1-huFc和ACE2结合的活性;
图3F显示了S1D-Ab-029和S1D-Ab-034阻断S蛋白S1-huFc和ACE2结合的活性;
图3G显示了S1D-Ab-054阻断S蛋白S1-huFc和ACE2结合的活性;
图3H显示了S1D-Ab-076和S1D-Ab-079阻断S蛋白S1-huFc和ACE2结合的活性;
图3I显示了S1D-Ab-092和阻断S蛋白S1-huFc和ACE2结合的活性;
图3J显示了S1D-Ab-101、S1D-Ab-102和S1D-Ab-106阻断S蛋白S1-huFc和ACE2结合的活性。
图4A-4E显示了候选抗体与SARS-CoV-2及其突变株的S蛋白的结合活性;其中:
图4A显示了S1D-Ab-102与S蛋白S1-His的结合活性;
图4B显示了S1D-Ab-102与Alpha-S1D-His的结合活性;
图4C显示了S1D-Ab-102与Beta-S1D-His的结合活性;
图4D显示了S1D-Ab-102与Delta-S1D-His的结合活性;
图4E显示了S1D-Ab-102与Omicron-S1D-His的结合活性。
图5A-5E显示了候选抗体阻断SARS-CoV-2及其突变株的S蛋白与ACE2结合的活性;其中:
图5A显示了S1D-Ab-102阻断S蛋白S1-His与人ACE2-huFc结合的活性;
图5B显示了S1D-Ab-102阻断Alpha-S1D-His与人ACE2-huFc结合的活性;
图5C显示了S1D-Ab-102阻断Beta-S1D-His与人ACE2-huFc结合的活性;
图5D显示了S1D-Ab-102阻断Delta-S1D-His与人ACE2-huFc结合的活性;
图5E显示了S1D-Ab-102阻断Omicron-S1D-His与人ACE2-huFc结合的活性。
图6显示了候选抗体对SARS-CoV-2突变株假病毒的中和活性。
图7显示了候选抗体的SDS-PAGE结果。
图8显示了候选抗体的SEC-HPLC结果。
具体实施方式
通过参考以下实施例将更容易地理解本文一般地描述的本发明,这些实施例是以举例说明的方式提供的,并且不旨在限制本发明的范围。这些实施例并不旨在表示下面的实验是全部或仅进行的实验。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法,按照常规方法和条件,或按照商品说明书选择。
实施例1冠状病毒S蛋白抗原的制备和检测用ACE2的制备
实施例中共用到如下抗原和ACE2蛋白:S蛋白RBD-His(Arg319-Asn532)、S蛋白S1-huFc或S蛋白S1-His(Gln14-Arg685)、Alpha突变株S1-His(Gln14-Arg685,含如下突变:HV69-70缺失、Y144缺失、N501Y、A570D、D614G)(以下简称Alpha-S1D-His)、Beta突变株S1-His(Gln14-Arg685,含如下突变:L18F、D80A、D215G、242-244缺失、R246I、K417N、E484K、N501Y、D614G)(以下简称Beta-S1D-His)、Delta突变株S1-His(Gln14-Arg685,含如下突变:T19R、G142D、EF156-157缺失、R158G、L452R、T478K、D614G)(以下简称Delta-S1D-His)、Omicron突变株S1-His(Gln14-Arg685,含如下突变:A67V、HV69-70缺失、T95I、G142D、VYY143-145缺失、N211缺失、L212I、插入214EPE、G339D、S371L、S373P、S375F、K417N、N440K、G446S、S477N、T478K、E484A、Q493R、G496S、Q498R、N501Y、Y505H、T547K、D614G、H655Y、N679K、P681H)(以下简称Omicron-S1D-His)、Omicron突变株RBD-His(Arg319-Asn532,含如下突变:G339D、S371L、S373P、S375F、K417N、N440K、G446S、S477N、T478K、E484A、Q493R、G496S、Q498R、N501Y、Y505H)(以下简称Omicron-RBD-His)、人ACE2-huFc(Gln18-Ser740),其自制蛋白的具体制备方法如下。
1.1质粒构建
从NCBI获取各蛋白序列,其中人ACE2序列获自NCBI Gene ID:59272,S蛋白序列获自NCBI Gene ID:43740568,分别按照上述氨基酸片段位置获得各蛋白序列,转化成基因序列后由金斯瑞生物科技股份有限公司进行目的片段基因合成,对于突变株则基于已合成的S蛋白序列进行相应的点突变PCR扩增。PCR扩增各目的片段,然后通过同源重组的方法构建至真核表达载体pcDNA3.3-TOPO(Invitrogen),用于后续重组蛋白的表达。
1.2质粒制备
将构建好的各重组蛋白表达载体分别转化到大肠杆菌SS320中,37℃过夜培养,利用无内毒素质粒提取试剂盒(OMEGA,D6950-01)进行质粒提取,得到无内毒素的各质粒以供真核表达使用。
1.3各蛋白的表达纯化
所有抗原蛋白均通过Expi293瞬转表达系统(ThermoFisher,A14635)表达,具体方法如下:
转染当天,确认细胞密度为4.5×106-5.5×106个活细胞/mL,细胞存活率>95%,此时用37℃预温的新鲜Expi293表达培养基将细胞调整到终浓度为3×106个细胞/mL。用4℃预冷的Opti-MEMTM稀释目的质粒(1mL Opti-MEMTM中加入1μg质粒),同时用Opti-MEMTM稀释ExpiFectamineTM293试剂,再将两者等体积混合并轻轻吹打混匀制备成ExpiFectamineTM293试剂/质粒DNA混合液,室温孵育10-20min,缓慢加入到准备好的细胞悬液中,并同时轻轻摇晃,最后置于细胞培养摇床中,在37℃,8%CO2条件下培养。
在转染后18-22h内添加ExpiFectamineTM293 Transfection Enhancer 1和ExpiFectamineTM293 Transfection Enhancer 2,摇瓶放置于32℃摇床和5%CO2条件下继续培养,在转染5-7天后,将细胞表达上清于15000g高速离心10min,所得Fc标签蛋白表达上清用MabSelect SuRe LX(GE,17547403)进行亲和纯化,然后用100mM乙酸钠(pH3.0)洗脱目的蛋白,接着用1M Tris-HCl中和;所得His标签蛋白表达上清用Ni Smart Beads 6FF(常州天地人和生物科技有限公司,SA036050)进行亲和纯化,然后用梯度浓度的咪唑洗脱目的蛋白。洗脱下来的各蛋白分别通过超滤浓缩管(Millipore,UFC901096)置换至PBS缓冲液中。经SDS-PAGE鉴定和活性鉴定合格后于-80℃冻存待用。
实施例2对照抗体制备
在本实施例中,使用的对照抗体为抗S蛋白Sotrovimab(VIR-7831/GSK4182136)单抗,由葛兰素史克(GSK)公司开发,是目前为数不多针对Omicron依然有中和活性的抗体,已被FDA获批为紧急使用(EUA)中和抗体,序列来自专利申请US20210371504A1(SEQ ID NO:1-2)。
抗体重链和轻链的DNA序列委托金唯智生物科技有限公司合成。PCR扩增各目的片段,然后通过同源重组的方法构建至真核表达载体pcDNA3.4(Invitrogen)。将构建好的重组蛋白表达载体转化到大肠杆菌DH5α中,37℃过夜培养,然后利用无内毒素质粒提取试剂盒(OMEGA,D6950-01)进行质粒提取,得到无内毒素的质粒以供真核表达使用。采用ExpiCHO瞬转表达系统(Thermo Fisher,A29133)表达(方法参见WO2020238730A1)。将细胞混悬液进行高速离心并收集上清,所得上清经0.22μm滤膜过滤后,采用Protein A/G柱进行亲和层析纯化。目的蛋白使用100mM甘氨酸盐酸(pH 3.0)进行洗脱,经浓缩,缓冲液置换,分装,SDS-PAGE鉴定和活性检测后入库冻存。
实施例3噬菌体展示文库的构建和筛选
在本实施例中,采用本司已构建及预制好的噬菌体展示文库进行抗体筛选,所使用文库THR为人源化重组抗体库,库容为1.1×1012。所使用的筛选路径包括:用S蛋白RBD-His、S蛋白S1-His筛选该抗体库,获得了特异性结合SARS-CoV-2冠状病毒S蛋白的抗体分子。
3.1噬菌体展示文库构建
THR为基于人源B细胞抗体基因,经轻重链重组获得的万亿全人重组抗体噬菌体展示抗体文库。具体构建方法如下:在PCR扩增得到抗体的重链可变区基因片段和轻链可变区基因片段后,根据重链和轻链的种系基因类型进行重组,构建万亿全人重组抗体库(文库构建方法参考专利CN111690058A中的实施例2.1)。通过梯度稀释铺板,测得此文库库容量为1.10×1012,即1.10×1012个抗体基因的抗体基因库(库容计算方法参考专利CN112250763B中的实施例2.2)。采用VSCM13辅助噬菌体(购自Stratagene)对其进行包装,获得了抗体基因噬菌体展示文库(抗体基因噬菌体展示文库的制备参考专利CN112250763B中的实施例2.3)。
3.2噬菌体展示文库的筛选
基于磁珠法和免疫管法,对上述文库进行筛选,采用S蛋白RBD-His和SARS-S1D-His筛选THR,具体的筛选方法参见专利CN112625136B的描述。
根据筛选所得的抗体的亲和阻断活性检测选择了15个抗体,所得抗体的CDR序列氨基酸见表1,采用AbM定义CDR的方式,确定CDR序列。
表1
实施例4抗体的构建、表达和纯化
将实施例3中获得的抗体的Fab序列中的VH编码序列与人IgG1的重链恒定区(SEQID NO:66)的编码序列连接获得抗体的重链编码序列,将Fab序列中的VL编码序列与人轻链恒定区(CL)的Kappa型(SEQ ID NO:67)的编码序列连接获得抗体的轻链编码序列。通过同源重组方法,将抗体重链和轻链的编码序列分别插入真核表达载体质粒pcDNA3.3-TOPO(Invitrogen)上,组成完整的全长抗体基因,如表2所示。将构建好的抗体载体转化到大肠杆菌SS320中,37℃过夜培养。利用无内毒素质粒提取试剂盒(OMEGA,D6950-01)进行质粒提取,得到无内毒素的抗体质粒以供真核表达使用。
表2
4.2抗体的表达和纯化
候选抗体通过ExpiCHO瞬转表达系统(Thermo Fisher,A29133)表达,具体方法如下:转染当天,确认细胞密度为7×106至1×107个活细胞/mL,细胞存活率>98%,此时,用37℃预温的新鲜ExpiCHO表达培养基将细胞调整到终浓度为6×106个细胞/mL。用4℃预冷的OptiPROTM SFM稀释目的质粒(向1mL所述培养基中加入1μg质粒),同时,用OptiPROTMSFM稀释ExpiFectamineTMCHO,再将两者等体积混合并轻轻吹打混匀制备成ExpiFectamineTMCHO/质粒DNA混合液,室温孵育1-5min,缓慢加入到准备好的细胞悬液中,并同时轻轻摇晃,最后置于细胞培养摇床中,在37℃、8%CO2条件下培养。
在转染后18-22h,向培养液中添加ExpiCHOTMEnhancer和ExpiCHOTMFeed,摇瓶放置于32℃摇床和5%CO2条件下继续培养。在转染后的第5天,添加相同体积的ExpiCHOTMFeed,缓慢加入的同时轻轻混匀细胞混悬液。在转染7-15天后,将表达有目的蛋白的细胞培养上清于15000g高速离心10min,所得上清用MabSelect SuRe LX(GE,17547403)进行亲和纯化,然后用100mM乙酸钠(pH 3.0)洗脱目的蛋白,接着用1M Tris-HCl中和,最后通过超滤浓缩管(Millipore,UFC901096)将所得蛋白置换至PBS缓冲液中。
实施例5基于ELISA方法检测抗体的亲和活性
5.1候选抗体的亲和活性检测
本实施例基于ELISA方法检测了候选抗体对Omicron突变株的S蛋白的结合活性,采用了两种ELISA形式,具体方法如下:
方法1:在96孔ELISA板上,包被Omicron-RBD-His(2μg/mL、30μL/孔),4℃过夜。次日,将孔板用PBST洗3次后用5%脱脂牛奶封闭2h,用PBST洗板3次后,加入梯度稀释的待测抗体,以梯度稀释的受体蛋白人ACE2-huFc作为对照,并孵育1h。之后,用PBST清洗3次后加入二抗(Anti-human-IgG-Fc-HRP,abcam,ab97225)并孵育1h。孵育完成后,PBST洗板六次,加TMB(SurModics,TMBS-1000-01)显色。根据显色结果,加入2M HCl终止反应,通过酶标仪(Molecular Devices,SpecterMax 190)在OD450下读板。
结果显示在图1A-1E中,结果表明,基于包被抗原的ELISA方法,所有抗体均与Omicron-RBD-His蛋白有不同程度的亲和活性,而阳性对照ACE2-huFc与Omicron-RBD-His蛋白的结合活性比较弱。基于此,采用了第2种ELISA方法对候选抗体与Omicron-RBD-His蛋白亲和力进一步进行评估。
方法2:在96孔ELISA板上,包被各抗体蛋白(4μg/mL、30μL/孔),4℃过夜,其中包被人ACE2-huFc以及对照抗体Sotrovimab作为阳性对照。次日,将孔板用PBST洗3次后用5%脱脂牛奶封闭2h,用PBST洗板3次后,加入梯度稀释的Omicron-RBD-His蛋白并孵育1h。然后用PBST清洗3次后加入二抗(Anti-6*his-HRP,Proteintech,HRP-66005)并孵育1h。孵育完成后,PBST洗板六次,加TMB(SurModics,TMBS-1000-01)显色。根据显色结果,加入2M HCl终止反应,通过酶标仪(Molecular Devices,SpecterMax 190)在OD450下读板。
结果显示在图2A-2B中,结果表明,基于包被抗体的ELISA方法,阳性对照人ACE2-huFc、Sotrovimab以及大部分抗体都显示了较好的结合活性,其中S1D-Ab-092和S1D-Ab-102显示了与阳性对照相似的结合活性。
实施例6候选抗体的阻断活性检测
本实施例采用ELISA方法检测了候选抗体阻断SARS-CoV-2 S蛋白和ACE2的活性,具体试验方法如下:
用人ACE2-huFc蛋白包被96孔板(4μg/mL,30μL/孔),4℃过夜。次日,将96孔板用PBST洗3次后用5%脱脂牛奶封闭2h。然后将候选抗体梯度稀释,并与生物素标记的S蛋白S1-huFc提前预混1.0h,在封闭完成并洗板结束后转移至96孔ELISA板中,孵育1h。用PBST清洗3次后加入100μL/孔1:5000稀释的第二抗体NeutrAvidin-HRP(Thermofisher,31001)并孵育1h。孵育完成后,PBST洗板六次,加入TMB(SurModics,TMBS-1000-01)显色,根据显色结果,加入2M HCl终止反应,通过酶标仪(Molecular Devices,SpecterMax 190)在OD450下读板。
结果显示在图3A-3I中,所有候选抗体均具有良好的阻断活性。
实施例7候选抗体对SARS-CoV-2及突变株S蛋白的结合活性检测
本实施例选择了S1D-Ab-102分子,检测了其对SARS-CoV-2 S蛋白、Alpha、Beta、Delta、Omicorn突变株S蛋白的结合活性,以Sotrovimab作为对照抗体。该方法基于包被一定浓度抗体,用梯度稀释的抗原(S蛋白S1-His、Alpha-S1D-His、Beta-S1D-His、Delta-S1D-His或Omicro-S1D-His)与抗体进行结合并检测相应的信号值,详细的ELISA方法参见实施例5方法二。
结果显示在图4A-4E中,结果显示,S1D-Ab-102和对照抗体Sotrovimab与各种突变株蛋白均具有结合活性,并且结合活性相当。
实施例8候选抗体对SARS-CoV-2突变株S蛋白的阻断活性检测
因SARS-CoV-2及其突变株、SARS-CoV的主要受体均为ACE2,因此阻断活性检测方法参考实施例6,检测了候选分子S1D-Ab-102和对照抗体Sotrovimab阻断不同突变株S蛋白和ACE2的结合活性。
结果如图5A-5F所示,由结果可知,对照抗体Sotrovimab对SARS-CoV-2及其突变株、SARS-CoV的S蛋白-ACE2的阻断活性均很弱,预示其结合表位非受配体结合的关键表位,S1D-Ab-102显示了对SARS-CoV-2及其突变株Omicron和Alpha的S蛋白-ACE2良好的阻断活性。
实施例9候选抗体对SARS-CoV-2突变株假病毒中和活性检测
本实施例中检测了抗体S1D-Ab-102和对照抗体Sotrovimab中和Omicron突变株假病毒的活性。假病毒为病毒衣壳上融合有SARS-CoV-2 S蛋白的慢病毒,当病毒通过S蛋白与细胞膜表面的受体ACE2结合后进行膜融合并进入细胞,在细胞内启动病毒带有的荧光素酶报告基因表达,在加入荧光素酶底物后可产生荧光,荧光素酶的表达量越高,催化底物产生的荧光越强。因此,当梯度稀释的抗体结合S蛋白,且抗体可以阻断S蛋白和ACE2结合时,可不同程度阻断病毒侵染细胞,具体实施操作如下:
收集指数生长期的AEC2-HEK293细胞,离心去上清,用工作培养基(DMEM+10%FBS)重悬后计数,将细胞密度调整为2×105个/mL,吸取50μL细胞加入到96孔白边底透明细胞培养板中,置于37度培养箱中培养过夜(16~20h)。其中ACE2-HEK293细胞是在HEK293细胞通过将含有ACE2的质粒进行电转,而最终获得的在细胞膜上可表达ACE2蛋白的稳转细胞株,可用于细胞水平的结合阻断以及功能测定。使用工作培养基(DMEM+10%FBS)为稀释液,将所有测试抗体在96孔板进行梯度稀释,并将稀释后的抗体与一定量Omicron假病毒(Genomeditech,GM-47297LV-R20)孵育15min,将孵育后的抗体和假病毒混合物加入细胞中,50μL/孔。轻轻拍打混匀,将细胞培养板放入37℃细胞培养箱孵育72h。将细胞板置于室温平衡20min,将bright-lite(Vazyme,DD1204-03)提前置于室温融化,每孔加50μLbright-lite,混匀并使用酶标仪震荡5min使其充分反应。使用SpectraMax i3X酶标仪检测信号,并进行结果记录。
结果显示在图6中,S1D-Ab-102的中和活性与阳性对照抗体相当,但完全抑制率均优于阳性对照。
实施例10候选抗体结合SARS-CoV-2突变株S蛋白的亲和力常数检测
在本实施例中,通过Fortebio方法检测了候选抗体S1D-Ab-102和对照抗体Sotrovimab与SARS-CoV-2 S蛋白及其突变株S蛋白的亲和力常数。
10.1材料准备
称取10g的BSA,量取5mL的Tween 20,加入到1000mL的10×PBS,混匀,制成10×KB缓冲液。过滤后分装保存。吸取0.1mL 0.1M且pH=2.0的甘氨酸溶液加入至0.9mL的超纯水中,混匀,制成传感器再生缓冲液。作为抗原的S蛋白RBD-His以10×KB稀释成10μg/mL,抗体以10×KB稀释成系列浓度梯度,依次为200、66.6、22.2、7.41、0nM。
10.2实验流程
避光条件下,采用10×KB缓冲液预湿传感器(Anti-Penta-HIS,HIS1K,Fortebio,CA),至少10min后开始测试样品板(GreinierBio,PN655209),测试无误后按预设程序进行。首先采用Protein A传感器抓取抗体,抗体浓度为30nM,孵育120s,在10×KB缓冲液中平衡60s后,将结合有抗体的传感器转移至不同浓度抗原稀释液中结合120s,抗原包括SARS-S1D-His蛋白、Omicorn-S1D-His蛋白、Delta-S1D-His蛋白和Beta-S1D-His蛋白(浓度设置为300nM起始,2倍梯度稀释,最低浓度为18.8nM),待结合信号稳定后,再转移到10×KB缓冲液中,解离时间为180s,最后通过不同浓度抗原的结合解离数据,取其中3个数据稳定的点,拟合得到KD、Kon和Koff。
10.3结果分析
结果显示在表3中,S1D-Ab-102除对Beta-S1D-His蛋白显示弱结合外,对其他各种突变株的S1蛋白均显示结合活性(“N/A”数据不可获得,“WB”弱结合)。对照抗体Sotrovimab与各种突变株的S1蛋白的结合亲和力均优于抗体S1D-Ab-102。
表3.
实施例11候选抗体的理化性质检测
在本实施例中,用SDS-PAGE、SEC-HPLC检测候选抗体的纯度。
11.1候选抗体SDS-PAGE鉴定
非还原溶液制备:候选抗体以及质控品IPI(所述IPI是伊匹木单抗(Ipilimumab)的缩写,通过实施例4的方法制备获得)1μg加入5×SDS上样缓冲液和40mM碘代乙酰胺,75℃干浴加热10min,冷却到室温后,12000rpm离心5min,取上清。还原溶液制备:候选纳米抗体以及质控品IPI 2μg加入5×SDS上样缓冲液和5mM DTT,100℃干浴加热10min,冷却到室温后,12000rpm离心5min,取上清。将上清加入Bis-tris 4-15%梯度胶(购于金斯瑞),恒压110V电泳,当考马斯亮蓝迁移到凝胶底部,停止运行,取出凝胶片置考马斯亮蓝染色液中1-2h,弃去染色液,加入脱色液,根据需要更换2-3次脱色液,脱色至凝胶背景透明后保存在去离子水中。脱色后用EPSON V550彩色扫描仪扫描,通过Image J按照峰面积归一法计算还原和非还原条带纯度。
结果如图7所示,抗体S1D-Ab-102和质控品IPI非还原胶的条带分别在80KD和150kD左右,还原胶带分别是55kD左右和25kD左右,符合预期大小,且纯度均大于95%。
11.2候选抗体的SEC-HPLC单体纯度鉴定
材料准备:1、流动相:150mmol/L磷酸缓冲液,pH 7.4;2、样品制备:候选纳米抗体以及质控品IPI均用流动相溶液稀释到0.5mg/mL。Agilent HPLC 1100色谱柱(XBridge BEHSEC 3.5μm,7.8mm I.D.×30cm,Waters)流速设为0.8mL/min,进样体积20μL,VWD检测器波长为280nm和214nm。依次进样空白溶液、IPI质控品溶液和样品溶液。
按照面积归一法计算样品中高分子聚合物、抗体单体和低分子物质百分比,结果如图8所示,S1D-Ab-102的单体纯度均为100%。
Claims (10)
1.一种靶向冠状病毒的中和抗体或其抗原结合片段,所述中和抗体包含重链可变区和轻链可变区,所述重链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ IDNO:5所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3;所述轻链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3;或者,
所述重链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3;所述轻链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO:12、SEQID NO:7和SEQ ID NO:13所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3;或者,
所述重链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3;所述轻链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO:17、SEQID NO:18和SEQ ID NO:19所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3;或者,
所述重链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:21所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3;所述轻链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO:22、SEQID NO:23和SEQ ID NO:24所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3;或者,
所述重链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:25所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3;所述轻链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO:26、SEQID NO:27和SEQ ID NO:28所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3;或者,
所述重链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:29所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3;所述轻链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO:30、SEQID NO:31和SEQ ID NO:32所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3;或者,
所述重链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:33所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3;所述轻链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO:34、SEQ IDNO:7和SEQ ID NO:35所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3;或者,
所述重链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:36所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3;所述轻链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO:37、SEQID NO:38和SEQ ID NO:39所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3;或者,
所述重链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:41所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3;所述轻链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO:26、SEQID NO:27和SEQ ID NO:28所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3;或者,
所述重链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:44所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3;所述轻链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:7和SEQ ID NO:45所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3;或者,
所述重链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:46所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3;所述轻链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO:47、SEQ IDNO:48和SEQ ID NO:49所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3;或者,
所述重链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:50所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3;所述轻链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO:51、SEQ IDNO:52和SEQ ID NO:53所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3;或者,
所述重链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:54所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3;所述轻链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO:55、SEQID NO:56和SEQ ID NO:57所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3;或者,
所述重链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:58和SEQ ID NO:59所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3;所述轻链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO:60、SEQID NO:61和SEQ ID NO:62所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3;或者,
所述重链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:58和SEQ ID NO:59所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3;所述轻链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO:63、SEQID NO:64和SEQ ID NO:65所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
2.如权利要求1所述的中和抗体或其抗原结合片段,其特征在于,所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:68所示或与SEQ ID NO:68具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列相同性的氨基酸序列,所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:69所示或与SEQ IDNO:69具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列相同性的氨基酸序列;或者,
所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:70所示或与SEQ ID NO:70具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列相同性的氨基酸序列,所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQID NO:71所示;或者或与SEQ ID NO:71具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列相同性的氨基酸序列;或者,
所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:72所示或与SEQ ID NO:72具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列相同性的氨基酸序列,所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQID NO:73所示或与SEQ ID NO:73具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列相同性的氨基酸序列;或者,
所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:74所示或与SEQ ID NO:74具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列相同性的氨基酸序列,所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQID NO:75所示或与SEQ ID NO:75具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列相同性的氨基酸序列;或者,
所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:76所示或与SEQ ID NO:76具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列相同性的氨基酸序列,所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQID NO:77所示或与SEQ ID NO:77具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列相同性的氨基酸序列;或者,
所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:78所示或与SEQ ID NO:78具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列相同性的氨基酸序列,所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQID NO:79所示或与SEQ ID NO:79具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列相同性的氨基酸序列;或者,
所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:80所示或与SEQ ID NO:80具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列相同性的氨基酸序列,所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQID NO:81所示或与SEQ ID NO:81具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列相同性的氨基酸序列;或者,
所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:82所示或与SEQ ID NO:82具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列相同性的氨基酸序列,所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQID NO:83所示或与SEQ ID NO:83具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列相同性的氨基酸序列;或者,
所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:84所示或与SEQ ID NO:84具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列相同性的氨基酸序列,所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQID NO:85所示或与SEQ ID NO:85具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列相同性的氨基酸序列;或者,
所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:86所示或与SEQ ID NO:86具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列相同性的氨基酸序列,所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQID NO:87所示或与SEQ ID NO:87具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列相同性的氨基酸序列;或者,
所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:88所示或与SEQ ID NO:88具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列相同性的氨基酸序列,所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQID NO:89所示或与SEQ ID NO:89具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列相同性的氨基酸序列;或者,
所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:90所示或与SEQ ID NO:90具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列相同性的氨基酸序列,所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQID NO:91所示或与SEQ ID NO:91具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列相同性的氨基酸序列;或者,
所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:92所示或与SEQ ID NO:92具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列相同性的氨基酸序列,所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQID NO:93所示或与SEQ ID NO:93具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列相同性的氨基酸序列;或者,
所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:94所示或与SEQ ID NO:94具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列相同性的氨基酸序列,所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQID NO:95所示或与SEQ ID NO:95具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列相同性的氨基酸序列;或者,
所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:94所示或与SEQ ID NO:94具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列相同性的氨基酸序列,所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQID NO:96所示或与SEQ ID NO:96具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列相同性的氨基酸序列。
3.如权利要求2所述的中和抗体或其抗原结合片段,其特征在于,所述抗体为全长抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv或多特异性抗体;
较佳地,当为全长抗体时,所述全长抗体的重链恒定区源自人源抗体的重链或其变体,所述全长抗体的轻链恒定区源自人源抗体的κ链或者λ链或其变体;
更佳地,所述重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO:66所示,所述轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO:67所示。
4.一种分离的核酸,其特征在于,所述核酸编码如权利要求1~3任一项所述的中和抗体或其抗原结合片段。
5.一种重组表达载体,其特征在于,所述重组表达载体包含如权利要求4所述的核酸;
较佳地,所述重组表达载体为质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体;
更佳地,所述病毒载体为逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体或腺相关病毒载体。
6.一种转化体,其特征在于,所述转化体在宿主细胞中包含如权利要求5所述的重组表达载体;
较佳地,所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞;
更佳地,所述宿主细胞选自酵母细胞、哺乳动物细胞或适用于制备抗体或其抗原结合片段的其它细胞;所述哺乳动物细胞例如为HEK293细胞。
7.一种制备靶向冠状病毒的中和抗体或其抗原结合片段的方法,其特征在于,所述方法包括培养如权利要求6所述的转化体,从培养物中获得靶向冠状病毒的中和抗体或其抗原结合片段。
8.一种药物组合物,其特征在于,所述药物组合物包含如权利要求1~3任一项所述的中和抗体或其抗原结合片段,以及药学上可接受的载体。
9.一种试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括如权利要求1~3任一项所述的中和抗体或其抗原结合片段、或者如权利要求8所述的药物组合物;
较佳地,所述试剂盒还包括检测所述中和抗体或其抗原结合片段与抗原结合的试剂。
10.一种如权利要求1~3任一项所述的中和抗体或其抗原结合片段、或者如权利要求8所述的药物组合物在制备诊断、预防和/或治疗病毒感染的药物中的应用;
较佳地,所述病毒感染为冠状病毒感染;
更佳地,所述冠状病毒为SARS-CoV-2感染。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202211153812.0A CN116253796A (zh) | 2022-09-21 | 2022-09-21 | 靶向冠状病毒的中和抗体、其抗原结合片段及其用途 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202211153812.0A CN116253796A (zh) | 2022-09-21 | 2022-09-21 | 靶向冠状病毒的中和抗体、其抗原结合片段及其用途 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN116253796A true CN116253796A (zh) | 2023-06-13 |
Family
ID=86685052
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202211153812.0A Pending CN116253796A (zh) | 2022-09-21 | 2022-09-21 | 靶向冠状病毒的中和抗体、其抗原结合片段及其用途 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN116253796A (zh) |
-
2022
- 2022-09-21 CN CN202211153812.0A patent/CN116253796A/zh active Pending
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN111234020B (zh) | 一种bcma结合蛋白及其制备方法和应用 | |
WO2016173558A1 (zh) | 抗诺如病毒gii.4型鼠源单克隆抗体的制备和应用 | |
CN111349161B (zh) | 抗cd19抗体的单克隆抗体及其应用 | |
CN115724958B (zh) | 抗诺如病毒gⅱ基因组衣壳蛋白vp1的单克隆抗体及其应用 | |
CN113527489A (zh) | 抗cd73的抗体及其用途 | |
CN117088976B (zh) | 一种抗nfl的单克隆抗体 | |
CN115286715B (zh) | 一种抗cd3的纳米抗体或其抗原结合部分及其制备方法 | |
CN114195897B (zh) | Pd-l1单克隆抗体、重链、轻链可变区、单克隆细胞株及运用和试剂盒 | |
CN116396387A (zh) | Pd-l1单克隆抗体、重链、轻链可变区、单克隆细胞株及运用和试剂盒 | |
CN113444181B (zh) | 抗kl-6双特异性抗体及基因、重组载体、药物、试剂盒 | |
CN114127110B (zh) | 抗cgrp抗体及其应用 | |
CN116253796A (zh) | 靶向冠状病毒的中和抗体、其抗原结合片段及其用途 | |
CN116023482A (zh) | 靶向冠状病毒的中和抗体、其抗原结合片段及其用途 | |
CN112062848B (zh) | 抗cd47单克隆抗体及其应用 | |
CN116813766B (zh) | 高通透性抗钙调蛋白融合纳米抗体及其制备方法及其应用 | |
CN115825415B (zh) | 阻断剂和体外免疫诊断产品、应用 | |
CN117164711B (zh) | 一种抗神经纤维丝轻链蛋白的抗体 | |
CN116640216B (zh) | 抗cd19抗体的抗体、抗cd22抗体的抗体及其应用 | |
CN110054675B (zh) | 免疫原性多肽以及抗ttc36抗体cp4-3及应用 | |
CN112250767B (zh) | 一种结合Strep-Tag II标签的抗体及其应用 | |
CN112724253B (zh) | 抗人穹窿体蛋白的抗体及其应用 | |
CN114316043B (zh) | 一种TGFβ1抗原结合分子及其应用 | |
CN114163528B (zh) | Cd47结合分子及其应用 | |
CN113980135B (zh) | 一种结合冠状病毒双特异性抗体的抗药抗体及其制备方法和应用 | |
CN115141275A (zh) | 一种fzd7鼠源单克隆抗体及其制备方法和应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |