CN107629126B - 一种抗gst标签蛋白的纳米抗体及应用 - Google Patents
一种抗gst标签蛋白的纳米抗体及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及抗GST标签蛋白的纳米抗体及应用，其含有的VHH链由框架区FR和互补决定区CDR组成，其中，架区FR区包括下组的FR的氨基酸序列：SEQ ID NO:1所示的FR1、SEQ ID NO:2所示的FR2、SEQ ID NO:3所示的FR3以及SEQ ID NO:4所示的FR4，互补决定区CDR区包括下组的CDR的氨基酸序列：SEQ ID NO:5所示的CDR1、由SEQ ID NO:6示的CDR2、以及由SEQ ID NO:7所示的CDR3。本发明还包括抗GST标签蛋白的纳米抗体的应用。本发明的抗GST标签蛋白的纳米抗体分子小，易表达，亲和力高，可溶性好，稳定性强，免疫原性低。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白质组学及分子蛋白相互作用领域，特别涉及一种抗GST标签蛋白的纳米抗体及应用。
背景技术
当今制药产业的热点，被称为“生物导弹”的治疗性抗体药物开发异常活跃，但其共同的特点，分子太大、结构太复杂、价格太昂贵又限制了它的生产及在临床应用上的推广。例如，普通抗体每个分子含有两套重链和轻链，并与糖分子重叠在一起，从而形成抗体药物大分子特性制约了其广泛使用和疗效的发挥，而且许多疾病无法用单克隆抗体药物治疗，同时单克隆抗体在高温和强酸强碱的条件下会分解，必须在绝对零度下保存，否则会在数周内失去活性。另外，在合成单克隆抗体之前，通常需要从老鼠体内分离出抗体，再进行复杂的人源化操作以及利用生物反应器进行制备，这一过程耗时长、费用高。
对此，1993年比利时的Hamers Casterman报道了骆驼体内中天然存在一种缺失轻链的抗体，克隆重链抗体的可变区得到只有一个重链可变区组成的单域抗体(singledomain antibody，sdAb)，称为VHH抗体，VHH晶体为2.5nm，长4nm，分子量只有15KDa，约为单克隆抗体分子量的1/10，因此又称为纳米抗体(nanobody，Nb)或单域重链抗体(heavychain antibody，hcAb)，是目前已知的可结合目标抗原的最小单位，与普通抗体及重组单链抗体(single chain fragment variable，scFv)相比，化学性质更加活泼，纳米抗体具有分子小、水溶性高、稳定性强、亲和力强、特异性强、易于表达、免疫原性低以及毒性低等优点,且不像单链抗体(single—chain antibody fragment，scFv)那样容易粘连，可进行大规模生产。因此，纳米抗体作为一种新型抗体在基础研究、新药开发以及疾病的诊断和治疗以及食品科学领域具有广阔的应用前景。
目前市场上已经有针对GST的单克隆或多克隆抗体，但单克隆抗体的研发和生产过程及其繁琐和复杂，多抗特异性不高又不稳定。相比之下纳米抗体有稳定性高，特异性高，分子量小和可大规模生产的优点，有广阔的应用前景。但是到目前为止，筛选能与GST标签蛋白高亲和结合的纳米抗体的研究鲜有报道。
目前获取纳米抗体最常用的方法是噬菌体抗体库筛选技术，噬菌体展示技术是一种快速高通量的蛋白多肽展示技术，利用噬菌体展示技术，能快速高通量的筛选高亲和的靶向抗体及功能型多肽。目前利用随机合成的方法，可以将多达109的不同纳米抗体序列展示到噬菌体表面，建立起一个大库容的纳米抗体库，筛选出不同需求的纳米抗体。但是，当前纳米抗体存在半衰期短的劣势，需要采取延长半衰期的改造措施。如Fc融合、PEG化、白蛋白融合等。
发明内容
本发明的目的是为解决以上问题的至少一个，本发明提供一种抗GST标签蛋白的纳米抗体及应用。
根据本发明的第一方面，提供一种抗GST标签蛋白的纳米抗体的VHH链，包括框架区FR和互补决定区CDR，其特征在于，框架区FR区包括下组的FR的氨基酸序列：SEQ ID NO:1所示的FR1、SEQ ID NO:2所示的FR2、SEQ ID NO:3所示的FR3以及SEQ ID NO:4所示的FR4，互补决定区CDR区包括下组的CDR的氨基酸序列：SEQ ID NO:5所示的CDR1、由SEQ ID NO:6示的CDR2、以及由SEQ ID NO:7所示的CDR3。
其中，该抗GST标签蛋白的纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。
根据本发明的第二方面，提供一种抗GST标签蛋白的纳米抗体，其包含如权利要求1或2所述的抗GST标签蛋白的纳米抗体的VHH链。
根据本发明的第三方面，提供一种基因，其编码上述的抗GST标签蛋白的纳米抗体的VHH链或者上述的抗GST标签蛋白的纳米抗体。
其中，该基因具有如SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列。
根据本发明的第四方面，提供一种核苷酸构建体，其包含上述的基因。
根据本发明的第五方面，提供一种重组表达载体，其包含上述的核苷酸构建体。
根据本发明的第六方面，提供一种重组宿主细胞，其包含上述的核苷酸构建体或上述的重组表达载体。
根据本发明的第七方面，提供一种生产抗GST标签蛋白的纳米抗体的方法，其通过培养上述的重组宿主，诱导表达抗GST标签蛋白的纳米抗体的形式大量制备。
根据本发明的第八方面，提供该抗GST标签蛋白的纳米抗体的VHH链或者上述的抗GST标签蛋白的纳米抗体在制备检测GST标签蛋白材料和GST标签蛋白的诊断试剂中的应用。
本发明具有以下有益效果：
(1)分子小，药物递送。本发明抗GST标签蛋白的纳米抗体分子小，当作为靶向分子时，对活性部位(效应分子)的构象影响和空间位阻都更小，效应分子活性更高，可应用于药物传递系统中。
(2)易制造和表达：本发明抗GST标签蛋白的纳米抗体可利用大肠杆菌可高效表达。
(3)亲和力高，特异性强：本发明抗GST标签蛋白的纳米抗体具有VHH链，获得了对GST标签蛋白的高亲和力。实验证明，本发明纳米抗体与蛋白的KD可达.47E-08。
(4)性能稳定，可塑性好：本发明抗GST蛋白的纳米抗体能够其他分子偶联，能保持对抗GST蛋白的稳定的结合能力。
(4)免疫原性低，代谢特征好：本发明GST标签蛋白的纳米抗体保留了VVH链抗体的能力，又尽可能避免了非人外源蛋白的引入，兼顾了有效结合抗GST蛋白的功能和尽可能低的异源性。另外，异源性的降低除了减少超敏反应以外还能延长了其在体内的半衰期，改善代谢特征。
附图说明
通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本发明的限制。而且在整个附图中，用相同的参考符号表示相同的部件。在附图中：
图1示出了根据本发明实施方式的GST标签蛋白的纳米抗体的氨基酸结构示意图；
图2示出了根据本发明实施方式的单噬菌体的phage-ELISA结合图；其中，横坐标1为实验组，2为空白对照组，3为阴性对照组，4为阳性对照组，纵坐标为450nm吸光度值；
图3示出了根据本发明实施方式的蛋白印迹Western-blot图谱；
图4示出了根据本发明实施方式的GST标签蛋白的纳米抗体与GST标签蛋白的结合力测定示意图，平衡解离常数KD＝KD＝7.47x10-8M。
具体实施方式
下面将参照附图更详细地描述本公开的示例性实施方式。虽然附图中显示了本公开的示例性实施方式，然而应当理解，可以以各种形式实现本公开而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了能够更透彻地理解本公开，并且能够将本公开的范围完整的传达给本领域的技术人员。
实施例1：抗GST标签蛋白单域重链抗体的淘选及鉴定
采用固相淘选的方法，将GST标签蛋白用1xPBS稀释到30-100ug/ul，包被到ELISA板条上，每空加入100ul，4℃过夜包被。PBS洗三遍，每孔加入300ul4％的脱脂牛奶，37℃封闭2小时。PBS洗三遍后加入噬菌体展示库(约有1x1012CFU)，37℃孵育1小时。吸出未结合的噬菌体，加入PBS洗5-10遍(逐轮增加洗涤次数)，再PBST洗三遍后加入100ul的PH＝2.2的甘氨酸-盐酸溶液，37℃孵育5分钟。轻轻吹打板孔将吸附的噬菌体洗下来，然后加入Tris-Hcl溶液(PH＝8.8)15ul，取10ul测定滴度，其余的扩增后用于下一轮淘选。
经过三轮淘选后，随机从测滴度的平板上挑取克隆用辅助噬菌体M13K07进行救援，得到展示目的蛋白的噬菌粒。
用phage-elisa实验进行验证，加样表见如下表1所示：
表1-phage-ELISA实验验证加样表
phage-elisa的实验结果如图2所示。将阳性克隆编号为38号的阳性的克隆送去测序，得到插入的纳米抗体基因碱基序列，如SEQ ID NO:9所示。对其氨基酸序列进行分析，其具有典型的纳米抗体结构，包括四个框架区(FR区)和三个互补决定区(CDR区)，FR区提供纳米抗体的稳定结构，CDR区是抗体结合区。其纳米结构的氨基酸序列为：SEQ ID NO:8，该抗GST标签蛋白的纳米抗体的氨基酸结构示意图如图1所示，其框架区(FR1，FR2，FR3，FR4)和互补决定区(CDR1，CDR2，CDR3)的氨基酸序列分别如下：
FR1:如SEQ ID NO:1所示；
FR2:如SEQ ID NO:2所示；
FR3:如SEQ ID NO:3所示；
FR4:如SEQ ID NO:4所示；
CDR1:如SEQ ID NO:5所示；
CDR2:如SEQ ID NO:6所示；
CDR3:如SEQ ID NO:7所示。
实施例2：纳米抗体的表达和纯化
将上述碱基序列送到生物公司插入到PET28a质粒上，构建表达载体。取1ul构建好的PET28a质粒加入到50ul的BL21感受态中，冰上放置30分钟然后放入到42°水浴中热激90秒，冰上放置5分钟，然后加入600ul的LB培养基放入37°恒温箱中培养1小时。取100ul上述培养液涂到氨苄平板上，放入37°恒温培养箱中过夜培养。第二天从平板上挑取单克隆接种到1L培养基中培养，37°，220rmp/min培养，当菌液OD＝0.5时加入终浓度为0.1mM的IPTG，16°，180rmp/min，过夜诱导。第二天将菌液离心收集用50mlPBS重悬菌体后进行超声破碎，条件为200w，破碎3秒，间歇3秒。然后4°，8000g离心收集上清，过镍柱，纳米抗体吸附到镍柱上，用洗涤液(10um咪唑溶液)洗去杂蛋白，加入洗脱液(250um咪唑溶液)洗脱纳米抗体，在得到的纳米抗体溶液中加入PBS进行超滤(4000rmp/min,30min)，得到的纳米抗体是溶在PBS中，测定浓度后加入20％的甘油-80°保存备用。
实施例3：Western blot验证
Western blot步骤：取抗GST标签蛋白500ng，上样，以十二烷基磺酸钠一聚丙烯酞胺凝胶(SDS-PAGE)电泳、转膜，先后加入特异性一抗及相应二抗孵育，然后以化学发光显色法分析抗GST标签蛋白纳米抗体的效果。
1、蛋白变性
将测定完浓度的蛋白样品按照4:1的比例与5×上样缓冲溶液混合，沸水煮10min，使蛋白变性，分装后-70℃保存备用或直接用于上样。
2、分离胶的制备
1)准备配套的1.5mm两块玻板，包括一块薄板，一块厚板；
2)玻璃板用自来水冲洗晾干；
3)用水洗净梳子，自然风干；
4)将玻板夹紧置于配胶夹板上，压紧玻板，以确保不漏胶；
5)配制8％分离胶溶液10-20ml，充分混匀后迅速注入玻璃板夹层内，缓慢持续注入，加至液面距离玻璃板顶端1.5cm或距离梳子齿0.5cm；
6)在液面上覆盖一层75％乙醇至玻璃板顶端，使凝胶表面压齐并隔绝空气；
7)室温静置30min以上，待分离胶凝聚充分后，可见分离胶和75％乙醇间出现一个清晰的界面；
8)倒掉上层乙醇，倒置控干或用滤纸吸干。
3、浓缩胶的制备
1)配制浓缩胶溶液5-10ml，充分混匀后迅速注入玻璃板中已聚合的分离胶上，直至凝胶溶液到达玻璃板的上端；
2)迅速插入加样梳，使底部与前玻璃板的顶端平齐，务必避免梳子齿末端出现气泡；
3)将凝胶玻璃板移至空的垂直电泳槽内；
4)10-20min后浓缩胶聚合，然后小心拔去加样梳，轻轻用水冲洗梳孔。
4、上样
1)取加有上样缓冲液的蛋白样品于水浴锅中解冻，每孔加20μg-40μg蛋白样品；
2)根据样品数量和跑样安排在样品一侧加入3-5ul蛋白Marker。
4、SDS-PAGE垂直电泳
1)上样完成后，将胶板移至垂直电泳槽，补加入1x电泳缓冲液，连接电源；
2)浓缩胶电压一般设为90-100V，约30min后，待样品压齐，溴酚蓝到达分离胶与浓缩胶交界处；
3)将电压改为120V，电泳80-120min，直至溴酚蓝到达分离胶底部(期间可间隔时间升高电压)；
4)断开电源，结束电泳。
5、蛋白质转膜
1)将凝胶从玻璃板上剥离，切去浓缩胶及溴酚蓝以下多余的分离胶，在第一个样品的左上角处切去一角做标记；
2)取滤纸4张，PVDF膜1张。滤纸和PVDF膜大小与需要转移的凝胶相同；
3)PVDF膜提前用甲醇溶液浸湿30s激发其表面电荷，再用电转液浸泡后用；
4)正极向负极的方向，依次叠放2张滤纸-PVDF膜-凝胶-2张滤纸，并将边缘放置整齐，制作“三明治”状。避免每层间存有气泡。将“三明治”夹在电转槽板之间，置于电转槽中，使胶朝向负极膜朝向正极。将预冷的电转液置于电转槽中，4℃；转膜；
5)接通电源，以恒电压90-100V转膜60-100min。将蛋白电转移至PVDF膜上；
6)取出PVDF膜，一定避免电转温度过热，用TBST漂洗两次。
6、抗原-抗体反应
1)将PVDF膜置于5％脱脂奶粉中，与凝胶贴合的一面朝上，务必保证封闭液没过膜上表面。盖好平皿，室温下置于水平摇床上缓慢摇动1hr；
2)吸弃封闭液，TBST洗膜10min×3次；
3)将PVDF膜放入杂交袋内或器皿中，加入适当稀释后的一抗工作液，除尽气泡，封口，4℃过夜或者室温下一抗孵育一小时到三个小时；
4)回收一抗，TBST洗PVDF膜10min×3次；
5)将PVDF膜重新放入杂交袋或器皿中。室温下，加入辣根过氧化物酶标记的抗鼠、抗兔或抗羊的二抗(用TBST或封闭液按建议稀释比例稀释抗体)，赶除气泡后封口，摇床上孵育1hr；
6)二抗回收。TBST洗PVDF膜10min×3次。
7、ECL显色
1)取ECL发光试剂A液、B液各0.2-0.5ml(等体积)，混合；
2)取出PVDF膜，用滤纸吸干膜上液体。
3)将电转时与凝胶贴合的PVDF膜的一面朝下放入混合后的ECL中，约80s见荧光表达后，用镊子将PVDF膜夹起沥干，正面朝上置于干净的保鲜膜上包好；
4)将包好的膜放入压片夹中，切取适当大小的胶片，压片(压片时间视情况而定)；
5)取出胶片，置于显影液中显影1-5min，定影液中定影5-10min，水洗；
6)将底片晾干后，见图3。
实施例4：抗GST标签蛋白的纳米抗体结合力的测定
将GST标签蛋白稀释到10ug/ml，将实施例2中得到的纳米抗体稀释到50ug/ml，稀释液为PBST(PBS+0.1％的吐温-20)+0.1％的BSA，利用Fortebio分子相互作用仪按表2表加样，平衡200s，包被加样200s，平衡200s反应300s，解离300s，进行抗GST标签蛋白的纳米抗体结合力的测定，其结合力图见图4，其测定结果分别见表3，其中解离常数KD＝Kd/Ka，式中Kon为结合常数，Kdis解离常数，KD为平衡解离常数。
表2-抗GST标签蛋白的纳米抗体结合力的测定家样表
| 实验组 | 对照组 | ||
| 平衡液 | PBST+BSA | PBST+BSA | |
| 传感器包被液 | GST蛋白+PBST+BSA | GST蛋白+PBST+BSA | |
| 平衡液 | PBST+BSA | PBST+BSA | |
| 反应液 | PBST+BSA+纳米抗体 | PBST+BSA | |
| 解离液 | PBST+BSA | PBST+BSA |
表3-抗GST标签蛋白的纳米抗体平衡常数、分离常数和解离常数测定值
| 纳米抗体浓度 | KD(M) | KD Error | k<sub>on</sub>(1/Ms) | K<sub>on</sub> Error | k<sub>dis</sub>(1/s) | k<sub>dis</sub> Error |
| 80ug/ml | 7.47E-08 | 2.59E-09 | 2.99E+04 | 8.44E+02 | 2.24E-03 | 4.49E-05 |
| 40ug/ml | 7.47E-08 | 2.59E-09 | 2.99E+04 | 8.44E+02 | 2.24E-03 | 4.49E-05 |
| 20ug/ml | 7.47E-08 | 2.59E-09 | 2.99E+04 | 8.44E+02 | 2.24E-03 | 4.49E-05 |
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京大学
<120> 一种抗GST标签蛋白的纳米抗体及应用
<130> 2017
<160> 9
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> PRT
<213> FR1
<400> 1
Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Thr
1 5 10 15
Leu Ser Cys Thr
20
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> FR2
<400> 2
Met Ala Trp Phe Arg Gln Gly Pro Gly Lys Gln Arg Glu Glu Val Ser
1 5 10 15
Cys
<210> 3
<211> 38
<212> PRT
<213> FR3
<400> 3
Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
1 5 10 15
Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Thr Ser Leu Lys Pro Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
35
<210> 4
<211> 11
<212> PRT
<213> FR4
<400> 4
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> CDR1
<400> 5
Ala Ser Gly Thr Thr Leu Ala
5
<210> 6
<211> 8
<212> PRT
<213> CDR2
<400> 6
Ile Ser Arg Gly Gly Gly Ser Met
1 5
<210> 7
<211> 19
<212> PRT
<213> CDR3
<400> 7
Ala Ala Gln Arg Asn Asn Trp Cys Thr Thr Ser Pro Arg Lys Glu Glu
1 5 10 15
Tyr Asp Phe
<210> 8
<211> 120
<212> PRT
<213> 抗GST标签蛋白的纳米抗体
<400> 8
Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Thr
1 5 10 15
Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Thr Thr Leu Ala Met Ala Trp Phe Arg
20 25 30
Gln Gly Pro Gly Lys Gln Arg Glu Glu Val Ser Cys Ile Ser Arg Gly
35 40 45
Gly Gly Ser Met Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile
50 55 60
Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Thr Ser Leu
65 70 75 80
Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Ala Gln Arg Asn Asn
85 90 95
Trp Cys Thr Thr Ser Pro Arg Lys Glu Glu Tyr Asp Phe Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 9
<211> 360
<212> DNA
<213> 核苷酸序列
<400> 9
ctgcaggagt ctggaggagg cgtggtgcag gcaggtgggt ctctgacgct ctcctgtaca 60
gcctctggaa cgactttggc catggcctgg ttccgccagg ggccagggaa gcagcgcgag 120
gaggtctcat gtattagccg cggtggcggt agcatgtact atgcagactc cgtgaagggc 180
cgattcacca tctccagaga caacgccaag aacacgctgt atctgcaaat gaccagcctg 240
aaacctgagg acacggccat gtattactgt gcggcgcagc gcaacaactg gtgcacaaca 300
tccccccgga aggaggagta tgacttttgg ggccagggga cccaggtcac cgtctcctca 360
Claims (9)
1.一种抗GST标签蛋白的纳米抗体，包括框架区FR和互补决定区CDR，其特征在于，框架区FR区包括下组的FR的氨基酸序列：SEQ ID NO:1所示的FR1、SEQ ID NO:2所示的FR2、SEQID NO:3所示的FR3以及SEQ ID NO:4所示的FR4，互补决定区CDR区包括下组的CDR的氨基酸序列：SEQ ID NO:5所示的CDR1、由SEQ ID NO:6示的CDR2、以及由SEQ ID NO:7所示的CDR3。
2.如权利要求1所述的抗GST标签蛋白的纳米抗体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQID NO:8所示。
3.一种基因，其特征在于，其编码如权利要求1或2所述的抗GST标签蛋白的纳米抗体。
4.如权利要求3所述的基因，其特征在于，其具有如SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列。
5.一种核苷酸构建体，其特征在于，其包含如权利要求3所述的基因。
6.一种重组表达载体，其特征在于，其包含如权利要求5所述的核苷酸构建体。
7.一种重组宿主细胞，其特征在于，其包含如权利要求5所述的核苷酸构建体或如权利要求6所述的重组表达载体。
8.一种生产抗GST标签蛋白的纳米抗体的方法，其特征在于，其通过培养如权利要求7所述的重组宿主，诱导表达抗GST标签蛋白的纳米抗体的形式制备。
9.如权利要求1或2所述的抗GST标签蛋白的纳米抗体在制备检测GST标签蛋白的诊断试剂中的应用。
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| 沈方圆.标签蛋白GST纳米抗体的制备以及rs116614913、rs2910164多态性与ESCC易感性的关联研究.《中国优秀硕士学位论文全文数据库》.2017,(第2期),A006-430. * |
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