CN114262375B - 一种抗血蓝蛋白的特异性人源scFv抗体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗血蓝蛋白的特异性人源scFv抗体及其应用，属于抗血蓝蛋白的单克隆抗体的筛选合成技术领域。通过淘选检测，本发明提供了一种特异性人源scFv抗体，还提供了编码该抗体的核苷酸序列，以及相应的重组表达载体、宿主细胞，还提供了筛选获得的两种抗KLH的检测性抗体(全长IgG抗体)的序列。这种特异性人源scFv抗体或其相应的核苷酸序列、重组表达载体、宿主细胞、全长IgG抗体能够应用于血蓝蛋白的内参标记和制备检测试剂盒。
Description
技术领域
本发明属于单克隆抗体筛选合成技术领域，特别是识别血蓝蛋白(KLH)的特异性单克隆抗体的筛选技术。
背景技术
血蓝蛋白(Keyhole limpet hemocyanin，以下简称KLH)是在某些软体动物、节肢动物(蜘蛛和甲壳虫)的血淋巴中发现的一种游离的蓝色呼吸色素。血蓝蛋白含两个直接连接多肽链的铜离子，与含铁的血红蛋白类似，它易于氧结合和解离，是已知的惟一可与氧可逆结合的铜蛋白。血蓝蛋白在被氧化时呈青绿色，还原时呈白色，具有载氧功能、抗病毒活性、抗菌活性、凝血功能。
血蓝蛋白因其质量大，复杂性高，与其他载体蛋白相比KLH会引出更强的免疫应答，广泛用于疫苗的生产，免疫抗原的制备，可作为载体蛋白应用，交联于半抗原和其他抗原，使它们具有更强的免疫原性以用于抗体的制备。由于来源于软体动物，在系统发生上远离哺乳动物物种，在测定过程中基本不会产生与典型靶点样品发生交叉反应的抗体。作为大质量的蛋白质，KLH还含有上百个伯胺和羧基基团可以成为与戊二醛，N-羟基琥珀酰亚胺酯和EDC等交联试剂交联的靶点。基于KLH所具有的上述特性及其适用的应用领域，针对KLH特异性识别抗体的开发就具有广泛的应用意义。识别KLH蛋白的特异性抗体可标记捕捉被KLH偶联的免疫抗原，在免疫抗原的标记，内参对照方面可起到重要作用。
然而，目前现有技术中尚未发现专门针对KLH蛋白的特异性抗体的研究。
发明内容
噬菌体展示技术是利用噬菌粒载体或噬菌体载体，将多肽或蛋白质的编码基因片段克隆入噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，使外源多肽或者蛋白与特定的噬菌体衣壳蛋白融合表达，展示在噬菌体表面的一种技术。针对以上现有技术的技术空白，本发明提供了一种抗血蓝蛋白的特异性人源scFv抗体，通过分子克隆的方法，通过噬菌体展示技术，构建了人源scFv合成抗体库，以KLH蛋白为靶点蛋白，对该文库进行体外富集淘选和单克隆高通量ELISA筛选，最终获得了针对KLH的特异性人源scFv抗体序列；进一步地，对该序列进行全长IgG抗体的表达和检测，最终获得了纯化后的识别KLH蛋白的特异性单克隆抗体。具体通过以下技术实现。
一种抗血蓝蛋白的特异性人源scFv抗体，由轻链可变区和重链可变区组成；
第一组：所述轻链可变区的三个高变区CDR1、CDR2、CDR3区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示，所述重链可变区的三个高变区CDR1、CDR2、CDR3区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示；
或者，第二组：所述轻链可变区的三个高变区CDR1、CDR2、CDR3区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9所示，所述重链可变区的三个高变区CDR1、CDR2、CDR3区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12所示。
优选地，所述轻链可变区和重链可变区通过连接肽连接，所述连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示。
更优选地，所述特异性人源scFv抗体的第一组氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示；或者，所述特异性人源scFv抗体的第二组氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示。
本发明还提供了一种编码上述特异性人源scFv抗体的核苷酸序列，一种包含上述的核苷酸序列的重组表达载体，以及一种转染上述述的重组表达载体的宿主细胞。所述宿主细胞可以选用哺乳动物细胞、昆虫细胞、大肠杆菌或酵母菌。
本发明还提供了一种抗KLH的检测性抗体，第一组所述抗KLH的检测性抗体为：含有如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示的所述轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3区的氨基酸序列，以及如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示的所述重链可变区的三个高变区CDR1、CDR2、CDR3区的氨基酸序列；
或者，第二组所述抗KLH的检测性抗体为：含有如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQID NO.9所示的所述轻链可变区的三个高变区CDR1、CDR2、CDR3区的氨基酸序列，以及如SEQID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12所示的所述重链可变区的三个高变区CDR1、CDR2、CDR3区的氨基酸序列。
优选地，所述检测性抗体包含全长IgG抗体或单克隆抗体的片段，所述单克隆抗体的片段包含但不限于Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv，或上述的特异性人源scFv抗体。
更优选地，一种抗KLH的检测性抗体，为全长IgG抗体，所述全长IgG抗体的第一组氨基酸序列如SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17所示；或者，所述全长IgG抗体的第二组的氨基酸序列如SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19所示。
上述抗血蓝蛋白的特异性人源scFv抗体，可以用于血蓝蛋白的内参标记和检测试剂盒上的应用。
与现有技术相比，本发明的有益之处在于：本发明提供了一种针对KLH的特异性人源scFv抗体序列。我们对该序列进行全长IgG抗体的表达和检测，最终获得了纯化后的识别KLH蛋白的特异性单克隆抗体，该抗体能够广泛应用于血蓝蛋白的内参标记和检测试剂盒上的应用。
附图说明
图1为实施例2的纯化后的全场抗体蛋白SDS-PAGE(6％)电泳检测图。
具体实施方式
下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：抗血蓝蛋白的特异性人源scFv抗体的体外富淘选和单克隆抗体的筛选
1、单链scFv噬菌体文库的构建
(1)提取血液PBMCs细胞的总RNA并反转录为cDNA；以cDNA为模板，PCR扩增抗体可变区序列，其中包括重链可变区VH和轻链可变区VL；1％琼脂糖凝胶电泳后回收300-500bp大小的目的片段。
(2)将VH片段和VL片段，通过重叠延伸PCR方法以连接肽linker(GGGGSGGGGSGGGGSGGGGAS)连接起来；1％琼脂糖凝胶电泳后回收700-800bp大小的目的片段。
(3)将回收后的目的片段和载体pCANTAB5E(Amersham biosciences公司)用SfiI和NotI酶切后，在T4连接酶(NEB公司)的作用下，16℃连接过夜；将连接产物通过电转化转入TG1电转感受态细胞(Lucigen公司)中，铺在2YT-Amp-Glucose固体培养基(配方同下)上，37度培养过夜；
2YT培养基配方为：1.6％(W/V)Tryptone，1％(W/V)Yeast Extract，0.5％(W/V)NaCl，溶于1L蒸馏水中；
2YT-Amp-Glucose培养基的配方为：在2YT培养基中加入100μg/ml的氨苄青霉素和2％葡萄糖。
(4)刮取培养基上的菌落，混合均匀后，将菌液加入15％甘油，保存在-80℃；取部分菌液，接种到2YT-Amp-Glucose培养基中，37℃培养1-2h，至OD600＝0.4-0.6；加入辅助噬菌体，37℃培养45min-1h；3000-5000rpm离心菌液，弃上清，用同等体积的2YT-Amp-Kan培养基，重悬菌体；30℃培养过夜；次日，离心将上清转入新的离心管中；加入1/4体积的5×PEG/NaCl溶液，充分混匀后，放置冰上或者4℃环境中，静置1-2h；然后离心弃上清，将沉淀用大约PBS重悬，最终获得单链ScFv噬菌体文库。4度或-20度保存；
2YT-Amp-Kan培养基的配方为：在2YT培养基中加入100μg/ml的氨苄青霉素和50μg/ml的卡那霉素。
2、免疫管固相淘选
所用的实验试剂及原料如下表1所述。
表1实验试剂及材料
| 材料 | 货号 | 品牌(采购来源) |
| 96-well plate | 42592 | Costar |
| Tween 20 | P2287 | Sigma |
| Tris | RES3098T-B7 | Sigma |
| Glycine(甘氨酸) | G8200 | Solarbio |
| PEG | 181986 | Sigma |
| PBS | C10010500BT | Life |
| 酪蛋白 | S12003-100g | shyuanye |
| 脱脂牛奶 | 6342932 | BD |
(1)包被免疫管：抗原蛋白KLH(40-50ug/ml in CBS/PBS)，500μl每管，共两管，4℃过夜；对照管加入500μl PBS；用5ml PBST洗涤免疫管3次；
(2)封闭：5ml 5％脱脂牛奶/PBST，或者1％酪蛋白/PBST，30℃封闭1h；然后用5mlPBS洗涤1次；
(3)孵育：每个免疫管中加入500μl，总量为1011-1012(各管加入总量一致)的单链ScFv噬菌体文库，30℃孵育2h；
(4)洗涤：5ml PBST洗涤5-8次；
(5)洗脱：每个免疫管中加入500μl的Gly-HCl(pH＝2.2)洗脱噬菌体，室温振荡孵育6-8min左右；然后加入Tris-HCl(pH＝9.6)中和溶液至pH＝7.0-8.0。
3、测定洗脱后噬菌体的滴度
(1)培养大肠杆菌TG1(采购自Lucigen公司)直到OD600＝0.4-0.6；取10μL稀释的洗脱后噬菌体和190μL大肠杆菌TG1。混合。
(2)混合物在37℃孵育30min后，倒到2×YT-A(含Amp 100μg/ml)固体培养基上，37℃培养过夜。
4、洗脱噬菌体的扩增
(1)直接吸取500-600μl洗脱后的p噬菌体溶液，加入到10ml的对数期的大肠杆菌TG1菌液中，37℃静置30min，220rpm，37℃培养30min-1h。
(2)将菌液加入到30ml 2YT-Amp-Glucose培养基中，37℃，220rpm培养至OD600＝0.4-0.6左右。
(3)在菌液中加入辅助噬菌体，加入的量为0.6×液体体积×5×108×30pfu，37℃静置30min后，220rpm，培养45min-1h；
(4)3000-5000rpm离心菌液，弃上清，用同等体积的2YT-Amp-Kan培养基，重悬菌体；30℃，220rpm，培养过夜；次日，8000rpm，4℃，离心20min，将上清转入新的离心管中；加入1/4体积的5×PEG/NaCl溶液，充分混匀后，放置冰上或者4℃环境中，静置1-2h；然后8000rpm，4℃，离心30min，弃上清，将沉淀用大约1ml PBS重悬；最后8000rpm-10000rpm，4℃，离心10min，将上清转入到新的离心管中。
5、测试扩增后的噬菌体滴度
测试方法同第2步。将上述步骤1-3重复2-4轮，进行富集淘选，淘选方式过程如下表2所示，淘选结果(即滴度测试结果)如下表3所示。
表2富集淘选方式
| 轮数 | 包被抗原(μg/mL) | 封闭液 | 洗涤次数 |
| 1 | KLH(50) | 5％脱脂牛奶/PBST | 5 |
| 2 | KLH(50) | 5％酪蛋白/PBST | 6 |
| 3 | KLH(50) | 5％脱脂牛奶/PBST | 7 |
| 4 | KLH(50) | 5％酪蛋白/PBST | 8 |
表3富集淘选结果
5、多克隆噬菌体ELISA检测
(1)包被免疫板：抗原蛋白KLH(2-4μg/ml in CBS/PBS)，100μl，4℃过夜；对照孔包被100μl PBS。300μl PBST洗涤3次；
(2)封闭：300μl 5％脱脂牛奶/PBST 30℃封闭1h，300μl PBST洗涤2-3次；
(3)孵育：用PBS稀释每一轮扩增后的噬菌体，初始浓度为1012pfu/ml，稀释倍数以3倍递增；每孔中加入100μl稀释后的扩增噬菌体，30℃孵育1h；
(4)洗涤：300ul PBST洗涤4-6次；
(5)二抗：加入100ul二抗稀释液(anti-M13-HRP，1:5000),30度孵育1h；
(6)洗涤：300ul PBST洗涤4-6次；
(7)显色：加入100ul显色液TMB避光显色3-8min，加入100ul 2M HCl终止反应.酶标仪读数(450nm-620nm)；
多克隆噬菌体ELISA检测结果如下表4所示。
表4多克隆噬菌体ELISA检测结果
6、单克隆噬菌体ELISA筛选
(1)选取合适的轮数(R3和R4)，将其洗脱噬菌体稀释到合适的浓度，侵染对数期的大肠杆菌TG1，铺板；
(2)次日，从板上挑取96个(或更多)单克隆噬菌体，接入96深孔板(每孔中加入600μl 2YT-Amp-Glucose培养基)中，37℃，250rpm振荡培养2h，至菌液OD600＝0.4-0.6；
每孔吸取100μl菌液至细胞培养板中，每孔加入无菌甘油(终浓度为20％-25％)，混匀后于-20℃保存。
(3)在剩余的96深孔板(Nest公司)中加入辅助噬菌体(NEB公司)，加入的量＝0.6×液体体积×5×108×30pfu；37℃静置30min，250rpm，37℃振荡培养45min-1h。
(4)将96深孔板，4000rpm离心5min，弃上清；每孔用600μl 2YT-Amp-Kan培养基重悬菌液，30℃，250rpm，振荡培养过夜。
(5)次日，将96深孔板4000rpm离心10-15min，取上清进行ELISA实验；
(6)包被免疫板：取100μl抗原蛋白KLH(2-4ug/ml in CBS/PBS)，4℃过夜；对照孔包被100μl PBS；用300μl PBST洗涤3次。
(7)封闭：取300μl 5％脱脂牛奶/PBST，30℃封闭1h；用300μl PBST洗涤2-3次
(8)孵育：每孔中加入100μl上清噬菌体。30℃孵育1h。
(9)洗涤：300μl PBST洗涤4-6次。
(10)二抗：加入100μl二抗稀释液(anti-M13-HRP，1:5000)，30℃孵育1h
(11)洗涤：300μl PBST洗涤4-6次。
(12)显色：加入100μl显色液TMB避光显色3-8min，加入100μl 2M HCl终止反应.酶标仪读数(450nm-620nm)
单克隆噬菌体ELISA检测结果如下表5-7。表5为第三轮1-96号单克隆(R3P1)的OD600(抗原组)-OD600(对照组)结果；表6为第三轮97-192号单克隆(R3P2)的OD600(抗原组)-OD600(对照组)结果；表7为第四轮1-96号单克隆(R4P1)的OD600(抗原组)-OD600(对照组)结果。
表5 R3P1的OD600(抗原组)-OD600(对照组)结果
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
| A | 0.05 | 0.04 | 0.02 | 0.02 | 0.06 | 0.05 | 0.05 | 0.03 | 0.04 | 0.05 | 0.06 | 0.33 |
| B | 0.02 | 0.03 | 0.02 | 0.02 | 0.03 | 0.04 | 0.04 | 0.03 | 0.04 | 0.04 | 0.02 | 0.02 |
| C | 0.02 | 0.03 | 0.02 | 0.02 | 0.17 | 0.02 | 0.04 | 0.03 | 0.03 | 0.03 | 0.03 | 0.02 |
| D | 0.02 | 0.03 | 0.02 | 0.02 | 0.03 | 0.04 | 0.02 | 0.02 | 0.04 | 0.03 | 0.04 | 0.04 |
| E | 0.02 | 0.03 | 0.02 | 0.03 | 0.04 | 0.03 | 0.02 | 0.02 | 0.04 | 0.05 | 0.03 | 0.04 |
| F | 0.02 | 0.03 | 0.02 | 0.02 | 0.15 | 0.02 | 0.04 | 0.03 | 0.03 | 1.21 | 0.20 | 0.05 |
| G | 0.02 | 0.04 | 0.02 | 0.02 | 0.03 | 0.02 | 0.04 | 0.03 | 0.04 | 0.05 | 0.03 | 0.04 |
| H | 0.02 | 0.03 | 0.03 | 0.04 | 0.03 | 0.05 | 0.12 | 0.04 | 0.25 | 0.04 | 0.04 | 0.32 |
表6 R3P2的OD600(抗原组)-OD600(对照组)结果
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
| A | 0.12 | 3.79 | 0.07 | 0.03 | 0.03 | 0.03 | 0.03 | 0.04 | 0.02 | 0.04 | 0.06 | 0.11 |
| B | 0.04 | 0.05 | 0.04 | 0.03 | 0.03 | 0.02 | 0.05 | 0.04 | 0.03 | 0.03 | 0.03 | 0.05 |
| C | 0.04 | 0.03 | 0.04 | 0.02 | 0.02 | 0.03 | 0.05 | 0.03 | 0.05 | 0.03 | 0.03 | 1.08 |
| D | 0.02 | 0.03 | 0.02 | 0.04 | 0.03 | 0.03 | 0.02 | 0.03 | 0.03 | 0.04 | 0.03 | 0.03 |
| E | 0.03 | 0.02 | 0.04 | 0.04 | 0.03 | 0.04 | 0.03 | 0.02 | 0.08 | 0.02 | 0.02 | 0.04 |
| F | 0.03 | 0.04 | 0.03 | 0.03 | 0.03 | 0.04 | 0.01 | 0.04 | 0.02 | 0.02 | 0.03 | 0.06 |
| G | 4.08 | 0.05 | 0.04 | 0.03 | 3.48 | 0.04 | 0.04 | 0.03 | 0.02 | 0.04 | 0.06 | 0.06 |
| H | 0.04 | 1.30 | 0.04 | 0.03 | 0.03 | 0.02 | 0.04 | 0.05 | 0.05 | 0.05 | 0.05 | 1.69 |
表7 R4P1的OD600(抗原组)-OD600(对照组)结果
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
| A | 4.35 | 0.08 | 1.41 | 0.10 | 0.05 | 0.04 | 0.05 | 0.08 | 0.05 | 0.06 | 0.09 | 0.25 |
| B | 1.38 | 0.93 | 0.02 | 0.02 | 0.03 | 1.01 | 0.02 | 0.03 | 0.03 | 0.02 | 0.03 | 1.35 |
| C | 1.11 | 0.04 | 0.03 | 0.06 | 0.02 | 0.02 | 0.02 | 0.02 | 0.02 | 0.03 | 0.03 | 1.35 |
| D | 1.18 | 0.94 | 1.23 | 0.03 | 0.03 | 0.02 | 0.02 | 0.03 | 1.11 | 0.12 | 0.03 | 0.04 |
| E | 0.06 | 0.03 | 0.02 | 0.02 | 0.03 | 0.03 | 0.02 | 0.03 | 0.03 | 0.04 | 0.03 | 1.40 |
| F | 1.19 | 0.03 | 0.03 | 0.04 | 0.03 | 0.03 | 0.03 | 1.10 | 0.03 | 0.04 | 0.03 | 0.07 |
| G | 0.08 | 0.08 | 1.21 | 0.03 | 0.03 | 0.03 | 1.12 | 0.03 | 0.03 | 0.07 | 0.94 | 0.05 |
| H | 0.09 | 0.05 | 1.20 | 0.04 | 0.03 | 0.04 | 0.03 | 0.05 | 0.05 | 1.38 | 1.39 | 0.18 |
将上述表5-7中，OD600(抗原组)-OD600(对照组)大于1的克隆定为阳性克隆，将阳性克隆进行测序。排除掉错误抗体序列和重复抗体序列，最终得到了2条高亲和力的抗体序列，即高特异性scFv抗体氨基酸序列如下：
KLH-R4P1-B1(即SEQ ID NO.14)
QVQLVQSGVEVKKPGESLRISCKASGYNFATYWIGWVRQMPGKGLEWMGIIYPGDSDTRYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAIYYCARQRASYPHWYFDLWGRGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGASDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAPSLLVYAASNLQTGVEPRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDFATYYCLQTNGFPFTFGPGTKVEIK
>KLH-R3P2-A2(即SEQ ID NO.15)
QVQLQQSGAEVKMPGASVKVSCNVSGYRLSELPMHWVRQAPGKGLEWVGGFDPEDGQRIYAQRFQGRVTMTEDTSTDTAYMDLGSLRSEDTAVYYCATTIELGDDAFDIWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGASQAGLTQPPSVSVAPGTTARVTCGGNSIGSRNVHWYQQKPGQAPVLVVYDDNDRPSGIPERFSGSNSGDTATLTISRVEAGDEADYHCQVWDGDSDNRVVFGGGTKLTVL。
实施例2：构建针对KLH特异性识别的全长IgG抗体
1、基因合成
将实施例1获得的两条scFv抗体的重链和轻链序列进行基因合成，重组克隆连接至pcDNA3载体(采购自Thermo公司)中，1(+)；将获得的重组质粒转入TOP10克隆菌株，挑取阳性克隆子测序，具体转入方法为：
取50μL大肠杆菌感受态细胞，加入适量质粒(体积不得超过4μL)冰浴30min后，42℃热激90s，马上放回冰上，冰浴2min；加400μL LB培养基，于37℃摇床慢摇振荡培养45-60min；取50-100μL涂在含有氨苄青霉素(100μg/mL)的LB固体培养基上，37℃倒置培养过夜，即得所需菌株。
2、无内毒素质粒抽提
使用Atagenix公司Endotoxin Free质粒重量抽提试剂盒抽提表达质粒，经LAL法测定<0.1EU/μg。
3、待转染细胞预处理
将处于对数生长期的293T细胞(ATCC)用Trypsin消化后稀释至4×105/mL的密度，种于2L的滚瓶中；每个滚瓶加200ml DMEM高糖培养基(含3％胎牛血清，来源于Gibco)，调节滚瓶转速至20转/小时，使细胞均匀贴到转瓶表面，约24h左右，当细胞贴壁面汇合至90％时进行转染。
4、细胞转染
取100μg无内毒素质粒，加入13ml OptiSFM，混匀后加入250μl转染试剂，再次混匀后室温孵育20min。将DNA-转染试剂复合物滴加至滚瓶中，轻轻混匀，调节滚瓶转速20转/h，37℃培养箱培养10h后换DMEM高糖培养基(含3％胎牛血清)，调节滚瓶转速40转/h；表达4天后收取上清。
5.重组抗体纯化
取ProteinA纯化柱，用5-10倍柱体积的PBS平衡柱子；取步骤4的细胞上清以1ml/min的速度上样至ProteinA纯化柱中。用20mM PB缓冲液以0.5ml/min流速洗脱杂样，至流出液OD280值到达基线；当蛋白值至核酸蛋白检测仪数值稳定不变时准备洗脱；用Elution-Buffer(0.1M NaCl，0.1M甘氨酸，pH值＝3.0)以1ml/min流速洗脱目的抗体，收集流出液，并用pH＝9.0Tris-HCL使其pH值恢复至中性，将收集的抗体溶液加入透析袋中，用20mM PBS(pH＝7.4)透析过夜，透析后的样品进行SDS-PAGE纯度分析和BCA浓度检测。纯化后的全场抗体蛋白SDS-PAGE(6％)电泳检测图如图1所示。
6、纯化后的全长抗体蛋白ELISA检测
(1)包被免疫板：抗原蛋白KLH(5ug/ml in CBS/PBS)，100μl，4℃过夜。对照孔包被100μl PBS；用300μl PBST洗涤3次；
(2)封闭：300μl 5％脱脂牛奶/PBST，30℃封闭1h；用300μl PBST洗涤2-3次；
(3)孵育：用PBS稀释纯化后的全长抗体蛋白，稀释倍数两倍递增；初始浓度为1μg/ml；每孔中加入100μl稀释后的全长抗体蛋白；30℃孵育1h；
(4)洗涤：300μl PBST洗涤4-6次；
(5)二抗：加入100μl二抗稀释液(anti-Human IgG-HRP，1:10000)，30℃孵育1h；
(6)洗涤：300μl PBST洗涤4-6次；
(7)显色：加入100μl显色液TMB避光显色3-8min，加入100μl 2M HCl终止反应，酶标仪读数(450nm-620nm)；
全长抗体蛋白ELISA检测结果如下表8所示。经测序，第一组全长IgG抗体KLH-R4P1-B1-H和KLH-R4P1-B1-L的全长氨基酸序列如SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17所示；第二组全长IgG抗体KLH-R3P2-A2-H和KLH-R3P2-A2-L的全长氨基酸序列如SEQ ID NO.18、SEQID NO.19所示。
表8全长抗体蛋白ELISA检测结果
序列表
<110> 普健生物（武汉）科技有限公司
<120> 一种抗血蓝蛋白的特异性人源scFv抗体及其应用
<160> 19
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gln Gly Ile Arg Asn Asp
1 5
<210> 2
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Ala Ala Ser
1
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Leu Gln Thr Asn Gly Phe Pro Phe Thr
1 5
<210> 4
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Gly Tyr Asn Phe Ala Thr Tyr Trp
1 5
<210> 5
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr
1 5
<210> 6
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Ala Arg Gln Arg Ala Ser Tyr Pro His Trp Tyr Phe Asp Leu
1 5 10
<210> 7
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Ser Ile Gly Ser Arg Asn
1 5
<210> 8
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Asp Asp Asn
1
<210> 9
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Gln Val Trp Asp Gly Asp Ser Asp Asn Arg Val Val
1 5 10
<210> 10
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Gly Tyr Arg Leu Ser Glu Leu Pro
1 5
<210> 11
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Phe Asp Pro Glu Asp Gly Gln Arg
1 5
<210> 12
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Ala Thr Thr Ile Glu Leu Gly Asp Asp Ala Phe Asp Ile
1 5 10
<210> 13
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ala Ser
20
<210> 14
<211> 249
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Val Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Asn Phe Ala Thr Tyr
20 25 30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Arg Ala Ser Tyr Pro His Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly
100 105 110
Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ala Ser Asp Ile
130 135 140
Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg
145 150 155 160
Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp Leu Gly
165 170 175
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Ser Leu Leu Val Tyr Ala
180 185 190
Ala Ser Asn Leu Gln Thr Gly Val Glu Pro Arg Phe Ser Gly Ser Gly
195 200 205
Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp
210 215 220
Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Thr Asn Gly Phe Pro Phe Thr Phe
225 230 235 240
Gly Pro Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
245
<210> 15
<211> 250
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Met Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Asn Val Ser Gly Tyr Arg Leu Ser Glu Leu
20 25 30
Pro Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Gly Phe Asp Pro Glu Asp Gly Gln Arg Ile Tyr Ala Gln Arg Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Asp Leu Gly Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Thr Ile Glu Leu Gly Asp Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ala Ser Gln Ala Gly
130 135 140
Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Thr Thr Ala Arg
145 150 155 160
Val Thr Cys Gly Gly Asn Ser Ile Gly Ser Arg Asn Val His Trp Tyr
165 170 175
Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr Asp Asp Asn
180 185 190
Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly
195 200 205
Asp Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly Asp Glu Ala
210 215 220
Asp Tyr His Cys Gln Val Trp Asp Gly Asp Ser Asp Asn Arg Val Val
225 230 235 240
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
245 250
<210> 16
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Val Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Asn Phe Ala Thr Tyr
20 25 30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Arg Ala Ser Tyr Pro His Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly
100 105 110
Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 17
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp
20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Ser Leu Leu Val
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Gln Thr Gly Val Glu Pro Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Thr Asn Gly Phe Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 18
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Met Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Asn Val Ser Gly Tyr Arg Leu Ser Glu Leu
20 25 30
Pro Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Gly Phe Asp Pro Glu Asp Gly Gln Arg Ile Tyr Ala Gln Arg Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Asp Leu Gly Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Thr Ile Glu Leu Gly Asp Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 19
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
Gln Ala Gly Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Thr
1 5 10 15
Thr Ala Arg Val Thr Cys Gly Gly Asn Ser Ile Gly Ser Arg Asn Val
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr
35 40 45
Asp Asp Asn Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asp Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr His Cys Gln Val Trp Asp Gly Asp Ser Asp Asn
85 90 95
Arg Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Arg Thr Val
100 105 110
Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys
115 120 125
Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg
130 135 140
Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn
145 150 155 160
Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser
165 170 175
Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys
180 185 190
Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr
195 200 205
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
Claims (10)
1.一种抗血蓝蛋白的特异性人源scFv抗体，其特征在于，由轻链可变区和重链可变区组成；
第一组：所述轻链可变区的三个高变区CDR1、CDR2、CDR3区的氨基酸序列分别如SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示，所述重链可变区的三个高变区CDR1、CDR2、CDR3区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示；
或者，第二组：所述轻链可变区的三个高变区CDR1、CDR2、CDR3区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9所示，所述重链可变区的三个高变区CDR1、CDR2、CDR3区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12所示。
2.根据权利要求1所述的抗血蓝蛋白的特异性人源scFv抗体，其特征在于，所述轻链可变区和重链可变区通过连接肽连接，所述连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示。
3.根据权利要求1或2所述的抗血蓝蛋白的特异性人源scFv抗体，其特征在于，第一组所述特异性人源scFv抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示；或者，第二组所述特异性人源scFv抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示。
4.一种编码权利要求3所述特异性人源scFv抗体的核酸分子。
5.一种包含权利要求4所述的核酸分子的重组表达载体。
6.一种转染有权利要求5所述的重组表达载体的宿主细胞，其特征在于：所述宿主细胞为哺乳动物细胞、昆虫细胞、大肠杆菌或酵母菌。
7.一种抗血蓝蛋白的检测性抗体，其特征在于，第一组所述抗血蓝蛋白的检测性抗体为：含有如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示的轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3区的氨基酸序列，以及如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示的重链可变区的三个高变区CDR1、CDR2、CDR3区的氨基酸序列；
或者，第二组所述抗血蓝蛋白的检测性抗体为：含有如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQID NO.9所示的轻链可变区的三个高变区CDR1、CDR2、CDR3区的氨基酸序列，以及如SEQ IDNO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12所示的重链可变区的三个高变区CDR1、CDR2、CDR3区的氨基酸序列。
8.根据权利要求7所述的抗血蓝蛋白的检测性抗体，其特征在于，所述检测性抗体为全长IgG抗体或单克隆抗体的抗原结合片段，所述单克隆抗体的抗原结合片段选自Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv或scFv。
9.根据权利要求8所述的抗血蓝蛋白的检测性抗体，其特征在于，第一组所述全长IgG抗体的重链和轻链的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17所示；或者，第二组所述全长IgG抗体的重链和轻链的的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19所示。
10.一种权利要求1或2所述的特异性人源scFv抗体，或权利要求4所述的核酸分子，或权利要求5所述的重组表达载体，或权利要求6所述的宿主细胞，或权利要求7-9任一项所述的抗血蓝蛋白的检测性抗体在制备血蓝蛋白的内参标记和检测试剂盒中的应用。
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|---|---|---|---|
| CN202111447053.4A CN114262375B (zh) | 2021-11-30 | 2021-11-30 | 一种抗血蓝蛋白的特异性人源scFv抗体及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
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|---|---|---|---|
| CN202111447053.4A CN114262375B (zh) | 2021-11-30 | 2021-11-30 | 一种抗血蓝蛋白的特异性人源scFv抗体及其应用 |
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Family Applications (1)
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Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101857866A (zh) * | 2010-04-23 | 2010-10-13 | 江苏省农业科学院 | 微囊藻毒素lr的单链抗体的筛选方法及其鉴定 |
-
2021
- 2021-11-30 CN CN202111447053.4A patent/CN114262375B/zh active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101857866A (zh) * | 2010-04-23 | 2010-10-13 | 江苏省农业科学院 | 微囊藻毒素lr的单链抗体的筛选方法及其鉴定 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Evaluation of human antibody responses to keyhole limpet hemocyanin on a carbohydrate microarray;Oyindasola Oyelaran等;《Proteomics Clin Appl》;第4卷(第3期);第285-294页 * |
| 血蓝蛋白免疫学功能、分子基础与应用新进展;张泽蕙等;《汕头大学学报(自然科学版)》;第31卷(第01期);第46-54页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN114262375A (zh) | 2022-04-01 |
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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