CN114409792B

CN114409792B - 抗EphB4纳米抗体

Info

Publication number: CN114409792B
Application number: CN202111452060.3A
Authority: CN
Inventors: 李丹; 梅超明; 杨帆; 单鸿
Original assignee: Fifth Affiliated Hospital of Sun Yat Sen University
Current assignee: Fifth Affiliated Hospital of Sun Yat Sen University
Priority date: 2021-12-01
Filing date: 2021-12-01
Publication date: 2022-08-12
Anticipated expiration: 2041-12-01
Also published as: CN114409792A

Abstract

本发明提出一种纳米抗体。该抗体具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，其中包含4个FR和3个CDR。所述纳米抗体能够特异性靶向人EphB4蛋白，具有分子量小、高水溶性、高耐性、高稳定性，高抗原结合性、低免疫原性等特点。

Description

抗EphB4纳米抗体

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，本发明涉及纳米抗体及其制备方法和应用，该纳米抗体可应用于EphB4蛋白检测试剂及治疗性抗体的研发。

背景技术

肝配蛋白受体B4（Ephrin type-B receptor 4, EphB4）属于最大的受体酪氨酸激酶家族，据相关文献报道其与 Ephrin-B2 配体相互作用后可诱导血管新生，发育以及成熟。EphB4在许多种癌症中有过表达，如乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、黑色素瘤和卵巢癌等，主要作用是调节恶性肿瘤的血管化。

然而，针对EphB4的单克隆抗体通常具有分子量大，表达以及纯化工艺较为复杂，免疫源性较高等不足。纳米抗体，一种通过噬菌体展示技术快速获得的高亲和力抗体，其具有分子量小（约15kD），体积小，结构简单，易于进行基因改造，抗原特异性好，组织穿透力强，稳定性高等特点，为抗体诊断治疗提供了新的思路和方向，因此在疾病的诊断及治疗方面有广阔的应用前景。基于此，我们研发了全新的针对EphB4的纳米抗体，以用于特异性的诊断分子探针的构建。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种针对EphB4的纳米抗体，同时提供该纳米抗体的编码序列以及制备方法。

本申请的发明人采用羊驼免疫与噬菌体展示技术相互结合，开发出了靶向EphB4的高亲和纳米抗体。

一方面，本发明提出了一种纳米抗体。根据本发明的实施例，所述纳米抗体包括：(1)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。根据本发明实施例的纳米抗体是特异性靶向EphB4蛋白的抗体，能够结合天然构象的EphB4蛋白，并且所述纳米抗体具有如下较普通抗体的独特性质:(1) 高水溶性、高耐性、高稳定性，高抗原结合性、低免疫原性以及较强的组织穿透力。

根据本发明的实施例，所述纳米抗体具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列，所述纳米抗体的框架区1(FR1)具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，所述纳米抗体的互补决定区1(CDR1)具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，所述纳米抗体的框架区2(FR2)具有SEQ IDNO:4所示的氨基酸序列，所述纳米抗体的互补决定区2(CDR2)具有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列，所述纳米抗体的框架区3(FR3)具有SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列，所述纳米抗体的互补决定区3(CDR)具有SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列，所述纳米抗体的框架区4(FR4)具有SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。

又一方面，本发明提出了一种核酸。根据本发明的实施例，所述核酸为：编码前面所述纳米抗体的核酸或其互补序列。根据本发明实施例的核酸特异性编码前面所述的纳米抗体，所述纳米抗体能够特异性靶向EphB4，结合天然构象的EphB4，具有高水溶性、高耐性、高稳定性，高抗原结合性、低免疫原性以及较强的组织穿透力。

根据本发明的实施例，所述核酸具有SEQ ID NO:9所示核苷酸序列。

根据本发明实施例的上述核酸所编码的蛋白具有与EphB4显著的高亲和活性，且该蛋白具有典型的纳米抗体的结构，即由框架区(FR1，FR2，FR3和FR4)和互补决定区(CDR1，CDR2和CDR3)构成。

需要说明的是，对于本发明权利要求书和说明书中所提及的核酸，本领域技术人员应当理解，实际包括互补双链的任意一条，或者两条。为了方便，在本权利要求书和说明书中，虽然多数情况下只给出了一条链，但实际上也公开了与之互补的另一条链。另外，本申请中的基因序列包括DNA形式或RNA形式，公开其中一种，意味着另一种也被公开。

再一方面，本发明提供了一种表达载体，其包含上述核酸。

又一方面，本发明提供了一种宿主细胞，其包含上述表达载体。

还一方面，本发明提供了上述EphB4纳米抗体的制备方法，包括：

a)构建针对EphB4蛋白的纳米抗体文库；

b)亲和淘选以及淘选后的文库扩增；

c)特异性噬菌体克隆的鉴定及分析；

d)在原核表达系统中表达纯化EphB4纳米抗体。

有益效果：与传统抗体制备技术相比，本发明将羊驼免疫与噬菌体展示技术相互结合，充分利用了噬菌体展示技术的优势——(1)较大的库容量，筛选操作简单，通量高；(2)高效率的淘选使得成功挑选微量存在但亲和力高的噬菌体成为可能，并能通过感染细菌而得到富集；(3)可以直接得到抗体基因，便于进一步构建各种基因工程抗体，还可用于一些难于制备的抗体，如弱免疫原、毒性抗原等，以及人源化抗体。所获得纳米抗体，较传统抗体，具有明显的高水溶性、高耐性、高稳定性，高抗原结合性、低免疫原性以及较强的组织穿透力的优势。

本发明的优点如下：本发明将重组EphB4蛋白免疫羊驼，随后利用该羊驼外周血淋巴细胞建立了针对于EphB4的纳米抗体基因库，试验中将EphB4偶联在酶标板上，以此形式的抗原利用噬菌体展示技术筛选免疫性的纳米抗体基因库（羊驼重链抗体噬菌体展示基因库），从而获得了针对EphB4特异性的纳米抗体基因，将此基因转至大肠杆菌中，从而建立了能在大肠杆菌中高效表达的纳米抗体株。

附图说明

图1显示实施例的免疫后羊驼血清中EphB4抗体ELISA检测结果图。

图2显示实施例的SDS-PAGE电泳检测EphB4纳米抗体的表达以及纯化的结果图。

图3显示实施例的经纯化的EphB4纳米抗体亲和力的ELISA检测结果图。

具体实施方式

下面通过具体实施例进一步描述本发明，但本发明不仅限于所述实施例。

实施例1

构建针对EphB4蛋白的纳米抗体文库

将重组EphB4蛋白与弗氏佐剂混合后免疫羊驼，共免疫4次。4次免疫结束后，提取50 mL羊驼外周血淋巴细胞并提取总RNA；然后通过Nest-PCR技术克隆抗体的VHH区，并将克隆产物通过同源重组的方法插入噬菌体，以获得噬菌体展示库。

实施例2

亲和淘选以及淘选后的文库扩增

(1) 亲和淘选

1）将重组EphB4蛋白用PH值为9.6的碳酸盐缓冲液稀释至终浓度为5 μg /mL，按100µL/孔加入酶标孔中，每个靶分子包被8孔，4℃包被过夜；

2）弃包被液，PBS 洗涤3次，每孔加入300 µL 3% BSA-PBS封闭液，37℃封闭1h；

3）PBS洗涤3次，加入100 µL噬菌体文库，37℃孵育1h；

5）吸出未结合的噬菌体，用PBST洗涤6次，PBS洗涤2次；

6）加入100 µL Gly-HCl 洗脱液，37℃孵育8min，洗脱特异性结合的噬菌体；将该洗脱液转移至1.5 mL无菌离心管中，迅速用10 μL Tris-HCl中和缓冲液中和；

7）取10µL进行梯度稀释，测定滴度，计算淘选回收率，其余洗脱物混合后进行扩增和纯化，用于下一轮亲和淘选，改变淘选条件，淘选条件如表1：

表1 亲和淘选条件

轮次

抗原包被浓度(µg/mL)

封闭液

文库投入量(cfu)

结合时间(h)

PBST浓度

PBST洗涤次数

1

5

BSA-PBS

2×10<sup>11</sup>

1

0.1%

6

(2) 淘选后文库的扩增

1)将淘选洗脱物与处于对数生长前期的E.coli TG1培养物5 mL混匀，37 ℃，静置30 min，220 r/min振荡培养30 min；1000g离心15 min，去上清，用500 μl 2×YT重悬涂布于200 mm 2×YT-GA平板；

2)用10 ml 2×YT液体培养基刮菌，取500 μl悬液加入50 ml 2×YT液体培养基中，37℃振摇30 min；按cell : phage=1:20的比例加入M13K07辅助噬菌体，37℃静置30min，220 r/min振荡培养30 min；将培养物分装于离心管中，25 ℃，5000 r/min，10 min，细胞沉淀以50 mL 2×YT-AK液体培养基重悬，30℃，230 r/min 振荡培养过夜；

3)将过夜培养物4 ℃，10000 r/min 离心 20 min，将上清转移至新离心管，加入1/5体积的PEG-NaCl，混匀后置于 4℃ 2 h 以上；

4）4 ℃，10000 r/min，20 min，去除上清，将沉淀重悬于 1 mL PBS 中，加入 1/5体积的 PEG/NaCl，混匀后置于 4℃ 1 h 以上；

5）4 ℃，12000 r/min，2 min，去除上清，将沉淀悬浮于200 µL PBS中，即为扩增产物，测定滴度，用于下一轮淘选或者分析。

实施例3

特异性噬菌体克隆的鉴定及分析

(1) 噬菌粒的救援

1）从第一轮淘选洗脱物滴度的平板上，用灭菌牙签各随机挑取96个单克隆接种于1 mL 2×YT-A中，37℃，220 r/min振荡培养8 h；

2）取200 µL上述培养物，按cell：phage = 1：20的比例加入M13K07噬菌体，37℃，静置15 min，220 r/min振荡培养45 min；

3）补加800 µL体积的2×YT-AK，30℃，振荡培养过夜；

4）第二天12000 rpm离心2 min，取上清，用于单克隆ELISA鉴定；

(2) 阳性噬菌体克隆的鉴定

1）将重组人EphB4蛋白用PH值为9.6的碳酸盐缓冲液稀释至终浓度为 2 μg /mL，按100 µL/孔加入酶标孔中，4℃包被过夜；

2）弃包被液，PBST洗涤3次，每孔加入300 µL 5%脱脂牛奶，37℃封闭1 h；

3）PBST洗涤3次，每孔加入50 μL噬菌体培养菌液上清和50 μL 5%脱脂牛奶，37℃，孵育1 h；

4）PBST洗涤5次，加入辣根过氧化物酶标记的抗M13抗体（用5%脱脂奶粉按1:10000稀释），100 μL/孔，37℃作用1 h；

5）PBST洗板6次。加入TMB显色液显色，100 μL/孔，37℃，7min，加入终止液终止反应，50 μL/孔，于450 nm下测光密度；

(3) 阳性噬菌体克隆的序列分析

将阳性克隆进行测序分析。

实施例4

在原核表达系统中表达纯化EphB4纳米抗体

1)将前面测序分析获得不同克隆株的VHH片段克隆到BL21(DE3)原核表达载体中；

2)涂布LB平板 (50 ug/ml 卡那霉素)；

3)挑选单个菌落接种在15mL含有卡那霉素的LB培养液中，37℃摇床培养过夜；

4)接种1mL的过夜菌种至300 mL LB培养基中，37℃摇床培养，培养到OD值达到0.6-1时，加入IPTG，16 ℃摇床培养16-20 h；

5)离心收菌，将菌体破碎以获得抗体粗提液；

6)经镍柱离子亲和层析纯化抗体蛋白，采用咪唑梯度洗脱法，低浓度咪唑洗脱液（30 mmol）用于洗去杂带，高浓度咪唑洗脱液（400 mmol）最终可制备纯度达90%以上的蛋白；

7)然后采用分子排阻色谱法进行进一步提纯；

通过上述方法，本发明得到EphB4纳米抗体A65。

A65 (SEQ ID NO:1)

QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSAYVMAWFRQAPGKEREFVAAISRTAVYTTYADSVKGRFTISRDFAKDTVYLQMDSLKPVDTAVYYCAADSAVDYRRTYYSPGDFGSWGQGTQVTVSS

FR1: QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAAS (SEQ ID NO:2)

CDR1: GRTFSAYV (SEQ ID NO:3)

FR2: MAWFRQAPGKEREFVAA (SEQ ID NO:4)

CDR2: ISRTAVYT (SEQ ID NO:5)

FR3: TYADSVKGRFTISRDFAKDTVYLQMDSLKPVDTAVYYC (SEQ ID NO:6)

CDR3: AADSAVDYRRTYYSPGDFGS (SEQ ID NO:7)

FR4: WGQGTQVTVSS (SEQ ID NO:8)

整体核苷酸序列：

CAGGTGCAGCTCGTGGAGTCAGGTGGAGGATTGGTGCAGGCTGGGGGCTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGACGCACCTTCAGTGCCTATGTTATGGCCTGGTTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGAGCGTGAGTTTGTAGCAGCTATTAGCAGGACTGCCGTTTACACAACCTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACTTCGCCAAGGACACGGTGTATCTGCAAATGGACAGCCTGAAACCTGTGGACACGGCCGTTTATTACTGTGCAGCGGATTCGGCGGTAGACTATAGACGTACTTACTACTCCCCCGGGGACTTTGGTTCCTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCG (SEQ ID NO:9)。

序列表

<110> 中山大学附属第五医院

<120> 抗EphB4纳米抗体

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 127

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ala Tyr

20 25 30

Val Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ala Ala Ile Ser Arg Thr Ala Val Tyr Thr Thr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Phe Ala Lys Asp Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asp Ser Leu Lys Pro Val Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Asp Ser Ala Val Asp Tyr Arg Arg Thr Tyr Tyr Ser Pro Gly

100 105 110

Asp Phe Gly Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 2

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser

20 25

<210> 3

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Gly Arg Thr Phe Ser Ala Tyr Val

1 5

<210> 4

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala

1 5 10 15

Ala

<210> 5

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Ile Ser Arg Thr Ala Val Tyr Thr

1 5

<210> 6

<211> 38

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Thr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Phe

1 5 10 15

Ala Lys Asp Thr Val Tyr Leu Gln Met Asp Ser Leu Lys Pro Val Asp

20 25 30

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

35

<210> 7

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Ala Ala Asp Ser Ala Val Asp Tyr Arg Arg Thr Tyr Tyr Ser Pro Gly

1 5 10 15

Asp Phe Gly Ser

20

<210> 8

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 9

<211> 381

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

caggtgcagc tcgtggagtc aggtggagga ttggtgcagg ctgggggctc tctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggacg caccttcagt gcctatgtta tggcctggtt ccgccaggct 120

ccagggaagg agcgtgagtt tgtagcagct attagcagga ctgccgttta cacaacctat 180

gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagact tcgccaagga cacggtgtat 240

ctgcaaatgg acagcctgaa acctgtggac acggccgttt attactgtgc agcggattcg 300

gcggtagact atagacgtac ttactactcc cccggggact ttggttcctg gggccagggg 360

acccaggtca ccgtctcctc g 381

Claims

1.一种针对EphB4的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；

其框架区为SEQ ID NO:2所示的FR1，SEQ ID NO:4所示的FR2，SEQ ID NO:6所示的FR3，SEQ ID NO:8所示的FR4；

其互补决定区为SEQ ID NO:3所示的CDR1，SEQ ID NO:5所示的CDR2，SEQ ID NO:7所示的CDR3。

2.一种核酸，其特征在于，所述核酸为：编码权利要求1所述抗体的核酸。

3.一种表达载体，其包含权利要求2所述的核酸。

4.一种宿主细胞，其包含权利要求3所述的表达载体。