发明内容
有鉴于此,本发明的目的在于提供一种人表皮生长因子受体2的单域抗体、检测试剂盒及其应用,所述单域抗体与人表皮生长因子受体2具有较高的结合亲和力,从而实现血清Her2蛋白水平的检测和相关肿瘤的治疗目的。
本发明提供了一种人表皮生长因子受体2的单域抗体,所述单域抗体包括以下方案:
A.所述单域抗体为FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4;
所述FR1、FR2、FR3和FR4为框架区;所述CDR1、CDR2和CDR3为互补决定区;所述CDR1的氨基酸序列为SEQ ID No.5;所述CDR2的氨基酸序列为SEQ ID No.6;所述CDR3的氨基酸序列为SEQ ID No.7;
B.与方案A中所述单域抗体的氨基酸序列相似度至少80%的多肽。
优选的,方案A中FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4为单域抗体pHxA5,氨基酸序列为SEQ ID No.8。
优选的,所述单域抗体为与方案A所述单域抗体的氨基酸序列相似度至少90%的多肽。
本发明提供了一种人表皮生长因子受体2的人源化单域抗体HpHx5A,所述人源化单域抗体HpHx5A的氨基酸序列为SEQ ID No.10。
本发明提供了所述单域抗体或所述人源化单域抗体HpHx5A在制备检测人表皮生长因子受体2水平、肿瘤分型或乳腺癌复发与转移的早期判断及预后评估的试剂或试剂盒中的应用。
本发明提供了所述单域抗体或所述人源化单域抗体HpHx5A在制备预防和/或治疗人表皮生长因子受体2阳性的肿瘤的药物中的应用。
本发明提供了一种基于免疫反应技术的人表皮生长因子受体2的检测试剂盒,包含所述单域抗体或所述人源化单域抗体HpHx5A。
本发明提供了一种体外表达所述人表皮生长因子受体2的单域抗体或所述人源化单域抗体HpHx5A的方法,包括以下步骤:
1)依次用乳腺癌细胞株BT474和Her2-ECD重组蛋白抗原从羊驼的非免疫单域抗体基因库中筛选获得特异性单域抗体株;
2)PCR扩增所述特异性单域抗体株,得到的PCR产物构建重组质粒;
所述PCR扩增用引物为SEQ ID No.12和SEQ ID No.13;
3)将所述重组质粒转化入原核生物中重组表达单域抗体蛋白。
优选的,所述PCR扩增的反应条件:94℃,3min;94℃,30s,72℃,40s,55℃,30s,共30个循环;72℃,7min。
本发明提供的人表皮生长因子受体2的单域抗体,包括以下方案:A.所述单域抗体为FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4;所述CDR1的氨基酸序列为SEQ ID No.5;所述CDR2的氨基酸序列为SEQ ID No.6;所述CDR3的氨基酸序列为SEQ ID No.7;B.与方案A中所述单域抗体的氨基酸序列相似度至少80%的多肽。亲和性实验表明,所述单域抗体与Her2-ECD蛋白结合,有较高的结合亲和力,而与Her2-ECDIV(Her2胞外区第4域)基本不结合。因此,基于该单域抗体的高亲和力特性,为后续所述单域抗体应用于检测人表皮生长因子受体2水平、肿瘤分型、乳腺癌复发与转移的早期判断及预后评估或制备预防和/或治疗由人表皮生长因子受体2引起的肿瘤的药物中的应用提供物质基础。
本发明提供的人表皮生长因子受体2的人源化单域抗体HpHx5A,在所述单域抗体的基础上经过人源化改造得到的,所述人源化单域抗体HpHx5A的氨基酸序列为SEQ IDNo.10。亲和性实验表明,所述所述人源化单域抗体HpHx5A与Her2-ECD蛋白结合,有较高的结合亲和力,而与Her2-ECDIV(Her2胞外区第4域)基本不结合,与上述单域抗体的亲和力较为一致。人源化单域抗体HpHx5A为后续所述单域抗体应用于检测人表皮生长因子受体2水平、肿瘤分型、乳腺癌复发与转移的早期判断及预后评估或制备预防和/或治疗由人表皮生长因子受体2引起的肿瘤的药物中的应用。
本发明提供了一种体外表达所述人表皮生长因子受体2的单域抗体或所述人源化单域抗体HpHx5A的方法,得到纯化的单域抗体和人源化后单域抗体的纯度可达95%以上,分子量在15~17kd。同时制备的pHx5A和HpHx5A的细菌培养物蛋白具有较高的得率,分别为6毫克/100ml和3.5毫克/100ml。
具体实施方式
本发明提供了一种人表皮生长因子受体2的单域抗体,所述单域抗体包括以下方案:
A.所述单域抗体为FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4;
所述FR1、FR2、FR3和FR4为框架区;所述CDR1、CDR2和CDR3为互补决定区;所述CDR1的氨基酸序列为SEQ ID No.5(FSNYAMG);所述CDR2的氨基酸序列为SEQ ID No.6(ATISWSGGTIDYADS);所述CDR3的氨基酸序列为SEQ ID No.7(AARLSSTSIRQNAYD);
B.与方案A中所述单域抗体的氨基酸序列相似度至少80%的多肽。
在本发明中,所述FR1的氨基酸序列为SEQ ID No.1(QVQLVDSGGGLVQTGGSLRLSCTASGLP);所述FR2的氨基酸序列为SEQ ID No.2(WFRQAPGKDVGKEREFV);所述FR3的氨基酸序列为SEQ ID No.3(VKGRFTVSRDNAKDTVYLQMDNLKPEDTAVYVC);所述FR4的氨基酸序列为SEQ ID No.4(YWGQGTQVTVSS);FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4优选为单域抗体pHxA5,其氨基酸序列为SEQ ID No.8(QVQLVDSGGGLVQTGGSLRLSCTASGLPFSNYAMGWFRQAPGKDVGKEREFVATISWSGGTIDYADSVKGRFTVSRDNAKDTVYLQMDNLKPEDTAVYVCAARLSSTSIRQNAYDYWGQGTQVTVSS),所述单域抗体pHxA5的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.9(CAGGTGCAGCTGGTGGATTCTGGGGGAGGATTGGTGCAGACTGGGGGCTCTCTGAGACTCTCCTGTACAGCCTCTGGATTGCCCTTCAGTAACTATGCCATGGGCTGGTTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGACGTAGGAAAGGAACGTGAGTTTGTAGCAACAATTAGTTGGAGTGGTGGTACCATAGACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCGTCTCCAGAGACAACGCCAAGGACACGGTGTATCTGCAAATGGACAACCTGAAACCTGAGGACACGGCCGTTTATGTCTGTGCAGCTCGACTATCTTCAACCTCAATACGGCAAAATGCCTATGACTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA)。
在本发明中,所述单域抗体为与方案A所述单域抗体的氨基酸序列优选相似度至少90%的多肽,更优选为相似度至少95%的多肽。
本发明提供了一种人表皮生长因子受体2的人源化单域抗体HpHx5A,所述HpHx5A是在单域抗体pHxA5的基础上进行人源化,所述人源化的方法参考文献研究报道方法(Ce′cile Vincke等,General Strategy to Humanize a Camelid Single-domain Antibodyand Identification of a Universal Humanized Nanobody Scaffold,2009,284(5):3273-3284,JBC。)所述人源化单域抗体HpHx5A的氨基酸序列为SEQ ID No.10(QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGLPFSNYAMGWFRQAPGLDVGKEREFVATISWSGGTIDYADSVKGRFTVSRDNSKDTLYLQMDNLRAEDTAVYYCAARLSSTSIRQNAYDYWGQGTLVTVSS);所述人源化单域抗体HpHx5A的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.11(CAGGTGCAGCTGGTGGAATCTGGGGGAGGATTGGTGCAGCCAGGGGGCTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTGCCCTTCAGTAACTATGCCATGGGCTGGTTCCGCCAGGCTCCAGGGCTAGACGTAGGAAAGGAACGTGAGTTTGTAGCAACAATTAGTTGGAGTGGTGGTACCATAGACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCGTCTCCAGAGACAACTCCAAGGACACGCTATATCTGCAAATGGACAACCTGAGAGCAGAGGACACGGCCGTTTATTACTGTGCAGCTCGACTATCTTCAACCTCAATACGGCAAAATGCCTATGACTACTGGGGCCAGGGGACCCTAGTCACCGTCTCCTCA)。
基于所述单域抗体或所述人源化单域抗体HpHx5A与人表皮生长因子受体2ECD的高亲和力,本发明提供了所述单域抗体或所述人源化单域抗体HpHx5A在制备检测人表皮生长因子受体2水平、肿瘤分型或乳腺癌复发与转移的早期判断及预后评估的试剂或试剂盒中的应用。所述人表皮生长因子受体2水平的方法优选依赖于所述单域抗体或所述人源化单域抗体HpHx5A与人表皮生长因子受体2ECD的抗原抗体特异性免疫反应实现,所述抗原抗体特异性免疫反应包括免疫层析技术、ELISA技术、western-blot、免疫荧光原位杂交或免疫组化等。
基于所述单域抗体或所述人源化单域抗体HpHx5A与人表皮生长因子受体2ECD的高亲和力,本发明还提供了所述单域抗体或所述人源化单域抗体HpHx5A在制备预防和/或治疗人表皮生长因子受体2阳性的肿瘤的药物中的应用。
本发明提供了一种基于免疫反应技术的人表皮生长因子受体2的检测试剂盒,包含所述单域抗体或所述人源化单域抗体HpHx5A。所述免疫反应技术包括免疫层析技术、ELISA技术、western-blot、免疫荧光原位杂交或免疫组化。本发明对所述试剂盒的制备方法没有特殊限制,采用本领域所熟知的免疫检测试剂盒的制备方法即可。
本发明提供了一种体外表达所述人表皮生长因子受体2的单域抗体或所述人源化单域抗体HpHx5A的方法,包括以下步骤:
1)依次用乳腺癌细胞株BT474和Her2-ECD重组蛋白抗原从羊驼的非免疫单域抗体基因库中筛选获得特异性单域抗体株;
2)PCR扩增所述特异性病毒株,得到的PCR产物构建重组质粒;
所述PCR扩增用引物为SEQ ID No.12(GAAGACACCAGGCCCAGGTRMAGCTGGWGGAGTCT)和SEQ ID No.13(GAAGATCTCCGGATCCTGAGGAGACGGTGACCTGGGT);
3)将所述重组质粒转化入原核生物中重组表达单域抗体蛋白。
在本发明中,所述PCR扩增的反应条件优选如下:94℃,3min;94℃,30s,72℃,40s,55℃,30s,共30个循环;72℃,7min。
在本发明中,重组表达后得到的培养液,优选还包括纯化。所述纯化的方法优选为Ni+离子亲和层析高压液相方法完成。纯化后的单域抗体蛋白纯度可达90%以上。pHx5A,HpHx5A的每100ml细菌培养物蛋白得率分别为6毫克和3.5毫克。
下面结合实施例对本发明提供的一种人表皮生长因子受体2的单域抗体、检测试剂盒及其应用进行详细的说明,但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
针对Her2的特异性的单域抗体的筛选过程:
(1)用T25细胞培养瓶培养乳腺癌细胞株BT474,待细胞生长至对数生长期,将细胞用PBST(0.1%T20PBS)洗2次,加入2%BSA-PBST,37℃放置1小时,吸出液体,加入2ml噬菌体(2×1012PFU非免疫羊驼单域抗体噬菌体展示基因库,2%BSA-PBST),在室温下放置1小时。
(2)弃上清,用PBST洗10次,再用PBS洗10次。
(3)用TEA(triethylamine(7.18M))溶液,将与BT474细胞结合的噬菌体洗脱下来,感染处于对数生长期的大肠杆菌TG1,取2μl,稀释100倍,涂2YT-Amp板,计算筛选回收效率,扩增洗脱的噬菌体并纯化,进行下一轮筛选。用细胞筛选2轮。
(4)用Her2-ECD蛋白(Cat:10004-H08H,北京义翘神州生物技术有限公司产品)50μg/ml,0.5ml包被免疫管,4℃过夜,用4%MPBST(4%的脱脂牛奶在PBST里),在室温,封闭2小时。
(5)加入用细胞筛选过第二轮的扩增噬菌体1x1012PFU,在4%MPBS0.5ml,放置室温1小时,弃上清,用PBST洗10次,再用PBS洗10次。
(6)用TEA(triethylamine(7.18M))溶液,将与Her2-ECD蛋白特异性结合的噬菌体解离下,并感染处于对数生长期的大肠杆菌TG1,产生并纯化噬菌体用于下一轮的筛选。相同筛选过程重复2轮,第2轮筛选所有Her-ECD蛋白浓度为25μg/ml。得到筛选后噬菌体。
实施例2
用噬菌体的酶联免疫方法(ELISA)筛选Her2-ECD特异性单个阳性克隆:
(1)从上述实施例1第(6)步骤的经2轮筛选后含有噬菌体的细菌培养皿中,挑选单个菌落并接种于96孔深孔细菌培养板中,培养3小时,加入辅助噬菌体M13,培养过夜,4000转,离心20分钟。
(2)将上清液转移到经Her2-ECD蛋白预先包被并用2%MPBST封闭过的96孔ELISA板中,在室温或37度放置1小时。用0.05%PBST洗去未结合的噬菌体。
(3)加入1:3000倍1%MPBST稀释的辣根过氧化物酶标记的抗噬菌体二抗,在室温或37度放置1小时。用0.05%PBST洗去未结合的噬菌体。
(4)TMB显色,于ELISA仪上,在450nm波长,读取吸收值(OD)。
(5)当样品孔OD值大于对照孔OD值10倍以上,判为阳性克隆孔。
(6)PCR扩增或纯化阳性孔的质粒并进行基因测序。
依据各个克隆株的基因序列,把CDR1、CDR2、CDR3序列相同的株既为同一克隆株,而其序列不同的株既为不同的克隆株。获得针对Her-ECD特异性的Hx5A、HxR1B、HxR2C和HxR3E单域抗体株。经大肠杆菌表达和纯化活性鉴定,仅Hx5A与Her2-ECD抗原结合活性高,结果见图2。
实施例3
特异性纳米抗体表达质粒的构建方法
PCR扩增实施例2所获得的特异性的纳米抗体基因,而获得带有限制性内切酶BbsI和BamHI位点PCR产物,用限制性内切酶BbsI和BamHI分别处理PCR产物和载体(pSJF2载体,kim Is.Biosic Biochem.2002,66(5):1148-51),经T4连接酶连接重组,而获得能在大肠杆菌中高效表达的质粒pHxA5,人源化的表达质粒HpHx5A,并进行基因序列测定以确定其序列的正确性。PCR的扩增所用引物:上游引物:GAAGACACCAGGCCCAGGTRMAGCTGGWGGAGTCT(SEQID No.12);下游引物gaagatctccggatccTGAGGAGACGGTGACCTGGGT(SEQ ID No.13)。PCR条件:94℃,3分钟;94℃,30秒,72℃,40秒,55℃,30秒,共30个循环,然后72℃,7分钟,4℃保存。
实施例4
单域抗体蛋白在大肠杆菌中表达、纯化
(1)将实施例3制备的含有质粒pHx5A,HpHx5A的菌种接种在含氨基苄青霉素的LB培养板上,37℃过夜,(2)挑选单个菌落接种于10毫升的含氨基苄青霉素的LB培养液中,37℃,摇床培养过夜,(3)转种于200ml含氨基苄青霉素的2YT培养液中,37℃摇床培养,240转/分,培养到OD值达0.6~1.0时,加入0.1~0.5M IPTG,继续培养过夜。(4)离心,5000转/分,收菌,(5)加入洗涤缓冲液(50mM Tris-HCl pH 8.0,0.9%NaCl)50ml,洗2次;加入蔗糖缓冲液(Sucrose Buffer:25%Sucrose,1mM EDTA,10mM Tris-HCl,pH 8.0)20ml,作用30分钟,离心10000转/分钟,30分钟,保留上清,进行纯化。(6)经Ni+离子亲和层析高压液相制备纯度可达90%以上的蛋白。
结果见图1所示,单域抗体pHx5A和人源单域抗体HpHx5A表达带His标签蛋白约15~17kd。pHx5A,HpHx5A的每100ml细菌培养物蛋白得率分别为6毫克和3.5毫克。
实施例5
鉴定所获得的Her2-ECD单域抗体pHx5A和HpHx5A与Her2-ECD的抗原结合表位:有Her2-ECD蛋白和Her-ECDIV蛋白(购自北京义翘神州生物技术公司产品)2ug/ml,包被96孔ELISA板,加入不同稀释浓度的pHx5A和HpHx5A,37℃,1小时,PBST洗3次,加入1:5000倍稀释的鼠抗His-HRP(北京义翘神州生物技术公司产品)二抗,,37℃,1小时,洗3次,加入TMB,室温15分钟,加入终止液。测定OD450,结果见图2和图3。表达纯化的单域抗体与Her2-ECD蛋白结合,有较高的结合亲和力,与Her2-ECDIV(Her2胞外区第4域)基本不结合。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 深圳市汉星生物科技有限责任公司
<120> 一种人表皮生长因子受体2的单域抗体、检测试剂盒及其应用
<160> 13
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gln Val Gln Leu Val Asp Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Thr Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Leu Pro
20 25
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Asp Val Gly Lys Glu Arg Glu Phe
1 5 10 15
Val
<210> 3
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Val Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asp Thr Val
1 5 10 15
Tyr Leu Gln Met Asp Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Val
20 25 30
Cys
<210> 4
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Phe Ser Asn Tyr Ala Met Gly
1 5
<210> 6
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Ala Thr Ile Ser Trp Ser Gly Gly Thr Ile Asp Tyr Ala Asp Ser
1 5 10 15
<210> 7
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Ala Ala Arg Leu Ser Ser Thr Ser Ile Arg Gln Asn Ala Tyr Asp
1 5 10 15
<210> 8
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Gln Val Gln Leu Val Asp Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Thr Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Leu Pro Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Asp Val Gly Lys Glu
35 40 45
Arg Glu Phe Val Ala Thr Ile Ser Trp Ser Gly Gly Thr Ile Asp Tyr
50 55 60
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys
65 70 75 80
Asp Thr Val Tyr Leu Gln Met Asp Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala
85 90 95
Val Tyr Val Cys Ala Ala Arg Leu Ser Ser Thr Ser Ile Arg Gln Asn
100 105 110
Ala Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 9
<211> 381
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
caggtgcagc tggtggattc tgggggagga ttggtgcaga ctgggggctc tctgagactc 60
tcctgtacag cctctggatt gcccttcagt aactatgcca tgggctggtt ccgccaggct 120
ccagggaagg acgtaggaaa ggaacgtgag tttgtagcaa caattagttg gagtggtggt 180
accatagact atgcagactc cgtgaagggc cgattcaccg tctccagaga caacgccaag 240
gacacggtgt atctgcaaat ggacaacctg aaacctgagg acacggccgt ttatgtctgt 300
gcagctcgac tatcttcaac ctcaatacgg caaaatgcct atgactactg gggccagggg 360
acccaggtca ccgtctcctc a 381
<210> 10
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Pro Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Leu Asp Val Gly Lys Glu
35 40 45
Arg Glu Phe Val Ala Thr Ile Ser Trp Ser Gly Gly Thr Ile Asp Tyr
50 55 60
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ser Lys
65 70 75 80
Asp Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asp Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala
85 90 95
Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Arg Leu Ser Ser Thr Ser Ile Arg Gln Asn
100 105 110
Ala Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 11
<211> 381
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
caggtgcagc tggtggaatc tgggggagga ttggtgcagc cagggggctc tctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt gcccttcagt aactatgcca tgggctggtt ccgccaggct 120
ccagggctag acgtaggaaa ggaacgtgag tttgtagcaa caattagttg gagtggtggt 180
accatagact atgcagactc cgtgaagggc cgattcaccg tctccagaga caactccaag 240
gacacgctat atctgcaaat ggacaacctg agagcagagg acacggccgt ttattactgt 300
gcagctcgac tatcttcaac ctcaatacgg caaaatgcct atgactactg gggccagggg 360
accctagtca ccgtctcctc a 381
<210> 12
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gaagacacca ggcccaggtr magctggwgg agtct 35
<210> 13
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gaagatctcc ggatcctgag gagacggtga cctgggt 37