CN110804096A - Cd123单域抗体、核苷酸序列、表达载体及试剂盒 - Google Patents

Cd123单域抗体、核苷酸序列、表达载体及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种CD123单域抗体、核苷酸序列、表达载体及试剂盒，其氨基酸序列包括依次组成的FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4区，其中，所述FR1、FR2、FR3、FR4区为框架区氨基酸序列，所述CDR1、CDR2、CDR3为可变区氨基酸序列；其中，所述FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3以及FR4区的氨基酸序列如表1所示。本发明技术方案通过结合基因工程的方法得到一种特异性结合CD123蛋白的单域抗体，该抗体特异性结合CD123蛋白的特异性结合能力高，且亲和力高。

Description

CD123单域抗体、核苷酸序列、表达载体及试剂盒
技术领域
本发明涉及基因工程和抗体药物技术领域，特别涉及一种CD123单域抗体、核苷酸酸序列、表达载体及试剂盒。
背景技术
CD123是白细胞介素3受体(interleukin-3 receptor,IL-3R)α链，能特异识别白细胞介素3(Interleukin-3,IL-3)，并与IL-3结合。
IL-3主要由受到抗原刺激而被活化的辅助T细胞产生，其可促进细胞的生长和增值。它与肿瘤、过敏性炎症、自身免疫性疾病的发生有关。CD123在大多数AML患者原始白血病细胞中表达。而且AML LSCS高表达CD123，正常造血干细胞不表达或者弱表达。除了在AML中表达，CD123在慢性粒细胞白血病，骨髓增生异常综合症及肥大细胞增多症，B-细胞急性淋巴细胞白血病中也有所表达。目前关于CD123单抗药物研究，早期临床研究中缓解率差异较大，说明靶向CD123的抗体药物尚需要通过优化抗体结合力等增强抗肿瘤活性。
相关技术中，能实现CD123普通抗体的分子量较大，与抗原结合的结合力偏低，不易改造且稳定性差。
发明内容
本发明的主要目的是提供一种氨基酸序列，旨在至少解决上述CD123抗体中存在的至少一个技术问题。
为实现上述目的，本发明提出一种CD123单域抗体，其氨基酸序列包括依次组成的FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4区，其中，所述FR1、FR2、FR3、FR4区为框架区氨基酸序列，所述CDR1、CDR2、CDR3为可变区氨基酸序列；其中，所述FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3以及FR4区的氨基酸序列如表1所示。
表1：
Figure BDA0002282996110000021
进一步地，所述氨基酸序列如表2所示。
Figure BDA0002282996110000022
表2
本发明还提供一种核苷酸序列，所述核苷酸序列为以下序列之一：
(1)如SEQ ID NO：1～3所示的核苷酸序列：
SEQ ID NO：1：GAGGTACAGCTGGTGGAATCTGGGGGAGGCTTGGTGCAGCCTGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTATGGATTCGCCTTCAGTAGCTACGACATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGAAAGGGGCCCGAGTGGGTCTCACGGATTAATTTTAATGGTATCATGACAAGATATGCCGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACGGCCCGTTATTACTGTGTGAAAGGGTATCTAAATAGTGATAGTTCCTTGTCTAAAAATGACAACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA；
SEQ ID NO：2：CAGGTACAGCTGGTGGAATCTGGGGGAGGCTTGGTGCAGCCTGGGGGGTCTCTGCGACTCTCCTGCGCAGCCTCTGGAAGTAGCGTCAGTCTCAATGCCATGGGCTGGTCGCGCGTGCAACCAGGAAGTACGCGCGACTTCGTCGCACGGATTGCTGCCGATGGTAGCA...CTCACTATGCAGACTCCGTGGAGGGCCGGTTCACCATCTCCGGGGACGCCGCCGGGAACACGGTGTATCTACTAATGGATTCGCTGAAACCCGAAGACACGGCCGTCTATTACTGTTT...TGCGTGGCTGGGTACGGACACGTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA；
SEQ ID NO：3：GAGGTACAGCTGGTGGAATCTGGGGGAGGCTTGGTGCAGCCTGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTATGGATTCGCCTTCAGTAACTACGACATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGAAAGGGGCCCGAGTGGGTCTCACGAATTAATTTTAATGGTATTATGACAAGATATGCCGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACGGCCCGTTATTACTGTGTGAAAGGGTATCTAAATAGTGATAGTTCCTTGTCTAAAAATGACAACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA；
(2)SEQ ID NO：1～3所示的核苷酸序列添加、取代、缺失或插入一个或若干个核苷酸序列；
(3)与(1)和/或(2)中的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；
(4)由于遗传密码子的简并性区别于(1)、(2)、(3)中的核苷酸序列的核苷酸序列。
本发明还提供一种表达载体，包括如上所述的核苷酸。
本发明还提供一种试剂盒，包括如上所述的CD123单域抗体，或者如上所述的核苷酸序列。
本发明技术方案通过结合基因工程的方法得到一种特异性结合CD123蛋白的单域抗体，该抗体特异性结合CD123蛋白的活性高，表达量高，生产成本低，易于改造。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为本发明实施例中第一轮PCR单域抗体基因电泳图；
图2为图1中第二轮PCR单域抗体基因电泳图；
图3至图5为本发明实施例中CD123蛋白表达纯化图；
图6至图8为本发明实施例中CD123单域抗体与CD123抗原结合活性图；
图9至图10为本发明实施例中CD123单域抗体与HL-60细胞结合图。
本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例及其附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。且下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法、检测方法等。
本发明提出了一种CD123单域抗体、核苷酸酸序列、表达载体及试剂盒。下述内容将针对所述CD123单域抗体及其筛选过程作详细介绍。
实施例1抗CD123抗原特异性的抗体库构建
需要说明的是，本实施例中选用的CD123抗原采购自北京义翘神州。QIAGEN试剂盒为北京雅安达生物技术有限公司的QIAamp RNA Blood Mini Kit(50)，货号52304。cDNA合成试剂盒为TAKARA公司的MiniBESTAgarose Gel DNAExtraction Kit Ver.4.0。
1、免疫实验。
1)选择健康的羊驼为免疫对象；
2)采用2mgCD123抗原与等体积福氏佐剂混合，对一只健康羊驼进行免疫，总共进行6次免疫实验；
3)在第4次免疫实验后，对羊驼血清进行采样，并测定其抗原免疫效价，直至测得的羊驼血清的免疫效价达到1万倍以上时，取100ml羊驼全血，并分离淋巴细胞；
4)裂解步骤3)中的淋巴细胞，用QIAGEN试剂盒提取裂解后淋巴细胞中的RNA，并进行RNA纯化；其中，QIAGEN试剂盒中采用的抗凝剂包括柠檬酸盐、肝素和EDTA中的一种。
2、构建噬菌体抗体库并进行特异性抗原CD123单域抗体的筛选。
1)用免疫实验中对CD123抗原免疫的羊驼的外周血为起始材料，利用cDNA合成试剂盒将免疫实验中提纯的RNA反转录为cDNA，构建cDNA文库。
2)采用巢式PCR克隆目的基因。
a、根据CD123抗原中缺失轻链的抗体重链可变区VHH基因片段设计引物，本实施例中通过设计两套引物来对缺失轻链的抗体重链可变区VHH基因片段进行扩增。
b、第一轮PCR。
PCRFd5’引物：
引物1(SEQ ID NO:199)：CGC CAT CAA GGT ACC AGT TGA
引物2(SEQ ID NO:200)：CGG GAT CCC AGG TGC AGC TGG TGG AGT CTG GGG GAG
PCR Bd3’引物：
引物1(SEQ ID NO:201)：CCG CTC GAG TAC TTC ATT CGT TCC TGA GGA GAC GGT
第一轮PCR扩增，可得到大于800bp的普通重链抗体基因片段，800bp～500bp之间的为缺失轻链的重链抗体基因片段，以及500bp的VHH目的基因片段。通过凝胶电泳，筛选出800bp～500bp的基因片段和500bp的基因片段。
电泳结果如图1所示。其中，普通CD123抗体扩增得到图1中凝胶电泳1跑道所示的两条亮条带，其碱基量主要分布在500bp～800bp；SEQ ID NO:199和SEQ ID NO:200配对使用，扩增得到图1中凝胶电泳2跑道所示的一条亮条带，其碱基量主要分布在500bp左右；SEQID NO:200和SEQ ID NO:201配对使用，扩增得到图1中凝胶电泳3跑道所示的一条亮条带，其碱基量主要分布在500bp左右。
c、切胶回收含目的基因的片段。将上述电泳中碱基量在500bp～800bp之间的1号条带，切胶回收，其中，1号条带包含普通抗体基因、缺失轻链的重链抗体基因以及即目的基因；将上述电泳中碱基量在500bp的2号条带以及3号条带，切胶回收，其中，2号条带以及3号条带为带目的基因的条带。
d、第二轮PCR。
引物构建：
引物1(SEQ ID NO:202)：CCG CTC GAG TGA GGA GAC GGT GAC CTG G
引物2(SEQ ID NO:203)：CGG GAT CCG ATG TAC AGC TGG TGG AGT CTG GGG GAG
第二轮PCR扩增，经凝胶电泳，可筛选出含重链抗体可变区VHH目的基因(也即500bp的基因片段)。
电泳结果如图2所示。其中，左侧的亮条带为标记DNA分子量，右侧亮条带为SEQ IDNO:202和SEQ ID NO:203配对使用扩增得到的，其基因碱基量在500bp(也即目的基因)。
3)构建目的基因文库。
将上述获得的VHH目的基因片段和pHEN6噬菌体展示载体质粒采用BamHI内切酶和XhoI内切酶双酶酶切，酶切完成后用连接酶将VHH目的基因片段连接至pHEN6载体，构建重组质粒。将构建好的重组质粒电转化至TG1感受态细胞中，以使VHH目的基因片段与pHEN6载体能融合表达。
取电转化菌液涂布LB/Amp平板，32℃过夜培养。次日用菌落PCR的方法验证抗体的连接效率。若抗体的连接效率小于等于90％则需重复上述实验，直至抗体连接效率大于90％；若抗体连接效率高于90％，则说明目的基因与载体连接良好，重组质粒的表达良好，可继续进行菌落扩大培养实验。
4)扩大培养。
a、将电转化菌液涂布LB/Amp平板，32℃过夜培养；
b、然后用2YT培养基洗，以洗掉原培养环境中的其他成分，以菌液：培养基液＝1:1000的比例在2YT培养基上进行表达目的基因的噬菌体的扩大培养；
c、加入辅助噬菌体M13K07(Invitrogen)进行感染，过夜培养；
d、离心，收集感染辅助噬菌体M13K07的上清液；
e、在上清液中加入20％PEG-2.5M NaCl混匀，再次离心，收集沉淀，并加入PBS和甘油进行重悬，于-80℃保藏备用。
实施例2特异性噬菌体的筛选
1)前期准备。分别准备CD123阴性对照细胞系和经改造的CD123阳性细胞系各5*106，使用CPBSH或2％BSA-PBS在转鼓上室温孵育2小时，离心备用。
2)筛选。将噬菌体(5*1011～1*1012)加入阴性细胞中，CPBS或2％BSA-PBS定量，至0.5ml，在转鼓上室温孵育2小时；取上清液，加入阳性细胞中，CPBS或2％BSA-PBS定量，至0.5ml，在转鼓上室温孵育2小时；以使该噬菌体的外壳能特异性分泌CD123抗体，与CD123抗原结合；用PBST洗涤5次，PBS洗涤3次，离心、弃上清液，以将没有结合的噬菌体洗掉。
3)滴度测定。将上述细胞结合的噬菌体重悬，取2ml对数生长期的TG1，感染，37℃，静置30min，进行滴度测定。
4)扩增、纯化。扩增并纯化扩增后的噬菌体。
重复上述实验三次，并以步骤4)中的噬菌体作为下一次步骤2)中加入的噬菌体。
筛选结果如下：
Figure BDA0002282996110000071
本实施例对噬菌体进行了3次筛选，并检测每次筛选试验洗脱下来的噬菌体滴度，根据上表可以知道：随着筛选轮数的增加，包被液浓度逐级递减，但是洗脱下来的噬菌体增加，也即CD123特异性噬菌体得到富集。
实施例3特异性阳性单克隆抗体的筛选
1)筛选高效表达的重组质粒。
PCR扩增实施例2中获得的特异性CD123抗体基因片段，以获取带有限制性内切酶BbsI和BamHI位点的PCR产物；用限制性内切酶BbsI和BamHI分别处理上述PCR产物和pSJF2载体；利用T4连接酶连接上述酶切后的基因片段，对其进行重组，以获得能在大肠杆菌中高效表达的重组质粒sdAb-pSJF2。
2)筛选CD123阳性克隆抗体。
从生长菌落的琼脂平板上随即挑取单菌落，接种在含有Amp的2YT液体培养基的96孔深孔培养板中，培养4小时；将单克隆一一对应接种在带编号的以小格分隔的含Amp的LB固体平板上；向深孔培养板加入IPTG至终浓度0.5mM诱导，过夜培养；收获表达蛋白的上清液，并以CD123抗原进行ELISA测定，选择OD值大于阴性对照5倍的菌落为挑选出的CD123阳性克隆；将阳性克隆小量培养保种并进行经DNA测序，鉴定抗CD123单域抗体的基因序列，得到如上述表3所示的基因序列。
实施例4 CD123单域抗体在宿主大肠杆菌中的表达、纯化
1)表达、纯化。
挑选步骤3)中的阳性克隆菌液接种于5ml的含氨基苄青霉素的LB培养液中，37℃，摇床培养过夜；转种2ml过夜培养物于200mL含氨基苄青霉素的LB培养液中，37℃摇床培养，240转/分，培养至OD值达0.4～0.6；加入0.5～1.0mM IPTG，继续培养过夜，然后离心，收菌；高渗法裂解细菌，离心，收上清中可溶性单域抗体蛋白；经Ni+离子亲和层析获得纯度达95％以上的蛋白。
纯化结果如图3至图5所示。
图3为CD123-13样品的纯化过程，流穿为粗提杂蛋白经镍柱后流穿的杂蛋白；40mM条带为含有40毫摩咪唑的洗脱液过脱镍柱后剩余的样品，说明经过一次洗脱后CD123-13样品中目的蛋白之外的蛋白大部分被洗脱下来了；100mM条带为含有100毫摩咪唑的洗脱液过脱镍柱后剩余的样品，很少的目的蛋白和部分杂蛋白被洗脱；400mM条带为含有400毫摩咪唑的洗脱液过脱镍柱后剩余的样品，说明经过400毫摩咪唑洗脱后CD123-13样品中镍柱的目的蛋白被洗脱下来，洗脱下来的目标蛋白纯度较高。且筛选出来的CD123-13的抗体分子的分子量在17KD左右，分子量远远低于传统抗体的分子量，为传统抗体分子量的十分之一。
图4为CD123-39样品的纯化过程，流穿为粗提杂蛋白经镍柱后流穿的杂蛋白；40mM条带为含有40毫摩咪唑的洗脱液过脱镍柱后剩余的样品，说明经过一次洗脱后CD123-39样品中目的蛋白之外的蛋白大部分被洗脱下来了；100mM条带为含有100毫摩咪唑的洗脱液过脱镍柱后剩余的样品，目的蛋白被洗脱，杂蛋白很少，目的蛋白非常纯；400mM条带为含有400毫摩咪唑的洗脱液过脱镍柱后剩余的样品，几乎没有蛋白，说明经过100毫摩咪唑洗脱后大部分CD123-39目的基因被洗脱下来。由100mM条带可看出，筛选出来的CD123-39的抗体分子的分子量在17KD左右，分子量远远低于传统抗体的分子量，为传统抗体分子量的十分之一。
图5为CD123-76样品的纯化过程，流穿为粗提杂蛋白经镍柱后流穿的杂蛋白；40mM条带为含有40毫摩咪唑的洗脱液过脱镍柱后剩余的样品，说明经过一次洗脱后CD123-76样品中目的蛋白之外的蛋白大部分被洗脱下来了；100mM条带为含有100毫摩咪唑的洗脱液过脱镍柱后剩余的样品，很少的目的蛋白和部分杂蛋白被洗脱；400mM条带为含有400毫摩咪唑的洗脱液过脱镍柱后剩余的样品，说明经过400毫摩咪唑洗脱后CD123-76样品中镍柱的目的蛋白被洗脱下来，洗脱下来的目标蛋白纯度较高。且筛选出来的CD123-76的抗体分子的分子量在17KD左右，分子量远远低于传统抗体的分子量，为传统抗体分子量的十分之一。
实施例5 CD123单域抗体与CD123抗原结合活性测定
1)包被。以0.05M的Na2CO3·NaHCO3(PH9.5)稀释CD123抗原至2μg/ml；在每个96孔板的反应微孔中加入100μl稀释后的CD123抗原蛋白，4℃过夜孵育；次日，弃反应微孔内包被液，并用PBS洗板三次；加入300μl2％BSA(或1％CPBS)于封闭96孔板中，37℃，孵育2小时。
2)抗原-抗体结合。在每个96孔板的反应微孔中加入100μl不同稀释浓度的纯化的CD123单域抗体，37℃，孵育1小时，用0.05％PBST洗板三次；在每个反应微孔中加入100μl5000倍稀释的anti-His antibody(HRP)，37℃，孵育1小时，用0.05％PBST洗板三次；在每个反应微孔中加入100μlTMB，避光室温静置10min。
3)终止反应。在每个反应微孔中加入50μl 2M H2SO4终止反应。
4)结果判定。用酶标仪测定450nm波长下的样品OD值，并得到如图6至图8所示的结果，图为不同基因片段纯化的CD123单域抗体与CD123蛋白结合的浓度梯度(ELISA)。从图中以看出，即便CD123单域抗体与CD123抗原结合后的浓度在0.016ug/ml时，依然具有较好的结合活性，说明抗体结合活性极佳，优于目前已有技术。
实施例6 CD123单域抗体与HL-60细胞的结合
1)流式细胞结合。采用20μg/ml CD123纳米抗体蛋白与HL-60细胞结合；抗HIS抗体染色，并利用BD FACSCalibur流式细胞仪进行流式细胞术分析，得到如图9和图10所示的结果。
2)结果分析。由图9和图10可知，CD123-39纳米抗体能与阳性细胞(即HL-60细胞系)发生结合，且其结合率近70％，而CD123-76纳米抗体与阳性细胞(即HL-60细胞系)的结合率近99％；说明本发明实施例组中申请保护的纳米抗体对细胞膜表面表达的CD123抗原具有非常良好的结合能力，远优于现有技术。
应当理解的是，本发明实施例筛选CD123单域抗体采用细胞筛选法代替传统的固相筛选法，使得靶抗原能保持天然的构象，更利于对膜抗原或细胞表面的抗原表位的抗体的筛选。本发明实施例中筛选得到了针对膜抗原的内化型抗体，对于治疗肿瘤有非常积极的效果。
最后，本发明实施例组中申请保护的CD123特异性单克隆纳米抗体可用于对CD123阳性细胞的鉴定、阳性细胞筛选、检测阳性率、开发靶向CD123阳性细胞的抗体药物、ADC复合药物、CAR-T细胞药物等多种与CD123蛋白表达相关的生物药物等。
以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的发明构思下，利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳普瑞金生物药业有限公司
<120> CD123单域抗体、核苷酸酸序列、表达载体及试剂盒
<130> 1
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 1
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Tyr Gly Phe Ala Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Asp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val
35 40 45
Ser Arg Ile Asn Phe Asn Gly Ile Met Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Arg Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Lys Gly Tyr Leu Asn Ser Asp Ser Ser Leu Ser Lys Asn Asp Asn
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 2
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 2
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ser Val Ser Leu Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Ser Arg Val Gln Pro Gly Ser Thr Arg Asp Phe Val
35 40 45
Ala Arg Ile Ala Ala Asp Gly Ser Thr His Tyr Ala Asp Ser Val Glu
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gly Asp Ala Ala Gly Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Leu Met Asp Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Phe
85 90 95
Ala Trp Leu Gly Thr Asp Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 3
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 3
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Tyr Gly Phe Ala Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Asp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val
35 40 45
Ser Arg Ile Asn Phe Asn Gly Ile Met Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Arg Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Lys Gly Tyr Leu Asn Ser Asp Ser Ser Leu Ser Lys Asn Asp Asn
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 4
<211> 369
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
gaggtacagc tggtggaatc tgggggaggc ttggtgcagc ctggggggtc tctgagactc 60
tcctgtgcag cctatggatt cgccttcagt agctacgaca tgaactgggt ccgccaggct 120
ccaggaaagg ggcccgagtg ggtctcacgg attaatttta atggtatcat gacaagatat 180
gccgactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgaa acctgaggac acggcccgtt attactgtgt gaaagggtat 300
ctaaatagtg atagttcctt gtctaaaaat gacaactggg gccaggggac ccaggtcacc 360
gtctcctca 369
<210> 5
<211> 345
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
caggtacagc tggtggaatc tgggggaggc ttggtgcagc ctggggggtc tctgcgactc 60
tcctgcgcag cctctggaag tagcgtcagt ctcaatgcca tgggctggtc gcgcgtgcaa 120
ccaggaagta cgcgcgactt cgtcgcacgg attgctgccg atggtagcac tcactatgca 180
gactccgtgg agggccggtt caccatctcc ggggacgccg ccgggaacac ggtgtatcta 240
ctaatggatt cgctgaaacc cgaagacacg gccgtctatt actgttttgc gtggctgggt 300
acggacacgt actggggcca ggggacccag gtcaccgtct cctca 345
<210> 6
<211> 369
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 6
gaggtacagc tggtggaatc tgggggaggc ttggtgcagc ctggggggtc tctgagactc 60
tcctgtgcag cctatggatt cgccttcagt aactacgaca tgaactgggt ccgccaggct 120
ccaggaaagg ggcccgagtg ggtctcacga attaatttta atggtattat gacaagatat 180
gccgactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgaa acctgaggac acggcccgtt attactgtgt gaaagggtat 300
ctaaatagtg atagttcctt gtctaaaaat gacaactggg gccaggggac ccaggtcacc 360
gtctcctca 369

Claims (5)

1.一种CD123单域抗体，其特征在于，其氨基酸序列包括依次组成的FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4区，其中，所述FR1、FR2、FR3、FR4区为框架区氨基酸序列，所述CDR1、CDR2、CDR3为可变区氨基酸序列；其中，所述FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3以及FR4区的氨基酸序列如表1所示。
2.一种核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列编码如权利要求1所述的CD123单域抗体。
3.如权利要求2所述的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列为以下序列之一：
(1)如SEQ ID NO：1～3所示所示的核苷酸序列：
SEQ ID NO：1：GAGGTACAGCTGGTGGAATCTGGGGGAGGCTTGGTGCAGCCTGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTATGGATTCGCCTTCAGTAGCTACGACATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGAAAGGGGCCCGAGTGGGTCTCACGGATTAATTTTAATGGTATCATGACAAGATATGCCGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACGGCCCGTTATTACTGTGTGAAAGGGTATCTAAATAGTGATAGTTCCTTGTCTAAAAATGACAACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA；
SEQ ID NO：2：CAGGTACAGCTGGTGGAATCTGGGGGAGGCTTGGTGCAGCCTGGGGGGTCTCTGCGACTCTCCTGCGCAGCCTCTGGAAGTAGCGTCAGTCTCAATGCCATGGGCTGGTCGCGCGTGCAACCAGGAAGTACGCGCGACTTCGTCGCACGGATTGCTGCCGATGGTAGCA...CTCACTATGCAGACTCCGTGGAGGGCCGGTTCACCATCTCCGGGGACGCCGCCGGGAACACGGTGTATCTACTAATGGATTCGCTGAAACCCGAAGACACGGCCGTCTATTACTGTTT...TGCGTGGCTGGGTACGGACACGTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA；
SEQ ID NO：3：GAGGTACAGCTGGTGGAATCTGGGGGAGGCTTGGTGCAGCCTGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTATGGATTCGCCTTCAGTAACTACGACATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGAAAGGGGCCCGAGTGGGTCTCACGAATTAATTTTAATGGTATTATGACAAGATATGCCGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACGGCCCGTTATTACTGTGTGAAAGGGTATCTAAATAGTGATAGTTCCTTGTCTAAAAATGACAACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA；
(2)SEQ ID NO：1～3所示的核苷酸序列添加、取代、缺失或插入一个或若干个核苷酸序列；
(3)与(1)和/或(2)中的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；
(4)由于遗传密码子的简并性区别于(1)、(2)、(3)中的核苷酸序列的核苷酸序列。
4.一种表达载体，其特征在于，包括如权利要求2至3任一项所述的核苷酸。
5.一种试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的CD123单域抗体，或者如权利要求2至3任一项所述的核苷酸序列。
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