CN111217908B - Cd22单域抗体、核苷酸序列、试剂盒、car-t病毒载体及car-t细胞 - Google Patents

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Abstract

本发明公开CD22单域抗体、核苷酸序列、试剂盒、CAR‑T病毒载体及CAR‑T细胞，所述CD22单域抗体包括编号分别为CD22‑25、CD22‑35和CD22‑45三种抗体中的至少一种，其中，所述CD22‑25、所述CD22‑35和所述CD22‑45的氨基酸序列如表1所示。本发明技术方案通过结合基因工程的方法得到特异性结合CD22蛋白的单域抗体，该抗体特异性结合CD22蛋白的特异性结合能力高，且亲和力高。

Description

CD22单域抗体、核苷酸序列、试剂盒、CAR-T病毒载体及CAR-T 细胞
技术领域
本发明涉及基因工程和抗体药物技术领域，特别涉及CD22单域抗体、核苷酸序列、试剂盒、CAR-T病毒载体及CAR-T细胞。
背景技术
CD22是又称唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素2，是一种B细胞的Ⅱ型跨膜蛋白，存在α，β两种不同的亚型，分子量约为135Kd。CD22是免疫球蛋白超家族的一员，为B淋巴细胞限制性抗原。CD22在成熟B细胞的细胞膜上表达，细胞激活时表达量增加。此外，CD22还大量表达于B细胞淋巴瘤细胞，因此是B细胞非霍奇金淋巴瘤治疗的理想靶点。
嵌合抗原受体T细胞，又称CAR-T，是一种基于基因改造T细胞从而实现T细胞对肿瘤细胞特异性识别和杀伤的新型免疫细胞疗法。其原理为通过基因修饰，使T细胞表达可以特异性识别肿瘤细胞表面抗原的受体结构(单链抗体)，并在该受体与肿瘤细胞表面抗原特异性结合后，激活其下游的免疫共刺激因子与T细胞激活，从而实现T细胞分泌相关细胞因子，对肿瘤细胞进行特异性杀伤。CAR-T细胞技术因其高效杀伤肿瘤活性，高特异性，低副作用，被视为肿瘤治疗中最具前景的抗癌疗法。
由于CAR-T技术需使用结合活性好、结合表位高效的单链抗体，因此，CAR-T细胞疗法的核心在于特异性好、结合力强，结合表位有效的高亲和力抗体。传统CD22抗体的分子量较大，与抗原结合的结合力偏低，亲和力较低，不易改造且稳定性差，且需要进行单链改造，因此使用传统的CD22抗体(如单克隆抗体等)很难实现CAR-T细胞的有效构造。
发明内容
本发明的主要目的是提供CD22单域抗体，其结构为天然的单链结构，且具有高亲和力，高特异性，分子量小等特点，且该单域抗体在构建CAR-T细胞后，应有非常显著的体外杀伤肿瘤细胞的效果。
为实现上述目的，本发明提出CD22单域抗体，包括编号分别为CD22-25、CD22-35和CD22-45三种抗体中的至少一种；所述CD22-25包括依次组成的FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4区，其中，所述CDR1的序列为LYGMG，所述CDR2的序列为AINWRGDSTSYA，所述CDR3的序列为AARKYSAANVFKPNDYDYW，所述FR1的序列为EVQLVESGGGLVQGGGSLRVSCVASGLSFS、EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGLTFN或者EVQLQASGGGLVQGGGSLRVSCVASGLSFS，所述FR2的序列为WFRQAPGKEREFVA、WFRQPPGKEREFVA或者WFRQAPGKEREFVS，所述FR3的序列为DSVKGRFTISRENAKNTAYLQMNSLKPEDTAVYYC或者DSVKGRFTISRDNAKNTMYLQMSSLKPEDTAVYYC，所述FR4的序列为GQGTQVTVSS；所述CD22-35包括依次组成的FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4区，其中，所述CDR1的序列为TYYMG，所述CDR2的序列为RISASGASTDYA，所述CDR3的序列为EADRYGLRYSPVDVYPYW，所述FR1的序列为EVQLVESGGGLVQGGGSLRVSCVASGLSFS、EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGLTFN或者EVQLQASGGGLVQGGGSLRVSCVASGLSFS，所述FR2的序列为WFRQAPGKEREFVA、WFRQPPGKEREFVA或者WFRQAPGKEREFVS，所述FR3的序列为DSVKGRFTISRENAKNTAYLQMNSLKPEDTAVYYC或者DSVKGRFTISRDNAKNTMYLQMSSLKPEDTAVYYC，所述FR4的序列为GQGTQVTVSS；所述CD22-45包括依次组成的FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4区，其中，所述CDR1的序列为YYGMG，所述CDR2的序列为AINWRGDTTSYA，所述CDR3的序列为AARKYSAANVFKPNDYDYW，所述FR1的序列为EVQLVESGGGLVQGGGSLRVSCVASGLSFS、EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGLTFN或者EVQLQASGGGLVQGGGSLRVSCVASGLSFS，所述FR2的序列为WFRQAPGKEREFVA、WFRQPPGKEREFVA或者WFRQAPGKEREFVS，所述FR3的序列为DSVKGRFTISRENAKNTAYLQMNSLKPEDTAVYYC或者DSVKGRFTISRDNAKNTMYLQMSSLKPEDTAVYYC，所述FR4的序列为GQGTQVTVSS。
进一步地，所述CD22-25的序列如SEQ ID NO：1所示，所述CD22-35的序列如SEQ IDNO：2所示，所述CD22-45的序列如SEQ ID NO：3所示，具体如表1所示。
表1：
Figure GDA0003038198290000031
本发明还提供核苷酸序列，所述核苷酸序列编码所述CD22单域抗体。
进一步地，所述核苷酸序列如SEQ ID NO：4～6所示，具体如表2所示。
表2：
Figure GDA0003038198290000032
本发明还提供试剂盒，其特征在于，包含如上所述的CD22单域抗体，或者如上所述的核苷酸序列。
本发明提供人源化CAR基因的核苷酸序列，所述人源化CAR基因的核苷酸序列由如表2所述的核苷酸序列人源化改造而成，所述人源化CAR基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：7～9所示，具体序列如表3所示。
表3：
Figure GDA0003038198290000041
Figure GDA0003038198290000051
本发明还提供CAR-T病毒载体，包含如表3所述的人源化CAR基因的核苷酸。
本发明还提供CAR-T细胞，表达如表3所述的人源化CAR基因。
本发明技术方案通过结合基因工程的方法得到特异性结合CD22蛋白的单域抗体，该抗体特异性结合CD22蛋白的活性高，表达量高，生产成本低，易于改造；并且在构建CAR-T细胞后，能达到非常良好的杀伤肿瘤细胞的作用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为本发明实施例中第一轮PCR单域抗体基因电泳图；
图2为图1中第二轮PCR单域抗体基因电泳图；
图3至图5为本发明实施例中CD22蛋白表达纯化图；
图6至图8为本发明实施例中CD22单域抗体与CD22抗原结合活性图；
图9至图11为本发明实施例中CD22单域抗体与细胞的结合图；
图12至图13为本发明实施例中CD22-CART细胞的体外杀伤实验的结果数据图。
本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例及其附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。且下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法、检测方法等。
本发明提出了CD22单域抗体、核苷酸序列、试剂盒、CAR-T病毒载体及CAR-T细胞。下述内容将针对所述CD22单域抗体及其筛选过程作详细介绍。
实施例1抗CD22抗原特异性的抗体库构建
需要说明的是，本实施例中选用的CD22抗原采购自北京义翘神州，货号11958-H08H1。QIAGEN试剂盒为北京雅安达生物技术有限公司的QIAamp RNA Blood Mini Kit(50)，货号52304。cDNA合成试剂盒为TAKARA公司的MiniBESTAgarose Gel DNAExtractionKit Ver.4.0。
1、免疫实验。
1)选择健康的羊驼为免疫对象；
2)采用2mgCD22抗原与等体积福氏佐剂混合，对一只健康羊驼进行免疫，总共进行6次免疫实验；
3)在第4次免疫实验后，对羊驼血清进行采样，并测定其抗原免疫效价，直至测得的羊驼血清的免疫效价达到1万倍以上时，取100ml羊驼全血，并分离淋巴细胞；
4)裂解步骤3)中的淋巴细胞，用QIAGEN试剂盒提取裂解后淋巴细胞中的RNA，并进行RNA纯化；其中，QIAGEN试剂盒中采用的抗凝剂包括柠檬酸盐、肝素和EDTA中的一种。
2、构建噬菌体抗体库并进行特异性抗原CD22单域抗体的筛选。
1)用免疫实验中对CD22抗原免疫的羊驼的外周血为起始材料，利用cDNA合成试剂盒将免疫实验中提纯的RNA反转录为cDNA，构建cDNA文库。
2)采用巢式PCR克隆目的基因。
a、根据CD22抗原中缺失轻链的抗体重链可变区VHH基因片段设计引物，本实施例中通过设计两套引物来对缺失轻链的抗体重链可变区VHH基因片段进行扩增。
b、第一轮PCR。
PCRFd5’引物：
引物1，核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示：CGCCATCAAGGTACCAGTTGA
引物2，核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示：CGGGATCCCAGGTACAGCTGGTGGATTCTGGGGGAG
PCR Bd3’引物：
引物3，核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示：CCGCTCGAGTACTTCATTCGTTCCTGAGGAGACGGT
第一轮PCR扩增，可得到大于800bp的普通重链抗体基因片段，800bp～500bp之间的为缺失轻链的重链抗体基因片段，以及500bp的VHH目的基因片段。通过凝胶电泳，筛选出800bp～500bp的基因片段和500bp的基因片段。
电泳结果如图1所示。其中，普通CD22抗体扩增得到图1中凝胶电泳1跑道所示的两条亮条带，其碱基量主要分布在500bp～800bp；引物1和引物2配对使用，扩增得到图1中凝胶电泳2跑道所示的一条亮条带，其碱基量主要分布在500bp左右；引物2和引物3配对使用，扩增得到图1中凝胶电泳3跑道所示的一条亮条带，其碱基量主要分布在500bp左右。
c、切胶回收含目的基因的片段。将上述电泳中碱基量在500bp～800bp之间的1号条带，切胶回收，其中，1号条带包含普通抗体基因、缺失轻链的重链抗体基因以及即目的基因；将上述电泳中碱基量在500bp的2号条带以及3号条带，切胶回收，其中，2号条带以及3号条带为带目的基因的条带。
d、第二轮PCR。
引物构建：
引物4，核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示：CCGCTCGAGTGAGGAGACGGTGACCTGG
引物5，核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示：CGGGATCCGAGGTACAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAG
第二轮PCR扩增，经凝胶电泳，可筛选出含重链抗体可变区VHH目的基因(也即500bp的基因片段)。
电泳结果如图2所示。其中，左侧的亮条带为标记DNA分子量，右侧亮条带为引物4和引物5配对使用扩增得到的，其基因碱基量在500bp(也即目的基因)。
3)构建目的基因文库。
将上述获得的VHH目的基因片段和pHEN6噬菌体展示载体质粒采用BamHI内切酶和XhoI内切酶双酶酶切，酶切完成后用连接酶将VHH目的基因片段连接至pHEN6载体，构建重组质粒。将构建好的重组质粒电转化至TG1感受态细胞中，以使VHH目的基因片段与pHEN6载体能融合表达。
取电转化菌液涂布LB/Amp平板，32℃过夜培养。次日用菌落PCR的方法验证抗体的连接效率。若抗体的连接效率小于等于90％则需重复上述实验，直至抗体连接效率大于90％；若抗体连接效率高于90％，则说明目的基因与载体连接良好，重组质粒的表达良好，可继续进行菌落扩大培养实验。
4)扩大培养。
a、将电转化菌液涂布LB/Amp平板，32℃过夜培养；
b、然后用2YT培养基洗，以洗掉原培养环境中的其他成分，以菌液：培养基液＝1:1000的比例在2YT培养基上进行表达目的基因的噬菌体的扩大培养；
c、加入辅助噬菌体M13K07(Invitrogen)进行感染，过夜培养；
d、离心，收集感染辅助噬菌体M13K07的上清液；
e、在上清液中加入20％PEG-2.5M NaCl混匀，再次离心，收集沉淀，并加入PBS和甘油进行重悬，于-80℃保藏备用。
实施例2特异性噬菌体的筛选
1)前期准备。分别准备CD22阴性对照细胞系和经改造的CD22阳性细胞系各5*106，使用CPBSH或2％BSA-PBS在转鼓上室温孵育2小时，离心备用。
2)筛选。将噬菌体(5*1011～1*1012)加入阴性细胞中，CPBS或2％BSA-PBS定量，至0.5ml，在转鼓上室温孵育2小时；取上清液，加入阳性细胞中，CPBS或2％BSA-PBS定量，至0.5ml，在转鼓上室温孵育2小时；以使该噬菌体的外壳能特异性分泌CD22抗体，与CD22抗原结合；用PBST洗涤5次，PBS洗涤3次，离心、弃上清液，以将没有结合的噬菌体洗掉。
3)滴度测定。将上述细胞结合的噬菌体重悬，取2ml对数生长期的TG1，感染，37℃，静置30min，进行滴度测定。
4)扩增、纯化。扩增并纯化扩增后的噬菌体。
重复上述实验三次，并以步骤4)中的噬菌体作为下一次步骤2)中加入的噬菌体。
筛选结果如下：
Figure GDA0003038198290000091
本实施例对噬菌体进行了3次筛选，并检测每次筛选试验洗脱下来的噬菌体滴度，根据上表可以知道：随着筛选轮数的增加，包被液浓度逐级递减，但是洗脱下来的噬菌体增加，也即CD22特异性噬菌体得到富集。
实施例3特异性阳性单克隆抗体的筛选
1)筛选高效表达的重组质粒。
PCR扩增实施例2中获得的特异性CD22抗体基因片段，以获取带有限制性内切酶BbsI和BamHI位点的PCR产物；用限制性内切酶BbsI和BamHI分别处理上述PCR产物和pSJF2载体；利用T4连接酶连接上述酶切后的基因片段，对其进行重组，以获得能在大肠杆菌中高效表达的重组质粒sdAb-pSJF2。
2)筛选CD22阳性克隆抗体。
从生长菌落的琼脂平板上随即挑取单菌落，接种在含有Amp的2YT液体培养基的96孔深孔培养板中，培养4小时；将单克隆一一对应接种在带编号的以小格分隔的含Amp的LB固体平板上；向深孔培养板加入IPTG至终浓度0.5mM诱导，过夜培养；收获表达蛋白的上清液，并以CD22抗原进行ELISA测定，选择OD值大于阴性对照5倍的菌落为挑选出的CD22阳性克隆；将阳性克隆小量培养保种并进行经DNA测序，鉴定抗CD22单域抗体的基因序列，经翻译得到如上述表1所示的氨基酸序列。
实施例4 CD22单域抗体在宿主大肠杆菌中的表达、纯化
1)表达、纯化。
挑选步骤3)中的阳性克隆菌液接种于5ml的含氨基苄青霉素的LB培养液中，37℃，摇床培养过夜；转种2ml过夜培养物于200mL含氨基苄青霉素的LB培养液中，37℃摇床培养，240转/分，培养至OD值达0.4～0.6；加入0.5～1.0mM IPTG，继续培养过夜，然后离心，收菌；高渗法裂解细菌，离心，收上清中可溶性单域抗体蛋白；经Ni+离子亲和层析获得纯度达95％以上的蛋白。
纯化结果如图3至图5所示。
其中，在图3中，Marker为蛋白分子标准，CD22-25为表达CD22-25抗体的菌体裂解后总蛋白粗提样品，CD22-35为表达CD22-35抗体的菌体裂解后总蛋白粗提取样品，CD22-45为表达CD22-45抗体的菌体裂解后总蛋白粗提取样品，说明实施例3)中筛选出来的阳性克隆细菌均能诱导表达出CD22抗体。
在图4和图5中，为经镍柱纯化后的洗脱样品。
图4中，关于CD22-25部分：40mM条带为含有40毫摩咪唑的洗脱液过脱镍柱后剩余的样品，说明经过一次洗脱后CD22-25样品中杂蛋白被洗脱下来；100mM条带为含有100毫摩咪唑的洗脱液过脱镍柱后剩余的样品，主要为目的蛋白，说明经过二次洗脱后CD22-25样品中杂蛋白含量较少，已获得部分目的蛋白；200mM条带为含有200毫摩咪唑的洗脱液过脱镍柱后剩余的样品，说明经过三次洗脱后CD22-25样品中目的蛋白已被洗脱下来，洗脱下来的目标蛋白纯度较高。
关于CD22-35部分：40mM条带为含有40毫摩咪唑的洗脱液过脱镍柱后剩余的样品，说明经过一次洗脱后CD22-35样品中杂蛋白被洗脱下来；100mM条带为含有100毫摩咪唑的洗脱液过脱镍柱后剩余的样品，说明经过二次洗脱后CD22-35样品中已基本为目的蛋白，杂蛋白极少；200mM条带为含有200毫摩咪唑的洗脱液过脱镍柱后剩余的样品，说明经过三次洗脱后CD22-35样品中镍柱中残留的蛋白基本被洗脱下来，洗脱下来的目标蛋白纯度较高。
由上可知，筛选出来的CD22-25和CD22-35的抗体分子的分子量在17KD左右，分子量远远低于传统抗体的分子量，为传统抗体分子量的十分之一。
图5中，40mM条带为含有40毫摩咪唑的洗脱液过脱镍柱后剩余的样品，说明经过一次洗脱后CD22-45样品中蛋白大部分被洗脱下来了；100mM条带为含有100毫摩咪唑的洗脱液过脱镍柱后剩余的样品，说明经过二次洗脱后CD22-45样品中杂蛋白已去除，洗脱下来的目标蛋白纯度较高；200mM条带为含有200毫摩咪唑的洗脱液过脱镍柱后剩余的样品，几乎没有任何蛋白，说明经过二次洗脱后CD22-45样品中镍柱的蛋白完全被洗脱下来，已无任何目的蛋白。由上可知筛选出来的CD22-45的抗体分子的分子量低于17KD，分子量远远低于传统抗体的分子量，为传统抗体分子量的十分之一。
实施例5 CD22单域抗体与CD22抗原结合活性测定
1)包被。以0.05M的Na2CO3·NaHCO3(PH9.5)稀释CD22抗原至2μg/ml；在每个96孔板的反应微孔中加入100μl稀释后的CD22抗原蛋白，4℃过夜孵育；次日，弃反应微孔内包被液，并用PBS洗板三次；加入300μl2％BSA(或1％CPBS)于封闭96孔板中，37℃，孵育2小时。
2)抗原-抗体结合。在每个96孔板的反应微孔中加入100μl不同稀释浓度的纯化的CD22单域抗体，37℃，孵育1小时，用0.05％PBST洗板三次；在每个反应微孔中加入100μl5000倍稀释的anti-His antibody(HRP)，37℃，孵育1小时，用0.05％PBST洗板三次；在每个反应微孔中加入100μlTMB，避光室温静置10min。
3)终止反应。在每个反应微孔中加入50μl 2M H2SO4终止反应。
4)结果判定。用酶标仪测定450nm波长下的样品OD值，并得到如图6至图8所示的结果，图为不同基因片段纯化的CD22单域抗体与CD22蛋白结合的浓度梯度(ELISA)。从图中以看出，即便CD22单域抗体与CD22抗原结合后的浓度在2ug/ml时，依然具有较好的结合活性，说明抗体结合活性极佳，优于目前已有技术。
实施例6 CD22单域抗体与细胞表面活性CD22蛋白的结合
1)流式细胞结合。采用20μg/ml CD22纳米抗体蛋白与CD22阳性细胞Raji细胞系结合；抗HIS抗体染色，并利用BD FACSCalibur流式细胞仪进行流式细胞术分析，得到如图9至图11所示的结果。
2)结果分析。
在图9中，CD22-25纳米抗体能与细胞发生结合，且其结合率大于50％。在图10中，CD22-35纳米抗体能与细胞发生结合，且其结合率近90％。在图11中，CD22-45纳米抗体能与细胞发生结合，且其结合率大于60％。由图9至图11可知，本发明实施例组中申请保护的CD22纳米抗体对细胞膜表面表达的CD22抗原具有非常良好的结合能力。
因此，本发明实施例组中申请保护的CD22特异性单克隆纳米抗体在制备CAR-T细胞药物方向有非常大的前景。
实施例7 CAR基因序列的构建
为使该CD22单域抗体的蛋白能够在人源T细胞中表达，本发明实施例中将该CD22单域抗体进行了人源化密码子优化，从而获得能够在人源T细胞中顺利表达该单域抗体结构的核苷酸序列。
1)获取含有CD22单域抗体的目的基因的碱基序列，如上表2所示；
2)对各个碱基序列进行人源化密码子优化；
3)将表2中的碱基序列组合添加信号肽、胞外区跨膜区以及胞内区的基因序列，构建CAR结构(即嵌合抗原受体结构)，以使新的碱基序列能在T细胞中顺利表达，并得到如表3所示的新的基因序列；
本实施例中将含有目的基因的碱基序列进行人源化优化，以使其适用于人体T细胞的表达。
实施例8构建质粒并包装病毒
1)构建包装质粒。根据实施例7中表3的碱基序列设计合适的引物，并进行PCR扩增；选用限制性内切酶对扩增出来的含CAR-T目的基因的基因片段进行酶切；然后将含有CAR-T目的基因的片段连接至pre-SIN载体，形成重组的穿梭质粒，将该重组穿梭质粒、包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2.G分别电转至感受态细菌中，并在酵母培养基中扩大培养；提取上述三种质粒并纯化，以用于病毒包装。
2)包装病毒，以获得含有CAR-T目的基因的病毒，并通过该包装好的病毒感染人体细胞，使得CAR-T目的基因能在人体细胞中得到表达。具体步骤如下：
2a)病毒包装前24小时，用胰酶消化293T细胞(购自ATCC)。培养基接种细胞浓度：每个培养皿接种1*107个细胞；可选地，本实施例中采用10cm培养皿。
2b)共转染293T细胞。将实施例7中构建的CAR-T病毒载体穿梭质粒(即CD22-CAR质粒)、本实施例1)中构建的包装质粒psPAX2以及包膜质粒pMD2.0G质粒三种质粒混合后加入500uL DMEM培养基中，以制备稀释的质粒混合物；同时，在另一个微型管内将30uL PEI加入500uL DMEM培养基中，以制备稀释的转染试剂；将稀释的转染试剂逐滴加入稀释的质粒混合物上方，混、离心，室温静置20min，形成含有转染剂和质粒混合物的共混物；将共混物加入含有293T细胞的10cm培养皿(也即本实施例2)中的培养皿)，混匀(轻轻晃动10次)、放入孵箱进行细胞转染，可选地，上述孵箱内环境温度为37℃、并充入5％CO2。
2c)收获包装病毒。转染2天后，取2b)中培养皿上清液，离心，以除去死亡的293T细胞；并将上述离心后的上清液过滤、浓缩、分装，即可得到包装病毒；-80℃保存备用。
实施例9构建CD22 CART细胞
1)分离T细胞，过夜培养；按MOI＝10加入上述实施例8中得到的CD22CAR病毒液，感染、过夜；病毒感染后第二日补加1ml新鲜培养液，过夜培养；病毒感染后第三日，将该T细胞转入25cm2培养瓶，此时，T细胞已充分活化，并进入增殖旺盛期；病毒感染后第五日，测定CD22 CAR分子在T细胞上的表达效率，得到如图12至图13所示的结果。
2)结果分析。参见图12和图13，可以清楚地知道，CD22 CAR分子在CD22CART细胞表面上的表达效率高于50％，远远高于传统T细胞的表达。
实施例10 anti-CD22 CAR-T细胞体外功能评价
本实施例采用LDH检测试剂盒(Promega)进行检测体外细胞杀伤实验，使用效靶比为4:1(CAR-T细胞数量：靶细胞数量＝4：1)。
体外培养Raji细胞(淋巴瘤细胞)，并利用流式细胞仪检测CD22表达情况。在96孔板的每个孔中加入3×104靶细胞，并以含X-VIVO培养基将其余所有孔的体系补足200μL/孔，37℃，5％CO2培养箱中培养；17h后，在最大释放的孔内加入20μL的裂解液，混匀，以使细胞完全裂解，将96孔板放入CO2培养箱中孵育；待靶细胞全部裂解，从每个孔吸出50μL上清液到平底96孔板中，并在各个孔中加入50μL底物液，避光显色30min；查看颜色变化，并用酶标仪测定490nm波长下的样品OD值，得到如图12至图13所示的结果。
结果分析。由图12和图13可知，在效靶比为4:1时，CD22-25-CART细胞、CD22-35-CART细胞以及CD22-45-CART细胞对靶细胞的杀伤活性高达40％以上，而作为对照组的CART细胞对靶细胞的杀伤活性不足5％。对比发现，CD22 CART细胞产品对淋巴瘤细胞有更好的杀伤力。
以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的发明构思下，利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳普瑞金生物药业有限公司
<120> CD22单域抗体、核苷酸序列、试剂盒、CAR-T病毒载体及CAR-T细胞
<130>
<160> 14
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 1
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Gly Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Val Ser Cys Val Ala Ser Gly Leu Ser Phe Ser Leu Tyr
20 25 30
Gly Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Asn Trp Arg Gly Asp Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Arg Lys Tyr Ser Ala Ala Asn Val Phe Lys Pro Asn Asp Tyr
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 2
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 2
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Phe Asn Thr Tyr
20 25 30
Tyr Met Gly Trp Phe Arg Gln Pro Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Arg Ile Ser Ala Ser Gly Ala Ser Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Met Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Glu Ala Asp Arg Tyr Gly Leu Arg Tyr Ser Pro Val Asp Val Tyr Pro
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 3
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 3
Glu Val Gln Leu Gln Ala Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Gly Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Val Ser Cys Val Ala Ser Gly Leu Ser Phe Ser Tyr Tyr
20 25 30
Gly Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ser Ala Ile Asn Trp Arg Gly Asp Thr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Arg Lys Tyr Ser Ala Ala Asn Val Phe Lys Pro Asn Asp Tyr
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 4
<211> 375
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
gaagtgcaac tggtggaatc tggtggagga ctggttcaag gaggaggctc tctccgggtt 60
tcatgcgtcg catctgggct gtcttttagc ctgtacggaa tgggctggtt ccggcaggct 120
ccaggtaagg aaagagagtt cgtggcagct atcaattgga gaggcgactc aacttcatac 180
gccgattccg tgaagggaag attcaccatt tcaagagaga atgccaagaa taccgcttac 240
ctccagatga actccctgaa gcccgaggac actgcagtct attactgtgc tgcccggaag 300
tacagtgccg ccaacgtttt caaacccaac gactatgatt actgggggca gggcacccag 360
gtgactgtga gttct 375
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<212> DNA
<213> 人工合成
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gaagttcagc tggtcgaaag tggaggagga ctggttcaag caggtgggtc cctcagactg 60
agctgcgcag cctctgggct gacttttaat acctattata tgggttggtt taggcagcca 120
cccggtaaag agagagagtt cgtggccaga attagcgctt ccggtgctag cacagattac 180
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tacggcctgc ggtactcacc cgtggacgtt tacccatact ggggccaagg cactcaggtc 360
acagtttcct cc 372
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 6
gaagtgcaac tgcaagcatc cggcggtggt ctggtccaag gaggagggag tctgcgcgtg 60
agttgcgtgg catctggcct gtccttcagc tactacggga tgggatggtt tcgccaggct 120
cctggtaagg aaagggagtt cgtgtccgct atcaattggc gcggagatac aacaagttac 180
gccgactccg tcaaagggcg cttcacaatt agtagagaga acgccaagaa cacagcatac 240
ctgcagatga atagtctgaa acccgaggat accgccgtgt actactgtgc agctcggaaa 300
tacagcgctg caaatgtgtt caagccaaac gactacgact actggggaca gggaacccag 360
gtgacagtgt cctct 375
<210> 7
<211> 1128
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 7
atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60
atcccagaag tgcaactggt ggaatctggt ggaggactgg ttcaaggagg aggctctctc 120
cgggtttcat gcgtcgcatc tgggctgtct tttagcctgt acggaatggg ctggttccgg 180
caggctccag gtaaggaaag agagttcgtg gcagctatca attggagagg cgactcaact 240
tcatacgccg attccgtgaa gggaagattc accatttcaa gagagaatgc caagaatacc 300
gcttacctcc agatgaactc cctgaagccc gaggacactg cagtctatta ctgtgctgcc 360
cggaagtaca gtgccgccaa cgttttcaaa cccaacgact atgattactg ggggcagggc 420
acccaggtga ctgtgagttc tcctgcaaaa cctactacta caccagcacc aagaccacct 480
actcctgctc ctactattgc cagccagcct ctctctctcc ggcccgaagc ctgtaggcca 540
gccgccggtg gcgcagtgca tacaagaggc ctcgatttcg cctgcgacat ctacatttgg 600
gctccactgg caggaacctg cggtgtgctg ctgctcagcc tggttattac cctctactgc 660
aagcgcggta ggaagaagct gctgtacata ttcaaacaac cctttatgag gcccgtccag 720
accacccagg aggaggatgg ctgcagctgt aggtttcctg aggaagaaga gggcggttgc 780
gagctcaggg tcaagttcag ccggagtgct gacgctcccg cttaccagca gggccagaac 840
cagctgtata acgagctgaa tctgggcagg agggaggaat atgatgtgct ggataaacgg 900
agaggacggg accctgagat gggcggaaaa cctcagcgcc ggaagaaccc tcaggaagga 960
ctgtacaatg aactgcagaa agacaagatg gctgaagcct acagcgagat cgggatgaaa 1020
ggtgaaagaa gacgcgggaa aggtcatgat gggctgtacc agggcctgag caccgccacc 1080
aaggacactt acgacgcact gcacatgcag gccctgccac cacggtaa 1128
<210> 8
<211> 1125
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 8
atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60
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agactgagct gcgcagcctc tgggctgact tttaatacct attatatggg ttggtttagg 180
cagccacccg gtaaagagag agagttcgtg gccagaatta gcgcttccgg tgctagcaca 240
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atgtacctcc aaatgagcag tctgaaacct gaggatacag ccgtgtatta ttgcgaagcc 360
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caggtcacag tttcctcccc tgcaaaacct actactacac cagcaccaag accacctact 480
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ctgtataacg agctgaatct gggcaggagg gaggaatatg atgtgctgga taaacggaga 900
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<210> 9
<211> 1128
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 9
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<213> 人工合成
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<212> DNA
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<212> DNA
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<400> 14
cgggatccga ggtacagctg gtggagtctg ggggag 36

Claims (7)

1.CD22单域抗体，其特征在于，包括编号分别为CD22-25、CD22-35和CD22-45三种抗体中的至少一种；
所述CD22-25包括依次组成的FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4区，其中，所述CDR1的序列为LYGMG，所述CDR2的序列为AINWRGDSTSYA，所述CDR3的序列为AARKYSAANVFKPNDYDYW，所述FR1的序列为EVQLVESGGGLVQGGGSLRVSCVASGLSFS、EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGLTFN或者EVQLQASGGGLVQGGGSLRVSCVASGLSFS，所述FR2的序列为WFRQAPGKEREFVA、WFRQPPGKEREFVA或者WFRQAPGKEREFVS，所述FR3的序列为DSVKGRFTISRENAKNTAYLQMNSLKPEDTAVYYC或者DSVKGRFTISRDNAKNTMYLQMSSLKPEDTAVYYC，所述FR4的序列为GQGTQVTVSS；
所述CD22-35包括依次组成的FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4区，其中，所述CDR1的序列为TYYMG，所述CDR2的序列为RISASGASTDYA，所述CDR3的序列为EADRYGLRYSPVDVYPYW，所述FR1的序列为EVQLVESGGGLVQGGGSLRVSCVASGLSFS、EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGLTFN或者EVQLQASGGGLVQGGGSLRVSCVASGLSFS，所述FR2的序列为WFRQAPGKEREFVA、WFRQPPGKEREFVA或者WFRQAPGKEREFVS，所述FR3的序列为DSVKGRFTISRENAKNTAYLQMNSLKPEDTAVYYC或者DSVKGRFTISRDNAKNTMYLQMSSLKPEDTAVYYC，所述FR4的序列为GQGTQVTVSS；
所述CD22-45包括依次组成的FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4区，其中，所述CDR1的序列为YYGMG，所述CDR2的序列为AINWRGDTTSYA，所述CDR3的序列为AARKYSAANVFKPNDYDYW，所述FR1的序列为EVQLVESGGGLVQGGGSLRVSCVASGLSFS、EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGLTFN或者EVQLQASGGGLVQGGGSLRVSCVASGLSFS，所述FR2的序列为WFRQAPGKEREFVA、WFRQPPGKEREFVA或者WFRQAPGKEREFVS，所述FR3的序列为DSVKGRFTISRENAKNTAYLQMNSLKPEDTAVYYC或者DSVKGRFTISRDNAKNTMYLQMSSLKPEDTAVYYC，所述FR4的序列为GQGTQVTVSS。
2.核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列编码如权利要求1所述的CD22单域抗体。
3.如权利要求2所述的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列如SEQ ID NO:4～6所示。
4.试剂盒，其特征在于，包含如权利要求1所述的CD22单域抗体，或者如权利要求2至3任一项所述的核苷酸序列。
5.CAR-T基因的核苷酸序列，其特征在于，所述CAR-T基因的核苷酸序列由如权利要求2至3任一项所述的核苷酸序列人源化改造而成，所述CAR-T基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：7～9所示。
6.CAR-T病毒载体，其特征在于，包含如权利要求5所述的CAR-T基因的核苷酸序列。
7.CAR-T细胞，其特征在于，表达如权利要求5所述的CAR-T基因的核苷酸序列。
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