KR20230164128A - 기능성 항원 결합 단백질 선별을 위한 벡터 및 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 파지 디스플레이 기술 및/또는 세포 디스플레이 기술을 통하여, 알려진 서열과 기능을 갖는 기준 항원 결합 단백질의 경쇄 또는 그 단편, 또는 기준 항원 결합 단백질의 중쇄 또는 그 단편을 사용하여 발현 벡터를 구성하여, 기준 항원 결합 단백질과 동일한 에피토프에 결합하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 단계를 포함하는, 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 방법을 통하여 얻어진 기능성 항원 결합 단백질에 관한 것이다.

Description

기능성 항원 결합 단백질 선별을 위한 벡터 및 방법
본 출원은 생물 의약품 분야에 관한 것으로서, 특히 항원 결합 단백질을 발현시키는 벡터를 구성하는 방법 및 기능성 항원 결합 단백질의 선별 방법에 관한 것이다.
현재, 항체 산업에서 원하는 특성을 가진 기능성 항체 또는 그 항원 결합 단편을 얻기 위해 널리 사용되는 방법은 주로 하이브리도마 기술과 항체 라이브러리 기술이다. 그러나, 하이브리도마 기술은 후보 클론 수가 적고, 양성 클론이 쉽게 손실되는 문제가 있으며, 양성 클론의 선택, 특히 복잡한 기능 선별은 많은 시간과 작업량이 필요하다. 항체 라이브러리 기술은 유전자 공학 방법을 이용하여 항체 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 유전자를 플라스미드 또는 파지에 복제하여 발현하고, 그 후 상이한 항원을 사용하여 특이성 항체 유전자를 갖는 클론을 선별하는 것을 말하며, 주로 파지 디스플레이 기술과 효모 표면 디스플레이 기술을 포함한다. 항체 라이브러리 기술은 라이브러리 용량을 크게 증가시키지만, 목표 항원은 일반적으로 여러 개(예를 들어, 몇 개, 수십 개 내지 수백 개)의 항원 결정 인자를 가지지만, 원하는 생물학적 기능을 가진 항원 결정 인자는 하나 또는 몇 개에 불과할 수 있다. 목표 타겟에 대한 항원 특이성 항체 또는 그 항원 결합 단편을 선별할 때, 어떤 항원 결정 인자가 원하는 생물학적 기능을 갖는지 알 수 없다. 종래 기술은 일반적으로 먼저 대량의 항원 특이성 항체 또는 그 항원 결합 단편을 확보한 후, 다시 하나씩 분석 및 감정하여 특정 항원 결정 인자에 결합되고, 원하는 생물학적 기능을 갖는 항체 또는 그 항원 결합 단편을 찾아내는데, 여전히 오랜 시간과 비교적 많은 작업량이 필요하고 선별 효과가 좋지 않다. 따라서, 선도 분자의 품질, 수량 및 다양성을 향상시키고 약물 개발 속도를 가속화하며 개발 성공률을 높이기 위해, 항체 또는 그 항원 결합 단편을 발견하기 위한 새로운 기술이 필요하다.
일 양태로, 본 출원은 기능성 항원 결합 단백질을 제공하며, a) 제1 폴리뉴클레오타이드가 제공되며, 상기 제1 폴리뉴클레오타이드는 5' 내지 3' 방향(5'-to-3' direction)으로 R1-핵산 단편 I-R2를 포함하고, 상기 핵산 단편 I은 항원 결합 단편 I을 인코딩할 수 있는 단계; b) 제2 폴리뉴클레오타이드가 제공되며, 상기 제2 폴리뉴클레오타이드는 5' 내지 3' 방향으로 R3-기준 핵산 단편 II-R4를 포함하고, 상기 기준 핵산 단편 II는 기준 항원 결합 단편(reference antigen-binding fragment) II를 인코딩할 수 있으며, 상기 기준 항원 결합 단편 II는 기준 핵산 단편 I에 의해 인코딩된 기준 항원 결합 단편 I과 결합하여 기준 항원 결합 단백질을 형성할 수 있는 단계; c) 제1 벡터 폴리뉴클레오타이드가 제공되며, 상기 제1 벡터 폴리뉴클레오타이드는 5' 내지 3' 방향으로 R2-벡터 단편 I-R3을 포함하는 단계; d) 제2 벡터 폴리뉴클레오타이드가 제공되며, 상기 제2 벡터 폴리뉴클레오타이드는 5' 내지 3' 방향으로 R4-벡터 단편 II-R1을 포함하는 단계; e) 상기 제1 폴리뉴클레오타이드, 상기 제2 폴리뉴클레오타이드, 상기 제1 벡터 폴리뉴클레오타이드 및 상기 제2 벡터 폴리뉴클레오타이드를 제한 엔도뉴클레아제(restriction endonuclease)로 절단하여, 절단된 제1 폴리뉴클레오타이드, 절단된 제2 폴리뉴클레오타이드, 절단된 제1 벡터 폴리뉴클레오타이드 및 절단된 제2 벡터 폴리뉴클레오타이드를 얻는 단계; f) 상기 절단된 제1 폴리뉴클레오타이드, 상기 절단된 제2 폴리뉴클레오타이드, 상기 절단된 제1 벡터 폴리뉴클레오타이드 및 상기 절단된 제2 벡터 폴리뉴클레오타이드를 혼합하여, 이들이 지향 연결(directional linkage)되고 고리화되어 제1 선별 대상 벡터(to-be-screened vector)를 형성하게 할 수 있는 단계; g) 상기 제1 선별 대상 벡터가 발현되게 하며, 상기 기준 항원 결합 단백질이 결합할 수 있는 표적에 대한 결합력은 상기 기준 항원 결합 단백질과 상기 표적의 결합력의 30% 이상인 특성을 갖는 발현 생성물을 발현할 수 있는 제1 선별 대상 벡터를 제1 치환 벡터로 선택하는 단계; h) 상기 제1 치환 벡터로부터 상기 기능성 항원 결합 단백질을 얻는 단계를 포함하며; 여기서, 상기 R1, R2, R3 및 R4는 각각 독립적으로 제한 엔도뉴클레아제 식별 사이트(recognition site)이다.
일부 실시형태에서, 상기 방법은 상기 R1 및 R2를 특이적으로 식별하는 제한 엔도뉴클레아제를 사용하여 상기 제1 폴리뉴클레오타이드를 절단하여, 상기 절단된 제1 폴리뉴클레오타이드를 얻는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 방법은 상기 R3 및 R4를 특이적으로 식별하는 제한 엔도뉴클레아제를 사용하여 상기 제2 폴리뉴클레오타이드를 절단하여, 상기 절단된 제2 폴리뉴클레오타이드를 얻는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 방법은 상기 R2 및 R3을 특이적으로 식별하는 제한 엔도뉴클레아제를 사용하여 상기 제1 벡터 폴리뉴클레오타이드를 절단하여, 상기 절단된 제1 벡터 폴리뉴클레오타이드를 얻는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 방법은 상기 R4 및 R1을 특이적으로 식별하는 제한 엔도뉴클레아제를 사용하여 상기 제2 벡터 폴리뉴클레오타이드를 절단하여, 상기 절단된 제2 벡터 폴리뉴클레오타이드를 얻는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 R1을 특이적으로 식별하는 제한 엔도뉴클레아제에 의한 특이적 절단에 의해 생성된 상기 R1의 말단과 대응하는 제한 엔도뉴클레아제에 의한 특이적 절단에 의해 생성된 상기 R2, R3 및 R4 중 어느 하나의 말단이 서로 식별되거나 연결되지 않는다.
일부 실시형태에서, 상기 R2를 특이적으로 식별하는 제한 엔도뉴클레아제에 의한 특이적 절단에 의해 생성된 상기 R2의 말단과 대응하는 제한 엔도뉴클레아제에 의한 특이적 절단에 의해 생성된 상기 R1, R3 및 R4 중 어느 하나의 말단이 서로 식별되거나 연결되지 않는다.
일부 실시형태에서, 상기 R3을 특이적으로 식별하는 제한 엔도뉴클레아제에 의한 특이적 절단에 의해 생성된 상기 R3의 말단과 대응하는 제한 엔도뉴클레아제에 의한 특이적 절단에 의해 생성된 상기 R1, R2 및 R4 중 어느 하나의 말단이 서로 식별되거나 연결되지 않는다.
일부 실시형태에서, 상기 R4를 특이적으로 식별하는 제한 엔도뉴클레아제에 의한 특이적 절단에 의해 생성된 상기 R4의 말단과 대응하는 제한 엔도뉴클레아제에 의한 특이적 절단에 의해 생성된 상기 R1, R2 및 R3 중 어느 하나의 말단이 서로 식별되거나 연결되지 않는다.
일부 실시형태에서, 상기 제한 엔도뉴클레아제는 SfiI 및 BsmBI 중에서 선택된다.
일부 실시형태에서, 상기 방법은 상기 제1 선별 대상 벡터를 세포에 도입하여, 상기 제1 선별 대상 벡터가 발현되도록 하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 방법은 상기 제1 선별 대상 벡터를 박테리아에 도입하여, 하나 이상의 상기 제1 선별 대상 벡터를 포함하는 파지 라이브러리를 제조하여, 상기 파지 라이브러리로부터 상기 기능성 항원 결합 단백질을 얻는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 벡터 단편 I은 링커를 포함하고, 상기 벡터 단편 II는 디스플레이 벡터로부터 유래된다.
일부 실시형태에서, 상기 핵산 단편 I은 항체 경쇄 또는 그 단편을 인코딩하고, 상기 벡터 단편 I은 상기 링커를 포함하며, 상기 기준 핵산 단편 II는 항체 중쇄 또는 그 단편을 인코딩하고, 상기 벡터 단편 II는 상기 디스플레이 벡터로부터 유래된다.
일부 실시형태에서, 상기 R1은 서열번호 1에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 R2는 서열번호 2에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 R3은 서열번호 3에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 R4는 서열번호 4에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 벡터 단편 II는 링커를 포함하고, 상기 벡터 단편 I은 디스플레이 벡터로부터 유래된다.
일부 실시형태에서, 상기 핵산 단편 I은 항체 중쇄 또는 그 단편을 인코딩하고, 상기 벡터 단편 I은 상기 디스플레이 벡터로부터 유래되며, 상기 기준 핵산 단편 II는 항체 경쇄 또는 그 단편을 인코딩하고, 상기 벡터 단편 II는 상기 링커를 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 R1은 서열번호 3에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 R2는 서열번호 4에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 R3은 서열번호 1에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 R4는 서열번호 2에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 디스플레이 벡터는 pComb3x 벡터로부터 유래된다.
일부 실시형태에서, 상기 링커는 신호 펩타이드 pelB 또는 그 단편을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 링커의 길이는 약 50 내지 약 200개 염기이다.
일부 실시형태에서, 상기 방법은 상기 제1 선별 대상 벡터를 박테리아에 도입하여, 상기 박테리아로부터 제1 선별 대상 벡터의 DNA를 획득하며, 상기 제1 선별 대상 벡터의 DNA를 세포에 도입하여, 상기 세포로부터 상기 기능성 항원 특이적 결합 폴리펩타이드를 얻는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 세포는 포유동물 세포이다.
일부 실시형태에서, 상기 벡터 단편 I 및/또는 상기 벡터 단편 II는 포유동물 세포 발현 벡터로부터 유래된다.
일부 실시형태에서, 상기 포유동물 세포 발현 벡터는 pDGB4로부터 유래된다.
일부 실시형태에서, 상기 핵산 단편 I은 항체 경쇄 또는 그 단편을 인코딩하고, 상기 기준 핵산 단편 II는 항체 중쇄 또는 그 단편을 인코딩한다.
일부 실시형태에서, 상기 R1은 서열번호 7에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 R2는 서열번호 8에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 R3은 서열번호 5에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 R4는 서열번호 6에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 핵산 단편 I은 항체 중쇄 또는 그 단편을 인코딩하고, 상기 기준 핵산 단편 II는 항체 경쇄 또는 그 단편을 인코딩한다.
일부 실시형태에서, 상기 R1은 서열번호 5에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 R2는 서열번호 6에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 R3은 서열번호 7에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 R4는 서열번호 8에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 방법은 a) 제3 폴리뉴클레오타이드가 제공되며, 상기 제3 폴리뉴클레오타이드는 5' 내지 3' 방향으로 R5-핵산 단편 I'-R6을 포함하는 단계; b) 제4 폴리뉴클레오타이드가 제공되며, 상기 제4 폴리뉴클레오타이드는 5' 내지 3' 방향으로 R7-핵산 단편 II'-R8을 포함하고, 상기 핵산 단편 II'는 항원 결합 단백질 II'를 인코딩할 수 있으며, 상기 항원 결합 단편 II'는 상기 기준 항원 결합 단편 I과 결합되어, 기준 항원 결합 단백질이 결합할 수 있는 표적에 대한 결합력은 상기 기준 항원 결합 단백질과 상기 표적의 결합력의 30% 이상인 특성을 갖는 항원 결합 단백질을 형성할 수 있는 단계; c) 제3 벡터 폴리뉴클레오타이드가 제공되며, 상기 제3 벡터 폴리뉴클레오타이드는 5' 내지 3' 방향으로 R6-벡터 단편 III-R7을 포함하는 단계; d) 제4 벡터 폴리뉴클레오타이드가 제공되며, 상기 제4 벡터 폴리뉴클레오타이드는 5' 내지 3' 방향으로 R8-벡터 단편 IV-R5를 포함하는 단계; e) 상기 제3 폴리뉴클레오타이드, 상기 제4 폴리뉴클레오타이드, 상기 제3 벡터 폴리뉴클레오타이드 및 상기 제4 벡터 폴리뉴클레오타이드를 제한 엔도뉴클레아제로 절단하여, 절단된 제3 폴리뉴클레오타이드, 절단된 제4 폴리뉴클레오타이드, 절단된 제3 벡터 폴리뉴클레오타이드 및 절단된 제4 벡터 폴리뉴클레오타이드를 얻는 단계; f) 상기 절단된 제3 폴리뉴클레오타이드, 상기 절단된 제4 폴리뉴클레오타이드, 상기 절단된 제3 벡터 폴리뉴클레오타이드 및 상기 절단된 제4 벡터 폴리뉴클레오타이드를 혼합하여, 이들이 지향 연결되고 고리화되어 이중 치환 선별 대상 벡터를 형성하게 할 수 있는 단계; g) 상기 이중 치환 선별 대상 벡터가 발현되게 하며, 상기 표적에 대한 결합력은 상기 기준 항원 결합 단백질과 상기 표적의 결합력의 30% 이상인 특성을 갖는 발현 생성물을 발현할 수 있는 이중 치환 선별 대상 벡터를 이중 치환 벡터로 선택하는 단계; h) 상기 이중 치환 벡터로부터 상기 기능성 항원 결합 단백질을 얻는 단계를 포함하며; 여기에서, 상기 R5, R6, R7 및 R8은 각각 독립적으로 상기 제한 엔도뉴클레아제 식별 사이트이다.
일부 실시형태에서, 상기 방법은 상기 R5 및 R6을 특이적으로 식별하는 제한 엔도뉴클레아제를 사용하여 상기 제3 폴리뉴클레오타이드를 절단하여, 상기 절단된 제3 폴리뉴클레오타이드를 얻는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 R7 및 R8을 특이적으로 식별하는 제한 엔도뉴클레아제를 사용하여 상기 제4 폴리뉴클레오타이드를 절단하여, 상기 절단된 제4 폴리뉴클레오타이드를 얻는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 방법은 상기 R6 및 R7을 특이적으로 식별하는 제한 엔도뉴클레아제를 사용하여 상기 제3 벡터 폴리뉴클레오타이드를 절단하여, 상기 절단된 제3 벡터 폴리뉴클레오타이드를 얻는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 방법은 상기 R8 및 R5를 특이적으로 식별하는 제한 엔도뉴클레아제를 사용하여 상기 제4 벡터 폴리뉴클레오타이드를 절단하여, 상기 절단된 제4 벡터 폴리뉴클레오타이드를 얻는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 R5를 특이적으로 식별하는 제한 엔도뉴클레아제에 의한 특이적 절단에 의해 생성된 상기 R5의 말단과 대응하는 제한 엔도뉴클레아제에 의한 특이적 절단에 의해 생성된 상기 R6, R7 및 R8 중 어느 하나의 말단이 서로 식별되거나 연결되지 않는다.
일부 실시형태에서, 상기 R6을 특이적으로 식별하는 제한 엔도뉴클레아제에 의한 특이적 절단에 의해 생성된 상기 R6의 말단과 대응하는 제한 엔도뉴클레아제에 의한 특이적 절단에 의해 생성된 상기 R5, R7 및 R8 중 어느 하나의 말단이 서로 식별되거나 연결되지 않는다.
일부 실시형태에서, 상기 R7을 특이적으로 식별하는 제한 엔도뉴클레아제에 의한 특이적 절단에 의해 생성된 상기 R7의 말단과 대응하는 제한 엔도뉴클레아제에 의한 특이적 절단에 의해 생성된 상기 R5, R6 및 R8 중 어느 하나의 말단이 서로 식별되거나 연결되지 않는다.
일부 실시형태에서, 상기 R8을 특이적으로 식별하는 제한 엔도뉴클레아제에 의한 특이적 절단에 의해 생성된 상기 R8의 말단과 대응하는 제한 엔도뉴클레아제에 의한 특이적 절단에 의해 생성된 상기 R5, R6 및 R7 중 어느 하나의 말단이 서로 식별되거나 연결되지 않는다.
일부 실시형태에서, 상기 제한 엔도뉴클레아제는 SfiI 및 BsmBI 중에서 선택된다.
일부 실시형태에서, 상기 방법은 상기 이중 치환 선별 대상 벡터를 세포에 도입하여, 상기 이중 치환 선별 대상 벡터가 발현되도록 하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 방법은 상기 이중 치환 선별 대상 벡터를 박테리아에 도입하여, 하나 이상의 상기 이중 치환 선별 대상 벡터를 포함하는 파지 라이브러리를 제조하여, 상기 파지 라이브러리로부터 상기 기능성 항원 결합 단백질을 얻는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 벡터 단편 III은 링커를 포함하고, 상기 벡터 단편 IV는 디스플레이 벡터로부터 유래된다.
일부 실시형태에서, 상기 핵산 단편 I'는 항체 경쇄 또는 그 단편을 인코딩하고, 상기 벡터 단편 III은 상기 링커를 포함하며, 상기 핵산 단편 II'는 항체 중쇄 또는 그 단편을 인코딩하고, 상기 벡터 단편 IV는 상기 디스플레이 벡터로부터 유래된다.
일부 실시형태에서, 상기 R5는 서열번호 1에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 R6은 서열번호 2에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 R7은 서열번호 3에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 R8은 서열번호 4에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 벡터 단편 IV는 링커를 포함하고, 상기 벡터 단편 III은 디스플레이 벡터로부터 유래된다.
일부 실시형태에서, 상기 핵산 단편 I'는 항체 중쇄 또는 그 단편을 인코딩하고, 상기 벡터 단편 III은 상기 디스플레이 벡터로부터 유래되며, 상기 핵산 단편 II'는 항체 경쇄 또는 그 단편을 인코딩하고, 상기 벡터 단편 IV는 상기 링커를 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 R5는 서열번호 3에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 R6은 서열번호 4에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 R7은 서열번호 1에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 R8은 서열번호 2에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 디스플레이 벡터는 pComb3x 벡터로부터 유래된다.
일부 실시형태에서, 상기 링커는 신호 펩타이드 pelB 또는 그 단편을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 링커의 길이는 약 50 내지 약 200개 염기이다.
일부 실시형태에서, 상기 방법은 상기 이중 디스플레이 선별 대상 벡터를 박테리아에 도입하고, 상기 박테리아로부터 이중 디스플레이 선별 대상 벡터의 DNA를 획득하며, 상기 이중 디스플레이 선별 대상 벡터의 DNA를 세포에 도입하여, 상기 세포로부터 상기 기능성 항원 특이적 결합 폴리펩타이드를 얻는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 세포는 포유동물 세포이다.
일부 실시형태에서, 상기 벡터 단편 III 및/또는 상기 벡터 단편 IV는 포유동물 세포 발현 벡터로부터 유래된다.
일부 실시형태에서, 상기 포유동물 세포 발현 벡터는 pDGB4로부터 유래된다.
일부 실시형태에서, 상기 핵산 단편 I'는 항체 경쇄 또는 그 단편을 인코딩하고, 상기 핵산 단편 II'는 항체 중쇄 또는 그 단편을 인코딩한다.
일부 실시형태에서, 상기 R5는 서열번호 7에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 R6은 서열번호 8에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 R7은 서열번호 5에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 R8은 서열번호 6에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 핵산 단편 I'는 항체 중쇄 또는 그 단편을 인코딩하고, 상기 핵산 단편 II'는 항체 경쇄 또는 그 단편을 인코딩한다.
일부 실시형태에서, 상기 R5는 서열번호 5에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 R6은 서열번호 6에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 R7은 서열번호 7에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 R8은 서열번호 8에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 방법은 a) 제5 폴리뉴클레오타이드가 제공되며, 상기 제5 폴리뉴클레오타이드는 5' 내지 3' 방향으로 R9-기준 핵산 단편 I-R10을 포함하는 단계; b) 제6 폴리뉴클레오타이드가 제공되며, 상기 제6 폴리뉴클레오타이드는 5' 내지 3' 방향으로 R11-핵산 단편 II-R12를 포함하는 단계; c) 제5 벡터 폴리뉴클레오타이드가 제공되며, 상기 제5 벡터 폴리뉴클레오타이드는 5' 내지 3' 방향으로 R10-벡터 단편 V-R11을 포함하는 단계; d) 제6 벡터 폴리뉴클레오타이드가 제공되며, 상기 제6 벡터 폴리뉴클레오타이드는 5' 내지 3' 방향으로 R12-벡터 단편 VI-R9를 포함하는 단계; e) 상기 제5 폴리뉴클레오타이드, 상기 제6 폴리뉴클레오타이드, 상기 제5 벡터 폴리뉴클레오타이드 및 상기 제6 벡터 폴리뉴클레오타이드를 제한 엔도뉴클레아제로 절단하여, 절단된 제5 폴리뉴클레오타이드, 절단된 제6 폴리뉴클레오타이드, 절단된 제5 벡터 폴리뉴클레오타이드 및 절단된 제6 벡터 폴리뉴클레오타이드를 얻는 단계; f) 상기 절단된 제5 폴리뉴클레오타이드, 상기 절단된 제6 폴리뉴클레오타이드, 상기 절단된 제5 벡터 폴리뉴클레오타이드 및 상기 절단된 제6 벡터 폴리뉴클레오타이드를 혼합하여, 이들이 지향 연결되고 고리화되어 제2 선별 대상 벡터를 형성하게 할 수 있는 단계; g) 상기 제2 선별 대상 벡터가 발현되게 하며, 상기 기준 항원 결합 단백질이 결합할 수 있는 표적에 대한 결합력은 상기 기준 항원 결합 단백질과 상기 표적의 결합력의 30% 이상인 특성을 갖는 발현 생성물을 발현할 수 있는 제2 선별 대상 벡터를 제2 치환 벡터로 선택하는 단계; h) 상기 제2 치환 벡터의 핵산 단편 II를 상기 핵산 단편 II'로 선택하는 단계를 포함하며; 여기서, 상기 R9, R10, R11 및 R12는 각각 독립적으로 제한 엔도뉴클레아제 식별 사이트이다.
일부 실시형태에서, 상기 R9 및 R10을 특이적으로 식별하는 제한 엔도뉴클레아제를 사용하여 상기 제5 폴리뉴클레오타이드를 절단하여, 상기 절단된 제5 폴리뉴클레오타이드를 얻는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 방법은 상기 R11 및 R12를 특이적으로 식별하는 제한 엔도뉴클레아제를 사용하여 상기 제6 폴리뉴클레오타이드를 절단하여, 상기 절단된 제6 폴리뉴클레오타이드를 얻는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 R10 및 R11을 특이적으로 식별하는 제한 엔도뉴클레아제를 사용하여 상기 제5 벡터 폴리뉴클레오타이드를 절단하여, 상기 절단된 제5 벡터 폴리뉴클레오타이드를 얻는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 방법은 상기 R12 및 R9를 특이적으로 식별하는 제한 엔도뉴클레아제를 사용하여 상기 제6 벡터 폴리뉴클레오타이드를 절단하여, 상기 절단된 제6 벡터 폴리뉴클레오타이드를 얻는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 R9를 특이적으로 식별하는 제한 엔도뉴클레아제에 의한 특이적 절단에 의해 생성된 상기 R9의 말단과 대응하는 제한 엔도뉴클레아제에 의한 특이적 절단에 의해 생성된 상기 R10, R11 및 R12 중 어느 하나의 말단이 서로 식별되거나 연결되지 않는다.
일부 실시형태에서, 상기 R10을 특이적으로 식별하는 제한 엔도뉴클레아제에 의한 특이적 절단에 의해 생성된 상기 R10의 말단과 대응하는 제한 엔도뉴클레아제에 의한 특이적 절단에 의해 생성된 상기 R11, R12 및 R9 중 어느 하나의 말단이 서로 식별되거나 연결되지 않는다.
일부 실시형태에서, 상기 R11을 특이적으로 식별하는 제한 엔도뉴클레아제에 의한 특이적 절단에 의해 생성된 상기 R11의 말단과 대응하는 제한 엔도뉴클레아제에 의한 특이적 절단에 의해 생성된 상기 R9, R10 및 R12 중 어느 하나의 말단이 서로 식별되거나 연결되지 않는다.
일부 실시형태에서, 상기 R12를 특이적으로 식별하는 제한 엔도뉴클레아제에 의한 특이적 절단에 의해 생성된 상기 R12의 말단과 대응하는 제한 엔도뉴클레아제에 의한 특이적 절단에 의해 생성된 상기 R9, R10 및 R11 중 어느 하나의 말단이 서로 식별되거나 연결되지 않는다.
일부 실시형태에서, 상기 제한 엔도뉴클레아제는 SfiI 및 BsmBI 중에서 선택된다.
일부 실시형태에서, 상기 방법은 상기 제2 선별 대상 벡터를 세포에 도입하여, 상기 제2 선별 대상 벡터가 발현되도록 하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 방법은 상기 제2 선별 대상 벡터를 박테리아에 도입하여, 하나 이상의 상기 제2 선별 대상 벡터를 포함하는 파지 라이브러리를 제조하여, 상기 파지 라이브러리로부터 상기 기능성 항원 결합 단백질을 얻는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 벡터 단편 V는 링커를 포함하고, 상기 벡터 단편 VI은 디스플레이 벡터로부터 유래된다.
일부 실시형태에서, 상기 기준 핵산 단편 I은 항체 경쇄 또는 그 단편을 인코딩하고, 상기 벡터 단편 V는 상기 링커를 포함하며, 상기 핵산 단편 II는 항체 중쇄 또는 그 단편을 인코딩하고, 상기 벡터 단편 VI은 상기 디스플레이 벡터로부터 유래된다.
일부 실시형태에서, 상기 R9는 서열번호 1에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 R10은 서열번호 2에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 R11은 서열번호 3에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 R12는 서열번호 4에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 벡터 단편 VI은 링커를 포함하고, 상기 벡터 단편 V는 디스플레이 벡터로부터 유래된다.
일부 실시형태에서, 상기 기준 핵산 단편 I은 항체 중쇄 또는 그 단편을 인코딩하고, 상기 벡터 단편 V는 상기 디스플레이 벡터로부터 유래되며, 상기 핵산 단편 II는 항체 경쇄 또는 그 단편을 인코딩하고, 상기 벡터 단편 VI은 상기 링커를 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 R9는 서열번호 3에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 R10은 서열번호 4에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 R11은 서열번호 1에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 R12는 서열번호 2에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 디스플레이 벡터는 pComb3x 벡터로부터 유래된다.
일부 실시형태에서, 상기 링커는 신호 펩타이드 pelB 또는 그 단편을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 링커의 길이는 약 50 내지 약 200개 염기이다.
일부 실시형태에서, 상기 방법은 상기 제2 선별 대상 벡터를 박테리아에 도입하여, 상기 박테리아로부터 제2 선별 대상 벡터의 DNA를 획득하며, 상기 제2 선별 대상 벡터의 DNA를 세포에 도입하여, 상기 세포로부터 상기 기능성 항원 특이적 결합 폴리펩타이드를 얻는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 세포는 포유동물 세포이다.
일부 실시형태에서, 상기 벡터 단편 V 및/또는 상기 벡터 단편 VI은 포유동물 세포 발현 벡터로부터 유래된다.
일부 실시형태에서, 상기 포유동물 세포 발현 벡터는 pDGB4로부터 유래된다.
일부 실시형태에서, 상기 기준 핵산 단편 I은 항체 경쇄 또는 그 단편을 인코딩하고, 상기 핵산 단편 II는 항체 중쇄 또는 그 단편을 인코딩한다.
일부 실시형태에서, 상기 R9는 서열번호 7에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 R10은 서열번호 8에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 R11은 서열번호 5에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 R12는 서열번호 6에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 기준 핵산 단편 I은 항체 중쇄 또는 그 단편을 인코딩하고, 상기 핵산 단편 II는 항체 경쇄 또는 그 단편을 인코딩한다.
일부 실시형태에서, 상기 R9는 서열번호 5에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 R10은 서열번호 6에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 R11은 서열번호 7에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 R12는 서열번호 8에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 항원 결합 단백질은 항체 또는 항체 단편을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 항체 단편은 scFv, Fab, Fab', (Fab)2 및/또는 (Fab')2를 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 지향 연결은 리가제의 사용을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 리가제는 DNA 리가제이다.
다른 일 양태로, 본 출원은 항원 결합 단백질의 제조 방법을 제공하는 바, 상기 제1 치환 벡터, 상기 제2 치환 벡터 및/또는 상기 이중 치환 벡터가 발현되는 조건 하에서, 상기 제1 치환 벡터, 상기 제2 치환 벡터 및/또는 상기 이중 치환 벡터를 발현하는 단계를 포함한다.
다른 일 양태로, 본 출원은 상기 방법에 따라 제조된 제1 치환 벡터를 제공한다.
다른 일 양태로, 본 출원은 상기 방법에 따라 제조된 제2 치환 벡터를 제공한다.
다른 일 양태로, 본 출원은 상기 방법에 따라 제조된 이중 치환 벡터를 제공한다.
다른 일 양태로, 본 출원은 상기 방법에 따라 제조된 기능성 항원 결합 단백질을 제공한다.
본 출원은 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 알려진 서열 및/또는 기능을 갖는 기준 항원 결합 단백질의 기준 항원 결합 단편(예를 들어, 기준 항원 결합 단편 I 및/또는 기준 항원 결합 단편 II)을 사용하여 벡터(예를 들어, 상기 이중 치환 선별 대상 벡터, 제1 선별 대상 벡터 및/또는 제2 선별 대상 벡터)를 구성하고, 상기 벡터가 발현되도록 하며, 상기 벡터의 발현 생성물과 상기 기준 항원 결합 단백질에 의해 식별 가능한 표적의 결합 활성에 기초하여, 상기 기능성 항원 결합 단백질을 얻는 단계를 포함한다. 본 출원은 또한 상기 벡터를 구성하는 방법 및 상기 벡터에 의해 얻어진 기능성 항원 결합 단백질을 제공한다. 본 출원은 종래 기술에 알려진 서열 및/또는 기능을 갖는 기준 항원 결합 단백질의 경쇄 및 중쇄 또는 그 단편을 통하여, 항체의 파지 디스플레이 기술 또는 세포 표면 디스플레이 기술과 결합하여 원하는 특성을 갖는 새로운 기능성 항원 결합 단백질을 선별하여 얻으며, 선별에 의해 얻어진 상기 기능성 항원 결합 단백질은 기준 항원 결합 단백질과 동일하거나 유사한 표적의 에피토프에 결합할 가능성이 높고, 생물학적 활성을 가질 가능성이 높고 선별 효율이 높으며 선별 시간이 짧다.
당업자는 아래의 상세한 설명을 통해 본 출원의 다른 측면 및 장점에 대하여 쉽게 이해할 수 있을 것이다. 아래의 상세한 설명은 본 출원의 예시적인 실시형태들만 도시하고 설명한다. 당업자가 할 수 있듯이, 본 출원의 내용은 당업자가 본 출원이 관련된 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 개시된 특정 실시형태를 변경할 수 있도록 한다. 따라서, 첨부된 도면 및 본 출원의 명세서에 기재된 설명은 단지 예시적인 것일 뿐이며, 이를 제한하기 위한 것이 아니다.
본 출원에 언급된 발명의 구체적인 특징은 첨부된 특허청구범위에 보여진 바와 같다. 본 출원이 관련된 본 발명의 특징 및 장점은 아래에 상세히 설명된 예시적인 실시형태 및 첨부 도면을 참조함으로써 더 잘 이해될 수 있다. 첨부된 도면에 대한 간략한 설명은 아래와 같다.
도 1은 본 출원의 상기 제1 선별 대상 벡터의 예시적 구조를 도시한다.
도 2는 본 출원의 상기 이중 치환 선별 대상 벡터의 예시적 구조를 도시한다.
도 3은 본 출원의 상기 제2 선별 대상 벡터의 예시적 구조를 도시한다.
도 4는 본 출원의 상기 방법으로 얻은 항체의 항체 흥분 활성 분석 결과를 도시한다.
도 5는 본 출원의 상기 방법으로 얻은 항체의 항체 세포내 섭취 활성 분석 결과를 도시한다.
도 6은 본 출원의 상기 방법으로 얻은 항체를 단독 투여한 항종양 효과를 도시한다.
도 7은 본 출원의 상기 방법으로 얻은 항체를 병행 투여한 항종양 효과를 도시한다.
아래, 특정된 구체적인 실시예를 통하여 본 출원의 실시방식에 대하여 설명하도록 하는 바, 당업계 통상의 지식을 가진 자들은 본 명세서에 기재된 내용에 의하여 용이하게 본 출원의 기타 장점과 효과를 이해할 수 있을 것이다.
용어 정의
본 출원에서, "기준 항원 결합 단백질"이라는 용어는 일반적으로 적어도 하나의 원하는 생물학적 기능을 갖는 항원 결합 단백질을 지칭한다. 예를 들어, 높은 친화력으로 어느 한 표적에 특이적으로 결합하고/거나, 어느 한 단백질과 특정 리간드의 결합을 차단하고/거나, 면역 세포를 자극하여 사이토카인을 분비하는 등이다. 기준 항원 결합 단백질은 종래 기술 중의 알려진 아미노산 서열 및/또는 기능을 갖는 항원 결합 단백질(예컨대, 항체)로부터 유래되는 것일 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 기준 항원 결합 단백질은 상업화의 항체 제품 및/또는 임상 시험 중인 항체로부터 유래된다. 어떤 기준 항원 결합 단백질(및 "기준 항원 결합 단편 I" 및/또는 "참조 항원-결합 단편 II")을 선택하는지는 어떤 생물학적 기능을 갖는 항원 결합 단백질을 원하는지에 의해 결정된다. 예를 들어, PD-1에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질을 얻고자 하는 경우, PD-1 항체인 Nivolumab, Pembrolizumab 또는 Cemiplimab을 기준 항원 결합 단백질로 선택할 수 있다. 예를 들어, PD-L1에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질을 얻고자 하는 경우, PD-1 항체인 Atezolizumab, Avelumab 또는 Durvalumab을 기준 항원 결합 단백질로 선택할 수 있다.
본 출원에서, "기준 핵산 단편 I"이라는 용어는 일반적으로 기준 항원 결합 단편 I을 인코딩할 수 있는 핵산 단편을 지칭한다.
본 출원에서, "기준 핵산 단편 II"라는 용어는 일반적으로 기준 항원 결합 단편 II를 인코딩할 수 있는 핵산 단편을 지칭한다.
본 출원에서, "기준 항원 결합 단편 I"이라는 용어는 일반적으로 기준 항원 결합 단백질을 형성할 수 있는 폴리펩타이드 단편을 지칭한다. 상기 "기준 항원 결합 단편 I"은 항체 중쇄 또는 중쇄 가변 영역, 또는 중쇄 단편일 수 있고, 또한 항체 경쇄 또는 경쇄 가변 영역, 또는 경쇄 단편일 수 있다.
본 출원에서, "기준 항원 결합 단편 II"라는 용어는 일반적으로 기준 항원 결합 단백질을 형성할 수 있는 폴리펩타이드 단편을 지칭한다. 상기 "기준 항원 결합 단편 II"는 항체 중쇄 또는 중쇄 가변 영역, 또는 중쇄 단편일 수 있고, 또한 항체 경쇄 또는 경쇄 가변 영역, 또는 경쇄 단편일 수 있다.
"기준 항원 결합 단편 I"은 "기준 항원 결합 단편 II"와 함께 항원 결합 단백질(예를 들어, 기준 항원 결합 단백질)을 형성할 수 있다.
본 출원에서, "항원 결합 단백질"이라는 용어는 일반적으로 항원 결합 부분을 포함하는 단백질 및 선택적으로 항원 결합을 허용하는 부분이 사용하는 항원 결합 단백질과 항원 결합을 촉진하는 구성의 스캐폴드 또는 지지체 또는 골격 부분을 지칭한다. 항원 결합 단백질은 전형적으로 항체 경쇄 가변 영역(VL), 항체 중쇄 가변 영역(VH) 또는 전술한 두 가지 및 그 기능적 단편을 포함할 수 있다. 중쇄와 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호 작용하는 결합 구조 도메인을 포함한다. 항원 결합 단백질의 예로는 항체, 항원 결합 단편, 면역 결합체, 다중 특이성 항체(예를 들어, 이중 특이성 항체), 항체 단편, 항체 유도체, 항체 유사체 또는 융합 단백질을 포함하되, 원하는 항원 결합 활성을 나타내기만 하면 이에 제한되지는 않는다.
본 출원에서 "항체"라는 용어는 일반적으로 특정 단백질 또는 펩타이드 또는 그 단편에 반응성을 갖는 면역 글로불린을 지칭한다. 항체는 모든 클래스의 항체에서 유래될 수 있으며, 여기에는 IgG, IgA, IgM, IgD 및 IgE와 모든 서브 클래스(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4)에서 유래되는 항체를 포함하되, 이에 제한되지 않는다. 항체는 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 중에서 선택된 중쇄 불변 영역을 가질 수 있다. 항체는 또한, 예를 들어 kappa(κ) 또는 lambda(λ) 중에서 선택된 경쇄를 가질 수 있다. 본 출원의 항체는 임의의 종으로부터 유래될 수 있다.
본 출원에서, "항원 결합 단백질"이라는 용어는 항원과 상호 작용하고 항원에 항체에 대한 특이성 및 친화성을 부여하는 아미노산 잔기를 포함하는 항체 분자의 어느 부분을 지칭할 수 있다. 본 출원에서, "항원 결합 단백질"이라는 용어는 항체 또는 항체 단편을 포함할 수 있고, 특히 항체 경쇄 또는 그 단편(예를 들어, VL) 및 항체 중쇄 또는 그 단편(예를 들어, VH)을 포함하는 항체 부분을 지칭할 수 있다. 상기 항원 결합 단백질에서, 상기 항체 경쇄 또는 그 단편(예를 들어, VL) 및 상기 항체 중쇄 또는 그 단편(예를 들어, VH)은 링커(예를 들어, 펩타이드 링커)에 의해 N-말단 또는 C-말단에서 결합되어 폴리펩타이드 사슬을 형성할 수 있다. 상기 항원 결합 단백질에서, 항체 경쇄 또는 그 단편(예를 들어, VL) 및 항체 중쇄 또는 그 단편(예를 들어, VH)은 또한 사슬간 화학 결합(예를 들어, 이황화 결합)에 의해 연결되어 이량체를 형성할 수 있다. 항원 결합 단백질의 예로는 Fab, Fab', F(ab)2, Fv 단편, F(ab')2, scFv, di-scFv 및/또는 dAb 등이 포함될 수 있지만, 이에 제한되지는 않다. 예를 들어, 상기 항원 결합 단백질은 scFv 또는 Fab일 수 있다.
본 출원에서, "Fab"이라는 용어는 일반적으로 구조적으로 완전한 항체가 파파인에 의해 소화되어(예를 들어, Fc 영역 및 힌지 영역을 제거) 생성된 2개의 동일한 항원 결합 단편을 지칭한다. Fab은 완전한 경쇄, 중쇄의 가변 영역(VH), 중쇄의 제1 불변 구조 도메인(CH1)으로 구성될 수 있다. 각 Fab는 단일 항원 결합 사이트를 가질 수 있다.
본 출원에서 "scFv"라는 용어는 일반적으로 항체의 중쇄 가변 구조 도메인과 경쇄 가변 구조 도메인을 유연한 펩타이드 링커를 통해 공유 결합 페어링시켜 형성된 1가 분자를 지칭한다.
본 출원에서, "기능성 항원 결합 단백질"이라는 용어는 일반적으로 본 출원의 방법에 따라 선택된 원하는 기능을 갖는 항원 결합 단백질을 지칭한다. 예를 들어, 높은 친화력으로 어느 한 표적에 특이적으로 결합하고/거나, 어느 한 단백질과 특정 리간드의 결합을 차단하고/거나, 면역 세포를 자극하여 사이토카인을 분비하는 등이다. 상기 기능성 항원 결합 단백질은 본 출원의 기준 결합 단백질이 결합할 수 있는 표적에 결합할 수 있고, 상기 표적에 대한 결합력은 상기 기준 항원 결합 단백질과 상기 표적의 결합력의 30% 이상(예를 들어, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99% 이상)인 특성을 가진다. 기능성 항원 결합 단백질은 기준 항원 결합 단편 I 및 항원 결합 단편 II'를 포함할 수 있다. 기능성 항원 결합 단백질은 기준 항원 결합 단편 II 및 항원 결합 단편 I'를 포함할 수 있다. 기능성 항원 결합 단백질은 항원 결합 단편 I' 및 항원 결합 단편 II"를 포함할 수 있다.
본 출원에서, "핵산 단편 I"이라는 용어는 일반적으로 항원 결합 단편 I을 발현할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 핵산 단편 I 중에서, 이것에 의해 발현된 항원 결합 단편 I이 기준 핵산 단편 II에 의해 발현된 기준 항원 결합 단편 I과 항원 결합 단백질을 형성할 수 있고, 상기 항원 결합 단백질은 상기 기준 항원 결합 단백질이 특이적으로 결합할 수 있는 표적에 결합할 수 있고, 상기 표적에 대한 결합력은 상기 기준 항원 결합 단백질과 상기 표적의 결합력의 30% 이상(예를 들어, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99% 이상)인 하나 이상의 특성을 가지는 특성을 갖는 핵산 단편 I이 핵산 단편 I'로 선택된다. 각 핵산 단편 I이 모두 핵산 단편 I'인 것은 아니다. 핵산 단편 I에 의해 발현되는 각 항원 결합 단편 I이 모두 기준 핵산 단편 II에 의해 발현되는 기준 항원 결합 단편 II와 항원 결합 단백질을 형성할 수 있는 것은 아니다.
본 출원에서, "핵산 단편 I'"라는 용어는 일반적으로 항원 결합 단편 I'를 발현할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 핵산 단편 I'에 의해 발현된 항원 결합 단편 I'가 기준 핵산 단편 II에 의해 발현된 기준 항원 결합 단편 I과 기능성 항원 결합 단백질을 형성할 수 있고, 상기 항원 결합 단백질은 상기 기준 항원 결합 단백질이 특이적으로 결합할 수 있는 표적에 결합할 수 있고, 상기 표적에 대한 결합력은 상기 기준 항원 결합 단백질과 상기 표적의 결합력의 30% 이상(예를 들어, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99% 이상)인 하나 이상의 특성을 가진다.
본 출원에서, "핵산 단편 II"이라는 용어는 일반적으로 항원 결합 단편 II를 발현할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 핵산 단편 II 중에서, 이것에 의해 발현된 항원 결합 단편 II가 기준 핵산 단편 I에 의해 발현된 기준 항원 결합 단편 I과 항원 결합 단백질을 형성할 수 있고, 상기 항원 결합 단백질은 상기 기준 항원 결합 단백질이 특이적으로 결합할 수 있는 표적에 결합할 수 있고, 상기 표적에 대한 결합력은 상기 기준 항원 결합 단백질과 상기 표적의 결합력의 30% 이상(예를 들어, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99% 이상)인 하나 이상의 특성을 갖는 핵산 단편 II가 핵산 단편 II'로 선택된다. 각 핵산 단편 II가 모두 핵산 단편 II'인 것은 아니다. 핵산 단편 II에 의해 발현되는 각 항원 결합 단편 II가 모두 기준 핵산 단편 I에 의해 발현되는 기준 항원 결합 단편 I과 항원 결합 단백질을 형성할 수 있는 것은 아니다.
본 출원에서, "핵산 단편 II'"라는 용어는 일반적으로 항원 결합 단편 II'를 발현할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 핵산 단편 II'에 의해 발현된 항원 결합 단백질 II'가 기준 핵산 단편 I에 의해 발현된 기준 항원 결합 단편 I과 기능성 항원 결합 단백질을 형성할 수 있고, 상기 항원 결합 단백질은 상기 기준 항원 결합 단백질이 특이적으로 결합할 수 있는 표적에 결합할 수 있고, 상기 표적에 대한 결합력은 상기 기준 항원 결합 단백질과 상기 표적의 결합력의 30% 이상(예를 들어, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99% 이상)인 하나 이상의 특성을 가진다.
본 출원에서, "항원 결합 단편 I"이라는 용어는 일반적으로 핵산 단편 I에 의해 인코딩되는 핵산 단편 I의 발현 생성물을 지칭한다. 항원 결합 단편 I 중에서, 기준 항원 결합 단편 II와 항원 결합 단백질을 형성할 수 있고, 상기 항원 결합 단백질은 상기 기준 항원 결합 단백질이 특이적으로 결합할 수 있는 표적에 결합할 수 있고, 상기 표적에 대한 결합력은 상기 기준 항원 결합 단백질과 상기 표적의 결합력의 30% 이상(예를 들어, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99% 이상)인 하나 이상의 특성을 갖는 항원 결합 단편 I이 항원 결합 단편 I'로 선택된다. 각 항원 결합 단편 I이 모두 항원 결합 단편 I'인 것은 아니다. 상기 "항원 결합 단편 I"은 항체 중쇄 또는 중쇄 가변 영역, 또는 중쇄 단편일 수 있고, 또한 항체 경쇄 또는 경쇄 가변 영역, 또는 경쇄 단편일 수 있다.
본 출원에서, "항원 결합 단편 I'"라는 용어는 일반적으로 핵산 단편 I'에 의해 인코딩되는 핵산 단편 I'의 발현 생성물을 지칭한다. 항원 결합 단편 I'는 항원 결합 단편 I에서 기준 항원 결합 단편 II와 결합하여 기능성 항원 결합 단백질을 형성할 수 있고, 상기 항원 결합 단백질은 상기 기준 항원 결합 단백질이 특이적으로 결합할 수 있는 표적에 결합할 수 있고, 상기 표적에 대한 결합력은 상기 기준 항원 결합 단백질과 상기 표적의 결합력의 30% 이상(예를 들어, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99% 이상)인 하나 이상의 특성을 가진다.
본 출원에서, "항원 결합 단편 II"라는 용어는 일반적으로 핵산 단편 II에 의해 인코딩되는 핵산 단편 II의 발현 생성물을 지칭한다. 항원 결합 단편 II 중에서, 기준 항원 결합 단편 I과 항원 결합 단백질을 형성할 수 있고, 상기 항원 결합 단백질은 상기 기준 항원 결합 단백질이 특이적으로 결합할 수 있는 표적에 결합할 수 있고, 상기 표적에 대한 결합력은 상기 기준 항원 결합 단백질과 상기 표적의 결합력의 30% 이상(예를 들어, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99% 이상)인 하나 이상의 특성을 갖는 항원 결합 단편 II가 항원 결합 단편 II'로 선택된다. 각 항원 결합 단편 II가 모두 항원 결합 단편 II'인 것은 아니다. 상기 "항원 결합 단편 II"는 항체 중쇄 또는 중쇄 가변 영역, 또는 중쇄 단편일 수 있고, 또한 항체 경쇄 또는 경쇄 가변 영역, 또는 경쇄 단편일 수 있다.
본 출원에서, "항원 결합 단편 II'"라는 용어는 일반적으로 핵산 단편 II'에 의해 인코딩되는 핵산 단편 II'의 발현 생성물을 지칭한다. 항원 결합 단편 II'는 항원 결합 단편 II에서 기준 항원 결합 단편 I과 결합하여 기능성 항원 결합 단백질을 형성할 수 있고, 상기 항원 결합 단백질은 상기 기준 항원 결합 단백질이 특이적으로 결합할 수 있는 표적에 결합할 수 있고, 상기 표적에 대한 결합력은 상기 기준 항원 결합 단백질과 상기 표적의 결합력의 30% 이상(예를 들어, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99% 이상)인 하나 이상의 특성을 가진다.
본 출원에서, "제1 폴리뉴클레오타이드"라는 용어는 일반적으로 핵산 단편 I을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다. 본 출원에서, 상기 제1 폴리뉴클레오타이드는 또한 5' 말단 및/또는 3' 말단에 엔도뉴클레아제(예를 들어, 제한 엔도뉴클레아제)에 대한 식별 사이트를 가질 수 있다. 예를 들어, 상기 제1 폴리뉴클레오타이드는 5' 내지 3' 방향으로 구조 R1-핵산 단편 I-R2를 포함할 수 있으며, 여기서 상기 R1 및 R2는 제한 엔도뉴클레아제에 대한 식별 사이트일 수 있다. 예를 들어, 상기 제1 폴리뉴클레오타이드의 엔도뉴클레아제 식별 사이트를 식별하는 엔도뉴클레아제(예를 들어, R1 및 R2를 식별하는 제한 엔도뉴클레아제, 예를 들어, SfiI 또는 BsmBI)에 의한 효소 절단 처리 후, 효소 절단 처리된 상기 제1 폴리뉴클레오타이드는 상기 핵산 단편 I을 포함할 수 있다.
본 출원에서, "제1 벡터 폴리뉴클레오타이드"라는 용어는 일반적으로 벡터 단편 I을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다. 본 출원에서, 상기 제1 벡터 폴리뉴클레오타이드는 또한 5' 말단 및/또는 3' 말단에 엔도뉴클레아제(예를 들어, 제한 엔도뉴클레아제)에 대한 식별 사이트를 가질 수 있다. 예를 들어, 상기 제1 벡터 폴리뉴클레오타이드는 5' 내지 3' 방향으로 구조 R2-벡터 단편 I-R3을 포함할 수 있으며, 여기서 상기 R2 및 R3은 제한 엔도뉴클레아제에 대한 식별 사이트일 수 있다. 예를 들어, 상기 제1 벡터 폴리뉴클레오타이드의 엔도뉴클레아제 식별 사이트를 식별하는 엔도뉴클레아제(예를 들어, R2 및 R3을 식별하는 제한 엔도뉴클레아제, 예를 들어, SfiI 또는 BsmBI)에 의한 효소 절단 처리 후, 효소 절단 처리된 상기 제1 벡터 폴리뉴클레오타이드는 상기 벡터 단편 I을 포함할 수 있다.
본 출원에서, "제2 폴리뉴클레오타이드"라는 용어는 일반적으로 기준 핵산 단편 II를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다. 본 출원에서, 상기 제2 폴리뉴클레오타이드는 또한 5' 말단 및/또는 3' 말단에 엔도뉴클레아제(예를 들어, 제한 엔도뉴클레아제)에 대한 식별 사이트를 가질 수 있다. 예를 들어, 상기 제2 폴리뉴클레오타이드는 5' 내지 3' 방향으로 구조 R3-기준 핵산 단편 II-R4를 포함할 수 있으며, 여기서 상기 R3 및 R4는 제한 엔도뉴클레아제에 대한 식별 사이트일 수 있다. 예를 들어, 상기 제2 폴리뉴클레오타이드의 엔도뉴클레아제 식별 사이트를 식별하는 엔도뉴클레아제(예를 들어, R3 및 R4를 식별하는 제한 엔도뉴클레아제, 예를 들어, SfiI 또는 BsmBI)에 의한 효소 절단 처리 후, 효소 처리된 상기 제2 폴리뉴클레오타이드는 상기 기준 핵산 단편 II를 포함할 수 있다.
본 출원에서, "제2 벡터 폴리뉴클레오타이드"라는 용어는 일반적으로 벡터 단편 II를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다. 본 출원에서, 상기 제2 벡터 폴리뉴클레오타이드는 또한 5' 말단 및/또는 3' 말단에 엔도뉴클레아제(예를 들어, 제한 엔도뉴클레아제)에 대한 식별 사이트를 가질 수 있다. 예를 들어, 상기 제2 벡터 폴리뉴클레오타이드는 5' 내지 3' 방향으로 구조 R4-벡터 단편 II-R1을 포함할 수 있으며, 여기서 상기 R4 및 R1은 제한 엔도뉴클레아제에 대한 식별 사이트일 수 있다. 예를 들어, 상기 제2 벡터 폴리뉴클레오타이드의 엔도뉴클레아제 식별 사이트를 식별하는 엔도뉴클레아제(예를 들어, R4 및 R1을 식별하는 제한 엔도뉴클레아제, 예를 들어, SfiI 또는 BsmBI)에 의한 효소 절단 처리 후, 효소 처리된 상기 제2 벡터 폴리뉴클레오타이드는 상기 벡터 단편 II를 포함할 수 있다.
본 출원에서, "제3 폴리뉴클레오타이드"라는 용어는 일반적으로 핵산 단편 I'를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다. 본 출원에서, 상기 제3 폴리뉴클레오타이드는 또한 5' 말단 및/또는 3' 말단에 엔도뉴클레아제(예를 들어, 제한 엔도뉴클레아제)에 대한 식별 사이트를 가질 수 있다. 예를 들어, 상기 제3 폴리뉴클레오타이드는 5' 내지 3' 방향으로 구조 R5-핵산 단편 I'-R6을 포함할 수 있으며, 여기서 상기 R5 및 R6은 제한 엔도뉴클레아제에 대한 식별 사이트일 수 있다. 예를 들어, 상기 제3 폴리뉴클레오타이드의 엔도뉴클레아제 식별 사이트를 식별하는 엔도뉴클레아제(예를 들어, R5 및 R6을 식별하는 제한 엔도뉴클레아제, 예를 들어, SfiI 또는 BsmBI)에 의한 효소 절단 처리 후, 효소 처리된 상기 제3 폴리뉴클레오타이드는 상기 핵산 단편 I'를 포함할 수 있다.
본 출원에서, "제3 벡터 폴리뉴클레오타이드"라는 용어는 일반적으로 벡터 단편 III을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다. 본 출원에서, 상기 제3 벡터 폴리뉴클레오타이드는 또한 5' 말단 및/또는 3' 말단에 엔도뉴클레아제(예를 들어, 제한 엔도뉴클레아제)에 대한 식별 사이트를 가질 수 있다. 예를 들어, 상기 제3 벡터 폴리뉴클레오타이드는 5' 내지 3' 방향으로 구조 R6-벡터 단편 III-R7을 포함할 수 있으며, 여기서 상기 R6 및 R7은 제한 엔도뉴클레아제에 대한 식별 사이트일 수 있다. 예를 들어, 상기 제3 벡터 폴리뉴클레오타이드의 엔도뉴클레아제 식별 사이트를 식별하는 엔도뉴클레아제(예를 들어, R6 및 R7을 식별하는 제한 엔도뉴클레아제, 예를 들어, SfiI 또는 BsmBI)에 의한 효소 절단 처리 후, 효소 처리된 상기 제3 벡터 폴리뉴클레오타이드는 상기 벡터 단편 III을 포함할 수 있다.
본 출원에서, "제4 폴리뉴클레오타이드"라는 용어는 일반적으로 핵산 단편 II'를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다. 본 출원에서, 상기 제4 폴리뉴클레오타이드는 또한 5' 말단 및/또는 3' 말단에 엔도뉴클레아제(예를 들어, 제한 엔도뉴클레아제)에 대한 식별 사이트를 가질 수 있다. 예를 들어, 상기 제4 폴리뉴클레오타이드는 5' 내지 3' 방향으로 구조 R7-핵산 단편 II'-R8을 포함할 수 있으며, 여기서 상기 R7 및 R8은 제한 엔도뉴클레아제에 대한 식별 사이트일 수 있다. 예를 들어, 상기 제4 폴리뉴클레오타이드의 엔도뉴클레아제 식별 사이트를 식별하는 엔도뉴클레아제(예를 들어, R7 및 R8을 식별하는 제한 엔도뉴클레아제, 예를 들어, SfiI 또는 BsmBI)에 의한 효소 절단 처리 후, 효소 처리된 상기 제2 폴리뉴클레오타이드는 상기 핵산 단편 II'를 포함할 수 있다.
본 출원에서, "제4 벡터 폴리뉴클레오타이드"라는 용어는 일반적으로 벡터 단편 IV를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다. 본 출원에서, 상기 제4 벡터 폴리뉴클레오타이드는 또한 5' 말단 및/또는 3' 말단에 엔도뉴클레아제(예를 들어, 제한 엔도뉴클레아제)에 대한 식별 사이트를 가질 수 있다. 예를 들어, 상기 제4 벡터 폴리뉴클레오타이드는 5' 내지 3' 방향으로 구조 R8-벡터 단편 IV-R5를 포함할 수 있으며, 여기서 상기 R8 및 R5는 제한 엔도뉴클레아제에 대한 식별 사이트일 수 있다. 예를 들어, 상기 제4 벡터 폴리뉴클레오타이드의 엔도뉴클레아제 식별 사이트를 식별하는 엔도뉴클레아제(예를 들어, R8 및 R5를 식별하는 제한 엔도뉴클레아제, 예를 들어, SfiI 또는 BsmBI)에 의한 효소 절단 처리 후, 효소 처리된 상기 제4 벡터 폴리뉴클레오타이드는 상기 벡터 단편 IV를 포함할 수 있다.
본 출원에서, "제5 폴리뉴클레오타이드"라는 용어는 일반적으로 기준 핵산 단편 I을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다. 본 출원에서, 상기 제5 폴리뉴클레오타이드는 또한 5' 말단 및/또는 3' 말단에 엔도뉴클레아제(예를 들어, 제한 엔도뉴클레아제)에 대한 식별 사이트를 가질 수 있다. 예를 들어, 상기 제5 폴리뉴클레오타이드는 5' 내지 3' 방향으로 구조 R9-기준 핵산 단편 I-R10을 포함할 수 있으며, 여기서 상기 R9 및 R10은 제한 엔도뉴클레아제에 대한 식별 사이트일 수 있다. 예를 들어, 상기 제5 폴리뉴클레오타이드의 엔도뉴클레아제 식별 사이트를 식별하는 엔도뉴클레아제(예를 들어, R9 및 R10을 식별하는 제한 엔도뉴클레아제, 예를 들어, SfiI 또는 BsmBI)에 의한 효소 절단 처리 후, 효소 처리된 상기 제5 폴리뉴클레오타이드는 상기 기준 핵산 단편 I을 포함할 수 있다.
본 출원에서, "제5 벡터 폴리뉴클레오타이드"라는 용어는 일반적으로 벡터 단편 V를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다. 본 출원에서, 상기 제5 벡터 폴리뉴클레오타이드는 또한 5' 말단 및/또는 3' 말단에 엔도뉴클레아제(예를 들어, 제한 엔도뉴클레아제)에 대한 식별 사이트를 가질 수 있다. 예를 들어, 상기 제5 벡터 폴리뉴클레오타이드는 5' 내지 3' 방향으로 구조 R10-벡터 단편 V-R11을 포함할 수 있으며, 여기서 상기 R10 및 R11은 제한 엔도뉴클레아제에 대한 식별 사이트일 수 있다. 예를 들어, 상기 제5 벡터 폴리뉴클레오타이드의 엔도뉴클레아제 식별 사이트를 식별하는 엔도뉴클레아제(예를 들어, R10 및 R11을 식별하는 제한 엔도뉴클레아제, 예를 들어, SfiI 또는 BsmBI)에 의한 효소 절단 처리 후, 효소 처리된 상기 제5 벡터 폴리뉴클레오타이드는 상기 벡터 단편 V를 포함할 수 있다.
본 출원에서, "제6 폴리뉴클레오타이드"라는 용어는 일반적으로 핵산 단편 II를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다. 본 출원에서, 상기 제6 폴리뉴클레오타이드는 또한 5' 말단 및/또는 3' 말단에 엔도뉴클레아제(예를 들어, 제한 엔도뉴클레아제)에 대한 식별 사이트를 가질 수 있다. 예를 들어, 상기 제6 폴리뉴클레오타이드는 5' 내지 3' 방향으로 구조 R11-핵산 단편 II-R12를 포함할 수 있으며, 여기서 상기 R11 및 R12는 제한 엔도뉴클레아제에 대한 식별 사이트일 수 있다. 예를 들어, 상기 제6 폴리뉴클레오타이드의 엔도뉴클레아제 식별 사이트를 식별하는 엔도뉴클레아제(예를 들어, R11 및 R12를 식별하는 제한 엔도뉴클레아제, 예를 들어, SfiI 또는 BsmBI)에 의한 효소 절단 처리 후, 효소 처리된 상기 제6 폴리뉴클레오타이드는 상기 핵산 단편 II를 포함할 수 있다.
본 출원에서, "제6 벡터 폴리뉴클레오타이드"라는 용어는 일반적으로 벡터 단편 VI을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다. 본 출원에서, 상기 제6 벡터 폴리뉴클레오타이드는 또한 5' 말단 및/또는 3' 말단에 엔도뉴클레아제(예를 들어, 제한 엔도뉴클레아제)에 대한 식별 사이트를 가질 수 있다. 예를 들어, 상기 제6 벡터 폴리뉴클레오타이드는 5' 내지 3' 방향으로 구조 R12-벡터 단편 VI-R9를 포함할 수 있으며, 여기서 상기 R12 및 R9는 제한 엔도뉴클레아제에 대한 식별 사이트일 수 있다. 예를 들어, 상기 제6 벡터 폴리뉴클레오타이드의 엔도뉴클레아제 식별 사이트를 식별하는 엔도뉴클레아제(예를 들어, R12 및 R9를 식별하는 제한 엔도뉴클레아제, 예를 들어, SfiI 또는 BsmBI)에 의한 효소 절단 처리 후, 효소 처리된 상기 제6 벡터 폴리뉴클레오타이드는 상기 벡터 단편 VI을 포함할 수 있다.
본 출원에서, "절단된 제1 폴리뉴클레오타이드"라는 용어는 일반적으로 제1 폴리뉴클레오타이드를 제한 엔도뉴클레아제로 처리하여 얻은 핵산 분자를 지칭한다. "절단된 제1 폴리뉴클레오타이드"는 핵산 단편 I과 양단에서 제한 엔도뉴클레아제 처리 후 얻은 특정 서열을 갖는 말단을 포함한다.
본 출원에서, "절단된 제1 벡터 폴리뉴클레오타이드"라는 용어는 일반적으로 제1 벡터 폴리뉴클레오타이드를 제한 엔도뉴클레아제로 처리하여 얻은 핵산 분자를 지칭한다. "절단된 제1 벡터 폴리뉴클레오타이드"는 벡터 단편 I과 양단에서 제한 엔도뉴클레아제 처리 후 얻은 특정 서열을 갖는 말단을 포함한다.
본 출원에서, "절단된 제2 폴리뉴클레오타이드"라는 용어는 일반적으로 제2 폴리뉴클레오타이드를 제한 엔도뉴클레아제로 처리하여 얻은 핵산 분자를 지칭한다. "절단된 제2 폴리뉴클레오타이드"는 기준 핵산 단편 II와 양단에서 제한 엔도뉴클레아제 처리 후 얻은 특정 서열을 갖는 말단을 포함한다.
본 출원에서, "절단된 제2 벡터 폴리뉴클레오타이드"라는 용어는 일반적으로 제2 벡터 폴리뉴클레오타이드를 제한 엔도뉴클레아제로 처리하여 얻은 핵산 분자를 지칭한다. "절단된 제2 벡터 폴리뉴클레오타이드"는 벡터 단편 II와 양단에서 제한 엔도뉴클레아제 처리 후 얻은 특정 서열을 갖는 말단을 포함한다.
본 출원에서, "절단된 제3 폴리뉴클레오타이드"라는 용어는 일반적으로 제3 폴리뉴클레오타이드를 제한 엔도뉴클레아제로 처리하여 얻은 핵산 분자를 지칭한다. "절단된 제3 폴리뉴클레오타이드"는 핵산 단편 I'와 양단에서 제한 엔도뉴클레아제 처리 후 얻은 특정 서열을 갖는 말단을 포함한다.
본 출원에서, "절단된 제3 벡터 폴리뉴클레오타이드"라는 용어는 일반적으로 제3 벡터 폴리뉴클레오타이드를 제한 엔도뉴클레아제로 처리하여 얻은 핵산 분자를 지칭한다. "절단된 제3 벡터 폴리뉴클레오타이드"는 벡터 단편 III과 양단에서 제한 엔도뉴클레아제 처리 후 얻은 특정 서열을 갖는 말단을 포함한다.
본 출원에서, "절단된 제4 폴리뉴클레오타이드"라는 용어는 일반적으로 제4 폴리뉴클레오타이드를 제한 엔도뉴클레아제로 처리하여 얻은 핵산 분자를 지칭한다. "절단된 제4 폴리뉴클레오타이드"는 기준 핵산 단편 II'와 양단에서 제한 엔도뉴클레아제 처리 후 얻은 특정 서열을 갖는 말단을 포함한다.
본 출원에서, "절단된 제4 벡터 폴리뉴클레오타이드"라는 용어는 일반적으로 제4 벡터 폴리뉴클레오타이드를 제한 엔도뉴클레아제로 처리하여 얻은 핵산 분자를 지칭한다. "절단된 제4 벡터 폴리뉴클레오타이드"는 벡터 단편 IV와 양단에서 제한 엔도뉴클레아제 처리 후 얻은 특정 서열을 갖는 말단을 포함한다.
본 출원에서, "절단된 제5 폴리뉴클레오타이드"라는 용어는 일반적으로 제5 폴리뉴클레오타이드를 제한 엔도뉴클레아제로 처리하여 얻은 핵산 분자를 지칭한다. "절단된 제5 폴리뉴클레오타이드"는 기준 핵산 단편 I과 양단에서 제한 엔도뉴클레아제 처리 후 얻은 특정 서열을 갖는 말단을 포함한다.
본 출원에서, "절단된 제5 벡터 폴리뉴클레오타이드"라는 용어는 일반적으로 제5 벡터 폴리뉴클레오타이드를 제한 엔도뉴클레아제로 처리하여 얻은 핵산 분자를 지칭한다. "절단된 제5 벡터 폴리뉴클레오타이드"는 벡터 단편 V와 양단에서 제한 엔도뉴클레아제 처리 후 얻은 특정 서열을 갖는 말단을 포함한다.
본 출원에서, "절단된 제6 폴리뉴클레오타이드"라는 용어는 일반적으로 제6 폴리뉴클레오타이드를 제한 엔도뉴클레아제로 처리하여 얻은 핵산 분자를 지칭한다. "절단된 제6 폴리뉴클레오타이드"는 핵산 단편 II와 양단에서 제한 엔도뉴클레아제 처리 후 얻은 특정 서열을 갖는 말단을 포함한다.
본 출원에서, "절단된 제6 벡터 폴리뉴클레오타이드"라는 용어는 일반적으로 제6 벡터 폴리뉴클레오타이드를 제한 엔도뉴클레아제로 처리하여 얻은 핵산 분자를 지칭한다. "절단된 제6 벡터 폴리뉴클레오타이드"는 벡터 단편 VI과 양단에서 제한 엔도뉴클레아제 처리 후 얻은 특정 서열을 갖는 말단을 포함한다.
본 출원에서, "제1 선별 대상 벡터"라는 용어는 일반적으로 핵산 단편 I, 기준 핵산 단편 II, 벡터 단편 I 및 벡터 단편 II를 포함하는 환상 핵산 분자를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 상기 "제1 선별 대상 벡터"는 절단된 제1 폴리뉴클레오타이드, 절단된 제2 폴리뉴클레오타이드, 절단된 제1 벡터 폴리뉴클레오타이드 및 절단된 제2 벡터 폴리뉴클레오타이드가 지향 연결되어 형성된다. 일부 경우에서, "제1 선별 대상 벡터"는 항원 결합 단백질을 발현 형성할 수 있다. 다른 일부 경우에서, "제1 선별 대상 벡터"는 항원 결합 단백질을 발현 형성할 수 없다. "제1 선별 대상 벡터"가 발현 형성하는 항원 결합 단백질은 기준 항원 결합 단백질이 특이적으로 결합할 수 있는 표적에 결합할 수 있고, 상기 표적에 대한 결합력은 상기 기준 항원 결합 단백질과 상기 표적의 결합력의 30% 이상(예를 들어, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99% 이상)인 하나 이상의 특성을 가질 때, 상기 "제1 선별 대상 벡터"는 "제1 치환 벡터"로 지칭될 수 있고, 상기 "제1 선별 대상 벡터" 중의 핵산 단편 I은 핵산 단편 I'로 지칭될 수 있다. "제1 선별 대상 벡터 라이브러리"는 하나 이상의 제1 선별 대상 벡터를 포함한다.
본 출원에서, "제1 치환 벡터"라는 용어는 일반적으로 핵산 단편 I', 기준 핵산 단편 II, 벡터 단편 I 및 벡터 단편 II를 포함하는 환상 핵산 분자를 지칭하며, "제1 치환 벡터"는 항원 결합 단백질을 발형 형성할 수 있고, 상기 항원 결합 단백질은 기준 항원 결합 단백질이 특이적으로 결합할 수 있는 표적에 결합할 수 있고, 상기 표적에 대한 결합력은 상기 기준 항원 결합 단백질과 상기 표적의 결합력의 30% 이상(예를 들어, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99% 이상)인 하나 이상의 특성을 가진다. "제1 치환 벡터 라이브러리"는 하나 이상의 "제1 치환 벡터"를 포함하며, 발현 형성한 항원 결합 단백질은 상기 기준 항원 결합 단백질이 특이적으로 결합할 수 있는 표적에 결합할 수 있고, 상기 표적에 대한 결합력은 상기 기준 항원 결합 단백질과 상기 표적의 결합력의 30% 이상(예를 들어, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99% 이상)인 하나 이상의 특성을 갖지 않는 제1 선별 대상 벡터를 포함하지 않는다.
본 출원에서, "제2 선별 대상 벡터"라는 용어는 일반적으로 핵산 단편 II, 기준 핵산 단편 I, 벡터 단편 V 및 벡터 단편 VI을 포함하는 환상 핵산 분자를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 상기 "제2 선별 대상 벡터"는 절단된 제5 폴리뉴클레오타이드, 절단된 제6 폴리뉴클레오타이드, 절단된 제5 벡터 폴리뉴클레오타이드 및 절단된 제6 벡터 폴리뉴클레오타이드가 지향 연결되어 형성된다. "제2 선별 대상 벡터"는 항원 결합 단백질을 발현 형성할 수 있다. "제2 선별 대상 벡터"가 발현 형성하는 항원 결합 단백질이 상기 기준 항원 결합 단백질이 특이적으로 결합할 수 있는 표적에 결합할 수 있고, 상기 표적에 대한 결합력은 상기 기준 항원 결합 단백질과 상기 표적의 결합력의 30% 이상(예를 들어, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99% 이상)인 특성을 가질 때, 상기 "제2 선별 대상 벡터"는 "제2 치환 벡터"로 지칭될 수 있고, 상기 "제2 선별 대상 벡터" 중의 핵산 단편 II는 핵산 단편 II'로 지칭될 수 있다. "제2 선별 대상 벡터 라이브러리"는 하나 이상의 제2 선별 대상 벡터를 포함한다.
본 출원에서, "제2 치환 벡터"라는 용어는 일반적으로 핵산 단편 II', 기준 핵산 단편 I, 벡터 단편 V 및 벡터 단편 VI을 포함하는 환상 핵산 분자를 지칭하며, "제2 치환 벡터"는 항원 결합 단백질을 발형 형성할 수 있고, 상기 항원 결합 단백질은 기준 항원 결합 단백질이 특이적으로 결합할 수 있는 표적에 결합할 수 있고, 상기 표적에 대한 결합력은 상기 기준 항원 결합 단백질과 상기 표적의 결합력의 30% 이상(예를 들어, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99% 이상)인 특성을 가진다. 본 출원에서, 상기 "제2 치환 벡터 라이브러리"는 하나 이상의 "제2 치환 벡터"를 포함하며, 발현 형성한 항원 결합 단백질은 상기 기준 항원 결합 단백질이 특이적으로 결합할 수 있는 표적에 결합할 수 있고, 상기 표적에 대한 결합력은 상기 기준 항원 결합 단백질과 상기 표적의 결합력의 30% 이상(예를 들어, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99% 이상)인 특성을 갖지 않는 제2 선별 대상 벡터를 포함하지 않는다.
본 출원에서, "이중 치환 선별 대상 벡터"라는 용어는 일반적으로 핵산 단편 I', 핵산 단편 II', 벡터 단편 I 및 벡터 단편 II를 포함하는 환상 핵산 분자를 지칭한다. 상기 "이중 치환 선별 대상 벡터"는 일반적으로 절단된 제1 폴리뉴클레오타이드, 상기 절단된 제2 폴리뉴클레오타이드, 상기 절단된 제1 벡터 폴리뉴클레오타이드 및 상기 절단된 제2 벡터 폴리뉴클레오타이드가 지향 연결되어 형성된다. 일부 경우에서, "이중 치환 선별 대상 벡터"는 항원 결합 단백질을 발현 형성할 수 있다. 다른 일부 경우에서, "이중 치환 선별 대상 벡터"는 항원 결합 단백질을 발현 형성할 수 없다. 만일 이중 치환 선별 대상 벡터의 발현 생성물은 기준 항원 결합 단백질이 특이적으로 결합할 수 있는 표적에 결합할 수 있고, 상기 표적에 대한 결합력은 상기 기준 항원 결합 단백질과 상기 표적의 결합력의 30% 이상(예를 들어, 35% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 99% 이상, 1배 이상, 1.5배 이상, 2배 이상, 2.5배 이상, 3배 이상 또는 그 이상)인 특성을 가지면, 싱기 이중 치환 선별 대상 벡터를 이중 치환 벡터라고 지칭할 수 있다. "이중 치환 선별 대상 벡터 라이브러리"는 하나 이상의 "이중 치환 선별 대상 벡터"를 포함한다.
본 출원에서, "절단"이라는 용어는 일반적으로 절단이 가능한 조건 하에서 제한 엔도뉴클레아제와 폴리뉴클레오타이드의 접촉을 지칭한다. 상기 절단은 일반적으로 뉴클레오타이드의 당 분자와 인접한 뉴클레오타이드 분자의 인산 사이의 결합을 절단하는 것을 말하며, 예를 들어, 상기 절단은 일반적으로 두 뉴클레오타이드 사이의 포스포디에스테르 결합을 절단하는 것을 말한다. 제한 엔도뉴클레아제를 사용하여 절단하면, 상기 폴리뉴클레오타이드는 특정 서열의 말단을 생성할 수 있다.
본 출원에서, "연결"이라는 용어는 일반적으로 2개 이상의 폴리뉴클레오타이드 분자를 함께 연결하는 것을 지칭한다. 이러한 연결은, 예를 들어 리가제(예를 들어, DNA 리가제)에 의해 이루어질 수 있다. 예를 들어, 한 폴리뉴클레오타이드의 3' 말단이 다른 폴리뉴클레오타이드의 5' 말단에 연결되어, 완전한 폴리뉴클레오타이드 분자를 형성한다. "지향 연결"은 일반적으로 2개 이상의 폴리뉴클레오타이드 분자를 일정한 순서로 연결하는 것을 지칭한다.
본 출원에서, "도입"이라는 용어는 일반적으로 외인성 폴리뉴클레오타이드를 세포로 전이하거나 도입하는 과정을 지칭한다. 상기 세포는 숙주 세포일 수 있다. 상기 도입된 세포는 대상의 일차 세포 및 그 자손을 포함한다. 상기 세포는 원핵 세포일 수 있으며, 예를 들어 박테리아 세포일 수 있다. 상기 세포는 진핵 세포일 수 있으며, 예를 들어 포유동물 세포 또는 효모 세포일 수 있다.
본 출원에서 "링커"라는 용어는 일반적으로 두 가지 이상의 폴리뉴클레오타이드 분자 또는 그 단편을 연결할 수 있는 시약을 지칭한다. 상기 링커는 폴리뉴클레오타이드 또는 그 단편일 수 있다. 본 출원에서, 상기 링커는 상이한 길이를 가질 수 있다. 예를 들어, 상기 링커는 40bp 이상, 50bp 이상, 60bp 이상, 70bp 이상, 80bp 이상, 90bp 이상, 100bp 이상, 150bp 이상, 200bp 이상 또는 그 이상의 길이를 가질 수 있다. 일부 경우에서, 상기 링커는 신호 펩타이드를 포함하며, "신호 펩타이드 pelB"라는 용어는 일반적으로 펙티나아제 리아제(pectinase lyase)의 신호 펩타이드를 지칭하며, 예를 들어 항원 결합 단백질이 Fab인 경우이다. 상기 신호 펩타이드 pelB는 일반적으로 원핵 발현 시스템에 사용된다. 예를 들어, 상기 신호 펩타이드 pelB의 GenBank에서의 수탁 번호는 ABS75961.1일 수 있다. 일부 경우에서, 상기 링커는 신호 펩타이드를 포함하지 않으며, 예를 들어 항원 결합 단백질이 scFv인 경우이다. 일부 경우에서, 상기 제1 폴리뉴클레오타이드는 VH를 인코딩하는 핵산 분자를 포함하고, 상기 제2 폴리뉴클레오타이드는 VL을 인코딩하는 핵산 분자를 포함할 수 있으며; 일부 경우, 상기 제1 폴리뉴클레오타이드는 VL을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하고, 상기 제2 폴리뉴클레오타이드는 VH를 인코딩하는 핵산 분자를 포함할 수 있다.
본 출원에서, "경쇄 또는 그 단편"이라는 용어는 일반적으로 동일하거나 유사한 항체의 중쇄에 결합할 수 있는 능력을 갖는 아미노산 단편을 지칭한다. 본 출원에서, 상기 경쇄 또는 그 단편은 경쇄 가변 영역(VL) 및 경쇄 불변 영역(CL) 영역을 포함할 수 있다. 상기 경쇄 불변 영역은 κ형 및 λ형으로 구분될 수 있다. 상기 경쇄는 κ 불변 영역(C-κ)에 연결된 λ 가변 영역(V-λ) 또는 λ 불변 영역(C-λ)에 연결된 κ 가변 영역(V-κ)을 갖는 경쇄를 더 포함할 수 있다.
본 출원에서, "중쇄 또는 그 단편"이라는 용어는 일반적으로 동일하거나 유사한 항체의 경쇄에 결합할 수 있는 능력을 갖는 아미노산 단편을 지칭한다. 본 출원에서, 상기 중쇄 또는 그 단편은 동일하거나 유사한 항체의 경쇄에 결합하는 능력을 가질 수 있다. 본 출원에서, 상기 중쇄 또는 중쇄 단편은 중쇄 가변 영역(VH) 및 중쇄 불변 영역(CH)을 포함할 수 있다. 상기 중쇄 불변 영역은 CH1 구조 도메인, 힌지 영역, CH2 구조 도메인 및 CH3 구조 도메인을 포함할 수 있다. IgE, IgM 및 IgY의 경우, 상기 중쇄 불변 영역은 CH4 구조 도메인을 포함하지만 힌지 영역을 갖지 않을 수 있다. 본 출원에서, 상기 "중쇄 불변 영역"은 CH1, 힌지 영역, CH2, CH3, CH4 구조 도메인 또는 그 임의의 조합일 수 있다.
본 출원에서, "제한 엔도뉴클레아제"라는 용어는 일반적으로 이중 가닥 DNA를 절단하는 효소를 지칭한다. 상기 제한 엔도뉴클레아제는 돌출된 단일 가닥 DNA를 갖는 접착성 말단을 생성하여, DNA 리가제에 접착될 수 있다. 본 출원의 맥락에서, 상기 제한 엔도뉴클레아제는 식별 및 제한 절단 역할을 가질 수 있다. 예를 들어, 상기 제한 엔도뉴클레아제의 절단 사이트는 식별 사이트로부터 일정한 거리가 존재한다. 예를 들어, 상기 제한 엔도뉴클레아제는 SfiI, BsmBI 및 Esp3I 중에서 선택될 수 있다.
본 출원에서, "폴리뉴클레오타이드"라는 용어는 일반적으로 뉴클레오타이드, 즉 한데 연결된 적어도 2개의 뉴클레오타이드를 지칭한다. 상기 폴리뉴클레오타이드는, 예를 들어, 200, 300, 500, 1,000, 2,000, 3,000, 5,000, 7,000, 10,000, 100,000 등 임의의 길이의 중합체일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오타이드는 포스포디에스테르 결합을 포함할 수 있다.
본 출원에서, "포함"이라는 용어는 일반적으로 명확하게 지정된 특징을 포함하나, 다른 요소를 배제하지 않는 것을 지칭한다.
본 출원에서, "약"이라는 용어는 일반적으로 지정된 수치 이상 또는 이하 0.5%-10%의 범위 내의 변동, 예를 들면 지정된 수치 이상 또는 이하 0.5%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 4.5%, 5%, 5.5%, 6%, 6.5%, 7%, 7.5%, 8%, 8.5%, 9%, 9.5% 또는 10%의 범위 내의 변동을 지칭한다.
발명에 대한 상세한 설명
본 출원은 사슬 치환 기술과 항체 디스플레이 기술(예를 들어, 파지 디스플레이 기술 및 포유동물 세포 디스플레이 기술)을 결합하여, 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법을 제공한다.
제1회 치환
본 출원에서, 상기 방법은 기준 항원 결합 단백질의 항체 중쇄 또는 그 단편(또는 항체 경쇄 또는 그 단편)과 복수의 항체 경쇄 또는 그 단편(또는 항체 중쇄 또는 그 단편)를 이용하여, 제1 선별 대상 벡터를 포함하는 선별 대상 라이브러리를 구성하는 단계를 포함한다 상기 제1 선별 대상 벡터는 파지 디스플레이 벡터 또는 세포 디스플레이 벡터, 또는 실제 상황에 따라 선택될 수 있는 임의의 다른 디스플레이 벡터일 수 있다. 구체적으로, 상기 방법은 a) 제1 폴리뉴클레오타이드가 제공되며, 상기 제1 폴리뉴클레오타이드는 5' 내지 3' 방향으로 R1-핵산 단편 I-R2를 포함하고, 상기 핵산 단편 I은 항원 결합 단편 I을 인코딩할 수 있는 단계; b) 제2 폴리뉴클레오타이드가 제공되며, 상기 제2 폴리뉴클레오타이드는 5' 내지 3' 방향으로 R3-기준 핵산 단편 II-R4를 포함하고, 상기 기준 핵산 단편 II는 기준 항원 결합 단편 II를 인코딩할 수 있으며, 상기 기준 항원 결합 단편 II는 기준 핵산 단편 I에 의해 인코딩된 기준 항원 결합 단편 I과 결합하여 기준 항원 결합 단백질을 형성할 수 있는 단계; c) 제1 벡터 폴리뉴클레오타이드가 제공되며, 상기 제1 벡터 폴리뉴클레오타이드는 5' 내지 3' 방향으로 R2-벡터 단편 I-R3을 포함하는 단계; d) 제2 벡터 폴리뉴클레오타이드가 제공되며, 상기 제2 벡터 폴리뉴클레오타이드는 5' 내지 3' 방향으로 R4-벡터 단편 II-R1을 포함하는 단계; e) 상기 제1 폴리뉴클레오타이드, 상기 제2 폴리뉴클레오타이드, 상기 제1 벡터 폴리뉴클레오타이드 및 상기 제2 벡터 폴리뉴클레오타이드를 제한 엔도뉴클레아제로 절단하여, 절단된 제1 폴리뉴클레오타이드, 절단된 제2 폴리뉴클레오타이드, 절단된 제1 벡터 폴리뉴클레오타이드 및 절단된 제2 벡터 폴리뉴클레오타이드를 얻는 단계; f) 상기 절단된 제1 폴리뉴클레오타이드, 상기 절단된 제2 폴리뉴클레오타이드, 상기 절단된 제1 벡터 폴리뉴클레오타이드 및 상기 절단된 제2 벡터 폴리뉴클레오타이드를 혼합하여, 이들이 지향 연결되고 고리화되어 제1 선별 대상 벡터를 형성하게 할 수 있는 단계를 포함한다. 상기 제1 선별 대상 벡터의 구조는 도 1을 참조할 수 있다. 상기 방법은 상기 선별 대상 벡터를 발현하고, 기준 항원 결합 단백질(또는 다른 양성 대조 항체)과 비교하여, 상기 기준 항원 결합 단백질이 결합할 수 있는 표적에 결합할 수 있고, 상기 표적에 대한 결합력은 상기 기준 항원 결합 단백질과 상기 표적의 결합력의 30% 이상인 특성을 갖는 항원 결합 단백질을 기능성 항원 결합 단백질로 선택하는 단계를 더 포함한다.
본 출원에서, 상기 핵산 단편 I은 항체 경쇄 또는 그 단편을 인코딩할 수 있고, 상기 기준 핵산 단편 II는 기준 항원 결합 단백질의 중쇄 또는 그 단편을 인코딩할 수 있으며, 상기 벡터 단편 I은 링커 펩타이드를 포함할 수 있고, 상기 벡터 단편 II는 파지 디스플레이 벡터(예를 들어, pComb3x 벡터)로부터 유래할 수 있다. 일부 경우에서, 상기 핵산 단편 I은 항체 경쇄를 인코딩하고, 상기 링커 펩타이드는 신호 펩타이드 pelB 또는 그 단편을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 경우에서, 상기 핵산 단편 I은 항체 경쇄 가변 영역을 포함한다. 상기 R1은 서열번호 1에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 R2는 서열번호 2에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 R3은 서열번호 3에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 R4는 서열번호 4에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
본 출원에서, 상기 핵산 단편 I은 항체 경쇄 또는 그 단편을 인코딩할 수 있고, 상기 기준 핵산 단편 II는 기준 항원 결합 단백질의 중쇄 또는 그 단편을 인코딩할 수 있으며, 상기 벡터 단편 I 및/또는 상기 벡터 단편 II는 포유동물 세포 발현 벡터(예를 들어, pDGB4 벡터)로부터 유래할 수 있다. 상기 R1은 서열번호 7에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 R2는 서열번호 8에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 R3은 서열번호 5에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 R4는 서열번호 6에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
본 출원에서, 상기 핵산 단편 I은 항체 중쇄 또는 그 단편을 인코딩할 수 있고, 상기 기준 핵산 단편 II는 기준 항원 결합 단백질의 경쇄 또는 그 단편을 인코딩할 수 있으며, 상기 벡터 단편 II는 링커 펩타이드를 포함할 수 있고, 상기 벡터 단편 I은 파지 디스플레이 벡터(예를 들어, pComb3x 벡터)로부터 유래할 수 있다. 일부 경우에서, 상기 기준 핵산 단편 II는 항체 경쇄를 인코딩하고, 상기 링커 펩타이드는 신호 펩타이드 pelB 또는 그 단편을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 경우에서, 상기 기준 핵산 단편 II는 항체 경쇄 가변 영역을 포함한다. 상기 R1은 서열번호 3에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 R2는 서열번호 4에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 R3은 서열번호 1에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 R4는 서열번호 2에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
본 출원에서, 상기 핵산 단편 I은 항체 중쇄 또는 그 단편을 인코딩할 수 있고, 상기 기준 핵산 단편 II는 기준 항원 결합 단백질의 경쇄 또는 그 단편을 인코딩할 수 있으며, 상기 벡터 단편 I 및/또는 상기 벡터 단편 II는 포유동물 세포 발현 벡터(예를 들어, pDGB4 벡터)로부터 유래할 수 있다. 상기 R1은 서열번호 5에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 R2는 서열번호 6에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 R3은 서열번호 7에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 R4는 서열번호 8에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
기능성 항원 결합 단백질을 발현할 수 있는 제1 선별 대상 벡터를 제1 치환 벡터라고 하고, 대응되게, 기능성 항원 결합 단백질을 발현할 수 있는 제1 선별 대상 벡터의 핵산 단편 I을 제1 치환 벡터의 핵산 단편 I'라고 한다.
제2회 치환
본 출원의 방법은 핵산 단편 I'를 획득한 후, 핵산 단편 II'와 이중 치환 선별 대상 벡터를 구성하는 단계를 더 포함할 수 있다. 항원 결합 단백질 II'를 인코딩할 수 있고, 상기 항원 결합 단편 II'는 상기 기준 항원 결합 단편 I과 결합되어, 기준 항원 결합 단백질이 결합할 수 있는 표적에 대한 결합력은 상기 기준 항원 결합 단백질과 상기 표적의 결합력의 30% 이상인 특성을 갖는 항원 결합 단백질을 형성할 수 있는 조건만 만족하면, 상기 핵산 단편 II'는 당업자의 임의의 방법에 의해, 예를 들어, 기준 항원 결합 단백질의 기준 항원 결합 단편을 사용하여 치환하여 얻을 수 있다.
일부 경우에서, 제2 선별 대상 벡터를 구성함으로써 상기 핵산 단편 II'를 얻는다. 구체적으로, 상기 방법은 a) 제5 폴리뉴클레오타이드가 제공되며, 상기 제5 폴리뉴클레오타이드는 5' 내지 3' 방향으로 R9-기준 핵산 단편 I-R10을 포함하는 단계; b) 제6 폴리뉴클레오타이드가 제공되며, 상기 제6 폴리뉴클레오타이드는 5' 내지 3' 방향으로 R11-핵산 단편 II-R12를 포함하는 단계; c) 제5 벡터 폴리뉴클레오타이드가 제공되며, 상기 제5 벡터 폴리뉴클레오타이드는 5' 내지 3' 방향으로 R10-벡터 단편 V-R11을 포함하는 단계; d) 제6 벡터 폴리뉴클레오타이드가 제공되며, 상기 제6 벡터 폴리뉴클레오타이드는 5' 내지 3' 방향으로 R12-벡터 단편 VI-R9를 포함하는 단계; e) 상기 제5 폴리뉴클레오타이드, 상기 제6 폴리뉴클레오타이드, 상기 제5 벡터 폴리뉴클레오타이드 및 상기 제6 벡터 폴리뉴클레오타이드를 제한 엔도뉴클레아제로 절단하여, 절단된 제5 폴리뉴클레오타이드, 절단된 제6 폴리뉴클레오타이드, 절단된 제5 벡터 폴리뉴클레오타이드 및 절단된 제6 벡터 폴리뉴클레오타이드를 얻는 단계; f) 상기 절단된 제5 폴리뉴클레오타이드, 상기 절단된 제6 폴리뉴클레오타이드, 상기 절단된 제5 벡터 폴리뉴클레오타이드 및 상기 절단된 제6 벡터 폴리뉴클레오타이드를 혼합하여, 이들이 지향 연결되고 고리화되어 제2 선별 대상 벡터를 형성하게 할 수 있는 단계를 포함한다. 상기 제2 선별 대상 벡터의 구조는 도 3을 참조할 수 있다. 상기 방법은 상기 선별 대상 벡터를 발현하고, 기준 항원 결합 단백질(또는 다른 양성 대조 항체)과 비교하여, 상기 기준 항원 결합 단백질이 결합할 수 있는 표적에 결합할 수 있고, 상기 표적에 대한 결합력은 상기 기준 항원 결합 단백질과 상기 표적의 결합력의 30% 이상인 특성을 갖는 항원 결합 단백질을 기능성 항원 결합 단백질로 선택하는 단계를 더 포함한다.
상기 핵산 단편 II에 의해 인코딩되는 것이 항체 경쇄 또는 그 단편인지 아니면 항체 중쇄 또는 그 단편인지 여부는 핵산 단편 I의 유형에 따라 결정된다. 핵산 단편 II에 의해 인코딩된 폴리펩타이드와 핵산 단편 I에 의해 인코딩된 폴리펩타이드 양자 중의 하나가 항체 경쇄 또는 그 단편이고, 다른 하나가 항체 중쇄 또는 그 단편이기만 하면 된다.
본 출원에서, 상기 기준 핵산 단편 I은 기준 항원 결합 단백질의 항체 경쇄 또는 그 단편을 인코딩할 수 있고, 상기 핵산 단편 II는 항체 중쇄 또는 그 단편을 인코딩할 수 있으며, 상기 벡터 단편 V는 링커 펩타이드를 포함할 수 있고, 상기 벡터 단편 VI은 파지 디스플레이 벡터(예를 들어, pComb3x 벡터)로부터 유래할 수 있다. 일부 경우에서, 상기 기준 핵산 단편 I은 항체 경쇄를 인코딩하고, 상기 링커 펩타이드는 신호 펩타이드 pelB 또는 그 단편을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 경우에서, 상기 기준 핵산 단편 I은 항체 경쇄 가변 영역을 포함한다. 상기 R9는 서열번호 1에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 R10은 서열번호 2에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 R11은 서열번호 3에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 R12는 서열번호 4에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
본 출원에서, 상기 기준 핵산 단편 I은 기준 항원 결합 단백질의 항체 경쇄 또는 그 단편을 인코딩할 수 있고, 상기 핵산 단편 II는 중쇄 또는 그 단편을 인코딩할 수 있으며, 상기 벡터 단편 V 및/또는 상기 벡터 단편 VI은 포유동물 세포 발현 벡터(예를 들어, pDGB4 벡터)로부터 유래할 수 있다. 상기 R9는 서열번호 7에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 R10은 서열번호 8에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 R11은 서열번호 5에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 R12는 서열번호 6에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
본 출원에서, 상기 기준 핵산 단편 I은 기준 항원 결합 단백질의 항체 중쇄 또는 그 단편을 인코딩할 수 있고, 상기 핵산 단편 II는 항원 결합 단백질의 경쇄 또는 그 단편을 인코딩할 수 있으며, 상기 벡터 단편 VI은 링커 펩타이드를 포함할 수 있고, 상기 벡터 단편 V는 파지 디스플레이 벡터(예를 들어, pComb3x 벡터)로부터 유래할 수 있다. 일부 경우에서, 상기 핵산 단편 II는 항체 경쇄를 인코딩하고, 상기 링커 펩타이드는 신호 펩타이드 pelB 또는 그 단편을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 경우에서, 상기 핵산 단편 II는 항체 경쇄 가변 영역을 포함한다. 상기 R9는 서열번호 3에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 R10은 서열번호 4에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 R11은 서열번호 1에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 R12는 서열번호 2에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
본 출원에서, 상기 기준 핵산 단편 I은 항체 중쇄 또는 그 단편을 인코딩할 수 있고, 상기 핵산 단편 II는 기준 항원 결합 단백질의 경쇄 또는 그 단편을 인코딩할 수 있으며, 상기 벡터 단편 V 및/또는 상기 벡터 단편 VI은 포유동물 세포 발현 벡터(예를 들어, pDGB4 벡터)로부터 유래할 수 있다. 상기 R9는 서열번호 5에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 R10은 서열번호 6에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 R11은 서열번호 7에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 R12는 서열번호 8에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
이중 치환
본 출원의 상기 방법은 나아가 a) 핵산 단편 I' 및 핵산 단편 II'를 얻으며, 해당 핵산 단편 I'에 의해 인코딩된 폴리펩타이드와 해당 핵산 단편 II'에 의해 인코딩된 폴리펩타이드 양자 중의 하나가 항체 경쇄 또는 그 단편이고, 다른 하나가 항체 중쇄 또는 그 단편인 단계; b) 제3 폴리뉴클레오타이드가 제공되며, 상기 제3 폴리뉴클레오타이드는 5' 내지 3' 방향으로 R5-핵산 단편 I'-R6을 포함하는 단계; c) 제4 폴리뉴클레오타이드가 제공되며, 상기 제4 폴리뉴클레오타이드는 5' 내지 3' 방향으로 R7-핵산 단편 II'-R8을 포함하고, 상기 핵산 단편 II'는 항원 결합 단백질 II'를 인코딩할 수 있으며, 상기 항원 결합 단편 II'는 상기 기준 항원 결합 단편 I과 결합되어, 기준 항원 결합 단백질이 결합할 수 있는 표적에 대한 결합력은 상기 기준 항원 결합 단백질과 상기 표적의 결합력의 30% 이상인 특성을 갖는 항원 결합 단백질을 형성할 수 있는 단계; d) 제3 벡터 폴리뉴클레오타이드가 제공되며, 상기 제3 벡터 폴리뉴클레오타이드는 5' 내지 3' 방향으로 R6-벡터 단편 III-R7을 포함하는 단계; e) 제4 벡터 폴리뉴클레오타이드가 제공되며, 상기 제4 벡터 폴리뉴클레오타이드는 5' 내지 3' 방향으로 R8-벡터 단편 IV-R5를 포함하는 단계; f) 상기 제3 폴리뉴클레오타이드, 상기 제4 폴리뉴클레오타이드, 상기 제3 벡터 폴리뉴클레오타이드 및 상기 제4 벡터 폴리뉴클레오타이드를 제한 엔도뉴클레아제로 절단하여, 절단된 제3 폴리뉴클레오타이드, 절단된 제4 폴리뉴클레오타이드, 절단된 제3 벡터 폴리뉴클레오타이드 및 절단된 제4 벡터 폴리뉴클레오타이드를 얻는 단계; g) 상기 절단된 제3 폴리뉴클레오타이드, 상기 절단된 제4 폴리뉴클레오타이드, 상기 절단된 제3 벡터 폴리뉴클레오타이드 및 상기 절단된 제4 벡터 폴리뉴클레오타이드를 혼합하여, 이들이 지향 연결되고 고리화되어 이중 치환 선별 대상 벡터를 형성하게 할 수 있는 단계를 포함한다. 상기 이중 치환 선별 대상 벡터의 구조는 도 2를 참조할 수 있다. 상기 방법은 상기 선별 대상 벡터를 발현하고, 기준 항원 결합 단백질(또는 다른 양성 대조 항체)과 비교하여, 상기 기준 항원 결합 단백질이 결합할 수 있는 표적에 결합할 수 있고, 상기 표적에 대한 결합력은 상기 기준 항원 결합 단백질과 상기 표적의 결합력의 30% 이상인 특성을 갖는 항원 결합 단백질을 기능성 항원 결합 단백질로 선택하는 단계를 더 포함한다.
본 출원에서, 상기 핵산 단편 I'는 기준 항원 결합 단백질의 항체 경쇄 또는 그 단편을 인코딩할 수 있고, 상기 핵산 단편 II'는 항체 중쇄 또는 그 단편을 인코딩할 수 있으며, 상기 벡터 단편 III은 링커 펩타이드를 포함할 수 있고, 상기 벡터 단편 IV는 파지 디스플레이 벡터(예를 들어, pComb3x 벡터)로부터 유래할 수 있다. 일부 경우에서, 상기 핵산 단편 I'는 항체 경쇄를 인코딩하고, 상기 링커 펩타이드는 신호 펩타이드 pelB 또는 그 단편을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 경우에서, 상기 핵산 단편 I'는 항체 경쇄 가변 영역을 포함한다. 상기 R5는 서열번호 1에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 R6은 서열번호 2에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 R7은 서열번호 3에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 R8은 서열번호 4에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
본 출원에서, 상기 핵산 단편 I'는 기준 항원 결합 단백질의 항체 경쇄 또는 그 단편을 인코딩할 수 있고, 상기 핵산 단편 II'는 중쇄 또는 그 단편을 인코딩할 수 있으며, 상기 벡터 단편 III 및/또는 상기 벡터 단편 IV는 포유동물 세포 발현 벡터(예를 들어, pDGB4 벡터)로부터 유래할 수 있다. 상기 R5는 서열번호 7에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 R6은 서열번호 8에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 R7은 서열번호 5에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 R8은 서열번호 6에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
본 출원에서, 상기 핵산 단편 I'는 기준 항원 결합 단백질의 항체 중쇄 또는 그 단편을 인코딩할 수 있고, 상기 핵산 단편 II'는 항원 결합 단백질의 경쇄 또는 그 단편을 인코딩할 수 있으며, 상기 벡터 단편 IV는 링커 펩타이드를 포함할 수 있고, 상기 벡터 단편 III은 파지 디스플레이 벡터(예를 들어, pComb3x 벡터)로부터 유래할 수 있다. 일부 경우에서, 상기 핵산 단편 II'는 항체 경쇄를 인코딩하고, 상기 링커 펩타이드는 신호 펩타이드 pelB 또는 그 단편을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 경우에서, 상기 핵산 단편 II'는 항체 경쇄 가변 영역을 포함한다. 상기 R5는 서열번호 3에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 R6은 서열번호 4에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 R7은 서열번호 1에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 R8은 서열번호 2에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
본 출원에서, 상기 핵산 단편 I'는 항체 중쇄 또는 그 단편을 인코딩할 수 있고, 상기 핵산 단편 II'는 기준 항원 결합 단백질의 경쇄 또는 그 단편을 인코딩할 수 있으며, 상기 벡터 단편 III 및/또는 상기 벡터 단편 IV는 포유동물 세포 발현 벡터(예를 들어, pDGB4 벡터)로부터 유래할 수 있다. 상기 R5는 서열번호 5에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 R6은 서열번호 6에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 R7은 서열번호 7에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 R8은 서열번호 8에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
본 출원의 상기 방법은 다수의 표적, 복수의 표적, 하나의 표적의 복수의 결합 사이트에 대한 기능성 항원 결합 단백질을 동시에 선택하는 것에 적용될 수 있다. 본 출원의 방법을 적용할 때, 제1 선별 대상 벡터 및/또는 제2 선별 대상 벡터를 구성할 때, 동일한 항원을 표적으로 하지만 상이한 에피토프에 결합하는 복수의 기준 항원 결합 단백질을 동시에 사용하여, 동일한 항원을 표적으로 하지만 상이한 에피토프에 결합하는 복수의 기능성 항원 결합 단백질을 인코딩하는 단편(핵산 단편 I' 또는 핵산 단편 II')을 얻기 위한 복수의 기준 항원 결합 단편의 선별 대상 벡터를 얻을 수 있다. 본 출원의 방법을 적용할 때, 상이한 항원을 표적으로 하는 복수의 기준 항원 결합 단백질을 동시에 사용하여, 상이한 항원을 표적으로 하는 복수의 기능성 항원 결합 단백질을 인코딩하는 단편(핵산 단편 I' 또는 핵산 단편 II')을 얻기 위한 복수의 기준 항원 결합 단편의 선별 대상 벡터를 얻을 수도 있다.
예를 들어, 상기 제1 선별 대상 벡터 라이브러리는 복수의 기준 핵산 단편 II를 포함하는 제1 선별 대상 벡터를 포함할 수 있고, 상기 기준 핵산 단편 I은 동일한 항원에 결합하는 2 가지, 3 가지, 4 가지 또는 그 이상의 기준 항원 결합 단백질의 단편을 인코딩한다. 예를 들어, 상기 제2 선별 대상 벡터 라이브러리는 복수의 기준 핵산 단편 I을 포함하는 제2 선별 대상 벡터를 포함할 수 있고, 상기 기준 핵산 단편 I은 동일한 항원에 결합하는 2 가지, 3 가지, 4 가지 또는 그 이상의 기준 항원 결합 단백질의 단편을 인코딩한다.
예를 들어, 상기 제1 선별 대상 벡터 라이브러리는 복수의 기준 핵산 단편 II를 포함하는 제1 선별 대상 벡터를 포함할 수 있고, 상기 기준 핵산 단편 II는 여러 가지(예를 들어, 2 가지, 3 가지, 4 가지, 5 가지, 6 가지, 7 가지, 8 가지, 9 가지, 10 가지 또는 그 이상) 항원에 결합하는 상이한 기준 항원 결합 단백질의 단편을 인코딩한다. 예를 들어, 상기 제2 선별 대상 벡터 라이브러리는 복수의 기준 핵산 단편 I을 포함하는 제2 선별 대상 벡터를 포함할 수 있고, 상기 기준 핵산 단편 I은 여러 가지(예를 들어, 2 가지, 3 가지, 4 가지, 5 가지, 6 가지, 7 가지, 8 가지, 9 가지, 10 가지 또는 그 이상) 항원에 결합하는 상이한 기준 항원 결합 단백질의 단편을 인코딩한다.
따라서, 하나 이상의 이중 치환 선별 대상 벡터의 이중 치환 선별 대상 벡터 라이브러리는 복수의(예를 들어, 2 가지, 3 가지, 4 가지, 5 가지, 6 가지, 7 가지, 8 가지, 9 가지, 10 가지 또는 그 이상) 항원에 대한 더 많은(예를 들어, 2 가지, 3 가지, 4 가지, 5 가지, 6 가지, 7 가지, 8 가지, 9 가지, 10 가지, 11 가지, 12 가지, 13 가지, 14 가지, 15 가지, 16 가지, 17 가지 또는 그 이상의) 항원 결합 단백질을 포함할 수 있다.
본 출원에서, 파지 발현을 위한 선별 대상 벡터를 구성하는 부분에 대해 PCT 국제출원 PCT/CN2020/085706을 참조할 수 있다.
본 출원에서, 상기 링커는 신호 펩타이드 pelB의 단편을 인코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있고, 신호 펩타이드 pelB의 단편을 인코딩하는 나머지 핵산 서열은 또한 상기 폴리뉴클레오타이드의 식별 사이트에 위치할 수 있다. 예를 들어, 신호 펩타이드 pelB의 단편을 인코딩하는 상기 핵산 서열의 3' 말단의 뉴클레오타이드는 상기 효소 절단 사이트에 위치할 수 있다. 예를 들어, 2개의 절단된 폴리뉴클레오타이드가 결합될 때, 하나의 폴리뉴클레오타이드에 포함된 신호 펩타이드 pelB의 단편을 인코딩하는 핵산 서열은 다른 폴리뉴클레오타이드에 포함된 신호 펩타이드 pelB의 단편을 인코딩하는 핵산 서열에 연결되어, 완전한 신호 펩타이드 pelB를 인코딩하는 핵산 서열을 형성할 수 있다.
본 출원에서, 상기 링커의 길이는 약 50 내지 약 200개 염기일 수 있다. 예를 들어, 상기 링커의 길이는 약 50 내지 약 200개 염기, 약 50 내지 약 180개 염기, 약 50 내지 약 160개 염기, 약 50 내지 약 140개 염기, 약 50 내지 약 120개 염기, 약 50 내지 약 100개 염기, 약 50 내지 약 90개 염기, 약 50 내지 약 80개 염기, 약 50 내지 약 75개 염기, 약 50 내지 약 70개 염기, 약 50 내지 약 60개 염기일 수 있다.
본 출원에서, 상기 R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11 및 R12 중 임의의 제한 엔도뉴클레아제에 의한 절단에 의해 생성되는 말단은 비회문 서열일 수 있다.
엔도뉴클레아제 식별 사이트(예를 들어, R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11, 및 R12)를 선택할 때, 핵산 단편(예를 들어, 핵산 단편 I, 핵산 단편 II, 핵산 단편 I', 핵산 단편 II', 기준 핵산 단편 I, 기준 핵산 단편 II')에 기본상 포함되지 않는 서열을 선택하여, 그것이 인코딩하는 항원 결합 단편의 기능 영역(예를 들어, 경쇄 가변 영역 또는 중쇄 가변 영역)의 무결성을 유지하여, 효소 절단 시 항체 유전자 라이브러리를 파괴(예를 들어, 분해)하는 것을 방지할 수 있다. 또한, 상기 제한 엔도뉴클레아제에 의한 상기 뉴클레아제 식별 사이트의 절단에 의해 형성된 말단은 자체 연결을 방지하기 위해 비회문 서열일 수 있으며, 나아가 비목적지 연결을 감소시킬 수 있다. 또한, 상기 엔도뉴클레아제 식별 사이트의 선택은 연결 효율을 향상시키기 위해 다수의 단편의 지향 연결이 가능하게 할 수 있다.
본 출원에서, 상기 R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11, 및 R12 중 2개 이상(예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개 또는 12개)은 동일한 제한 엔도뉴클레아제에 의해 식별되고 절단될 수 있다.
본 출원에서, 상기 제한 엔도뉴클레아제는 SfiI, BsmBI 및 Esp3I 중에서 선택될 수 있다. 본 출원에서, 상기 BsmBI 및 Esp3I은 동일한 제한 엔도뉴클레아제 식별 사이트를 식별할 수 있는 동질 효소일 수 있다.
예를 들어, SfiI일 13개의 염기로 구성된 서열(5' 내지 3') GGCCNNNN/NGGCC (서열번호 9)를 식별할 수 있으며, 이는 효소 절단 후 3' 말단의 돌출 서열(overhang, 예를 들어, 3개의 염기를 포함하는 단일 가닥 서열)을 형성할 수 있고, 여기서 N은 GATC 4 가지 염기 중 하나를 나타낼 수 있다. 따라서, 64개의 서로 다른 서열이 SfiI에 의해 식별될 수 있다.
예를 들어, BsmBI 및 Esp3I은 12개의 염기로 구성된 서열 (5' 내지 3') CGTCTCN/NNNNN (서열번호 10)를 식별할 수 있으며, 이는 효소 절단 후 5' 말단의 돌출 서열(overhang, 예를 들어, 4개의 염기를 포함하는 단일 가닥 서열)을 형성할 수 있고, 여기서 N은 GATC 4 가지 염기 중 하나를 나타낼 수 있다. 따라서, 264개의 서로 다른 서열이 BsmBI 및 Esp3I에 의해 식별될 수 있다.
본 출원에서, 본 출원의 벡터를 구성하기 위해, 상기 파지 디스플레이 벡터 또는 포유동물 세포 디스플레이 벡터(예를 들어, pDGB4 및/또는 pComb3x 벡터)에 대하여 엔지니어링/수정(engineering/modifying)을 진행할 수 있다. 예를 들어, 위치 유도 돌연변이에 의해 상기 벡터 내의 하나 이상의 엔도뉴클레아제 식별 사이트를 제거할 수 있다. 일부 경우에서, 위치 유도 돌연변이에 의해 상기 벡터 내의 하나 이상의 엔도뉴클레아제 식별 사이트를 추가할 수도 있다.
예를 들어, 상기 pComb3x 벡터는 본 출원의 목적에 적용되기에 적합하도록 수정될 수 있다. 예를 들어, 상기 pComb3x 벡터는 5' 말단에 위치한 SfiI 식별 사이트 및 3' 말단에 위치한 SfiI 식별 사이트를 포함할 수 있으며, 상기 수정 과정에, 위치 유도 돌연변이에 의해 상기 pComb3x 벡터의 3' 말단에 있는 SfiI 식별 사이트를 제거할 수 있다. 일부 경우에서, 상기 위치 유도 돌연변이는 상기 벡터 중 단백질(예컨대, 항체 중쇄 단편 및/또는 항체 경쇄 단편)의 프레임 내 발현에 영향을 미치지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 돌연변이는 넌센스 돌연변이, 예를 들어, 염기 서열만 변경하고 아미노산 서열은 변경하지 않는 돌연변이일 수 있다.
일부 경우에서, 상기 제1 선별 대상 벡터, 상기 제2 선별 대상 벡터 및/또는 상기 선별 대상 이중 치환 벡터가 포유동물 세포를 사용하여 발현될 때, 상기 벡터 단편(예를 들어, 벡터 단편 I, 벡터 단편 II, 벡터 단편 III, 벡터 단편 IV, 벡터 단편 V 및 벡터 단편 VI)은 표적 유전자를 발현시킬 수 있는 임의의 벡터로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 상기 벡터 단편은 디스플레이 벡터 pDGB4로부터 유래되는 단편일 수 있다(pDGB4에 대해서는 Ivan Zhou, et al., "Four-way ligation for construction of a mammalian cell-based fμLl-length antibody display library", Acta Biochim Biophys Sin 2011, 43: 232-238를 참조).
본 출원의 벡터 단편(예를 들어, 벡터 단편 I, 벡터 단편 II, 벡터 단편 III, 벡터 단편 IV, 벡터 단편 V 및 벡터 단편 VI)은 프로모터, 인핸서, 신호 펩타이드, 선별 마커(예를 들어, 효소 식별 사이트, 저항 유전자, 리포터 유전자, 선별 유전자)를 포함하되, 이에 한정되지 않는 특정 기능을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 당업자에 의해 원하는 기능에 적합하도록 벡터 단편에서 조정(상기 특정 기능을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 삽입/치환 및/삭제 등)될 수 있다. 일부 경우에서, 상기 벡터 단편은 상이한 뉴클레오타이드 서열을 얻기 위해 상이한 상황에서 조정될 수 있다.
본 출원에서, 상기 벡터는 하나 이상의 적합한 마커(예를 들어, 정제/식별/선별용 마커)를 포함하거나 인코딩할 수 있으며, 상기 마커는, 예를 들어, His tag, Flag Tag, 형광 단백질, 선택적 항생제 및/또는 아비딘 등일 수 있다.
발현하고자 하는 항원 결합 단편의 길이 또는 성질, 효소 절단 사이트의 길이 또는 성질에 따라 원하는 길이 또는 종류의 벡터 단편(예를 들어, 벡터 단편 I, 벡터 단편 II, 벡터 단편 III, 벡터 단편 IV, 벡터 단편 V 및/또는 벡터 단편 VI)을 각각 선택할 수 있다.
본 출원에서, 상기 핵산 단편 I 및 상기 핵산 단편 II는 샘플 재료로부터 얻을 수 있다. 본 출원에서, 상기 샘플 재료는 말초 혈액 림프구 샘플로부터 유래된 재료를 포함할 수 있다. 본 출원에서, 상기 말초 혈액 림프구는 인간 말초 혈액 림프구일 수 있다. 본 출원에서, 상기 샘플 재료는 또한 다른 임의의 조직 및/또는 세포로부터 유래될 수 있으며, 상기 말초 혈액 림프구 샘플에 한정되지 않는다.
예를 들어, 상기 핵산 단편 I 및 상기 핵산 단편 II는 종래 기술에서 이미 구성된 항체 경쇄 또는 그 단편 라이브러리 또는 이미 구성된 항체 중쇄 또는 그 단편 라이브러리를 이용하여 얻을 수 있다. 상기 방법은 하나 이상의 항체 중쇄 또는 그 단편, 또는 하나 이상의 항체 경쇄 또는 그 양단에 본 출원의 상기 효소 절단 사이트를 추가하는 단계를 포함한다.
본 출원에서, 상기 제1 선별 대상 벡터, 제2 선별 대상 벡터 및/또는 상기 이중 치환 선별 대상 벡터의 발현 생성물의 상기 표적에 대한 결합력을 테스트하기 위해 다양한 방법이 사용될 수 있다. 선별 대상 벡터의 발현 생성물과 기준 항원 결합 단백질 또는 다른 양성 대조군의 결합력의 비교는 정량적 또는 비정량적 방법에 의해 수행될 수 있다.
일 양태로, 표적에 결합하는 본 출원의 항원 결합 단백질의 활성은, 예를 들어, 효소 면역 분석법(ELISA), 면역 블롯(예를 들어, 단백질 면역 블롯), 유동 세포 분석법(예를 들어, FACS), 면역 조직 화학, 면역 형광 등과 같은 공지 방법에 의해 테스트될 수 있다. 일부 경우에서, 결합 친화도는 표면 플라즈마 공진법(SPR), 효소 면역 분석법(ELISA), 결합 항원 침전법, 평형 투석법, 생체막 간섭법(BLI)에 의해 측정될 수 있다. 일부 경우에서, PD-1에 대한 PD-1 항원 결합 단백질의 결합 친화도 및 KD 값은 생체막 간섭법(BLI)에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, ELISA를 사용하여 측정할 수 있다. 예를 들어, 상기 항원 결합 단백질 및/또는 상기 기준 항원 결합 단백질이 상기 표적과 결합할 수 있게 허용하는 조건 하에서, 상기 제1 선별 대상 벡터, 상기 제2 선별 대상 벡터 및/또는 상기 선별 대상 이중 벡터의 발현 생성물 및/또는 상기 기준 항원 결합 단백질과 상기 표적(예를 들어, 항원)이 결합되게 하고, 상기 제1 선별 대상 벡터, 상기 제2 선별 대상 벡터 및/또는 상기 선별 대상 이중 치환 벡터의 발현 생성물과 상기 표적 사이에 복합체가 형성되는지 여부를 검출하고, 상기 기준 항원 결합 단백질과 상기 표적 사이에 복합체가 형성되는지 여부를 검출한다.
정량적 방법의 경우, 상기 표적과의 결합력은 표적에 결합되는 EC50 값, 표적에 결합되는 KD 값, 표적과 결합하여 형성된 복합체의 OD 값 및/또는 표적과 결합하여 형성된 복합체의 흡광도를 포함할 수 있다. 상기 제1 선별 대상 벡터, 상기 제2 선별 대상 벡터 및/또는 상기 선별 대상 이중 치환 벡터의 발현 생성물이 표적에 결합되는 EC50 값, 표적에 결합되는 KD 값, 표적과 결합하여 형성된 복합체의 OD 값 및/또는 표적과 결합하여 형성된 복합체의 흡광도가 상기 기준 항체가 표적에 결합되는 EC50 값, 표적에 결합되는 KD 값, 표적과 결합하여 형성된 복합체의 OD 값 및/또는 표적과 결합하여 형성된 복합체의 흡광도의 30% 이상(예를 들어, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 100%, 110% 또는 120% 이상)인 경우, 상기 발현 생성물이 상기 표적에 특이적으로 결합하는 것으로 추정할 수 있다. 다르게는, 상기 제1 선별 대상 벡터, 상기 제2 선별 대상 벡터 및/또는 상기 선별 대상 이중 치환 벡터의 발현 생성물이 표적에 결합되는 EC50 값, 표적에 결합되는 KD 값, 표적과 결합하여 형성된 복합체의 OD 값 및/또는 표적과 결합하여 형성된 복합체의 흡광도가 상기 제1 선별 대상 벡터, 제2 선별 대상 벡터, 상기 선별 대상 이중 치환 벡터의 발현 생성물 및/또는 상기 기준 항원 결합 단백질이 존재하지 않는 음성 대조군의 2배 이상(예를 들어, 2.5배, 3배, 3.5배 이상)인 경우에도, 상기 발현 생성물이 상기 표적에 특이적으로 결합하는 것으로 추정할 수 있다.
다른 일 양태로, 본 출원은 상기 제1 선별 대상 벡터, 상기 제2 선별 대상 벡터 및/또는 상기 선별 대상 이중 치환 벡터를 사용하는 단계를 포함하는 상기 기능성 항원 결합 단백질을 제조하는 방법을 제공한다.
다른 일 양태로, 본 출원은 본 출원의 상기 방법에 따라 제조된 기능성 항원 결합 단백질을 제공한다.
아무런 이론의 제한도 받지 않고, 이하의 실시예는 본 출원의 상기 방법 및 본 출원의 상기 방법에 의해 얻어진 기능성 항원 결합 단백질 등을 설명하기 위한 것일 뿐이며, 본 출원의 발명의 범위를 한정하기 위한 것이 아니다.
실시예
실시예1: 16개의 기준 항체 Fab 파지 디스플레이 벡터를 가진 Tg1 박테리아의 제조
1.1. 16개의 기준 항체의 전장 경쇄 및 중쇄 가변 영역 유전자의 합성
다음 16개의 기준 항체의 전장 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 문헌 검색을 통해 얻었다: Secukinumab, Selicrelumab, APX-005M, Tafasitamab, Ublituximab, Epratuzumab, Relatlimab, Leramilimab, Coblimab, Tiraglumab, Vibostolimab, Etigilimab, Amatuximab, TRX-518, Bleselumab, Iscalimab.
예를 들어, 문헌 검색을 통해 Selicrelumab의 전장 경쇄 및 전장 중쇄의 아미노산 서열을 얻었다(WO 2018/220100의 관련 서열 정보 참조). 여기서, Selicrelumab의 전장 경쇄의 아미노산 서열은 서열번호 11에 도시되어 있고, Selicrelumab의 전장 중쇄의 아미노산 서열은 서열번호 12에 도시되어 있다.
Selicrelumab의 전장 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 대장균에서 발현될 수 있는 염기 서열로 변환하고, 서열의 양단에 파지 디스플레이 벡터와 매칭되는 적절한 효소 절단 서열 및(또는) 신호 펩티드 서열을 포함하는 염기 서열을 추가하여 유전자를 합성하고, pUC57 벡터(GENEWIZ(金唯智) 생물과기유한회사 합성)에 삽입한다.
여기서, 전장 경쇄를 포함하는 합성된 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 13에 도시되고, 중쇄 가변 영역을 포함하는 합성된 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 14에 도시된다.
16개의 기준 항체의 전장 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 대장균에서 발현될 수 있는 염기 서열로 변환하고, 서열의 양단에 파지 디스플레이 벡터와 매칭되는 적절한 효소 절단 서열 및(또는) 신호 펩티드 서열을 포함하는 염기 서열을 추가하여 유전자를 합성하고, pUC57 벡터(GENEWIZ(金唯智) 생물과기유한회사)에 삽입했다.
1.2. 16개의 기준 항체 Fab 파지 디스플레이 벡터의 구성
합성된 16개의 전장 경쇄를 포함하는 염기 서열을 포함하는 pUC 57 벡터를 SfiI로 효소 절단하여, 16개의 전장 경쇄 단편을 얻으며, 이 단편이 도 1의 제1 폴리뉴클레오타이드이다.
합성된 16개의 중쇄 가변 영역 염기 서열을 포함하는 pUC 57 벡터를 SfiI+Esp3I 이중 효소 절단하여, 16개의 중쇄 가변 영역 단편을 얻으며, 이 단편이 도 1의 제2 폴리뉴클레오타이드이다.
얻은 16개의 전장 경쇄 단편(즉, 본 출원의 도 1의 제1 폴리뉴클레오타이드), 16개의 중쇄 가변 영역 단편(즉, 본 출원의 도 1의 제2 폴리뉴클레오타이드)은 기준 항체에 대응되는 경쇄 단편, 중쇄 가변 영역 단편 및 도 1에 도시된 제1 벡터 폴리뉴클레오타이드, 제2 벡터 폴리뉴클레오타이드에 따라 16개의 4-단편 연결을 수행하고, 클론의 염기 서열을 시퀀싱 분석하여 16개의 양성 기준 항체 Fab의 파지 디스플레이 벡터를 얻는다. 제1 벡터 폴리뉴클레오타이드와 제2 벡터 폴리뉴클레오타이드의 설명 및 제조는 라이브러리 구성 특허 출원 WO 2020/216191 A1의 관련 단계를 참조할 수 있다.
예를 들어, 얻은 Selicrelumab의 전장 경쇄 단편(제1 폴리뉴클레오타이드), Selicrelumab의 중쇄 가변 영역 단편(제2 폴리뉴클레오타이드)은 도 1에 도시된 제1 벡터 폴리뉴클레오타이드, 제2 벡터 폴리뉴클레오타이드에 따라 4-단편 연결을 수행하고, 클론의 염기 서열을 시퀀싱 분석하여 양성 대조 항체 Selicrelumab-Fab의 파지 디스플레이 벡터를 얻는다. 제1 벡터 폴리뉴클레오타이드와 제2 벡터 폴리뉴클레오타이드의 설명 및 제조는 WO 2020/216191 A1의 관련 단계를 참조할 수 있다.
구체적으로, 상기 설명된 제1 벡터 폴리뉴클레오타이드는 WO 2020/216191 A1의 실시예 1.6에 기재된 것과 같이, 링커를 포함하는 0.8kb 단편을 링커 조립 플라스미드 또는 실시예 1.4.4의 링커 저장 벡터를 주형으로 하여, 링커의 순방향 프라이머(WO 2020/216191 A1의 서열번호 79)와 링커의 역방향 프라이머(WO 2020/216191 A1의 서열번호 80)를 사용하여 증폭한 후, 제한 엔도뉴클레아제 R3 및 R4로 해당 0.8kb의 PCR 생성물을 효소 절단하고, 겔 전기영동 정제로 회수하여(작은 단편 겔 회수 키트 사용, LifeFeng()생물에서 구입, Cat # DK402) 72pb의 링커 단편을 얻으며;
상기 제2 벡터 폴리뉴클레오타이드는 WO 2020/216191 A1의 실시예 1.8에 기재된 것과 같이, 실시예 1.7에서 제조된 디스플레이 벡터 DDB-R1R2R5R6을 제한 엔도뉴클레아제 R7 및 제한 엔도뉴클레아제 R8을 사용하여 효소 절단하여, 3.6kb 디스플레이 벡터 단편을 얻는다.
1.3. 16개의 기준 항체 Fab 파지 디스플레이 벡터를 가진 TG1 박테리아의 제조
16개의 기준 항체 Fab의 파지 디스플레이 벡터를 TG1 유도성 박테리아(Lucigen, Cat#: 60502)에 도입하여, 각 기준 항체 Fab 파지 디스플레이 벡터를 가진 TG1 박테리아를 얻는다.
예를 들어, 양성 대조 항체 Selicrelumab-Fab의 파지 디스플레이 벡터를 TG1 유도성 박테리아에 도입하여, 대조 항체 Selicrelumab-Fab의 파지 디스플레이 벡터를 가진 TG1 박테리아를 얻는다.
실시예 2: 다중 기준 항체 경쇄 치환 유전자 라이브러리, 박테리아 라이브러리 및 파지 라이브러리의 구성
1. 완전 인간 Kappa 경쇄 및 Lambda 경쇄 서브 라이브러리를 SfiI로 효소 절단하여, Kappa 경쇄 라이브러리 및 Lambda 경쇄 라이브러리 삽입 단편을 제조한다.
2. Kappa 경쇄 라이브러리와 Lambda 경쇄 라이브러리 삽입 단편(제1 폴리뉴클레오타이드), 16개의 기준 항체 중쇄 가변 영역 단편(제2 폴리뉴클레오타이드)을 도 1에 도시된 제1 벡터 폴리뉴클레오타이드, 제2 벡터 폴리뉴클레오타이드(라이브러리 구성 특허 참조)와 4-단편 연결을 수행하여, 경쇄 치환 라이브러리를 구성한다. 총량이 2,345ng인 4개의 단편을 1:1:1:1의 분자수로 동일한 비율로 혼합하며, 20℃에서 하룻밤 연결한다(15시간).
3. 연결 생성물을 정제하여 1,062ng의 경쇄 치환 라이브러리 연결 생성물(유전자 라이브러리)을 얻는다.
4. TG1 유도성 박테리아 3개를 변환하고, 박테리아 용액 총량이 6,000μl이며, 37℃/250rpm에서 60분간 배양한 다음, 10μl의 박테리아 용액을 취하여 연결 변환 효율 적정을 수행한다. 10배 희석을 8회 수행하고, 각 희석액을 5μl씩 취해 접시 코팅하여 32℃에서 하룻밤 배양한다.
5. 나머지 박테리아 용액을 2YT-Amp-2% 글루코스 배양액 220ml로 희석하고, 37℃에서 250rpm으로 3시간 동안 배양하며, OD600 = 0.6(박테리아 라이브러리)을 측정한다.
6. 7 단계의 박테리아 라이브러리 용액 50ml를 취하여 150ml 쉐이크 플라스크로 옮기고, 37℃에서 250rpm으로 4시간 동안 배양한 후 원심분리하여 박테리아를 수집하고, 2TY-Amp-7% DMSO 4ml로 박테리아를 현탁시킨 후, 2개의 튜브에 나누어 담고 영하 80℃에서 동결 보관한다.
7. 나머지 7 단계의 박테리아 라이브러리 용액(170ml)에 보조 파지(2.9x1013/ml) 3ml를 넣고 37℃에서 40분간 정치시킨 후, 37℃에서 250rpm으로 40분간 배양한다.
8. 보조 파지에 감염된 박테리아를 원심분리하여 수집하고, 3,500G에서 15분간 원심분리한 후 상청액을 버리고, 박테리아를 500ml의 2YT-Amp-Kan 배양액으로 재현탁시킨 후, 30℃에서 250rpm으로 하룻밤 배양한다.
9. 다음날, 4 단계의 적정 접시 코팅 결과에 따라, 경쇄 치환 박테리아 라이브러리 용량 1.2x109을 분석 계산한다. 10 단계에서 하룻밤 배양한 박테리아를 원심분리하여 침전시키고, 상청액 500ml를 취하여 20% PEG-5M NaCl 125ml와 혼합하고 2시간 동안 빙욕을 시킨 후, 다시 원심분리하여 경쇄 치환 파지 라이브러리를 수집하다.
10. 원심 침전된 경쇄 치환 파지 라이브러리를 5ml의 PBS를 사용하여 현탁시키고, 테이블형 고속 원심분리기에서 4℃, 18,000g으로 5분간 원심분리한 후, 상청액을 취하고 OD280을 측정한 후, 경쇄 치환 파지 라이브러리의 농도: OD280 =13.7을 계산하며, 파지 농도는 3.2x1013/ml이다.
11. 동결 보관 경쇄 치환 파지 라이브러리: 5ml 파지 라이브러리 + 2ml 80% 고압 멸균 글리세롤 + 0.5ml PBS = 7.5ml를 균일하게 혼합하여 0.5ml/1x1013/튜브로 분배하고 영하 80℃에서 동결 보관한다.
실시예 3: 다중 기준 항체 중쇄 치환 유전자 라이브러리, 박테리아 라이브러리 및 파지 라이브러리의 구성
1. 완전 인간 중쇄 가변 영역(Vh) 서브 라이브러리를 SfiI 및 Esp3I로 이중 효소 절단하여 Vh 라이브러리 삽입 단편을 제조한다.
2. 실시예 1에 기재된 단계를 참조하여, 얻은 16개의 기준 항체 경쇄 삽입 단편(제1 폴리뉴클레오타이드), Vh 라이브러리 삽입 단편(제2 폴리뉴클레오타이드)을 도 1에 도시된 제1 벡터 폴리뉴클레오타이드, 제2 벡터 폴리뉴클레오타이드와 4-단편 연결을 수행하여, 경쇄 치환 라이브러리를 구성한다. 4개의 단편을 1:1:1:1의 분자수로 동일한 비율로 혼합하며, 총량이 2,345ng이고, 20℃에서 하룻밤 연결한다(15시간).
3. 연결 생성물을 정제하여 1,134ng의 중쇄 치환 라이브러리 연결 생성물(유전자 라이브러리)을 얻는다.
4. TG1 유도성 박테리아 3개를 총 6,000μl의 박테리아 용액으로 변환하고, 37℃/250rpm에서 60분간 배양한 다음 10μl의 박테리아 용액을 취하여 연결 변환 효율 적정을 수행한다. 10배 희석을 8회 수행하고, 각 희석액을 5μl씩 취해 접시 코팅하여 32℃에서 하룻밤 배양한다.
5. 나머지 박테리아 용액을 2YT-Amp-2% 글루코스 배양액 220ml로 희석하고, 37℃에서 250rpm으로 3시간 동안 배양하며, OD600 = 0.6(박테리아 라이브러리)을 측정한다.
6. 7 단계의 박테리아 라이브러리 용액 50ml를 취하여 150ml 쉐이크 플라스크로 옮기고, 37℃에서 250rpm으로 4시간 동안 배양한 후 원심분리하여 박테리아를 수집하고, 2TY-Amp-7% DMSO 4ml로 박테리아를 현탁시킨 후, 2개의 튜브에 나누어 담고 영하 80℃에서 동결 보관한다.
7. 나머지 7 단계의 박테리아 라이브러리 용액(170ml)에 보조 파지(2.9x1013/ml) 3ml를 넣고 37℃에서 40분간 정치시킨 후, 37℃에서 250rpm으로 40분간 배양한다.
8. 보조 파지에 감염된 박테리아를 원심분리하여 수집하고, 3,500G에서 15분간 원심분리한 후 상청액을 버리고, 박테리아를 500ml의 2YT-Amp-Kan 배양액으로 재현탁시킨 후, 30℃에서 250rpm으로 하룻밤 배양한다.
9. 다음날, 4 단계의 적정 접시 코팅 결과에 따라, 중쇄 치환 박테리아 라이브러리 용량 1.2x109을 분석 계산한다. 10 단계에서 하룻밤 배양한 박테리아를 원심분리하여 침전시키고, 상청액 500ml를 취하여 20% PEG-5M NaCl 125ml와 혼합하고 2시간 동안 빙욕을 시킨 후, 다시 원심분리하여 중쇄 치환 파지 라이브러리를 수집하다.
10. 원심 침전된 경쇄 치환 파지 라이브러리를 5ml의 PBS를 사용하여 현탁시키고, 테이블형 고속 원심분리기에서 4℃, 18,000g으로 5분간 원심분리한 후, 상청액을 취하고 OD280을 측정한 후, 중쇄 치환 파지 라이브러리의 농도: OD280 =20.3을 계산하며, 파지 농도는 4.7x1013/ml이다.
11. 동결 보관 중쇄 치환 파지 라이브러리: 5ml 파지 라이브러리 + 2ml 80% 고압 멸균 글리세롤 + 0.5ml PBS = 7.5ml를 균일하게 혼합하여 0.5ml/1x1013/튜브로 분배하고 영하 80℃에서 동결 보관한다.
실시예 4: 기준 항체(Her3/Patritumab) Fab 파지 디스플레이 벡터를 가진 Tg1 박테리아의 제조, 단일 기준 항체(Patritumab) 경쇄 치환 및 중쇄 치환 유전자 라이브러리, 박테리아 라이브러리 및 파지 라이브러리의 구축
1. 실시예 1의 과정을 참조하여, 기준 항체(Patritumab) Fab 파지 디스플레이 벡터를 가진 Tg1 박테리아를 제조한다. 여기서, Patritumab의 관련 CDR 서열은 CN 102633881 B를 참조할 수 있다. Patritumab의 경쇄 및 중쇄 서열은 US 7705130 B2를 참조할 수 있다.
2. 다중 기준 항체 경쇄 및 중쇄 치환 라이브러리 구성 과정을 참조하여 단일 기준 항체 Patritumab의 경쇄 치환 라이브러리와 중쇄 치환 라이브러리를 구성한다.
3. 경쇄 치환 라이브러리와 질량 치환 라이브러리에서, 각 연결 단편 총량이 각각 1,173ng이고, 6시간 동안 연결하고 연결 생성물을 정제하여, 각각 550ng을 얻는다.
4. 각각 250ng을 취하여 하나의 TG1 유도성 박테리아를 변환한다. 변환된 박테리아 용액 부피는 각각 2ml이고, 각각 10μl를 취하여 적정하고, 나머지 박테리아 용액을 각각 하나의 큰 접시와 하나의 중간 접시에 코팅한다. 32℃에서 하룻밤 배양한다.
5. 이튿날 적정 결과에 따라 박테리아 라이브러리 용량을 계산한 결과, 중쇄 치환 라이브러리가 2.4 x 10e8, 경쇄 치환 라이브러리가 4.4 x 10e8이다. 두 박테리아 라이브러리의 모든 콜로니를 각각 수집하여 각 라이브러리에 대해 50ml의 배양액(2YT-0.2% 글루코스-Amp)을 준비하고, 적정량의 박테리아 용액을 첨가하여 OD600을 측정한 결과 약 0.12이다.
6. 37℃에서 250rpm으로 50분간 배양하여 OD600을 측정한 결과 약 0.25이다. 각각 보조 파지(OD280=13) 250μl를 첨가한다. 균일하게 교반한 후 37℃에서 30분간 정적 배양하고, 37℃에서 250rpm으로 30분간 배양한다.
7. 박테리아를 원심분리하여 수집하고, 각각 100ml의 배양액(2YT-Amp-Kana)으로 재현탁시킨 후, 30℃에서 250rpm으로 6시간(3pm-9pm) 동안 배양시킨다. 원심분리하여 박테리아를 침전시키고 상청액을 수집한 후, 각각 25ml의 5xPEG-NaCl을 첨가하고 균일하게 혼합하여 4℃에서 하룻밤 파지를 침전시킨다.
8. 셋째 날, 경쇄 치환 파지 라이브러리와 중쇄 치환 파지 라이브러리를 원심분리하여 수집한다. 파지 라이브러리를 각각 2ml의 PBS를 사용하여 현탁시키고, 각각 4개의 튜브에 나누어 영하 80℃에서 동결 보관한다.
실시예 5: 단일 기준 항체(CD40/Secukinumab) 중쇄 치환 유전자 라이브러리, 박테리아 라이브러리 및 파지 라이브러리의 구성
1. 다중 기준 항체 중쇄 치환 라이브러리 구성 과정(실시예 3)을 참조하여, 단일 기준 항체 Secukinumab의 중쇄 치환 라이브러리를 구성한다.
2. 실시예 1의 과정을 참조하여, 얻은 Selicrelumab 경쇄 삽입 단편(제1 폴리뉴클레오타이드), 완전 인간 Vh 라이브러리 삽입 단편(제2 폴리뉴클레오타이드)을 도 1에 도시된 제1 벡터 폴리뉴클레오타이드, 제2 벡터 폴리뉴클레오타이드와 4-단편 연결을 수행하여, 중쇄 치환 라이브러리를 구성한다. 4개의 단편을 1:1:1:1의 분자수로 동일한 비율로 혼합하며, 총량이 1,175ng이고, 20℃에서 하룻밤 연결한다(15시간).
3. 연결 생성물을 정제하여 513ng의 중쇄 치환 라이브러리 연결 생성물(유전자 라이브러리)을 얻는다.
4. 300ng을 취하여 TG1 유도성 박테리아 1개를 변환하고, 변환 박테리아 용액 총량이 2,000μl이며, 37℃/250rpm에서 60분간 배양한 다음 10μl의 박테리아 용액을 취하여 연결 변환 효율 적정을 수행한다. 10배 희석을 8회 수행하고, 각 희석액을 5μl씩 취해 접시 코팅하여 32℃에서 하룻밤 배양한다.
5. 나머지 박테리아 용액은 큰 접시 2개에 균일하게 코팅하고, 32℃에서 하룻밤 배양한다.
6. 다음날, 4 단계의 적정 결과에 따라, 중쇄 치환 라이브러리 용량을 분석 계산한 결과는 3.2x108이다. 5 단계에서 하룻밤 배양한 2개의 큰 접시의 모든 콜로니를 수집하며, 박테리아 용액 총량이 15ml이다. 수집된 박테리아 용액의 OD600 = 20으로 측정된다. 3ml를 취하고 DMSO(최종 농도 7%)를 첨가하고, 두 튜브로 나누어 영하 80℃에서 (박테리아 라이브러리를) 동결 보관한다.
7. 6 단계에서 수집한 동결 보관 박테리아 용액 200μl를 취하여, 2YT-Amp-0.2% 글루코스 배양액 50ml에 넣고 OD600 = 0.109를 측정한 후, 37℃에서 250rpm으로 60분간 배양하고 OD600 = 0.247을 측정한다.
8. 보조 파지(OD280=13) 250μl를 첨가하고, 균일하게 교반한 후 37℃에서 30분간 정지시키며, 37℃에서 250rpm으로 30분간 배양한다.
9. 보조 파지에 감염된 박테리아를 원심분리하여 수집하고, 2YT-Amp-Kana 배양액 100ml에 현탁시키며, 30℃에서 250rpm으로 8시간 동안 배양한다. 원심분리하여 박테리아를 침전시키고 상청액을 수집한 후, 각각 25ml의 5 x PEG-NaCl과 균일하게 혼합하여 4℃에서 하룻밤 파지를 침전시킨다.
10. 다음날, 9 단계의 파지 라이브러리를 원심분리하여 침전시키고, 2ml의 PBS로 파지 침전물을 현탁시켜 파지 라이브러리를 얻는다. OD280 =13을 측정하고, 파지 농도가 3x1013/ml이며, 0.2ml의 중쇄 치환 파지 라이브러리를 취하여 제1 라운드 선별에 사용한다.
11. 중쇄 치환 파지 라이브러리 동결 보관: 최종 글리세롤 농도 20%까지 고압 소독한 80% 글리세롤 용액 0.6ml를 첨가하고, 균일하게 혼합한 후 0.6ml/튜브씩 4개 튜브로 나누고 영하 80℃에서 동결 보관한다.
실시예 6: CD40 항원 특이적 Selicrelumab 경쇄 치환 양성 클론의 선별
항원 준비:
비오틴이 표지된 CD40 항원(AcroBio, Cat#: CD0-H82E8) 및 비오틴이 표지되지 않은 CD40 항원(AcroBio, Cat#: CD0-H5253)을 구입하고, 설명서에 따라 동결 건조 분말을 녹여 비오틴이 표지된 항원은 5μg/튜브, 비오틴이 표지된 항원은 10μg/튜브로 나눈 후, 영하 80℃에서 보관한다.
제1 라운드 선별:
1. 영하 80℃에서 동결 보관한 기준 항체 경쇄 치환 파지 라이브러리 1 튜브(파지 농도 1x1013/0.5ml, 실시예 2)를 취하여 빙욕으로 해동한 후, MPBST(12% Milk, 0.05% Tween의 1X PBS 함유) 100μl와 혼합하여, 최종 부피 0.6ml, Milk 최종 농도가 2%가 되도록 한다.
2. 세척 및 재현탁시킨 자성 비드(Invitrogen, Cat#: 11206D) 60μl를 첨가하고, 실온에서 30분간 회전시키며 흔들어, 비드에 결합할 수 있는 비특이적 파지를 흡착한다.
3. 마그네틱 프레임(Invitrogen Cat#: 12321D)으로 마그네틱 비드를 흡착하여 제거하고, 파지 라이브러리 용액을 2% MPBST로 밀폐된 새 2ml EP 튜브에 옮긴다.
4. 5μg의 비오틴이 표지된 항원을 취하여 경쇄 치환 파지 라이브러리와 혼합하고(최종 항원 농도 5μg/0.6ml), 실온에서 2시간 동안 회전시키며 흔들어, 항원 특이적 Fab을 보여주는 파지를 비오틴이 표지된 항원에 결합시킨다.
5. 세척 및 재현탁시킨 자성 비드 60μl를 파지 라이브러리 용액에 첨가하고, 실온에서 20분 동안 회전시키며 흔들어, 자성 비드 표면의 아비딘과 비오틴의 결합을 통해 항원 특이적 파지를 포집하여 자성 비드-아비딘-비오틴-항원-Fab 항체 단편 가교체를 형성한다.
6. 마그네틱 프레임으로 5 단계에서 형성된 항원 특이적 Fab의 가교체를 휴대하는 자기 비드를 수집한다.
7. 자성 비드를 1xPBST로 4회 세척한 다음, 다시 1xPBS로 4회 세척한다.
8. 항원 특이적 Fab을 디스플레이하는 파지는 300μl의 pH 2.2 글리신 용액으로 현탁시키고, 실온에서 10분간 회전시키며 흔들어 용출시킨다.
9. 비드를 마그네틱 프레임을 통해 수집하고, 비드가 없는 용출 상청액을 새 1.5ml EP 튜브로 옮긴 후, 110μl의 pH 8.0 Tris 완충액를 사용하여 pH 7.0으로 중화한다.
10. 항원 특이적 Fab을 디스플레이하는 파지는 100μl의 pH 2.2 글리신 용액으로 재현탁시키고, 5분간 회전시키며 흔들어 용출시킨다.
11. 비드를 마그네틱 프레임을 통해 수집하고, 비드가 없는 용출 상청액을 새 1.5ml EP 튜브로 옮긴 후, 35μl의 pH 8.0 Tris 완충액를 사용하여 pH 7.0으로 중화한다.
12. 9 단계와 11 단계에서 얻은 중화 용출 파지 용액 약 540μl를 섞어 얼음에 보관하여 준비한다.
13. TG1 박테리아 40ml를 사전 배양하고, OD600을 0.2-0.3으로 모니터링한다.
14. TG1 박테리아 용액 3ml를 취하여 용출 중화 파지 용액 400μl와 혼합한 후, 37℃에서 30분간 정치시킨다.
15. 파지 라이브러리에 감염된 박테리아 용액 10μl를 취하여, 2YT 배양액으로 10배 희석을 8회 진행하고, 각 희석도 5μl를 취하여 2YT-Amp 접시에 코팅하고, 32℃에서 하룻밤 배양한 후 선별 효율 적정을 수행한다.
16. 나머지 박테리아 용액은 큰 정사각형 접시 2개(Thermo Cat#: 8-1030-051)에 코팅하고, 32℃에서 하룻밤 배양한다.
17. 남은 용출 중화 파지 용액 140μl를 4℃에서 보관한다.
18. 다음날, 경쇄 치환 파지 라이브러리의 제1 라운드 선별에서 얻은 파지 t산출물(output)이 8.8 x 108인 것을 분석하여 계산한다.
제1 라운드 선별에서 얻은 파지 라이브러리의 패키징, 증폭, 침전 및 수집:
1. 제1 라운드 산출물로부터의 2개의 큰 접시의 콜로니(최종 박테리아 용액 부피 10ml)를 수집하고, 4ml를 취하여 2개의 튜브(2ml/7% DMSO/튜브)를 동결 보관한다.
2. 수집한 박테리아 용액 20μl를 취하여, 2YT로 50배 희석하고 OD600 = 0.7, 원 박테리아 용액 OD600 = 35를 측정한다.
3. 2YT-Amp-2% Glocose 배양액 60ml를 준비하고, OD600 =0.7의 박테리아 라이브러리 용액 200μl를 첨가하며, 37℃에서 250rpm으로 1시간 동안 배양한 후, OD600이 약 0.35인 것을 측정한다.
4. 보조 파지(OD280=13) 0.5ml를 첨가하고, 박테리아 라이브러리 용액과 혼합하며, MOI가 500-1,000이다. 37℃에서 30분간 정치하고, 37℃에서 250rpm으로 30분간 배양한다.
5. 박테리아를 원심분리하여 수집하고, 2YT-Amp-Kan 배양액 100ml를 사용하여 박테리아를 재현탁시키며, 30℃에서 250rpm으로 하룻밤 배양한 후, 제1 라운드 산출물 파지를 패키징하고 증폭한다.
6. 다음날 4℃에서 9,000rpm(Beckman, JA-10)으로 15분간 원심분리하고, 상청액을 취하여 25ml의 20% PEG-5M NaCl과 균일하게 혼합한 후, 2시간 동안 빙욕을 수행한다.
7. 4℃에서 9,000rpm(Beckman, JA-10)으로 15분간 원심분리하고, 상청액을 제거하고 다시 4℃에서 5분간 원심분리하여 파지를 원심분리 튜브 바닥에 침전시켜 집중시킨 후, 잔류 상청액을 피펫팁으로 흡착하여 제거한다.
8. 파지 라이브러리를 2ml의 PBS를 사용하여 현탁시키고, 테이블형 고속 원심분리기에서 4℃, 18,000g으로 5분간 원심분리한 후, 상청액을 취하고 OD280 = 16을 측정하고, 파지 농도 3.73 x 1013/ml를 계산한다.
9. 0.5ml의 파지 라이브러리를 취하여, 제2 라운드 선별을 수행한다.
10. 나머지 파지 라이브러리는 고압 소독한 80% 글리세롤 용액(최종 글리세롤 농도 20%) 1/3을 첨가하고, 균일하게 혼합한 후 각 라이브러리를 3개의 튜브에 나누며, 0.5ml/튜브이고 영하 80℃에서 동결 보관한다.
제2 내지 제5 라운드 선별:
1. 증폭 수집한 제1 라운드 선별에서 얻은 파지 라이브러리 0.5ml를 취하여 제2 라운드 선별을 수행한다. 선별 과정은 제1 라운드 선별과 동일하지만 선별 시 항원 최종 농도는 1μg/0.6ml이며, 540μl의 용출 중화 파지 용액을 얻는다.
2. 제2 라운드 용출 중화 파지 용액 0.5ml를 취하여 증폭없이 직접 제3 라운드 선별을 수행하되, 선별 과정은 제1 라운드 선별과 동일하고, 선별 시 항원 최종 농도는 1μg/0.6ml이며, 270μl의 용출 중화 파지 용액을 얻는다.
3. 제3 라운드 용출 중화 파지 용액 200μl를 취하여, TG1 박테리아 1ml를 37℃에서 30분 동안 감염시키고, 적정을 위해 10μl의 생성물을 취하여 8 구배 희석을 수행하며, 각 희석읠 위하여, 5μl의 박테리아 용액를 취하여 2YT-Amp 접시에 코팅하고, 32℃에서 하룻밤 배양한 후 선별 효율 적정을 수행한다. 나머지 박테리아 용액은 750μl를 큰 접시 하나에, 250μl를 큰 접시 하나에 코팅하여, 32℃에서 하룻밤 배양한다.
4. 다음날, 제3 라운드 용출 중화 파지 용액 200μl에 포함된 경쇄 치환 파지의 총 개수 2.6 x 105를 계산한다.
5. 제3 라운드 선별에서 얻은 파지 라이브러리를 패키징, 증폭, 침전 및 수집하며, 과정은 제1 라운드와 동일하다.
6. 증폭 수집한 제3 라운드 선별에서 얻은 파지 라이브러리 0.5ml를 취하여 제4 라운드와 제5 라운드 선별을 수행한다. 선별 과정은 제2 라운드 및 제3 라운드 선별과 동일하고, 선별 시 항원 최종 농도는 1μg/0.6ml이다.
7. 제5 라운드 용출 중화 파지 용액 200μl를 취하여, TG1 박테리아 1ml를 37℃에서 30분 동안 감염시키고, 적정을 위해 10μl를 취하며, 나머지 박테리아 용액은 750μl를 큰 접시 하나에, 250μl를 큰 접시 하나에 코팅하여, 32℃에서 하룻밤 배양한다.
8. 다음날, 제5 라운드 파지 용액 200μl에 포함된 경쇄 치환 파지의 총 개수 1.7 x 106를 계산한다.
딥웰 플레이트에 접종하고 IPTG로 Fab 발현을 유도:
1. 접종 배양액 2YT-Amp-0.2% 글루코스를 준비하고, 딥웰 플레이트당 40ml, 400μl/웰을 분주한다.
2. 제5 라운드 선별 콜로니(딥웰 플레이트 1개)를 접종하고, 딥웰 플레이트를 통기성 멤브레인으로 덮은 후, 37℃에서 250rpm으로 6시간 배양한다.
3. 딥웰 플레이트당 40ml의 IPTG 유도 배양액 2YT-Amp-2mM-IPTG를 준비하고, 이미 접종하여 6시간 배양한 딥웰 플레이트에 유도 배양액(400μl/웰)를 첨가한다(IPTG 최종 농도 1 mM).
4. 배양 조건을 30℃, 250rpm으로 조정하고 하룻밤 동안 유도 배양한다.
5. CD40 특이적 항원 코팅액(9.5ml ddH2O + 0.5ml 20x 코팅액 + 비오틴이 표지되지 않은 CD40 항원 10μg)을 준비하여, ELISA 플레이트 1개를 코팅하고(100μl/웰) 4℃에서 하룻밤 코팅한다.
CD40 항원 특이적 경쇄 치환 양성 클론의 ELISA 분석 선별:
1. 3% MPBST(10ml/ELISA 플레이트), PBST(200μl/매 회 플레이트 세척/웰)를 준비한다.
2. 4℃에서 하룻밤 동안 코팅한 ELISA 플레이트를 취하여 코팅액을 제거한 후 PBST로 세 번 세척한다.
3. 3% MPBST(100μl/웰)를 첨가하고 비통기성 멤브레인으로 덮은 후 37℃에서 60분간 밀폐한다.
4. 밀폐액을 제거하고 PBST로 세 번 세척한다.
5. 하룻밤 유도된 딥웰 플레이트에서 균일하게 혼합된 박테리아 용액 100μl/웰을 취하여 ELISA 플레이트의 대응되는 웰에 첨가하고, 비통기성 멤브레인으로 덮은 후 37℃에서 60분간 배양한다.
6. 박테리아 용액을 제거하고 PBST로 세 번 세척한다.
7. 2차 항체 용액 준비: Anti-flag-HRP 용액(GenScript(金斯瑞) Cat# A0148-100, ddH2O, 0.5μg/μl로 용해) 5μl를 취하고, 5ml PBS를 첨가한다. 준비된 2차 항체 용액을 ELISA 플레이트에 50μl/웰로 첨가하고, 비통기성 멤브레인으로 덮은 후 37℃에서 45분간 배양한다.
8. 2차 항체 용액을 제거하고 PBST로 세 번 세척한다.
9. 발색 용액(ABTS, Invitrogen, Cat# MD21704) 50μl/웰을 첨가하고 실온에서 30분간 발색한다.
10. 정지액(0.1M 구연산) 50μl/웰을 추가하고 균일하게 교반한 후 OD405 값을 읽는다.
11. OD405가 1.2 이상인 클론의 시퀀싱 분석 결과 43개의 Selicrelumab 경쇄 치환 양성 클론을 얻고, 영하 80℃에서 동결 보관한다.
실시예 7: CD40 항원 특이적 Selicrelumab 중쇄 치환 양성 클론의 선별
제1 라운드 선별:
새로 제조되고 글리세롤이 첨가되지 않은 단일 기준 항체 중쇄 치환 파지 라이브러리 200μl(파지 농도 3x1013/ml, 실시예 5)를 취하여, MPBST(4% Milk, 0.05% Tween의 1X PBS 함유) 200μl와 혼합하여, 최종 부피가 0.4ml이고, Milk 최종 농도가 2%가 되도록 한다.
액상 자기 비드 방법을 사용하여 중쇄 치환 파지를 선별하며, 선별 과정은 경쇄 치환 파지 라이브러리의 제1 라운드 선별과 동일하다. 항원 농도는 1μg/400μl, 최종 용출 중화 파지 용액은 540μl이다. 용출 중화 용액 400μl를 취하여 TG1 박테리아 1ml를 감염시키고, 박테리아 용액 10μl를 취하여 적정을 수행하며, 박테리아 용액 1ml를 큰 접시에 코팅하고, 나머지 박테리아 용액을 다른 큰 접시에 코팅하여 32℃에서 하룻밤 배양한다.
중쇄 치환 파지 라이브러리의 제1 라운드 선별에서 얻은 파지 산출물은 8.5 x 105이다.
제1 라운드 선별에서 얻은 중쇄 치환 파지 라이브러리의 패키징, 증폭, 침전 및 수집:
기본 과정은 제1 라운드 선별에서 얻은 경쇄 치환 파지 라이브러리의 패키징, 증폭, 침전 및 수집 과정과 동일하다. 간략하게 설명하면 하기와 같다.
1ml의 박테리아 용액이 코팅된 큰 접시의 모든 콜로니(6.3x10e5)을 수집하되, 총 부피가 8ml이고 종자로 2개의 튜브에 동결 보관한다. 수집한 박테리아 용액 140μl를 취하여 배양액(2YT-A-G) 50ml와 혼합하여 OD600 =0.114를 측정하고, 37℃에서 60분간 배양하며, OD600 =0.234를 측정하고, M13KO7 보조 파지(OD280 =13) 250μl를 첨가하여 균일하게 혼합하며, 37℃에서 30분간 정치하고, 37℃에서 250rpm으로 30분간 배양한다. 박테리아를 원심분리하여 수집하고, 2YT-Amp-Kana 배양액 100ml에 재현탁시키며, 30℃에서 8시간 동안 배양한다. 원심분리하여 배양액 상청액을 수집한 후, 각각 25ml의 5 x PEG-NaCl과 균일하게 혼합하여 4℃에서 하룻밤 파지를 침전시킨다. 다음날, 원심분리하여 파지 라이브러리를 수집하고, 2ml PBS로 현탁시키며, OD280=7을 측정하고, 글리세롤을 최종 농도 20%로 첨가하며, 0.5ml/튜브로 분주하고, 영하 80℃에서 동결 보관한다.
딥웰 플레이트 내의 접종 및 Fab 발현의 IPTG 유도:
중쇄 치환 파지 라이브러리 제1 라운드 선별을 0.4ml의 박테리아 용액을 코팅한 큰 접시의 콜로니에 접종(딥웰 플레이트 1개)하고, 시약 재료 준비 및 Fab 유도 발현 과정은 경쇄 치환 클론과 동일하다.
CD40 항원 특이적 중쇄 치환 양성 클론의 ELISA 분석 선별:
선별 과정은 경쇄 치환 클론의 분석 선별과 동일하다.
이렇게 ELISA 판독값이 0.8 초과인 클론을 시퀀싱 분석하고 분석하여 28개의 중쇄 치환 양성 클론을 얻고, 영하 80℃에서 동결 보관한다.
실시예 8: CD40 항원 특이적 Selicrelumab 경쇄 및 중쇄 이중 치환 양성 클론의 선별
경쇄 치환 양성 클론의 경쇄 단편(도 2, 제3 폴리뉴클레오타이드 참조)과 중쇄 치환 양성 클론의 중쇄 가변 영역 단편(도 2, 제4 폴리뉴클레오타이드 참조)을 제조한다.
경쇄 치환 양성 클론 37개(실시예 6)와 중쇄 치환 양성 클론 28개(실시예 7)의 동결 보관 박테리아 용액을 실온에서 해동한 후, 각각 5μl씩 취하고 혼합하여 CD40-LC-ZH-M37 박테리아 용액과 CD40-VH-ZH-M28 박테리아 용액을 얻는다. 혼합 박테리아 용액 50μl + 2YT-Amp 500μl를 각각 취하여 혼합한 후, 큰 접시에 각각 코팅하고 32℃에서 하룻밤 배양한다.
다음날, 2개의 큰 접시의 모든 콜로니를 수집한다. 영하 80℃에서 각각 2개씩 냉동 보관한다.
CD40-VH-ZH-M28(26μg) 및 CD40-LC-ZH-M37(32μg)의 벡터 DNA를 취한다.
5μg의 CD40-VH-ZH-M28 벡터 DNA를 Esp3I 및 SfiI로 효소 절단하고, 전기영동 분석으로 M28-VH 단편(324ng)을 정제한다(도 2, 제4 폴리뉴클레오타이드 참조).
5μg의 CD40-LC-ZH-M37 벡터 DNA를 SfiI로 효소 절단하고, 전기영동 분석으로 M37-LC 단편(432ng)을 정제한다(도 2, 제3 폴리뉴클레오타이드 참조).
경쇄 및 중쇄 이중 치환 라이브러리 구성:
제조된 M37-LC 삽입 단편(제3 폴리뉴클레오타이드), M28-VH 삽입 단편(제4 폴리뉴클레오타이드)을 도 2에 도시된 제3 벡터 폴리뉴클레오타이드, 제4 벡터 폴리뉴클레오타이드와 4-단편 연결을 수행하여, 경쇄 및 중쇄 이중 치환 라이브러리를 구성한다. 4개의 단편을 1:1:1:1의 분자수로 동일한 비율로 혼합하며, 총량이 596ng이고, 20℃에서 4시간 연결한다.
연결 생성물을 정제하여 450ng의 경쇄 및 중쇄 이중 치환 라이브러리를 얻는다.
정제된 연결 생성물 50ng을 취하여 하나의 TG1 유도성 박테리아를 변환하고, 적정하고 접시에 코팅하며, 32℃에서 하룻밤 배양한다.
다음날, 경쇄 및 중쇄 치환 박테리아 라이브러리 용량 2x106을 분석 계산한다.
콜로니 접종 및 Fab 발현 유도:
2개의 딥웰 플레이트에 접종하고, 30℃에서 IPTG 유도로 하룻밤 배양한다. CD40 항원을 2개의 ELISA 플레이트에 100ng/웰로 코팅하여, 4℃에서 하룻밤 배양한다.
CD40 항원 특이적 경쇄 및 중쇄 이중 치환 양성 클론의 ELISA 분석 선별:
분석 선별 과정은 단일 치환 클론과 동일하다.
이렇게 ELISA 판독값이 1.5 이상인 양성 클론을 시퀀싱 분석하고 분석하여 10개의 고유의 신규 VH, 19개의 고유의 신규 LC를 얻고, 30개의 이중 치환 양성 클론을 구성하여, 영하 80℃에서 동결 보관한다.
실시예 9: CD40 항원 특이적 Selicrelumab 경쇄 치환, 중쇄 치환, 경쇄 및 중쇄 이중 치환 양성 클론의 기능 분석
항체 발현:
293 세포 일시 전염 발현을 통하여, ELISA 판독값이 양성 대조군과 유사한 16개(#2-17)개의 선별된 CD40 항원 특이적 양성 클론의 전장 항체(KLC/IgG1)를 발현 및 정제를 위하여 선택하고 결정하였고, 한편, 기준 항체 Selicrelumab(#1)은 양성 대조군으로서 발현되었다.
1개 양성 대조군: Selicrelumab, #1;
6개 경쇄 치환 클론: #2-7;
6개 중쇄 치환 클론: #8-13;
4개 경쇄 및 중쇄 이중 치환 클론: #14-17.
총 15개의 정제된 항체를 얻는다(클론 #8 및 #17은 발현되지 않았다).
구체적으로는 표 1에 표시된 바와 같다.
[표 1]
Figure pct00002
항체 흥분 활성(excitation activity) 분석:
참고 문헌(Scandinavian Journal of Immunology 65, 479-486)을 참조하여, 항체를 인간 PBMC와 5일간 공동 배양(항체 농도 100 nM)한 후, 배양액 상청액의 IFN-γ 농도(pg/ml)를 검출하여 15개 흥분 활성을 분석한다. 그 결과, 선별된 14개 항체 모두 양성 항체인 Selicrelumab(#1)과 비교하여 다양한 정도의 흥분 활성을 보였으며, 여기서 #2, #3, #4, #5, #6, #7과 #16은 양성 대조 항체와 유사한 수준의 흥분 활성을 나타낸다.
결과는 도 4에 도시된 바와 같다.
6개의 사슬 치환 기능성 항체의 Vh와 전장 경쇄 아미노산 서열:
2개의 경쇄 치환 클론 #2, # 3; 2개의 중쇄 치환 클론 #12, #13; 2개의 경쇄 및 중쇄 이중 치환 클론 #14, #16의 아미노산 서열 비교 결과, 양성 대조군 항체 Selicrelumab의 대응되는 경쇄 또는 중쇄의 아미노산 서열과 비교할 때, 선별된 경쇄(경쇄 치환 클론), 중쇄(중쇄 치환 클론), 경쇄 및 중쇄(경쇄 및 중쇄 이중 치환 클론)의 CDR 영역의 아미노산 서열이 현저하게 다르다. 표 2를 참조할 수 있다.
[표 2]
Figure pct00003
실시예 10: Her3 항원 특이적 Patritumab 경쇄 치환 양성 클론의 선별
실시예 6의 선별 과정을 참조하여, Her3 항원 특이적 Patritumab 경쇄 치환 양성 클론 및 중쇄 치환 양성 클론을 선별한다.
하나의 Patritumab 경쇄 치환 파지 라이브러리(실시예 4)를 취하여 제1 라운드 선별을 수행하여, 경쇄 치환 파지 산출물이 1 x 105인 것을 얻었다.
제1 라운드의 산출물을 위하여 박테리아를 수집, 증폭 및 패키징하여, 제1 라운드 산출물 경쇄 교체 파지 라이브러리를 얻어, 제2 라운드 및 제3 라운드 선별을 수행한다. 제3 라운드 선별에서 얻은 경쇄 치환 파지 산출물은 2.2 x 107이다.
경쇄 치환 파지 라이브러리 클론으로 딥웰 플레이트 2개를 접종하고, 32℃에서 250rpm으로 하룻밤 배양한 후, IPTG로 Fab 발현을 유도한다.
Her3 항원 특이적 경쇄 치환 양성 클론을 ELISA 분석으로 선별한 결과, OD405가 높은 총 51개의 클론을 시퀀싱하여, 28개의 고유의 경쇄 치환 양성 클론을 얻는다.
실시예 11: Her3 항원 특이적 Patritumab 경쇄 치환 양성 클론의 기능 분석
항체 발현:
293 세포 일시 전염 발현을 통하여, ELISA 판독값이 양성 대조군과 유사한 12개의 선별된 Her3 항원 특이적 경쇄 치환 양성 클론 및 Patritumab(#1)의 전장 항체(#2-13, KLC/IgG1)를 발현하고 정제하기 위해 선택하고 결정하였다.
항체 세포내 섭취 활성 분석:
위암 오가노이드(3-27-T)를 소생시키고, 7일간 배양하며; 위암 오가노이드를 수집하고, 세척하여 매트릭스겔을 제거하며, 페놀 레드가 없는 D-Hanks 현탁액으로 적절한 부피로 현탁시키고, 균일하게 혼합하며, 96웰 플레이트에 웰당 50μL씩 분주한다.
참고 문헌(ThermoFisher/Invitrogen, Zenon™ pHrodo™ iFL IgG Labeling Reagents, Catalog Nos. Z25609, Z25610, Z25611, Z25612, Pub. No. MAN0017436 Rev. B.0)을 참조하여, 항체 용액 160nM와 4 x 결합 시약을 준비하고, 두 시약을 1:1 비율로 혼합한 후 실온에서 5분간 배양한다.
항체-결합 시약 혼합물을 위암 오가노이드를 분주한 96웰 플레이트에 웰당 50μl로 첨가하고, 실온에서 60분간 배양한다.
현미경 관찰을 통해 형광장의 형태를 촬영 및 기록하여, 항체의 세포내 섭취 활성을 분석한다.
결과는 도 5에 도시된 바와 같다. 결과에 의하면 DDBK004-2, DDBK004-3, DDBK004-7 및 DDBK004-13을 포함하는 4개의 항체가 녹색 형광을 나타내어 세포내 섭취 활성을 시사하지만, 양성 대조군보다 약하며; DDBK004-11의 형광 강도는 양성 대조군과 유사하여, 이 항체의 세포내 섭취 활성이 양성 항체와 유사함을 시사하며; DDBK004-9의 형광 강도가 가장 강하여 DDBK004-9는 양성 대조군보다 높아, 이 항체의 세포내 섭취 활성이 양성 대조군보다 높다는 것을 시사한다.
상기 항체의 CDR 및 가변 영역 서열은 표 3에 표시된 바와 같다.
[표 3]
Figure pct00004
실시예 12: TIGIT 항원 특이적 기준 항체 Tiragolumab 경쇄 치환 양성 클론, 중쇄 치환 양성 클론 및 이중 치환 양성 클론의 선별과 양성 클론의 생물학적 기능 분석
사슬 치환 양성 클론의 선별:
실시예 6의 항원 준비를 참조하여, 경쇄 치환 파지 라이브러리 및 중쇄 치환 파지 라이브러리로부터 TIGIT 항원 특이적인 경쇄 치환 양성 클론 및 중쇄 치환 양성 클론을 선별한다.
거의 1,000개의 클론을 ELISA로 분석한다. ELISA 분석 결과에 기초하고, 양성 대조군 클론의 OD405 판독값을 참조하여 판독값이 비교적 높은 400개 이상의 클론을 선별하여 시퀀싱을 진행하여, TIGIT 항원 특이적 경쇄 치환 양성 클론과 중쇄 치환 양성 클론을 결정한다.
실시예 8을 참조하여, 경쇄 치환 고유의 서열 양성 클론 및 중쇄 치환 고유의 서열 양성 클론을 선택하고, 고유의 서열 경쇄 단편(도2, 제3 폴리뉴클레오타이드 참조) 및 중쇄 단편(도 2, 제4 폴리뉴클레오타이드 참조)을 제조하고, 도 2에 도시된 제3 벡터 폴리뉴클레오타이드, 제4 벡터 폴리뉴클레오타이드와 4-단편 연결을 수행하여, 경쇄 및 중쇄 이중 치환 유전자 라이브러리, 박테리아 라이브러리 및 파지 라이브러리를 구성하고, 이중 치환 고유의 서열 양성 클론을 얻는다.
293 세포 일시 전염 발현을 통하여, ELISA 판독값이 양성 대조군과 유사하거나 더욱 높은 15개(#2-16)개의 선별된 TIGIT 항원 특이적 양성 클론의 전장 항체(KLC/IgG1)가 발현하고 정제하기 위해 선택되고 결정되었고, 아울러 기준 항체 Tiragolumab(#1)이 양성 대조군으로서 발현되었다. 총 15개의 정제된 항체(클론 #3은 발현되지 않음)를 얻으며, 표 4에 표시된 바와 같다.
[표 4]
Figure pct00005
여기서, Tiragolumab의 아미노산 서열은 WO 2009/126688 A2를 참조할 수 있다.
항체의 종양 세포 살상 활성 분석:
TIGIT 항체와 PD-1 항체(Pembrolizomab)의 병용의 비소세포 폐암 오가노이드에 대한 살상 활성을 실험적으로 관찰하였다. 여러 번의 사전 실험 결과에 기초하면, 표 4의 #5, #10, #12, #14 및 #15의 총 5개의 항체가 서로 다른 정도의 살상 활성을 보였다. 사전 실험의 결과를 비교하고 추가로 확인하기 위해, 실험을 TIGIT/PD-1 항체 병용 그룹(1~8번)과 TIGIT 항체 단독 사용 그룹(9~16번)으로 나누고, 각 그룹에 8개의 웰을 사용하였다.
실험 과정은 다음과 같다.
1. 참고 문헌(Tumor organoid-T-cell coculture systems; NATURE PROTOCOLS| VOL 15 JANUARY 2020 15-39)을 참조하여, 비소세포 폐암 오가노이드(4-11-T)를 소생시키고, IFNγ(200ng/mL)의 배양액에서 24시간 배양하며, 오가노이드를 수집하고 세척하여 매트리겔을 제거하며, 배양액으로 적절한 부피로 현탁시킨 후, 혼합하여 사용을 위하여 준비한다.
2. PBMC(4-11-PBMC)를 취하고 계수하며, 생존율 및 세포 수를 계산하고, 수집 및 세척하며, T 세포 배양액(RPMI1640, 10% FBS, 1% 이중 항체, 2mM 글루타민, IL2 첨가)으로 현탁시켜 적절한 농도로 조정하고, 96 웰 U-플레이트, 5x103 PBMC/웰에 분주한다.
3. 웰당 적정량의 비소세포 폐암 오가노이드를 추가하고 최종 부피 200μL/웰로 조정한다.
4. 웰 1-8에 PD-1 항체(Pembrolizomab)를 최종 농도 100 nM으로 첨가한 후, 웰 1 내지 웰 8까지 양성 대조군 항체(P), Isotype 항체(I), PBS 및 사전 실험 양성 클론 5개를 순차적으로 첨가하고, 그 중 하나의 웰에 PBS를 첨가하여 공백 대조군으로 한다. 웰 9~16의 경우, PD-1 항체(Pembrolizomab)를 첨가하지 않지만, 다른 시약은 웰 1~8과 동일하다. 결과는 표 5에 표시된 바와 같다.
[표 5]
Figure pct00006
5. 비소세포 폐암 오가노이드에 대한 항체의 살상 활성을 분석하기 위해, 오가노이드 및 림프구 변화에 대한 지속적인 현미경 관찰 및 정기적인 사진 기록을 수행한다.
6. TIGIT 항체 단독 사용 결과(도 6)에 따르면, PBS 공백 대조군 및 Isotype 항체와 비교했을 때, 단독 TIGIT 항체는 비소세포 폐암 오가노이드에 대한 유의미한 살상 활성이 나타나지 않았다.
7. TIGIT 항체와 PD-1 항체 병용 투여한 그룹의 결과에 따르면(도 7),
1) "음성" 대조군 웰(PD1+I; PD1+PBS)에서는 단독 PD-1 항체의 비소세포 폐암 오가노이드에 대한 유의미한 살상 활성이 관찰되지 않았다.
2) 양성 대조군 웰(PD1+P)에서, 11일째(D11)에 TIGIT 항체와 PD-1 항체 병용의 비소세포 폐암 오가노이드에 대한 유의미한 살상 활성이 관찰되었다.
3) TIGIT 항체 #5, #10, #12, #14, #15를 PD-1 항체(PD1+005, PD1+010, PD1+012, PD1+014, PD1+015)와 병용한 5개 실험 웰은 양성 대조군(PD1+P)과 비소세포 폐암 오가노이드에 대해 비슷한 살상 활성을 보였고, 11일(D11)에 유의미한 살상 활성이 관찰되었다.
상기 항체의 CDR 및 가변 영역 서열은 표 6에 표시된 바와 같다.
[표 6]
Figure pct00007
전술한 상세한 설명은 해석 및 예시의 방식으로 제공되고, 첨부된 청구범위의 범주를 제한하는 것이 아니다. 현재 본 출원에 나열된 실시방식의 여러 가지 변화는 당업자로 말하면 자명한 것이고, 또한 첨부된 청구범위와 동등한 방안의 범주 내에 보류된다.
SEQUENCE LISTING <110> DDBio. Co, Ltd., (Shang Hai) <120> VECTOR AND METHOD FOR SCREENING FUNCTIONAL ANTIGEN-BINDING PROTEIN <130> 0112-PA-011 <140> PCT/CN2022/084229 <141> 2022-03-30 <150> CN 202110350207.1 <151> 2021-03-31 <160> 79 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Recognition Site 1 <400> 1 ggcccaggcg gcc 13 <210> 2 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Recognition Site 2 <400> 2 ggccacatag gcc 13 <210> 3 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Recognition Site 3 <400> 3 ggcccaaccg gcc 13 <210> 4 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Recognition Site 4 <400> 4 cgtctcctca gc 12 <210> 5 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Recognition Site 5 <400> 5 cgtctcagtg gt 12 <210> 6 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Recognition Site 6 <400> 6 cgtctcatca gc 12 <210> 7 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Recognition Site 7 <400> 7 ggccacaggg gcc 13 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32 Thr Ala Ser Thr Leu Gln Ser 1 5 <210> 33 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DDBK003-12 LCDR3; DDBK003-13 LCDR3 <400> 33 Gln Gln Ala Asn Ile Phe Pro Leu Thr 1 5 <210> 34 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DDBK003-13 VH <400> 34 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Ala Ser Gly Gly Ser Val Ser Ser Ala 20 25 30 Ser Asp Leu Trp Gly Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Gly Asn Ile Tyr Tyr Leu Gly Lys Thr Asp Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Gly Gly Arg Val Ser Ile Thr Met Asp Lys Ser Lys Asn Gln Phe 65 70 75 80 Ser Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Met Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Lys Arg Ser Thr Leu Pro Met Arg Gly Phe Phe Val Ser Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 35 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DDBK003-13 HCDR1 <400> 35 Ser Ala Ser Asp Leu Trp Gly 1 5 <210> 36 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DDBK003-13 HCDR2 <400> 36 Asn Ile Tyr Tyr Leu Gly Lys Thr Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Gly Gly 1 5 10 15 <210> 37 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DDBK003-13 HCDR3 <400> 37 Arg Ser Thr Leu Pro Met Arg Gly Phe Phe Val Ser 1 5 10 <210> 38 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DDBK003-14 VH; DDBK003-16 VH <400> 38 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ala Ser 20 25 30 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Ile Phe Pro Ile Leu Gly Ser Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Leu Ala Gly Tyr Asn Tyr Gly Phe Phe Gly Tyr Trp Gly 100 105 110 Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 39 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DDBK003-14 HCDR1;DDBK003-16 HCDR1 <400> 39 Ala Ser Ala Ile Ser 1 5 <210> 40 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DDBK003-14 HCDR2; DDBK003-16 HCDR2 <400> 40 Gly Ile Phe Pro Ile Leu Gly Ser Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 41 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DDBK003-14 HCDR3; DDBK003-16 HCDR3 <400> 41 Asp Leu Ala Gly Tyr Asn Tyr Gly Phe Phe Gly Tyr 1 5 10 <210> 42 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DDBK003-14 KLC <400> 42 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Asn Ser Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Arg Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Thr Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Lys Ser Phe Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 43 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DDBK003-14 LCDR1 <400> 43 Arg Ala Ser Gln Gly Ile Asn Ser Trp Leu Ala 1 5 10 <210> 44 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DDBK003-14 LCDR3 <400> 44 Gln Gln Ala Lys Ser Phe Pro Leu Thr 1 5 <210> 45 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DDBK003-16 KLC <400> 45 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 46 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DDBK003-16 LCDR1 <400> 36 Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp Leu Ala 1 5 10 <210> 47 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DDBK003-16 LCDR2 <400> 47 Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser 1 5 <210> 48 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DDBK003-16 LCDR3 <400> 48 Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Leu Thr 1 5 <210> 49 <211> 220 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DDBK004-9 KLC <400> 49 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser 20 25 30 Pro Asn Asn Arg Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ala Pro Lys Leu Leu Ile Ser Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Tyr Tyr Gly Pro Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile 100 105 110 Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp 115 120 125 Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn 130 135 140 Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu 145 150 155 160 Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp 165 170 175 Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr 180 185 190 Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser 195 200 205 Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 220 <210> 50 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DDBK004-9 LCDR1 <400> 50 Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser Pro Asn Asn Arg Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Ala <210> 51 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DDBK004-9 LCDR2；DDBK004-11 LCDR2；#15 LCDR2 <400> 51 Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser 1 5 <210> 52 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DDBK004-9 LCDR3 <400> 52 Gln Gln Tyr Tyr Gly Pro Pro Arg Thr 1 5 <210> 53 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DDBK004-9 VH ；DDBK004-11 VH <400> 53 Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr 20 25 30 Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asn His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Glu Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Asp Lys Trp Thr Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 54 <211> 220 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DDBK004-11 KLC <400> 54 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Gly 20 25 30 Ser Asn Asn Arg Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Tyr Tyr Asn Ala Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 100 105 110 Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp 115 120 125 Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn 130 135 140 Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu 145 150 155 160 Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp 165 170 175 Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr 180 185 190 Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser 195 200 205 Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 220 <210> 55 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DDBK004-11 LCDR1 <400> 55 Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Gly Ser Asn Asn Arg Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Ala <210> 56 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DDBK004-11 LCDR3 <400> 56 Gln Gln Tyr Tyr Asn Ala Pro Arg Thr 1 5 <210> 57 <211> 220 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> #5 KLC <400> 57 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser 20 25 30 Pro Asn Asn Lys Asn Tyr Phe Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Val Ser Trp Ala Ser Thr Arg Lys Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Tyr Tyr Ser Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 100 105 110 Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp 115 120 125 Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn 130 135 140 Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu 145 150 155 160 Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp 165 170 175 Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr 180 185 190 Glu Lys His Lys Leu Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser 195 200 205 Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 220 <210> 58 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> #5 LCDR1 <400> 58 Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser Pro Asn Asn Lys Asn Tyr Phe 1 5 10 15 Ser <210> 59 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> #5 LCDR2 <400> 59 Trp Ala Ser Thr Arg Lys Ser 1 5 <210> 60 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> #5 LCDR3 <400> 60 Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Pro Thr 1 5 <210> 61 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> #10 VH <400> 61 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Met Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Gly Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Thr Ile Ser Gly Gly Ala Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ser Glu Val Val Ala Ala Thr Thr Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 62 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> #10 HCDR1 <400> 62 Met Tyr Ala Met Ser 1 5 <210> 63 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> #10 HCDR2 <400> 63 Thr Ile Ser Gly Gly Ala Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 64 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> #10 HCDR3 <400> 64 Glu Val Val Ala Ala Thr Thr Leu Asp Tyr 1 5 10 <210> 65 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> #12 VH <400> 65 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr 20 25 30 Trp Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Asn Thr Asn Gln Asp Gly Ser Glu Thr Tyr Tyr Val Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Trp Ser Gly Tyr His Asp Gly Ser Gly Tyr Asp Tyr Phe 100 105 110 Asp Tyr Trp Asp Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 66 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> #12 HCDR1 <400> 66 Arg Tyr Trp Met Thr 1 5 <210> 67 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> #12 HCDR2 <400> 67 Asn Thr Asn Gln Asp Gly Ser Glu Thr Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 68 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> #12 HCDR3 <400> 68 Arg Trp Ser Gly Tyr His Asp Gly Ser Gly Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 69 <211> 220 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> #15 KLC <400> 69 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser 20 25 30 Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Tyr Tyr Ser Thr Pro Gln Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 100 105 110 Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp 115 120 125 Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn 130 135 140 Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu 145 150 155 160 Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp 165 170 175 Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr 180 185 190 Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser 195 200 205 Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 220 <210> 70 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> #15 LCDR1 <400> 70 Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Ala <210> 71 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> #15 LCDR3 <400> 71 Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Gln Thr 1 5 <210> 72 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> #15 VH <400> 72 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Gln Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Thr Tyr 20 25 30 Trp Val Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Ile Tyr Pro Arg Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60 Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ala Thr Asp Thr Ala Phe 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ile Gly Glu Arg Trp Gln Asp Gly Arg Val Phe Trp Asn Gly 100 105 110 Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 73 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> #15 HCDR1 <400> 73 Thr Tyr Trp Val Gly 1 5 <210> 74 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> #15 HCDR2 <400> 74 Ile Ile Tyr Pro Arg Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 75 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> #15 HCDR3 <400> 75 Ile Gly Glu Arg Trp Gln Asp Gly Arg Val Phe Trp Asn Gly Met Asp 1 5 10 15 Val <210> 76 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> #14 VH <400> 76 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Pro Glu Val Lys Lys Pro Gly Thr 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Leu Thr Phe Ser Arg Ser 20 25 30 Ala Val Gln Trp Leu Arg Gln Ala Arg Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Trp Val Asp Val Ala Ser Ser Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Glu Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Met Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Asn Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Asp Leu Tyr Gly Phe Trp Gly Val Gln Gly Phe Asp Pro Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 77 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> #14 HCDR1 <400> 77 Arg Ser Ala Val Gln 1 5 <210> 78 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> #14 HCDR2 <400> 78 Trp Val Asp Val Ala Ser Ser Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Glu <210> 79 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> #14 HCDR3 <400> 79 Asp Leu Tyr Gly Phe Trp Gly Val Gln Gly Phe Asp Pro 1 5 10

Claims (132)

  1. 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법에 있어서,
    a) 제1 폴리뉴클레오타이드가 제공되며, 상기 제1 폴리뉴클레오타이드는 5' 내지 3' 방향(5'-to-3' direction)으로 R1-핵산 단편 I-R2를 포함하고, 상기 핵산 단편 I은 항원 결합 단편 I을 인코딩할 수 있는 단계;
    b) 제2 폴리뉴클레오타이드가 제공되며, 상기 제2 폴리뉴클레오타이드는 5' 내지 3' 방향으로 R3-기준 핵산 단편 II-R4를 포함하고, 상기 기준 핵산 단편 II는 기준 항원 결합 단편 II를 인코딩할 수 있으며, 상기 기준 항원 결합 단편 II는 기준 핵산 단편 I에 의해 인코딩된 기준 항원 결합 단편 I과 결합하여 기준 항원 결합 단백질을 형성할 수 있는 단계;
    c) 제1 벡터 폴리뉴클레오타이드가 제공되며, 상기 제1 벡터 폴리뉴클레오타이드는 5' 내지 3' 방향으로 R2-벡터 단편 I-R3을 포함하는 단계;
    d) 제2 벡터 폴리뉴클레오타이드가 제공되며, 상기 제2 벡터 폴리뉴클레오타이드는 5' 내지 3' 방향으로 R4-벡터 단편 II-R1을 포함하는 단계;
    e) 상기 제1 폴리뉴클레오타이드, 상기 제2 폴리뉴클레오타이드, 상기 제1 벡터 폴리뉴클레오타이드 및 상기 제2 벡터 폴리뉴클레오타이드를 제한 엔도뉴클레아제(restriction endonuclease)로 절단하여, 절단된 제1 폴리뉴클레오타이드, 절단된 제2 폴리뉴클레오타이드, 절단된 제1 벡터 폴리뉴클레오타이드 및 절단된 제2 벡터 폴리뉴클레오타이드를 얻는 단계;
    f) 상기 절단된 제1 폴리뉴클레오타이드, 상기 절단된 제2 폴리뉴클레오타이드, 상기 절단된 제1 벡터 폴리뉴클레오타이드 및 상기 절단된 제2 벡터 폴리뉴클레오타이드를 혼합하여, 이들이 지향 연결(directional linkage)되고 고리화되어 제1 선별 대상 벡터(to-be-screened vector)를 형성하게 할 수 있는 단계;
    g) 상기 제1 선별 대상 벡터가 발현되게 하며, 상기 기준 항원 결합 단백질이 결합할 수 있는 표적에 대한 결합력은 상기 기준 항원 결합 단백질과 상기 표적의 결합력의 30% 이상인 특성을 갖는 발현 생성물을 발현할 수 있는 제1 선별 대상 벡터를 제1 치환 벡터로 선택하는 단계;
    h) 상기 제1 치환 벡터로부터 상기 기능성 항원 결합 단백질을 얻는 단계를 포함하며;
    상기 R1, R2, R3 및 R4는 각각 독립적으로 제한 엔도뉴클레아제 식별 사이트(recognition site)인 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 R1 및 R2를 특이적으로 식별하는 제한 엔도뉴클레아제를 사용하여 상기 제1 폴리뉴클레오타이드를 절단하여, 상기 절단된 제1 폴리뉴클레오타이드를 얻는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 R3 및 R4를 특이적으로 식별하는 제한 엔도뉴클레아제를 사용하여 상기 제2 폴리뉴클레오타이드를 절단하여, 상기 절단된 제2 폴리뉴클레오타이드를 얻는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R2 및 R3을 특이적으로 식별하는 제한 엔도뉴클레아제를 사용하여 상기 제1 벡터 폴리뉴클레오타이드를 절단하여, 상기 절단된 제1 벡터 폴리뉴클레오타이드를 얻는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R4 및 R1을 특이적으로 식별하는 제한 엔도뉴클레아제를 사용하여 상기 제2 벡터 폴리뉴클레오타이드를 절단하여, 상기 절단된 제2 벡터 폴리뉴클레오타이드를 얻는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R1을 특이적으로 식별하는 제한 엔도뉴클레아제에 의한 특이적 절단에 의해 생성된 상기 R1의 말단과 대응하는 제한 엔도뉴클레아제에 의한 특이적 절단에 의해 생성된 상기 R2, R3 및 R4 중 어느 하나의 말단이 서로 식별되거나 연결되지 않는 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R2를 특이적으로 식별하는 제한 엔도뉴클레아제에 의한 특이적 절단에 의해 생성된 상기 R2의 말단과 대응하는 제한 엔도뉴클레아제에 의한 특이적 절단에 의해 생성된 상기 R1, R3 및 R4 중 어느 하나의 말단이 서로 식별되거나 연결되지 않는 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R3을 특이적으로 식별하는 제한 엔도뉴클레아제에 의한 특이적 절단에 의해 생성된 상기 R3의 말단과 대응하는 제한 엔도뉴클레아제에 의한 특이적 절단에 의해 생성된 상기 R1, R2 및 R4 중 어느 하나의 말단이 서로 식별되거나 연결되지 않는 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R4를 특이적으로 식별하는 제한 엔도뉴클레아제에 의한 특이적 절단에 의해 생성된 상기 R4의 말단과 대응하는 제한 엔도뉴클레아제에 의한 특이적 절단에 의해 생성된 상기 R1, R2 및 R3 중 어느 하나의 말단이 서로 식별되거나 연결되지 않는 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제한 엔도뉴클레아제는 SfiI 및 BsmBI 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 선별 대상 벡터를 세포에 도입하여, 상기 제1 선별 대상 벡터가 발현되도록 하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 선별 대상 벡터를 박테리아에 도입하여, 하나 이상의 상기 제1 선별 대상 벡터를 포함하는 파지 라이브러리를 제조하여, 상기 파지 라이브러리로부터 상기 기능성 항원 결합 단백질을 얻는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터 단편 I은 링커를 포함하고, 상기 벡터 단편 II는 디스플레이 벡터로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 핵산 단편 I은 항체 경쇄 또는 그 단편을 인코딩하고, 상기 벡터 단편 I은 상기 링커를 포함하며, 상기 기준 핵산 단편 II는 항체 중쇄 또는 그 단편을 인코딩하고, 상기 벡터 단편 II는 상기 디스플레이 벡터로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서, 상기 R1은 서열번호 1에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  16. 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R2는 서열번호 2에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  17. 제13항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R3은 서열번호 3에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  18. 제13항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R4는 서열번호 4에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  19. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터 단편 II는 링커를 포함하고, 상기 벡터 단편 I은 디스플레이 벡터로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 핵산 단편 I은 항체 중쇄 또는 그 단편을 인코딩하고, 상기 벡터 단편 I은 상기 디스플레이 벡터로부터 유래되며, 상기 기준 핵산 단편 II는 항체 경쇄 또는 그 단편을 인코딩하고, 상기 벡터 단편 II는 상기 링커를 포함하는 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  21. 제19항 또는 제20항에 있어서, 상기 R1은 서열번호 3에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  22. 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R2는 서열번호 4에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  23. 제19항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R3은 서열번호 1에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  24. 제19항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R4는 서열번호 2에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  25. 제13항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 디스플레이 벡터는 pComb3x 벡터로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  26. 제13항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커는 신호 펩타이드 pelB 또는 그 단편을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  27. 제13항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커의 길이는 약 50 내지 약 200개 염기인 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  28. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 선별 대상 벡터를 박테리아에 도입하여, 상기 박테리아로부터 제1 선별 대상 벡터의 DNA를 획득하며, 상기 제1 선별 대상 벡터의 DNA를 세포에 도입하여, 상기 세포로부터 상기 기능성 항원 특이적 결합 폴리펩타이드를 얻는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  29. 제28항에 있어서, 상기 세포는 포유동물 세포인 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  30. 제28항 또는 제29항에 있어서, 상기 벡터 단편 I 및/또는 상기 벡터 단편 II는 포유동물 세포 발현 벡터로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  31. 제28항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유동물 세포 발현 벡터는 pDGB4로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  32. 제28항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 단편 I은 항체 경쇄 또는 그 단편을 인코딩하고, 상기 기준 핵산 단편 II는 항체 중쇄 또는 그 단편을 인코딩하는 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  33. 제28항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R1은 서열번호 7에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  34. 제28항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R2는 서열번호 8에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  35. 제28항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R3은 서열번호 5에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  36. 제28항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R4는 서열번호 6에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  37. 제28항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 단편 I은 항체 중쇄 또는 그 단편을 인코딩하고, 상기 기준 핵산 단편 II는 항체 경쇄 또는 그 단편을 인코딩하는 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  38. 제37항에 있어서, 상기 R1은 서열번호 5에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  39. 제37항 또는 제38항에 있어서, 상기 R2는 서열번호 6에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  40. 제37항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R3은 서열번호 7에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  41. 제37항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R4는 서열번호 8에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  42. 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서,
    a) 제3 폴리뉴클레오타이드가 제공되며, 상기 제3 폴리뉴클레오타이드는 5' 내지 3' 방향으로 R5-핵산 단편 I'-R6을 포함하는 단계;
    b) 제4 폴리뉴클레오타이드가 제공되며, 상기 제4 폴리뉴클레오타이드는 5' 내지 3' 방향으로 R7-핵산 단편 II'-R8을 포함하고, 상기 핵산 단편 II'는 항원 결합 단백질 II'를 인코딩할 수 있으며, 상기 항원 결합 단편 II'는 상기 기준 항원 결합 단편 I과 결합되어, 기준 항원 결합 단백질이 결합할 수 있는 표적에 대한 결합력은 상기 기준 항원 결합 단백질과 상기 표적의 결합력의 30% 이상인 특성을 갖는 항원 결합 단백질을 형성할 수 있는 단계;
    c) 제3 벡터 폴리뉴클레오타이드가 제공되며, 상기 제3 벡터 폴리뉴클레오타이드는 5' 내지 3' 방향으로 R6-벡터 단편 III-R7을 포함하는 단계;
    d) 제4 벡터 폴리뉴클레오타이드가 제공되며, 상기 제4 벡터 폴리뉴클레오타이드는 5' 내지 3' 방향으로 R8-벡터 단편 IV-R5를 포함하는 단계;
    e) 상기 제3 폴리뉴클레오타이드, 상기 제4 폴리뉴클레오타이드, 상기 제3 벡터 폴리뉴클레오타이드 및 상기 제4 벡터 폴리뉴클레오타이드를 제한 엔도뉴클레아제로 절단하여, 절단된 제3 폴리뉴클레오타이드, 절단된 제4 폴리뉴클레오타이드, 절단된 제3 벡터 폴리뉴클레오타이드 및 절단된 제4 벡터 폴리뉴클레오타이드를 얻는 단계;
    f) 상기 절단된 제3 폴리뉴클레오타이드, 상기 절단된 제4 폴리뉴클레오타이드, 상기 절단된 제3 벡터 폴리뉴클레오타이드 및 상기 절단된 제4 벡터 폴리뉴클레오타이드를 혼합하여, 이들이 지향 연결되고 고리화되어 이중 치환 선별 대상 벡터를 형성하게 할 수 있는 단계;
    g) 상기 이중 치환 선별 대상 벡터가 발현되게 하며, 상기 표적에 대한 결합력은 상기 기준 항원 결합 단백질과 상기 표적의 결합력의 30% 이상인 특성을 갖는 발현 생성물을 발현할 수 있는 이중 치환 선별 대상 벡터를 이중 치환 벡터로 선택하는 단계;
    h) 상기 이중 치환 벡터로부터 상기 기능성 항원 결합 단백질을 얻는 단계를 포함하며;
    상기 R5, R6, R7 및 R8은 각각 독립적으로 상기 제한 엔도뉴클레아제 식별 사이트인 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  43. 제42항에 있어서, 상기 R5 및 R6을 특이적으로 식별하는 제한 엔도뉴클레아제를 사용하여 상기 제3 폴리뉴클레오타이드를 절단하여, 상기 절단된 제3 폴리뉴클레오타이드를 얻는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  44. 제42항 또는 제43항에 있어서, 상기 R7 및 R8을 특이적으로 식별하는 제한 엔도뉴클레아제를 사용하여 상기 제4 폴리뉴클레오타이드를 절단하여, 상기 절단된 제4 폴리뉴클레오타이드를 얻는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  45. 제42항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R6 및 R7을 특이적으로 식별하는 제한 엔도뉴클레아제를 사용하여 상기 제3 벡터 폴리뉴클레오타이드를 절단하여, 상기 절단된 제3 벡터 폴리뉴클레오타이드를 얻는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  46. 제42항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R8 및 R5를 특이적으로 식별하는 제한 엔도뉴클레아제를 사용하여 상기 제4 벡터 폴리뉴클레오타이드를 절단하여, 상기 절단된 제4 벡터 폴리뉴클레오타이드를 얻는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  47. 제42항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R5를 특이적으로 식별하는 제한 엔도뉴클레아제에 의한 특이적 절단에 의해 생성된 상기 R5의 말단과 대응하는 제한 엔도뉴클레아제에 의한 특이적 절단에 의해 생성된 상기 R6, R7 및 R8 중 어느 하나의 말단이 서로 식별되거나 연결되지 않는 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  48. 제42항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R6을 특이적으로 식별하는 제한 엔도뉴클레아제에 의한 특이적 절단에 의해 생성된 상기 R6의 말단과 대응하는 제한 엔도뉴클레아제에 의한 특이적 절단에 의해 생성된 상기 R5, R7 및 R8 중 어느 하나의 말단이 서로 식별되거나 연결되지 않는 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  49. 제42항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R7을 특이적으로 식별하는 제한 엔도뉴클레아제에 의한 특이적 절단에 의해 생성된 상기 R7의 말단과 대응하는 제한 엔도뉴클레아제에 의한 특이적 절단에 의해 생성된 상기 R5, R6 및 R8 중 어느 하나의 말단이 서로 식별되거나 연결되지 않는 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  50. 제42항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R8을 특이적으로 식별하는 제한 엔도뉴클레아제에 의한 특이적 절단에 의해 생성된 상기 R8의 말단과 대응하는 제한 엔도뉴클레아제에 의한 특이적 절단에 의해 생성된 상기 R5, R6 및 R7 중 어느 하나의 말단이 서로 식별되거나 연결되지 않는 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  51. 제42항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제한 엔도뉴클레아제는 SfiI 및 BsmBI 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  52. 제42항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이중 치환 선별 대상 벡터를 세포에 도입하여, 상기 이중 치환 선별 대상 벡터가 발현되도록 하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  53. 제42항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이중 치환 선별 대상 벡터를 박테리아에 도입하여, 하나 이상의 상기 이중 치환 선별 대상 벡터를 포함하는 파지 라이브러리를 제조하여, 상기 파지 라이브러리로부터 상기 기능성 항원 결합 단백질을 얻는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  54. 제42항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터 단편 III은 링커를 포함하고, 상기 벡터 단편 IV는 디스플레이 벡터로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  55. 제54항에 있어서, 상기 핵산 단편 I'는 항체 경쇄 또는 그 단편을 인코딩하고, 상기 벡터 단편 III은 상기 링커를 포함하며, 상기 핵산 단편 II'는 항체 중쇄 또는 그 단편을 인코딩하고, 상기 벡터 단편 IV는 상기 디스플레이 벡터로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  56. 제42항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R5는 서열번호 1에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  57. 제42항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R6은 서열번호 2에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  58. 제42항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R7은 서열번호 3에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  59. 제42항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R8은 서열번호 4에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  60. 제42항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터 단편 IV는 링커를 포함하고, 상기 벡터 단편 III은 디스플레이 벡터로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  61. 제60항에 있어서, 상기 핵산 단편 I'는 항체 중쇄 또는 그 단편을 인코딩하고, 상기 벡터 단편 III은 상기 디스플레이 벡터로부터 유래되며, 상기 핵산 단편 II'는 항체 경쇄 또는 그 단편을 인코딩하고, 상기 벡터 단편 IV는 상기 링커를 포함하는 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  62. 제60항 또는 제61항에 있어서, 상기 R5는 서열번호 3에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  63. 제60항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R6은 서열번호 4에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  64. 제60항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R7은 서열번호 1에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  65. 제60항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R8은 서열번호 2에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  66. 제54항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 디스플레이 벡터는 pComb3x 벡터로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  67. 제54항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커는 신호 펩타이드 pelB 또는 그 단편을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  68. 제54항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커의 길이는 약 50 내지 약 200개 염기인 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  69. 제42항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이중 디스플레이 선별 대상 벡터를 박테리아에 도입하고, 상기 박테리아로부터 이중 디스플레이 선별 대상 벡터의 DNA를 획득하며, 상기 이중 디스플레이 선별 대상 벡터의 DNA를 세포에 도입하여, 상기 세포로부터 상기 기능성 항원 특이적 결합 폴리펩타이드를 얻는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  70. 제69항에 있어서, 상기 세포는 포유동물 세포인 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  71. 제69항 또는 제70항에 있어서, 상기 벡터 단편 III 및/또는 상기 벡터 단편 IV는 포유동물 세포 발현 벡터로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  72. 제71에 있어서, 상기 포유동물 세포 발현 벡터는 pDGB4로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  73. 제69항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 단편 I'는 항체 경쇄 또는 그 단편을 인코딩하고, 상기 핵산 단편 II'는 항체 중쇄 또는 그 단편을 인코딩하는 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  74. 제69항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R5는 서열번호 7에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  75. 제69항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R6은 서열번호 8에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  76. 제69항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R7은 서열번호 5에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  77. 제69항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R8은 서열번호 6에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  78. 제69항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 단편 I'는 항체 중쇄 또는 그 단편을 인코딩하고, 상기 핵산 단편 II'는 항체 경쇄 또는 그 단편을 인코딩하는 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  79. 제78항에 있어서, 상기 R5는 서열번호 5에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  80. 제78항 또는 제79항에 있어서, 상기 R6은 서열번호 6에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  81. 제78항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R7은 서열번호 7에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  82. 제78항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R8은 서열번호 8에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  83. 제1항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서,
    a) 제5 폴리뉴클레오타이드가 제공되며, 상기 제5 폴리뉴클레오타이드는 5' 내지 3' 방향으로 R9-기준 핵산 단편 I-R10을 포함하는 단계;
    b) 제6 폴리뉴클레오타이드가 제공되며, 상기 제6 폴리뉴클레오타이드는 5' 내지 3' 방향으로 R11-핵산 단편 II-R12를 포함하는 단계;
    c) 제5 벡터 폴리뉴클레오타이드가 제공되며, 상기 제5 벡터 폴리뉴클레오타이드는 5' 내지 3' 방향으로 R10-벡터 단편 V-R11을 포함하는 단계;
    d) 제6 벡터 폴리뉴클레오타이드가 제공되며, 상기 제6 벡터 폴리뉴클레오타이드는 5' 내지 3' 방향으로 R12-벡터 단편 VI-R9를 포함하는 단계;
    e) 상기 제5 폴리뉴클레오타이드, 상기 제6 폴리뉴클레오타이드, 상기 제5 벡터 폴리뉴클레오타이드 및 상기 제6 벡터 폴리뉴클레오타이드를 제한 엔도뉴클레아제로 절단하여, 절단된 제5 폴리뉴클레오타이드, 절단된 제6 폴리뉴클레오타이드, 절단된 제5 벡터 폴리뉴클레오타이드 및 절단된 제6 벡터 폴리뉴클레오타이드를 얻는 단계;
    f) 상기 절단된 제5 폴리뉴클레오타이드, 상기 절단된 제6 폴리뉴클레오타이드, 상기 절단된 제5 벡터 폴리뉴클레오타이드 및 상기 절단된 제6 벡터 폴리뉴클레오타이드를 혼합하여, 이들이 지향 연결되고 고리화되어 제2 선별 대상 벡터를 형성하게 할 수 있는 단계;
    g) 상기 제2 선별 대상 벡터가 발현되게 하며, 상기 기준 항원 결합 단백질이 결합할 수 있는 표적에 대한 결합력은 상기 기준 항원 결합 단백질과 상기 표적의 결합력의 30% 이상인 특성을 갖는 발현 생성물을 발현할 수 있는 제2 선별 대상 벡터를 제2 치환 벡터로 선택하는 단계;
    h) 상기 제2 치환 벡터의 핵산 단편 II를 상기 핵산 단편 II'로 선택하는 단계를 포함하며;
    상기 R9, R10, R11 및 R12는 각각 독립적으로 제한 엔도뉴클레아제 식별 사이트인 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  84. 제83항에 있어서, 상기 R9 및 R10을 특이적으로 식별하는 제한 엔도뉴클레아제를 사용하여 상기 제5 폴리뉴클레오타이드를 절단하여, 상기 절단된 제5 폴리뉴클레오타이드를 얻는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  85. 제83항 또는 제84항에 있어서, 상기 R11 및 R12를 특이적으로 식별하는 제한 엔도뉴클레아제를 사용하여 상기 제6 폴리뉴클레오타이드를 절단하여, 상기 절단된 제6 폴리뉴클레오타이드를 얻는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  86. 제83항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R10 및 R11을 특이적으로 식별하는 제한 엔도뉴클레아제를 사용하여 상기 제5 벡터 폴리뉴클레오타이드를 절단하여, 상기 절단된 제5 벡터 폴리뉴클레오타이드를 얻는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  87. 제83항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R12 및 R9를 특이적으로 식별하는 제한 엔도뉴클레아제를 사용하여 상기 제6 벡터 폴리뉴클레오타이드를 절단하여, 상기 절단된 제6 벡터 폴리뉴클레오타이드를 얻는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  88. 제83항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R9를 특이적으로 식별하는 제한 엔도뉴클레아제에 의한 특이적 절단에 의해 생성된 상기 R9의 말단과 대응하는 제한 엔도뉴클레아제에 의한 특이적 절단에 의해 생성된 상기 R10, R11 및 R12 중 어느 하나의 말단이 서로 식별되거나 연결되지 않는 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  89. 제83항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R10을 특이적으로 식별하는 제한 엔도뉴클레아제에 의한 특이적 절단에 의해 생성된 상기 R10의 말단과 대응하는 제한 엔도뉴클레아제에 의한 특이적 절단에 의해 생성된 상기 R11, R12 및 R9 중 어느 하나의 말단이 서로 식별되거나 연결되지 않는 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  90. 제83항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R11을 특이적으로 식별하는 제한 엔도뉴클레아제에 의한 특이적 절단에 의해 생성된 상기 R11의 말단과 대응하는 제한 엔도뉴클레아제에 의한 특이적 절단에 의해 생성된 상기 R9, R10 및 R12 중 어느 하나의 말단이 서로 식별되거나 연결되지 않는 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  91. 제83항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R12를 특이적으로 식별하는 제한 엔도뉴클레아제에 의한 특이적 절단에 의해 생성된 상기 R12의 말단과 대응하는 제한 엔도뉴클레아제에 의한 특이적 절단에 의해 생성된 상기 R9, R10 및 R11 중 어느 하나의 말단이 서로 식별되거나 연결되지 않는 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  92. 제83항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제한 엔도뉴클레아제는 SfiI 및 BsmBI 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  93. 제83항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 선별 대상 벡터를 세포에 도입하여, 상기 제2 선별 대상 벡터가 발현되도록 하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  94. 제83항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 선별 대상 벡터를 박테리아에 도입하여, 하나 이상의 상기 제2 선별 대상 벡터를 포함하는 파지 라이브러리를 제조하여, 상기 파지 라이브러리로부터 상기 기능성 항원 결합 단백질을 얻는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  95. 제83항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터 단편 V는 링커를 포함하고, 상기 벡터 단편 VI은 디스플레이 벡터로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  96. 제95항에 있어서, 상기 기준 핵산 단편 I은 항체 경쇄 또는 그 단편을 인코딩하고, 상기 벡터 단편 V는 상기 링커를 포함하며, 상기 핵산 단편 II는 항체 중쇄 또는 그 단편을 인코딩하고, 상기 벡터 단편 VI은 상기 디스플레이 벡터로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  97. 제83항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R9는 서열번호 1에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  98. 제83항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R10은 서열번호 2에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  99. 제83항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R11은 서열번호 3에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  100. 제83항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R12는 서열번호 4에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  101. 제83항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터 단편 VI은 링커를 포함하고, 상기 벡터 단편 V는 디스플레이 벡터로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  102. 제101항에 있어서, 상기 기준 핵산 단편 I은 항체 중쇄 또는 그 단편을 인코딩하고, 상기 벡터 단편 V는 상기 디스플레이 벡터로부터 유래되며, 상기 핵산 단편 II는 항체 경쇄 또는 그 단편을 인코딩하고, 상기 벡터 단편 VI은 상기 링커를 포함하는 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  103. 제101항 또는 제102항에 있어서, 상기 R9는 서열번호 3에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  104. 제101항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R10은 서열번호 4에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  105. 제101항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R11은 서열번호 1에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  106. 제101항 내지 제105항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R12는 서열번호 2에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  107. 제95항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 디스플레이 벡터는 pComb3x 벡터로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  108. 제95항 내지 제107항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커는 신호 펩타이드 pelB 또는 그 단편을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  109. 제95항 내지 제108항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커의 길이는 약 50 내지 약 200개 염기인 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  110. 제83항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 선별 대상 벡터를 박테리아에 도입하여, 상기 박테리아로부터 제2 선별 대상 벡터의 DNA를 획득하며, 상기 제2 선별 대상 벡터의 DNA를 세포에 도입하여, 상기 세포로부터 상기 기능성 항원 특이적 결합 폴리펩타이드를 얻는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  111. 제110항에 있어서, 상기 세포는 포유동물 세포인 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  112. 제110항 또는 제111항에 있어서, 상기 벡터 단편 V 및/또는 상기 벡터 단편 VI은 포유동물 세포 발현 벡터로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  113. 제112에 있어서, 상기 포유동물 세포 발현 벡터는 pDGB4로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  114. 제110항 내지 제113항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기준 핵산 단편 I은 항체 경쇄 또는 그 단편을 인코딩하고, 상기 기준 핵산 단편 II는 항체 중쇄 또는 그 단편을 인코딩하는 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  115. 제110항 내지 제114항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R9는 서열번호 7에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  116. 제110항 내지 제115항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R10은 서열번호 8에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  117. 제110항 내지 제116항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R11은 서열번호 5에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  118. 제110항 내지 제117항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R12는 서열번호 6에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  119. 제110항 내지 제113항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기준 핵산 단편 I은 항체 중쇄 또는 그 단편을 인코딩하고, 상기 핵산 단편 II는 항체 경쇄 또는 그 단편을 인코딩하는 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  120. 제119항에 있어서, 상기 R9는 서열번호 5에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  121. 제119항 또는 제120항에 있어서, 상기 R10은 서열번호 6에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  122. 제119항 내지 제121항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R11은 서열번호 7에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  123. 제119항 내지 제122항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R12는 서열번호 8에 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  124. 제1항 내지 제123항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 결합 단백질은 항체 또는 항체 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  125. 제124항에 있어서, 상기 항체 단편은 scFv, Fab, Fab', (Fab)2 및/또는 (Fab')2를 포함하는 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  126. 제1항 내지 제125항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지향 연결은 리가제의 사용을 포함하는 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  127. 제126항에 있어서, 상기 리가제는 DNA 리가제인 것을 특징으로 하는 기능성 항원 결합 단백질을 선택하는 방법.
  128. 제1항 내지 제127항 중 어느 한 항의 상기 제1 치환 벡터, 제83항 내지 제127항 중 어느 한 항의 상기 제2 치환 벡터 및/또는 제42항 내지 제127항 중 어느 한 항의 상기 이중 치환 벡터가 발현되는 조건 하에서, 제1항 내지 제127항 중 어느 한 항의 상기 제1 치환 벡터, 제83항 내지 제127항 중 어느 한 항의 상기 제2 치환 벡터 및/또는 제42항 내지 제127항 중 어느 한 항의 상기 이중 치환 벡터를 발현하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 항원 결합 단백질의 제조 방법.
  129. 제1항 내지 제127항 중 어느 한 항의 상기 방법에 따라 제조된 제1 치환 벡터.
  130. 제83항 내지 제127항 중 어느 한 항의 상기 방법에 따라 제조된 제2 치환 벡터.
  131. 제42항 내지 제127항 중 어느 한 항의 상기 방법에 따라 제조된 이중 치환 벡터.
  132. 제1항 내지 제127항 중 어느 한 항의 상기 방법에 따라 제조된 기능성 항원 결합 단백질.
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