JP2022516647A - 非毒性ｃａｓ９酵素およびその用途 - Google Patents

Abstract

細胞毒性が減少した操作されたＣａｓ９酵素に関する組成物と、正常細胞および遺伝子疾患に関連する細胞の両方における内因性核酸セグメントの選択的ターゲティングおよび編集に関するその使用方法とが開示される。いくつかの場合では、リンカーペプチドにより接続されたヒトＥｘｏ１酵素または第１のその機能的断片およびＣａｓ９酵素または第２のその機能的断片を含むポリペプチドが開示される。いくつかの場合では、ポリペプチドおよびガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードするポリヌクレオチドが開示される。さらに、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドのいずれかを利用して単一遺伝子障害を処置するための方法が開示される。

Description

相互参照
本出願は、２０１９年１月７日に出願された米国仮出願第６２／７８９，３４７号；２０１９年３月２５日に出願された米国仮出願第６２／８２３，４７７号；２０１９年３月２６日に出願された米国仮出願第６２／８２４，１６４号および２０１９年５月３１日に出願された米国仮出願第６２／８５５，６１２号（これらは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）の優先権を主張する。
配列表

本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出された配列表であって、その全体が参照により本明細書に組み込まれる配列表を含有する。２０２０年１月３日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは５５１９０－７０１＿６０１＿ＳＬ．ｔｘｔという名称であり、２３６，３１７バイトのサイズである。

核酸の標的編集は、遺伝的機能を研究するための、ならびに遺伝子障害および疾患の症状を処置および改善するための非常に有望なアプローチである。最も注目すべき標的特異的遺伝子改変方法は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）およびＲＮＡガイドＤＮＡエンドヌクレアーゼＣａｓの操作および使用を伴う。非相同末端結合（ＮＨＥＪ）修復機構を介して欠失および挿入などの変異を標的核酸に導入する頻度は、治療の開発における遺伝子ターゲティングおよび編集の適用を制限する。

本開示は、本明細書に開示される特許請求の範囲に部分的に要約される。第１のベクターを複数の細胞に導入することを含む方法であって、前記第１のベクターが、エキソヌクレアーゼに融合したＣａｓ９ヌクレアーゼを含む融合タンパク質複合体をコードし；前記ベクターを含む前記複数の細胞の生存率が、Ｃａｓ９ヌクレアーゼをコードする第２のベクターを含む第２の複数の細胞の生存率の少なくとも１．５倍であり；前記第２の複数の細胞が、前記第２のベクターをトランスフェクトしたＫ５６２細胞である方法が本明細書に開示される。第１のベクターは、エキソヌクレアーゼおよびｇＲＮＡに融合したＣａｓ９をコードし得る。エキソヌクレアーゼは、ＭＲＥ１１、ＥＸＯｌ、ＥＸＯＩＩＩ、ＥＸＯＶＩＩ、ＥＸＯＴ、ＤＮＡ２、ＣｔＩＰ、ＴＲＥＸ１、ＴＲＥＸ２、Ａｐｏｌｌｏ、ＲｅｃＥ、ＲｅｃＪ、Ｔ５、Ｌｅｘｏ、ＲｅｃＢＣＤおよびＭｕｎｇｂｅａｎからなる群より選択され得る。ドナーポリヌクレオチドは、第１の複数の細胞に導入され得る。前記方法は、エキソヌクレアーゼに融合した前記Ｃａｓ９により、遺伝子の異常遺伝子座に対して編集を行うことを含み得る。ドナーポリヌクレオチドは、前記遺伝子の機能的遺伝子座をさらに含む組み込みカセットを含み得る。生存率は、レサズリンアッセイにより測定され得る。エキソヌクレアーゼはＥｘｏＩであり得る。異常遺伝子座は、ＨＢＢ遺伝子の異常遺伝子座であり得る。ドナーポリヌクレオチドは、前記ＨＢＢ遺伝子の機能的遺伝子座をコードし得る。融合タンパク質複合体は、少なくとも１つの核局在化シグナル（ＮＬＳ）をコードし得る。融合タンパク質複合体をコードする第１のベクターは、配列番号２～１８のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有し得る。第１のベクターは、エレクトロポレーションにより送達され得る。ドナーポリヌクレオチドは、切断部位のすぐ３’末端に位置する変異プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列を含み得、前記変異ＰＡＭ配列は５’－ＮＣＧ－３’または５’－ＮＧＣ－３’を含む。融合タンパク質複合体は、前記変異ＰＡＭ配列を切断することができない可能性がある。ドナーポリヌクレオチドは一本鎖ＤＮＡであり得る。ドナーポリヌクレオチドは二本鎖ＤＮＡであり得る。

第１の機能的断片と、Ｃａｓヌクレアーゼを含む第２の機能的断片と、リンカーペプチドとを含むポリペプチドであって、前記第１の機能的断片が前記リンカーペプチドの第１の末端にカップリングされ、第２の機能的断片が前記リンカーペプチドの第２の末端にカップリングされ；ならびに前記ポリペプチドおよびリボ核酸（ＲＮＡ）分子を含む第１の複合体が第１の複数の細胞に投与される場合、前記第１の複数の細胞では、減少した毒性が、Ｃａｓ９ヌクレアーゼおよび前記ＲＮＡ分子を含む第２の複合体が第２の複数の細胞に投与される場合に前記第２の複数の細胞において観察される前記毒性と比較して観察される、ポリペプチドが本明細書に開示される。第１の機能的断片はエキソヌクレアーゼを含み得、エキソヌクレアーゼは、ＭＲＥ１１、ＥＸＯｌ、ＥＸＯＩＩＩ、ＥＸＯＶＩＩ、ＥＸＯＴ、ＤＮＡ２、ＣｔＩＰ、ＴＲＥＸ１、ＴＲＥＸ２、Ａｐｏｌｌｏ、ＲｅｃＥ、ＲｅｃＪ、Ｔ５、Ｌｅｘｏ、ＲｅｃＢＣＤおよびＭｕｎｇｂｅａｎからなる群より選択される。ＲＮＡ分子はガイドＲＮＡであり得る。エキソヌクレアーゼはヒトＥｘｏ１酵素であり得る。ヒトＥｘｏ１酵素のＮ末端は、前記Ｃａｓヌクレアーゼの前記Ｃ末端にカップリングした前記リンカーの前記Ｃ末端にカップリングされ得る。ヒトＥｘｏ１酵素は配列番号１を含み得る。ヒトＥｘｏ１酵素は、配列番号１の８０％の配列同一性を有する断片を含み得る。ヒトＥｘｏ１酵素は、配列番号１の９０％の配列同一性を有する断片を含み得る。ヒトＥｘｏ１酵素は、配列番号１の９５％の配列同一性を有する断片を含み得る。第２の機能的断片はＣａｓ９酵素を含み得る。Ｃａｓ９酵素は、Ｎ末端核局在化配列（ＮＬＳ）およびＣ末端ＮＬＳを含み得る。Ｃａｓ９酵素はＮ末端核局在化配列（ＮＬＳ）を含み得る。Ｃａｓ９酵素はＣ末端核局在化配列（ＮＬＳ）を含み得る。リンカーペプチドは、ＦＬ２Ｘ、ＳＬＡ２Ｘ、ＡＰ５Ｘ、ＦＬ１Ｘ、ＳＬＡ１Ｘからなる群より選択され得る。リンカーペプチドはＳＬＡ２Ｘであり得る。ペプチドは、５～２００個のアミノ酸を含み得る。減少した毒性は、レゾルフィン蓄積を測定することにより定量され得る。前記第１の複合体の投与後、第１の複数の細胞は、前記第２の複合体の投与後の前記第２の複数の細胞と比較して少なくとも２倍の数の生細胞を有し得、生細胞の数は、レゾルフィンアッセイにより定量される。第１の複合体の投与後、細胞ＨＤＲアッセイにより定量した場合に、第１の複数の細胞は、第２の複合体の投与後の第２の複数の細胞と比較して少なくとも２倍の量のＨＤＲ編集細胞を有する。細胞ＨＤＲアッセイは、ＩＨＣ、ｑＰＣＲまたはディープシークエンシングを含み得る。

前述のポリペプチドおよびＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチドが本明細書に開示される。リンカーペプチドの第１の末端は３’末端であり得、リンカーペプチドの第２の末端は５’末端であり得る。前記リンカーペプチドの第１の末端は５’末端であり得、前記リンカーペプチドの第２の末端は３’末端であり得る。ＲＮＡ分子はガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）であり得る。ポリヌクレオチドは相同組換え修復（ＨＤＲ）テンプレートを含み得る。ｇＲＮＡは、表２に掲載されている配列から選択され得る。ＨＤＲテンプレートは一本鎖ＤＮＡであり得る。ＨＤＲテンプレートは二本鎖ＤＮＡであり得る。ポリヌクレオチドはリポソーム中に製剤化され得る。リポソームは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、細胞透過性ペプチド、リガンド、アプタマー、抗体またはそれらの組み合わせを含み得る。

前述のポリペプチドのヌクレオチド配列を含むベクターが本明細書に開示される。ベクターはプロモーターを含み得る。プロモーターは、ＣＭＶまたはＣＡＧプロモーターであり得る。ベクターは、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクターからなる群より選択され得る。ベクターはアデノ随伴ウイルスベクターであり得る。前述のベクターを含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）が本明細書に開示される。適合医薬賦形剤中に製剤化された前述のポリペプチドと、投与指示付き挿入物（ｉｎｓｅｒｔ ｗｉｔｈ ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｉｎｇ ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）と、試薬とを含むキットが本明細書に開示される。

適合医薬賦形剤中に製剤化された前述のポリヌクレオチドと、投与指示付き挿入物と、試薬とを含むキットが本明細書に開示される。

適合医薬賦形剤中に製剤化された前述のベクターと、投与指示付き挿入物と、試薬とを含むキットが本明細書に開示される。

細胞においてＤＮＡの相同組換えを誘導するための方法であって、ＤＮＡを前述のポリペプチドと接触させることを含む方法が本明細書に開示される。

インビトロまたはエクスビボで細胞においてＨＤＲを誘導するための方法であって、前述のポリヌクレオチドを細胞に送達することを含む方法が本明細書に開示される。細胞は、ヒト細胞、非ヒト哺乳動物細胞、幹細胞、非哺乳動物細胞、無脊椎動物細胞、植物細胞または単一の真核生物であり得る。

第１の複数の細胞を前述のポリヌクレオチドと接触させ、第２の複数の細胞を、野生型Ｃａｓ９酵素をコードする第２のポリヌクレオチドと接触させること；ならびに前記第１の複数の細胞および前記第２の複数の細胞において、目的の遺伝子座で部位特異的切断を誘導し、続いてＨＤＲを誘導すること；ならびに前記第１の複数の細胞において、前記第２の複数の細胞と比較して少なくとも３０～９０％多くの細胞を回収することを含む方法が本明細書に開示される。前記方法は、前記第１の複数の細胞および前記第２の複数の細胞において産生されたレゾルフィンの量を測定することにより、細胞生存率を測定することをさらに含み得る。第１の複数の細胞は、レゾルフィンアッセイにより定量した場合に、第２の複数の細胞と比較して２～５倍の量の生細胞を有し得る。第１の複数の細胞および第２の複数の細胞は、ヒト細胞、非ヒト哺乳動物細胞、幹細胞、非哺乳動物細胞、無脊椎動物細胞、植物細胞または単一の真核生物を含み得る。ヒト細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、好中球、好酸球、好塩基球、マスト細胞、造血前駆細胞、造血幹細胞（ＨＳＣ）、赤血球、血液幹細胞、内胚葉幹細胞、内胚葉前駆細胞、内胚葉前駆体細胞、分化内胚葉細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、間葉系前駆細胞、間葉系前駆体細胞または分化間葉系細胞であり得る。分化内胚葉細胞は、肝細胞前駆細胞、膵臓前駆細胞、肺前駆細胞または気管前駆細胞であり得る。分化間葉系細胞は、骨細胞、軟骨細胞、筋細胞、脂肪細胞、間質細胞、線維芽細胞または真皮細胞であり得る。

被験体における単一遺伝子障害を処置するための方法であって、前記被験体から得られた複数の初代細胞を培養すること；前述のポリヌクレオチドを複数の初代細胞に投与すること（ここで、前記ｇＲＮＡは、前記障害を引き起こす前記遺伝子の遺伝子座を認識するように構成され、前記ＨＤＲテンプレートは、前記遺伝子の機能配列を提供するように構成される）；および前記遺伝子座で部位特異的切断を誘導し、続いてＨＤＲを誘導すること（ここで、前記遺伝子の前記機能配列は前記遺伝子座に挿入される）を含む方法が本明細書に開示される。前記方法は、遺伝子の前記機能配列が遺伝子座に挿入された初代細胞を選択すること；および選択した初代細胞を前記被験体に再導入することをさらに含み得る。被験体は哺乳動物であり得る。哺乳動物はヒトであり得る。複数の初代細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、好中球、好酸球、好塩基球、マスト細胞、造血前駆細胞、造血幹細胞（ＨＳＣ）、赤血球、血液幹細胞、内胚葉幹細胞、内胚葉前駆細胞、内胚葉前駆体細胞、分化内胚葉細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、間葉系前駆細胞、間葉系前駆体細胞、分化間葉系細胞、肝細胞前駆細胞、膵臓前駆細胞、肺前駆細胞、気管前駆細胞、骨細胞、軟骨細胞、筋細胞、脂肪細胞、間質細胞、線維芽細胞および真皮細胞を含む群より選択され得る。前記単一遺伝子障害を引き起こす遺伝子は、表３から選択され得る。

被験体における異常ＨＢＢ遺伝子により引き起こされる鎌状赤血球貧血を処置するための方法であって、前記被験体から得られた複数の初代細胞を培養すること；前述のポリヌクレオチドを前記複数の初代細胞に投与すること（ここで、前記ｇＲＮＡは、前記障害を引き起こす前記ＨＢＢ遺伝子の遺伝子座を認識するように構成され、前記ＨＤＲテンプレートは、前記ＨＢＢ遺伝子の機能配列を提供するように構成される）；および前記遺伝子座で部位特異的切断を誘導し、続いてＨＤＲを誘導すること（ここで、前記ＨＢＢ遺伝子の前記機能配列は前記遺伝子座に挿入される）を含む方法が本明細書に開示される。前記方法は、前記ＨＢＢ遺伝子の前記機能配列が前記遺伝子座に挿入された初代細胞を選択すること；および前記選択した初代細胞を前記被験体に再導入することをさらに含み得る。被験体は哺乳動物であり得る。哺乳動物はヒトであり得る。初代細胞は造血幹細胞であり得る。初代細胞はＣＤ３４＋造血幹細胞であり得る。初代細胞はＣＤ３４＋造血幹細胞であり得る。ベクターはプラスミドＰＸ３３０を含み得る。細胞はＣＤ３４＋造血幹細胞であり得る。

被験体における異常ＨＢＢ遺伝子により引き起こされる鎌状赤血球貧血を処置するための方法であって、前記被験体から得られた複数の初代細胞を培養すること；前述のポリヌクレオチドを前記複数の初代細胞に投与すること（ここで、前記ｇＲＮＡは、前記障害を引き起こす前記ＨＢＢ遺伝子の遺伝子座を認識するように構成され、前記ＨＤＲテンプレートは、前記ＨＢＢ遺伝子の機能配列を提供するように構成される）；および前記遺伝子座で部位特異的切断を誘導し、続いてＨＤＲを誘導すること（ここで、前記ＨＢＢ遺伝子の前記機能配列は前記遺伝子座に挿入される）を含む方法が本明細書に開示される。前記方法は、ＨＢＢ遺伝子の機能配列が遺伝子座に挿入された初代細胞を選択すること；および選択した初代細胞を被験体に再導入することをさらに含み得る。被験体は哺乳動物であり得る。哺乳動物はヒトであり得る。初代細胞はＣＤ３４＋造血幹細胞であり得る。

第１の複数の細胞を、前述の前記ポリヌクレオチドおよびＲＮＡ分子を含む第１の複合体と接触させること；前記第１の複数の細胞において部位特異的切断を誘導し、続いてＨＤＲを誘導することを含む方法であって、細胞ＨＤＲアッセイにより定量された、前記第１の複数の細胞のうちのＨＤＲにより編集された細胞のパーセンテージが、第２の複数の細胞のうちの野生型Ｃａｓ９酵素および前記ＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチドを含む第２の複合体と接触された細胞のパーセンテージと比較して少なくとも２倍高い方法が本明細書に開示される。細胞ＨＤＲアッセイはＩＨＣを含み得る。細胞ＨＤＲアッセイはｑＰＣＲを含み得る。細胞ＨＤＲアッセイは核酸シークエンシングを含み得る。
参照による援用

本明細書で言及されるすべての刊行物、特許および特許出願は、個々の各刊行物、特許または特許出願が参照により組み込まれることが具体的かつ個々に示されている場合と同程度に参照により本明細書に組み込まれる。

特許または出願ファイルは、カラーで実行された少なくとも１つの図面を含有する。この特許または特許出願公報とカラー図面（複数可）のコピーは、要求および必要な料金の支払いに応じて米国特許商標庁から提供される。

本開示の特徴および利点のいくらかの理解は、本開示の原理が利用される例示的な実施形態を説明する以下の詳細な説明およびその添付の図面を参照することにより得られる：

図１は、異なるリンカーを介して互いに連結されたｈＥｘｏ１酵素およびＣａｓ９酵素を含む融合タンパク質の実施形態を示す。

図２は、目的の標的部位およびＨＤＲテンプレートの実施形態を示す。

図３は、レサズリン還元アッセイを行う実施形態を示す。１～８列目は、それぞれ図１に記載されているＣａｓ９－ＨＲ融合タンパク質１～８に対応する。

図４は、ピューロマイシン選択前の、ＲＮＰプラスミド、ＧＦＰプラスミドおよび対照プラスミドをトランスフェクトした細胞のレゾルフィン蛍光の正規化変化倍率を示す。

図５は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）またはピフィスリン－α（ＰＦＴ－α）のいずれかで処理した野生型Ｃａｓ９酵素プラスミドをトランスフェクトした細胞のレゾルフィン蛍光の正規化変化倍率を示す。

図６Ａは、ＨＢＢ遺伝子のエクソン１を標的とするように設計された３つのｇＲＮＡ配列（Ｇ１、Ｇ２およびＧ３；それぞれ配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３）を有する目的の標的部位の実施形態を示す。

図６Ｂは、ＨＢＢ遺伝子のエクソン１を標的とするように設計された３つのｇＲＮＡ配列（Ｇ１、Ｇ２およびＧ３；それぞれ配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３）を有するＲＮＰプラスミドをトランスフェクトした細胞のレゾルフィン蛍光の正規化変化倍率を示す。

図６Ｃは、Ｃａｓ９ ＨＢＢ－Ｇ３逆サンガー配列トレース（配列番号１６１）を示す。

図７は、レサズリン還元アッセイを行う実施形態を示す。１～９列目は、それぞれ図１に記載されている融合タンパク質のＣａｓ９－ＨＲ融合タンパク質１～９に対応する。

図８は、異なるｇＲＮＡ配列を有するＲＮＰプラスミドと、ＧＦＰプラスミドと、対照細胞に対する２つの異なる対照プラスミドとをトランスフェクトした細胞のレゾルフィン蛍光の正規化変化倍率を示す。

図９Ａ～Ｂは、ＲＮＰプラスミドをトランスフェクトした細胞のレゾルフィン蛍光の正規化変化倍率を示す。図９Ａは、ＨＢＢ遺伝子のエクソン１を標的とするＧ２（配列番号２２）およびＧ３（配列番号２３）ｇＲＮＡを示す。図９Ｂは、第７の融合タンパク質（図１）およびＧ３ ｇＲＮＡを有するＲＮＰプラスミドが、未改変Ｃａｓ９およびＧ２ ｇＲＮＡを有するＲＮＰプラスミドと比較して低い細胞毒性を有することを示す。

図１０は、ＨＢＢ遺伝子のエクソン１を標的とする異なるＲＮＰプラスミドをトランスフェクトした細胞のレゾルフィン蛍光の正規化変化倍率を示す。

図１１Ａは、哺乳動物Ｃａｓ９発現のための構成的プロモーターを含有するプラスミドＰＸ３３０と、Ｕ６プロモーター駆動ｇＲＮＡ発現の図である。

図１１Ｂは、細胞を播種して２日間の成長後に細胞毒性を定量する実験設定の例である。

図１１Ｃは、図１１Ｂの実験設定に示されているＡ５４９細胞における細胞毒性の減少を示すグラフ、およびグラフ上に示されている１２番染色体上の遺伝子間領域を標的とするｇＲＮＡの図である。

図１１Ｄは、アルファ－ピフィスリン（１０マイクロモル濃度）による処理が、Ａ５４９細胞におけるＣａｓ９誘導細胞毒性を減少させることを示すグラフである。

図１２Ａは、ピューロマイシン耐性修復テンプレート（ＲＴ）の図である。

図１２Ｂは、Ａ５４９細胞におけるｈＥｘｏ－Ｃａｓ９融合物のＨＤＲおよびＩＮＤＥＬ率を定量するために使用した方法を示す。

図１２Ｃは、レサズリンアッセイを介して試験した様々な構築物の毒性を示すグラフである。

図１２Ｄは、レサズリンアッセイの方法を示す。

図１２Ｅは、Ｐｕｒｏ－ＲＴにより成功裏に組み込まれた細胞のゲノム領域の描写である。

図１２Ｆは、３日間のピューロマイシン処理後の、Ｇ２またはＧ３ ＲＮＡと共にＣａｓ９－ＨＲ８（８）またはＣａｓ９（ＮＴ）のいずれかをトランスフェクトしたＫ５６２細胞の生存のグラフである。

図１２Ｇは、図１２Ｅに示されているプライマーの増幅産物のアガロースゲルであり、ゲノム中におけるｇＲＮＡ Ｇ２またはＧ３と共にＣａｓ９－ＨＲ８（図１の融合タンパク質８）およびＣａｓ９（ＮＴ）を使用した修復テンプレートの安定組み込みを示す。

図１３Ａは、ヒトヘモグロビンベータ（ＨＢＢ）遺伝子を編集することを目的としたＨＢＢの最初の２つのエクソンを含むゲノム領域、およびＡ５４９細胞におけるＨＢＢ ｇＲＮＡガイドの毒性スクリーニングからのデータを示すグラフを示す。

図１３Ｂは、ＨＢＢ－Ｇ３処理Ａ５４９細胞におけるＨＢＢゲノム領域（配列番号１６１）のサンガーシークエンシングを示す。

図１３Ｃは、野生型ＨＢＢ配列（配列番号１６２）およびＳＳＲＴ－Ｇ３配列（配列番号１６３）（これは、鎌状赤血球（Ｅ６Ｖ）と、ＥｃｏＲＩ部位をもたらすミスセンス変異と、４つのサイレントミスマッチ変異（一本鎖修復テンプレートＳＳＲＴＧ３上の太字のヌクレオチドａ、ａ、ａおよびｇ）とを導入する）の図であり、ＨＢＢ－Ｇ３ ｇＲＮＡは、上からバーにより強調されている。変異は、修復の成功によりｇＲＮＡ結合を防止するように設計されている

図１３Ｄは、Ｃａｓ９＋ＳＳＲＴ－Ｇ３、Ｃａｓ９－ＨＲ１～９＋ＳＳＲＴ－Ｇ３またはＳＳＲＴ－Ｇ３のみをＫ５６２細胞またはＡ５４９細胞にエレクトロポレーションするＨＢＢ編集実験を示す。

図１４は、図１に示されているように、ＨＢＢ－Ｇ３ ｇＲＮＡならびにＣａｓ９－ＨＲ融合タンパク質４および５をＡ５４９細胞にトランスフェクトすることにより決定した場合の、２つのトランスフェクション方法（リポフェクタミンおよびリン酸カルシウム（ＣａｌＰｈｏｓ））の毒性評価を示す。

図１５は、図１３ＡのＨＢＢ修復テンプレートをＡ５４９細胞にトランスフェクトすることによる毒性評価を示す。トランスフェクション後２日目に、レサズリンレベルを測定する。

図１６Ａは、ＨＢＢ修復テンプレートをＫ５６２細胞のゲノムに組み込んだ図１のＣａｓ９－ＨＲ融合タンパク質８のＥｃｏＲＩ消化アッセイのアガロースゲルを示す。矢印はＥｃｏＲＩ消化産物を示す。Ｃａｓ９のみ（ＮＴ）、ＳＳＲＴおよびＣｏｎ（Ｃａｓ９なし）のレーンでは、ＥｃｏＲＩ消化産物はない。

図１６Ｂは、ＨＢＢ修復テンプレートをＫ５６２細胞のゲノムに組み込んだ図１のＣａｓ９－ＨＲ融合タンパク質４、５、６、７および８のＥｃｏＲＩ消化アッセイのアガロースゲルを示す。矢印はＥｃｏＲＩ消化産物を示す。ＮＴおよびＣｏｎレーンでは、ＥｃｏＲＩ消化産物はない。

図１６Ｃは、図１のＣａｓ９－ＨＲ融合タンパク質４、５、６、７および８、Ｃａｓ９のみ（ＮＴ）ならびにＣｏｎ（Ｃａｓ９なし）のウエスタンブロッティングを示す。矢印は、Ｃａｓ９－ＨＲ融合タンパク質およびＮＴレーンにおけるＣａｓ９の検出を示す。

図１６Ｄは、Ｃａｓ９－ＨＲ３の大腸菌における発現および精製の成功を示す。比較を助けるために、Ｃａｓ９の発現および精製の成功（レーン８～１４）も示されている。

図１６Ｅは、図１６Ｃと同じトランスフェクト細胞の免疫組織化学（ＩＨＣ）を示す。矢印は、Ｃａｓ９－ＨＲ融合物およびＣａｓ９が細胞の核に局在することを示す。

図１７Ａは、完全Ｈ２Ｂノックイン実験のための構築物を示す。

図１７Ｂは、上皮肺がん細胞株において図１のＣａｓ－ＨＲ融合タンパク質４、５、６および８、Ｃａｓ９のみ（ＮＴ）ならびにＣｏｎ（Ｃａｓ９なし）により誘導される細胞毒性のｐ５３依存的減少を示す。Ａ５４９細胞はｐ５３活性について陽性であり、Ｈ１２９９細胞はｐ５３活性について陰性である。正規化レサズリンレベル（ｙ軸）により決定した毒性は、Ｈ１２９９細胞におけるｐ５３の欠如がより低い細胞毒性をもたらすことを示す。

図１７Ｃは、図１７Ａに図示されているように、Ｋ５６２細胞におけるＨ２ＢのＧＦＰタグ付けの成功の評価を示す。矢印は、核におけるＧＦＰの検出により示されているように、ＧＦＰによるＨ２Ｂのタグ付けの成功を示す。

図１８Ａは、Ｃａｓ９のみのモデルとＣａｓ９－ＨＲモデルとの間のスキーマの差を示す。エキソヌクレアーゼドメインの存在は、予測インビトロ切断パターンを根本的に変化させる。Ｅｘｏ１は、非リン酸化５’末端と対比してリン酸化５’末端に対する有意な選好性を有する。したがって、ＰＣＲ産物または５’－リン酸化末端を欠く他のＤＮＡ片を使用する場合、Ｃａｓ９を介したエンドヌクレアーゼ切断が最初に優先し得るのに対して、切断後、２つの断片はそれぞれ、ｈＥｘｏ１を介した急速な分解をもたらす５’－リン酸化末端を有し得ると予想され得る。

図１８Ｂは、図１８Ａに基づく例示的な消化パターンを示す。Ｃａｓ９－ＨＲ３＋ｇＲＮＡおよびＣａｓ９－ＨＲ３のみが、インビトロヌクレアーゼ活性の成功を実証する消化産物を産生し得る。加えて、ｈＥｘｏ１はリン酸化５’末端を強く好むが、ｈＥｘｏ１は依然として非リン酸化５’末端に結合してそれを切除し得るので、ｇＲＮＡなしの分解量はＣａｓ９と比較して少ない。

図１８Ｃは、図１８Ａおよび図１８Ｂの実際のアガロースの例を示す。レーン１および２は、ＨＢＢ－Ｇ１またはＨＢＢ－Ｇ３のいずれかを標的とするＣａｓ９－ＨＲ３を示し、レーン３および４は、ＨＢＢ－Ｇ１またはＨＢＢ－Ｇ３のいずれかを標的とするＣａｓ９（ＮＴ）を示し、レーン５は未処理ＤＮＡである。

図１８Ｄは、図１８Ｃと同様の実験を示し、タンパク質安定性を比較するために、酵素を４℃で２週間放置した後に実験を行うことのみが異なる。レーン１は、Ｃａｓ９－ＨＲ３およびｇＲＮＡ ＨＢＢ－Ｇ１の組み合わせからの消化パターンである。レーン２は、Ｃａｓ９およびｇＲＮＡ ＨＢＢ－Ｇ１の組み合わせからの消化パターンである。レーン３は、Ｃａｓ９－ＨＲ３およびＨＢＢ－Ｇ３の組み合わせからの消化パターンである。レーン４は、Ｃａｓ９およびＨＢＢ－Ｇ３の組み合わせからの消化パターンである。レーン５は、Ｃａｓ９－ＨＲのみからの消化パターンである。レーン６は、Ｃａｓ９のみからの消化パターンである。レーン７は対照であり、Ｃａｓ９もｇＲＮＡもない。

図１９Ａ～Ｇは、Ｃａｓ９－ＨＲ４、Ｃａｓ９－ＨＲ８、Ｃａｓ９のみ（ＮＴ）およびＣａｓ９なしの対照（Ｃｏｎ）を介したＨ２ＢｍＮｅｏｎ融合物のゲノム組み込みの誘導を示す。図１９Ａは、Ｈ２Ｂ組み込み検出プライマーの設計を示す。２セットのプライマーは、修復テンプレートの５’および３’末端の外側に結合して、ＲＴではなくゲノムにのみ存在する配列にアニーリングするように設計されているが、他のものは、修復テンプレートに特異的な配列にアニールし、かつ未改変細胞に存在しない。図１９Ｂは、５’プライマーにより増幅されたＰＣＲ産物を示すアガロースゲルを示し、ＧＦＰによる内因性Ｈ２Ｂのタグ付けの成功を示す。図１９Ｃは、３’プライマーにより増幅されたＰＣＲ産物を示すアガロースゲルを示し、ＧＦＰによる内因性Ｈ２Ｂのタグ付けの成功を示す。図１９Ｄは、５’プライマーにより増幅されたＰＣＲ産物のサンガーシークエンシングからの配列トレースの吸光度を示す。図は、出現順にそれぞれ配列番号１６４～１６５を開示する。図１９Ｅは、３’プライマーにより増幅されたＰＣＲ産物のサンガーシークエンシングからの配列トレースの吸光度を示す。図は、出現順にそれぞれ配列番号１６６～１６７を開示する。図１９Ｆは、５’プライマーにより増幅されたＰＣＲ産物のシークエンシングアラインメントを示し、出現順にそれぞれ配列番号１５５、１５４、１５３および１６０を開示する。図１９Ｇは、３’プライマーにより増幅されたＰＣＲ産物のシークエンシングアラインメントを示し、出現順にそれぞれ配列番号１５８、１５７、１５６および１５９を開示する。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。

図２０は、拡張機能を有するさらなるＣａｓ９－ＨＲ融合タンパク質の設計を示す。 同上。

ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート）／Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）システムに関する簡単な説明が含まれる。細菌および古細菌において最初に発見されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素システムは、ウイルス感染に対する免疫防御である。ウイルス感染中、ウイルスＤＮＡのセグメントはＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に組み込まれる。組み込まれたウイルスＤＮＡのこれらのセグメントは、ウイルスゲノムに連続的に相補的なガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）に転写される。ｇＲＮＡは、Ｃａｓ酵素をｇＲＮＡが標的とするウイルスゲノムに誘導し、そこで、Ｃａｓタンパク質はウイルスゲノムを切断し、ウイルス感染から防御する。

ＣＲＩＳＰＲシステムは、典型的には、標的ＤＮＡ配列に特異的なｇＲＮＡおよび非特異的Ｃａｓ９タンパク質を含む。一般に、ｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）および転写活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）の２つの異なるセグメントを含む。ｃｒＲＮＡは標的ＤＮＡ配列に相補的であるので、切断すべき配列を認識する。そして、ｔｒａｃｒＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ－Ｃａｓ９相互作用のための足場として機能する。ガイドＲＮＡは二重鎖分子を自然に形成し、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ断片は互いにアニーリングされる。Ｃａｓタンパク質は、部位特異的二本鎖切断（ＤＳＢ）を生成することにより、遺伝子編集のためのツールとして調査および操作されている。カスタム設計ｇＲＮＡは、ｇＲＮＡの配列に相補的な任意の核酸遺伝子座でＤＳＢを生成するようにＣａｓタンパク質に指示する。Ｃａｓタンパク質は、真核細胞においてヌクレオチド変化、欠失、挿入および置換を成功裏に導入することが示されている。

核酸を編集するためのＣＲＩＳＰＲおよびＣａｓ９タンパク質の使用は、細胞の内因性修復機構により制限される。ＤＳＢは、ＮＨＥＪにより優先的に修復される。ＮＨＥＪに関連する修復部位における非意図的な挿入および欠失は、遺伝子治療の開発を望ましくないものにする。あるいは、長い（＜２００ｂｐ）３’オーバーハングが生成されるように生成ＤＳＢが切除される場合、内因性修復経路はＨＲの使用を強制される。１～１０００ｂｐのＤＮＡの任意の場所のエラー無しの標的化挿入および欠失は、所望の挿入または欠失に隣接する相同アームを含むポリヌクレオチド（テンプレート配列）の追加により達成され得る。

相同組換え修復はエラーがなく、所定のゲノム中の特定のＤＮＡ配列を挿入または欠失する能力をもたらす。

さらに、ＨＤＲは、ＣＲＩＳＰＲおよびＣａｓ９酵素システムにより導入されたＤＳＢにより引き起こされる細胞毒性を減少させる。ｐ５３機能の阻害または喪失は、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）および不死化網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞の両方において細胞毒性を大幅に減少させるので、細胞毒性はｐ５３腫瘍抑制経路に依存する。ｐ５３機能性の永久的な喪失は、ゲノムの不安定性、細胞恒常性の変化、およびインビボにおけるがんの発生率の増加を含む細胞に対する深刻な影響を有するので、１つの解決策は、小分子またはドミナントネガティブ阻害剤の過剰発現のいずれかによるｐ５３の一過性阻害である。しかしながら、インビボにおけるｐ５３の一過性阻害は困難であり、望ましくない副作用を生じさせ得る。したがって、非毒性Ｃａｓ９酵素の生成がインビボ用途にとって望ましい。

正常細胞、および細胞毒性の減少を伴う遺伝子疾患に関連する細胞の両方における内因性核酸セグメントの選択的ターゲティングおよび編集に関連する組成物および方法が本明細書に開示される。標的化内因性核酸は、ＨＤＲを介して切断、消化および編集される。ｇＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質部分およびヒトＥｘｏ１酵素から構成されるタンパク質融合複合体を特定の内因性核酸セグメントに誘導し、そこで、タンパク質融合複合体は切断および消化を導入し、標的化内因性核酸セグメント上に３’または５’オーバーハングが残る。標的とされ消化された内因性核酸セグメントとしてある程度の配列相同性を共有するポリヌクレオチド断片が細胞にさらに提示されると、オーバーハングはＨＤＲ率の増加を可能にする。

標的化内因性核酸が公知の疾患遺伝子座に位置する組成物が本明細書に開示される。公知の標的疾患遺伝子座は、ＨＤＲを介して切断、消化および編集される。ｇＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質部分およびヒトＥｘｏ１酵素を含むタンパク質融合複合体を特定の公知の疾患遺伝子座に誘導し、そこで、タンパク質融合複合体は切断および消化を導入し、標的化内因性核酸セグメント上に３’または５’オーバーハングが残る。標的とされ消化された内因性核酸セグメントとしてある程度の配列相同性を共有するポリヌクレオチド断片が細胞にさらに提示されると、オーバーハングはＨＤＲ率の増加を可能にする。
融合タンパク質組成物

本明細書に開示される組成物および方法のいくつかの態様は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムにおける未改変のプログラム可能なエンドヌクレアーゼ、例えばＣａｓ９酵素のものと比べて細胞毒性を減少させるために、エキソヌクレアーゼ、例えばヒトＥｘｏ１エキソヌクレアーゼまたは他のエキソヌクレアーゼ、例えばＭＲＥ１１、ＥＸＯｌ、ＥＸＯＩＩＩ、ＥＸＯＶＩＩ、ＥＸＯＴ、ＤＮＡ２、ＣｔＩＰ、ＴＲＥＸ１、ＴＲＥＸ２、Ａｐｏｌｌｏ、ＲｅｃＥ、ＲｅｃＪ、Ｔ５、Ｌｅｘｏ、ＲｅｃＢＣＤおよびＭｕｎｇｂｅａｎの断片にカップリングしたプログラム可能なエンドヌクレアーゼ、例えばＣａｓ９または他のＣＲＩＳＰＲ関連プログラム可能なエンドヌクレアーゼを含む少なくとも１つの改変ポリペプチドを伴う。
Ｃａｓ９タンパク質

ポリペプチド（融合タンパク質）は、ペプチジルリンカーにより共有結合的に接続されたプログラム可能なエンドヌクレアーゼ、例えばＣａｓ９、他のＣＲＩＳＰＲ関連のプログラム可能なエンドヌクレアーゼ、他の部位特異的エンドヌクレアーゼまたはそれらの断片およびエキソヌクレアーゼ、例えばヒトＥｘｏ１エキソヌクレアーゼまたはその断片を含む。本明細書で使用される場合、「Ｃａｓ９」、「Ｃａｓ９ドメイン」または「Ｃａｓ９断片」は、Ｃａｓ９タンパク質またはその断片、例えばＣａｓ９の活性ＤＮＡ切断ドメインを含むタンパク質を含むＲＮＡガイドヌクレアーゼを指す。Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、ｃａｓｎ１ヌクレアーゼまたはＣＲＩＳＰＲ（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート）関連ヌクレアーゼと称されることもある。Ｃａｓ９ヌクレアーゼ配列および構造は当業者に周知である。Ｃａｓ９オルソログは、限定されないが、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓおよびＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓを含む様々な種で説明されている。野生型（未改変）Ｃａｓ９は、以下の表１に掲載されている配列のいずれかに由来し得る。表１に掲載されているＣａｓ９タンパク質配列は、限定的であることを意味しない。さらなる適切なＣａｓ９ヌクレアーゼおよびタンパク質配列は当業者には明らかである。
表１．様々なＣａｓ９のペプチド配列。

さらに、いくつかの実施形態では、ＤＮＡ切断機能を保持するＣａｓ９または他のプログラム可能なヌクレアーゼの断片は、融合タンパク質を生成するために使用され得る。例えば、Ｃａｓ９または他のプログラム可能なヌクレアーゼポリペプチド断片は、野生型Ｃａｓ９と少なくとも約７０％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９６％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一、少なくとも約９９％同一、少なくとも約９９．５％同一または少なくとも約９９．９％同一である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９断片は、野生型Ｃａｓ９と比較して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２１、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０個またはそれを超えるアミノ酸変化を有し得る。

本明細書に開示されるＣａｓ９酵素または他のプログラム可能なヌクレアーゼはまた、少なくとも１つの核局在化シグナル（ＮＬＳ）（これは、核輸送による細胞核へのインポートのためにタンパク質に結合するアミノ酸配列である）を含む。一般に、ＮＬＳは、タンパク質表面に露出した正荷電リジンまたはアルギニンの１つまたはそれを超える短い配列を含む。これらのタイプの古典的なＮＬＳは、単節型または双節型のいずれかにさらに分類され得る。２つの間の主な構造的差異は、双節型ＮＬＳ中の２つの塩基性アミノ酸クラスターは比較的短いスペーサー配列により分離されるが（したがって双節型－２部）、単節型ＮＬＳはそうではないことである。いくつかの実施形態では、ＮＬＳは、「ＳＶ４０ラージＴ抗原」の配列ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号１９）（単節型ＮＬＳ）を含む。他の実施形態では、ヌクレオプラスミンのＮＬＳは、配列ＫＲ［ＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡ］ＫＫＫＫ（配列番号２０）を含む。多くの他のタイプの非古典的なＮＬＳもある。本明細書に開示される異なるタイプのＮＬＳは限定的であることを意味するものではなく、当業者は、ＮＬＳを選択してＣａｓ９タンパク質に結合させることができる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質はＮ末端ＮＬＳを含む。他の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質はＣ末端ＮＬＳを含む。さらに他の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｎ末端およびＣ末端ＮＬＳの両方を含む。

いくつかの実施形態では、他のＣＲＩＳＰＲ関連のプログラム可能なエンドヌクレアーゼは、多くの場合、クラス１ Ｃａｓポリペプチド、クラス２ Ｃａｓポリペプチド、タイプＩ Ｃａｓポリペプチド、タイプＩＩ Ｃａｓポリペプチド、タイプＩＩＩ Ｃａｓポリペプチド、タイプＩＶ Ｃａｓポリペプチド、タイプＶ ＣａｓポリペプチドおよびタイプＶＩ ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ポリペプチド、ＣＲＩＳＰＲ関連ＲＮＡ結合タンパク質を含むＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ポリペプチドもしくはＣａｓヌクレアーゼまたはそれらの機能的断片を含む。さらに、本開示による使用に適切なＣａｓポリペプチドは、多くの場合、Ｃｐｆ１（またはＣａｓ１２ａ）、ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２（またはＣａｓ１３ａ）、Ｃａｓ１３、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、ｃ２ｃ３、Ｃａｓｌ、ＣａｓｌＢ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ５ｅ（ＣａｓＤ）、Ｃａｓ６、Ｃａｓ６ｅ、Ｃａｓ６ｆ、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８ａ、Ｃａｓ８ａｌ、Ｃａｓ８ａ２、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃｓｎｌ、Ｃｓｘｌ２、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１０ｄ、ＣａｓｌＯ、ＣａｓｌＯｄ、ＣａｓＦ、ＣａｓＧ、ＣａｓＨ、Ｃｓｙｌ、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅｌ（ＣａｓＡ）、Ｃｓｅ２（ＣａｓＢ）、Ｃｓｅ３（ＣａｓＥ）、Ｃｓｅ４（ＣａｓＣ）、Ｃｓｃｌ、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒｌ、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂｌ、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘｌ７、Ｃｓｘｌ４、ＣｓｘｌＯ、Ｃｓｘｌ６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘｌ、Ｃｓｘｌ５、Ｃｓｆｌ、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４およびＣｕｌ９６６；それらの任意の誘導体；それらの任意のバリアント；ならびにそれらの任意の機能的断片を含む。

加えて、本明細書に開示される融合タンパク質組成物に適切な他の部位特異的エンドヌクレアーゼは、多くの場合、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）；転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）；メガヌクレアーゼ；ＲＮＡ結合タンパク質（ＲＢＰ）；リコンビナーゼ；フリッパーゼ；トランスポザーゼ；アルゴノート（Ａｇｏ）タンパク質（例えば、原核生物アルゴノート（ｐＡｇｏ）、古細菌アルゴノート（ａＡｇｏ）および真核生物アルゴノート（ｅＡｇｏ））；またはそれらの任意の機能的断片を含む。
ｈＥｘｏ１タンパク質

プログラム可能なヌクレアーゼは、多くの場合、本明細書に開示される結果をもたらすために、エキソヌクレアーゼドメインに係留される。いくつかのエキソヌクレアーゼ／プログラム可能なエキソヌクレアーゼの組み合わせは、本明細書の開示と一致する。エキソヌクレアーゼに関して、本出願における融合タンパク質の一部としての使用に適切な特定の例示的なエキソヌクレアーゼとしては、ＭＲＥ１１、ＥＸＯｌ、ＥＸＯＩＩＩ、ＥＸＯＶＩＩ、ＥＸＯＴ、ＤＮＡ２、ＣｔＩＰ、ＴＲＥＸ１、ＴＲＥＸ２、Ａｐｏｌｌｏ、ＲｅｃＥ、ＲｅｃＪ、Ｔ５、Ｌｅｘｏ、ＲｅｃＢＣＤおよびＭｕｎｇｂｅａｎが挙げられる。さらなる適切なエキソヌクレアーゼも企図される。特定の実施形態では、ヒトＥｘｏ１（ｈＥｘｏ１）は、本明細書では融合タンパク質の一部として使用される。全長ｈＥｘｏ１は、大きく２つの領域に分けられ得る：Ｎ末端ヌクレアーゼ領域（１～３９２）（配列番号１）ＭＧＩＱＧＬＬＱＦＩ ＫＥＡＳＥＰＩＨＶＲ ＫＹＫＧＱＶＶＡＶＤ ＴＹＣＷＬＨＫＧＡＩ ＡＣＡＥＫＬＡＫＧＥ
ＰＴＤＲＹＶＧＦＣＭ ＫＦＶＮＭＬＬＳＨＧ ＩＫＰＩＬＶＦＤＧＣ ＴＬＰＳＫＫＥＶＥＲ ＳＲＲＥＲＲＱＡＮＬ
ＬＫＧＫＱＬＬＲＥＧ ＫＶＳＥＡＲＥＣＦＴ ＲＳＩＮＩＴＨＡＭＡ ＨＫＶＩＫＡＡＲＳＱ ＧＶＤＣＬＶＡＰＹＥ
ＡＤＡＱＬＡＹＬＮＫ ＡＧＩＶＱＡＩＩＴＥ ＤＳＤＬＬＡＦＧＣＫ ＫＶＩＬＫＭＤＱＦＧ ＮＧＬＥＩＤＱＡＲＬ
ＧＭＣＲＱＬＧＤＶＦ ＴＥＥＫＦＲＹＭＣＩ ＬＳＧＣＤＹＬＳＳＬ ＲＧＩＧＬＡＫＡＣＫ ＶＬＲＬＡＮＮＰＤＩ
ＶＫＶＩＫＫＩＧＨＹ ＬＫＭＮＩＴＶＰＥＤ ＹＩＮＧＦＩＲＡＮＮ ＴＦＬＹＱＬＶＦＤＰ ＩＫＲＫＬＩＰＬＮＡ
ＹＥＤＤＶＤＰＥＴＬ ＳＹＡＧＱＹＶＤＤＳ ＩＡＬＱＩＡＬＧＮＫ ＤＩＮＴＦＥＱＩＤＤ ＹＮＰＤＴＡＭＰＡＨ
ＳＲＳＨＳＷＤＤＫＴ ＣＱＫＳＡＮＶＳＳＩ ＷＨＲＮＹＳＰＲＰＥ ＳＧＴＶＳＤＡＰＱＬ ＫＥ）およびＣ末端ＭＬＨ２／ＭＳＨ１相互作用領域（３９３～８４６）。いくつかの実施形態では、ｈＥｘｏ１のＮ末端ヌクレアーゼ領域（配列番号１）は、ペプチジルリンカーを介して、少なくとも１つのＮＬＳを有するＣａｓ９に共有結合的に連結するために使用される。他の実施形態では、ヌクレアーゼ機能を保持する配列番号１または他のエキソヌクレアーゼドメインの断片が本明細書で使用される。例えば、断片は、配列番号１と少なくとも約７０％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９６％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一、少なくとも約９９％同一、少なくとも約９９．５％同一または少なくとも約９９．９％同一である。いくつかの実施形態では、断片は、配列番号１または他の非切断もしくは非変異ドメインと比較して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２１、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０個またはそれを超えるアミノ酸変化を有し得る。ｈＥｘｏ１のＮ末端ヌクレアーゼ領域は例示的であり、さらなる適切なＥｘｏ１または他のエキソヌクレアーゼ配列は、本明細書に開示される目的のために当業者により利用され得る。

エキソヌクレアーゼ、例えばｈＥｘｏ１ペプチドは、いくつかの場合ではリンカーを使用して、プログラム可能なエンドヌクレアーゼ、例えばＣａｓ９ペプチドおよび少なくとも１つのＮＬＳに接続される。いくつかの実施形態では、リンカーはリンカーペプチドである。リンカーペプチドは、タンパク質部分を接続するように機能するだけではなく、いくつかの場合では、多くの他の機能、例えば協調的ドメイン間相互作用の維持または生物学的活性の保存も提供する（Ｇｏｋｈａｌｅ ＲＳ，Ｋｈｏｓｌａ Ｃ．Ｒｏｌｅ ｏｆ ｌｉｎｋｅｒｓ ｉｎ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｏｄｕｌｅｓ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．２０００；４：２２－２７；Ｉｋｅｂｅ Ｍ，Ｋａｍｂａｒａ Ｔ，Ｓｔａｆｆｏｒｄ ＷＦ，Ｓａｔａ Ｍ，Ｋａｔａｙａｍａ Ｅ，Ｉｋｅｂｅ Ｒ．Ａ ｈｉｎｇｅ ａｔ ｔｈｅ ｃｅｎｔｒａｌ ｈｅｌｉｘ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ｏｆ ｍｙｏｓｉｎ ｉｓ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｆｏｒ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ｍｙｏｓｉｎ ｍｏｔｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９９８；２７３：１７７０２－１７７０７；およびＣｈｅｎ ＸＹ，Ｚａｒｏ Ｊ，ａｎｄ Ｓｈｅｎ ＷＣ．Ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｉｎｋｅｒｓ：ｐｒｏｐｅｒｔｙ，ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ．Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ ２０１４；６５，１３５７－１３６９は本明細書に組み込まれる）。リンカーペプチドは、それぞれ最大４．５±０．７個またはそれ未満、９．１±２．４個および２１．０±７．６個またはそれを超える残基の平均長を有する小、中および大リンカーに分類され得るが、これら３つの範囲により定義されるセット内の任意の範囲の例も企図される。いくつかの実施形態では、リンカーペプチドは、５～２００個のアミノ酸を含む。他の実施形態では、リンカーペプチドは、５～２５個のアミノ酸を含む。特定の実施形態では、リンカーペプチドは、ＦＬ２Ｘ（配列番号１２２（ｇｇｔｃｔｃｃｔｔａａａｃｃｔｇｔｃｔｔｇｔ）によりコードされる）、ＳＬＡ２Ｘ（配列番号１２３（ＧＧＡＧＧＴＧＧＡＧＧＣＴＣＴＧＧＴＧＧＡＧＧＣＧＧＡＴＣＡ）によりコードされる）、ＡＰ５Ｘ（配列番号１２４（ＧＣＡＧＡＧＧＣＴＧＣＡＧＣＣＧＣＴＡＡＧＧＣＣ）によりコードされる）、ＦＬ１Ｘ（配列番号１２５（ＧＣＡＧＡＧＧＣＴＧＣＡＧＣＣＧＣＴＡＡＧＧＡＧＧＣＡＧＣＴＧＣＣＧＣＴＡＡＧＧＣＣ）によりコードされる）、ＳＬＡ１Ｘ（配列番号１２６（ＧＣＡＣＣＴＧＣＴＣＣＡＧＣＧＣＣＣＧＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣＣ）によりコードされる）；およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される。いくつかの実施形態では、リンカーペプチドはＳＬＡ２Ｘである。この場合も、これらの開示されるリンカーペプチドは限定的であることを意味しない。当業者は、適切なリンカーペプチドを選択することができる。

本明細書に開示される融合タンパク質は、翻訳後に直接的に互いに融合され得るか、または共通のオープンリーディングフレーム中の開示される融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド（融合ヌクレオチド）から翻訳され得る。いくつかの実施形態では、ｈＥｘｏ１またはそのＮ末端ヌクレアーゼ領域をコードする第１の核酸配列は、選択されたリンカーペプチドをコードする第２の核酸配列の一方の末端にラーゲーションされる。さらに、第２の核酸配列の他方の末端は、少なくとも１つのＮＬＳを有するＣａｓ９酵素をコードする第３の核酸配列とラーゲーションされる。一般に、第１、第２および第３の核酸配列の終止コドンは除去される。いくつかの実施形態では、第１、第２および第３の核酸配列は、標的細胞におけるより効率的なトランスフェクションまたは発現のためにコドン最適化または操作される。同様に、いくつかの場合では、イントロン配列は除去される。

図２０は、リンカー（Ｌ１、Ｌ２およびＬ３）により接続されたヌクレアーゼ、Ｃａｓ９および他の機能的ドメインの様々な配置を有する例示的な融合タンパク質を示す。融合タンパク質のさらなる非限定的な例としては、ｈＥｘｏ１－Ｃａｓ９－ＤＮ１ｓ（または逆方向ＤＮ１ｓ－Ｃａｓ９－ＨＲ）；ｈＥｘｏ１－Ｃａｓ９－ＤＮ１ｓ－ジェミニン（１－１１０）（またはＤＮ１ｓ－Ｃａｓ９－ＨＲ－ジェミニン）；ｈＥｘｏ１－Ｃａｓ９－ジェミニン（１－１１０）（またはＣａｓ９－ｈＥｘｏ１－ジェミニン）；ｈＥｘｏ１－Ｃａｓ９－ＰＣＶ（またはＰＣＶ－Ｃａｓ９－ｈＥｘｏ１）；ｈＥｘｏ１－Ｃａｓ９－ＰＣＶ－ジェミニン（１－１１０）（またはＰＣＶ－Ｃａｓ９－ｈＥｘｏ１－ジェミニン）；およびｈＥｘｏ１－Ｃａｓ９－ＣｔＩＰ（１－２９６）（またはＣｔＩＰ－Ｃａｓ９－ｈＥｘｏ１）が挙げられる。

いくつかの実施形態では、ｈＥｘｏ１－Ｃａｓ９－ＤＮ１ｓ（または逆方向ＤＮ１ｓ－Ｃａｓ９－ＨＲ）は、ｈＥｘｏ１（１－３５２）が、リンカー１（ＦＬ１Ｘ、ＡＰ５Ｘまたは他のもの）を介して、Ｎ末端ＦＬＡＧ＋ＮＬＳ（図２０ではＮＬＳとして示されている）を保有または欠如するＣａｓ９に融合し、続いてリンカー２（ＴＧＳまたは他のもののいずれか）を介して、Ｃ末端に付加されたＮＬＳ配列を有するヒトｐ５３（１２３１－１６４４）の断片に融合したものであり得る。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９－ＨＲおよびＣａｓ９－ＤＮ１ｓは、相同組換え経路において異なる段階で作用し得る。いくつかの実施形態では、ＨＲ－Ｃａｓ９－ＤＮ１ｓは、Ｃａｓ９－ＨＲまたはＣａｓ９－ＤＮ１ｓのいずれかと比べてエラーのない編集効率の増加を有し得る。いくつかの実施形態では、細胞毒性は、Ｃａｓ９のみと比較した場合、Ｃａｓ９－ＤＮ１ｓで見られる増加と比べて大幅に減少し得る。

いくつかの場合では、ｈＥｘｏ１－Ｃａｓ９－ＤＮ１ｓ－ジェミニン（１－１１０）（またはＤＮ１ｓ－Ｃａｓ９－ＨＲ－ジェミニン）は、ｈＥｘｏ１（１－３５２）が、リンカー１（ＦＬ１Ｘ、ＡＰ５Ｘまたは他のもの）を介して、Ｎ末端ＦＬＡＧ＋ＮＬＳを保有または欠如するＣａｓ９に融合し、続いてリンカー２（ＴＧＳまたは他のもののいずれか）を介して、ヒトｐ５３（１２３１－１６４４）の断片に融合したものであり得る。ＤＮ１ｓは、そのＣ末端に付加されたＮＬＳ（これは、次いでＬ３（任意の配列）を介してジェミニン（１－１１０）に融合され得る）を有し得るか、またはそのＣ末端にＮＬＳ配列を有するジェミニン（これは、Ｌ３を介してＤＮ１ｓに融合され得る）に融合され得る。いくつかの実施形態では、ｈＥｘｏ１－Ｃａｓ９－ＤＮ１ｓ－ジェミニン（１－１１０）（またはＤＮ１ｓ－Ｃａｓ９－ＨＲ－ジェミニン）の細胞毒性は、Ｃａｓ９と比較して減少し得る。いくつかの実施形態では、ｈＥｘｏ１－Ｃａｓ９－ＤＮ１ｓ－ジェミニン（１－１１０）（またはＤＮ１ｓ－Ｃａｓ９－ＨＲ－ジェミニン）のエラーのない編集効率は、Ｃａｓ９と比較して増加され得る。いくつかの実施形態では、ｈＥｘｏ１－Ｃａｓ９－ＤＮ１ｓ－ジェミニン（１－１１０）（またはＤＮ１ｓ－Ｃａｓ９－ＨＲ－ジェミニン）のエラーのない編集効率は、内因性ＨＲが細胞において最も高い場合、ヌクレアーゼ活性をＳ／Ｇ２期に制限するｈＥｘｏ１－Ｃａｓ９－ＤＮ１ｓ－ジェミニンのジェミニンを介した翻訳後調節により、Ｃａｓ９と比較して増加され得る。

いくつかの実施形態では、ｈＥｘｏ１－Ｃａｓ９－ジェミニン（１－１１０）（またはＣａｓ９－ｈＥｘｏ１－ジェミニン）は、ｈＥｘｏ１（１－３５２）が、リンカー１（ＦＬ１Ｘ、ＡＰ５Ｘまたは他のもの）を介して、Ｎ末端ＦＬＡＧ＋ＮＬＳを保有または欠如するＣａｓ９であって、Ｃ末端ＮＬＳ配列を保有または欠如するＣａｓ９に融合し、続いてリンカー２（ＴＧＳまたは他のもののいずれか）を介して、Ｃ末端ＮＬＳ配列を保有または欠如するジェミニン（１－１１０）の断片に融合したものであり得る。いくつかの実施形態では、ｈＥｘｏ１－Ｃａｓ９－ジェミニン（１－１１０）（またはＣａｓ９－ｈＥｘｏ１－ジェミニン）は、Ｃａｓ９と比較して細胞毒性の減少およびエラーのない編集効率の増加を含む。

いくつかの実施形態では、ｈＥｘｏ１－Ｃａｓ９－ＰＣＶ（またはＰＣＶ－Ｃａｓ９－ｈＥｘｏ１は、ｈＥｘｏ１（１－３５２）が、リンカー１（ＦＬ１Ｘ、ＡＰ５Ｘまたは他のもの）を介して、Ｎ末端ＦＬＡＧ＋ＮＬＳを保有または欠如するＣａｓ９であって、Ｃ末端ＮＬＳ配列を保有または欠如するＣａｓ９に融合し、続いてリンカー２（ＴＧＳまたは他のもののいずれか）を介して、ＰＣＶに融合したものであり得る。いくつかの実施形態では、ＰＣＶは特定のｓｓＤＮＡ配列に結合し、それにより、修復テンプレートをＣａｓ９複合体に係留し得る。いくつかの実施形態では、ｈＥｘｏ１－Ｃａｓ９－ＰＣＶは、Ｃａｓ９と比較してエラーのない編集効率の増加を含む。いくつかの実施形態では、ｈＥｘｏ１－Ｃａｓ９－ＰＣＶは、Ｃａｓ９と比較して細胞毒性の減少を含む。

いくつかの実施形態では、ｈＥｘｏ１－Ｃａｓ９－ＰＣＶ－ジェミニン（１－１１０）（またはＰＣＶ－Ｃａｓ９－ｈＥｘｏ１－ジェミニン）は、ｈＥｘｏ１（１－３５２）が、リンカー１（ＦＬ１Ｘ、ＡＰ５Ｘまたは他のもの）を介して、Ｎ末端ＦＬＡＧ＋ＮＬＳを保有または欠如するＣａｓ９であって、Ｃ末端ＮＬＳ配列を保有または欠如するＣａｓ９に融合し、続いてリンカー２（ＴＧＳまたは他のもののいずれか）を介して、ＰＣＶ（これは、次いでジェミニン（１－１１０）に融合され得る）に融合したものであり得る。いくつかの実施形態では、ｈＥｘｏ１－Ｃａｓ９－ＰＣＶ－ジェミニン（１－１１０）（またはＰＣＶ－Ｃａｓ９－ｈＥｘｏ１－ジェミニン）は、Ｃａｓ９と比較してエラーのない高い編集効率を含む。いくつかの実施形態では、ｈＥｘｏ１－Ｃａｓ９－ＰＣＶ－ジェミニン（１－１１０）（またはＰＣＶ－Ｃａｓ９－ｈＥｘｏ１－ジェミニン）は、Ｓ／Ｇ２期へのヌクレアーゼ活性の制限により、Ｃａｓ９と比較してエラーのない高い編集効率を含む。

いくつかの実施形態では、ｈＥｘｏ１－Ｃａｓ９－ＣｔＩＰ（１－２９６）（またはＣｔＩＰ－Ｃａｓ９－ｈＥｘｏ１）は、ｈＥｘｏ１（１－３５２）が、リンカー１（ＦＬ１Ｘ、ＡＰ５Ｘまたは他のもの）を介して、Ｎ末端ＦＬＡＧ＋ＮＬＳを保有または欠如するＣａｓ９であって、Ｃ末端ＮＬＳ配列を保有または欠如するＣａｓ９に融合し、続いてリンカー２（ＴＧＳまたは他のもののいずれか）を介して、ＣｔＩＰに融合したものであり得る。いくつかの実施形態では、ＣｔＩＰは、ＣｔＩＰなしのＣａｓ９と比較してエラーのない編集効率を改善し得る。いくつかの実施形態では、ＣｔＩＰは、遮断されたＤＳＢ（二本鎖切断）の下流に結合して３’から５’へのエキソヌクレアーゼ活性を使用して切断部に向けて再切除することにより、Ｃａｓ９と比較してエラーのない編集効率を改善し得る。

ＥｘｏＩのＥｓｃｈｅｒｉａ Ｃｏｌｉ（大腸菌）バージョン

特定の実施形態では、ＥｘｏＩのＥｓｃｈｅｒｉａ Ｃｏｌｉ（大腸菌）バージョン（大腸菌ＥｘｏＩ）は、本明細書では融合タンパク質の一部として使用される。大腸菌Ｅｘｏ１は、ｈＥｘｏ１の５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性とは反対に、３’から５’へのエキソヌクレアーゼ活性を有する。大腸菌ＥｘｏＩ Ｃａｓ９融合物は、従来のＣａｓ９よりもはるかに長い欠失を生成し得る。
核酸配列

本開示のいくつかのヌクレオチド構築物は、エキソヌクレアーゼ、例えばｈＥｘｏ１をコードする核酸を含む。さらに、いくつかの本開示のヌクレオチド構築物は、プログラム可能なエンドヌクレアーゼ、例えばＣａｓ９または他のＣＲＩＳＰＲ関連のプログラム可能なエンドヌクレアーゼをコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、ｈＥｘｏ１またはそのＮ末端ヌクレアーゼ領域をコードする核酸配列は天然に存在しないが、それによりコードされるｈＥｘｏ１またはそのＮ末端ヌクレアーゼ領域は、天然に存在するアミノ酸配列を有する。いくつかの場合では、核酸配列は、天然に存在するｈＥｘｏ１またはそのＮ末端ヌクレアーゼ領域核酸配列とは異なるが、コドン縮重によりｈＥｘｏ１またはそのＮ末端ヌクレアーゼ領域と同一のポリペプチドをコードする。同様に、少なくとも１つのＮＬＳを有するＣａｓ９酵素をコードする第３の核酸配列は天然に存在しないが、それによりコードされるＣａｓ９タンパク質は、天然に存在するアミノ酸配列を有する。いくつかの場合では、核酸配列は、天然に存在するＣａｓ９核酸配列とは異なるが、コドン縮重によりＣａｓ９と同一のポリペプチドをコードする。
リボ核タンパク質（ＲＮＰ）

リボ核タンパク質（ＲＮＰ）は、典型的には、少なくとも２つの部分を含む：一方の部分は、プログラム可能なエンドヌクレアーゼ、例えばＣａｓ９または他のＣＲＩＳＰＲ関連のプログラム可能なエンドヌクレアーゼを含み；他方の部分は、ｇＲＮＡまたは他の特異性伝達核酸（ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ－ｃｏｎｖｅｙｉｎｇ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）を含む。多くの場合、野生型Ｃａｓ９酵素または他のＣａｓまたは非Ｃａｓプログラム可能なエンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムの一部であり得る。リンカーペプチドを介してｈＥｘｏ１の断片にカップリングした改変Ｃａｓ９タンパク質もまた、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムの一部であり得る。さらに、改変Ｃａｓ９タンパク質およびｇＲＮＡは、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）を形成し得る。
ｇＲＮＡ

リボ核酸を遺伝子上の標的部位にガイドするための配列と、エンドヌクレアーゼ、例えばＣａｓ９酵素に結合するための別の配列とを含むリボ核酸が本明細書で使用される。多くの場合、リボ核酸はｇＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは合成ｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である。ｇＲＮＡは、融合タンパク質複合体をＤＮＡ分子の標的ヌクレオチド配列に誘導する。ｇＲＮＡは、Ｃａｓ結合に必要な足場配列と、改変すべきゲノム標的を規定する約２０ヌクレオチドのユーザー定義スペーサーとから構成される短い合成ＲＮＡである。特定の実施形態では、ｇＲＮＡのスペーサーは、ＨＢＢ遺伝子のエクソン１を認識するように設計され得る。したがって、ｇＲＮＡに存在する標的配列を単に変更することにより、Ｃａｓタンパク質のゲノム標的を変更し得る。

ｇＲＮＡを細胞に送達するいくつかの方法がある。１つは、プラスミドＤＮＡとしてｇＲＮＡを細胞に送達することである。いくつかの実施形態では、融合タンパク質をコードする核酸は、目的の遺伝子を標的とする設計されたｇＲＮＡをコードする核酸配列を有する１つのプラスミドまたは他の適切なベクターにクローニングされ得る。

代表的なｇＲＮＡ構成要素のリストは以下に提供されている。
表２．ｇＲＮＡ配列のリスト。

ＨＤＲテンプレート配列

ゲノム安定性は、ＤＳＢの正確かつ効率的な修復を必要とする。真核細胞では、ＤＳＢの機構的修復は、主に２つの経路：非相同末端結合（ＮＨＥＪ）および相同組換え修復（ＨＤＲ）により起こる。ＮＨＥＪは、２つの末端の再ライゲーションのために多くともわずか１～数個の相補的塩基のアラインメントを伴うので、標準的な相同性非依存的経路であるのに対して、ＨＤＲは、より長い長さの配列相同性を使用してＤＮＡ損傷部を修復する。ＨＤＲは、損傷したＤＮＡ鎖とインタクトなドナーのＤＮＡ鎖との間のより高い配列相同性が必要なことにより、ＤＳＢ修復のより正確な機構である。修復に使用されるＤＮＡテンプレートが、ＤＳＢにおける元のＤＮＡ配列と同一である場合、またはそれが、非常に特異的な変異を損傷ＤＮＡに導入し得る場合、前記プロセスはエラーがない。

上述のように、ＨＤＲ法は、ゲノム工学における大きな自由を提供し、わずか１塩基の変異からキロベース（ｋｂ）のＤＮＡの挿入または欠失までを可能にする。真核生物では、ＨＤＲ率は、２つの異なる経路：相同組換え（ＨＲ）および非相同末端結合（ＮＨＥＪ）間の競合により管理される。これら２つの経路間の競合は、ＭＲＮ／ＣｔＩＰ複合体またはＫｕ７０／８０ヘテロダイマーのいずれかによる競合的結合により開始する。ＭＲＮ／ＣｔＩＰが最初に結合する場合、それらは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するエキソヌクレアーゼＩ（ＥｘｏＩ）を含む他のタンパク質を動員する２０。切断部の両側のＥｘｏ１またはＤｎａ２のいずれかによる二本鎖ＤＮＡ切断の５’末端切除は、ＨＲ経路によるＤＳＢの修復にコミットする。あるいは、Ｋｕ７０／８０ヘテロダイマーが結合する場合、それは、ＤＮＡリガーゼＩＶを含む他のＮＨＥＪ経路メンバーを動員し、最終的にはＮＨＥＪを介して二本鎖切断を修復し得る。

ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムを細胞に送達する場合、ＨＤＲテンプレート配列が細胞に送達される必要がある。特異的な変異を造り出すかまたは新たなエレメントを遺伝子に挿入するために使用されるＨＤＲテンプレートは、改変される標的配列の周囲に一定量の相同性を必要とする。いくつかの実施形態では、５’および３’相同アームは、ＣＲＩＳＰＲ誘導ＤＳＢで始まる。一般に、改変の挿入部位はＤＳＢに非常に近く、可能であれば理想的には１０ｂｐ未満の距離であり得る。いくつかの実施形態では、ＨＤＲテンプレート配列の５’および３’相同アームは、標的配列と少なくとも８０％同一である。さらに、いくつかの実施形態では、一本鎖ドナーオリゴヌクレオチド（ｓｓＤＯＮ）がより小さな挿入に利用される。ｓｓＤＯＮの各相同アームは、約３０～８０ｂｐのヌクレオチド配列を含み得る。相同アームの長さは限定的であることを意味せず、長さは、目的の遺伝子の遺伝子座および実験系にしたがって当業者により調整され得る。蛍光タンパク質または選択カセットなどのより大きな挿入の場合、二本鎖ドナーオリゴヌクレオチド（ｄｓＤＯＮ）がＨＤＲテンプレート配列として利用され得る。いくつかの実施形態では、ｓｓＤＯＮの各相同アームは、約８００～１５００ｂｐのヌクレオチド配列を含み得る。Ｃａｓ９酵素がＨＤＲテンプレートを切断することを防止するために、いくつかの実施形態では、単一の塩基変異が、ＨＤＲテンプレートのプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列に導入され得る。
送達方法

いくつかの異なる方法、例えばトランスフェクションは、リボ核タンパク質およびｓｓＤＯＮまたは他の核酸を切断部位に送達するために使用される。トランスフェクション法は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９または他のプログラム可能なエンドヌクレアーゼ構成成分を細胞に送達するために使用され得る。例示的な方法のいくつかは、開示される改変ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムを細胞に送達するために使用され得、当業者に公知の本開示に一致するさらなる方法は、細胞のタイプおよびＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９構成成分の形式に応じて特定の方法を選択し得る。

送達は、２つの主なカテゴリ：カーゴおよび送達ビヒクルに分類され得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９カーゴに関して、３つのアプローチが一般に利用可能である：（１）Ｃａｓ９タンパク質または他のプログラム可能なエンドヌクレアーゼおよびガイドＲＮＡの両方をコードするＤＮＡプラスミド、（２）別個のガイドＲＮＡと一緒にＣａｓ９または他のプログラム可能なエンドヌクレアーゼ翻訳のためのｍＲＮＡ、および（３）ガイドＲＮＡを有するＣａｓ９タンパク質または他のプログラム可能なエンドヌクレアーゼ（リボ核タンパク質複合体）。使用される送達ビヒクルは、多くの場合、これら３つのカーゴのどれを詰め得るか、ならびにシステムがインビトロおよび／またはインビボで使用可能かを決定する。

遺伝子編集システムカーゴを送達するために使用されるビヒクルは、３つの一般的なグループ：物理的送達、ウイルスベクターおよび非ウイルスベクターに分類され得る。最も一般的な物理的送達方法は、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションおよびヌクレオフェクションである。エレクトロポレーションは、脂質ベースの送達システムを使用して形質転換することが困難な細胞タイプにおけるＣＲＩＳＰＲ機構の送達を可能にする。細胞への制御された短い電気パルスの適用は、細胞膜において細孔を形成し、異物の侵入を可能にする。ヌクレオフェクションは、細胞の核膜も細孔を形成するように電気パルスが最適化されたエレクトロポレーションの変種である。したがって、ＣＲＩＳＰＲ構成成分は核の内側に直接送達される。マイクロインジェクションは、Ｃａｓ９または他のプログラム可能なエンドヌクレアーゼおよびｇＲＮＡリボ核タンパク質複合体を胚に注入するために一般的に使用されるが、それはまた、細胞において使用され得る。ゼブラフィッシュ、マウスおよびごく最近ではヒト胚が、この技術を使用して操作されている。

ウイルス送達ベクターとしては、特別に操作されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）およびフルサイズアデノウイルスおよびレンチウイルスビヒクルが挙げられる。特にインビボ研究の場合、ウイルスベクターが好まれており、最も一般的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９送達ベクターである。ディペンドウイルス属およびパルボウイルス科のＡＡＶは、遺伝子治療に広く利用されている一本鎖ＤＮＡウイルスである。ＬＶおよびＡｄＶは明確に異なるが、それらがＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構成成分の送達に使用される方法は非常に似ている。ＬＶ送達の場合、骨格ウイルスはＨＩＶのプロウイルスであり；ＡｄＶ送達の場合、骨格ウイルスは、公知のＡｄＶの多くの異なる血清型の１つである。ＬＶおよびＡｄＶは両方とも、分裂細胞および非分裂細胞に感染し得るが；しかしながら、ＬＶとは異なり、ＡｄＶはゲノムに組み込まれない。オフターゲット効果を制限するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベースの編集の場合、これは有利である。ＡＡＶ粒子の場合と同様に、ＬＶおよびＡｄＶは両方とも、インビトロ、エクスビボおよびインビボ用途で使用され得るので、有効性および安全性の両方の試験が容易である。機構の点では、このクラスのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９送達は上記ＡＡＶ送達に似ている。所望のＣａｓ９およびｓｇＲＮＡを含有する完全ウイルス粒子は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の形質転換により作り出される。次いで、これらのウイルス粒子は、標的細胞タイプを感染させるために使用される。ＬＶ／ＡｄＶ送達とＡＡＶ送達との間の最大の差異は粒子のサイズであり；ＬＶおよびＡｄＶは両方とも約８０～１００ｎｍの直径である。ＡＡＶの直径２０ｎｍと比較して、これらのシステムでは、より大きな挿入がより許容される。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を検討する場合、マルチプレックスゲノム編集のための異なるサイズのＣａｓ９構築物またはいくつかのｓｇＲＮＡのためのさらなるパッケージングスペースは、ＡＡＶ送達システムに対する大きな利点である。

ウイルスベクターは改変ウイルスベクターであり得るか、あるいはそれは未改変ベクターであり得る。多くの場合、改変ウイルスベクターは遺伝子改変ベクターである。改変ウイルスベクターは、減少した免疫原性、血流中のベクターの持続性の増加、またはマクロファージおよび抗原提示細胞によるベクターの取り込み障害を示し得る。

改変ウイルスベクターは、ポリマー、脂質、ペプチド、磁性ナノ粒子（ＭＮＰ）、さらなる化合物またはそれらの組み合わせをさらに含み得る。ポリマー、脂質または磁性ナノ粒子は、ウイルスベクターのカプシドに結合され得る。ポリマーはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であり得る。ポリマーは、Ｎ－［２－ヒドロキシプロピル］メタクリルアミド（ＨＰＭＡ）、ポリ（２－（ジメチルアミノ）エチルメタクリレート）（ｐＤＭＡＥＭＡ）またはアルギニングラフト化生体還元性ポリマー（ＡＢＰ）であり得る。ペプチドは、細胞透過性ペプチド、細胞接着ペプチドまたは細胞上の受容体に結合するペプチドであり得る。細胞は腫瘍細胞であり得る。任意の適切な細胞透過性ペプチドが使用され得る。細胞透過性ペプチドの例としては、限定されないが、ポリリジンペプチドおよびポリアルギニンペプチドが挙げられる。細胞接着ペプチドは、アルギニルグリシルアスパラギン酸（ＲＧＤ）ペプチドであり得る。さらなる化合物は、細胞上の受容体に結合する化合物、例えば葉酸であり得る。

いくつかの場合では、改変ウイルスベクターは遺伝子改変ベクターである。遺伝子改変ベクターは、減少した免疫原性、減少した遺伝子毒性、増加したローディング容量、増加した導入遺伝子発現またはそれらの組み合わせを有し得る。いくつかの場合では、遺伝子改変ウイルスベクターは偽型ウイルスベクターである。偽型ウイルスベクターは、少なくとも１つの外来ウイルスエンベロープタンパク質を有し得る。外来ウイルスエンベロープタンパク質は、リッサウイルス、アレナウイルス、ヘパドナウイルス、フラビウイルス、パラミクソウイルス、バキュロウイルス、フィロウイルスまたはアルファウイルス由来のエンベロープタンパク質であり得る。外来ウイルスエンベロープタンパク質は、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）の糖タンパク質Ｇであり得る。いくつかの場合では、外来ウイルスエンベロープタンパク質は、遺伝子改変ウイルスエンベロープタンパク質である。遺伝子改変ウイルスエンベロープタンパク質は、天然に存在しないウイルスエンベロープタンパク質であり得る。

いくつかの実施形態では、ウイルスベクターはウイルス様粒子（ＶＬＰ）である。ＶＬＰはウイルスに似ているが、それらはウイルス遺伝物質を含有しないので非感染性である。ＶＬＰは、パルボウイルス科（例えば、アデノ随伴ウイルス）、レトロウイルス科（例えば、ＨＩＶ）、フラビウイルス科（例えば、Ｃ型肝炎ウイルス）およびバクテリオファージを含む多種多様なウイルス科の構成成分から生産されている。ＶＬＰは、細菌、哺乳動物細胞株、昆虫細胞株、酵母および植物細胞を含む複数の細胞培養系において生産され得る。

非ウイルスベクター送達ビヒクルに関して、脂質ナノ粒子／リポソームが本明細書で使用され得る。脂質は、陽イオン性脂質、陰イオン性脂質または中性脂質であり得る。脂質は、リポソーム、小単層ベシクル（ＳＵＶ）、脂質エンベロープ、リピドイドまたは脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）であり得る。脂質を核酸と混合して、リポプレックス（核酸－リポソーム複合体）を形成し得る。脂質は核酸にコンジュゲートされ得る。脂質は、非ｐＨ感受性脂質またはｐＨ感受性脂質であり得る。脂質は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）をさらに含み得る。

陽イオン性脂質は、一価陽イオン性脂質、例えばＮ－［１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、［１，２－ビス（オレオイルオキシ）－３－（トリメチルアンモニオ）プロパン］（ＤＯＴＡＰ）または３β［Ｎ－（Ｎ’，Ｎ’－ジメチルアミノエタン）－カルバモイル］コレステロール（ＤＣ－Ｃｈｏｌ）であり得る。陽イオン性脂質は、多価陽イオン性脂質、例えばジ－オクタデシル－アミド－グリシル－スペルミン（ＤＯＧＳ）または｛２，３－ジオレイルオキシ－Ｎ－［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－プロパナミニウムトリフルオロアセテート｝（ＤＯＳＰＡ）であり得る。

陰イオン性脂質は、リン脂質またはジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）であり得る。リン脂質の例としては、限定されないが、ホスファチジン酸、ホスファチジルグリセロールまたはホスファチジルセリンが挙げられる。いくつかの場合では、陰イオン性脂質は、二価陽イオン、例えばＣａ^２＋、Ｍｇ^２＋、Ｍｎ２＋およびＢａ^２＋をさらに含む。

陽イオン性脂質または陰イオン性脂質は中性脂質をさらに含み得る。中性脂質は、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）またはジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）であり得る。いくつかの場合では、荷電脂質と組み合わせたヘルパー脂質の使用は、より高いトランスフェクション効率をもたらす。

リポソームは、ポリマー、脂質、ペプチド、磁性ナノ粒子（ＭＮＰ）、さらなる化合物またはそれらの組み合わせをさらに含み得る。ポリマー、脂質または磁性ナノ粒子はリポソームに結合され得るか、またはリポソーム膜に組み込まれ得る。ポリマーはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であり得る。ポリマーは、Ｎ－［２－ヒドロキシプロピル］メタクリルアミド（ＨＰＭＡ）、ポリ（２－（ジメチルアミノ）エチルメタクリレート）（ｐＤＭＡＥＭＡ）またはアルギニングラフト化生体還元性ポリマー（ＡＢＰ）であり得る。ペプチドは、細胞透過性ペプチド、細胞接着ペプチドまたは細胞上の受容体に結合するペプチドであり得る。細胞は腫瘍細胞であり得る。任意の適切な細胞透過性ペプチドが使用され得る。細胞透過性ペプチドの例としては、限定されないが、ポリリジンペプチドおよびポリアルギニンペプチドが挙げられる。細胞接着ペプチドは、アルギニルグリシルアスパラギン酸（ＲＧＤ）ペプチドであり得る。さらなる化合物は、細胞上の受容体に結合する化合物、例えば葉酸であり得る。
キット

１つまたはそれを超える本明細書に記載される方法および組成物と共に使用するためのキットおよび製造品が本明細書に開示される。キットは、適合医薬賦形剤中に製剤化されて適切な容器に入れられた本明細書に記載されるポリヌクレオチド組成物を含み得る。

キットは、担体、パッケージまたは容器を含み得、１つまたはそれを超える容器、例えばバイアル、チューブなどを収容するように区画化されており、容器（複数可）の各々は、本明細書に記載される方法において使用すべき別個のエレメントの１つを含む。適切な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジおよび試験管が挙げられる。容器は、様々な材料、例えばガラスまたはプラスチックから形成され得る。

キットは、識別説明（ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）、ラベルまたは添付文書を含み得る。ラベルまたは添付文書は、キットもしくは免疫学的組成物の内容物、本明細書に記載される方法におけるその使用に関する指示、またはそれらの組み合わせを掲載し得る。ラベルは、容器上にあり得るかまたはそれに付随し得る。ラベルを形成する文字、数字または他の符号が容器自体に取り付け、成形またはエッチングされる場合、ラベルは容器上にあり得る。ラベルは、それが、例えば添付文書として、容器も保持するレセプタクルまたは担体内に存在する場合、容器に付随し得る。いくつかの場合では、ラベルは、内容物が特定の治療用途に使用されるべきであることを示すために使用される。

本明細書におけるキットは、ポリヌクレオチド配列を細胞、組織または器官に送達するために使用される１つまたはそれを超える試薬をさらに含み得る。
用途

開示されるＲＮＰは、細胞においてＤＮＡの相同組換えを誘導するために、本明細書に開示される送達方法の１つを使用して細胞に導入され得る。さらに、開示されるＲＮＰは、インビトロまたはエクスビボで細胞においてＨＤＲを誘導するために、本明細書に開示される送達方法の１つを使用して細胞に導入され得る。ＤＮＡ分子はＲＮＰと接触される。ｇＲＮＡによりガイドされる改変Ｃａｓ９タンパク質は、ｇＲＮＡとＤＮＡ分子とのハイブリダイゼーションにより決定された位置で切断することによりＤＳＢを導入する。ｈＥｘｏ１ペプチドは、切断されたＤＮＡ分子を部分的に消化し、３’または５’オーバーハングが残る。消化されたＤＮＡ分子とある程度の配列相同性を含むＨＤＲテンプレート配列は、ＨＤＲのためのテンプレートとして促進および機能する。ＨＤＲの後、細胞中のＤＮＡ分子は、相同組換えが起こる領域のＨＤＲテンプレートと同一の配列を含む。

細胞においてＨＤＲを誘導することにより、野生型Ｃａｓ９タンパク質とｇＲＮＡにより引き起こされる細胞毒性は減少する。細胞毒性は、いくつかの細胞生存率アッセイにより測定され得る。いくつかの実施形態では、テトラゾリウム還元アッセイが使用される。様々なテトラゾリウム化合物が、生細胞を検出するために使用されている。最も一般的に使用される化合物としては、ＭＴＴ、ＭＴＳ、ＸＴＴおよびＷＳＴ－１が挙げられる。これらの化合物は、２つの基本的なカテゴリ：１）生存真核細胞に容易に浸透する正荷電のＭＴＴと、２）細胞に容易に浸透しない負荷電のもの、例えばＭＴＳ、ＸＴＴおよびＷＳＴ－１とに分けられる。後者のクラス（ＭＴＳ、ＸＴＴ、ＷＳＴ－１）は、典型的には、細胞質または原形質膜から電子を移動させて着色ホルマザン生成物へのテトラゾリウムの還元を促進し得る中間電子受容体と共に使用される。例えば、活発な代謝を有する生細胞は、５７０ｎｍ付近の最大吸光度を有する紫色ホルマザン生成物にＭＴＴを変換する。細胞が死ぬと、それらは、ＭＴＴをホルマザンに変換する能力を喪失するので、色形成は、生細胞のみの有用かつ便利なマーカーとして機能する。

他の実施形態では、レサズリン還元アッセイが使用される。レサズリンは、テトラゾリウム化合物を利用するものと同様のプロトコールを用いて生細胞数をモニタリングするために使用され得る細胞透過性レドックス指示薬である。レサズリンを生理学的緩衝液に溶解させ（濃青色の溶液をもたらす）、均一なフォーマットで培養液中の細胞に直接添加し得る。活発な代謝を有する生細胞は、レサズリンをピンク色かつ蛍光性のレサズリン生成物に還元し得る。産生されるレゾルフィンの量は、５３０ｎｍまたは５６０ｎｍ励起／５９０ｎｍ発光フィルタセットを備えるマイクロプレート蛍光光度計を使用して定量され得る生細胞の数に比例する。波長は、異なるタイプの細胞および実験デザインにしたがって調整され得る。レゾルフィンはまた、吸光度の変化を測定することにより定量され得るが；しかしながら、吸光度検出は、蛍光の測定よりもはるかに感度が低いのであまり使用されない。

さらに、本明細書に開示されるＲＮＰは、疾患の原因が染色体異常の遺伝子座にある疾患を処置するために使用される。特定の実施形態では、生物学的サンプルは、疾患に罹患している被験体から得られる。ＤＮＡが生物学的サンプルから抽出され、染色体異常の遺伝子座を決定するためにシークエンシングされる。染色体異常を有する初代細胞が被験体から単離され、エクスビボで培養される。ＲＮＰは、本明細書に開示される送達方法の１つを使用して、前記培養初代細胞に送達される。ＨＤＲテンプレート配列もまた、培養初代細胞に送達される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ部分は、染色体異常の標的遺伝子座に相補的な少なくとも１０個のヌクレオチドを含む。ＨＤＲテンプレート配列は、５’相同領域および３’相同領域に挟まれた組み込みカセットを含み、５’相同領域および３’相同領域は、標的遺伝子座の隣接セグメントと少なくとも８０％の同一性を示す。ＨＤＲテンプレートの組み込みカセットは、初代細胞において検出された染色体異常の遺伝子座に対応する野生型配列を含む。ＲＮＰの送達により、ｇＲＮＡは、タンパク質融合複合体を標的遺伝子座に誘導し、そこで、改変Ｃａｓタンパク質部分は、ｇＲＮＡにより認識される前記標的遺伝子座を切断することによりＤＳＢを作る。ヌクレアーゼ部分は、染色体異常の切断された遺伝子座を部分的に消化し、３’オーバーハングが残る。ＨＤＲテンプレート配列の存在は、ＨＤＲを介した内因性修復を促進する。染色体異常を置き換える野生型配列を有する初代細胞は、被験体への再導入のためにスクリーニングおよび選択される。

いくつかの実施形態では、初代細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、好中球、好酸球、好塩基球、マスト細胞、造血前駆細胞、造血幹細胞（ＨＳＣ）、赤血球、血液幹細胞、内胚葉幹細胞、内胚葉前駆細胞、内胚葉前駆体細胞、分化内胚葉細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、間葉系前駆細胞、間葉系前駆体細胞、分化間葉系細胞、肝細胞前駆細胞、膵臓前駆細胞、肺前駆細胞、気管前駆細胞、骨細胞、軟骨細胞、筋細胞、脂肪細胞、間質細胞、線維芽細胞および真皮細胞を含む群より選択される。

さらに、いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ヒトＨＢＢ遺伝子のエクソン１を認識するように構成される。ＨＤＲテンプレートは、機能的ヒトＨＢＢ遺伝子と５’および３’アーム相同性を有するように構成される。他の実施形態では、ｇＲＮＡは、ＣＦＴＲの領域を認識するように構成され、ＨＤＲテンプレートは、機能的ＣＦＴＲ遺伝子と５’および３’アーム相同性を有するように設計される。

表３にそれぞれ掲載されている、遺伝子の変異遺伝子座を有する単一遺伝子障害のリストを参照のこと。ヒト単一遺伝子疾患、遺伝形式および関連遺伝子の例。
表３．

また、本明細書に開示されるＲＮＰは、疾患に対する免疫を付与するための遺伝子改変を導入するために使用される。生物学的サンプルは被験体から得られる。ＤＮＡが抽出され、標的遺伝子改変のための遺伝子座がシークエンシングされる。被験体の初代細胞が単離され、エクスビボで培養される。ＲＮＰおよびＨＤＲテンプレート配列は、前記培養初代細胞に送達される。ｇＲＮＡ部分は、ＲＮＰを標的遺伝子座に誘導して、ＤＳＢの形成およびＤＮＡ消化を開始し、３’オーバーハングを生成する。ＨＤＲテンプレートは、５’相同領域および３’相同領域に挟まれた組み込みカセットを含み、５’相同領域および３’相同領域は、標的遺伝子座の隣接セグメントと少なくとも８０％の同一性を示す。組み込みカセットは、標的遺伝子座の対象の配列とは異なる野生型配列を含む。ポリヌクレオチドの存在は、ＨＤＲを介した内因性修復を促進する。ポリヌクレオチドによりコードされる野生型配列を有する初代細胞は、被験体への再導入のためにスクリーニングおよび選択される。
特定の定義

本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」という単数形は、文脈上特に明確な指示がない限り、複数の指示対象を含む。請求項は、任意の必要に応じたエレメントを除外するように起草され得ることにさらに留意する。したがって、この記述は、請求項のエレメントの列挙に関して「単独」、「のみ」などの排他的用語の使用、または「否定的な」限定の使用について先行詞として機能するものである。

本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーに関して本明細書で互換的に頻繁に使用される。タンパク質は、一般に、コードオープンリーディングフレームから翻訳された、またはその成熟形態にプロセシングされた全長ポリペプチドを指し、ポリペプチドまたはペプチドは、それにもかかわらず特定のタンパク質にユニークにまたは識別可能にマッピングするタンパク質の分解断片またはプロセシング断片を非公式に指す。ポリペプチドは、隣接アミノ酸残基のカルボキシル基とアミノ基との間のペプチド結合により互いに結合したアミノ酸の単一線状ポリマー鎖であり得る。ポリペプチドは、例えば、炭水化物の付加、リン酸化などにより改変され得る。タンパク質は、１つまたはそれを超えるポリペプチドを含み得る。

本明細書で使用される場合、「断片」、「ドメイン」という用語または同等の用語は、全長未満のタンパク質を有し、タンパク質の機能を維持するタンパク質の部分を指す。さらに、タンパク質の部分がタンパク質と再びブラストされると、タンパク質配列の部分は、タンパク質配列の一部と少なくとも８０％の同一性でアライメントする。

本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」、「核酸」、「オリゴヌクレオチド」という用語または同等の用語は、モノマーの配列がポリヌクレオチドを規定するポリマー配置のヌクレオチド塩基モノマーを含む分子を指す。ポリヌクレオチドは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を産生するためのデオキシリボヌクレオチドのポリマー、およびリボ核酸（ＲＮＡ）を産生するためのリボヌクレオチドのポリマーを含み得る。ポリヌクレオチドは一本鎖または二本鎖であり得る。一本鎖の場合、ポリヌクレオチドは、遺伝子のセンス鎖またはアンチセンス鎖に対応し得る。一本鎖ポリヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドの相補的部分とハイブリダイズして、ホモ二重鎖またはヘテロ二重鎖であり得る二重鎖を形成し得る。ポリヌクレオチドの長さは、いかなる点においても制限されない。ヌクレオチド間の結合は、ヌクレオチド間タイプのホスホジエステル結合または任意の他のタイプの結合であり得る。ポリヌクレオチドは、インビボ（細胞内）またはインビトロ（無細胞系）のいずれかで生物学的手段により（例えば、酵素的に）産生され得る。ポリヌクレオチドは、無酵素系を使用して化学的に合成され得る。ポリヌクレオチドは、酵素的に伸長可能または酵素的に伸長不可能であり得る。

本明細書で使用される場合、「ベクター」、「ビヒクル」、「構築物」および「プラスミド」という用語は、ある生物から別のものに核酸セグメント（複数可）を移すために増殖および使用され得る任意の組換えポリヌクレオチド分子に関して使用される。ベクターは、一般に、ベクター増殖および操作を媒介する部分を含む（例えば、１つまたはそれを超える複製起点、薬物または抗生物質耐性を付与する遺伝子、多重クローニング部位、クローニングされた遺伝子の発現を可能にする作動可能に連結されたプロモーター／エンハンサーエレメントなど）。ベクターは一般に組換え核酸分子であり、多くの場合、バクテリオファージまたは植物もしくは動物ウイルスに由来する。プラスミドおよびコスミドは、２つのこのような組換えベクターを指す。「クローニングベクター」または「シャトルベクター」または「サブクローニングベクター」は、サブクローニング工程を容易にする作動可能に連結された部分を含有する（例えば、複数の制限エンドヌクレアーゼ標的配列を含有する多重クローニング部位）。核酸ベクターは、ベクターのタイプまたは用途のタイプに応じて、線状分子または環状形態であり得る。いくつかの環状核酸ベクターは、細胞への送達前に意図的に線状化され得る。

本明細書で使用される場合、「遺伝子」という用語は、一般に、ネイティブな方法または組換え的な方法のいずれかで動作可能なように連結された場合に、いくつかの生成物または機能を提供するポリヌクレオチドエレメントの組み合わせを指す。「遺伝子」という用語は広く解釈されるべきであり、遺伝子のｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｃＲＮＡおよびゲノムＤＮＡ形態を包含し得る。いくつかの用途では、「遺伝子」という用語は、５’および３’非翻訳領域（５’－ＵＴＲおよび３’－ＵＴＲ）、エクソンおよびイントロンを含む転写配列を包含する。いくつかの遺伝子では、転写領域は、ポリペプチドをコードする「オープンリーディングフレーム」を含有する。この用語のいくつかの用途では、「遺伝子」は、ポリペプチドをコードするために必要なコード配列（例えば、「オープンリーディングフレーム」または「コード領域」）のみを含む。いくつかの態様では、遺伝子は、ポリペプチド、例えばリボソームＲＮＡ遺伝子（ｒＲＮＡ）およびトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）遺伝子をコードしない。いくつかの態様では、「遺伝子」という用語は、転写配列だけではなく、加えて、上流および下流調節領域、エンハンサーならびにプロモーターを含む非転写領域も含む。「遺伝子」という用語は、遺伝子のｍＲＮＡ、ｃＤＮＡおよびゲノム形態を包含する。

本明細書で使用される場合、「被験体」、「個体」または「患者」という用語は、本明細書で互換的に頻繁に使用される。「被験体」は、発現された遺伝物質を含有する生物学的実体であり得る。生物学的実体は、例えば、細菌、ウイルス、真菌および原生動物を含む植物、動物または微生物であり得る。被験体は、インビボで得られたかまたはインビトロで培養された生物学的実体の組織、細胞およびそれらの子孫であり得る。被験体は哺乳動物であり得る。哺乳動物はヒトであり得る。被験体は、疾患の高いリスクがあると診断され得るかまたは疑われ得る。疾患はがんであり得る。いくつかの場合では、被験体は、疾患の高いリスクがあると必ずしも診断されなくてもよいしまたは疑われなくてもよい。

本明細書で使用される場合、「インビボ」という用語は、被験体の体内で起こる事象を説明するために使用される。

本明細書で使用される場合、「エクスビボ」という用語は、被験体の体外で起こる事象を説明するために使用される。「エクスビボ」アッセイは、被験体に対して実施されない。むしろ、それは、被験体とは別個のサンプルに対して実施される。サンプルに対して実施される「エクスビボ」アッセイの例は、「インビトロ」アッセイである。

本明細書で使用される場合、「インビトロ」という用語は、材料が得られた生きている生物学的供給源生物から分離されるように、実験用試薬を保持するための容器に含まれて起こる事象を説明するために使用される。インビトロアッセイは、生きているまたは死んでいる細胞が用いられる細胞ベースのアッセイを包含し得る。インビトロアッセイはまた、インタクトな細胞が用いられない無細胞アッセイを包含し得る。

「処置する」または「処置」は、目的が標的とした病的状態または障害を防止または減速（軽減）することである治療的処置および予防的もしくは防止的手段の両方を指す。処置が必要な者としては、障害を既に有する者、および障害を有する傾向がある者、または障害を予防すべき者が挙げられる。治療利益は、症状のまたは処置されている基礎障害の根絶または改善を指し得る。また、治療利益は、被験体が依然として基礎障害に罹患している可能性があるにもかかわらず、改善が被験体において観察されるような、基礎障害に関連する生理学的症状の１つまたはそれよりも多くの根絶または改善により達成され得る。予防効果としては、疾患もしくは状態の出現の遅延、防止もしくは排除、疾患もしくは状態の症状の発症の遅延もしくは排除、疾患もしくは状態の進行の減速、停止もしくは逆転、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。予防利益については、特定の疾患を発症するリスクがある被験体、または疾患の生理学的症状の１つもしくはそれよりも多くを報告する被験体は、この疾患の診断がなされていない場合であっても、処置を受け得る。

本明細書では、特定の範囲が示され、「約」という用語が数値の前に付く。「約」という用語は、本明細書では、それが前に付く正確な数字、ならびにその用語が前に付く数字に近いまたは近似の数字、例えばそれが前に付く数値の１０％以内の数字に関する文言的裏付けを提供するために使用される。数字が具体的に記載されている数字に近いかまたは近似するかの決定では、近いかまたは近似する記載されていない数字は、それが示されている文脈において、具体的に記載されている数字と実質的に同等物を提供する数字であり得る。値の範囲が提供される場合、下限の単位の１０分の１までで、文脈上特に明確な指示がない限り、その範囲の上限～下限の、およびその記載範囲内の任意の他の記載値または中間値（ｉｎｔｅｒｖｅｎｉｎｇ ｖａｌｕｅ）の各中間値は、本明細書に記載される方法および組成物内に包含されると理解される。これらのより小範囲の上限および下限は独立してより小範囲内に含まれ得、記載範囲内の任意の具体的に除外された限界を条件として、本明細書に記載される方法および組成物内にも含まれる。記載範囲が限界の一方または両方を含む場合、それらの含まれる限界のいずれかまたは両方を除外する範囲もまた、本明細書に記載される方法および組成物内に含まれる。

本開示を通じて「Ｃａｓ９」について頻繁に言及される。Ｃａｓ９は特定の実施形態であるが、さらなるプログラム可能なエンドヌクレアーゼ、例えばＣａｓ１２または他のものも企図されると理解される。したがって、Ｃａｓ９の言及は、代替または他のプログラム可能なエンドヌクレアーゼを除外すると必ずしも読まれるべきではない。

同様に、「ｈＥＸＯ１」は頻繁に言及される。ｈＥＸＯ１は特定の実施形態であるが、さらなるプログラム可能なエンドヌクレアーゼも企図されると理解される。したがって、ｈＥＸＯ１の言及は、代替または他のエキソヌクレアーゼを除外すると必ずしも読まれるべきではない。

特に定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本明細書に記載される方法および組成物が属する分野の当業者により一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似または同等の任意の方法および材料もまた、本明細書に記載される方法および組成物の実施または試験において使用され得るが、代表的な例示的方法および材料が次に記載されている。
図の説明

図１は、９つのＣａｓ９－ＨＲ融合タンパク質を示す。第１の融合タンパク質は、リンカーＦＬ２Ｘを介して、Ｎ末端ＮＬＳを有するＣａｓ９（配列番号２～１８のいずれか１つ）にカップリングしたｈＥｘｏ１（配列番号１）を含む。第２の融合タンパク質は、リンカーＳＬＡ２Ｘを介して、Ｎ末端ＮＬＳを有するＣａｓ９（配列番号２～１８のいずれか１つ）にカップリングしたｈＥｘｏ１（配列番号１）を含む。第３の融合タンパク質は、リンカーＡＰ５Ｘを介して、Ｎ末端ＮＬＳを有するＣａｓ９（配列番号２～１８のいずれか１つ）にカップリングしたｈＥｘｏ１（配列番号１）を含む。第４の融合タンパク質は、リンカーＦＬ１Ｘを介して、Ｎ末端ＮＬＳを有するＣａｓ９（配列番号２～１８のいずれか１つ）にカップリングしたｈＥｘｏ１（配列番号１）を含む。第５の融合タンパク質は、リンカーＳＬＡ１Ｘを介して、Ｎ末端ＮＬＳを有するＣａｓ９（配列番号２～１８のいずれか１つ）にカップリングしたｈＥｘｏ１（配列番号１）を含む。第６の融合タンパク質は、リンカーＦＬ２Ｘを介して、Ｎ末端ＮＬＳおよびＣ末端ＮＬＳを有するＣａｓ９（配列番号２～１８のいずれか１つ）にカップリングしたｈＥｘｏ１（配列番号１）を含む。第７の融合タンパク質は、リンカーＳＬＡ２Ｘを介して、Ｎ末端ＮＬＳおよびＣ末端ＮＬＳを有するＣａｓ９（配列番号２～１８のいずれか１つ）にカップリングしたｈＥｘｏ１（配列番号１）を含む。そして、第８の融合タンパク質は、リンカーＡＰ５Ｘを介して、Ｎ末端ＮＬＳおよびＣ末端ＮＬＳを有するＣａｓ９（配列番号２～１８のいずれか１つ）にカップリングしたｈＥｘｏ１（配列番号１）を含む。第９の融合タンパク質は、Ｎ末端ＮＬＳおよびＣ末端ＮＬＳを有するＣａｓ９（配列番号２～１８のいずれか１つ）に直接カップリングしたｈＥｘｏ１（配列番号１）を含む。

図２は、ヌクレオチド切断および置き換えのための目的の標的部位の実施形態を示す。目的の標的部位は、６番染色体上のヒトＨ２Ｂ遺伝子の３’末端まで約１ｋｂである。この図はまた、５’末端でＣＭＶプロモーターにカップリングし、３’末端でＳＶ４０ポリ（Ａ）にカップリングしたプロマイシン抗生物質耐性カセットを含有するＨＤＲテンプレートの実施形態を示す。さらに、ＨＤＲテンプレートは、上記目的の標的部位に対する５’および３’相同領域を含有する。ＨＤＲテンプレートのＲＮＰ切断を防止するために、単一のＧ→Ｃ変異がＰＡＭ配列に導入される。

図３は、実験計画の実施形態を示す。細胞を９６ウェルプレート中で培養し、約２．５×１０^４個の細胞を各ウェルに播種する。９６ウェルプレートの各列は、それぞれ異なるプラスミドによる処理を受ける。各列は８つのウェルを含有するので、各処理は８個の反復を有する。１列目の細胞は、図１に示されている第１の融合タンパク質をコードするプラスミドをトランスフェクトされ；２列目の細胞は、図１に示されている第２の融合タンパク質をコードするプラスミドをトランスフェクトされ；３列目の細胞は、図１に示されている第３の融合タンパク質をコードするプラスミドをトランスフェクトされ；４列目の細胞は、図１に示されている第４の融合タンパク質をコードするプラスミドをトランスフェクトされ；５列目の細胞は、図１に示されている第５の融合タンパク質をコードするプラスミドをトランスフェクトされ；６列目の細胞は、図１に示されている第６の融合タンパク質をコードするプラスミドをトランスフェクトされ；７列目の細胞は、図１に示されている第７の融合タンパク質をコードするプラスミドをトランスフェクトされ；８列目の細胞は、図１に示されている第８の融合タンパク質をコードするプラスミドをトランスフェクトされる。さらに、９列目の細胞は、未改変Ｃａｓ９酵素をコードするプラスミドをトランスフェクトされる。１０列目の細胞は、ＧＦＰをコードするプラスミドをトランスフェクトされる。１１列目の細胞は、いかなる処理もない対照である。

図４は、ピューロマイシン選択前の測定されたレゾルフィン蛍光の正規化変化倍率を示す棒グラフを示す。ｙ軸は正規化変化倍率の数を示し、ｘ軸は、それぞれ８つの融合タンパク質、未改変Ｃａｓ９およびＧＦＰをコードするプラスミドによる処理ならびに非トランスフェクト対照を示す。対照処理からの細胞は、最小の細胞毒性により最大のレゾルフィン蛍光を有すると予想される。対照処理のレゾルフィン蛍光測定は１に対して正規化されるので、それらの正規化変化倍率数（ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ ｎｕｍｂｅｒ）は１である。あらゆる他の処理のレゾルフィン蛍光測定を対照処理と比較して、正規化変化倍率数を得る。また、すべての処理はある程度の細胞毒性を有するので、各処理は、１未満の正規化変化倍率数を有し得ると予想される。例えば、野生型Ｃａｓ９による処理は、対照処理と比較して最小の変化倍率数を示すが、これは、野生型Ｃａｓ９トランスフェクト細胞が、最小量のレゾルフィン蛍光を有することを意味している。対照的に、第７の融合タンパク質およびＧＦＰをコードするプラスミドによる処理は、類似した最大変化倍率数を示すが、これは、トランスフェクト細胞が、２番目に多い量のレゾルフィン蛍光を有することを示している。

図５は、野生型Ｃａｓ９酵素をコードするプラスミドを細胞にトランスフェクトした後２日目の測定されたレゾルフィン蛍光の正規化変化倍率を示す棒グラフを示す。左のバーは、ＤＭＳＯで処理した細胞の正規化変化倍率数を示し、右のバーは、腫瘍抑制因子ｐ５３の転写活性を特異的に遮断するＰＦＴ－αで処理した細胞の正規化変化倍率数を示す。右のバーは左のバーよりも高い数値を示すが、これは、ＰＦＴ－αで処理した細胞が、増加したレゾルフィン蛍光測定を有するので、ＰＦＴ－αが細胞毒性を減少させることを意味している。これは、Ａ５４９細胞において見られるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムに関連する細胞毒性が、他のヒト細胞タイプにおいて見られるＣａｓ９媒介細胞毒性を促す主な因子であるｐ５３に少なくとも部分的に依存することを示す。Ａ５４９細胞は、ｐ５３活性について陽性である。

図６は、対照細胞に対して異なるｇＲＮＡ配列を有するＲＮＰプラスミドをトランスフェクトした細胞のレゾルフィン蛍光の正規化変化倍率を示す棒グラフを示す。図６のパネルＡは、ＨＢＢ遺伝子のエクソン１を標的とするように設計された３つのｇＲＮＡ配列（Ｇ１、Ｇ２およびＧ３）を示す。図６のパネルＢでは、ｙ軸は正規化変化倍率の数値を示し、ｘ軸は、ＮＴ ＨＢＢ－Ｇ１、ＮＴ ＨＢＢ－Ｇ２、ＮＴ ＨＢＢ－Ｇ３および対照の列を示す。対照のレゾルフィン蛍光測定は１に対して正規化されるので、それらの正規化変化倍率数は１である。ＮＴ ＨＢＢ－Ｇ３は最小の正規化変化倍率数を有するが、これはそれが最小のレゾルフィン蛍光を有することを示している。図６のパネルＣは、ＩＮＤＥＬの生成を示すＣａｓ９ ＨＢＢ－Ｇ３逆配列トレースを示し、毒性をヌクレアーゼ切断活性に関連付ける。

図７は、実験計画の実施形態を示す。細胞を９６ウェルプレート中で培養し、約２．５×１０^４個の細胞を各ウェルに播種する。９６ウェルプレートの各列は、それぞれ異なるプラスミドによる処理を受ける。各列は８つのウェルを含有するので、各処理は８個の反復を有する。１列目の細胞は、図１に示されている第１の融合タンパク質をコードするプラスミドをトランスフェクトされ；２列目の細胞は、図１に示されている第２の融合タンパク質をコードするプラスミドをトランスフェクトされ；３列目の細胞は、図１に示されている第３の融合タンパク質をコードするプラスミドをトランスフェクトされ；４列目の細胞は、図１に示されている第４の融合タンパク質をコードするプラスミドをトランスフェクトされ；５列目の細胞は、図１に示されている第５の融合タンパク質をコードするプラスミドをトランスフェクトされ；６列目の細胞は、図１に示されている第６の融合タンパク質をコードするプラスミドをトランスフェクトされ；７列目の細胞は、図１に示されている第７の融合タンパク質をコードするプラスミドをトランスフェクトされ；８列目の細胞は、図１に示されている第８の融合タンパク質をコードするプラスミドをトランスフェクトされ；９列目の細胞は、図１に示されている第９の融合タンパク質をコードするプラスミドをトランスフェクトされる。さらに、１０列目の細胞は、未改変Ｃａｓ９酵素をコードするプラスミドをトランスフェクトされ、１１列目の細胞は、未改変Ｃａｓ９酵素をコードするプラスミドと、ｈＥｘｏ１（１－３５２）をコードするプラスミドとをトランスフェクトされる。１２列目の細胞は、ＧＦＰをコードするプラスミドをトランスフェクトされる。１３列目の細胞は、いかなる処理もない対照である。

図８は、測定されたレゾルフィン蛍光の正規化変化倍率を示す棒グラフを示す。ｙ軸は正規化変化倍率の数値を示し、ｘ軸は、それぞれ９つの融合タンパク質およびＧ３（配列番号２３）ｇＲＮＡをコードするＲＮＰプラスミドによる処理を示す。ｘ軸は、２つのさらなる処理をさらに示す：一方は、未改変Ｃａｓ９およびＧ３ ｇＲＮＡをコードするＲＮＰプラスミドを細胞にトランスフェクトし（Ｃａｓ９ ＷＴ）；他方は、別個に未改変Ｃａｓ９およびｈＥｘｏ１ならびにＧ３ ｇＲＮＡをコードするＲＮＡプラスミドを細胞にトランスフェクトする（Ｃａｓ９ ＷＴ＋Ｅｘｏ１）。また、ｘ軸は、いかなる処理もないＧＦＰ処理群および対照群を示す。正規化変化倍率数は１であるので、対照群のレゾルフィン蛍光測定は１に対して正規化される。あらゆる他の処理のレゾルフィン蛍光測定を対照群と比較して、正規化変化倍率数を得る。予想通り、すべての他の処理とは異なる程度の細胞毒性が観察され、Ｃａｓ９およびＣａｓ９＋ｈＥｘｏ１群は最小の正規化変化倍率数を示すが、これは、２つの陽性対照群からのトランスフェクト細胞が最小量のレゾルフィン蛍光を有することを示し、Ｃａｓ９へのｈＥｘｏ１の直接融合が毒性減少に必要であることをさらに実証している。

図９Ａ～Ｂは、測定されたレゾルフィン蛍光の正規化変化倍率を示す棒グラフを示す。図９Ａは、ＨＢＢ遺伝子のエクソン１を標的とするＧ２およびＧ３ ｇＲＮＡを示す。パネル図９Ｂでは、ｙ軸は正規化変化倍率の数値を示し、ｘ軸は、第７の融合タンパク質とＧ３ ｇＲＮＡをコードするＲＮＰプラスミドおよび未改変Ｃａｓ９およびＧ２ ｇＲＮＡをコードするＲＮＰプラスミドならびに対照による処理を示す。正規化変化倍率数は１であるので、対照群のレゾルフィン蛍光測定は１に対して正規化される。あらゆる他の処理のレゾルフィン蛍光測定を対照群と比較して、正規化変化倍率数を得る。未改変Ｃａｓ９およびＧ２ ｇＲＮＡをコードするＲＮＰプラスミドの群は、最低の正規化変化倍率数を示すが、これは、この群からのトランスフェクト細胞が最小量のレゾルフィン蛍光を有することを示している。

図１０は、一本鎖相同組換え修復テンプレート（ＨＤＲＴ）の有無にかかわらず、ＨＢＢ遺伝子のエクソン１を標的とする異なるＲＮＰプラスミドをトランスフェクトした細胞のレゾルフィン蛍光の正規化変化倍率を示す。ＨＤＲＴを有するおよび有しないＣａｓ９－ＨＲ７は両方とも、増加したレゾルフィン蛍光（したがって細胞毒性の減少）を示す。加えて、ＨＤＲＴの付加は、Ｃａｓ９－ＨＲ７および野生型Ｃａｓ９（ＮＴ）の両方の毒性を減少させるが、しかしながら、本発明者らは、この影響が特異的であるか（ＨＢＢエクソン１の相同アームを必要とするか）、またはＨＤＲＴが、Ｃａｓ９－ＨＲ７およびＣａｓ９（ＮＴ）をコードするプラスミドのトランスフェクションと単に競合するかは分からない。とにかく、Ｃａｓ９－ＨＲ７は減少した毒性を示す。

図１１Ａは、Ｕ６プロモーター駆動ｇＲＮＡ発現と一緒に、哺乳動物Ｃａｓ９発現のための構成的プロモーターを含有するプラスミドＰＸ３３０の図である。様々なＣａｓ９－ＨＲバージョン１～９を産生するようにこのプラスミドを改変した。

図１１Ｂは、細胞を９６ウェルガラス底ウェルプレートに播種する実験設定の例である。トランスフェクションの２日後に、レゾルフィンへのレサズリンの変換により細胞毒性を定量し、次いで、非トランスフェクト対照に対して正規化して、実験間の正確な比較を可能にする。９６ウェルプレートの上に示されているように、各列は異なる処理であり、８つの行は、各処理の８個の独立した反復を提供する。

図１１Ｃは、１２番染色体上の遺伝子間領域を標的とするｇＲＮＡを有するＡ５４９細胞における細胞毒性の減少を示すグラフである。Ｃａｓ９－ＨＲ構築物１～８は、より高い正規化変化倍率値により示されているように、Ａ５４９細胞において未改変Ｃａｓ９よりも有意に低い毒性を有する。Ｃａｓ９－ＨＲ１～８、Ｃａｓ９、Ｃａｓ９＋ｈＥｘｏ１、ＧＦＰおよび非トランスフェクト対照（Ｃｏｎ）の平均は、Ｃｏｎ平均蛍光に対して正規化される。重要なことに、Ｃａｓ９およびｈＥｘｏ１の両方のトランスフェクションは、Ｃａｓ９のみと比べて毒性を減少させないので、Ｃａｓ９およびｈＥｘｏ１の物理的カップリングは毒性減少に必要である。すべての実験は、２回反復の独立したウェルプレート（合計１６個の反復）で行われ、エラーバーは平均の標準誤差を表す。

図１１Ｄは、アルファ－ピフィスリン（１０マイクロモル濃度）による処理が、Ａ５４９細胞においてＣａｓ９誘導細胞毒性を減少させることを示すグラフである。図５の拡大として、ここでは、ＤＭＳＯの追加は、Ｃａｓ９のみのトランスフェクションと比べて毒性を変化させないことが分かるが、これは、ＰＦＴ－αで見られる効果が特異的であることを示している。

図１２Ａは、ピューロマイシン耐性修復テンプレート（ＲＴ）の図である。それは、５’相同アーム（５’）、強力な構成的ウイルスプロモーター（ｐＣＭＶ）、ピューロマイシン耐性遺伝子（Ｐｕｒｏ）、ポリＡ配列（ＳＣ４０Ｐａ）および３’相同アーム（３’）を含有する。修復テンプレートの下には、ガイドＩｎｔ－Ｇ２およびＧ３により標的とされるゲノム領域がある。修復テンプレートは、両方のガイド配列の中央に組み込まれ、それにより、Ｃａｓ９のさらなる切断を防止するように設計されている。組み込み部位は、６番染色体上のＨ２Ｂ－ＢとＨ２Ｂ－Ａとの間の遺伝子間領域にあり、これが、ゲノムの遺伝子間領域およびコード領域の両方で機能するＣａｓ９－ＨＲの能力を試験することを可能にする。さらに、両鎖をターゲティングして、センスおよびアンチセンス方向の両方でＣａｓ９－ＨＲ適合性を試験する。

図１２Ｂは、Ａ５４９細胞におけるｈＥｘｏ－Ｃａｓ９融合物の毒性を定量するために使用した方法を示す。Ａ５４９細胞を９６ウェルプレートにプレーティングし、前述のように、標準的なＣａｌ－Ｐｈｏｓプロトコールにより、５００ｎｇの各プラスミドおよび１００ｎｇの修復テンプレートをトランスフェクトした。

図１２Ｃは、レサズリンアッセイを介して試験した様々な構築物の毒性を示すグラフである。すべてのＣａｓ９－ＨＲ構築物は、Ｃａｓ９－ＮＴよりも有意に低い毒性（より高い正規化蛍光）を示し、８は、修復テンプレートのみの対照と毒性の統計的有意差（ｓｔａｔｉｃａｌｌｙ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ）がない。加えて、センスおよびアンチセンスの両方を標的とするＣａｓ９－ＨＲは、同様の毒性減少を示したが、これは、Ｃａｓ９－ＨＲがいずれの方向でも機能し得ることを示している。

図１２Ｄは、Ｃａｓ９－ＨＲ８およびＣａｓ９のＨＤＲ活性を測定するためのアッセイの方法を示す。このアッセイは、ピューロマイシンによる処理に対する細胞生存率を測定することにより、ＨＤＲ率を特定する。これは生存アッセイであり、Ａ５４９細胞は、Ｃａｓ９のトランスフェクションに対して有意なｐ５３依存的細胞毒性を示したので、ＨＤＲ率の正確な定量を容易にするために、Ｋ５６２細胞（ｐ５３－／－）を代わりに使用した。５００ｎｇのＣａｓ９－ＨＲ８またはＣａｓ９のいずれかおよび１００ｎｇの修復テンプレートのエレクトロポレーション後、Ｋ５６２細胞を１２ウェルプレートに分注した。２日後、ＤＮＡを抽出し、ピューロマイシン（０．５ｍｇ／ｍＬ）選択を開始した。選択の３日後、９６ウェルプレート中のレサズリンにより、Ｋ５６２細胞を定量した。

図１２Ｅは、Ｐｕｒｏ－ＲＴにより成功裏に組み込まれた細胞のゲノム領域の描写である。一方のプライマーが修復テンプレートの外側のゲノム領域に結合し、他方のプライマーがピューロマイシンカセットに特異的な配列に結合するように、左のプライマーペアおよび右のプライマーペアは設計されている。５’および３’プライマーセットの両方の増幅の成功は、導入遺伝子の正しい組み込みを強く示している。

図１２Ｆは、ピューロマイシン処理の３日後の、Ｃａｓ９－ＨＲ８またはＣａｓ９とＧ２またはＧ３ ｇＲＮＡをトランスフェクトしたＫ５６２細胞の生存データを示す。ＲＴを含有するプラスミドをトランスフェクトした細胞に対してデータを正規化した。ピューロマイシン選択の３日後、センス（Ｉｎｔ－Ｇ２）およびアンチセンス（Ｉｎｔ－Ｇ３）を標的とするＣａｓ９－ＨＲ８は、野生型Ｃａｓ９（ＮＴ）と比べて、正規化レゾルフィン蛍光の２倍を超える増加を示した。レゾルフィン蛍光の２倍の増加は、ＨＤＲ率の少なくとも２倍の増加に相当するが、これは、Ｃａｓ９－ＨＲが毒性を劇的に減少させ得るだけではなく、それらが、複数の細胞タイプにおいてＨＤＲ率およびＣａｓ９－ＨＲ機能を増加させ得ることを示している。

図１２Ｇは、５’および３’プライマーペアの両方による標的領域の増幅後のアガロースゲルを示し、修復テンプレートが、図１の第８の融合タンパク質およびＣａｓ－９対照（ＮＴ）により成功裏に組み込まれたことを示す。ＧＦＰ構築物のみ（ＧＦＰ）またはテンプレートなし（Ｃｏｎ）をトランスフェクトした場合、標的領域の増幅はなかった。

図１３Ａは、ヒトヘモグロビンベータ（ＨＢＢ）遺伝子を編集することを目的にしたＨＢＢの最初の２つのエクソンを含むゲノム領域を示す。挿入図は、試験したｇＲＮＡを示す図と共に、エクソン１の拡大バージョンを示す。グラフは、Ａ５４９細胞におけるＨＢＢ ｇＲＮＡガイドの毒性スクリーニングからのデータを示す。図１１Ｄのように毒性実験を実施し、ＨＢＢ－Ｇ３は、ＨＢＢ－Ｇ１またはＨＢＢ－Ｇ２のいずれよりも高い毒性を示した。

図１３Ｂは、ＨＢＢ－Ｇ３処理Ａ５４９細胞におけるＨＢＢゲノム領域のサンガーシークエンシングを示す。サンガーシークエンシングは、ＮＨＥＪ経路を介したＣａｓ９切断および修復後の特徴的なノイズを示し、バーはｇＲＮＡ配列を示す。この場合、リバースプライマーによる配列により、ノイズは３’ではなく５’である。ＨＢＢ－Ｇ１またはＨＢＢ－Ｇ２で処理した細胞では、ＮＨＥＪを介した明確な切断および修復を検出することができなかった。

図１３Ｃは、野生型ＨＢＢ配列およびＳＳＲＴ－Ｇ３配列（これは、鎌状赤血球（Ｅ６Ｖ）と、ミスセンス変異を作り出すＥｃｏＲＩ部位と、４つのサイレントミスマッチ変異（太字のａ、ａ、ａおよびｇヌクレオチド塩基）とを導入する）の図であり、ＨＢＢ－Ｇ３ ｇＲＮＡは、上のバーにより強調されている。一本鎖修復テンプレート（ＳＳＲＴ）－Ｇ３は１２０ｂｐの長さであり、予測切断部位の両側に６０ｂｐアームを有する。変異は、修復の成功によりｇＲＮＡ結合を防止するように設計されている

図１３Ｄは、Ｃａｓ９＋ＳＳＲＴ－Ｇ３、Ｃａｓ９－ＨＲ１～９＋ＳＳＲＴ－Ｇ３またはＳＳＲＴ－Ｇ３のみをＫ５６２細胞またはＡ５４９細胞にエレクトロポレーションするＨＢＢ編集実験を示す。２日後、図１１Ｄのように細胞を定量する。次いで、ＤＮＡを抽出し、２つのプライマーペアを用いてＨＢＢ遺伝子座を増幅する。ＥｃｏＲＩで外側ペアを消化してＨＤＲ編集率を定量し、内側ペアをディープシークエンシングに使用して、ＩＮＤＥＬ率に加えてＨＤＲ率の独立した定量を提供し、ＨＤＲ／ＩＮＤＥＬ比の正確な定量を可能にし得る。

図１４は、図１に示されているように、ＨＢＢ－Ｇ３ ｇＲＮＡならびにＣａｓ９－ＨＲ融合タンパク質４および５をＡ５４９細胞にトランスフェクトすることにより決定した場合の、２つのトランスフェクション方法（リポフェクタミンおよびリン酸カルシウム（ＣａｌＰｈｏｓ））の毒性評価を示す。Ｃａｓ９－ＨＲ４および５で見られるＣａｌ－Ｐｈｏｓまたはリポフェクタミンのいずれかを使用した同様の結果は、毒性作用が特定のトランスフェクション試薬／方法に依存しないことを強く示している。加えて、Ｃａｓ９（ＮＴ）のリポフェクタミントランスフェクションは、Ｃａｌ－Ｐｈｏｓトランスフェクションと比べて増加した毒性を示したが、これは実際には、Ｃａｌ－Ｐｈｏｓトランスフェクションが、おそらくはより効率的なリポフェクタミントランスフェクションと比較して、Ｃａｓ９－ＨＲによる毒性の減少を実際に過少報告し得ることを示している。

図１５は、図１３ＡのＳＳＲＴ ＨＢＢ修復テンプレートをＡ５４９細胞にトランスフェクトすることによる毒性評価を示す。トランスフェクション後２日目に、レサズリンレベルを測定する。Ａ５４９細胞では、Ｃａｓ９－ＨＲ融合タンパク質４および８はより低い毒性である。特にＮＴの場合、ＳＳＲＴは、細胞毒性の毒性（ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｔｏｘｉｃｉｔｙ）を減少させる。

図１６Ａは、ＨＢＢ修復テンプレートをＫ５６２細胞のゲノムに組み込んだ図１のＣａｓ９－ＨＲ融合タンパク質８を示すＥｃｏＲＩ消化アッセイのアガロースゲルを示す。矢印はＥｃｏＲＩ消化産物を示す。Ｃａｓ９のみ（ＮＴ）、ＳＳＲＴおよびＣｏｎ（Ｃａｓ９なし）のレーンでは、検出可能なＥｃｏＲＩ消化産物はない。これは、修復テンプレート選択においてＣａｓ９－ＨＲが柔軟であり、ＳＳＲＴおよび二本鎖（ＤＳ）ＲＴの両方をゲノム編集に使用し得ることを示している。

図１６Ｂは、ＨＢＢ修復テンプレートをＫ５６２細胞のゲノムに組み込んだ図１のＣａｓ９－ＨＲ融合タンパク質４、５、６、７および８を示すＥｃｏＲＩ消化アッセイのアガロースゲルを示す。矢印はＥｃｏＲＩ消化産物を示し、ＨＤＲの成功を示す。先の毒性結果（図８）から予想されるように、Ｃａｓ９－ＨＲ４は最も高いＨＤＲ率を有するように見え、すべての他のＣａｓ９－ＨＲおよびＣａｓ９（ＮＴ）は、非トランスフェクト対照（Ｃｏｎ）の消化と比較していくらかのレベルのＨＤＲの成功を示す。

図１６Ｃは、（図１に示されている）Ｃａｓ９－ＨＲ融合タンパク質４、５、６、７および８、Ｃａｓ９のみ（ＮＴ）ならびにＣｏｎ（Ｃａｓ９なし）のウエスタンブロッティングを示す。矢印は、Ｃａｓ９－ＨＲ融合タンパク質およびＮＴレーンにおけるＣａｓ９の検出を示す。融合物４～７の量は少ないように見えるが、さらなるブロットおよびＩＨＣ（図１６Ｅ）は、すべてのＣａｓ９－ＨＲの適切な発現および局在を示しており、これは、毒性の減少が発現レベルの減少によるものである可能性が低いことを示している。例として、Ｃａｓ９－ＨＲ４および８は、ウエスタンブロットによりアッセイしたＣａｓ９－ＨＲの最も低いおよび最も高い発現体の一部である。発現を減少させることにより細胞毒性が本当に減少した場合、Ｃａｓ９－ＨＲ４は、ゲノム中の試験したあらゆる標的で最も低い毒性を有すると予想される。しかしながら、図１１Ｃおよび図１２Ｃは、Ｃａｓ９－ＨＲ４が実際には、試験したすべてのＣａｓ９－ＨＲの中で最も高い毒性を有するのに対して、Ｃａｓ９－ＨＲ８が最も低い毒性であることを示すので、それはそのケースではない。これらの結果を考慮すると、発現レベルは、細胞毒性の決定において重大な役割を果たさない可能性がかなり高く、これは、ＨＢＢ ｅｘｏ１を標的とする場合、Ｃａｓ９－ＨＲ４は、試験したすべてのＣａｓ９－ＨＲの中で最大の毒性減少を有するという事実によりさらに証明されており（図８）、したがって、発現レベルと毒性との間の明確な相関関係は示されていない。最後に、Ｃａｓ９－ＨＲ４および８は、ゲノム中の様々な部位で毒性の相補的減少を示すように見えることに注目することは興味深い：Ｃａｓ９－ＨＲ４が毒性を減少させる場合、Ｃａｓ９－ＨＲ８は減少させず（または低減があまり効果的でない）、逆もまた同様である。これは、これらの異なる環境における異なる局所クロマチン環境を証明し得、異なるリンカー同一性が、異なるクロマチン環境におけるｈＥｘｏ１ドメインの最適配置を可能にする可能性がある。したがって、異なるバージョンのＣａｓ９－ＨＲの使用は、ゲノム全体のほぼすべての位置で毒性の減少（およびＨＤＲの増加）を可能にし得る。

図１６Ｄは、クーマシー染色を用いたＳＤＳ－ＰＡＧＥを介してモニタリングした大腸菌由来のＣａｓ９－ＨＲ３の発現および精製の成功を示す。レーンＬはラダーである。レーン１および８は、細胞溶解物の可溶性画分である。レーン２および９は、不溶性溶解細胞ペレットである。レーン３および１０は、ニッケル（Ｎｉ－ＮＴＡ）カラムを通過する可溶性画分のフロースルーである。レーン４および１１は、ニッケルに結合したタンパク質が溶出した溶出画分である。レーン５および１２は、スルホプロイル（ｓｕｌｐｈｏｐｒｏｙｌ）（ＳＰ）陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂のフロースルーである。レーン６および１３は、５００ｍＭ ＮａＣｌで溶出した溶出画分である。レーン７および１４は、１Ｍ ＮａＣｌで溶出した溶出画分である。レーン１～７は、Ｃａｓ９－ＨＲ３をトランスフェクトした細胞由来のものである。レーン８～１４は精製プロトコールの対照として機能し、未改変Ｃａｓ９のみを発現する大腸菌由来のものである。Ｃａｓ９－ＨＲのための成功した大腸菌ベースのタンパク質精製プロトコールの開発は、Ｃａｓ９－ＨＲ活性のインビトロ試験、ならびに様々な真核生物の直接ＲＮＰトランスフェクションおよび編集の両方を可能にする。

図１６Ｅは、図１６Ｃと同じトランスフェクト細胞の免疫組織化学（ＩＨＣ）を示す。矢印は、Ｃａｓ９－ＨＲ融合物およびＣａｓ９が細胞の核に局在することを示す。核におけるすべてのＣａｓ９－ＨＲ４～８（５～７をアッセイし適切な局在が見られた、データは示さず）の検出および適切な局在は両方とも、Ｃａｓ９－ＨＲによる毒性の減少が、ＩＨＣによりアッセイされたように、不適切な局在および発現レベルの有意な減少によるものではないことをさらに実証している。

図１７Ａは、Ｈ２ＢｍＮｅｏｎノックイン実験のための修復テンプレートの設計を示す。この実験は、非生存ベースのアッセイにおいて適切に局在したＧＦＰ蛍光を介して、ＨＤＲ率の正確な定量を可能にする。

図１７Ｂは、上皮肺がん細胞株において図１のＣａｓ－ＨＲ融合タンパク質４、５、６および８、Ｃａｓ９のみ（ＮＴ）ならびにＣｏｎ（Ｃａｓ９なし）により誘導される細胞毒性のｐ５３依存的減少を示す。Ａ５４９細胞はｐ５３活性について陽性であり、Ｈ１２９９細胞はｐ５３活性について陰性である。正規化レサズリンレベル（ｙ軸）により決定した毒性は、Ｈ１２９９細胞におけるｐ５３の欠如がより低い細胞毒性をもたらすことを示す。Ａ５４９細胞では、Ｃａｓ９－ＨＲ８のみが、Ｃａｓ９（ＮＴ）と比べて毒性の有意な減少を示すが、Ｃａｓ９－ＨＲ４～７はＮＴに類似する。しかしながら、Ｈ１２９９細胞では、Ｃａｓ９－ＨＲ４～７およびＮＴの毒性は、Ｃａｓ９－ＨＲ８を有するＡ５４９において見られるおおよそのレベルまで劇的に減少するが、Ｃａｓ９－ＨＲ８は、さらに毒性をわずかに減少させる。先の実験と同様に、リンカー同一性が異なるためｈＥｘｏ１ドメインの異なる方向は、末端切除の尤度およびしたがってＨＤＲへの関与に影響を与えると予想される。この場合、Ｃａｓ９－ＨＲ８は最も高いＨＤＲ率を有する、これは、図１７Ｃで直接試験されている。Ｈ１２９９対Ａ５４９細胞におけるｐ５３機能の喪失は、Ｃａｓ９－ＨＲ４～７およびＮＴにおいて見られる毒性の有意な減少を促す可能性があるので、これは、ＰＦＴ－αを有するＡ５４９細胞において見られる結果もさらに裏付けている。加えて、Ｃａｓ９ ＨＲ８は、Ｈ１２９９細胞における他の融合タンパク質と比べて減少した毒性を有することに留意する。

図１７Ｃは、Ｋ５６２細胞における図１７Ａの（ＧＦＰ＋細胞定量による）Ｈ２Ｂのタグ付けの成功の評価を示す。ＩＨＣ画像中の矢印は、Ｈ２ＢｍＮｅｏｎノックインが成功した細胞の正しい発現および局在を示す。この実験からのデータは、Ａ５４９細胞における毒性の減少が、Ｋ５６２細胞におけるＨＤＲ率の増加に関連することを再び示しているが、これは、ｐ５３＋細胞におけるＣａｓ９－ＨＲによる毒性の減少がＨＤＲ率の代理として機能し得ることを示している。重要なことに、これは非生存ベースのアッセイであり、Ｃａｓ９（ＮＴ）と比較したＨＤＲ率の少なくとも２倍の増加（Ｃａｓ９－ＨＲ８については２．５倍）も示している。加えて、この実験は、Ｃａｓ９－ＨＲが、遺伝子間（図１２Ｆ）およびコード配列（この実験）の両方で同等に十分に機能し得ることを示している。

図１８Ａは、実験的に検証されたＣａｓ９のみのモデルと理論的Ｃａｓ９－ＨＲモデルとの間のスキーマの差を示す。エキソヌクレアーゼドメインの存在は、予測インビトロ切断パターンを根本的に変化させる。Ｅｘｏ１は、非リン酸化５’末端と対比してリン酸化５’末端に対する有意な選好性を有する。したがって、理論的には、ＰＣＲ産物または５’－リン酸化末端を通常欠く他のＤＮＡ片を使用する場合、Ｃａｓ９を介したエンドヌクレアーゼ切断が最初は優勢であり得るのに対して、切断後、２つの断片はそれぞれ、ｈＥｘｏ１を介した急速な分解をもたらし得る５’－リン酸化末端を有する。

図１８Ｂは、図１８Ａに基づく例示的な消化パターンを示す。Ｃａｓ９－ＨＲ３＋ｇＲＮＡおよびＣａｓ９－ＨＲ３のみが、インビトロヌクレアーゼ活性の成功を実証する消化産物を産生し得る。加えて、ｈＥｘｏ１はリン酸化５’末端を強く好むが、ｈＥｘｏ１は依然として非リン酸化５’末端に結合してそれを切除し得るので、ｇＲＮＡなしのＣａｓ９－ＨＲの追加では、ｇＲＮＡなしの少量の分解が見られ得る。

図１８Ｃは、図１８Ａおよび図１８Ｂの実際のアガロースの例を示す。ＨＢＢエクソン１の周辺の約９５０ｂｐの領域を増幅するプライマーを用いて、ゲノムＤＮＡを増幅した。レーン１および２は、ｇＲＮＡ ＨＢＢ－Ｇ１またはＨＢＢ－Ｇ３を有するＣａｓ９－ＨＲ３を示し、レーン３および４は、ｇＲＮＡ ＨＢＢ－Ｇ１またはＨＢＢ－Ｇ３を有するＣａｓ９（ＮＴ）を示し、レーン５は未処理対照である。Ｃａｓ９切断パターンは、検証されたモデルに基づいて予想された通りであり、ＨＢＢ－Ｇ１およびＧ３は両方とも強い切断を示し、初期産物（９５０ｂｐ）は明らかに減少し、切断産物（約５５０～３００ｂｐのバンドのペア）が蓄積する。Ｃａｓ９－ＨＲ３の切断パターンも予測パターンと一致し、大きな初期産物（９５０ｂｐ）の強度は明らかに減少するが、これは、Ｃａｓ９－ＨＲ３が機能的ガイドエンドヌクレアーゼ活性を保持することを実証している。加えて、Ｃａｓ９と比較して、Ｃａｓ９－ＨＲ３は、おそらくはｈＥｘｏ１ドメインを介した消化により、中間サイズの切断産物（６５０～３００ｂｐ）を産生しない。したがって、これらの結果は、Ｃａｓ９－ＨＲ３が、インビトロで両方の予想酵素活性（エンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼ）を示すことを示している。

図１８Ｄは、図１８Ｃと同様の実験を示すが、タンパク質安定性を比較するために、酵素を４℃で２週間放置した後に実験を行う点が異なる。レーン１は、Ｃａｓ９－ＨＲ３およびｇＲＮＡ ＨＢＢ－Ｇ１の組み合わせからの消化パターンである。レーン２は、Ｃａｓ９およびｇＲＮＡ ＨＢＢ－Ｇ１の組み合わせからの消化パターンである。レーン３は、Ｃａｓ９－ＨＲ３およびＨＢＢ－Ｇ３の組み合わせからの消化パターンである。レーン４は、Ｃａｓ９およびＨＢＢ－Ｇ３の組み合わせからの消化パターンである。レーン５は、Ｃａｓ９－ＨＲのみからの消化パターンである。レーン６は、Ｃａｓ９のみからの消化パターンである。レーン７は対照であり、Ｃａｓ９もｇＲＮＡもない。これらの結果は、Ｃａｓ９－ＨＲ３およびＣａｓ９が両方とも、同様のレベルの安定性を有することを示している。

図１９Ａは、Ｈ２Ｂ組み込み検出プライマーの設計を示す。２セットのプライマーは、修復テンプレートの５’および３’末端の外側に結合して、ＲＴではなくゲノムにのみ存在する配列にアニーリングするように設計されているが、他のものは、修復テンプレートに特異的な配列にアニーリングし、未改変細胞に存在しない。５’および３’プライマーセットの両方の増幅の成功は、ｍＮｅｏｎによるＨ２Ｂの適切なタグ付けの成功を強く示している。

図１９Ｂは、Ｃａｓ９－ＨＲ４、８およびＣａｓ９ＮＴ＋Ｈ２ＢｍＮｅｏｎＲＴをトランスフェクトしたＫ５６２細胞と非トランスフェクト対照（レーン４、８、ＮＴおよびＣｏｎ）から抽出したｇＤＮＡから増幅したＰＣＲ産物を示すアガロースゲルを示す。５’プライマーと、Ｃａｓ９－ＨＲ４、８およびＣａｓ９（ＮＴ）からのｇＤＮＡとによる増幅はすべて、５’産物の増幅の成功を示すが、Ｃｏｎはそうではなく、これは、ＲＴの５’末端の適切な組み込みを示している。加えて、Ｃａｓ９－ＨＲ８からのｇＤＮＡを使用したより大量の増幅産物は、図１７Ｃに見られるより高いＨＤＲ率に対応する。

図１９Ｃ、Ｃａｓ９－ＨＲ４、８およびＣａｓ９ＮＴ＋Ｈ２ＢｍＮｅｏｎＲＴをトランスフェクトしたＫ５６２細胞と非トランスフェクト対照から抽出したｇＤＮＡから増幅したＰＣＲ産物（レーン４、８、ＮＴおよびＣｏｎ）。Ｃａｓ９－ＨＲ８およびＣａｓ９のレベルは同様であるように見えるが、これら２つの有意に高い増幅を考慮すると、対数期を超えて反応が進行した可能性があり、定量の信頼性を低下させている。それにもかかわらず、３’プライマーと、Ｃａｓ９－ＨＲ４、８およびＣａｓ９（ＮＴ）からのｇＤＮＡとによる増幅はすべて、３’産物の増幅の成功を示すが、Ｃｏｎレーンは特定のバンドを示さず、これは、ＲＴの３’末端の適切な組み込みを示している。

図１９Ｄは、Ｃａｓ９－ＨＲ８からの５’プライマーにより増幅したＰＣＲ産物のサンガーシークエンシングからの配列トレースの吸光度を示す。上のトレースは産物の５’配列を示し、白色のバーはゲノムにのみ存在する配列を示し、影付きのバーはＲＴおよびゲノムの両方に存在する配列を示す。介在配列が切り取られ、下のトレースは産物の３’末端を示す。影付きのバーはやはりＨ２Ｂ ＯＲＦを表し、白色のバーはｍＮｅｏｎを表す。加えて、影付きのバーは、導入遺伝子組み込み後のさらなる切断を防止するために導入された２つのサイレント変異を示す。Ｃａｓ９－ＨＲ４およびＣａｓ９（ＮＴ）トレースは両方とも同じであった。

図１９Ｅは、Ｃａｓ９－ＨＲ８からの３’プライマーにより増幅したＰＣＲ産物のサンガーシークエンシングからの配列トレースの吸光度を示す。上のトレースは産物の５’配列を示し、白色のバーはｍＮｅｏｎを示し、影付きのバーはＲＴおよびゲノムの両方に存在する配列を示す。介在配列が切り取られ、下のトレースは産物の３’末端を示す。影付きのバーはやはりＨ２Ｂ３’領域を表し、破線は、ゲノムおよびＲＴからゲノム配列のみへの移行を示す。加えて、３つの矢印は、参照配列に対するＳＮＰを示す。Ｃａｓ９－ＨＲ４は同様の変異を含有していたのに対して、Ｃａｓ９トレースはＲＴの終了直後に分解した。これらはボニファイドＳＮＰ（ｂｏｎｉｆｉｅｄ ＳＮＰ）を表す可能性がかなり高いが、Ｃａｓ９－ＨＲが接合部位の周辺にいくつかのエラーを誘導し得ることを排除することはできない。対照細胞の直接シークエンシングは、これを解決するために役立つであろう。

図１９Ｆは、５’プライマーにより増幅されたＰＣＲ産物のシークエンシングアラインメントを示す。予想された参照配列に対するエラーは見られない。

図１９Ｇは、３’プライマーにより増幅されたＰＣＲ産物のシークエンシングアラインメントを示す。予想配列に対する唯一の変化はＲＴ配列の外側に見られ、参照配列に対する細胞株特異的ＳＮＰを示す可能性が最も高い。

図２０は、少なくとも２つのリンカーによりＣａｓ９に連結されたドメインの組み合わせを有するさらなるＣａｓ９－ＨＲ融合タンパク質を示す。これらの様々な融合はＨＤＲ率を増加させ、および／または細胞毒性をさらに減少させ得る可能性がある。

以下の実施例は、本開示に記載される様々な実施形態を説明する目的で示されており、いかなる形でも限定的であることを意味しない。本実施例は、本明細書に記載される方法と一緒に、好ましい実施形態を現在の代表的なものであり、例示的であり、本開示の範囲に対する限定として意図されない。当業者は、特許請求の範囲により定義される本開示の精神に包含されるその変更および他の使用を想到する。
実施例１－Ａ５４９細胞における細胞毒性の減少

図１に関して、異なるポリヌクレオチドを有するいくつかのプラスミド構築物を生成した。各ポリヌクレオチドは、特定のリンカーペプチドを介してＣａｓ９（配列番号２～１８のいずれか１つ）に連結されたｈＥｘｏ１断片（配列番号１のアミノ酸１～３５２）から構成される異なる融合タンパク質をコードする。いくつかのプラスミド構築物は、１つのＮ末端核局在化配列（ＮＬＳ）またはＣ末端ＮＬＳを有するＣａｓ９酵素をコードし、いくつかのプラスミド構築物は、Ｃ末端ＮＬＳおよびＮ末端ＮＬＳの両方を有するＣａｓ９酵素をコードしていた。すべてのプラスミド構築物を配列決定して、ポリヌクレオチド配列に変異が生じていないことを確認した。各プラスミド構築物はまた、目的の染色体部位に向けられたｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含有していた。目的の染色体部位は、１２番染色体の５’のＶＳＰ３３Ａと３’のＣＬＩＰ１との間の遺伝子間領域にある。この領域は、予測遺伝子も長い非コードＲＮＡも有しない。プラスミドを細胞にトランスフェクトすると、Ｃａｓ９－ｇＲＮＡリボ核タンパク質（ＲＮＰ）が細胞内に形成された。未改変Ｃａｓ９（配列番号２～１８のいずれか１つ）酵素をコードするように対照プラスミドを調製した。

ヒト肺癌Ａ５４９細胞を培養し、約２．５×１０^４個の細胞を９６ウェルプレートにプレーティングし、個々の処理ごとのトランスフェクション反復は８～１６個であった。次いで、標準的なリン酸カルシウムトランスフェクション技術を使用して、６２．５ｎｇのプラスミドＤＮＡを各ウェルにトランスフェクトし、１６～２０時間にわたって一晩インキュベートした。次いで、細胞を１日回復させた。レサズリン還元アッセイ（図３）を使用して、９６ウェルプレート中の生細胞の数を推定した。レサズリンは、生細胞数をモニタリングするために使用され得る細胞透過性レドックス指示薬である。レサズリンを生理学的緩衝液に溶解させ（濃青色の溶液をもたらす）、均一なフォーマットで９６ウェルプレートの培養液中の細胞に直接添加した。活発な代謝を有する生細胞は、レサズリンをピンク色かつ蛍光性のレサズリン生成物に還元し得る。さらに、産生されるレゾルフィンの量は、５３５ｎｍ励起／５９０ｎｍ発光フィルタセットを備えるマイクロプレート蛍光光度計を使用して定量され得る生細胞の数に比例する。

図４に関して、プラスミドＤＮＡトランスフェクションの２日後、融合ｈＥｘｏ１－Ｃａｓ９タンパク質をコードするプラスミドをトランスフェクトしたほとんどの細胞は、未改変Ｃａｓ９酵素をコードする対照プラスミドをトランスフェクトした細胞と比較して統計的に増加した細胞生存率（約３～４倍）を有していた。さらに、ＨＤＲテンプレート、対照抗体またはＧＦＰプラスミドで処理した細胞と、処理を受けなかった細胞とは、同様の細胞生存率を有する。
実施例２－ＨＢＢ遺伝子を標的とするｇＲＮＡを有するＡ５４９細胞における細胞毒性の減少

実施例１で行った実験と同様に、融合タンパク質ｈＥｘｏ１－Ｃａｓ９酵素（図１）をコードするポリヌクレオチドを含有するいくつかのプラスミドを生成した。各プラスミド構築物はまた、ヒトＨＢＢ遺伝子のエクソン１を認識するように指示されたｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含有していた。実施例１で行った実験と比較して、野生型Ｃａｓ９酵素をコードするヌクレオチド配列およびｈＥｘｏ１をコードするヌクレオチド配列を有するプラスミドを細胞に別個にトランスフェクトするさらなる対照を組み込んだ。ＨＢＢ遺伝子のエクソンの１つを認識するように誘導される表２に掲載されている３つのｇＲＮＡ配列を使用した。未改変Ｃａｓ９（配列番号２～１８のいずれか１つ）酵素をコードするように対照プラスミドを調製した。

実施例１で行った実験のように、同様の細胞培養およびトランスフェクションプロトコールを使用した。図６に関して、ｇＲＮＡ Ｇ３（配列番号２３）は、ｇＲＮＡ Ｇ１（配列番号２１）およびｇＲＮＡ Ｇ２（配列番号２２）と比較して最も高い細胞毒性を有する。図８に関して、ＲＮＰプラスミドをトランスフェクトした細胞は、一般に、２つの対照処理による細胞と比較して高い割合の生細胞を有していた。さらに、図９Ｂは、第７の融合タンパク質（図１）およびＧ２ ｇＲＮＡを有するＲＮＰプラスミドが、未改変Ｃａｓ９およびＧ３ ｇＲＮＡを有するＲＮＰプラスミドと比較して低い細胞毒性を有することを示す。
実施例３－患者における鎌状赤血球貧血の処置

鎌状赤血球貧血に罹患している被験者から生物学的サンプルを得る。ゲノムＤＮＡを生物学的サンプルから抽出し、シークエンシングして、β－グロビン遺伝子のアミノ酸６コドンの一塩基置換（ＡからＴ）を検証する。この変異は、グルタミン酸コドン（ＧＡＧ）をバリンコドン（ＧＴＧ）に変換する。造血幹細胞を患者の骨髄腔から単離し、エクスビボで培養する。ｈＥｘｏ１－Ｃａｓ９およびｇＲＮＡ部分のタンパク質融合複合体をコードする核酸ベクターを培養造血幹細胞に送達する。さらに、β－グロビン遺伝子のエクソン１の野生型配列をコードする組み込みカセットを有するＤＮＡテンプレート配列を培養造血幹細胞に送達する。ｇＲＮＡ部分は、β－グロビン遺伝子のエクソン１のＧＴＧ遺伝子座に相補的な少なくとも１０個のヌクレオチドを含む。ＤＮＡテンプレート配列は、５’相同領域および３’相同領域に挟まれた組み込みカセットを含み、５’相同領域および３’相同領域は、エクソン１のＧＴＧ遺伝子座に隣接するセグメントと少なくとも８０％の同一性を示す。ポリヌクレオチドの組み込みカセットは、初代細胞において検出された染色体異常の遺伝子座に対応する野生型ＧＡＧ配列を含む。ＲＮＰおよびＤＮＡテンプレート配列をコードする核酸を培養造血幹細胞に送達すると、ｇＲＮＡは、操作されたｈＥｘｏ１－Ｃａｓ９タンパク質をＧＴＧ遺伝子座に誘導し、そこで、操作されたｈＥｘｏ１－Ｃａｓ９タンパク質のＣａｓ９部分がＤＳＢを作り出す。操作されたｈＥｘｏ１－Ｃａｓ９タンパク質のｈＥｘｏ１部分は、切断されたＧＴＧ遺伝子座を部分的に消化し、３’オーバーハングが残る。ＤＮＡテンプレート配列の存在は、ＨＤＲを介した内因性修復を促進し、β－グロビン遺伝子のエクソン１のアミノ酸６で正しい野生型配列ＧＡＧを有する組み込みカセットが造血幹細胞の染色体に挿入される。正しいＧＡＧ配列を有する造血幹細胞を、患者への再移植のためにスクリーニングおよび選択する。
実施例４－１２番染色体上の遺伝子間領域を標的とするｇＲＮＡを有するＡ５４９細胞における細胞毒性の減少

実施例２で行った実験と同様に、融合タンパク質ｈＥｘｏ１－Ｃａｓ９酵素をコードするポリヌクレオチドを含有するいくつかのプラスミド（図１１Ａおよび図１）を生成した。各プラスミド構築物はまた、１２番染色体上の遺伝子間領域を認識するように指示されたｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含有し、このうちＡ５４９細胞は２コピーを有する。実施例３で行った実験と比較して、野生型Ｃａｓ９酵素をコードするヌクレオチド配列およびｈＥｘｏ１をコードするヌクレオチド配列を有するプラスミドを細胞に別個にトランスフェクトする対照も組み込んだ。未改変Ｃａｓ９（配列番号２～１８のいずれか１つ）酵素をコードするように対照プラスミドを調製した。

実施例２で行った実験のように、同様の細胞培養およびトランスフェクションプロトコールを使用した。図１１Ｂに図示されているように、約２．５×１０^４個の細胞を９６ウェルプレートにプレーティングし、個々の実験ごとの反復は８～１６個であった。図１１Ｃに関して、ＰＸ３３０プラスミドをトランスフェクトした細胞は、一般に、２つの対照処理による細胞と比較してかなり高い割合の生細胞を有しており、細胞生存率は３～４倍増加した。図１１Ｃはまた、Ｃａｓ９およびｈＥｘｏ１の共発現は細胞毒性に影響を及ぼさないので、細胞毒性の減少を引き起こすのはｈＥｘｏ１の融合であることを示す。図１１Ｄは、野生型Ｃａｓ９をトランスフェクトした細胞のアルファピフィスリン（ａｌｐｈａ ｐｆｉｔｈｒｉｎ）による処理が、Ｃａｓ９の活性により引き起こされる毒性を減少させることを示す。図１１Ｄに示されているＣａｓ９の不活性化は、Ａ５４９細胞におけるＣａｓ９処理の毒性の原因が、少なくとも部分的には、ＩｈｒｅｙらおよびＨａａｐａｎｉｅｍｉらと同様にアポトーシスに基づくＰ５３の活性化によるものであることを示す。
実施例５－Ａ５４９細胞におけるｈＥｘｏ－Ｃａｓ９融合物のＨＤＲおよびＩＮＤＥＬ率の定量

Ｃａｓ－９ ｈＥｘｏ１融合物を使用して、抗生物質耐性カセットをＡ５４９細胞の６番染色体上の遺伝子座に組み込んだ。ピューロマイシン耐性修復テンプレートは図１２Ａに図示されている。それは、５’相同アーム（５’）、強力な構成的ウイルスプロモーター（ｐＣＭＶ）、ピューロマイシン耐性遺伝子（Ｐｕｒｏ）、ポリＡ配列（ＳＶ４０Ｐａ）および３’相同アーム（３’）を含有する。修復テンプレートの下には、ガイドＩｎｔ－Ｇ２およびＧ－３により標的とされるゲノム領域が示されている。修復テンプレートは、両ガイド配列の中央への組み込みを妨害し、それによりさらなるＣａｓ９切断を防止するように設計されている。抗生物質選択により、組み込みの成功を定量する。Ａ５４９細胞は、１コピーの６番染色体のみを有する。標的組み込み部位は、６番染色体上のヒトＨ２Ｂ遺伝子の３’末端まで約１ｋｂである。この領域は予測遺伝子を有しない。

実施例４で行った実験のように、同様の細胞培養およびトランスフェクションプロトコールを使用した。図１２Ｂに図示されているように、約２．５×１０^４個の細胞を９６ウェルプレートにプレーティングし、個々の実験ごとの反復は８～１６個であった。

図１２Ｃは、それぞれＧ２ ｇＲＮＡおよびＧ３ ＲＮＡを有するＣａｓ９－ＨＲ８が、他の融合タンパク質およびＣａｓ９と比較して、２日目におけるＡ５４９細胞の最大生存率を示したことを示す。この結果により、以下の実施例ではＣａｓ９－ＨＲ８を使用した。
実施例６－Ｋ５６２細胞におけるｈＥｘｏ－Ｃａｓ９融合物のＨＤＲおよびＩＮＤＥＬ率の定量

実施例５の実験と比較して、Ｋ５６２細胞を使用し、Ｎｅｏｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）エレクトロポレーションを使用した。Ｋ５６２細胞はＰ５３機能を欠く。実施例５の結果を考慮すると、Ｃａｓ９の活性によるＰ５３の活性化の変数は融合Ｃａｓ９と野生型Ｃａｓ９との間で異なり、抗生物質スクリーニングの結果に影響を与える可能性をもたらすので、これを除去することが重要であった。

図１２Ｄに示されているように、５００ｎｇの各プラスミドおよび１００ｎｇの修復テンプレートをＫ５６２細胞にエレクトロポレーションした。２日後、ＤＮＡを生細胞の約１／１０から抽出し、Ｐｕｒｏ ＲＴゲノム組み込みの分析に使用する。翌日、０．５ｍｇ／ｍＬピューロマイシンを添加し、３日後、図１２Ｄに示されているように、標準的なレサズリンアッセイを用いて細胞生存を定量する。

融合構築物９を追加して実施例５のように毒性の定量を実施した。図１２Ｆは、（ｇＲＮＡ Ｇ２およびＧ３を有する）Ｃａｓ９と比較した、（ｇＲＮＡ Ｇ２およびＧ３を有する）Ｃａｓ９－ＨＲ８間の細胞毒性の劇的な減少、２倍量の生細胞を示す。

ゲノムに特異的および修復テンプレートに特異的なプライマーを使用した増幅の成功は、修復テンプレートの組み込みの成功と、Ｃａｓ９－ＨＲシリーズの構築物の毒性の減少がヌクレアーゼ活性の欠如によるものではないこととを実証する。Ｃａｓ９－ＨＲシリーズがＣａｓ９よりも高い編集効率を有するという兆候が見られ得る。

図１２Ｅは、修復テンプレートを成功裏に組み込んだ細胞のゲノム領域の描写を示す。２日目に、トランスフェクト細胞を定量する。ＤＮＡを各処理の１つのウェルから抽出する。１マイクログラム／ミリリットルのピューロマイシン処理の７日後、レサズリンを用いて細胞を定量する。ＤＮＡを別の列の細胞から抽出する。左右のプライマーペアを用いて、挿入接合部を増幅する。ディープシークエンシングを実施して、ＨＤＲが成功した細胞のＩＮＤＥＬ率を特定し得る。２日目のＤＮＡを使用して、図１２Ｅに見られるように左右のプライマーを用いた増幅により、ＨＤＲ細胞におけるＩＮＤＥＬ率を定量する。

図１２Ｇは、増幅産物のゲル電気泳動の結果を示し、それは、Ｃａｓ９－ＨＲ８（８）またはＣａｓ９とｇＲＮＡ Ｇ２またはＧ３（ＮＴ）のいずれかをトランスフェクトしたＫ５６２細胞が、図１２Ｅに示されている両プライマーペアを有するアンプリコンを成功裏に産生し、ＧＦＰもトランスフェクト細胞も産生しなかったことを示す。これは、修復テンプレートが成功裏に組み込まれたことを示している。
実施例７－毒性とＣａｓ９活性との間の関係の決定

実施例２に見られるように、異なるガイドＲＮＡは、根本的に異なる切断率および毒性を有し得る。未改変Ｃａｓ９と、図１３Ａに示されている領域を標的とするガイドとを有する構築物を、実施例４と同じ方法を使用して、Ａ５４９細胞にトランスフェクトした。実施例１のようにレサズリンを使用して、毒性を定量した。

ＨＢＢ－Ｇ１、ＨＢＢ－Ｇ２およびＨＢＢ－Ｇ３をトランスフェクトした細胞からＤＮＡを抽出し、図１３Ｄの外側プライマーペアを用いて増幅し、サンガーシークエンシングに送った。図１３Ｂに示されている切断部位に続くノイズの特徴的な増加により証明されるように、ＨＢＢ－Ｇ３のみが有意な切断を示した。これは、毒性が、Ａ５４９細胞におけるＣａｓ９ヌクレアーゼ活性の優れた代理であることを示している。したがって、実施例８では、ガイドＲＮＡ ＨＢＢ－Ｇ３を使用した。
実施例８－Ｃａｓ９－ＨＲを用いた公知の疾患遺伝子座の編集

実施例７と同様に、Ｋ５６２細胞はＰ５３活性を欠くので、およびそれらはＡ５４９細胞よりも血球とより多くの類似性を共有するので、Ｋ５６２細胞を使用する。

実施例７のｇＲＮＡ、すなわちＨＢＢ－Ｇ３をそれぞれＣａｓ９およびＣａｓ９－ＨＲ１～９と共にトランスフェクトして、複数の変異をＫ５６２細胞のＨＢＢ遺伝子座に導入する。選択した第１の変異は鎌状赤血球Ｅ６Ｖ変異である。予測切断部位の両側の６０ｂｐ相同アームに加えて、ＥｃｏＲＩ制限部位を作り出すさらなる変異と、ゲノムに組み込まれると修復テンプレートの再切断を防止するように設計された２つのサイレント変異と一緒に鎌状赤血球Ｅ６Ｖ変異を作製する。

エレクトロポレーションを用いて、トランスフェクションを達成する。エレクトロポレーションの２日後、実施例６のようにレサズリンを用いた毒性アッセイを行う。ＤＮＡも採取し、ＨＢＢ遺伝子座を増幅して、ＩＮＤＥＬおよびＨＤＲ率を測定するためのディープシークエンシングの準備をする。あるいは、ＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化して、標的効率を測定し得る。図１６Ａおよび図１６Ｂは、修復テンプレートの組み込みにより、ゲノム遺伝子座をＥｃｏＲＩで消化し得ることを示す。Ｃａｓ９－ＨＲ４、Ｃａｓ９－ＨＲ５、Ｃａｓ９－ＨＲ６、Ｃａｓ９－ＨＲ７およびＣａｓ９－ＨＲ８レーンでは、ＥｃｏＲＩ消化アンプリコンが観察され得る。図１６Ｃ、図１６Ｄおよび図１６Ｅは、Ｃａｓ９－ＨＲが発現され、トランスフェクト細胞の核に局在することを確認する。
実施例９－ＣＤ３４＋造血幹細胞の編集

ＣＤ３４＋細胞に対して実施例８の実験を繰り返す。実施例８のｇＲＮＡ、すなわちＨＢＢ－Ｇ３をそれぞれＣａｓ９およびＣａｓ９－ＨＲ１～９と共にトランスフェクトして、複数の変異をＫ５６２細胞のＨＢＢ遺伝子座に導入する。選択した第１の変異は鎌状赤血球Ｅ６Ｖ変異である。予測切断部位の両側の６０ｂｐ相同アームに加えて、ＥｃｏＲＩ制限部位を作り出すさらなる変異と、ゲノムに組み込まれると修復テンプレートの再切断を防止するように設計された２つのサイレント変異と一緒に鎌状赤血球Ｅ６Ｖ変異を作製する。

エレクトロポレーションを用いて、トランスフェクションを達成する。エレクトロポレーションの２日後、実施例６のようにレサズリンを用いた毒性アッセイを行う。ＤＮＡを採取し、ＨＢＢ遺伝子座を増幅して、ＩＮＤＥＬおよびＨＤＲ率を測定するためのディープシークエンシングの準備をする。あるいは、ＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化して、標的効率を測定する。
実施例１０－Ｃａｓ９－ＨＲ３のインビトロヌクレアーゼ活性

標準的なＴａｑＤＮＡポリメラーゼならびにＨＢＢ－ｏｕｔ－４－Ｆ（５’－ａａｃｇａｔｃｃｔｇａｇａｃｔｔｃｃａｃａ－３’（配列番号１２７））およびＨＢＢ－ｏｕｔ－５－Ｒ（５’－ｔｇｃｔｔａｃｃａａｇｃｔｇｔｇａｔｔｃｃ－３’（配列番号１２８））を使用して、Ｔｍ＝５６、３５サイクルで野生型Ｋ５６２細胞から９５４ｂｐのＤＮＡ片を増幅し、Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲクリーンアップキットを使用して精製した。次に、ＨＢＢ－Ｇ１（５’－ｇｕａａｃｇｇｃａｇａｃｕｕｃｕｃｃｕｃ－３’（配列番号１２９），ＩＤＴ）またはＨＢＢ－Ｇ３（５’－ｇａｇｇｕｇａａｃｇｕｇｇａｕｇａａｇｕ－３’（配列番号１３０），ＩＤＴ）を、デュプレックスバッファー（ＩＤＴ）中、各１μＭの最終濃度でｔｒａｃｒＲＮＡ（ＩＤＴ）と組み合わせた。ＲＮＡを９５℃で５分間加熱し、次いで、室温に冷却した。次いで、Ｃａｓ９またはＣａｓ９－ＨＲ３をＨＢＢ－Ｇ１またはＨＢＢ－Ｇ３ガイドＲＮＡ複合体と組み合わせ、１×Ｃａｓ９反応バッファー（５０ｍＭトリス、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ７．９）中、１０：１０：１のモル濃度比（３０ｎＭ：３０ｎＭ：３ｎＭ）でＤＮＡを増幅し、３７℃で１時間インキュベートし、その後、１μＬのプロテイナーゼＫを添加し、反応物を５０℃でさらに２０分間インキュベートした。次いで、標準的な１％ＴＡＥアガロースゲルでサンプルを電気泳動し、イメージングした。

図１８Ａは、Ｃａｓ９－ＨＲの機構モデリングを示す。Ｃａｓ９は目的の部位に結合し、切断し、次いで、プロテイナーゼＫで消化されて離れるまで結合した状態である。Ｃａｓ９－ＨＲはさらなる５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するので、より複雑なパターンが予想される。重要なことに、ｈＥｘｏ１は、非リン酸化に関してはリン酸化５’二本鎖ＤＮＡ末端に対して約１０倍の親和性を有することが示されている。これは２つの重要な結果をもたらす。第１に、いかなるｇＲＮＡも添加しない場合でもＰＣＲがわずかに消化されることが予想されるが、これは、一般にはＣａｓ９では起こらないと予想される。（５’－リン酸またはチオエステル結合のいずれかを有する）ＤＮＡ断片を増幅するために使用されるプライマーの性質の変化は、それぞれこの分解を増加または減少させ得る。第２に、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡの切断は５’－リン酸を有する末端を産生するので、元のＣａｓ９－ＨＲまたは他の非結合Ｃａｓ９－ＨＲ分子のいずれかが５’→３’でｄｓＤＮＡを切除して、様々なｄｓＤＮＡ、二本鎖および一本鎖（ｄｓ：：ｓｓ）ＤＮＡならびにｓｓＤＮＡ産物の混合物を生成すると予想される。図１８Ｂは、図１８Ａの機構に基づく予想Ｃａｓ９およびＣａｓ９－ＨＲ消化パターンを示す。図１８Ｃは、図１８Ａおよび図１８Ｂの実際のアガロースの例を示す。レーン１および２は、ＨＢＢ－Ｇ１またはＨＢＢ－Ｇ３のいずれかを標的とするＣａｓ９－ＨＲ３を示し、レーン３および４は、ＨＢＢ－Ｇ１またはＨＢＢ－Ｇ３のいずれかを標的とするＣａｓ９（ＮＴ）を示し、レーン５は未処理ＤＮＡである。図１８Ｄは、図１８Ｃと同様の実験を示し、タンパク質安定性を比較するために、酵素を４℃で２週間放置した後に実験を行うことが図１８Ｂと異なる。レーン１は、Ｃａｓ９－ＨＲ３およびｇＲＮＡ ＨＢＢ－Ｇ１の組み合わせからの消化パターンである。レーン２は、Ｃａｓ９およびｇＲＮＡ ＨＢＢ－Ｇ１の組み合わせからの消化パターンである。レーン３は、Ｃａｓ９－ＨＲ３およびＨＢＢ－Ｇ３の組み合わせからの消化パターンである。レーン４は、Ｃａｓ９およびＨＢＢ－Ｇ３の組み合わせからの消化パターンである。レーン５は、Ｃａｓ９－ＨＲのみからの消化パターンである。レーン６は、Ｃａｓ９のみからの消化パターンである。レーン７は対照であり、Ｃａｓ９もｇＲＮＡもない。図１８Ｃおよび図１８Ｄは、消化パターンが、図１８Ａおよび図１８Ｂに示されている機構に対応することを実証する。
実施例１１－ｈＨ２Ｂゲノム組み込みおよびゲノム検証

Ｃａｓ９－ＨＲおよびＣａｓを利用して、ｈＨ２ｂ断片をＨ２Ｂゲノム遺伝子座に導入した。図１９Ａに示されているように、ゲノムプライマーがＨ２Ｂ－ｍＮＥｏｎ修復テンプレート（ＲＴ）の外側にあり、他方がＲＴ特異的である（ｍＮｅｏｎ内にある）ように、プライマーを設計した。３’プライマーの配列は、Ｈ２Ｂ－ＲＴ－３’－Ｆ：５’－ａｇｇｃｃｔｔｔａｃｃｇａｔｇｔｇａｔｇ－３’（配列番号１３１）、Ｈ２Ｂ－ＲＴ－３’－Ｒ：５’－ａｃｇｇａｇｔｃｔｃｇｃｔｃｔｇｔｃａｃ－３’（配列番号１３２）である。５’プライマーの配列は、Ｈ２Ｂ－ＲＴ－５’－Ｆ：５’－ｃａａａｃｔｇｃａａｇｇｃｔｇｃａａｔａ－３’（配列番号１３３）、Ｈ２Ｂ－ＲＴ－３’－Ｒ：５’－ｇａｃｃｃａｃｃａｔｇｔｃａａａｇｔｃｃ－３’（配列番号１３４）である。

Ｋ５６２細胞のトランスフェクション後、修復テンプレート（ＲＴ）およびＣａｓ９－ＨＲ４、Ｃａｓ９－ＨＲ８、Ｃａｓ９（ＮＴ）のいずれかをトランスフェクトした細胞または非トランスフェクト（Ｃｏｎ）からゲノムＤＮＡを抽出した。標準的なＴａｑポリメラーゼ（Ｂｉｏｎｅｅｒ、Ｔｍ＝５６，３５サイクル）を使用して、５’プライマーまたは３’プライマーに挟まれた断片を増幅した。

図１９Ｂは、５’プライマーにより増幅されたＰＣＲ産物を示すアガロースゲルを示す。増幅産物は、Ｃａｓ９－ＨＲ４、８およびＣａｓ９－ＮＴでは検出されたが、非トランスフェクト対照では検出されなかった。

図１９Ｃは、Ｃａｓ９－ＨＲ４、Ｃａｓ９－ＨＲ８およびＣａｓ９のみ（ＮＴ）における３’プライマーによる特異的増幅の成功を示すアガロースゲルを示す。

図１９Ｄは、５’プライマーにより増幅されたＣａｓ９－ＨＲ８のＰＣＲ産物のサンガーシークエンシングからの配列トレースの吸光度を示す。示されている塩基の下の実線または白抜きのバーは、ＤＮＡの同一性を示し（白抜きの左上のバーはゲノムであり、線の中央の２つのバーはＨ２Ｂ ＯＲＦであり、白抜きの右下のバーはｍＮｅｏｎである）、図１９Ａの縦の灰色の破線は、内因性ゲノム配列のみと対比して、ＲＴに含まれるゲノム配列間の接合部を示す。ＲＴに含まれるＨ２Ｂ－ｍＮｅｏｎ配列から内因性ゲノム配列のみへの明確な移行は、５’末端における導入遺伝子の組み込みの成功を示した。

図１９Ｅは、３’プライマーにより増幅されたＣａｓ９－ＨＲ８のＰＣＲ産物のサンガーシークエンシングからの配列トレースの吸光度を示す。示されている塩基の上のバーはＤＮＡの同一性を示す（白抜きのバーはｍＮｅｏｎであり、影付きのバーはゲノムである）。ｍＮｅｏｎからＲＴに含まれるｍＮｅｏｎ－ゲノム配列から内因性ゲノム配列のみへの明確な移行は、３’末端における導入遺伝子の組み込みの成功を示した。

図１９Ｆおよび図１９Ｇは、Ｃａｓ９－ＨＲ４、Ｃａｓ９－ＨＲ８およびＮＴからの５’（図１９Ｆ）および３’（図１９Ｇ）ＰＣＲ産物と参照配列のシークエンシング結果のアラインメントを示す。ＣｌｕｓｔａｌＯｍｅｇａを使用して配列をアライメントした。
実施例１２－代謝フラックスを増加させるための脂肪または前脂肪組織の編集

未分化または成熟脂肪組織のいずれか由来の細胞を患者から単離し、いずれか１つのバージョンのＣａｓ９－ＨＲまたは精製ＲＮＰをコードするプラスミドのいずれかをトランスフェクトする。選択したＣａｓ９－ＨＲ（複数可）は、ＤＮＡ挿入に適切であることが既に示されているヒトゲノムの部位（「セーフハーバー部位」）または同定された任意のこのような新規部位を標的とし得る。加えて、脱共役タンパク質（ＵＣＰ）１、２、３のいずれかのｃＤＮＡを含有する修復テンプレートを同時にトランスフェクトする。この導入遺伝子は、選択した組み込み部位に対する５’相同アーム（ＨＡ）、５’ＵＴＲ配列の有無にかかわらず基本プロモーターと複合体形成した普遍的または組織特異的エンハンサーのいずれか、３’ＵＴＲ配列の有無にかかわらずＵＣＰ１、２または３のいずれかからの前述のｃＤＮＡからなるＯＲＦ、ポリアデニル化配列、および選択した組み込み部位に対する３’ＨＡを含有する。この導入遺伝子を発現する脂肪組織の組み込みおよびその後の再導入は基礎代謝を増加させ、全体的な体重減少および脂肪脂質沈着サイズ（ａｄｉｐｏｓｅ ｌｉｐｉｄ ｄｅｐｏｓｉｔ ｓｉｚｅ）の減少をもたらし得る。Ｃａｓ９－ＨＲの使用は毒性の減少をもたらし、成功裏に組み込まれた細胞の数を増幅させ得る。
実施例１３－アンドロゲン性脱毛症を減少させるためのヒト皮膚細胞の編集

Ｃａｓ９－ＨＲ（複数可）または精製ＲＮＰをコードするプラスミドを使用して、単離された細胞またはインサイチューで頭皮をトランスフェクトし、全長または改変性ホルモン結合グロブリン（Ｓｅｘ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｇｌｏｂｕｌｉｎ）（ＳＢＨＧ）、ＮＲＦ２またはＳＲＤ５Ａ１、２もしくは３のいずれかを発現する導入遺伝子をトランスフェクトし得る。選択したＣａｓ９－ＨＲ（複数可）は、ＤＮＡ挿入に適切であることが既に示されているヒトゲノムの部位（「セーフハーバー部位」）または同定された任意のこのような新規部位を標的とし得る。これらの導入遺伝子は、選択した組み込み部位に対する５’相同アーム（ＨＡ）、５’ＵＴＲ配列の有無にかかわらず基本プロモーターと複合体形成した普遍的または組織特異的エンハンサーのいずれか、３’ＵＴＲ配列の有無にかかわらずＳＢＨＧ、ＮＦＲ２またはＳＲＤ５Ａ１、２もしくは３のいずれかからの前述のｃＤＮＡからなるＯＲＦ、ポリアデニル化配列、および選択した組み込み部位に対する３’ＨＡを含有する。インサイチュー細胞のトランスフェクションまたは単離された真皮細胞の再導入の成功は、脱毛を遅延または永久に停止させ、髪の再生をもたらし得る。

本開示の好ましい実施形態が本明細書に示され記載されているが、このような実施形態はほんの一例として提供されていることは当業者には明らかである。本開示から逸脱せずに、当業者は、多数の変形、変更および置換を想到する。本明細書に記載される実施形態の様々な代替が用いられ得ることを理解すべきである。以下の特許請求の範囲は本開示の範囲を規定し、これらの特許請求の範囲内の方法および構造ならびにそれらの均等物は、それによりカバーされることを意図する。

Claims (90)

1. 第１のベクターを複数の細胞に導入することを含む方法であって、前記第１のベクターが、エキソヌクレアーゼに融合したＣａｓ９ヌクレアーゼを含む融合タンパク質複合体をコードし；
   前記ベクターを含む前記複数の細胞の生存率が、Ｃａｓ９ヌクレアーゼをコードする第２のベクターを含む第２の複数の細胞の生存率の少なくとも１．５倍であり；
   前記第２の複数の細胞が、前記第２のベクターをトランスフェクトしたＫ５６２細胞である、方法。
2. 前記第１のベクターが、前記融合タンパク質複合体およびｇＲＮＡをコードする、請求項１に記載の方法。
3. 前記エキソヌクレアーゼが、ＭＲＥ１１、ＥＸＯｌ、ＥＸＯＩＩＩ、ＥＸＯＶＩＩ、ＥＸＯＴ、ＤＮＡ２、ＣｔＩＰ、ＴＲＥＸ１、ＴＲＥＸ２、Ａｐｏｌｌｏ、ＲｅｃＥ、ＲｅｃＪ、Ｔ５、Ｌｅｘｏ、ＲｅｃＢＣＤおよびＭｕｎｇｂｅａｎからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
4. ドナーポリヌクレオチドが前記複数の細胞に導入される、請求項２に記載の方法。
5. エキソヌクレアーゼに融合した前記Ｃａｓ９により、遺伝子の異常遺伝子座に対して編集が行われる、請求項４に記載の方法。
6. 前記ドナーポリヌクレオチドが、前記遺伝子の機能的遺伝子座をさらに含む組み込みカセットを含む、請求項５に記載の方法。
7. 前記生存率が、レサズリンアッセイにより測定される、請求項１に記載の方法。
8. 前記エキソヌクレアーゼがＥｘｏＩである、請求項３に記載の方法。
9. 前記異常遺伝子座がＨＢＢ遺伝子の異常遺伝子座である、請求項５に記載の方法。
10. 前記ドナーポリヌクレオチドが、前記ＨＢＢ遺伝子の機能的遺伝子座をコードする、請求項９に記載の方法。
11. 前記融合タンパク質複合体が、少なくとも１つの核局在化シグナル（ＮＬＳ）をコードする、請求項１に記載の方法。
12. 前記融合タンパク質複合体をコードする前記第１のベクターが、配列番号２～１８のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する、請求項１に記載の方法。
13. 前記第１のベクターが、エレクトロポレーションにより送達される、請求項１に記載の方法。
14. 前記ドナーポリヌクレオチドが、切断部位のすぐ３’末端に位置する変異プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列を含み、前記変異ＰＡＭ配列が５’－ＮＣＧ－３’または５’－ＮＧＣ－３’を含む、請求項４に記載の方法。
15. 前記融合タンパク質複合体が、前記変異ＰＡＭ配列を切断することができない、請求項１４に記載の方法。
16. 前記ドナーポリヌクレオチドが一本鎖ＤＮＡである、請求項４に記載の方法。
17. 前記ドナーポリヌクレオチドが二本鎖ＤＮＡである、請求項４に記載の方法。
18. 第１の機能的断片と、Ｃａｓヌクレアーゼを含む第２の機能的断片と、リンカーペプチドとを含むポリペプチドであって、
    前記第１の機能的断片が前記リンカーペプチドの第１の末端にカップリングされ、前記第２の機能的断片が前記リンカーペプチドの第２の末端にカップリングされ；ならびに
    前記ポリペプチドおよびリボ核酸（ＲＮＡ）分子を含む第１の複合体が第１の複数の細胞に投与される場合、前記第１の複数の細胞では、減少した毒性が、Ｃａｓ９ヌクレアーゼおよび前記ＲＮＡ分子を含む第２の複合体が第２の複数の細胞に投与される場合に前記第２の複数の細胞において観察される前記毒性と比較して観察される、ポリペプチド。
19. 前記第１の機能的断片がエキソヌクレアーゼを含み、前記エキソヌクレアーゼが、ＭＲＥ１１、ＥＸＯｌ、ＥＸＯＩＩＩ、ＥＸＯＶＩＩ、ＥＸＯＴ、ＤＮＡ２、ＣｔＩＰ、ＴＲＥＸ１、ＴＲＥＸ２、Ａｐｏｌｌｏ、ＲｅｃＥ、ＲｅｃＪ、Ｔ５、Ｌｅｘｏ、ＲｅｃＢＣＤおよびＭｕｎｇｂｅａｎからなる群より選択される、請求項１８に記載のポリペプチド。
20. 前記ＲＮＡ分子がガイドＲＮＡ分子である、請求項１９に記載のポリペプチド。
21. 前記エキソヌクレアーゼがヒトＥｘｏ１酵素である、請求項１９に記載のポリペプチド。
22. 前記ヒトＥｘｏ１酵素の前記Ｎ末端が、前記Ｃａｓヌクレアーゼの前記Ｃ末端にカップリングした前記リンカーの前記Ｃ末端にカップリングされる、請求項２１に記載のポリペプチド。
23. 前記ヒトＥｘｏ１酵素が配列番号１を含む、請求項２１に記載のポリペプチド。
24. 前記ヒトＥｘｏ１酵素が、配列番号１の８０％の配列同一性を有する断片を含む、請求項２１に記載のポリペプチド。
25. 前記ヒトＥｘｏ１酵素が、配列番号１の９０％の配列同一性を有する断片を含む、請求項２１に記載のポリペプチド。
26. 前記ヒトＥｘｏ１酵素が、配列番号１の９５％の配列同一性を有する断片を含む、請求項２１に記載のポリペプチド。
27. 前記第２の機能的断片がＣａｓ９酵素を含む、請求項１８に記載のポリペプチド。
28. 前記Ｃａｓ９酵素が、Ｎ末端核局在化配列（ＮＬＳ）およびＣ末端ＮＬＳを含む、請求項２７に記載のポリペプチド。
29. 前記Ｃａｓ９酵素がＮ末端核局在化配列（ＮＬＳ）を含む、請求項２７に記載のポリペプチド。
30. 前記Ｃａｓ９酵素がＣ末端核局在化配列（ＮＬＳ）を含む、請求項２７に記載のポリペプチド。
31. 前記リンカーペプチドが、ＦＬ２Ｘ、ＳＬＡ２Ｘ、ＡＰ５Ｘ、ＦＬ１Ｘ、ＳＬＡ１Ｘからなる群より選択される、請求項１８～３０のいずれかに記載のポリペプチド。
32. 前記リンカーペプチドがＳＬＡ２Ｘである、請求項３１記載のポリペプチド。
33. 前記リンカーペプチドが５～２００個のアミノ酸を含む、請求項３１のいずれかに記載のポリペプチド。
34. 前記減少した毒性が、レゾルフィン蓄積を測定することにより定量される、請求項１８に記載のポリペプチド。
35. 前記第１の複合体の投与後、前記第１の複数の細胞が、前記第２の複合体の投与後の前記第２の複数の細胞と比較して少なくとも２倍の数の生細胞を有し、生細胞の前記数が、レゾルフィンアッセイにより定量される、請求項３４に記載のポリペプチド。
36. 前記第１の複合体の投与後、細胞ＨＤＲアッセイにより定量した場合に、前記第１の複数の細胞が、前記第２の複合体の投与後の前記第２の複数の細胞と比較して少なくとも２倍の量のＨＤＲ編集細胞を有する、請求項３４に記載のポリペプチド。
37. 前記細胞ＨＤＲアッセイが、ＩＨＣ、ｑＰＣＲまたはディープシークエンシングを含む、請求項３３に記載のポリペプチド。
38. 請求項１７～３５のいずれかに記載のポリペプチドおよび前記ＲＮＡ分子をコードする、ポリヌクレオチド。
39. 前記リンカーペプチドの前記第１の末端が３’末端であり、前記リンカーペプチドの前記第２の末端が５’末端である、請求項３８に記載のポリヌクレオチド。
40. 前記リンカーペプチドの前記第１の末端が５’末端であり、前記リンカーペプチドの前記第２の末端が３’末端である、請求項３８に記載のポリヌクレオチド。
41. 前記ＲＮＡ分子がガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）である、請求項３８に記載のポリヌクレオチド。
42. 相同組換え修復（ＨＤＲ）テンプレートをさらに含む、請求項３８に記載のポリヌクレオチド。
43. 前記ｇＲＮＡが、表２に掲載されている配列から選択される、請求項３８に記載のポリヌクレオチド。
44. 前記ＨＤＲテンプレートが一本鎖ＤＮＡである、請求項３８に記載のポリヌクレオチド。
45. 前記ＨＤＲテンプレートが二本鎖ＤＮＡである、請求項３８に記載のポリヌクレオチド。
46. 前記ポリヌクレオチドがリポソーム中に製剤化される、請求項３８に記載のポリヌクレオチド。
47. 前記リポソームが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、細胞透過性ペプチド、リガンド、アプタマー、抗体またはそれらの組み合わせを含む、請求項４６に記載のポリヌクレオチド。
48. 請求項３８に記載のヌクレオチド配列を含む、ベクター。
49. プロモーターを含む、請求項４８に記載のベクター。
50. 前記プロモーターがＣＭＶまたはＣＡＧプロモーターである、請求項４９に記載のベクター。
51. レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクターからなる群より選択される、請求項４８～５０のいずれかに記載のベクター。
52. アデノ随伴ウイルスベクターである、請求項５１に記載のベクター。
53. 請求項４８～５０のいずれかに記載のベクターを含む、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
54. 適合医薬賦形剤中に製剤化された請求項１８～４１のいずれかに記載のポリペプチドと、投与指示を含む挿入物と、試薬とを含む、キット。
55. 適合医薬賦形剤中に製剤化された請求項３８に記載のポリヌクレオチドと、投与指示を含む挿入物と、試薬とを含む、キット。
56. 適合医薬賦形剤中に製剤化された請求項４８～５２のいずれかに記載のベクターと、投与指示を含む挿入物と、試薬とを含む、キット。
57. 細胞においてＤＮＡの相同組換えを誘導するための方法であって、前記ＤＮＡを請求項１８～３５のいずれかに記載のポリペプチドと接触させることを含む、方法。
58. インビトロまたはエクスビボで細胞においてＨＤＲを誘導するための方法であって、請求項３８に記載のポリヌクレオチドを細胞に送達することを含む、方法。
59. 前記細胞が、ヒト細胞、非ヒト哺乳動物細胞、幹細胞、非哺乳動物細胞、無脊椎動物細胞、植物細胞または単一の真核生物である、請求項５７～５８のいずれかに記載の方法。
60. 第１の複数の細胞を請求項１８に記載のポリヌクレオチドと接触させ、第２の複数の細胞を、野生型Ｃａｓ９酵素をコードする第２のポリヌクレオチドと接触させること；ならびに
    前記第１の複数の細胞および前記第２の複数の細胞において、目的の遺伝子座で部位特異的切断を誘導し、続いてＨＤＲを誘導すること；ならびに
    前記第１の複数の細胞において、前記第２の複数の細胞と比較して少なくとも３０～９０％多くの細胞を回収すること
    を含む、方法。
61. 前記第１の複数の細胞および前記第２の複数の細胞において産生されたレゾルフィンの量を測定することにより、細胞生存率を測定することをさらに含む、請求項６０に記載の方法。
62. 前記第１の複数の細胞が、レゾルフィンアッセイにより定量した場合に、前記第２の複数の細胞と比較して２～５倍の量の生細胞を有する、請求項６１に記載の方法。
63. 前記第１の複数の細胞および前記第２の複数の細胞が、ヒト細胞、非ヒト哺乳動物細胞、幹細胞、非哺乳動物細胞、無脊椎動物細胞、植物細胞または単一の真核生物を含む、請求項６０～６２のいずれかに記載の方法。
64. 前記ヒト細胞が、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、好中球、好酸球、好塩基球、マスト細胞、造血前駆細胞、造血幹細胞（ＨＳＣ）、赤血球、血液幹細胞、内胚葉幹細胞、内胚葉前駆細胞、内胚葉前駆体細胞、分化内胚葉細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、間葉系前駆細胞、間葉系前駆体細胞または分化間葉系細胞である、請求項６３に記載の方法。
65. 前記分化内胚葉細胞が、肝細胞前駆細胞、膵臓前駆細胞、肺前駆細胞または気管前駆細胞である、請求項６４に記載の方法。
66. 前記分化間葉系細胞が、骨細胞、軟骨細胞、筋細胞、脂肪細胞、間質細胞、線維芽細胞または真皮細胞である、請求項６４に記載の方法。
67. 被験体における単一遺伝子障害を処置するための方法であって、
    前記被験体から得られた複数の初代細胞を培養すること；
    請求項４２に記載のポリヌクレオチドを前記複数の初代細胞に投与すること（ここで、前記ｇＲＮＡは、前記障害を引き起こす前記遺伝子の遺伝子座を認識するように構成され、前記ＨＤＲテンプレートは、前記遺伝子の機能配列を提供するように構成される）；および
    前記遺伝子座で部位特異的切断を誘導し、続いてＨＤＲを誘導すること（ここで、前記遺伝子の前記機能配列は前記遺伝子座に挿入される）
    を含む、方法。
68. 前記遺伝子の前記機能配列が前記遺伝子座に挿入された初代細胞を選択すること；および
    前記選択した初代細胞を前記被験体に再導入すること
    をさらに含む、請求項６７に記載の方法。
69. 前記被験体が哺乳動物である、請求項６７または請求項６８のいずれかに記載の方法。
70. 前記哺乳動物がヒトである、請求項６９に記載の方法。
71. 前記複数の初代細胞が、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、好中球、好酸球、好塩基球、マスト細胞、造血前駆細胞、造血幹細胞（ＨＳＣ）、赤血球、血液幹細胞、内胚葉幹細胞、内胚葉前駆細胞、内胚葉前駆体細胞、分化内胚葉細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、間葉系前駆細胞、間葉系前駆体細胞、分化間葉系細胞、肝細胞前駆細胞、膵臓前駆細胞、肺前駆細胞、気管前駆細胞、骨細胞、軟骨細胞、筋細胞、脂肪細胞、間質細胞、線維芽細胞および真皮細胞を含む群より選択される、請求項６７に記載の方法。
72. 前記単一遺伝子障害を引き起こす前記遺伝子が表３から選択される、請求項６７に記載の方法。
73. 被験体における異常ＨＢＢ遺伝子により引き起こされる鎌状赤血球貧血を処置するための方法であって、
    前記被験体から得られた複数の初代細胞を培養すること；
    請求項４２に記載のポリヌクレオチドを前記複数の初代細胞に投与すること（ここで、前記ｇＲＮＡは、前記障害を引き起こす前記ＨＢＢ遺伝子の遺伝子座を認識するように構成され、前記ＨＤＲテンプレートは、前記ＨＢＢ遺伝子の機能配列を提供するように構成される）；および
    前記遺伝子座で部位特異的切断を誘導し、続いてＨＤＲを誘導すること（ここで、前記ＨＢＢ遺伝子の前記機能配列は前記遺伝子座に挿入される）
    を含む、方法。
74. 前記ＨＢＢ遺伝子の前記機能配列が前記遺伝子座に挿入された初代細胞を選択すること；および
    前記選択した初代細胞を前記被験体に再導入すること
    をさらに含む、請求項７３に記載の方法。
75. 前記被験体が哺乳動物である、請求項７３または請求項７４のいずれかに記載の方法。
76. 前記哺乳動物がヒトである、請求項７５に記載の方法。
77. 前記初代細胞が造血幹細胞である、請求項７３または請求項７４のいずれかに記載の方法。
78. 前記初代細胞がＣＤ３４＋造血幹細胞である、請求項７３記載の方法。
79. 前記初代細胞がＣＤ３４＋造血幹細胞である、請求項７４に記載の方法。
80. プラスミドＰＸ３３０である、請求項４８記載のベクター。
81. 前記細胞がＣＤ３４＋造血幹細胞である、請求項５８記載の方法。
82. 被験体における異常ＨＢＢ遺伝子により引き起こされる鎌状赤血球貧血を処置するための方法であって、
    前記被験体から得られた複数の初代細胞を培養すること；
    請求項２２に記載のポリヌクレオチドを前記複数の初代細胞に投与すること（ここで、前記ｇＲＮＡは、前記障害を引き起こす前記ＨＢＢ遺伝子の遺伝子座を認識するように構成され、前記ＨＤＲテンプレートは、前記ＨＢＢ遺伝子の機能配列を提供するように構成される）；および
    前記遺伝子座で部位特異的切断を誘導し、続いてＨＤＲを誘導すること（ここで、前記ＨＢＢ遺伝子の前記機能配列は前記遺伝子座に挿入される）
    を含む、方法。
83. 前記ＨＢＢ遺伝子の前記機能配列が前記遺伝子座に挿入された初代細胞を選択すること；および
    前記選択した初代細胞を前記被験体に再導入すること
    をさらに含む、請求項８２に記載の方法。
84. 前記被験体が哺乳動物である、請求項８２または請求項８３のいずれかに記載の方法。
85. 前記哺乳動物がヒトである、請求項８４に記載の方法。
86. 前記初代細胞がＣＤ３４＋造血幹細胞である、請求項８２または請求項８３に記載の方法。
87. 第１の複数の細胞を、請求項１８に記載の前記ポリヌクレオチドおよびＲＮＡ分子を含む第１の複合体と接触させること；
    前記第１の複数の細胞において部位特異的切断を誘導し、続いてＨＤＲを誘導すること
    を含む方法であって、
    細胞ＨＤＲアッセイにより定量された、前記第１の複数の細胞のうちのＨＤＲにより編集された細胞のパーセンテージが、第２の複数の細胞のうちの野生型Ｃａｓ９酵素および前記ＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチドを含む第２の複合体と接触された細胞のパーセンテージと比較して少なくとも２倍高い、方法。
88. 前記細胞ＨＤＲアッセイがＩＨＣを含む、請求項８４に記載の方法。
89. 前記細胞ＨＤＲアッセイがｑＰＣＲを含む、請求項８４に記載の方法。
90. 前記細胞ＨＤＲアッセイが核酸シークエンシングを含む、請求項８４に記載の方法。

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