ES2528892T3

ES2528892T3 - Identificación mediada por trasposición de proteínas de unión o funcionales específicas

Info

Publication number: ES2528892T3
Application number: ES12178529.9T
Authority: ES
Inventors: Ulf Grawunder
Original assignee: NBE Therapeutics AG
Current assignee: NBE Therapeutics AG
Priority date: 2012-07-30
Filing date: 2012-07-30
Publication date: 2015-02-13
Anticipated expiration: 2032-07-30
Also published as: MX2015000885A; US20190153433A1; US10174309B2; IL236771A; CA2878982A1; EP2692865B1; CN104640985A; BR112015000836B1; JP2015522286A; BR112015000836A2; SI2692865T1; AU2013291971A1; CN104640985B; HK1209779A1; AU2013291971B2; ZA201500203B; WO2014013026A1; DK2692865T3; MX338911B; PT2692865E

Abstract

Un método para identificar un polipéptido que tiene una especificidad de unión o funcionalidad deseada, que comprende: (i) generar una colección diversa de polinucleótidos, preferentemente vectores plasmídicos o amplicones de PCR, de ADN bicatenario, que codifican polipéptidos que tienen diferentes especificidades de unión o funcionalidades, en donde dichos polinucleótidos comprenden una secuencia que codifica un polipéptido dispuesto entre una primera y una segunda secuencias de repeticiones terminales invertidas que son reconocidas por al menos una enzima transposasa y son funcionales con ella; (ii) introducir la colección diversa de polinucleótidos de (i) en las células hospedadoras; (iii) expresar en la células hospedadoras al menos una enzima transposasa funcional con dichas secuencias de repeticiones terminales invertidas, de modo que dicha colección diversa de polinucleótidos se integre en el genoma de la célula hospedadora para proporcionar una población de células hospedadoras que exprese dicha colección diversa de polinucleótidos que codifican polipéptidos que presentan diferentes especificidades de unión y funcionalidades; (iv) explorar dichas células hospedadoras para identificar una célula hospedadora que expresa un polipéptido con una especificidad de unión o funcionalidad deseada; y (v) aislar la secuencia polinucleotídica que codifica el polipéptido de dicha célula hospedadora.

Description

Identificación mediada por trasposición de proteínas de unión o funcionales específicas

Antecedentes de la invención

Campo de la invención

(a) Tecnologías para la identificación de proteínas de unión y funcionales específicas

El descubrimiento de proteínas específicas de diana, incluyendo anticuerpos y fragmentos de los mismos, es de interés comercial significativo, ya que la selección de proteínas funcionales o proteínas de unión altamente selectivas, incluyendo anticuerpos y fragmentos de los mismos, tiene un alto potencial para el desarrollo de nuevas entidades biológicas (NBE) con nuevas propiedades terapéuticas que se integran muy específicamente, o interfieren con procesos biológicos, y por lo tanto se predice que presentan perfiles de efectos secundarios menores que las nuevas entidades químicas (NCE) convencionales. A este respecto, particularmente el desarrollo de anticuerpos terapéuticos, altamente específicos de diana, y productos terapéuticos basados en anticuerpos, han allanado el camino para terapias completamente nuevas con eficacia mejorada. Como consecuencia, los anticuerpos monoclonales terapéuticos representan el segmento de crecimiento más rápido en el desarrollo de nuevos fármacos durante la última década, y en la actualidad generan aproximadamente 50.000 millones de dólares americanos en ingresos globales, lo que representa un porcentaje significativo del mercado global total de los fármacos. Página adicional 1a.

Por lo tanto, hay mucha demanda de tecnologías eficaces e innovadoras, que permitan el descubrimiento de proteínas altamente terapéuticas, pero también bien toleradas, en particular productos terapéuticos basados en anticuerpos.

Para identificar una proteína con una funcionalidad deseada o una propiedad de unión específica, como sucede para anticuerpos, se requiere generar, expresar funcionalmente y explorar grandes colecciones diversas, o bibliotecas de proteínas, incluyendo anticuerpos y fragmentos de los mismos, con respecto a propiedades funcionales deseadas o especificidad de unión a diana. Se han desarrollado varias tecnologías durante últimos los veinte años, que permiten la expresión de diversas bibliotecas de proteínas bien en células hospedadoras, o bien en partículas virales y de fago y métodos para su exploración de alto rendimiento y/o selección de una propiedad funcional deseada, o fenotipo de unión.

En Kempeni, Ann Rheum Dis 1999, 58 (sup. I) 170-2, se analizan los resultados preliminares de ensayos clínicos tempranos con anticuerpo monoclonal anti-TNF alfa completamente humano D2E7.

Además, Urban et al., Nucleic Acids Research, 2005, Vol. 33, Nº 4 analiza la presentación de fragmentos de Fv monocatenarios expresados en la superficie de partículas retrovirales por fusión con una proteína de envoltura retroviral y selección de agentes de unión de fragmentos Fv monocatenarios seleccionando partículas retrovirales para una proteína de unión deseada. No está relacionado con la presentación de anticuerpos de longitud completa en la superficie de células de mamífero.

Las tecnologías del estado de la técnica, convencionales, para conseguir identificación de agentes de unión específicos de diana o proteínas con propiedades funcionales deseadas incluyen, por ejemplo, presentación de fagos, presentación retroviral, presentación bacteriana, presentación de levadura y diversas tecnologías de presentación de células de mamífero, en combinación con unión a superficie sólida (selección) y/u otras técnicas de enriquecimiento. Todas estas tecnologías están abarcadas por diversas patentes y solicitudes de patente pendientes.

Aunque se han establecido sistemas de presentación de fagos y procariotas y están ampliamente adoptados en la industria biotecnológica y en la academia para la identificación de agentes de unión específicos de diana, incluyendo fragmentos de anticuerpo (Hoogenboom, Nature Biotechnology 23, 1105-1116 (2005)), padecen diversas limitaciones, incluyendo la incapacidad de expresar versiones de longitud completa de proteínas mayores, incluyendo anticuerpos de longitud completa, la falta de la modificación post-traduccional apropiada, la falta de plegamiento apropiado por chaperonas de vertebrados y, en el caso de anticuerpos, una combinación de cadena pesada y ligera forzada artificialmente. Por lo tanto, en el caso del descubrimiento de anticuerpos por estos métodos, se requiere el “cambio de formato” a anticuerpos de longitud completa y expresión en células de mamífero. Debido a las limitaciones anteriormente mencionadas esto da como resultado con frecuencia anticuerpos con propiedades biofísicas desfavorables (por ejemplo baja estabilidad, tendencia a agregarse, afinidad reducida), que limitan el potencial terapéutico y diagnóstico de dichas proteínas. Esto, por un lado, conduce a tasas de desgaste significativas en el desarrollo de moléculas candidatas generadas por estos métodos y, por otro lado, requiere un esfuerzo significativo para corregir las desventajas biofísicas y moleculares en estas proteínas para desarrollo farmacológico corriente abajo adicional.

Por lo tanto, se han desarrollo tecnologías de descubrimiento de proteínas y anticuerpos usando sistemas de expresión de células eucariotas inferiores (por ejemplo, levadura) y, más recientemente, también de mamíferos para la identificación de proteínas con propiedades deseadas, ya que estas tecnologías permiten (i) la expresión de proteínas mayores, de longitud completa, incluyendo anticuerpos de longitud completa, (ii) modificación posttraduccional mejor o normal y (iii) en el caso de anticuerpos formación de pares de cadena pesada-ligera apropiada (Beerli y Rader, mAbs 2, 365-378 (2010)). Esto selecciona además proteínas con propiedades biofísicas favorables que tienen un mayor potencial en el desarrollo farmacológico y uso terapéutico.

Aunque sería más deseable la expresión y exploración de proteínas de células de vertebrados, debido a que las células de vertebrados (por ejemplo, células CHO de hámster, HEK-293 humanas o DT40 de pollo) son sistemas de expresión preferidos para la producción de proteínas terapéuticas mayores, tales como anticuerpos, estas tecnologías se asocian también en la actualidad con varias limitaciones, que han conducido a una adopción lenta de estas tecnologías en la academia y la industria.

En primer lugar, las células de vertebrados no se modifican genéticamente de forma tan eficaz y estable como, por ejemplo, las células procariotas o eucariotas inferiores como levadura. Por lo tanto, sigue siendo un reto generar bibliotecas de proteínas basadas en células de vertebrados suficientemente diversas (complejas), de las que puedan identificarse candidatos con propiedades deseadas o afinidades de unión mayores. En segundo lugar, para aislar eficazmente proteínas con propiedades deseadas, se requieren habitualmente ciclos por iteraciones de enriquecimiento celular. La expresión de vertebrados por transfección transitoria de plásmidos (Higuchi et al J. Immunol. Methods 202, 193-204(1997)), o sistemas de expresión viral transitorios, como virus sindbis o vaccinia (Beerli et al. PNAS 105, 14336-14341 (2008), y documento WO02102885) no permiten múltiples ciclos de selección celular requerida para enriquecer eficazmente proteínas altamente específicas, y estos métodos se restringen por lo tanto a la exploración de bibliotecas pequeñas, pre-enriquecidas, de proteínas o requieren ciclos de aislamiento de virus/re-infección celular tediosos.

Para conseguir una expresión estable de proteínas de unión y anticuerpos de células de vertebrados, que permitan múltiples ciclos de selección basándose en el acoplamiento de genotipo-fenotipo estable, se han desarrollado tecnologías, que utilizan recombinasas específicas (sistema de recombinasa flp/frt, Zhou et al. mAbs 5, 508-518 (2010)), o vectores retrovirales (documento WO2009109368). Sin embargo, la recombinación flp/frt es un sistema de baja eficacia para la integración estable de genes en genomas de células hospedadoras de vertebrados y por lo tanto, de nuevo, solamente aplicable a bibliotecas pequeñas, preseleccionadas, o la optimización de candidatos de proteínas o anticuerpos seleccionados.

En comparación con el sistema de recombinasa flp/frt, los vectores retrovirales permiten una modificación genética estable más eficaz de células hospedadoras de vertebrados y la generación de bibliotecas celulares más complejas. Sin embargo, (i) se restringen solamente a líneas celulares permisibles seleccionadas, (ii) representan un riesgo para la seguridad biológica, cuando se utilizan células humanas, (iii) los vectores de expresión retroviral están sujetos a mutagénesis no deseada de las secuencias de bibliotecas debido a transcripción inversa de baja fidelidad,

(iv): los vectores retrovirales no permiten la integración de casetes de expresión genómica con estructura de intrón/exón intacta, debido al corte y empalme del genoma retroviral antes del empaquetamiento del vector en partículas retrovirales, (v) los retrovirus están sujetos a recombinación homóloga incontrolable y desfavorable de secuencias de bibliotecas durante el empaquetamiento de los genomas virales, (vi) están sujetos a silenciamiento retroviral y (vii) requieren un procedimiento tedioso de dos etapas de transfección de células de empaquetamiento/infección de célula hospedadora. Todas estas limitaciones representan retos y limitaciones significativos, e introducen complejidades significativas para la utilidad de los enfoques basados en vectores retrovirales en la generación de bibliotecas de células de vertebrados de alta calidad/alta complejidad para descubrimiento de proteínas específicas de diana o anticuerpos eficaz.

Por lo tanto, existe claramente una necesidad de una tecnología más eficaz, más controlable y sencilla que permita la generación de bibliotecas basadas en células de vertebrados de alta calidad y altamente complejas que expresen diversas bibliotecas de proteínas incluyendo anticuerpos y fragmentos de los mismos de los que pueden aislarse proteínas con propiedades de unión y/o función altamente específicas y altas afinidades.

(b): Transposasas/transposición:

Los transposones, o elementos transponibles (TE), son elementos genéticos con la capacidad para integrarse de forma estable en genomas de células hospedadoras, un proceso que se denomina transposición (Ivics et al. Mobile DNA 1, 25 (2010)). Los TE ya los postuló en los años 50 Barbara McClintock en estudios genéticos con maíz, pero los primeros modelos funcionales para transposición se han descrito para TE bacterianos al final de los años 70 (Shapiro, PNAS 76, 1933-1937 (1979)).

Entre tanto está claro que los TE están presentes en el genoma de todos los organismos, y la secuenciación genómica ha revelado que aproximadamente el 45 % del genoma humano deriva de transposones (International Human Genome Sequencing Consortium Nature 409: 860-921 (2001)). Sin embargo, a diferencia de los invertebrados, en los que se han identificado TE funcionales (o autónomos) (Fig. 1a), los seres humanos y la

mayoría de los vertebrados superiores no contienen TE funcionales. Se ha planteado la hipótesis de que la presión selectiva evolutiva contra el potencial mutagénico de los TE condujo a su inactivación funcional hace millones de años durante la evolución.

Los TE autónomos comprenden ADN que codifica una enzima transposasa localizada entre dos secuencias de repetición terminal invertidas (ITR), que se reconocen por la enzima transposasa codificada entre las ITR y que pueden catalizar la transposición del TE en cualquier secuencia de ADN bicatenario (FIG. 1a). Hay dos clases diferentes de transposones: clase I, o retrotransposones, que se movilizan mediante un intermedio de ARN y un mecanismo de “copia y pega” (FIG. 2b), y clase II, o transposones de ADN, que se movilizan mediante escisiónintegración, o mecanismo de “corta y pega” (FIG. 2a) (Ivics et al. Nat. Methods 6, 415-422(2009).

Los transposones bacterianos, eucariotas inferiores (por ejemplo de levadura) y de invertebrados parecen ser en gran medida específicos de especie, y no pueden usarse para la transposición eficaz de ADN en células de vertebrados. Solamente después de haberse reconstruido artificialmente un primer transposón activo por redistribución de secuencia de TE inactivos de peces, que se denominó por lo tanto “sleeping beauty” (Ivics et al. Cell 91, 501-510 (1997)), se hizo posible conseguir con éxito la integración de ADN por transposición en células de vertebrados, incluyendo células humanas. Sleeping beauty es un transposón de ADN de clase II que pertenece a la familia de Tc1/mariner de transposones (Ni et al. Briefings Funct. Genomics Proteomics 7, 444-453 (2008)). Entre tanto, se han identificado transposones funcionales adicionales o se han reconstruido de diferentes especies, incluyendo Drosophila, rana e incluso genomas humanos, que se ha mostrado que permiten todos la transposición de ADN en genomas de células hospedadoras de vertebrados y también humanas (FIG. 3). Cada uno de estos transposones tiene ventajas y desventajas que están relacionadas con la eficacia de transposición, estabilidad de expresión, capacidad de carga genética, etc.

Hasta la fecha, no se han desvelado en la técnica anterior tecnologías mediadas por transposones para la expresión de bibliotecas diversas de proteínas, incluyendo anticuerpos y fragmentos de los mismos, en células hospedadoras de vertebrados para el aislamiento de proteínas de unión funcional, específicas, incluyendo anticuerpos y fragmentos de los mismos.

Breve sumario de la invención

El método como se caracteriza en las reivindicaciones y se desvelan en el presente documento describe una nueva tecnología que ofrece una eficacia, flexibilidad, utilidad y velocidad sin precedentes para el descubrimiento y optimización de polipéptidos que tienen una especificidad de unión y/o funcionalidad deseadas, incluyendo moléculas de unión a antígeno tales como anticuerpos y fragmentos de los mismos, para fenotipos funcionales y/o de unión deseados. El nuevo método se basa en construcciones transponibles y diversas bibliotecas de ADN clonadas en vectores transponibles y su transfección en células hospedadoras por expresión transitoria conjunta de una enzima transposasa funcional. Esto asegura una introducción eficaz, estable de los vectores de expresión basados en transposones en células hospedadoras de vertebrados en una etapa, que pueden después explorarse con respecto a un fenotipo funcional o de unión deseado de las proteínas expresadas, después de lo cual las secuencias codificantes relevantes de las proteínas expresadas, incluyendo anticuerpos y fragmentos de los mismos, pueden identificarse por clonación convencional y técnicas de secuenciación de ADN.

En una realización, la invención se dirige en general a un método para identificar un polipéptido que tiene una especificidad de unión o funcionalidad deseada, que comprende:

(i): generar una colección diversa de polinucleótidos que codifican polipéptidos que tienen diferentes especificidades de unión o funcionalidades, en el que dichos polinucleótidos comprenden una secuencia que codifica un polipéptido dispuesto entre primera y segunda secuencias de repeticiones terminales invertidas que se reconocen por y son funcionales con al menos una enzima transposasa;

(ii): introducir la colección diversa de polinucleótidos de (i) en células hospedadoras;

(iii) expresar al menos una enzima transposasa funcional con dichas secuencias de repeticiones terminales invertidas en dichas células hospedadoras de modo que dicha colección diversa de polinucleótidos se integre en el genoma de la célula hospedadora para proporcionar una población de células hospedadoras que expresan dicha colección diversa de polinucleótidos que codifican polipéptidos que tienen diferentes especificidades de unión o funcionalidades;

(iv): explorar dichas células hospedadoras para identificar una célula hospedadora que expresa un polipéptido que tiene una especificidad de unión o funcionalidad deseada; y

(v): aislar la secuencia polinucleotídica que codifica dicho polipéptido de dicha célula hospedadora.

En una realización preferida, los polinucleótidos son moléculas de ADN. En una realización, la colección diversa de polinucleótidos comprende una secuencia de unión a ligando de un receptor o una secuencia de unión a diana de una molécula de unión. En una realización preferida, los polinucleótidos comprenden una secuencia que codifica una molécula de unión a antígeno, tal como un dominio VH o VL de anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, o cadenas pesadas o ligeras de anticuerpo que son de longitud completa (es decir, que incluyen la región constante). En ciertas realizaciones, los polinucleótidos pueden comprender una secuencia que codifica una región

tanto VH como VL, o cadenas tanto pesadas como ligeras de anticuerpo. En otra realización, los polinucleótidos comprenden una secuencia que codifica un dominio Fv monocatenario o uno Fab.

En una realización, la colección diversa de polinucleótidos se genera sometiendo las secuencias del gen de región V a PCR en condiciones de mutación, por ejemplo, por amplificación por PCR de repertorios de región V de linfocitos B de vertebrados. En otra realización, la colección diversa de polinucleótidos se genera por síntesis génica (por ejemplo, por selección aleatoria de secuencias que codifican un polipéptido que tiene especificidad de unión y/o funcionalidad conocidas). En una realización útil, la colección diversa de polinucleótidos comprende vectores plasmídicos. En otra realización útil, la colección diversa de polinucleótidos comprende amplicones de PCR de ADN bicatenario. Los vectores plasmídicos pueden comprender una secuencia que codifica un gen marcador, tal como un marcador fluorescente, un marcador de superficie celular o un marcador seleccionable. La secuencia del gen marcador puede estar cadena arriba o cadena abajo de la secuencia que codifica el polipéptido que tiene una especificidad de unión o funcionalidad, pero entre las secuencias de repeticiones terminales invertidas. Como alternativa, la secuencia del gen marcador puede estar cadena abajo de dicha secuencia que codifica un polipéptido que tiene especificidad de unión o funcionalidad y separada por un sitio de entrada ribosómica interno.

En algunas realizaciones, la colección diversa de polinucleótidos codifica una pluralidad de moléculas de unión a antígeno de un vertebrado, tal como un mamífero, por ejemplo, un ser humano.

En una realización, la etapa (ii) del método comprende introducir en células hospedadoras polinucleótidos que comprenden secuencias que codifican regiones VH o VL de inmunoglobulina, o fragmentos de unión a antígeno de las mismas, y en el que dichas secuencias de región VH y VL se codifican en vectores separados. En otra realización, la etapa (ii) del método de la invención comprende introducir en células hospedadoras polinucleótidos que comprenden secuencias que codifican cadenas pesada o ligera de inmunoglobulina de longitud completa, o fragmentos de unión a antígeno de las mismas, en el que dichas secuencias de cadena pesada y ligera de longitud completa están en vectores separados. Los vectores pueden introducirse en las células hospedadoras simultáneamente o secuencialmente. En otra realización, las secuencias que codifican regiones VH y VL o cadenas pesadas y ligeras de longitud completa se introducen en células hospedadoras en el mismo vector. En el caso de que las secuencias VH y VL o las secuencias de cadena pesada y ligera del anticuerpo de longitud completa se introduzcan en las células hospedadoras en diferentes vectores, es útil que las secuencias de repeticiones terminales invertidas en cada vector se reconozcan por y sean funcionales con diferentes enzimas transposasas.

Las células hospedadoras son preferentemente células de vertebrados, y preferentemente células de mamíferos, tales como células de roedores o humanas. Son particularmente útiles células linfoides, por ejemplo, linfocitos B. Los linfocitos B pueden ser linfocitos B progenitores o linfocitos B precursores tales como, por ejemplo, linfocitos B progenitores o linfocitos B precursores transformados con virus de Leucemia Murina de Albelson y linfocitos proB y preB humanos transformados con VEB sin inmunoglobulina, tempranos. Otras células hospedadoras útiles incluyen líneas de linfocitos B tales como células Sp2/0, células NSO, células X63 y células Ag8653, o líneas celulares de mamíferos habituales tales como células CHO, células Per.C6, células BHK y células 293.

En una realización del método de la invención, la etapa de expresión (iii) comprende introducir en dichas células hospedadoras un vector de expresión que codifica una enzima transposasa que reconoce y es funcional con al menos una secuencia de repetición terminal invertida en los polinucleótidos. El vector que codifica la enzima transposasa puede introducirse en las células hospedadoras simultáneamente con o antes de o posteriormente a la colección diversa de polinucleótidos. En una realización, la enzima transposasa se expresa transitoriamente en dicha célula hospedadora. Como alternativa, la etapa de expresión (iii) puede comprender inducir un sistema de expresión inducible que está integrado de forma estable en el genoma de la célula hospedadora, tal como, por ejemplo, un sistema inducible por tetraciclina o inducible por tamoxifeno. En una realización preferida, la etapa (iii) comprende expresar en la célula o células hospedadoras un vector que comprende una transposasa Sleeping Beauty funcional o una transposasa PiggyBac funcional. En una realización útil, la etapa (iii) comprende expresar en dicha célula hospedadora un vector que comprende SEC ID Nº: 17. En otra realización útil, el vector codifica SEC ID Nº: 18, o una secuencia con al menos 95 % de homología de secuencia de aminoácidos y que tiene la misma especificidad de secuencia de repetición terminal invertida o similar.

En una realización del método de la invención, la etapa de exploración (iv) comprende separación de células activadas magnética (MACS), separación de células actividades por fluorescencia (FACS), selección frente a moléculas inmovilizadas en una selección de superficie sólida, selección con respecto a unión con moléculas asociadas con membrana celular incorporadas en una membrana de bicapa lipídica reconstituida de forma artificial, celular o natural, o exploración de alto rendimiento de clones celulares individuales en formato multipocillo con respecto a un fenotipo de unión o funcional deseado. En una realización, la etapa de exploración (iv) comprende explorar para identificar polipéptidos que tienen una especificidad de unión a diana o funcionalidad deseadas. En una realización preferida, la etapa de exploración (iv) comprende explorar para identificar moléculas de unión a antígeno que tengan una especificidad de unión deseada. En una realización útil, la etapa de exploración comprende además explorar para identificar moléculas de unión a antígeno que tienen una o más propiedades funcionales deseadas. La etapa de exploración (iv) puede comprender múltiples ciclos de enriquecimiento celular con expansión de células hospedadoras entre ciclos de enriquecimiento celular individuales.

En una realización del método de la invención, la etapa (v) de aislar la secuencia polinucleotídica que codifica el polipéptido que tiene una especificidad de unión o funcionalidad deseada comprende amplificación genómica o por RT-PCR o secuenciación profunda de siguiente generación. En una realización útil, la secuencia polinucleotídica aislada en la etapa (v) se somete a optimización de afinidad. Esto puede realizarse sometiendo la secuencia polinucleotídica aislada a PCR o RT-PCR en condiciones de mutación. En otra realización útil, la secuencia mutada se somete después a las etapas (i)-(v) del método de la invención. En una realización preferida, la secuencia polinucleotídica obtenida en (v) comprende una secuencia que codifica una región VH o VL de un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, y en el que dicha optimización de anticuerpo comprende introducir una o más mutaciones en una región determinante de complementariedad o región marco conservada de dicha VH o VL.

En una realización útil, las secuencias de repeticiones terminales invertidas son del sistema de transposón PiggyBac y se reconocen por y son funcionales con la transposasa PiggyBac. En una realización, la secuencia que codifica la secuencia de repetición terminal invertida PiggyBac cadena arriba comprende SEC ID Nº: 1. En otra realización, la secuencia que codifica la secuencia de repetición terminal invertida PiggyBac cadena abajo comprende SEC ID Nº:

2.

En otra realización útil, las secuencias de repeticiones terminales invertidas son del sistema de transposón Sleeping Beauty y se reconocen por y son funcionales con la transposasa Sleeping Beauty. En una realización, la secuencia que codifica la secuencia de repetición terminal invertida Sleeping Beauty cadena arriba comprende SEC ID Nº: 14. En otra realización, la secuencia que codifica la secuencia de repetición terminal invertida Sleeping Beauty cadena abajo comprende SEC ID Nº: 15.

En una realización de la invención, los polinucleótidos comprenden secuencias de la región VH o VL que codifican una secuencia derivada de un anticuerpo anti-TNF alfa humano. En una realización, el anticuerpo anti-TNF alfa humano es D2E7.

En una realización útil, la etapa (iii) comprende introducir en dicha célula hospedadora un vector que comprende una secuencia que codifica una transposasa PiggyBac funcional. En una realización el vector comprende SEC ID Nº: 11. En otra realización, el vector codifica SEC ID Nº: 12, o una secuencia con al menos 95 % de homología de secuencia de aminoácidos y que tiene la misma o similar especificidad de secuencia de repetición terminal invertida.

En realizaciones preferidas, las secuencias de repeticiones terminales invertidas se reconocen por y son funcionales con al menos una transposasa seleccionada del grupo que consiste en PiggyBac, Sleeping Beauty, Frog Prince, Himar1, Passport, Minos, hAT, Tol1, Tol2, Ac/Ds, PIF, Harbinger, Harbinger3-DR, y Hsmar1.

La presente invención se refiere además a una biblioteca de moléculas polinucleotídicas que codifican polipéptidos que tienen diferentes especificidades de unión o funcionalidades, que comprende una pluralidad de moléculas polinucleotídicas, en la que dichas moléculas polinucleotídicas comprenden una secuencia que codifica un polipéptido que tiene una especificidad de unión o funcionalidad dispuesta entre secuencias de repeticiones terminales invertidas que se reconocen por y son funcionales con al menos una enzima transposasa. Preferentemente los polinucleótidos son moléculas de ADN y comprenden una secuencia de unión a ligando de un receptor o una secuencia de unión a diana de una molécula de unión. En una realización particularmente preferida, la biblioteca comprende polinucleótidos, en los que cada polinucleótido comprende una secuencia que codifica una secuencia de unión a antígeno de un anticuerpo. En una realización, la biblioteca comprende polinucleótidos que codifican una región VH o VL de un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo. Como alternativa, los polinucleótidos pueden codificar una región VH y una región VL. En una realización preferida, los polinucleótidos de la biblioteca comprenden una secuencia que codifica una cadena pesada o ligera de anticuerpo de longitud completa (es decir, incluyendo la región constante) o un fragmento de unión a antígeno del mismo. Como alternativa, los polinucleótidos pueden codificar una cadena tanto pesada como ligera de inmunoglobulina de longitud completa. En otras realizaciones, los polinucleótidos de la biblioteca comprenden una secuencia que codifica un dominio Fv monocatenario o un Fab. En realizaciones preferidas, los polinucleótidos de la biblioteca están en forma de plásmidos o amplicones de PCR de ADN bicatenario. En ciertas realizaciones, los plásmidos de la biblioteca comprenden un gen marcador. En otra realización, los plásmidos comprenden una secuencia que codifica una enzima transposasa que reconoce y es funcional con las secuencias de repeticiones terminales invertidas. En una realización, la biblioteca de la invención comprende polinucleótidos que codifican la cadena pesada de inmunoglobulina de longitud completa incluyendo la estructura de intrón/exón natural de una cadena pesada de anticuerpo. La cadena pesada de inmunoglobulina de longitud completa puede comprender el dominio de anclaje a membrana endógeno.

La presente invención también se refiere a un método para generar una biblioteca de polinucleótidos transponibles que codifican polipéptidos que tienen especificidades de unión o funcionalidad diferentes, que comprende (i) generar una colección diversa de polinucleótidos que comprenden secuencias que codifican polipéptidos que tienen diferentes especificidades de unión o funcionalidades, en el que dichos polinucleótidos comprenden una secuencia que codifica un polipéptido que tiene una especificidad de unión o funcionalidad dispuesta entre secuencias de repeticiones terminales invertidas que se reconocen por y son funcionales con al menos una enzima transposasa.

La presente invención también se refiere a un vector que comprende una secuencia que codifica una región VH o VL de un anticuerpo, o parte de unión a antígeno del mismo, dispuesta entre secuencias de repeticiones terminales invertidas que se reconocen por y son funcionales con al menos una enzima transposasa. En ciertas realizaciones, el vector codifica una cadena pesada o ligera de longitud completa de una inmunoglobulina. Preferentemente, la secuencia que codifica la VH o VL o la cadena pesada o ligera es una secuencia aleatoria generada, por ejemplo, por amplificación por PCR en condiciones de mutación o síntesis génica. En una realización, el vector comprende secuencias de repeticiones terminales invertidas que se reconocen por y son funcionales con la transposasa PiggyBac. En otra realización, las secuencias de repeticiones terminales invertidas se reconocen por y son funcionales con la transposasa Sleeping Beauty. En una realización, el vector comprende una secuencia de región VH o VL derivada de un anticuerpo anti-TNF alfa tal como, por ejemplo, D2E7. En ciertas realizaciones, el vector comprende al menos una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEC ID Nº: 5, SEC ID Nº: 8, SEC ID Nº: 9, SEC ID Nº: 10, SEC ID Nº: 11, SEC ID Nº: 13, SEC ID Nº: 16, SEC ID Nº: 17 y SEC ID Nº: 19.

La presente invención también se refiere a una célula hospedadora que comprende un vector de la invención como se ha descrito anteriormente. En una realización preferida, la célula hospedadora comprende además un vector de expresión que comprende una secuencia que codifica una transposasa que reconoce y es funcional con al menos una secuencia de repetición terminal invertida en el vector que codifica dicha secuencia de región VH o VL.

La presente invención se refiere además a moléculas de unión a antígeno, por ejemplo, anticuerpos, producidos por un método que comprende la reivindicación 1.

La presente invención también se refiere a un método para generar una población de células hospedadoras capaces de expresar polipéptidos que tienen diferentes especificidades o funcionalidades, que comprende:

(i): generar una colección diversa de polinucleótidos que comprende secuencias que codifican polipéptidos que tienen diferentes especificidades de unión o funcionalidades, en el que dichos polinucleótidos comprenden una secuencia que codifica un polipéptido que tiene una especificidad de unión o funcionalidad dispuesta entre secuencias de repeticiones terminales invertidas que se reconocen por y son funcionales con al menos una enzima transposasa; y

(ii): introducir dicha colección diversa de polinucleótidos en células hospedadoras.

Breve descripción de los dibujos/figuras

FIG. 1: a.) Este dibujo representa la configuración de un elemento transponible autónomo (TE), que puede transponerse o “saltar” en cualquier secuencia de ADN diana. Los componentes clave de un TE son una enzima transposasa activa que reconoce las repeticiones terminales invertidas (ITR) que flanquean la enzima transposasa en sí misma cadena arriba y abajo de su secuencia. Los TE catalizan la copia o la escisión del TE, y la integración en secuencias de ADN diana no relacionadas. b.) Este dibujo representa la configuración de un sistema de vector de transposón, en el que la expresión de una enzima transposasa activa se efectúa por un vector de expresión que no está acoplado con el TE en sí mismo. En su lugar, el TE puede contener cualquier secuencia o secuencias, o gen o genes de interés que se clonan entre las ITR cadena arriba y abajo. La integración del TE que contiene cualquier secuencia o secuencias, o gen o genes de interés (por ejemplo, una biblioteca de ADN que codifica una biblioteca de proteínas) puede integrarse en secuencias de ADN diana no relacionadas, si la expresión de enzima transposasa se proporciona en trans, por ejemplo por una construcción de expresión de transposasa separada, como se representa en el presente documento. FIG. 2: a) Este dibujo representa las dos maneras diferentes cómo los TE pueden “saltar” o transponerse en ADN diana no relacionado. Para transposones del grupo II la enzima transposasa en una primera etapa reconoce las ITR del elemento transponible y cataliza la escisión del TE de ADN. En una segunda etapa, el TE escindido se inserta en una secuencia de ADN diana no relacionada, que también se cataliza por la enzima transposasa. Esto da como resultado un mecanismo de transposición de “corta y pega”. Para transposones del grupo I (mostrados en b.) la información codificante del TE se replica en primer lugar (por ejemplo, se transcribe y se transcribe de forma inversa, en el caso de retrotransposones) y después el TE replicado se integra en una secuencia de ADN diana no relacionada, que se cataliza por la enzima transposasa. Esto da como resultado un mecanismo de transposición de “copia y pega”. FIG. 3: Esta figura proporciona una visión de conjunto de enzimas transposasas activas que se han identificado y/o reconstruido a partir de TE inactivos, durmientes, y que se ha mostrado que pueden conferir transposición en diversas células de vertebrados y también humanas, como se proporciona en la tabla. La tabla se ha adaptado a partir de la Tabla I de la publicación Ni et al. Briefings Functional Genomics Proteomics 7, 444-453 (2008). FIG. 4: Esta figura perfila al principio del método desvelado en el presente documento, para el aislamiento de información codificante para proteínas, incluyendo anticuerpos y fragmentos de los mismos, con una función deseada, por ejemplo, la unión con una diana de interés, como se representa en el presente documento. El gen o los genes de interés, por ejemplo, una biblioteca de ADN transponible diversa que codifica proteínas, incluyendo cadenas polipeptídicas de anticuerpos o fragmentos de las mismas, que se clona entre repeticiones terminales invertidas (ITR) de una construcción transponible se introduce en una célula hospedadora de vertebrado junto con un vector de expresión para una enzima transposasa activa (véase parte superior del dibujo). La expresión de la enzima del transposón en dichas células hospedadoras en trans y la presencia del gen o los genes de

interés clonados entre ITR que pueden reconocerse por la enzima transposasa permite la integración estable del gen o los genes flanqueados por ITR de interés en el genoma de las células hospedadoras, que pueden después expresar de forma estable la proteína o las proteínas de interés codificadas por los genes de interés. La biblioteca celular que expresa la proteína o las proteínas de interés puede después explorarse con respecto a una funcionalidad deseada de las proteínas expresadas, por ejemplo, pero sin limitación, la unión de una proteína diana de interés, como se representa en el presente documento. Por medio de técnicas de separación de células conocidas en este campo, por ejemplo MACS o FACS, las células que expresan la proteína o las proteínas de interés con el fenotipo deseado y que por lo tanto contienen el genotipo correspondiente, pueden aislarse y la información codificante del gen o los genes de interés pueden recuperarse de las células aisladas por técnicas de clonación conocidas en este campo, por ejemplo pero sin limitación clonación por PCR genómica, como se representa en el presente documento. FIG. 5a) y 5b): Este dibujo perfila la estrategia de clonación para la generación de un vector de expresión de cadena ligera kappa (LC) de inmunoglobulina (lg) humana transponible, como se describe en el Ejemplo 1. La FIG. 5 a.) representa la estrategia de clonación para la inserción de ITR 5’ y 3’ del transposón PiggyBac en el vector de expresión de mamíferos pIRES-EGFP (Invitrogen, Carlsbad, CA, Estados Unidos), que ya contiene el fuerte elemento promotor de células de mamífero pCMV (IE) (promotor temprano inmediato de CMV) y señales de intrón/poliA para fuerte expresión en células hospedadoras de mamífero. Además, cadena abajo del sitio de clonación múltiple que contiene ClaI, EcoRV, Notl, EcoRI, en el que pueden clonarse un gen o genes de interés, pIRES-EGFP contiene un sitio de entrada ribosómica interno (IRES) con una ORF cadena abajo de proteína verde fluorescente potenciada (EGFP), que efectúa el acoplamiento de la expresión del gen o los genes de interés clonados cadena arriba del IRES. También se representan elementos funcionales bacterianos (gen de resistencia a ampicilina, ampR) y un origen bacteriano de replicación (Col EI) para amplificación y selección del plásmido en E. coli. El plásmido que contiene ITR PiggyBac resultante se designa pIRES-EGFP-T1T2. La FIG 5b) representa después la inserción de una LC kappa Ig humana de síntesis génica en el sitio de enzima de restricción EcoRV único de pIRES-EGFP-T1T2, que sitúa la LC kappa Ig humana cadena arriba del casete IRES-EGFP y de este modo acopla la expresión de la LC kappa Ig humana con la expresión del gen marcador EGFP. La inserción de la LC kappa Ig humana da como resultado el vector de expresión de LC kappa Ig humano transponible pIRES-EGFP-T1T2-IgL. Los dibujos muestran sitios de enzimas de restricción únicos seleccionados en los plásmidos, así como sitios duplicados seleccionados resultantes de etapas de clonación. FIG. 6: Este dibujo perfila la clonación de un vector de expresión de cadena pesada (HC) de inmunoglobulina (Ig) gamma 1 humana transponible, que puede generarse por intercambio de la fase abierta de lectura (ORF) de LC kappa Ig humana frente a la ORF para una ORF de HC Ig gamma 1 humana. El diseño de la ORF de HC Ig gamma 1 final es similar, también con respecto a la modificación por ingeniería genética de un sitio de enzima de restricción Eco47III único que separa las regiones codificantes variable (V) de la constante (C), lo que permite el intercambio de una única región codificante V de anticuerpo frente a una biblioteca diversa de regiones codificantes de V de anticuerpo, como se describe en el Ejemplo 3. FIG. 7: Este dibujo representa la clonación de un vector de expresión de enzima transposasa PiggyBac de mamífero, como se describe en el Ejemplo 4, usando pCDNA3.1(+) hygro como la cadena principal del vector de expresión de mamífero, en el que la ORF de síntesis génica de transposasa PiggyBac se clona en el sitio de enzima de restricción EcoRV único de pCDNA3.1(+) hygro, dando como resultado el vector de expresión de transposón PiggyBac pCDNA3.1(+) hygro-PB. Además en este dibujo se muestran la posición relativa de otros elementos funcionales de mamífero (promotor IE de CMV, señal poliA de BGH, segmento poliA de SV40, ORF de higromicina B) y elementos funcionales bacterianos (gen de resistencia a ampicilina, ampR, origen de replicación, ColE1), así como sitios de reconocimiento de enzimas de restricción relevantes seleccionados. FIG. 8: Este dibujo representa la clonación de un vector de expresión de cadena ligera kappa de inmunoglobulina (LC Kappa-Ig) humana transponible Sleeping Beauty, como se describe en el Ejemplo 5. La clonación puede realizarse por reemplazo secuencial de las ITR 5’ y 3’ de PiggyBac con ITR 5’ y 3’ de Sleeping Beauty en la construcción pIRES-EGFP-T1T2-IgL. Además en este dibujo se muestra la posición relativa de otros elementos funcionales de mamífero (promotor IE de CMV, señal poliA de BGH, segmento poliA de SV40, ORF de higromicina B) y elementos funcionales bacterianos (gen de resistencia a ampicilina, ampR, origen de replicación, ColE1), así como sitios de reconocimiento de enzimas de restricción relevantes seleccionados. FIG. 9: Este dibujo representa la clonación de un vector de expresión de enzima transposasa Sleeping Beauty de mamífero, como se describe en el Ejemplo 6, usando pCDNA3.1(+) hygro como la cadena principal del vector de expresión de mamífero, en el que se clona la ORF de síntesis génica de transposasa Sleeping Beauty en el sitio de enzima de restricción EcoRV único de pCDNA3.1(+) hygro, dando como resultado el vector de expresión de transposón Sleeping Beauty pCDNA3.1(+) hygro-SB. Además en este dibujo se muestra la posición relativa de otros elementos funcionales de mamífero (promotor IE de CMV, señal poliA de BGH, segmento poliA de SV40, ORF de higromicina B) y elementos funcionales bacterianos (gen de resistencia a ampicilina, ampR, origen de replicación, ColE1), así como sitios de reconocimiento de enzimas de restricción relevantes seleccionados.

Descripción detallada de la invención

Definiciones

Como se usa en el presente documento, “colección diversa” significa una pluralidad de variantes o mutantes de proteínas funcionales o de unión particulares que muestran diferencias en las secuencias de nucleótidos codificantes

o en las secuencias de aminoácidos primarias, que definen funcionalidades o propiedades de unión diferentes.

Como se usa en el presente documento, “biblioteca” significa una pluralidad de polinucleótidos que codifican polipéptidos que tienen diferentes especificidades de unión y/o funcionalidades. En ciertas realizaciones, la biblioteca puede comprender polinucleótidos que codifican al menos 102, al menos 103, al menos 104, al menos 105,

678 9

al menos 10, al menos 10, al menos 10o al menos 10polipéptidos únicos, tales como, por ejemplo, dominios VH

o VL o cadenas pesadas o ligeras de anticuerpo de longitud completa.

Como se usa en el presente documento, “secuencia de repetición terminal invertida” o “ITR” significa una secuencia identificada en los extremos 5’ o 3’ de elementos transponibles que se reconocen por transposasas y que median en la transposición de las ITR incluyendo información codificante intermedia de una construcción de ADN o locus a otra construcción de ADN o locus.

Como se usa en el presente documento, “transposasa” significa una enzima que tiene la capacidad de reconocer y de unirse con ITR y de mediar en la movilización de un elemento transponible de una secuencia de ADN diana a otra secuencia de ADN diana.

Como se usa en el presente documento, “molécula de unión a antígeno” se refiere en su sentido más amplio a una molécula que se une específicamente con un determinante antigénico. Un ejemplo no limitante de una molécula de unión a antígeno es un anticuerpo o fragmento del mismo que conserva unión específica de antígeno. Por “se une específicamente” se entiende que la unión es selectiva para el antígeno y puede diferenciarse de interacciones no deseadas o no específicas.

Como se usa en el presente documento, se pretende que el término “anticuerpo” incluya moléculas de anticuerpo completas, incluyendo anticuerpos monoclonales, policlonales y multiespecíficos (por ejemplo, biespecíficos), así como fragmentos de anticuerpo que tengan una región Fc y conserven especificidad de unión, y proteínas de fusión que incluyen una región equivalente a la región Fc de una inmunoglobulina y que conservan especificidad de unión. También están abarcados fragmentos de anticuerpo que conservan la especificidad de unión incluyendo, pero sin limitación, fragmentos VH, fragmentos VL, fragmentos Fab, fragmentos F(ab’)2, fragmentos scFv, fragmentos Fv, minicuerpos, diacuerpos, triacuerpos y tetracuerpos (véase, por ejemplo, Hudson y Souriau, Nature Med. 9: 129-134 (2003)).

Una realización de la invención desvelada en el presente documento es un método como se caracteriza en las reivindicaciones para la identificación de polipéptidos funcionales o de unión específicos, incluyendo, pero sin limitación cadenas de anticuerpos o fragmentos de las mismas (FIG. 4), que comprende:

i. clonación de diversas bibliotecas de ADN transponible que codifican proteínas, incluyendo cadenas polipeptídicas de anticuerpo o fragmentos de las mismas, entre repeticiones terminales invertidas (ITR) derivadas de elementos transponibles y reconocibles por y funcionales con al menos una enzima transposasa,

ii. introducción de una o más bibliotecas de ADN transponibles diversas de la etapa (i) en células hospedadoras de vertebrados por métodos convencionales conocidos en la técnica,

iii. proporcionar expresión temporal de al menos una enzima transposasa funcional en dichas células hospedadoras de vertebrados en trans, de modo que dichas una o más bibliotecas de ADN transponibles diversas se integran de forma estable en los genomas de células hospedadoras de vertebrados, proporcionando de este modo una población de células hospedadoras de vertebrados que después expresan de forma estable diversas bibliotecas de proteínas, incluyendo cadenas de anticuerpos o fragmentos de las mismas.

iv.: exploración de dichas bibliotecas celulares diversas, que expresan de forma estable proteínas, incluyendo anticuerpos o fragmentos de los mismos, con respecto a un fenotipo funcional o de unión deseado por métodos conocidos en la técnica,

v.: opcionalmente, incluir ciclos de enriquecimiento por iteraciones con las células hospedadoras de vertebrados modificadas genéticamente de forma estable para un fenotipo de unión o funcional deseado, y

vi. aislamiento de los genes correspondientes de las células hospedadoras enriquecidas que codifican la unión o el fenotipo funcional deseado por métodos de clonación convencionales, conocidos en la técnica, por ejemplo, pero sin limitación, PCR (reacción en cadena de la polimerasa) usando cebadores específicos para las secuencias contenidas en la o las construcciones de biblioteca de ADN transpuesto.

Una realización preferida de la etapa (i) es generar diversas bibliotecas de ADN transponibles bien por síntesis génica, o bien por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando cebadores apropiados para la amplificación de diversas regiones codificantes de proteínas, y moldes de ADN que comprenden diversas proteínas de unión, incluyendo anticuerpos o fragmentos de los mismos, por métodos conocidos en la técnica.

Para la generación de diversas bibliotecas de anticuerpos, puede generarse una colección diversa de secuencias de cadena pesada y ligera de anticuerpos por síntesis génica convencional en la que las secuencias codificantes de región V pueden seleccionarse aleatoriamente en ciertas posiciones, por ejemplo, pero sin limitación, cualquiera o todas de las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de las regiones V de cadena pesada o ligera del anticuerpo. La diversidad puede restringirse a CDR individuales de las regiones V, o a posiciones de marco conservado particulares o varias, y/o a posiciones particulares en una o más de las regiones CDR. Las regiones V con variaciones diseñadas, como se ha descrito anteriormente, pueden sintetizarse como un fragmento que codifica cadenas pesadas o ligeras de anticuerpo completo que se flanquean por repeticiones terminales invertidas funcionales para al menos una enzima transposasa deseada. Preferentemente, se genera la biblioteca de ADN que contiene diversos dominios variables que codifican regiones V para cadenas pesadas o ligeras de anticuerpo, y flanqueada por sitios de clonación apropiados, incluyendo pero sin limitación, sitios de reconocimiento de enzimas de restricción, que son compatibles con sitios de clonación en vectores de expresión de cadena pesada o ligera de anticuerpo. Los sistemas de expresión de transposones útiles para su uso en los métodos de la invención incluyen, por ejemplo, el sistema de transposón PiggyBac como se ha descrito, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos Nº 6.218.185; 6.551.825; 6.962.810; 7.105.343; y 7.932.088 y el sistema de transposón Sleeping Beauty como se describe en las Patentes de Estados Unidos Nº 6.489.458; 7.148.203; 7.160.682; documentos US 2011 117072; US 2004 077572; y US 2006 252140.

También pueden obtenerse diversas bibliotecas de cadena pesada y ligera de anticuerpo a partir de poblaciones de linfocitos B aisladas de especies de vertebrados deseadas, preferentemente seres humanos, y preferentemente de compartimentos celulares que contienen linfocitos B, por ejemplo, pero sin limitación, sangre periférica o del cordón umbilical, y órganos linfoides como médula ósea, bazo, amígdalas y tejidos de ganglios linfáticos. En este caso, pueden aislarse diversas secuencias de región V de anticuerpo para cadenas pesadas y ligeras de anticuerpo por RT-PCR o por PCR genómica usando pares de cebadores de PCR degradados específicos de cadena pesada y ligera de anticuerpo, que pueden amplificar la mayoría de familias de la región V proporcionando cebadores cadena arriba que se unen con secuencias homólogas cadena arriba de, o dentro de secuencias líder, cadena arriba de o dentro de regiones marco conservadas de región V, y proporcionando cebadores cadena abajo que se unen en regiones de homología dentro de o cadena abajo del segmento génico de unión J de regiones codificantes de dominio variable o dentro de o cadena abajo de las regiones codificantes de las regiones constantes de cadenas pesadas o ligeras de anticuerpo.

Los conjuntos de cebadores de PCR utilizados para la amplificación de diversas regiones codificantes variables pueden flanquearse por sitios de clonación apropiados, por ejemplo, pero sin limitación sitios de reconocimiento de enzimas de restricción, que son compatibles con sitios de clonación en vectores de expresión de cadena pesada o ligera de anticuerpo.

Las bibliotecas de ADN transponibles de la etapa (i) que codifican diversas proteínas, incluyendo anticuerpos y fragmentos de anticuerpo de los mismos, pueden proporcionarse en forma de bibliotecas de plásmidos, en las que las bibliotecas de ADN transponibles amplificadas por PCR o de síntesis génica se clonan usando sitios de clonación apropiados, como se ha mencionado anteriormente. Como alternativa, las bibliotecas de ADN transponibles que codifican diversas bibliotecas de proteínas de unión, tales como anticuerpos y fragmentos de los mismos, pueden proporcionarse en forma de construcciones de ADN lineal, bicatenario, directamente como resultado de la síntesis de ADN, o como resultado de amplificación por PCR. Este último enfoque de proporcionar las bibliotecas de ADN transponible como amplicones de PCR de ADN bicatenario lineal, que no se han clonado en vectores de expresión o plásmidos (en comparación con todos los otros sistemas de expresión de células de vertebrados) tiene la ventaja de que se mantiene la máxima complejidad molecular de las bibliotecas de ADN transponibles y no se compromete por una eficacia de clonación o ligamiento limitada en un vector de expresión. Por el contrario, la clonación por ligamiento, o de otro modo, en vectores de expresión o lanzadera plasmídicos es un intermedio necesario para todos los otros sistemas de expresión de células de vertebrados basados en plásmidos o basados en vector viral.

Sin embargo, el uso de vectores de expresión de transposón basados en plásmidos que contienen las diversas bibliotecas de ADN transponible que codifican diversas proteínas de unión, incluyendo anticuerpos y fragmentos de anticuerpos de los mismos, tiene la ventaja de que estos vectores de expresión pueden modificarse por ingeniería genética para contener elementos funcionales adicionales, lo que permite la exploración, o, como alternativa, la selección de células hospedadoras de vertebrados con transposición estable para la integración estable del vector de expresión del transposón en células hospedadoras de vertebrados con transposiciones.

Esto se consigue proporcionando en unión operativa con las diversas bibliotecas de ADN transponible, es decir, clonadas en los vectores de expresión de transposones en cis, casetes de expresión para genes marcadores incluyendo, pero sin limitación, proteínas marcadoras fluorescentes (proteínas verdes, amarillas, rojas o azules fluorescentes, y versiones potenciadas de las mismas, como se conoce en la técnica) o casetes de expresión para marcadores de superficie celular incluyendo, pero sin limitación, marcadores de CD, contra los que están disponibles anticuerpos de diagnóstico específicos u otras herramientas de diagnóstico.

Como alternativa, pueden proporcionarse casetes de expresión para marcadores seleccionables, que permiten la selección de células hospedadoras de vertebrados con transposiciones con respecto a resistencia a antibióticos,

incluyendo, pero sin limitación, puromicina, higromicinaB, bleomicina, resistencia a neomicina, en unión operativa con las diversas bibliotecas de ADN transponible, es decir, clonadas en los vectores de expresión de transposones en cis.

La unión operativa puede conseguirse clonando dichos casetes de expresión para genes marcadores o marcadores de resistencia a antibióticos, bien cadena arriba o bien cadena abajo de las regiones codificantes que comprenden dichas bibliotecas diversas de ADN transponible, pero dentro de las repeticiones terminales invertidas del vector de transposón.

Como alternativa, la unión operativa puede conseguirse clonando las regiones codificantes de dicho marcador o genes de resistencia a antibióticos cadena abajo de las regiones codificantes que comprenden dichas diversas bibliotecas de ADN transponible, pero separadas por secuencias de sitios de entrada ribosómica internos (IRES), que aseguran el acoplamiento transcripcional de la expresión de dichas diversas bibliotecas de ADN transponible con dichos genes de marcadores o de resistencia a antibióticos, y permitiendo de este modo la exploración con respecto a una selección de células hospedadoras de vertebrados con transposiciones estables.

En la etapa (ii) del método desvelado en el presente documento, se introducen dichas diversas bibliotecas de ADN transponible que codifican diversas bibliotecas de proteínas, incluyendo anticuerpos y fragmentos de los mismos, en células hospedadoras de vertebrados deseadas por métodos conocidos en la técnica para transferir eficazmente ADN entre membranas celulares de vertebrados, incluyendo, pero sin limitación, transfección de ADN usando liposomas, fosfato cálcico, DEAE-dextrano, partículas magnéticas de polietilenimida (PEI), o mediante fusión de protoplastos, transfección mecánica, incluyendo métodos físicos o balísticos (pistola génica) o por nucleofección. Puede usarse cualquiera de los métodos anteriormente mencionados u otros métodos apropiados para transferir ADN en células hospedadoras de vertebrados individualmente, o en combinación para la etapa (ii) del método desvelado en el presente documento.

En el caso de proteínas diméricas, incluyendo, pero sin limitación, anticuerpos y fragmentos de los mismos, es una realización útil del método desvelado en el presente documento introducir diversas bibliotecas de ADN transponible y/o vectores de transposones para cadenas pesadas o ligeras de anticuerpos contenidas en vectores transponibles separados, que pueden introducirse de forma independiente en las células hospedadoras de vertebrados. Esto permite la introducción secuencial de diversas bibliotecas de ADN transponible para cadenas pesadas o ligeras de anticuerpo en dichas células, o su introducción simultánea de diversas bibliotecas de ADN transponible para cadenas pesadas o ligeras de anticuerpo, que, en cualquiera de los casos, permite la redistribución aleatoria de cualquier cadena pesada de anticuerpo con cualquier cadena ligera de anticuerpo codificada por las al menos dos bibliotecas de ADN transponible diversas separadas.

Otra realización útil de la realización anterior es utilizar vectores de transposones separados y/o diversas bibliotecas transponibles de ADN para cadenas pesadas y ligeras de anticuerpo, donde dichas construcciones o bibliotecas están contenidas en vectores transponibles reconocidos por diferentes enzimas transposasas (Figura 3). Esto permite la transposición independiente de construcciones de cadena pesada de anticuerpo y ligera de anticuerpo sin interferencia entre las dos enzimas transposasas diferentes, ya que un vector transponible solamente se reconoce y se transpone por su enzima transposasa específica. En el caso de la transposición secuencial de vectores transponibles o bibliotecas de ADN que codifican cadenas pesadas o ligeras de anticuerpo, la ventaja de utilizar enzimas transposasas con diferentes secuencias de ITR es que, tras el segundo acontecimiento de transposición, la primera construcción ya transpuesta de forma estable no se vuelve a movilizar para transposición adicional.

Esta realización también permite el descubrimiento de anticuerpos por el método de selección guiada (Guo-Qiang et al. Methods Mol. Biol. 562, 133-142 (2009)). La selección guiada puede usarse, por ejemplo, para la conversión de cualquier anticuerpo no humano específico para una especificidad de diana/epítopo deseada y con una funcionalidad deseada en un anticuerpo completamente humano, donde se conserva la misma especificidad de diana/epítopo y funcionalidad. El principio de selección guiada implica la expresión de una única cadena de anticuerpo (cadena pesada o ligera) de un anticuerpo de referencia (el "guía"), en combinación con una biblioteca diversa de las cadenas de anticuerpos complementarios (es decir cadena ligera, o pesada, respectivamente), y la exploración de estas combinaciones de cadena pesada-ligera con respecto al fenotipo funcional o de unión deseado. De esta manera, la primera cadena de anticuerpo "guía" la selección de una o más cadenas de anticuerpo complementarias de la biblioteca diversa con respecto al fenotipo funcional o de unión deseado. Una vez que se aíslan la o las cadenas de anticuerpo complementarias nuevas, estas pueden clonarse en vectores de expresión y usarse de nuevo para "guiar" la selección de la segunda cadena de anticuerpo complementaria de una biblioteca de cadenas de anticuerpo diversa. El resultado final de este proceso de dos etapas es que las cadenas tanto pesadas como ligeras del anticuerpo original de un anticuerpo de referencia se reemplazan por secuencias de cadena de anticuerpo nuevo y no relacionado de las bibliotecas diversas, pero cuando la combinación de cadena pesada-ligera del anticuerpo nuevo muestra las mismas propiedades funcionales o de unión, o similares, del anticuerpo de referencia original. Por lo tanto, este método requiere la capacidad de expresar independientemente construcciones de cadena pesada y ligera de anticuerpo o bibliotecas en las células hospedadoras de vertebrados, que pueden conseguirse por la realización preferida para proporcionar casetes de expresión de cadena pesada y ligera de anticuerpo en diferentes sistemas de vector transponible, reconocidos por diferentes enzimas de transposones.

Sin embargo, también pueden construirse bibliotecas de ADN transponible diversas de manera que las regiones codificantes de proteínas multiméricas, incluyendo anticuerpos y fragmentos de los mismos, estén contenidas en el mismo vector de transposón, es decir cuando la expresión de las al menos dos subunidades diferentes de una proteína multimérica, por ejemplo regiones VH y VL o cadenas pesadas y ligeras de longitud completa, está unida operativamente por clonación de los casetes de expresión respectivos o regiones codificantes en el mismo vector transponible.

Son células hospedadoras de vertebrados útiles para la introducción de construcciones transponibles y/o bibliotecas de ADN transponible de la etapa (ii) las células de especies de vertebrados que pueden inmortalizarse o que están inmortalizadas y que pueden cultivarse en medios de cultivo celular apropiados y en condiciones conocidas en la técnica. Estas incluyen, pero sin limitación, células de, por ejemplo, ranas, peces, aves, pero preferentemente de especies de mamífero, incluyendo, pero sin limitación, células de roedores, rumiantes, especies de primates no humanas y seres humanos, prefiriéndose las células de origen roedor o humano.

Los tipos celulares útiles de las especies anteriormente mencionadas incluyen, pero sin limitación las células del linaje linfoide, que pueden cultivarse en suspensión y a altas densidades, prefiriéndose las células derivadas del linaje B, ya que expresan de forma endógena todas las proteínas, factores, chaperonas y enzimas posttraduccionales requeridas para la expresión óptima de muchas proteínas, en particular de anticuerpos, o proteínas basadas en anticuerpo. De las células de vertebrados derivadas de linaje B, se prefieren las que representan estadios de diferenciación tempranos, y se conocen como linfocitos de progenitores (pro) o precursores (pre), ya que dichos linfocitos pro-o preB en la mayoría de los casos no expresan cadenas de anticuerpos endógenas que podrían interferir con la expresión de cadena de anticuerpo exógena o heteróloga que son parte del método desvelado en el presente documento.

Son células de linaje pro-y pre-B útiles de origen roedor los linfocitos proB y preB transformados por virus de leucemia murina de Abelson (A-MuLV) (Alt et al. Cell 27, 381-390 (1981)) que expresan todos los componentes necesarios para la expresión de anticuerpos y también para su deposición en superficie apropiada, incluyendo los componentes receptores de linfocitos B Ig-alfa (CD79a, o mb-1), e Ig-beta (CD79b, o B-29) (Hombach et al. Nature 343, 760-762 (1990)), pero como se ha mencionado anteriormente, carecen en su mayoría de la expresión de cadenas de anticuerpo o inmunoglobulina endógenas. Aquí, se prefieren linfocitos pro-y preB transformados por A-MuLV que derivan de mutantes de ratón, incluyendo, pero sin limitación, mutantes de ratón defectuosos en el gen activador de recombinación 1 (RAG-1) o gen activador de recombinación 2 (RAG-2), o animales que portan otras mutaciones en genes requeridos para recombinación de V(D)J, por ejemplo, XRCC4, ADN ligasa IV, Ku70 o Ku80, Artemis, proteína quinasa dependiente de ADN, subunidad catalítica (ADN-PKcs), y por lo tanto carecen de la capacidad para expresar normalmente polipéptidos de anticuerpos endógenos.

Son tipos útiles adicionales de células de linaje B progenitoras (pro) y precursoras (pre), linfocitos proB y preB humanos transformados por VEB sin inmunoglobulina (sin Ig) (Kubagawa et al., PNAS 85, 875-879 (1988)) que también expresan todos los factores requeridos para expresión, modificación post-traduccional y expresiones de superficie de anticuerpos exógenos (incluyendo CD79a y CD79b).

Pueden usarse otras células hospedadoras del linaje B, que representan estadios de diferenciación de células plasmáticas del linaje de linfocitos B, preferentemente, pero sin limitación, líneas celulares de mieloma sin Ig, como Sp2/0, NSO, X63, Ag8653, y otras células de mieloma y plasmacitoma, conocidas en la técnica. Opcionalmente, estas líneas celulares pueden transfectarse de forma estable o modificarse genéticamente de forma estable por otros medios distintos de transfección, para sobreexpresar componentes del receptor de linfocitos B Ig-alfa (CD79a o mb-1), e Ig-beta (CD79b o B-29), en caso de que se desee deposición en superficie óptima de anticuerpos expresados de forma exógena.

Pueden usarse otras líneas celulares de mamífero no linfoides, incluyendo pero sin limitación, células hospedadoras de expresión de anticuerpos convencionales en la industria, incluyendo, pero sin limitación, células CHO, células Per.C6, células BHK y células 293 como células hospedadoras para el método desvelado en el presente documento, y cada una de estas células puede además opcionalmente transfectarse de forma estable o modificarse genéticamente de forma estable para sobreexpresar componentes del receptor de linfocitos B Ig-alfa (CD79a o mb1) e Ig-beta (CD79b o B-29), en caso de que se desee deposición de superficie óptima de anticuerpos expresados de forma exógena.

Esencialmente, puede usarse cualquier célula hospedadora de vertebrado, que sea transfectable, para el método desvelado en el presente documento, lo que representa una ventaja importante en comparación con cualquier sistema de expresión viral, tal como, pero sin limitación, sistemas de expresión de virus vaccinia, retroviral, adenoviral o de virus sindbis, debido a que el método desvelado en el presente documento no muestra restricción de células hospedadoras debido al tropismo del virus para ciertas especies o tipos celulares, y además puede usarse con todas las células de vertebrados, incluyendo células humanas, al nivel de bioseguridad más bajo, aumentando su utilidad general.

La etapa (iii) del método desvelada en el presente documento da como resultado la modificación genética estable de células hospedadoras de vertebrados deseadas con las construcciones transponibles transfectadas de la etapa (ii) por expresión temporal, o transitoria, de una enzima transposasa funcional, de modo se genere que una población estable de células hospedadoras de vertebrados que exprese bibliotecas diversas de proteínas codificadas por dichas construcciones.

Una realización útil de la etapa (iii) es introducir transitoriamente en las células hospedadoras, preferentemente por co-transfección, como se ha descrito anteriormente, un vector de expresión de vertebrados que codifique una enzima transposasa funcional junto con dicha al menos una biblioteca de ADN transponible diversa. Debe entenderse que la co-transfección o co-integración transitoria de un vector de expresión de transposasa puede realizarse simultáneamente, o poco antes o después de la transferencia de las construcciones transponibles y/o bibliotecas de ADN transponible diversas en las células hospedadoras de vertebrados, de modo que la transposasa expresada de forma transitoria puede usar óptimamente los vectores transponibles introducidos de forma transitoria de la etapa (ii) para la integración de la biblioteca de ADN transponible en el genoma de la célula hospedadora de vertebrado.

Otra realización útil de la etapa (iii) es efectuar la integración estable de los vectores transponibles introducidos y/o bibliotecas de ADN transponible de la etapa (ii) expresando de forma transitoria una enzima transposasa funcional por medio de un sistema de expresión inducible conocido en la técnica, que ya está integrado en el genoma de la célula hospedadora de vertebrado. Dicha expresión inducible y transitoria de una transposasa funcional puede conseguirse, por ejemplo, mediante sistemas promotores inducibles por tetraciclina (tet-on/tet-off) o inducible por tamoxifeno conocidos en la técnica. En este caso, solo es necesario introducir el o los vectores transponibles o bibliotecas de ADN en el genoma de la célula hospedadora, y la transposición estable de las construcciones y la expresión estable de las proteínas codificadas por el o los vectores transponibles o bibliotecas de ADN se efectúa por la expresión activada de forma transitoria de la enzima transposasa funcional en las células hospedadoras.

La etapa (iv) del método desvelado en el presente documento efectúa el aislamiento de células hospedadoras de vertebrados con transposición que expresan proteínas con un fenotipo de funcionalidad o unión deseado.

Una realización preferida de la etapa (iv) es explorar con respecto a y aislar las células hospedadoras con transposición de la etapa (iii) que expresan proteínas deseadas, incluyendo anticuerpos y fragmentos de los mismos, con ensayos de unión a diana y por medio de técnicas de separación de células convencionales, como separación de células activadas magnética (MACS) o separación de células activadas por fluorescencia de alta velocidad (FACS) conocidas en este campo. Especialmente, en una primera etapa de enriquecimiento de una población específica de células hospedadoras de vertebrados con transposición, en la que es necesario procesar un gran número de células, se prefiere aislar células específicas diana de un gran número de células no específicas por técnicas basadas en MACS.

Particularmente, para ciclos de enriquecimiento de células adicionales y por iteraciones, se prefiere enriquecimiento de FACS, ya que es necesario procesar potencialmente menores números de células, y debido a que la citometría de flujo multicanal permite el enriquecimiento simultáneo de funcionalidades, incluyendo, pero sin limitación, unión con una diana específica de más de una especie, o la exploración específica con respecto a epítopos particulares usando anticuerpos de competición específicos de epítopo en la exploración de FACS.

Si van a descubrirse proteínas, incluyendo anticuerpos y fragmentos de los mismos, que interaccionen con compañeros de unión solubles, estos compañeros de unión se marcan preferentemente con marcadores o etiquetas específicos, tales como pero sin limitación biotina, myc o marcadores de HA conocidos en la técnica, que pueden detectarse por reactivos secundarios, por ejemplo pero sin limitación, estreptavidina o anticuerpos, que en sí mismos están marcados de forma magnética (para enriquecimiento celular basado en MACS) o con fluorocromos (para enriquecimiento celular basado en FACS), de modo que pueden aplicarse las técnicas de separación de células.

Si van a descubrirse proteínas, incluyendo anticuerpos y fragmentos de los mismos, contra proteínas unidas a membrana, que no pueden expresarse fácilmente como proteínas solubles, como por ejemplo, pero sin limitación, tetraspaninas, proteínas de 7 dominios transmembrana (como receptores acoplados a proteína G) o canales iónicos, estas pueden expresarse en partículas virales, o sobreexpresarse en líneas celulares específicas, que después se usan para métodos de marcaje o selección conocidos en la técnica, que pueden enriquecer las células hospedadoras de vertebrados que expresan las proteínas de las construcciones transpuestas, incluyendo anticuerpos y fragmentos de los mismos.

Debido al acoplamiento genotipo-fenotipo estable en la población de células hospedadoras de vertebrados con transposición estable, una realización útil de la etapa (v) es repetir los ciclos de enriquecimiento celular para un fenotipo funcional o de unión deseado, hasta que se obtiene una población de células definida que se asocia con un fenotipo funcional o de unión deseado. Opcionalmente, pueden aislarse clones de células individuales por ejemplo, pero sin limitación, separación de células individuales usando tecnología de citometría de flujo, o por dilución limitante, para recuperar la información de ADN transpuesto de clones de células individuales que se acoplan a un fenotipo funcional o de unión deseado, particular.

Para la identificación de anticuerpos específicos de diana funcionales es con frecuencia favorable no solamente explorar y seleccionar con respecto a un fenotipo de unión particular, sino explorar adicionalmente con respecto a propiedades funcionales adicionales de anticuerpos específicos de diana, en particular efectos antagonistas o agonistas en un ensayo biológico.

Por lo tanto, es deseable poder "cambiar" eficazmente la expresión de anticuerpo unido a membrana por expresión de anticuerpo secretado en las células hospedadoras de vertebrados con suficiente rendimiento para producir una cantidad suficiente de un clon de anticuerpo particular para ensayos funcionales.

En células de linaje B natural el cambio de expresión de anticuerpo unido a membrana a secretado se produce mediante un mecanismo de corte y empalme alternativo, en el que en los linfocitos preB y B un donante de corte y empalme alternativo cerca del extremo 3' del último exón de región constante de cadena pesada se corta y se empalma preferentemente en un aceptor de corte y empalme de un exón de anclaje de membrana cadena abajo de los exones de región constante de cadena pesada. De esta manera, se produce una cadena pesada de anticuerpo en linfocitos B con un dominio transmembrana, extendido, C-terminal, que ancla la cadena pesada y por lo tanto el anticuerpo que contiene cadena pesada-ligera completo en la membrana celular. El dominio de transmembrana, Cterminal, también interacciona de forma no covalente con los componentes transmembrana Ig-alfa (CD79a o mb-1) e Ig-beta (CD79b o B29), lo que probablemente da como resultado mejor anclaje de membrana y mayor expresión de inmunoglobulina en superficie en células de linaje B.

Una vez que un linfocito B se diferencia adicionalmente al estadio de célula plasmática, ya no se produce el corte y empalme alternativo y el donante de corte y empalme alternativo cerca del extremo 3' de la última región constante de cadena pesada ya no se reconoce ni se utiliza, y el molde de ARNm se termina cadena abajo del codón de parada de región constante de cadena pesada, y se traduce una cadena pesada de un anticuerpo secretado.

Para aprovechar este mecanismo natural de corte y empalme alternativo y "cambio" de expresión unida a membrana a secretada de anticuerpos expresados, es una realización útil del método desvelado en el presente documento construir los vectores transponibles y diversas bibliotecas de ADN que codifican proteínas, incluyendo anticuerpos o fragmentos de los mismos, de tal manera que se mantiene la estructura de intrón/exón natural de una cadena pesada de anticuerpo constante, incluyendo los exones que codifican los dominios transmembrana. Esta realización representa una clara ventaja frente a sistemas de expresión retrovirales, ya que el genoma del vector retroviral ya está cortado y empalmado antes de empaquetarse en una partícula retroviral y transducirse de forma estable en el genoma de la célula hospedadora.

Otros sistemas de vector viral pueden restringirse en la longitud del inserto de ADN que puede incorporarse a los vectores, evitando de esta manera la clonación de regiones genómicas mayores en dichos vectores de expresión y evitando de este modo el aprovechamiento del "cambio" natural de expresión de anticuerpo unido a membrana a secretado por corte y empalme alternativo. Ciertos transposones (por ejemplo, Tol2, véase Figura 3), se han caracterizado como capaces de transponer eficazmente fragmentos de ADN de más de 10 kb en células hospedadoras de vertebrados sin ninguna pérdida de eficacia de transposición (Kawakami Genome Biol. 8, Supl I, S7 (2007)). Por lo tanto, es una realización útil del método desvelado en el presente documento construir vectores de expresión transponibles que comprenden estructuras exónicas/intrónicas genómicas para una expresión mejor y apropiada y para el cambio de regulación natural de expresión de anticuerpo unido a membrana a secretado. Los métodos de la invención son útiles para transponer fragmentos de ADN de al menos 5 kb, al menos 6 kb, al menos 7 kb, al menos de 8 kb, al menos 9 kb, al menos 10 kb de tamaño en genomas de células hospedadoras.

La diferenciación del estadio de diferenciación de linaje B anterior que favorece la expresión de anticuerpo unido a membrana, a un estadio de célula plasmática, posterior, que favorece la expresión de anticuerpo secretado puede inducirse por factores de diferenciación de linfocitos B, tales como, pero sin limitación, desencadenamiento de CD40/IL4, o estimulación por mitógenos, tales como, sin limitación, lipopolisacáridos (LPS) u otros activadores policlonales, activadores de cepa Cowan de Staph. aureus (SAC), y nucleótidos CpG, o cualquier combinación de los mismos.

Preferentemente, esta diferenciación se efectúa en células transformadas, en las que la proliferación puede inhibirse artificialmente, de modo que puede producirse de nuevo diferenciación de linfocitos B apropiada, como ya se ha descrito para linfocitos preB murinos transformados por A-MuLV, en los que la tirosina quinasa de Abelson se inhibe específicamente por el inhibidor de tirosina Gleevec (Muljo et al. Nat. Immunol 4, 31-37 (2003)). Por lo tanto, es una realización preferida utilizar linfocitos preB murinos transformados por A-MuLV sin Ig para el método, que por tratamiento con Gleevec, pueden de nuevo diferenciarse en estadios de linfocitos B más maduros, incluyendo células plasmáticas, que después secretan suficientes cantidades de anticuerpo secretado para ensayos funcionales adicionales basándose en el corte y empalme alternativo de construcciones de expresión de cadena pesada genómica. Es una realización preferida del método desvelado en el presente documento, mejorar adicionalmente dicha diferenciación de células de linaje B por sobreexpresión estable de factores anti-apoptóticos, conocidos en la técnica, incluyendo, pero sin limitación, bcl-2 o bcl-xL.

Después de la etapa (iv), se ha realizado el enriquecimiento de células hospedadoras de vertebrados con transposición como se ha descrito anteriormente, opcionalmente, pueden realizarse enriquecimientos celulares adicionales de acuerdo con los métodos anteriormente mencionados (etapa (v)), hasta que se aíslen poblaciones celulares, o células individuales que expresen proteínas, incluyendo anticuerpos y fragmentos de los mismos, con propiedades funcionales y/o de unión deseadas.

La etapa (vi) del método desvelado en el presente documento se realiza después para aislar la información codificante relevante contenida en las células hospedadoras de vertebrados transpuestas, aisladas con respecto a una propiedad funcional y/o de unión deseada.

Una realización útil de la etapa (vi) para el aislamiento, clonación y secuenciación de la información codificante relevante con respecto a una proteína funcional o de unión deseada, incluyendo un anticuerpo o fragmento de anticuerpo del mismo, contenida en las células aisladas, es utilizar amplificación genómica o por RT-PCR con pares de cebadores específicos para la información codificante relevante comprendida en las construcciones de ADN transpuesto, y para secuenciar los amplicones genómicos o de RT-PCR bien directamente, o bien después de subclonar en vectores de secuenciación, conocidos en la técnica, por ejemplo, pero sin limitación, vectores de clonación TA o Gateway.

Otra realización útil de la etapa (vi) es someter las poblaciones de células enriquecidas de las etapas (iv) o (v), que muestran un fenotipo funcional o de unión deseado a secuenciación de siguiente generación ("profunda") (Reddy et al. Nat. Biotech 28, 965-969 (2010)), para recuperar directamente y en una etapa un conjunto representativo de varios miles de secuencias para la información codificante contenida en las construcciones de ADN transpuesto. Basándose en un análisis bioinformático de la frecuencia relativa de secuencias identificadas de las poblaciones celulares enriquecidas, permite una predicción acerca de qué secuencias codifican una proteína funcional o de unión, incluyendo un anticuerpo o fragmento del mismo (Reddy et al. Nat. Biotech. 28, 965-969 (2010)). Las secuencias sobrerrepresentadas estadísticamente se vuelven a sintetizar después y se clonan en un vector de expresión para expresión como proteínas recombinantes, anticuerpos o fragmentos de los mismos, para caracterizarlas funcionalmente y con respecto a sus propiedades de unión. Este método puede acelerar significativamente la identificación de secuencias relevantes dentro de una población celular enriquecida funcional y fenotípicamente, que expresa proteínas con propiedades específicas funcionales o diana.

Otra realización útil más del método desvelado en el presente documento es utilizar expresión celular de proteínas de vertebrados mediada por transposición, incluyendo anticuerpos o fragmentos de los mismos, para la mutagénesis y optimización de proteínas deseadas, incluyendo la optimización de afinidad de anticuerpos y fragmentos de los mismos.

Esto puede conseguirse aislando los genes que codifican las proteínas, incluyendo cadenas de anticuerpo o fragmentos de las mismas, de poblaciones celulares de vertebrados con transposiciones enriquecidas con respecto a un fenotipo de unión o funcional deseado de acuerdo con los métodos desvelados en la etapa (iv), tal como, pero sin limitación, por amplificación por PCR genómica o RT-PCR en condiciones mutantes, conocidas en la técnica. Las secuencias mutadas pueden volver a clonarse después en vectores de transposición y después volver a transponerse en células hospedadoras de vertebrados, para someterlos a exploración de acuerdo con los métodos desvelados en el presente documento, con respecto a propiedades funcionales o de unión mejoradas.

En una realización útil de este enfoque, se usan cebadores específicos que permiten la amplificación por PCR en condiciones mutantes de construcciones transpuestas completas, incluyendo las ITR flanqueantes.

Por este método se genera un amplicón de PCR mutado que contiene una frecuencia media definida de mutaciones aleatorias de las células con transposición seleccionadas funcional o fenotípicamente. Dicho amplicón de PCR con mutaciones (variaciones) controladas de los moldes originales pueden ahora volver a transponerse directamente en nuevas células hospedadoras de vertebrados, de acuerdo con realizaciones preferidas desveladas en los métodos aplicables en la etapa (ii).

La principal ventaja de este método sobre otros enfoques de células de vertebrados modificadas genéticamente es que con esta tecnología no se requiere nueva clonación que consume tiempo de los amplicones de PCR mutados y control de calidad que consume tiempo de las secuencias mutadas en vectores de expresión, que es un requisito obligatorio en todos los demás sistemas de expresión virales o basados en plásmidos, si va a someterse a una secuencia mutada a otro ciclo de exploración.

Debido a que la transposición de ADN solamente requiere la presencia de ITR que flanquean la región codificante de genes de interés, los amplicones de PCR mutados amplificados por PCR pueden volver a introducirse directamente y volver a transponerse en células hospedadoras de vertebrados nuevas para expresión y exploración con respecto a propiedades mejoradas y/o mutantes de afinidad madurada.

Sumados juntos, los métodos desvelados en el presente documento, para utilizar los TE para la modificación genética estable de células hospedadoras de vertebrados con construcciones transponibles y/o bibliotecas de ADN

transponible diversas que codifican proteínas, incluyendo anticuerpos y fragmentos de los mismos, ofrece una eficacia, flexibilidad, utilidad y velocidad sin precedentes para el descubrimiento y optimización de dichas proteínas para fenotipos funcionales o de unión deseados óptimos.

5 Ejemplos:

Ejemplo 1: Clonación del vector de expresión de cadena ligera transponible para cadenas ligeras kappa de anticuerpo humano compatibles con la enzima transposasa PiggyBac.

10 Puede generarse un vector de expresión transponible para cadenas ligeras kappa humanas clonando las ITR del sistema de transposón PiggyBac cadena arriba y cadena abajo de un casete de expresión de cadena ligera kappa de inmunoglobulina humana.

Para esto, como una primera etapa, las secuencias mínimas para las ITR cadena abajo y cadena arriba del

15 transposón PiggyBac pueden derivar de pXLBacII (publicado en el documento US 7.105.343 y pueden sintetizarse de forma génica los sitios de enzimas de restricción flanqueantes para clonación en el vector de expresión de mamíferos pIRES-EGFP (PT3157-5, número de orden 6064-1, Invitrogen, Carlsbad, CA, Estados Unidos.)

La secuencia de ITR de PiggyBac cadena arriba con la repetición 5' terminal tiene que sintetizarse de forma génica

20 con secuencia de enzimas de restricción MunI flanqueante (en negrita y subrayada), compatible con un sitio de enzima de restricción MunI único en pIRES-EGFP, y cuatro nucleótidos aleatorios adicionales (en minúscula) que permiten la digestión por enzimas apropiada. Esta secuencia es la siguiente:

Sec-ID1: 25

Los sitios de enzimas de restricción MunI en cada extremo están subrayados y en negrita, las adiciones de nucleótidos aleatorios en los extremos están en minúscula.

30 La secuencia de ITR PiggyBac cadena abajo con la repetición 3' terminal tiene que sintetizarse de forma génica con una secuencia de enzima de restricción XhoI flanqueante (en negrita y subrayada) compatible con un sitio de enzima de restricción XhoI único en pIRES-EGFP, y cuatro nucleótidos aleatorios adicionales (en minúscula) permitiendo la digestión con enzimas de restricción apropiada. Esta secuencia es la siguiente:

35 Sec-1D2:

40 Tras la digestión con enzimas de restricción MunI de la Sec-IDI de síntesis génica, el fragmento de ADN puede ligarse en pIRES-EGFP linealizado con MunI, generando pIRES-EGFP-TR1 de acuerdo con métodos convencionales, conocidos en la técnica. La orientación apropiada del inserto puede verificarse por digestión con enzima de restricción de diagnóstico y/o mediante secuenciación de ADN de la construcción clonada (Figura 5a).

45 En una siguiente etapa el fragmento de ADN digerido con XhoI y de síntesis génica Sec-ID2, puede ligarse en pIRES-EGFP-T1 linealizado por XhoI (Figura 5a) por métodos convencionales conocidos en la técnica para generar pIRES-EGFP-T1T2, que contiene ITR PiggyBac tanto cadena arriba como cadena abajo del casete de expresión IRES-EGFP (Figura 5b). La orientación apropiada del inserto puede verificarse por digestión con enzimas de restricción de diagnóstico, y/o mediante secuenciación de ADN de la construcción clonada (Figura 5b).

Para la clonación de una cadena ligera kappa de inmunoglobulina humana en el vector pIRES-EGFP-T1T2, puede sintetizarse la cadena ligera kappa Ig humana del anticuerpo específico anti-TNF-alfa humano D2E7, que puede recuperarse de la solicitud de Patente Europea EP 1 285 930.

5 La región V de D2E7 fusionada en fase con una secuencia líder Vk1-27 (entrada de GenBank: X63398.1), que es el miembro de la familia de V-kappa del gen de línea germinal más cercano de D2E7, y con la región constante kappa humana (entrada de Genbank: J00241) tienen la siguiente secuencia de nucleótidos:

Sec-ID3: 10

Esta se traduce en la siguiente secuencia de aminoácidos: 15 Sec-ID4

El fragmento de ADN Sec-ID3 que codifica la cadena ligera kappa de Ig D2E7 de Sec-ID4 puede sintetizarse de

20 forma génica y ligarse directamente por ligamiento de extremos romos en el sitio de enzima de restricción EcoRV único (que también corta en extremos romos), por métodos conocidos en la técnica, dando como resultado la construcción pIRES-EGFP-T1T2-IgL (Figura 5b).

Sec-ID3 se ha obtenido por ingeniería genética para contener un sitio de enzima de restricción Eco47III único entre

25 las regiones codificantes de V-kappa y C-kappa (destacadas en negrita y subrayadas), lo que permite el reemplazo de regiones V-kappa en esta construcción frente a otras regiones V-kappa o bibliotecas de V-kappa, usando una enzima de restricción única cadena arriba de la región codificante de V-kappa en la construcción, junto con Eco47III. La orientación apropiada del inserto de cadena ligera kappa puede verificarse por digestión con enzimas de restricción de diagnóstico, y/o mediante secuenciación de ADN de la construcción clonada (Figura 5b).

30 La secuencia para el vector de cadena ligera kappa de anticuerpo humano transponible pIRES-EGFP-T1T2-IgL se proporciona en la secuencia Sec-ID5:

Sec-ID5: 35

Ejemplo 2: Clonación de un vector de expresión de cadena pesada transponible para cadenas pesadas de anticuerpo gamma1 humano:

5 Para clonar un vector de cadena pesada transponible, simplemente es necesario cambiar la ORF de pIRES-EGFPT1T2-IgL con una región codificante de cadena pesada de IgG1 completamente humana.

Para el reemplazo de la cadena ligera kappa humana en el vector pIRES-EGFP-T1T2-IGL por una cadena pesada

10 de inmunoglobulina gamma-1 humana, la región VH del anticuerpo D2E7, que es específica para TNF-alfa humano (véase: documento EP 1 285 930 A2) puede sintetizarse y fusionarse en fase con la secuencia líder de un miembro de la familia de región VH3 de línea germinal cercano y además fusionarse en fase con la región codificante de una región constante gamma1 humana (GenBank: J00228) que incluye los exones transmembrana (GenBank: X52847). Para poder reemplazar la cadena ligera kappa Ig humana de pIRES-EGFP-T1T2 IgL es necesario que haya sitios de

15 enzimas de restricción ClaI y NotI únicos en los extremos 5' y 3' de la secuencia (subrayado), respectivamente, incluyendo cuatro nucleótidos que flanquean los sitios de enzimas de restricción (destacados en minúscula en los extremos de la secuencia), permitiendo la digestión con enzimas de restricción apropiada del fragmento de ADN de síntesis génica y ligamiento en la cadena principal de pIRES-EGFP-T1T2 IgL linealizado por ClaI-NotI, de acuerdo con métodos convencionales. La secuencia que es necesario sintetizar por genes es la siguiente secuencia:

20 Sec-ID6:

Sec-ID6:

Desde el codón de inicio en la posición 11 de Sec-ID6, esta secuencia de nucleótidos se traduce en la cadena pesada de IgG1 humana del clon específico anti-TNF-alfa D2E7 (véase: documento EP 1 285 930 A2), pero incluyendo los exones transmembrana gamma1 humanos M1 y M2. La traducción de la proteína se proporciona en SEC-ID7 a continuación.

Sec-ID7:

El fragmento de ADN Sec-ID6 que codifica la cadena pesada de Ig gamma-1 de D2E7 puede después someterse a doble digestión por enzimas de restricción ClaI y NotI y ligarse direccionalmente en pIRES-EGFP-T1T2 IgL linealizado por ClaI y NotI, dando como resultado la construcción pIRES-EGFP-T1T2-IgH (Figura 6).

15 Sec-ID6 también se ha modificado por ingeniería genética para contener un sitio de enzima de restricción Eco47III único entre las regiones codificantes variable pesada V y constante C-gamma1 (destacadas en negrita y subrayadas), lo que permite el reemplazo de regiones V-pesadas en esta construcción frente a otras regiones Vpesadas o bibliotecas de V-pesada, usando una enzima de restricción única cadena arriba de la región codificante

20 de V-pesada en la construcción, junto con Eco47III. El ligamiento correcto del inserto puede verificarse por digestión con enzimas de restricción de diagnóstico y/o secuenciación de ADN de la construcción clonada (Figura 6).

La secuencia para el vector de cadena pesada de anticuerpo gamma-1 humano transponible pIRES-EGFP-T1T2-IgH se proporciona en la secuencia Sec-ID8.

Sec-ID8:

Los ejemplos 1 y 2 proporcionan los vectores de expresión transponibles humanos básicos para cadenas ligera kappa de anticuerpo humano y ligera gamma-1 humana y por lo tanto para IgG1 humano unido a membrana, de longitud completa.

Ejemplo 3: Generación de bibliotecas de ADN transponible que codifican bibliotecas de cadena pesada y ligera de anticuerpo humano.

Para generar bibliotecas de ADN transponible diversas que codifican bibliotecas de cadena pesada y ligera de

5 anticuerpo humano, solamente es necesario reemplazar las regiones VL y VH de vectores transponibles pIRESEGFP-T1T2-IgL del Ejemplo 2 y pIRES-EGFP-T1T2-igH del Ejemplo 3, respectivamente. Esto puede realizarse por síntesis génica de regiones codificantes de VH y VL humanas flanqueadas por sitios de enzimas de restricción ClaI y Eco47III, y permitiendo variaciones de nucleótidos en ciertas posiciones de HCDR y LCDR, como se proporciona en Sec-ID9, que codifica bibliotecas para dominios de cadena pesada variable, y Sec-ID-10, que codifica bibliotecas

10 para dominios de cadena ligera variable, debido a que ambos de ellos contienen secuencias N en la HCDR3 (negrita) y LCDR3 (negrita), respectivamente. Las secuencias tanto Sec-ID9 como Sec-ID10 están flanqueadas por enzimas de restricción ClaI y Eco47III (subrayadas), respectivamente, incluyendo cuatro nucleótidos que flanquean los sitios de enzimas de restricción (destacados en minúscula en los extremos de la secuencia), permitiendo la digestión con enzimas de restricción apropiada de los fragmentos de ADN sintetizados por genes y ligamiento

15 dirigido en cadenas principales de pIRES-EGFP-T1T2-IgH y pIRES-EGFP-T1T2-IgL linealizadas por ClaI-Eco47III, respectivamente.

Sec-ID9:

Sec-ID10:

25 De esta manera, pueden generarse diversas bibliotecas de ADN transponible, que codifican cadenas pesadas y ligeras de anticuerpo en vectores separados, en los que la expresión de las cadenas de anticuerpo está unida de forma transcripcional y por lo tanto operativa a una proteína marcadora verde fluorescente

30 Ejemplo 4: Clonación de un vector de expresión de transposasa PiggyBac

La ORF de la enzima transposasa PiggyBac funcional puede recuperarse de la Patente de Estados Unidos US

7.105.343 B1 y se proporciona en Sec-ID11. 35

Sec-ID11:

Esta secuencia se traduce en la secuencia de aminoácidos Sec-ID12. Sec-ID12:

Para generar un vector de expresión de células de vertebrados para la enzima transposasa PiggyBac, esta ORF puede sintetizarse de forma génica y clonarse como un ADN de extremos romos en el sitio de enzima de restricción 15 de corte romo, único, EcoRV en el vector de expresión de células de vertebrados convencional pCDNA3.1-hygro(+)

(número de catálogo V870-20, Invitrogen, Carlsbad, CA, Estados Unidos), por métodos conocidos en la técnica. El ligamiento correcto de la ORF PiggyBac, en relación con el promotor pCDNA3 puede verificarse por digestión con enzimas de restricción de diagnóstico y/o por secuenciación de ADN de la construcción de expresión de PiggyBac clonada pCDNA3.1-hygro(+)-PB (Figura 7).

5 La secuencia de la construcción de expresión de PiggyBac pCDNA3.1-hygro(+)-PB se proporciona en SEC-ID13, a continuación:

Sec-ID13: 10

Con la compleción del Ejemplo 4, todas las construcciones genéticas están disponibles para realizar el método desvelado en el presente documento.

5 Ejemplo 5: Clonación del vector de expresión de cadena ligera transponible para cadenas ligeras kappa de anticuerpo humano compatibles con la enzima transposasa Sleeping Beauty.

Para transponer vectores de expresión de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina humana contenidos en un

10 vector transponible independientemente en células hospedadoras, puede construirse una construcción de cadena ligera de inmunoglobulina transponible con diferentes secuencias de repeticiones terminales invertidas (ITR) que se reconocen por la transposasa Sleeping Beauty.

Para esto, puede usarse el vector de expresión de cadena ligera kappa de Ig humana pIRES-EGFP-T1T2-IgL (Sec

15 ID5) del ejemplo 1 para reemplazar las ITR 5' y 3' del sistema de transposón PiggyBac, contenido en este vector, con las ITR 5' y 3' del sistema de transposón Sleeping Beauty. Las secuencias para la ITR 5' e ITR 3' de Sleeping Beauty, reconocidas y funcionales con la transposasa Sleeping Beauty, pueden recuperarse del documento de Patente US7160682B1.

20 La secuencia de ITR de Sleeping Beauty cadena arriba con la repetición 5' terminal tiene que sintetizarse de forma génica con secuencias de enzimas de restricción MunI flanqueantes, que permiten el reemplazo de la ITR 5' PiggyBac flanqueada por MunI en la construcción pIRES-EGFP-T1T2-IgL (Sec-ID-5) del ejemplo 1 por la secuencia de ITR 5' de Sleeping Beauty. Esta secuencia es la siguiente (los sitios de la enzima de restricción MunI están destacados en negrita y 4 nucleótidos aleatorios flanqueantes adicionales, que permiten la digestión de enzima de

25 restricción apropiada del fragmento sintetizado de forma génica, se indican en minúscula):

Sec-ID14:

La secuencia de ITR de Sleeping Beauty cadena abajo con la repetición 3' terminal (también publicada en el documento US7160682B1) tiene que sintetizarse de forma génica con las secuencias de la enzima de restricción XhoI flanqueantes, permitiendo el reemplazo de la ITR 3' de PiggyBac flanqueada por XhoI en la construcción pIRES-EGFP-T1T2-IgL (Sec-ID-5) del ejemplo 1 por la secuencia de ITR 3' de Sleeping Beauty. Esta secuencia es

5 la siguiente (Los sitios de enzimas de restricción XhoI están destacados en negrita y 4 nucleótidos aleatorios flanqueantes adicionales, que permiten la digestión con enzimas de restricción apropiada del fragmento sintetizado de forma génica, se indican en minúscula):

Sec-ID15: 10

En una primera etapa, la ITR 5’ de PiggyBac flanqueada por MunI de la construcción pIRES-EGFP-T1T2-IgL (SecID-5) tiene que reemplazarse por la ITR 5’ de Sleeping Beauty digiriendo pIRES-EGFP-T1T2-IgL (Sec-ID-5) con

15 enzima de restricción MunI y ligando el fragmento sintetizado de forma génica digerido con MunI de Sec-ID-14 con la cadena principal del vector linealizado por MunI de pIRES-EGFP-T1T2-IgL (Sec-ID-5). El reemplazo apropiado y la orientación correcta de la ITR 5’ de Sleeping Beauty puede comprobarse por digestiones con enzima de restricción de diagnóstico y/o secuenciación de ADN. El plásmido resultante se denomina pIRES-EGFP-sbT1-PBT2-IgL (Figura 8).

20 En una segunda etapa, la ITR 3’ de PiggyBac flanqueada por XhoI de la construcción aún contenida en pIRESEGFP-sbT1-PBT2-IgL tiene que reemplazarse por la ITR 3’ de Sleeping Beauty digiriendo pIRES-EGFP-sbT1-PBT2-IgL con enzimas de restricción XhoI y ligando el fragmento de síntesis génica digerido con XhoI de Sec-ID-15 en la cadena principal del vector linealizado por XhoI de pIRES-EGFP-sbT1-PBT2-IgL. El reemplazo apropiado y la

25 orientación correcta de ITR 3’ de Sleeping Beauty puede comprobarse por digestiones con enzimas de restricción de diagnóstico y/o secuenciación de ADN. El plásmido resultante se denomina pIRES-EGFP-sbT1T2-IgL (Figura 8).

La secuencia completa del vector de expresión de LC kappa de Ig humano pIRES-EGFP-sbT1T2-IgL transponible por la transposasa Sleeping Beauty se proporciona en Sec-ID-16: 30 Sec-ID16:

Ejemplo 6: Clonación de un vector de expresión de Sleeping Beauty

5 La fase abierta de lectura (ORF) de la enzima transposasa Sleeping Beauty también puede encontrarse en la referencia de Patente US7160682B 1/US2003154500A1. Esta secuencia se proporciona en la Sec-ID17, a continuación:

10 Sec-ID17:

Esta secuencia se traduce en la siguiente secuencia de aminoácidos: Sec-ID18:

Para generar un vector de expresión de células de vertebrados para la enzima transposasa Sleeping Beauty, esta

10 ORF puede sintetizarse de forma génica y clonarse como un ADN de extremos romos en el sitio de enzima de restricción de corte romo, único, EcoRV en el vector de expresión de células de vertebrados convencional pCDNA3.1-hygro(+) (número de catálogo V870-20, Invitrogen, Carlsbad, CA, Estados Unidos), por técnicas conocidas en este campo. El ligamiento correcto de la ORF de Sleeping Beauty, en relación con el promotor de pCDNA3 puede verificarse por digestión con enzimas de restricción de diagnóstico, y/o por secuenciación de ADN

15 de la construcción de expresión de Sleeping Beauty clonada pCDNA3.1-hygro(+)-SB (Figura 9).

La secuencia de la construcción de expresión de Sleeping Beauty pCDNA3.1-hygro(+)-SB se proporciona en Sec ID19, a continuación:

Sec-ID19:

Ejemplo 7: Generación de una biblioteca de expresión de cadena ligera kappa Ig humana transponible Sleeping Beauty

Para generar una biblioteca de ADN transponible de Sleeping Beauty diversa que codifica bibliotecas de cadena

5 ligera de anticuerpo humano, es necesario reemplazar la región VL del vector transponible de Sleeping Beauty pIRES-EGFP-sbT1T2-IgL del Ejemplo 5 con un repertorio de genes VL diverso. Esto puede realizarse sintetizando de forma génica regiones codificantes de VL humana flanqueadas por sitios de enzimas de restricción ClaI y Eco47III, y permitiendo variaciones de nucleótidos en ciertas posiciones de HCDR y LCDR, como ya se ha proporcionado en Sec-ID-10 anteriormente. La secuencia Sec-ID10 está flanqueada por enzimas de restricción ClaI

10 y Eco47III que permiten el ligamiento dirigido en pIRES-EGFP-sbT1T2-IgL linealizado con ClaI-Eco47III. De esta manera puede generarse una biblioteca de ADN transponible de Sleeping Beauty que codifica diversas cadenas ligeras de anticuerpo humano.

De esta manera, pueden generarse bibliotecas de ADN transponible diversas, que codifican cadenas pesadas y

15 ligeras de anticuerpo en vectores separados, en las que la expresión de las cadenas de anticuerpo está unida de forma transcripcional y por lo tanto operativa a una proteína marcadora verde fluorescente.

Habiendo generado vectores de expresión de cadena IgH humana transponible de PiggyBac (Ejemplo 2) y vectores de expresión de biblioteca de cadena IgH humana (Ejemplo 3), así como vectores de expresión transponibles de 20 Sleeping Beauty para cadenas IgL humanas (Ejemplo 5) y bibliotecas de cadenas IgL humanas (Ejemplo 7), y habiendo además proporcionado los vectores de expresión de vertebrados las transposasas PiggyBac y Sleeping Beauty (Ejemplos 4 y 6, respectivamente), se permite la realización de la invención por transposición independiente de vectores de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina en células hospedadoras usando dos sistemas de transposición separados, si se siguen métodos de biología celular y biología molecular convencionales, que incluyen 25 el cultivo de células hospedadoras de vertebrados o mamíferos in vitro, su transfección con las construcciones anteriormente mencionadas por métodos conocidos en la técnica, de modo que se produzca transposición estable de las construcciones y se efectúe expresión de los polipéptidos de interés de esas construcciones, seguido de técnicas de exploración y separación de células convencionales con respecto a unión o función deseadas de las proteínas expresadas, y, en último lugar, seguido de la identificación de las secuencias codificantes de

30 construcciones transpuestas contenidas en el células seleccionadas por métodos genómicos o de RT-PCR convencionales en combinación con secuenciación de ADN convencional o de siguiente generación.

LISTADO DE SECUENCIAS

35 <110> Grawunder, Ulf

<120> Identificación mediada por transposición de proteínas de unión específica o funcionales

<130> ND 40268 40

<160> 19

<170> PatentIn versión 3.3

45 <210> 1

<211> 327

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

50 <220>

<223> Secuencia de ITR de PiggyBac cadena arriba con secuencias de reconocimiento de enzima de restricción MunI flanqueantes y 4 nucleótidos en los extremos 5’ y 3’ para facilitar la digestión con enzima de restricción

<400> 1 55

<210> 2

<211> 264

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 5

<220>

<223> Secuencia de ITR de PiggyBac cadena abajo con secuencias de reconocimiento de enzima de restricción XhoI flanqueante y 4 nucleótidos en los extremos 5’ y 3’ para facilitar la digestión con enzima de restricción

10 <400> 2

<210> 3 15 <211> 711

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

20 <223> Región codificante de cadena ligera kappa de Ig humana de longitud de completa, incluyendo región codificante de VL de D2E7 y región codificante de cadena ligera kappa constante humana

<400> 3

<210> 4

<211> 236

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia proteica de cadena ligera kappa de Ig humana de longitud completa, codificada por la región codificante de VL de D2E7 y región codificante de cadena ligera kappa constante humana.

<400> 4

<210> 5

<211> 6436

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

5

<220>

<223> pIRES-EGFP-T1T2-IgL

<400> 5

10

<210> 6

<211> 1642 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Región codificante de cadena pesada de Ig gamma1 humana de longitud completa, que incluye región

10 codificante de VH de D2E7 y región codificante de cadena pesada gamma1 constante humana con región codificante transmembrana de Ig gamma1 humana, flanqueada por sitios de enzimas de restricción ClaI y NotI y 4 nucleótidos en los extremos 5’ y 3’ para facilitar la digestión con enzimas de restricción.

<400> 6

<210> 7

<211> 539 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia proteica de cadena pesada de Ig gamma1 humana de longitud completa unida a membrana, 10 codificada por la región codificante de VH de D2E7 y región codificante de cadena pesada gamma1 constante

humana con región codificante transmembrana de Ig gamma1 humana

<400> 7

<210> 8

<211> 7341 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia para el vector de cadena pesada de anticuerpo gamma-1 humano transponible pIRES-EGFP10 T1T2-IgH

<400> 8

<210> 9

<211> 437 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Biblioteca de ADN que codifica dominios de cadena pesada variable que contiene secuencias N en la

10 HCDR3 y flanqueados por sitios de restricción ClaI y Eco47III con 4 nucleótidos adicionales en los extremos 5’ y 3’ para facilitar la digestión con enzimas de restricción.

<220>

<221> misc_feature 15 <222> (362)..(385)

<223> N = comodín, el nucleótido puede ser cualquiera de los cuatro nucleótidos que aparecen en el ADN

<400> 9

<210> 10

<211> 395

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Biblioteca de ADN que codifica dominios de cadena ligera variable que contienen secuencias N en la LCDR3 y flanqueados por sitios de restricción ClaI y Eco47III, con 4 nucleótidos adicionales en los extremos 5’ y 3’ para facilitar la digestión con enzimas de restricción

<220>

<221> misc_feature

<222> (337)..(351)

<223> N = comodín, el nucleótido puede ser cualquiera de los cuatro nucleótidos que aparecen en el ADN 10

<400> 10

15 <210> 11

<211> 1784

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

20 <220>

<223> ORF de enzima transposasa PiggyBac funcional

<400> 11

<210> 12

<211> 593

<212> PRT

<213> Secuencia artificial 5

<220>

<223> Secuencia proteica de enzima transposasa PiggyBac

<400> 12 10

<210> 13

<211> 7385 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de la construcción de expresión de PiggyBac pCDNA3.1-hygro(+)-PB 10

<400> 13

<210> 14

<211> 246 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de ITR de Sleeping Beauty cadena arriba con secuencias de reconocimiento de la enzima de

10 restricción MunI flanqueantes y 4 nucleótidos en los extremos 5’ y 3’ para facilitar la digestión con enzimas de restricción

<400> 14

<210> 15

<211> 248

<212> ADN 20 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de ITR de Sleeping Beauty cadena abajo con secuencias de reconocimiento de la enzima de

restricción XhoI flanqueantes y 4 nucleótidos en los extremos 5’ y 3’ para facilitar la digestión con enzimas de 25 restricción

<400> 15

<210> 16

<211> 6339

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 35

<220>

<223> Secuencia del vector de expresión de LC kappa Ig humana de pIRES-EGFP-sbT1T2-IgL

<400> 16 40

<210> 17

<211> 1023 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> fase abierta de lectura (ORF) de la enzima transposasa Sleeping Beauty 10

<400> 17

15 <210> 18

<211> 340

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

20 <220>

<223> Secuencia proteica de la enzima transposasa Sleeping Beauty

<400> 18

<210> 19

<211> 6624 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de la construcción de expresión de Sleeping Beauty pCDNA3.1-hygro(+)-SB 10

<400> 19

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para identificar un polipéptido que tiene una especificidad de unión o funcionalidad deseada, que comprende:

(i)

generar una colección diversa de polinucleótidos, preferentemente vectores plasmídicos o amplicones de PCR, de ADN bicatenario, que codifican polipéptidos que tienen diferentes especificidades de unión o funcionalidades, en donde dichos polinucleótidos comprenden una secuencia que codifica un polipéptido dispuesto entre una primera y una segunda secuencias de repeticiones terminales invertidas que son reconocidas por al menos una enzima transposasa y son funcionales con ella;

(ii)

introducir la colección diversa de polinucleótidos de (i) en las células hospedadoras;

(iii) expresar en la células hospedadoras al menos una enzima transposasa funcional con dichas secuencias de repeticiones terminales invertidas, de modo que dicha colección diversa de polinucleótidos se integre en el genoma de la célula hospedadora para proporcionar una población de células hospedadoras que exprese dicha colección diversa de polinucleótidos que codifican polipéptidos que presentan diferentes especificidades de unión y funcionalidades;

(iv)

explorar dichas células hospedadoras para identificar una célula hospedadora que expresa un polipéptido con una especificidad de unión o funcionalidad deseada; y

(v)

aislar la secuencia polinucleotídica que codifica el polipéptido de dicha célula hospedadora.
2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dichos polinucleótidos comprenden

a) una secuencia de unión a ligando de un receptor o una secuencia de unión a diana de una molécula de unión, b) una secuencia de unión a antígeno de un anticuerpo, c) una secuencia que codifica una región VH o VL de un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, d) una secuencia que codifica una región VH de un anticuerpo y una región VL de un anticuerpo, e) una secuencia que codifica una cadena pesada o una cadena ligera de inmunoglobulina de longitud completa,

o un fragmento de unión a antígeno de la misma, y/o f) una secuencia que codifica un dominio Fv monocatenario o uno Fab.
3.

Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones mencionadas, en el que la generación de dicha colección diversa de polinucleótidos comprende someter secuencias génicas de región V a PCR en condiciones de mutación.
4.

Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones mencionadas, en el que la etapa (ii) comprende introducir en dichas células hospedadoras polinucleótidos que comprenden secuencias que codifican

a) regiones VH o VL de inmunoglobulina, o fragmentos de unión a antígeno de las mismas, y en el que dichas secuencias de región VH y VL se codifican en vectores separados y/o b) cadenas pesadas o ligeras de inmunoglobulina de longitud completa, o fragmentos de unión a antígeno de las mismas, en donde dichas secuencias de cadena pesada y ligera de longitud completa están en vectores separados, c) un vector que comprende secuencias que codifican cadenas VH y VL de anticuerpo. d) un vector que comprende secuencias que codifican una cadena pesada de inmunoglobulina de longitud completa y una cadena ligera de inmunoglobulina de longitud completa.
5.

Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones mencionadas, en el que dicha etapa de expresión

(iii) comprende introducir en dichas células hospedadoras un vector de expresión que codifica una enzima transposasa que reconoce y es funcional con dichas secuencias de repeticiones terminales invertidas, en donde dicha enzima transposasa se expresa preferentemente de forma transitoria en dicha célula hospedadora.
6. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones mencionadas, en el que dicha etapa de exploración

(iv) comprende separación de células activadas magnéticamente (MACS), separación de células activadas por fluorescencia (FACS), selección frente a moléculas inmovilizadas en una superficie sólida, selección con respecto a unión con moléculas asociadas a membrana celular incorporadas en una membrana de bicapa lipídica celular, natural o artificialmente reconstituida, o exploración de alto rendimiento de clones celulares individuales en formato multi-pocillo con respecto a un fenotipo funcional o de unión deseado.
7.

Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones mencionadas, en el que dicha etapa (v) de aislar la secuencia polinucleotídica que codifica el polipéptido que tiene una especificidad de unión o funcionalidad deseada comprende amplificación genómica o por RT-PCR o secuenciación profunda de siguiente generación.
8.

Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones mencionadas, en el que

a) dichas secuencias de repeticiones terminales invertidas son del sistema de transposón PiggyBac o del sistema de transposón Sleeping Beauty y/o b) la etapa (iii) comprende introducir en dicha célula hospedadora un vector que comprende una secuencia que codifica una transposasa PiggyBac o transposasa Sleeping Beauty funcionales.
9.

Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones mencionadas, en el que dichas secuencias de repeticiones terminales invertidas se reconocen por y son funcionales con al menos una transposasa seleccionada del grupo que consiste en: PiggyBac, Sleeping Beauty, Frog Prince, Himar1, Passport, Minos, hAT, Tol1, Tol2, Ac/Ds, PIF, Harbinger, Harbinger3-DR y Hsmar1.
10.

Una biblioteca de moléculas polinucleotídicas que codifican polipéptidos que tienen diferentes especificidades de unión o funcionalidades, que comprende una pluralidad de moléculas polinucleotídicas, preferentemente plásmidos o amplicones de PCR de ADN bicatenario, en donde dichas moléculas polinucleotídicas comprenden una secuencia que codifica un polipéptido que tiene una especificidad de unión o funcionalidad dispuesta entre secuencias de repeticiones terminales invertidas que son reconocidas por al menos una enzima transposasa y son funcionales con ella.
11.

Una biblioteca de acuerdo con la reivindicación 10, en la que dichos polinucleótidos comprenden

a) al menos una secuencia que codifica una secuencia de unión a antígeno de un anticuerpo, b) una secuencia que codifica una región VH o VL de un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo, c) una secuencia que codifica una región VH de anticuerpo y una región VL de anticuerpo, d) una secuencia que codifica una cadena pesada o cadena ligera de inmunoglobulina de longitud completa, o un fragmento de unión a antígeno de la misma, e) una secuencia que codifica un dominio Fv monocatenario o uno Fab.
12.

Una biblioteca de acuerdo con las reivindicaciones 10-11, en la que dichos plásmidos o amplicones de PCR de ADN bicatenario comprenden además una secuencia que codifica una enzima transposasa que reconoce las secuencias de repeticiones terminales invertidas y es funcional con ellas.
13.

Un método para generar una biblioteca de polinucleótidos transponibles que codifican polipéptidos que tienen diferentes especificidades de unión o funcionalidad, que comprende generar una colección diversa de polinucleótidos que comprenden secuencias que codifican polipéptidos que tienen diferentes especificidades de unión o funcionalidades, en donde dichos polinucleótidos comprenden una secuencia que codifica un polipéptido que tiene una especificidad de unión o funcionalidad dispuesta entre secuencias de repeticiones terminales invertidas que son reconocidas por al menos una enzima transposasa y son funcionales con ella.
14.

Un vector que comprende una secuencia que codifica una región VH o VL de un anticuerpo, o parte de unión a antígeno del mismo, dispuesta entre secuencias de repeticiones terminales invertidas que son reconocidas por al menos una enzima transposasa y son funcionales con ella.
15.

Una célula hospedadora que comprende un vector de acuerdo con la reivindicación 14.
16.

Un método para generar una población de células hospedadoras capaces de expresar polipéptidos que tienen diferentes especificidades de unión o funcionalidades, que comprende:

(i)

generar una colección diversa de polinucleótidos que comprenden secuencias que codifican polipéptidos que tienen diferentes especificidades de unión o funcionalidades, en donde dichos polinucleótidos comprenden una secuencia que codifica un polipéptido que tiene una especificidad de unión o funcionalidad dispuesta entre secuencias de repeticiones terminales invertidas que son reconocidas por al menos una enzima transposasa y son funcionales con ella; y

(ii)

introducir dicha colección diversa de polinucleótidos en células hospedadoras.
17.

El método o el vector de acuerdo con las reivindicaciones mencionadas 2-16, en el que el vector que comprende la secuencia VH comprende secuencias de repeticiones terminales invertidas que son reconocidas por una enzima transposasa diferente de las secuencias de repeticiones terminales invertidas en el vector que comprende la secuencia VL.
18.

Un método o una célula hospedadora de acuerdo con las reivindicaciones mencionadas 1-12, 15-17, en donde las células hospedadoras son células de vertebrados, preferentemente células de mamífero, más preferentemente células humanas o de roedores, aún más preferentemente células linfoides, aún más preferentemente linfocitos B, incluso más preferentemente linfocitos B progenitores o linfocitos B precursores, particularmente preferentemente linfocitos B progenitores o linfocitos B precursores transformados con virus de la leucemia murina de Abelson y linfocitos proB y preB humanos transformados con VEB sin inmunoglobulina, tempranos.