MX2015000885A

MX2015000885A - Identificacion mediada por trasposición de proteínas de unión o funcionales específicas.

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Publication number: MX2015000885A
Application number: MX2015000885A
Authority: MX
Inventors: Ulf Grawunder
Original assignee: Nbe Therapeutics Llc
Priority date: 2012-07-18
Filing date: 2013-07-18
Publication date: 2015-07-14
Also published as: DK2692865T3; SI2692865T1; MX338911B; SG11201500280XA; BR112015000836B1; CA2878982C; US10174309B2; EP2692865A1; ZA201500203B; WO2014013026A1; JP2015522286A; EP2692865B1; HK1209779A1; PT2692865E; IN2015DN01301A; NZ705074A; ES2528892T3; BR112015000836A2; US20150152406A1; AU2013291971B2

Abstract

El método descrito en la presente describe una tecnología novedosa que ofrece eficiencia no paralela, flexibilidad, utilidad y velocidad para el descubrimiento y optimización de polipéptidos que tienen especificidad y/o funcionalidad de unión deseadas, que incluye moléculas de unión al antígeno tales como anticuerpos y fragmentos de los mismos, para los fenotipos funcionales y/o de unión deseados. El método novedoso se basa en constructos de transposición y diversas bibliotecas de ADN donadas en vectores de transposición y su transfección en células huésped por expresión temporal concomitante de una enzima de transposasa funcional. Esto asegura una introducción eficiente y estable de los vectores de expresión basados en transposón en células huésped de vertebrado en una etapa, que pueden clasificarse entonces por un fenotipo funcional o de unión deseado de las proteínas expresadas, después de lo cual las secuencias de codificación relevantes para las proteínas expresadas, que incluyen anticuerpos y fragmentos de los mismos, pueden identificarse por técnicas de donación y secuenciación de ADN estándar.

Description

IDENTIFICACIÓN MEDIADA POR TRASPOSICIÓN DE PROTEÍNAS DE UNIÓN O FUNCIONALES ESPECÍFICAS ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Campo de la invención (a) Teenologías para la identificación de proteínas funcionales y de unión específicas El descubrimiento de proteínas diana específicas, incluyendo anticuerpos y fragmentos de los mismas, es de interés comercial significativo, debido a que la selección de proteínas funcionales o proteínas de unión altamente selectivas, incluyendo anticuerpos y fragmentos de los mismos, tiene un alto potencial para el desarrollo de nuevas entidades biológicas (NBE) con nuevas propiedades terapéuticas que se integran muy específicamente, o interfieren con procesos biológicos, y por lo tanto se predicen para expresar perfiles de efecto secundario menor que las nuevas entidades químicas (NCE) convencionales. En este sentido, particularmente el desarrollo de anticuerpos terapéuticos altamente de diana específico, y productos terapéuticos basados en anticuerpos, han preparado la manera para terapias completamente nuevas con eficacia mejorada. Como consecuencia, los anticuerpos monoclonales terapéuticos representan el segmento de crecimiento más rápido en el desarrollo de nuevos medicamentos durante la última década, y en la actualidad generan aproximadamente 50 billones de dólares americanos en ingresos globales, que representan una parte significativa del mercado global total de medicamentos farmacéuticos.

Por lo tanto, se encuentran en alta demanda las teenologías eficaces e innovadoras, que permitan el descubrimiento de proteínas terapéuticas altamente potentes, sino también bien toleradas, en particular productos terapéuticos basados en anticuerpos.

Para identificar una proteína con una funcionalidad deseada o una propiedad de unión específica, como es el caso de anticuerpos, se requiere generar, expresar funcionalmente y clasificar grandes colecciones diversas, o bibliotecas de proteínas, que incluyen anticuerpos y fragmentos de los mismos, para propiedades funcionales deseadas o especificidad de unión a diana. Se han desarrollado una cantidad de tecnologías durante últimos los veinte años, las cuales permiten la expresión de diversas bibliotecas de proteínas ya sea en células huésped, o en partículas virales y de fago y métodos para su clasificación de alto rendimiento y/o selección de una propiedad funcional deseada, o fenotipo de unión.

El estado del arte de las tecnologías estándar para lograr la identificación de aglutinantes o proteínas de diana específicas con propiedades funcionales deseadas, incluyen por ejemplo, expresión de fagos, expresión retroviral, expresión bacteriana, expresión en levaduras y diversas teenologías de expresión en células de mamífero, en combinación con unión (selección) en superficie sólida y/u otras técnicas de enriquecimiento. Todas estas tecnologías se abarcan por diversas patentes y solicitudes de patentes pendientes .

Mientras que los sistemas de expresión de fagos y procarióticos se han establecido y adoptado ampliamente en la industria biotecnológica y en la academia para la identificación de aglutinantes de diana específico, incluyendo fragmentos de anticuerpos (Hoogenboom, Nature Biotechnology 23, 1105-1116 (2995)), han sufrido de una variedad de limitaciones, incluyendo la capacidad de expresar versiones de longitud completa de proteínas más grandes, incluyendo anticuerpos de longitud completa, la carencia de modificación post-traducción, la carencia de un plegamiento apropiado por chaperonas en vertebrados, y en el caso de anticuerpos, una combinación de cadena pesada y ligera reforzada artificialmente. Por lo tanto, en caso del descubrimiento de anticuerpos por estos métodos, se requiere "someter a formato" la expresión de anticuerpos de longitud completa y en células de mamífero. Debido a las limitaciones mencionadas en lo anterior, esto resulta con frecuencia en anticuerpos con propiedades biofísicas desfavorables (por ejemplo, baja estabilidad, tendencia a agregarse, afinidad disminuida), limitando el potencial terapéutico y diagnóstico de tales proteínas. Esto, por otra parte, lleva a tasas de fracaso en el desarrollo de moléculas principales generadas por estos métodos y por otra parte, requiere de un esfuerzo significativo para corregir las responsabilidades biofísicas y moleculares en estas proteínas para el desarrollo de medicamentos adicionales corriente abajo.

Por lo tanto, las teenologías de descubrimiento de proteínas y anticuerpos se ha desarrollado utilizando células eucariotas inferiores (por ejemplo, levaduras) y más recientemente, también sistemas de expresión en células de mamífero para la identificación de proteínas con propiedades deseadas, cuando estas tecnologías permiten (i) expresar proteínas de longitud completa más grandes, incluyendo anticuerpos de longitud completa, (ii) modificación posttraducción mejor o normal, y (iii) en caso de los anticuerpos, aparear la cadena pesada-ligera apropiada (Beerli y Rader, mAbs 2, 365-378 (2010)). Esto en conjunto, selecciona proteínas con propiedades biofísicas favorables que tiene un mayor potencial en el desarrollo de medicamentos y uso terapéutico.

Aunque la expresión y clasificación de proteínas en células de vertebrados puede ser lo más deseable, debido a que las células de vertebrados (por ejemplo, células CHO de hámster, HEK-293 de humano, o DT40 de pollo) sin sistemas de expresión preferidos, estas teenologías también se asocian actualmente con un número de limitaciones, las cuales han dejado una lenta adopción de estas tecnologías en la academia y en la industria.

En primer lugar, las células de vertebrados no se modifican genéticamente de forma tan eficaz y estable, como por ejemplo, células procariotas o eucariotas inferiores como levaduras. Por lo tanto, sigue siendo un desafío generar bibliotecas de proteínas basadas en células de vertebrados lo suficientemente diversas (complejas), de las que puedan identificarse candidatos con propiedades deseadas o afinidades de unión mayores. En segundo lugar, para aislar eficazmente proteínas con propiedades deseadas, usualmente se requieren casos de estudio interactivos de enriquecimiento celular. La expresión en vertebrados ya sea por transfección transitoria de plásmidos (Higuchi et al J. Immunol. Methods 202, 193-204(1997)), o sistemas de expresión viral transitorios, como virus de sindbis o vaccinia (Beerli et al . PNAS 105, 14336-14341 (2008), y 002102885), no permiten diversos casos de estudio de selección celular requeridos para enriquecer eficazmente proteínas altamente específicas, y por lo tanto, estos métodos se restringen a la clasificación de bibliotecas pequeñas pre-enriquecidas de proteínas o requieren de ciclos tediosos de aislamiento de virus/re-infección celular.

Para lograr una expresión estable de proteínas de unión y anticuerpos en células de vertebrado, que permitan diversos casos de estudio de selecciones basadas en el acoplamiento de genotipo-fenotipo estable, se han desarrollado teenologías que utilizan recombinasas específicas (sistema de recombinasa flp/frt, Zhou et al . mAbs 5, 508-518 (2010)), o vectores retrovirales (W02009109368). Sin embargo, la recombinación flp/frt es un sistema de baja eficacia para la integración estable de genes en genomas de células huésped de vertebrados y por lo tanto, de nuevo, solamente aplicable a bibliotecas pequeñas, preseleccionadas, o la optimización de candidatos de proteínas o anticuerpos seleccionados.

En comparación con el sistema de recombinasa flp/frt, los vectores retrovirales permiten una modificación genética estable más eficaz de células huésped de vertebrados y la generación de bibliotecas celulares más complejas. Sin embargo, (i) se restringen solamente a líneas celulares permitidas seleccionadas, (ii) representan un riesgo de bioseguridad, cuando se utilizan células de humano, (iii) los vectores de expresión retroviral se someten a mutagénesis no deseada de las secuencias de biblioteca debido a una transcripción inversa de baja fidelidad, (iv) los vectores retrovirales no permiten la integración de casetes de expresión genómica con estructura de intrón/exón intacta, debido al empalme del genoma retroviral antes del empacado del vector en partículas retrovirales, (v) los retrovirus se someten a recombinación homologa incontrolable y desfavorable de secuencias de bibliotecas durante el empacado de los genomas virales, (vi) se someten a sileneiamiento retroviral, y (vii) requieren un procedimiento tedioso en dos etapas de transfección de empacado celular/infección de célula huésped. Todas estas limitaciones representan desafíos y limitaciones significativas, e introducen complejidades significativas para la utilidad de los procedimientos basados en vectores retrovirales en la generación de bibliotecas de células de vertebrado de alta calidad/alta complejidad para descubrimiento eficaz de proteínas diana específicas o anticuerpos.

Por lo tanto, existe claramente una necesidad de una teenología más eficaz, más controlable y sencilla que permita la generación de bibliotecas basadas en células de vertebrado de alta calidad y altamente complejas que expresen diversas bibliotecas de proteínas incluyendo anticuerpos y fragmentos de los mismos de los cuales pueden aislarse proteínas con función altamente específica y/o propiedades de unión y altas afinidades. (b) Transposasas/transposición: Los transposones, o elementos de transposición (TE), son elementos genéticos con la capacidad de integrarse de forma estable en genomas de células huésped, un proceso que se denomina transposición (Ivics et al . Mobile DNA 1, 25 (2010)) (incorporado en la presente para referencia en su totalidad). Los TE ya se postularon en los años 50 por Barbara McClintock en sus estudios genéticos con maíz, pero los primeros modelos funcionales para transposición han sido descritos para los TE bacterianos al final de los años 70 (Shapiro, PNAS 76, 1933-1937 (1979)) (incorporado en la presente para referencia en su totalidad).

Aunque es claro que los SE TE encuentran presentes en el genoma de todos los organismos, y la secuenciación genómica ha revelado que aproximadamente el 45 % del genoma humano deriva de transposones (Interna ional Human Genome Sequencing Consortium Nature 409 : 860-921 (2001)) (incorporado en la presente para referencia en su totalidad). Sin embargo, a diferencia de los invertebrados, donde se han identificado los TE funcionales (o autónomos) (Figura la), los seres humanos y la mayoría de los vertebrados superiores no contienen TE funcionales. Se ha planteado la hipótesis de que la presión selectiva evolutiva contra el potencial mutagénico de los TE llevó a su inactivación funcional hace millones de años durante su evolución.

Los TE autónomos comprenden ADN que codifica una enzima transposasa localizada entre dos secuencias de repetición terminal invertidas (ITR), que se reconocen por la enzima transposasa codificada entre las ITR y las cuales pueden catalizar la transposición del TE en cualquier secuencia de ADN de doble hebra (FIGURA la). Existen dos clases diferentes de transposones: la clase I, o retrotransposones, que se movilizan mediante un intermediario de ARN y un mecanismo de "copiar y pegar" (FIGURA 2b), y la clase II, o transposones de ADN, que se movilizan mediante la escisión-integración, o un mecanismo de "cortar y pegar" (FIGURA 2a) (Ivics et al . Nat. Methods b, 415-422(2009) (incorporado en la presente para referencia en su totalidad).

Los transposones bacterianos, de células eucariotas inferiores (por ejemplo, levaduras) y de invertebrados parecen ser en gran medida específicos de la especie, y no pueden usarse para la transposición eficaz de ADN en células de vertebrado. Solamente después de haber reconstruido artificialmente un primer transposón activo por reordenamiento de secuencias de TE inactivos de peces, que por lo tanto se denominó " Sleeping Beauty" (Ivics et al . Cell 91 , 501-510 (1997)) (incorporado en la presente para referencia en su totalidad), se hizo posible lograr con éxito la integración de ADN por transposición en células de vertebrado, incluyendo células de humano. Sleeping beauty es un transposón de ADN de clase II que pertenece a la familia de transposones Tcl/mariner (Ni et al . Briefings Funct. Genomics Proteomics 7, 444-453 (2008)) (incorporado en la presente para referencia en su totalidad). Mientras tanto, se han identificado transposones funcionales adicionales o reconstruido de diferentes especies, incluyendo Drosophila, rana e incluso genomas de humano, que todos han mostrado permitir la transposición de ADN vertebrados y también en genomas de células huésped de humano (FIGURA 3). Cada uno de estos transposones tiene ventajas y desventajas que se encuentran relacionadas con la eficacia de transposición, estabilidad de expresión, capacidad de carga genética, etc.

A la fecha, las teenologías mediadas por transposón para la expresión de diversas bibliotecas de proteínas, incluyendo anticuerpos y fragmentos de los mismos, en células huésped de vertebrado para el aislamiento de proteínas funcionales de unión, de diana específico, incluyendo anticuerpos y fragmentos de los mismos, no se han descrito en la técnica anterior.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN El método descrito en la presente describe una nueva tecnología que ofrece una eficacia, flexibilidad, utilidad y velocidad incomparables para el descubrimiento y optimización de polipéptidos que tienen una especificidad y/o funcionalidad de unión deseadas, incluyendo moléculas de unión al antígeno tales como anticuerpos y fragmentos de los mismos, para fenotipos funcionales y/o de unión deseados. El nuevo método se basa en constructos de transposición y diversas bibliotecas de ADN clonadas en vectores de transposición y su transfección en células huésped por expresión transitoria simultánea de una enzima transposasa funcional. Esto asegura una introducción eficaz y estable de los vectores de expresión basados en transposones en células huésped de vertebrado en una etapa, las cuales entonces pueden clasificarse para un fenotipo funcional o de unión deseado de las proteínas expresadas, después de lo cual las secuencias de codificación relevantes para las proteínas expresadas, incluyendo anticuerpos y fragmentos de los mismos, pueden identificarse por clonación estándar y téenicas de secuenciación de ADN.

En una modalidad, la invención se dirige ampliamente a un método para identificar un polipéptido que tiene una especificidad o funcionalidad de unión deseada, que comprende: (i) generar una colección diversa de polinucleótidos que codifican polipéptidos que tienen diferentes especificidades o funcionalidades de unión, en donde los polinucleótidos comprenden una secuencia de codificación para un polipéptido dispuesto entre una primera y segunda secuencias de repetición de terminal invertida que se reconocen por y son funcionales con al menos una enzima transposasa; (ii) introducir la colección diversa de polinucleótidos de (i) en células huésped; (iii) expresar al menos una enzima transposasa funcional con las secuencias de repetición de terminal invertida en las células huésped de modo que la colección diversa de polinucleótidos se integra en el genoma de la célula huésped para proporcionar una población de células huésped que expresan la colección diversa de polinucleótidos que codifican polipéptidos que tienen especificidades o funcionalidades de unión diferentes; (iv) clasificar las células huésped para identificar una célula huésped que expresa un polipéptido que tiene una especificidad o funcionalidad de unión deseada; y (v) aislar la secuencia de polinucleótidos que codifica el polipéptido de la célula huésped.

En una modalidad preferida, los polinucleótidos son moléculas de ADN. En una modalidad, la colección diversa de polinucleótidos comprende una secuencia de unión a ligando de un receptor o una secuencia de unión a diana de una molécula de unión. En una modalidad preferida, los polinucleótidos comprenden una secuencia que codifica una molécula de unión al antígeno, tal como un dominio VH o VL de anticuerpo, o un fragmento de antígeno de unión del mismo, o cadenas pesadas o ligeras de anticuerpo que son de longitud completa (es decir, que incluyen la región constante). En ciertas modalidades, los polinucleótidos pueden comprender una secuencia que codifica una región VH y VL, o ambas cadenas pesadas y ligeras de anticuerpo. En otra modalidad, los polinucleótidos comprenden una secuencia que codifica un dominio Fv o uno Fab de una sola cadena.

En una modalidad, la colección diversa de polinucleótidos se genera al someter a PCR secuencias del gen de región V bajo condiciones de mutagénesis, por ejemplo, por amplificación de PCR de repertorios de la región V de células B de vertebrado. En otra modalidad, la colección diversa de polinucleótidos se genera por síntesis de genes (por ejemplo, por selección aleatoria de secuencias que codifican un polipéptido que tiene especificidad y/o funcionalidad de unión conocidas). En una modalidad útil, la colección diversa de polinucleótidos comprende vectores de plásmidos. En otra modalidad útil, la colección diversa de polinucleótidos comprende amplicones por PCR de ADN de doble hebra. Los vectores de plásmidos pueden comprender una secuencia que codifica un gen marcador, tal como un marcador fluorescente, un marcador de superficie celular o un marcador seleccionable. La secuencia del gen marcador puede estar corriente arriba o corriente abajo de la secuencia que codifica el polipéptido que tiene especificidad o funcionalidad de unión, pero entre las secuencias de repetición de terminal invertida. Alternativamente, la secuencia del gen marcador puede encontrarse corriente abajo de la secuencia que codifica un polipéptido que tiene especificidad o funcionalidad de unión y separada por un sitio de entrada ribosomal interno.

En algunas modalidades, la colección diversa de polinucleótidos codifica una pluralidad de moléculas de unión al antígeno de un vertebrado, tal como un mamífero, por ejemplo, un humano.

En una modalidad, la etapa (ii) del método comprende introducir en polinucleótidos de células huésped que comprenden secuencias que codifican regiones VH o VL de inmunoglobulina, o fragmentos de unión al antígeno de las mismas, y en donde las secuencias de las regiones VH y VL se codifican en vectores separados. En otra modalidad, la etapa (ii) del método de la invención comprende introducir en polinucleótidos de células huésped que comprenden secuencias que codifican cadenas pesadas o ligeras de inmunoglobulina de longitud completa, o fragmentos de unión al antígeno de las mismas, en donde las secuencias de cadena pesada y ligera de longitud completa se encuentran en vectores separados. Los vectores pueden introducirse en las células huésped de modo simultáneo o secuencial. En otra modalidad, las secuencias que codifican las regiones VH y VL o cadenas pesadas y ligeras de longitud completa se introducen en las células huésped en el mismo vector. En el caso de que las secuencias VH y VL o las secuencias de cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo de longitud completa se introduzcan en las células huésped en diferentes vectores, es útil que se reconozcan por las secuencias de repetición de terminal invertida en cada vector y sean funcionales con diferentes enzimas transposasa.

Las células huésped son de preferencia células de vertebrado, y de preferencia células de mamífero, tales como células de roedor o de humano. Las células linfoides, por ejemplo, células B, son particularmente útiles. Las células B pueden ser células B progenitoras o células B precursoras tales como, por ejemplo, células B progenitoras o células B precursoras transformadas por el virus de Leucemia de Murino de Abelson y células pro-B y pre-B de humano transformadas con inmunoglobulina nula de VEB, temprana. Otras células huésped útiles incluyen líneas de células B tales como células Sp2/0, células NSO, células X63 y células Ag8653, o líneas celulares de mamíferos comunes tales como células CHO, células Per.C6, células BHK y células 293.

En una modalidad del método de la invención, la etapa de expresión (iii) comprende introducir en las células huésped un vector de expresión que codifica una enzima transposasa que reconoce y es funcional con al menos una secuencia de repetición de terminal invertida en los polinucleótidos. El vector que codifica la enzima transposasa puede introducirse en las células huésped simultáneamente con o antes de o después de la colección diversa de polinucleótidos. En una modalidad, la enzima transposasa se expresa transitoriamente en la célula huésped. Alternativamente, la etapa de expresión (iii) puede comprender inducir un sistema de expresión inducible que se encuentra integrado de forma estable en el genoma de la célula huésped, tal como, por ejemplo, un sistema inducible por tetracielina o inducible por tamoxifeno. En una modalidad preferida, la etapa (iii) comprende expresar en la célula o células huésped un vector que comprende una transposasa funcional Sleeping Beauty o una transposasa funcional PiggyBac. En una modalidad útil, la etapa (iii) comprende expresar en la célula huésped un vector que comprende la SEQ ID N°: 11. En otra modalidad útil, el vector codifica la SEQ ID N°: 12, o una secuencia con al menos 95% de homología de secuencia de aminoácidos y que tiene la misma o similar especificidad de secuencia de repetición de terminal invertida.

En una modalidad útil, la etapa (iii) comprende expresar en la célula huésped un vector que comprende SEQ ID N°: 18 o una secuencia con al menos 95% de homología de secuencia de aminoácidos y tiene la misma especificidad de secuencia de repetición de terminal invertida similar.

En una modalidad del método de la invención, la etapa de exploración (iv) comprende clasificación celular magnética activada (MACS), clasificación celular activada por fluorescencia (FACS), selección contra moléculas inmovilizadas en una selección de superficie sólida, selección por la unión a moléculas asociadas a la membrana celular incorporadas en una membrana celular de bicapa lipídica reconstituida natural o artificialmente artificial, o clasificación de alto rendimiento de clones de células individuales en un formato de diversos pozos para un fenotipo funcional o de unión deseada. En una modalidad, la etapa de clasificación (iv) comprende clasificar para identificar polipéptidos que tienen una especificidad de funcionalidad o de diana de unión deseadas. En una modalidad preferida, la etapa de clasificación (iv) comprende clasificar para identificar moléculas de unión al antígeno que tienen una especificidad de unión deseada. En una modalidad útil, la etapa de clasificación además comprende clasificar para identificar moléculas de unión al antígeno que tienen una o más propiedades funcionales deseadas. La etapa de clasificación (iv) puede comprender diversos ciclos de enriquecimiento celular con expansión de células huésped entre ciclos de enriquecimiento de células individuales.

En una modalidad del método de la invención, la etapa (v) de aislar la secuencia de polinucleótidos que codifica el polipéptido que tiene una especificidad o funcionalidad de unión deseada comprende amplificación genómica o por RT-PCR o secuenciación profunda de siguiente generación. En una modalidad útil, la secuencia de polinucleótidos aislada en la etapa (v) se somete a optimización de afinidad. Esto puede hacerse al someter la secuencia de polinucleótidos aislada a PCR o RT-PCR en condiciones de mutagénesis. En otra modalidad útil, la secuencia de mutagénesis se somete después a las etapas (i)- (v) del método de la invención. En una modalidad preferida, la secuencia de polinucleótidos obtenida en (v) comprende una secuencia que codifica una región VH o VL de un anticuerpo, o un fragmento de unión al antígeno del mismo, y en donde la optimización de anticuerpo comprende introducir una o más mutaciones en una región de determinación de complementariedad o región marco conservada de la VH o VL.

En una modalidad útil, las secuencias de repetición de terminal invertida son del sistema de transposón PiggyBac y se reconocen por y son funcionales con la transposasa PiggyBac. En una modalidad, la secuencia que codifica la secuencia de repetición de terminal invertida PiggyBac corriente arriba comprende SEQ ID N°: 1. En otra modalidad, la secuencia que codifica la secuencia de repetición de terminal invertida PiggyBac corriente abajo comprende SEQ ID N°: 2.

En otra modalidad útil, las secuencias de repetición de terminal invertida son del sistema de transposón Sleeping Beauty y se reconocen por y son funcionales con la transposasa Sleeping Beauty. En una modalidad, la secuencia que codifica la secuencia de repetición de terminal invertida Sleeping Beauty corriente arriba comprende SEQ ID N°: 14. En otra modalidad, la secuencia que codifica la secuencia de repetición de terminal invertida Sleeping Beauty corriente abajo comprende SEQ ID N°: 15.

En una modalidad de la invención, los polinucleótidos comprenden secuencias de la región VH o VL que codifican una secuencia derivada de un anticuerpo anti-TNF alfa humano. En una modalidad, el anticuerpo anti-TNF alfa humano es D2E7.

En una modalidad útil, la etapa (iii) comprende introducir en la célula huésped un vector que comprende una secuencia que codifica una transposasa PiggyBac funcional. En una modalidad, el vector comprende SEQ ID N°: 11. En otra modalidad, el vector codifica SEQ ID N°: 12, o una secuencia con al menos 95% de homología de secuencia de aminoácidos y que tiene la misma o similar especificidad de secuencia de repetición de terminal invertida.

En otra modalidad útil, la etapa (iii) comprende expresar en la célula huésped un vector que comprende SEQ ID N° : 17. En otra modalidad preferida, el vector que codifica SEQ ID NO:18, o una secuencia con al menos 95% de homología de secuencia de aminoácidos y tiene la misma o similar especificidad de secuencia de repetición de terminal invertida.

En modalidades preferidas, las secuencias de repetición de terminal invertida se reconocen por y son funcionales con al menos una transposasa seleccionada del grupo que consiste de: PiggyBac, Sleeping Beauty, Frog Prince, Hi arl , Passport , Minos, hAT, Toll , Tol2 , Ac/Ds, PIF, Harbinger, Harbinger3-DR , y Hsmarl .

La presente invención además se refiere a una biblioteca de moléculas de polinucleótidos que codifican polipéptidos que tienen diferentes especificidades o funcionalidades de unión, que comprende una pluralidad de moléculas de polinucleótidos, en donde las moléculas de polinucleótidos comprenden una secuencia que codifica un polipéptido que tiene una especificidad o funcionalidad de unión dispuesta entre las secuencias de repetición de terminal invertida que se reconocen por y son funcionales con al menos una enzima transposasa. De preferencia, los polinucleótidos son moléculas de ADN y comprenden una secuencia de unión a ligando de un receptor o una secuencia de diana de unión de una molécula de unión. En una modalidad particularmente preferida, la biblioteca comprende polinucleótidos, en donde cada polinucleótido comprende una secuencia que codifica una secuencia de unión al antígeno de un anticuerpo. En una modalidad, la biblioteca comprende polinucleótidos que codifican una región VH o VL de un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo. Alternativamente, los polinucleótidos pueden codificar una región VH y una región VL. En una modalidad preferida, los polinucleótidos de la biblioteca comprenden una secuencia que codifica una cadena pesada o ligera de anticuerpo de longitud completa (es decir, que incluye la región constante) o un fragmento de unión al antígeno del mismo. Alternativamente, los polinucleótidos pueden codificar una cadena pesada y ligera de inmunoglobulina de longitud completa. En otras realizaciones, los polinucleótidos de la biblioteca comprenden una secuencia que codifica un dominio Fv o un Fab de una sola cadena. En modalidades preferidas, los polinucleótidos de la biblioteca se encuentran en forma de plásmidos o amplicones por PCR de ADN de doble hebra. En ciertas modalidades, los plásmidos de la biblioteca comprenden un gen marcador. En otra modalidad, los plásmidos comprenden una secuencia que codifica una enzima transposasa que reconoce y es funcional con las secuencias de repetición de terminal invertida. En una modalidad, la biblioteca de la invención comprende polinucleótidos que codifican la cadena pesada de inmunoglobulina de longitud completa incluyendo la estructura de intrón/exón natural de una cadena pesada de anticuerpo. La cadena pesada de inmunoglobulina de longitud completa puede comprender el dominio de anclaje de membrana endógen .

La presente invención también se dirige a un método para generar una biblioteca de polinucleótidos de transposición que codifican polipéptidos que tienen especificidades funcional o de unión diferentes, que comprende (i) generar una colección diversa de polinucleótidos que comprenden secuencias que codifican polipéptidos que tienen diferentes especificidades o funcionalidades de unión, en donde los polinucleótidos comprenden una secuencia que codifica un polipéptido que tiene una especificidad o funcionalidad de unión dispuesta entre secuencias de repetición de terminal invertida que se reconocen por y son funcionales con al menos una enzima transposasa.

La presente invención también se dirige a un vector que comprende una secuencia que codifica una región VH o VL de un anticuerpo, o una porción de unión al antígeno del mismo, dispuesta entre secuencias de repetición de terminal invertida que se reconocen por y son funcionales con al menos una enzima transposasa. En ciertas modalidades, el vector codifica una cadena pesada o ligera de longitud completa de una inmunoglobulina. De preferencia, la secuencia que codifica la VH o VL o la cadena pesada o ligera es una secuencia aleatoria generada, por ejemplo, por amplificación PCR bajo condiciones de mutagénesis o síntesis de genes. En una modalidad, el vector comprende secuencias de repetición de terminal invertida que se reconocen por y son funcionales con la transposasa PiggyBac . En otra modalidad, las secuencias de repetición de terminal invertida se reconocen por y son funcionales con la transposasa Sleeping Beauty. En una modalidad, el vector comprende una secuencia de región VH o VL derivada de un anticuerpo anti-TNF alfa tal como, por ejemplo, D2E7. En ciertas modalidades, el vector comprende al menos una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID N°: 5, SEQ ID N°: 8, SEQ ID N°: 9, SEQ ID N°: 10, SEQ ID N°: 11, SEQ ID N°: 13, SEQ ID N°: 16, SEQ ID N°: 17 y SEQ ID N°: 19, SEQ ID N°: 20, SEQ ID N°: 21, SEQ ID N°: 22, SEQ ID N°: 23, SEQ ID N°: 24, SEQ ID N°: 32, SEQ ID N°: 33, SEQ ID N°: 34, SEQ ID N°: 35, SEQ ID N°: 36, SEQ ID N°: 37, SEQ ID N°: 38, SEQ ID N°: 39, SEQ ID N°: 40 y SEQ ID N°: 41.

La presente invención también se dirige a una célula huésped que comprende un vector de la invención como se describe en lo anterior. En una modalidad preferida, la célula huésped además comprende un vector de expresión que comprende una secuencia que codifica una transposasa que reconoce y es funcional con al menos una secuencia de repetición de terminal invertida en el vector que codifica la secuencia de la región VH o VL.

La presente invención incluso se refiere a moléculas de unión al antígeno, por ejemplo, anticuerpos producidos por un método que comprende la reivindicación 1.

La presente invención también se dirige a un método para generar una población de células huésped capaz de expresar polipéptidos que tienen diferentes especificidades o funcionalidades, que comprenden: (i) generar una colección diversa de polinucleótidos que comprende secuencias que codifican polipéptidos que tienen diferentes especificidades o funcionalidades de unión, en donde los polinucleótidos comprenden una secuencia que codifica un polipéptido que tiene una especificidad o funcionalidad de unión dispuesta entre secuencias de repetición de terminal invertida que se reconocen por y son funcionales con al menos una enzima transposasa; y (ii) introducir la colección diversa de polinucleótidos en células huésped.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Figura 1: a.) Este dibujo representa la configuración de un elemento de transposición (TE) autónomo, que puede transponerse o "saltar" en cualquier secuencia de ADN diana. Los componentes clave de un TE son una enzima transposasa activa que reconoce las repeticiones de terminal invertida (ITR) que flanquean la enzima transposasa en sí misma corriente arriba y abajo de su secuencia. Los TE catalizan ya sea el copiado o la escisión del TE, y la integración en secuencias de ADN diana no relacionadas, b.) Este dibujo representa la configuración de un sistema de vector de transposón, en el cual la expresión de una enzima transposasa activa se efectúa por un vector de expresión que no se acopla con el TE en sí mismo. En su lugar, el TE puede contener cualquier secuencia o secuencias, o gen o genes de interés que se clonan entre las ITR corriente arriba y abajo. La integración del TE que contiene cualquier secuencia o secuencias, o gen o genes de interés (por ejemplo, una biblioteca de ADN que codifica una biblioteca de proteínas) puede integrarse en secuencias de ADN diana no relacionadas, si la expresión de enzima transposasa se proporciona en trans, por ejemplo, por un constructo de expresión de transposasa separada, como se representa aquí.

Figura 2: a) Este dibujo representa las dos maneras diferentes cómo los TE pueden "saltar" o transponerse en ADN diana no relacionado. Para transposones del grupo II. La enzima transposasa en una primera etapa que reconoce las ITR del elemento de transposición y cataliza la escisión del TE de ADN. En una segunda etapa, el TE escindido se inserta en una secuencia de ADN diana no relacionada, la cual también se cataliza por la enzima transposasa. Esto da como resultado un mecanismo de transposición de "cortar y pegar". Para transposones del grupo I (mostrados en b.), la información codificante del TE se replica en primer lugar (por ejemplo, se transcribe y se transcribe de forma inversa, en el caso de los retrotransposones) y el TE replicado entonces se integra en una secuencia de ADN diana no relacionada, la cual se cataliza por la enzima transposasa. Esto da como resultado un mecanismo de transposición de "copiar y pegar".

Figura 3: Esta figura proporciona una visión general de enzimas transposasas activas identificadas y/o reconstruidas a partir de TE inactivos, durmientes, y que se ha mostrado que son capaces de conferir transposición en diversas células de vertebrado y también de humano, como se proporciona en la tabla. La tabla se ha adaptado de la Tabla I de la publicación de Ni et al . Briefings Functional Genomics Proteomics 7, 444-453 (2008) (incorporado en la presente para referencia en su totalidad).

Figura 4: Esta figura indica el principio del método descrito en la presente, para el aislamiento de codificar información para proteínas, incluyendo anticuerpos y fragmentos de los mismos, con una función deseada, por ejemplo, la unión de un diana de interés, como se representa aquí. El gen o genes de interés, por ejemplo, una biblioteca de ADN de transposición diversa que codifica proteínas, incluyendo cadenas de polipéptidos de anticuerpos o fragmentos de los mismos, que se clonan entre repeticiones de terminal invertida (ITR) de un constructo de transposición se introduce en una célula huésped de vertebrado junto con un vector de expresión para una enzima transposasa activa (véase parte superior del dibujo). La expresión de la enzima del transposón en las células huésped en trans y la presencia del gen o genes de interés clonados entre las ITR que pueden reconocerse por la enzima transposasa permite la integración estable del gen o genes flanqueados por la ITR de interés en el genoma de las células huésped, los cuales después pueden expresar de forma estable la proteína o proteínas de interés codificadas por los genes de interés. La biblioteca celular que expresa la proteína o proteínas de interés entonces puede clasificarse para una funcionalidad deseada de las proteínas expresadas, por ejemplo, pero no limitadas a la unión de una proteína diana de interés, como se representa aquí. Por medio de téenicas de separación celular conocidas en el arte, por ejemplo MACS o FACS, las células que expresan la proteína o proteínas de interés con el fenotipo deseado y el cual, por lo tanto, contienen el genotipo correspondiente, pueden aislarse y la información de codificación del gen o genes de interés pueden recuperarse de las células aisladas por técnicas de clonación conocidas en el arte, por ejemplo, pero no limitadas a clonación por PCR genómica, como se representa aquí .

Figuras 5a) y 5b): Este dibujo indica la estrategia de clonación para la generación de un vector de expresión de cadena ligera (LC) kappa de inmunoglobulina (Ig) humana de transposición, como se describe en el Ejemplo 1. La FIGURA 5a.) representa la estrategia de clonación para la inserción de ITR 5' y 3' del transposón PiggyBac en el vector de expresión de célula de mamífero pIRES-EGFP (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA), el cual ya contiene el elemento promotor fuerte de células de mamífero pC V (IE) (promotor temprano inmediato de CMV) y señales de intrón/polyA para la expresión fuerte en células huésped de mamífero. Además, corriente abajo del sitio de clonación múltiple que contiene Clal, EcoRV, Notl, EcoRI, en los cuales pueden clonarse un gen o genes de interés, pIRES-EGFP contiene un sitio de entrada riboso al interno (IRES) con una ORF corriente abajo de proteína verde fluorescente intensificada (EGFP), que efectúa el acoplamiento de la expresión del gen o genes de interés clonados corriente arriba del IRES. También se representan los elementos funcionales bacterianos (gen con resistencia a ampicilina, ampR) y un origen bacteriano de replicación (Col El) para amplificación y selección del plásmido en E. coli. El plásmido que contiene ITR PiggyBac resultante se designa pIRES-EGFP-TlT2. FIG 5b) entonces representa la inserción de un gen que sintetiza LC kappa de Ig humana en el sitio de enzima de restricción EcoRV único de pIRES-EGFP-TlT2, que coloca la LC kappa de Ig humana corriente arriba del casete de IRES-EGFP y de este modo acopla la expresión de la LC kappa de Ig humana con la expresión del gen marcador EGFP. La inserción de la LC kappa de Ig humana da como resultado el vector de expresión pIRES-EGFP-TlT2-IgL de LC kappa de Ig humana de transposición. Los dibujos muestran sitios de enzimas de restricción únicos seleccionados en los plásmidos, así como sitios duplicados seleccionados que resultan de las etapas de clonación.

Figura 6: Este dibujo indica la clonación de un vector de expresión de cadena pesada (HC) de inmunoglobulina (Ig) gamma 1 humana de transposición, que puede generarse por intercambio del marco de lectura abierta (ORF) LC kappa de Ig humana contra el ORF de un ORF de HC de Ig gamma 1 humana. El diseño del ORF de HC de Ig gamma 1 final es similar, también con respecto al diseño de un sitio de enzima de restricción Eco47III único que separa las regiones de codificación variable (V) de la constante (C), lo cual permite el intercambio de una sola región de codificación V de anticuerpo contra una biblioteca diversa de regiones codificantes V de anticuerpo, como se describe en el Ejemplo 3 Figura 7: Este dibujo representa la clonación de un vector de expresión de enzima transposasa PiggyBac de mamífero, como se describe en el Ejemplo 4, utilizando pCDNA3.lhygro(+) como la cadena principal del vector de expresión de mamífero, en el cual el ORF sintetizado de genes de transposasa PiggyBac se clona en el único sitio de enzima de restricción EcoRV de pCDNA3.lhygro (+), dando como resultado el vector de expresión pCDNA3 .lhygro(+)-PB de transposón PiggyBac. Además, en este dibujo se muestran la posición relativa de otros elementos funcionales de mamífero (promotor CMV-IE, señal BGH-polyA, segmento SV40-polyA, ORF de higromicina B) y elementos funcionales bacterianos (gen de resistencia a ampicilina, ampR, origen de la replicación, ColEl), así como sitios de reconocimiento de enzimas de restricción relevantes seleccionados.

Figura 8: Este dibujo representa la clonación de un vector de expresión de cadena ligera kappa de inmunoglobulina (LC Kappa-Ig) humana de transposición Sleeping Beauty, como se describe en el Ejemplo 5. La clonación puede realizarse al remplazar secuencialmente las ITR 5' y 3' de PiggyBac con las ITR 5' y 3' de Sleeping Beauty en el constructo pIRES-EGFP-TlT2-IgL. Además, en este dibujo se muestra la posición relativa de otros elementos funcionales de células de mamífero (promotor CMV-IE, señal BGH-polyA, segmento SV40-polyA, ORF de higromicina B) y elementos funcionales bacterianos (gen de resistencia a ampicilina, ampR, origen de replicación, ColEl), así como sitios de reconocimiento de enzimas de restricción relevantes seleccionados.

Figura 9: Este dibujo representa la clonación de un vector de expresión de enzima transposasa Sleeping Beauty de célula de mamífero, como se describe en el Ejemplo 6, utilizando pCDNA3.lhygro(+) como la cadena principal del vector de expresión en célula de mamífero, en el cual la OEF del gen sintetizado de transposasa Sleeping Beauty se clona en el sitio de enzima de restricción EcoRV único de pCDNA3.lhygro(+), dando como resultado en el vector de expresión pCDNA3.lhygro(+)-SB del transposón Sleeping Beauty. Además, en este dibujo se muestra la posición relativa de otros elementos funcionales de célula de mamífero (promotor CMV-IE, señal BGH-polyA, segmento SV40-polyA, ORF de higromicina B) y elementos funcionales bacterianos (gen de resistencia a ampicilina, ampR, origen de la replicación, ColEl), así como sitios de reconocimiento de enzimas de restricción relevantes seleccionados.

Figura 10: Este dibujo muestra la disposición de elementos funcionales y posición de sitios de enzima de restricción únicos dentro de los fragmentos 1.) y 2.) de ADN sintetizados por gen que se utilizaron en el Ejemplo 4, con el fin de clonar ambos vectores de expresión de cadena de IgH "vacíos" que permiten la transposición utilizando cualquiera de transposasa PiggyBac o Sleeping Beauty. El origen de los elementos funcionales se describe en detalle en la descripción del Ejemplo.

Figura 11: Este dibujo muestra el diseño final y mapa de plásmido de los vectores de expresión de transposición para cadenas pesadas de Ig gamma 1 de membrana de humano (izquierda) y cadenas ligeras kappa de Ig humana (derecha). Para el vector de expresión de IgH, la región de codificación de VH puede remplazarse por regiones de codificación VH en este vector, para el vector de expresión IgL, la región de codificación de VL puede remplazarse por regiones de codificación de VL de cualquier otro anticuerpo monoclonal o por una biblioteca de genes de VL utilizando los sitios de enzima de restricción únicos Notl y BsiWI, flanqueando la región de codificación de VL en este vector. Las construcciones del vector 8 para los vectores de IgH e IgL de transposición de PiggyBac y Sleeping Beauty, se describen en detalle en el Ejemplo 4 y comparten su diseño general. Los dos mapas de vector visualizados aquí corresponden a los mapas del vector de pPB-EGFP-HC-Ac-10 (izquierda) y pPB-EGFP-LC-AclO (derecha), y los vectores adicionales para la cadena pesada (HC) o cadena ligera (LC) de hNU12, que contienen cualquiera de las ITR de PiggyBac o Sleeping Beauty, se proporcionan en las siguientes tablas, las secuencias de todos los vectores en esta figura se proporcionan en el Ejemplo 4.

Figura 12: Esta figura muestra dos gráficos de puntos FACS dimensionales, en los cuales la expresión de superficie de IgG humana a partir de los vectores de expresión de IgHC e IgLC transpuestos se detectan en la superficie de células 63-12 pro-B de murino transformadas por A-MuLV derivadas de ratones RAG-2-deficientes. d2 post TF significa que el análisis FACS se realizó 2 días después de la transfección de constructos de vector en células 63-12. Los gráficos FACS en la columna a mano derecha representan controles negativo y positivo de la transfección. Electroporación de células NC=simulado sin ADN plásmido. El control pEGFP-N3=transfección con el vector de control pEGFP-N3, el cual se controla para la eficacia de transfección al representar células transfectadas en verde. La segunda columna de la izquierda muestra gráficos FACS de células 63-12 co-transfectadas con cualquier vector de transposasa PiggyBac, vectores pPB-EGFP-HC-AclO, pPB-EGFP-LC-AC10 (hilera a la mitad) o con el vector de transposasa Sleeping Beauty, vectores pSB-EGFP-HC-AclO, pSB-EGFP-LC-AC10 (hilera al fondo). La segunda columna a la izquierda etiquetada "d2 post TF" muestra el análisis para células que expresan IgG en la superficie celular (eje Y) y la expresión (eje X) de dos días después de la co-transfección de los vectores como se mencionó en lo anterior. Las células positivas de IgG y EGFP de doble superficie se clasificaron por FACS como se indica por la activación rectangular. La segunda columna a la derecha etiquetada "d9 lx clasificado" muestra los análisis de expresión de IgG y EGFP de superficie en la población celular y se clasificó en el día 2 después de la transíección, analizada de la misma manera para la expresión de superficie de IgG y EGFP en los experimentos previos.

Figura 13: Esta figura representa la demostración de que las células Pro que expresan IgG específica a CD30 en la superficie de las células 63-12 pueden teñirse específicamente y detectarse por el antígeno CD30, y que las células específicas a CD30 pueden detectarse y reaislarse a partir de una gran población de célula que expresan IgG de superficie de especificidad no relacionada (aquí CD19), en la cual las células específicas a CD30 han sido enriquecidas en la cual la frecuencia disminuye. El gráfico por puntos FASCS en la parte superior muestra la detección de IgG (mediante tinción anti-kappaLC) y unión a CD30 (mediante la tinción del antígeno a CD30) en la superficie de las células de control positivo que son células 63-12 transpuestas de forma estable y clasificadas 2x para expresar IgG anti-CD30 de humano, clon AclO en la superficie celular. Como se esperó, se detectó una población bastante pura (97.3%) de positiva a IgG- /reactiva a CD30 en el cuadrante derecho superior del gráfico por puntos FACS. Los números en la parte superior de cada gráfico de FACS indicó el número de células vivas basadas en la activación de FSC/SSC que se adquirió en cada experimento. La hilera a la mitad muestra el análisis FACS para células positivas a IgG/reactivas a CD30 que se detectaron en un fondo de células específicas positivas a IgG/CD19. El número sobre el número de eventos indica el factor de dilución de células positivas a IgG específicas a anti-CD30 que se utilizaron para la generación de la población "en punta" de células positivas a IgG de mAb anti-CD30 en un fondo de IgG de mAb anti-CD19. Las activaciones clasificadas indican que se utilizaron para aislar específicamente células reactivas positivas a IgG/antígeno CD30 de las poblaciones en punta. Grandes cantidades de eventos necesarios para adquirirse para permitir la detección y aislamiento de las células positivas a IgG/CD30 en mayores diluciones, la hilera inferior de gráficos FACS entonces muestra el re-análisis de células clasificadas después que las células se han expandidos por 12 días para los mismos parámetros (especificidad de expresión de IgG y antígeno de CD30).

Figura 14: esta figura muestra la clonación de un vector de transposición para una cadena pesada (HC) de Ig gamma 1 humana en configuración genómica. El fragmento lineal en la parte superior representa exón e intrones gamma 1 humanos para HC de Ig gamma 1 unida a membrana, con sitios de flanqueo Bhel y restricción BstBI agregados para permitir la ligadura en el vector pPB-EGFP-HC-AclO de ADNc de Ig gamma 1. H designa el exón de región de Bisagra, MI y M2 representan los exones que codifican la región de transmembrana de superficie expresada por la cadena pesada de Ig. Con una simple ligadura en una etapa, la región C-gamma 1 de ADNc del vector de cadena pesada de humano de transposición se remplaza por su contraparte genómica como se indica en la figura. Utilizando esta estrategia, la región de codificación VH se ligará en marco al exón de codificación CH1 de C-gamma 1 de humano.

Figura 15: Esta figura muestra la secuencia y diseño global de la biblioteca de cadena ligera kappa. Se subraya la región de codificación CDR3. Se indican los sitios de restricción útiles.

Figura 16: Esta figura muestra la secuencia y diseño global de la biblioteca de cadena pesada gama, que muestra como un ejemplo el fragmento de biblioteca al azar utilizando la estrategia de aleatorización NNK4. Los fragmentos de biblioteca de cadena pesada gamma al azar que utilizan las estrategias de aleatorización NNK6, NNK8 y NNK10 sólo difieren en el número de residuos de aminoácidos al azar en la región HCDR3. Se subraya la región de codificación CGDR3. El codón ARG codifica Lisina y Arginina. Se indican los sitios de restricción útiles.

Figura 17: Esta figura muestra la digestión de plantillas PCR antes de la amplificación con cebadores. (A) Digestión de pUC57_jkappa2-Ckappa con la endonucleasa Seal de restricción produce un fragmento de ADN de extremo romo ideal para cebarse con el cebador LCDR3-NNK6-F. (B) Digestión de pUC57_JH4 con la endonucleasa DrdI de restricción que produce un fragmento de ADN ideal para cebarse con los cebadores HCDR3-NNK4-F, HCDR3-NNK6-F, HCDR3-NNK8-F, y HCDR3-NNK10-F.

Figura 18: Esta figura muestra los electroferogramas que abarcan la región LCDR3 y HCDR3 al azar de los amplicones por PCR generados para diversificar la región LCDR3 por el procedimiento de NNK-6 para Vkappa (A), y la región HCDR3 por el procedimiento de NNK-4 para VH, como se describe en los Ejemplos 12 y 13, respectivamente.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Definiciones Como se utiliza en la presente, "colección diversa" significa una pluralidad de variantes o mutantes de proteínas funcionales o de unión particulares que muestran diferencias en las secuencias de nucleótidos de codificación o en las secuencias de aminoácidos primarias, que definen diferentes funcionalidades o propiedades de unión.

Como se utiliza en la presente, "biblioteca" significa una pluralidad de polinucleótidos que codifican polipéptidos que tienen diferentes especificidades y/o funcionalidades de unión. En ciertas modalidades, la biblioteca puede comprender polinucleótidos que codifican al menos 102, al menos 103, al menos 104, al menos 105, al menos 106, al menos 107, al menos 108 o al menos 109 polipéptidos únicos, tales como, por ejemplo, dominios VH o VL o cadenas pesadas o ligeras de anticuerpo de longitud completa.

Como se utiliza en la presente, "secuencia de repetición de terminal invertida" o "ITR" significa una secuencia identificada en los extremos 5' o 3' de elementos de transposición que se reconocen por transposasas y que intervienen en la transposición de las ITR incluyendo intervenir información de codificación a partir de un constructo o sitio de ADN a otro constructo o sitio de ADN.

Como se utiliza en la presente, "transposasa" significa una enzima que tiene la capacidad de reconocer y de unirse a las ITR y de intervenir en la movilización de un elemento de transposición de una secuencia de ADN diana a otra secuencia de ADN diana.

Como se utiliza en la presente, "molécula de unión al antígeno" se refiere en su sentido más amplio a una molécula que une específicamente un determinante antigénico. Un ejemplo no limitante de una molécula de unión al antígeno es un anticuerpo o fragmento del mismo que mantiene una unión específica al antígeno. Por "se une específicamente" se entiende que la unión es selectiva para el antígeno y puede discriminarse de interacciones no deseadas o no específicas.

Como se utiliza en la presente, se pretende que el término "anticuerpo" incluya moléculas de anticuerpo completas, incluyendo anticuerpos monoclonales, policlonales y multiespecíficos (por ejemplo, biespecíficos), así como fragmentos de anticuerpo que tienen una región Fe y mantienen especificidad de unión, y proteínas de fusión que incluyen una región equivalente a la región Fe de una inmunoglobulina y que mantienen especificidad de unión. También se abarcan fragmentos de anticuerpo que mantienen la especificidad de unión. También se abarcan fragmentos de anticuerpo que mantienen especificidad de unión incluyendo, pero no limitados a fragmentos VH, fragmentos VL, fragmentos Fab, fragmentos F(ab')2 fragmentos scFv, fragmentos Fv, minicuerpos, diacuerpos, triacuerpos y tetracuerpos (véase, por ejemplo, Hudson y Souriau, Nature Med. 9: 129-134 (2003)) (incorporado para referencia en su totalidad).

Una realización de la invención descrita en la presente es un método para la identificación de polipéptidos funcionales o de unión específicos, incluyendo, pero no limitados a cadenas de anticuerpos o fragmentos de los mismos (Figura 4), que comprenden: i. clonación de diversas bibliotecas de ADN de transposición que codifican proteínas, incluyendo cadenas de polipéptidos de anticuerpo o fragmentos de los mismos, entre las repeticiones de terminal invertida (ITR) derivadas de elementos de transposición y reconocibles por y funcionales con al menos una enzima transposasa, ii. introducción de una o más bibliotecas de ADN de transposición diversas de la etapa (i) en células huésped de vertebrado por métodos estándares conocidos en la téenica, iii. proporcionar la expresión temporal de al menos una enzima transposasa funcional en las células huésped de vertebrado en trans, de modo que las una o más bibliotecas de ADN de transposición diversas se integran de forma estable en los genomas de células huésped de vertebrado, proporcionando de este modo una población de células huésped de vertebrado que después expresan de forma estable diversas bibliotecas de proteínas, incluyendo cadenas de anticuerpos o fragmentos de los mismos, iv. clasificación de las bibliotecas celulares diversas, que expresan de forma estable proteínas, incluyendo anticuerpos o fragmentos de los mismos, para un fenotipo funcional o de unión deseado por métodos conocidos en la técnica, v. opcionalmente, incluir ciclos de enriquecimiento por iteraciones con células huésped de vertebrado modificadas para un fenotipo funcional o de unión deseado, y vi. aislamiento de los genes correspondientes de las células huésped enriquecidas que codifican el fenotipo de unió o funcional deseado por métodos de clonación estándar, conocidos en la técnica, por ejemplo, pero no limitados a PCR (reacción de cadena de polimerasa) utilizando cebadores específicos para las secuencias contenidas en uno o más constructos de biblioteca de ADN de transposición.

Una modalidad preferida de la etapa (i) es generar diversas bibliotecas de ADN de transposición ya sea por síntesis de genes, o bien por reacción de cadena de polimerasa (PCR) utilizando cebadores apropiados para la amplificación de diversas regiones de codificación de proteínas, y plantillas de ADN que comprenden una diversidad de proteínas de unión, incluyendo anticuerpos o fragmentos de los mismos, por métodos conocidos en la téenica.

Para la generación de diversas bibliotecas de anticuerpos, puede generarse una colección diversa de secuencias de cadena pesada y ligera de anticuerpos por síntesis de genes estándar en la cual las secuencias de codificación de región V pueden seleccionarse al azar en ciertas posiciones, por ejemplo, pero no limitadas a cualquiera o todas de las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de las regiones V de cadena pesada o ligera del anticuerpo. La diversidad puede restringirse a las CDR individuales de las regiones V, o en posiciones de marco particulares o diversas, y/o en posiciones particulares en una o más de las regiones CDR. Las regiones V con variaciones diseñadas, como se describe en lo anterior, pueden sintetizarse como un fragmento que codifica cadenas pesadas o ligeras de anticuerpo completo que se flanquean por repeticiones de terminal invertida funcionales por al menos una enzima transposasa deseada. De preferencia, se genera la biblioteca de ADN que contiene diversos dominios variables que codifican regiones V para cadenas pesadas o ligeras de anticuerpo, y flanqueada por sitios de clonación apropiados, incluyendo pero no limitados a sitios de reconocimiento de enzimas de restricción, que son compatibles con sitios de clonación en vectores de expresión de cadena pesada o ligera de anticuerpo. Los sistemas de expresión de transposones útiles para su uso en los métodos de la invención incluyen, por ejemplo, el sistema de transposón PiggyBac como se ha descrito, por ejemplo, en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 6,218,185; 6,551,825; 6,962,810; 7,105,343; y 7,932,088 (el contenido total de cada una de las cuales se incorpora en la presente para referencia) y el sistema de transposón Sleeping Beauty como se describe en las Patentes de los Estados Unidos Nos.6,489,458; 7,148,203; 7,160,682; y US 2011 117072; US 2004 077572; y US 2006 252140 (los contenidos completos de cada una de las cuales se incorpora en la presente para referencia).

También pueden obtenerse diversas bibliotecas de cadena pesada y ligera de anticuerpos a partir de poblaciones de células B aisladas de especies de vertebrado deseadas, de preferencia humanos, y de preferencia de compartimentos celulares que contienen células B, por ejemplo, pero no limitados a sangre periférica o de cordón umbilical, y órganos linfoides como médula ósea, bazo, amígdalas y tejidos de ganglios linfáticos. En este caso, pueden aislarse diversas secuencias de región V de anticuerpo para cadenas pesada y ligera de anticuerpo por RT-PCR o por PCR genómica utilizando pares de cebadores PCR degradados específicos de cadena pesada y ligera de anticuerpo, que pueden amplificar la mayoría de familias de la región V al proporcionar cebadores corriente arriba que se unen a secuencias homologas corriente arriba o dentro de secuencias líder, corriente arriba o dentro de marcos de región V, y al proporcionar cebadores corriente abajo que se unen en regiones de homología dentro o corriente abajo del segmento génico de unión J de regiones de codificación de dominio variable o dentro o corriente abajo de las regiones de codificación de las regiones constantes de cadenas pesadas o ligeras de anticuerpo.

Los conjuntos de cebadores de PCR utilizados para la amplificación de diversas regiones de codificación variables pueden flanquearse por sitios de clonación apropiados, por ejemplo, pero no limitados a sitios de reconocimiento de enzimas de restricción, que son compatibles con sitios de clonación en vectores de expresión de cadena pesada o ligera de anticuerpo.

Las bibliotecas de ADN de transposición de la etapa (i) que codifican diversas proteínas, incluyendo anticuerpos y fragmentos de anticuerpo de los mismos, pueden proporcionarse en forma de bibliotecas de plásmidos, en las cuales las bibliotecas sintetizadas o genes o de ADN de transposición amplificadas por PCR se clonan utilizando sitios de clonación apropiados, como se menciona en lo anterior. Alternativamente, las bibliotecas de ADN de transposición que codifican diversas bibliotecas de proteínas de unión, tales como anticuerpos y fragmentos de los mismos, pueden proporcionarse en forma de constructos de ADN de doble hebra lineales, directamente como resultado de la síntesis de ADN, o como resultado de amplificación por PCR. Este último procedimiento para proporcionar las bibliotecas de ADN de transposición como amplicones por PCR de ADN de doble hebra lineal, que no se han clonado en vectores o plásmidos de expresión (en comparación con los demás sistemas de expresión celular en vertebrados) tiene la ventaja de que se mantiene la máxima complejidad molecular de las bibliotecas de ADN de transposición y no se compromete por una eficacia de clonación o ligadura limitada en un vector de expresión. En contraste, la clonación por ligadura, o de otro modo, en vectores de expresión o lanzadera de plásmidos es un intermediario necesario para todos los otros sistemas de expresión celular de vertebrado basados en plásmidos o basados en vectores virales.

Sin embargo, el uso de vectores de expresión de transposón basados en plásmidos que contienen las diversas bibliotecas de ADN de transposición que codifican diversas proteínas de unión, incluyendo anticuerpos y fragmentos de anticuerpos de los mismos, tienen la ventaja de que estos vectores de expresión pueden diseñarse para contener elementos funcionales adicionales, que permite la clasificación, o, alternativamente, la selección de células huésped de vertebrado con transposición estable para la integración estable del vector de expresión del transposón en células huésped de vertebrado con transposiciones.

Esto se logra al proporcionar en unión operativa con las diversas bibliotecas de ADN de transposición, es decir, clonadas en los vectores de expresión de transposón en cis, casetes de expresión para genes marcadores incluyendo, pero no limitados a proteínas marcadoras fluorescentes (por ejemplo, proteínas fluorescentes verdes, amarillas, rojas o azules, y versiones intensificadas de las mismas, como se conoce en la téenica), o casetes de expresión para marcadores de superficie celular que incluyen, pero no se limitan a marcadores CD, contra los cuales se encuentran disponibles anticuerpos de diagnóstico específico u otras herramientas de diagnóstico.

Alternativamente, pueden proporcionarse casetes de expresión para marcadores seleccionables, que permiten la selección de células huésped de vertebrado transpuestas para resistencia a antibióticos, incluyendo pero no limitados a puromicina, higromicina B, bleomicina, resistencia a neomicina, pueden proporcionarse en unión operativa con las diversas bibliotecas de ADN de transposición, es decir, clonadas en los vectores de expresión de transposones en cis.

La unión operativa puede lograrse al clonar los casetes de expresión para genes marcadores o marcadores de resistencia a antibióticos, ya sea corriente arriba o corriente abajo de las regiones de codificación que comprenden las diversas bibliotecas de ADN de transposición, pero dentro de las repeticiones de terminal invertida del vector de transposón.

Alternativamente, la unión operativa puede lograrse por clonación de las regiones de codificación del marcador o genes de resistencia a antibióticos corriente abajo de las regiones de codificación que comprenden las diversas bibliotecas de ADN de transposición, pero separadas por secuencias de sitios de entrada ribosomal internas (IRES), que aseguran el acoplamiento transcripcional de la expresión de las diversas bibliotecas de ADN de transposición con los genes marcadores o de resistencia a antibióticos, y permitiendo de este modo la clasificación o selección para células huésped de vertebrado con transposiciones estables.

En la etapa (ii) del método descrito en la presente, las diversas bibliotecas de ADN de transposición que codifican diversas bibliotecas de proteínas, al incluir anticuerpos y fragmentos de los mismos, se introducen en células huésped de vertebrado deseadas por métodos conocidos en la téenica para transferir eficazmente ADN a través de las membranas celulares de vertebrados, que incluyen pero no se limitan a transfección de ADN utilizando liposomas, fosfato de calcio, DEAE-dextrán, partículas magnéticas de polietilenimida (PEI), o por fusión de protoplastos, transfección mecánica, incluyendo métodos físicos o balísticos (pistola génica) o por nucleofección. Puede utilizarse de individualmente cualquiera de los métodos mencionados en lo anterior y otros métodos apropiados para transferir ADN en células huésped de vertebrado, o en combinación para la etapa (ii) del método descrito en la presente.

En el caso de proteínas diméricas, incluyen pero no se limitan a anticuerpos y fragmentos de los mismos, es una modalidad útil del método descrito en la presente para introducir diversas bibliotecas de ADN de transposición y/o vectores de transposón para cadenas pesadas o ligeras de anticuerpo contenidas en vectores de transposición separados, los cuales pueden introducirse de forma independiente en las células huésped de vertebrado. Esto ya sea permite la introducción secuencial de diversas bibliotecas de ADN de transposición para cadenas pesadas o ligeras de anticuerpo en las células, o su introducción simultánea en diversas bibliotecas de ADN de transposición para cadenas pesadas o ligeras de anticuerpo, las cuales, en cualquier caso, permiten el reordenamiento aleatorio de cualquier cadena pesada de anticuerpo con cualquier cadena ligera de anticuerpo codificada por al menos dos bibliotecas de ADN de transposición diversas separadas.

Otra modalidad útil de la modalidad anterior es utilizar vectores de transposón separados y/o diversas bibliotecas de transposición de ADN para cadenas pesadas y ligeras de anticuerpo, donde los constructos o bibliotecas se contiene en vectores de transposición reconocidos por diferentes enzimas transposasa (Figura 3). Esto permite la transposición independiente de constructos de cadena pesada de anticuerpo y ligera de anticuerpo sin interferencia entre las dos enzimas transposasa diferentes, cuando un vector de transposición sólo se reconoce y transpone por su enzima transposasa específica. En el caso de transposición secuencial de vectores de transposición o bibliotecas de ADN que codifican cadenas pesadas o ligeras de anticuerpo, la ventaja de utilizar enzimas transposasa diferentes con secuencias ITR diferentes es que, después del segundo evento de transposición, el primer constructo ya transpuesto de forma estable no se moviliza otra vez para una transposición adicional.

Esta modalidad también permite el descubrimiento de anticuerpos por el método de la selección guiada (Guo-Qiang et al . Methods Mol . Biol . 562, 133-142 (2009)) (incorporado en la presente para referencia en su totalidad). La selección guiada puede utilizarse, por ejemplo, para la conversión de cualquier anticuerpo específico no humano para una especificidad de diana/epítopo deseada y con una funcionalidad deseada en un anticuerpo completamente humano, donde se conserva la misma especificidad y funcionalidad de diana/epítopo. El principio de la selección guiada implica la expresión de una sola cadena de anticuerpo (de cadena pesada o ligera) de un anticuerpo de referencia (el "guía"), en combinación con una biblioteca diversa de las cadenas de anticuerpos complementarias (es decir, de cadena ligera o pesada, respectivamente) , y la clasificación de estas combinaciones de cadena pesada-ligera para el fenotipo funcional o de unión deseado. De esta manera, la primera cadena de anticuerpo "guía" la selección de una o más cadenas de anticuerpo complementarias a partir de la biblioteca diversa para el fenotipo funcional o de unión deseado. Una vez que se aíslan una o más cadenas de anticuerpos complementarias nuevas, estas pueden clonarse en vectores de expresión y utilizarse otra vez para "guiar" la selección de la segunda cadena de anticuerpos complementaria de una biblioteca de cadenas de anticuerpos diversa. El resultado final de este proceso en dos etapas es que las cadenas pesada y ligera del anticuerpo original de un anticuerpo de referencia se remplazan por secuencias de cadena de anticuerpo nuevas y no relacionadas de las diversas bibliotecas, pero donde la combinación de cadena pesada-ligera del anticuerpo nuevo muestra las mismas propiedades funcionales o de unión, o similares, del anticuerpo de referencia original. Por lo tanto, este método requiere la capacidad para expresar de modo independiente constructos o bibliotecas de cadena pesada y ligera de anticuerpo en las células huésped de vertebrado, las cuales pueden obtenerse por la modalidad preferida para proporcionar casetes de expresión de cadena pesada y ligera de anticuerpo en diferentes sistemas de vector de transposición, reconocidos por diferentes enzimas de transposón.

Sin embargo, también pueden construirse bibliotecas de ADN de transposición diversas en una manera que las regiones de codificación de proteínas multiméricas, incluidos los anticuerpos y fragmentos de los mismos, se encuentren contenidas en el mismo vector de transposón, es decir, cuando la expresión de al menos dos subunidades diferentes de una proteína multimérica, por ejemplo, regiones VH y VL o cadenas pesadas y ligeras de longitud completa, se encuentran unidas operativamente por clonación de los casetes de expresión respectivos o regiones de codificación en el mismo vector de transposición.

Las células huésped de vertebrado útiles para la introducción de constructos de transposición y/o bibliotecas de ADN de transposición de la etapa (ii) son células de especies de vertebrados que pueden o que se encuentran inmortalizadas y que se cultivan en medios de cultivo celular apropiados y bajo condiciones conocidas en la téenica. Estas incluyen, pero no se limitan a células, por ejemplo, de ranas, peces, aves, pero de preferencia de especies de mamíferos, que incluyen pero no se limitan a células de roedores, rumiantes, especies de primates no humanos y humanos, se prefieren con células de origen roedor o humano.

Los tipos celulares útiles de las especies mencionadas en lo anterior incluyen pero no se limitan a células de linaje linfoide, las cuales pueden cultivarse en suspensión y en altas densidades, se prefieren las células derivadas del linaje B, cuando expresan de forma endógena todas las proteínas, factores, chaperonas y enzimas post traducción requeridas para la expresión óptima de muchas proteínas, en particular de anticuerpos, o proteínas basadas en anticuerpos. De las células de vertebrado derivadas de linaje B, se prefieren que representen etapas de diferenciación temprana, y se conocen como células B progenitoras (pro) o precursoras (pre), debido a que las células pro- o pre-B en la mayoría de los casos no expresan cadenas de anticuerpo endógenas que podrían interferir con la expresión de cadena de anticuerpo exógena o heteróloga que son parte del método descrito en la presente.

Las células de linaje pro- y pre-B útiles de origen de roedor son células pro-B y pre-B transformados por el virus de Leucemia de Murino de Abelson (A-MuLV) ( Alt et al . Cell 27, 381-390 (1981) (incorporado en la presente para referencia en su totalidad) ) que expresan todos los componentes necesarios para la expresión de anticuerpos y también para su deposición en la superficie apropiada, incluyendo los componentes Ig-alfa (CD79a, o mb-1), e Ig-beta (CD79b, o B-29) de receptor de célula B ( Hombach et al . Nature 343 , 760-762 (1990)) (incorporado en la presente para referencia en su totalidad), pero como se menciona en lo anterior, carecen en su mayoría de la expresión de cadenas de anticuerpo o inmunoglobulina endógenas. Aquí, se prefieren células pro- y pre-B transformadas por A-MuLV que se derivan de mutantes de ratón, incluyendo pero no limitadas a mutantes de ratón defectuosos en el gen 1 (RAG 1) de activación de la recombinación o el gen 2 (RAG-2) de activación de la recombinación, o animales que transportan otras mutaciones en genes requeridos para recombinación de V(D)J, por ejemplo, XRCC4, ADN ligasa IV, Ku70 o Ku80, Artemis, proteína cinasa dependiente de ADN, subunidad catalítica (ADN-PKcS), y por lo tanto, carecen de la capacidad de expresar normalmente polipéptidos de anticuerpos endógenos.

Tipos útiles adicionales de células de linaje B progenitor (pro) y precursor (pre) son tempranos, células pro-B y pre-B de humano transformados por inmunoglobulina nula de VEB (Ig nula) (Kubagawa et al . , PNAS 85, 875-879 (1988)) (incorporado en la presente para referencia en su totalidad) que también expresan todos los factores requeridos para la expresión, modificación post-traducción y expresión de superficie de anticuerpos exógenos (que incluyen CD79a y CD79b).

Pueden utilizarse otras células huésped del linaje B que representan etapas de diferenciación en células plasmáticas del linaje de células B, de preferencia pero no limitadas a líneas celulares de mieloma de Ig nula, como Sp2/0, NSO, X63, Ag8653, y otras células de mieloma y plasmacitoma, conocidas en la téenica. Opcionalmente, estas líneas celulares pueden transfectarse de forma estable o modificarse genéticamente de forma estable por otros medios que la transfección, para sobreexpresar componentes Ig-alfa (CD79a o mb-1) e Ig-beta (CD79b o B-29) del receptor de células B, en caso de que se desee la deposición en superficie óptima de anticuerpos expresados de forma exógena.

A diferencia, líneas celulares de mamífero no linfoide, incluyendo pero no limitadas a células huésped de expresión de anticuerpos en la industria estándar, incluyen pero no se limitan a células CHO, células Per.C6, células BHK y células 293 pueden utilizarse como células huésped para el método descrito en la presente, y cada una de estas células además puede transfectarse opcionalmente de forma estable o modificarse genéticamente de forma estable para sobreexpresar componentes Ig-alfa (CD79a o mb-1) e Ig-beta (CD79b o B-29) del receptor de células B, en caso de que se desee la deposición en superficie óptima de anticuerpos expresados de forma exógena.

Esencialmente, puede utilizarse cualquier célula huésped de vertebrado, que sea transfectable, para el método descrito en la presente, lo cual representa una mayor ventaja en comparación con cualesquier sistemas de expresión viral, tales como, pero no limitados a sistemas de expresión de virus de vaccinia, retrovirales, adenovirales o virus sindbis, debido a que el método descrito en la presente no muestra restricción de célula huésped debido al tropismo de virus para ciertas especies o tipos celulares, y además puede utilizarse con todas las células de vertebrado, incluyendo células de humano, al nivel de bioseguridad más bajo, aumentando su utilidad general.

La etapa (iii) del método descrita en la presente da como resultado la modificación genética estable de células huesped de vertebrado deseadas con los constructos de transposición transfectados de la etapa (ii) por expresión temporal o transitoria de una enzima transposasa funcional, de modo que se genere una población estable de células huésped de vertebrado que exprese bibliotecas diversas de proteínas codificadas por los constructos.

Una modalidad útil de la etapa (iii) es introducir transitoriamente en las células huésped, de preferencia por co-transfección, como se ha descrito en lo anterior, un vector de expresión en células de vertebrado que codifique una enzima transposasa funcional junto con al menos una biblioteca de ADN de transposición diversa. Debe entenderse que la co-transfección o co-integración transitoria de un vector de expresión de transposasa puede ya sea realizarse simultáneamente, o poco antes o después de la transferencia de los constructos de transposición y/o bibliotecas de ADN de transposición diversas en las células huésped de vertebrado, de modo que la transposasa expresada de forma transitoria pueda utilizar de modo óptimo los vectores de transposición introducidos de forma transitoria de la etapa (ii) para la integración de la biblioteca de ADN de transposición en el genoma de la célula huésped de vertebrado.

Otra modalidad útil de la etapa (iii) es efectuar la integración estable de los vectores de transposición y/o bibliotecas de ADN de transposición introducidas de la etapa (ii) al expresar de forma transitoria una enzima transposasa funcional por medio de un sistema de expresión inducible conocido en la téenica, que ya se encuentra integrado en el genoma de la célula huésped de vertebrado. Tal expresión inducible y transitoria de una transposasa funcional puede lograrse, por ejemplo, por sistemas de promotor inducible por tetracielina (tetraciclina activado/tetraciclina desactivado) o inducible por tamoxifeno conocidos en la técnica. En este caso, sólo necesita introducirse uno o más vectores de transposición o bibliotecas de ADN en el genoma de la célula huésped, y la transposición estable de los constructos y la expresión estable de las proteínas codificadas por uno o más vectores de transposición o bibliotecas de ADN se efectúa por la expresión activada transitoriamente conmutada de la enzima transposasa funcional en las células huésped.

La etapa (iv) del método descrito en la presente efectúa el aislamiento de células huésped de vertebrado con transposición que expresan proteínas con un fenotipo de funcionalidad o unión deseado.

Una modalidad preferida de la etapa (iv) es clasificar para y aislar las células huésped con transposición de la etapa (iii) que expresan proteínas deseadas, incluyendo anticuerpos y fragmentos de los mismos, con ensayos de diana de unión y por medio de técnicas de separación de células estándar, como clasificación celular magnética activada (MACS) o clasificación de células activadas por fluorescencia de alta velocidad (FACS) conocidas en la téenica. Especialmente, en una primera etapa de enriquecimiento de una población específica de células huésped de vertebrado con transposición, donde un gran número de células necesita procesarse, se prefiere aislar células específicas diana aisladas a partir de un gran número de células no específicas por técnicas basadas en MACS.

Particularmente, para ciclos de enriquecimiento de células adicionales e iterativas, se prefiere enriquecimiento de FACS, ya que necesitan procesarse potencialmente poca cantidad de células, y debido a que la citometría de flujo de canales múltiples permite el enriquecimiento simultáneo de funcionalidades, se incluyen pero no se limitan a la unión con un diana específico de más de una especie, o la clasificación específica para epítopos particulares utilizando anticuerpos de competencia específicos de epítopo en la clasificación FACS.

Si se descubren proteínas que incluyen anticuerpos y fragmentos de los mismos, que interaccionen con parejas de unión solubles, estas parejas de unión se marcan de preferencia con marcadores o etiquetas específicos, de modo que no se limiten a biotina, myc o marcadores HA conocidos en la técnica, que pueden detectarse por reactivos secundarios, por ejemplo, pero no limitados a estreptavidina o anticuerpos, que en sí mismos se encuentren marcados magnéticamente (para enriquecimiento de células basadas en MACS) o con fluorocromos (para enriquecimiento de células basadas en FACS), de modo que puedan aplicarse las téenicas de separación de células.

Si se descubren proteínas que incluyen anticuerpos y fragmentos de los mismos contra proteínas de unión a membrana, que no pueden expresarse fácilmente como proteínas solubles, como por ejemplo pero no limitadas a tetraspaninas, de 7 dominios de transmembrana (como receptores acoplados a proteína acoplada G) o canales iónicos, estas pueden expresarse en partículas virales, o sobreexpresarse en líneas celulares específicas, las cuales después se utilizan para métodos de mareaje o selección conocidos en la técnica, los cuales pueden enriquecer las células huésped de vertebrado que expresan las proteínas de los constructos transpuestos, que incluyen anticuerpos y fragmentos de los mismos.

Debido al acoplamiento genotipo-fenotipo estable en la población de células huésped de vertebrado transpuesta estable, una modalidad útil de la etapa (v) es repetir los ciclos de enriquecimiento celular para un fenotipo funcional o de unión deseado, hasta que se obtiene una población de células distinta que se asocia con un fenotipo funcional o de unión deseado. Opcionalmente, pueden aislarse clones de células individuales, por ejemplo, pero no limitados a clasificación de una sola célula utilizando teenología de citometría de flujo, o por dilución limitante, para recuperar la información de ADN transpuesto de clones de células individuales que se acoplan a un fenotipo funcional o de unión deseado particular.

Para la identificación de anticuerpos de diana específico funcionales es con frecuencia favorable no sólo clasificar y seleccionar para un fenotipo de unión particular, sino clasificar adicionalmente para propiedades funcionales adicionales de anticuerpos de diana específico, en particular efectos antagonistas o agonistas en un ensayo biológico.

Por lo tanto, es deseable poder "conmutar" eficazmente la expresión de anticuerpo de unión a la membrana celular para la expresión del anticuerpo secretado en las células huésped de vertebrado con producciones suficientes para producir una cantidad suficiente de un clon de anticuerpo particular para ensayos funcionales.

En células de linaje B natural la conmutación de expresión la membrana unida a la expresión de anticuerpo secretado ocurre mediante un mecanismo empalme alternativo, en el cual en las células pre-B y B un donante de empalme cerca del extremo 3' del último exón de región constante de cadena pesada se empalma de preferencia a un aceptor de empalme de un exón de anclaje de membrana corriente abajo de los exones de regiones constantes de cadena pesada. De esta manera, se produce una cadena pesada de anticuerpo en células B con un dominio C-terminal extendido que abarca la transmembrana, que ancla la cadena pesada y por lo tanto, el anticuerpo que contiene la cadena pesada-ligera completa en la membrana celular. El dominio C-terminal que abarca la transmembrana, también interactúa de forma no covalente con los componentes Ig-alfa (CD79a o mb-1) e Ig-beta (CD79b o B29) que abarcan la membrana, lo que probablemente da como resultado un mejor anclaje de membrana y mayor expresión de inmunoglobulina de superficie en células de linaje B.

Una vez que se diferencia aún más una célula B a la etapa de célula plasmática, la alternativa de empalme ya no ocurre más y donante de empalme alternativo cerca del extremo 3' de la última región constante de cadena pesada no se reconoce o se utiliza en gran medida, y la plantilla de ARNm se termina corriente abajo del codón de parada de región constante de cadena pesada, y se traduce una cadena pesada de anticuerpo secretado.

Para explotar este mecanismo natural de empalme alternativo y "conmutación" de unión de membrana para la expresión secretada de anticuerpos expresados, es una modalidad útil del método descrito en la presente construir los vectores de transposición y diversas bibliotecas de ADN que codifican proteínas, incluyendo anticuerpos o fragmentos de los mismos, de tal manera que se mantenga la estructura de intrón/exón natural de una cadena pesada de anticuerpo constante, incluyendo los exones que codifican los dominios que abarcan la transmembrana. Esta modalidad representa una clara ventaja contra sistemas de expresión retroviral, como el genoma de vector retroviral que ya se encuentra empalmado antes de empacarse en una partícula retroviral y transducirse de forma estable en el genoma de célula huésped.

Otros sistemas de vector viral pueden restringirse en la longitud del inserto de ADN que puede incorporarse a los vectores, evitando de esta manera la clonación de regiones genómicas más grandes en los vectores de expresión y evitando de este modo la exploración de la "conmutación" natural de la unión a membrana a expresión de anticuerpo secretado para que sea capaz de transponerse eficazmente más de 10 kb de fragmentos de ADN en células huésped de vertebrado sin ninguna pérdida en la eficacia de transposición (Kawakami Genome Biol . 8, Suppl 1 , SI (2007)) (incorporado en la presente para referencia en su totalidad). Por lo tanto, es una modalidad útil del método descrito en la presente a los vectores de expresión de transposición del constructo que comprenden estructura de exón/intrón genómicas para una expresión mejor y apropiada y para la conmutación de la regulación natural de la unión de membrana para la expresión de anticuerpo secretada. Los métodos de la invención son útiles para transponer fragmentos de ADN de al menos 5 kb, al menos 6 kb, al menos 7 kb, al menos de 8 kb, al menos 9 kb, al menos 10 kb de tamaño en genomas de células huésped.

La diferenciación del etapa de diferenciación de linaje B temprano que favorece la expresión de anticuerpo de unión a membrana, a un etapa de célula plasmática posterior, que favorece la expresión de anticuerpo secretado puede inducirse por factores de diferenciación de células B, tales como, pero no limitados a la activación de CD40/IL4, o estimulación por mitógenos, tales como pero no limitados a lipopolisacáridos (LPS) u otros activadores policlonales, activadores de la cepa Cowan de Staphylococcus aureus (SAC), y nucleótidos CpG, o cualquier combinación de los mismos.

De preferencia, esta diferenciación se efectúa en células transformadas, en las cuales la proliferación puede inhibirse artificialmente, de modo que pueda ocurrir otra vez la diferenciación de células B apropiada, como se ha descrito para células pre-B de murino transformados por A-MuLV, en las cuales la tirosina cinasa de Abelson se inhibe específicamente por el inhibidor de tirosina Gleevec ( Muljo et al . Nat . Immunol 4, 31-37 (2003)) (incorporado en la presente para referencia en su totalidad). Por lo tanto, es una modalidad preferida utilizar células pre-B de murino transformadas por A-MuLV con Ig nula para el método, el cual por tratamiento con Gleevec, pueda otra vez diferenciarse en etapas de células B más maduras, incluyendo células plasmáticas, que después secretan cantidades suficientes de anticuerpo secretado para pruebas funcionales adicionales en la base de empalme alternativo de constructos de expresión de cadena pesada genómica. Es una modalidad preferida del método descrito en la presente, mejorar aún más tal diferenciación de células de linaje B por sobreexpresión estable de factores anti-apoptóticos conocidos en la téenica, que incluyen pero no se limitan a bcl-2 o bcl-xL.

Después de la etapa (iv), se ha realizado el enriquecimiento de células huésped de vertebrado con transposición como se describe en lo anterior, opcionalmente, pueden realizarse enriquecimientos de células adicionales de acuerdo con los métodos mencionados en lo anterior (etapa (v)), hasta que las poblaciones celulares, o células individuales se aíslan expresando proteínas, incluyendo anticuerpos y fragmentos de los mismos, con propiedades funcionales y/o de unión deseadas.

La etapa (vi) del método descrito en la presente entonces se realiza para aislar la información de codificación relevante contenida en las células huésped de vertebrado transpuestas, aisladas para una propiedad funcional y/o de unión deseada.

Una modalidad útil de la etapa (vi) para la clonación y secuenciación de aislamiento de la información de codificación relevante para una proteína funcional o de unión deseada, incluyendo un anticuerpo o fragmento de anticuerpo del mismo, contenida en las células aisladas, es utilizar la amplificación genómica o por RT-PCR con pares de cebadores específicos para la información de codificación relevante comprendida en los constructos de ADN transpuestos, y para secuenciar los amplicones genómicos o de RT-PCR ya sea directamente, o después de sub-clonar en vectores de secuenciación conocidos en la téenica, por ejemplo, pero no limitados a vectores de clonación tipo TA o Gateway.

La clonación y secuenciación de la información para una proteína funcional o de unión deseada, incluyendo un anticuerpo o fragmento de unión del mismo, como se describe en el párrafo previo por amplificación genómica o de RT-PCR también puede realizarse con el vector de expresión de IgH e IgL de transposición, de modo que la región de codificación de la proteína de unión no sólo puede identificarse, sino que al mismo tiempo también puede expresarse en la transposición estable en células huésped de mamífero como se describe en la presente. Para la expresión de anticuerpos secretados esto sólo puede requerir el uso de vectores de expresión de cadena pesada de Ig que carecen de la región de codificación que abarca IgH de transmembrana.

Otra modalidad útil de la etapa (vi) es para someter las poblaciones de células enriquecidas de las etapas (iv) o (v), que muestran un fenotipo funcional o de unión deseado para la siguiente generación ("profunda") (Reddy et al . Nat. Biotech 28, 965-969 (2010)) (incorporado en la presente para referencia en su totalidad), para recuperar directamente y en una etapa de un conjunto representativo de diversos miles de secuencias para la información de codificación contenida en los constructos de ADN transpuesto. Basándose en un análisis bioinformático de la frecuencia relativa de secuencias identificadas de las poblaciones celulares enriquecidas, permite una predicción sobre la cual secuencias que codifican una proteína funcional o de unión, incluyen un anticuerpo o fragmento del mismo (Reddy et al . Nat. Biotech . 28, 965-969 (2010)) (incorporado en la presente para referencia en su totalidad). Las secuencias sobrerrepresentadas estadísticamente entonces se vuelven a sintetizar y se clonan en un vector de expresión para la expresión como proteínas recombinantes, anticuerpos o fragmentos de los mismos, para caracterizarlas funcionalmente y para sus propiedades de unión. Este método puede acelerar significativamente la identificación de secuencias relevantes dentro de una población celular enriquecida funcional y fenotípicamente, que expresa proteínas con propiedades específicas funcionales o de diana específicas.

Aún otra modalidad útil del método descrito en la presente, es utilizar expresión de proteínas en células de vertebrado mediada por transposición, incluyendo anticuerpos o fragmentos de los mismos, para la mutagénesis y optimización de proteínas deseadas, incluyendo la optimización de afinidad de anticuerpos y fragmentos de los mismos.

Esto puede lograrse al aislar los genes que codifican las proteínas, incluyendo cadenas de anticuerpos o fragmentos de los mismos, de poblaciones de células de vertebrado con transposición enriquecidas para un fenotipo funcional o de unión deseado de acuerdo con los métodos descritos en la etapa (iv), tales como pero no limitados a mediante amplificación por PCR o RT-PCR genómica bajo condiciones de mutagénesis, conocidas en la téenica. Las secuencias de mutagénesis entonces pueden volverse a clonar en vectores de transposición y después otra vez transponerse en células huésped de vertebrado, para someterlos a clasificación de acuerdo con los métodos descritos en la presente, para propiedades funcionales o de unión mejoradas.

En una modalidad útil de este procedimiento, se utilizan cebadores específicos que permiten la amplificación por PCR bajo condiciones de mutagénesis de constructos transpuestos completos, incluyendo las ITR flanqueadas.

Por este método, se genera un amplicón de PCR mutagenizado que contiene una frecuencia promedio definida de mutaciones aleatorias se genera a partir de células con transposición seleccionadas funcional o fenotípicamente. El amplicón de PCR con mutaciones (variaciones) controladas de las plantillas originales ahora pueden volverse a transponer directamente en nuevas células huésped de vertebrado, de acuerdo con modalidades preferidas descritas en los métodos aplicables en la etapa (ii).

La principal ventaja de este método sobre otros procedimientos de células de vertebrado modificadas genéticamente, es que con esta teenología no se requiere una nueva clonación que consuma el tiempo de los amplicones de PCR mutagenizados y control de calidad de consumo de tiempo de las secuencias mutagenizadas en vectores de expresión, lo cual es un requisito obligatorio en todos los demás sistemas de expresión virales o basados en plásmidos, si una secuencia de mutagénesis se somete a otro caso de estudio de clasificación.

Debido a que la transposición de ADN sólo requiere la presencia de las ITR que flanquean la región de codificación de genes de interés, los amplicones de PCR mutagenizados amplificados por PCR pueden reintroducirse directamente y volverse a transponer en nuevas células huésped de vertebrado para su expresión y clasificación para propiedades mejoradas y/o mutantes de afinidad madura.

Tomados juntos, los métodos descritos en la presente, para utilizar los TE para la modificación genética estable de células huésped de vertebrado con constructos de transposición y/o bibliotecas de ADN de transposición diversas que codifican proteínas, incluyendo anticuerpos y fragmentos de los mismos, ofrece una eficacia, flexibilidad, utilidad y velocidad incomparables para el descubrimiento y optimización de las proteínas para fenotipos óptimos funcionales o de unión deseados.

Ejemplos: Ejemplo 1: Instrucción para clonación del vector de expresión de cadena ligera de transposición PíggyBac para cadenas ligeras kappa de anticuerpo humano compatibles con la enzima transposasa PiggyBac .

Un vector de expresión de transposición para cadenas ligeras kappa de humano puede generarse por clonación las ITR casete de expresión de cadena ligera kappa de inmunoglobulina humana corriente arriba y debajo de transposón Pi ggyBa c .

Para esto, como una primera etapa, las secuencias mínimas para las ITR corriente abajo y arriba del transposón PiggyBac pueden derivarse de pXLBacII (publicado en US 7,105,343) (incorporada en la presente para referencia en su totalidad) y pueden sintetizar genes con sitios de enzimas de restricción flanqueadas para clonarse en el vector de expresión pIRES-EGFP (PT3157-5, número de orden 6064-1, Invitrogen , Carlsbad, CA, EUA) de célula de mamífero.

La secuencia de ITR PiggyBac corriente arriba con la repetición 5' terminal tiene que sintetizarse por genes con la secuencia de enzimas de restricción Muñí flanqueada, compatible con un sitio de enzima de restricción Muñí único en pIRES-EGFP, y cuatro nucleótidos aleatorios adicionales ((en letras minúsculas) que permiten la digestión de enzimas de restricción apropiadas. Esta secuencia se proporciona en Seq-IDl.

La secuencia de ITR PiggyBac corriente abajo con la repetición 3' terminal tiene que sintetizarse por genes con una secuencia de enzimas de restricción Xhol flanqueada compatible con un sitio de enzima de restricción Xhol en pIRES-EGFP, y cuatro nucleótidos aleatorios adicionales que permiten la digestión de enzimas de restricción apropiadas. Esta secuencia se proporciona en Seq-ID2. Después que la digestión de la enzima de restricción Muñí de la Seq-IDl sintetizada por genes, el fragmento de ADN puede ligarse en pIRES-EGFP linearizada por Muñí, generar pIRES-EGFP-TRl de acuerdo con métodos estándar, conocidos en la téenica. La orientación apropiada del inserto puede verificarse por digestión de enzimas de restricción de diagnóstico, y/o por secuenciación de ADN del constructo clonado (Figura 5a).

En una siguiente etapa sintetizada por genes y el fragmento Seq-ID2 de ADN digerido por Xhol, puede ligarse en pIRES-EGFP-Tl linearizado por Xhol (Figura 5a) por métodos estándar conocidos en la téenica, para generar pIRES-EGFP-T1T2, que contiene las ITR PiggyBac corriente arriba y abajo del casete de expresión IRES-EGFP (Figura 5b). La orientación adecuada del inserto puede verificarse por digestión de la enzima de restricción de diagnóstico y/o por secuenciación de ADN del constructo clonado (Figura 5b).

Para la clonación de una cadena ligera kappa de inmunoglobulina humana en el vector pIRES-EGFP-TlT2, puede sintetizarse la cadena ligera kappa de Ig humana a partir del anticuerpo D2E7 específico de anti-TNF-alfa, la cual puede recuperarse a partir de la solicitud de patente europea EP 1 285 930 A2 (incorporada en la presente para referencia en su totalidad).

La región de codificación para la cadena ligera kappa de Ig humana del anticuerpo D2E7 específico anti-TNF-alfa de humano, en el cual la región V de D2E7 se fusiona en marco a una secuencia líder Vkl-27 (ingreso Gembank: X63398.1, el cual es el miembro V-kappa de D2E7 de la familia del gen V-kapppa de la línea germinal más cercana), y en la región constante kappa de humano (ingreso Genbank: J00241) tiene la siguiente secuencia de nucleótidos, la cual se proporciona en Seq-ID3.

La secuencia de nucleótidos de Seq-ID3 se traduce en la secuencia de aminoácidos Seq-I4. El fragmento Seq-ID3 de ADN que codifica la cadena ligera kappa de Ig D2E7 puede sintetizar genes y ligarse directamente por ligadura terminada en romo en el único sitio de enzima de restricción EcoRV (el cual también es un corte romo), por métodos conocidos en la téenica, lo que resulta en el constructo pIRES-EGFP-TlT2-IgL (Figura 5b).

Seq-ID3 se ha diseñado para contener un sitio de enzima de restricción Eco47III único entre las regiones de codificación V-kappa y C-kappa (resaltadas en negritas y subrayadas), que permiten el remplazo de regiones V-kappa en este constructo contra otras regiones V-kappa o bibliotecas V-kappa utilizando una enzima de restricción única corriente arriba de la región de codificación V-kappa en el constructo, junto con Eco47III. La orientación apropiada del inserto de cadena ligera kappa puede verificarse por digestión de la enzima de restricción de diagnóstico y/o por secuenciación de ADN del constructo clonado (Figura 5b).

Toda la secuencia para el vector pIRES-EGFP-TlT2-IgL del vector de cadena ligera kappa del anticuerpo humano de transposición se proporciona en la secuencia Seq-ID5.

Secuencias denominadas en este Ejemplo 1: Seq-IDl (secuencia 5'-ITR PiggyBac de 327 pb de largo. Los sitios de enzima de restricción Muñí en cada extremo se subrayaron y escribieron impresas en negritas, las adiciones de nucleótidos al azar en los extremos se imprimieron en letras minúsculas).

Seq-ID2 (secuencia 3'-ITR PiggyBac de 264 pb. Los sitios de la enzima de restricción Xhol en cada extremo se subrayaron y escribieron en impresión en negritas, las adiciones de nucleótidos al azar en los extremos se imprimen en letras minúsculas).

Seq-ID3 (región que codifica LC kappa de Ig de 711 pb de largo del mAb D2E7 anti-TNF-alfa específico) Seq-ID4 (secuencia de 236 aminoácidos de largo del mAb D2E7 Anti-TNF-alfa específico) Seq-ID5 (secuencia de ADN de 6436 pb de largo del vector pIRES-EGFP-TlT2-IgL de expresión de LC kappa de Ig de transposición).

Ejemplo 2: Instrucciones de clonación de un vector de expresión de cadena pesada de transposición Piggybac para cadenas pesadas de anticuerpo gammal humano que abarca membrana Para clonar un vector de expresión de cadena pesada de Ig de transposición, el ORF de cadena ligera kappa de pIRES-EGFP-TlT2-IgL (Seq-ID5) necesita intercambiarse con una ORF que codifique una región de codificación de cadena pesada de IgGl completamente humana.

Para el reemplazo de la cadena ligera kappa humana en el vector pIRES-EGFP-TlT2-IGL por una cadena pesada de inmunoglobulina gamma 1 humana, puede sintetizarse la región VH del anticuerpo D2E7, la cual es específica para TNF-alfa de humano (véase: documento EP 1285 930 A2) (incorporada en la presente para referencia en su totalidad). Para esto, una secuencia líder de un miembro cercano de la familia de la región VH3 de línea germinal se fusiona en marco a la región VH de anticuerpo D2E7 (Genbank: J00228) que incluye los exones que abarcan membrana (GenBank; X52847). Para ser capaces de remplazar la cadena ligera kappa de Ig humana de pIRES-EGFP-TlT2 IgL, son necesarios los sitios de enzima de restricción Clal y Notl se encuentren presentes en los extremos 5' y 3' de la secuencia (subrayado), respectivamente. Además, cuatro nucleótidos que flanquean los sitios de enzimas de restricción (destacados en letras minúsculas en los extremos de la secuencia) permiten la digestión apropiada de enzimas de restricción del fragmento de ADN de sintetizado por genes y ligadura en la cadena principal pIRES-EGFP-TlT2 IgL linearizada por Clal-Notl, de acuerdo con métodos estándar. La secuencia que necesita sintetizarse por genes se proporciona en Sec-ID6.

A partir del codón de inicio en la posición 11 de Sec-ID6 (resaltado en impresión en negritas), esta secuencia de nucleótidos se traduce en la cadena pesada de IgGl humana del clon D2E7 específico anti-TNF-alfa (véase: EP 1285 930 A2) (incorporado en la presente para referencia), pero incluye los exones MI y M2 de transmembrana gamma 1 de humano. La traducción de la proteína de Seq-ID6 se proporciona en Seq-ID7. El fragmento de ADN de Seq-ID6 que codifica la cadena pesada gamma 1 de D2E7 entonces puede digerirse al doble por las enzimas de restricción Clal y Notl y ligarse en forma direccionada en el pIRES-EGFP-TlT2-IgL linearizado, resultando en el constructo pIRES-EGFP-TlT2-IgH (Figura 6).

Seq-ID6 también se ha diseñado para contener un sitio de enzima de restricción Eco47III único entre las regiones de codificación variable pesada en V y constante C-gamma 1 (resaltadas en negritas y subrayadas en Seq-ID7), lo que permite el remplazo de regiones de cadena pesada V en este constructo contra otras regiones de cadena pesada V o bibliotecas de cadena pesada V, utilizando una enzima de restricción única corriente arriba de la región de codificación de cadena pesada V en el constructo, junto con Eco47III. La ligadura correcta del inserto puede verificarse por digestión con enzimas de restricción de diagnóstico y/o secuenciación de ADN del constructo clonado (Figura 6).

La secuencia completa para el vector pIRES-EGFP-TlT2-IgH de cadena pesada gamma 1 de anticuerpo humano de transposición se proporciona en la secuencia Seq-ID8.

Los Ejemplos 1 y 2 proporcionan instrucciones para la clonación de vectores de expresión de transposición PiggyBac básicos para cadenas pesadas gamma 1 de humano y ligera kappa de anticuerpo humano (forma unida a membrana) y por lo tanto, para IgGl de humano de membrana de longitud completa, que puede utilizarse para la reducción de la práctica de la invención.

Secuencias denominadas en este Ejemplo 2: Seq-ID6 (fragmento de ADN de 1642 pb de largo contenido en la región de codificación para HC gamma 1 de Ig unida a membrana del mAb D2E7 anti-TNF-alfa específico).

Seq-ID7 (secuencia larga de 539 aminoácidos de HV gamma 1 de Ig unida a membrana de anticuerpo anti-TNF alfa).

Seq-ID8 (secuencia de ADN de 7341 pb del vector pIRES-EGFP-TlT2-IgH de expresión de HC de membrana de Ig gamma 1 humana de transposición PiggyBac) .

Ejemplo 3: Instrucciones de clonación del vector de expresión de cadena ligera de transposición básica para cadenas ligeras kappa de anticuerpo humano compatibles con la enzima transposasa Sleeping Beauty Para generar vectores de expresión de cadena ligera y pesada de inmunoglobulina humana contenidos en un vector de transposición independientemente en células huésped, un constructo de cadena ligera de inmunoglobulina de transposición con diferentes secuencias de repetición de terminal invertida (ITR) diferentes pueden construidas que se reconocen por la transposasa Sleeping Beauty.

Para esto, el vector pIRES-EGFP-TlT2-IgL (Seq-ID-5) de expresión de cadena ligera kappa de Ig humana puede utilizarse para remplazar las ITR 5' y 3' del sistema de transposón PiggyBac, contenido en este vector, con las ITR 5' y 3' del sistema de transposón Sleeping Beauty.

Las secuencias para 5'-ITR y 3'-ITR Sleeping Beauty reconocidas y funcionales con la transposasa Sleeping Beauty, pueden recuperarse del documento de patente US7160682B2/US2003154500A1.

La secuencia ITR Sleeping Beauty corriente arriba con la terminal de repetición 5' tiene que sintetizarse por genes con secuencias de enzimas de restricción Muñí flanqueadas, permitiendo el remplazo de la 5'-ITR PiggyBac flanqueada con Muñí en el constructo pIRES-EGFP-TlT2-IgL (Seq-ID-5) del ejemplo 1 por la secuencia 5'-ITR Sleeping Beauty. Esta secuencia se proporciona como Seq-ID14 a continuación, al final de este Ejemplo.

La secuencia ITR Sleeping beauty corriente abajo con la terminal de repetición 3' (también publicada en US7160682B1/US2003154500Al) se ha sintetizado por genes con secuencias de la enzima de restricción Xhol que permiten el remplazo de la 3'-ITR PiggyBac flanqueada por Xhol en el constructo pIRES-EGFP-TlT2 (Seq-ID-5) del ejemplo 1 por la secuencia 3'-ITR Sleeping beauty. Esta secuencia es como se proporciona en Seq-ID15 a continuación, en el extremo de este Ejemplo (los sitios de la enzima de restricción Xhol se resaltan en impresión en negritas y 4 nucleótidos al azar de flanqueo, permitiendo la digestión de la enzima de restricción apropiada del fragmento sintetizado por genes, se indica en letras minúsculas): En una primera etapa, la 5'-ITR PiggyBac flanqueada por Muñí del constructo pIRES-EGFP-TlT2-IgL (Seq-ID-5) tiene que remplazarse por la 5'-ITR Sleeping Beauty al digerir pIRES-EGFP-TlT2-IgL (Seq-ID-5) con la enzima de restricción Muñí y al ligar el fragmento sintetizado por genes digeridos por Muñí de la Seq-ID-14 en la cadena principal del vector linearizado de Muñí de pIRES-EGFP-TlT2-IgL (Seq-ID-5). La orientación correcta de 5' -ITR Sleeping Beauty puede comprobarse por digestiones de enzimas de restricción de diagnóstico y/o secuenciación de ADN. El plásmido resultante se llama pIRES-EGFP-sbTl-pbT2-IgL (Figura 8).

En una segunda etapa, la 3' -ITR PiggyBac flanqueada por Xhol del constructo aún contenido en pIRES-EGFP-sbTl-pbT2-IgL tiene que remplazarse por la 3' -ITR Sleeping Beauty al digerir pIRES-EGFP-sbTl-pbT2-IgL con la enzima de restricción Xhol y al ligar el fragmento sintetizado por genes digerido por Xhol de Seq-ID-15 en la cadena principal del vector linearizado Xhol de pIRES-EGFP-sbTl-pbT2-IgL. La orientación correcta dela 3'-ITR Sleeping Beauty puede comprobarse por digestiones de enzimas de restricción de diagnóstico y/o secuenciación de ADN. El plásmido resultante se llama pIRES-EGFP-sbTlT2-IgL (Figura 8).

Toda la secuencia del vector pIRES-EGFP-sbTlT2-IgL de expresión de LC kappa de Ig de transposición por la transposasa Sleeping Beauty se proporciona en Seq-ID-16 siguiente, en el extremo de este Ejemplo.

Secuencias denominadas en este Ejemplo 3: Seq-ID14 (fragmento de ADN de 246 pb de largo que contiene la 5'-ITR del sistema de transposón Sleeping Beauty. Los sitios de la enzima de restricción Muñí flanqueada se imprimen en negritas y subrayado).

Seq-ID15 (fragmento de ADN de 248 pb de largo que contiene la 3' -ITR del sistema de transposón Sleeping Beauty) .

Seq-ID16 (secuencia de ADN de 6339 pb de largo del vector pIRES-EGFP-sbTlT2-IgL de expresión de LC kappa de Ig de transposición Sleeping beauty).

Ejemplo 4: Clonación de vectores de transposición PiggyBac y Sleeping Beauty para IgGx humana de unión de membrana Además de las instrucciones de clonación para los vectores de expresión de IgH e IgL de transposición PiggyBac básico proporcionadas en los Ejemplos 1 y 2, y la construcción de un vector de expresión de IgL de transposición Sleeping Beauty básico proporcionado en el Ejemplo 3, clonado adicionalmente de los vectores de expresión de IgH e IgL de transposición PiggyBac y Sleeping Beauty mejorados se han realizado para un mAb CD30 anti humano quimérico y para un mAb CD19 anti-humano humanizado, para reducir la invención a la práctica.

Para esto, en una primera etapa, se han sintetizado los siguientes dos fragmentos de genes (comisionado a Genscript, Piscataway, NJ, EUA). 1.) Un fragmento de ADN de 4975 pb que contiene un casete de expresión, en el cual la expresión de una cadena pesada de IgGi de unión a membrana humana se impulsa por el promotor EFl-alfa (pares de bases 1-1335 del vector pEFl-alfa-IRES, No. de Catálogo 631970 de expresión Clontech), y en el cual la expresión de cadenas de Ig se une a la expresión EGFP mediante un sitio de entrada ribosomal interna (IRES). Las secuencias de ADN para las regiones IRES y EGFP se derivaron de pIRES-EGFP (pares de bases 1299-1884 y 1905-2621, respectivamente, del vector pIRES-EGFP de expresión Clontech (No. de Catálogo 6064-1, Life Technologies). Además, el fragmento de ADN sintetizado que contiene un intrón quimérico colocado entre la región de codificación constante de Ig y la secuencia IRES, cuya secuencia se derivó del vector de expresión en célula de mamífero pCI (pares de bases 857-989, od Promega, No. de Catálogo E1731). En el extremo 3' del casete de expresión, el fragmento sintetizado que contiene una señal de poliadenilación de hormona de crecimiento de bovino (BGH-polyA), cuya secuencia se derivó del vector de expresión pCDNA3.1-hygro(+) (pares de bases 1021-1235 de Invitrogen-Life Technologies, No. de Catálogo V870-20). El casete de expresión se flanqueó corriente arriba y abajo por las ITR de transposón PiggyBac ya descritas en Seq-IDl y Seq-ID2 aún más en lo anterior.

Un mapa de los elementos y su disposición en el fragmento de ADN sintetizado por genes se proporciona en la Figura 10, incluyendo sitios de enzimas de restricción únicos agregados adicionalmente que puede utilizarse para escindir o reemplazar cualquiera de los elementos funcionales del casete de expresión.

La secuencia del fragmento sintetizado por genes de 4975 pb de largo se proporciona como la Sqe-ID20 siguiente, al final de este Ejemplo.

Debe observarse aquí que el casete de expresión sintetizado por genes para cadenas de IgH humana proporcionadas en Seq-ID20, a propósito, no contienen aún la región de codificación para un dominio VH, de modo que el constructo puede utilizarse para la inserción de cualquier región de codificación VH deseado y/o biblioteca génica de codificación de VH utilizando los sitios NoTi y Nhel de enzimas de restricción únicos. Por lo tanto, este constructo se diseña en el casete de expresión de HC de Ig gamma 1 "vacío". 2.) Para proporcionar una cadena principal de plásmido para el casete de expresión de transposición de Seq-ID20, un fragmento de ADN de 2774 pb de largo se ha sintetizado por genes (realizado por Genscript, Piscataway, NJ, EUA) que contiene un ColEl ori y un gen de resistencia a ampicilina. La información de secuencia de estos componentes de cadena principal de plásmidos se derivan de la cadena principal del plásmido del vector pCl de expresión (Promega, No. de Catálogo E1731). El fragmento de genes sintetizados contiene adicionalmente las ITR 3' y 5' del transposón Sleeping Beauty, ya descrito en Seq-ID14 y Seq-ID15, respectivamente. Este fragmento necesita hacerse circular y podría propagarse en E. coli como un plásmido autónomo, debido a la presencia de los genes ColEl y el gen de resistencia a ampicilina.

Un mapa de los elementos y su disposición en el fragmento de ADN sintetizado por genes se proporciona en la Figura 10, incluyendo la posición de sitios de enzimas de restricción únicos agregados que pueden utilizarse para ejercer o remplazar cualquiera de los elementos funcionales del vector de expresión.

La secuencia del fragmento sintetizado por genes de 2774 pb se proporciona como Seq-ID21 a continuación al final de este Ejemplo: Estos dos fragmentos de genes permitieron la construcción de los vectores de transposición PiggyBac y Sleeping Beauty al ligar fragmentos de estos vectores, después de la digestión con enzimas de restricción diferentes, seguidos por ligadura, como sigue: El vector de transposición PiggyBac se clonó al ligar fragmentos de EcoRI-Clal de Seq-ID20 y Seq-ID21, de modo que el constructo resultante contenga todo el casete de expresión flanqueado de ITR PiggyBac, y la cadena principal que contiene ColEl-amp sin las ITR Sleeping Beauty de Seq-ID21. AL contrario, la ligadura de fragmentos Xbal-Mlul de Seq-ID20 y Seq-ID21 que resultaron en la ligadura del casete de expresión sin las ITR PiggyBac en la cadena principal de plásmido linearizado de Seq-ID21 que aún contiene las ITR Sleeping Beauty. Los plásmidos minipreparados que resultaron de las dos ligaduras se analizaron por digestiones de enzima de restricción de diagnóstico utilizando una mezcla de Xhol-BamHI y en adición con las enzimas de restricción Pvul, para identificar los plásmidos ligados correctamente. Un clon de ADN seleccionado para cada ligadura se transformó de nuevo en E. coli para generar maxipreparaciones de ADN, las cuales se verificaron por secuenciación de ADN utilizando cebadores de secuenciación permitiendo la secuenciación de toda la secuencia de plásmidos.

Todas las secuencias de los vectores de transposición PiggyBac y Sleeping beauty (que contienen el casete de expresión de HC gamma 1 humana "vacío") generado como se describe en lo anterior y verificado por secuenciación de ADN se proporciona como Seq-ID22 (vector de transposición PiggyBac) u Seq-ID23 (vector de transposición Sleeping Beauty) siguiente, al final de este Ejemplo.

Las regiones de codificación VH y VL del anticuerpo brentuximab CD30 anti-humano quimérico (clon AclO) podría recuperarse de las secuencias 1 y 9 de la solicitud de patente US2008213289A1, y se proporcionan a continuación como Seq-ID24 y Seq-ID25, respectivamente.

Las regiones de codificación VH y VL del anticuerpo hBU12 CD19 anti-humano humanizado se recuperaron del documento de patente UD 8,242,252 B2 como variantes de secuencia HF y LG, respectivamente, y se proporcionan en Seq-ID26 y Seq-ID27 además a continuación, al final del Ejemplo.

Para permitir la construcción de los vectores de expresión de IgHC anti-CD30 y anti-CVD19 de transposición PiggyBac y Sleeping Beauty, los fragmentos de ADN de los dominios VH se diseñaron para tener sitios de enzimas de restricción Nhel y Notl flanqueados. La secuencia de nucleótidos que codifica el anticuerpo brentuximab anti-CD30 (clon AclO) se ha modificado adicionalmente para contener además una secuencia líder para la expresión en células de mamífero. Las secuencias de ADN de los fragmentos NotI_NheI que codifican los mAbs anti-CD30 y anti-CD19 de VH se proporcionan en Seq-ID28 y Seq-ID29 al final de este Ejemplo. Los fragmentos de ADN se han sintetizado por genes por GeneArt, Resenburg, Alemania (los sitios Notl y Nhel se encuentran subrayados).

Para generar los vectores de expresión de cadena de IgH anti-CD30 y anti-CD19 que se transponen con cualquiera de la transposasa PiggyBac o Sleeping Beauty, los fragmentos digeridos Notl-Nhel de Seq-Id28 y Seq-ID29 se ligaron en los vectores linearizados Notl-Nhel descritos en Seq-ID22 o Seq-ID23, respectivamente. Esto resulta en la generación de cuatro vectores que contienen una cadena pesada (HC) totalmente funcional del mAb brentuximab anti-CD30 (clon AclO) y del mAb hBU12 anti-CD19 y se diseñaron los constructos: pPB-EGFP-HC-AclO, pPB-EGFP-HC-hBU12, pSB-EGFP-HC-AclO, y pSB-EGFP-HC-hUB12 y sus mapas de vector se proporcionan en la Figura 11. Estos vectores se han diseñado específicamente para permitir la expresión en superficie de cadenas pesadas, y después de la co-expresión de las cadenas ligeras, la expresión de IgG de superficie. Sin embargo, una omisión simple de la región de codificación de para la región que abarca la membrana de las cadenas pesadas de Ig teh puede resultar en los vectores de expresión de transposición de la IgG secretada.

Para generar los vectores de expresión que pueden transponerse con cualquiera de la transposasa PiggyBac o Sleeping Beauty, los genes de región constante de IgH de los vectores descritos en Seq-ID22 y Seq-ID23 necesarias para remplazarse con las regiones de codificación de cadena de IgL de los anticuerpos anti-CD30 y anti-CD19. Esto puede lograrse al sintetizar genes de fragmentos de genes que contienen las regiones de codificación VL como se describe en Seq-ID25 y Seq-ID27 fusionados en marco a una región de codificación de cadena ligera kappa constante humana, con una secuencia líder en el extremo 5' y flanqueada por los sitios de clonación Notl-BstBI que permiten la ligadura del fragmento dirigido Notl-BstBI en los vectores linearizados Notl-BstBI descritos en Seq-ID22 y Seq-ID23, remplazando de este modo a región de codificación constante de IgH de Seq-ID22 y Seq-ID23 con las regiones de codificación de IgL del mAb anti-CD30 AclO y mAb hBU12 anti-CD19.

Los fragmentos de genes que contienen las regiones de codificación de IgL del mAb anti-CD30 AclO y mAb hBU12 anti-CD19, con secuencia líder y flanqueados por los sitios de clonación Notl-BstBI se describen en Seq-ID30 y Seq-ID a continuación, al final del Ejemplo. Esta síntesis de genes a partir de estos fragmentos de ADN se realizó por Genscript (Piscataway, NJ, EUA).

Para general los vectores de expresión de cadena de IgL anti-CD30 y anti-CD19 que pueden transponerse con cualquiera de la transposasa PiggyBac o Sleeping Beauty, los fragmentos digeridos de Notl-BstBI de Seq-ID30 y Seq-ID31 se han ligado a los vectores linearizados de Notl-BstBI descritos en Seq-ID22 o Seq-ID23. Los cuatro vectores resultantes se llamaron: pPB-EGFP-LC-AclO, pPB-EGFP-LC-hBU12, pSB-EGFP-LC-AclO, y pSB-EGFP-LC-hBU12 y sus mapas de vector se proporcionan en la Figura 11.

Las secuencias completas de los constructos de IgL e IgH anti-CD30 y anti-CD19 de PiggyBac y Sleeping beauty (ocho combinaciones) se proporcionan en Seq-ID32 (pPB-EGFP-HC-AclO), Seq-ID33 (pPB-RGFP-HC-hUB12), en Seq-ID38 (pSB-EGFP-LC-AclO) y Seq-ID39 (pSB-EGFP-hBU12) siguientes, al final de este Ejemplo.

Secuencias denominadas en este Ejemplo: Seq-ID20 (secuencia de ADN que contiene 4975 pb que contiene un casete de expresión flanqueado por ITR PiggyBac para cadenas pesadas de Ig gamma 1 humana que abarca la membrana) Seq-ID21 (secuencia de ADN de 2774 pb de largo que contiene los componentes ColEl y de resistencia a ampicilina de cadena principal de vector flanqueados por las ITR 5' y 3' de Sleeping Beauty) Seq-ID22 (secuencia de 7242 pb de largo del vector de HC gamma 1 humana "vacío" de transposición PiggyBac) Seq-ID23 (secuencia de 7146 pb de largo del vector de HC gamma 1 humana "vacío" de transposición Sleeping Beauty) Seq-ID24 (región de codificación VH de 351 pb de largo del anticuerpo brentuximab CD30 anti-humano) Seq-ID25 (región de codificación VL de 333 pb de largo del anticuerpo brentuximab CD30 anti-humano) Seq-ID26 (región de codificación VH de 417 pb de largo del mAb huB12 CD19 anti-humano) Seq-ID27 (región de codificación VL de 375 pb de largo del mAb huB12 CD19 anti-humano) Seq-ID28 (fragmento de ADN de 423 pb de largo, que contiene la región de codificación VH flanqueada por Notl-Nhel del dominio VH del mAb brentuximab CD30 anti-humano) Seq-ID29 (fragmento de ADN de 432 pb de largo, que contiene la región de codificación VH flanqueada por Notl-Nhel del dominio VH del mAb hBU12 CD19 anti-humano) Seq-ID30 (fragmento de ADN de 733 pb que contiene la región de codificación de IgL del mAb anti-CD30 AclO y flanqueada por los sitios de enzimas de restricción Notl y BstBI) Seq-ID31 (fragmento de ADN de 718 pb que contiene la región de codificación de IgL del mAb hUB12 anti-CD19 y flanqueada por los sitios de enzimas restricción Notl y BstBI) Seq-ID32 (secuencia de 7645 pb de pPB-EGFP-HC-AclO) Seq-ID33 (secuencia de 7654 pb de pPB-EGFP-HC-hBU12) Seq-ID34 (secuencia de 7549 pb de pSB-EGFP-HC-AclO) Seq-ID35 (secuencia de 7659 pb de pSB-EGFP-HC-hUB12) Seq-ID36 (secuencia de 6742 pb de largo de pPB-EGFP-HC-AclO) Seq-ID37 (secuencia de 6727 pb de largo de pPB-EGFP-HC-hBUl2) Seq-ID38 (secuencia de 6646 pb de largo de pSB- EGFP-HC-AclO) Seq-ID39 (secuencia de 6631 pb de largo de pSB-EGFP-HC-hUB12) Ejemplo 5: Instrucciones para clonación de un vector de expresión de la transposasa PiggyBac El ORF de la enzima transposasa PiggyBac puede recuperarse de la Patente de los Estados Unidos US 7,105,343 B1 (incorporada en la presente para referencia en su totalidad) y se proporciona en la Seq-IDll siguiente al final de este ejemplo. La secuencia de ADN de Seq-IDll se traduce en la Seq-ID12 de aminoácidos que también se proporciona al final de este Ejemplo.

Para generar un vector de expresión en células de vertebrado para la enzima transposasa PiggyBac, este ORF puede sintetizarse por genes y clonarse como un ADN terminado en romo en el único sitio EcoRV de enzima de restricción cortado en romo en el vector pCNA3.1-hygro(+) de expresión en células de vertebrado estándar (No. de catálogo V870-20, Invitrogen, Carlsbad, CA; EUA), por métodos conocidos en la téenica. La ligadura corregida del ORF de PiggyBac, en relación con el promotor pCDNA3 puede verificarse por digestión de la enzima de restricción de diagnóstico y secuenciación de ADN.

La secuencia del constructo pCDNA3.1-hygro(+) de expresión PiggyBac se proporciona como la Seq-ID13 siguiente al final de este Ejemplo.

Secuencias denominadas en este Ejemplo 5: Seq-IDll (ORF de transposasa PiggyBac) Seq-ID12 (secuencia de aminoácidos de transposasa PiggyBac) Seq-ID13 (vector pCDNA3 .1-hygro(+) -PiggyBac de expresión) Ejemplo 6: Instrucciones para clonación de un vector de expresión de transposasa Sleeping Beauty El marco de lectura abierta (ORF) de la enzima transposasa Sleeping Beauty puede encontrarse en la patente de referencia US7160682B1/US2003154500A1. La secuencia se proporciona en la Seq-ID7 siguiente al final de este Ejemplo. Esta secuencia de ADN de Seq-ID7 se traduce la secuencia de aminoácidos de Seq-ID18, también proporcionada al final de este ejemplo, además a continuación.

Para generar un vector de expresión de célula de vertebrado para la enzima transposasa Sleeping Beauty, este ORF puede sintetizarse por genes y clonarse como un ADN de extremo romo en el único sitio EcoRV de enzima de restricción de corte romo en el vector pCDNA3.1-hygro(+) de expresión de células de vertebrado (No. de catálogo V870-20, Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA), por métodos conocidos en la téenica. La ligadura correcta del ORF Sleeping Beauty, en relación con el promotor pCDNA3 puede verificarse por la digestión de la enzima de restricción de diagnóstico y/o por secuenciación de ADN del constructo pCDNA3.1-hygro(+) de expresión de Sleeping Beauty (Figura 9).

La secuencia del constructo pCDNA3.1-hygro(+) de expresión se proporciona en Seq-ID19 a continuación al final de este Ejemplo.

La construcción de un vector de expresión Sleeping Beauty se realizó como se describe en la presente y el diseño del vector se verificó por digestión de la enzima de restricción de diagnóstico y secuenciación de ADN. Las regiones de codificación para las enzimas transposasa PiggyBac y Sleeping Beauty se han sintetizado por genes por Genscript, Piscataway, NJ. Con los ocho vectores de expresión de IgH e IgL de transposición diferentes para las transposasas de PiggyBac y Sleeping Beauty, y los vectores pCDNA3.1-hygro(+) de expresión para las enzimas transposasa PiggyBac y Sleeping Beauty, todos los vectores que se han generado permiten la expresión de anticuerpos anti-CD30 y anti-CD19 en la superficie celular de células de mamífero.

Secuencias denominadas en este Ejemplo 6: Seq-ID17 (ORF de la enzima transposasa Sleeping Beauty) Seq-ID18 (secuencia de aminoácidos de la transposasa Sleeping Beauty) Seq-ID19 (secuencia de ADN del vector pCDNA3.1-hygro(+) de expresión-SB de Sleeping Beauty) Ejemplo 7: Generación de células pre-B de murino que expresan de forma estable vectores de expresión transpuestos de forma estable de IgG de humano unidos a la membrana Para demostrar los anticuerpos de IgG de humano de expresión estable en células de mamífero, los constructos de expresión de IgH e IgL humana de transposición se han transfectado en la línea 63-12 de células pro-B transformada por el virus de leucemia de murino de Abelson (A-MuLV), derivada originalmente de ratones deficientes RAG-2 (Shinkai et al. (1992) Cell 68, 855-867) y por lo tanto, incapaces de iniciar la recombinación V(D)J. Esta línea de células huésped representa un linaje de células B del tipo celular de linfocitos que expresa todos los componentes celulares para la expresión óptima del anticuerpo de unión a la membrana, incluyendo los cofactores de Ig-alfa (CD79a o mb-1) e Ig-beta (CD79b o B29) del receptor de célula B que interactúan con los aminoácidos que abarcan la transmembrana de inmunoglobulina de unión a la membrana. Por lo tanto, estas moléculas de IgG de anclaje óptimo a células con una región que abarca la transmembrana en las células 63-12 de membrana de superficie celular se hicieron crecer en un cultivo estático en suspensión utilizando un medio de IMDM complementado con FCS al 2%, Primatone™ RL-UF al 0.03% (Sheffiel Bioscience), L-glutamina 2 mM, 2-mercaptoetanol 50mM a 37°C en una incubadora de humidificación en una atmósfera de CO2 al 10%. Para la co-transfección de los vectores de expresión de IgH e IgL de transposición (Ejemplo 4) con un vector de expresión de transposón (Ejemplos 5 ó 6), las células se hicieron pasar 24 horas antes de la transfección y se sembraron a una densidad de 5xl05 células/ml, para dejar que las células entraran en una fase de crecimiento logarítmico hasta el punto de tiempo de la transfección.

El día de la transfección, las células 63-12 se cosecharon por centrifugación y resuspendieron en un medio RPMI 640 sin ningún complemento o suero a una densidad de 5xl06 células/ml. Se transíectaron 400 ml de esta suspensión celular (que corresponde a 2xl06 células) en cubetas de electroporación de 0.4 cm (BioRad No. de orden 165-2081) y se mezclaron con 400m1 de medio RPMI 640 que contuvo el plásmido de ADN deseado (o una mezcla de plásmidos). Las células entonces se transíectaron utilizando el Gene Pulser II de BioRad en ajustes de 950 mR/300 V y se incubaron por 5 minutos a temperatura ambiente después de un solo pulso de electroporación. Después de esto, las células se transfectaron en 5 mi de n medio de crecimiento a base de IMDM y las células se centrifugaron una vez, para retirar los residuos celulares y de ADN de la electroporación, antes que las células se transfretarán en un medio de crecimiento basado en IMDM para la recuperación y expresión de proteínas a partir de los plásmidos transfectados.

Los ajustes de electroporación han sido determinados como las condiciones de transfección más óptimas de una línea 63-12 de células pro-B transformadas por A-MuLV que resultaron rutinariamente en eficacias de transfección transitoria que oscilaron entre 30-40%. El resultado de tal transfección por electroporación se documentó en los análisis FACS representados en la Figura 12, donde los controles de transfección, dos días después de la post-transfección, se representan en los paneles de la columna izquierda. El control negativo (etiquetado NC) que se sometió a electroporación simulada sin ADN, como se esperaba, no mostró ningunas células verde fluorescente, mientras que el control de la transfección que se transfectó con 15 del plásmido pEGFP-N3 (Clontech, No. de orden 6080-1), mostró que 38.8% de las células se transíectaron de modo transitorio, como se detectó por la proteína verde fluorescente intensificada expresado por las células (véase células en el cuadrante derecho inferior). Como se esperaba, los controles de la transfección no mostraron ninguna señal de Ig-kappa, debido a que ninguno de los controles de la transfección se transfectó con un constructo de expresión de Ig.

Para a transposición de los vectores de expresión de IgH e IgL, las células 63-12 también se transfectaron por electroporación con una mezcla de 5 mg cada una de un vector de expresión de IgH de transposición, 5 pg e un vector de IgL de transposición, y 5 pg de un vector de expresión que permite la expresión de una transposasa que interviene en la transposición del vector de expresión de IgH e IgL. El resultado de esta transfección también se muestra en la Figura 12.

La expresión de la IgG humana en la superficie de las células se detectó por un anticuerpo biotinilado específico de cadena ligera kappa anti-humano (Affy etrix, eboscience, No. de orden 139970-82) detectado con estreptadivina-aloficocianina (strep-APC) (Affymetrix, eboscience, No. de orden 17-4317-82), y se muestra en el eje Y de los gráficos por puntos FACS. Como puede observarse en la Figura 10, las mediciones representadas en la segunda columna de la izquierda muestran el análisis de células transíectadas con los vectores de expresión IgH+IgL+transposasa dos días después de la electroporación (etiquetadas "d2 post TF"). El análisis FACS después de dos días de transfección mostró que entre 1.8% y 2.8% de las células expresaron IgH+IgL humana en la superficie celular, debido a que la expresión IgL en la superficie celular sólo puede detectarse si las cadenas de IgH se co-expresan en las células de modo que una IgG completa pueda expresarse en la superficie de las células.

A partir de estos datos, puede inferirse que si aproximadamente 38% de las células se transfectan de modo transitorio, aproximadamente 5-7.5% de estas células se habrán co-transfectado con ambos vectores de expresión de IgH e IgL. A partir de este experimento, se concluye que los constructos de expresión de IgH e IgL de transposición se perite la expresión de IgG humana de alto nivel en la superficie de celulas pro-B de murino trasformadas por A-MuLV, la cual es comparable con las señales de IgG de superficie obtenidas por tinción de linfocitos B periféricos de humano con los mismos reactivos de tinción de anticuerpos (datos no mostrados).

Como se esperaba, las células mostraron una expresión de IgG que también visualizó la expresión de RGFP, debido a que la expresión de RGFP se acopló de forma transcripcional a la expresión de IgH o IgL mediante secuencias de IRES. Sin embargo, la expresión de EGFP fue significativamente menor cuando se compara con la expresión de EGFP a partir del plásmido de control pEGFP-N3, el cual se esperaba que se accionara directamente como la expresión de EGFP en pEGFP-N3 por un promotor constitutivo fuerte, mientras que la expresión de RGFP en los vectores de expresión de IgH e IgL de transposición se efectuó por el acoplamiento de la transcripción a la región de codificación de IgH e IgL utilizando un sitio de entrada ribosomal interno (IRES). Sin embargo, como se esperaba, las células que visualizaron una mayor expresión de IgG también visualizaron mayores señales de RGFP (llevando a una población de Ig-kappa+/EGFP+ ligeramente diagonal), lo cual demostró claramente que se acoplaron ambos niveles de expresión.

Cuando las células se analizaron sin clasificación celular después de una semana de transíección, no se detectó en gran medida la señal de EGFP en las transfecciones de control de pEGFP-N3 (datos no mostrados), mostrando que las células no hacen constructos de expresión integrados de forma estables en cualquier frecuencia significativa. En contraste, una población doble positiva de IgG-EGFP de aproximadamente 1-2% menor se mantuvo en células que se co-trasfectaron con vectores de IgH e IgL de transposición junto con un vector de expresión de transposición, que ya indica que aproximadamente 3-6% de las células transfectadas de forma transitoria en células integran de forma estable simultánea los vectores de expresión de IgH e IgL en su genoma (datos no mostrados).

Para enriquecerse de estas células transpuestas de forma estable, la cadena ligera de Ig-kappa y las células EGFP doble positivas se han clasificado en FACS en el día 2 después de la transfección, como se indica por las puertas de clasificación (rectángulos negros en los gráficos por puntos FACS de la segunda columna de la izquierda). Cada 5,000 células que cayeron en esta puerta se clasificaron a partir de las transposiciones Piggybac con IgH e IgL del MAb anti-CD30 AclO (hilera superior), y del mAb hBU12 anti-CD19 (hilera a la mitad)m y 3,000 células se clasificaron de la transposición Sleeping Beauty con IgH e IgL del MAb anti-CD30 AclO (hilera inferior), como se indica en la Figura 12.

Las células clasificadas por FACS se expandieron por una semana (representando el día 9 después de la transfección), y se reanalizaron otra vez para la expresión de IgG de superficie por detección de IgG con un anticuerpo de cadena ligera anti-kappa como se describe en lo anterior. Como puede observarse en la Figura 10 (segunda columna de la derecha), mientras que estas células, como se esperaba, también fueron positivas a EGFP. Esto demuestra que un porcentaje significativo de IgH e IgL de forma transitoria co-transfectaron células de forma estable manteniendo la expresión de IgG. Las transposiciones mediadas por PiggyBac en esta configuración experimental parecieron haber ocurrido con alrededor de una eficiencia 6-10 veces mayor que las transposiciones mediadas por Sleeping Beauty.

Un acoplamiento de conclusiones adicionales puede extraerse a partir de este experimento de transposición: en primer lugar, de las células de IgG/EGFP doble positivas clasificadas en el día dos después de la transfección, cerca del 75% de las células permanecieron EGFP+ de forma estable en las transposiciones PiggyBac careciendo de una expresión de superficie de IgG. Estas células fue más probable que se transpusieran de forma estable en sólo uno de los dos vectores de expresión de IgH e IgL de transposición, lo que no permitió la expresión de IgG en la superficie, pero fue suficiente para hacer células EGFP positivas. Esto también significa que de aproximadamente 38% de las células transíectadas originalmente de forma transitoria, al menos 5% se transpusieron de forma estable con al menos un vector de expresión de Ig de transposición.

Los números de celulas transpuestas de forma estable para la transposición Sleeping Beauty fue menor que aquellas de la transposición PiggyBac , y después de un primer estudio de caso de clasificación FACS de células co-transfectadas de IgH-IgL+transposasa, sólo se obtuvo alrededor de 5% de células que expresan IgG de forma estable. Sin embargo, si también se consideran células EGFP positivas de forma estable, alrededor de 9% de células transpuestas de forma estables obtenidas después del primer ciclo de clasificación por FACS utilizó la transposasa Sleeping Beauty.

Cuando estas células transpuestas de IgH/IgL se clasificaron por FACS otra vez, se obtuvo más de 99% de células que expresaron IgG de forma estable (Figura 12, columna más a la derecha), y el fenotipo de expresión estable se mantuvo por más de cuatro semanas, sin ningún cambio en el porcentaje de células de IgG+ (datos no mostrados). Por lo tanto, se concluye que los vectores de expresión de transposición para las cadenas de IgH e IgL humanas como se describe en esta invención son funcionales y pueden integrarse de forma estable en un genoma de célula huésped de mamífero con alta eficiencia.

Ejemplo 8: Enriquecimiento de células que expresan IgG transpuesta de forma estable e IgG mediante la unión específica al antígeno Para demostrar que las células pro-B expresan IgG humana, se generaron por transposición de vectores de expresión de IgH e IgL como se describe en el Ejemplo 7 anterior, pueden utilizarse para el aislamiento de células específicas al antígeno, al reducir las cantidades de la línea 63-12 de células pro-B que expresan el mAb anti-CD30 (véase dl6, clasificado 2x, 63-12+PB-AclO, de la Figura 12) se mezclaron con la línea 63-12 de células pro-B que expresan el mAb anti-CD19 (véase dl6, clasificado 2x, 63-12+PB-hBU12, de la Figura 12) en relaciones de 102, 103, 104, 105, 106 (véase la Figura 13). Se tiñeron un total de 107 células en 1 mi de PBS complementado con FCS al 2% por 30 minutos en hielo, con los siguientes reactivos: 0.1 mg de CD30 humano recombinante (Sino Biologial Inc., Beiging, China. No. de orden 10777-H08H) etiquetado 6x con His, y - 10 ml de anticuerpo etiquetado con Ig-kappa-APC anti-humana de ratón (Life Technologies, Invitrogen, No. de orden MH10515).

Después que se retiraron por centrifugación y lavado en PBS, FCS al 2% estos reactivos primarios de las células, se realizó una tinción secundaria en 1 mi de PBS complementado con FCS al 2% por 30 minutos en hielo con: 0.1 mg de anticuerpo biotinilado anti-His-etiqueta (IBA Sciences, Góttingen, Alemania, No. de orden 2-1590-001) - después que se retiró por centrifugación y lavado este reactivo secundario de las células con FCS al 2%, se detectó la combinación CD30-6cHis/anti-His-etiqueta-bio al teñirla en 1 mi de PBS, FCS al 2% por 30 minutos en hielo con: - Reactivo de estreptavidina-ficoeritrina (ste-PE) diluida (Affymetrix ebioscience, No. de orden 12-4317-87).1/500.

Después de la tinción de FACS final, las células se lavaron otra vez dos veces en PBS enfriado con hielo, FCS al 2%, y luego se resuspendieron en 1.0 mi de PBS, FCS al 2%, después del cual las células se sometieron a un análisis de FACS y clasificación celular de células positivas a Ig-kappaLC/CD30 (véase Figura 13).

Como puede observarse de los resultados obtenidos en la Figura 13, es detectable una población específica de IgG positiva y células reactivas a CD30 en el cuadrante superior derecho de los gráficos de FACS del control positivo, y como se esperaba, la intensidad de la señal de FACS para la IgG de superficie (detectada mediante anti-Ig-kappa-APC) se correlaciona con la señal de FACS de anti-CD30 que resulta en un patrón de tinción diagonal de esta población.

En las mezclas de células que expresan mAb anti-CD30 con células que expresan mAb anti-CD19, el nivel de dilución de las células que expresan mAb anti-CD30 se refleja muy bien por la frecuencia de las células específicas de antígeno CD30 en el cuadrante superior derecho y la puerta de clasificación de FACS de severidad definidas (cuadro negro en el cuadrante superior derecho). Los eventos muy raros correspondieron a células positivas a CD30 reactivas/IgG después de la dilución incrementada de las células específicas (1:10,000, 1:100,000, 1:1,000,000) que son fuertemente visibles en las impresiones de los gráficos por puntos de FACS, inclusi si las cantidades incrementadas de eventos se adquirieron, como se indica en lo anterior en los gráficos individuales por puntos. Sin embargo, la frecuencia de células detectables CD30 se correlacionan bien con su frecuencia como se esperaba del factor de dilución. A partir de este resultado se concluye que la visualización y detección específica de antígeno de las células que expresan un anticuerpo específico de antígeno por medio de la transposición mediada por la expresión de IgG humana en la superficie de células de mamífero y de células pro-B como se muestra aquí, puede realizarse de forma confiable.

La hilera inferior de los gráficos por puntos FACS en la Figura 13 muestra el reanálisis de células clasificadas por FACS de diferentes experimentos de dilución en pico diferentes. Como puede observarse de los resultados, el reanálisis de las células clasificadas por FACS de 1:100, 1:1,000 y 1:10,000 de dilución resultaron en casi la misma población celular que fue enriquecida, lo cual mostró aproximadamente 90-95% de células reactivas al antígeno, las células clasificadas por FACS por la dilución 1:100,000 contuvieron una población adicional pequeña que no cayó en la puerta de aquellas IgG positivas/CD30 reactivas, pero también en este experimento, aproximadamente 85% de las células clasificadas por FACS fueron células que expresaron IgG específicas al antígeno. De forma sorpresiva, la mayor pureza de las células con respecto a la reactividad a CD30 y expresión de IgG resultó de la clasificación de FACS, en la cual sólo 1 en 1,000,000 fue específica al antígeno CD30 y donde sólo se clasificaron aproximadamente 14 células. Esto sólo puede explicar que sus efectos casi clónales necesitan considerarse de modo que la clasificación no sea una mezcla de células reactivas a CD30-positivas a IgG, sino que a su vez pocos clones puedan representar todos los clones de células reactivas a CD30-positivas a IgG.

Sin embargo, los resultados de la tinción mediada por antígeno específico e identificación de células que expresan el anticuerpo específico de antígeno y su enriquecimiento exitoso mediante clasificación celular mediada por FACS claramente demuestra la viabilidad del metodo descrito en la presente para el aislamiento de células que expresan anticuerpos con un fenotipo de unión deseado.

Ejemplo 9: Instrucciones para la generación y el uso de los vectores de expresión IgH transportables que pueden utilizarse para el intercambio de la membrana unida a la expresión del anticuerpo secretado Los vectores de expresión Ig transportables descritos en los Ejemplos 1 a 4 pueden sólo permitir la expresión del IgG humano en la superficie de las células de mamífero, de modo que el fenotipo de unión de los anticuerpos pueden fácilmente identificarse y enriquecerse por medio del enlace del antígeno a las células, por medio de los FACS, como se ejemplifica en el Ejemplo 8 o por la selección celular o métodos de enriquecimiento por lote (por ejemplo clasificación de células magnéticas de cuentecillas activadas, MACS). Sin embargo, algunas veces se desea analizar rápidamente las propiedades de unión del antígeno de un anticuerpo dado desplegado por una célula también como un anticuerpo secretado en solución. Mientras es posible amplificar PCR, las regiones de codificación VH y VL relevantes de un clon celular específico de antígeno en los vectores de expresión para la expresión IgG secretada, este objeto se consume a tiempo y es intensivo en labor.

En la descripción detallada de la invención se describe ya que los constructores de expresión IgH transportables pueden emplearse que aprovechan la "conmutación" natural desde el enlace de membrana en la expresión del anticuerpo secretado, basada en el empalme alterno de los constructores de cadena IgH de genotipo.

Esta conmutación del enlace de membrana en la expresión del anticuerpo secretado puede lograrse como sigue: En lugar de un casete de expresión basado en ADNc para las cadenas pesadas Ig-gammal humana, la organización genómica original del sitio del gen Ig-gammal humana necesita clonarse en los vectores de expresión IgH como se describe antes en el Ejemplo 4. La secuencia del sitio del gen de inmunoglobulina completo en la configuración de línea germinal puede recuperarse del NT_010168 contiguo del proyecto de genoma humano, que cubre el sitio de cadena pesada Ig humana ubicada en el cromosoma 14. El sitio de gen de cadena pesada Ig-gammal humana inicia a partir del primer aminoácido del dominio CH1 en el extremo 5' corriente abajo 500 pb del último codón de detención del segundo exón que abarca la membrana gammal-M2 en el extremo 3' tiene una longitud de 5807 pares de base y despliega sitios Nhel o BstBI no internos. Por lo tanto, este sitio de gen puede sintetizarse con flanqueo de sitios Nhel y BstBI, que pueden utilizarse para la clonación direccional. Tal fragmento sintetizado de gen puede entonces utilizarse directamente para colocar la región de codificación de ADNc de la región de codificación constante-gammal unidad por la membrana en pPB-EGFP-HC-AclO (Seq-ID32).

En la secuencia de ADN de un fragmento Ig-gammal humana de genotipo a sintetizarse se proporciona en la Seq-ID40 siguiente, al final de este ejemplo (los sitios 5'-Nhel y 3'-BstBI se resaltan en letras en negrita).

La organización del exón y los intrones del sitio de línea germinal de cadena pesada Ig-gammal humana, que incluye sus exones MI y M2 que abarcan la membrana se representan en la Figura 14. Las regiones de codificación y no codificación en este fragmento de gen genómico a la izquierda en su configuración genómica original se superponen para contener todos los elementos cis-regulatorios requeridos para permitir el empalme alterno de un ARNm Ig-gammal que depende de la etapa de diferenciación de las células de unión-B en las cuales el ARNm se procesa (Peterson et al. (2002) Mol. Cell. Biol. 22, 5606-5615). La clonación del fragmento Seq-ID40 en un vector de expresión HC Ig-gammal transportable puede realizarse al reemplazar la región de codificación C-gammal en pPB-EGFP-HC-AclO al digerir pPB-EGFP-HC-AclO con las enzimas de restricción Nhel y BstBI y ligar el fragmento genómico de Seq-ID40 como un fragmento digerido Nhcl-BstBI en el fragmento del vector linearizado NhcI-BstBI de pPB-EGFP-HC-AclO.

Los resultados en esta ligadura se muestran esquemáticamente en la Figura 14, y la secuencia del constructo se proporciona en la Seq-ID41 siguiente al final de este Ejemplo.

Las células pro-B transformadas con A-MuLV, como las células 63-12, representan una línea celular adecuada para explotar el mecanismo natural de empalme alternativo de un constructor de HC de Ig-gammal genómico, cuando es posible efectuar la diferenciación fenotípica de estas células a más células de linaje B maduras, si la actividad de transformación de la Abl-cinasa se inhibe. Esto puede lograrse específicamente con el inhibidor de Abl-cinasa Gleevec (también conocido como Imatinib, o ST1-571) (Muljo y Schlissel (2003) Nature Immunol.4, 31-37). Sin embargo, si las células pro-B transformadas con A-MuLV se tratan con Gleevec, no solamente inicia la diferencia fenotípica a más etapas de linaje B maduras, sino que este proceso también se asocia con una inducción de apoptosis (observación no publicada). Esto puede prevenirse al establecer primero una línea celular transformada con A-MuLV 63-12 que se transfecta de forma estable con un vector de expresión bcl-2.

La secuencia de ANRm de bcl-2 de ratón puede encontrarse en la entrada NCBI-Genbank NM_009741, y tiene la siguiente secuencia Seq-ID42, mostrada en lo siguiente al final de este Ejemplo. Este marco de lectura abierto se traduce en la siguiente secuencia de aminoácidos Seq-ID43, también proporcionada en lo siguiente, al final del Ejemplo.

Para generar un vector de expresión bcl-2 de célula de mamífero, la región de codificación de bcl-2 de murino puede sintetizarse por genes con sitios de enzima de restricción de Kpnl y Xhol flanqueado que no se encuentran presente se la región de codificación del fragmento de ADN sintetizado por genes digerido doble de bcl-2 y Kpnl-Xhol pueden ligarse en pCDNA3.1-hygro(+) descrito en lo anterior adicionalmente para generar un vector de expresión de mamífero para bcl-2 que puede transíectarse de manera estable en células 63-2 para seleccionar por transfectantes bcl-2 estables.

Toda la secuencia del vector de expresión pCDNA3.l-hygro(+) que contiene el gen bcl-2 murino insertado en los sitios de restricción Kpnl y Xhol del sitio de clonación múltiple se proporciona como Seq-ID44 siguiente, al final de este Ejemplo.

Para facilitar la generación de transfectantes estables, este vector, por ejemplo, puede linearizarse fuera de los casetes de expresión para bel-2 o higromicina B utilizando la enzima FspI, que lineariza el vector en el gen de resistencia de ampicilina bacteriana. 20 mg de tal vector linearizado puede transíectarse en 2xl06 células 63-12 por electroporación en 950pF/300V exactamente como se describe en lo anterior adicionalmente para la transfección de vectores de transposición. Después de la electroporación, las células pueden diluirse entonces en 100ml del medio de crecimiento y se colocan en placas en cinco placas de 96 pozos con cada una de 200m1/rozo, lo cual resultará en la colocación de placas de aproximadamente 4.103 células/pozo.

Los transfectantes estables pueden seleccionarse entonces al agregar 800pg/ml de higromicina B 48 horas después de la transfección. Los clones de células de forma estable transfectadas individuales, de las cuales 20-100 pueden esperarse de tal experimento, pueden obtenerse entonces 2-3 semanas después. Los clones de células transfectadas bel-2 estables son funcionalmente mejor probadas por su capacidad de proteger células de apoptosis, al medir la supervivencia de clones individuales con la exposición de 0.1 a lMn de Gleevec (Imatinib, o STI-571). Una vez que un transfectante de bcl-2 estable 63-12 se identifica que tiene alta resistencia a Gleevec (Imatinib, o STI-571), este clon puede utilizarse como una célula huésped para expresión de IgG humano de vector de expresión IgG-gammal HC e Ig-kappa LC genómicos de transposición, por ejemplo, utilizando los vectores Seq-ID41 y Seq-ID36.

Estos vectores pueden co-transfectarse con vectores de expresión PiggyBac (Seq-ID13) hacia las células 63-12 transfectadas por Bcl-2 estables, y células que expresan IgG y de forma estable transpuestas pueden establecerse como se describe en lo anterior adicionalmente (equivalente al Ejemplo 7). Debido a que las células pro-B representan una etapa de diferenciación, en donde la inmunoglobulina endógena se expresa como inmunoglobulina de unión de membrana, puede esperarse que también el Ig-HC expresado a partir de un vector de expresión de HC Ig-gammal de transposición en configuración genómica se expresará como la versión de unión de membrana.

Sin embargo, si las células se tratan con 0.1 a lmM de Gleevec (Imatinib, o STI-571). La Abl-cinasa codificada por el A-MuLV se inhibe específicamente, las células no se transforman en gran medida y continúan su programa de diferenciación intrínseco a etapas de diferenciación de célula B más madura. In vitro, esta diferenciación es independiente de las proteínas de Ig funcionalmente expresadas (Grawunder et al., (1995) Int. Immunol.7, 1915-1925). Incluso se ha mostrado que la diferenciación in vitro de células pro-B no transformadas haciéndolas sensibles a estimulación anti-IL4 y CD40 derivados de células T, con lo cual las células incluso se diferencian en células de etapa celular de plasma que experimentan la recombinación de conmutación de clase y donde pueden fusionarse con células de mieloma para generar hibridomas (Rolink et al., (1996) Immunity 5, 319-330).

Esto significa que también las célula 63-12 transformadas con A-MuLV, las cuales se hacen resistentes a apoptosis por expresión estable de bcl-2 pueden diferenciarse en células de la fase celular de plasma con tratamiento con Gleevec e incubación simultánea con lOpg/ml de anticuerpo anti-CD40 agonista, y 100U/ml de IL4 recombinante, exactamente como se describe en Rolink et. al. (1996) Immunity 5, 319-330.

Este tratamiento inducirá un cambio en el programa de diferenciación celular, que cambiará el programa de empalme alternativo celular de la expresión de IgG de unión de membrana para secretar la expresión IgG a partir de un constructo de expresión de HC de Ig en la organización genómica. Esto permitirá la producción de anticuerpo secretado a partir de clones de células con plaquetas de réplica identificados y aislados por el despliegue superficial y unión de antágenos, sin la necesidad de volver a clonar las regiones de codificación VH y VL a partir de los clones celulares seleccionados y sin la necesidad de ligarlos en vectores de expresión para anticuerpos de IgG secretados.

Esto es una característica funcional de los vectores que no pueden incorporarse fácilmente en la mayoría del sistema de expresión celular de mamíferos, particularmente no en muchos sistemas de expresión a base de virus, en los cuales tales vectores de expresión genómica no pueden insertarse fácilmente.

Secuencias denominadas en este Ejemplo 9: Seq-ID40 (gen de cadena pesada de Ig-gammal humana genómica de 5812 pb de largo) Seq-ID41 (vector de expresión de HC de Ig-gammal de transposición en configuración genómica) Seq-ID42 (región de codificación bel-2 de murino) Seq-ID43 (secuencia de aminoácidos de proteína de Bel-2 de murino) Seq-ID44 (vector de expresión de mamífero pCDNA3.1-hygro(+)-bcl2).

Ejemplo 10: Instrucción para la generación de vectores que codifican bibliotecas de cadena pesada y ligera de anticuerpo humano básico como vectores de transposición PiggyBac.

Para generar bibliotecas de ADN de transposición simple que codifican bibliotecas de cadena pesada y ligera de anticuerpos humanos, solamente las regiones VL y VH de vectores pIRES-EGFP-TlT2-IgL de transposición del Ejemplo 2 y pIRES-EGFP-TlT2-IgH del Ejemplo 3, respectivamente, necesita reemplazarse. Esto puede hacerse al sintetizar los genes de las regiones de codificación VH y VL humanos flanqueado por los sitios de enzima de restricción Clal y Eco47III, y al permitir las variaciones de nucleótido en ciertas posiciones HCDR y LCDR, como se proporciona en la Seq-ID9, la cual codifica las bibliotecas para dominio de cadena pesada variables y Seq-ID10, la cual codifica las bibliotecas para dominio de cadena ligera variable, y las cuales se proporcionan al final de este ejemplo. Ambas de estas secuencias contienen un tramo de N-secuencias en la HCRD3 (en negritas) y LCDR3 (en negritas), respectivamente. Ambas de las secuencias Seq-ID9 y Seq-ID10 se flanquean por enzimas de restricción Clal y Eco47III (subrayadas), respectivamente, incluyendo cuatro nucleótidos que flanquean los sitios de enzimas de restricción (resaltado en letras minúsculas en los extremos de la secuencia), permitiendo la digestión de enzima de restricción apropiada de los fragmentos de ADN sintetizados por genes y ligadura dirigida en cadenas principales de pIRES-EGFP-TlT2-IgH y pIRES-EGFP-TlT2-IgL linearizados por ClaI-Eco47III, respectivamente.

De este modo, las bibliotecas de ADN de transposición diversas, que codifican las cadenas pesadas y ligeras de anticuerpo en vectores separados, en los cuales pueden generarse la expresión de las cadenas de anticuerpos son en forma transcripcional y por lo tanto operablemente enlazadas a una proteína marcadora fluorescente verde.

Seq-ID9 (región de codificación de dominio VL con variación de N-secuencia variable en posiciones que codifican LCDR3).

Seq-ID10 (región de codificación de dominio VH con variación de N-secuencia variable en posiciones que codifican HCDR3).

Ejemplo 11: Instrucciones para la generación de una biblioteca de expresión de cadena ligera Ig-kappa humana de transposición de la Sleeping Beauty básica.

Para generar una biblioteca de ADN de transposición Sleeping Beauty diversa que codifica biblioteca de cadena ligera de anticuerpo humano, la región VL del vector pIRES-EGFP-sbTlT2-IgL de transposición Sleeping Beauty del Ejemplo 5 necesita remplazarse con un repertorio de genes de VL diverso. Éste puede hacerse al sintetizar los genes de regiones de codificación VL humanos flanqueado por los sitios de enzima de restricción Clal y Eco47III, y al permitir las variaciones de nucleótido en ciertas posiciones HCDR y LCDR, como ya se proporcionan en la Seq-ID-10 anterior. La secuencia Seq-ID10 se flanquea por enzimas de restricción Clal y Eco47III permitiendo la ligadura dirigida hacia pIRES-EGFP-sbTlT2-IgL linearizado con el Clal-Eco47III. De esta forma puede generarse una biblioteca de ADN de transposición Sleeping Beauty que codifica la cadena ligera de anticuerpo humano diversa.

De esta forma, las bibliotecas de ADN de transposición diversas, que codifican las cadenas pesada y ligera de anticuerpos en vectores separados, en los cuales pueden generarse la expresión de las cadenas de anticuerpo son en forma transcripcional y por lo tanto operablemente enlazadas a una proteína marcadora fluorescente verde.

Ejemplo 12: Clonación de una biblioteca de expresión de IgL de transposición.

Una biblioteca de cadena ligera V-kappa con región LCDR3 aleatorizada se construyó como se describe en lo siguiente. Seis residuos de aminoácido se aleatorizaron, es decir, se codificaron por el codón NNK (N = cualquier nucleótido K = T o G), el cual acomoda cada uno de los 20 aminoácidos. La biblioteca se basó en segmentos de genes Vkappal-5 y Jkappa2 humanos de línea germinal y se aleatorizaron entre la cisteína conservada al final de la región de marco 3 y la región de marco 4 basada en Jkappa2 como sigue: Gln-Gln-(NNK)6-Thr. La secuencia y diseño general de la biblioteca de cadena ligera kappa se muestra en la Figura 15.

Una molécula de ADN línea que codifica la biblioteca de cadena ligera kappa se generó por PCR. Para esto, se generaron dos plantillas por síntesis de genes total (realizado por GenScript, Piscataway, NJ, USA). Por un lado, se generó un constructo sintetico que comprende el segmento de genes Vkappal-5 clonado en el sitio EcoRV de pUC57 (Orden GenScript #SD1176), pUC57_Vkappal-5 (SEQ-ID45); por otro lado, se generó un constructo sintético que comprende el segmento de genes Jkappa2 fusionado en la región de codificación Ckappa clonada en el sitio EcoRV de pUC57, pUC57_Jkappa2-Ckappa (SEQ-ID46).

Un primer ADN lineal que comprende el segmento de genes Vkappal-5 fue PCR amplificado de pUC57_Vkappal-5 utilizando los cebadores pUC57-l (5'-CGT TGT AAA ACG ACG GCC AG-3') y LCDR3-B (5'-CTG, TTG GCA GTA ATA AGT TGC-3'). Un segundo ADN lineal que comprende la región de CDR3 aleatorizado (Gln-Gln-(NNK)6-Thr). El segmento de genes Jkappa2 y la región constante de Ckappa se amplificó a partir de pUC57_Jkappa2-Ckappa utilizando los cebadores LCDR3-NNK6-F (5'-GCA ACT TAT TAC TGC CAA CAG NNK NNK NNK NNK NNK NNK ACT TTT GGC CAG GGG ACC AAG-3') y pUC57-2 (5'-TCA CAC AGG AAA CAG CTA TG-3'). Para prevenir la introducción de una desviación de secuencia debido a la imprimación de la región aleatorizada del cebador LCDR3-NNK6-F en pUC57_Jkappa2-Ckappa, el plásmido primero se linearizó por digestión con la enzima de restricción Seal (Figura 17A).

Las moléculas de ADN resultantes (SEQ-ID47 y SEQ- ID48) despliegan un solapamiento de 21 pb y se ensamblaron por extensión de traslape de PCR utilizando los cebadores pUC57-1 y pUC57 -2, generando una molécula de ADN que comprende la biblioteca de cadena ligera kappa flanqueada por los sitios de restricción Notl y AsuII (=BstBI) como se muestra en la Figura 15. El amplicón por PCR de la biblioteca de cadena ligera V-kappa se sometió a secuenciación de fragmento de PCR, y el resultado mostrado en la Figura 18, demuestra que de hecho la diversidad esperada se introdujo como se diseñó en las posiciones de la LCDR3, como se evidencia al solapar las señales de electroferograma en las posiciones aleatorizadas. Este fragmento de PCR se digirió con las endonucleasas de restricción Notl y BstBI (un isoesquisómero de AsuII) y clonadas en el vector de transposición PiggyBac pPB-EGFP-HC-gl (SEQ-ID049, que resulta en una biblioteca que consiste de 5.2xl07 clones independientes. El tamaño de esta biblioteca puede incrementarse fácilmente por un factor 10 a la escala ascendentemente las reacciones de ligadura.

Las bibliotecas de cadena ligera que incorporan distintos diseños de aleatorización, o que comprenden segmentos de genes Vkappa y Jkappa distintos de aquellos utilizados en este ejemplo, pueden producirse de la misma forma.

De igual manera, la estrategia descrita aquí puede emplearse para la producción de bibliotecas de cadena ligera Vlambda.

Secuencias denominadas en este Ejemplo 12: SEQ-ID45 (pUC57_Vkappal-5) SEQ-ID46 (pUC57_Jkappa2-C-kappa) SEQ-ID47 (producto de PCR de Vkappal-5) SEQ-ID48 (producto de PCR de NNK6-Jkappa2-C-kappa) Ejemplo 13: Clonación de bibliotecas de expresión de cadena IgH de transposición con longitud HCDR3 variable Una biblioteca de cadena pesada gamma 1 humana con región HCDR3 aleatorizada se construyó como se describe en lo siguiente. Diversos residuos de aminoácido se aleatorizaron, es decir, se codificaron por el codón NNK (N = cualquier nucleótido; K = T o G), que acomoda cada uno de los 20 aminoácidos. La biblioteca se basó en los segmentos de VH3-30 y JH4 y se aleatorizaron entre el residuo Cisteína conservada en el extremo de la región de marco 3 y la región de marco 4 basada en JH4 como sigue: Ala-Lys/Arg-(NNK)n-Asp-NNK. Varias longitudes HCDR3 se exploraron con n = 4, 6, 8 ó 10 (aleatorización de NNK4, NNK6, NNK8 y NNK10). La secuencia y el diseño total de la biblioteca de cadena pesada gamma se muestran en la Figura 16.

Una molécula ADN lineal que codifica la biblioteca de región variable (VH) de cadena pesada se generó por PCR.

Para esto, se generaron dos plantillas por la síntesis de gen total (realizada por GenScript, Piscataway, NJ, USA). En esa forma, se generó un constructo sintético que comprende el segmento de gen VH3-30 clonado en el sito EcoRV de pUC57, pUC57_VH3-30 (SEQ-ID49); en la otra forma, se generó un constructo sintético que comprende el segmento de gen JH4 clonado en el sitio EcoRV de pUC57, pUC57_JH4 (SEQ-ID50).

Un primer ADN lineal que comprende el segmento de gen VH3-30 fue PCR amplificado de pUC57_VH3-30 que utiliza los cebadores VH3-30-F (5'-GAT ATC CAA TGC GGC CGC ATG -3') y HCDR3-B (5'-CGC ACA GTA ATA CAC AGC CGT G -3'). Las moléculas de ADN lineales adicionales que comprenden las regiones HCDR3 aleatorizadas Ala-Lys/Arg-(NNK)4-Asp-NNK, Ala-Lys/Arg-(NNK)6-Asp-NNK, Ala-Lys/Arg-(NNK)8-Asp-NNK, o Ala-Lys/Arg (NNK)10-Asp-NNK fusionada del segmento de gen JH4 se amplificó del pUC57_JH4 que utiliza, respectivamente, los cebadores HCDR3-NNK4-F (5'-CAC GGC TYGT GTA TTA CTG TGC GFAR GNN KNN KNN KNN KGA CNN KTG GGG CCA AGG AAC CCT GGT C-3'), HCDR3-NNK6-F (5'-CAC GGC TGT GTA TTA CTG TGC GAR GNN KNN KNN KNN KNN KNN KGA CNN KTG GGG CCA AGG AAC CCT GGT C-3'), HCDR3-NNK8-F (5'-CAC GGC TGT GTA TTA CTG TGC GAR GNN KNN KNN KNN KNN KNN KNN KNN KGA CNN KTG GGG CCA AGG AAC CCT GGT C-3'), o HDR3-NNK10-F (5'-CAC GGC TGT FTA TTA CTG TGC GAR GNN KNN KNN KNN KNN KNN KNN KNN KNN KNN KGA CNN KTG GGG CCA AGG AAC CCT GGT C-3') en combinación con el cebador pUC57-3 (5'-CAG GTT TCC CGA CTG GAA AG-3'). Para prevenir la introducción de un sesgo en la secuencia debido a la producción de cebador de la región aleatorizada de los cebadores HCDR3-NNK4-F, HCDR3-NNK6-F, HCDR3-NNK8-F y HCDR3-NNK10-F en pUC57_JH4, el plásmido primero se alineo mediante la digestión con la enzima de restricción DrdI (Figura 17B).

El producto VH3-30 PCR resultante (SEQ-ID51) desplegó una solapa de 22 pb con los productos PCR NNK4-JH4, NNK6-JH4, NNK8-JH4 y NNK10-JH4 (SEQ-ID52 a 55), y se ensamblaron con cada una de las extensiones solapadas PCR en 4 reacciones separadas, utilizando los cebadores VH3-30-F y pUC57-3. Las moléculas de ADN resultantes comprendieron la biblioteca VH flanqueada por los sitios de restricción Notl y Nhel como se muestra en la Figura 16. Todos los amplicones PCR obtenidos de los PCR que emplearon los oligos degenerados NNK4-JH4, NNK6-JH4, NNK8-JH4 y NNK10-JH4 se sometieron a secuenciación de ADN directa y confirmaron que la aleatorización designada de las posiciones HCDR3 se obtuvieron, como se espera. Esto se muestra por medio del ejemplo en la Figura 18(B), donde el electroferograma de la región que abarca el HCDR3 se proporciona. Las posiciones aleatorizadas mostraron solapas de tipo de secuencia esperadas que demuestran la diversidad del nucleótido en estas posiciones (Figura 18). Los ADN de la biblioteca VH diferentes de 4 se mezclaron en proporción equimolar, digeridos con las endonucleasas Notl y Nhel de restricción y se clonaron en el vector pPB-EGFP_HC-gamma1 de PiggyBac-transportable (SEQ-ID22), corriente arriba de la región constante de cadena pesada gammal, que resulta en una biblioteca que consiste de 3.7 x 107 clones independientes. El tamaño de la biblioteca puede fácilmente incrementarse por un factor 10 al escalar la reacción de ligando.

Las bibliotecas de cadena pesada que incorporan los diseños de aleatorización distintos, o que comprende segmentos de gen VH y JH diferentes de unos utilizados en este ejemplo, pueden producirse de la misma forma.

Secuencias de ADN referidas en este Ejemplo 13: SEQ-ID49 (pUC57_VH3-30) SEQ-ID50 (pUC57_JH4) SEQ-ID51 (producto VH3-30 PCR) SEQ-ID52 (producto NNK4-JH4 PCR) SEQ-ID53 (producto N K6-JH4 PCR) SEQ-ID54 (producto NNK8-JH4 PCR) SEQ-ID55 (producto NNK10-JH4 PCR) Ejemplo 14: Identificación de regiones de codificación de cadena ligera y pesada variable de las células huésped de forma estable transportadas y enriquecidas, de antígeno reactivo.

Debido a la integración estable de los vectores de expresión transportables codifican las cadenas de cadena ligera y pesada del anticuerpo en el huésped, las regiones de codificación de cadena ligera y pesada variable pueden aislarse en una forma sencilla mediante la amplificación de PCR estándar seguida por la secuenciación directa de los amplicones PCR o, en la re-codificación de los vectores de plásmido re-clonados. Para esto, las células aisladas o los clones de célula, que expresan los anticuerpos de antígeno específico, se centrifugan durante 5 minutos a 1200x g. El ARN total se aisló de estas células que utilizan el reactivo TRIzol (Sigma-Aldrich). La primera hebra de ADNc puede sintetizarse con PowerScript (Clontech-Life Technologies) utilizando un cebador oligio-dT. Las regiones de codificación de cadena ligera pueden entonces amplificarse por PCR utilizando los cebadores SP-F (5'-GAG GAG GAG GCG GCC GCC ATG AAT TTT GGA C-3') y CK-rev (5'-GAG GAG GAG TTC GAA AGC GCT AAC ACT CTC-3'), la cual resulta en un amplicón de PCR de aproximadamente 740 pb, dependiendo de la longitud de la región V-kappa contenida en el amplicón por PCR. Si se desea, este amplicón por PCR puede digerirse con las endonucleasas Notl y BstBI de restricción, y se clonaron en el vector pPB-EGFP_HC-gl (Seq-ID22) para subclonar clones individuales del amplicón por PCR para identificación de secuencia adicional. Los clones de la región V-kappa individual pueden entonces someterse a secuenciación utilizando el cebador pPB-seql3 (5'-GGC CAG CTT GGC ACT TGA TG-3'), unido en el promotor EFl-alfa corriente arriba de la región de codificación V clonada.

Las regiones variables de cadena pesada pueden ser PCR amplificado en ADNc, generado como en lo anterior, utilizando los cebadores SP-F (5'-GAG GAG GAG GCGT GCC GCC ATG AAT TTT GGA C-3') y CG-revseq-1 (5'-GTT CGG GGA AGT AGT CCT TG-3') que resultará en un amplicón por PCR del tamaño esperado de aproximadamente 530 pb, dependiendo de la longitud de la región VH contenida en el amplicón por PCR. Si se desea, este amplicón por PCR puede digeriré con endonucleasas Notl y Nhel de restricción y clonadas en el vector pPB-EGFP__HG-gl (Seq-ID22). Los clones individuales entonces se sometieron a secuenciación de la región VH que utiliza el cebador pPB-seql3 (5'- GGC CAG CTT GGC ACT TGA TG-3') que se une en el promotor EFl-alfa, corriente arriba de la región de codificación V clonada.

MODALIDADES DE LA INVENCIÓN 1. Un método para identificar un polipéptido que tiene una especificidad o funcionalidad de unión deseada, que comprende: (i) generar una colección diversa de polinucleótidos que codifican polipéptidos que tienen diferentes especificidades o funcionalidades de unión, en donde los polipéptidos comprenden una secuencia que codifica para un polipéptido dispuesto entre la primera y segunda secuencias de repetición de terminal invertida que se reconocen por y son funcionales con al menos una enzima transposasa; (ii) introducir la colección diversa de polinucleótidos de (i) en células huésped; (iii) expresar al menos una enzima transposasa funcional con las secuencias de repetición de terminal invertida en células huésped de manera que la colección diversa de polinucleótidos se integre en el genoma de la célula huésped para proporcionar una población de células huésped que exprese la colección diversa de polinucleótidos que codifican polipéptidos que tienen diferentes especificidades o funcionalidades de unión; (iv) clasificar las células huésped para identificar una célula huésped que expresa un polipéptido que tiene una especificidad o funcionalidad de unión deseada; y (v) aislar la secuencia de polinucleótidos que codifica el polipéptido de la célula huésped. 2. Un método de acuerdo con 1, en donde los polinucleótidos son moléculas de ADN. 3. Un método de acuerdo con 1, en donde los polinucleótidos comprenden una secuencia de unión al ligando de un receptor o una secuencia de unión a la diana de una molécula de unión. 4. Un método de acuerdo con 1, en donde los polinucleótidos comprenden una secuencia de unión al antígeno de un anticuerpo. 5 Un método de acuerdo con 1, en donde los polinucleótidos comprenden una secuencia que codifica una región VH o VL de un anticuerpo, o un fragmento de unión al antígeno de la misma. 6. Un método de acuerdo con 1, en donde los polinucleótidos comprenden una secuencia que codifica una región VH de anticuerpo y una región VL de anticuerpo. 7. Un método de acuerdo con 1, en donde los polinucleótidos comprenden una secuencia que codifica una cadena ligera o cadena pesada de inmunoglobulina de longitud completa, o un fragmento de unión al antígeno de los mismos. 8. Un método de acuerdo con 1, en donde los polinucleótidos comprenden una secuencia que codifica un dominio Fv o Fab de una sola cadena. 9. Un método de acuerdo con 1, en donde generar la colección diversa de polinucleótidos comprende someter secuencias de genes de la región V a PCR bajo condiciones de mutagénesis. 10. Un método de acuerdo con 1, en donde generar la colección diversa de polinucleótidos comprende síntesis por genes. 11. Un método de acuerdo con 1, en donde generar la colección diversa de polinucleótidos comprende amplificación por PCR de repertorios de la región V de células V de vertebrado. 12. Un método de acuerdo con 1, en donde la colección diversa de polinucleótidos comprende 1 vectores plásmidos. 13. Un método de acuerdo con 1, en donde la colección diversa de polinucleótidos comprende amplicones por PCR de ADN de doble hebra. 14. Un método de acuerdo con 4, en donde la secuencia de unión al antígeno es de células de vertebrado. 15. Un método de acuerdo con 4, en donde la secuencia de unión al antígeno es de células de mamífero. 16. Un método de acuerdo con 4, en donde la secuencia de unión al antígeno es de células de humano. 17. Un método de acuerdo con 12, en donde los vectores plásmidos además codifican un gen marcador. 18. Un método de acuerdo con 17, en donde el marcador se selecciona del grupo que consiste de: un marcador fluorescente, un marcador de superficie celular y un marcador seleccionable. 19. Un método de acuerdo con 17, en donde la secuencia del gen marcador se encuentra corriente arriba o corriente abajo de la secuencia que codifica el polipéptido que tiene una especificidad o funcionalidad de unión, pero entre las secuencias de repetición de terminal invertida. 20. Un método de acuerdo con 17, en donde la secuencia del gen marcador se encuentra corriente abajo de la secuencia que codifica un polipéptido que tiene especificidad o funcionalidad de unión y se separa por un sitio de entrada ribosomal interno. 21. Un método de acuerdo con 1, en donde la etapa (ii) comprende introducir en las células huésped polinucleótidos que comprenden secuencias que codifican regiones VH o VL de inmunoglobulina, o fragmentos de enlace al antígeno de las mismas, y en donde las secuencias de región VH y VL se codifican en vectores separados. 22. Un método de acuerdo con 21, en donde la etapa (ii) comprende introducir en las células huésped polinucleótidos que comprenden secuencias que codifican cadenas pesadas o ligeras de inmunoglobulina de longitud completa, o fragmentos de enlace al antigeno de las mismas, en donde las secuencias de cadena pesada o ligera que tienen longitud completa se encuentran en vectores separados. 23. Un método de acuerdo con 21, en donde los vectores que comprenden secuencias VH y los vectores que comprenden secuencias VL se introducen en las células huésped de manera simultánea. 24. Un método de acuerdo con 21, en donde los vectores que comprenden secuencias VH y los vectores que comprenden secuencias VL se introducen en las células huésped de manera secuencial. 25. Un método de acuerdo con 1, en donde la etapa (ii) comprende introducir en las células huésped a vector que comprende secuencias que codifican cadenas VH y VL de anticuerpo. 26. Un método de acuerdo con 1, en donde la etapa (ii) comprende introducir en las células huésped un vector que comprende secuencias que codifican una cadena pesada de inmunoglobulina de longitud completa y una cadena ligera de inmunoglobulina de longitud completa. 27. Un método de acuerdo con 21, en donde el vector que comprende la secuencia VH comprende secuencias de repetición de terminal invertida que se reconocen por una enzima transposasa diferente de las secuencias de repetición de terminal invertida en el vector que comprende la secuencia VL. 28. Un método de acuerdo con 1, en donde las células huésped de la etapa (ii) son células de vertebrado. 29. Un método de acuerdo con 28, en donde las células huésped son células de mamífero. 30. Un método de acuerdo con 29, en donde las células huésped son células de humano o de roedor. 31. Un metodo de acuerdo con 28, en donde las células huésped de vertebrado son células linfoides. 32. Un método de acuerdo con 31, en donde las células huésped son células B. 33. Un método de acuerdo con 32, en donde las células huésped son células B progenitoras o células B precursoras. 34. Un método de acuerdo con 33, en donde las células huésped se seleccionan del grupo que consiste de: células B progenitoras transformadas con virus de Leucemia de Murino Abelson o células B precursoras y tempranas, células pro-B y pre-B transformadas con EBV de inmunoglobulina nula. 35. Un método de acuerdo con 32, en donde las células huésped se seleccionan del grupo que consiste de: Células Sp2/0, células NSO, células X63, y células Ag8653. 36. Un método de acuerdo con 29, en donde las células huésped se seleccionan del grupo que consiste de: células CHO, células Per.C6, células BHK, y células 293. 37. Un método de acuerdo con 1, en donde la expresión de la etapa {iii) comprende introducir en las células huésped un vector de expresión que codifica a enzima transposasa que reconoce y es funcional con al menos una secuencia de repetición de terminal invertida. 38. Un método de acuerdo con 37, en donde el vector que codifica la enzima transposasa se introduce en las células huésped de manera concurrente con o antes o de manera subsiguiente a la diversa colección de polinucleótidos. 39. Un método de acuerdo con 37, en donde la enzima transposasa se expresa de forma transitoria en la célula huésped. 40. Un método de acuerdo con 1, en donde la expresión de la etapa (iii) comprende introducir un sistema de expresión introducible que se integra de forma estable en el genoma de la célula huésped. 41. Un método de acuerdo con 40, en donde el sistema de que se introduce, puede inducirse por tetracielina o inducirse por tamoxifeno. 42. Un método de acuerdo con 1, en donde la clasificación de la etapa (iv) comprende clasificación celular magnética activada (MACS), clasificación celular activada por fluorescencia (FACS), selección contra moléculas inmobilizadas en una selección de superficie sólida, selección para unirse a moléculas asociada con la membrana celular incorporadas en una membrana celular de bicapa lipídica reconstituida natural o artificialmente o clasificación de alta eficiencia de clones de células individuales en un formato de diversos pozos para un fenotipo funcional o de unión deseada. 43. Un método de acuerdo con 1, en donde la clasificación de la etapa (iv) comprende clasificar para identificar polipéptidos que tienen una especificidad o funcionalidad de unión de diana deseada. 44. Un método de acuerdo con 1, en donde la clasificación de la etapa (iv) comprende clasificar para identificar moléculas de unión al antígeno que tienen una especificidad de antígeno deseada. 45. Un método de acuerdo con 44, en donde la clasificación de la etapa además comprende clasificar para identificar moléculas de unión al antígeno que tienen una o más propiedades de funcionalidad deseadas. 46. Un método de acuerdo con 1, en donde la clasificación de la etapa (iv) comprende ciclos de enriquecimiento de múltiples células con expansión de célula huésped entre ciclos de enriquecimiento de células individuales. 47. Un método de acuerdo con 1, en donde la etapa (v) de aislar la secuencia de polinucleótidos que codifican el polipéptido que tiene una especificidad o funcionalidad de unión deseada comprende secuenciación profunda genómica o de amplificación por RT-PCR o de siguiente generación. 48. Un método de acuerdo con 1, que además comprende (vi) optimización de afinidad de la secuencia de polinucleótidos obtenidos en (v). 49. Un método de acuerdo con 48, en donde la optimización de afinidad comprende PCR o RT-PCR genómico bajo condiciones de mutagénesis. 50. Un método de acuerdo con 49, que además comprende someter las secuencias de mutagénesis a las etapas (i)-(v) de la reivindicación 1. 51. Un método de acuerdo con 1, en donde las secuencias de repetición de terminal invertida son del sistema de transposón PiggyBac. 52. Un método de acuerdo con 51, en donde la secuencia que codifica la secuencia de repetición de terminal invertida de PiggyBac corriente arriba comprende la SEQ ID NO:1. 53. Un método de acuerdo con 51, en donde la secuencia que codifica la secuencia de repetición de terminal invertida de PiggyBac corriente abajo comprende SEQ ID NO:2. 54. Un método de acuerdo con 5, en donde las secuencias de región VH o VL codifican una secuencia derivada de un anticuerpo anti-TNF alfa de humano. 55. Un método de acuerdo con 54, en donde el anticuerpo anti-TNF alfa de humano es D2E7. 56. Un método de acuerdo con 55, en donde las regiones VH y VL de D2E7 se codifican por vectores de transposición separados. 57. Un método de acuerdo con 56, en donde el vector que comprende la secuencia de región VL comprende SEQ ID NO:5. 58. Un método de acuerdo con 56, en donde el vector que comprende la secuencia de región VH comprende SEQ ID NO:8. 59. Un método de acuerdo con 56, en donde el vector que comprende la secuencia de región VH comprende una secuencia al azar como se establece en SEQ ID NO:9. 60. Un método de acuerdo con 56, en donde el vector que comprende la secuencia de región VL comprende una secuencia al azar como se establece en SEQ ID NO:10. 61. Un método de acuerdo con 1, en donde la etapa (iii) comprende introducir en la célula huésped un vector que comprende una secuencia que codifica una transposasa PiggyBac funcional. 62. Un método de acuerdo con 61, en donde el vector comprende SEQ ID NO:11. 63. Un método de acuerdo con 61, en donde el vector codifica SEQ ID NO:12, o una secuencia con al menos 95% de homología de secuencia de aminoácidos y que tiene la misma o similar especificidad de secuencia de repetición de terminal invertida. 64. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde las secuencias de repetición de terminal invertida se reconocen por y son funcionales con al menos una transposasa seleccionada del grupo que consiste de: PiggyBac, Sleeping Beauty, Frog Prince, Himarl, Passport, Minos, hAT, Toll, Tol2, Ac/Ds, PIF, Harbinger, Harbinger3-DR, andHsmarl. 65. Una biblioteca de moléculas de polinucleótidos que codifican polipéptidos que tienen diferentes especificidades o funcionalidades de unión, que comprenden una pluralidad de moléculas de polinucleótidos, en donde las moléculas de polinucleótidos comprenden una secuencia que codifica un polipéptido que tiene una especificidad o funcionalidad de unión dispuesta entre secuencias de repetición de terminal invertida que se reconocen por y son funcionales con al menos una enzima transposasa. 66. Una biblioteca de acuerdo con 65, en donde los polinucleótidos son moléculas de ADN. 67. Una biblioteca de acuerdo con 65, en donde los polinucleótidos comprenden una secuencia de unión al ligando de un receptor o una secuencia de unión a la diana de una molécula de unión. 68. Una biblioteca de acuerdo con 65, en donde los polinucleótidos comprenden al menos una secuencia que codifica una secuencia de unión al antígeno 1 de un anticuerpo. 69 Una biblioteca de acuerdo con 65, en donde los polinucleótidos comprenden una secuencia que codifica una región VH o VL de un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno de la misma. 70. Una biblioteca de acuerdo con 65, en donde los polinucleótidos comprenden una secuencia que codifica una región VH de anticuerpo y una región VL de anticuerpo. 71. Una biblioteca de acuerdo con 65, en donde los polinucleótidos comprenden una secuencia que codifica una cadena ligera o cadena pesada de inmunoglobulina de longitud completa, o un fragmento de unión al antígeno de la misma. 72. Una biblioteca de acuerdo con 65, en donde los polinucleótidos comprenden una secuencia que codifica un dominio Fv o Fab de una sola cadena. 73. Una biblioteca de acuerdo con 65, en donde las moléculas de polinucleótidos son plásmidos. 74. Una biblioteca de acuerdo con 65, en donde las moléculas de polinucleótidos son amplicones por PCR de ADN de doble hebra. 75. Una biblioteca de acuerdo con 73, en donde los plásmidos además comprenden una secuencia que codifica un gen marcador. 76. Una biblioteca de acuerdo con 73, en donde los plásmidos además comprenden una secuencia que codifica a enzima transposasa que reconoce y es funcional con las secuencias de repetición de terminal invertida. 77. Un método para generar una biblioteca de polinucleótidos de transposición que codifican los polipéptidos que tienen diferentes especificidades o funcionalidad de unión, que comprende: (i) generar una colección diversa de polinucleótidos que comprenden secuencias que codifican polipéptidos que tienen diferentes especificidades o funcionalidades de unión, en donde los polipéptidos comprenden una secuencia que codifica el polipéptido que tiene una especificidad o funcionalidad de unión dispuesta entre secuencias de repetición de terminal invertida que se reconocen por y son funcionales con al menos una enzima transposasa. 78. A vector que comprende una secuencia que codifica una región VH o VL de un anticuerpo, o porción de unión al antígeno del mismo, dispuesta entre secuencias de repetición de terminal invertida que se reconocen por y son funcionales con al menos una enzima transposasa. 79. Un vector de acuerdo con 78, que comprende una secuencia que codifica a una cadena ligera o pesada de longitud completa de una inmunoglobulina. 80. Un vector de acuerdo con 78, en donde la secuencia de la región VL o VH se somete al azar. 81. Un vector de acuerdo con 78, en donde las secuencias de repetición de terminal invertida se reconocen por y son funcionales con la transposasa PiggyBac. 82. Un vector de acuerdo con 78, en donde la secuencia de la región VH o VL se derivan de un anticuerpo anti-TNF alfa. 83. Un vector de acuerdo con 82, en donde el anticuerpo es D2E7. 84. Un vector de acuerdo con 78, que comprende al menos una secuencia seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, y SEQ ID NO: 19. 85. Una célula huésped que comprende un vector acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 78-84. 86. Una célula huésped de acuerdo con 85 que además comprende un vector de expresión que comprende una secuencia que codifica una transposasa que reconoce y es funcional con al menos una secuencia de repetición de terminal invertida en el vector que codifica la secuencia de región VH o VL. 87. Un anticuerpo producido por un método que comprende la reivindicación 1. 88. Un método de acuerdo con 1, en donde las secuencias de repetición de terminal invertida son del sistema de transposón Sleeping Beauty. 89. Un método de acuerdo con 88, en donde la secuencia que codifica secuencia de repetición de terminal invertida Sleeping Beauty corriente arriba comprende SEQ ID NO:14. 90. Un método de acuerdo con 88, en donde la secuencia que codifica secuencia de repetición de terminal invertida Sleeping Beauty corriente abajo comprende SEQ ID NO: 15. 91. Un método de acuerdo con 88, en donde la etapa (iii) comprende expresar en la célula huésped un vector que comprende a transposasa Sleeping Beauty funcional. 92. Un método de acuerdo con 48, en donde la secuencia de polinucleótidos obtenida en (v) comprende una secuencia que codifica una región VH o VL de un anticuerpo, o un fragmento de unión al antígeno de la misma, y en donde la optimización del anticuerpo comprende introducir una o más mutaciones en una región que determina la complementariedad o región de marco de la VH o VL. 93. Una biblioteca de acuerdo con 71, en donde la cadena pesada de inmunoglobulina de longitud completa comprende la estructura intrón/exón natural de un anticuerpo de cadena pesada. 94. Una biblioteca de acuerdo con 93, en donde la cadena pesada de inmunoglobulina de longitud completa comprende el dominio de anclaje de membrana endógena. 95. Un método para generar una población de células huésped capacea de expresar polipéptidos que tienen diferentes especificidades o funcionalidades de unión, que comprende: (i) generar una colección diversa de polinucleótidos que comprende secuencias que codifican polipéptidos que tienen diferentes especificidades o funcionalidades de unión, en donde los polipéptidos comprenden una secuencia que codifica un polipéptido que tiene una especificidad o funcionalidad de unión dispuesta entre secuencias de repetición de terminal invertida que se reconocen por y son funcionales con al menos una enzima transposasa; y (ii) introducir la colección diversa de polinucleótidos en células huésped. 96. Un vector de acuerdo con 78, en donde las secuencias de repetición de terminal invertida se reconocen por y son funcionales con la transposasa Sleeping Beauty. 97. Un método de acuerdo con 91, en donde la etapa (iii) comprende expresar en la célula huésped un vector que comprende SEQ ID NO: 17. 98. Un método de acuerdo con 91, en donde el vector codifica SEQ ID NO: 18, o una secuencia con al menos 95% de homología de secuencia de aminoácidos y que tiene la misma secuencia o similar especificidad de repetición de terminal invertida.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para identificar un polipéptido que tiene una especificidad o funcionalidad de unión deseada, caracterizado porque comprende: (i) generar una colección diversa de polinucleótidos, de preferencia vectores plásmidos o Amplicones por PCR de ADN de doble hebra, que codifica polipéptidos que tienen diferentes especificidades o funcionalidades de unión, en donde los polipéptidos comprenden una secuencia que codifica para un polipéptido dispuesto entre la primera y segunda secuencias de repetición de terminal invertida que se reconocen por y son funcionales con al menos una enzima transposasa; (ii) introducir la colección diversa de polinucleótidos de (i) en células huésped; (iii) expresar al menos una enzima transposasa funcional con las secuencias de repetición de terminal invertida en las células huésped de manera que la colección diversa de polinucleótidos se integre en el genoma de la célula huésped para proporcionar una población de células huésped que exprese la colección diversa de polinucleótidos que codifican polipéptidos que tienen diferentes especificidades o funcionalidades de unión; (iv) clasificar las células huésped para identificar una célula huésped que expresa un polipéptido que tiene una especificidad o funcionalidad de unión deseada; y (v) aislar la secuencia de polinucleótidos que codifica el polipéptido de la célula huésped.

2. Un método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque los polinucleótidos comprenden a) a secuencia de unión al ligando de un receptor o una secuencia de unión a la diana de una molécula de unión, b) una secuencia de unión al antígeno de un anticuerpo, c) una secuencia que codifica una región VH o VL de un anticuerpo, o un fragmento de unión al antígeno de la misma. d) una secuencia que codifica una región VH de anticuerpo y una región VL de anticuerpo. e) una secuencia que codifica una cadena pesada o cadena ligera de inmunoglobulina de longitud completa, o un fragmento de unión al antígeno de la misma, y/o f) una secuencia que codifica un dominio Fv o Fab de una sola cadena.

3. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones antes mencionadas, caracterizado porque generar la colección diversa de polinucleótidos comprende someter secuencias de genes de la región V a PCR bajo condiciones de mutagénesis.

4. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones antes mencionadas, caracterizado porque la etapa (ii) comprende introducir en las células huésped polinucleótidos que comprenden secuencias que codifican a) regiones VH o VL de inmunoglobulina, o fragmentos de enlace al antxgeno de las mismas, y en donde las secuencias de la región VH y VL se codifican en vectores separados, y/o b) cadenas pesadas o ligeras de inmunoglobulina de longitud completa, o fragmentos de enlace al antígeno de las mismas, en donde las secuencias de cadena pesada o ligera de longitud completa se encuentran en vectores separados. c) un vector que comprende secuencias que codifican cadenas VH y VL de anticuerpo. d) un vector que comprende secuencias que codifican una cadena pesada de inmunoglobulina de longitud completa y una cadena ligera de inmunoglobulina de longitud completa.

5. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones antes mencionadas, caracterizado porque la expresión de la etapa (iii) comprende introducir en las células huésped un vector de expresión que codifica una enzima transposasa que reconoce y es funcional con al menos una secuencia de repetición de terminal invertida, en donde la enzima transposasa se expresa de preferencia de forma transitoria en la célula huésped.

6. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones antes mencionadas, caracterizado porque la clasificación de la etapa (iv) comprende clasificación celular magnética activada (MACS), clasificación celular activada por fluorescencia (FACS), selección contra moléculas inmobilizadas en una superficie sólida, selección para unir a las moléculas asociadas por membrana celular incorporadas en una membrana celular de bicapa lipídica reconstituida natural o artificialmente o clasificación de alta eficiencia de clones de células individuales en un formato de diversos pozos para un fenotipo funcional o de unión deseada.

7. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones antes mencionadas, caracterizado porque la etapa (v) de aislar la secuencia de polinucleótidos que codifica el polipéptido que tiene una especificidad o funcionalidad de unión deseada comprende amplificación genómica o por RT-PCR o secuenciación profunda de última generación.

8. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones antes mencionadas, caracterizado porque a) las secuencias de repetición de terminal invertida son del sistema de transposón PiggyBac o del sistema de transposón Sleeping Beauty, y/o b) etapa (iii) comprende introducir en la célula huésped un vector que comprende una secuencia que codifica una transposasa PiggyBac funcional o transposasa Sleeping Beauty.

9. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones antes mencionadas, caracterizado porque las secuencias de repetición de terminal invertida se reconocen por y son funcionales con al menos una transposasa seleccionada del grupo que consiste de: PiggyBac, Sleeping Beauty, Frog Prince, Himarl, Passport, Minos, hAT, Toll, Tol2, Ac/Ds, P1F, Harbinger, Harbinger3-DR, y Hsmarl

10. Una biblioteca de moléculas de polinucleótidos que codifica polipéptidos que tienen diferentes especificidades o funcionalidades de unión, caracterizada porque comprende una pluralidad de moléculas de polinucleótidos, de preferencia plásmidos o amplicones por PCR de ADN de doble hebra, en donde las moléculas de polinucleótidos comprenden una secuencia que codifica un polipéptido que tiene una especificidad o funcionalidad de unión dispuesta entre secuencias de repetición de terminal invertida que se reconocen por y son funcionales con al menos una enzima transposasa.

11. La biblioteca de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada porque los polipéptidos comprenden a) al menos una secuencia que codifica una secuencia de unión al antígeno de un anticuerpo. b) una secuencia que codifica una región VH o VL de un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno de la misma. c) una secuencia que codifica una región VH de anticuerpo y una región VL de anticuerpo. d) una secuencia que codifica una cadena pesada o cadena ligera de inmunoglobulina de longitud completa, o un fragmento de unión al antígeno de la misma. e) una secuencia que codifica un dominio Fv o Fab de una sola cadena.

12. La biblioteca de conformidad con las reivindicaciones 10-11, caracterizadas porque los plásmidos o amplicones por PCR de ADN de doble además comprenden una secuencia que codifica una enzima transposasa que reconoce y es funcional con las secuencias de repetición de terminal invertida.

13. El método para generar una biblioteca de polinucleótidos de transposición que codifican polipéptidos que tienen diferentes especificidades o funcionalidad de unión, caracterizado porque comprende generar una colección diversa de polinucleótidos que comprende secuencias que codifican polipéptidos que tienen diferentes especificidades o funcionalidades de unión, en donde los polinucleótidos comprenden una secuencia que codifica el polipéptido que tiene una especificidad o funcionalidad de unión dispuesta entre secuencias de repetición de terminal invertida que se reconocen por y son funcionales con al menos una enzima transposasa.

14. El vector caracterizado porque comprende una secuencia que codifica una región VH o VL de un anticuerpo, o porción de unión al antígeno del mismo, dispuesto entre secuencias de repetición de terminal invertidas que se reconocen por, y son funcionales con al menos una enzima transposasa.

15. La célula huésped caracterizada porque comprende un vector de conformidad con la reivindicación 14.

16. El anticuerpo caracterizado porque se produce por un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-9

17. Un método para generar una población de células huésped capaz de expresar polipéptidos que tienen diferentes especificidades o funcionalidades de unión, caracterizado porque comprende: (i) generar una colección diversa de polinucleótidos que comprende secuencias que codifican polipéptidos que tienen diferentes especificidades o funcionalidades de unión, en donde los polinucleótidos comprenden una secuencia que codifica un polipéptido que tiene una especificidad o funcionalidad de unión dispuesta entre secuencias de repetición de terminal invertida que se reconocen por y son funcionales con al menos una enzima transposasa; e (ii) introducir la colección diversa de polinucleótidos en células huésped.

18. El método, vector o anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones antes mencionadas, caracterizado porque las secuencias de región VH o VL codifican una secuencia derivada de un anticuerpo anti-TNF alfa de humano, de preferencia de D2E7, y en donde las regiones VH y VL de D2E7 se codifican de preferencia por vectores de transposición separados.

19. El método o vector de conformidad con las reivindicaciones antes mencionadas, caracterizado porque el vector que comprende la secuencia VH comprende secuencias de repetición de terminal invertida que se reconocen por una enzima transposasa diferente de las secuencias de repetición de terminal invertida en el vector que comprende la secuencia VL.

20. El método o célula huésped de conformidad con reivindicaciones antes mencionadas, caracterizado porque las células huésped son células de vertebrado, de preferencia células de mamífero, de mayor preferencia de humano o roedor, aún de mayor preferencia células linfoides, incluso aún de mayor preferencia células B, incluso de mayor preferencia células B progenitoras o células B precursoras, particularmente se prefieren células B progenitoras o células B precursoras y tempranas del virus de Leucemia de Murino de Abelson, células pro-B y pre-B de humano transformadas por EBV de inmunoglobulina nula. RESUMEN DE LA INVENCION El método descrito en la presente describe una teenología novedosa que ofrece eficiencia no paralela, flexibilidad, utilidad y velocidad para el descubrimiento y optimización de polipéptidos que tienen especificidad y/o funcionalidad de unión deseadas, que incluye moléculas de unión al antígeno tales como anticuerpos y fragmentos de los mismos, para los fenotipos funcionales y/o de unión deseados. El método novedoso se basa en constructos de transposición y diversas bibliotecas de ADN clonadas en vectores de transposición y su transfección en células huésped por expresión temporal concomitante de una enzima de transposasa funcional. Esto asegura una introducción eficiente y estable de los vectores de expresión basados en transposón en células huésped de vertebrado en una etapa, que pueden clasificarse entonces por un fenotipo funcional o de unión deseado de las proteínas expresadas, después de lo cual las secuencias de codificación relevantes para las proteínas expresadas, que incluyen anticuerpos y fragmentos de los mismos, pueden identificarse por técnicas de clonación y secuenciación de ADN estándar.