CN114085289B - 一种半合成单域抗体库的构建方法及其应用 - Google Patents

一种半合成单域抗体库的构建方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种半合成单域抗体库的构建方法及其应用，涉及抗体工程技术领域。该构建方法包括构建缺失型单域抗体初始库，以缺失型单域抗体初始库为模板，扩增骆驼单域抗体FR1‑FR3区基因片段，另设计并人工合成一段具有多样性的寡聚核苷酸序列，将所述单域抗体FR1‑FR3区基因片段与人工合成片段拼接成具有多样性的全长单域抗体序列，从而制备得到半合成单域抗体库。通过本发明的构建方法得到了高容量、高多样性的单域抗体半合成抗体库，库容量为1.85×109，符合大容量抗体库的标准，并且可以实现抗体库的不断增容。本发明无需免疫骆驼、花费低、耗时短，并可实现对多种类型抗原（如CD20）的单域抗体的筛选。

Description

一种半合成单域抗体库的构建方法及其应用
技术领域
本发明涉及抗体工程技术领域，具体涉及一种半合成单域抗体库的构建方法及该半合成单域抗体库在特异性单域抗体筛选中的应用，尤其涉及应用该库筛选到的抗CD20单域抗体。
背景技术
噬菌体抗体库技术的建立是20世纪90年代抗体工程领域的重大进展，是用于制备特异性抗体的最简单、快速和经济的方法。其原理是将抗体分子的功能片段如单链抗体（ScFv）、抗原结合片段（Fab）、单域抗体（SdAb）等，与单链噬菌体外壳蛋白形成融合蛋白，展示于噬菌体颗粒表面，呈现在噬菌体表面的小分子抗体能够在体外与靶抗原相互作用。抗体表型与基因型之间建立直接联系，使与各种靶标抗原特异性结合的抗体小分子通过淘选得以快速鉴定。例如利用结合在固相的抗原对表达出的噬菌体抗体进行亲和吸附，能从庞大的文库中选择性富集到特异性噬菌体抗体。
20世纪90年代，比利时大学的Hamers-Casterman等在骆驼科动物的血清中发现了一种缺乏轻链的特殊抗体，称之为重链抗体（HcAb）。HcAb不仅完整保留了抗原结合区域结构，而且保持了与抗原结合的高亲和力。重链抗体（HcAb）缺少轻链和重链CH1，只含有重链CH2、CH3和可变区。重链抗体的可变区（VHH）经过基因重组技术人工改构后，在体外表达得到小分子的抗体片段，可以单独稳定地在体外存在，并保留结合抗原的生物学特性，这段小分子被称为单域抗体（SdAbs，或者VHH）。
由于不存在传统抗体的轻重链匹配问题，单域抗体特别适合采用噬菌体展示文库技术进行筛选。噬菌体单域抗体文库一般分为三大类：免疫库、天然库和合成库。骆驼是获得单域抗体最为理想的免疫动物，因为骆驼产生的重链抗体和传统抗体的比率要远高于其他动物（如大小羊驼），而且骆驼免疫后重链抗体的多样性要更好，从而得到理想的单域抗体成功率更高。
毋庸置疑，免疫库是能筛选到有效单域抗体的成功率最高的库。但同时免疫库也存在一些缺陷：有些分子如DNA、RNA或小分子蛋白等免疫原性不强，不足以刺激骆驼产生重链抗体；有的分子有毒性，或者存在污染源，对实验动物造成伤害；此外，单一免疫用抗原蛋白纯度越高越好，因此制备要求高，同时费用也较高；免疫周期较长，因此库的构建周期长；没条件免疫骆驼。针对以上不足，天然库或者合成库是用于筛选单域抗体的另一种选择。
构建天然库的血液来源于没有经过免疫的骆驼，优势是没有免疫时间的限制，缺点是不容易筛选到有效的抗体。合成库的多样性更加丰富，构建合成库的常规流程是，选择一个稳定高效表达的已知单域抗体序列作为骨架载体，通过合成突变型寡核苷酸序列实现对CDR1和/或CDR2和/或CDR3区的多样性改造。
CD20在B细胞淋巴瘤、毛细胞白血病、B细胞慢性白血病和黑色素瘤肿瘤干细胞中均有表达。CD20分子具有不易脱落、与抗体结合后不内化、在人体血清中无游离形式存在等特征。CD20在正常生理组织和肿瘤组织的差异表达特征，使CD20可以作为一个很好的B细胞疾病相关的靶点，如治疗B细胞淋巴瘤等。
大容量半合成库结合了合成库和天然库的优势，能有效实现抗体库的快速构建，节约时间和成本。构建具有高度多样性、通用性好、无抗原偏向性的半合成库具有重要的应用价值，可以用于高通量筛选到临床治疗、医学检验、食品安全等领域中用到的低抗原性、高亲和性抗体，例如可用于筛选抗CD20抗体。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种半合成单域抗体库的构建方法及其应用。通过本发明的构建方法得到了高容量、高多样性的单域抗体半合成抗体库，库容量为1.85×109，符合大容量抗体库的标准，并且可以实现抗体库的不断增容。本发明构建得到的半合成单域抗体库可以用于筛选特异性单域抗体。本发明无需免疫骆驼、花费低、耗时短，并可实现对多种类型抗原（例如CD20）的单域抗体的筛选。
本发明的目的在于提供一种半合成单域抗体库的构建方法及该半合成单域抗体库在特异性单域抗体筛选中的应用，提供了应用此库筛选到的特异性单域抗体，尤其是应用该库筛选到的抗CD20单域抗体。应用此库本发明筛选出3株抗CD20抗原的单域抗体。
本发明提供的技术方案如下：
在一个方面，本发明提供了一种半合成单域抗体库的构建方法，所述方法包括以下步骤：
（A）构建缺失型单域抗体初始库：
（a）扩增天然骆驼中包括骆驼全部重链抗体基因前导序列到CH2区的抗体基因片段，回收纯化PCR产物，得到多样性抗体基因片段；
（b）将回收纯化的PCR产物与T载体连接，连接产物转化感受态细菌，挑取100个以上的阳性克隆进行测序；
（c）根据对测序结果的多样性分析，以回收纯化的PCR产物为模板，设计引物并PCR扩增单域抗体FR1-FR3区基因片段，引物序列如SEQ ID No. 4和SEQ ID No. 5所示；
（d）将步骤（c）扩增得到的PCR产物纯化后连接到T载体，转化感受态细菌，收集阳性克隆的菌落和由此提取得到的质粒，得到缺失型单域抗体初始库冻存菌和质粒DNA；
（B）利用所述缺失型单域抗体初始库构建半合成单域抗体库：
（a1）以缺失型单域抗体初始库为模板，扩增单域抗体FR1-FR3区基因片段；
（b1）设计并人工合成一段寡聚核苷酸序列，序列如SEQ ID No. 6所示，其中MNN一共重复合成至少12次以上；
（c1）将所述单域抗体FR1-FR3区基因片段与人工合成片段拼接组装到一起得到多样性的全长单域抗体基因片段；
（d1）将所述全长单域抗体基因片段与用于展示单域抗体的噬菌粒表达载体连接，连接产物电击转化感受态细菌，转化后菌液涂布到固体筛选培养皿中，收集固体筛选培养皿上菌苔和由此提取得到的质粒，得到半合成全长单域抗体库冻存菌和质粒DNA。
本发明通过从天然骆驼体内扩增单域抗体基因不完全序列与一段人工合成序列进行组装，拼接成具有多样性的全长单域抗体序列；通过合成片段MNN的核苷酸随机性和长度多态性将多样性引入互补决定区CDR3区，构建了具有高度多样性的单域抗体文库。
在一个实施方案中，步骤（a）中，采集5只以上未经免疫任何抗原的骆驼血样分离外周血淋巴细胞，提取总RNA，通过RT-PCR扩增得到cDNA，以cDNA为模板扩增天然骆驼中包括骆驼全部重链抗体基因前导序列到CH2区的抗体基因片段。本文中，“扩增天然骆驼中包括骆驼全部重链抗体基因前导序列到CH2区的抗体基因片段”指的是扩增所采样骆驼体内的全部重链抗体的前导序列到CH2区的抗体片段，即获得具有多样性的重链抗体片段的集合。
在一个实施方案中，步骤（a）中，扩增天然骆驼中包括骆驼全部重链抗体基因前导序列到CH2区的抗体基因片段的引物如SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示。
在一个实施方案中，步骤（b）中，测序的引物序列如SEQ ID No. 3所示。
具体地，SEQ ID No.1和SEQ ID No. 2的序列如下所示：
SEQ ID No.1（CALL001）:5’-GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC-3’；
SEQ ID No.2（CALL002）: 5’-GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGG-3’；
具体地，SEQ ID No.3的序列如下所示：GAGCGGATAACAATTTCACACAGG。
具体地，SEQ ID No.4和SEQ ID No. 5的序列如下所示：
SEQ ID No.4（VHH-F）:5’-CGGCCATGGCGGTCCTGGCTGCTCTTCT-3’；SEQ ID No.5（MCDR2）:5’-ACAGTAATACNGGCNGTGTC-3’；其中N=A，C，T，G。
在一个具体的实施方案中，缺失型单域抗体初始库的构建方法包括分离多只骆驼（至少5只）血样，进行外周血淋巴细胞的分离以及总RNA的提取，通过RT-PCR合成cDNA第一链；以cDNA为模板，使用Taq酶，扩增重链抗体中前导序列至CH2区之间的一段序列，扩增引物的序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No. 2所示；回收700 bp左右的DNA条带（即PCR片段）。
进一步地，可分离来源于30只（但不限于30只）3-4岁龄的未经过抗原免疫的健康骆驼的外周血分离而得淋巴细胞并进行总RNA的提取。
在一个具体的实施方案中，缺失型单域抗体初始库的构建方法还包括将纯化后的PCR片段和T载体进行连接，将连接产物转化化学感受态细菌Top10中，转化后菌液涂布到Amp固体培养皿中；从固体培养皿中挑取界限清楚的100个单菌落（至少100个），接种到含Amp的液体培养基中，摇菌，对100个克隆进行测序，测序引物序列如SEQ ID No. 3所示。
在一个具体的实施方案中，缺失型单域抗体初始库的构建方法还包括对上述测序结果进行多样性分析，根据比对结果，设计能够扩增单域抗体局部区域的上下游引物（扩增VHH局部区域FR1-FR3区的上游引物VHH-F和下游引物MCDR2，引物序列如SEQ ID No. 4和SEQ ID No. 5所示；以回收纯化的PCR产物为模板，使用Taq酶，以SEQ ID No. 4和SEQ IDNo. 5扩增FR1-FR3区，得到的PCR产物经过纯化后连接到T载体中；连接产物电击转化感受态细菌Top10中，转化后菌液涂布到Amp固体培养皿中，37℃孵箱中进行过夜培养；用2-YT培养基将固体培养皿上菌苔全部刮落下来，加20%甘油，-80℃冻存，即为缺失型单域抗体初始库冻存菌，用于保存和扩增单域抗体的部分区域以及用于单域抗体噬菌体库的不断扩容。
在一个实施方案中，利用所述缺失型单域抗体初始库构建半合成单域抗体库包括以上述缺失型单域抗体初始库为模板，使用Prime Star高保真DNA聚合酶，以特异性引物VHH-F和MCDR2为上下游引物进行PCR反应，扩增单域抗体FR1-FR3区基因。
在一个实施方案中，利用所述缺失型单域抗体初始库构建半合成单域抗体库包括研究分析缺失型单域抗体初始库的构建中100条序列测序结果，通过比较和分析FR3-CDR3-FR4区序列，设计和人工合成一段寡聚核苷酸序列，序列如SEQ ID No. 6所示，将其与FR1-FR3区基因进行拼接，获得全长单域抗体基因。
人工合成的寡聚核苷酸序列为：
GCTGCTAACGGTAACCTGGGTACCCTGGCCCCA(MNN)nACAGTAATACANGGCNGTGTC（SEQ IDNo. 6）；其中MNN一共合成12次以上。
在一个具体的实施方案中，人工合成一段寡聚核苷酸序列18AA，其中MNN一共合成18次，即MNNMNNMNNMNNMNNMNNMNNMNNMNNMNNMNNMNNMNNMNNMNNMNNMNNMNNMNNMNNMNN。
在一个实施方案中，所述展示单域抗体的噬菌粒表达载体为pSC-NEN，所述载体在噬菌体DIII蛋白之前引入Nco I-EcoR I-Not I酶切位点。
在一个实施方案中，将融合的全长单域抗体基因用Not I和Nco I进行双酶切，纯化后与用Not I、Nco I以及EcoR I三个酶进行三酶切的pSC-NEN载体片段进行连接，将连接产物纯化后电击转化TG1感受态细菌。
进一步地，将转化后菌液涂布到Amp固体培养皿中，37℃孵箱中进行过夜培养；用2-YT培养基将固体培养皿上菌苔全部刮落下来，加20%甘油，-80℃冻存，得到半合成单域抗体库冻存菌。由部分这些菌中提取得到的质粒DNA，得到半合成单域抗体库质粒DNA；本发明半合成单域抗体库的库容量为1.85×109。
在一个具体的实施方案中，半合成单域抗体库的构建方法，所述方法包括以下：
（1）采集30只（3-4岁龄）未经免疫任何抗原的骆驼血样，分离外周血淋巴细胞；提取总RNA，通过RT-PCR扩增得到cDNA；以cDNA为模板，使用Taq酶，采用一组几乎覆盖骆驼全部重链抗体的基因前导序列到CH2区之间序列的特异性引物（如SEQ ID No. 1和SEQ IDNo. 2所示）进行PCR反应，在获得的PCR产物中，胶回收纯化700 bp左右的DNA条带；
（2）将回收纯化的PCR片段连接到T载体中，常规转化化学感受态细菌Top10，转化后菌液涂布到Amp抗性的2-YT固体培养皿中，37℃孵箱中进行过夜培养；随机挑取100个以上的单菌落，接种到含Amp的液体培养基中，摇菌，进行测序，测序引物序列如SEQ ID No. 3所示；
（3）对测序结果进行多样性分析，根据比对结果设计能够扩增单域抗体局部区域FR1-FR3区的上下游引物，引物序列如SEQ ID No. 4和SEQ ID No. 5所示；以步骤（1）纯化后的PCR产物为模板，使用Taq酶，以VHH-F(SEQ ID No. 4)和MCDR2(SEQ ID No. 5)为上下游引物扩增单域抗体FR1-FR3区，得到的PCR产物经过纯化后连接到T载体中；连接产物电击转化感受态细菌Top10中，转化后菌液涂布到Amp固体培养皿中，37℃孵箱中进行过夜培养；用10 mL的2-YT培养基将固体培养皿上菌苔全部刮落下来，加20%甘油，-80℃冻存，即为缺失型单域抗体初始库冻存菌，用于保存和扩增单域抗体的部分区域和单域抗体噬菌体库的不断扩容；
（4）以缺失型单域抗体初始库为模板，使用Prime Star高保真DNA聚合酶，以特异性引物VHH-F（SEQ ID No. 4）和MCDR2(SEQ ID No. 5)为上下游引物进行PCR反应，扩增单域抗体FR1-FR3区基因；
（5）参考步骤（2）中多菌落测序结果，通过比较和分析FR3-CDR3-FR4区序列，设计和合成一段寡聚核苷酸序列18AA，序列如SEQ ID No. 6所示（其中MNN一共合成18次），与步骤（4）中的FR1-FR3区基因进行融合，通过多轮PCR进行组装，获得全长单域抗体基因；
（6）将融合后的全长单域抗体基因用Not I和Nco I进行双酶切，纯化后与用NotI、Nco I以及EcoR I三个酶进行三酶切的pSC-NEN载体片段进行连接，将连接产物纯化后置换到100 μL的纯净水中，分10次电击转化TG1感受态细菌，将转化菌液全部涂布在含100 μg/mL氨苄青霉素和25 mM葡萄糖的固体培养皿上，37℃孵箱中进行过夜培养；用10 mL的2-YT培养基将固体培养皿上菌苔全部刮落下来，一部分加20%甘油，-80℃冻存，另一部分用于提取质粒DNA，即为半合成单域抗体库冻存菌和质粒DNA。
在一个具体的实施方案中，通过多轮PCR进行组装为通过融合PCR进行拼接组装。将FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3区DNA片段和合成基因片段18AA按照摩尔比为1：1的比例进行重叠延伸PCR反应，使用Prime Star高保真DNA聚合酶，首先经过5个循环的拼接反应使得FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3和18AA基因片段进行融合，拼接成为完整的单域抗体基因，扩增条件为：95℃，5 min，然后98℃，30 sec，52℃，30 sec，72℃，50 sec，共5个循环。5个循环结束后，加入引物VHH-F（SEQ ID No. 4）和VHH-KAR（SEQ ID No. 9）进行扩增反应，扩增条件为：95℃，5 min，然后98℃，30 sec，58℃，30 sec，72℃，50 sec，共30个循环，最终延长为 72℃，10 min，得到完整的单域抗体基因。
在一个具体的实施方案中，噬菌体展示单域抗体的噬菌粒载体pSC-NEN的构建方法包括：在商品化噬菌体载体pCANTAB-5E的基础上，人工合成两段寡核苷酸序列，序列如SEQ ID No. 7和SEQ ID No. 8所示，将两段寡核苷酸序列退火生成一段连接头以及用SfiI以及Not I双酶切处理的噬菌体载体pCANTAB-5E质粒进行连接，转化Top10细菌，挑选鉴定阳性克隆质粒。新构建的质粒载体pSC-NEN在噬菌体DIII蛋白之前引入Nco I-EcoR I-NotI酶切位点，以利于单域抗体基因的插入。
在获得半合成单域抗体库后，可进行半合成单域抗体库的多样性分析。
在第二方面，本发明提供了所述的构建方法得到的半合成单域抗体库。
在第三方面，本发明提供了所述的半合成单域抗体库在筛选单域抗体中的应用，所述应用包括在免疫管中包被抗原，利用所述半合成单域抗体库进行多轮（如四轮）富集筛选、噬菌体ELISA、测序鉴定以及对富集的单域抗体进行抗体表达和亲和力鉴定。
在第四方面，本发明提供了应用所述半合成单域抗体库筛选到的单域抗体。
在一个实施方案中，本发明还包括含有所述单域抗体的药剂、试剂、检测试剂盒，所述试剂、检测试剂盒用于检测样品中是否存在所述的目标靶点分子；本发明还包括所述单域抗体在制备用于治疗或预防和目标靶分子表达异常的相关疾病的药物中的用途。
在一个实施方案中，所述单域抗体为抗CD20单域抗体，其氨基酸序列如SEQ IDNo. 12、SEQ ID No. 13或SEQ ID No. 14所示。
在一个实施方案中，本发明还包括抗CD20单域抗体在在制备抗肿瘤药物中的用途，所述肿瘤包括表达CD20的癌症，如B细胞非霍奇金淋巴瘤。
本发明所述的抗CD20单域抗体的生物筛选过程为：免疫管中包被CD20抗原→四轮富集筛选半合成单域抗体库→噬菌体ELISA→测序鉴定→对富集的单域抗体进行抗体表达和亲和力鉴定。本发明中，用CD20抗原筛选到了特异性CD20单域抗体。
本发明公开了一种从天然骆驼体内扩增单域抗体基因不完全序列和一段人工合成序列进行组装；其中单域抗体不完全序列可包括单域抗体的FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3区，人工合成序列可以包括单域抗体的CDR3-FR4区，两者通过多轮PCR进行组装，得到多样性单域抗体基因的全长序列。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明能够快速实现半合成单域抗体库的构建，构建了高容量、高多样性的单域抗体半合成抗体库，库容量为1.85×109，符合大容量抗体库的标准，并且可以继续增容；
本发明有利于解决免疫骆驼花费高，耗时长，没有合适的免疫抗原等问题，并实现对多种类抗原的单域抗体筛选；
本发明还公开了该抗体库在筛选针对CD20蛋白的单域抗体方面的应用，由本发明构建的半合成单域抗体库能够筛选得到可应用于临床治疗、医学检验、食品安全领域中特异性好、亲和性高的单域抗体；
本发明半合成库结合了天然库和合成库优势，主要用于高通量筛选可供临床治疗、医学检验、食品安全等领域中使用的低抗原性、高亲和性、高特异性的单域抗体，为筛选出具有应用价值的特异性单域抗体奠定了基础。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为骆驼抗体基因一轮PCR电泳图；
图2为骆驼单域抗体基因FR1-FR3区PCR电泳图；
图3为不对称PCR扩增单域抗体基因FR1-FR3区PCR电泳图；
图4为单域抗体全长基因融合PCR电泳图；
图5为噬菌体抗体库电转TG1感受态细菌；
图6为菌落PCR鉴定半合成单域抗体库电泳图；
图7为PHAGE-ELISA检测阳性抗CD20单域抗体；
图8为三株CD20单域抗体的真核表达蛋白电泳图；
图9为三株CD20单域抗体的亲和力测定。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1. 单域抗体FR1-FR3区基因的保存和构建.
1.1 分离骆驼外周血淋巴细胞（PBMCs）.
采集30只未经免疫任何抗原的双峰骆驼的血样，收集到抗凝采血管中，每只骆驼血样取5 mL，混合后24小时内，分离外周血淋巴细胞。
具体过程为：将150 mL左右的血液从抗凝采血管中取出来，用DPBS液体等体积稀释，轻柔混匀。取12个50 mL离心管，每管加入15 mL的淋巴细胞分离液，然后沿管壁滴加25mL左右DPBS稀释后的血液到离心管中淋巴细胞分离液上，800 g室温离心30 min。离心结束，离心管中的液体从上至下将分为四层，分别是血浆层、PBMCs层、淋巴细胞分离液层和红细胞层。收集PBMCs层的淋巴细胞，小心转入一个新的15 mL离心管中。
1.2 总RNA的提取.
取1-2 mL的PBMCs细胞，2000 g离心10 min，弃上清，留细胞沉淀。加入1 mLTrizol液裂解细胞沉淀，用移液枪反复吹打直至充分裂解，加入200 μL氯仿颠倒混匀，室温放置5 min；4℃离心，12000 rpm 15 min；转上层水相450 μL于另一个1.5 mL的EP管中，加入等体积的异丙醇，混匀，静置15 min；4℃离心，12000 rpm 10 min；弃上清，加入预冷的75％乙醇(800-1000 μL)；4℃离心，7500 rpm 5 min；弃上清，将EP管倒置于吸纸上，室温放置风干，将沉淀在管底部的RNA重新溶于30 μL DEPC水中。
1.3 cDNA合成.
每个PCR小管中加8 μL RNA为模板，1 μL随机六核苷酸引物（50 ng/μL），1μL 10mM dNTP，充分混匀；65℃孵育5 min，冰上放置1 min；继续依次加入2 μL 10×反转录缓冲液，4 μL 25 mM氯化镁，2 μL 0.1M DTT，1 μL RNaseOUT™ (40U/μL)，1μL SuperScript®Ⅲ RT(200U/μL)。25℃作用10分钟，然后50℃作用50分钟，85℃作用5分钟终止反应，冰上放置；短暂离心，在反应液体中加入1 μL RNase H，37℃作用20 min以去除RNA。
1.4 PCR实验.
第一步是利用IgG特异性上游引物CALL001（SEQ ID No. 1）和下游引物CALL002（SEQ ID No. 2）扩增骆驼重链抗体基因的前导序列至CH2区，使用Taq酶进行PCR扩增，扩增条件为：98℃，3 min，然后98℃，30 sec，56℃，30 sec，72℃，50 sec，共30个循环，最终延长为 72℃，10 min。
PCR产物经1.5%的凝胶电泳鉴定，显示有两条带，分别为1000 bp和750 bp左右，电泳结果如图1所示，采用胶回收试剂盒回收纯化750 bp左右的条带，回收后产物进行定量。
1.5 连接转化.
将纯化后的PCR片段和pGEM-T载体进行连接，连接产物常规转化化学感受态细菌Top10，取部分转化后菌液涂布到含100 μg/mL氨苄青霉素的2-YT固体培养皿中，放置于37℃孵育箱中，过夜培养。
1.6 序列分析.
从固体培养皿中挑取界限清楚的100个单菌落(可不限于100个)，接种到含100 μg/mL氨苄青霉素的液体培养基中，摇菌，待OD值为1-2时，每管菌液取200 μL，用pGEM-T载体上测序引物RV-M（SEQ ID No. 3）进行测序。对全部测序结果进行多样性分析，根据比对结果设计扩增单域抗体局部区域基因的上下游引物。
1.7 FR1-FR3区基因的扩增.
以1.4中纯化后的PCR产物为模板，使用Taq酶，以VHH-F(SEQ ID No. 4)和MCDR2(SEQ ID No. 5)为上下游引物扩增FR1-FR3区，对单域抗体FR1-FR3区基因库进行PCR扩增，扩增条件为：95℃，5 min，然后98℃，30 sec，56℃，30 sec，72℃，40 sec，共30个循环，最终延长为 72℃，10 min。PCR产物经1.5%的凝胶电泳鉴定，电泳结果如图2所示，采用胶回收试剂盒回收纯化330 bp左右的主条带。
取1 μg左右纯化后的PCR产物和500 ng左右的pGEM-T载体片段进行连接，连接后产物置换到20-40 μL纯净水中，分10次电击转化TG1感受态细菌，将转化菌液均匀涂布于含有100 μg/mL氨苄青霉素的2-YT固体培养皿中，37℃孵箱中进行过夜培养，用10 mL的2-YT培养基将固体培养皿上菌苔全部刮落下来，一部分提取质粒DNA，剩余菌液加入20%甘油，-80℃冻存，即为缺失型单域抗体初始库冻存菌和质粒DNA。
实施例2. 半合成单域抗体库的构建.
2.1 载体改构.
pSC-NEN噬菌体展示载体是在商品化噬菌体载体pCANTAB-5E的基础上改造而成。人工合成两段寡核苷酸序列，序列如SEQ ID No. 7和SEQ ID No. 8所示，将两段寡核苷酸序列调整浓度至5 μM，各取1 μL，补水至10 μL，加入到PCR管中。95℃冰浴5 min，室温缓慢降温至65℃，维持10 min，缓慢降温至室温，退火生成一段连接头。取2 μL退火后的连接头以及用Sfi I以及Not I双酶切处理的噬菌体载体pCANTAB-5E质粒进行连接，转化Top10细菌，挑选鉴定阳性克隆质粒。新构建的质粒载体pSC-NEN在噬菌体DIII蛋白之前引入Nco I-EcoR I-Not I酶切位点，以利于单域抗体基因的插入。
2.2 FR1-FR3区基因的扩增.
以缺失型单域抗体初始库为模板，使用Prime Star高保真DNA聚合酶，以VHH-F（SEQ ID No. 4）和MCDR2（SEQ ID No. 5）为上下游引物，对单域抗体FR1-FR3区基因库进行PCR扩增，扩增条件为：95℃，5 min，然后98℃，30 sec，56℃，30 sec，72℃，50 sec，共30个循环，最终延长为 72℃，10 min。PCR产物经1.5%的凝胶电泳鉴定，采用胶回收试剂盒回收纯化小于400 bp左右的主条带；以回收后的产物作为模板，再次以VHH-F（SEQ ID No.4）和MCDR2（SEQ ID No. 5）为上下游引物，采用不对称PCR进行扩增，获得FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3的DNA片段，经1.5%的凝胶电泳鉴定，电泳结果如图3所示，采用胶回收试剂盒回收纯化小于400 bp左右的主条带。
2.3 CDR3-FR4区的设计及合成.
参考本研究中实施例1中100个（不限于100个）VHH序列测序结果，通过比较和分析FR3-CDR3-FR4区序列，设计和合成一段基因18AA，采用基因合成的方法，体外合成下列序列18AA：
GCTGCTAACGGTAACCTGGGTACCCTGGCCCCA(MNN)18ACAGTAATACANGGCNGTGTC；
其中MNN一共是合成18次，但不限于仅仅18次，即
MNNMNNMNNMNNMNNMNNMNNMNNMNNMNNMNNMNNMNNMNNMNNMNNMNNMNNMNNMNNMNN（其中，M：AC；N：ATGC）。
2.4 多样性单域抗体基因的融合.
将FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3区DNA片段和合成基因18AA按照摩尔比为1：1的比例进行重叠延伸PCR反应，使用Prime Star高保真DNA聚合酶，首先经过5个循环的拼接反应使得FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3和18AA基因片段进行融合，拼接成为完整的单域抗体基因，扩增条件为：95℃，5 min，然后98℃，30 sec，52℃，30 sec，72℃，50 sec，共5个循环。5个循环结束后，加入引物VHH-F（SEQ ID No. 4）和VHH-KAR（SEQ ID No. 9）进行扩增反应，扩增条件为：95℃，5 min，然后98℃，30 sec，58℃，30 sec，72℃，50 sec，共30个循环，最终延长为 72℃，10 min，得到完整的单域抗体基因，经1.5%的凝胶电泳鉴定，电泳结果如图4所示，采用胶回收试剂盒回收纯化430 bp左右的主条带，回收后产物进行定量。
2.5 半合成单域抗体库的制备.
使用Not I和NcoI对2-3 μg单域抗体基因片段进行双酶切，回收酶切后单域抗体片段并进行定量。使用Not I和NcoI以及EcoR I对2-3 μg的pSC-NEN载体进行三酶切，回收酶切后质粒片段并进行定量。取1 μg左右酶切后的单域抗体基因片段和1-2 μg左右的pSC-NEN载体片段进行连接，将连接后产物置换到20-40 μL纯净水中，分10次电击转化TG1感受态细菌，将转化菌均匀涂布于含有100 μg/mL氨苄青霉素和25 mM葡萄糖的2-YT固体培养皿中，37℃孵箱中进行过夜培养，用10 mL的2-YT培养基将固体培养皿上菌苔全部刮落下来，一部分提取质粒DNA，剩余菌液加入20%甘油，-80℃冻存，即为半合成单域抗体库冻存菌和质粒DNA。
电转感受态TG1同时，取1 μL（0.01 ng/μL）pUC19质粒转化100 μL的感受态细胞。向转化反应液中加入900 μL SOC培养基，经过热激和复苏后，梯度稀释，各取100 μL均匀涂布于含有100 μg/mL氨苄青霉素的2-YT固体培养皿中，培养过夜，计数菌落个数，结果见图5，计算转化效率，转化效率要求至少>1×10^10cfu/μgDNA。
同时将半合成单域抗体库原始菌液进行10倍梯度稀释，不同梯度菌液各取200μL涂板，37℃孵箱中进行过夜培养，计算菌落个数，并且随机挑取100个菌落（不限于100个），用引物CX01（SEQ ID No. 10）和CX02（SEQ ID No. 11）进行菌落PCR鉴定和测序，菌落PCR电泳结果见图6。通过计算转化效率，插入率，序列正确率，获得半合成单域抗体库的库容量为1.85×109，符合大容量噬菌体抗体库的要求。对测序结果进行分析，所有序列均不相同，说明了半合成库具有高度的多样性。
实施例3. 抗CD20抗体的生物淘选.
3.1 半合成单域抗体库的呈现.
取一定体积的抗体库菌液加入到200 mL的2YT-GA培养基中，初始OD值调整到0.4，37℃，220rpm摇菌，培养至OD≈0.7；按MOI≈10加入M13KO7辅助噬菌体，约5×1011cfu，室温静置30 min；37℃，150 rpm继续培养30 min，4000 rpm离心15 min，弃上清，不留残液；用200 mL含100 μg/mL氨苄青霉素，50 μg/mL卡那霉素，0.05M阿拉伯糖的2-YT-KAA培养基重悬菌团，28℃，220rpm，过夜培养至少16小时。
3.2 抗体库噬菌体的沉降.
收集过夜培养的噬菌体抗体库菌液离心，4℃，8000 rpm×30 min，收集上清，装到500 mL的离心瓶中，在200 mL上清中加入50 mL PEG/NaCl溶液，分装到两个200 mL的离心瓶中，冰浴放置至少4小时以上，4℃，8000 rpm离心30 min，弃上清，保留沉淀，各取30 mL冰预冷的PBS重悬两个离心瓶中的白色噬菌体沉淀，转移到2个50 mL灭菌离心管中；在30 mL的上清液中加入10 mL的PEG/NaCl溶液，冰浴至少1小时，4℃，12000 rpm离心20 min，充分弃上清，不留残液；各取2 mL冰预冷的PBS重悬两个离心瓶中的白色噬菌体沉淀，合并后4℃放置，对噬菌体滴度进行测定。取出合适的量用于抗体的筛选，余下包装好的噬菌体抗体库加入甘油至终浓度为20%，-80℃冻存。
3.3 CD20抗体的淘选
以CD20为抗原包被免疫管，将CD20蛋白加入到PBS液中，每只免疫管加包被液体1mL，首轮抗原包被量为10 μg/管，其后每轮抗原包被量2倍递减。包被过夜后，采用含2％牛血清白蛋白(BSA)的PBS进行封闭，向免疫管中加入半合成抗体库进行抗体抗原结合，首轮噬菌体加入量为1×1012cfu，其后每轮噬菌体加入量2倍递减；孵育2小时后，用PBST反复冲洗，洗去未结合的噬菌体，用pH=2.2的0.1M HCl-Glycine （盐酸-甘氨酸缓冲液）洗脱抗体，将洗脱下来的抗体重新感染OD≈0.4的TG1细菌，室温静置30 min，37℃，150 rpm继续培养30min。将感染后菌液进行梯度稀释，各取200 μL涂布在含有100 μg/mL氨苄青霉素和25mM葡萄糖的的2-YT（2-YT-AG）固体培养皿中，过夜培养，计算菌落个数，计算产出的噬菌体数，计算投入产出比。剩余菌液全部涂布在2-YT-GA固体大培养皿上，过夜培养，将噬菌体感染的细菌菌苔全部从固体培养皿上刮下来，重新呈现，沉降噬菌体，用于下一轮筛选，在CD20抗体的筛选中，先后用了四轮筛选。
3.4 PHAGE-ELISA.
将第二轮、第三轮、第四轮中用于计数的小固体培养皿上的菌落随机挑取94个单菌落（但不限于94个）培养在96孔深孔板中的2-YT-AG液体培养基中，37℃，220 rpm培养约6小时至OD=0.7；加入辅助噬菌体M13KO7进行感染，室温静置30min；37℃，150 rpm继续培养30 min，2000 rpm离心15 min，弃上清，不留残液；用含100 μg/mL氨苄青霉素，50 μg/mL卡那霉素，0.05M阿拉伯糖的2-YT培养基（2-YT-KAA），按照600 μL/孔重悬菌团，28℃，220rpm，过夜培养至少16小时；
用CD20抗原包被ELISA板，每孔抗原包被量约200 ng，同时设置无关抗原混合物作为对照。对扩增后的噬菌体上清液进行ELISA鉴定，实验孔和对照孔的OD值差别在三倍以上者视为阳性克隆。实验结果见图7，用CX01（SEQ ID No. 10）对阳性克隆进行测序鉴定，对测序结果进行分析，其中有三组抗体（1，5，8号）得以富集，氨基酸序列如SEQ ID No. 12，SEQID No. 13， SEQ ID No. 14所示。
实施例4. 单域抗体的表达.
4.1 构建单域抗体表达载体.
以筛选到的3组CD20单域抗体噬菌粒质粒为模板，使用PVHHSAL（SEQ ID No. 15）和DVHHNHE（SEQ ID No. 16）为引物扩增单域抗体区域的基因序列，片段大小为420 bp左右。采用胶回收试剂盒回收纯化扩增后PCR产物，回收后单域抗体片段通过用Sal I和Nhe I进行双酶切，连接到同样用Sal I和Nhe I进行双酶切的真核表达载体pCDNA-HIS中，连接后转化感受态细菌Top10，培养过夜，随机挑取菌落，用CX03（SEQ ID No. 17）进行测序鉴定，对序列正确的菌液进行中量培养，提取质粒。
4.2 蛋白表达和纯化.
培养悬浮293细胞浓度至1×106个/mL，活性保持在96%时，取50 mL细胞进行转染。质粒转染量为40 μg，转染试剂用FectoPRO DNA，全程注意无菌操作。然后细胞放置细胞摇床中孵育培养72-96h，37℃，125 rpm，每天检测一次细胞的活度，待细胞活度降至80%以下时，即可收样进行单域抗体纯化。
将待纯化的细胞液回收至离心管中，8000 rpm离心10 min，上清转移到干净的容器中，用真空泵过滤上清（0.45 μM孔径）。利用蛋白上的His标签，采用AKTA纯化系统和Ni-NTA柱亲和纯化的方法对单域抗体蛋白进行纯化。收集不同浓度咪唑的平衡缓冲液洗脱目标蛋白，对每个洗脱组分进行SDS-PAGE分析，比较不同梯度洗脱液中的蛋白含量和纯度，收集纯度最高的蛋白液进行脱盐置换。纯化后单域抗体蛋白大小约为15kDa，蛋白电泳结果见图8所示。
4.3 亲和力测定.
用CD20抗原包被ELISA板，每孔抗原包被量约200 ng，同时设置空白孔作为对照。将抗体3倍等比稀释为15个浓度，起始浓度设为20 μg/mL，每个梯度设置三个复孔，二抗为HRP标记的抗His抗体，OPD显色，读取OD值，复孔求平均值，绘制亲和力曲线，结果如图9所示，证明经过四轮淘洗-筛选后富集得到的单域抗体分子可以与CD20特异性结合。
本发明中构建的纳米抗体半合成库多样性丰富，并且具有应用价值，为后续的其他抗体的筛选提供了良好的平台。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
序列表
<110> 安卡沃生物科技（北京）有限责任公司
<120> 一种半合成单域抗体库的构建方法及其应用
<130> PA21046070
<160> 17
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ggtacgtgct gttgaactgt tcc 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gtcctggctg ctcttctaca agg 23
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gagcggataa caatttcaca cagg 24
<210> 4
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
cggccatggc ggtcctggct gctcttct 28
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 5
acagtaatac nggcngtgtc 20
<210> 6
<211> 90
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (35)..(36)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (38)..(39)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (41)..(42)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (44)..(45)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (47)..(48)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (50)..(51)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (53)..(54)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (56)..(57)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (59)..(60)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (62)..(63)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (65)..(66)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (68)..(69)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (81)..(81)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (85)..(85)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 6
gctgctaacg gtaacctggg taccctggcc ccamnnmnnm nnmnnmnnmn nmnnmnnmnn 60
mnnmnnmnna cagtaataca nggcngtgtc 90
<210> 7
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
cggccccatg gatacggaat tccggagc 28
<210> 8
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
ggccgctccg gaattccgta tccatggggc cggct 35
<210> 9
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
tcccgcggcc gcgctgctaa cggtcccctg ggt 33
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
gattagcgga tcctacctg 19
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
gatgatgatg tgcggccgc 19
<210> 12
<211> 136
<212> PRT
<213> 1号VHH序列
<400> 12
Ala Val Leu Ala Ala Leu Leu Gln Gly Val Gln Ala Gln Val Gln Leu
1 5 10 15
Ala Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ser Gly Gly Ser Leu Arg Leu
20 25 30
Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Val Ser Arg Tyr Arg Met Gly Trp
35 40 45
Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala Phe Ile His
50 55 60
Ser Asp Gly Ser Thr Ile Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr
65 70 75 80
Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser
85 90 95
Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Phe Phe Arg Asn Pro
100 105 110
Arg Asn His Gly Ser Trp Arg Pro Arg Phe Trp Ser Ser Trp Gly Gln
115 120 125
Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
130 135
<210> 13
<211> 136
<212> PRT
<213> 5号VHH序列
<400> 13
Ala Val Leu Ala Ala Leu Leu Gln Gly Val Gln Ala Gln Val Gln Leu
1 5 10 15
Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Asp Gly Gly Ser Leu Arg Leu
20 25 30
Ser Cys Ala Ala Ser Glu Tyr Asn Ser Ile Arg Tyr Val Gly Trp Phe
35 40 45
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala Ser Ile Tyr Thr
50 55 60
Arg Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asn Ser Val Arg Gly Arg Phe Thr
65 70 75 80
Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser
85 90 95
Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ile Ile Ser Arg Lys
100 105 110
Arg Ile Pro Glu Arg Trp Arg Leu Ser Ala Arg Ala Trp Trp Gly Gln
115 120 125
Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
130 135
<210> 14
<211> 137
<212> PRT
<213> 8号VHH序列
<400> 14
Ala Val Leu Ala Ala Leu Leu Gln Gly Val Gln Ala Gln Val Gln Leu
1 5 10 15
Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Glu Ala Gly Lys Ser Leu Lys Leu
20 25 30
Ser Cys Val Ala Ser Ala Leu Thr Glu Asp Thr Lys Ser Met Ala Trp
35 40 45
Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Gly Val Ala Thr Ile Asp
50 55 60
Thr Thr Lys Leu Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe
65 70 75 80
Thr Ile Ser Gln Asp Ala Ala Glu Lys Thr Val Tyr Leu Gln Met Asp
85 90 95
Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Val Thr Lys Leu
100 105 110
Ala Trp Arg Arg Pro Trp Arg Thr Pro Arg Leu Thr Thr Val Trp Gly
115 120 125
Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
130 135
<210> 15
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
cgggtcgacc ggtgcggtcc tggctgctct tctaca 36
<210> 16
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
tggggctagc gctgctaacg gtaacctggg t 31
<210> 17
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
gagtgacaat gacatccac 19

Claims (9)

1.一种半合成单域抗体库的构建方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
（A）构建缺失型单域抗体初始库：
（a）扩增天然骆驼中包括骆驼全部重链抗体基因前导序列到CH2区的抗体基因片段，回收纯化PCR产物；
（b）将回收纯化的PCR产物与T载体连接，连接产物转化感受态细菌，挑取100个以上的阳性克隆进行测序；
（c）根据测序结果的多样性分析，以回收纯化的PCR产物为模板，设计引物并PCR扩增单域抗体FR1-FR3区基因片段，引物序列如SEQ ID No. 4和SEQ ID No. 5所示；
（d）将步骤（c）扩增得到的PCR产物纯化后与T载体连接，转化感受态细菌，收集阳性克隆的菌落和由此提取得到的质粒，得到缺失型单域抗体初始库；
（B）利用所述缺失型单域抗体初始库构建半合成单域抗体库：
（a1）以缺失型单域抗体初始库为模板，扩增单域抗体FR1-FR3区基因片段；
（b1）设计并人工合成一段寡聚核苷酸序列，序列如SEQ ID No. 6所示；其中MNN共重复合成至少12次以上；
（c1）将所述单域抗体FR1-FR3区基因片段与人工合成片段拼接组装到一起得到多样性的全长单域抗体基因片段；
（d1）将所述全长单域抗体基因片段与用于展示单域抗体的噬菌粒表达载体连接，连接产物电击转化感受态细菌，转化后菌液涂布到固体筛选培养皿中，收集固体筛选培养皿上菌苔和由此提取得到的质粒，得到半合成单域抗体库。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤（a）中，采集5只以上未经免疫任何抗原的骆驼血样分离外周血淋巴细胞，提取总RNA，通过RT-PCR扩增得到cDNA，以cDNA为模板扩增天然骆驼中包括骆驼全部重链抗体基因前导序列到CH2区的抗体基因片段。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤（a）中，扩增天然骆驼中包括骆驼全部重链抗体基因前导序列到CH2区的抗体基因片段的引物如SEQ ID No. 1和SEQ ID No.2所示。
4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤（b）中，测序的引物序列如SEQ IDNo. 3所示。
5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤（c1）中，通过融合PCR将所述单域抗体FR1-FR3区基因片段与人工合成片段拼接组装到一起。
6.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤（d1）中，所述展示单域抗体的噬菌粒表达载体为pSC-NEN，所述载体在噬菌体DIII蛋白之前引入Nco I-EcoR I-Not I酶切位点。
7.权利要求1-6中任一项所述的构建方法得到的半合成单域抗体库。
8.权利要求7所述的半合成单域抗体库在筛选单域抗体中的应用，其特征在于，所述应用包括在免疫管中包被抗原，利用所述半合成单域抗体库进行四轮富集筛选、噬菌体ELISA、测序鉴定以及对富集的单域抗体进行抗体表达和亲和力鉴定。
9.应用权利要求7所述的半合成单域抗体库筛选到的单域抗体，所述单域抗体为抗CD20单域抗体，其氨基酸序列如SEQ ID No. 12所示。
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