CN114181314A

CN114181314A - 一种用于筛选高表达量细胞系的纳米抗体以及方法和试剂盒

Info

Publication number: CN114181314A
Application number: CN202111612281.2A
Authority: CN
Inventors: 朱迪; 刘江海; 王征
Original assignee: Shanghai Baoji Pharmaceutical Co ltd; Chengdu Shengshijunlian Biotechnology Co ltd
Current assignee: Chengdu Shengshijunlian Biotechnology Co ltd; Shanghai Baoji Pharmaceutical Co ltd
Priority date: 2021-12-27
Filing date: 2021-12-27
Publication date: 2022-03-15
Anticipated expiration: 2041-12-27
Also published as: CN114181314B

Abstract

本发明公开了一种用于筛选高表达量细胞系的纳米抗体以及方法和试剂盒。该纳米抗体具有如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列的VHH链。本发明构建了噬菌体展示纳米抗体库，通过筛选获得了人源化IgG1FC特异性的VHH，并专门比较了传统荧光抗体(山羊抗人IgG(H+L)交叉吸附二抗,Alexa Fluor 488，Thermo Fisher)和重组荧光抗体(VHH‑GFP)筛选人IgG1单克隆抗体CHO细胞系，为选择合适的荧光抗体提供了合理的基础。

Description

一种用于筛选高表达量细胞系的纳米抗体以及方法和试剂盒

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种用于筛选高表达量细胞系的纳米抗体以及方法和试剂盒。

背景技术

抗免疫球蛋白G二抗是进行基础研究和医学诊断的基本工具之一。但实验过程复杂，成本效益低，难以避免外源性物质的影响，且违反动物福利原则。因此，有必要研发一种简单高效，绿色可替代性实验方案。已有研究证明，带有绿色荧光蛋白(GFP)的单链可变片段(ScFv)融合抗体可在流式细胞术或免疫荧光实验中直接标记细胞，避免因标记荧光素基团而影响抗原结合力。1993年，科学家Hamers-Casterman首次报道骆驼血液中存在一种天然缺乏CH1结构域和轻链的重链抗体，即纳米抗体(Nanobody,Nb)，是己知的可结合目标抗原的最小单位。因其具有很好的结构稳定性，易于在原核表达系统中表达，以及经简单的工程改造可获得适合体外和体内应用的试剂而受到赞赏。纳米抗体在亲和力方面与scFv相当，但在可溶性、稳定性、表达产率以及DNA操作、文库构建的容易性方面超越scFv。相对于传统的IgG(150kDa)，Nb的微小尺寸和扩展的CDRH3赋予了与抗原的隐蔽表位结合的独特能力。Nb基于上述诸多优良特性，能有效地克服单克隆抗体为检测抗体的一些不足和缺陷。

因此，本研究采用噬菌体展示技术筛选特异性结合人IgG1 FC片段的纳米抗体。然后，将纳米体与绿色荧光蛋白(GFP)融合并在大肠杆菌中大规模生产。用纯化的重组荧光抗体(VHH-GFP)筛选高表达人IgG1单克隆抗体的CHO细胞株。

发明内容

针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种用于筛选高表达量细胞系的纳米抗体以及方法和试剂盒，能够快速有效的筛选出亚克隆表达量高的细胞系。

为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种抗人抗体FC片段的纳米抗体，该纳米抗体具有如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列的VHH链。

进一步地，VHH链还可以是与如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示的序列具有80％同源性以上，且具有相同功能的氨基酸序列。

一种用于筛选高表达量细胞系的方法，包括以下步骤：

(1)构建稳定表达人IgG1的细胞系；

(2)对构建得到的细胞系进行培养，然后加入上述纳米抗体，继续培育以后检测thermo抗体和纳米抗体的平均荧光强度值，根据平均荧光强度值筛选出高表达量的细胞系。

进一步地，步骤(1)的具体过程为：

合成抗Her2的人源IgG1抗体对应的DNA序列，将其克隆至表达载体，然后构建重组表达质粒，最后转染CHO-K1细胞即可。

进一步地，步骤(2)中对步骤(1)构建得到的细胞系进行培育的过程为：

(1)取细胞系，使用PBS清洗，1000rpm离心5分钟后，去除上清，加入0.4mL含1％HAS的CD-CHO细胞培养基的封闭液重悬，调整细胞密度为1×10^e6/mL；

(2)将步骤(1)培育得到的细胞置于37℃培养箱60分钟，每5-10分钟混匀细胞一次，避免细胞贴壁，封闭后，1000rpm离心5分钟，去上清，使用150μl PBS重悬计数，调整细胞密度为2.5×10⁶个/mL。

进一步地，步骤(2)中加入纳米抗体后的培育过程为：

4℃避光染色30分钟；1000rpm离心，去上清；加入2倍染色体积的预冷PBS洗涤2次，1000rpm离心去上清；再用200μl PBS重悬并去除结团细胞。

进一步地，步骤(2)中所述筛选的标准为：

筛选thermo抗体和纳米抗体平均荧光强度值分别为最高的20％的细胞进行培育，得到高表达的细胞系。

一种用于筛选高表达细胞系的试剂盒，包括上述纳米抗体。

本发明的有益效果：

本发明构建了噬菌体展示Nb库，通过筛选获得了人源化IgG1 FC特异性的VHH，并专门比较了传统荧光抗体(与人源化IgG1特异性结合)和重组荧光抗体(VHH-GFP)筛选高表达人源化IgG1单克隆抗体CHO细胞系，为选择合适的荧光抗体提供了合理的基础。

本发明构建了一种新的抗人抗体FC片段的纳米抗体，其可用于亚克隆高表达的细胞系的筛选。

附图说明

图1为VHH-1-GFP和VHH-16-GFP的亲和力检测；

图2为流式细胞仪检测VHH-GFP的结合活性；

图3为流式细胞术分析重组蛋白VHH-GFP的亲和力荧光值；

图4为Thermo抗体和VHH-1-GFP重组抗体的F.sight染色结果；

图5为Thermo抗体和VHH-1-GFP筛选细胞时所有克隆的荧光值的分布情况；

图6为Thermo抗体和VHH-1-GFP筛选亚克隆细胞表达量。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。

实施例1 抗原制备和羊驼免疫

1、人IgG1抗体Fc片段重组蛋白的表达制备

合成人IgG1抗体Fc片段对应的DNA序列，克隆到带分泌信号肽的真核表达载体pFcIG中，电转大肠杆菌trans5α，经过氨苄青霉素筛选，对单克隆测序获得正确的重组质粒；然后扩大培养含重组质粒的宿主菌，使用去内毒素试剂盒获得无菌无内毒素质粒；将IgG1Fc重组质粒与polyplus悬浮细胞转染试剂混合，转染HEK293F细胞，在无血清培养基中扩大培养5天后，收集培养基上清，使用ProteinA树脂分离纯化人IgG1Fc重组蛋白。

2、羊驼(Alpaca)免疫

对2只羊驼的颈背部皮下、肌肉多点注射人IgG1Fc重组蛋白成多个包块，跟踪观察皮下注射包块的吸收情况，以确认免疫正确。首次免疫使用0.5mg抗原与弗氏完全佐剂1:1混合，乳化后注射，体积1mL/只羊驼；第二次免疫：首次免疫3周后，使用0.25mg抗原与弗氏不完全佐剂1:1混合，乳化后注射，注射体积1mL/只羊驼；第三次免疫：第二次免疫3周后，使用0.25mg抗原与弗氏不完全佐剂1:1混合，乳化后注射，注射体积1mL/只羊驼；第四次免疫：三次免疫3周后，使用0.25mg抗原与弗氏不完全佐剂1:1混合，乳化后注射，注射体积1mL/只羊驼。

3、血清处理和效价检测

在第四次免疫后一周，采集外周血50mL，分离血清和淋巴细胞。将IgG1Fc抗原包被在ELISA96孔板中，利用ELISA法测定血清中抗体效价。ELISA结果显示羊驼四免血清效价>1：32000,符合建库标准。

实施例2 噬菌体展示免疫抗体库的构建和筛选

1、收集2只羊驼第四次免疫后的血液，分离淋巴细胞PBMC；取2×107的PBMC，利用RNA提取试剂盒提取总RNA；取适量RNA(如3-5ug)，通过RT-PCR反转录试剂盒获得cDNA。

2、通过巢式PCR分步获取IgG2和IgG3重链可变区序列(纳米抗体的重链可变区域VHH)，实验步骤如下：

(1)设计两对特异性的引物扩增羊驼重链抗体基因片段，其中巢式外侧引物位于抗体重链信号肽区域及CH2结构域高度保守区，该对引物用于扩增大小分别为900bp的VH-CH1-CH2片段和约700bp的VH-CH2片段；巢式内侧引物用于从700bp的VH-CH2片段中扩增得到约400bp的重链抗体可变区VHH片段。

(2)以cDNA为模板，使用巢式外侧引物进行第一轮PCR扩增，产物分离DNA凝胶电泳，切胶回收700bpPCR产物。

(3)使用巢式内侧引物PCR扩增第一轮所得700bp产物，获得目的基因VHH片段，使用PCR产物纯化试剂盒进行纯化回收。

3、通过同源重组或酶切连接的方式将重链可变区序列插入到经酶切处理的线性化噬菌粒载体pShort中，获得重组载体；经纯化回收后，转化超级感受态SS320细胞(含辅助噬菌体M13K07)；转化后的菌液用SOC培养基重悬、活化1小时；取少量菌液进行10倍比梯度稀释，选取适宜的稀释滴度，于LB/tet10及LB/Carb50培养板上涂板，置于37℃生化培养箱过夜，次日用于库容的计算；剩余菌液转入大体积的2YT/Carb50/Kan25液体培养基中，置于37℃摇床，过夜培养，次日收获上清，加入1/4倍体积的PEG/NaCl溶液，沉淀噬菌体后，取适量PBT溶液重悬、稀释至需要的浓度，即得到噬菌体展示免疫抗体库(-80℃保存备用)。

4、统计LB/Carb50平板上克隆数目，计算库容为：羊驼#1库1：1.42×10⁹；羊驼#2库2：3.15×10⁹。从平板上各随机挑取20个单克隆测序，全部为VHH正确插入的克隆。将2只羊驼构建的2个抗体小库，合并为1个大库，用于后续的生物淘筛。

实施例3 抗体库的筛选

1、将5μg/mL的人IgG1Fc重组蛋白加入96孔板(100μl/孔)，4℃包被过夜；将NEB5αF’大肠杆菌在2YT/Tet10平板划线生长，37℃孵箱过夜培养；第二天，从过夜的2YT/Tet10平板上挑取NEB5αF’单克隆，加入到3mL 2YT/Tet10液体培养基中，37℃摇菌生长至OD₆₀₀＝0.8；

2、同时，去除96孔板的抗原上清液，每孔加入200μL的1％BSA封闭，同时在空白孔加入200μL 1％BSA作为阴性对照孔，在室温下置于3D旋转振荡器2小时；之后，去除蛋白孔和对照孔的上清液，用200μLPT清洗，各加入100μL的噬菌体抗体库，在室温下置于3D旋转振荡器2小时；去除蛋白孔和对照孔的上清液，用200μL PT清洗；向孔中加入100μL100mMHCl,室温放置5分钟；将上清液吸出，加入到1.5mL离心管中，使用1MTris-HCl中和。

3、将混合液加入到含1mL NEB5αF’菌的离心管中，摇床37℃，培养1小时；取离心管中培养液20μL进行适宜倍数的稀释，于LB/Carb50培养板上涂板，置于37℃生化培养箱过夜，次日用于滴度和富集程度的计算；剩余培养液中加入1μL辅助噬菌体M13K07(终浓度为10¹⁰个/mL)，摇床37℃，培养1小时；将上述培养液转入35mL 2YT/Carb50/Kan25培养液中，置于摇床中，37℃过夜培养，收集噬菌体形成每轮的抗体库。

4、重复以上操作3-5轮，直到出现噬菌体富集。若抗原结合孔在LB/Carb50培养板上的菌落数是阴性对照孔的10倍以上，视为富集成功。在本实验中，第三轮筛选后，抗原结合孔的菌落数是阴性对照孔的1000倍，表明富集成功，则进入Phage-ELISA挑选高亲和力的阳性克隆。

实施例4 鉴定阳性克隆和测序

在96深孔板中，每孔加入400μL 2YT/Carb50/Kan25/M13K07培养基；从获得富集的LB/Carb50培养板上挑取单克隆，转入96深孔板中，置于摇床，在200rpm、37℃条件下过夜，第二天离心，上清液即为每个单克隆生产的噬菌体。

同时将人IgG1Fc重组蛋白稀释到1μg/mL，按50μL/孔加入ELISA 96孔板中，置于4℃冰箱过夜；第二天，将ELISA板倒扣以去上清，然后每孔加入100μL 1％BSA封闭；空白孔中加入100μL 1％BSA作为阴性对照孔；室温下孵育1小时。

封闭完成后，抗原孔和阴性对照孔用PT溶液清洗后，加入50μL 96深孔板的上清液，室温下孵育2小时；每个单克隆获得的上清液，分别加入一个抗原孔和一个阴性对照孔。结合完成后，用PT溶液清洗ELISA板子，加入HRP-M13抗体50μL，室温孵育1小时；用PT溶液和PBS溶液清洗后，加入50μL TMB，室温孵育5分钟，然后加入50μL的1M磷酸终止反应；用酶标仪测量450nm处的吸光度值。

若OD值>4，则酶标仪读数显示为溢出；将抗原孔OD值>0.5和阴性对照孔OD值<0.2所对应的单克隆认定为具有较高亲和力的阳性克隆，进行单克隆DNA测序；获得的4条Unique序列按照CDRH3的差异性分为2组(表1)。

表1 序列

实施例5 绿色荧光标记的纳米抗体的表达(VHH-GFP融合蛋白)

对实施例4的表1的每组序列中挑选1条，包括序列HFC-1和HFC-16进行了原核表达，实验步骤如下：

(1)构建含有TAT分泌信号肽和GFP荧光基因的原核表达载体pTAT-GFP：合成TAT-GFP片段对应的基因，通过酶切位点NdeI和BamHI克隆到pET25b质粒中，电转大肠杆菌trans5α，经过氨苄青霉素筛选，对单克隆测序获得正确的重组质粒pTAT-GFP；

(2)PCR扩增的VHH片段，通过酶切位点BamHI和XhoI克隆到克隆到pTAT-GFP质粒中，电转大肠杆菌Rosetta2，经过氨苄青霉素筛选，对单克隆测序获得正确的重组质粒pTAT-GFP-VHH-His；

(3)挑选含重组质粒的单克隆，37℃摇菌扩大培养到OD600＝0.6-0.8，加入1mMIPTG，25℃摇菌过夜培养；第二天收集菌体，超声波破碎菌体，收集上清液，经镍亲和层析纯化获得GFP-VHH-His融合蛋白(表2)。

表2 蛋白产量

实施例6 亲和力检测

将人IgG1 FC抗原(2μg/mL)包被在96孔板中，4℃孵育过夜，第二天，去除96孔板的抗原上清，每孔加入200μL的1％PVA封闭，同时在空白孔加入200μL1％BSA作为阴性对照孔，在室温下置于3D旋转振荡器2小时；之后，去除蛋白孔和对照孔的上清液，用200μLPT清洗3次，拍干，加入100μL梯度稀释的一抗(VHH-GFP)，室温孵育2h，去除蛋白孔和对照孔的上清液，用200μLPT清洗；用HRP连接的抗羊驼IgG，VHH区域检测结合的纳米抗体，室温检测1h，清洗干净后，加入100μLTMB显色，在450nm处测量OD值。分析结果表明VHH-1-GFP和VHH-1-GFP的EC50分别为0.27nM和0.29nM，反映了较高的抗原结合能力(图1)。

实施例7 流式细胞仪检测VHH-GFP亲和力及荧光值

收集5.5×10⁶个jurkat细胞，500g离心5min，用4℃预冷的PBS洗3次，加入10μg/mLanti-CD3 VHH-hFC，冰上放置1h，500g离心5min，用遇冷的PBS重悬细胞，500g离心5min，重复3次，洗去未结合的一抗，加入VHH-GFP抗体，冰上避光放置1h后，500g离心5min，去上清，PBS洗涤3次后，流式细胞仪检测荧光值，每管5.5×10⁵个jurkat细胞(图2)，图2中(a)VHH-1-GFP流式检测结果。(b)VHH-16-GFP流式检测结果。图中黑色曲线(右侧曲线)为jurkat细胞与h20-hFC(anti-CD3纳米抗体与human FC的重组蛋白)，VHH-1-GFP共孵育。图中灰色曲线(左侧曲线)是阴性对照(未与h20-hFC孵育的细胞)。

流动检测的结果表明，与阴性对照相比，VHH-1-GFP和VHH-16-GFP抗体的平均荧光强度分别为4789.3和3798.9。表明低浓度条件下(1ug/ul)，VHH-1-GFP和VHH-16-GFP荧光蛋白可用于流式细胞术检测。

实施例8 抗体稳转细胞株的筛选

1、稳定表达人IgG1-CHO细胞系的建立

合成抗Her2的人源IgG1抗体对应的DNA序列，克隆至表达载体，构建重组表达质粒，转染CHO-K1细胞，该细胞系命名为Her2IgG1-CHO。

2、取Her2 IgG1-CHO混合细胞共0.5×10^e6，使用PBS清洗，1000rpm离心5分钟。去除上清，加入0.4mL封闭液(含1％HAS的CD-CHO细胞培养基)重悬，细胞计数，调整细胞密度为1×10^e6/mL；将细胞置于37℃培养箱60分钟，每5-10分钟混匀细胞一次，避免细胞贴壁。封闭后，1000rpm离心5分钟，去上清，使用150μL PBS重悬计数，调整细胞密度为2.5×10⁶个/mL；加入VHH-GFP抗体(50μg/mL)，4℃避光染色30分钟；1000rpm离心，去上清；加入2倍染色体积的预冷PBS洗涤2次，1000rpm离心去上清；用200μL PBS重悬，细胞过40μM滤器，去除结团细胞。流式细胞仪检测thermo抗体，VHH-1-GFP，VHH-16-GFP，平均荧光强度值(MFI)分别为19132.5，164058.6，8609；VHH-16-GFP的MFI值只有VHH-1-GFP的1/20(图3，(a)Thermo抗体筛选；(b)VHH-1-GFP筛选；(c)VHH-16-GFP筛选，图中黑色为阴性细胞，灰色为阳性细胞)，因此选择VHH-1-GFP和thermo抗体进行下一步F.sight筛选。

F.sight筛选分为2个组，每个组筛选4块96孔板，以细胞圆度0.6-1，FL intensity＝80mW，Exposure time＝10ms进行分选，筛选细胞时F.sight染色结果(图4，(a)Thermo抗体染色和(b)VHH-1-GFP的F.sight染色结果)和所有克隆的荧光值的分布情况(图5，不同抗体筛选细胞时所有克隆的荧光值的分布情况)。

3、对于Thermo抗体，选择荧光值大于50的(约top 20％)，对于VHH-1-GFP，选择荧光值大于80的(约top 20％)的细胞被克隆到96孔板进行培养(图5)，在96孔板的每孔中加入100μl CD-CHO培养基，7天后补加100μl。亚克隆培养基用5μM MSX加压，并加入1％FBS以提高克隆形成率。在37℃和5％二氧化碳以120rpm/min培养。每隔一周测定一次克隆形成率，直到有60％的克隆形成率时，使用ForteBio定量检测蛋白质浓度(图6)。96孔板中培养20天后，VHH-1-GFP筛选的亚克隆表达量的平均值为15.75mg/L，单克隆细胞表达量最高为28mg/L,Thermo抗体筛选的细胞的表达量的平均值为9.14mg/L，最高表达量为17.8mg/L。

序列表

<110> 盛世君联生物科技有限公司

<120> 一种用于筛选高表达量细胞系的纳米抗体以及方法和试剂盒

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 126

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Asn Leu Ser Cys Ala Val Ser Asp Ile Met Phe Ser Trp Ser

20 25 30

Thr Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Gln Glu Arg Gly Ser Gly Arg Ile Asn Tyr Ala Asp Phe Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser Ala Lys Asn Thr Met Asn Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Trp

85 90 95

Val Arg Arg Pro Ser Gly Ser Trp Arg Gly Gln His Tyr Pro Asp Ala

100 105 110

Gln Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 2

<211> 126

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Asn Leu Ser Cys Ala Val Ser Asp Ile Met Phe Asn Trp Ser

20 25 30

Thr Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Val

35 40 45

Thr Gln Glu Arg Gly Ser Gly Lys Ile Asn Tyr Ala Asp Phe Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser Thr Lys Asn Thr Met Asn Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Trp

85 90 95

Val Arg Arg Pro Thr Gly Ser Trp Arg Gly Gln His Tyr Pro Asp Ala

100 105 110

Gln Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 3

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Asp Ser Ala Phe Ile Ile Lys

20 25 30

Ser Ala Gly Trp Tyr Arg Arg Pro Pro Gly Gly Gln Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Ala Ile Gly Asn Gly Gly Glu Thr Asp Tyr Gly Asp Asn Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Val Glu Asp Ser Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Asp Val Tyr Tyr Cys Thr

85 90 95

Ala Leu Gly Tyr Leu Thr Thr Thr Gly Arg Trp Asp Thr Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Gln Val Ser Val Ser Ser

115 120

Claims

1.一种抗人抗体FC片段的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体具有如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列的VHH链。

2.根据权利要求1所述的抗人抗体FC片段的纳米抗体，其特征在于，所述VHH链还可以是与如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示的序列具有80％同源性以上，且具有相同功能的氨基酸序列。

3.一种用于筛选高表达量细胞系的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)构建稳定表达人IgG1的细胞系；

(2)对构建得到的细胞系进行培养，然后加入权利要求1或2所述的纳米抗体，继续培育以后检测Thermo抗体和纳米抗体的平均荧光强度值，根据平均荧光强度值筛选出高表达量的细胞系。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(1)的具体过程为：

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(2)中对步骤(1)构建得到的细胞系进行培育的过程为：

(2)将步骤(1)培育得到的细胞置于37℃培养箱60分钟，每5-10分钟混匀细胞一次，避免细胞贴壁，封闭后，1000rpm离心5分钟，去上清，使用150μlPBS重悬计数，调整细胞密度为2.5×10⁶个/mL。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(2)中加入纳米抗体后的培育过程为：

7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述筛选的标准为：

8.一种用于筛选高表达细胞系的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1或2所述的纳米抗体。