CN117510627A - 一种p16-INK4a纳米抗体及应用 - Google Patents

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Abstract

一种p16‑INK4a纳米抗体及其应用，所述p16‑INK4a纳米抗体具有SEQID NO:1所示的FR1；SEQ ID NO:2所示的FR2；SEQ ID NO:3所示的FR3；SEQ ID NO:4所示的FR4；SEQ ID NO:5所示的CDR1；SEQ ID NO:6所示的CDR2；SEQ ID NO:7所示的CDR3。本公开还提供了用于编码所述p16‑INK4a纳米抗体的核酸分子、包含该核酸分子的载体和宿主细胞以及所述p16‑INK4a纳米抗体用于检测p16‑INK4a蛋白的应用。本公开提供的p16‑INK4a纳米抗体稳定性高且具有成本效益，并且易于修饰以便应用于检测。

Description

一种p16-INK4a纳米抗体及应用
序列表
本申请包括以DT.26.XML格式电子提交的序列表，在此通过引用将其全部并入。上述DT.26.XML副本创建于2022年7月21日，名为012231205_Sequence_listing_20220721.xml，大小为21kb。
技术领域
本文涉及生物医学或生物制药技术领域，尤指一种针对于p16-INK4a的纳米抗体。
背景技术
INK4a/ARF基因位于人9号染色体p21区，可以产生两个不同的转录产物，进而编码了氨基酸序列不同的两种蛋白。其中一种编码p16-INK4a蛋白，包含156个氨基酸，而另外一种编码p14-ARF蛋白，包含132个氨基酸。p16-INK4a蛋白可以与cyclinD蛋白竞争结合进而抑制CDK4/6的活性，CDK4/6的活性被抑制后导致Rb蛋白非磷酸化，非磷酸化的Rb蛋白与E2F的启动子结合，抑制E2F的转录活性，使细胞周期不能通过G1/S检查点，使细胞周期阻滞在G1期。p14-ARF蛋白位于细胞核，主要结合MDM2蛋白，促进MDM2降解，进而稳定细胞内p53蛋白的水平，使细胞周期阻滞在G1期和G2期。由此表明，INK4a/ARF基因编码的两个蛋白均起到负反馈调节细胞周期的作用，而且近年来已证实INK4a/ARF基因在肺癌、黑色素瘤、食道癌、胃癌、乳腺癌、胰腺癌、白血病等肿瘤中表达失活。但是，INK4a/ARF基因在几乎100％的宫颈癌中过表达，并且无论是否存在HPV感染，宫颈癌中INK4a/ARF基因都过表达。临床上检测p16-INK4a蛋白表达，被应用于宫颈癌的早期诊断与风险预测。宫颈癌是妇女中发病率第二高的恶性肿瘤，而其死亡率在各类妇科恶性肿瘤中最高。感染宫颈癌目前尚无有效治疗药物和治疗方案，早期诊断和治疗对延长病人生存期十分重要，所以开发宫颈癌的检测试剂是其中关键。
目前市场上用于宫颈癌早期筛查，检测p16-INK4a蛋白的试剂主要是鼠抗人p16-INK4a蛋白单克隆抗体。该试剂的检测原理是通过FITC标记的抗p16-INK4a蛋白单克隆抗体与p16-INK4a蛋白结合来实现的。但是这种传统抗体稳定性差、生产成本高，这些因素限制了p16-INK4a蛋白的检测。1993年，比利时科学家首次报道在骆驼血液中发现了没有轻链的抗体，即heavy-chain-only antibody(hcAb)，并且hcAb的一个单独的抗原结合区进行克隆表达出的蛋白就可以与抗原进行结合。一个单独的抗原结合区的分子尺度在纳米级别，所以称为纳米抗体(nanobody,nb)。相比于传统抗体，纳米抗体稳定性更高，生产成本更低，因此纳米抗体在检测试剂中的应用具有广阔前景。
发明内容
以下是对本文详细描述的主题的概述。本概述并非是为了限制权利要求的保护范围。
本申请提供了一种p16-INK4a纳米抗体及其应用。本申请提供的p16-INK4a纳米抗体能够克服传统抗体具备分子量大的缺点，并且本申请提供的p16-INK4a纳米抗体稳定性高且具有成本效益。
本申请提供了一种p16-INK4a纳米抗体及其应用、用于编码所述p16-INK4a纳米抗体的核酸分子、包含所述核酸分子的载体和宿主细胞以及所述p16-INK4a纳米抗体用于检测p16-INK4a蛋白的应用。
本申请的实施方式中，提供了一种p16-INK4a纳米抗体，其中，所述p16-INK4a纳米抗体包括重链可变区(VHH)链，所述VHH链包括框架区FR，所述框架区FR选自下组的FR的氨基酸序列：SEQ ID NO:1所示的FR1；SEQ ID NO:2所示的FR2；SEQ ID NO:3所示的FR3；SEQID NO:4所示的FR4。
本申请的一些实施方式中，所述VHH链还包括互补决定区CDR，并且所述互补决定区CDR选自下组的CDR的氨基酸序列：SEQ ID NO:5所示的CDR1；SEQ ID NO:6所示的CDR2；SEQ ID NO:7所示的CDR3。
本申请的一些实施方式中，所述VHH链具有SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。
本申请的一些实施方式中，所述p16-INK4a纳米抗体是针对p16-INK4a蛋白表位的纳米抗体，所述p16-INK4a纳米抗体包括SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。
本申请的实施方式中，提供了一种核酸分子，所述核酸分子编码权利要求1至4中任一项所述的p16-INK4a纳米抗体或其VHH链。
本申请的一些实施方式中，所述核酸分子具有SEQ ID NO:15所示的序列。
本申请的一些实施方式中，编码FR1、FR2、FR3、FR4的核苷酸序列分别为SEQ IDNO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列。
本申请的一些实施方式中，编码CDR1、CDR2、CDR3的核苷酸序列分别为SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列。
本申请的实施方式中，提供了一种载体，所述载体包含权利要求5至8中任一项所述的核酸分子。
本申请的实施方式中，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包含以上所述的核酸分子，或者包含以上所述的载体。
本申请的实施方式中，提供了以上所述的p16-INK4a纳米抗体、以上所述的核酸分子、以上所述的载体或以上的宿主细胞在制备检测p16-INK4a蛋白的产品中的应用；或者以上所述的p16-INK4a纳米抗体、以上所述的核酸分子、以上所述的载体或以上所述的宿主细胞在制备治疗、预防与p16-INK4a蛋白相关疾病中的应用。
本申请的实施方式中，提供了一种产生以上所述的p16-INK4a纳米抗体的方法，其中所述方法包括以下步骤：
将p16-INK4a蛋白人工表达纯化获得，随后利用骆驼脾脏淋巴细胞建立了纳米抗体的天然非免疫文库；
筛选实验中将p16-INK4a蛋白偶联在酶标板上，以此形式的抗原利用噬菌体展示技术筛选骆驼重链抗体噬菌体展示基因库，从而获得了针对p16-INK4a蛋白的特异性的纳米抗体基因，将此基因转至大肠杆菌中，从而建立了能在大肠杆菌中高效表达的纳米抗体株。
本申请的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本申请而了解。本申请的其他优点可通过在说明书以及附图中所描述的方案来实现和获得。
附图说明
附图用来提供对本申请技术方案的理解，并且构成说明书的一部分，与本申请的实施例一起用于解释本申请的技术方案，并不构成对本申请技术方案的限制。
图1为纳米抗体文库构建第一轮PCR产物电泳图；从左至右，第一泳道为DNAmarker；第二至第四泳道均为纳米抗体文库构建第一轮PCR产物。
图2为纳米抗体文库构建第二轮PCR产物电泳图；从左至右，第一泳道为DNAmarker；第二泳道为纳米抗体文库构建第二轮PCR产物。
图3为噬菌粒Pcantab 5E线性化PCR产物电泳图；从左至右，第一泳道为DNAmarker；第二泳道为噬菌粒Pcantab 5E线性化PCR产物。
图4为p16-INK4a纳米抗体纯化结果图；从左至右，第一泳道为蛋白marker；第二至第四泳道均为p16-INK4a纳米抗体的纯化产物。
图5为纳米抗体噬菌体筛选和验证的基本流程图，该流程图包括纳米文库筛选和基于Phage-Elisa的验证流程。
具体实施方式
实验材料，实验仪器，方法。
材料：TSINGKE TSC-E02 BL21-AI Chemically Competent Cell、M13噬菌体、骆驼脾脏等；
仪器：
原核/酵母表达系统-摇床(生产厂家：知楚，型号：ZQZY-C)
制备型超速离心机(生产厂家：Beckman；型号：XPN-100)
AKTAPure L蛋白层析系统(生产厂家：GE；型号：PURE L)
分子间相互作用仪-SPRi(生产厂家：PlexArray；型号：HT)
超净工作台(型号：YT-CJ-2ND)
超声细胞破碎仪(型号：Scientz-IID)
超低温保存箱(型号：DW-86L626)
超纯水系统(型号：CascadaTM)
液氮罐(型号：DC180MP)
电子天平(型号：AL204)
PH计(型号：PHS-3E)
方法：PCR，反转录PCR，噬菌体文库展示、原核系统的蛋白表达与纯化技术、镍柱亲和层析、SDS-PAGE电泳等。
本发明首先利用骆驼的新鲜脾脏，提取该骆驼脾脏淋巴细胞并构建了单域重链抗体文库。将p16-INK4a蛋白偶联在酶标板上，展示p16-INK4a蛋白的正确空间结构，使得p16-INK4a蛋白的抗原表位得以暴露出来，以此形式的抗原利用噬菌体展示技术筛选单域重链抗体文库，从而获得了能在大肠杆菌中高效表达的纳米抗体株。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
实施例1：骆驼单域重链抗体文库的构建
1)获取双峰骆驼脾脏组织：双峰骆驼脾脏组织取材于内蒙古阿拉善左旗某屠宰场经检验检疫健康的骆驼。
2)Bactrian camel(Camelus bactrianus)spleen总RNA提取：称取1g骆驼的脾脏组织，使用天根的组织提取试剂盒进行总RNA提取。提取后检测总RNA的浓度。
3)逆转录合成cDNA：然后使用天根的逆转录试剂盒(Quantscript RT Kit，KR103)进行反转录，得到cDNA，并测定浓度。Note：反应体系如下表1：
组分 体积(μL) 终浓度
10×RT Mix 2 1×
Super pure dNTPs(2.5mM each) 2 0.25mM each
Oligo dT 2 1μM
QuantReverse Tanscriptase 1 20μL体系
RNase-free water 补足至20μL
RNA模板 <2μg
反应总体积 20
本次逆转录进行了10×20μL体系的逆转录反应。
4)第一轮PCR扩增反应：
(1)使用NEBHigh-Fidelity 2X Master Mix(M0492L)进行第一轮巢式PCR。取9个200μL的PCR tube。每管按50μL的反应体系(表2)进行。
组分 体积(μL) 终浓度
Q5 High-Fidelity 2X Master Mix 25 1×
10μM Forward Primer(CALL001) 2.5 0.5mM each
10μM Reverse Primer(CALL002) 2.5 0.5mM each
Template DNA 1μL
Nuclease free water 补足至50μL
反应总体积 50
(2)High-Fidelity 2X Master Mix PCR反应条件如下表3：
(3)将所得PCR产物加入1％琼脂糖凝胶中(in TAE buffer)，140V电泳30min。然后切取0.7Kb大小的条带，混到一起，使用凝胶回收试剂盒进行DNA回收，并测定DNA的浓度。结果见附图1。
5)第二轮PCR(巢式PCR反应)
(1)使用第一轮巢式PCR所得的0.7Kb的片段为模板进行第二轮巢式PCR(表4)：
组分 体积(μL) 终浓度
Q5 High-Fidelity 2X Master Mix 25 1×
10μM F Primer(Camel-F) 2.5 0.5mM each
10μM R Primer(Camel-R) 2.5 0.5mM each
Template DNA note
Nuclease free water 补足至50μL
反应总体积 50
(2)PCR的反应体系及反应条件如下表5：
(3)本次PCR共扩增26×50μL体系，之后进行琼脂糖凝胶(1％，m/v)电泳(140V)进行胶回收DNA。结果见附图2。
6)噬菌粒Pcantab 5E线性化制备
(1)使用NEBHigh-Fidelity 2X Master Mix(M0492L)进行Pcantab5E载体的PCR线性化处理，需要至少30μg的线性化片段。每管按50μL的反应体系进行。PCR反应体系如下表6：
组分 体积(μL) 终浓度
Q5 High-Fidelity 2X Master Mix 25 1×
10μM F Primer(Camel-pcantab-F) 2.5 0.5mM each
10μM R Primer(Camel-pcantab-R) 2.5 0.5mM each
Template DNA(88ng/μL) 2μL
Nuclease free water 补足至50μL
反应总体积 50
(2)PCR反应条件如下表7：
(3)PCR反应结束后，短暂离心，然后将扩增的溶液合并到一起，再根据使用的Pcantab 5E的量加入合适的DpnI，置于37℃孵育6小时。然后进行琼脂糖凝胶(1％，m/v)电泳：(140V)进行胶回收DNA。结果见附图3。
7)Pcantab 5E与VHH片段(文库)的同源重组(大试)
(1)按照nPCR-2片段(Camel VHHs)和线性化载体的摩尔比＝5:1进行同源重组。
(2)同源重组的反应体系：按vector的投入量为30μg进行计算总反应体系(表8)。
试剂 用量
PCR片段(433bp,10-100ng) 14.5μg
线性化载体(Pcantab 5E,4485bp,300ng) 30μg
2×Seamless cloning mix 1000μL
Nuclease free water 1000-(a+b)μL
(3)经计算，insert＝14.5μg；vector＝30μg，按insert：vector＝5:1的比例进行重组反应。
(4)将2ml的反应体系混匀后，分装成50μL/tube，50℃反应3h。
(5)纯化：在重组反应结束之后，使用TIANGEN的普通DNA产物纯化试剂盒(DP204)对重组产物进行纯化，以去除重组反应中的酶及盐离子成分，进而提高转化效率。
(6)将纯化后的产物与提前制备好的电转化TG1感受态细胞混合均匀，然后分装到14个电转杯中(使用的电转杯为0.2cm gap width)，每个电转杯放置150μL，加入菌液后冰上静置10min。然后进行电转(使用的电转仪是BTX Gemini X2)参数设置为25μF，200OHMs，电压为2.5kV。将电击杯推入电转化仪，按一下pulse键，听到蜂鸣声后，向电击杯中迅速加入500μL的SOC液体培养基，重悬细胞后，转移到50ml的离心管中，再加入500μL的SOC液体培养基洗涤一次，将洗涤液同样转移到上述50ml的离心管中。
(7)37℃，220－250rpm复苏2小时。
(8)4,000r/min将上述培养基离心10min，倒掉上清，收集菌体，用10mL的2×TY培养基重悬菌体。
(9)吸出100μL所构建的全合成纳米抗体文库，按照10-1，10-2到10-7梯度稀释，将各个梯度的菌液各吸出100μL涂于90mm的2×TY/A平板上，于37℃培养箱中过夜培养。
(10)对各稀释度平板上的单菌落计数，选择单菌落个数合适的平板，根据稀释度计算文库的库容。经计算，本次构建的骆驼天然纳米抗体库容为6.7×10^6。
附引物序列：
CALL001 primer:5-GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGG-3(SEQ ID NO:17)
CALL002 primer:5-GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC-3(SEQ ID NO:18)
Camel-F:ATGCGGCCCAGCCGGCCATGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGRGGAGG(SEQ ID NO:19)
Camel-R:
ACCGGCGCACCTGCGGCCGCTGAGGAGACGGTGACCTGGGT(SEQ ID NO:20)
Camel-pcantab-F:GCGGCCGCAGGTGCGCCGGT(SEQ ID NO:21)
Camel-pcantab-R:CATGGCCGGCTGGGCCGCAT(SEQ ID NO:22)
实施例2：针对p16-INK4a蛋白的纳米抗体筛选过程(参见图5)
1)用包被缓冲液配置5mL终浓度100μg/mL的抗原，并用配置的抗原溶液包被5mL的聚苯乙烯管，4℃静置12-16小时以包被抗原。
2)弃去包被缓冲液，用PBS溶液将聚苯乙烯洗涤三次。洗涤完成后，向聚苯乙烯管中加入4mL含有2％脱脂奶的PBS溶液，37℃培养箱中静置3h。
3)弃去封闭液，先用PBST缓冲液将聚苯乙烯洗涤三次，再换PBS缓冲液洗涤三次。
4)取文库噬菌体2×1012Cfu，加入含有2％BSA的PBS溶液至总体积5mL，将稀释后的噬菌体文库加至聚苯乙烯管中，37℃培养箱中静置2h。
5)弃去噬菌体文库，先用PBST缓冲液将聚苯乙烯洗涤4次，再用PBS缓冲液洗涤4次。
6)将1mL 0.1M glycine(pH＝2.5)溶液加入到聚苯乙烯管中，反复翻转10min，以洗脱与抗原特异性结合的噬菌体。
7)翻转结束后，立即向免疫管中加入0.5mL 1M的Tris-HCl(pH＝8.5)中和洗脱下来的噬菌体，翻转混匀，将聚苯乙烯管中的溶液吸至1.5mL Eppendorf中，4℃保存。
8)将洗脱下来的噬菌体加入到16mL OD600＝0.5的TG1大肠杆菌培养液中。同时向聚苯乙烯中加入4mL OD600＝0.5的TG1大肠杆菌培养液，将两者同时37℃摇床静置45min，随后将两者混合。
9)取出100μL的TG1菌液按照10-1到10-7梯度稀释，各取100μL稀释液涂于相应的90mm 2×TY/E/A平板上。剩余菌液4℃，4,000r/min离心10min，弃去上清收集菌体，用少量的2×TY培养基重悬菌体，涂于3-10个180mm2×TY/E/G/A平板上，一个平板上约涂500μL菌液(第一轮、第二轮筛选涂4个平板，第三轮筛选涂6个平板)。在37℃培养箱中过夜培养。
10)用刮子收集平板上的菌落，将刮下来的菌体溶解于10mL 2×TY-15％甘油的培养基中，于-80℃冰箱保存备用。
11)将收集的菌液接种于6瓶含有250mL 2×TY/G/A液体培养基的锥形瓶中，初始OD600不超过0.1，37℃220r/min培养至OD600＝0.6。
12)按照TG1：M13K07＝1:20的比例向培养液中加入辅助噬菌体，37℃静置孵育45min。
13)4℃，8,500r/min离心15min，弃去上清，收集菌体。
14)将菌体重悬于1瓶含有250mL 2×TY/K/A培养基的锥形瓶中，30℃180r/min过夜培养。
15)将培养物10,000rpm 4℃离心10min，转移上清至干净的离心管中，加1/4体积的PEG/NaCl溶液，4℃静置沉淀噬菌体2h。
16)4℃离心，10,000rpm，15min，倒掉上清，收集噬菌体沉淀。
17)用1/20体积的PBS缓冲液重悬所得噬菌体沉淀，4℃，12,000rpm离心20min，缩聚不溶物，转移上清至干净的离心管中。
18)重复步骤15)-16)。
19)用10mL PBS-15％甘油重悬所得噬菌体沉淀，4℃静置过夜。
20)4℃，12,000r/min离心10min以缩聚噬菌体溶液里的不溶物，转移上清至干净的离心管中，将噬菌体溶液分装至1.5mL的Eppendorf中，每管1mL，-80℃保存备用。
21)10-1、10-2、10-3、10-4梯度稀释所得噬菌体，取10μL 10-4的稀释液侵5mL OD600＝0.6的大肠杆菌TG1菌液，37℃孵育45min。
22)取出100μL被噬菌体侵染的大肠杆菌TG1菌液，按照10-1到10-7梯度稀释，从各个梯度的稀释液中分别取出100μL涂于相应的2×TYE/A平板上，在37℃培养箱中过夜培养。
23)计数平板上的菌落，计算扩增所得噬菌体的滴度。
24)重复以上步骤完成第二轮和第三轮的筛选过程。
实施例3：用噬菌体的酶联免疫方法(phage-ELISA)筛选特异性单个阳性克隆(参见图5)
1)从第三轮筛选所得的平板上随机挑取30个菌落克隆至含有5mL2×TY/A培养基的试管中，37℃220r/min培养至OD600＝0.6。
2)分别取1mL菌液至1.5mL Eppendorf管中，按照TG1：M13K07＝1:20的比例向培养液中加入辅助噬菌体，37℃静置孵育45min。将剩余菌液继续培养。
3)4℃，10,000r/min离心菌体10min，弃去上清收集菌体，每个Eppendorf管中加入1mL的2×TY/K/A液体培养基，30℃180r/min过夜培养。
4)4,000r/min 4℃离心20min，收集所得上清用于后续ELISA检测。
5)用包被缓冲液将抗原蛋白稀释至50μg/mL，每孔100μL将抗原包被在96孔酶标板上，同时包被BSA做阴性对照，4℃静置过夜包被。
6)弃去包被液，用PBST缓冲液洗涤3次，之后用PBS缓冲液洗涤3次。
7)每孔加入含2％脱脂奶的PBS封闭液，37℃静置封闭2h。
8)弃去包被液，用PBST洗涤3次，之后用PBS缓冲液洗涤3次。
9)取步骤4制备的噬菌体上清加入到包被有抗原和BSA的孔中，每孔加入100μL噬菌体上清，37℃孵育2h。
10)弃去上清，用PBST洗涤3次，之后用PBS缓冲液洗涤3次。每孔加入1:1000倍稀释的鼠抗M13单克隆抗体，37℃避光孵育1h。
11)弃去二抗，用PBST缓冲液洗涤4次，之后用PBS缓冲液洗涤4次。
12)每孔加入100μL TMB底物溶液，37℃孵育15min或更长时间。
13)每孔加入50μL 1M的稀硫酸终止反应。
14)使用酶标仪读取450nm处的吸光度值，实验组与对照组读数的比值大于2的鉴定为阳性克隆。
15)最后根据Phage-Elisa结果对阳性克隆测序，确定候选纳米抗体序列。Phage-Elisa结果表如下表9：
p16-INK4a BSA Ratio
Negative control 0.07 0.07 1.00
Positive control 0.42 0.26 1.63
Clone-12 0.46 0.24 1.94
注：Negative control为不加任何噬菌体；Positive control为使用商业化公司abcam的p16抗体；Clone-12为筛选出的阳性克隆。p16-INK4a表示ELISA实验中固定的抗原为纯化的p16-INK4a蛋白；BSA表示ELISA实验中固定的抗原为牛血清白蛋白BSA；Ratio表示ELISA实验中，抗体结合p16-INK4a蛋白的检测信号比上BSA的检测信号的比值。
实施例4：纳米抗体在宿主菌大肠杆菌中表达、纯化
1)将前面测序分析所获得一种纳米抗体DNA序列，构建至载体pET21b中，并将测序鉴定构建正确的重组质粒转化到表达型宿主菌BL21中，然后将转化后活化后的菌液涂布在含有50微克每毫升的氨苄抗性的LB平板上，37℃过夜；
2)挑选单克隆菌落接种在5毫升含有100微克每毫升的氨苄抗性的LB培养基中，37℃摇床培养8-12小时；
3)接种的培养后的菌液接种至1L含有100微克每毫升的氨苄抗性的LB培养基中，37℃摇床培养，培养到值达到在600nm的光吸收值在1.0时，加入IPTG试剂，终浓度是0.5mM，16℃摇床培养过夜
4)第二天，离心收集菌沉淀，将菌体在高压破碎仪中破碎以获得抗体粗提液；
5)经镍柱离子亲和层析纯化抗体蛋白，采用咪唑梯度洗脱法
6)最终可制备纯度达95％以上的蛋白。结果见附图4。
实施例5：Biacore实验测定p16-INK4a纳米抗体与p16-INK4a抗原蛋白的亲和力
1)将p16-INK4a抗原蛋白通过氨基偶联的方式固定在Biacore实验的CM5芯片上；
2)利用纯化的p16-INK4a纳米抗体，进行浓度梯度稀释，然后不同浓度的p16-INK4a纳米抗体稀释液流经固定了p16-INK4a抗原蛋白的CM5芯片通道；
3)Biacore 8K plus仪器检测抗原抗体的结合情况。测定实验结果显示，筛选出的p16-INK4a纳米抗体与p16-INK4a抗原蛋白结合的亲和力常数KD＝266nM。说明本申请的p16-INK4a纳米抗体与p16-INK4a抗原蛋白具有较强的亲和力。相比于目前的纳米抗体，本申请的p16-INK4a纳米抗体对抗原蛋白的结合亲和力更强。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人才来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (12)

1.一种p16-INK4a纳米抗体，其中，所述p16-INK4a纳米抗体包括重链可变区VHH链，所述VHH链包括框架区FR，所述框架区FR选自下组的FR的氨基酸序列：SEQ ID NO:1所示的FR1；SEQ ID NO:2所示的FR2；SEQ ID NO:3所示的FR3；SEQ ID NO:4所示的FR4。
2.根据权利要求1所述的p16-INK4a纳米抗体，其中，所述VHH链还包括互补决定区CDR，并且所述互补决定区CDR选自下组的CDR的氨基酸序列：SEQ ID NO:5所示的CDR1；SEQ IDNO:6所示的CDR2；SEQ ID NO:7所示的CDR3。
3.根据权利要求1所述的p16-INK4a纳米抗体，其中，所述VHH链具有SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的p16-INK4a纳米抗体，其中，所述p16-INK4a纳米抗体是针对p16-INK4a蛋白表位的纳米抗体，所述p16-INK4a纳米抗体包括SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。
5.一种核酸分子，其中，所述核酸分子编码权利要求1至4中任一项所述的p16-INK4a纳米抗体或其VHH链。
6.根据权利要求5所述的核酸分子，其中，所述核酸分子具有SEQ ID NO:16所示的序列。
7.根据权利要求5所述的核酸分子，其中，编码FR1、FR2、FR3、FR4的核苷酸序列分别为SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列。
8.根据权利要求5所述的核酸分子，其中，编码CDR1、CDR2、CDR3的核苷酸序列分别为SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列。
9.一种载体，所述载体包含权利要求5至8中任一项所述的核酸分子。
10.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求5至8中任一项所述的核酸分子，或者包含权利要求9所述的载体。
11.根据权利要求1至4中任一项所述的p16-INK4a纳米抗体、根据权利要求5至8中任一项所述的核酸分子、根据权利要求9所述的载体或根据权利要求10所述的宿主细胞在制备检测p16-INK4a蛋白的产品中的应用；或者根据权利要求1至4中任一项所述的p16-INK4a纳米抗体、根据权利要求5至8中任一项所述的核酸分子、根据权利要求9所述的载体或根据权利要求10所述的宿主细胞在制备治疗、预防与p16-INK4a蛋白相关疾病中的应用。
12.一种产生权利要求1至4中任一项所述的p16-INK4a纳米抗体的方法，其中所述方法包括以下步骤：
将p16-INK4a蛋白人工表达纯化获得，随后利用骆驼脾脏淋巴细胞建立了纳米抗体的天然非免疫文库；
筛选实验中将p16-INK4a蛋白偶联在酶标板上，以此形式的抗原利用噬菌体展示技术筛选骆驼重链抗体噬菌体展示基因库，从而获得了针对p16-INK4a蛋白的特异性的纳米抗体基因，将此基因转至大肠杆菌中，从而建立了能在大肠杆菌中高效表达的纳米抗体株。
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