CN116004612A - 一种抗gpc3纳米抗体合成库及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗GPC3纳米抗体合成库及其构建方法，旨在增加纳米抗体文库的序列多样性和结构多样性；其制备方法：以从免疫库获得的抗GPC3的纳米抗体的基因为全合成抗体文库的参考模板，确定框架区域初始长度以及随机化位点；再进行PCR扩增得到初始模板的目的基因FR1‑FR4区域片段；依次制备FR1‑CDR1‑FR2新目的短片段N‑1、短片段N‑2、目的基因序列N3、新目的基因序列N4；再酶切目的片段N4，使用T4DNA连接酶将目的片段插入线性化pComb3xss噬菌粒中进行PCR反应，得连接产物，再进行电击转化，取细胞液培养过夜；其余复苏后的细胞液接种培养、重悬沉淀，分离后收集溶解液即为噬菌体展示抗GPC3的纳米抗体全合成文库；属于生物技术领域。

Description

一种抗GPC3纳米抗体合成库及其构建方法

技术领域

本发明涉及一种纳米抗体合成库，具体地说，是涉及抗GPC3纳米抗体合成库，本发明还涉及该抗GPC3纳米抗体合成库的构建方法。

背景技术

针对肝癌的应对是早发现早诊断早治疗，但是目前肝癌标志物AFP存在一定的漏诊率和误诊率，作为新型肝癌标志诊断物磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypican3，GPC-3)表现出更好的特异性与灵敏度。因此将GPC3作为抗原来制备纳米抗体可以提高肝癌的早期诊断是十分必要且有重大应用前景！

纳米抗体是在羊驼与骆驼的血液里面所发现的，因为它天然缺少轻链而仅仅包含重链可变区(VHH)，也被称为单域抗体。它的长约4nm，宽约2.5nm，分子量大约为15kDa左右，相对于与多克隆抗体和单克隆抗体而言，更小体积可以为它带来渗透力高、可溶性好、可以识别隐藏表位等优点。

纳米抗体的产生目前主流方式是通过免疫羊驼或者骆驼从而构建免疫文库来得到的，这需要完成制备抗原，免疫羊驼，采集血液，利用巢氏PCR技术和噬菌体展示技术等一系列实验，时间跨度较大，且不适合高毒性免疫原性对象。而最近构建合成文库来得到纳米抗体令人瞩目，目前市场上仅有一种合成文库的方法存在，但是上述合成文库是采用识别小分子的抗体框架，而GPC3蛋白的相对分子量约为70kDa，若应用上述合成文库来识别GPC3蛋白作为抗原，无法确保筛选出抗GPC3的纳米抗体及所筛选的纳米抗体可以用于肝癌的早期诊断，而利用GPC3蛋白作为抗原去免疫羊驼或者骆驼则费时费力，因此需要分析从免疫文库筛选的抗GPC3的纳米抗体作为基础框架，从而来构建抗GPC3的合成文库做到筛选出针对GPC3蛋白的高特异性与高灵敏度的纳米抗体。

发明内容

针对上述不足，本发明的第一个目的是提供一种抗GPC3纳米抗体合成库，增加纳米抗体文库的序列多样性和结构多样性。

本发明的第二个目的是提供上述抗GPC3纳米抗体合成库的构建方法，以便获得高亲和力的抗GPC3纳米抗体。

一种抗GPC3纳米抗体合成库的构建方法，依次通过包括下述方法：

1)以从免疫库获得的抗GPC3的纳米抗体的基因为全合成抗体文库的参考模板，确定FR1、FR2、FR3、FR4区域与CDR1、CDR2、CDR3区域的初始长度；FR1、FR2、FR3、FR4区域的氨基酸全部不变，将CDR1、CDR2、CDR3作为随机化位点，并且CDR3的氨基酸长度设计为13，17，21；

2)将从免疫库获得的抗GPC3的纳米抗体的菌株提取质粒后作为PCR的模板，进行PCR扩增得到初始模板的目的基因FR1-FR4区域片段；

3)设计2段随机化CDR区的引物；

所述的2段随机化CDR区的引物为序列如SEQ ID NO.3所示的引物3，序列如SEQ IDNO.4所示的引物4，序列如SEQ ID NO.4所示的引物4，序列如SEQ ID NO.5所示的引物5，序列如SEQ ID NO.6所示的引物6。

4)利用步骤2)制备的初始模板的目的基因FR1-FR4区域片段作为PCR的模板，采用引物3、引物4扩增得到FR1-CDR1-FR2新目的短片段N-1；

同时步骤2)制备的初始模板的目的基因FR1-FR4区域片段作为PCR的模板，采用引物5、引物6得到FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4新目的短片段N-2；

5)最后利用新目的短片段N-1和新目的短片段N-2作为重叠延伸PCR的模板，采用引物1、引物2得到完整且CDR1、CDR2、CDR3区域都已经随机化的纳米抗体的目的基因序列N3；

6)最后设计核苷酸序列所示的SEQ ID NO.7和核苷酸序列所示的引物8，加上酶切位点，利用N3作为PCR的模板，采用引物7和8得到加上酶切位点的纳米抗体的新目的基因序列N4；

7)将目的基因片段N4与pComb3XSS质粒进行sfiI酶切，酶切结束才用OMEGA胶回收试剂盒进行回收酶切好的目的片段N4与pComb3XSS质粒片段；

8)再用酶切好的目的片段N4与pComb3XSS质粒片段作为模板，使用T4DNA连接酶将目的片段插入线性化pComb3xss噬菌粒中进行PCR反应；

9)次日将未纯化的连接产物进行纯化得连接产物；

10)取纯化后的连接产物加入大肠杆菌TG1感受态细胞中进行电击转化，将转化后的细胞悬液复苏培养后的取细胞液，稀释，加入到CA抗性LB平板中，用涂布板均匀涂布，倒置平板，在37℃培养箱中，培养过夜；次日，计算板上的克隆数；随机挑选20个单克隆，送上海生工进行菌落测序，同时进行菌液PCR，最终的构建的纳米抗体合成库实际库容为1×10⁸cfu/mL；其余复苏后的细胞液用于构建噬菌体展示纳米抗体文；

11)取复苏的菌液接种培养、重悬沉淀，分离后收集溶解液即为噬菌体展示抗GPC3的纳米抗体全合成文库，-80℃保存。

进一步，所述的抗GPC3纳米抗体合成库的构建方法，所述的参考模板的FR1区域为17个氨基酸长度，CDR1区域为7个氨基酸长度，FR2区域为17个氨基酸长度，CDR2区域为8个氨基酸长度，FR3区域为38个氨基酸长度，CDR3区域为13个氨基酸长度，FR4区域为11个氨基酸长度。

进一步，所述的抗GPC3纳米抗体合成库的构建方法，步骤2)所述的PCR扩增采用的引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

进一步，所述的抗GPC3纳米抗体合成库的构建方法，步骤7)所述的sfiI酶切反应体系如下：1ng目的基因片段/pComb3XSS质粒，1μ lsfiI酶，5μl缓冲液，灭菌水补足至20μl；然后置于PCR仪器里50℃反应5h，然后使用琼脂糖凝胶电泳仪器进行电泳跑胶验证。

进一步，所述的抗GPC3纳米抗体合成库的构建方法，步骤7)所述的将pComb3XSS菌液在含有CA抗性的细菌培养皿划线，次日挑选大小适中的单克隆菌放入2ml含有CA抗性的LB培养基，37℃，220rpm培养过夜，次日利用OMEGA PlasmidMiniKit I提取质粒。

进一步，所述的抗GPC3纳米抗体合成库的构建方法，步骤8)所述的反应体系如下：取pComb3XSS质粒片段45ng，酶切好的目的片段N414ng，T4DNA酶1μl，缓冲液2μl，灭菌水补足至20μ，配好后放入PCR仪器里面16℃反应16h，65℃10min，4℃过夜。

进一步，所述的抗GPC3纳米抗体合成库的构建方法，步骤9)所述的纯化方法为：加入4μ乙酸钠终止反应，再加入220μ1无水乙醇并且上下摇匀后置于-20℃过夜。次日，在4℃，14000rpm，10min离心去掉上清，加入1ml70％乙醇，上下摇匀，再4℃，12000rpm，离心30min，小心去掉上清，不要碰到沉淀，再倒置于通风的情况下，等沉淀干燥后加入30μl灭菌水，即得到纯化好的连接产物。

进一步，所述的抗GPC3纳米抗体合成库的构建方法，步骤11)所述的具体方法为：取复苏的菌液接种至含20μg/mL四环素的190mLCA抗性LB培养基中，37℃，220rpm培养2h；加入辅助噬菌体M13K07，37℃静置感染30min，继续培养2h；加入硫酸卡那霉素使其终浓度为70μg/mL，并继续培养过夜；次日，在4℃，11，000rpm，离心20min，取上清，加入50mL2.5MPEG/NaCl溶液充分混合，冰上静置2h；在4℃，11,000rpm，离心30min，弃去上清，将PBS：2.5MPEG/NaCl按4∶1的比例加入重悬沉淀，冰上静置2h；在4℃，11，000rpm，离心30min，弃上清，将离心管倒置在吸水纸上，干燥3min，加入1mLPBS溶解，溶解液即为噬菌体展示抗GPC3的纳米抗体全合成文库，-80℃保存。

与现有的技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明公开了一种纳米抗体合成库及其构建方法，相比于采cabBCII10骨架的纳米抗体表达量(均不超10mg/L)高出4～10倍，相比于通用框架的表达量也高出近一个数量级，具有高表达量及良好的热稳定性，为后续抗体制备及实际应用提供良好的抗体性能基础。再通过数据统计、序列分析，并综合考虑到CDR3区不同长度对抗体可变区结构的改变后，将CDR3区随机化氨基酸个数设计为3种不同长度，CDR1、CDR2区氨基酸随机化个数固定。随后对三个CDR区均进行随机化构建全合成纳米抗体文库。

本发明不同于其他常见合成库采用报道的通用框架，而选择另外的高表达量高热稳定性纳米抗体的骨架区作为合成库构建基本骨架，并且不仅仅只对一个CDR区进行随机化，选择所有CDR区进行随机化，需要进行多次延伸拼接，相对难度更高，其中各片段的重叠延伸PCR反应条件经多次实验优化所得，最终以求获取更丰富的文库多样性(序列多样性、结构多样性)，增加淘筛各类不同对象的可能性。

其中，CDR序列长度的确定是根据统计工具分析而进行选定的，本发明提供的构建方法对CDR3区设计了三种不同长度的氨基酸数目，这三种CDR3区的氨基酸长度有助于形成凹型、凸型、环型结构，增加了文库结构多样性。

附图说明

图1为重叠延伸PCR拼接VHH片段(图A中lane 1：DL500 DNA marker；lane 1：VHH基因基础目标模板片段。图B中lane 1：含CDR1区随机化位点双链DNA片段N1；lane 2：DL500DNA marker；图C中lane 1：含CDR2和CDR3区随机化位点双链DNA片段N2；lane 2：DL500 DNAmarker；图D中lane 1：所有CDR区随机化的VHH基因；lane 2：DL2000 DNA marker)

图2为酶切pComb3XSS和VHH基因片段(图E中lane 1-5：pComb 3XSS酶切后的基因片段；lane6：DL15000 DNA marker；图F中lane 1-5：VHH酶切后的基因片段；lane 6：DL2000DNA marker)；

图3为VHH基因片段的菌液PCR(图中lane 1：DL2000 DNA marker；lane2-12：VHH基因片段；lane 13：DL2000 DNA marker)；

图4为抗体库挑菌测序结果。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进一步说明，但本发明的保护范围并不局限于实施例表示的范围。

本发明以从免疫库获得的抗GPC3的纳米抗体的基因为全合成抗体文库的参考模板。将所选定的纳米抗体的基因序列上传至网站(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast)，通过数据分析对比，区分框架区(FR区)与可变区(CDR区)且确定FR区与CDR区的初始长度，其中参考模板的FR1区域为17个氨基酸长度，CDR1区域为7个氨基酸长度，FR2区域为17个氨基酸长度，CDR2区域为8个氨基酸长度，FR3区域为38个氨基酸长度，CDR3区域为13个氨基酸长度，FR4区域为11个氨基酸长度。为了针对GPC3蛋白，FR区域的氨基酸全部不变，将CDR1-3作为随机化位点，并且CDR3的氨基酸长度设计为13，17，21。

实施例1

以下实施例仅对氨基酸长度为13个的CDR3区氨基酸随机化位点进行后续的构建。

首先将从免疫库获得的抗GPC3的纳米抗体的菌株提取质粒后作为PCR的模板，利用引物1：CAGGTGCAGCTCGTGGAG(SEQ ID NO.1)与引物2：TGGGTCCCCTGGCCCCA(SEQ ID NO.2)进行PCR得到初始模板的目的基因(FR1-FR4区域片段)，如图1的A所示，条带均匀且大小符合。

然后设计2段可以做到随机化CDR区的引物，其中：

引物3：CAGGTGCAGCTCGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTGCAGGCTGGGGGCTCTCTGAGACTCTCCTGTACAGCCTCTNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKATGGGCTGGTTCCGCCAG(SEQ ID NO.3)；

引物4：CGCTGCTATAAATTCACGCTCCTTCCCAGGAGCCTGGCG(SEQ ID NO.4)；

引物5：CGTGAATTTATAGCAGCGNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKTACCATGTAGATGCCCTG(SEQ ID NO.5)；

引物6：TGAGGAGACGGTGACCTGGGTCCCCTGGCCCCAMNNMNNMNNMNNMNNMNNMNNMNNMNNMNNMNNMNNMNNACAGTAATAAACAGCCGT(SEQ ID NO.6)；

利用初始模板的目的基因作为PCR的模板、引物3和4得到FR1-CDR1-FR2新目的短片段N-1，如图1的B所示，条带均匀且大小符合；同时也利用初始模板的目的基因作为PCR的模板、引物5和6得到FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4新目的短片段N-2，如图1的C所示，条带均匀且大小符合；最后利用新目的短片段N-1和新目的短片段N-2作为重叠延伸PCR的模板，引物1和2得到完整且CDR1-3区域都已经随机化的纳米抗体的目的基因序列N3，如图1的D所示，条带均匀且大小符合。

最后设计引物7：GTGGCCCAGGCGGCCCAGGTGCAGCTCGTGGAG(SEQ ID NO.7)和引物8：CTGGCCGGCCTGGCCCTGAGGAGACGGTGACCTGGGTCCCCTGGCCCCA(SEQ ID NO.8)，加上酶切位点方便后续实验，利用N3作为PCR的模板、引物7和8得到加上酶切位点的纳米抗体的新目的基因序列N4。

将pComb3XSS菌液在含有CA抗性的细菌培养皿划线，次日挑选大小适中的单克隆菌放入2ml含有CA抗性的LB培养基，37℃，220rpm培养过夜，次日利用OMEGA PlasmidMiniKit I提取质粒，将目的基因片段N4与pComb3XSS质粒进行sfiI酶切，反应体系如下：lng目的基因片段/pComb3XSS质粒，1μlsfiI酶，5μl缓冲液，灭菌水补足至20μl；然后置于PCR仪器里50℃反应5h，然后使用琼脂糖凝胶电泳仪器进行电泳跑胶验证，结果如图2所示，条带均匀大小符合。随后用OMEGA胶回收试剂盒进行回收酶切好的目的片段N4与pComb3XSS质粒片段。

再用酶切好的目的片段N4与pComb3XSS质粒片段作为模板，使用T4DNA连接酶将目的片段插入线性化pComb3xss噬菌粒中，反应体系如下：pComb3XSS质粒片段45ng，酶切好的目的片段N414ng，T4DNA酶1μl，缓冲液2μl，灭菌水补足至20μ，配好后放入PCR仪器里面16℃反应16h，65℃10min，4℃过夜。

次日，将未纯化的连接产物进行纯化，加入4μ乙酸钠终止反应，再加入220μ1无水乙醇并且上下摇匀后置于-20℃过夜。次日，在4℃，14000rpm，10min离心去掉上清，加入1ml70％乙醇，上下摇匀，再4℃，12000rpm，离心30min，小心去掉上清，不要碰到沉淀，再倒置于通风的情况下，等沉淀干燥后加入30μl灭菌水，即得到纯化好的连接产物。

取3μL纯化后的连接产物加入50μL大肠杆菌TG1感受态细胞中，混匀；将混合液转移至预冷电转杯中置入电穿孔仪进行电击转化；取出电转杯，立即加入已预热37℃的1mLSOC培养基，重悬转化后的细胞；重复上述步骤，进行10个电转化；将上述所得的转化后的细胞悬液合并至同一根摇菌管中，在37℃，200rpm摇床中，复苏培养60min；取2μL复苏后的细胞液，10倍倍比稀释，取100μL加入到CA抗性LB平板中，用涂布板均匀涂布，倒置平板，在37℃培养箱中，培养过夜。次日，计算板上的克隆数。随机挑选20个单克隆，送上海生工进行菌落测序，同时进行菌液PCR，结果如图3，图4所示，图3可以看出大小符合条带均匀，图4可以看出文库插入率100％，最终实施例所构建的纳米抗体合成库实际库容为1×108cfu/mL。其余复苏后的细胞液用于构建噬菌体展示纳米抗体文库。

取复苏的菌液接种至含20μg/mL四环素的190mLCA抗性LB培养基中，37℃，220rpm培养2h；加入1mL1×1012pfu/mL辅助噬菌体M13K07，37℃静置感染30min，继续培养2h；加入硫酸卡那霉素使其终浓度为70μg/mL，并继续培养过夜；次日，在4℃，11，000rpm，离心20min，取上清，加入50mL2.5MPEG/NaCl溶液充分混合，冰上静置2h；在4℃，11，000rpm，离心30min，弃去上清，将PBS：2.5MPEG/NaCl按4：1的比例加入重悬沉淀，冰上静置2h；在4℃，11，000rpm，离心30min，弃上清，将离心管倒置在吸水纸上，干燥3min，加入1mLPBS溶解，溶解液即为噬菌体展示抗GPC3的纳米抗体全合成文库，-80℃保存。

其余两种CDR3区氨基酸随机化位点定长度17和21，进行构建纳米文库时除了所用随机化位点的引物片段不同以外，其他操作均与以下实施例1步骤相同。

Claims (8)

1.一种抗GPC3纳米抗体合成库的构建方法，其特征在于，依次通过包括下述方法：

1)以从免疫库获得的抗GPC3的纳米抗体的基因为全合成抗体文库的参考模板，确定FR1、FR2、FR3、FR4区域与CDR1、CDR2、CDR3区域的初始长度；FR1、FR2、FR3、FR4区域的氨基酸全部不变，将CDR1、CDR2、CDR3作为随机化位点，并且CDR3的氨基酸长度设计为13，17，21；

2)将从免疫库获得的抗GPC3的纳米抗体的菌株提取质粒后作为PCR的模板，进行PCR扩增得到初始模板的目的基因FR1-FR4区域片段；

3)设计2段随机化CDR区的引物；

所述的2段随机化CDR区的引物为序列如SEQ ID NO.3所示的引物3，序列如SEQ IDNO.4所示的引物4，序列如SEQ ID NO.4所示的引物4，序列如SEQ ID NO.5所示的引物5，序列如SEQ ID NO.6所示的引物6。

4)利用步骤2)制备的初始模板的目的基因FR1-FR4区域片段作为PCR的模板，采用引物3、引物4扩增得到FR1-CDR1-FR2新目的短片段N-1；

同时步骤2)制备的初始模板的目的基因FR1-FR4区域片段作为PCR的模板，采用引物5、引物6得到FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4新目的短片段N-2；

5)最后利用新目的短片段N-1和新目的短片段N-2作为重叠延伸PCR的模板，采用引物1、引物2得到完整且CDR1、CDR2、CDR3区域都已经随机化的纳米抗体的目的基因序列N3；

6)最后设计核苷酸序列所示的SEQ ID NO.7和核苷酸序列所示的引物8，加上酶切位点，利用N3作为PCR的模板，采用引物7和8得到加上酶切位点的纳米抗体的新目的基因序列N4；

7)将目的基因片段N4与pComb3XSS质粒进行sfiI酶切，酶切结束才用OMEGA胶回收试剂盒进行回收酶切好的目的片段N4与pComb3XSS质粒片段；

8)再用酶切好的目的片段N4与pComb3XSS质粒片段作为模板，使用T4DNA连接酶将目的片段插入线性化pComb3xss噬菌粒中进行PCR反应；

9)次日将未纯化的连接产物进行纯化得连接产物；

10)取纯化后的连接产物加入大肠杆菌TGI感受态细胞中进行电击转化，将转化后的细胞悬液复苏培养后的取细胞液，稀释，加入到CA抗性LB平板中，用涂布板均匀涂布，倒置平板，在37℃培养箱中，培养过夜；次日，计算板上的克隆数；随机挑选20个单克隆，送上海生工进行菌落测序，同时进行菌液PCR，最终的构建的纳米抗体合成库实际库容为1×10⁸cfu/mL；其余复苏后的细胞液用于构建噬菌体展示纳米抗体文；

11)取复苏的菌液接种培养、重悬沉淀，分离后收集溶解液即为噬菌体展示抗GPC3的纳米抗体全合成文库，-80℃保存。

2.根据权利要求1所述的抗GPC3纳米抗体合成库的构建方法，其特征在于，所述的参考模板的FR1区域为17个氨基酸长度，CDR1区域为7个氨基酸长度，FR2区域为17个氨基酸长度，CDR2区域为8个氨基酸长度，FR3区域为38个氨基酸长度，CDR3区域为13个氨基酸长度，FR4区域为11个氨基酸长度。

3.根据权利要求1所述的抗GPC3纳米抗体合成库的构建方法，其特征在于，步骤2)所述的PCR扩增采用的引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

4.根据权利要求1所述的抗GPC3纳米抗体合成库的构建方法，其特征在于，步骤7)所述的sfiI酶切反应体系如下：1ng目的基因片段/pComb3XSS质粒，1μlsfiI酶，5μl缓冲液，灭菌水补足至20μl；然后置于PCR仪器里50℃反应5h，然后使用琼脂糖凝胶电泳仪器进行电泳跑胶验证。

5.根据权利要求1所述的抗GPC3纳米抗体合成库的构建方法，其特征在于，步骤7)所述的将pComb3XSS菌液在含有CA抗性的细菌培养皿划线，次日挑选大小适中的单克隆菌放入2ml含有CA抗性的LB培养基，37℃，220rpm培养过夜，次日利用OMEGA PlasmidMiniKit I提取质粒。

6.根据权利要求1所述的抗GPC3纳米抗体合成库的构建方法，其特征在于，步骤8)所述的反应体系如下：取pComb3XSS质粒片段45ng，酶切好的目的片段N414ng，T4DNA酶1μl，缓冲液2μl，灭菌水补足至20μ，配好后放入PCR仪器里面16℃反应16h，65℃ 10min，4℃过夜。

7.根据权利要求1所述的抗GPC3纳米抗体合成库的构建方法，其特征在于，步骤9)所述的纯化方法为：加入4μ乙酸钠终止反应，再加入220μl无水乙醇并且上下摇匀后置于-20℃过夜。次日，在4℃，14000rpm，10min离心去掉上清，加入1ml70％乙醇，上下摇匀，再4℃，12000rpm，离心30min，小心去掉上清，不要碰到沉淀，再倒置于通风的情况下，等沉淀干燥后加入30μl灭菌水，即得到纯化好的连接产物。

8.根据权利要求1所述的抗GPC3纳米抗体合成库的构建方法，其特征在于，步骤11)所述的具体方法为：取复苏的菌液接种至含20μg/mL四环素的190mLCA抗性LB培养基中，37℃，220rpm培养2h；加入辅助噬菌体M13K07，37℃静置感染30min，继续培养2h；加入硫酸卡那霉素使其终浓度为70μg/mL，并继续培养过夜；次日，在4℃，11，000rpm，离心20min，取上清，加入50mL2.5MPEG/NaCl溶液充分混合，冰上静置2h；在4℃，11，000rpm，离心30min，弃去上清，将PBS：2.5MPEG/NaCl按4∶1的比例加入重悬沉淀，冰上静置2h；在4℃，11，000rpm，离心30min，弃上清，将离心管倒置在吸水纸上，干燥3min，加入1mLPBS溶解，溶解液即为噬菌体展示抗GPC3的纳米抗体全合成文库，-80℃保存。

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