CN110396128B

CN110396128B - 抗cd19纳米抗体的制备

Info

Publication number: CN110396128B
Application number: CN201910215841.7A
Authority: CN
Inventors: 劳英斌; 张晴晴; 焦力; 姚紫娟; 孙建飞
Original assignee: Nanjing Dongji Pharmaceutical Technology Co ltd
Current assignee: Nanjing Dongji Pharmaceutical Technology Co ltd
Priority date: 2019-03-21
Filing date: 2019-03-21
Publication date: 2022-09-06
Anticipated expiration: 2039-03-21
Also published as: CN110396128A

Abstract

本发明公开了一种CD19的纳米抗体的VHH链，包括框架区FR和互补决定区CDR，公开了框架区FR选自下组的FR的氨基酸序列和互补决定区CDR氨基酸序列，本发明还公开了一种CD19纳米抗体，还公开了一种DNA分子，它编码本发明所述的CD19的纳米抗体的VHH链或本发明所述的CD19纳米抗体，还公开了一种宿主细胞，它可以表达CD19的纳米抗体，还公开了该CD19纳米抗体用于检测CD19的用途。通过本发明所公布的纳米抗体基因序列及宿主细胞，该纳米抗体能够在大肠杆菌内高效表达，应用于CD19检测试剂及生物制药的研发。

Description

抗CD19纳米抗体的制备

技术领域

本发明属于生物医学或生物制药技术领域，涉及针对于CD19的纳米抗体及其编码序列。

背景技术

1989年布鲁塞尔自由大学的Muyldermans偶然发现骆驼血液中有半数的抗体是天然缺失轻链。4年后，与其导师Hamers教授在Nature发文阐述了该类重链抗体特性。源于骆驼的SdAb，即纳米抗体（Nanobody，Nb），相对分子质量小于15KD，其内部存在二硫键，表面有大量亲水残基，对热和pH值有较强的抵抗力。具有常规单域抗体无法比拟的水溶性和构象稳定性。这种单体结构域能高特异性、高亲和力地与抗原结合，从而中和或者封闭相对隐蔽的抗原表位。凭借以上特性，Nb较之常规单域抗体收到了更加广泛的关注和认可。随着1994年第一个Nb的氨基酸序列测定以后，便进入了对Nb结构、特性和生产、应用的探索与开发研究阶段，纳米抗体技术的研发也将大大提高人类疾病的诊断与治疗水平。

急性淋巴细胞白血病（ALL）是血液系统常见恶性疾病之一，B细胞系ALL（B-ALL）占ALL的70%-80%，在儿童恶性血液病中尤为多见。目前成人ALL的疗效较差、生存期较短，单独应用联合化疗方法难以取得满意的疗效，需要结合骨髓移植、生物治疗及免疫治疗等多种手段进行综合治疗。研究表明，ALL白血病细胞表面免疫共刺激分子B7.1表达低下或缺乏，是导致白血病细胞不能被机体细胞毒性T细胞（CTL）有效地识别杀伤，从而逃逸宿主免疫监视的重要原因之一。然而几乎所有的B-ALL病例均高表达CD19表面抗原。因此可以利用CD19表面抗原作为ALL白血病细胞的表面标记，构建抗CD19纳米抗体-B7.1融合蛋白、表达融合蛋白，通过融合蛋白中抗CD19纳米抗体，将B7.1结合到ALL白血病细胞表面，刺激肿瘤特异性CTL细胞活化，从而起到杀伤白血病细胞的作用。

发明内容

发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供一种针对CD19的纳米抗体，同时提供该纳米抗体的编码序列及该纳米抗体在制备检测的应用。

技术方案：本发明的技术方案为：本发明的第一方面，提供了一种针对CD19重链抗体VHH，包括框架区FR和互补决定区CDR，所述框架区FR选自下组的FR的氨基酸序列：SEQ IDNO：1所示的FR1，SEQ ID NO：2所示的FR2，SEQ ID NO：3所示的FR3，SEQ ID NO：4所示的FR4。

所述互补决定区CDR选自下组的CDR的氨基酸序列：SEQ ID NO：5所示的CDR1，SEQID NO：6所示的CDR2，SEQ ID NO：7所示的CDR3。

优选地，所述的CD19纳米抗体的VHH链，它具有SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列。

本发明第二方面，一种针对CD19重链抗体VHH，此抗体特异性识别CD19抗原，包括一条具有SEQ ID NO：8所示氨基酸序列的VHH链。

本发明第三方面，提供了一种DNA分子，它编码选自下组的蛋白质：本发明所述的CD19重链抗体VHH。

优选地，所述的DNA分子，其特征在于，它具有选自下组的DNA序列：SEQ ID NO：9。

有益效果：与现有技术相比，本发明的优点如下：本发明将血液中提取的CD19免疫新疆单峰驼，随后利用该骆驼外周血淋巴细胞建立了针对于CD19的纳米抗体基因库，试验中将CD19偶联在酶标板上，以此形式的抗原利用噬菌体展示技术筛选免疫性的纳米抗体基因库（骆驼重链抗体噬菌体展示基因库），从而获得了针对CD19特异性的纳米抗体基因，将此基因转至大肠杆菌中，从而建立了能在大肠杆菌中高效表达的纳米抗体株。

附图说明

图1是用噬菌体的酶联免疫方法（ELISA）筛选特异性单个阳性克隆的模式图；其中1是将CD19蛋白偶联在酶标板上，2是纳米抗体，3是鼠抗HA抗体，4是山羊抗小鼠碱性磷酸酶标记的抗体，5是碱性磷酸酶显色液。

图2是表达的CD19纳米抗体，经镍柱树脂凝胶亲和层析纯化后的SDS-PAGE的电泳图；其中泳道1是蛋白分子标准，其余泳道是250毫摩尔咪唑洗脱液所洗脱下来的纳米抗体，结果显示CD19纳米抗体经过该纯化过程，其纯度可达到95%以上。

图3是CD19纳米抗体在不同环境温度下的耐受性检测。

具体实施方式

本发明首先将CD19的可溶性蛋白作为抗原免疫一只新疆单峰驼，经过5次免疫之后提取该单峰驼外周血淋巴细胞并构建了CD19特异的单域重链抗体文库。将CD19偶联在NUNC酶标板上，展示蛋白质的正确空间结构，使得CD19的抗原表位得以暴露出来，以此形式的抗原利用噬菌体展示技术筛选CD19免疫性的纳米抗体基因库（骆驼重链抗体噬菌体展示基因库），而获得了能在大肠杆菌中高效表达的纳米抗体株。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。

实施例1针对于CD19的纳米抗体文库的构建：

（1）首先合成抗原CD19，用于免疫所用的CD19的浓度为500μg/mL，每次免疫将0.5mgCD19与弗氏佐剂等体积混合，免疫一只新疆单峰驼(句容圣龙家畜养殖厂)，每周一次，共免疫5次，除第一次使用完全的弗氏佐剂（购自sigma），剩余几次全部使用弗式不全佐剂（购自sigma），免疫过程中刺激B细胞表达抗原特异性的纳米抗体。（2）5次免疫结束后，提取骆驼外周血淋巴细胞100mL并提取总RNA参照QIAGEN公司提供的RNA提取试剂盒。（3）按照Super-Script III FIRST STRANDSUPERMIX试剂盒说明书，将提取的RNA反转录成cDNA。用巢式PCR扩增重链抗体的可变区片段：

第一轮PCR：

上游引物：GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGGC

下游引物：GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC

扩增重链抗体引导肽和抗体CH2之间的片段，54℃退火，25个循环；结果显示该片段的大小约为700bp，即纳米抗体基因电泳带约为700bp。

第二轮PCR：以第一轮PCR产物作模板，

上游引物：GATGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGRGGAGG

下游引物：GGACTAGTGCGGCCGCTGGAGACGGTGACCTGGGT

扩增重链抗体FR1区和长、短铰链区之间的片段（长片段和短片段），60℃退火，17个循环，回收目的片段，结果显示该片段的大小约为500bp，即纳米抗体基因电泳带约为500bp。

（4）使用限制性的内切酶（购自NEB）PstI及NotI酶切20μg pComb3噬菌体展示载体（Biovector供应）及10μg VHH并用T4 DNA连接酶（购自TaKaRa公司）连接两个片段。（5）将连接产物电转化至电转感受态细胞TG1（北京神州红叶科技有限公司）中，构建CD19的纳米抗体噬菌体展示文库并测定库容，库容的大小为3.1×10⁸。与此同时，通过菌落PCR检测引物使用第二轮PCR引物，Tm55℃。文库构建完成后，为检测文库的插入率，随机选取24颗克隆做菌落PCR。结果显示插入率已达到90%以上。

实施例2针对CD19的纳米抗体筛选过程：

(1)将溶解在PBS中的100μg/mL的CD19包被在NUNC酶标板上，4℃放置过夜，同时设立负对照。(2)第二天两个孔中分别加入200μL1％牛奶，室温封闭2小时。(3)2小时后，加入100μL噬菌体(8×10¹¹ tfu免疫骆驼纳米抗体噬菌展示基因库)，在室温下作用1小时。(4)用PBST(PBS中含有0.05％吐温20)洗5遍，以洗掉不结合的噬菌体。(5)用三乙基胺(100mM)将与CD19特异性结合的噬菌体解离下，并感染处于对数期生长的大肠杆菌TG1，产生并纯化噬菌体用于下一轮的筛选，相同筛选过程重复2轮。结果如图1显示：在不断地筛选的过程中，阳性的克隆将不断的被富集，从而达到了利用噬菌体展示技术筛取抗体库中CD19特异抗体的目的。

实施例3

用噬菌体的酶联免疫方法(ELISA)筛选特异性单个阳性克隆：

该实验的原理模式图如图1所示，具体检测如下：

(1)从3-4轮筛选后含有噬菌体的细胞培养皿中，挑选96个单个菌落并接种于含有100μg/mL 的氨苄青霉素的TB培养基(1L TB培养基中含有2.3g磷酸二氢钾，12.52g磷酸氢二钾，12g 蛋白胨，24g酵母提取物，4mL甘油)中，生长至对数期后，加终浓度1mmol的IPTG，28℃ 培养过夜。(2)利用渗透法获得粗提抗体，并将抗体转移到经抗原包被的ELISA板中，在室温下放置1小时。(3)用PBST洗去未结合的抗体，加入一抗mouse anti-HA tagantibody(抗鼠抗HA抗体，购自北京康为世纪生物科技有限公司)，在室温下放置1小时。(4)用PBST 洗去未结合的抗体，加入二抗anti-mouse alkaline phosphatase conjugate(山羊抗小鼠碱性磷酸酶标记抗体，购自艾美捷科技有限公司)，在室温下放置1小时。(5)用PBST洗去未结合的抗体，加入碱性磷酸酶显色液，于ELISA仪上，在405nm波长，读取吸收值。(6)当样品孔 OD值大于对照孔OD值3倍以上时，判为阳性克隆孔。(7)将阳性克隆孔的菌转摇在含有 100μg/mL的LB液体中以便提取质粒并进行测序。

根据序列比对软件Vector NTI分析各个克隆株的基因序列，把CDR1，CDR2，CDR3序列相同的株视为同一克隆株，而其序列不同的株视为不同克隆株，最终得到氨基酸序列SEQIDNO：8所示的纳米抗体。

实施例4

纳米抗体在宿主菌大肠杆菌中表达、纯化：

(1)将前面测序分析所获得两种纳米抗体亚克隆至表达性的载体PET32a中，并将测序鉴定正确的重组质粒转化到表达型宿主菌DE3中，其涂布在含有100μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基的板上，37℃过夜。(2)挑选单个菌落接种在15mL含有氨苄青霉素的LB培养液中，37℃摇床培养过夜。(3)接种1mL的过夜菌种至330mLLB培养基中，37℃摇床培养，培养到OD值达到0.6-1时，加入IPTG，28℃摇床培养过夜。(4)第二天，离心收菌。(5) 将菌体破碎以获得抗体粗提液。(6)经镍柱离子亲和层析纯化抗体蛋白，为获得高纯度的抗体，采用咪唑梯度洗脱法，低浓度咪唑洗脱液(50mmol)用于洗去杂带，高浓度咪唑洗脱液(250mmol，500mmol)最终可制备纯度达90％以上的蛋白。图2所示从左到右的条带分别是：第一为标准蛋白分子，第二第三250mmol咪唑的洗脱液洗脱的蛋白样品；结果显示，纳米抗体经过该纯化后，其纯度可达到95％以上。

实施例5生物素化纳米抗体及其纯化方法：

（1）将针对PIK3的纳米抗体基因片段亚克隆至pBAD载体上，随后构建好的质粒pBAD与质粒BirA共转至大肠杆菌WK6中，并将其涂布在含有氨苄青霉素、氯霉素和葡萄糖的LB培养平板上，37℃培养过夜；（2）挑选单个菌落接种在5mL含有氨苄青霉素和氯霉素的LB培养液中，37℃摇床培养过夜；（3）接种1mL的过夜菌种至330mL含氨苄青霉素和氯霉素的TB培养液中，37℃摇床培养，培养到OD值达到0.4-0.5时，加入330μl50mM的D-生物素（D-biotion）溶液，37℃慢摇1h；（4）加入终浓度为1mMIPTG，28℃摇床培养过夜；（4）离心，收菌；（5）利用渗透法，获得抗体粗提液；（6）使用链霉亲和素磁珠纯化偶联生物素的纳米抗体。

实施例6CD19纳米抗体温度耐受性检测：

（1）将CD19纳米抗体分别放置于不同温度条件下：25℃ 24h，30℃ 24h，37℃ 24h，45℃ 24h，75℃ 1h，95℃ 1h；（2）将CD19蛋白经碳酸盐透析后包被在酶标板上，同时做空白孔对照（只包被NaHCO3）；（3）将不同处理的CD19纳米抗体分别转移到经抗原包被的ELISA板中，在室温下放置1h；（4）用PBST洗去未结合的抗体，加入一抗mouse anti-HA tagantibody（抗鼠抗HA抗体，购自北京康为世纪生物科技有限公司），在室温下放置1h；（5）用PBST洗去未结合的抗体，加入二抗anti-mouse alkaline phosphatase conjugate（山羊抗小鼠碱性磷酸酶标记抗体，购自艾美捷科技有限公司），在室温下放置1h；（6）用PBST洗去未结合的抗体，加入碱性磷酸酶显色液，放置于ELISA酶标仪上，在405nm波长读取吸光度值。结果如图3所示，CD19纳米抗体有较好的温度耐受性，CD19纳米抗体的耐高温特性也为我们之后结合光电化学免疫传感器进行高特异性和高灵敏度的检测提供了可能。

本发明提供一个CD19纳米抗体，每个纳米抗体提供骨架区和互补决定区，其中所述的骨架区FR1、FR2、FR3、FR4和互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的核苷酸和氨基酸序列分别为：

CD19纳米抗体

骨架区和互补决定区的核苷酸序列：

FR1:CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGGGGAGGCTCGGTGCAGGCTGGAGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCAGTC。

FR2:TGGTTCCGCCAAGTTCCAGGGAAGGAGCGCGAGGGGGTCGCGACT。

FRF3:AGATACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCATCATCTCCCAAGACAACGCCAAGAACACTCTGTATCTCCAAATGAACGCCCTGAAACCTGAGGACACTGCCATGTACTACTGT。

FR4:TGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA。

CDR1:TCTGGAATCACCTTTAGGCGCAACTGCATGGGC。

CDR2:CTTGATGGTGCTAGTTTGACA。

CDR3:GCGGCAAGCCCAACCCGCTATGGTTGTGGCGGAGCTGACTTCGACTCC。

骨架区和互补决定区的氨基酸序列：

FR1:QVQLQESGGGSVQAGGSLRLSCAAV（SEQ ID NO：1）。

FR2:WFRQVPGKEREGVAT（SEQ ID NO：2）。

FR3:RYADSVKGRFIISQDNAKNTLYLQMNALKPEDTAMYYC（SEQ ID NO：3）。

FR4:WGQGTQVTVSS（SEQ ID NO：4）。

CDR1:SGITFRRNCMG（SEQ ID NO：5）。

CDR2:LDGASLT（SEQ ID NO：6）。

CDR3:AASPTRYGCGGADFDS（SEQ ID NO：7）。

整体核苷酸序列：

CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGGGGAGGCTCGGTGCAGGCTGGAGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCAGTCTCTGGAATCACCTTTAGGCGCAACTGCATGGGCTGGTTCCGCCAAGTTCCAGGGAAGGAGCGCGAGGGGGTCGCGACTCTTGATGGTGCTAGTTTGACAAGATACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCATCATCTCCCAAGACAACGCCAAGAACACTCTGTATCTCCAAATGAACGCCCTGAAACCTGAGGACACTGCCATGTACTACTGTGCGGCAAGCCCAACCCGCTATGGTTGTGGCGGAGCTGACTTCGACTCCTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA（SEQID NO：9）。

整体氨基酸序列：

QVQLQESGGGSVQAGGSLRLSCAAVSGITFRRNCMGWFRQVPGKEREGVATLDGASLTRYADSVKGRFIISQDNAKNTLYLQMNALKPEDTAMYYCAASPTRYGCGGADFDSWGQGTQVTVSS（SEQ ID NO：8）。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 南京东极医药科技有限公司

<120> 抗CD19纳米抗体的制备

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Val

20 25

<210> 2

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Trp Phe Arg Gln Val Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala Thr

1 5 10 15

<210> 3

<211> 38

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Ile Ile Ser Gln Asp Asn

1 5 10 15

Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ala Leu Lys Pro Glu Asp

20 25 30

Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

35

<210> 4

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 5

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Ser Gly Ile Thr Phe Arg Arg Asn Cys Met Gly

1 5 10

<210> 6

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Leu Asp Gly Ala Ser Leu Thr

1 5

<210> 7

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Ala Ala Ser Pro Thr Arg Tyr Gly Cys Gly Gly Ala Asp Phe Asp Ser

1 5 10 15

<210> 8

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Val Ser Gly Ile Thr Phe Arg Arg

20 25 30

Asn Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Val Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly

35 40 45

Val Ala Thr Leu Asp Gly Ala Ser Leu Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Ile Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ala Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Ser Pro Thr Arg Tyr Gly Cys Gly Gly Ala Asp Phe Asp Ser

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 9

<211> 369

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

caggtgcagc tgcaggagtc tgggggaggc tcggtgcagg ctggagggtc tctgagactc 60

tcctgtgcag cagtctctgg aatcaccttt aggcgcaact gcatgggctg gttccgccaa 120

gttccaggga aggagcgcga gggggtcgcg actcttgatg gtgctagttt gacaagatac 180

gcagactccg tgaagggccg attcatcatc tcccaagaca acgccaagaa cactctgtat 240

ctccaaatga acgccctgaa acctgaggac actgccatgt actactgtgc ggcaagccca 300

acccgctatg gttgtggcgg agctgacttc gactcctggg gccaggggac ccaggtcacc 360

gtctcctca 369

Claims

1.可结合CD19的纳米抗体，包括框架区FR和互补决定区CDR，其特征在于，所述框架区FR为：SEQ ID NO：1所示的FR1，SEQ ID NO：2所示的FR2，SEQ ID NO：3所示的FR3和SEQ IDNO：4所示的FR4；

所述互补决定区CDR为：SEQ ID NO：5所示的CDR1，SEQ ID NO：6所示的CDR2和SEQ IDNO：7所示的CDR3。

2.一种DNA分子，其特征在于，其编码权利要求1所述的可结合CD19的纳米抗体。

3.根据权利要求2所述的DNA分子，其特征在于，其DNA序列为SEQ ID NO：9。