CN108753792B

CN108753792B - 绿色荧光蛋白纳米抗体的编码基因及其制备方法和应用

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Publication number: CN108753792B
Application number: CN201810400122.8A
Authority: CN
Inventors: 容益康; 裘建香; 李凯丽
Original assignee: Sun Yat Sen University
Current assignee: Sun Yat Sen University
Priority date: 2018-04-28
Filing date: 2018-04-28
Publication date: 2021-09-24
Anticipated expiration: 2038-04-28
Also published as: CN108753792A

Abstract

本发明涉及四个绿色荧光蛋白(GFP)纳米抗体编码基因，及其制备方法和应用。本发明构建了GFP纳米抗体文库。利用噬菌体展示技术，从该抗体文库中筛选到了四个特异结合GFP的纳米抗体，分别命名为A12、E6、D5和B9。测序获得了这四个纳米抗体基因的核苷酸序列，如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示，其对应的氨基酸序列如SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示。将A12基因克隆到改造的表达载体pADL‑10b‑His中，并导入SS320菌株中；将E6、D5和B9基因分别克隆到改造的表达载体pBAD24‑Flag‑His中，并分别导入TOP10菌株中，从而获得了四个纳米抗体的原核表达载体和菌株。本发明表达纯化了四个纳米抗体并证明了四个GFP纳米抗体能够特异结合GFP，可应用于基础研究中对GFP的检测。

Description

绿色荧光蛋白纳米抗体的编码基因及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种纳米抗体的编码基因及其制备方法和应用，属于基因工程领域，特别涉及4种绿色荧光蛋白纳米抗体的编码基因及其制备方法和应用。

背景技术

绿色荧光蛋白(GFP)是一种荧光分子，大小约27KDa，在蓝色波长光线激发下可以发出绿光。GFP在生物医学基础研究领域被广泛用作蛋白质标签，通过与目标蛋白融合表达，用于观察目标蛋白的定位及分子运动。因此GFP抗体在基础研究中有极大需求。

目前，应用最广泛的抗体是由两条重链和两条轻链组成的四聚体，大小约150KDa，称为传统抗体。传统抗体对抗原特异性和亲和力高，但分子量大，结构复杂，且面临生产工艺繁杂且批次不稳定性的缺点，严重影响了其在基础研究及临床领域的应用。虽然通过基因工程技术，从传统抗体中获得了结合抗原的抗体片段，如Fab(～50KDa)和scFv(～25KDa)，但这类抗体在微生物系统中产量低，可溶性和稳定性差，且易形成聚集体，抗体的应用仍然受限。

纳米抗体又叫单域抗体，是天然重链抗体的可变区(VHH)区域。天然重链抗体于1993 年在骆驼中首次发现，随后在美洲驼和羊驼等其他骆驼科动物以及鲨鱼体内也被发现。这种重链抗体只由两条重链组成，不含轻链，它们重链的单个可变区足以识别并结合抗原。纳米抗体具备分子量小，稳定性高及抗原亲和力高的优点；其结构简单，易折叠，可溶性好，修饰较少，能够在细菌和酵母中大量生产，不易形成聚集体。这些优越特性将提高并拓宽抗体在基础研究领域的应用可能性，并且有望实现纳米抗体在诊断和临床治疗中的广泛应用。

传统的GFP抗体通过免疫动物获得，常常出现稳定性差及生产成本高的问题，影响了 GFP抗体的应用。由于纳米抗体能在微生物中稳定高效表达，可以克服这些问题，因此开发 GFP纳米抗体基因及其原核表达载体和菌株，在基础研究中对GFP的检测有广阔的前景。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明目的是提供四种来源于羊驼的GFP纳米抗体编码基因及其氨基酸序列，以及该纳米抗体的原核表达载体和菌株。本发明表达纯化了四个纳米抗体并证明了四个GFP纳米抗体能够特异结合GFP，可应用于基础研究中对GFP的检测。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供四种绿色荧光蛋白纳米抗体的编码基因，其核苷酸序列分别如序列表SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。

本发明提供上述的绿色荧光蛋白纳米抗体的编码基因的制备方法，包括以下步骤：

(1)用绿色荧光蛋白免疫羊驼，第5次免疫后抽取羊驼外周血，分离血细胞；提取血细胞总RNA，反转录成cDNA后，通过PCR扩增得到VHH编码基因；

用葡聚糖-泛影葡胺密度梯度离心法分离免疫羊驼的血淋巴细胞；利用巢式PCR扩增羊驼重链抗体可变区(既VHH区域)；

(2)将VHH编码基因克隆到噬菌体展示载体pADL-10b上，构建VHH噬菌体展示文库；

采用酶切连接的方法，将VHH编码基因连接到pADL-10b上，然后采用电激法，将重组载体导入SS320菌株，构建纳米抗体细菌文库；利用辅助噬菌体超感染，从纳米抗体细菌文库中获取纳米抗体噬菌体展示文库，用于后续筛选实验；

(3)将绿色荧光蛋白固定在磁珠上，通过噬菌体展示技术从文库中富集绿色荧光蛋白纳米抗体；

采用体外筛选方法，利用生物淘洗法进行筛选；将生物素化的GFP固定在链霉亲和素的磁珠上作为固定相，以噬菌体展示文库为流动相，经过一段时间的孵育后，洗去没有或非特异结合的噬菌体，然后用胰蛋白酶将与GFP结合的噬菌体洗脱下来；用洗脱的与GFP结合的噬菌体感染SS320菌株后繁殖扩增，进行下一轮的筛选；重复这个筛选过程3次，得到与GFP高亲和的纳米抗体展示文库；

(4)通过ELISA方法筛选结合绿色荧光蛋白的纳米抗体阳性单克隆；

利用间接ELISA方法，从上述第三轮筛选后得到的纳米抗体展示文库中筛选GFP纳米抗体单克隆；将GFP包被在固相载体上，依次加入纳米抗体粗提液、anti-pIII抗体和碱性磷酸酶偶联的山羊抗小鼠抗体，分别经过一段时间的孵育和清洗，最后加入碱性磷酸酶显色液，避光孵育一段时间，在酶标仪上，在405nm波长下，测定吸收值，将吸收值为阴性对照组(不加纳米抗体粗体液或不加anti-pIII抗体)吸收值的2倍以上的克隆判定为阳性克隆；

(5)将阳性单克隆菌落送测序，获得GFP纳米抗体基因序列；

将阳性克隆的菌扩大培养，提取质粒，送测序；利用MegAlign软件，对测序结果进行比对分析。

本发明提供四种绿色荧光蛋白纳米抗体，其氨基酸序列分别如序列表SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示。

本发明提供四种绿色荧光蛋白纳米抗体的表达载体，分别含有如上所述的四种绿色荧光蛋白纳米抗体的编码基因。

进一步地，所述表达载体为原核或真核表达载体。

进一步地，所述表达载体为大肠杆菌质粒表达载体。

进一步地，所述表达载体为pADL-10b-His或者pBAD24-Flag-His。

具体地，所述四种绿色荧光蛋白纳米抗体的表达载体分别为pADL-10b-A12-His、pBAD24 -Flag-E6-His、pBAD24-Flag-D5-His和pBAD24-Flag-B9-His。

优选地，其中，绿色荧光蛋白纳米抗体的表达载体pADL-10b-A12-His是由所述绿色荧光蛋白纳米抗体编码基因A12插入至质粒pADL-10b-His的Bgl II位点来构建的；绿色荧光蛋白纳米抗体的表达载体pBAD24-Flag-E6-His、pBAD24-Flag-D5-His和pBAD24-Flag-B9-His 分别是由绿色荧光蛋白纳米抗体编码基因E6、D5和B9插入至质粒pBAD24-Flag-His的Xho I和Not I位点来构建的。

本发明提供四种绿色荧光蛋白纳米抗体的菌株，分别含有如上所述的四种绿色荧光蛋白纳米抗体的表达载体。

进一步地，所述菌株为SS320菌株或者TOP10菌株。

优选地，所述绿色荧光蛋白纳米抗体菌株为SS320菌株，含有如上所述绿色荧光蛋白纳米抗体表达载体pADL-10b-A12-His；所述绿色荧光蛋白纳米抗体菌株为TOP10菌株，含有如上所述绿色荧光蛋白纳米抗体表达载体pBAD24-Flag-E6-His、pBAD24-Flag-D5-His和pBAD24-Flag-B9-His。

本发明提供上述的绿色荧光蛋白纳米抗体的菌株的制备方法，所述表达载体导入菌株的方法采用热激法或电激法。

进一步地，所述热激法具体为分别制备SS320菌株和TOP10菌株的热激转化感受态细胞，然后将pADL-10b-A12-His热激转入SS320菌株中，将pBAD24-Flag-E6-His、pBAD24-Flag-D5- His和pBAD24-Flag-B9-His分别热激转入TOP10菌株中，复苏后涂板，挑取单克隆进行PCR 鉴定，鉴定正确的菌株为相应纳米抗体表达菌株。

进一步地，所述电激法具体为分别制备SS320菌株和TOP10菌株的电激转化感受态细胞，然后将pADL-10b-A12-His通过电激转入SS320菌株中，将pBAD24-Flag-E6-His、pBAD24- Flag-D5-His和pBAD24-Flag-B9-His分别通过电激转入TOP10菌株中，复苏后涂板，挑取单克隆进行PCR鉴定，鉴定正确的菌株为相应纳米抗体表达菌株。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明提供四种GFP纳米抗体的编码基因，分别为A12、E6、D5和B9，其核苷酸序列分别如序列表SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。该编码基因通过5次免疫羊驼后构建VHH噬菌体展示文库，通过3轮富集筛选，得到阳性单克隆菌落，具有更高的特异性和亲和性。

(2)本发明提供上述四种GFP纳米抗体的编码基因对应的氨基酸序列，分别如序列表 SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示。所得纳米抗体分子量大小约15kDa，是传统抗体的十分之一，更易于穿透细胞组织。且知道其氨基酸序列后，更加便于对抗体分子进行生物化学标记，而传统抗体通常难以知道其编码序列，因此不利于抗体的进一步改造。

(3)本发明提供四种GFP纳米抗体的表达载体：pADL-10b-A12-His、pBAD24-Flag-E6-His、pBAD24-Flag-D5-His和pBAD24-Flag-B9-His。这四个载体中的纳米抗体的N端都融合了PelB序列，可以使纳米抗体分泌到细菌周质，通过渗透压法破解细菌，可以获得高纯度的纳米抗体。每个载体中的纳米抗体的C端融合了His标签，便于通过镍柱亲和纯化。pBAD24-Flag–His载体中插入了Flag标签，便于对纳米抗体进行检测。

(4)本发明提供四种GFP纳米抗体的菌株，其中一种菌株SS320，携带有GFP纳米抗体表达载体pADL-10b-A12-His；三种菌株TOP10，分别携带GFP纳米抗体表达载体 pBAD24-Flag-E6-His、pBAD24-Flag-D5-His和pBAD24-Flag-B9-His。这两种菌株易于培养，增殖快，以IPTG或L-阿拉伯糖为诱导剂，操作方便，是很好的表达菌株。比起传统抗体要在动物中制备而言，其在细菌中表达更加简单方便，周期短，而且菌株能够无限稳定扩增，因此能够源源不断的从中获得功能稳定的纳米抗体。

附图说明

图1为实施例1中纳米抗体基因电泳图；

图中：泳道M是DNA marker，泳道VHH是PCR扩增的纳米抗体基因。

图2为实施例1中PCR鉴定所构建的纳米抗体文库中纳米抗体基因插入率的产物电泳图；

图中：泳道M是DNA marker，泳道1-20是挑取的菌落单克隆。

图3A为实施例4中表达载体pADL-10b-A12-His的图谱；

图3B为实施例4中表达载体pBAD24-Flag-E6-His、pBAD24-Flag-D5-His和pBAD24-Flag-B9-His的图谱。

图4为实施例4中纯化的纳米抗体电泳图。

图5为实施例5中ELISA法验证纯化的纳米抗体与GFP的特异结合；

图中：1是加入A12抗体，2是加入E6抗体，3是加入D5抗体，4是加入B9抗体，5 是加入没有偶联生物素的纳米抗体，6是没有加入纳米抗体，7是没有包被抗原GFP。

图6A为实施例6中蓝光照射下，A12和GFP孵育后的电泳凝胶图；

图中：泳道1，A12和GFP孵育后的样品，泳道2，只加了GFP，泳道3，只加了纯化的A12抗体；

图6B为实施例6中蓝光照射下，E6、D5、和B9与GFP孵育后的电泳凝胶图；

图中：泳道1，只加了GFP，泳道2，B9和GFP孵育后的样品，泳道3，D5和GFP孵育后的样品，泳道4，E6和GFP孵育后的样品；

图6C为实施例6中图6A的凝胶经过考马斯亮蓝染色后的凝胶图；

图中：圆圈指示GFP或MBP条带，正方形指示纳米抗体条带，三角形指示GFP-纳米抗体复合体条带；

图6D为实施例6中图6B的凝胶经过考马斯亮蓝染色后的凝胶图；

图中：圆圈指示GFP或MBP条带，正方形指示纳米抗体条带，三角形指示GFP-纳米抗体复合体条带。

现结合附图与具体实施例对本发明作进一步说明。

具体实施方式

本发明公开了四个绿色荧光蛋白(GFP)纳米抗体编码基因，及其制备方法和应用。

本发明以GFP免疫羊驼，构建了GFP免疫后的羊驼纳米抗体文库。利用噬菌体展示技术，从该抗体文库中筛选到了四个特异结合GFP的纳米抗体，分别命名为A12、E6、D5和B9。测序获得了这四个纳米抗体基因的核苷酸序列，如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3和SEQ ID NO:4所示，其对应的氨基酸序列如SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示。

将A12基因克隆到改造的表达载体pADL-10b-His中，并导入SS320菌株中；将E6、D5和B9基因分别克隆到改造的表达载体pBAD24-Flag-His中，并分别导入TOP10菌株中，从而获得了四个纳米抗体的原核表达载体和菌株。

本发明表达纯化了四个GFP纳米抗体并证明了四个GFP纳米抗体能够特异结合GFP，可应用于基础研究中对GFP的检测。

本发明提供来源于羊驼的GFP纳米抗体编码基因及其氨基酸序列，以及该纳米抗体的原核表达载体和菌株。

本发明用原核表达纯化的GFP免疫一只羊驼，经过5次免疫后，抽取该羊驼的外周血淋巴细胞，构建了GFP免疫后的纳米抗体文库。将GFP蛋白生物素化并将其偶联在链霉亲和素磁珠上，利用噬菌体展示技术从构建的文库中筛选GFP特异的纳米抗体并测序得到其编码基因，将筛选到的纳米抗体基因克隆到原核表达载体中，从而获得能在大肠杆菌中高效表达的纳米抗体株。

本发明第一方面，获得4个GFP纳米抗体编码基因，分别为A12、E6、D5和B9，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。

本文中纳米抗体基因获取方式是：用GFP免疫羊驼，第5次免疫后抽取羊驼外周血，分离血细胞。提取血细胞总RNA，反转录成cDNA后，通过PCR扩增得到VHH编码基因，将 VHH编码基因克隆到噬菌体展示载体pADL-10b上，构建VHH噬菌体展示文库。将GFP固定在磁珠上，通过噬菌体展示技术从文库中富集GFP纳米抗体，然后通过ELISA方法筛选结合GFP的纳米抗体阳性单克隆。将阳性单克隆菌落送测序，获得GFP纳米抗体基因序列。

测序共获得4种序列，其中A12的序列是最富集的序列，其次为E6的序列，另两种不同的序列分别为单克隆D5和B9，因此将这四种序列都进行了后续功能验证。

本发明第二方面，获得上述4个GFP纳米抗体基因对应的氨基酸序列，分别如SEQID NO: 5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示。

本发明第三方面，获得4个GFP纳米抗体表达载体：pADL-10b-A12-His、pBAD24-Flag- E6-His、pBAD24-Flag-D5-His和pBAD24-Flag-B9-His。所述载体分别含有如上第一方面所述核苷酸片段。

用Bgl II酶切载体pADL-10b-A12和改造过的载体pADL-10b-His，分别回收A12片段和 pADL-10b-His载体，通过T4连接酶将A12克隆到pADL-10b-His中，获得表达载体pADL-10b-A12-His。

通过PCR将E6、D5和B9基因分别扩增下来，用Xho I和Not I分别酶切PCR片段和改造过的载体pBAD24-Flag-His，通过T4连接酶将E6、D5和B9基因片段分别克隆到 pBAD24-Flag-His中，得到表达载体pBAD24-Flag-E6-His、pBAD24-Flag-D5-His和 pBAD24-Flag-B9-His。

本发明开发的两种载体：pADL-10b-His载体由噬菌体展示载体pADL-10b改造而来，用His标签替代了原载体中的噬菌体pIII蛋白，使得纳米抗体可以在用于筛选的载体中进行单独表达，保证抗体功能稳定性；pBAD24-Flag-His载体由pBAD24改造而来，在原载体中插入了PelB序列、His标签和Flag标签。

获得的四种GFP纳米抗体表达载体都含有PelB序列，使表达的抗体能够分泌到细菌周质中，从而易于获得高纯度抗体；都插入了His标签，便于纳米抗体的镍柱亲和纯化；pBAD24-Flag-His中的Flag标签，便于纳米抗体的检测。

这四种GFP纳米抗体表达载体中表达纳米抗体的启动子分别为Lac操纵子和阿拉伯糖启动子，表达量中等，从而使表达的纳米抗体能以可溶状态分泌到周质，不至于因表达量过高而聚集或分泌受阻。对应的诱导物分别为IPTG和阿拉伯糖，十分易于操作。

本发明第四方面，获得4种GFP纳米抗体菌株：一种菌株SS320，携带有如上第三方面所述的表达载体pADL-10b-A12-His；以及三种菌株TOP10，分别携带有如上第三方面所述的三种表达载体pBAD24-Flag-E6-His、pBAD24-Flag-D5-His和pBAD24-Flag-B9-His。通过热激的方法将相应质粒转入相应菌株中，获得纳米抗体表达菌株。

本发明针对两种纳米抗体表达载体选用了两种菌株，其中SS320菌株是本文抗体筛选过程所用的pADL-10b的宿主菌株，因此选用此菌株作为pADL-10b-His的宿主菌进行纳米抗体原核表达，便于获得功能稳定的抗体。TOP10菌株也是一种可用于外源蛋白表达的大肠杆菌，该菌株不会代谢L-阿拉伯糖，因此适合作为pBAD24-Flag-His的宿主菌，使得诱导表达过程中，加入的阿拉伯糖能持续诱导纳米抗体表达。

本发明第五方面，验证所述GFP纳米抗体用于检测GFP的用途。通过ELISA方法和非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳法，验证了纯化的A12、E6、D5和B9抗体都能够特异结合GFP。

下面通过具体实施例以及附图对本发明作进一步阐释，但是本发明的技术方案不以具体实施例为限。

本文中所有PCR所用酶均为TAKARA公司的

Max DNA Polymerase；本文所用PBST都是含有0.05％的tween-20。

实施例1：GFP纳米抗体文库的构建

(1)原核表达纯化GFP，将浓度稀释到1mg/mL，每次免疫将1mg GFP与等体积佐剂(购自GERBU公司)混合，免疫一只羊驼，每两周免疫一次，共免疫5次。

(2)5次免疫结束后，抽取羊驼外周血50mL，用葡聚糖-泛影葡胺密度梯度离心法分离血淋巴细胞，用Trizol法抽提细胞总RNA。

(3)按照TAKARA公司的PrimerScript^TM 1st Strand cDNA Synthesis Kit说明书，将提取的RNA反转录成cDNA，利用巢式PCR扩增羊驼重链抗体可变区(既VHH区域)。

第一轮PCR：进行8个平行的PCR，所用引物如下：

上游引物(5’－3’)：GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGG，

下游引物(5’－3’)：GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC；

反应条件：98℃，3min；98℃，10s，55℃，10s，72℃，1min，30个循环；72℃，10min。

每个PCR产物分别切胶回收大小约700bp的条带。

第二轮PCR：以回收的8个700bp DNA片段分别为模版，共进行8个反应，所用引物如下：

上游引物(5’－3’)：

CTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCAGATGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGRGGAGG

下游引物(5’－3’)：

GTGTTGGCC TCCCGGGCCACTAGTGCGGCCGCTGGAGACGGTGACCTGGGT。

反应条件：98℃，3min；98℃，10s，55℃，10s，72℃，30s，16个循环；72℃，10min。

切胶回收大小约500bp目的片段VHH。

结果如图1所示，泳道M是DNA marker，泳道VHH是VHH片段，即得到纳米抗体基因片段，大小约500bp左右。

(4)用限制性内切酶Bgl II(购自NEB公司)分别酶切10μg噬菌体展示载体pADL-10b 和4μg VHH，分别回收两个片段，并用T4连接酶(购自Thermo Fisher Scientific^TM公司)连接两个片段，纯化连接产物。

(5)取100ng连接产物转化一管SS320菌株，电激转化感受态细胞，共转化10管，复苏后涂板，构建GFP免疫后的纳米抗体细菌文库。

测定库容量，大小约6.7x10⁷个。

同时随机挑取20个单克隆，通过PCR对所建纳米抗体细菌文库中纳米抗体基因插入率进行检测，所用引物如下：

上游引物(5’-3’)：CAGGAAACAGCTATGACCATGAT，

下游引物(5’-3’)：GCCCTCATAGTTAGCGTAACGAT。

结果如图2所示，从每个克隆中都能扩增出包含纳米抗体基因的约700bp片段，表明纳米抗体细菌文库插入率达到100％，文库质量合格。

利用辅助噬菌体超感染，从纳米抗体细菌文库中获取纳米抗体噬菌体展示文库，具体方法如下：取100μL纳米抗体细菌文库，转接到60mL 2×TY培养基中，37℃培养；待到OD₆₀₀约为0.5时，取20mL菌液，加入辅助噬菌体dM13KO7以感染复数为10进行超感染，37℃孵育30min；然后在2800g和4℃条件下，离心收集菌体，用60mL 2×TY培养基重悬，加入终浓度为0.2μM的IPTG，28℃培养培养过夜。第二天从培养基上清中纯化噬菌体，即得到纳米抗体噬菌体展示文库，测定噬菌体文库大小，用于后续筛选实验。

实施例2：GFP特异的纳米抗体的富集过程

(1)按照EZ-LinkTM Sulfo-NHS-LC-Biotinylation Kit(购自Thermo FisherScientific^TM公司)的说明书，将纯化的GFP偶联上生物素(biotin)。

(2)取1μg偶联上生物素的GFP与30μL偶联链霉亲和素的磁珠(Dynabeads^TMM-280Streptavidin，Invitrogen)室温孵育30min，使GFP结合在磁珠上，然后用PBST清洗3次，洗去未结合的GFP。

(3)向磁珠中加入500μL噬菌体展示文库(含有5x10¹²个展示免疫羊驼纳米抗体的噬菌体)，室温翻转孵育2h。用PBST清洗25次，洗去没有结合或结合力弱的噬菌体。用500μL胰蛋白酶(0.25mg/mL)将与GFP特异结合的噬菌体解离下来，向解离下来的噬菌体溶液中加入10μL protease inhibitor cocktail(50x)(购自Roche公司)进行中和。

(4)取300μL解离下来的噬菌体溶液感染3mL处于对数生长期的SS320细胞，37℃孵育30min，之后再加入7mL培养基，30℃培养过夜。第二天纯化噬菌体用于下一轮筛选。

(5)重复这个筛选过程3次，第二轮和第三轮筛选时用于孵育的噬菌体数量降为1x10¹²个。

在不断筛选过程，展示有特异结合GFP的纳米抗体的噬菌体被不断富集，结果如表1所示，解离下来的噬菌体数量越来越多，从而达到从文库中富集GFP纳米抗体的目的。

表1筛选前后噬菌体数量

筛选过程	筛选前数量	筛选后数量
			第一轮	5x10<sup>12</sup>	2x10<sup>7</sup>
第二轮	1x10<sup>12</sup>	6x10<sup>8</sup>
			第三轮	1x10<sup>12</sup>	5x10<sup>10</sup>

实施例3：酶联免疫吸附方法(ELISA)筛选GFP特异的纳米抗体阳性单克隆

(1)从实施例2中第三轮筛选后得到的培养过夜的纳米抗体细菌文库中随机挑选20个细菌单克隆，分别接种至LB培养基中，培养至细菌生长对数期，加入终浓度为0.2mM的IPTG，30℃培养过夜，诱导纳米抗体表达。

(2)第二天收集菌体，用1/10菌液体积的CelLytic^TMB Cell Lysis Reagent(购自Sigma 公司)裂解细菌获得纳米抗体粗提液。取100μL抗体粗提液，加入GFP包被好并用3％BSA 封闭好的ELISA板中，室温孵育1h。

(3)用PBST清洗5次，每次1min，洗去未结合的蛋白。加入anti-pIII抗体(1：1000，购自NEB公司)，室温孵育1h。

(4)用PBST清洗5次，每次1min，洗去未结合的抗体。加入碱性磷酸酶偶联的山羊抗小鼠抗体(1:2000，购自Abcam公司)，室温孵育1h。

(5)用PBST清洗5次，每次1min，洗去未结合的抗体。每孔加入200μL碱性磷酸酶显色液DNPP(购自Sigma公司)，室温避光显色，不超过30min。

(6)加入50μL 3N氢氧化钠终止反应，在酶标仪上，在405nm波长下，测定吸收值。

(7)将吸收值为阴性对照组(不加纳米抗体粗体液或不加anti-pIII抗体)吸收值的2倍以上的克隆判定为阳性克隆。将阳性克隆的菌扩大培养，提取质粒，送测序。

(8)利用MegAlign软件，对测序结果进行比对分析。

结果发现共有4种DNA序列，它们的CDR3区域各不相同。将这4个抗体按照其克隆编号命名分别为A12、E6、D5和B9，它们的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1，SEQ ID NO: 2，SEQID NO:3和SEQ ID NO:4所示，氨基酸序列分别如SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:6， SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示。

实施例4：GFP纳米抗体在大肠杆菌中的原核表达和纯化

(1)对pADL-10b进行改造，用6×His标签替换pIII基因，获得重组载体pADL-10b-His。将A12克隆到pADL-10b-His中，获得表达载体pADL-10b-A12-His，图谱如图3A所示，将鉴定正确的重组质粒通过热激法导入SS320菌中进行表达。

对pBAD24进行改造，将PelB序列、6×His标签和Flag标签插入载体中，获得重组载体 pBAD24-Flag-His。将E6、D5和B9分别克隆到pBAD24-Flag-His中，获得表达载体pBAD24-Flag-E6-His、pBAD24-Flag-D5-His和pBAD24-Flag-B9-His，图谱如图3B所示，将鉴定正确的三个重组质粒分别通过热激法导入宿主菌TOP10中进行表达。

(2)挑取单克隆至含相应抗生素的LB培养基中，37℃培养过夜，第二天按1:100转接菌液到300mL LB培养基，37℃培养至OD₆₀₀约为0.5时，加入终浓度为0.4mM的IPTG诱导A12表达，加入0.02％的L-阿拉伯糖诱导E6、D5和B9表达，28℃培养过夜。

(3)第二天离心收集菌体，用渗透压法破裂细菌，获得抗体粗体液，然后通过镍柱亲和层析纯化抗体，用20mM的咪唑洗去杂蛋白，最后用250mM的咪唑将抗体洗脱下来。

将所得纳米抗体进行电泳检测，结果如图4所示，泳道1为蛋白marker，泳道2为纯化的A12抗体，泳道3为纯化的E6抗体，泳道4为纯化的D5抗体，泳道5为纯化的B9抗体。

所得抗体分子量如表2所示：

表2抗体分子量

抗体	A12	E6	D5	B9
					分子量(KDa)	15.7	18.4	16.6	17.3

检测结果表明成功得到目标纳米抗体。按照上述标记生物素的方法，用生物素标记纯化的抗体，用于后续实验。

实施例5：ELISA法验证GFP纳米抗体与GFP的结合能力

(1)首先用ELISA对纯化的GFP纳米抗体进行功能验证，将GFP(1μg/孔)包被在酶标板上，4℃过夜，用3％BSA封闭，室温孵育2h,用PBST清洗5次，每次1min。

(2)加入生物素化的纳米抗体(1μg/孔)，室温孵育1h，用PBST清洗5次，每次1min，洗去未结合的抗体。

(3)加入HRP偶联的链霉亲和素(1:10000)，室温孵育1h，用PBST清洗5次，每次1min。

(4)最后加入100μL TMB显色液，室温避光显色20min。加入50μL 2M浓硫酸终止反应，在酶标仪上，测定450nm波长下的吸收值。本实验设置了3组阴性对照，分别为不包被抗原GFP(既直接用BSA封闭，第(2)步中加入D5-biotin)、不加纳米抗体和加入没有生物素化的纳米抗体D5。每个实验组和对照组重复3次。

结果显示，实验组都呈现明显的颜色反应，吸收值结果如表3和图5所示。

如图5所示，纵坐标是450nm波长下的吸收值，横坐标是各个纳米抗体的实验组和阴性对照组，1是加入A12抗体，2是加入E6抗体，3是加入D5抗体，4是加入B9抗体，5是加入没有偶联生物素等纳米抗体，6是没有加入纳米抗体，7是没有包被抗原GFP。每个值都代表3次独立重复实验，结果实验组的吸收值都显著高于阴性对照组。

加入生物素化的纳米抗体的实验组的吸收值都显著高于阴性对照组的吸收值。且加入 A12、E6和D5的实验组的吸收值高于所有阴性对照组吸收值3倍以上，B9组的吸收值高于其中2个阴性对照组吸收值3倍以上，略低于其中一组阴性对照组的吸收值的3倍，但也呈现显著差异。这些结果表明这四个纳米抗体都能特异结合抗原GFP。影响这些纳米抗体吸收值高低有所不同的因素可能是它们对抗原亲和力的差异和抗体偶联上的生物素个数的差异。

表3 450nm波长下的吸收值

实施例6：

非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)方法验证纳米抗体与GFP的结合能力

(1)取3μg GFP和3μg纯化的纳米抗体(未偶联生物素)在PBS缓冲液条件下室温孵育30min，以3μg MBP和3μg纯化的纳米抗体在相同条件下孵育作为阴性对照。

(2)将孵育好的混合液进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。

由于单独的GFP或MBP分子在凝胶里的迁移率和GFP-纳米抗体或MBP-纳米抗体复合体的迁移率不一致，因此迁移率是否发生改变表明纳米抗体是否能结合GFP或MBP。而非变性条件下，GFP能发绿光，因此对于GFP的迁移，还能直接在蓝光下通过肉眼观察。

结果如图6所示，为Native-PAGE法验证纳米抗体与GFP的特异结合，将纯化的纳米抗体和GFP或MBP室温孵育，然后将孵育液进行Native-PAGE。

图6A和6B中，在蓝光照射下可见，A12、E6、D5和B9与GFP孵育后导致GFP迁移率发生改变，表明它们都能与GFP结合。图6A泳道2中GFP有部分降解，因此出现两条带。

图6C和6D是图6A和6B经过考马斯亮蓝染色后的凝胶图(在图6A和图6B中，由于MBP不发荧光，蓝光下看不到条带，因此未展示出来)，从图6C前3个泳道和图6D前4个泳道可以看到GFP(圆圈指示)、纳米抗体(正方形指示)和GFP-纳米抗体复合体(三角形指示)的蛋白条带。图6C后2个泳道和6D后4个泳道是MBP及MBP和纳米抗体的结合情况，可以看到MBP(圆圈指示)和纳米抗体(正方形指示)的蛋白条带，但是没有MBP- 纳米抗体复合体的条带，表明纳米抗体不与MBP结合。

值得注意的是，A12并不能迁移进入凝胶内，可能由于A12等电点偏碱性所致。另外， E6的迁移率可能和GFP-E6复合体的迁移率较为接近，电泳未能将两者分开，因此图6D中第4泳道没有看到单独的E6条带。

以上结果表明，A12、E6、D5和B9能特异结合GFP。

本发明并不局限于上述实施方式，如果对本发明的各种改动或变型不脱离本发明的精神和范围，倘若这些改动和变型属于本发明的权利要求和等同技术范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变动。

序列表

<110> 中山大学

<120> 绿色荧光蛋白纳米抗体的编码基因及其制备方法和应用

<130> 2018.4.18

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 378

<212> DNA

<213> Alpaca

<400> 1

atggcagatg tgcagctgca ggagtctgga ggaggattgg tgcaggctgg gggctctctg 60

agactctcct gtgcagcctc tggaggcacc ttcagtatct tgtccttggg ctggtttcgc 120

caggcgccag ggaaggagcg cgaatttgta gcagctatta gccggagtga aggtagcaca 180

gactatgcag acttcgtgaa gggccgattc atgatctcca gagagaacgc caagaatacg 240

gcgtatctgc aaatgaacag cctgaaacct gaggacacgg ccgtttattt ctgtgcagct 300

tcatacgcgc gcagactatc tactacagcg tctcgcgttt tatactgggg ccaggggacc 360

caggtcaccg tctccagc 378

<210> 2

<211> 396

<212> DNA

<213> Alpaca

<400> 2

atggcagatg tgcagctgca ggagtctgga ggaggattgg tgcaggctgg gggctctctg 60

agactctcct gtgcagcctc tggacgcttc gtcagtagtt atatcatggg ctggttccgc 120

caggctccag ggaaggagcg ggaggctgta gcaagtattc tccggagtgt tgacgcgaca 180

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cgggcacgtg gatatttcgg gtcgttcggg cgtctctggc ccgacgaccg acagtatgat 360

tactggggcc aggggaccca ggtcaccgtc tccagc 396

<210> 3

<211> 351

<212> DNA

<213> Alpaca

<400> 3

atggcagatg tgcagctgca ggagtctgga ggaggcttgg tgcagcctgg ggggtctctg 60

agactctcct gtgcagcctc tggaatcatc ttcagtatct atgacatggg ctggtaccgc 120

caggctccag ggaagcagcg cgagttggtc gcacttatta ctattcatcg tagcacaaac 180

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tatctgcaaa tgaacagcct gaaacctgag gacacggccg tctattactg taatgcaaat 300

ggggtaaatt accaatactg gggccagggg acccaggtca ccgtctccag c 351

<210> 4

<211> 375

<212> DNA

<213> Alpaca

<400> 4

atggcagatg tgcagctgca ggagtctgga ggaggatcgg tgcaggccgg gggctctctg 60

acgctctcct gtacagtctc tggagacacc ttcagtaatt atatattggg gtggttccgc 120

caggctccag ggaaggaccg tgagtttgcg gcagctatta gccgacttgg ggttcacaca 180

gagtatgcag acaccgttac gggccgattc accatctcca gagacaacgc caagtcaaca 240

ctgtatctac aaatgagcag tctgaaacct gaggacacgg ccgtgtatta ctgtgcggca 300

aaagccgtca ggcgcgtgca tggtacgcgc gactatgact tttggggcca ggggacccag 360

gtcaccgtct ccagc 375

<210> 5

<211> 126

<212> PRT

<213> Alpaca

<400> 5

Met Ala Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala

1 5 10 15

Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser

20 25 30

Ile Leu Ser Leu Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu

35 40 45

Phe Val Ala Ala Ile Ser Arg Ser Glu Gly Ser Thr Asp Tyr Ala Asp

50 55 60

Phe Val Lys Gly Arg Phe Met Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Thr

65 70 75 80

Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Phe Cys Ala Ala Ser Tyr Ala Arg Arg Leu Ser Thr Thr Ala Ser Arg

100 105 110

Val Leu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 6

<211> 132

<212> PRT

<213> Alpaca

<400> 6

Met Ala Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala

1 5 10 15

Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Phe Val Ser

20 25 30

Ser Tyr Ile Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu

35 40 45

Ala Val Ala Ser Ile Leu Arg Ser Val Asp Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Asp Lys Asn Thr

65 70 75 80

Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Thr Arg Ala Arg Gly Tyr Phe Gly Ser Phe Gly Arg Leu

100 105 110

Trp Pro Asp Asp Arg Gln Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val

115 120 125

Thr Val Ser Ser

130

<210> 7

<211> 117

<212> PRT

<213> Alpaca

<400> 7

Met Ala Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro

1 5 10 15

Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Ile Phe Ser

20 25 30

Ile Tyr Asp Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu

35 40 45

Leu Val Ala Leu Ile Thr Ile His Arg Ser Thr Asn Tyr Glu Asp Ser

50 55 60

Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val

65 70 75 80

Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

85 90 95

Cys Asn Ala Asn Gly Val Asn Tyr Gln Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 8

<211> 125

<212> PRT

<213> Alpaca

<400> 8

Met Ala Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala

1 5 10 15

Gly Gly Ser Leu Thr Leu Ser Cys Thr Val Ser Gly Asp Thr Phe Ser

20 25 30

Asn Tyr Ile Leu Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Asp Arg Glu

35 40 45

Phe Ala Ala Ala Ile Ser Arg Leu Gly Val His Thr Glu Tyr Ala Asp

50 55 60

Thr Val Thr Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Ala Lys Ala Val Arg Arg Val His Gly Thr Arg Asp Tyr

100 105 110

Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

Claims

1.一种绿色荧光蛋白纳米抗体的编码基因，其特征在于：所述编码基因核苷酸序列如序列表SEQ ID NO: 1所示。

2.一种绿色荧光蛋白纳米抗体，其特征在于：所述绿色荧光蛋白纳米抗体氨基酸序列如序列表SEQ ID NO: 5所示。

3.绿色荧光蛋白纳米抗体的表达载体，其特征在于：所述表达载体含有权利要求1所述的绿色荧光蛋白纳米抗体的编码基因。

4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于：所述表达载体为原核或真核表达载体。

5.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于：所述表达载体为大肠杆菌质粒表达载体。

6.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于：所述表达载体为pADL-10b-His或者pBAD24-Flag-His。

7.一种菌株，其特征在于：所述菌株含有权利要求3-6中任一项所述的绿色荧光蛋白纳米抗体的表达载体。

8.根据权利要求7所述的菌株，其特征在于：所述菌株为SS320菌株或者TOP10菌株。

9.权利要求7所述的菌株的制备方法，其特征在于：所述表达载体导入菌株的方法采用热激法或电激法。