CN112794914B

CN112794914B - 一种基于噬菌体展示技术开发的alk纳米抗体及其应用

Info

Publication number: CN112794914B
Application number: CN201911126600.1A
Authority: CN
Inventors: 任丙昭; 欧阳冰洁; 于颖佳; 范广益; 王媚娘; 李新洋; 杨乃波; 刘心
Original assignee: Qingdao Bgi Gene Research Institute; BGI Shenzhen Co Ltd
Current assignee: Qingdao Bgi Gene Research Institute; BGI Shenzhen Co Ltd
Priority date: 2019-11-14
Filing date: 2019-11-18
Publication date: 2022-09-16
Anticipated expiration: 2039-11-18
Also published as: CN112794914A

Abstract

本发明公开了一种基于噬菌体展示技术开发的ALK纳米抗体及其应用。本发明所提供的纳米抗体，包含由CDR1、CDR2和CDR3组成的互补决定区；CDR1的氨基酸序列为SEQ ID No.1的第21‑28位；CDR2的氨基酸序列为SEQ ID No.1的第46‑52位；CDR3的氨基酸序列为SEQ ID No.1的第91‑107位。本发明利用骆驼PBMC细胞，构建出骆驼纳米抗体天然文库，并利用噬菌体展示技术，从文库中筛选获得了高亲和力的ALK纳米抗体噬菌体克隆，转化到大肠杆菌表达体系中进行大量表达，有效降低了ALK抗体的开发和生产成本，本发明ALK纳米抗体经临床样本的免疫组化验证，具有更高的灵敏度和特异性。

Description

一种基于噬菌体展示技术开发的ALK纳米抗体及其应用

技术领域

本发明涉及生物医学领域，具体涉及一种基于噬菌体展示技术开发的ALK纳米抗体及其应用。

背景技术

近十年来，肺癌已经成为严重危害人类健康的常见恶性肿瘤之一，发病率和致死率不断上升。据2018年卫生统计年鉴显示，我国每年新发肺癌病例达70余万，死亡率占我国恶性肿瘤死亡率的第一位。非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)是肺癌中最常见的类型，约占85％，5年生存率仅为15％。NSCLC根据不同的组织学类型可以分为腺癌(≥40％)、鳞癌(30％)以及较为少见的大细胞(large cell carcinoma,LCC)(10％)。随着肺腺癌和鳞癌个体化治疗方案的日趋不同，临床强烈要求对不同类型的NSCLC明确诊断。对于绝大多数手术切除病例而言，经充分取材均能够正确诊断，但病理医师在实际工作中经常面临的是小活检标本(占70％)的诊断，诊断靶点的重要性不仅体现在NSCLC不同组织学类型之间的诊断，还在于明确特征性的分子学改变，用于满足NSCLC个体化治疗和预后判断的需要。目前临床应用的个体化靶向治疗主要针对表皮生长因子受体(epithelial growthfactor receptor,EGFR)基因突变性和间变性淋巴瘤激酶(Anaplastic lymphoma kinase,ALK)融合基因阳性肺癌，这两种基因变异型肺癌均具有明确的分子靶点、靶点检测技术及上市的靶向药物，临床疗效得到明显提高。

2007年Soda等人首次报道了NSCLC患者中存在由于染色体重排导致的间变性淋巴瘤激酶(Anaplastic lymphoma kinase,ALK)基因与其他基因的融合，其中，最常见的ALK基因重排的融合变异为2号染色体短臂倒位[inv(2)(p21p23)]，形成EML4-ALK融合基因，编码含EML4的氨基末端和ALK的胞内酪氨酸激酶域的融合蛋白生成。目前，已经有三代ALK靶向药物(克唑替尼、色瑞替尼、艾乐替尼)应用于临床治疗。ALK重排阳性患者的药物耐药性问题和副作用更小，整体治疗效果更好，因此ALK靶点也被誉为NSCLC领域的“钻石靶点”。

目前针对ALK融合基因检测常用的方法主要有3种：荧光原位杂交(fluorescentinsitu hybridization，FISH)、基于聚合酶链反应(PCR)扩增基础上的技术[cDNA末端快速扩增PCR(RACE-PCR)或逆转录(RT)-PCR联合测序技术、即时荧光定量RT-PCR反应(real-time quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction，qRT-PCR)等]和针对融合蛋白表达的免疫组织化学法(IHC)。FISH虽然是临床试验验证的标准方法，步骤繁多复杂，容易信号丢失从而造成假阴性的结果，且只能判断ALK基因是否断裂，而无法区分与其发生融合的基因是什么，RNA检测只能定性间接反映检测基因的表达情况，无法检测蛋白质的定量表达情况，且FISH检测存在经济适用性的问题；RT-PCR对标本取材要求较高，需专用的试剂盒进行检测；IHC方法操作简单，特异性强，敏感度高，可在组织和细胞中进行抗原的准确定位，因而可同时对不同抗原在同一组织或细胞中进行定位观察，这样就可以进行形态与功能相结合的研究，对病理学研究的深入是十分有意义的。IHC特异性强和敏感度高等优点取决于有亲和力高特异性强的抗体，但是目前用于IHC方法的ALK抗体被价格昂贵的进口产品垄断，Cell Signaling Technology公司的D5F3抗体和Abcam公司的5A4抗体的准确度分别为100％和95％－99％。Roche VENTANA公司利用D5F3抗体并结合自身显色技术研制出ALK(D5F3)CDx试剂盒，先后获得CFDA和FDA批准，作为靶向药物克唑替尼和色瑞替尼的伴随诊断试剂。我国在ALK免疫诊断领域的研究严重滞后，国产抗体无法满足NSCLC患者的需求。

现自1993年Hamers等在骆驼血液中发现了天然缺失轻链的重链抗体后，纳米抗体(Nanobody,Nb)逐渐取代其他的小型抗体，逐渐成为新型抗体药物研发的热点。Nb通常只有15KDa左右，约传统抗体大小的十分之一，其内部存在二硫键，表面有大量亲水残基，对热和pH有较强的抵抗力；Nb缺乏Fc段和轻链的性质使其能够识别传统抗体无法识别的隐蔽表位或小表位，且避免了补体反应；此外，纳米抗体还具有稳定性高、毒性低、可溶性强、易于靶点筛选，和易于在原核微生物中直接表达，经济性好等诸多优势。序列同源性分析显示，骆驼Nb的VHH胚系基因序列和人VH3高度同源，但CDR1和CDR3比人稍长，CDR3在三级结构中向外凸出，因而推测有更高的抗原结合的特异性和亲和力。检测抗体的前景巨大，但国内检测抗体仍然处于起步阶段。因此，开发我国国产化ALK检测抗体，满足我国国民对于检测抗体的迫切需求，具有深远而积极的意义。

发明内容

本发明针对“现有技术对于ALK抗体的开发集中在单克隆兔源传统抗体，传统单克隆抗体筛选方法费时费力，传统抗体无法在原核体系表达，研发周期长，生产成本高，批间差异大，严重限制了我国ALK抗体的开发，完全不能满足我国NSCLC患者的诊断和治疗需求”这一问题，提供了一种基于噬菌体展示技术开发的ALK纳米抗体及其应用。

第一方面，本发明要求保护一种纳米抗体。

本发明所要求保护的纳米抗体，命名为F10，包含互补决定区；

所述互补决定区由CDR1、CDR2和CDR3组成；

所述CDR1的氨基酸序列为SEQ ID No1的第21-28位；

所述CDR2的氨基酸序列为SEQ ID No.1的第46-52位；

所述CDR3的氨基酸序列为SEQ ID No.1的第91-107位。

进一步地，所述纳米抗体由所述互补决定区和框架区组成。

更进一步地，所述纳米抗体可为下述A1)或A2)：

A1)氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的纳米抗体；

A2)在SEQ ID No.1所示氨基酸序列的N端和/或C端连接上蛋白标签后得到的纳米抗体。

所述蛋白标签(protein-tag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为His标签、Flag标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。

在本发明的具体实施方式中，所述纳米抗体具体为在SEQ ID No.1所示氨基酸序列的C端连接HA和6His标签后得到的。

第二方面，本发明要求保护与所述纳米抗体相关的生物材料。

本发明所要求保护的生物材料为如下任一：

B1)编码所述纳米抗体的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体；

B4)含有B2)所述表达盒的重组载体；

B5)含有B1)所述核酸分子的重组微生物；

B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物；

B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物；

B9)含有B1)所述核酸分子的转基因动物细胞系；

B10)含有B2)所述表达盒的转基因动物细胞系；

B11)含有B3)所述重组载体的转基因动物细胞系；

B12)含有B4)所述重组载体的转基因动物细胞系。

上述生物材料中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

上述生物材料中，B2)所述表达盒是指能够在宿主细胞中表达所述纳米抗体的DNA，该DNA不但可包括启动所述纳米抗体编码基因转录的启动子，还可包括终止所述纳米抗体编码基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。

可用现有的表达载体构建含有所述表达盒的重组载体。

上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。

上述生物材料中，所述重组载体可为将B1)所述核酸分子导入到pMECS载体中得到的重组载体。在本发明的一个实施例中，B3)所述重组载体为将所述纳米抗体编码基因(SEQID No.2)导入pMECS载体中得到的重组载体。

上述生物材料中，所述微生物可为细菌(如大肠杆菌)、酵母、藻或真菌。

进一步地，所述纳米抗体的CDR1的编码序列为SEQ ID No.2的第61-84位核苷酸。所述纳米抗体的CDR2的编码序列为SEQ ID No.2的第136-156位核苷酸。所述纳米抗体的CDR3的编码序列为SEQ ID No.2的第271-321位核苷酸。

更进一步地，B1)所述核酸分子可为如下任一：

C1)核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的DNA分子；

C2)在严格条件下与C1)限定的DNA分子杂交且编码所述纳米抗体的DNA分子；

C3)与C1)或C2)限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码所述纳米抗体的DNA分子。

其中，所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

第三方面，本发明要求保护含有所述纳米抗体结构的衍生抗体。

进一步地，所述衍生抗体可为如下任一：

D1)含有所述纳米抗体的单链抗体；

D2)含有D1)所述单链抗体的融合抗体；

D3)含有所述纳米抗体的融合抗体；

D4)含有所述纳米抗体的Fab；

D5)含有所述纳米抗体的完整抗体。

第四方面，本发明要求保护含有所述纳米抗体或所述生物材料或所述衍生抗体的试剂盒。

第五方面，本发明要求保护所述纳米抗体的制备方法。

本发明所要求保护的纳米抗体的制备方法，可包括如下步骤：将编码所述纳米抗体的核酸分子导入受体细胞得到表达所述纳米抗体的转基因细胞，培养所述转基因细胞，得到所述纳米抗体。

进一步地，编码所述纳米抗体的核酸分子为前文第二方面中所述的核酸分子。

进一步地，所述受体细胞可为微生物细胞，如细菌(如大肠杆菌)、酵母、藻或真菌。

在本发明的具体实施方式中，所述受体细胞具体为大肠杆菌。

第六方面，本发明要求保护如下任一应用：

E1)所述纳米抗体在制备用于检测非小细胞肺癌患者ALK融合蛋白的表达情况的产品中的应用；

E2)所述生物材料在制备用于检测非小细胞肺癌患者ALK融合蛋白的表达情况的产品中的应用；

E3)所述衍生抗体在制备用于检测非小细胞肺癌患者ALK融合蛋白的表达情况的产品中的应用；

E4)所述试剂盒在制备用于检测非小细胞肺癌患者ALK融合蛋白的表达情况的产品中的应用；

E5)所述方法在制备用于检测非小细胞肺癌患者ALK融合蛋白的表达情况的产品中的应用；

E6)所述纳米抗体在制备与ALK结合的产品中的应用；

E7)所述生物材料在制备与ALK结合的产品中的应用；

E8)所述衍生抗体在制备与ALK结合的产品中的应用；

E9)所述试剂盒在制备与ALK结合的产品中的应用；

E10)所述方法在制备与ALK结合的产品中的应用；

E11)所述纳米抗体在制备用于检测ALK的产品中的应用；

E12)所述生物材料在制备用于检测ALK的产品中的应用；

E13)所述衍生抗体在制备用于检测ALK的产品中的应用；

E14)所述试剂盒在制备用于检测ALK的产品中的应用；

E15)所述方法在制备用于检测ALK的产品中的应用。

进一步地，E1)-E4)中具体可为利用免疫组化来诊断非小细胞肺癌患者ALK融合蛋白的表达情况。

本发明首先采集骆驼血及脾脏，分离骆驼的PBMC细胞，从中扩增出天然的VHH文库。其次本发明结合使用了噬菌体展示技术，能够比较直观的获得抗体亲和信息，在较短时间内获得了高亲和力的ALK纳米抗体基因。此外，本发明提供了上述ALK纳米抗体的制备方案，优化了大肠杆菌原核表达系统，对ALK纳米抗体进行了大量表达和纯化，有效地降低了ALK抗体的开发和生产成本，该纳米抗体经ELISA和Biacore系统验证具有靶向ALK的高特异性和高亲和性，将挑选出的亲和力较高的纳米抗体(F10)利用ALK重排阳性患者的肿瘤组织切片进行临床功能验证，具有更高的灵敏度和特异性，表明本发明得到的ALK纳米抗体(F10)具有继续开发价值。

附图说明

图1为淘选ALK纳米抗体单克隆ELISA筛选。其中横坐标编号78为本发明中的F10纳米抗体。

图2为竞争ELISA淘选ALK纳米抗体。基线为阴性对照的平均值。

图3为anti-ALK纳米抗体F10的表达和纯化。泳道1为流穿液，泳道2为20mM咪唑洗脱液，泳道3、4、5、6为250mM咪唑洗脱液。

图4为Biacore验证anti-ALK纳米抗体F10亲和力。

图5为病例1(鳞状细胞癌，实体为主型)病理切片验证F10亲和力及特异性。F10在病例1癌变细胞中表现为细胞浆强阳性，在正常细胞(同一张组织切片上的癌细胞和正常细胞)中表现为阴性。

图6为病例2(肺腺癌，腺泡为主型)病理切片验证F10亲和力及特异性。F10在病例2癌变细胞中表现为细胞浆强阳性，在正常细胞(同一张组织切片上的癌细胞和正常细胞)中表现为阴性。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、骆驼天然纳米抗体噬菌体展示文库扩增和拯救

一、构建噬菌体重组质粒文库

采集骆驼的外周血细胞(PBMC)，提取总RNA，采用Nest-PCR技术克隆骆驼重链抗体的V区，将其插入到噬菌体质粒pMECS中，构建得到噬菌体重组质粒文库。

具体操作如下：

1、血液淋巴细胞样品分离将采集的骆驼血液样本分离淋巴细胞，分离方法如下：

(1)在15ml离心管中加入7ml淋巴细胞分离液Ficoll(GE,货号17-1440-02)；

(2)在已加入抗凝剂(EDTA)的新鲜全血中加入等体积PBS(生工，货号B548117-0500)(1×)或生理盐水，充分混匀；

(3)取加淋巴细胞分离液的15ml离心管，小心地缓慢转入另一已加入淋巴细胞分离液的15ml离心管中，并使上述混合液处于淋巴细胞分离液液面之上(即两种液体不要混合，保留清晰的界面)，3000g离心20min；

(4)用1ml移液枪将上清(血浆样品)小心转移到1.5ml细胞冻存管中，写上动物编号和血浆字样，放入带绳小布袋中，置液氮罐保存。

(5)用1ml移液枪小心分离出白细胞层到一个15ml离心管中；加满PBS(1×)到15ml；用PBS(1×)清洗白细胞，离心(3000g离心20min)，小心倾倒掉上清，不要搅动管底的细胞团块，回收白细胞在剩余0.1-0.2ml PBS中。

(6)加5倍体积的RNA later(LIFE TECHNOLOGIES，货号AM7020)，轻轻混溶细胞团块，分成2份到1.5ml细胞冻存管中，置液氮罐保存。

2、总RNA提取，cDNA合成

取一份冻存的淋巴细胞，加入1ml Trizol(INVITROGEN，货号10296028)，室温静置10min后，加入0.2ml氯仿，剧烈震荡，室温静置，待溶液分层(约10min)，12,000rpm离心后，收集上层水相，加入等体积的异丙醇，混匀，室温静置15min，待核酸沉淀，高速离心去上清，RNA沉淀加入1ml的75％乙醇(DEPC水配制)进行洗涤，高速离心去上清，控干水分后，RNA用无核酸酶的水溶解，分别取1μl用于浓度和纯度测定。

取1μg RNA，采用SuperScript^TMIII First-Strand Synthesis SuperMix(THERMO，货号18080051)试剂盒进行cDNA合成，逆转录引物用Oligo dT，合成cDNA在-20℃冻存；

3、噬菌体展示文库构建

PCR扩增：以上述合成的cDNA为模板，采用Nest-PCR扩增骆驼重链抗体的V区(VHH)，表1为Nest-PCR引物的名称及序列。

表1骆驼VHH片段扩增使用的引物信息

第一轮PCR反应体系：cDNA 2μL；Mix 12.5μL；CALL001 0.5μL；CALL002/005/0060.5μL；水补足至25μL。

第一轮PCR反应条件：95℃5min；94℃1min，57℃1min，72℃1min，35个循环；72℃7min。

第二轮PCR反应体系：第一轮PCR产物40ng；Mix 25μL；VHH For(10μM)1μL；VHHBack(10μM)1μL；水补足至50μL。

第二轮PCR反应条件：95℃5min；94℃45’，60℃45’，72℃45’，25个循环；72℃7min。

PCR反应结束后，用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，第一轮PCR的目的基因片段在700bp处，胶回收试剂盒QIAEX II Gel Extraction kit(500)(QIAGEN，货号20051)切胶回收目的条带，进行第二轮PCR，目的基因片段在500bp处，切胶回收目的条带，即VHH片段；

用限制性内切酶NotI(NEB，货号R0189M)和PstI(NEB,货号R0140L)分别对VHH片段和pMECS载体进行双酶切，反应体系如下：

载体酶切体系：pMECS载体20μg；PstI 10μl；NotI 20μl；Cutsmart(buffer)50μl；加H₂O至500μl。

片段酶切体系：VHH片段5μg；PstI 7μl；NotI 14μl；Cutsmart(buffer)50μl；加H₂O至500μl。

37℃，酶切过夜，琼脂糖凝胶电泳后，切胶回收；将载体和VHH片段的酶切产物混合，用T4 DNA Ligase(NEB，货号M0202L)连接酶在16℃连接过夜；

4、噬菌体展示库的构建

连接产物经PCR Purification Kit(TIANGEN，货号DP214-02)纯化后，取1μl转化大肠杆菌TG1感受态细胞(LUCIGEN，货号60502-2)，37℃复苏2h，梯度稀释至10¹，10²，10³，分别取300μl涂布平板，37℃，过夜培养，计算克隆数，约10⁵个克隆/平板。

采用上述相同的转化方法，大量转化，直到文库的克隆数达到10⁷以上。将所有克隆用LB洗脱下，5,000g，离心5min，沉淀用2ml LB悬浮，加入等体积的30％甘油，-80冻存。

二、采用辅助噬菌体对骆驼天然纳米抗体噬菌体库进行扩增和拯救

取步骤一已建的天然纳米抗体文库1ml接入100ml培养基中培养至对数生长期，加入MOI为20的辅助噬菌体(NEB，货号N0315s)，室温，静置30min，低速离心后，沉淀用培养基悬起，接入300ml培养基中，培养过夜。次日，3,000g离心30min，收集上清，加入PEG沉淀噬菌体，冰上静置30min，3,000g离心30min，沉淀为骆驼天然纳米抗体噬菌体库，用PBS悬浮沉淀后，测定其滴度为2.9×10¹²pfu/ml。

实施例2、用噬菌体展示技术淘选ALK融合蛋白纳米抗体

(1)亲和ALK纳米抗体噬菌体库淘洗

取500ng ALK抗原(上海安研公司产品，货AY-78081P-1mg)包被ELISA板，4℃，过夜孵育。次日，加入实施例1拯救出的天然纳米抗体噬菌体展示文库，室温，孵育2h；PBST洗孔10次，加入100μl三乙胺，室温，孵育15min，收集的噬菌体即亲和淘洗获得的ALK纳米抗体噬菌体库；取10μl感染大肠杆菌TG1细胞涂布平板，用于测定筛选后的克隆数测定，剩余筛选后的噬菌体用于扩增。

(2)筛选后噬菌体的扩增和拯救

扩增和拯救方法同实施例1，获得的PBS悬浮液即扩增的第一轮筛选后的噬菌体，置于4℃保存，并用于下一轮的筛选；按上述相同筛选步骤，逐次递减抗原量，筛选4轮。

(3)鉴定ALK特异性的纳米抗体阳性克隆

ELISA板包被200ng的ALK抗原，对照组只包被包被液，4℃孵育过夜；取每一轮筛选获得的噬菌体涂布的平板，随机挑取96个单克隆于500μl培养基中，37℃，培养至对数期，加入MOI为20的辅助噬菌体(NEB，货号N0315s)过夜；次日，3200rpm离心10min，收集上清；同时取ELISA板，加2％的BSA室温封闭1h；实验组每孔加入单克隆上清噬菌体，对照组加入等量单克隆上清噬菌体，室温，孵育2h；PBST洗10次，HRP标记的M13抗体，室温1h；PBST洗3-5次，加入显色液，避光反应10-30min，加入终止液，在酶标仪上读取吸光值；当吸光值与对照孔比值大于10时，判定为阳性克隆；ELISA验证结果显示，获得84个阳性克隆(图1)；

(4)竞争ELISA鉴定亲和力

ELISA板包被200ng的ALK抗原，对照组只包被包被液，4℃孵育过夜；从上轮84个阳性克隆中挑选出30个比值最高的克隆，将上清噬菌体与ALK抗原混合孵育1h，同时取ELISA板，加2％的BSA室温封闭1h；实验组A每孔加单克隆上清噬菌体，实验组B加单克隆上清噬菌体与ALK抗原混合液，对照加单克隆上清噬菌体，室温，孵育0.5h；PBST洗10次，HRP标记的M13抗体，室温1h；PBST洗3-5次，加入显色液，避光反应10-30min，加入终止液，在酶标仪上读取吸光值；挑选13个亲和力高的克隆(图2中OD450值高于基线且从高到低的13个克隆)测序，得到9条不同序列。

(5)阳性克隆序列分析

测序结果显示，获得9种核苷酸序列，对其氨基酸序列进行分析，其中都具有典型的纳米抗体的结构，即由框架区(FR1，FR2，FR3和FR4)和互补决定区(CDR1，CDR2和CDR3)构成。将其中一种命名为F10。

F10这株纳米抗体单克隆的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，氨基酸序列如SEQ IDNo.1所示。

在SEQ ID No.1中，第1-20位为FR1；第21-28位为CDR1；第29-45位为FR2；第46-52位为CDR2；第53-90位为FR3；第91-107位为CDR3；第108-118位为FR4。

实施例3、ALK纳米抗体的诱导表达和纯化

由于pMECS在HA标签和M13 GIII基因之间为琥珀终止子(TAG)，普通的表达系统不能有效识别该终止子，从而有效表达纳米抗体蛋白。本发明优化了原核表达系统，利用大肠杆菌原核表达系统ALK纳米抗体F10进行诱导表达和纯化。

1、ALK纳米抗体的表达

将实施例2得到的表达纳米抗体单克隆F10的重组大肠杆菌接种到15ml TB培养液(INVITROGEN，货号22711022)中，37℃培养过夜至OD₆₀₀为0.6-0.8，将已经接种的15ml TB培养液转至400ml TB培养液中，加入Ampicillin抗性37℃培养2h后加入终浓度为1mM的IPTG于25℃诱导表达5h。离心菌液，收集菌体沉淀，用裂解缓冲液重悬沉淀，超声破碎菌体，离心收集破碎后的菌体上清。

2、ALK纳米抗体的纯化

通过Ni柱亲和纯化获得ALK纳米抗体。Ni柱先用裂解缓冲液平衡；将上述ALK纳米抗体表达菌的破碎上清以1ml/min的流速加入Ni柱；用5倍柱体积的亲和A液(20mM咪唑)洗去杂蛋白，再用等体积的亲和B液(250mM咪唑)洗脱目的蛋白，并收集洗脱液；最后15％的SDS-PAGE监测PCSK9纳米抗体的表达和纯化情况。结果如图3所示。由图可见，3、4、5、6泳道在15kDa附近有纳米抗体条带。

实施例4、Biacore对ALK纳米抗体的亲和力测定

活化芯片(货号：29104988，GE)后，加入500nM的ALK抗原进行反应；加入150μl的1M乙醇胺盐酸洗掉残留的活性羧基基团；将ALK纳米抗体F10进行梯度稀释分别为5000nM，2500nM，1250nM，625nM和312.5nM并加入360μl，速率为25μl/min，结合120s，解离400s；获得数据后，进行结果处理。

结果显示，ALK纳米抗体F10展示了较高亲和力。ALK纳米抗体F10与抗原ALK相互作用的参数分别是，K_a(1/Ms)为3.150E+06，K_d(1/s)为0.6863，R_max(RU)为88.86(图4)，表示抗体的结合位点被抗原占领时的信号强度，K_D(M)为3.1E-07为抗原抗体相互作用的解离常数，表明ALK纳米抗体F10与ALK抗原的相互作用良好，具有继续开发的价值。

另外，将实施例2步骤(5)中获得的F10外的其他8个纳米抗体单克隆进行了同样的检测，结果显示其在与ALK抗原相互作用方面的效果都没有F10的好，所以选在了F10作为候选抗体。

实施例5、利用免疫组化试验验证ALK纳米抗体的亲和力和特异性

将F10进一步进行免疫组化验证。前往聊城市人民医院病理科随机挑选近5年来非小细胞肺癌ALK融合蛋白表达阳性并具有手术大组织标本的患者2例。用切片机将2例石蜡包埋的样本切片各十片，放入60℃烘箱烤片2h，然后放入4℃冰箱保存。每个病例5张总共10张切片常规脱水放置水中，用EDTA对切片进行高压抗原修复。PBS缓冲液洗3次每次3min，用免疫组化PAP笔在组织0.5cm画圈，每张切片上滴加3％过氧化氢溶液，室温下孵育10min，以阻断内源性过氧化物酶。PBS冲洗3次，每次3min。甩去PBS，每张切片滴加60μl一抗，分别为anti-ALK纳米抗体F10(0.1mg/ml)、阳性对照D5F3(0.0025mg/ml，cell signaltechnology)、阳性对照5A4(即用型，福州迈新)，冰箱4℃孵育过夜。PBS冲洗三遍，每次5s。每张切片酌量滴加增强剂(迈新生物)，室温下孵育20min。PBS冲洗3次，每次5s。甩去PBS，每张切片滴加对应二抗，室温孵育30min，PBS洗3遍，每次5s。甩去PBS，每张切片滴加适量新鲜配制的DAB，2min。自来水冲洗，苏木素复染5分钟，0.1％盐酸酒精分化，自来水冲洗返蓝5min。按照常规走缸，自动封片机封片。

结果显示，其中anti-ALK纳米抗体F10定位准确为细胞浆，并且展现出较强特异性，无非特异性染色(图5、图6)，具有发展成为一种抗ALK融合蛋白的检测抗体。由图可见，F10与阳性对照相比，其所呈现出来的ALK检测结果要比阳性对照要好很多。

另外，将实施例2步骤(5)中获得的F10外的其他8个纳米抗体单克隆进行了同样的检测，结果显示对两个病例的检测结果均为阴性。

序列表

<110> 深圳华大生命科学研究院；青岛华大基因研究院

<120> 一种基于噬菌体展示技术开发的ALK纳米抗体及其应用

<130> GNCLN192005

<141> 2019-11-18

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 118

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 1

Glu Ser Gly Gly Gly Thr Val Glu Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser

1 5 10 15

Cys Ile Ala Ser Gly Leu Thr Phe Asp Asp Thr Asp Met Gly Trp Tyr

20 25 30

Arg Gln Gly Pro Gly Asn Glu Cys Asp Leu Val Ser Thr Ile Asn Asn

35 40 45

Tyr Gly Val Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile

50 55 60

Ser Arg Asp Asn Gly Glu Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu

65 70 75 80

Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr His Cys Ala Glu Gly Pro Gln Leu

85 90 95

Pro Leu Leu Tyr Arg Arg Arg Cys Pro Thr Val Pro Thr Gln Gly Thr

100 105 110

Gln Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 2

<211> 354

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 2

gagtctggag gaggcacggt tgaggctgga gggtctctga ggctctcctg tatagcctct 60

gggctcactt tcgatgatac tgacatgggc tggtatcgtc aaggtccagg gaatgagtgc 120

gacttggtct caactatcaa taattatggt gtcacatact atgcggactc cgtgaagggc 180

cgattcacca tctcccgaga caacggcgaa aacacggtgt atctacaaat gaacagtctg 240

aaacctgagg acacggccgt gtatcactgt gcagaaggtc cacaattacc ccttctttat 300

aggcggcgct gcccaacggt gcccacccag gggacccagg tcaccgtctc ctca 354

Claims

1.抗ALK的纳米抗体，包含互补决定区；

所述互补决定区由CDR1、CDR2和CDR3组成；

所述CDR1的氨基酸序列为SEQ ID No.1的第21-28位；

所述CDR2的氨基酸序列为SEQ ID No.1的第46-52位；

所述CDR3的氨基酸序列为SEQ ID No.1的第91-107位。

2.根据权利要求1所述的纳米抗体，其特征在于：所述纳米抗体由所述互补决定区和框架区组成。

3.根据权利要求1或2所述的纳米抗体，其特征在于：所述纳米抗体为下述A1)或A2)：

A1)氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的纳米抗体；

4.与权利要求1或2或3所述纳米抗体相关的生物材料，为B1)至B12)中的任一种：

B1)编码权利要求1或2或3所述纳米抗体的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体；

B4)含有B2)所述表达盒的重组载体；

B5)含有B1)所述核酸分子的重组微生物；

B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物；

B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物；

B9)含有B1)所述核酸分子的转基因动物细胞系；

B10)含有B2)所述表达盒的转基因动物细胞系；

B11)含有B3)所述重组载体的转基因动物细胞系；

B12)含有B4)所述重组载体的转基因动物细胞系。

5.根据权利要求4所述的生物材料，其特征在于：所述纳米抗体的CDR1的编码序列为SEQ ID No.2的第61-84位核苷酸。

6.根据权利要求4所述的生物材料，其特征在于：所述纳米抗体的CDR2的编码序列为SEQ ID No.2的第136-156位核苷酸。

7.根据权利要求4所述的生物材料，其特征在于：所述纳米抗体的CDR3的编码序列为SEQ ID No.2的第271-321位核苷酸。

8.根据权利要求4所述的生物材料，其特征在于：B1)所述核酸分子为核苷酸序列如SEQID No.2所示的DNA分子。

9.含有权利要求1-3中任一所述纳米抗体或权利要求4-8中任一所述生物材料的试剂盒。

10.权利要求1或2或3所述纳米抗体的制备方法，包括如下步骤：将编码权利要求1或2或3所述纳米抗体的核酸分子导入受体细胞得到表达所述纳米抗体的转基因细胞，培养所述转基因细胞，得到所述纳米抗体。

11.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于：编码所述纳米抗体的核酸分子为权利要求5-8任一中所述核酸分子。

12.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于：所述受体细胞为微生物细胞。

13.如下任一应用：

E1)权利要求1或2或3所述纳米抗体在制备用于检测非小细胞肺癌患者ALK融合蛋白的表达情况的产品中的应用；

E2)权利要求4-8中任一所述生物材料在制备用于检测非小细胞肺癌患者ALK融合蛋白的表达情况的产品中的应用；

E3)权利要求9所述试剂盒在制备用于检测非小细胞肺癌患者ALK融合蛋白的表达情况的产品中的应用；

E4)权利要求10-12中任一所述方法在制备用于检测非小细胞肺癌患者ALK融合蛋白的表达情况的产品中的应用；

E5)权利要求1或2或3所述纳米抗体在制备与ALK结合的产品中的应用；

E6)权利要求4-8中任一所述生物材料在制备与ALK结合的产品中的应用；

E7)权利要求9所述试剂盒在制备与ALK结合的产品中的应用；

E8)权利要求10-12中任一所述方法在制备与ALK结合的产品中的应用；

E9)权利要求1或2或3所述纳米抗体在制备用于检测ALK的产品中的应用；

E10)权利要求4-8中任一所述生物材料在制备用于检测ALK的产品中的应用；

E11)权利要求9所述试剂盒在制备用于检测ALK的产品中的应用；

E12)权利要求10-12中任一所述方法在制备用于检测ALK的产品中的应用。