CN116410322A - 抗人pcdh7蛋白的单克隆抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于抗体制备技术领域，尤其涉及抗人PCDH7蛋白的单克隆抗体及其应用。所述单克隆抗体包括轻链和重链，重链互补决定区1、重链互补决定区2和重链互补决定区3分别含有“ESLVNSKGNTH”、“KVS”及“SQSTHAPYT”所示的氨基酸序列；轻链互补决定区1、轻链互补决定区2和轻链互补决定区3分别含有“GYTFTDYV”、“IFPRTGST”及“AFITSVDWAMEY”所示的氨基酸序列。本发明提供的具备上述互补决定区序列的单克隆抗体能够识别并结合人PCDH7蛋白，抗体效价达到1：100万，灵敏度高，检测限低至pg/mL级别，而且特异性好，可应用于免疫学诊疗技术领域的抗体原材料。

Description

抗人PCDH7蛋白的单克隆抗体及其应用
技术领域
本发明涉及抗体制备技术领域，特别涉及抗人PCDH7蛋白的单克隆抗体及其应用。
背景技术
原钙粘蛋白7(protocadherins 7，PCDH7)属于原钙粘蛋白超家族PCDHδ1家族中的一员，最早是从胃癌细胞分离出来的，后来研究发现其主要分布于神经细胞表面，参与神经细胞之间的识别。人类PCDH7的编码基因位于人染色体4p15。PCDH7是一种膜蛋白，包含7个重复序列的N末端胞外结构域(extracellua，EC)、C末端胞质结构域(cytoplasmic，CP)和连接胞内外结构域的跨膜结构域(transmembrane，TM)。其中，N末端胞外结构域EC1缺乏与Ⅰ型典型钙粘蛋白细胞-细胞结合功能有关的HAV粘附识别序列，EC2包含165个氨基酸(同家族其他成员包含110个氨基酸)，其中间部位有一个独特的插入点，包含55个氨基酸，C-末端胞质结构域具有保守的CM1和CM2结构域，除此之外，还具有蛋白磷酸酶-1α(PP1α)结合结构域(CM3)，缺乏与经典钙粘蛋白中β-catenin连环蛋白结合位点相对应的同源序列。
现有研究表明，PCDH7可以影响神经系统发育，并且在多种癌症中存在异常表达。PCDH7在非小细胞肺癌(NSCLC)中经常过表达，这种事件与不良的临床结果相关。在人支气管上皮细胞和NSCLC细胞系中，PCDH7过表达与KRAS和EGFR协同诱导MAPK信号通路和肿瘤发生；相反，PCDH7缺失抑制ERK激活，使细胞对MEK抑制剂敏感，并降低NSCLC异种移植的生长。这些致癌效应与PCDH7结合蛋白磷酸酶2A(PP2A)的能力有关，它直接去磷酸化ERK1/2和SET癌蛋白，是一种有效的PP2A抑制剂，可抑制PP2A的活性。总的来说，PCDH7导致MAPK通路过度激活，MAPK通路是肺肿瘤发生的关键驱动因素；这些发现确立了PCDH7在体内的关键致癌功能，并证明PCDH7是NSCLC等癌症的一个可操作的治疗靶点。因此，定量评价PCDH7蛋白具有重要的临床病理意义，开发特异性好、灵敏度高的抗PCDH7抗体用于实现PCDH7蛋白的精准检测具有极高的应用价值，而且开发抗PCDH7抗体对多种癌症的治疗同样具有广阔的应用前景。
然而，市面上针对人PCDH7蛋白的抗体多为多克隆抗体，存在特异性不强、效价低、灵敏度低等问题，给蛋白检测、疾病诊疗的研究造成了不便。因此，急需开发特异性强和/或灵敏度高的抗人PCDH7抗体。
发明内容
针对现有技术中抗人PCDH7蛋白的多克隆抗体特异性不强、效价低、灵敏度低等问题，本发明提供了一种抗人PCDH7蛋白的单克隆抗体及其应用。
为实现上述目的，本发明具体通过以下技术方案实现：
本发明第一方面提供了一种抗人PCDH7蛋白的单克隆抗体，所述单克隆抗体包括轻链和重链，重链互补决定区1、重链互补决定区2和重链互补决定区3分别含有“ESLVNSKGNTH”、“KVS”及“SQSTHAPYT”所示的氨基酸序列，轻链互补决定区1、轻链互补决定区2和轻链互补决定区3分别含有“GYTFTDYV”、“IFPRTGST”及“AFITSVDWAMEY”所示的氨基酸序列。
进一步地，重链可变区含有如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列，轻链可变区含有如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列。
更进一步地，重链全长含有如SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列，轻链全长含有如SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列。
本发明第二方面提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸用于编码如上所述的抗人PCDH7蛋白的单克隆抗体。
进一步地，编码所述单克隆抗体的重链和轻链的核苷酸分别如SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11所示。
本发明第三方面提供了一种表达载体，所述表达载体用于表达如上所述的多核苷酸。
进一步地，所述表达载体的出发载体为真核表达载体pcDNA3.1。
本发明第四方面提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞携带如上所述的多核苷酸或包含如上所述的表达载体。
进一步地，所述宿主细胞为293F细胞。
本发明第五方面提供了如上所述的抗人PCDH7蛋白的单克隆抗体、如上所述的多核苷酸、如上所述的表达载体、如上所述的宿主细胞在制备人PCDH7蛋白检测试剂和/或检测试剂盒中的应用。
进一步地，检测人PCDH7蛋白的方法包括酶免疫分析法、酶联免疫吸附法、酶联免疫斑点法、免疫组织化学法、免疫荧光法、免疫印迹法和流式细胞术中的一种。
本发明的优点及积极效果为：
本发明提供的具备上述互补决定区序列的单克隆抗体能够识别并结合人PCDH7蛋白，抗体效价达到1：100万，灵敏度高，检测限低至pg/mL级别，而且特异性好，可应用于免疫学诊疗技术领域的抗体原材料。此外，本发明的单克隆抗体可以经基因工程技术重复量产，能够保证抗体批次间的稳定性，性价比高。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1含有抗人PCDH7蛋白的单克隆抗体的亲链和重链基因的表达载体pcDNA3.1-MA001-His的构建流程图；
图2为本发明实施例1含有表达载体pcDNA3.1-MA001-His的宿主细胞培养物经His亲和纯化和磁珠纯化后SDS-PAGE蛋白电泳图；
图3为本发明实施例2抗人PCDH7蛋白的单克隆抗体的抗体效价分析图；
图4为本发明实施例2抗人PCDH7蛋白的单克隆抗体的抗体灵敏度分析图；
图5为本发明实施例3通过免疫印迹法测定抗人PCDH7蛋白的单克隆抗体与人PCDH7蛋白特异性结合情况图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。此处所描述的实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
根据本发明包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。
为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本发明中所用的表示用量、百分比的所有数字以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。另外，术语“包括”、“包含”、“含有”、“具有”等类似词语的含义是非限制性的，即可加入不影响结果的其它步骤和其它成分。
需要说明的是，在本发明中使用的“和/或”应被视对在具有或不具有另一者的情况下两种指定特征或组分中的每一种的具体公开。例如，“A和/或B”将被视为(i)A、(ii)B、以及(iii)A和B。
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更为明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施例做详细说明。
抗体是一种免疫球蛋白分子，其能够通过位于免疫球蛋白分子的可变区的至少一个抗原识别位点特异性结合至目标抗原或表位。典型的抗体分子由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成，轻链可分为两种，分别为kappa(κ)链和lambda(λ)链。重链和轻链靠近N端的氨基酸序列变化很大，其他部分氨基酸序列相对恒定，将轻链和重链中靠近N端氨基酸序列变化较大的区域称为可变区(variable region，V)，将靠近C端的氨基酸序列相对稳定的区域，称为恒定区(constant region，C)。重链可变区(VH)以及轻链可变区(VL)通常是抗体的最可变部分并含有抗原结合位点。VH与VL区域可进一步细分为高变区(hypervariable region，HVR)和框架区(framework region，FR)，高变区又称为互补决定区(CDR)，为环状结构，重链CDR与轻链CDR通过框架区紧密地靠在一起并相互配合，共同形成能与目标抗原或表位的三维结构互补的表面，决定抗体的特异性，是抗体识别及结合抗原的部位。框架区是VH与VL中较保守的部分，它们大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连。每个VH与VL通常由三个CDR以及四个FR所组成，按以下顺序从氨基端到羧基端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。轻链恒定区(CL)和重链恒定区(CH)不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。抗体重链与轻链恒定区的氨基酸序列是本领域众所周知的。
在本发明的上下文中，术语“与PCDH7蛋白特异性结合的单克隆抗体”、“抗人PCDH7蛋白单克隆抗体”、“人PCDH7蛋白单克隆抗体”、“单克隆抗体”等词语可互换使用，均指特异性结合人PCDH7蛋白的单克隆抗体。
术语“特异性结合”是本领域众所周知的术语，如果分子与特定目标抗原或表位的反应比与其他目标抗原或表位的反应更频繁、更快速、持续时间更长和/或具有更大的亲和力，则其表现出“特异性结合”，“特异性结合”或称为“优先结合”，并不一定需要(尽管可以包括)排他结合。
术语“单克隆抗体”是指同质抗体群，即除了可能以少量存在的可能的天然出现的突变和/或翻译后修饰(例如异构化、酰胺化)之外，构成群体的各个抗体是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，针对单个抗原或表位。“单克隆”表明抗体从基本上同质的抗体群获得的特征，不应解释为限制抗体的来源或制备方式。在一些实施例中，单克隆抗体通过杂交瘤法、噬菌体展示法、酵母展示法、重组DNA法、单细胞筛选或单细胞测序法制备得到。
本发明实施例提供了一种抗人PCDH7蛋白的单克隆抗体，所述单克隆抗体包括轻链和重链，所述轻链和所述重链均包括互补决定区(CDR)，重链互补决定区1(HCDR1)、重链互补决定区2(HCDR2)和重链互补决定区3(HCDR3)分别含有“ESLVNSKGNTH(见SEQ ID NO：1)”、“KVS”及“SQSTHAPYT(见SEQ ID NO：2)”所示的氨基酸序列，轻链互补决定区1(LCDR1)、轻链互补决定区2(LCDR2)和轻链互补决定区3(LCDR3)分别含有“GYTFTDYV(见SEQ ID NO：3)”、“IFPRTGST(见SEQ ID NO：4)”及“AFITSVDWAMEY(见SEQ ID NO：5)”所示的氨基酸序列。
抗体与抗原特异性结合的能力，即抗体的亲和力和特异性绝大部分取决于抗体互补决定区(CDR)的氨基酸序列，本发明具备上述CDR序列的单克隆抗体能够识别并结合人PCDH7蛋白，经间接酶联免疫吸附法(间接ELISA)检测抗体效价达到1：100万，灵敏度可以达到检测pg/mL级别含量蛋白，进一步经蛋白质印迹法(Western blot)证实抗体的特异性好，即，本发明提供的抗人PCDH7蛋白的单克隆抗体与人PCDH7蛋白具有较强的亲和力，特异性好，灵敏度高，可应用于免疫学诊疗技术领域的抗体原材料。而且，本发明的单克隆抗体可以经基因工程技术重复量产，能够保证抗体批次间的稳定性，性价比高。
可选地，所述轻链和所述重链均包括框架区(FR)，4个所述FR区与3个所述CDR区按顺序交错排列，构成可变区，其中，重链可变区(VH)含有“QVQLQQSGPELVKPGASVRMSCKTSGYTFTDYVISWVKQRPGQGLEWIGEIFPRTGSTYY NENFKATATLTADKSSNTAYMQLSSLTSEDSAAYFCAFITSVDWAMEYWGQGTSVTVSS(见SEQ ID NO：6)”所示的氨基酸序列，轻链可变区(VL)含有“DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSESLVNSKGNTHLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFS GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHAPYTFGGGTKLEIK(见SEQ ID NO：7)”所示的氨基酸序列。
可选地，所述轻链和所述重链均包括恒定区，所述恒定区与所述可变区构成完整抗体，所述重链全长的氨基酸序列如SEQ ID NO：8，所述轻链全长的氨基酸序列如SEQ IDNO：9所示。
可选地，所述抗人PCDH7蛋白的单克隆抗体的免疫原为人PCDH7重组蛋白(购自Sino Biological公司，货号21701-H07B)。
本发明又一实施例提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸用于编码如上所述的抗人PCDH7蛋白的单克隆抗体。
示例性地，编码所述单克隆抗体的重链和轻链全长的多核苷酸分别如SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11所示。
需要注意的是，所述多核苷酸的序列依据氨基酸序列通过常规手段如密码子编码规则推导即可得到。本领域技术应当理解，由于遗传密码的简并性，不同于本发明所示例的多核苷酸序列同样可以编码得到本发明的单克隆抗体，因此，本发明提供的用于编码如上所述的抗人PCDH7蛋白的单克隆抗体的多核苷酸不作为对本发明保护范围的限定。
本发明另一实施例提供了一种表达载体，所述表达载体用于表达如上所述的多核苷酸。
将编码本发明单克隆抗体的多核苷酸序列可操作地连接至少一个表达调控元件，可以形成表达载体，之后通过将含有编码本发明多核苷酸序列的表达载体导入宿主细胞内，即可获得相应的特异性抗体。编码如本发明所述的抗人PCDH7蛋白的单克隆抗体的重链与轻链的多核苷酸可以克隆至一个表达载体中，每段核苷酸序连接到合适的启动子下游。如，编码重链与轻链的每段核苷酸序列可操作地连接到不同的启动子，或者，编码重链与轻链的核苷酸序列可以与单个启动子可操作地连接，使得重链与轻链都可由相同的启动子表达。在另一些具体的实施方式中，编码如本发明所述的抗人PCDH7蛋白的单克隆抗体的重链与轻链的多核苷酸也可以别构建到两个载体上，这两个载体组成表达载体，其可以被导入至相同或不同的宿主细胞中。当重链与轻链在不同的宿主细胞中表达时，每一条链都可以从表达其的宿主细胞中分离出来，并将分离的重链与轻链混合并在合适的条件下孵育以形成抗体。前述的表达载体/启动子的选择取决于用于产生抗体的宿主细胞的类型，此为本领域的公知技术，在此不再详细介绍。
可选地，所述表达载体包括原核表达载体(如大肠杆菌表达载体、枯草杆菌表达载体)、真核表达载体(如酵母表达载体)或病毒表达载体(如慢病毒、腺病毒)。
在一些具体的实施方式中，所述表达载体的出发载体为真核表达载体pcDNA3.1。
本发明再一实施例提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞携带如上所述的多核苷酸或包含如上所述的表达载体。
宿主细胞包括原核细胞和真核细胞，根据表达载体的类型选择，例如，当为原核表达载体时，宿主细胞选用原核细胞，常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。用于表达本发明的单克隆抗体的宿主细胞包括但不限于大肠杆菌、枯草杆菌、酵母细胞、昆虫细胞等。在获得转化如上所述的多核苷酸或包含如上所述的表达载体的宿主细胞后，在适合条件下培养该细胞，即可表达出单克隆抗体，然后再分离出表达的单克隆抗体。
在一些具体的实施方式中，所述宿主细胞为293F细胞(人胚肾细胞)。
本发明实施例还提供了如上所述的抗人PCDH7蛋白的单克隆抗体、如上所述的多核苷酸、如上所述的表达载体、如上所述的宿主细胞在制备人PCDH7蛋白检测试剂和/或检测试剂盒中的应用。
本发明的抗人PCDH7蛋白的单克隆抗体对人PCDH7蛋白的亲和力高、特异性好，将其作为抗原结合抗体，可以高效识别并特异性结合待检测样本中的低含量的人PCDH7蛋白，同时抗原结合抗体可以与发光标记物连接或者与偶联有发光标记物的检测抗体特异性结合，发光标记物可以为胶体金、化学染料、荧光染料等中的一种，发光标记物用于产生可识别的信号变化，从而实现定性或定量检测人PCDH7蛋白。所述抗人PCDH7蛋白的单克隆抗体、所述多核苷酸、所述表达载体、所述宿主细胞在制备人PCDH7蛋白检测试剂和/或检测试剂盒中的应用优势与如上所述的抗人PCDH7蛋白的单克隆抗体相对于现有技术的优势相同，在此不再赘述。
可选地，上述所述的定性或定量检测人PCDH7蛋白的方法采用公知的免疫学分析方法，如酶免疫分析法(Enzyme immunoassay，EIA)、酶联免疫吸附法(Enzyme linkedimmunosorbent assay，ELISA)、酶联免疫斑点法(Enzyme-linked Immunospot，ELISPOT)、免疫组织化学法(Immunohistochemistry，IHC)、免疫荧光法(Immunofluorescence，IF)、免疫印迹法(Western blot，WB)、流式细胞术(Flow Cytometry，FCM)等。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如冷泉港实验室出版的《分子克隆实验指南(第四版)》中所述的条件，或者通常按照制造厂商所建议的条件。
实施例1分泌抗人PCDH7抗体的杂交瘤细胞的筛选
1、小鼠免疫
首次免疫，取人PCDH7重组蛋白(购自Sino Biological公司，货号21701-H07B)溶解于PBS缓冲液中，浓度为1mg/mL，取100μL人PCDH7蛋白溶液与弗氏完全佐剂(购自sigma公司)等体积混合，冰上乳化，得到乳化液；再取乳化液免疫6-8周龄雌性BALB/c小鼠(购自安评实验动物中心)，每只小鼠注射200μL乳化液(含100μg人PCDH7蛋白)，免疫方法为背部皮下多点注射。间隔三周后进行加强免疫，将弗氏完全佐剂替换成弗氏不完全佐剂(购自sigma公司)，免疫剂量和方法一致。之后每间隔二周后进行一次加强免疫，使用弗氏不完全佐剂，免疫剂量和方法一致。第2次加强免疫后7天取小鼠尾静脉采集小鼠免疫血清，采用间接ELISA方法检测血清效价。当血清效价达到1：64000以上后准备细胞融合。挑选血清效价最高的小鼠(3次加强免疫后效价1：1000000)，在融合前4天进行冲击免疫，去除弗氏佐剂，免疫剂量一致，免疫方法为腹腔注射。
免疫血清效价检测采用间接ELISA法测定，具体操作包括：取上述人PCDH7重组蛋白溶液(1mg/mL)用0.05M碳酸盐缓冲液(pH9.6)稀释，稀释后包被聚苯乙烯微96孔板，100μL/孔(包被浓度为1μg/mL)，4℃过夜。次日，使用洗涤液(PBS含0.05％(v/v)Tween-20)洗板三次，用封闭液(PBS含1％BSA、0.5％明胶和5％蔗糖)300μL/孔，37℃封闭2h，使用洗涤液洗板三次，小鼠于第2次加强免疫后的小鼠免疫血清用抗体稀释液(PBS含1％BSA)稀释，加入96孔板，100μL/孔，37℃孵育1h，洗涤液洗板三次后，加入1：10000倍抗体稀释液稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG(购自Jackson Immunoresearch公司，货号115-035-071)，100μL/孔，37℃孵育50min，洗涤液洗板三次后，TMB显色，100μL/孔，37℃避光10min，加100μL/孔0.5M草酸溶液终止反应，测450nm吸收值，以免疫前小鼠血清作为阴性对照，以测定值与对照值的比≥2.1为阳性来判断免疫血清的效价。
2、杂交瘤细胞的制备
在无菌操作室中取出冲击免疫后的小鼠脾脏，制成脾细胞悬液与对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞株SP2/0按2：1的比例混合，使用电脉冲缓冲液(购自bio-sun公司)10mL洗涤2次，200g室温离心5min，使用电脉冲缓冲液重悬细胞后利用电融合仪进行细胞融合实验。融合结束后将细胞悬液加入到HAT培养液(次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T))(购自Sigma)中，37℃、5％CO2培养箱中孵育30min。将细胞接种到含饲养层细胞的96孔板中，每孔100μL。培养6天后，观察细胞融合情况，更换一半HAT培养液，连续数日，直至有克隆形成，更换HT培养基(购自Sigma)培养24小时后，通过间接ELISA法筛选出能分泌抗人PCDH7重组蛋白抗体的杂交瘤细胞，以与阴性培养基OD450的比值大于2.1判为阳性。
3、筛选分泌抗人PCDH7单克隆抗体的杂交瘤细胞株
挑选间接ELISA效价较高的阳性克隆杂交瘤细胞，进行内源Western Blot验证，选择内源Western Blot阳性的杂交瘤细胞进行亚克隆化，采用有限稀释法连续克隆化2-3次，直至100％细胞阳性率，最后获得稳定分泌抗人PCDH7蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株3E4G2F8。
4、杂交瘤细胞抗体基因测序及重组单克隆抗体表达
将上述杂交瘤细胞株3E4G2F8扩大培养至细胞数目为5×106个时，使用TrizolReagent充分裂解5×106个以上新鲜收集的杂交瘤细胞。保证总RNA浓度不低于100ng/μL，体积20μL以上，且RNA条带清晰无明显降解。然后将样品置于液氮中，并测序。测序结果进行基因组比对(Genome mapping)、转录组比对(Transcriptome mapping)、转录组组装(Reference-free assembly)获得抗体重链和轻链序列，获得抗人PCDH7的重组单克隆抗体，命名为MA001抗体。根据测序结果，MA001抗体重链核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示，轻链核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示；其编码的重链氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示，轻链氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示。具体如下所示：
重链全长氨基酸序列(见SEQ ID NO：8)：
Figure BDA0004189496290000091
Figure BDA0004189496290000092
注：粗体部分所示为信号肽，阴影部分所示为可变区，下划线所示从N段到C端依次为FR1、FR2、FR3和FR4，斜体所示从N段到C端依次为CDR1、CDR2和CDR3；其余部分为恒定区。
轻链全长氨基酸序列(见SEQ ID NO：9)：
Figure BDA0004189496290000093
Figure BDA0004189496290000094
注：粗体部分所示为信号肽，阴影部分所示为可变区，下划线所示从N段到C端依次为FR1、FR2、FR3和FR4，斜体所示从N段到C端依次为CDR1、CDR2和CDR3；其余部分为恒定区。
重链全长核苷酸序列(见SEQ ID NO：10)：
Figure BDA0004189496290000095
Figure BDA0004189496290000101
；注：第58-414nt编码可变区(阴影部分所示)，其中，第1-57nt编码信号肽，第58-132nt编码FR1，第133-156nt编码CDR1，第157-207nt编码FR2，第208-231nt编码CDR2，第232-342nt编码FR3，第343-378nt编码CDR3，第379-414nt编码FR4。即，粗体部分所示为信号肽，阴影部分所示为可变区，下划线所示为FR区，斜体所示为CDR区；其余部分为恒定区。
轻链全长核苷酸序列(见SEQ ID NO：11)：
Figure BDA0004189496290000102
Figure BDA0004189496290000103
注：第1-66nt编码信号肽，第67-402nt编码可变区，其中第67-144nt编码FR1，第145-177nt编码CDR1，第178-228nt编码FR2，第229-237nt编码CDR2，第238-345nt编码FR3，第346-372nt编码CDR3，第373-402nt编码FR4。即，粗体部分所示为信号肽，阴影部分所示为可变区，下划线所示为FR区，斜体所示为CDR区；其余部分为恒定区。
通过PCR法和同源重组法将MA001抗体的重链和轻链全长核苷酸序列连接至真核表达载体pcDNA3.1(带His标签)中，参见图1，具体操作包括：
(1)PCR扩增MA001抗体的重链和轻链：依据上述测序结果设计用于扩增MA001抗体的重链和轻链的引物，通过PCR扩增抗体重链和轻链的目的片段；
重链上下游引物分别如SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13所示，轻链上下游引物分别如SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15所示。
重链上游引物(见SEQ ID NO：12)：
CTTGTGACTAACTCTGAATTCCAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGACC；
重链下游引物(见SEQ ID NO：13)：
TCATTACTAACCGGTCTCGAGTTATGAGGAGACGGTGACTGAGGTTCCT；
轻链上游引物(见SEQ ID NO：14)：
CTTGTGACTAACTCTGAATTCGATGTTGTGATGACCCAAA；
轻链下游引物(见SEQ ID NO：15)：
TCATTACTAACCGGTCTCGAGTTATTTTATTTCCAGCTTGGTCCCCCCT。
(2)通过EcoR1和Xho1限制性内切酶分别酶切目的片段和真核表达载体pcDNA3.1，用同源重组酶将目的片段连接至表达载体pcDNA3.1中，经过基因序列测定，获得正确的含有编码抗体重链和轻链核苷酸序列的重组质粒，命名为pcDNA3.1-MA001-His。
5、MA001重组单克隆抗体表达
将上述重组质粒pcDNA3.1-MA001-His扩增抽提后瞬时转染至293F细胞中，获得可以表达带His标签的重组单克隆抗体的瞬转细胞株。将瞬转细胞株接种到100mL OPM-293CD05培养基(购自奥浦迈公司，货号81075-001)，放入恒温摇床125rpm/min、37℃和95％湿度以及8％CO2条件下进行培养。转染后6天，取出细胞培养物，离心，收集上清进行His标签纯化，对纯化抗体进行SDS-PAGE电泳，结果见图2，其中，左图为还原电泳结果，右图为非还原电泳结果，经检测，纯化抗体纯度为90％。
实施例2MA001重组单克隆抗体效价和灵敏度检测
将上述纯化的重组单克隆抗体采用间接ELISA法测定抗体效价，具体方法参考实施例1中的免疫血清效价检测方法，抗体稀释倍数为1：1000，3倍稀释8点，蛋白浓度为1μg/mL，结果如图3所示，其中，横坐标为稀释倍数，纵坐标为OD450。
进一步将上述纯化的重组单克隆抗体采用间接ELISA法测定灵敏度，具体方法参考实施例1中的免疫血清效价检测方法，抗体浓度为1μg/mL，人PCDH7蛋白初始浓度为1μg/mL，3倍梯度稀释8点，结果如图4所示，其中，横坐标为蛋白浓度，纵坐标为OD450。
从图3-4中可以看出，重组单克隆抗体MA001效价达到1：100万，与人PCDH7蛋白具有优秀的结合能力，灵敏度可以检测到pg/mL的蛋白。
实施例3通过Western blot鉴定MA001重组单克隆抗体的特异性
准备过表达PCDH7细胞系：构建过表达PCDH7的人非小细胞肺癌细胞系HCC827(参考文献：Li X,Yuan Y,Pal M,Jiang X.Identification and Validation of lncRNA-SNHG17 in Lung Adenocarcinoma:A Novel Prognostic and DiagnosticIndicator.Front Oncol.2022Jun 1；12:929655.doi:10.3389/fonc.2022.929655.)及敲除PCDH7基因的HCC827，即PCDH7-\-HCC827。
通过Western blot鉴定上述纯化的重组单克隆抗体的特异性。具体操作包括：
取上述过表达PCDH7的HCC827细胞和PCDH7-\-HCC827细胞分别进行裂解提取总蛋白，各取40μg蛋白分别加入20μL SDS缓冲液混匀后，煮沸5min。上样进行电泳，转膜后使用5％脱脂奶粉室温封闭1h，使用TBST进行洗膜3次，加入纯化的重组单克隆抗体MA001(1：500稀释)4℃摇床摇动孵育过夜。使用TBST进行洗膜3次，加入5％脱脂奶粉1：5000稀释的羊抗鼠酶标二抗(购自Abclonal公司，货号AS003)，室温摇床摇动孵育1h。使用TBST进行洗膜3次后进行曝光，结果如图5所示。
可以看出，与敲除PCDH7基因的HCC827细胞样本相比，抗人PCDH7单克隆抗体MA001在野生型细胞中检测出单一的特异性条带，表明本发明制备的单克隆抗体MA001可以在免疫印迹中特异地检出人非小细胞肺癌细胞系HCC827中的人源PCDH7天然蛋白，蛋白大小约为116kD，蛋白大小于理论相符，证明其具有较高的特异性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种抗人PCDH7蛋白的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体包括轻链和重链，其中，重链互补决定区1、重链互补决定区2和重链互补决定区3分别含有“ESLVNSKGNTH”、“KVS”及“SQSTHAPYT”所示的氨基酸序列；
轻链互补决定区1、轻链互补决定区2和轻链互补决定区3分别含有“GYTFTDYV”、“IFPRTGST”及“AFITSVDWAMEY”所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的抗人PCDH7蛋白的单克隆抗体，其特征在于，重链可变区含有如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列，轻链可变区含有如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列。
3.根据权利要求2所述的抗人PCDH7蛋白的单克隆抗体，其特征在于，重链全长含有如SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列，轻链全长含有如SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列。
4.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸用于编码如权利要求1-3任一项所述的抗人PCDH7蛋白的单克隆抗体。
5.根据权利要求4所述的多核苷酸，其特征在于，编码所述单克隆抗体的重链和轻链的核苷酸分别如SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11所示。
6.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体用于表达如权利要求4-5任一项所述的多核苷酸。
7.根据权利要求6所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体的出发载体为真核表达载体pcDNA3.1。
8.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞携带如权利要求4-5任一项所述的多核苷酸或包含如权利要求6-7任一项所述的表达载体。
9.根据权利要求8所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为293F细胞。
10.如权利要求1-3任一项所述的抗人PCDH7蛋白的单克隆抗体在制备人PCDH7蛋白检测试剂和/或检测试剂盒中的应用，其特征在于，检测人PCDH7蛋白的方法包括酶免疫分析法、酶联免疫吸附法、酶联免疫斑点法、免疫组织化学法、免疫荧光法、免疫印迹法和流式细胞术中的一种。
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